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MARISTELLA KATO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TECIDUAL DA MUCOSA DA
ORELHA MÉDIA DE COBAIAS À PRESENÇA DE CELULOSE
BACTERIANA. ESTUDO EXPERIMENTAL.
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DA SANTA CASA DE SÃO PAULO
PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
MESTRE EM MEDICINA
SÃO PAULO
2007
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MARISTELLA KATO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA TECIDUAL DA MUCOSA DA
ORELHA MÉDIA DE COBAIAS À PRESENÇA DE CELULOSE
BACTERIANA. ESTUDO EXPERIMENTAL.
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DA SANTA CASA DE SÃO PAULO
PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
MESTRE EM MEDICINA.
Área de concentração:
otorrinolaringologia
Orientador: Professor Doutor Henrique
Olavo Olival Costa
SÃO PAULO
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Kato, Maristella
Avaliação da resposta tecidual da mucosa da orelha média de
cobaias à presença de celulose bacteriana. Estudo experimental/
Maristella Kato. São Paulo, 2007.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo – Curso de pós-graduação em Medicina.
Área de Concentração: Otorrinolaringologia
Orientador: Henrique Olavo Olival Costa
1. Orelha média/anatomia & histologia 2. Celulose 3. Cobaias 4.
Gluconacetobacter xylinus
BC-FCMSCSP/29-07
À minha família,
Principalmente à minha mãe, Teruko, que
sempre me incentivou e me apoiou até o
seu último momento. Responsável pela
minha educação em todos os sentidos.
Minha maior fã.
“O valor das coisas não está no tempo que
elas duram, mas na intensidade com que
acontecem. Por isso, existem momentos
inesquecíveis, coisas inexplicáveis e
pessoas incomparáveis”
Fernando Pessoa
AGRADECIMENTOS
Ao professor Doutor Henrique Olavo Olival Costa, Professor Adjunto do
Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo, meu orientador, de quem recebi assistência e apoio para a
realização deste trabalho. Sua amizade, paciência, disponibilidade e principalmente
seus ensinamentos contribuíram para que um sonho se tornasse realidade. Muito
obrigada.
Ao professor Doutor José Eduardo Lutaif Dolci, Diretor e Professor adjunto do
Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo, por permitir o meu crescimento científico e acadêmico.
Ao professor Doutor Fernando de Andrade Quintanilha Ribeiro, Professor adjunto
do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo, um professor grandioso, que pelo seu interesse e
curiosidade, sempre colabora para o crescimento do conhecimento científico. Pela
sua forma de instruir fez dispertar o interesse pela otologia.
Ao professor Doutor Ney Penteado de Castro Júnior, Professor adjunto do
Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo, pelo incentivo e atenção dispendidos desde o primeiro ano de
minha formação na otorrinolaringologia.
Ao professor Doutor Leonardo da Silva, Professor assistente do Departamento de
Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, pelos conselhos e pela contribuição à este trabalho, mostrando-se atencioso
e prestativo às minhas solicitações.
Ao professor Doutor Osmar Mesquita Neto, Professor adjunto do Curso de
Fonoaudiologia da Fundação Arnaldo Vieira de Carvalho e Professor assistente do
Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo pela grande ajuda, sempre disponível e pronto a resolver
dúvidas e dar conselhos. Dedicando parte de seu tempo para realizar procedimentos
cirúrgicos e exames complementares para completar este trabalho.
À professora Doutora Ana Cristina Kfouri Camargo, pela ajuda, incentivo e
amizade. Sempre disposta a dar conselhos e coordenadas para tornar este trabalho
o melhor possível.
À Doutora Marília Germanos de Castro Médica segundo assistente da Santa Casa
de São Paulo e à Doutora Maria Fernanda Carriel Amary, Professora assistente da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo pela atenção e carinho
dispendido comigo para a leitura e descrição das lâminas anatomopatológicas. Uma
parte fundamental deste trabalho.
À Flávia Coelho, veterinária do ICAO, pelo entusiasmo e dedicação com o cuidado
aos animais.
À Ana Paula Scramim de Freitas, bacharel em estatística, pela organização e
compilação dos dados, pela paciência e disposição para me ajudar.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à Irmandade
da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo pela oportunidade de desenvolver o
projeto e contribuir para o conhecimento da otorrinolaringologia.
Ao Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia e funcionários,
pela oportunidade de desenvolver este projeto, dando toda a infra-estrutura
necessária.
À CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, e à
FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pela
contribuição financeira, incentivo fundamental para a conclusão deste trabalho.
À Sônia Regina Alves, secretária da Pós-Graduação, sempre muito gentil e
prestativa para esclarecer minhas dúvidas e a me ajudar a percorrer pela primeira
vez este caminho.
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
A. xylinum Acetobacter xylinum
CT Cavidade timpânica
Grupo CT Grupo CavidadeTimpânica
Grupo MT Grupo Membrana Timpânica
HE Hematoxilina-eosina
MT Membrana Timpânica
OMA Otite Média Aguda
OMC Otite Média Crônica
SPSS
Statistics Package for Social Sciences
TORP
Total ossicular replacement prothesis
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................1
1.1 REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................4
1.1.1 RESPOSTA TECIDUAL À BIOMATERIAIS ...................................................................... 4
1.1.2 RESPOSTA TECIDUAL À BIOMATERIAIS IMPLANTADOS NA MEMBRANA
TIMPÂNICA ...................................................................................................................... 5
1.1.3 RESPOSTA TECIDUAL à BIOMATERIAIS IMPLANTADOS NA ORELHA MÉDIA ......... 8
1.1.4 ESTUDOS COM A CELULOSE ...................................................................................... 10
2 OBJETIVO.........................................................................................................15
3 MATERIAL E MÉTODO.....................................................................................17
3.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA ....................................................17
3.2 USO E PREPARO DA MEMBRANA E DA MANTA DE CELULOSE..........17
3.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO .................................................................18
3.3.1 IMPLANTE DE MEMBRANA DE CELULOSE NA MEMBRANA TIMPÂNICA................ 18
3.3.2 IMPLANTE DE MANTA DE CELULOSE NA CAVIDADE TIMPÂNICA .......................... 19
3.4 ALOCAÇÃO E DEFINIÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO .........................19
3.4.1 EUTANÁSIA .................................................................................................................... 20
3.5 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA.............................................................20
3.6 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA........................................................................22
4 RESULTADOS ..................................................................................................24
4.1 OTOMICROSCOPIA...................................................................................24
4.2 PARÂMETROS HISTOPATOLÓGICOS.....................................................25
4.2.1 NEUTRÓFILOS E FIBRINA ............................................................................................ 25
4.2.2 NEOFORMAÇÃO VASCULAR........................................................................................ 27
4.2.3 PROLIFERAÇÃO CONJUNTIVO-FIBROSA................................................................... 29
4.2.4 CÉLULAS INFLAMATÓRIAS MONONUCLEADAS (LINFÓCITOS E MACRÓFAGOS) 30
4.2.5 INTEGRIDADE DA CELULOSE...................................................................................... 31
4.2.6 POSIÇÃO DA CELULOSE .............................................................................................. 32
5 DISCUSSÃO......................................................................................................39
6 CONCLUSÃO....................................................................................................50
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................51
FONTES CONSULTADAS
RESUMO
ABSTRACT
APÊNDICE
ANEXO
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
A otite média é definida como um processo inflamatório, infeccioso ou não,
localizado focal ou difusamente na fenda auditiva. Pela sua elevada prevalência e
diversidade de apresentações clínicas, a otite média gera um enorme custo social e
movimenta, direta ou indiretamente, cifras superlativas (Genov, Roxo Júnior, 2001).
Com o advento de antibióticos de amplo espectro e eficácia, os pacientes têm
se beneficiado por apresentarem menor número de recidivas, maior período de
remissão e menor número de complicações. Entretanto, as seqüelas relativas às
perdas de substância na membrana e cavidade timpânica, são motivos de
preocupação, uma vez que provocam limitação funcional (Dormer et al, 1995).
Dentre as mais freqüentes seqüelas otológicas das otites médias estão a
perfuração da membrana timpânica e a perda de integridade da cadeia ossicular.
