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MARCIA SARPA DE CAMPOS MELLO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE REPRODUTIVA DO
PESTICIDA TRIFENIL HIDRÓXIDO DE ESTANHO
(TPTH) EM CAMUNDONGOS
PPGVS / INCQS
FIOCRUZ
2007
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ii
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE REPRODUTIVA DO
PESTICIDA TRIFENIL HIDRÓXIDO DE ESTANHO
(TPTH) EM CAMUNDONGOS
MARCIA SARPA DE CAMPOS MELLO
Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Fundação Oswaldo Cruz.
Orientadores: Dr
a
Isabella Fernandes Delgado e
Dr. Francisco José Roma Paumgartten
Rio de Janeiro
2007
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iii
FOLHA DE APROVAÇÃO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE REPRODUTIVA DO
PESTICIDA TRIFENIL HIDRÓXIDO DE ESTANHO
(TPTH) EM CAMUNDONGOS
MARCIA SARPA DE CAMPOS MELLO
Tese submetida à Comissão Examinadora composta pelo corpo docente do Programa de
Pós-Graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de Qualidade
em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz e por professores convidados de outras
instituições, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor.
Aprovada em 30 de Julho de 2007 pela banca examinadora:
Prof. Dr. Luís Felipe Ribeiro Pinto (UERJ)
Prof. Dr. Thomas Manfred Krauss (INCQS)
Prof. Drª. Isabella Fernandes Delgado (INCQS)
Orientadores: Dr
a
Isabella Fernandes Delgado e Dr. Francisco José Roma
Paumgartten
Rio de Janeiro
2007
iv
FICHA CATALOGRÁFICA
Sarpa, Marcia
Avaliação da toxicidade reprodutiva do pesticida trifenil hidróxido de estanho (TPTH)
em camundongos/ Marcia Sarpa de Campos Mello - 2007
xxiii, p. 131.
Orientadores: Dr
a
. Isabella Fernandes Delgado e Dr. Francisco José Roma Paumgartten
Tese (Doutorado) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde, Julho de 2007
1.TPTH 2.Toxicidade peri e pós-natal 3.Puberdade 4.Fertilidade
v
“Aquele que vê as coisas crescerem desde o princípio terá delas a
melhor visão”.
- Aristóteles, 384-322 a.C.
vi
A meus queridos pais,
Salvatore e Lia, e ao meu
marido, Luís que, em troca de
todas as minhas ausências, me
ofereceram paz, força e amor.
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus por essa vida maravilhosa.
A meus pais, pelo amor e carinho, exemplo de honestidade, humanidade, trabalho e
força de vontade. Amo vocês!
Ao meu querido marido Luis, pela tranqüilidade para lidar com o meu estresse e que
nos dias mais cansativos de experimento me dava força e paz para seguir em frente.
Obrigada pela compreensão nos momentos em que precisei me isolar para analisar os
dados e escrever a tese.
Aos meus amados sobrinhos, Gabi e Vitor, e ao meu gatinho Nit pelo carinho que me
recebia diariamente quando eu voltava para casa.
A Isabella Fernandes Delgado, que contribuiu como exemplo para a minha formação
científica e acadêmica. Obrigada por todas as oportunidades, pela confiança e pela
amizade.
Ao Prof. Francisco Paumgartten pela orientação, estímulo, confiança e pelos
ensinamentos indispensáveis na minha formação científica.
A querida e grande amiga Karen Friedrich que esteve presente em todas as etapas da
minha vida acadêmica e pessoal, me dando conselhos e estendendo as mãos todas as
vezes que precisei chorar. Obrigado pela amizade, paciência e por ajudar na revisão
final da tese.
A Camila, meu “braço direito (e esquerdo)” durante os experimentos e nos momentos
difíceis que passei. Obrigada pelo companheirismo, por dividir as tarefas e pela grande
amizade.
A querida Rose que esteve presente durante todo o período da minha vida acadêmica no
Laboratório de Toxicologia Ambiental e que se tornou uma grande amiga.
viii
A minha querida amiga Isabel, pelo carinho e atenção dispensados mesmo estando do
outro lado do oceano.
A Tânia Fróes, psicóloga e amiga, por me ajudar a caminhar durante esse período de
turbulências e incertezas.
Ao Paulo Dalsenter e Samanta Araújo do Laboratório de Toxicologia Ambiental da
Universidade Federal do Paraná, pela atenção e pelos grandes ensinamentos recebidos
no período que estive em Curitiba.
A Wilma Kempinas da UNESP de Botucatu por me receber em seu laboratório, pela
atenção e tempo dispensados ao meu aprendizado sobre espermatogênese. Obrigada,
também, a todos os alunos da sua equipe que estavam sempre dispostos a ajudar e tirar
dúvidas e, principalmente, a Ana Paula Favareto, que continuou me ajudando via
Internet.
Ao Marco Antônio, Gina, Aline, Cristina Queiroz, Sonia Dória, Marília (in
memoriam), Ubiracir, Luciane Medeiros, Lú Lobianco, Márcia Pietroluongo, enfim,
a todos da maravilhosa Turma de Mestrado e Doutorado / 2003 do INCQS. Vocês
tornaram cada dia de aula mais suave e alegre. Nossos trabalhos em grupo e churrascos
serão inesquecíveis.
Ao Rodrigo Netto Costa por fazer as análises da testosterona, pelas palavras que
sempre me confortam e pela grande amizade.
A Ana Cecília, Maria Regina, Sérgio Kuriama, Manuel, Hellen, Renan, Igor,
Renato, Jéferson, Mara, Antônio Augusto, Tiago, Flávio, Elaine, Kátia, Bárbara,
Elza, Vanilda, Flavia, enfim, a todos que fazem ou fizeram parte do Laboratório de
Toxicologia Ambiental e que direta ou indiretamente me apoiaram e incentivaram no
decorrer dessa tese.
A Tininha e Andréia pela grande ajuda na preparação da apresentação final da tese.
ix
A Maria Helena Simões Villas Bôas coordenadora da pós-graduação e a todos da
secretaria acadêmica.
A Fiocruz e a CAPES pelo auxílio financeiro.
x
ÍNDICE
Lista de Abreviaturas xv
Lista de Figuras xvii
Lista de Tabelas xviii
Lista de Gráficos e Quadros xxi
Resumo xxii
Abstract xxiii
I. Introdução 01
I.1 Avaliação da toxicidade reprodutiva de xenobióticos 02
I.2 Estanho 06
I.3 Compostos organoestanhosos 06
I.4 Compostos Trifenílicos de Estanho 11
I.4.1 Identidade e propriedades físico-químicas 11
I.4.2 Transformação, distribuição e transporte no ambiente 12
I.4.3 Métodos Analíticos 12
I.4.4 Fontes de exposição humana e ambiental 13
I.4.5 Toxicidade aguda e sub-crônica 14
I.2.6 Toxicidade crônica e carcinogenicidade 15
I.2.7 Genotoxicidade 16
I.2.8 Imunotoxicidade 16
I.2.9 Neurotoxicidade 17
I.2.10 Toxicidade Reprodutiva 17
I.5 Relevância do Estudo 21
II. Objetivos 23
III. Metodologia 25
xi
III.1 Experimento 1 25
III.1.1 Animais 26
III.1.2 Acasalamento 27
III.1.3 Doses e Tratamento 27
III.1.4 Acompanhamento pré- e peri-natal 28
III.1.5 Acompanhamento pós-natal 28
III.1.6 Teste de Fertilidade 29
III.1.7 Fêmeas na idade adulta 29
III.1.8 Machos na idade adulta 30
III.1.8.1 Número de espermatozóides e espermátides 30
III.1.8.2 Morfologia espermática 31
III.1.9 Análise Estatística 33
III.2 Experimento 2 33
III.2.1 Animais 33
III.2.2 Doses e Tratamento 35
III.2.3 Toxicidade geral 36
III.2.4 Acompanhamento pós-natal 36
III.2.5 Fim do tratamento (45 PN) 36
III.2.5.1 Peso corporal e dos órgãos reprodutivos, fígado,
baço e timo das fêmeas 37
III.2.5.2 Peso corporal e dos órgãos reprodutivos, fígado,
baço e timo dos machos 37
III.2.5.3 Número de espermátides e espermatozóides 37
III.2.5.4 Morfologia espermática 38
III.2.5.5 Histologia Testicular 42
III.2.5.6 Quantificação da testosterona 46
III.2.6 Teste da Fertilidade 46
III.2.7 Cesariana 47
III.2.8 Machos que participaram do teste de fertilidade 48
III.2.9 Análise estatística 48
xii
IV. Resultados 52
V.1 Experimento 1 50
IV.1.1 Efeitos sobre o organismo materno 50
IV.1.2 Efeitos sobre os órgãos maternos 50
IV.1.3 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre o nascimento e desenvolvimento pós-natal 50
IV.1.4 Efeitos da exposição ao TPTH sobre o ganho de
peso médio dos filhotes 51
IV.1.5 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre o aparecimento dos marcos do
desenvolvimento pós-natal 58
IV.1.6 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre fertilidade 60
IV.1.7 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre os órgãos dos filhotes na idade adulta 62
IV.1.8 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre os parâmetros reprodutivos masculinos dos
filhotes na idade adulta 62
IV.2 Experimento 2 66
IV.2.1 Toxicidade geral e mortalidade 66
IV.2.2 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-
puberdade e a puberdade sobre o ganho de peso corporal 66
IV.2.3 Efeitos da exposição ao TPTH sobre o aparecimento
dos marcos do desenvolvimento pós-natal 67
IV.2.4 Avaliação do ciclo estral 67
IV.2.5 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a
puberdade ao TPTH sobre fígado, baço e timo de fêmeas e
machos mortos após o tratamento 73
IV.2.6 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a
puberdade ao TPTH sobre os órgãos reprodutivos de
machos e fêmeas mortos após o tratamento 73
xiii
IV.2.7 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a
puberdade ao TPTH sobre os parâmetros reprodutivos de
machos mortos após o tratamento 77
IV.2.8 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-
puberdade e a puberdade sobre a fertilidade de machos e
fêmeas 81
IV.2.9 Efeitos da exposição durante ao TPTH a pré-
puberdade e a puberdade sobre fígado, baço e timo de
machos e fêmeas que participaram do teste de fertilidade 83
IV.2.10 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-
puberdade e a puberdade sobre os órgãos reprodutivos de
machos e fêmeas que participaram do teste de fertilidade 83
IV.2.11 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-
puberdade e a puberdade sobre os parâmetros reprodutivos
de machos que participaram do teste de fertilidade 87
V. Discussão 90
V.1 Experimento 1 97
V.1.1 Toxicidade materna e efeitos pré e peri-natais 97
V.1.2 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre o aparecimento dos marcos do
desenvolvimento pós-natal 98
V.1.3 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre fertilidade 99
V.1.4 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao
TPTH sobre os órgãos e sobre os parâmetros reprodutivos
dos filhotes na idade adulta 99
V.2 Experimento 2 101
xiv
V.2.1 Toxicidade geral e correlação entre o ganho de peso
corporal e os marcos físicos do desenvolvimento 101
V.2.2 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a
puberdade ao TPTH sobre os órgãos de fêmeas e machos
mortos no dia 46 pós-natal 104
V.2.3 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a
puberdade ao TPTH sobre os parâmetros reprodutivos de
machos mortos após o tratamento 106
V.2.4 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-
puberdade e a puberdade sobre a fertilidade de machos e
fêmeas 110
V.2.5 Efeitos da exposição durante ao TPTH a pré-
puberdade e a puberdade sobre os órgãos e parâmetros
reprodutivos dos animais submetidos ao teste de fertilidade 111
VI. Conclusões 112
VI.1 Experimento 1 112
VI.2 Experimento 2 112
VII. Bibliografia 114
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
ad libitum – a vontade
ANOVA – Análise de variância (estatística)
AO – abertura de olhos
AP – aparecimento de pêlos
apud – do latim “junto a”, fonte de uma citação direta
AV – abertura do canal vaginal
b. wt. – body weight (peso corporal)
CECAL – Centro de Criação de Animais de Laboratório
DBTCl – di-n-butil dicloreto de estanho
DBTs – dibutil de estanho
DO – descolamento de orelhas
DT – descida dos testículos
EI – erupção dos incisivos
e.g. – por exemplo (exempli gratia)
EEC – Comunidade Econômica Européia
FDA – Agência de Drogas e Alimentos dos Estados Unidos
HPLC – Cromatografia Liquida de Alta Eficiência
i.e.- isto é (“id est”)
ICH – Conferência Internacional de Harmonização
IDA – Ingestão Diária Aceitável
IDT – Ingestão Diária Tolerável
Igs – Imunoglobulinas
IPCS – Programa Internacional de Segurança de Químicos
JMPR – Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues
xvi
NOAEL – No Observed Adverse Effect Level
OECD – Organização para Cooperação Econômica e sobre o Desenvolvimento
per se – por si só
PN – pós-natal
TBT – Compostos Tributil de Estanho
TBTA – Tri-n-butil Acetato de Estanho
TBTCl – Tri-n-butil Cloreto de Estanho
TBTO – Tributil Óxido de Estanho
TPT – Compostos Trifenil de Estanho
TPTA – Trifenil Acetato de Estanho
TPTCl – Trifenil Cloreto de Estanho
TPTH – Trifenil Hidróxido de Estanho
US EPA – Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
WHO – Organização Mundial de Saúde
xvii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – O ciclo reprodutivo.
Figura 2 – Vias de entrada dos compostos organoestanhosos no ambiente.
Figura 3 – Estrutura química geral de compostos trifenil de estanho.
Figura 4 – Desenho esquemático do experimento 1
Figura 5 – Estágios do ciclo espermatogênico de camundongos
Figura 6
– Desenho do experimento 2
Figura 7
– Grupos formados para tratamento
Figura 8 – Morfologia dos espermatozóides
Figura 9 – Aspecto histológico dos estágios dos túbulos seminíferos de camundongos
em cortes transversais corados com H&E
Figura 10
– Esquema do teste de fertilidade
xviii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Ganho de peso materno de camundongos tratados oralmente com TPTH (não
tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 6 de gestação ao dia
21 de lactação.
Tabela 2 – Peso dos órgãos maternos no dia 21 pós-natal de camundongos tratados
oralmente com TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de peso corporal/dia)
do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tabela 3 – Dados do nascimento e do desmame de camundongos expostos in utero ao
TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5mg/kg de peso corporal) do dia 6 de gestação
ao dia 21 de lactação.
Tabela 4 – Mortalidade materna e mortalidade pré-. peri- e pós-natal de camundongos
expostos in utero ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5mg/kg de peso corporal)
do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação
Tabela 5 – Peso médio dos filhotes expostos in utero e durante a lactação ao TPTH (não
tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de peso corporal/dia).
Tabela 6
– Ganho de peso dos filhotes (ninhada) expostos in utero e durante a lactação
ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de peso corporal/dia).
Tabela 7
– Marcos do desenvolvimento pós-natal de filhotes de camundongos expostos
ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5mg/kg de peso corporal) do dia 6 de
gestação ao dia 21 de lactação.
Tabela 8 – Teste de fertilidade de camundongos expostos ao TPTH in utero do dia 6 de
gestação ao dia 21 pós-natal.
xix
Tabela 9 – Peso dos órgãos absoluto e relativo de filhotes (fêmeas) expostos in utero ao
TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 6 de
gestação ao dia 21 de lactação.
Tabela 10 – Peso dos órgãos absoluto e relativo de filhotes (machos) expostos in utero
ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 6 de
gestação ao dia 21 de lactação.
Tabela 11 – Mortalidade dos camundongos (filhotes) fêmeas e machos tratados
oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao
dia 45 pós-natal.
Tabela 12
– Ganho de peso de camundongos (fêmeas) tratados oralmente com TPTH
(óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 13
– Ganho de peso de camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH
(óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 14 – Marcos físicos do desenvolvimento pós-natal de camundongos expostos ao
TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 15
– Ciclo estral de camundongos expostos ao TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e
15mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 16
– Peso dos órgãos de camundongos (fêmeas) tratados oralmente com TPTH
(óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 17 – Peso dos órgãos dos camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH
(óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 18 – Peso dos órgãos sexuais dos camundongos (machos) tratados oralmente
com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45
pós-natal.
xx
Tabela 19 – Variáveis reprodutivas de camundongos machos expostos ao TPTH (óleo;
1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 20 – Variáveis reprodutivas de camundongos machos expostos ao TPTH (óleo;
1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tabela 21 – Análise histológica dos túbulos seminíferos de camundongos machos
expostos ao TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia
45 pós-natal.
Tabela 22 – Teste de fertilidade de camundongos (fêmeas) expostos ao TPTH do dia 15
pós-natal ao dia 45 pós-natal.
Tabela 23 – Peso dos órgãos de camundongos (fêmeas grávidas) tratados oralmente com
TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-
natal e que participaram do teste de fertilidade.
Tabela 24 – Peso dos órgãos dos camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH
(óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal e
que participaram do teste de fertilidade.
Tabela 25
– Peso dos órgãos dos camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH
(óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal e
que participaram do teste de fertilidade.
Tabela 26
– Variáveis reprodutivas de camundongos machos expostos ao TPTH (óleo
de milho; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal
que participaram do teste de fertilidade.
Tabela 27 – Variáveis reprodutivas de camundongos machos expostos ao TPTH (óleo;
1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
xxi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Resumo dos Protocolos Regulatórios in vivo para avaliação da toxicidade
sobre o desenvolvimento.
Quadro2 – Estudos de toxicidade reprodutiva do TPTH
Quadro 3
– Estudos da Toxicidade Materna e Embriofetotoxicidade dos Compostos
Triorganoestanhosos.
Quadro 4
– Estudos da Toxicidade Peri e Pós-Natal dos Compostos
Triorganoestanhosos
Quadro 5 – Esquema indicando a redução do ganho de peso corporal durante as quatro
semanas de tratamento.
Quadro 6 – Relação entre o peso corporal médio e os dias da abertura de vagina e da
descida de testículos.
xxii
RESUMO
O grupo de compostos organoestanhosos inclui uma variedade de químicos amplamente
empregados na agricultura e na indústria em geral. Sob o ponto de vista toxicológico,
um dos desfechos que merece atenção diz respeito aos possíveis efeitos sobre o sistema
reprodutivo de organismos em desenvolvimento. O presente estudo - dividido em 2
etapas - buscou investigar: i. efeitos do TPTH sobre o desempenho reprodutivo geral e a
fertilidade após exposição in utero e durante a lactação, e ii. efeitos da exposição
durante a pré-puberdade e a puberdade sobre o desenvolvimento de órgãos reprodutivos
e a fertilidade. Experimento 1: Camundongos Swiss Webster foram acasalados e as
fêmeas grávidas tratadas com 0, 1,875; 3,75 e 7,5mg TPTH/kg de peso corpóreo/dia por
entubação gástrica do 6º dia de gravidez ao 21º dia pós-natal (PN). Ao nascimento, foi
registrado o número de filhotes nascidos vivos e de natimortos. Parâmetros físicos do
desenvolvimento PN foram avaliados. No dia 70PN, o teste de fertilidade foi realizado.
Logo após o nascimento, três ninhadas do maior grupo de dose foram totalmente
canibalizadas pela mãe. O ganho de peso materno ao longo da gestação e lactação não
diferiu entre os grupos, nem houve alteração do número de filhotes ao nascimento e ao
desmame. No dia 1PN, observou-se redução do peso corporal médio da prole a partir da
dose de 1,87mg TPTH/kg. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos
quanto ao aparecimento de marcos físicos do desenvolvimento, nem quanto ao teste de
fertilidade. As mortes de algumas ninhadas (7,5mg/kg) e a redução do peso médio dos
filhotes ao nascimento (a partir de 1,875 mg/kg) indicam que nas condições
experimentais deste estudo, o TPTH induziu toxicidade peri-natal em camundongos.
Experimento 2: Camundongos Swiss Webster foram tratados por entubação gástrica (0,
1,875; 3,75, 7,5 e 15 mg TPTH/kg de peso corpóreo/dia) nos dias 15 a 45 PN.
Parâmetros físicos do desenvolvimento PN (descida de testículos e abertura de vagina) e
peso corporal foram avaliados diariamente. No dia 46PN, a metade dos animais foi
sacrificada. Foram determinados: peso do timo, baço e órgãos reprodutivos, número de
espermatozóides e produção espermática diária. No dia 65PN, a outra metade foi
avaliada quanto à fertilidade. A dose de 15mg TPTH /kg causou mortalidade de 80%
dos animais. O TPTH reduziu o ganho ponderal na primeira semana do tratamento, mas
houve recuperação nas semanas que se seguiram, de modo que ao final do tratamento a
redução foi observada apenas com as duas maiores doses estudadas. A descida de
testículos ocorreu no 21PN no grupo controle e 29PN no grupo tratado com 15mg
TPTH/kg. A abertura de vagina também foi atrasada nos grupos tratados com as duas
maiores doses. O número de espermatozóides na cauda do epidídimo foi 167±39 (x10
6
)
no grupo controle, 103±31 (x10
6
) nos animais tratados com 7,5mg/kg e 30±9 (x10
6
) na
maior dose estudada. A produção espermática diária foi de 82±16 e 45±14 (x10
6
) nos
grupos tratados óleo de milho e com 15mg TPTH/kg, respectivamente. No teste de
fertilidade, a razão entre o número de fêmeas que cruzaram e o número de fêmeas que
deram à luz não diferiu entre os grupos. Não foram observadas diferenças quanto ao
número de espermatozóides e espermátides entre os animais sacrificados após o teste de
fertilidade. A maior dose de TPTH induziu acentuada mortalidade. O TPTH também
retardou a descida de testículos e a abertura de vagina nos grupos tratados com doses
superiores a 3,75mg TPTH/kg e diminuiu o número de espermatozóides e espermátides
nas doses de 7,5 e 15mg TPTH/kg nos animais sacrificados logo após o fim do
tratamento (46PN). Essa redução não foi observada, entretanto, nos animais que
participaram do teste de fertilidade (65PN), indicando que os efeitos tóxicos sobre as
gônadas masculinas foram reversíveis com a interrupção do tratamento.
xxiii
ABSTRACT
Organotin compounds are a broad-group of chemicals used in agriculture as well as in
industry. Tri substituted organotins are potent biocidal compounds that are used for a
variety purposes. The present study was performed to evaluate the effects of exposure to
TPTH during developmental periods of utmost importance for reproductive function.
Two independent experiments were performed. Experiment 1: Swiss Webster mice
were mated and the day on which copulation was confirmed by the presence of a
vaginal plug was designated as day ´0` of pregnancy. Pregnant mice were treated by
gavage with 0; 1.875; 3.75; 7.5 mg TPTH/kg body wt /day from day 6 of gestation to
day 21 of lactation. A vehicle-control group received corn oil only. The progeny was
examined at birth and subsequently until weaning. Mortality, weight gain and the day of
appearance of physical signs of postnatal development (ear unfolding, incisor eruption,
fur development, eye opening, testis descent and vaginal opening) were evaluated.
When the exposed offspring reached maturity (postnatal day 70) their reproductive
capacity was assessed. Weights of reproductive organs of the exposed offspring were
evaluated in adulthood. Furthermore, sexually mature male mice were assessed for their
daily sperm production, sperm counts and sperm morphology. TPTH did not alter
maternal weight gain during gestation and lactation. No difference between control and
treated groups was observed regarding viability of the offspring at birth and during
lactation. There was, however, a dose-related reduction of pup body weight in groups
treated with 1.875, 3.75 and 7.5mg TPTH /kg body wt at postnatal day 1 and an increase
of perinatal mortality in the group treated with 7.5mg TPTH/kg bw/day. Developmental
landmarks were unaffected and no adverse effect was noted in groups treated with the
two lowest doses of TPTH. The foregoing results therefore suggested that increased
perinatal mortality was the most evident toxic effect noted during prenatal and
lactational exposure to TPTH. Experiment 2: The effects of 0; 1.875; 3.75; 7.5 and 15
mg TPTH/kg body wt /day on male and female sexual development were investigated in
the second experiment. Swiss Webster pups were treated by gavage for 30 days
beginning on postnatal day 15. Mortality, weight gain and physical signs of postnatal
development (testis descent and vaginal opening) were evaluated. One half of each
group was killed postnatal day 46. Male and female sexual organs, thymus, spleen and
liver weights recorded. Furthermore, sexually mature male mice were assessed for their
daily sperm production, sperm counts, sperm transit time, sperm morphology,
testosterone levels and testicular histology. When exposed animals reached maturity
(postnatal day 65) their reproductive capacity was assessed (fertility test) and all
parameters previously described were evaluated. TPTH induced a dose-related increase
in the frequency of deaths with a high mortality in the group treated with 15 mg
TPTH/kg body wt /day. A dose-related delay in testis descent was observed in groups
treated with 3.75, 7.5 and 15 mg TPTH/kg body wt. A dose-related delay of vaginal
opening was observed as well, but only at the two highest dose levels evaluated.
Treatment with TPTH also reduced the absolute and relative weights of the reproductive
organs, when these parameters were evaluated at postnatal day 46. The reduction of
sperm counting [control group = 167±39 (x10
6
); 7.5mg/kg = 103±31 (x10
6
) and 15 =
30±9 (x10
6
)] and of daily sperm production [0 = 82±16 (x10
6
) and 15mg/kg = 45±14 e
(x10
6
)] was also caused by TPTH exposure. Our data indicated that peripubertal and
pubertal exposure to TPTH (7.5 and 15 mg TPTH/kg) impaired development and
altered gonadal function of male mice. Our data also suggested, however, that these
toxic effects were reversed as exposure was discontinued.
I. INTRODUÇÃO
O rápido desenvolvimento industrial ocorrido no século XX, principalmente,
após a Segunda Guerra Mundial, resultou no marcante crescimento da produção de
medicamentos, fibras sintéticas, pesticidas e compostos químicos industriais e também
na liberação dessas substâncias no meio ambiente. A produção de compostos orgânicos
sintéticos aumentou de menos de 450 mil toneladas em 1920 para mais de nove milhões
de toneladas em 1945 (Gallo, 1996; Thomas, 1996). A partir de 1960, a intensificação
da exploração agrícola conduziu ao aumento na produção e utilização de pesticidas no
combate a pragas da lavoura (Ecobichon, 1996). Apesar da sua importância na
agricultura, os resíduos de pesticidas encontrados nos alimentos, água e solo podem
oferecer riscos à saúde do homem e de outros organismos não alvo.
Alguns pesticidas e outras substâncias químicas sintéticas têm o potencial de
produzir alterações no sistema endócrino através da ligação a receptores específicos de
hormônios esteróides, e.g. estradiol, testosterona e progesterona, antagonizando ou
estimulando o sistema endócrino (Gaido et al., 1998; Kavlock et al., 1996). Essas
substâncias químicas são conhecidas como desreguladores endócrinos. Segundo
definição do EDSTAC (Endocrine Disrupter Screening and Testing Advisory
Committee, comitê constituído pela Agência de Proteção Ambiental americana – US
EPA), desreguladores endócrinos são substâncias exógenas que alteram funções
endócrinas e causam efeitos adversos no indivíduo, sua progênie e/ou (sub) populações
de organismos (Goldman et al., 2000).
Independentemente, dos eventuais efeitos dos contaminantes químicos
ambientais sobre o sistema endócrino, é de grande importância o estudo dos seus efeitos
sobre o desenvolvimento, o comportamento, a reprodução e a fertilidade (Neubert &
Chahoud, 1995). Existem evidências de que a exposição a determinadas substâncias
químicas contribui para o surgimento de distúrbios do sistema reprodutivo masculino e
feminino de animais, incluindo alterações estruturais e funcionais, tais como,
micropênias em crocodilos, reversão sexual em peixes e masculinização de caramujos
fêmeas (Gray, 1998; Baker, 2001). Também foram observados anormalidades do
sistema reprodutivo em seres humanos, entre elas, o aumento do número de casos de
2
criptorquidismo, hipospádia, abortos, redução da libido, prejuízos na produção
espermática, impotência e aumento na incidência de tumores de testículo, próstata e
mama (Sonnenschein & Soto, 1998; Baker, 2001; Toppari et al., 1996; Sultan et al.,
2001; Garry et al., 2002). Portanto, o estudo dos efeitos dos contaminantes ambientais
que interferem com funções reguladas pelo sistema endócrino e com sistema
reprodutivo é de grande interesse para a saúde pública.