Acredita-se que cerca de 20% dos pacientes com OMC tenham alguma perda de
substância nos ossículos. Essas perdas podem atingir a bigorna, o martelo e o
estribo em ordem decrescente de freqüência, mais comumente no processo longo
ou no processo lenticular da bigorna (Babu, Seidman, 2004).
As perfurações da MT são observadas na prática clínica diária como resultado
de outras afecções, como por exemplo, as perfurações traumáticas, perfurações por
introdução de corpos estranhos no conduto auditivo externo ou após colocação de
tubos de ventilação (Laurent et al, 1991; Ajulo et al, 1993; Saadat et al, 2001).
Atualmente, os procedimentos cirúrgicos para reabilitação destes tipos de
afecções procuram reconstituir a MT com colocação de enxertos na tentativa de
fechar a perfuração, ou o sistema tímpano-ossicular com reconstruções de MT e
cadeia ossicular. No procedimento explora-se a mucosa de revestimento da orelha
média e corrige-se a disjunção da cadeia ossicular pela retirada e recolocação dos
ossículos remanescentes remodelados e inseridos com outra conformação, ou pelo
uso de osso das adjacências, modelado com formato de ossículo ou ainda com o
uso de implantes biocompatíveis (Freitas et al, 2002).
Um material é considerado biocompatível quando não interage adversamente
com o meio biológico e vice-versa. Reações adversas são manifestações tóxicas,
neoplásicas ou inflamatórias locais exacerbadas. (Högset, Bradberg, 1986; Dormer
et al 1995).
2
As principais características de um biomaterial para reconstruções de cadeia
ossicular são: biocompatibilidade; rigidez para garantir a transmissão sonora;
bioinércia ou bioatividade, na qual não há influência bioquímica sobre o tecido
receptor; estabilidade morfológica que evite a degradação ou reabsorção do
material; ser moldável; ter fácil disponibilidade; não haver fixação com o osso de
sustentação (promontório ou canal do nervo facial); e não interferir com a aeração
normal da cavidade timpânica (Sprekelsen, Algarra, 1992; Pou, 2003; Menéndez-
Colino et al, 2004).
A maioria das técnicas em uso corrente lança mão de materiais autólogos,
retirados do próprio paciente. Os materiais mais utilizados são a fáscia do músculo
temporal, pericôndrio e cartilagem que, como todo material autólogo, têm boa
aceitação pelo hospedeiro, além de ter boa aplicabilidade como “ponte de suporte”,
essencial para a migração tecidual no processo de fechamento da perfuração
(Epstein, Sataloff, 1986; Pfleiderer, Moffat, 1988; Rahman et al, 2005). A taxa de
sucesso desses enxertos é de aproximadamente 90%, desde que aplicados com
técnica cirúrgica apropriada. Entretanto, eles têm como desvantagem a necessidade
de coleta, o que amplia o tempo e morbidade cirúrgicos (Epstein, Sataloff, 1986;
Terry et al,1988; Ajulo et al, 1995; Ayache, 2003; Güneri et al, 2003).
Vários tipos de enxertos para miringoplastia vêm sendo utilizados e avaliados,
entre outros, o papel de arroz (Laurent et al, 1991), a gordura de lóbulo da orelha
(Terry et al, 1988), a gordura periumbilical (Ajulo et al, 1993; Ayache et al, 2003), o
pericôndrio de cartilagem tragal (Boone et al, 2004) e o aloderme (Youssef, 1999;
Saadat et al, 2001; Benecke 2001; Fayad et al, 2003; Fishman et al, 2005, Haynes et
al, 2005; Vos et al, 2005).
Nas cirurgias de timpanoplastias, percebe-se muitas vezes que os ossículos
estão destruídos pela própria doença crônica e não podem ser utilizados para
interposições ou recolocações. Nesses casos, há vários tipos de biomateriais,
biológicos e não biológicos para restaurar o mecanismo de transmissão do som. Os
materiais mais ultilizados são as próteses de hidroxiapatita (Meijer et al, 2002;
Rondini-Gilli et al, 2003; Goebel, Jacob, 2005), de cimento de osso (Hoffmann et al,
2003; Babu, Seidman, 2004; Saunders, 2006), de titânio (Schwager, Geyer, 1998;
Hillman, Shelton, 2003; Menéndez-Colino et al, 2004; Trabant et al, 2004), de
cerâmica (Epstein, Sataloff, 1986) e de plastipore
®
(Bayazit et al, 1999; House et al,
2001).
3
Uma dificuldade encontrada para a execução dessas cirurgias é que nem
sempre a quantidade e maleabilidade de tecido do próprio indivíduo são suficientes
para sua utilização como enxerto, seja pelo tamanho da perfuração, pelo grau de
deterioração dos ossículos, seja pela ocorrência de cirurgias prévias em que a coleta
já tenha sido realizada. Além disso, em relação ao uso de materiais não biológicos,
pode ocorrer sua extrusão levando ao insucesso cirúrgico (Benecke, 2001).
A possibilidade de utilização de tecido que possa permanecer na cavidade
timpânica sem causar resposta inflamatória, não sendo rejeitado nem tampouco
reabsorvido e, ao mesmo tempo, que ofereça condições para escultura em formato
adequado à reconstrução desejada pode ser de grande valia no tratamento dessas
seqüelas (Ajulo et al, 1995; Ayache, 2003; Güneri et al, 2003).
A celulose sintetizada pela bactéria Acetobacter xylinum (A. xylinum) pode
apresentar-se na forma de uma membrana, como uma película fina, flexível,
semitransparente de cor amarelada, semelhante a um papel manteiga ou na forma
de manta, sólida, densa, maleável, de consistência gelatinosa firme e espessura em
torno de 0,5 centímetro. É composta de polissacárides, sendo biodegradável, não
tóxica, não pirogênica e estéril.
Atualmente é utilizada como substituta temporária da pele, sendo útil para
curativos em lesões por queimaduras, dermabrasões ou áreas doadoras de pele
(Fontana et al, 1990; Hart et al, 2002; Costa et al, 2005; Czaja et al, 2006). Também
foi utilizada como substituta de meninge, como material de revestimento de stents
intravasculares e úlceras varicosas de membros inferiores (Mello et al, 1997; Mello et
al, 1998; Ewald et al, 2001; Mello et al, 2001; Nemetz et al, 2001).
Suas características físicas e de biocompatibilidade, assim como a facilidade
de colocação e a possibilidade de modelação no ato da inserção faz deste material
um elemento potencial quando o tratamento exige adição cartilaginosa na cadeia
ossicular ou como “ponte de suporte” para fechamento de perfurações na MT. Como
os testes em animais não incluíram sua avaliação na orelha, é necessário analisar a
presença desse material no tecido hospedeiro, avaliando a resposta tecidual
provocada frente à celulose.
Desse modo, estudamos essa reação tecidual em dois locais distintos da
orelha média, o epitélio da membrana timpânica e a mucosa da cavidade timpânica,
para que tivéssemos informações abrangentes neste cenário.
4
1.1 REVISÃO DE LITERATURA
1.1.1 RESPOSTA TECIDUAL À BIOMATERIAIS
Segundo Sevastjanova et al (1987), quando um polímero sintético é
implantado no organismo, a primeira reação é a destruição e necrose do tecido
causada pela implantação, independente do local e do propósito dessa implantação.
É sabido que há uma reação universal do organismo, inicialmente com formação de
tecido inflamatório composto de células humorais do exsudato sangüíneo, e por fim,
desenvolvimento de tecido inflamatório que migra para dentro do tecido fibroso e
acúmulo de biopolímeros de tecido conjuntivo extracelular da matriz. O processo
completa-se com a formação de tecido fibroso rico em colágeno levando à
reparação anatômica e biomecânica do defeito. Por isso, a biocompatibilidade do
material implantado pode ser avaliada por métodos morfológicos (análise do tecido
conjuntivo, colágeno e glicosaminoglicanos ao redor do implante). Esses resultados
dependerão de algumas características próprias do material como propriedades
físicas e porosidade (ocorre influência nas células que participam do processo
inflamatório), textura da superfície, consistência e propriedades químicas.
O conceito de biocompatibilidade é baseado na interação entre o material a
ser implantado e o ambiente biológico receptor. A falha de um biomaterial em
oferecer biocompatibilidade, geralmente é revelada por um rompimento das
propriedades do material ou uma resposta biológica insatisfatória. O principal
aspecto da biocompatibilidade é a resposta tecidual local. A resposta normal no
processo cicatricial é um fenômeno dinâmico, no qual as células e seus produtos
interagem para reparar o tecido danificado. Muitas células estão envolvidas neste
processo reparativo, incluindo macrófagos e leucócitos polimorfonucleares. A
observação da distribuição e contagem dessas células pode ser usada para
promover uma descrição da reação inflamatória (Vince et al, 1991).
Robbins et al (1994) descrevem que a inflamação constitui-se na principal
reação do organismo vivo à presença de corpo estranho. Consiste estruturalmente
em exsudação de líquidos e de proteínas plasmáticas (edema) e migração de
leucócitos, principalmente neutrófilos, nas primeiras horas ou dias do processo
agudo. Com o passar do tempo esta reação tornar-se-á crônica, sendo menos
uniforme, de maior duração, com presença de linfócitos e macrófagos, com
proliferação de vasos sangüíneos e tecido conjuntivo.
5
Segundo Bonzon et al (1995), estudos de biocompatibilidade de enxertos
podem revelar nos primeiros oito dias, edema ao redor do tecido e reação
inflamatória ao lado do implante. Há uma concentração maior de células
inflamatórias, na sua maioria de linfócitos e de células polimorfonucleares na
interface entre o implante e o tecido conjuntivo. Após 15 dias, pode se ver
proliferação de alguns capilares no tecido conjuntivo e no local de implantação. Não
se observa células gigantes multinucleadas ou formação de cápsula fibrosa. Alguns
macrófagos podem estar presentes. No 21˚ dia, é observada menor resposta
inflamatória e inicia-se a resposta fibroblástica. Com 30 dias, não se vê resposta
inflamatória e o tecido conjuntivo está quase normal, parcialmente organizado e
orientado. Com 60 dias, há síntese do colágeno e resposta fibroblástica e após 90
dias, tem-se tecido conjuntivo normal, novo e organizado.
Dormer et al (1995) afirmam que existem vários procedimentos para qualificar
a biocompatibilidade de biomateriais e a resposta no tecido hospedeiro. Os testes
biológicos podem ser feitos em modelos animais, por técnicas de cultura de células,
histoquímica, cultura de tecidos ou estudos de perfusão de todo um órgão. Os
parâmetros físicos de avaliação dos materiais são medidas de peso, rigidez,
elasticidade, alongamento, quebras na mecânica e alterações na superfície que
podem ser revelados na microscopia eletrônica. Testes químicos podem quantificar
perda ou ganhos do material, efeitos do meio no material, aparecimento de
exudatos, mudanças no peso molecular e outros indícios que possam revelar
degradação biológica. A resposta típica do tecido hospedeiro ao implante é uma
reação de corpo estranho e de reação cicatricial. Neste estágio pode-se progredir
uma reação cicatricial normal com formação de uma fina cápsula fibrosa envolvendo
o implante e/ou crescimento de tecido dentro do biomaterial. Isso indica uma
resposta favorável do hospedeiro. Se a reação continua, ocorre uma resposta
inflamatória crônica caracterizada por formação de cápsula fibrosa espessa,
granulação e rompimento do tecido com subseqüente formação de abcesso ou
fístula, culminando com extrusão do enxerto e alterações neoplásicas.
1.1.2 RESPOSTA TECIDUAL À BIOMATERIAIS IMPLANTADOS NA
MEMBRANA TIMPÂNICA
Laidlaw et al (2001) realizou um estudo experimental em 28 chinchilas para
avaliação do aloderme como material de enxerto para perfurações crônicas da MT
6
(aproximadamente 50% da parte tensa) em comparação com o papel de arroz. Após
cinco a oito semanas sem sinais de regeneração epitelial, os animais não infectados
foram utilizados para o estudo. Os enxertos foram colocados sob os remanescentes
da MT, e preenchido o conduto auditivo externo com pedaços de gelfoam e
finalmente instilação de gotas de antibiótico. Observou-se que após seis a oito
semanas do procedimento cirúrgico em 18 das 23 miringoplastias (78%) com o
aloderme e em 14 de 21 (66%) com o papel de arroz, estavam sem perfuração. A
avaliação histológica demonstrou que o aloderme foi incorporado na camada média
fibrosa da MT. À microscopia, observou-se um processo cicatricial com formação de
uma camada trilaminar com camada fibrosa muito fina, além de integração com o
tecido hospedeiro pelo envolvimento por epitélio escamoso de um lado e mucosa de
outro. Quanto ao papel de arroz, houve formação de uma camada bilaminar (sem
lâmina própria) ou trilaminar atrófica (mínima lâmina própria).
Em um estudo experimental realizado por Güneri et al (2003) com 30 ratos,
avaliou-se o fechamento da perfuração na MT da orelha direita com o uso de ácido
hialurônico, fator de crescimento epidérmico ou mitomicina C. As orelhas esquerdas
permaneceram sem tratamento para serem os controles. Para examinar o processo
cicatricial, os ratos sofreram eutanásia com três, cinco, sete, nove e 14 dias.
Histologicamente as MT foram avaliadas quanto à reação fibroblástica e à
neovascularização, graduadas em ausente, leve, moderada e acentuada. Os autores
não observaram diferença estatística para os parâmetros histológicos avaliados
entre os grupos e entre as orelhas tratadas e não tratadas, isto é, houve boa
aceitabilidade do tecido hospedeiro para os dois materiais. Quanto ao fechamento
espontâneo da perfuração, observou uma média de 15±2 dias, sem diferença
estatística para as orelhas tratadas com ácido hialurônico (8,8±1,6 dias) e fator de
crescimento epidérmico (7,4±1,6 dias). No grupo tratado com mitomicina C não
houve fechamento de perfuração em nenhuma amostra.
Segundo Rahman et al (2005), em um estudo realizado com 10 ratos para
avaliar a restituição estrutural e funcional da MT após uma perfuração traumática
aguda com duas e quatro semanas, afirmam que o processo de cicatrização de uma
ferida inicia-se com uma atividade mitótica das células basais na margem da
perfuração. Esse processo é seguido por migração e estimulação das células
epiteliais em direção ao defeito, produzindo continuamente uma fina camada
epitelial. O tecido granulomatoso progressivamente invade a área com fibrilas de
7
colágeno. A proliferação das células epiteliais continuam e a epiderme recupera sua
arquitetura e queratinização normais. No local em que foi feita a perfuração
observaram, no tecido novo, um aumento de espessura devido à presença de
fibroblastos e matriz extracelular com estrutura semelhante às fibras, entretanto, sem
a devida orientação.
Spiegel, Kessler (2005) estudaram a eficácia de submucosa acelular de
intestino delgado suíno no tratamento de perfurações de MT em dez chinchilas
adultas. Com o auxílio de uma faca de miringotomia, foi feita uma perfuração na
metade anterior. Após oito semanas os animais foram submetidos à miringoplastia
em uma das orelhas com utilização de enxerto de cartilagem ou submucosa
acelular. A eutanásia foi realizada com 6 semanas de seguimento, sendo retirado o
osso temporal para a histologia. Houve fechamento da perfuração em todas as
amostras com sinais de neovascularização. Observaram no grupo tratado com
cartilagem, reparação com camada monomérica composta de epitélio escamoso e
presença do enxerto localizado medialmente, além de pequenas áreas com
formação de camada bilaminar (epitélio e mucosa). Ainda, notaram sinais de
inflamação leve e áreas de calcificação. No grupo da submucosa acelular,
observaram uma membrana trilaminar composta de epitélio escamoso, camada
fibrosa ao redor do enxerto e mucosa cuboidal medialmente. Os autores concluem
que há biocompatibilidade dos materiais, sendo alternativas viáveis para as
miringoplastias.