I.1 Avaliação da toxicidade reprodutiva de xenobióticos
O impacto de xenobióticos sobre o sistema reprodutivo foi evidenciado pela
“Tragédia da Talidomida” na década de 60. Esse acontecimento levou a um aumento do
conhecimento da toxicidade de compostos químicos e medicamentos sobre o sistema
reprodutivo (Thomas, 1996). As agências regulatórias, por sua vez, tornaram mais
rigorosas as exigências quanto aos estudos de segurança e eficácia de novos
medicamentos, incluídos os estudos de toxicidade reprodutiva, e estenderam tais
exigências a outros produtos, tais como pesticidas, aditivos alimentares e substâncias
químicas em geral.
A Toxicologia Reprodutiva é uma das áreas mais complexas da Toxicologia
Preditiva, esta complexidade se deve em parte à própria natureza e duração do processo
reprodutivo. Entende-se por reprodução o processo biológico que assegura a
continuidade das espécies, possibilitando que o material genético existente seja passado
às gerações seguintes. Portanto, o ciclo reprodutivo não consiste apenas na concepção,
gravidez e nascimento, mas tem início com a produção de gametas nos pais (ainda no
período pré-natal do organismo parenteral), seguindo pela fertilização e
desenvolvimento embriofetal, nascimento e desenvolvimento pós-natal até a maturidade
sexual, quando o descendente adulto torna-se capaz de procriar (Figura 1
).
Os agentes químicos podem afetar o ciclo reprodutivo em qualquer das suas
diferentes fases. Um agente químico pode, por exemplo, impedir ou inibir
temporariamente a reprodução, pode ainda causar defeitos de desenvolvimento na prole
exposta e assim por diante. Desta forma os estudos de Toxicidade Reprodutiva têm que
ser igualmente abrangentes para que se possam detectar diferentes tipos de agravos nas
3
diferentes fases do ciclo reprodutivo. As diretrizes internacionais do FDA (US Food &
Drug Administration) e da ECC (European Economic Community), a princípio,
recomendam a realização do estudo de Toxicidade Reprodutiva em três segmentos.
No entanto, vários fatores, tais como o aumento do conhecimento do processo
reprodutivo básico e a crescente divergência nos desenhos de estudos empregados em
diferentes países, levou a publicação, recentemente, de novos protocolos aceitos
internacionalmente, que estão resumidos, no Quadro 1
. Essas diretrizes harmonizadas
são resultados da Conferência Internacional de Harmonização (ICH) de técnicas
necessárias para o registro de medicamentos de uso humano (Riecke & Stahlmann,
2002).
4
A reprodução nos mamíferos pode ser dividida em seis partes cada qual com um
grau de susceptibilidade aos diferentes efeitos adversos de medicamentos e químicos.
Portanto, devem ser estudadas por testes de toxicidade reprodutiva específicos.
Figura 1: O ciclo reprodutivo. (Riecke & Stahlmann, 2000)
A) Pré-acasalamento-
Concepção: Produção
e liberação dos
gametas
B) Concepção –
Implantação: Fertilização
e transporte do zigoto
C) Implantação –
Fechamento do
palato:
organogenese
D) Fechamento
do palato – Final
da gestação:
desenvolvimento
fetal
E) Nascimento -
Desmame:
Desenvolvimento pós-
natal
F) Desmame -
Maturidade
sexual: Maturaçã
o
sexual
Estudos específicos:
A) Pré-acasalamento até a concepção: avaliação das funções reprodutivas de adultos
machos e fêmeas, desenvolvimento e maturação dos gametas, comportamento no
acasalamento e fertilização.
B) Concepção até a implantação: avaliação das funções reprodutivas de adultos fêmeas,
desenvolvimento pré-implantação e implantação.
C) Implantação até o fechamento do palato: avaliação das funções reprodutivas de adultos
fêmeas, desenvolvimento embrionário e formação de órgãos principais.
D) Fechamento do palato até o final da gestação: avaliação das funções reprodutivas de
adultos fêmeas, crescimento e desenvolvimento fetal, e crescimento e desenvolvimento dos
órgãos.
E) Nascimento até o desmame: avaliação das funções reprodutivas de adultos fêmeas,
adaptação neonatal a vida extra-uterina, crescimento e desenvolvimento pré-desmame.
F) Desmame até a maturidade sexual: crescimento e desenvolvimento pós-desmame,
adaptação a vida independente, e alcance da função sexual completa.
5
Quadro 1: Resumo dos Protocolos Regulatórios in vivo para avaliação da
toxicidade reprodutiva e sobre o desenvolvimento.
Estudo Exposição Desfechos registrados Comentários
Segmento 1
Fertilidade e Desempenho
reprodutivo
Machos: 10 semanas
antes do acasalamento
Fêmeas: 2 semanas
antes do acasalamento
Desenvolvimento do gameta,
fertilidade, viabilidade pré- e
pós-implantação, nascimento
e lactação.
Avalia a capacidade reprodutiva
de machos e fêmeas após a
exposição por todo o ciclo
espermatogênico e oogênico
Segmento 2
Embriofeto-toxicidade
Da implantação ao
final da organogênese
Viabilidade e morfologia
(análise externa, visceral e
esquelética) do concepto
antes do nascimento.
Exposição curta para prevenir
adaptação do metabolismo
materno e fornece alta exposição
ao embrião durante período de
vulnerabilidade associado a
gastrulação e organogênese
Segmento 3
Desenvolvimento peri- e
pós-natal
Do último trimestre da
gestação até a lactação
Sobrevivência pós-natal,
crescimento e morfologias
externas.
Observa os efeitos sobre o
desenvolvimento dos principais
órgãos funcionais durante o
período peri-natal
ICH 4.1.1
Protocolo de fertilidade
Machos: 4 semanas
antes do acasalamento
Fêmeas: 2 semanas
antes do acasalamento
Machos: peso e histologia
dos órgãos reprodutivos,
motilidade e contagem dos
espermatozóides.
Fêmeas: viabilidade do
concepto na metade da
gravidez ou mais tarde
Avaliação dos desfechos
reprodutivos dos machos;
duração do tratamento é menor
do que no Segmento 1
ICH 4.1.2
Efeitos sobre o
desenvolvimento pré-
natal e pós-natal,
incluindo funções
maternas.
Da Implantação ao
final da lactação
Toxicidade relativa de
fêmeas grávidas vs não
grávidas; viabilidade pós-
natal, crescimento,
desenvolvimento, e déficits
funcionais (incluindo
comportamento, maturação e
reprodução).
Semelhante ao estudo de
Segmento 1
ICH 4.1.3
Efeitos sobre o
desenvolvimento
embriofetal
Da Implantação ao
final da organogênese
Viabilidade e morfologia dos
fetos (análise externa,
visceral e esquelética) antes
do nascimento.
Semelhante ao estudo de
Segmento 2, usualmente
conduzido em duas espécies
(roedor e não-roedor).
OECD 4.1.4
Estudo da toxicidade
sobre o desenvolvimento
pré-natal
Da Implantação (ou
acasalamento) até um
dia antes da cesárea
Viabilidade e morfologia dos
fetos (análise externa,
visceral e esquelética) antes
do nascimento.
Semelhante ao estudo de
Segmento 2, usualmente
conduzido em duas espécies
(roedor e não-roedor).
Fonte: Rogers & Kavlock, 2001.
6
I.2 Estanho
Estudos arqueológicos realizados no domínio interfluvial dos rios Tigre e
Eufrates, antiga Mesopotâmia, atual Iraque, revelaram que o uso do bronze remonta a
3.500 a 3.200 a.C. Reconhece-se, portanto, que o estanho foi um dos primeiros metais a
ser trabalhado pelo homem, inicialmente aplicado na forma de liga com o cobre
(bronze) para manufatura de armas e ferramentas, caracterizando um marco da evolução
tecnológica das civilizações, a denominada Idade do Bronze. A utilização do estanho
pelos povos do Oriente Médio em tempos tão remotos, deve-se, provavelmente, às
peculiaridades físicas e químicas do metal.
O estanho é um metal branco prateado, maleável, pouco dúctil, de baixo ponto
de fusão, altamente cristalino e insolúvel em água, que é usado para revestir latas de
alimentos, bebidas e aerossóis. O estanho pode ser combinado com outros químicos
formando vários compostos. Quando o estanho é combinado com o cloro, o enxofre, ou
o oxigênio, ele é chamado de composto inorgânico de estanho. Compostos inorgânicos
de estanho são encontrados em pequenas quantidades na crosta terrestre. Esses
compostos estão também presentes em cremes dentais, sabonetes, perfumes, aditivos
alimentares e corantes (ATSDR, 2005). O estanho também pode ser combinado com o
carbono para formar compostos orgânicos, que são usados na fabricação de plásticos,
embalagens de alimentos, tubos plásticos, pesticidas, aditivos de tintas e preservativos
de madeira. Em geral, compostos organoestanhosos são produzidos pelo homem e não
ocorrem naturalmente no ambiente.
I.3 Compostos organoestanhosos
O grupo dos compostos organoestanhosos inclui uma variedade de químicos
amplamente empregados na agricultura e na indústria em geral. A grande maioria destes
compostos tem origem antropogênica, com exceção do metil estanho, que pode também
ser produzido por biometilação ambiental. O primeiro registro de comercialização de
compostos organoestanhosos data de 1936, quando foram usados como estabilizadores
de polímeros sintéticos (Fent, 1996). Desde que sua propriedade biocida foi reconhecida
em 1950, observou-se um aumento considerável de sua aplicação, consumo e produção,
7
que cresceu de 5.000 t no ano de 1955 para cerca de 35.000 t no ano de 1985, que
naquele momento, representava aproximadamente 7% do consumo mundial total de
estanho por ano.
Os compostos diorganoestanhosos e monoorganoestanhosos são usados,
principalmente, como estabilizadores de policloreto de vinila (PVC) e catalisadores na
produção de poliuretanos, silicone e em outros processos industriais. Os compostos
triorganoestanhosos são utilizados como pesticidas de uso agrícola; como agentes
preservativos da madeira, algodão, papel, na indústria de vidros; e como aditivos de
tintas para uso náutico (efeito antiincrustante). Já os compostos tetraorganoestanhosos
são basicamente usados como estabilizadores de óleos e intermediários na produção dos
seus derivados (Fait et al., 1994). Dentre os diferentes grupos de compostos a base de
estanho, são os compostos triorganoestanhosos os mais estudados sob o ponto de vista
toxicológico (Guard et al., 1981).
Compostos tributil estanho (TBT) têm sua principal aplicação como agentes
biocidas. O TBT foi inicialmente proposto como bactericida (e.g. desinfetante de uso
hospitalar), e como moluscicidas no combate da Biomphalaria glabrata, hospedeiro
intermediário do Schistossoma mansoni nas áreas endêmicas (Cardarelli, 1977 e
Duncan, 1980). No entanto, após a descoberta de sua potente ação antiincrustante, a
adição de TBT em tintas para uso próprio em embarcações, redes de pesca, plataformas
para exploração de petróleo, bóias para auxílio à navegação e tubulações de usinas
nucleares, passou a representar a principal aplicação deste composto. A utilização de
tintas contendo acima de 20% de TBT em sua composição previne a adesão e o
crescimento de crustáceos, plâncton, bactérias, algas e outros organismos nos cascos de
embarcações, o que reduz o custo de manutenção com limpeza e o consumo excessivo
de combustível devido às incrustações biológicas (Boyer, 1989). A bioincrustação, além
de provocar graves danos nas estruturas submersas, causa prejuízos econômicos óbvios,
porque torna irregular e rugosa a superfície dos cascos aumentando o arrasto e
reduzindo a velocidade das navegações. Estima-se uma economia anual de dois bilhões
de dólares com o uso destes compostos (Champ, 1999).
O emprego de compostos tributil estanho em tintas de uso náutico faz com que
essa seja a principal via de entrada do TBT no ambiente aquático (WHO, 1980). Outra
8
possível via de entrada e distribuição dos compostos organoestanhosos no meio
ambiente ocorre através da aplicação agrícola de compostos trifenil estanho (TPT), o
que contamina o solo e os corpos de água. Apesar do TPT ser também usado como
agente antiincrustante em adição ao TBT, sua principal aplicação é agrícola, onde este é
usado como agente fungicida, sobretudo nas plantações de batata, beterraba, café e
arroz. Apesar das poucas estimativas alguns relatos demonstram que o consumo de TPT
como fungicida agrícola não é raro. Em países europeus, como e.g. a Holanda, o
consumo anual de trifenil acetato de estanho (TPTA) na safra de batata do ano de 1987
foi de 300 t, o que representa aproximadamente 8% do total de fungicidas utilizados
neste país (Fent, 1996).
A Figura 2 ilustra algumas outras vias importantes de entrada de compostos
organoestanhosos no meio ambiente. A contaminação com TBT pode decorrer da
lixiviação ou do próprio desgaste de produtos a base de PVC e outros inúmeros
produtos industriais revestidos e/ou protegidos por este composto, sobretudo os
compostos mono-butil de estanho e di-butil de estanho, que contaminam, via de regra,
os sistemas de tratamento de esgotos municipais. O descarte de produtos contendo
compostos organoestanhosos em aterros sanitários pode levar a contaminação do solo e
do lençol freático. Já em incineradores municipais, compostos organoestanhosos são
decompostos em óxido de estanho e em outros produtos de combustão, considerados de
toxicidade relativamente baixa.
Embora ocorra a emissão de compostos organoestanhosos no ar durante a
aplicação de pesticidas, ou a partir de superfícies revestidas com estes compostos, esta
forma de contaminação ambiental não é considerada de grande importância. Isto porque
TBT e TPT, além de apresentarem baixa pressão de vapor, são rapidamente
decompostos por fotodegradação (Fent, 1996).
9
1
2
3
4
6
Pesticidas
7
5
Antiincrustante
PVC
Catalisadores
Biocidas
1. MAR, LAGOS E BAÍAS
2. SISTEMA DE TRATAMENTO DE
ESGOTO
3. INCINERAÇÃO
4. ATERRO SANITÁRIO
5. AR
6. SOLO
7. LENÇOL FREÁTICO
Figura 2: Vias de entrada dos compostos organoestanhosos no ambiente
(Fent, 1996)
10
A contaminação mundial de peixes e outros organismos de origem marinha por
TBT e TPT é apreciável. Apesar de nas últimas décadas a adição de TBT em produtos
antiincrustantes ter sido mais abundante do que a adição de TPT, os níveis residuais
destes dois compostos em peixes e mariscos são comparáveis, havendo, entretanto
diferenças consideráveis quanto aos níveis residuais encontrados nas diferentes espécies
de peixes estudadas (WHO, 1999). Os níveis residuais são bem mais elevados em
peixes de cativeiro e naqueles encontrados em baías e em áreas costeiras, quando
comparados com peixes pelágicos. Apesar dos compostos TPT serem degradados por
defenilação seqüencial e serem excretados em forma conjugada, vários estudos têm
demonstrado que tais compostos sofrem bioacumulação ao longo da cadeia alimentar e
que a exposição humana pode ocorrer através da ingestão de frutos do mar
contaminados (WHO, 1999).
Desde que as tintas contendo TBT e TPT começaram a ser utilizada em larga
escala, no início da década de 1970, pensou-se que essa seria a solução para o antigo e
oneroso problema da bioincrustação. No entanto, já nessa época surgiram às primeiras
evidências de efeitos prejudiciais em muitas outras formas de vida marinha além dos
organismos incrustantes. Os primeiros apontamentos de problemas ambientais
decorrentes do uso de compostos a base de estanho foram registrados no final dos anos
1970, após a observação de um drástico declínio na produção de espécies
economicamente importantes na Baía de Arcachon, na França. A principal alteração
biológica atribuída ao amplo uso de compostos organoestanhosos foi à morte de ostras e
larvas de moluscos, além do aparecimento de órgão sexual masculino em gastrópodes
fêmeas (Fernandez et al., 2002). Esse último efeito, um fenômeno observado após
distúrbio hormonal induzido é denominado imposex, e altera a proporção sexual desses
organismos no meio ambiente. Compostos organoestanhosos são, por isso, considerados
desreguladores endócrinos em moluscos.
Diante do acidente ocorrido na Baía de Arcachon, a França foi o primeiro país a
regulamentar o uso de compostos organoetanhosos com aplicação antiincrustante, na
tentativa de reduzir as concentrações ambientais. Em 1982, a França baniu o uso de
tintas a base de estanho em embarcações com dimensões menores que 25 metros de
comprimento. Essa proibição foi, posteriormente, adotada por outros países, tais como
11
Inglaterra (1987), Estados Unidos (1988), Suécia e Nova Zelândia (1989), Austrália e
Japão (1990) e Dinamarca (1991). Alemanha, Áustria e Suíça impuseram também
restrições em ambientes de água doce (Champ, 1999). Recentemente, a Comissão de
Proteção Ambiental Marinha (CPAM) pertencente à Organização Internacional
Marítima (IMO) recomendou que no ano de 2008 ocorra a proibição global do uso de
compostos organoestanhosos em tintas de navios, além da suspensão de novas
aplicações em embarcações já a partir do ano de 2003 (Champ, 1999). Entretanto, é
importante que se ressalte, que no Brasil, bem como em outros países em
desenvolvimento, não existe legislação impondo restrições ou estabelecendo níveis
permissíveis desses compostos no meio ambiente.
I.4 Compostos Trifenílicos de Estanho
I.4.1 Identidade e propriedades físico-químicas
Compostos trifenil estanho (TPT) são derivados trifenílicos do estanho
tetravalente. Eles apresentam a fórmula geral (C
6
H
5
)
3
Sn-X, onde X é um ânion ou um
grupo aniônico, i.e. o cloro, o hidróxido ou o acetato.
Figura 3: Estrutura química geral de compostos trifenil estanho.
Sn
X
12
As propriedades físico-químicas do TPT dependem do ânion ligado ao estanho.
Em temperatura ambiente, com pH entre 3-8, o TPTA (trifenil acetato de estanho) e
TPTCl (trifenil cloreto de estanho) são rapidamente hidrolisados em TPTH. Como
conseqüência, os resultados de muitos estudos com TPTA e TPTCl são aplicados ao
TPTH. Esses compostos são lipofílicos e têm baixa solubilidade em água (WHO, 1999).
I.4.2 Transformação, distribuição e transporte no ambiente.
A degradação do TPT ocorre através de uma seqüência de defenilação resultante
da clivagem da ligação estanho-carbono através de mecanismos biológicos, químicos ou
térmicos e irradiação ultravioleta. A clivagem biológica e por irradiação ultravioleta são
consideradas os processos mais importantes. Fatores abióticos, tais como, temperatura
elevada, aumento da intensidade da luz solar, e condições aeróbicas parecem aumentar a
degradação de TPT no ambiente (WHO, 1999).
O TPTH é fortemente adsorvido pelo solo e sedimentos, portanto, a
contaminação de plantas, via raízes, é extremamente baixa. A persistência do TPTH
depende do tipo de solo e de seu pH. Em solo arenoso e sedimentado sua meia-vida foi
registrada como sendo cerca de 1 a 3 meses, já em solo inundado a meia-vida foi
estimada em 126 dias. Em água, a meia-vida estimada do TPT é de 2 a 3 semanas
(WHO, 1999).
I.4.3 Métodos analíticos
TPT e seus produtos de degradação podem ser analisados em alimentos e em
amostras ambientais ou de origem biológica a partir da utilização de uma variedade de
técnicas, dependendo do meio e da sensibilidade necessária para cada análise.
Normalmente, o processo tem início com a extração líquida ou adsorsão em
matrizes sólidas, seguidas por re-extração e/ou concentração (WHO, 1999). A
quantificação pode ser realizada utilizando-se espectrometria de absorção atômica,
13
cromatografia gasosa com detector fotométrico de chama, espectrometria de massa, ou
ainda cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detector ultravioleta ou de
fluorescência. Os limites de detecção destas técnicas situam-se na faixa de ng/litro para
amostras de água e <1 μg/kg para sedimento e amostras de origem biológica (WHO,
1999).
Estudos em roedores mostraram que o TBT e TPT são absorvidos no trato
gastro-intestinal, e que níveis de TPT e de seus metabólitos no fígado e nos rins são
maiores que os níveis no sangue e em outros tecidos (Ohhira e Matsui, 1996; Appel,
2004).
I.4.4 Fontes de exposição ambiental e humana
O TPTH apresenta potente ação algicida, fungicida e moluscicida. Como
descrito anteriormente, a adição deste composto em tintas próprias para uso em
embarcações impede a bioincrustação, o que promoveu seu amplo uso na década de
1970. Anos depois, observou-se que o TPTH apresenta potente ação tóxica para
organismos aquáticos não-alvo. Por ser extremamente tóxica à vida marinha, a produção
de TPTH foi banida em muitos países desenvolvidos, apesar das vantagens econômicas
que representava a aplicação de um agente biocida tão potente. Entretanto, o TPTH,
assim como outros compostos a base de estanho, ainda vêm sendo usados como
estabilizadores de PVC, em preservativos da madeira e na produção de pesticidas. O
TPTH é utilizado no Brasil como pesticida agrícola, com aplicação em lavouras e no
tratamento de sementes para plantio em culturas de amendoim, arroz, batata, cacau,
cenoura e feijão (ANVISA, 2006).
Além de representar risco ao ecossistema, principalmente, às populações
aquáticas não-alvo, estudos realizados em mamíferos demonstram que o TPTH pode
induzir uma variedade de alterações fisiológicas. Os efeitos induzidos pelo TPTH
incluem: marcante neurotoxicidade e imunotoxicidade, indução de apoptose em
timócitos, indução de hiperplasia/adenomas em órgãos endócrinos, e irritação ocular
(WHO, 1999). O TPTH apresenta toxicidade aguda moderada em roedores e não é
14
carcinogênico, entretanto, alguns dados sugerem uma possível ação co-clastogênica
(WHO, 1999).
Não existem dados disponíveis sobre exposição ocupacional ao TPTH. Os
poucos relatos de envenenamento que foram divulgados até hoje registram efeitos
neurotóxicos que, aparentemente, são persistentes (WHO, 1999).
Além da exposição ocupacional, a exposição humana pode se dar através da
ingestão de alimentos contaminados, sobretudo produtos agrícolas e frutos do mar. Em
países como Inglaterra, Alemanha e Estados Unidos, em que TPT tem freqüente
aplicação agrícola, os níveis de resíduos encontrados nos alimentos são periodicamente
monitorados pelos órgãos federais de vigilância sanitária (FAO, 1991a) e a ingestão
diária tolerável (IDT= 0-0,5µg/kg de peso corpóreo dia) estabelecida pelo JMPR (Joint
FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues) é criteriosamente obedecida. Um estudo
realizado no Japão forneceu uma estimativa de ingestão diária de 4,3 e 2,7µg (expresso
como TPTCl por 50Kg) em 1990 e 1997, respectivamente (Ueno et al., 1999; WHO,
1999). Um estudo similar finlandês estimou a ingestão diária de sete compostos
organoestanhosos, incluindo o TPT, como sendo 2,47 ng/kg de peso corporal
(Rantakokko et al., 2006). No Brasil, apesar de serem livremente comercializados, não
há dados disponíveis na literatura sobre a exposição humana ou ambiental a compostos
organoestanhosos.
I.4.5 Toxicidade aguda e sub-crônica
Após administração oral de TPTH, os sinais tóxicos observados em várias
espécies incluem anorexia, vômito, tremor, diarréia e ataxia. A DL
50
aproximada,
calculada após administração oral de TPTH é 160 mg/kg de peso corpóreo para ratos e
100-245 mg/kg de peso corpóreo para camundongos (WHO, 1999).
A avaliação da toxicidade sub-crônica oral do TPTH evidencia alguns sintomas
comuns em diferentes espécies estudadas, i.e. diminuição do nível sérico de
imunoglobulinas (Igs), redução do ganho de peso corpóreo e aumento do peso do
fígado, além da morte de camundongos, ratos e cães tratados com doses relativamente
15
baixas (WHO, 1999). Os efeitos induzidos em camundongos foram observados a partir
de 3,4mg TPTH/kg/dia. Tais efeitos foram igualmente observados em ratos tratados por
via oral com doses maiores que 0,30mg TPTH/kg/dia. Em estudos realizados em cães, o
NOAEL (No Observed Adverse Effect Level, ou nível máximo de dose em que não se
observa efeito adverso) foi estabelecido em 0,21mg TPTH/kg/dia. Desta forma,
podemos dizer que camundongos são aparentemente mais resistentes aos efeitos
deletérios induzidos pela exposição subcrônica ao TPTH.
I.4.6 Toxicidade crônica e carcinogenicidade
Os estudos de toxicidade crônica evidenciaram que o organismo feminino é mais
susceptível aos efeitos deletérios de compostos TPT (e.g. redução do peso corpóreo,
alteração de componentes do sistema imune e aumento da taxa de mortalidade). A maior
susceptibilidade feminina foi observada tanto em ratos como em camundongos (WHO,
1999).
Não existem evidências que o estanho e compostos estanhosos causem câncer
em humanos. Estudos em animais não demonstraram evidência de carcinogenicidade
para o estanho inorgânico (ATSDR, 2005). Observou-se aumento da incidência de
adenoma hepatocelular, em ambos os sexos, e da incidência de carcinoma hepatocelular
em fêmeas tratadas com TPTH. Um aumento da incidência de adenoma hipofisário foi
observado exclusivamente em fêmeas, enquanto este mesmo estudo revelou que em
doses maiores que 4,8 mg TPTH/kg/dia, aumentou a incidência de tumores de células
intersticiais do testículo (células de Leydig) em ratos machos (WHO, 1999).
Embora alguns tumores tenham surgido nestes estudos, não houve aumento
estatisticamente significativo entre os animais expostos. Além disso, estudos recentes
sugerem que a hiperplasia de células de Leydig é extremamente rara no homem, e que o
desenvolvimento de adenomas e alterações neoplásicas observados em ratos são
processos provocados por alterações hormonais específicas da fisiologia de roedores
que apresentam pouca, ou nenhuma, relevância sob o ponto de vista da
carcinogenicidade humana (WHO, 1999). Portanto, o Departamento de Saúde e Serviço
Humano (DHHS), a Agência internacional para Pesquisa do Câncer (IARC), e a
16
Agência de Proteção Ambiental Americana (U.S. EPA) não classificaram o estanho
metálico ou compostos inorgânicos de estanho como carcinogênico. A EPA determinou
que um organoestanhoso especifico, tributil óxido de estanho, não é classificado como
carcinogênico para humanos (ATSDR, 2005).
I.4.7 Genotoxicidade
Testes in vitro e in vivo de genotoxicidade, tal como, testes de mutagenicidade
da Salmonella (Teste de Ames), ensaios de aberrações cromossômicas, testes de
micronúcleos em camundongos, ensaio citogenético em células de ovários de hamster
chinês (CHO), teste dominante letal em ratos, entre outros, mostraram resultados
negativos, mesmo em altas doses. Porém, dados indicam que o TPT potencializa a
genotoxicidade de outras substâncias. Sasaki et al. (1993) identificaram que compostos
TPT potencializam a indução de aberrações cromossômicas pela mitomicina C em
cultura de células CHO quando tratados durante a fase G
2
. Da mesma forma, uma ação
co-clastogênica foi encontrada por Yamada et al. 1993, ao registrarem um aumento na
freqüência de micronúcleos induzida pela mitomicina C em reticulócitos periféricos de
camundongos tratados por via intraperitoneal com TPTCl, embora o TPTCl per se não
apresente ação clastogênica (WHO, 1999).
I.4.8 Imunotoxicidade
Efeitos sobre o sistema imune foram observados tanto em estudos de toxicidade
em longo prazo como em estudos em curto prazo. Como outros compostos
organoestanhosos, o TPTH mostrou propriedades imunossupressoras tais como,
promoção de linfopenia e diminuição dos pesos de órgãos imuno-relacionados, i.e.,
baço e timo, resultando em alterações nas respostas humoral e celulares em ratos,
camundongos e cobaias (WHO, 1999).