Szabó (2006) analisou 114 cobaias nas quais retirou o quadrante posterior da
MT e colocou enxerto de fáscia do músculo temporal. Esses animais foram
acompanhados por diferentes tempos de seguimento (um, três, cinco, sete, nove,
14, 21, 35 dias e seis, nove e 12 meses). Ele observou sinais de regeneração do
terceiro ao nono dia, caracterizada por acúmulo de fibroblastos na camada fibrosa
da MT, vasodilatação e atividade mitótica nos bordos da perfuração. Além disso,
notou que a camada mucosa da cavidade da orelha média, próxima ao rebordo da
perfuração intumesceu e proliferou, fazendo com que o enxerto tomasse uma
posição de camada intermediária na neomembrana. A partir de três semanas o
enxerto começou a perder volume.
Em um estudo prospectivo de Weber et al (2006), avaliaram o uso de tubos
de alginatos de cálcio em comparação ao papel de arroz nas perfurações de MT de
chinchilas. Foram estudadas 43 orelhas após dez semanas da implantação dos
8
materiais. Apenas no grupo do alginato de cálcio, a eutanásia foi com duas, quatro e
seis semanas para avaliação cronológica do processo cicatricial. A análise
histológica mostrou que as áreas ao redor do alginato residual eram compostas de
tecido conjuntivo com fibroblastos rodeada por epitélio. Não houve evidências de
presença de células gigantes, inflamação granulomatosa ou outros indicativos de
reações a corpo estranho.
1.1.3 RESPOSTA TECIDUAL À BIOMATERIAIS IMPLANTADOS NA ORELHA
MÉDIA
Um estudo experimental realizado por Willians, Blaybey (1987) com ratos,
avaliou três tipos diferentes de polímeros implantados na orelha média. O material
foi depositado na cavidade timpânica entre o martelo e a parede póstero-medial e
analisado por histologia e microscopia eletrônica após seis, 12 e 26 semanas.
Observaram em todas as amostras formação de fina cápsula fibrosa de colágeno
com alguns fibroblastos e linfócitos, sendo considerado uma resposta satisfatória do
organismo.
Merchant, Nadol (1994) fizeram uma análise retrospectiva sobre vários tipos
de enxertos utilizados para reconstrução de cadeia ossicular e observaram que os
autólogos (ossículos remodelados, osso cortical) mantiveram o formato e tamanho
originais e formação de cápsula fibrosa ao seu redor. Os enxertos cartilaginosos
tenderam a desenvolver condromalácia e a serem reabsrovidos. As próteses
sintéticas provocaram reação de células gigantes de corpo estranho com
conseqüente biodegradação.
Schwager, Geyer (1998), realizaram em estudo experimental em coelhos para
avaliar a biocompatibilidade da prótese de titânio (n=27) e de cimento de vidro
ionomérico (n=37) como próteses totais (total ossicular replacement prothesis -
TORP). Os animais foram acompanhados por 28, 84, 168, 336, 504 dias e 2 anos. O
estudo histológico (Giemsa) foi do osso temporal em microscópio óptico. Com a
prótese de titânio, aos 28 dias, os autores observaram vasodilatação na mucosa da
orelha média, com algumas áreas com tecido de granulação, que também envolvia
parcialmente a prótese. Após 84 dias, não observaram inflamação e a prótese
estava totalmente envolvida por mucosa normal e presa por fibras de tecido
conjuntivo que se inseriam na MT. A partir de 168 dias de implantação a prótese
estava coberta por mucosa normal, em alguns casos com tecido conjuntivo, porém
9
sem células inflamatórias de corpo estranho ou macrófagos. A prótese de cimento
de vidro, inicialmente apresentou-se envolvida por epitélio contendo fibras de
colágeno e fibroblastos. Não observaram macrófagos ou células de reação de corpo
estranho. Com 84 dias, a prótese estava fixada por fibras de colágeno à membrana
timpânica ou ao estribo. Após 168 dias a mucosa apresentava-se normal,
localizaram-se alguns osteócitos e o material não apresentou sinais de degradação.
Na avaliação após 2 anos, a mucosa estava normal, mostrando integração dos
implantes com a mucosa adjacente. Portanto, ambos os materiais apresentaram
resultados favoráveis à implantação no tecido hospedeiro.
Uma avaliação histopatológica de implantes de hidroxiapatita-polietileno
realizada em nove amostras retiradas em cirurgias otológicas revisionais, ao
microscópio óptico, notaram que a prótese estava parcialmente coberta por uma
camada de tecido epitelial e fibroso com alguns capilares na camada mais profunda
da matriz. A camada epitelial consistia de células poligonais e cuboidais com
espessura variando entre uma a quatro camadas de células. O tecido fibroso
consistia predominantemente de colágeno, fibroblastos, matriz e plasma. Em
nenhuma das amostras foi encontrado macrófagos ou células gigantes de corpo
estranho, afirmando sua biocompatibilidade (Meijer et al, 2002).
Hoffmann et al (2003) fizeram uma análise de bicompatibilidade de cimento
de osso como adjuvante na reconstrução de cadeia ossicular. O estudo foi realizado
em 25 cobaias nas quais quatro sofreram eutanásia logo após o procedimento
cirúrgico e 21 foram acompanhadas por seis a nove semanas. As cirurgias foram
realizadas somente na orelha direita. O osso temporal foi retirado e feito exame
histopatológico. Utilizaram uma escala de I a IV para avaliar o grau de inflamação e
presença de reação de corpo estranho, sendo o grau I sem células inflamatórias ou
reação de corpo estranho e o grau IV, presença de alterações granulomatosas
intensas, células gigantes de corpo estranho, com inflamação e infiltrado de
linfócitos estendendo-se para o tecido reparativo. Os resultados histológicos
mostraram uma integração entre o osso e o implante de cimento de osso. Em todos
os espécimes observou-se um crescimento significativo de tecido ósseo novo ao
redor dos ossículos onde estava o implante. Houve pouca evidência de inflamação
ou reação de corpo estranho com 95% das amostras apresentando grau I na
mucosa da orelha média.
10
Trabandt et al (2004) estudaram a biocompatibilidade da prótese de titânio
(TORP) comparada com a prótese de óxido de alumínio (Al
2
O
3
) em 29 coelhos. A
prótese foi colocada na orelha direita e o lado contralateral não foi manipulado,
servindo como controle. O acompanhamento dos animais obedeceu aos seguintes
períodos: 28, 84 ou 300 dias. Toda a cavidade da orelha média foi submetida à
avaliação histológica em microscópio óptico e eletrônico. Após 28 dias da
implantação (titânio), observaram que parte do material estava encoberto por uma
fina camada epitelial, enquanto que após 84 dias, estava envolvida por mucosa,
além de pequena vascularização do tecido ao redor do implante. Em relação à
formação de tecido conjuntivo denso, foi visto nos implantes de alumínio, além do
aparecimento de vasos sangüíneos, tecido granuloso ao longo do tempo e
degradação do material. Não observaram, em nenhum momento, a presença de
células gigantes de corpo estranho multinucleadas ou células inflamatórias
reacionais.
Saunders (2006) em um estudo retrospectivo sobre o uso de cimento de osso
de carbonato de fosfato de cálcio em cirurgia otológica afirma que as reparações de
grandes defeitos no osso temporal continuam sendo um desafio apesar de existirem
vários métodos de reconstrução e de haver diversos materiais disponíveis. O uso de
osso ou cartilagem homólogos são preferíveis, entretanto está limitado a defeitos de
tamanho pequeno e médio. Defeitos maiores podem necessitar de materiais
aloplásticos tanto para estabilizar enxertos ósseos homólogos quanto para reparar o
defeito, porém causam mais reações. Têm–se relatado que os enxertos autogênicos
de osso perdem 30% do seu volume após implantação. A cartilagem é menos
reabsorvida, porém pode produzir aderências fibrosas extensas que
conseqüentemente complicam a recuperação da audição.
1.1.4 ESTUDOS COM A CELULOSE
A maioria das celuloses é produzida por plantas vasculares. Além delas, a
síntese de celulose também ocorre na maioria dos grupos de algas, várias espécies
de bactérias e no reino animal (Brown Jr et al, 1976; Saxena, Brown Jr, 2005).
Segundo esses autores, a celulose é composta de uma cadeia linear de
polímeros de β-1,4-glicose (moléculas de alto peso molecular). Dependendo da fonte
que é obtida, as propriedades físicas como o estado e grau de cristalinização e peso
11
molecular podem variar. O estado de cristalinização da celulose é determinado pelo
arranjo das cadeias de glicose em relação umas às outras dentro da unidade celular.
As cadeias de glicose na celulose tipo I estão dispostas paralelamente e
estão alocadas ao lado de microfibrilas com 3 nm de espessura. A síntese dessas
microfibrilas ocorre através de um processo extracelular envolvendo uma adição
seqüencial de resíduos de glicose. Alongam-se a partir de complexos de síntese
terminais e organizados que se move na superfície plana da membrana plasmática.
Portanto, a produção da celulose faz-se pela polimerização das cadeias de glicose e
pela cristalização de microfibrilas, um processo celular direto da Acetobacter xylinum
(Brown Jr et al, 1976; Benziman et al, 1980). (Fig. 1 e Fig. 2)
FIGURA 2: Imagem de A. xylinum
produzindo celulose
Fonte: Benziman et al, 1980
FIGURA 1: Imagem de A. xylinum
(x7000). Fonte: Benziman et al, 1980
A acetobacter é uma bactéria gram negativa, pertencente à família
Pseudomonodaceae, definida como bactéria acética por ter a habilidade de
converter álcool (etanol) em ácido acético na presença de ar. A espécie xylinum é a
única capaz de sintetizar celulose (Gromet-Elhanan, Hestrin, 1963).
Segundo Mateos (2004), a bactéria A. xylinum sintetiza celulose pura em 48 a
72 horas, enquanto que as acetobacter comuns em frutas em decomposição (na
mesma quantidade) levam de 10 a 20 dias para produzir uma tonelada de celulose.
Aplicada sobre a ferida, a membrana de celulose adere totalmente à lesão em
48 horas, funcionando como um perfeito substituto temporário da pele: tem poros
pequenos o bastante para impedir a entrada de bactérias, mas grandes o suficiente
para que o tecido respire; filtra totalmente os raios ultravioletas e, tal qual a pele, tem
permeabilidade mínima para líquidos, o que evita o processo de desidratação e
perda de sais minerais comuns nos queimados. Com isso, os pacientes podem
vestir roupas, tomar banho e até se expor ao sol. E o curativo não precisa ser
12
trocado, o que no caso de queimaduras graves é uma vantagem, porque a troca
retira parte do tecido recém-formado, num procedimento doloroso que quase sempre
exige anestesia geral. O curativo protege o tecido enquanto o organismo renova a
pele por baixo dele. Quando a cicatrização está concluída, a membrana de celulose
resseca e cai naturalmente.
• Estudos experimentais
He et al (1997) estudaram o efeito na cura e adesão aos planos
circunjacentes da secção e sutura do tendão da perna de ratos com e sem uso de
celulose como curativo cirúrgico em 46 ratos distribuídos em 2 grupos,
acompanhados em períodos de uma, duas, três e quatro semanas de pós-
operatório. Os resultados histológicos mostraram que a velocidade e força de
cicatrização do tendão não foram afetadas e que a celulose pode prevenir a adesão
do tendão.
Obara et al (1997), em estudo experimental, usaram a hidroxipropil
metilcelulose hidrofobicamente modificada (HM-HPMC), um derivado de celulose
usado como um curativo tópico, em ratos, em estudo de seis meses com doses
repetidas para avaliação de toxicidade dérmica, seguido por um teste de
recuperação de 30 dias. A substância foi aplicada uma vez, diariamente, em pasta
aquosa, na pele de ratos em doses de até 60 mg/Kg/dia (a dose mais alta que
poderia ser administrada). Os parâmetros avaliados foram sinais gerais, análise de
urina, hematológica, oftalmológica e histopatológica. Os autores concluíram que a
substância não era tóxica em administração dérmica crônica.
Mello et al (1997) realizaram um estudo experimental em 32 cães para avaliar
o uso de celulose em duroplastia. A análise histológica mostrou que a celulose
estava recoberta por uma camada de tecido conjuntivo, quase nenhuma reação de
corpo estranho e ocorreu diminuição da espessura da celulose.
Em outro estudo experimental com cães, Mello et al (1998), observaram que a
celulose implantada em lesão no córtex cerebral apresentou aos sete e 30 dias de
acompanhamento, pequena quantidade de células gigantes de corpo estranho.
Houve regressão da reação histoplasmocitária e, aos 90 dias, a celulose estava
circundada por pobre reação inflamatória. Quando implantada no interior do fígado
de ratos, observaram no sétimo dia após implantação, intensa reação
histolinfoplasmocitária ao redor do material. Após 30 dias havia reação inflamatória
13
de corpo estranho com numerosas células gigantes multinucleadas, sugerindo
reabsorção por fagocitose, que diminuíram de intensidade nos animais aos 90 dias.
Na avaliação da celulose como substituto de peritônio em cães, observou-se
que após 45 dias de implantação, havia proliferação de fibroblastos e
neovascularização evidentes. Após 90 dias, havia fibras de colágeno e fibroblastos
penetrando na celulose e com 180 dias de seguimento, encontrou-se algumas áreas
da celulose fundida com o tecido conjuntivo adjacente e mínima neovascularização
(Nemetz et al, 2001).
Costa et al (2005) estudaram a cicatrização de pele de porcos large white
após ressecção e termoabrasão da pele com metal a 100°C, comparando o uso da
membrana de celulose ao curativo local diário padrão. Observaram que a
cicatrização completou-se em todos os animais, não havendo diferenças entre as
lesões com um ou outro tipo de curativo.
14
OBJETIVO
15
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta tecidual da mucosa da orelha
média, isto é, epitélio da membrana timpânica e mucosa da cavidade timpânica, de
cobaias quando receptora de implante de celulose produzida pela bactéria
Acetobacter xylinum em forma de membrana e manta.
MATERIAL E MÉTODO
17
3 MATERIAL E MÉTODO
Após aprovação na Comissão de Ética em Experimentação Animal da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, o estudo foi realizado
no biotério do Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia (ICAO) com
supervisão e acompanhamento de veterinária, sendo que os animais permaneceram
em caixas apropriadas, com livre acesso à água e à ração comercial padronizada,
necessitando de jejum pré-operatório de 4 horas.
Os procedimentos cirúrgicos foram realizados de acordo com as normas da
comissão de ética da Unidade de Técnica Cirúrgica Experimental da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e obedeceu às normas da Lei
Federal nº 6.638 de oito de maio de 1979 e aos princípios éticos na experimentação,
postulados pelo Código Brasileiro de Experimentação em animais (COBEA).
Todos os animais foram submetidos a procedimento cirúrgico bilateralmente,
de acordo com técnica a ser descrita a seguir, sendo que as orelhas contralaterais à
colocação da celulose foram consideradas controles no estudo.
3.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA
Os animais utilizados foram 42 cobaias (cavia porcellus) machos com três a
quatro meses de idade, pesando cerca de 400g e apresentando otomicroscopia
normal.
Os 42 animais foram distribuídos em dois grupos, a saber:
• Grupo MT (implante de membrana de celulose na MT)
o Duas cobaias para controle do procedimento cirúrgico
o 18 cobaias para o grupo de estudo, que foram subdivididas em grupos MT1,
MT2 e MT3, contendo 6 cobaias em cada
• Grupo CT (implante de manta de celulose na cavidade timpânica)
o Duas cobaias para controle do procedimento cirúrgico
o 20 cobaias para o grupo de estudo, que foram subdivididas em grupos CT1,
CT2, CT3 e CT4, contendo 5 cobaias em cada
3.2 USO E PREPARO DA MEMBRANA E DA MANTA DE CELULOSE
A celulose utilizada neste trabalho foi da marca Bionext
®
(anexo 1).
Previamente ao procedimento cirúrgico, os fragmentos de membrana e de manta de
18
celulose esterilizados foram confeccionados utilizando-se punch dermatológico de
0,4 cm de diâmetro. O tamanho foi padrão para todos os procedimentos.