17
I.4.9 Neurotoxicidade
Após administração oral de TPT em roedores, observou-se aumento dos níveis
de estanho no tecido cerebral, e efeitos neurotoxicológicos, tais como, necrose neuronal
e deficiência de aprendizado no teste do labirinto (WHO, 1999). No entanto, o TPT
induz efeitos neurotóxicos relativamente brandos quando comparados com aqueles
induzidos após exposição a outros compostos a base de estanho, tais como trimetil e
trietil de estanho (ATSDR, 2005).
I.4.10 Toxicidade reprodutiva
Com relação à toxicidade reprodutiva e efeitos sobre o desenvolvimento pré-e
pós-natal induzidos por compostos organoestanhosos, pode-se dizer que, pelo menos até
o momento em que concluímos o levantamento bibliográfico desta tese, não existiam na
literatura dados disponíveis sobre os efeitos da exposição ao TPTH sobre o
desenvolvimento, a lactação, a pré-puberdade e a puberdade de camundongos. No
entanto, alguns estudos demonstram que os TPTs causam efeitos sobre a reprodução de
ratos, coelhos e hamster a partir de doses relativamente baixas, em geral, tóxicas
também para o organismo materno. Diminuição do número de sítios de implantações,
do número de fetos vivos, e do peso médio fetal ao nascimento, além de aumento do
número de reabsorções são alguns dos efeitos encontrados nestas espécies.
Apesar do estudo conduzido em ratas grávidas (Chernoff et al., 1990 e Rodwell,
1985, apud WHO, 1999) não demonstrar nenhuma alteração estrutural que sugerisse
efeito teratogênico do TPTH, avaliações conduzidas em hamster (Carlton & Howard,
1982 apud WHO, 1999) (Quadro 2) evidenciam um discreto aumento na incidência de
hidronefrose e hidrocefalia, em níveis de dose em que sinais de toxicidade materna já
eram evidentes. Além disso, estudo realizado com outro composto organoestanhoso, i.e.
o tributil óxido de estanho (TBTO), em fêmeas grávidas de camundongos, revelou um
aumento da incidência de fenda palatina, encurtamento da mandíbula e fusão dos ossos
exooccipital/basooccipital, sugerindo que o TBTO induz efeito teratogênico nesta
espécie (Faqi et al., 1997). Outro estudo descreveu que ratos expostos ao tributil de
18
estanho durante a gestação e lactação apresentaram problemas no desenvolvimento de
algumas características femininas. Não se sabe se o estanho e os compostos estanhosos
passam através do leite para os filhotes de animais. Porém, alguns organoestanhosos
podem atravessar a placenta e alcançar os fetos em animais (ATSDR, 2005).
Com relação aos efeitos embriofetotóxicos de compostos trifenílicos de estanho,
i.e. TPTH, TPTCl e TPTA, poucos são os estudos que tenham realizado uma avaliação
sistemática de seus potenciais teratogênicos. Em estudo conduzido por Ema et al (1997)
nenhuma malformação externa, interna ou de esqueleto foi registrada após exposição a
doses entre 3,1 e 25mg TPTCl/kg em ratas expostas durante o período precoce da
gestação (período pré-implantação). O TPTCl, no entanto, parece produzir efeito severo
antiimplantação, sobretudo quando administrado na fase mais precoce do processo de
blastogênese, i.e. entre os dias 0 e 3 de gestação. Em outra investigação, na qual ratas
foram tratadas oralmente com TPTCl por três dias consecutivos durante o período de
organogênese (entre os dias 7-9, ou dias 10-12, ou dias 13-15), Ema et al (1999) não
encontraram alterações morfológicas em decorrência à exposição ao TPTCl. Assim, não
há evidências conclusivas que sustentem a teratogenicidade do TPTCl.
A situação é a mesma para o TPTA. Há somente um artigo científico publicado a
respeito da toxicidade materna e do potencial embriofeto-tóxico do TPTA (Noda et al
1991a). Este estudo foi realizado em ratos e não evidenciou efeito teratogênico, nem
mesmo em níveis de dose tóxicos para mãe. Além dos registros citados acima, somente
um trabalho completo sobre a toxicidade reprodutiva do TPTH está disponível até o
momento (Chernoff et al., 1990), porém, assim como em Rodwell (1985, apud WHO,
1999) não foi observado efeito teratogênico do TPTH em ratos. Duas únicas exceções
são os estudos conduzidos recentemente em nosso laboratório (Viana, 2002 e Sarpa,
2007). Sarpa (2007), constatou que a exposição in utero ao TPTH durante todo o
processo de organogênese (do dia 6 ao dia 17 de gestação) induziu efeito teratogênico
em camundongos, causando o aumento de malformações severas, i.e. fenda palatina e
alterações morfológicas em órgãos sexuais, em níveis de dose não-tóxicos para o
organismo materno, apontando para uma certa seletividade dos efeitos adversos sobre o
desenvolvimento embrionário (Quadro 3).
19
Os artigos científicos sobre a toxicidade reprodutiva do TPTH são escassos,
apesar do interesse óbvio que tais estudos representam em termos de Saúde Pública.
Nos últimos anos, apenas algumas avaliações foram realizadas, a grande maioria delas
pela indústria química (Carlton & Howard 1982; Rodwell, 1987; Rodwell, 1985 e
Young, 1986; apud WHO, 1999). Estes dados estão compilados no Quadro 2. É
importante destacar, que nenhum destes estudos foi publicado em revistas científicas,
estando disponíveis somente em formato resumido em publicações da Organização
Mundial de Saúde (OMS), como no Concise International Chemical Assessment
Document 13 (WHO, 1999), tal qual reproduzidas no Quadro 2. Desta forma, apesar de
apresentar indícios de toxidade reprodutiva, esta forma de apresentação de resultados
não nos permite avaliar o verdadeiro grau de severidade das alterações funcionais e
morfológicas encontradas, nem tão pouco, descrevem detalhes sobre a metodologia e
métodos estatísticos empregados na interpretação final dos resultados.
20
Quadro 2: Estudos de toxicidade reprodutiva do TPTH
Espécie (cepa;N; sexo; dose) Desenho Experimental Efeitos Referência
Hamster grávidas (Syrian; 20-
25/grupo).
TPTH (0; 2,25; 5,08 e 12 mg/kg/dia, entubação gástrica)
do dia 5 ao dia 14 de gestação. Cesárea: dia 15. Desfechos
avaliados: toxicidade materna (sinais clínicos, ganho de
peso corpóreo, consumo de ração) e embriofeto-toxicidade
(corpo lúteo, reabsorções, peso fetal, alterações de
vísceras e esqueleto).
Três casos de hidronefrose na dose de 5,08
mg/kg e um caso de hidrocefalia na dose de
12 mg/kg. NOAEL<2,25 mg/kg.
Carlton & Howard,
1982
Coelhas grávidas (New Zeland
albino; 22/grupo).
TPTH (0; 0,1; 0,3 e 0,9 mg/kg/dia via entubação gástrica)
do dia 6 ao dia 18 de gestação. Cesárea: dia 29. Desfechos
avaliados: toxicidade materna (sinais clínicos, ganho de
peso corpóreo, consumo de ração) e embriofeto-toxicidade
(corpo lúteo, reabsorções, implantações, peso fetal,
alterações de vísceras e esqueleto).
O NOAEL para toxicidade materna foi de
0,1 mg/kg. NOAEL para embriofeto-
toxicidade foi de 0,3 mg/kg
Rodwell, 1987
Ratas grávidas (Sprague-Dawley;
45/grupo).
TPTH (0; 0,35; 1,0; 2,8 e 8,0 mg/kg/dia, na ração) do dia 6
ao dia 15 de gestação. Cesárea: dia 20. Desfechos
avaliados: toxicidade materna (sinais clínicos, ganho de
peso corpóreo, consumo de ração) e embriofeto-toxicidade
(corpo lúteo, número de fetos vivos e mortos, reabsorções,
implantações, peso fetal, alterações de vísceras e
esqueleto).
Não houve evidência de indução de efeitos
estruturais irreversíveis (teratogenicidade). O
NOAEL para a toxicidade materna foi de 1,0
mg/kg, e para embriofeto-toxicidade foi de
2,8 mg/kg.
Rodwell, 1985.
Ratos (Wistar; 30/sexo/grupo). Toxicidade reprodutiva – 2 gerações. TPTH (0; 0,4; 1,5 e
4,0 mg/kg/dia, na ração) durante o crescimento,
acasalamento, gestação e lactação. Desfechos avaliados:
sinais clínicos, ganho de peso corpóreo, consumo de
ração, fertilidade. Peso e análise morfológica dos órgãos
dos pais e filhotes. Número de filhotes vivos e mortos.
Mortalidade e redução, dose-relacionada, do
peso do timo e baço nos lactentes das
gerações F1 e F2, nas doses de 1,5 e 4,0
mg/kg. NOAEL: 0,4 mg/kg.
Young, 1986
WHO, 1999 (modificado)
21
Com relação aos efeitos de compostos organoestanhosos sobre o
desenvolvimento sexual de ratos, machos e fêmeas, expostos durante o período da
puberdade foram descritos, recentemente, por Grote et al. 2004 e Grote et al. 2006,
respectivamente. Nesses estudos, os efeitos induzidos por compostos organoestanhosos
são: diminuição do peso dos órgãos imuno-competentes, dos testículos, dos epidídimos,
da próstata e da vesícula seminal, diminuição dos níveis de testosterona e progesterona e
aumento nos níveis de estradiol. No entanto, os resultados desses estudos não fornecem
dados suficientes sobre marcos do desenvolvimento dos filhotes expostos in utero e
durante a lactação, fertilidade e sobre o desenvolvimento sexual dos machos e das
fêmeas, tais como, produção espermática diária, contagem de espermatozóides na cauda
do epidídimo, morfologia dos espermatozóides e histologia dos testículos, manutenção
do ciclo estral e histopatologia do timo, baço e fígado. Outro estudo publicado
recentemente encontrou uma redução da espermatogênese de camundongos adultos
expostos, através de injeção intraperitoneal, ao hidróxido de fentina (Reddy et al.,
2006), porém, foi um estudo de curta duração (3 dias) e a via usada não é a principal via
de exposição ao pesticida. Portanto, vários aspectos com relação aos efeitos trifenil
hidróxido de estanho sobre os órgãos reprodutivos de machos e fêmeas, e sobre a
fertilidade devem ser esclarecidos.
I.5 Relevância do Estudo
A constatação de que compostos organoestanhosos agridem fortemente o meio
ambiente ocorreu há mais de duas décadas. No entanto, as tentativas de substituição por
novos agentes antiincrustantes não se consumaram e os processos de regulamentação da
produção, consumo e utilização destes compostos, além de serem extremamente lentos,
diferem fortemente entre as diferentes nações.
Enquanto a maioria dos países europeus e os Estados Unidos baniram o uso de
tintas antiincrustantes a base de estanho em embarcações de pequeno porte ainda na
década de 1980, no Brasil e na grande maioria de países em desenvolvimento não existe
legislação impondo restrições ou estabelecendo níveis permissíveis destes compostos no
meio ambiente.
22
Como resultado da restrição de uso de compostos organoestanhosos como
agentes antiincrustante em alguns países, a aplicação do TBT e TPT tornou-se menor na
década de 1990. No entanto, é importante ressaltar que os compostos organoestanhosos
permanecem no ambiente aquático devido ao seu amplo uso em embarcações de grande
porte e em estruturas de auxílio a embarcações e ao acúmulo na cadeia biológica. Além
disso, a falta de controle da produção, aplicação e monitoramento dos níveis de
contaminação humana e ambiental em países em desenvolvimento contribuem para a
permanência destes compostos em nosso meio.
Como se trata de um produto de uso agrícola (ANVISA, 2006), a preocupação
com a exposição ocupacional deve prevalecer, sobretudo em países como o nosso, em
que o consumo de pesticidas tem crescido rapidamente, mas na maioria dos casos, não
existe controle eficaz sobre a venda destes produtos, não há monitoramento da
exposição ocupacional, os diagnósticos dos casos de intoxicação são falhos e os
equipamentos de proteção individual não são utilizados rotineiramente (Delgado &
Paumgartten 2004 e Forget, 1991). Além disso, as decisões regulatórias em países em
desenvolvimento baseiam-se em estimativas de risco realizadas para cenários de
exposição de países desenvolvidos, que obviamente não levam em consideração tais
peculiaridades do nosso meio.
Desta forma, podemos dizer que a resposta à questão levantada neste estudo é
importante em termos de uma possível reavaliação de risco do TPTH, sobretudo em
países como o nosso, em que compostos organoestanhosos são livremente
comercializados, sem que, no entanto, haja dados disponíveis sobre contaminação
humana ou ambiental. As informações obtidas neste estudo poderão subsidiar a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) com dados que permitam a implementação
de medidas de proteção da população exposta e na definição de uma legislação, que
imponha restrições ou estabeleça níveis permissíveis desses compostos no meio
ambiente.
23
II. OBJETIVOS
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da exposição pré e pós-natal ao
TPTH sobre o desenvolvimento, maturação sexual e fertilidade de camundongos. O
estudo foi dividido em duas etapas, a saber:
II.1 Avaliação dos efeitos adversos resultantes da exposição ao TPTH in utero (a
partir do dia 6 de gestação) e durante a lactação sobre o desenvolvimento pós-natal da
prole (Experimento 1), cujos objetivos específicos foram avaliar possíveis efeitos
adversos sobre:
9 gestação e ganho de peso materno;
9 ganho de peso corporal dos filhotes;
9 marcos físicos do desenvolvimento [aparecimento de pêlos (AP), descolamento
de orelhas (DO), erupção de incisivos (EI), abertura de olhos (AO), descida de
testículo (DT) e abertura de vagina (AV)];
9 fertilidade;
9 peso dos órgãos imuno-competentes (timo, baço e fígado) e dos órgãos
reprodutivos (testículos, epidídimos, vesícula seminal, útero e ovários);
9 produção espermática diária, número de espermatozóides na cauda do epidídimo
e tempo de trânsito espermático;
9 morfologia dos espermatozóides.
II.2 Avaliação dos efeitos adversos do TPTH sobre a reprodução de
camundongos (machos e fêmeas) após exposição durante a pré-puberdade e puberdade,
i.e. do dia 15 PN ao dia 45PN (Experimento 2), cujos objetivos específicos foram
avaliar possíveis efeitos adversos sobre:
9 ganho de peso corporal;
9 marcos físicos do desenvolvimento (descida de testículo e abertura de vagina);
9 ciclo estral;
9 fertilidade;
24
9 peso dos órgãos imuno-competentes (timo, baço e fígado) e reprodutivos
(testículos, epidídimos, vesícula seminal, útero e ovários);
9 produção espermática diária, número de espermatozóides na cauda do epidídimo
e tempo de trânsito espermático;
9 concentração hormonal (testosterona);
9 morfologia dos espermatozóides;
9 histologia testicular.
25
III. METODOLOGIA
III.1 Experimento 1
III.1.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss Webster, machos e fêmeas, com idade
entre 50 e 60 dias, fornecidos pelo Centro de Criação de Animais de Laboratório da
Fundação Oswaldo Cruz (CECAL-FIOCRUZ). Os animais foram alojados em gaiolas
de plástico com tampa de aço inoxidável (33,5 x 40,5 x 17,0 cm) e cama de maravalha
de pinho branco e aclimatados durante os 10 dias que antecederam o início do
experimento. Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética em Uso de Animais da
FIOCRUZ (processo nº 0077-01), e todos os procedimentos que envolveram a
manipulação animal foram realizados com base nas normas desta comissão. O
experimento 1 foi realizado no Setor de Animais de Laboratório do INCQS – Fiocruz.
Os animais receberam água e ração comercial para ratos (Nuvilab® - Nuvital
Ltda., Curitiba, Paraná) ad libitum. Todos os animais foram mantidos sobre as seguintes
condições ambientais: temperatura (23 ± 2ºC), umidade relativa do ar (cerca de 70%) e
ciclo claro-escuro constante (período claro de 8 às 20 horas). As trocas das camas de
maravalha e água foram feitas três vezes por semana, e a ração foi substituída
semanalmente. A seguir o desenho esquemático do experimento 1 (Figura 4
).
26
Figura 4: Desenho esquemático do experimento 1 (AP: aparecimento dos pêlos; EI: erupção dos incisivos; AO: abertura dos olhos; DO: descolamento das orelhas; DT:
descida dos testículos e AV: abertura da vagina).
Tratamento: gestação e lactação
Dia 1PN
Nascimento
espontâneo
Dia 21PN
desmame
Observação dos parâmetros:
AP, EI, AO, DO, DT e peso
corporal
Observação dos
parâmetros AV e peso
corporal
Dia 40
PN
Acasalamento
(8 dias)
Dia 0
“plug”
Dia 6 de
gestação
Dia 18 de
gestação
Dia 17
Inspeção das
gaiolas às 8 e 17h
Dia 65
PN
Início do Teste de
Fertilidade
(dia 70 PN)
Sacrifício dos
animais que não
participaram do
teste de fertilidade
(dia 80-90 PN)
Fim do Teste de
Fertilidade
(dia 85 PN)
Animais (♂ e ♀):
- peso corporal e dos órgãos sexuais e imuno-
competentes
- produção espermática e contagem de
espermatozóides (sptz)
- morfologia dos sptz
Nascimento espontâneo:
- peso corporal
- peso dos fetos
- nº filhotes vivos e perdas
gestacionais e neonatais
27
III.1.2 Acasalamento
O acasalamento dos animais ocorreu segundo o procedimento proposto por
Chahoud & Kwasigroch (1977). Duas fêmeas foram transferidas para a gaiola de um
macho durante as duas últimas horas do período escuro (6 às 8 horas da manhã). Em
seguida as fêmeas foram retiradas e examinadas para a verificação da ocorrência do
cruzamento. O cruzamento foi confirmado pela presença do “plug” (massa
esbranquiçada de espermatozóides) na abertura vaginal. As primeiras 24 horas após a
confirmação do cruzamento foram consideradas como dia ´0` de gravidez.
III.1.3 Doses e Tratamento
Após a confirmação do cruzamento as fêmeas foram pesadas (dia zero), alojadas
em gaiolas individuais e incluídas aleatoriamente a um dos seguintes grupos
experimentais:
Grupo Experimental Nº de fêmeas grávidas
Não tratado N = 12
Controle (óleo de canola) N = 18
1,875mg TPTH/kg de peso corporal N = 17
3,75mg TPTH/kg de peso corporal N = 18
7,50mg TPTH/kg de peso corporal N = 18
O trifenil hidróxido de estanho (TPTH; Aldrich - Inc) foi diluído em óleo de
canola (Mazola®) e administrado por via oral (entubação gástrica) do dia 6 de gestação
ao dia 21 de lactação. Dois grupos controle, um tratado apenas com o veículo (óleo de
canola) e outro não-tratado, foram constituídos. As doses foram selecionadas baseadas
em estudos anteriores (Viana, 2002 e Sarpa, 2003). As diluições foram feitas de modo a
obter um volume de solução de 10 ml/kg de peso corporal. O tratamento foi realizado
sempre na parte da manhã (8 às 12 horas). Os animais foram pesados diariamente
durante todo o período de gestação e lactação.
28
III.1.4 Acompanhamento pré- e peri- natal
O peso corporal das fêmeas grávidas foi registrado no dia ´0` de gestação e
diariamente do dia 6 de gestação ao dia 21 pós-natal (desmame). Os animais foram
observados quanto a alterações clínicas e comportamentais sugestivas de toxicidade
materna, tais como, perda de pêlo, hipoatividade, piloereção e redução do consumo de
ração.
A partir do dia 18 de gestação as gaiolas foram inspecionadas duas vezes ao dia,
sempre às 8 horas e às 17 horas, para verificação do nascimento dos filhotes. Para
obtenção dos dados da gravidez foram registrados os números de filhotes nascidos vivos
e de natimortos. As fêmeas que não deram à luz até o dia 22 gestação e aquelas que,
após terem dado à luz, canibalizaram toda a ninhada foram pesadas e sacrificadas por
inalação de CO
2
. As cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisão
longitudinal e o útero, o fígado, o baço e o timo de cada animal foram examinados. Os
pesos do fígado, baço e timo foram registrados. As paredes uterinas foram seccionadas e
seu conteúdo foi examinado. Após os conteúdos dos úteros terem sido examinados, os
sítios de implantação foram identificados pelo método descrito por Salewisk (1964). O
útero foi imerso em solução de sulfeto de amônio a 10% (Merck®), por 10 minutos. Em
seguida, o útero foi lavado em água corrente e mergulhado por mais 10 minutos em uma
solução formada por partes iguais de ferrocianeto de potássio a 20% e ácido clorídrico a
1% (Merck®). Após a coloração, os sítios de implantação, que aparecem como pontos
escuros na parede uterina, foram localizados e contados.
III.1.5 Acompanhamento pós-natal
Após a verificação do nascimento, os filhotes foram identificados
individualmente, através de injeção subcutânea de nanquim preto na pata. Os seguintes
parâmetros foram registrados: peso individual, número de filhotes nascidos vivos e
número de natimortos. Durante a avaliação destes parâmetros, que durou em média 5
minutos para cada ninhada, os filhotes foram mantidos afastados da mãe, sob condições
controladas de temperatura.
29
O dia da verificação do nascimento foi considerado dia 1 pós-natal (Dia 1 PN).
Do dia 1 PN até o final do período de lactação (dia 21 PN), cada filhote foi examinado
diariamente para avaliação do aparecimento de marcos físicos do desenvolvimento (i.e.
abertura dos olhos, aparecimento de pêlo, descolamento das orelhas e erupção dos
incisivos e descida dos testículos). Todos os filhotes nascidos durante o experimento
foram individualmente pesados nos dias 5, 10, 15, 20 e 25 PN e o peso destes animais,
assim como as mortes ocorridas durante o período de lactação, foram registrados.
No dia do desmame, dia 21 PN, os filhotes foram separados de suas mães.
Cada mãe foi então pesada e morta por inalação de CO
2
. As cavidades abdominais
foram abertas por uma ampla incisão longitudinal para avaliação de alterações
macroscópicas. O útero, timo, fígado e baço foram retirados e seus pesos registrados. Os
sítios de implantação presentes no útero foram identificados pelo método descrito por
Salewisk (1964). Os filhotes foram separados por sexo e alojados em gaiolas contendo
um número máximo de 05 animais. A avaliação e o registro do dia da abertura completa
do canal vaginal foram realizados após o desmame.
III.1.6 Teste da Fertilidade
Quando os filhotes expostos in utero e durante a lactação alcançaram a idade de
cerca de 70 dias, teve início o teste da fertilidade. Um macho e três fêmeas provenientes
de diferentes ninhadas e do mesmo grupo experimental foram selecionados
aleatoriamente e alojados juntos durante 15 dias. Ao final do período de acasalamento
as fêmeas foram alojadas em gaiolas individuais, que foram inspecionadas duas vezes
ao dia para verificação do nascimento dos filhotes. No dia 1 pós-natal o número de
filhotes vivos por ninhada foi registrado, as mães foram sacrificadas por inalação de
CO
2
e o número de sítios de implantação foi determinado pelo método descrito por
Salewisk (Salewisk, 1964). As fêmeas que não deram à luz até o 22º dia após o início
do período de acasalamento foram submetidas a um segundo acasalamento similar ao
primeiro, porém foram utilizados machos não tratados. Por outro lado, machos que não
acasalaram com pelo menos duas fêmeas, foram submetidos a um segundo período de
acasalamento de 15 dias com três fêmeas não tratadas.
III.1.7 Fêmeas na idade adulta
30
As fêmeas expostas in utero e durante a lactação que não participaram do teste
de fertilidade foram pesadas e sacrificadas por inalação de CO
2
entre os dias 80 e 90 de
vida. As cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisão longitudinal e o
útero, os ovários, o fígado e o baço de cada animal foram examinados, pesados e
fixados para posterior análise histopatológica.
III.1.8 Machos na idade adulta
Ao alcançarem cerca de 90 dias de idade, os machos que não participaram do
teste de fertilidade foram pesados e sacrificados por inalação de CO
2
. As cavidades
abdominais foram abertas por uma ampla incisão longitudinal e testículos, epidídimos,
vesícula seminal, fígado e baço foram retirados, examinados e pesados. O peso da
vesícula seminal foi obtido após a retirada do líquido seminal por perfuração e
raspagem. Os testículos, epidídimos, fígado, baço e timo foram fixados para posterior
análise histopatológica. Os animais foram avaliados quanto à contagem de espermátides
e espermatozóides nos testículos e na cauda do epidídimo, respectivamente, e
morfologia dos espermatozóides.
III.1.8.1 Número de espermatozóides e espermátides
Depois de pesados, os testículos e os epidídimos foram separados para
determinação da produção espermática diária e da quantidade de espermatozóides,
respectivamente. Os testículos tiveram a túnica albugínea removida e foram colocados
separadamente em 1 ml de uma solução salina (cloreto de sódio 0,9%) contendo 0,5%
de Triton X-100 (Sigma®) para homogeneização. O material foi processado em
homegeneizador manual de tecidos. Então, 100µl do homogeneizado foram diluídos em
900µl de solução salina (diluição 1:10), do qual uma alíquota (10µl) foi colocada em
câmara de Neubauer para contagem do número de espermátides resistentes à
homogeneização (adaptado de Dalsenter et al., 1997).
A contagem foi feita por microscopia ótica (Zeiss SV11, Alemanha - aumento
400x) contando-se as células presentes em quatro dos doze retículos maiores da câmara
de Neubauer. O valor médio contado foi multiplicado pelo volume de diluição (100) e
31
dividido pelo volume da câmara de contagem (0,0001). O número de espermátides por
animal foi obtido pela soma das contagens do testículo direito e esquerdo. Para
estabelecer a produção espermática diária, o número de espermátides por grama de
testículo de cada animal foi dividido por 4,84. A determinação deste divisor de tempo
está baseada nos tipos celulares resistentes à homogeneização (espermátides 14-16) que
estão presentes nos estágios II-VIII do ciclo do epitélio seminífero (Figura 5) (Parker,
2006). A série completa das associações celulares é conhecida como ciclo do epitélio
seminífero, sendo que sua duração, isto é, o intervalo necessário para que todos os
estágios apareçam em um ponto do túbulo seminífero é uniforme em cada espécie
(Amann, 1982). No camundongo, as associações celulares abrangem 12 estágios
diferentes. O ciclo espermatogênico do camundongo está ilustrado na Figura 5.
Para contagem do número de espermatozóides, depois de registrado o peso dos
epidídimos, a cauda foi separada do corpo-cabeça, cortada em pequenos pedaços e
colocada em 1ml de solução salina (NaCl 0,9%) contendo 0,5% de Triton X-100
(Sigma®). Os epidídimos direito e esquerdo foram processados em homegeneizador
manual de tecidos. Então, 50µl do homogeneizado foram diluídos em 950µl de solução
salina (diluição 1:20), e uma alíquota (10µl) foi colocada em câmara de Neubauer
(adaptado de Dalsenter et al., 1997). Como descrito para as espermátides, a contagem
dos espermatozóides por cauda de epidídimos foi feita por microscopia ótica, contando-
se as células presentes em quatro dos doze retículos maiores da câmara de Neubauer. O
valor médio contado foi multiplicado pelo volume de diluição (200) e dividido pelo
volume da câmara de contagem (0,0001) (Parker, 2006). O tempo de trânsito
espermático na cauda do epidídimo foi obtido através da divisão do número de
espermatozóides pela produção espermática diária (Amann, 1986).
Este processo está baseado no fato de que no final da espermatogênese os
núcleos dos espermatozóides e das espermátides alongadas se tornam altamente
condensadas e entrelaçadas, conseqüentemente o núcleo dos espermatozóides e das
espermátides são resistentes à homogeneização, enquanto os núcleos das outras células
germinativas e das células somáticas são destruídos (Amann, 1982).