3.3 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Todos os animais foram anestesiados com quetamina 40 mg/Kg e
hidrocloreto de xylasina 10 mg/Kg por via intraperitoneal e permaneceram sob
ventilação espontânea durante todo o procedimento.
Após a anestesia, as cobaias foram posicionadas no leito cirúrgico, e então foi
feita otomicroscopia para averiguação da normalidade da MT e para limpeza e
remoção de eventuais acúmulos de cerume no conduto auditivo externo.
Previamente à incisão, foi feita assepsia e anti-sepsia dos canais auditivos externos
e dos pavilhões auriculares com iodopovidina.
No pós-operatório imediato, os animais receberam clindaminicina 600 mg
numa dose única de 0,3 ml via intramuscular e 3 gotas otológicas da associação de
ciprofloxacino e hidrocortisona em cada orelha, igualmente em dose única.
3.3.1 IMPLANTE DE MEMBRANA DE CELULOSE NA MEMBRANA TIMPÂNICA
Realizamos uma perfuração central ampla na parte tensa da membrana
timpânica com instrumental cirúrgico otológico (pinça tipo estilete), importando
aproximadamente 70% do seu tamanho total, em ambas as orelhas. Posteriormente,
fizemos um sorteio de qual orelha receberia o fragmento de membrana de celulose,
que foi apoiado sobre os rebordos da perfuração da orelha sorteada, de maneira a
fechar por completo a perfuração, semelhante ao procedimento de miringoplastia
(Fig. 3). A membrana de celulose foi apoiada sobre os rebordos da perfuração para
observarmos os resultados do contato do material com o tecido hospedeiro e não o
fechamento da perfuração.
Na orelha contralateral, após a perfuração na MT, não houve mais
manipulação.
FIGURA 3 – Esquema mostrando o
procedimento cirúrgico com a
colocação da membrana de celulose.
Imagem adaptada de
(http://sprojects.mmi.mcgill.ca/oto3d/)
19
3.3.2 IMPLANTE DE MANTA DE CELULOSE NA CAVIDADE TIMPÂNICA
A incisão de pele do conduto auditivo externo foi realizada superior e
anteroposterior, estendendo-se de 11hs às 2hs na orelha esquerda e de 1h às 10hs
na orelha direita, a cerca de 1mm acima do anel timpânico. Após a incisão, a MT foi
rebatida. Este procedimento foi feito em ambas as orelhas. Após, realizamos um
sorteio de qual cavidade receberia a celulose em manta, caso a orelha fosse
considerada para o grupo controle, a MT era rebatida e o procedimento considerado
encerrado.
Na orelha contralateral, pela abertura, foi introduzido o fragmento de manta de
celulose, sendo depositado dentro da cavidade timpânica, junto à cadeia ossicular,
acima do estribo e posteriormente ao cabo do martelo. Por fim, a membrana
timpânica foi rebatida para seu local original (Fig. 4).
FIGURA 4 – Esquema mostrando o procedimento cirúrgico para a
colocação da manta de celulose.
(Imagem adaptada de http://sprojects.mmi.mcgill.ca/oto3d/)
3.4 ALOCAÇÃO E DEFINIÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO
Os grupos de seguimento foram constituídos de acordo com o tempo de
acompanhamento após o procedimento cirúrgico. As cobaias foram alocadas nos
grupos de estudo por sorteio no final de cada período de seguimento.
O grupo MT foi composto por duas cobaias para controle do procedimento
cirúrgico, sendo a eutanásia no pós-operatório imediato, e 18 cobaias para o grupo
de estudo, que foi dividido em três subgrupos:
• Grupo de estudo MT1 (n=6): sete dias de sobrevida;
• Grupo de estudo MT2 (n=6): 15 dias de sobrevida;
• Grupo de estudo MT3 (n=6): 30 dias de sobrevida.
20
O grupo CT foi composto por duas cobaias para controle do procedimento
cirúrgico, sendo a eutanásia no pós-operatório imediato, e 20 cobaias para o grupo
de estudo, que foi dividido em quatro subgrupos:
• Grupo de estudo CT1 (n=5): sete dias de sobrevida;
• Grupo de estudo CT2 (n=5): 30 dias de sobrevida;
• Grupo de estudo CT3 (n=5): 90 dias de sobrevida;
• Grupo de estudo CT4 (n=5): 180 dias de sobrevida.
Os animais foram agrupados em períodos de seguimento diferentes para que
pudéssemos observar possíveis modificações cicatriciais relacionadas ao tempo.
Salientando que os grupos MT e CT não são comparáveis entre si, são dois grupos
distintos, com o intuito de avaliarmos toda a orelha média em contato com a
celulose. Para o grupo MT, foi considerado tempo máximo de seguimento de 30
dias, pois uma vez cicatrizada a MT, não há mais reações de interações entre o
tecido receptor e o material implantado. Por outro lado, o tempo de seguimento se
estendeu ao máximo de 180 dias para o grupo CT, para obtermos informações de
compatibilidade e estabilidade da manta de celulose na cavidade timpânica.
3.4.1 EUTANÁSIA
Ao final de cada período de seguimento, fizemos um sorteio para a alocação
das cobaias naquele grupo a sofrer eutanásia. O grupo de maior tempo de
seguimento foi composto pelos animais remanescentes do estudo. Desse modo, as
cobaias foram novamente anestesiadas e realizadas otomicroscopias para
observação do aspecto da MT.
Para a eutanásia, os animais receberam injeção intracardíaca de cloreto de
potássio 19,1%, enquanto anestesiados. Após, foi feita a extração de ambos os
ossos temporais, armazenados em formol 10% e encaminhados para exame
histopatológico.
3.5 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
Todo o osso temporal, compreendendo conduto auditivo externo e o osso
mastoídeo foi extraído e fixado em solução de formol 10% para armazenamento e,
21
posteriormente, imersa em ácido nítrico a 5% por 24 horas para descalcificação. O
osso temporal foi cortado na linha mediana longitudinalmente e submetido às
técnicas usuais para exame histológico. Foram realizados cortes seqüenciais com
0,5 micra de espessura e corados pela coloração hematoxilina-eosina (HE).
Finalmente foi feita leitura em microscópio óptico.
Foram avaliadas as condições inflamatórias aguda e crônica e o grau de
cicatrização e fibrose encontrados em cada orelha.
Os parâmetros definidores de condição inflamatória foram:
1-Inflamação aguda:
• Exsudato purulento caracterizado por presença de polimorfonucleares
neutrófilos e fibrina;
• Congestão vascular caracterizada por neovascularização e dilatação dos
vasos existentes com aglutinação de hemácias em seu interior;
• Edema caracterizado por extravasamento do plasma para o interstício.
2-Inflamação crônica:
• Infiltrado inflamatório caracterizado pela presença de linfócitos e macrófagos;
• Proliferação conjuntivo-fibrosa caracterizada pela presença de fibroblastos;
• Reação granulomatosa: presença de células gigantes multinucleadas e
formação de granulomas.
Cada um dos parâmetros foi categorizado, sendo considerados:
• Exsudato de neutrófilos e fibrina
0-ausente
1-focos isolados
2-acúmulos de neutrófilos envolvendo as estruturas
• Neoformação vascular:
0-ausente
1-presente
• Proliferação conjuntivo–fibrosa:
0-ausente
1-presença de fibroblastos isolados
2-proliferação fibroblástica reparativa com espessamento da estrutura avaliada
22
• Células inflamatórias mononucleadas (linfócitos e macrófagos):
0-ausente
1-focos isolados
2-infiltrado difuso
• Integridade da celulose:
0- ausente
1-íntegra
2-fragmentada
• Posição da celulose:
0-ausente
1-solta
2-envolta por epitélio
3-envolta por fibrose
O estudo histológico baseou-se na observação da MT (grupo MT e CT) e da
mucosa da cavidade timpânica (grupo CT).
Todas as lâminas de histologia foram documentadas por fotografia digital.
3.6 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA
A análise dos dados foi desenvolvida por tabelas e testes produzidos no
SPSS (Statistics Package for Social Sciences) 10.0 para Windows e considerado
p<0,05 para a significância estatística. Realizamos:
• Análise estatística pareada para a comparação dos resultados entre a “orelha
com celulose” e “orelha sem celulose” (controle) para cada parâmetro histológico
dentro de cada grupo (MT1, MT2, MT3, CT1, CT2, CT3 e CT4). Para isso, foi
aplicado o teste dos sinais de Wilcoxon.