III.1.8.2 Morfologia espermática
32
Para avaliar o percentual de espermatozóides morfologicamente anormais
(defeitos na cabeça ou pedaço da cauda), uma suspensão de espermatozóides foi obtida
através da lavagem da luz do ducto deferente com 0,3 ml de cloreto de sódio 0,9%. A
lâmina foi preparada com uma alíquota dessa suspensão, secou a temperatura ambiente
durante 24h e foi corada com vermelho congo e violeta de genciana (adaptado de
Andrade et al., 2002). A análise das lâminas, para avaliação de defeitos encontrados na
cabeça, corpo e cauda dos espermatozóides encontra-se em andamento.
Figura 5: Estágios do ciclo espermatogênico de camundongos (Zenick et al, 1994).
33
III.1.9 Análise estatística
Para as variáveis que apresentam distribuição normal (paramétricas) os
resultados foram comparados empregando a análise de variância de uma via (ANOVA).
As diferenças entre os grupos foram determinadas pelos testes de Tukey e de
Bonferroni. Para as variáveis que não obedeçam a distribuição normal, os resultados
foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis seguido do teste U de Mann-Whitney
para determinar as diferenças entre dois grupos. As proporções foram analisadas pelo
teste qui-quadrado.
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, exceto na Tabela 7
[mediana (mínimo e máximo)]. O nível de significância estatística foi de 5% (p<0,05).
Os cálculos estatísticos foram realizados por meio do programa SPSS® 12.0.
III.2 Experimento 2
III.2.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss Webster, fêmeas grávidas, com idade
entre 50 e 60 dias, fornecidos pelo Centro de Criação de Animais de Laboratório da
Fundação Oswaldo Cruz (CECAL-FIOCRUZ). Os animais foram alojados em gaiolas
de plástico com tampa de aço inoxidável (33,5 x 40,5 x 17,0 cm) e cama de maravalha
de pinho branco. Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética em Uso de Animais
da FIOCRUZ (processo nº P 0077-01), e todos os procedimentos que envolveram a
manipulação animal foram realizados com base nas normas desta comissão. O
experimento 2 foi realizado no Laboratório de Toxicologia Ambiental da ENSP –
Fiocruz.
Os animais receberam água e ração comercial para ratos (Nuvilab® - Nuvital
Ltda., Curitiba, Paraná) ad libitum. Todos os animais foram mantidos no biotério, com
os seguintes controles ambientais: temperatura (23 ± 2ºC), umidade relativa do ar (cerca
de 70%) e ciclo claro-escuro constante (período claro de 8 às 20 horas). As trocas das
34
camas de maravalha e água foram feitas três vezes por semana e a ração foi substituída
semanalmente.
35
Figura 6: Desenho do experimento 2 (DT: descida dos testículos; AV: abertura da vagina; TF: teste de fertilidade; PN: pós-natal)
Fêmeas
grávidas
Nascimento
espontâneo
1 PN 15 PN 20 PN 45 PN
Avaliação dos parâmetros: DT e AV
Tratamento (n=27 ♀ e 27 ♂)
Ciclo estral
½ dos animais ♂ e ♀: 46PN
- peso corporal e dos órgãos
sexuais, timo, baço e fígado
- nível de testosterona
- produção espermática e contagem
de espermatozóides (sptz)
- morfologia dos sptz
- histologia testicular
½ ♂ e ♀: 65PN Teste de Fertilidade
♂ mortos 10 dias após o TF:
- peso corporal, dos órgãos
sexuais, timo, baço e fígado
- nível de testosterona
- produção espermática e
contagem de espermatozóides
- morfologia dos sptz
- histologia testicular
Cesárea ♀ do TF
-peso órgãos
-nº fetos e
reabsorções
36
III.2.2 Doses e Tratamento
Após a verificação do nascimento, somente cinco filhotes machos e cinco
fêmeas, de cada ninhada, permaneceram no estudo para compor os cinco grupos (Figura
7). No dia 15 pós-natal os filhotes, machos e fêmeas, provenientes da mesma ninhada,
foram incluídos aleatoriamente a um dos seguintes grupos experimentais:
Grupo Experimental Fêmeas Machos
Controle (óleo de milho) 23 26
1,875 mg TPTH/kg de peso corporal 22 26
3,75 mg TPTH/kg de peso corporal 21 24
7,50 mg TPTH/kg de peso corporal 27 27
15 mg TPTH/kg de peso corporal 21 26
O trifenil hidróxido de estanho (Aldrich, Inc) foi diluído em óleo de milho grau
farmacêutico (Sigma®) e administrado por via oral (entubação gástrica) do dia 15 ao
dia 45 pós-natal, nas doses de 1,875; 3,75; 7,5 e 15mg TPTH/kg de peso corporal. As
doses foram selecionadas baseadas em estudos anteriores (Viana, 2002 e Sarpa, 2003).
As diluições foram feitas de modo a obter um volume de solução de 10 ml/kg de peso
corporal. Um grupo controle, tratado apenas com o veículo (óleo de milho), foi
constituído. O tratamento foi realizado sempre na parte da manhã (8 às 12 horas). Os
animais foram pesados diariamente durante todo o período de tratamento. No dia do
desmame, i.e. dia 21 pós-natal, os filhotes foram separados de sua mãe, divididos por
sexo e alojados em gaiolas contendo um número máximo de 05 animais.
Figura 7: Grupos formados para tratamento
Mãe 1
♀
1: óleo
♀
2: 1,875m
g
♀
3: 3,75m
g
♀
4: 7,5m
g
♀
5: 15m
g
♂1: óleo
♂2: 1,875m
g
♂3: 3,75m
g
♂4: 7,5m
g
♂5: 15m
g
37
III.2.3 Toxicidade geral
Para avaliar a toxicidade geral induzida pelo TPTH, os animais foram pesados
diariamente durante todo o período de tratamento e monitorados quanto à mortalidade e
alterações clínicas e comportamentais, tais como, perda de pêlo, hipoatividade e redução
do consumo de ração.
III.2.4 Acompanhamento pós-natal
Durante a lactação, i.e. a partir do dia 15 pós-natal, os filhotes machos foram
avaliados diariamente para determinar o dia da descida dos testículos através da
palpação da bolsa escrotal. As fêmeas foram examinadas diariamente, a partir do dia 20
pós-natal, para o registro do dia em que houve completa abertura do canal vaginal. A
partir do dia que foi registrado a abertura do canal vaginal, o ciclo estral das fêmeas foi
monitorado pela observação das mudanças citológicas do esfregaço vaginal durante,
pelo menos, três ciclos completos. O esfregaço foi realizado com auxílio de uma
micropipeta, através da lavagem vaginal com 50 μl de água destilada e posterior
avaliação, a fresco, dos tipos celulares do epitélio vaginal em microscopia óptica (Zeiss
SV11, Alemanha - aumento de 200x). A avaliação do esfregaço vaginal foi baseada nos
seguintes critérios citológicos que caracterizam o estágio do ciclo estral: predominância
de células epiteliais nucleadas (proestro); predominância de células epiteliais
cornificadas (estro); presença de células epiteliais cornificadas e/ou leucócitos
(metaestro); presença abundante de leucócitos (diestro) (Chahoud & Kwasigroch, 1977;
U.S. EPA, 1996). O monitoramento do ciclo estral foi realizado somente na metade das
fêmeas, i.e. das fêmeas que participaram do teste de fertilidade. O lavado vaginal para o
preparo da lâmina foi realizado no dia em que foi observada a completa abertura da
vagina até o dia 65 pós-natal.
III.2.5 Fim do tratamento (45 PN)
38
A metade dos animais (machos e fêmeas) expostos ao TPTH do dia 15 ao 45
pós-natal foi morta no dia seguinte ao fim do tratamento (Figura 6) e avaliada quanto ao
peso corporal e dos órgãos, número de espermátides e espermatozóides, morfologia
espermática, histologia testicular e níveis de testosterona.
III.2.5.1 Peso corporal e dos órgãos reprodutivos, fígado, baço e timo das
fêmeas
Para verificar os possíveis efeitos imediatos da exposição ao TPTH durante a
puberdade, após o período de tratamento, metade das fêmeas foi escolhida
aleatoriamente e sacrificada por deslocamento cervical. Os pesos do fígado, baço e timo
foram registrados, bem como, o peso dos seus órgãos reprodutivos, útero e ovários.
Após serem pesados os órgãos foram fixados em Millonig de Carlson (100 ml formol a
40%; 900 ml água destilada; 18,6g fosfato monobásico de sódio; 4,2g hidróxido de
sódio) para posterior análise histopatológica. Antes de serem sacrificadas, as fêmeas que
estavam no estro foram anestesiadas com éter etílico e tiveram o sangue do plexo orbital
coletado para posterior determinação da concentração de estradiol e progesterona.
III.2.5.2 Peso corporal e dos órgãos reprodutivos, fígado, baço e timo dos
machos
A partir do dia 46 pós-natal, os filhotes machos foram pesados e anestesiados
com éter etílico. Amostras de sangue foram coletadas do plexo orbital, e os animais
foram mortos por deslocamento cervical. Os testículos, epidídimos e a vesícula seminal
foram removidos e pesados. A vesícula seminal foi pesada após a retirada do líquido
seminal por perfuração e raspagem. O fígado, o baço e timo também foram pesados e
fixados para posterior análise histopatológica. Os animais foram avaliados quanto à
produção espermática diária, contagem de espermatozóides na cauda do epidídimo,
concentração de testosterona sanguínea, morfologia dos espermatozóides e histologia
testicular.
III.2.5.3 Número de espermátides e espermatozóides
39
Depois de pesados, os testículos e os epidídimos foram separados para
determinação da produção espermática diária e da quantidade de espermatozóides,
respectivamente. Os testículos (direito) tiveram a túnica albugínea removida e foram
colocados em 1 ml de uma solução salina (cloreto de sódio 0,9%) contendo 0,5% de
Triton X-100 para homogeneização. O material foi processado em homegeneizador
manual de tecidos. Então, 100µl do homogeneizado foram diluídos em 900µl de solução
salina (diluição 1:10), do qual uma alíquota (10µl) foi colocada em câmara de Neubauer
para contagem do número de espermátides resistentes à homogeneização (adaptado de
Dalsenter et al., 1997).
A contagem foi feita por microscopia ótica (Zeiss SV11, Alemanha - aumento
400x) contando-se as células presentes em quatro dos doze retículos maiores da câmara
de Neubauer. O valor médio contado foi multiplicado pelo volume de diluição (100) e
dividido pelo volume da câmara de contagem (0,0001). Nos animais em que um dos
testículos foi utilizado para a histologia testicular, o número de espermátides contadas
foi multiplicado por dois para estimar o número de espermátides por animal. Para
estabelecer a produção espermática diária, o número de espermátides por grama de
testículo de cada animal foi dividido por 4,84.
Para contagem do número de espermatozóides, depois de registrado o peso dos
epidídimos, a cauda foi separada do corpo-cabeça, cortada em pequenos pedaços e
colocada em 1mL de solução salina (NaCl 0,9%) contendo 0,5% de Triton X-100. Os
epidídimos direito e esquerdo foram processados em homegeneizador manual de
tecidos. Então, 50µl do homogeneizado foram diluídos em 950µl de solução salina
(diluição 1:20), e uma alíquota (10µl) foi colocada em câmara de Neubauer (adaptado
de Dalsenter et al, 1997). Como descrito para as espermátides, a contagem dos
espermatozóides por cauda de epidídimos foi feita por microscopia ótica, contando-se as
células presentes em quatro dos doze retículos maiores da câmara de Neubauer. O valor
médio contado foi multiplicado pelo volume de diluição (200) e dividido pelo volume
da câmara de contagem (0,0001) (Parker, 2006). O tempo de trânsito espermático na
cauda do epidídimo foi obtido através da divisão do número de espermatozóides pela
produção espermática diária (Amann, 1986).
40
III.2.5.4 Morfologia espermática
Para avaliar o percentual de espermatozóides morfologicamente anormais
(defeitos na cabeça ou pedaço da cauda), uma suspensão de espermatozóides foi obtida
através da lavagem da luz de cada ducto deferente com 0,3 ml de cloreto de sódio 0,9%.
A lâmina foi preparada com uma alíquota dessa suspensão, mantida a temperatura
ambiente durante 24h e posteriormente corada com vermelho congo e violeta de
genciana (adaptado de Andrade et al., 2002). Duzentos espermatozóides (somente
cabeça ou espermatozóide intacto) por animal foram analisados em microscópio (Zeiss
SV11 - aumento de 1000x - imersão) quanto à presença de defeitos na cabeça e/ou
cauda. As classificações individuais dos espermatozóides estão descritas abaixo.
Anomalias de cabeça Anomalias de cauda Outras anomalias
Duas cabeças Flagelo enrolado Cauda quebrada
Gancho reduzido Flagelo torto Gancho rombudo
Cabeça de banana Ponta do flagelo torta
Cabeça de alfinete
Cabeça em forma de gota
Cabeça invertida
Sem gancho
Cabeça separada
Gancho excessivo
Amorfo
Cabeça curta
(adaptado de Filler, 1993)
41
Espermatozóides Normais Cabeça redonda
Cabeça de alfinete Cabeça invertida
Cabeça gigante Cabeça estreita
Cabeça anã Gancho acentuado
Gancho reduzido Cabeça amorfa
Figura 8: Morfologia dos espermatozóides
42
Continuação da Figura 8
Cabeça separada e flagelo torto Flagelo torto
Flagelo enrolado Ponta do flagelo enrolada
43
III.2.5.5 Histologia Testicular
Para análise histológica, o testículo esquerdo de cada animal foi pesado e fixado
em solução de Bouin (300 ml de água destilada; ácido pícrico à saturação; 20 ml ácido
acético glacial; 100 ml formaldeído) durante 6 horas e posteriormente fixado em
Millonig de Carlson (adaptado de Garagna, 2005). Após a fixação, os testículos foram
clivados e processados (desidratação, clarificação e impregnação). A impregnação foi
feita em parafina durante 3h a 56ºC, e subsequentemente emblocadas (inclusão). Foram
realizados cortes transversais de 5µm de espessura que foram corados com
hematoxilina/eosina para posterior análise histológica.
Após o preparo das lâminas, os diâmetros dos túbulos seminíferos e a altura do
epitélio foram medidos. Como os túbulos seminíferos apresentam uma variabilidade
natural nos diâmetros, foram selecionados cinco túbulos seminíferos por animal
apresentando contornos mais circulares e com associações celulares específicas dos
estágios VII-VIII. As medidas foram feitas com o auxílio da ocular micrométrica (Zeiss
SV11 – Alemanha).
Outro parâmetro avaliado foi à análise histopatológica dos túbulos para detectar
anormalidades, tais como, vacuolização, perda de adesão das células (“sweling”),
aparência das células de Sertoli, hiperplasia ou hipertrofia das células de Leydig do
interstício, presença de células descamadas na luz dos túbulos, organização da
arquitetura celular dos túbulos, degeneração de células germinativas, espermátides
retidas e espermiação tardia. Além disso, 50 secções de túbulos de cada testículo foram
analisadas microscopicamente para determinar a freqüência dos estágios dos túbulos,
que foram divididos da seguinte forma: I-VI, VII-VIII, IX-XI e XII (em andamento)
(Figura 9).
44
Estágios I – VI Estágios VII – VIII
Estágios IX – XI Estágio XII
Figura 9: Aspecto histológico dos estágios dos túbulos seminíferos de
camundongos em cortes transversais corados com H&E
45
III.2.5.6 Quantificação da testosterona
Para a determinação da concentração de testosterona sanguínea, amostras de
sangue foram coletadas do plexo orbital (sempre às 10 horas da manhã). O sangue foi
centrifugado a 3500 rpm durante 15 minutos (MiniSpin - Eppendorf) e o soro foi
separado e mantido a -18ºC até o momento da análise. A concentração de testosterona
foi determinada por imunoensaio competitivo (Free Testosterone Elisa, ARP, Inc™). O
princípio deste ensaio está baseado na competição entre a testosterona da amostra e a
testosterona conjugada utilizada como reagente para uma quantidade constante de
anticorpo antitestosterona. Foram adicionados 25µl da amostra, do padrão e do controle
(em duplicata) nos poços previamente sensibilizados com o anticorpo antitestosterona.
Em seguida, foram adicionados 100µl de testosterona conjugada e a placa incubada por
60 minutos a 37 ºC. Os poços foram lavados três vezes com 300µl de tampão de
lavagem diluído. Após a lavagem, foram adicionados 150µl da solução reagente TMB
(3,3´, 5,5´ tetrametilbenzidina), a placa foi homogeneizada e incubada por 15 minutos
em estufa a 37 ºC, ao abrigo da luz. Então, 50µl da solução de parada foi adicionada e a
medida a absorbância espectrofotometricamente em 450 nm (Biotek Instruments, INC).
A construção da curva padrão foi feita com seis soluções de referência contendo
concentrações conhecidas de testosterona, que foram relacionadas com as absorbâncias
lidas. Os níveis de testosterona livre das amostras (pg/ml), foram determinados com a
plotagem da absorbância na curva padrão. Foi utilizado um controle, que juntamente
com os padrões e amostras foram feitos em duplicata, e reportada a média obtida.
III.2.6 Teste da Fertilidade
Quando a outra metade dos filhotes expostos ao TPTH durante a pré-puberdade
e a puberdade alcançou à idade de 65 dias (Figura 6), teve início o teste de fertilidade. O
acasalamento dos animais ocorreu segundo o procedimento proposto por Chahoud &
Kwasigroch (1977). Duas fêmeas não-tratadas (65 dias de vida) foram transferidas para
a gaiola de um macho exposto ao TPTH, e duas fêmeas tratadas foram alojadas com um
macho não-tratado (65 dias de vida), durante as duas últimas horas do período escuro (6
às 8 horas da manhã). Em seguida as fêmeas foram retiradas e examinadas para a
verificação da ocorrência do cruzamento. O cruzamento foi confirmado pela presença
46
do “plug” (massa esbranquiçada de espermatozóides) na abertura vaginal. As primeiras
24 horas após a confirmação do cruzamento foram consideradas como dia ´0` de
gravidez. O procedimento do acasalamento foi repetido diariamente durante oito dias.
Os machos e as fêmeas, que não cruzaram nos primeiros oito dias do teste de fertilidade,
foram submetidos a um segundo período de acasalamento com novas fêmeas e novos
machos não-tratados e com comprovada fertilidade.
1º cruzamento
2º cruzamento
Figura 10: Esquema do teste de fertilidade
III.2.7 Cesariana
No dia 16 de gestação as fêmeas que participaram do teste de fertilidade foram
sacrificadas por deslocamento cervical. As cavidades abdominais foram abertas por uma
Fêmea não-tratada Fêmea não-tratada
Macho tratado
Fêmea tratada Fêmea tratada
Macho não-tratado
Fêmea não-tratada
Macho tratado
Fêmea tratada
Macho não-tratado
47
ampla incisão longitudinal e o útero gravídico, os ovários, o fígado, o baço e o timo de
cada animal foram examinados. Os pesos do fígado, baço, timo e ovários foram
registrados. O útero foi pesado com todo o seu conteúdo e posteriormente aberto,
mantendo sempre a mesma posição que ocupava no ventre materno. A parede uterina
foi secionada com cuidado para evitar danos aos fetos. O número de sítios de
implantação, fetos vivos e mortos e o número de reabsorções (intermediária e tardia)
foram registrados. Após os conteúdos dos úteros terem sido examinados, os sítios de
implantação foram identificados pelo método descrito por Salewisk (1964).
III.2.8 Machos que participaram do teste de fertilidade
No dia 75 pós-natal, os machos adultos que participaram do teste de fertilidade
foram pesados e anestesiados com éter etílico. Amostras de sangue foram coletadas do
plexo orbital, e os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os testículos,
epidídimos e a vesícula seminal foram removidos e pesados. A vesícula seminal foi
pesada após a retirada do líquido seminal por perfuração e raspagem. Os pesos do
fígado, baço e timo também foram registrados. Todas as variáveis avaliadas nos filhotes
machos sacrificados após o tratamento também foram avaliadas nos machos adultos que
participaram do teste de fertilidade. Os animais foram avaliados quanto à produção
espermática diária, contagem de espermatozóides na cauda do epidídimo, morfologia
dos espermatozóides, histologia testicular e nível de testosterona no sangue (conforme
itens III.2.5.3 ao III.2.5.6).
III.2.9 Análise estatística
Para as variáveis que apresentam distribuição normal (paramétricas) os
resultados foram comparados empregando a análise de variância de uma via (ANOVA).
As diferenças entre os grupos foram determinadas pelos testes de Tukey e de
Bonferroni. Para as variáveis que não obedeçam a distribuição normal, os resultados
foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis seguido do teste U de Mann-Whitney
para determinar as diferenças entre dois grupos. As proporções foram analisadas pelo
teste qui-quadrado.
48
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, exceto na Tabela
14 [mediana (mínimo e máximo)]. O nível de significância estatística foi de 5%
(p<0,05). Os cálculos estatísticos foram realizados por meio do programa SPSS® 12.0.
49
IV. RESULTADOS
IV.1 Experimento 1
IV.1.1 Efeitos sobre o organismo materno
A Tabela 1 mostra a evolução ponderal das fêmeas tratadas com TPTH durante a
gravidez e lactação. O ganho de peso materno ao longo da gestação, assim como
durante o período de lactação, não diferiu entre os grupos tratados com as diferentes
doses de TPTH e os dois grupos controle.
IV.1.2 Efeito sobre os órgãos maternos
Na Tabela 2
podem ser encontrados os valores de peso absoluto do timo, fígado,
baço, ovários e útero maternos no dia do desmame, assim como o peso relativo [(peso
do órgão ÷ peso corporal) x 100] destes órgãos.
Foi observado um aumento do peso relativo do fígado na dose de 7,5mg
TPTH/kg (7,05±0,42) em relação aos controles e demais doses estudadas (NT =
6,38±0,50; óleo = 6,50±0,61; 1,875mg/kg = 6,70±0,57; 3,75mg/kg = 6,47±0,51). Houve
também redução dos pesos relativos do útero na dose de 7,5mg TPTH/kg, em relação ao
controle veículo (óleo) (Tabela 2
).
IV.1.3 Efeito da exposição in utero e durante a lactação ao TPTH sobre o
nascimento e desenvolvimento pós-natal
A Tabela 3 mostra o número médio de sítios de implantação evidenciada ao
desmame, o número de perdas gestacionais e neonatais, o tamanho médio das ninhadas
ao nascimento (dia 1 PN) e o número de filhotes ao desmame (dia 21PN). O número
médio de sítios de implantação por útero (avaliado nas mães sacrificadas ao desmame
através do método de Salewisk) e o número médio de nascimentos por ninhada, não
diferem significativamente entre os grupos experimentais. Não há diferença estatística
entre os diferentes grupos experimentais quanto ao tamanho médio da ninhada ao
nascimento. Durante o período de lactação, algumas mortes de filhotes foram
50
registradas, mas estas ocorreram em todos os grupos experimentais, inclusive no grupo
não tratado. Não houve diferença estatística entre os grupos quanto ao número médio de
filhotes por ninhada ao desmame.
A Tabela 4 mostra os dados referentes à mortalidade materna e à mortalidade pré-,
peri-e pós-natal da prole exposta ao TPTH in utero e durante lactação. Não observamos
mortes maternas durante o período de tratamento. Logo após o nascimento, três
ninhadas do grupo que recebeu 7,5 mg TPTH/kg foram totalmente canibalizadas pelas
mães (Tabela 2). Não foi observado canibalismo em nenhum outro grupo experimental.
Nos filhotes dos grupos em que não houve canibalismo, não observamos anomalias nos
filhotes.
IV.1.4 Efeito da exposição ao TPTH sobre o ganho de peso médio dos
filhotes
A Tabela 5 mostra o peso médio dos filhotes durante os primeiros 25 dias do
desenvolvimento pós-natal. Há uma evidente redução – dose relacionada – do peso
médio dos filhotes ao nascimento. Embora essa redução seja observada em todos os
níveis de dose houve recuperação ponderal de modo que, a partir do dia 5 pós-natal, os
grupos não mais diferem entre si.
O ganho de peso (∆p) dos filhotes expostos in utero e durante a lactação ao
TPTH, é apresentado na Tabela 6. Não houve diferença estatisticamente significativa
entre os diferentes grupos experimentais quanto ao ganho de peso nos períodos
analisados.
51
Tabela 1: Ganho de peso materno de camundongos tratados oralmente com TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de
peso corporal/dia) do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tratamento TPTH (mg/kg peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,5
Fêmeas grávidas (N)
12 18 17 18 18
Fêmeas no dia 1PN (N)
12 18 17 18 18
Fêmeas no dia 21 PN (N)
12 18 17 18 15♣
Peso materno (g)
Dia 0
30,5±2,7 31,2±1,9 30,6±3,2 30,0±1,8 30,1±2,4
Dia 18
62,7±7,8 63,3±5,6 65,5±5,8 61,3±4,5 61,3±5,9
Ganho de peso materno (g)
Dia 6-0
5,1±1,1 5,5±1,1 5,9±0,9 5,7±1,2 5,8±1,1
Dia 11-6
6,7±1,9 5,2±0,9 5,6±1,0 5,4±1,4 5,4±1,7
Dia 15-6
16,6±3,4 15,5±2,2 17,0±2,1 15,8±2,5 16,3±2,7
Dia 18-0
32,3±6,3 32,1±4,4 34,9±3,4 31,3±3,3 31,3±4,7
Peso materno pós-natal (g)
Dia 1 pós-natal
40,9±4,2 43,2±2,9 43,1±3,9 41,1±3,2 40,9±3,2
Dia 21 pós-natal
49,2±5,4 49,4±4,4 49,5±4,9 47,2±4,2 48,7±4,86
Ganho de peso materno pós-
natal(g)
Dia 21 PN – 1 PN
8,2±3,2 6,1±3,2 6,46±4,3 6,1±3,1 7,8±2,8
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle não tratado; b: diferente do controle
óleo; c: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg. ♣: Todas as mortes ocorreram no período peri-natal (dia 1 PN).
52
Tabela 2: Peso dos órgãos maternos no dia 21 pós-natal de camundongos tratados oralmente com TPTH (não tratado; óleo;
1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,5
Fêmeas (dia 21PN)
12 18 17 18 15
Timo (g)
0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01
Timo %
0,04±0,02 0,04±0,02 0,04±0,03 0,05±0,03 0,04±0,03
Fígado (g)
3,14±0,48 3,20±0,32 3,33±0,51 3,06±0,34 3,43±0,40
d
Fígado %
6,38±0,50 6,50±0,61 6,70±0,57 6,47±0,51 7,05±0,42
a, b, c, d
Baço (g)
0,22±0,13 0,23±0,07 0,23±0,07 0,19±0,06 0,19±0,06
Baço %
0,44±0,24 0,47±0,15 0,46±0,12 0,40±0,11 0,39±0,10
Ovário (g)
0,03±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01
Ovário %
0,07±0,02 0,07±0,02 0,07±0,03 0,06±0,02 0,06±0,03
Útero (g)
0,12±0,04 0,14±0,06 0,12±0,07 0,10±0,04 0,09±0,05
Útero %
0,24±0,08 0,27±0,11 0,24±0,12 0,22±0,08 0,20±0,11
b
Peso do animal no dia
21 PN (g)
49,20±5,4 49,40±4,4 49,50±4,9 47,20±4,2 48,70±4,86
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle não tratado; b: diferente do controle
óleo; c: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 3,75 mgTPTH/kg.