• Análise estatística para amostras independentes para a comparação dos
resultados entre os grupos MT1xMT2xMT3 e CT1xCT2xCT3xCT4 de cada
parâmetro histológico para a “orelha com celulose”. Para essa análise foi
aplicado o teste de Kruskal-Wallis e o teste U de Mann-Whitney.
RESULTADOS
24
4 RESULTADOS
No momento pré-operatório, todas as cobaias apresentaram à otoscopia
membrana timpânica íntegra, translúcida, brilhante, sem abaulamento ou retração,
cabo do martelo posicionado adequadamente e sem secreções em orelha média
(Fig. 5). Histologicamente, o exemplo de uma MT sem alterações está representada
na figura 7.
FIGURA 5 - Otomicroscopia da orelha
direita de cobaia mostrando membrana
timpânica normal.
4.1 OTOMICROSCOPIA
A otomicroscopia realizada previamente à eutanásia, revelou que nos animais
dos grupos de menor tempo de seguimento, isto é, sete dias, apresentaram em sua
maioria a MT ainda perfurada. Nos demais animais com observações após 15 dias
da cirurgia, observamos cicatrização da perfuração da MT (Tab.1 e tab.2).
TABELA 1. Observações da otomicroscopia no grupo de estudo MT (implante
de membrana de celulose na MT).
Grupo de
estudo
celulose
MT
perfurada
MT
cicatrizada
presença de
crosta na MT
Total
MT1 com 6 - - 6
sem 5 1 - 6
MT2 com 1 3 2 6
sem - 6 - 6
MT3 com - 6 - 6
sem - 6* - 6
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
MT= membrana timpânica.
* Dois casos apresentaram timpanosclerose na MT.
25
TABELA 2. Observações da otomicroscopia no grupo de estudo
CT (implante de manta de celulose na cavidade timpânica).
Grupo de
estudo
celulose MT perfurada MT cicatrizada Total
CT1 com 5 - 5
sem 5 - 5
CT2 com 2 3 5
sem - 5 5
CT3 com - 5 5
sem - 5 5
CT4 com - 5 5
sem - 5 5
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
MT= membrana timpânica.
4.2 PARÂMETROS HISTOPATOLÓGICOS
O produto da exenteração que foi encaminhado para exame
anatomopatológico está representado na figura 6.
OD
OE
FIGURA 6 - Ossos temporais de cobaia.
4.2.1 NEUTRÓFILOS E FIBRINA
No grupo de estudo MT, observamos ausência de sinais inflamatórios em oito
de 18 orelhas (44,4%) quando avaliadas àquelas que receberam a celulose. Focos
isolados de polimorfonucleares neutrófilos foram observados em três orelhas (50%)
do grupo MT1 e em apenas uma orelha no grupo MT2 (Fig. 8). No entanto, a
presença difusa dessas células ocorreu em duas orelhas do grupo MT2 e em quatro
orelhas (66,6%) do grupo MT3 (Fig. 9 e Fig. 10). Nas orelhas que não receberam a
celulose, cinco (83,3%) do grupo MT1, quatro (66,6%) do MT2 e quatro (66,6%) do
MT3 não havia células. Não houve diferença estatística na comparação pareada,
26
isto é, “orelha com celulose” e “orelha sem celulose”, assim como na análise para
amostras independentes (MT1xMT2xMT3) (Tab. 3).
TABELA 3: Quantidade de casos segundo o parâmetro histológico -
neutrófilos e fibrina - no grupo de estudo MT (implante de membrana
de celulose na MT).
Neutrófilos e fibrina
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
ausente
focos
isolados
difuso
Total
MT1 MT com 3 3 0 6
MT sem 5 1 0 6
MT2 MT com 3 1 2 6
MT sem 4 1 1 6
MT3 MT com 2 0 4 6
MT sem 4 0 2 6
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
MT= membrana timpânica.
Para as orelhas que receberam a celulose, na avaliação da MT, observamos
processo inflamatório agudo difuso em todas as orelhas (n=5) no grupo CT1. Nos
grupos CT2, CT3 e CT4, inversamente, foi encontrado maior quantidade de orelhas
apresentando ausência de células polimorfonucleares neutrófilos, isto é, quatro,
cinco e quatro orelhas respectivamente. Quando avaliada a mucosa da cavidade
timpânica nessas mesmas cobaias, notamos ausência de processo inflamatório
agudo na grande maioria das orelhas. Para as orelhas que não receberam a
celulose, no grupo CT1, ocorreu ausência de células em três orelhas (60%) tanto na
MT quanto na mucosa da CT. Da mesma forma, em quatro orelhas (80%) do grupo
CT2 e em cinco (100%) nos grupos CT3 e CT4. Não houve diferença estatística na
análise pareada, apenas uma tendência para a diferença (p=0,059) no grupo CT1.
Ao comparar os resultados para orelha com celulose ao longo do tempo
(CT1xCT2xCT3xCT4), observamos diferença estatisticamente significativa (p=0,006)
na avaliação da MT. Fato também observado na comparação entre CT1xCT2
(p=0,036), CT1xCT3 (p=0,036) e CT1xCT4 (p=0,008) (Tab. 4).
27
TABELA 4: Quantidade de casos segundo o parâmetro histológico -
neutrófilos e fibrina - no grupo de estudo CT (implante de manta de
celulose na cavidade timpânica).
Neutrófilos e fibrina
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
Ausente
Focos
isolados
Focos
difusos
Total
CT1 MT* com 0 0 5 5
sem 3 1 1 5
CT com 2 2 1 5
sem 3 2 0 5
CT2 MT com 4 1 0 5
sem 4 0 1 5
CT com 4 1 0 5
sem 4 0 1 5
CT3 MT com 5 0 0 5
sem 5 0 0 5
CT com 5 0 0 5
sem 5 0 0 5
CT4 MT com 4 1 0 5
sem 5 0 0 5
CT com 4 0 1 5
sem 5 0 0 5
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
* p= 0,059 para orelha com celulose x orelha sem celulose (Teste Wilcoxon)
p= 0,006 para CT1xCT2xCT3xCT4 (Teste Kruskal-Wallis)
p= 0,036 para CT1xCT2 e CT1xCT3; p= 0,008 para CT1xCT4 (Teste U de
Mann-Whitney)
MT= membrana timpânica; CT= cavidade timpânica.
4.2.2 NEOFORMAÇÃO VASCULAR
Quanto às orelhas que receberam o implante de membrana de celulose,
observamos presença de neoformação vascular em duas amostras (33,3%) do
grupo MT1, três (50%) do MT2 e quatro (66,6%) do MT3 (Tab. 5 e Fig. 11). Nas
orelhas que não receberam a celulose, esta característica foi presente em duas
(33,3%) orelhas do MT1 e em uma (16,6%) do MT3. Não houve diferença estatística
na avaliação dos resultados entre a “orelha com celulose” e a “orelha sem celulose”
e entre os grupos de seguimento para a “orelha com celulose” (Tab. 5).
28
TABELA 5: Quantidade de casos segundo o parâmetro
histológico – neoformação vascular no grupo de estudo MT
(implante de membrana de celulose na MT).
Neoformação
vascular
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
Ausente Presente
Total
MT1 MT com 4 2 6
MT sem 4 2 6
MT2 MT com 3 3 6
MT sem 6 0 6
MT3 MT com 2 4 6
MT sem 5 1 6
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
MT= membrana timpânica.
Em três orelhas do CT1, notamos neoformação vascular na MT da orelha que
recebeu a manta de celulose, enquanto que não apareceu esta característica nas
orelhas que não receberam o material (Tab. 6).
TABELA 6: Quantidade de casos segundo o parâmetro histológico
– neoformação vascular no grupo de estudo CT (implante de manta
de celulose na cavidade timpânica).