53
Tabela 3: Dados do nascimento e do desmame de camundongos expostos in utero ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875;
3,75 e 7,5mg/kg de peso corporal) do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,50
Sítios de implantação
Total (ninhada)
141 (12) 228 (18) 221 (17) 220 (18) 195 (15)
N por ninhada (média ±DP)
11,75±2,01 12,67±1,75 13,00±1,90 12,22±1,63 13,00±2,24
Perdas gestacionais e neonatais
Total (ninhada)
20 (10) 31 (14) 24 (9) 28 (14) 33 (15)
Por sítios de implantações (%)
13,71 12,53 9,58 12,21 16,62
Por ninhada (média ±DP)
1,67±1,30 1,72±2,40 1,41±2,83 1,56±1,46 2,20±1,56
Nº de filhotes ao nascimento
Total (ninhada)
121 (12) 197 (18) 197 (17) 192 (18) 162 (15)
Por sítios de implantações (%)
86,29 87,47 90,42 87,79 83,38
Por ninhada (média ±DP)
10,08±1,73 10,94±2,01 11,59±2,60 10,67±1,64 10,80±2,24
Nº de filhotes ao desmame
Total (ninhada)
118 (12) 197 (18) 189 (17) 180 (18) 143 (15)
Por sítios de implantações (%)
84,42 87,47 87,11 82,65 74,11
Por ninhada (média ±DP)
9,83±1,59 10,94±2,01 11,12±2,37 10,00±1,94 9,53±2,61
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis. seguido pelo teste U de Mann-
Whitney. ou por Qui-quadrado. Outros parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA). seguida pelos testes de
Tukey e de
Bonferroni.
Em todos os casos a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a:
diferente do controle não tratado; b: diferente do controle óleo; c: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 3,75 mgTPTH/kg.
54
Tabela 4: Mortalidade materna e mortalidade pré-. peri- e pós-natal de camundongos expostos in utero ao TPTH (não
tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5mg/kg de peso corporal) do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,50
Fêmeas grávidas (Salewisk positivo)
12 18 17 18 18
Mortalidade Materna
0 0 0 0 0
Nascimento prematuro (antes do dia 18
de gestação)
0 0 0 0 0
Mortalidade pré-natal (grávidas que
não deram a luz até o dia 22 gestação)
0 0 0 0 0
Mortalidade peri- e pós-natal
(mortalidade de toda a ninhada)
0 0 0 0
3♣
Mortalidade peri- e pós-natal/Grávida
(%)
0% 0% 0% 0% 16,6%
Ninhadas viáveis ao nascimento
12 18 17 18 18
Ninhadas viáveis ao desmame
12 18 17 18 15
Os valores percentuais foram analisados pelo teste de Qui-quadrado. Em todos os casos a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando
p<0,05. ♣: Todas as mortes ocorreram no período peri-natal (dia 1PN).
55
Tabela 5: Peso médio dos filhotes expostos in utero e durante a lactação ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5 mg/kg de
peso corporal/dia).
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,5
Ninhadas (N)
12 18 17 18 15
Dia 1 pós-natal
1,79±0,15 1,76±0,13 1,67±0,11
a, b
1,66±0,11
a, b
1,57±0,12
a, b, c, d
Dia 5 pós-natal
2,96±0,40 2,94±0,28 2,95±0,39 2,98±0,34 2,87±0,28
Dia 10 pós-natal
5,30±0,94 5,01±0,69 5,03±0,67 5,19±0,64 4,96±0,71
Dia 15 pós-natal
6,98±1,43 6,61±0,92 6,53±1,00 6,63±1,04 6,61±1,15
Dia 20 pós-natal
9,42±2,51 8,48±1,51 8,43±1,65 8,24±1,85 8,56±1,97
Dia 25 pós-natal
15,22±3,86 14,11±2,09 14,00±2,73 14,19±3,21 14,50±3,53
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey
e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente
do controle não tratado; b: diferente do controle óleo de canola; c: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 3,75 mgTPTH/kg.
Obs: A ninhada usada como unidade de análise e os valores representam a média das médias por ninhada. O desmame foi realizado no dia 21 PN.
56
Tabela 6: Ganho de peso dos filhotes (ninhada) expostos in utero e durante a lactação ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e
7,5 mg/kg de peso corporal/dia).
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,5
Ninhadas (N)
12 18 17 18 15
Ganho de peso
Dia 5-1 PN
1,17±0,33 1,18±0,23 1,28±0,33 1,33±0,29 1,30±0,21
Dia 10-1 PN
3,51±0,86 3,25±0,63 3,36±0,61 3,54±0,62 3,39±0,66
Dia 20-1 PN
7,63±2,43 6,73±1,45 6,76±1,63 6,58±1,82 6,99±1,92
Dia 25-1 PN
13,44±3,81 12,35±2,04 12,33±2,69 12,54±3,18 12,92±3,48
Dia 20-5 PN
6,46±2,16 5,55±1,33 5,48±1,49 5,26±1,69 5,69±1,80
Dia 25-10 PN
9,92±3,06 9,10±1,47 8,97±2,31 9,00±2,75 9,54±2,86
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Em
todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle não
tratado; b: diferente do controle óleo de canola; c: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 3,75 mgTPTH/kg.
57
IV.1.5 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao TPTH sobre o
aparecimento dos marcos do desenvolvimento pós-natal
Os dados relativos ao aparecimento dos marcos físicos do desenvolvimento pós-
natal avaliados neste estudo são mostrados na Tabela 7. O TPTH não alterou o
aparecimento dos marcos do desenvolvimento estudados, i.e. descolamento da orelha,
aparecimento de pêlo, erupção de incisivos, abertura de olhos, abertura de vagina e
descida de testículo (Tabela 7
).
58
Tabela 7: Marcos do desenvolvimento pós-natal de filhotes de camundongos expostos ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875;
3,75 e 7,5mg/kg de peso corporal) do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,50
Ninhadas (N)
12 18 17 18 15
Dia do descolamento da
orelha
5 (5-6) 5 (4-6) 5 (4-6) 5 (4-6) 5 (4-5)
Ninhadas (N)
12 18 17 18 15
Dia do aparecimento de pêlo
5 (4-6) 5 (4-6) 5 (5-6) 5 (4,5-7) 5 (5-6)
Ninhadas (N)
12 18 17 18 15
Dia da erupção dos incisivos
9 (8-10) 9 (8-10) 9 (8-10) 8 (8-10) 8,5 (8-10)
Ninhadas (N)
12 18 17 18 15
Dia da abertura dos olhos
16 (15-17) 16 (14-17) 16 (15-17) 16 (15-17) 16 (15-18)
Ninhadas (N)
11 18 17 18 15
Dia da abertura de vagina
27 (25-33) 27,5 (25-31) 28 (26-32) 27,5 (24-34) 29 (25-33)
Ninhadas (N)
12 18 17 18 15
Dia da descida de testículo
22 (21-26) 22 (22-27) 22,5 (21-26) 23 (21-30) 23 (21-29)
Os dados são apresentados como mediana (mínimo - máximo). Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de
Mann-Whitney (análise por ninhada - mediana das medianas). Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05.
59
IV.1.6 Efeito da exposição in utero e durante a lactação ao TPTH sobre
fertilidade
A Tabela 8 mostra os resultados do Teste de Fertilidade realizado com animais
adultos expostos in utero e durante a lactação ao TPTH. Como pode ser visto na Tabela
8, a proporção de fêmeas que deram à luz por fêmeas que cruzaram, e a razão do
número de machos que acasalaram com pelo menos duas fêmeas pelo total de machos
não difere entre os grupos tratados com TPTH e os grupos controles. Portanto, a
exposição in utero e durante a lactação ao TPTH não alterou a fertilidade de
camundongos, machos e fêmeas, avaliados no presente teste.
60
Tabela 8: Teste de fertilidade de camundongos expostos ao TPTH in utero do dia 6 de gestação ao dia 21 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,5
1º cruzamento
Nº fêmeas que deram à luz/
Nº fêmeas que cruzaram (%)
18/18 (100%)
27/27 (100%)
22/27 (81%)
25/27 (92%)
24/24 (100%)
Nº machos que acasalaram com pelo
menos duas fêmeas/ Total de machos (%)
6/6 (100%)
9/9 (100%)
8/9 (88,8%)
9/9 (100%)
8/8 (100%)
2º cruzamento
Nº fêmeas que cruzaram /
Nº fêmeas que deram à luz (%)
__
__
5/5 (100%)
2/2 (100%)
__
Nº machos que acasalaram com pelo
menos duas fêmeas/ Total de machos (%)
__
__
0/1 (0%)
__
__
1º + 2º cruzamento
Nº fêmeas que deram à luz/
Nº fêmeas que cruzaram (%)
18/18 (100%)
27/27 (100%)
27/27 (100%)
27/27 (100%)
24/24 (100%)
Nº machos que acasalaram com pelo
menos duas fêmeas/ Total de machos (%)
6/6 (100%)
9/9 (100%)
8/9 (88,8%)
9/9 (100%)
8/8 (100%)
Sítios de implantação
Total
Por ninhada (média±DP)
250
13,89±3,29
370
13,70±2,30
302
13,73±2,62
334
13,36±2,51
330
13,75±1,96
Fetos vivos
Total
Por ninhada (média±DP)
(dia 1 pós-natal)
209
11,61±3,18
335
12,41±2,52
267
12,14±2,32
298
11,92±2,53
299
12,46±2,45
Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney, ou por Qui-quadrado. Outros parâmetros foram avaliados pela análise
de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando
p<0,05.
61
IV.1.7 Efeito da exposição in utero e durante a lactação ao TPTH sobre os
órgãos dos filhotes na idade adulta
Na Tabela 9 podem ser encontrados os valores de peso absoluto e relativo do
fígado, baço, ovários e útero das fêmeas sacrificadas entre os dias 80 e 90 pós-natal.
Encontramos uma redução estatisticamente significativa do peso absoluto do fígado na
dose de 7,5mg TPTH /kg de peso corpóreo.
Os valores de peso absoluto do fígado, baço, testículos, epidídimos e vesícula
seminal dos machos mortos entre os dias 90 e 100 pós-natal encontram-se resumidos na
Tabela 10. A exposição in utero e durante a lactação ao TPTH diminuiu o peso absoluto
dos epidídimos e vesícula seminal dos filhotes quando comparado ao peso dos
controles.
IV.1.8 Efeito da exposição in utero e durante a lactação ao TPTH sobre os
parâmetros reprodutivos masculinos dos filhotes na idade adulta
Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos
tratados com TPTH e os grupos controles com relação ao número de espermátides nos
testículos (soma do testículo direito e esquerdo), produção espermática diária, número
de espermatozóides na cauda do epidídimo e tempo de trânsito espermático (dados não
demonstrados).
62
Tabela 9: Peso dos órgãos absoluto e relativo de filhotes (fêmeas) expostos in utero ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e 7,5
mg/kg de peso corporal/dia) do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,5
Ninhadas (N)*
12 18 17 18 15
Fígado (g)
1,94±0,17 1,93±0,33 1,80±0,26 1,75±0,21 1,68±0,14
a, b
Fígado %
5,09±0,55 4,95±0,62 4,61±0,41 4,73±0,46 4,79±0,49
Baço (g)
0,21±0,03 0,20±0,03 0,20±0,04 0,20±0,04 0,19±0,03
Baço %
0,56±0,08 0,52±0,08 0,51±0,08 0,53±0,09 0,55±0,08
Ovário (g)
0,03±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01
Ovário %
0,08±0,02 0,08±0,02 0,07±0,02 0,09±0,02 0,08±0,03
Útero (g)
0,12±0,01 0,14±0,04 0,13±0,04 0,11±0,03 0,13±0,03
Útero %
0,30±0,05 0,36±0,10 0,34±0,11 0,30±0,08 0,37±0,09
Peso médio (g)
38,14±2,51 38,82±2,69 38,90±3,70 37,09±2,64 35,18±3,26
b, c
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão (média das médias). Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de
Mann-Whitney. Outros parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos,
a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle não tratado; b: diferente
do controle óleo de canola; c: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg. *: Sacrifício ao final do experimento, ninhadas com
idade entre 80 e 90 dias.
63
Tabela 10: Peso dos órgãos absoluto e relativo de filhotes (machos) expostos in utero ao TPTH (não tratado; óleo; 1,875; 3,75 e
7,5 mg/kg de peso corporal/dia) do dia 6 de gestação ao dia 21 de lactação.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
não tratado óleo 1,875 3,75 7,5
Ninhadas (N)*
12 18 17 18 15
Fígado (g)
2,3±0,2 2,3±0,20 2,4±0,32 2,5±0,35 2,4±0,35
Fígado %
4,7±0,5 4,6±0,36 4,8±0,43 5,1±0,57
a, b
5,0±0,50
b
Baço (g)
0,18±0,03 0,18±0,02 0,17±0,03 0,18±0,04 0,20±0,06
Baço %
0,38±0,07 0,37±0,04 0,35±0,06 0,38±0,09 0,42±0,13
Testículo Direito (g)
0,13±0,02 0,13±0,02 0,13±0,02 0,12±0,02 0,12±0,01
Testículo Direito %
0,27±0,04 0,26±0,04 0,26±0,04 0,25±0,04 0,26±0,03
Testículo esquerdo (g)
0,13±0,02 0,13±0,02 0,12±0,02 0,12±0,01 0,12±0,02
Testículo esquerdo %
0,26±0,04 0,26±0,04 0,25±0,04 0,24±0,03 0,26±0,04
Epidídimos (g)
0,09±0,01 0,09±0,01 0,10±0,02 0,09±0,01 0,08±0,01
c
Epidídimos %
0,19±0,03 0,18±0,02 0,19±0,03 0,18±0,03 0,17±0,02
Vesícula Seminal (g)
0,24±0,05 0,20±0,03
a
0,21±0,03
a
0,19±0,02
a
0,20±0,04
a
Vesícula Seminal %
0,51±0,11 0,42±0,06
a
0,41±0,05
a
0,40±0,05
a
0,42±0,07
a
Peso médio dos filhotes (g)
48,7±4,00 48,7±3,4 49,0±5,76 48,7±5,2 47,7±5,2
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle não tratado; b: diferente do controle óleo
de canola; c: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg. *: Sacrifício ao final do experimento, ninhadas com idade entre 80 e 90
dias.
64
IV.2 Experimento 2
IV.2.1 Toxicidade geral e mortalidade
Durante o período de tratamento, não observamos mortes ou sinais clínicos de
toxicidade nos animais dos grupos tratados com óleo de milho, 1,875 e 3,75 mg
TPTH/kg de peso corporal. No entanto, na dose de 7,5 mg TPTH/kg, 7,4% dos machos
e 3,7% das fêmeas morreram, e na dose de 15 mg TPTH/kg, observamos um drástico
aumento da mortalidade tanto entre os machos (80,8%), quanto entre as fêmeas (80,9%)
logo após o desmame, i.e. entre os dias 21 e 25 pós-natal (Tabela 11).
IV.2.2 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre o ganho de peso corporal
A Tabela 12 mostra a evolução ponderal e o ganho de peso das fêmeas expostas
ao TPTH durante a pré-puberdade e a puberdade. No dia 15 pós-natal, i.e. antes do
início do tratamento, não houve diferenças quanto ao peso médio dos filhotes. A partir
do dia 21 pós-natal (desmame), observamos uma redução estatisticamente significativa
do peso médio das fêmeas das duas maiores doses (7,5 e 15 mg/kg) com relação aos
outros grupos experimentais. Nos primeiros dias de tratamento (dia 21-15) notamos uma
drástica redução – dose relacionada – do ganho de peso (média±DP) das fêmeas a partir
da dose de 1,875 mg/kg (óleo = 3,41±0,99g; 1,875mg/kg = 2,84±0,77g; 3,75mg/kg =
2,26±0,75g; 7,5mg/kg = 0,85±1,09g; 15mg/kg = -0,49±0,55g). Portanto, o ganho de
peso no início do tratamento foi comprometido a partir da menor dose avaliada. A
análise do ganho de peso durante todo o período de tratamento (dia 45-15), entretanto,
indicou que o TPTH foi tóxico a partir da dose de 7,5 mg/kg (óleo = 21,02±2,55g;
7,5mg/kg = 18,85±2,99g; 15mg/kg = 14,55±1,80).
O peso médio e o ganho de peso dos filhotes machos expostos ao TPTH do dia
15 ao dia 45 pós-natal estão ilustrados na Tabela 13. Até o dia 30 pós-natal, o peso
médio dos filhotes machos encontrava-se reduzido a partir da dose de 3,75 mg
TPTH/kg, indicando uma maior susceptibilidade dos machos ao TPTH quando
comparado com as fêmeas no mesmo período de tratamento. O ganho de peso dos
machos do início do tratamento até o desmame (dia 21-15) diminuiu de forma dose-
65
relacionada a partir da dose de 1,875mg TPTH/kg (óleo = 3,59±0,79g; 1,875mg/kg =
3,05±0,85g; 3,75mg/kg = 1,90±0,91g; 7,5mg/kg = 1,35±0,82g; 15mg/kg = -
0,22±0,81g), porém, após o dia 35 pós-natal (10º dia de tratamento) essa diminuição
aparece a partir da dose de 7,5mg TPTH/kg (óleo = 28,12±2,03g; 7.5mg/kg =
25,70±4,66g; 15mg/kg = 18,62±2,87 18,62±2,87g), indicando que o período mais
crítico ocorre logo após o desmame.
IV.2.3 Efeitos da exposição ao TPTH sobre o aparecimento dos marcos do
desenvolvimento pós-natal
Os dados referentes ao aparecimento dos marcos físicos do desenvolvimento
pós-natal avaliados neste estudo são mostradas na Tabelas 14. Nas fêmeas observa-se
um atraso na abertura de vagina nas ninhadas do grupo de 7,5 e 15 mg de TPTH/kg em
relação ao grupo controle veículo (óleo de milho). No entanto, o atraso na descida de
testículo, foi estatisticamente significativo a partir da dose de 3,75 mg de TPTH/kg de
peso corporal, demonstrando assim, mais uma vez, uma maior susceptibilidade dos
machos aos efeitos do TPTH no período pré-puberdade e durante a puberdade. A média
do peso corporal no dia da abertura de vagina nas fêmeas e no dia da descida de
testículos nos machos não estava alterada.
IV.2.4 Avaliação do ciclo estral
A Tabela 15
apresenta os resultados da avaliação do ciclo estral das fêmeas
expostas ao TPTH do dia 15 ao dia 45 PN e que participaram do teste de fertilidade no
dia 65PN. Uma fêmea do grupo exposto a 3,75mg TPTH/kg e uma fêmea do grupo
exposto a 7,5mg TPTH/kg não entraram no estro até o dia 65 pós-natal. Observamos
uma tendência não significativa do atraso da idade para o primeiro estro nas duas
maiores doses de TPTH (7,5mg/kg: p = 0,059 em relação ao óleo e p = 0,067 em
relação à dose de 1,875mg TPTH/kg). O peso corporal no dia do primeiro estro e o
tempo decorrido desde a abertura do canal vaginal até o primeiro estro não estavam
alterados entre os diferentes grupos experimentais.
66
Tabela 11: Mortalidade dos camundongos (filhotes) fêmeas e machos tratados oralmente com TPTH (óleo; 1.875; 3.75 e 7.5
e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1.875 3.75 7.50 15
Número de filhotes fêmeas no dia 15 PN
23 22 21 27 21
Número de filhotes fêmeas no dia 45 PN
23 22 21 26 4
Mortalidade durante o tratamento (%)
0% 0% 0% 3,7%♣ 80,9%
a
♣
Número de filhotes machos no dia 15 PN
26 26 24 27 26
Número de filhotes machos no dia 45 PN
26 26 24 25 5
Mortalidade durante o tratamento (%)
0% 0% 0% 7,4%♣ 80,8%
a
♣
Os valores percentuais foram analisados pelo teste de Qui-quadrado. Em todos os casos a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando
p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle óleo; b: diferente da dose de 1.875 mg TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg
TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mgTPTH/kg. ♣: Todas as mortes ocorreram no período do desmame (entre os dias 21 e 25 pós-natal).
67
Tabela 12: Ganho de peso de camundongos (fêmeas) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso
corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento
TPTH (mg/kg peso corporal)
óleo 1,875 3,75 7,5 15
Fêmeas no dia 45 PN (N)
23 22 21 26 4
Peso médio(g)
Dia 15
7,27±1,03 7,22±0,79 7,31±0,99 7,24±0,96 7,20±1,34
Dia 21 (desmame)
10,68±1,83 10,07±1,38 9,58±1,56 8,09±1,60
a, b, c
6,71±1,08
a, b, c
Dia 25
15,14±2,40 14,35±1,76 13,68±2,27 11,28±2,61
a, b, c
8,82±1,46
a, b, c
Dia 30
20,61±2,88 20,34±2,03 19,2±3,30 16,12±3,75
a, b, c
12,48±2,30
a, b, c
Dia 35
24,72±2,63 24,71±1,76 23,31±4,03 20,59±3,82
a, b, c
16,02±2,72
a, b, c
Dia 45
28,29±3,08 28,49±2,20 27,59±4,63 26,09±3,55 21,75±2,67
a, b, c
Ganho de peso (g)
Dia 21 – 15
3,41±0,99 2,84±0,77
a
2,26±0,75
a, b
0,85±1,09
a, b, c
-0,49±0,55
a, b, c, d
Dia 25 – 15
7,87±1,49 7,13±1,17 6,36±1,38
a
4,04±2,03
a, b, c
1,62±0,96
a, b, c, d
Dia 35 – 15
17,45±1,96 17,49±1,32 16,00±3,36 13,35±3,23
a, b, c
8,82±1,68
a, b, c, d
Dia 45 – 15
21,02±2,55 21,27±2,06 20,27±4,12 18,85±2,99
a, b, c
14,55±1,80
a, b, c, d
Dia 45 – 21
17,61±2,27 18,43±2,12 18,01±3,98 18,00±2,72 15,04±1,67
a, b, c, d
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle; b: diferente do 1,875 mg TPTH/kg; c:
diferente da dose 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
68
Tabela 13: Ganho de peso de camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso
corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento
TPTH (mg/kg peso corporal)
óleo 1,875 3,75 7,5 15
Machos no dia 45 PN (N)
26 26 24 25 5
Peso médio(g)
Dia 15
7,34±0,86 7,25±0,86 7,09±0,97 7,28±1,01 7,47±0,36
Dia 21 (desmame)
10,93±1,37 10,30±1,43 8,99±1,46
a, b
8,63±1,52
a, b
7,24±0,84
a, b
Dia 25
15,96±2,21 15,11±2,48 13,30±2,44
a
12,07±2,42
a, b
9,18±1,43
a, b, c
Dia 30
23,66±3,08 22,90±3,64 20,60±3,76
a
18,18±4,01
a, b
13,32±0,99
a, b, c, d
Dia 35
29,54±2,68 29,15±3,21 26,85±3,74 24,49±4,65
a, b
18,13±1,03
a, b, c, d
Dia 45
35,45±2,57 36,20±3,31 34,83±3,98 32,98±5,28
b
26,08±2,90
a, b, c, d
Ganho de peso (g)
Dia 21 – 15
3,59±0,79 3,05±0,85
a
1,90±0,91
a, b
1,35±0,82
a, b, c
-0,22±0,81
a, b, c, d
Dia 25 – 15
8,62±1,53 7,86±1,77 6,21±1,78
a, b
4,79±1,84
a, b, c
1,71±1,39
a, b, c, d
Dia 35 – 15
22,21±2,21 21,90±2,54 19,76±3,03
a, b
17,21±4,07
a, b, c
10,67±1,23
a, b, c, d
Dia 45 – 15
28,12±2,03 28,95±2,66 27,74±3,30 25,70±4,66
a, b
18,62±2,87
a, b, c, d
Dia 45 – 21
24,53±2,03 25,90±2,29 25,84±3,00 24,35±4,47 18,84±3,66
a, b, c, d
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle; b: diferente do 1,875 mg TPTH/kg; c:
diferente da dose 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
69
Tabela 14: Marcos físicos do desenvolvimento pós-natal de camundongos expostos ao TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e
15mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
Óleo 1,875 3,75 7,50 15
Fêmeas (N)
23 22 21 26 4
Dia da abertura de vagina
27 (22-30) 27,5 (23-32) 28 (24-38) 31 (24-44)
a
39,5 (31-42)
a
Média do peso corporal no
dia da abertura de vagina
17,00±2,36 16,97±2,59 16,66±3,00 17,55±2,57 17,88±0,94
Machos (N)
26 26 24 25 5
Dia da descida de testículo
21 (19-25) 21 (20-25) 22,5 (20-28)
a
23 (21-29)
a
29 (27-30)
a
Média do peso corporal no
dia da descida de testículos
11,40±1,12 10,95±1,12 10,83±1,11 10,56±1,14 11,63±1,76
Os dados são apresentados como mediana (mínimo-máximo) e média±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido
pelo teste U de Mann-Whitney. Outros parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de
Bonferroni.Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a:
diferente do controle óleo; b: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mgTPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mgTPTH/kg.
70
Tabela 15: Ciclo estral de camundongos expostos ao TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao
dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
Óleo 1,875 3,75 7,50 15
Fêmeas (N)
12 10 9 11 2
Dia pós-natal do 1º estro
38,70±5,73 38,70±8,23 41,33±6,18 46,33±6,15
w,
y
51,50±0,71
Peso corporal no 1º estro
24,79±3,46 24,35±3,12 25,93±2,00 25,05±2,41 24,82±1,58
Da abertura do canal vaginal
ao 1º estro (dias)
12,00±4,20 11,80±6,50 13,00±5,20 11,58±4,40 11,50±2,10
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de
Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como
segue: a: diferente do controle óleo; b: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg
TPTH/kg;
w
: p = 0,059 em relação ao óleo e
y
: p = 0,067 em relação ao 1,875mg/kg. Obs: O lavado vaginal para o preparo da lâmina foi realizado, diariamente,
do dia da abertura da vagina até o dia 65 pós-natal (início do teste de fertilidade).
71
IV.2.5 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a puberdade ao
TPTH sobre o fígado, baço e timo de fêmeas e machos mortos após o tratamento
A avaliação de sinais clínicos de toxicidade normalmente envolve a avaliação do
peso dos órgãos. Para evitar fatores de confundimento devidos a variações do peso
corporal, o resultado foi expresso, também, em termos de peso relativo [(peso do órgão
÷ peso corporal) x 100]. Na Tabela 16 podem ser encontrados os valores de peso
absoluto do timo, fígado e baço das fêmeas no dia 46 pós-natal, assim como o peso
relativo destes órgãos. O peso relativo do timo no grupo tratado com 15mg TPTH/kg
(0,48±0,12) encontrou-se significativamente aumentado quando comparamos com o
grupo controle (0,29±0,08). Foi observado um aumento do peso relativo do fígado das
fêmeas a partir da dose de 3,75mg TPTH/kg (5,70±0,55) com relação ao grupo tratado
com óleo (4,97±0,45).
A exposição repetida ao TPTH alterou o peso de órgãos como fígado, baço e
timo dos machos (Tabela 17). Logo após o fim do tratamento, dia 46 pós-natal,
observamos um aumento significativo do peso relativo do fígado nas duas maiores
doses (7,5 e 15 mg TPTH/kg). Outra observação digna de nota foi o aumento do peso
relativo do baço na maior dose (0,55±0,08) em relação a todos os diferentes grupos
experimentais. Esse efeito foi observado somente nos machos.
IV.2.6 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a puberdade ao
TPTH sobre os órgãos reprodutivos de fêmeas e machos mortos após o tratamento
Não observamos alterações de peso dos órgãos reprodutivos – útero e ovários –
das fêmeas expostas ao TPTH do dia 15 ao dia 45 pós-natal (Tabela 16). O efeito do
TPTH sobre os órgãos reprodutivos dos machos pode ser observado na Tabela 18.
Observamos redução do peso absoluto dos epidídimos na dose de 15mg TPTH/kg
(0,05±0,01) e da vesícula seminal a partir da dose de 7,5mg TPTH/kg (0,13±0,01)
quando comparado com o controle óleo de milho (0,07±0,01 e 0,16±0,03). O efeito na
redução do peso dos órgãos reprodutivos também foi evidente em termos de peso
relativo.
72
Tabela 16: Peso dos órgãos de camundongos (fêmeas) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso
corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,875 3,75 7,5 15
Fêmeas no dia 46 PN
(N)
11 12 11 14 2
Timo (g)
0,09±0,03 0,09±0,02 0,10±0,02 0,10±0,02 0,12±0,01
Timo %
0,29±0,08 0,30±0,08 0,33±0,07 0,34±0,09 0,48±0,12
a, b
Fígado (g)
1,58±0,19 1,68±0,25 1,81±0,27 1,76±0,24 1,61±0,32
Fígado %
4,97±0,45 5,39±0,55 5,70±0,55
a
6,02±0,61
a, b
6,27±0,43
a
Baço (g)
0,17±0,03 0,15±0,03 0,16±0,06 0,14±0,03 0,16±0,05
Baço %
0,53±0,10 0,49±0,10 0,51±0,16 0,47±0,09 0,60±0,12
Ovário (g)
0,02±0,01 0,03±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01
Ovário %
0,07±0,03 0,08±0,04 0,07±0,03 0,07±0,03 0,06±0,02
Útero (g)
0,14±0,06 0,14±0,04 0,11±0,06 0,13±0,05 0,05±0,02
Útero %
0,42±0,16 0,45±0,11 0,36±0,20
b
0,42±0,14 0,17±0,06
b
Peso corporal (g)
31,82±2,07 31,05±1,68 31,75±2,38 29,26±3,22 25,47±3,32
a, b, c
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle óleo; b: diferente da dose de 1,875 mg
TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mgTPTH/kg.
73
Tabela 17: Peso dos órgãos dos camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso
corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,785 3,75 7,5 15
Machos no dia 46PN (N)
14 14 12 13 4
Timo (g)
0,06±0,02 0,07±0,01 0,07±0,03 0,08±0,02 0,10±0,01
a, b
Timo %
0,14±0,04 0,16±0,03 0,16±0,05 0,19±0,05
a
0,27±0,03
a, b, c, d
Fígado (g)
2,27±0,18 2,37±0,09 2,43±0,21 2,60±0,48
a
2,35±0,22
Fígado %
5,58±0,38 5,66±0,30 5,82±0,44 6,23±0,68
a, b
6,61±0,27
a, b, c
Baço (g)
0,15±0,03 0,15±0,02 0,16±0,04 0,16±0,03 0,20±0,01
Baço %
0,37±0,07 0,35±0,06 0,39±0,08 0,38±0,07 0,55±0,08
a, b, c, d
Peso corporal
40,82±3,10 41,92±2,29 41,90±3,55 41,59±4,21 35,48±3,20
a, b, c, d
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle; b: diferente da dose de 1,875 mg
TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
74
Tabela 18: Peso dos órgãos sexuais dos camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15mg/kg de
peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,785 3,75 7,5 15
Machos no dia 46PN (N)
14 14 12 13 4
Testículo Direito (g)
0,12±0,02 0,12±0,01 0,11±0,01 0,12±0,02 0,10±0,01
b
Testículo Direito %
0,29±0,04 0,30±0,03 0,27±0,03 0,28±0,03 0,27±0,03
Testículo Esquerdo (g)
0,11±0,01 0,12±0,01 0,11±0,01 0,11±0,02 0,10±0,01
Testículo Esquerdo %
0,27±0,03 0,28±0,04 0,26±0,03 0,26±0,03 0,28±0,04
Epidídimos (g)
0,07±0,01 0,07±0,01 0,07±0,01 0,06±0,01 0,05±0,01
a, b
Epidídimos %
0,18±0,03 0,17±0,02 0,16±0,03 0,16±0,03 0,13±0,02
a, b
Vesícula Seminal (g)
0,16±0,03 0,16±0,03 0,15±0,02 0,13±0,01
a, b
0,08±0,03
a, b, c, d
Vesícula Seminal %
0,40±0,05 0,38±0,07 0,36±0,06 0,32±0,04
a, b
0,21±0,08
a, b, c, d
Peso corporal
40,82±3,10 41,92±2,29 41,90±3,55 41,59±4,21 35,48±3,20
a, b, c, d
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle; b: diferente da dose de 1,875 mg
TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
75
IV.2.7 Efeitos da exposição durante a pré-puberdade e a puberdade ao
TPTH sobre os parâmetros reprodutivos masculinos dos animais mortos após o
tratamento
Nas Tabelas 19, 20 e 21 observam-se os efeitos da exposição ao TPTH sobre a
produção espermática diária, contagem de espermatozóides na cauda do epidídimo,
tempo de trânsito espermático, concentração de testosterona sanguínea, morfologia dos
espermatozóides e histologia testicular.
Uma redução, estatisticamente significativa, na produção espermática diária e
no número de espermatozóides, foi observada nos animais expostos ao TPTH. O
número de espermatozóides na cauda do epidídimo por animal foi 30±9 (x10
6
) na maior
dose, 103±31 (x10
6
) nos animais tratados com 7,5mg/kg e 167±39 (x10
6
) no grupo
controle. A produção espermática diária foi de 45±14 (x10
6
) e 60±23 (x10
6
) nos animais
tratados com 15 e 7,5mg TPTH/kg, respectivamente, e 82±16 (x10
6
) nos grupos tratados
com óleo de milho. No tempo de trânsito espermático, essa redução foi observada
apenas na maior dose (controle = 2,05±0,44 dias e 15mg/kg = 0,81±0,61 dias). A
exposição durante a pré-puberdade e a puberdade ao TPTH não alterou
significativamente os níveis de testosterona livre medidos pelo teste de ELISA no soro
dos animais, quando comparado ao grupo controle (Tabela 19). Observamos um
discreto aumento do número de espermatozóides anormais (defeitos de cabeça e cauda)
nos animais expostos ao TPTH, no entanto, esse aumento não diferiu significativamente
do percentual observado nos animais do grupo exposto apenas ao controle veículo
(óleo) (Tabela 20).
Histologia testicular
Os resultados referentes à análise morfométrica dos túbulos seminíferos
encontram-se na Tabela 21. Foi observada uma redução do diâmetro e da altura do
epitélio dos túbulos seminíferos dos animais do grupo de 3,75 mg TPTH/kg em relação
ao grupo controle veículo (óleo).
76
Tabela 19: Variáveis reprodutivas de camundongos machos expostos ao TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso
corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo de milho 1,875 3,75 7,50 15
Machos no dia 46 PN (N)
14 14 12 13 4
Nº de espermátides por testículo
(x10
6
)
89±17 88±21 69±17 61±21
a, b
41±10
a, b
Nº de espermátides por
g
rama
testículo (x10
6
)
400±79 385±113 319±77 291±111
a
218±67
a, b
Produção espermática diária
82±16 79±23 66±16 60±23
a
45±14
a, b
Nº de espermatozóides por animal
(x10
6
)
167±39 150±33 124±20
a
103±31
a, b
30±9
a, b, c, d
Tempo de trânsito espermático
(dias)
2,05±0,44 1,99±0,56 1,97±0,52 1,86±0,67 0,81±0,61
a, b, c, d
Testosterona livre (pg/ml)
16,7±21,8 34,2±32,8 14,4±22,9 18,2±20,7 0,12±0,09
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida
pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os
símbolos são designados como segue: a: diferente do controle óleo de milho; b: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg; c: diferente da dose de
3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
77
Tabela 20: Morfologia dos espermatozóides de camundongos machos expostos ao
TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-
natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,875 3,75 7,5 15
Machos no dia 46
PN
14 14 12 13 4
Normal (%)
87,30 86,68 89,50 85,50 85,00
Anormal (%)
12,70 13,32 10,50 14,50 15,00
Gancho reduzido
0,43 0,14 0,46 0,46 1,38
Cabeça de banana
0,14 0,11 0,21 0,23 0,38
Cabeça de alfinete
0,11 0,14 0,21 0,31 0,38
Gancho acentuado
0 0,04 0 0,12 0
Cabeça separada
0 0 0 0,15 0
Cabeça redonda ou
invertida
1,14 0,86 1,50 2,00 1,88
Cabeça amorfa
0,14 0,29 0,38 1,31 0,75
Cabeça anã
0,14 0,11 0,04 0,04 0,13
Cabeça gigante
0,04 0 0 0 0,13
Flagelo enrolado
6,75 7,54 4,79 6,58 4,75
Flagelo ou ponta do
flagelo torta
1,89 2,11 2,04 1,73 2,75
Ponta do flagelo
enrolada
1,96 2,00 0,88 1,35 2,50
Cauda quebrada
0 0 0 0 0
As percentagens foram comparadas pelo Teste de Qui-quadrado ou, alternativamente pelo teste de Fisher. Em todos
os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0.05.
78
Tabela 21: Morfometria dos túbulos seminíferos de camundongos machos expostos ao TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de
peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo de milho 1,875 3,75 7,50 15
Machos no dia 46 PN (N)
14 13 12 12 4♠
Diâmetro dos túbulos
seminíferos (μm)
Média
231,1±11,70 227,0±8,0 219,4±7,80
a
218,6±11,31
a
215,0±12,8
Mínimo
212,1±10,6 206,0±9,7 202,1±8,7 201,7±8,3 194,6±11,1
a
Máximo
251,1±14,4 248,0±11,2 236,7±8,4
a
240,9±14,5 239,3±18,5
Altura do epitélio dos túbulos
seminíferos (μm)
Média
68,8±5,9 68,8±6,6 62,2±3,9
a, b
64,2±3,9 63,7±1,5
Mínimo
60,8±5,3 59,0±5,1 55,0±3,3
a
56,7±3,2 57,0±3,5
Máximo
77,5±7,9 78,0±9,1 69,3±4,7
a, b
71,1±4,6 70,6±2,9
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida
pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os
símbolos são designados como segue: a: diferente do controle óleo de milho; b: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg; c: diferente da dose de
3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg. ♠somente 3 animais foram analisados, pois não foi encontrado estágios VII-VIII
em uma das lâminas.
79
IV.2.8 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre a fertilidade de machos e fêmeas
A exposição ao TPTH não interferiu com o resultado do teste de fertilidade dos
machos e das fêmeas. Como pode ser visto na Tabela 22, a proporção de fêmeas que
deram à luz por fêmeas que cruzaram, e a razão do número de machos que acasalaram
com pelo menos duas fêmeas pelo número total de machos não difere entre os grupos
tratados com TPTH e os grupos controles. Portanto, não encontramos neste estudo
evidência de que a administração oral de TPTH altere a fertilidade de camundongos
machos e fêmeas. O reduzido número de animais na maior dose (15mg/kg) se deve a
acentuada mortalidade durante o tratamento.
80
Tabela 22: Teste de fertilidade de camundongos (fêmeas) expostos ao TPTH do dia 15 pós-natal ao dia 45 pós-natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,875 3,75 7,5 15
1º cruzamento
Nº de machos que cruzaram/
Nº de machos total (%)
12 / 12 (100%)
12 / 12 (100%)
12 / 12 (100%)
11 / 12 (91,6%)
2 / 2 (100%)
Nº de fêmeas que deram à luz/
Nº de fêmeas que cruzaram (%)
11 / 12 ♠ (100%)
10 / 10 (100%)
9 /10 (90%)
11 / 12 (91,6%)
2 / 2 (100%)
2º cruzamento
Nº de machos que cruzaram/
Nº de machos total (%)
__
__
__
0 / 1 (0%)
__
Nº de fêmeas que deram à luz/
Nº de fêmeas que cruzaram (%)
__
__
0 / 1 (0%)
0 / 1 (0%)
__
1º + 2º cruzamento
Nº de machos que cruzaram/
Nº de machos total (%)
12 / 12 (100%)
12 / 12 (100%)
12 / 12 (100%)
11 / 12 (91,6%)
2 / 2 (100%)
Nº de fêmeas que deram à luz/
Nº de fêmeas que cruzaram (%)
12 / 12 ♠ (100%)
10 / 10 (100%)
9 /10 (90%)
11 / 12 (91,6%)
2 / 2 (100%)
Sítios de implantação
Total (ninhada)
Por ninhada (média±DP)
149
13,55±1,86
140
14,00±2,26
123
13,67±3,24
150
13,64±1,63
27
13,50±3,54
Fetos vivos
Total (ninhada)
Por ninhada (média±DP)
143
13,0±2,0
135
13,50±2,01
110
12,22±3,38
145
13,18±1,47
23
11,50±0,71
Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney, ou por Qui-quadrado. Outros parâmetros foram avaliados pela análise
de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando
p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle óleo de milho; b: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d:
diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg. ♠ Uma fêmea grávida morreu durante a gestação.
81
IV.2.9 Efeitos da exposição durante ao TPTH a pré-puberdade e a
puberdade sobre fígado, baço e timo de fêmeas e machos que participaram do teste
de fertilidade
Na Tabela 23 podem ser encontrados os valores de peso absoluto do timo, fígado
e baço das fêmeas grávidas que participaram do teste de fertilidade, assim como o peso
relativo [(peso do órgão ÷ peso corporal) x 100] destes órgãos. Não observamos
diferenças significativas nos pesos – absoluto e relativo – do timo, baço e fígado das
fêmeas e dos machos que participaram do teste de fertilidade (Tabela 24).
IV.2.10 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre os órgãos reprodutivos de fêmeas e machos que participaram do
teste de fertilidade
Não foram observadas alterações de peso dos órgãos reprodutivos (ovários e
útero) das fêmeas grávidas expostas ao TPTH no período da pré-puberdade e puberdade
(Tabela 23), bem como dos testículos, epidídimos e vesícula seminal dos machos
(Tabela 25), o que indica recuperação dos animais.
82
Tabela 23: Peso dos órgãos de camundongos (fêmeas grávidas) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de
peso corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal e que participaram do teste de fertilidade.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,875 3,75 7,5 15
Fêmeas no dia 80 PN (N)
11 ♠ 10 9♣ 11♣ 2
Timo (g)
0,04±0,02 0,04±0,01 0,05±0,02 0,04±0,01 0,04±0,01
Timo %
0,07±0,03 0,07±0,02 0,08±0,03 0,07±0,02 0,06±0,03
Fígado (g)
3,64±0,42 3,72±0,55 3,62±0,50 3,84±0,36 4,10±0,06
Fígado %
6,34±0,52 6,47±0,69 6,39±0,80 6,51±0,44 6,47±0,76
Baço (g)
0,23±0,06 0,27±0,07 0,25±0,08 0,25±0,08 0,26±0,04
Baço %
0,41±0,11 0,48±0,16 0,45±0,15 0,42±0,13 0,41±0,11
Ovário (g)
0,04±0,02 0,04±0,01 0,05±0,02 0,04±0,02 0,04±0,00
Ovário %
0,07±0,02 0,07±0,02 0,08±0,03 0,06±0,03 0,06±0,01
Útero gravídico (g)
14,11±2,71 13,00±5,44 13,46±6,23 14,18±3,48 17,56±6,72
Útero gravídico %
24,36±2,74 21,67±7,90 22,70±7,08 23,85±4,84 27,03±6,99
Peso corporal gestacional (g)
57,52±5,63 57,81±8,21 57,35±9,57 59,08±5,42 63,87±8,36
Peso corporal menos peso do
útero
43,41±3,45 44,81±4,23 43,89±5,21 44,91±3,95 46,32±1,63
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle; b: diferente da dose de 1,875 mg
TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg. ♠: uma fêmea morreu durante a gestação; ♣: uma fêmea não ficou grávida.
83
Tabela 24: Peso dos órgãos dos camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso
corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal e que participaram do teste de fertilidade.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,785 3,75 7,5 15
Machos no dia 75PN
12 12 12 12 1
Timo (g)
0,05±0,01 0,05±0,02 0,05±0,02 0,05±0,01
0,07
Timo %
0,11±0,03 0,11±0,03 0,11±0,04 0,11±0,03
0,15
Fígado (g)
2,73±0,31 2,75±0,43 2,78±0,27 2,76±0,48
3,09
Fígado %
6,01±0,36 6,19±0,33 6,23±0,54 6,29±0,59
6,81
Baço (g)
0,20±0,03 0,20±0,03 0,17±0,02 0,19±0,03
0,19
Baço %
0,43±0,05 0,45±0,06 0,39±0,05 0,44±0,09
0,42
Peso corporal
45,39±3,64 44,31±5,44 44,74±3,85 43,74±5,41
45,39
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle; b: diferente da dose de 1,875 mg
TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
84
Tabela 25: Peso dos órgãos dos camundongos (machos) tratados oralmente com TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso
corporal/dia) do dia 15 ao dia 45 pós-natal e que participaram do teste de fertilidade.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,785 3,75 7,5 15
Machos no dia 75PN 12 12 12 12 1
Testículo Direito (g)
0,13±0,02 0,12±0,02 0,13±0,02 0,13±0,02
0,15
Testículo Direito %
0,28±0,04 0,27±0,05 0,29±0,04 0,30±0,05
0,33
Testículo Esquerdo (g)
0,12±0,01 0,12±0,01 0,13±0,02 0,12±0,02
0,13
Testículo Esquerdo %
0,26±0,03 0,26±0,04 0,28±0,03 0,28±0,05
0,29
Epidídimos (g)
0,09±0,01 0,09±0,02 0,09±0,01 0,09±0,02
0,10
Epidídimos %
0,19±0,02 0,19±0,04 0,20±0,02 0,20±0,04
0,22
Vesícula Seminal (g)
0,19±0,03 0,19±0,04 0,20±0,03 0,20±0,03
0,25
Vesícula Seminal %
0,43±0,08 0,44±0,08 0,44±0,07 0,45±0,06
0,55
Peso corporal
45,39±3,64 44,31±5,44 44,74±3,85 43,74±5,41
45,39
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores percentuais foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste U de Mann-Whitney. Outros
parâmetros foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi
considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os símbolos são designados como segue: a: diferente do controle; b: diferente da dose de 1,875 mg
TPTH/kg; c: diferente da dose de 3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
85
IV.2.11 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre os parâmetros reprodutivos masculinos dos animais que
participaram do teste de fertilidade
Os efeitos da exposição ao TPTH sobre a produção espermática diária,
contagem de espermatozóides, morfologia dos espermatozóides e concentração de
testosterona sanguínea são mostrados nas Tabelas 26 e 27.
Não encontramos diferenças significativas na produção espermática diária, no
número de espermatozóides e no tempo de trânsito diário entre os grupos expostos ao
TPTH e o controle, demonstrando mais uma vez a recuperação dos animais. A
exposição durante a pré-puberdade e a puberdade ao TPTH não alterou os níveis de
testosterona livre medidos pelo teste de ELISA no soro dos animais, quando comparado
ao grupo controle (Tabela 26). O percentual total de espermatozóides anormais (defeitos
de cabeça e cauda) nos animais expostos ao TPTH não diferiu significativamente do
percentual observado nos animais do grupo controle (Tabela 27).
86
Tabela 26: Variáveis reprodutivas de camundongos machos expostos ao TPTH (óleo de milho; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg
de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-natal que participaram do teste de fertilidade.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo de milho 1,875 3,75 7,50 15
Machos no dia 75 PN (N)
12 12 12 12 1
Nº espermátides por testículo
(x10
6
)
100±38 83±37 82±30 64±28 100
Nº de espermátides por
g
rama
testículo (x10
6
)
422±151 370±169 334±126 276±140 384
Produção espermática diária
87±31 76±35 69±26 57±29 79
Nº espermatozóides por animal
(x10
6
)
302±66 306±81 299±60 269±65 200
Tempo de trânsito espermático
(dias)
3,81±1,40 4,92±2,76 5,02±2,28 6,22±3,87 2,17
Testosterona plasmática
27,7±30,2 40,0±34,9 38,6±24,6 38,5±34,7 0,29
Os dados são apresentados como média ±desvio padrão. Os valores foram avaliados pela análise de variância de um critério (ANOVA), seguida
pelos testes de Tukey e de Bonferroni. Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05. Os
símbolos são designados como segue: a: diferente do controle óleo de milho; b: diferente da dose de 1,875 mg TPTH/kg; c: diferente da dose de
3,75 mg TPTH/kg e d: diferente da dose de 7,5 mg TPTH/kg.
87
Tabela 27: Morfologia dos espermatozóides de camundongos machos expostos ao
TPTH (óleo; 1,875; 3,75; 7,5 e 15 mg/kg de peso corporal) do dia 15 ao dia 45 pós-
natal.
Tratamento TPTH (mg/kg de peso corporal)
óleo 1,875 3,75 7,5 15
Machos no dia 75
PN
12 12 12 12 1
Normal (%)
82,20 80,63 81,42 80,58 81,00
Anormal (%)
17,80 19,38 18,58 19,42 19,00
Gancho reduzido
0,25 0,58 0,29 0,54 0
Cabeça de banana
0,08 0 0,08 0 0
Cabeça de alfinete
0 0,17 0,04 0,04 0
Sem Gancho
0 0 0 0,04 0
Cabeça separada
0 0 0,04 0,13 0
Cabeça redonda ou
invertida
0,54 1,25 1,79 1,17 2,0
Cabeça amorfa
0,17 0,04 0,17 0 0
Cabeça anã
0 0 0 0,04 0
Cabeça gigante
0 0 0 0 0
Flagelo enrolado
10,0 10,71 10,21 10,25 13,0
Flagelo ou ponta do
flagelo torta
4,17 4,13 3,50 4,79 1,0
Ponta do flagelo
enrolada
2,67 2,46 2,38 2,13 3,0
Cauda quebrada
0 0,04 0,08 0,21 0
As percentagens foram comparadas pelo Teste de Qui-quadrado ou, alternativamente pelo teste de Fisher.
Em todos os casos, a diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando p<0,05.
88
V. DISCUSSÃO
O uso de pesticidas na agricultura, e a conseqüente contaminação dos alimentos,
é motivo de preocupação quanto aos impactos em termos de saúde pública. Nesse
contexto, a avaliação toxicológica de pesticidas é importante para a ação da vigilância
sanitária porque permite estabelecer parâmetros de segurança relativos à utilização
desses produtos, viabilizando programas e ações de controle cientificamente embasados
e tecnicamente aplicáveis. A exposição humana aos pesticidas resulta tanto do consumo
de alimentos, quanto ao contato direto, no caso da exposição ocupacional dos
aplicadores rurais e manipuladores (Anvisa, 2007).
Os resíduos de pesticidas presentes nos alimentos podem representar risco para a
saúde da população. Como apresentado no relatório do Projeto de Análise de Resíduos
de Agrotóxicos em Alimentos (PARA), que visa avaliar a qualidade dos alimentos em
relação à contaminação por pesticidas, a grande maioria das culturas investigadas no
Brasil foi positiva para a presença de resíduos de pesticidas acima dos níveis toleráveis.
Alguns estudos sugerem também que há alta incidência de intoxicações com pesticidas,
como por exemplo, carbamatos, piretróides e organofosforados (Faria et al., 1999;
Levigard & Rozemberg, 2004). Além da intoxicação aguda, estudos realizados com
trabalhadores e/ou animais sugerem que a exposição crônica a pesticidas também afeta a
saúde, causando alterações neurológicas, reprodutivas, imunológicas ou metabólicas
(Dalsenter et al., 1997; Sonnenschein & Soto, 1998; Koifman et al., 2002). Assim
sendo, estudos sobre os efeitos à longo prazo da exposição continua a pesticidas são de
grande importância para avaliar o risco dessas substâncias para a saúde humana.
Tem sido relatado que nos últimos anos houve um aumento da incidência de
distúrbios reprodutivos acometendo seres humanos e animais, e suspeita-se que este
fenômeno possa estar relacionado com a crescente exposição a diversas substâncias
químicas (e.g. pesticidas) capazes de afetar processos regulados por hormônios.
Recentemente grande atenção tem sido dada aos possíveis efeitos adversos decorrentes
da exposição durante o desenvolvimento pré, peri- e pós-natal do indivíduo. Vários
estudos sugerem que a exposição a pesticidas e a outras substâncias químicas durante
essas fases do desenvolvimento pode causar distúrbios reprodutivos. Exemplo nesse
89
sentido são o adiantamento da abertura do canal vaginal em ratas expostas ao inseticida
metoxiclor (Gray et al., 1989), os efeitos adversos sobre a espermatogênese causados
após exposição in utero e durante a lactação ao ftalato de di-(2-etil-hexila) (Andrade et
al., 2006) e danos ao tecido testicular causado pelo inseticida lindano (Dalsenter et al.,
1996). A exposição a pesticidas durante o desenvolvimento tem produzido também
alterações reprodutivas funcionais, sem comprometer o crescimento e a viabilidade dos
descendentes, que só se tornam aparentes na idade adulta, como a redução da fertilidade
(Neubert & Chahoud, 1995; Gray & Otsby, 1998; Faqi et al., 1998).
Para a maior parte dos compostos químicos, entretanto, não existem informações
suficientes para estabelecer uma relação entre os níveis de exposição e os efeitos
adversos sobre a saúde reprodutiva humana. Dados obtidos a partir de estudos de
exposições ocupacionais são normalmente imprecisos, e os níveis de exposição na
população em geral são ainda mais difíceis de serem documentados (Thomas, 1996).
Portanto, estudos experimentais com animais são necessários para determinação do
potencial de causar distúrbios reprodutivos. A extrapolação de resultados de estudos em
animais para o homem deve, no entanto, respeitar as possíveis diferenças entre espécies.
O sistema reprodutivo masculino humano, por exemplo, é via de regra mais suscetível à
interferência química adversa do que o de roedores. Assim sendo, o planejamento
experimental, e a interpretação dos resultados de estudos toxicológicos preditivos em
animais devem ser feitos de forma crítica (Zenick et al., 1994; Dourson et al., 2002; Lu,
1991).
Os compostos organoestanhosos foram classificados como desreguladores
endócrinos a partir, principalmente, de estudos com organismos aquáticos. Alguns
desses estudos relataram o aparecimento de órgão sexual masculino em gastrópodes
fêmeas, uma alteração biológica denominada imposex (Golub & Doherty, 2004). Em
relação aos efeitos de compostos organoestanhosos sobre a reprodução de mamíferos,
diversos estudos sugerem que os triorganoestanhosos causam toxicidade materna e
efeitos embriofetotóxicos (Quadro 3), alterações morfológicas e funcionais do sistema
reprodutivo de ratos (machos e fêmeas), bem como diminuição do peso corporal e dos
órgãos reprodutivos quando a exposição ocorre no período peri e pós-natal e durante a
puberdade (Quadro 4). O TPTH é pesticida agrícola amplamente utilizado no Brasil.
Entretanto, até a presente data, foram realizados poucos estudos voltados para a
90
avaliação do risco do TPTH, durante períodos críticos do desenvolvimento, para a
função reprodutiva de roedores machos e fêmeas. Neste trabalho estudamos os efeitos
do TPTH sobre a função reprodutiva de camundongos expostos in utero e durante a
lactação (experimento 1), e durante a pré-puberdade e a puberdade, período em que os
animais imaturos são mais vulneráveis, uma vez que, a maturação dos órgãos
reprodutivos e sexuais ainda está em curso (experimento 2). Os estudos aqui
apresentados complementam e estendem os estudos anteriores realizados em nosso
laboratório com este pesticida triorganoestanhoso (Viana, 2002 e Sarpa, 2003).
91
Quadro 3: Estudos da Toxicidade Materna e Embriofetotoxicidade dos Compostos Triorganoestanhosos.
Espécie/
Exposição
Doses Toxicidade
Materna
Teratogenicidade Cesárea Tipo de avaliação
TBTO
Baroncelli et al
1990
Camundongos/
dia 6 a 15
0;5; 20
e 40 mg/kg
≥40mg/kg ≥40mg/kg Sim alterações visíveis
externamente
Baroncelli et al
1995
Camundongos/
dia 6 a 15
0;5;10;20
e 30 mg/kg
< 5mg/kg dados não
conclusivos
Não filhotes após
nascimento espontâneo
Davis et al
1987
Camundongos/
dia 6 a 15
0;1,2; 3,5;5,8;
11,7; 23,4
e 35mg/kg
≥11,7mg/kg ≥11,7mg/kg Sim alterações de esqueleto
e vísceras
Crofton et al
1989
Ratos/
dia 6 a 20
0;2,5;5;10;12
e 16 mg/kg
≥10mg/kg dados não
conclusivos
Não filhotes após
nascimento espontâneo
Faqi et al
1997
Camundongos/
dia 6 a 17
0;0,5; 1,5; 4,5,
13,5 e 27 mg/kg
≥27mg/kg ≥27mg/kg Sim alterações de esqueleto
e vísceras
TBTA
Noda et al
1991b
Ratos/
dia 7 a 17
0;1;2;4;8
e 16mg/kg
≥16mg/kg ≥16mg/kg Sim alterações de esqueleto
e vísceras
TBTCl
Itami et al 1990
Ratos/
dia 7 a 15
0;5;9;15
e 25 mg/kg
≥ 9mg/kg
Nenhum
Efeito*
Sim
alterações de esqueleto
e vísceras
Ema et al 1995 Ratos/
dia 7 a 9
0;25;50
e 100 mg/kg
Nenhum
efeito
Nenhum
Efeito*
Sim alterações de esqueleto
e vísceras
dia 10 a 12 idem ≥100 mg/kg ≥100 mg/kg idem idem
dia 13 a 15 idem ≥100 mg/kg ≥25 mg/kg** idem idem
* Após avaliação sistemática de esqueleto e vísceras não foram encontrados efeitos teratogênicos.
** Registro de efeito teratogênico em níveis de dose não-tóxico para o organismo materno
.
92
(continuação do Quadro 3)
Espécie/
Exposição
Doses Toxicidade
Materna
Teratogenicidade Cesárea Tipo de avaliação
TPTCl
Ema et al
1997
Ratos/
dia 0 a 3
0;3,1;4,7
e 6,3mg/kg
> 6,3mg/kg Nenhum
Efeito *
Sim alterações de esqueleto
e vísceras
dia 4 a 6 0; 6,3; 12,5
e 25mg/kg
> 12,5mg/kg Nenhum
Efeito *
idem idem
Ema et al
1999
Ratos/
dia 7 a 9
0;3,1;6,3;9,4
e 12,5mg/kg
> 6,3mg/kg Nenhum
Efeito *
Sim alterações de esqueleto
e vísceras
dia 10 a 12 0; 6,3; 9,4
e 12,5 mg/kg
< 6,3mg/kg Nenhum
Efeito *
idem idem
dia 13 a 15 0; 6,3; 9,4
e 12,5 mg/kg
< 6,3mg/kg Nenhum
Efeito *
idem idem
TPTA
Noda
et al 1991a
Ratos/
dia 7 a17
0;1,5;3;6;9
e 12mg/kg
> 9mg/kg
Nenhum
Efeito*
Sim
alterações de esqueleto
e vísceras
TPTH
Chernoff
et al 1990
Ratos/
dia 6 a 15
0 e 13 mg/kg 13mg/kg Nenhum
Efeito*
Sim alterações de esqueleto
e vísceras
Viana,
2002#
Camundongos/
dia 6 a 17
0; 7,5;15 e
30mg/kg
> 15mg/kg dados não
conclusivos
Não filhotes após nascimento
espontâneo
Sarpa, 2003# Camundongos/
dia 6 a 17
0;3,75;7,5;15 e
30mg/kg
> 7,5mg/kg > 3,75mg/kg** Sim alterações de esqueleto
e vísceras
* Após avaliação sistemática de esqueleto e vísceras, não foram encontrados efeitos teratogênicos.
** Registro de efeito teratogênico em níveis de dose não-tóxico para o organismo materno.
# Estudo realizado em nosso laboratório.
93
Quadro 4: Estudos da Toxicidade Peri e Pós-Natal dos Compostos Triorganoestanhosos
Autores/
Ano
Espécie Exposição/morte Doses/via Efeitos
TBTCl
Cooke et al.,
2004
Ratos Sprague-
Dawley
Mães: do dia 8 gestação até
o desmame e filhotes
continuaram sendo tratados
e foram sacrificados nos
dias 30, 60 e 90 PN
0; 0,025; 0,25 e
2,5mg/kg / via
oral
Nenhum efeito sobre a mãe, o tamanho da ninhada, razão de
sexos e sobrevivência até o desmame; ↓ do peso do timo, baço e
fígado dos filhotes, mas as lesões histopatológicas não foram
significativas.
Omura et al.,
2001
Ratos Wistar
(avaliação dos
machos)
Gestação e lactação – estudo
de duas gerações / F1 morta
no dia 119 PN e F2 morta
no dia 91 PN
0; 5; 25 e
125µg/g na dieta
Atraso no dia da abertura dos olhos, ↓ do peso corporal e dos
testículos, epidídimos e vesícula seminal nas gerações F1 e F2;
↓ do nº de espermátides na geração F1 e F2 e de
espermatozóides na F2; ↑ na [ ] de testosterona em F1 e F2;
alterações histopatológicas, não significativas, nos túbulos
seminíferos em F1 e F2.
Ogata et al.,
2001
Ratos Wistar
(avaliação das
fêmeas)
Gestação e lactação – estudo
de duas gerações / F1 morta
no dia 148 PN e F2 morta
no dia 92 PN
0; 5; 25 e
125µg/g na dieta
Índice de fertilidade normal; ↓ do nº de fetos vivos e do peso
corporal dos filhotes no DPN 1; ↓ ganho de peso corporal
gestacional; Atraso no dia da abertura dos olhos e da vagina; ↑
na distância anogenital no DPN 1; alterações no ciclo estral; ↓
do peso dos ovários e ↑ no peso do útero; nenhuma alteração
histopatológica nos ovários.
Makita et al.,
2003
Ratos Wistar
(avaliação das
fêmeas)
Do dia 1 de gestação ao dia
21 pós-natal (desmame);
fêmeas sacrificadas com 6
semanas de idade.
25µg/g na dieta ↓ do peso materno e do peso dos filhotes no DPN 28; Atraso no
dia da abertura dos olhos; ↓ na [ ] de LH; não houve diferenças
na abertura de vagina, nem alterações patológicas.
Makita et al.,
2004
Ratos Wistar
(avaliação dos
machos)
Do dia 1 de gestação ao dia
21 pós-natal (desmame);
machos sacrificados com 6
semanas de idade
25µg/g na dieta ↓ do peso materno e do ganho de peso dos filhotes; atraso na
abertura dos olhos; ↓ do peso da próstata e do LH; não foram
observadas alterações na testosterona, no dia da separação
prepucial e nem histopatológicas.
94
Continuação: Quadro 4
Autores/
Ano
Espécie Exposição/morte Doses/via Efeitos
TBTCl
Makita et al.,
2006
Ratos Wistar
(avaliação dos
machos)
Do dia 1 de gestação ao dia
21 pós-natal (desmame);
machos sacrificados com 12
semanas de idade.
25µg/g na dieta não foram observadas alterações nos níveis de testosterona, LH
e FSH, no dia da separação prepucial, no peso dos órgãos
reprodutivos, na contagem e morfologia de espermatozóides e
nem alterações histopatológicas.
Makita et al.,
2005
Ratos Wistar Da 6º semana a 12º semana
pós-natal; sacrificados logo
após o tratamento.
25µg/g na dieta ↑ do peso corporal e tendência de aumento no peso do fígado e
do baço; ↓ do peso do timo; não foram observadas alterações
nos níveis de testosterona, LH e FSH, no peso dos órgãos
reprodutivos, na contagem de espermatozóides e nem alterações
histopatológicas.
YU et al.,
2003.
Ratos Sprague-
Dawley
Do dia 35 ao 44 de idade;
sacrificados 5 semanas após
o fim do tratamento.
5; 10 e 20mg/kg
/ via oral
não foram observadas alterações no peso corporal e dos órgãos
reprodutivos, e nem alterações histopatológicas nos testículos; ↓
do nº de espermatozóides, espermátides e da produção
espermática diária
TBT e
TPT
Grote et al.,
2004.
Ratos Wistar
(avaliação dos
machos)
Do dia 23 ao dia 52 PN;
sacrificados no dia 53 PN.
0,5 e 15mg
TBT/kg; 2 e
12mgTPT/kg /
via oral
TBT: atraso na separação prepucial; ↓ do peso corporal; ↓ nos
níveis de testosterona (15mg/kg); ↑ do peso do epididimo e
próstata (0,5mg/kg) e ↓ desses órgãos na dose de 15mg/kg.
TPT: alta mortalidade (12mg/kg); acentuada perda de peso
corporal; ↓ no peso do timo e baço; ↓ nos níveis de testosterona
(2 e 6mg/kg) e do LH (2mg/kg), e ↑ do LH (6mg/kg); ↓ do peso
dos testículos e epidídimos.
TPTCl
Grote et al.,
2006.
Ratos Wistar
(avaliação das
fêmeas)
Do dia 23 ao dia 52 PN;
sacrificados nos dias 33PN e
após o dia 53PN (1º estro).
2 e 6mgTPT/kg /
via oral
Dia 33PN: ↓ no peso do timo; ↑ do peso do útero (2mg/kg) e ↓
na dose de 6mg/kg; Dia 53PN: ↑ do peso do fígado e dos
ovários; ↑ do peso do útero (2mg/kg) e ↓ na dose de 6mg/kg; ↑
da [ ] estradiol; atraso na abertura de vagina (6mg/kg).
TBTO/
TPTH
Reddy et al.,
2006.
Camundongos
Suíço Albino (55
dias de vida)
Durante 3 dias alternados
(1º, 3º e 5º de
experimentação) / no 25º dia
de experimentação.
10 e 25µg /kg
(TBTO e
TPTH)/via i.p.
↓ no peso dos órgãos reprodutivos e do nº de espermatozóides; ↓
nos níveis de testosterona e ↑ do LH e FSH.
95
V.1 Experimento 1
V.1.1 Toxicidade materna e efeitos pré e peri-natais
As investigações sobre a origem de malformações congênitas em mamíferos,
assim como os ensaios preditivos relacionados à Toxicologia do Desenvolvimento, são
relativamente recentes. Vários fatores contribuíram para o atraso desta área da
Toxicologia, entre eles está a idéia - preconcebida - de que o desenvolvimento
embrionário de mamíferos, por ocorrer no interior do útero materno, estaria protegido
dos efeitos adversos de agentes ambientais. Acreditava-se que as conseqüências da
exposição materna aos agentes ambientais poderiam ser unicamente do tipo “tudo-ou-
nada”, ou seja, ou o agravo seria severo o suficiente para causar a morte do embrião e a
interrupção da gravidez, ou então não causaria mal algum ao concepto (Manson, 1986).
Somente a partir da década de 1930 começaram a surgir as primeiras constatações
experimentais de que a proteção materna não era tão eficiente a ponto de impedir que
fatores externos (ambientais) causassem anomalias em embriões de mamíferos
(Persuad, 1979).
Hoje é conhecido que determinados agentes químicos podem alterar o
desenvolvimento pré-natal e causar alterações visíveis ao nascimento ou seqüelas que só
serão detectadas na vida adulta. Enquanto muitas anomalias congênitas são
diagnosticadas já ao nascimento, ou até antes deste (e.g. por ultra-sonografia ou por
amniocentese e exame do cariótipo), outras só são detectadas bem mais tarde ou até
mesmo décadas depois, como é o caso da carcinogênese transplacentária (e.g.
adenocarcinoma de vagina que resulta da exposição in utero ao dietilestilbestrol e se
manifesta em mulheres adultas jovens). Para avaliar o efeito tóxico de um determinado
agente químico durante a gestação é preciso levar em consideração que a toxicocinética
pode ser modificada por essa condição fisiológica que envolve não somente o
organismo materno, mas sim, uma nova unidade denominada unidade “materno-
placentáriafetal” (Lemonica, 2003). Vários estudos mostram que a manutenção da
homeostasia, i.e. da constância do meio interno, é essencial ao desenvolvimento
embriofetal normal. Assim sendo, o aparecimento do efeito embriofetotóxico induzido
por determinada substância química pode resultar da interação desta substância com
outros fatores que incidem sobre o organismo materno, como e.g. o estado nutricional,
96
idade materna, estresse e outros fatores ambientais (Chahoud et al., 2002; Noda et al.,
2001; Chernoff et al., 1988; Chernoff et al., 1989).
Há diversos indícios de que a manutenção da homeostasia materna é essencial
para o desenvolvimento embriofetal normal. Por exemplo, o estresse experimentado
pela mãe durante a gestação pode alterar o desenvolvimento pré- e/ou pós-natal, além de
ser capaz também de potencializar o efeito teratogênico de outros agentes (Chernoff et
al 1988). Doenças maternas, tais como diabetes mellitus e hipertemia, podem
igualmente comprometer os processos normais de embriogênese, resultando em efeitos
embriotóxicos. A ação tóxica de xenobióticos sobre o organismo materno pode, de
forma inespecífica, alterar o desenvolvimento normal da prole. Por outro lado, a
toxicidade materna nem sempre está associada à indução de anormalidades do
desenvolvimento embriofetal. Por exemplo, o estireno, mesmo em níveis de dose
altamente tóxicos para a mãe, não causa alterações embriofetais (Murray et al 1978). O
TPTH, por outro lado, causou efeitos embriofetotóxicos em camundongos expostos in
utero em níveis de doses não tóxicos para o organismo materno, apontando uma certa
seletividade dos efeitos adversos sobre o desenvolvimento embriofetal (Sarpa et al.,
2007).
A interpretação de efeitos adversos sobre o desenvolvimento da prole, em níveis
de dose tóxicos para o organismo materno é difícil, uma vez que é praticamente
impossível distinguir os efeitos decorrentes da exposição direta do embrião, daqueles
induzidos indiretamente, pela alteração da fisiologia materna. A toxicidade materna, nos
estudos de toxicidade pré-natal é, via de regra, confirmada por avaliações que podem
incluir: 1. redução do ganho de peso corpóreo, 2. ocorrência de óbitos durante o período
de tratamento, 3. redução do consumo de água e/ou ração, 4. aparecimento de sinais
clínicos e 5. alterações no peso e/ou morfologia dos órgãos. Nas diretrizes das agências
regulatórias internacionais recomenda-se que os estudos de toxicidade reprodutiva, além
de conduzidos de forma a viabilizar a avaliação da relação dose-efeito, incluam pelo
menos um nível de dose que produza toxicidade materna. Acredita-se que, ao
incluirmos um nível de dose tóxico para o organismo materno, estaríamos aumentando
as chances de trabalhar em faixas de dose capazes de produzir algum tipo de efeito
sobre o desenvolvimento embriofetal.
97
Como um agente químico pode interferir no desenvolvimento dos descendentes
por afetar diretamente os filhotes, ou indiretamente, ao comprometer a capacidade da
mãe em sustentar a prole, tais informações são importantes e devem ser levadas em
consideração na interpretação dos efeitos tóxicos de uma substância.
Nas condições experimentais do presente estudo, a exposição ao TPTH não
provocou mortes, alterações no ganho de peso corporal das fêmeas grávidas, nem
qualquer outro sinal de toxicidade aparente, tais como, diarréia, perda do apetite,
piloereção, tremores ou convulsões, nas mães. A única alteração observada no
organismo materno diz respeito ao peso dos órgãos avaliados.
Como dito anteriormente, a toxicidade de uma substância pode ser evidenciada,
também, pelo aspecto macroscópico e peso de órgãos durante a necrópsia. Por ser o
fígado o principal órgão do metabolismo de xenobióticos, em casos de intoxicação, o
seu volume e/ou peso pode estar aumentado. As mães expostas à maior dose de TPTH
apresentaram um drástico aumento do peso relativo do fígado, indicando toxicidade
materna nesse nível de dose. Órgãos do sistema imunológico, como o timo e o baço,
também foram examinados na necrópsia.
Apesar dos compostos trifenil estanho serem considerados como agentes
imunotóxicos menos severos que compostos tributil estanho, ainda assim o TPTH exibe
claros efeitos imunotóxicos. (WHO, 1999). Os efeitos desses compostos sobre o sistema
imunológico de mamíferos são bem documentados e foram observados tanto em estudos
de curta duração, como em estudos de exposição mais prolongada, conduzidos em ratos,
camundongos e cobaias (WHO, 1992, CICAD National Committee, 1997). Dentre os
diferentes órgãos e parâmetros relacionados ao sistema imunológico; o baço, o timo, a
produção de imunoglobulinas e o número absoluto e relativo de linfócitos estão entre
aqueles que foram mais intensamente afetados pela exposição a compostos trifenil
estanho. No nosso estudo, notamos uma tendência (não estatisticamente significativa) à
redução do peso do absoluto e relativo do baço. Este resultado é consistente com os
resultados obtidos nos estudos realizados por Viana (2002) e Sarpa (2003), e podem ser
atribuídos ao efeito imunotóxico do TPTH.
98
Dados relativos à duração da gestação, ao número de sítios de implantação no
útero, ao número de filhotes ao nascimento e a viabilidade dos filhotes, sugeriram a
ausência de toxicidade materna e embriofetal. Todavia, o canibalismo de 3 ninhadas
completas ao nascimento na dose de 7,5mg/kg indica que houve um efeito que pode ter
sido devido a alterações nas mães ou, provavelmente, na prole exposta in utero, já que o
canibalismo de filhotes malformados ou inviáveis é comportamento exibido por
roedores e outros mamíferos. Nos filhotes dos grupos em que não ocorreu canibalismo,
não observamos anomalias externas. Observamos uma redução – dose relacionada – do
peso médio dos filhotes no dia 1 de vida pós-natal, indicando que ocorreu toxicidade
peri-natal em níveis de doses não tóxicos para as mães. Esse efeito, embora significativo
no primeiro dia de vida pós-natal, foi reversível, de modo que, a partir do dia 5 de vida
pós-natal, a diferença entre os grupos não foi mais detectada pela análise estatística.
Esses resultados indicam que, nas condições experimentais deste estudo, o TPTH
apresentou toxicidade peri-natal em camundongos.
V.1.2 Efeitos da exposição ao TPTH in utero e durante a lactação sobre o
aparecimento dos marcos do desenvolvimento pós-natal
O desenvolvimento no período de amamentação, caracterizado pelo ganho de
peso, descolamento das orelhas, aparecimento de pêlos, abertura de olhos e erupção de
incisivos, não foi alterado pela exposição ao TPTH. Viana (2002) encontrou diferenças
nos marcos somáticos do desenvolvimento (erupção de incisivos e abertura de olhos)
em camundongos expostos apenas durante a gestação ao TPTH. Essas alterações foram
notadas, porém, em níveis de doses mais altos do que 7,5 mg/kg de peso / dia. Estes
resultados sugerem, portanto, que o TPTH nas doses empregadas não afetou
adversamente o desenvolvimento pós-natal dos filhotes das mães expostas ao TPTH.
Para avaliação da possível interferência do TPTH com o desenvolvimento sexual
da prole exposta via organismo materno, determinamos o dia da descida dos testículos
para a bolsa escrotal, e o dia da abertura do canal vaginal. Tem sido relatado que
agentes que perturbam o equilíbrio hormonal (“desreguladores endócrinos”) podem
acelerar ou retardar estes processos (U.S. EPA, 1996). Nesse contexto, Makita et al.
(2003 e 2006) não observaram atraso na abertura de vagina e na separação prepucial,
respectivamente, de ratos (fêmeas e machos) expostos in utero e durante a lactação a 25
99
µg/g TBTCl incorporado na dieta. Neste estudo, a exposição ao TPTH in utero e
durante a lactação não alterou os períodos médios para a descida dos testículos ou
abertura do canal vaginal, não interferindo, portanto, com o início da puberdade nos
camundongos, tanto machos quanto fêmeas.
V.1.3 Efeitos da exposição in utero e durante a lactação ao TPTH sobre
fertilidade
A exposição ao TPTH in utero e durante a lactação não afetou adversamente a
fertilidade de camundongos - machos e fêmeas - como demonstrado pelos índices de
cruzamentos e fertilização, o que é consistente com os resultados encontrados por Ogata
& Omura (2001). Em estudo de exposição contínua por duas gerações consecutivas,
esses autores não observaram diferenças no índice de fertilidade em animais expostos ao
TBTCl (5, 25 e 125 µg/g de peso corporal/dia) via dieta. A ausência de efeitos sobre a
fertilidade dos animais expostos in utero e durante a lactação ao TPTH se deve,
provavelmente, a uma característica dos roedores que, em geral, produzem e armazenam
espermatozóides em quantidade muito superior à quantidade necessária para garantir a
fertilidade. Em roedores, a produção espermática pode ser reduzida em 90% sem
comprometer a fertilidade.
V.1.4 Efeitos da exposição ao TPTH in utero e durante a lactação sobre os
órgãos e sobre os parâmetros reprodutivos dos filhotes na idade adulta
Os animais foram avaliados na idade adulta quanto ao peso do fígado e do baço.
Não foram observadas alterações dignas de nota no peso desses órgãos entre os
diferentes grupos experimentais. Cooke et al. (2004) registraram redução no peso do
timo, baço e fígado nos filhotes de ratos Sprague-Dawley expostos a 0,025; 0,25 e 2,5
mg TBTCl/kg in utero e durante a lactação. Nesse estudo, no entanto, os animais
continuaram sendo expostos do desmame até a idade adulta. Os resultados do nosso
estudo, entretanto, indicam que as doses que testamos não produziram toxicidade na
prole exposta quando esta foi avaliada na idade adulta.
Além do fígado e do baço, examinamos também o peso dos órgãos reprodutivos
femininos e masculinos. Alterações do peso de órgãos reprodutivos podem indicar
100
toxicidade reprodutiva. Modificações do peso absoluto e relativo de órgãos reprodutivos
indicam que um agente pode ser potencialmente prejudicial ao sistema reprodutivo
(Zenick et al., 1994). Não observamos alterações dos pesos dos ovários e do útero das
fêmeas mortas na idade adulta. Nos machos, o peso dos testículos apresenta variação
pequena entre animais da mesma espécie, sendo um marcador sensível de dano à
gônada. No presente estudo, não observamos diferenças entre controles e expostos ao
TPTH quanto ao peso dos testículos. Outros autores também não observaram diferenças
do peso dos testículos em ratos expostos ao TBT (25 µg/g de peso corporal/dia) no
período perinatal, através da dieta, e mortos com 6 e 12 semanas de idade. (Makita et
al., 2004; Makita & Omura, 2006). Os dados referentes aos pesos dos órgãos
reprodutivos indicam que, nas condições experimentais do presente estudo, o TPTH não
causou toxicidade reprodutiva nas fêmeas e nos machos expostos in utero e durante a
lactação e mortos na idade adulta.
O número de células espermáticas representa a integridade da espermatogênese
nos testículos, enquanto o número de espermatozóides na cauda do epidídimo é uma das
avaliações mais significativas da função do epidídimo (Amann, 1982; Zenick et al.,
1994). O tamanho dos testículos e a produção espermática na idade adulta dependem do
número de células de Sertoli formadas no período perinatal (Sharpe, 1994; Jensen et al.,
1995; Toppari et al., 1996). A exposição aos contaminantes químicos ambientais com
atividade estrogênica durante esse período, pode reduzir a multiplicação dessas células
em decorrência da supressão da síntese e secreção do hormônio folículo estimulante
(Toppari et al., 1996; Sweeney, 2000). Esse efeito pode ser irreversível, uma vez que as
células de Sertoli não se dividem em roedores adultos, e constituem uma população fixa
de células que dão suporte físico e bioquímico às células germinativas durante o
processo de espermatogênese (Orth, 1982). Para verificar se a exposição ao TPTH, in
utero e durante a lactação, foi capaz de afetar tardiamente os parâmetros reprodutivos
masculinos, neste estudo os filhotes foram avaliados quanto a número de
espermatozóides, produção espermática diária e tempo de trânsito espermático quando
alcançaram a idade adulta (cerca de 90 dias). Não foram observadas diferenças entre os
grupos expostos ao TPTH e os controles não expostos, indicando ausência de efeitos
tóxicos sobre a espermatogênese dos machos expostos in utero e durante a lactação e
mortos na idade adulta. Todavia, para verificar se houve ausência de dano, ou uma
101
reversão do dano, um grupo de filhotes deveria ter sido morto logo após o fim do
tratamento.
102
V.2 Experimento II
V.2.1 Toxicidade geral e correlação entre o ganho de peso corporal e os
marcos físicos do desenvolvimento
Alterações do sistema reprodutivo podem ser secundárias à ocorrência de
toxicidade geral. A toxicidade do TPTH para os animais (machos e fêmeas) foi avaliada
através do ganho de peso corporal, do peso do fígado, timo e baço e do monitoramento
diário dos animais para detectar sinais clínicos de toxicidade, tais como, perda de pêlo,
convulsões, salivação, tremores e piloereção. A avaliação do peso corporal durante o
tratamento indica o estado de saúde geral do animal e a redução do ganho de peso
corporal pode ser um reflexo de toxicidade sistêmica (Zenick et al., 1994; U.S. EPA,
1996).
No presente estudo, observamos acentuada mortalidade (80%) das fêmeas e dos
machos a partir do 6º dia de tratamento com a maior dose de TPTH (15mg/kg de peso
corporal/dia). A exposição ao TPTH também reduziu o ganho ponderal (média±DP) das
fêmeas e dos machos na primeira semana do tratamento em todas as doses estudadas,
mas houve recuperação nas semanas que se seguiram de modo que, ao final do
tratamento, a redução foi observada apenas com as duas maiores doses (Quadro 5).
Esses resultados indicam que os animais podem ter se tornado tolerantes ao tratamento
com TPTH.
Quadro 5: Esquema indicando a redução do ganho de peso corporal durante as quatro
semanas de tratamento.
TPTH
1º semana 2º semana 3º semana 4º semana
1,875mg/kg
Macho
↓ -- -- --
Fêmea
↓ -- -- --
3,75mg/kg
Macho
↓ ↓ ↓ --
Fêmea
↓ ↓ -- --
7,5mg/kg
Macho
↓ ↓ ↓ ↓
Fêmea
↓ ↓ ↓ ↓
15mg/kg
Macho
↓ ↓ ↓ ↓
Fêmea
↓ ↓ ↓ ↓
↓: redução do ganho de peso corporal diferente estatisticamente do grupo controle (óleo).
103
É importante ressaltar que, nas fêmeas, a média de peso corporal pode variar
com o estado fisiológico do animal, uma vez que estrógeno e progesterona influenciam
a ingestão alimentar e o gasto de energia. Um composto com atividade estrogênica pode
reduzir a ingestão de alimentos e, portanto, interferir com a massa corporal de ratas.
Interferências endócrinas extragonadais sobre o hormônio do crescimento, ou
hormônios tireoideanos, por exemplo, podem levar ao retardo de desenvolvimento, com
atraso do início da puberdade ou interferir com o ciclo sexual e fertilidade (U.S. EPA,
1996). No nosso estudo, além da drástica diminuição no ganho de peso corporal das
fêmeas expostas ao TPTH, observamos também atraso do desenvolvimento sexual (dia
da abertura da vagina) nas duas maiores doses, quando comparadas ao grupo controle (0
= 27 pós-natal, 7,5 mg/kg = 31 pós-natal e 15mg/kg = 39 pós-natal). É sabido que
tratamentos com hormônios sexuais afetam a abertura de vagina. Tratamento pré-natal e
neonatal com estrógenos acelera a abertura de vagina (Rodriguez et al., 1993; Biegel et
al., 1998), enquanto o tratamento com andrógenos retarda a abertura de vagina
(Hoepfner & Ward, 1988; Rhees et al., 1997). Desreguladores endócrinos também
afetam a abertura de vagina. A exposição pré-natal e/ou neonatal ao desregulador
endócrino estrogênico, metoxiclor, acelera a abertura da vagina, enquanto que a
exposição pré-natal a 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina e 3,3`,4,4`,5-pentacloro-
bifenila atrasa a abertura de vagina (Gray et al., 1989; Gray e Otsby, 1995; Faqi et al.,
1998). O adiantamento do dia da abertura da vagina causado por estrógenos e
metoxiclor foi acompanhado pela diminuição do peso corporal no dia da abertura da
vagina (Rodriguez et al., 1993; Gray et al., 1989). Nesse estudo, observamos um atraso
do dia da abertura da vagina nos animais expostos as duas maiores doses. Se o atraso do
dia da abertura de vagina foi causado pelo retardo no desenvolvimento sexual e não
devido a uma carência do crescimento, então o peso corporal no dia da abertura da
vagina deveria estar aumentado. No entanto, o peso corporal no dia da abertura da
vagina, em nosso estudo, não estava aumentado nas duas maiores doses, sugerindo que
o efeito induzido pelo TPTH não está hormonalmente relacionado (Quadro 6). Portanto,
o atraso da abertura do canal vaginal pode estar associado à toxicidade geral, uma vez
que ele ocorreu em níveis de doses que claramente reduziram o peso corporal dos
animais.
104
Além da abertura do canal vaginal e do peso do útero, outros parâmetros são
usados para avaliar a atividade estrogênica de compostos químicos, entre eles, a
receptividade sexual das fêmeas e a presença de células cornificadas na vagina
(determinação do estro). O prolongamento do estro pode ser uma resposta à exposição a
um agente com propriedades estrogênicas ou a um agente capaz de bloquear a ovulação.
Dodds et al. (1938) (apud EDSTAC, 1998) observaram indução de estro persistente em
ratas ovariectomizadas após exposição ao dietilestilbestrol (DES). Já o diestro
prolongado pode ser resultado da exposição a agentes que afetam o desenvolvimento
dos folículos ovarianos, que reduzem o número de folículos primordiais, ou que
interferem com a ação das gonadotrofinas no ovário (U.S. EPA, 1996). Com relação a
possível interferência dos compostos triorganoestanhosos sobre a função reprodutiva
(ciclo estral) de fêmeas, Ogata et al. (2001), após um estudo de duas gerações com ratas
expostas ao TBTCl (125 µg/g de peso corporal/dia) através da dieta, observaram
prejuízo da ciclicidade do estro, associado ao atraso da abertura da vagina. Até a
presente data, não foram relatados estudos relativos aos efeitos do TPTH sobre o ciclo
estral de camundongos. No nosso estudo, a exposição ao TPTH causou irregularidade
do ciclo estral e atrasou o primeiro estro das fêmeas nas doses de 7,5 e 15 mg TPTH/kg
de peso corpóreo, sem alterar o peso corporal no 1º estro e o tempo, em dias, entre a
abertura do canal vaginal e o 1º estro. Esse atraso no dia do primeiro estro nas duas
maiores doses coincide com o atraso no dia da abertura do canal vaginal (Quadro 6) e
com a redução do peso corporal até a 4º semana de tratamento (Quadro 5) indicando,
mais uma vez, que esse efeito pode estar associado a uma toxicidade sistêmica, e atraso
geral do desenvolvimento somático, e não ao efeito de desregulação endócrina
associado aos compostos triorganoestanhosos. Os mecanismos com relação aos efeitos
do TPTH sobre o ciclo estral não são conhecidos.
Nos machos, a época (em dias) em que ocorre a descida dos testículos para a
bolsa escrotal e a separação prepucial são parâmetros andrógeno-dependentes,
constituindo sinal externo do estado de desenvolvimento sexual dos machos (Dalsenter
et al., 1999). Em um estudo com ratos expostos ao TBT (15mg/kg de peso corporal/dia)
durante a puberdade, Grote et al. (2004) verificaram um atraso significativo na completa
separação prepucial, que começou no dia 46 pós-natal. Esse atraso, entretanto, não foi
observado nos animais expostos a 6mg TPT/kg de peso corporal/dia. Makita et al.
(2004) e Makita & Omura (2006), por outro lado, não observaram diferenças do dia da
105
separação prepucial em ratos Wistar expostos no período perinatal, através da dieta, ao
TBT (25 µg/g de peso corporal/dia) e mortos com 6 e 12 semanas de idade,
respectivamente. Os mesmos autores (Makita et al., 2001) não encontraram atraso na
descida dos testículos em animais expostos a doses de 5, 25 e 125 µg/g de peso
corporal/dia de TBTCl na dieta, em estudo de toxicidade reprodutiva de duas gerações
com Ratos Wistar. Neste estudo, a diminuição do ganho de peso corporal dos machos
(Quadro 5) foi acompanhada de um atraso na descida de testículos, a partir da dose de
3,75mg TPTH/kg,
indicando que esse atraso pode estar relacionado a uma toxicidade
sistêmica. Os dados apresentados no Quadro 6
confirmam essa hipótese, uma vez que, o
peso corporal no dia da descida de testículo não diferiu entre os grupos. Devido ao
reduzido tamanho do animal com que trabalhamos (camundongos), não foi possível
determinar com precisão o dia da separação prepucial.
Quadro 6: Relação entre o peso corporal médio e os dias da abertura de vagina e da
descida de testículos.
Óleo 1,875mg
TPTH/kg
3,75mg
TPTH/kg
7,50mg
TPTH/kg
15mg
TPTH/kg
Mediana do dia da abertura
de vagina (dias) x peso
médio corporal no dia da
abertura de vagina (g)
27
17,00
27,5
16,97
28
16,66
31*
17,65
39,5*
17,88
Mediana do dia da descida
de testículos (dias) x peso
médio corporal no dia da
descida de testículos (g)
21
11,40
21
10,95
22,5*
10,83
23*
10,56
29*
11,63
*diferente estatisticamente significativo do controle (óleo).
V.2.2 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre os órgãos de fêmeas e machos mortos no dia 46 pós-natal
Além das alterações do peso corporal, as modificações do peso dos órgãos
também são indicadores de toxicidade sistêmica (Zenick et al., 1994; U.S. EPA, 1996).
Neste estudo determinamos o peso do fígado, do timo e do baço dos animais (machos e
fêmeas) expostos ao TPTH do dia 15 ao 45 pós-natal.
106
Observamos um aumento do peso relativo do fígado, a partir da dose de 3,75mg
TPTH/kg, nas fêmeas e na dose de 7,5 e 15mg TPTH/kg, nos machos. Grote et al.
(2006) também encontraram um aumento do peso absoluto e relativo do fígado nas ratas
expostas durante a puberdade a 6mg TPT/kg de peso corporal/dia e sugeriram que este
aumento dever-se-ia a uma indução das enzimas hepáticas, que resultaria,
possivelmente, da acumulação e subseqüente aumento do metabolismo da substância.
No nosso estudo, também observamos um aumento do peso relativo do timo das fêmeas
expostas à maior dose de TPTH e, nos machos, aumento relativo do peso do timo nas
duas maiores doses (7,5 e 15mg /kg peso corporal/dia). No período da pré-puberdade e
da puberdade, a testosterona aparece como um mediador no processo normal de
involução tímica, portanto, o aumento do peso do timo poderia estar relacionado a uma
diminuição no nível de testosterona (Pearce et al., 1981; Greenstein et al., 1986).
Porém, no nosso estudo, não notamos alterações no nível de testosterona, o que sugere
que o aumento do peso do timo ocorreu devido a um efeito tóxico direto do TPTH sobre
o órgão. Nós também constatamos aumento do peso relativo do baço na dose de 15
mg/kg de peso corporal/dia. Esses resultados contrastam com os dados de Grote et al.
(2004) em ratos. Esses autores encontraram uma diminuição dos pesos, absoluto e
relativo, do timo e do baço nos ratos expostos a 6,0 e 12mg TPT/kg de peso corporal/dia
e 15mg TBT/kg de peso corporal/dia durante o período da puberdade.
Os pesos do útero e dos ovários são desfechos importantes para caracterizar a
saúde e o funcionamento do sistema reprodutivo feminino. As variações hormonais do
ciclo sexual feminino têm reflexos no peso do útero que, em resposta à secreção de
estrógeno, aumenta de tamanho e se enche de fluido (U.S. EPA, 1996). Sendo assim, o
peso do útero pode ser utilizado em testes para avaliar o potencial estrogênico de
diferentes agentes (Teste uterotrófico). No entanto, a variabilidade natural do peso desse
órgão dificulta a interpretação de resultados, principalmente se as fêmeas não forem
mortas na mesma fase do ciclo. Para os ovários, alterações de peso podem estar
associadas à depleção de folículos, presença de cistos, inibição da formação do corpo
lúteo ou alteração na função do hipotálamo ou hipófise (U.S. EPA, 1996). No nosso
estudo, para verificar se a redução do peso dos órgãos apenas acompanha a diminuição
do peso corporal, ou se esse órgão é particularmente vulnerável ao TPTH, analisamos
também as modificações de peso relativo. A exposição ao TPTH não alterou o peso dos
ovários e diminuiu o peso relativo do útero na dose de 3,75 e 15mg TPTH/kg, quando
107
comparado ao grupo que recebeu a menor dose (1,875 mg/kg). Estes dados e o
aparecimento de efeitos sobre outras variáveis avaliadas, i.e., atraso no dia da abertura
de vagina e do dia do 1º estro, somente em níveis de doses que causaram acentuada
toxicidade sistêmica, indicam que a exposição ao TPTH, nas condições experimentais
desse estudo, não foi prejudicial ao sistema reprodutivo feminino.
Estudos que examinaram a interferência de TPT e TBT sobre os órgãos e o
desenvolvimento sexual masculino são mais freqüentes do que relatos sobre alterações
em órgãos reprodutivos femininos. Grote et al. (2004) verificaram que, após a
exposição de ratos por 30 dias, durante o período da puberdade, houve diminuição do
peso, absoluto e relativo, dos testículos nos animais tratados com 2mg TPT/kg de peso
corporal/dia e somente do peso absoluto dos testículos nos machos tratados com 6 e
12mg TPT/kg de peso corporal/dia, e diminuição do peso, absoluto e relativo, dos
epidídimos e da vesícula seminal nas doses de 6 e 12mg TPT/kg de peso corporal/dia.
Nos animais tratados com TBT, os mesmos autores observaram aumento do peso,
absoluto e relativo, dos epidídimos e da próstata na dose de 0,5mg TBT/kg de peso
corporal / dia e redução do peso, absoluto e relativo, dos epidídimos, da próstata e da
vesícula seminal na dose de 15mg TBT/kg de peso corporal/dia. Omura et al (2001)
estudaram em ratos expostos por 2 gerações, a toxicidade reprodutiva do TBTCl
focalizando os efeitos deste composto sobre o desenvolvimento sexual masculino. Estes
autores observaram diminuição do peso dos testículos e do epidídimo, apesar das
concentrações do hormônio luteinizante e da testosterona no soro não estarem
diminuídas. Os autores sugerem que as mudanças observadas se devem à inibição da
aromatase e que o TBTCl deve ser um fraco inibidor da dessa enzima em ratos machos.
No que diz respeito à masculinização de gastrópodes expostos ao TBT, o relatório do
Programa Internacional de Segurança de Químicos (IPCS) sobre desreguladores
endócrinos indica que a inibição da aromatase e o consequente aumento de andrógenos
pode ser um dos mecanismos envolvidos no imposex (Global Assessment of the State-
of-the-Science of Endocrine Disruptors).
No presente estudo, o TPTH causou uma drástica redução do peso, absoluto e
relativo, dos epidídimos na dose de 15 mg/kg de peso corporal/dia e uma pequena
redução do peso absoluto do testículo direito também foi observada neste mesmo nível
de dose, nos machos mortos no dia 46 de vida pós-natal. No entanto, nessa dose o
108
número de animais avaliados era pequeno (n=4) e a redução desses órgãos foi
acompanhada de toxicidade sistêmica e acentuada redução do peso corpóreo dos
animais, indicando que o efeito do TPTH sobre os órgãos reprodutivos está
possivelmente associado à toxicidade geral do composto. Nos machos mortos após o
tratamento, i.e., no dia 46 pós-natal, observamos redução do peso da vesícula seminal a
partir da dose de 7,5 mg TPTH/kg de peso corporal/dia. Esse efeito foi dose-relacionado
e observado tanto em termos de pesos absolutos, como relativos. Como o peso da
vesícula seminal é considerado um parâmetro andrógeno-dependente esse achado
parece refletir alguma interferência endócrina decorrente da exposição ao TPTH. Dados
sobre o peso da próstata poderiam consubstanciar os achados em relação ao peso da
vesícula seminal sobre uma possível interferência endócrina, mas devidos a dificuldades
de cunho técnico para a dissecação desta glândula, não foi possível realizar esta
avaliação.
Com relação à avaliação histológica dos testículos é sabido que o dano
histopatológico de órgãos reprodutivos pode ser considerado como indicativo de efeito
adverso sobre a reprodução (U.S. EPA, 1996). No entanto, freqüentemente, a avaliação
histológica revela lesões apenas se o prejuízo ao epitélio germinativo for severo. Lesões
mais sutis, como retenção de espermátides ou perda de células germinativas, que podem
afetar significativamente a liberação normal de espermatozóides na luz do túbulo,
podem não ser detectadas histologicamente (Zenick et al., 1994; U.S. EPA, 1996). Além
disso, na espermatogênese a população de espermatogônias é continuamente renovada,
e, a menos que ocorra a destruição completa da reserva de espermatogônias, a
espermatogênese pode ser restaurada depois que a exposição ao agente cessa. Snow &
Hays (1983) mostraram que a exposição de machos adultos ao TPTCl induz distúrbios
nos túbulos seminíferos em 72% dos animais tratados. Saxena et al (1985) registraram
que a administração intratesticular de di-n-butil de estanho induz uma marcante
mudança degenerativa nos testículos, com possível atrofia dos túbulos seminíferos e
completa suspensão da espermatogênese. A análise histopatológica, do presente estudo,
encontra-se em andamento, porém, após análise morfométrica dos túbulos seminíferos,
observamos uma diminuição na média do diâmetro dos testículos dos animais expostos
a 3,75 e 7,5 mg TPTH/kg. Esse resultado indica que pode ter ocorrido atrofia dos
túbulos seminíferos nos animais expostos ao TPTH na pré-puberdade e na puberdade.
109
V.2.3 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre os parâmetros reprodutivos de machos mortos logo após o
término do tratamento
O número de células espermáticas reflete a integridade da espermatogênese no
interior dos testículos e a função testicular, enquanto que o número de espermatozóides
na cauda do epidídimo é uma das avaliações mais significativas da função do epidídimo
(Amann, 1982; Zenick et al., 1994). Efeitos adversos sobre o sistema reprodutivo
masculino foram relatados em animais expostos a outros compostos organoestanhosos.
YU et al. (2003) observaram uma redução na produção espermática diária e no número
de espermátides por testículos em ratos (Sprague-Dawley) tratados por 10 dias durante a
puberdade com 20mg TBTCl/kg, e uma acentuada diminuição no número de
espermatozóides na cauda do epidídimo nas doses de 10 e 20mg TBTCl/kg, apesar de
não encontrar diferenças no peso dos órgãos reprodutivos. Em outro estudo com TBTCl,
Omura et al. (2001), relataram uma redução no número de espermátides por testículo
em machos da geração F1 expostos a 125µg/g de TBTCl na dieta. Já ratos Wistar
imaturos expostos a 25µg/g de TBT na dieta da 6º a 12º semana de vida não
apresentaram diferenças no número de espermatozóides no epidídimo (Makita et al.,
2005). Também não foram observadas diferenças na contagem de espermatozóides do
epidídimo de animais expostos in utero e durante a lactação a 25 µg/g TBT na dieta e
mortos com 12 semanas de vida (Makita & Omura, 2006). Reddy et al. (2006)
encontraram uma drástica redução no número de espermatozóides no epidídimo de
camundongos Suíço Albino, após três dias de exposição ao TPTH (10 e 25µg/kg de
peso corporal / dia) ou ao TBTO (10 e 25µg/kg de peso corporal/dia). A via de
administração utilizada nesse estudo (i.p.), entretanto, não é aquela pela qual ocorre à
exposição humana a essa substância. Além disso, o TPTH e o TBTO foram dissolvidos
em etanol, solvente que pode ter influenciado nos resultados do estudo.
Neste estudo, a exposição de camundongos (Suíço Albino) durante 30 dias ao
TPTH reduziu em 26% e 45% a produção espermática diária e em 38% e 82% o número
de espermatozóides da cauda do epidídimo nas doses 7,5 e 15 mg TPTH/kg,
respectivamente, nos animais mortos logo após o fim do tratamento. O TPTH reduziu
também o tempo de trânsito espermático (dias) nos animais expostos a 15mg /kg de
peso corporal/dia. Estes resultados demonstram que a exposição a substâncias químicas
110
na pré-puberdade e puberdade pode afetar adversamente o sistema reprodutivo
masculino. Alguns desfechos não avaliados poderiam enriquecer a discussão sobre os
achados anteriormente apresentados. A produção espermática diária e a maturação dos
espermatozóides podem ser criticamente dependentes do número e da funcionalidade
das células de Sertoli presentes nos testículos. Cabe lembrar, inclusive, que os
espermatozóides imaturos do testículo se movem para o epidídimo, ajudados por
secreções das células de Sertoli (Neubert, 1997). A produção espermática é uma
variável diretamente relacionada com o número de células de Sertoli. Portanto, as
avaliações histopatológicas dos testículos (em andamento), complementarão os achados
deste estudo e não podem ser negligenciadas (Toppari et al., 1996). Avaliações
histopatológicas dos epidídimos seriam igualmente importantes porque as células da
parede do epidídimo são responsáveis pela secreção de proteínas fundamentais ao
processo de maturação dos espermatozóides. Seguindo nesta mesma vertente de
raciocínio, a avaliação da motilidade espermática (desfecho também não avaliado)
poderia trazer indícios adicionais sobre a função do epidídimo, visto que a habilidade
dos espermatozóides em movimentar-se seria adquirida durante o processo de
maturação neste órgão. Porém, devido a dificuldades de cunho técnico, esta avaliação
também não pode ser realizada no presente estudo.
A avaliação espermática pode ser feita no homem, sendo, portanto, uma medida
que permite a comparação entre os efeitos observados em animais e o efeito em seres
humanos. Alguns estudos relatam oligospermia relacionada à exposição ocupacional a
diferentes pesticidas como DDT, kepone e 1,2-dibromo-3-cloropropano (DBCP)
(Cannon et al., 1978; Slutsky et al., 1999). Até a presente data não foram realizados
estudos epidemiológicos com avaliação espermática em seres humanos expostos ao
TPTH. Todavia, o efeito nocivo de pesticidas em geral sobre a reprodução de animais
de laboratório sugere que estes podem também afetar a fertilidade do homem. Os
processos reprodutivos em seres humanos, pelo menos nos machos, parecem ser mais
vulneráveis a efeitos deletérios do que os roedores usualmente empregados como
modelo experimental (Amann, 1982). Os roedores apresentam as espermatogônias A0
(de reserva) que são recrutadas em caso de dano testicular. A existência destas células
de reserva nos humanos é incerta, sendo que a ausência desta população de células
compensatórias pode contribuir para o aumento da vulnerabilidade do homem a agentes
espermatotóxicos (Zenick et al., 1994). Além disso, em roedores, o número de
111
espermatozóides produzidos é amplamente superior à quantidade necessária para
garantir a fertilidade plena. Em algumas linhagens de ratos e camundongos, a produção
espermática pode ser reduzida em até 90% sem comprometer a fertilidade. No entanto,
reduções bem menos severas podem comprometer a capacidade reprodutiva na espécie
humana (e em primatas não humanos). No homem a produção de espermatozóides é
muito próxima ao limite necessário para assegurar um desempenho reprodutivo
adequado (Amann, 1982; Zenick et al., 1994).
Morfologia dos espermatozóides
A morfologia espermática refere-se a aspectos estruturais dos espermatozóides
e pode ser avaliada na cauda do epidídimo, no ducto deferente e em amostras do
ejaculado. A avaliação da morfologia é capaz de identificar anomalias na cabeça e no
flagelo dos espermatozóides. Como há uma correlação entre potencial mutagênico e
capacidade de induzir anormalidades espermáticas, a análise morfológica da cabeça dos
espermatozóides tem sido freqüentemente reportada em estudos de potencial
genotóxico. Com isso, estudos relatam que o aumento da incidência de malformações na
cabeça dos espermatozóides, reflete a mutação em células germinativas. No entanto,
nem todos os mutágenos induzem anormalidades na cabeça dos espermatozóides, e
substâncias não mutagenicas também podem alterar a morfologia dos espermatozóides.
Portanto, a relação entre morfologia espermática e mutagenicidade não é
necessariamente sensível ou específica (U.S. EPA, 1996). No nosso estudo, esse
parâmetro foi usado para ampliar a avaliação de efeitos tóxicos sobre os
espermatozóides e indicar se uma determinada substância tóxica é capaz de agir nas
células germinativas (U.S. EPA, 1986).
A análise da morfologia espermática revelou um discreto aumento do número de
espermatozóides anormais nos animais expostos ao TPTH. Não observamos, no entanto
diferenças entre os grupos expostos ao TPTH e o grupo controle, sugerindo que o TPTH
não causa danos morfológicos persistentes nas células germinativas de camundongos.
112
Níveis de Testosterona
Alterações dos níveis hormonais podem indicar dano à gônada. Apesar de não
ser usada rotineiramente em testes de toxicidade, a medida dos hormônios sexuais
oferece informação complementar para a avaliação da toxicidade reprodutiva de um
agente químico (U.S. EPA, 1996). Grote et al. (2004) verificaram uma diminuição nos
níveis de testosterona total em animais expostos por 30 dias a 12mg TPT/kg de peso
corporal/dia e naqueles expostos a 15mg TBT/kg de peso corporal/dia. Reddy et al.
(2006) também observaram uma redução nos níveis de testosterona total em animais
expostos por via ip a doses baixas de TPTH. Omura et al. (2001), por outro lado,
encontraram um aumento na concentração de testosterona no soro de machos da geração
F1 expostos a 125µg/g de TBTCl na dieta. Makita et al. (2006) não notaram diferenças
na concentração de testosterona no soro de animais expostos no período perinatal a
25ppm de TBT através da dieta. Neste estudo, não observamos diferenças entre os
diferentes grupos experimentais quanto aos níveis de testosterona livre.
Uma explicação para a inconsistência desses achados na literatura é a variação
cíclica dos níveis hormonais que acontece no período de 24 horas como conseqüência
da liberação pulsátil do hormônio luteinizante (LH). Isto dificulta a detecção de
diferenças entre os grupos. O controle no horário de coleta da amostra ajuda a
minimizar esta variabilidade, reduzindo a interferência dos ritmos pulsáteis e circadiano
(U.S. EPA, 1996). No entanto, um grande número de animais seria necessário para
diminuir de forma expressiva o efeito dessa variabilidade na investigação de diferenças
entre tratados e controles. No nosso estudo observamos redução na contagem
espermática sem termos detectado alterações dos níveis de testosterona circulante. Um
agente químico que demonstre toxicidade testicular pode afetar as células germinativas,
ou as células de Sertoli, sem interferir na estrutura e função das células de Leydig,
portanto, a produção de andrógenos pode não ser afetada, mesmo havendo dano aos
órgãos reprodutivos. Os resultados obtidos para a dosagem de testosterona contrastam,
até certo ponto, com os efeitos observados anteriormente sobre variáveis andrógeno-
dependentes: diminuição do peso da vesícula seminal e atraso no dia da descida dos
testículos para a bolsa escrotal.
113
V.2.4 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre a fertilidade de machos e fêmeas
Apesar dos efeitos sobre as a reprodução masculina, i.e., diminuição do número
de espermatozóides e espermátides, nas duas maiores doses de TPTH (7,5 e 15mg /kg
peso corporal/dia), a exposição durante a pré-puberdade e a puberdade a este pesticida
não afetou o desempenho reprodutivo de camundongos, machos e fêmeas. A ausência
de efeitos sobre a fertilidade dos animais expostos ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade se deve, provavelmente, a uma característica dos roedores que, em geral
produzem e armazenam espermatozóides em quantidade muito superior à quantidade
necessária para determinar a fertilidade. Portanto, a ausência de efeitos sobre a
fertilidade dos animais expostos ao TPTH não é inconsistente com a redução observada
na produção espermática e na concentração de espermatozóides. Em função de
diferenças inter-específicas, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (U.S.
EPA, 1996) passou a sugerir a investigação de outras variáveis, além dos
acasalamentos, como o peso de órgãos sexuais, a histologia testicular, a produção
espermática e os níveis hormonais, para detectar possíveis efeitos adversos de
xenobióticos sobre a função reprodutiva. Parte dessas avaliações adicionais foi realizada
no presente estudo.
V.2.5 Efeitos da exposição ao TPTH durante a pré-puberdade e a
puberdade sobre os órgãos e parâmetros reprodutivos dos animais
submetidos ao teste de fertilidade
O TPTH não alterou o peso do fígado, baço e timo, e dos órgãos reprodutivos,
(ovário, útero, testículos, epidídimos e vesícula seminal) das fêmeas e dos machos que
foram mortos após o teste de fertilidade (75 dias de vida pós-natal). Também não
observamos alterações na produção espermática diária e no número de espermatozóides
da cauda do epidídimo nos animais expostos do dia 15 ao dia 45 pós-natal e mortos no
dia 75 de vida pós-natal. A exposição ao TPTH também não alterou a morfologia dos
espermatozóides nem a concentração de testosterona livre nos animais que participaram
do teste de fertilidade, i.e., naqueles que foram mortos 30 dias após a interrupção do
tratamento, indicando que os efeitos do TPTH notados logo após o término do
tratamento foram revertidos com a suspensão da exposição.
114
VI. CONCLUSÕES
VI.1 Experimento 1
A exposição materna ao TPTH durante a gravidez e lactação resultou em:
¾ Toxicidade materna na dose de 7,5mg/kg de peso corporal/dia, o que foi
evidenciado pelo aumento do peso relativo do fígado;
¾ Toxicidade perinatal evidenciada pela morte de todos os filhotes de algumas
ninhadas logo após o nascimento na dose de 7,5 mg /kg de peso corporal/dia
e pela redução do peso médio dos filhotes ao nascimento (dia 1PN), a partir
da dose de 1,875 mg/kg de peso corporal/dia.
VI.2 Experimento 2
A exposição direta dos filhotes ao TPTH durante a pré-puberdade, puberdade e
início da idade adulta resultou em:
¾ Acentuada mortalidade na maior dose (15mg /kg de peso corporal/dia);
¾ Redução do ganho ponderal de todos os grupos (média±DP) na primeira
semana do tratamento, havendo recuperação nas semanas que se seguiram de
modo que ao final do tratamento a diminuição de peso foi constatada apenas
com as duas maiores doses;
¾ Atraso da abertura de vagina e descida de testículos nos grupos tratados com
3,75, 7,5 e 15mg kg de peso corporal/dia em relação ao grupo controle;
¾ Atraso do dia do primeiro estro nas fêmeas expostas a 7,5mg/kg de peso
corporal/dia;
Nos animais mortos no dia 46 pós-natal:
115
¾ Aumento do peso relativo do timo das fêmeas expostas a 15mg/kg de peso
corporal/dia e aumento do peso relativo do fígado a partir da dose de
3,75mg/kg de peso corporal/dia;
¾ Aumento do peso relativo do timo e do fígado dos machos expostos a 7,5 e
15mgkg de peso corporal/dia e aumento do peso relativo do baço, somente
na maior dose testada;
¾ Redução do peso relativo do testículo e do peso absoluto e relativo dos
epidídimos na dose de 15mg /kg de peso corporal/dia;
¾ Acentuada redução no peso absoluto e relativo das vesículas seminais nas
doses de 7,5 e 15mg/kg de peso corporal/dia;
¾ Diminuição do número de espermátides por testículo, do número de
espermátides por grama de testículo, da produção espermática diária, do
número de espermatozóides por animal e do tempo de trânsito espermático
dos animais tratados com 7,5 e 15mg /kg de peso corporal/dia;
¾ Discreto aumento do número de espermatozóides anormais (defeitos de
cabeça e cauda) nos animais expostos ao TPTH;
¾ Diminuição da média do diâmetro dos túbulos seminíferos dos animais
tratados com 3,75 e 7,5mg /kg de peso corporal/dia;
Nos animais mortos no dia 75 pós-natal:
¾ A exposição ao TPTH não alterou o desempenho reprodutivo (fertilidade)
dos machos e das fêmeas expostos na pré-puberdade e na puberdade;
¾ Não foram observadas alterações de órgãos e parâmetros reprodutivos
masculinos dos animais mortos a partir do dia 75 de vida pós-natal.
116
Os resultados encontrados nesse estudo não apóiam a hipótese do TPTH ser um
desregulador endócrino em camundongos. Entretanto, é importante ressaltar, que os
triorganoestanhosos causam efeitos reprodutivos em roedores e que o mecanismo de
ação ainda não foi esclarecido. Por se tratar de um produto, amplamente, utilizado na
agricultura, novos estudos devem ser realizados para melhor subsidiar a avaliação de
risco para seres humanos.
117
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