Neoformação
vascular
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
Ausente Presente
Total
CT1 MT com 2 3 5
sem 5 0 5
CT com 3 2 5
sem 5 0 5
CT2 MT com 4 1 5
sem 5 0 5
CT com 4 1 5
sem 5 0 5
CT3 MT com 5 0 5
sem 5 0 5
CT com 5 0 5
sem 5 0 5
CT4 MT com 4 1 5
sem 5 0 5
CT com 5 0 5
sem 5 0 5
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
MT= membrana timpânica; CT= cavidade timpânica.
29
4.2.3 PROLIFERAÇÃO CONJUNTIVO-FIBROSA
Notamos ausência de proliferação conjuntivo-fibrosa em quatro (66,6%)
orelhas do grupo MT1 que receberam o material, e em apenas uma (16,6%) de MT2
e de MT3, nos quais observamos quatro (66,6%) amostras de cada grupo com
presença de fibroblastos difusos (Tab. 7, Fig. 8, Fig. 12). Nas orelhas que não
receberam o implante, houve ausência de fibroblastos em quatro (66,6%) do grupo
MT1, duas (33,3%) do MT2 e três (50%) do MT3. Houve diferença estatisticamente
significativa (p=0,033) ao se comparar a “orelha com celulose” ao longo do tempo
(teste de Kruskal Wallis). Quando comparados os grupos MT1xMT2, houve diferença
estatisticamente significativa (p=0,041), assim como na comparação dos grupos
MT1xMT3 (p=0,041). Entre MT2xMT3 nenhuma diferença estatística foi observada
(Tab. 7).
TABELA 7: Quantidade de casos segundo o parâmetro histológico –
proliferação conjuntivo-fibrosa no grupo de estudo de estudo MT
(implante de membrana de celulose na MT).
Proliferação conjuntivo-fibrosa
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
Ausente
Fibroblastos
isolados
Fibroblastos
difusos
Total
MT1 MT com 4 2 0 6
MT sem 4 2 0 6
MT2 MT com 1 1 4 6
MT sem 2 3 1 6
MT3 MT com 1 1 4 6
MT sem 3 1 2 6
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
p= 0,033 para MT1xMT2xMT3 (Teste Kruskal-Wallis)
p= 0,041 para MT1xMT2; p= 0,041 para MT1xMT3 (Teste U de Mann-Whitney)
MT= membrana timpânica.
Na avaliação da MT das orelhas que receberam a manta de celulose do grupo
CT1, notamos que em 3 de 5 orelhas (60%) apresentaram fibroblastos isolados e em
2 (40%), fibroblastos difusos. Quando comparado ao grupo CT4, pelo teste U de
Mann-Whitney, observamos diferença estatisticamente significativa (p=0,016), que
apresentou 4 (80%) orelhas sem fibroblastos e 1 (20%) com fibroblastos isolados.
Nenhuma outra diferença estatística foi encontrada (Tab. 8).
30
TABELA 8: Quantidade de casos segundo o parâmetro histológico –
proliferação conjuntivo-fibrosa no grupo de estudo CT (implante de
manta de celulose na cavidade timpânica).
Proliferação conjuntivo-fibrosa
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
Ausente
Fibroblastos
isolados
Fibroblastos
difusos
Total
CT1 MT com 0 3 2 5
sem 3 1 1 5
CT com 3 2 0 5
sem 4 1 0 5
CT2 MT com 4 0 1 5
sem 4 1 0 5
CT com 4 0 1 5
sem 4 1 0 5
CT3 MT com 4 0 1 5
sem 5 0 0 5
CT com 5 0 0 5
sem 5 0 0 5
CT4 MT com 4 1 0 5
sem 5 0 0 5
CT com 5 0 0 5
sem 5 0 0 5
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
p= 0,016 para CT1xCT4 (Teste U de Mann-Whitney)
MT= membrana timpânica; CT= cavidade timpânica.
4.2.4 CÉLULAS INFLAMATÓRIAS MONONUCLEADAS (LINFÓCITOS E
MACRÓFAGOS)
Encontramos focos isolados de linfócitos e macrófagos (Fig. 13, Fig. 14) nas
três orelhas (50%) que receberam a membrana de celulose em cada grupo de
seguimento (MT1, MT2 e MT3), sendo que em 2 das 6 orelhas (33,3%) avaliadas do
MT3, notamos distribuição difusa dessas células. Nenhuma diferença estatística foi
encontrada em ambos os grupos de estudo (Tab. 9, Tab. 10).
TABELA 9: Quantidade de casos segundo o parâmetro histológico – células
inflamatórias mononucleadas (linfócitos e macrófagos) no grupo de estudo
de estudo MT (implante de membrana de celulose na MT).
Células mononucleadas
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
Ausente
Focos
isolados
Focos
difusos
Total
MT1 MT com 3 3 0 6
MT sem 5 1 0 6
MT2 MT com 3 3 0 6
MT sem 5 1 0 6
MT3 MT com 1 3 2 6
MT sem 4 2 0 6
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
MT= membrana timpânica.
31
Tabela 10: Quantidade de casos segundo o parâmetro histológico – células
inflamatórias mononucleadas (linfócitos e macrófagos) no grupo de estudo
CT (implante de manta de celulose na cavidade timpânica).
Células mononucleadas
Grupo de
estudo
Local
avaliado
Celulose
Ausente
Focos
isolados
Focos
difusos
Total
CT1 MT com 0 5 0 5
sem 3 2 0 5
CT com 2 3 0 5
sem 3 2 0 5
CT2 MT com 4 1 0 5
sem 4 1 0 5
CT com 4 1 0 5
sem 4 1 0 5
CT3 MT com 4 1 0 5
sem 5 0 0 5
CT com 5 0 0 5
sem 5 0 0 5
CT4 MT com 4 0 1 5
sem 5 0 0 5
CT com 5 0 0 5
sem 5 0 0 5
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
MT= membrana timpânica; CT= cavidade timpânica.
4.2.5 INTEGRIDADE DA CELULOSE
A celulose apresentou-se fragmentada em quatro orelhas (66,6%) no grupo
MT2 e no MT3 e em uma (20%) orelha nos grupos CT1, CT3 e CT4 (Fig. 8, Fig. 12).
Houve diferença estatisticamente significativa somente quando comparados os
grupos MT1xMT2 (p=0,041) no teste U de Mann-Whitney (Tab. 11 e Tab. 12).
A membrana íntegra na MT foi notada em cinco amostras de MT1 e duas de
MT2 (Fig. 13).
TABELA 11: Relação da integridade da celulose no grupo de
estudo de estudo MT (implante de membrana de celulose na
MT).
Grupo de
estudo
Ausente Íntegra Fragmentada Total
MT1 1 5 0 6
MT2 0 2 4 6
MT3 2 0 4 6
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em
Otorrinolaringologia, 2005.
p= 0,041 para MT1xMT2 (Teste U de Mann-Whitney)
32
TABELA 12: Relação da integridade da celulose no grupo de
estudo CT (implante de manta de celulose na cavidade
timpânica).
Grupo de
estudo
Ausente Íntegra Fragmentada Total
CT 1 0 4 1 5
CT 2 2 3 0 5
CT 3 4 0 1 5
CT 4 2 2 1 5
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
4.2.6 POSIÇÃO DA CELULOSE
Observamos que a celulose estava envolta por epitélio adjacente na maioria
das amostras do grupo MT (Fig. 16). A fibrose envolveu a celulose em apenas um
caso do grupo MT3 e um do CT3 (Fig. 17). Percebe-se que a manta de celulose, na
maioria das amostras do grupo CT, estava ausente ou solta na cavidade. Nenhuma
diferença estatística foi encontrada (Tab. 13 e Tab. 14).
Tabela 13: Relação da posição da celulose no grupo de estudo de
estudo MT (implante de membrana de celulose na MT).
Grupo de
estudo
Ausente Solta
Envolta por
epitélio
Envolta por
fibrose
Total
MT1 0 6 0 0 6
MT2 0 2 4 0 6
MT3 1 1 3 1 6
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
TABELA 14: Relação da posição da celulose no grupo de estudo CT
(implante de manta de celulose na cavidade timpânica).
Grupo de
estudo
Ausente Solta
Evolta por
epitélio
Envolta por
fibrose
Total
CT 1 0 5 0 0 5
CT 2 2 3 0 0 5
CT 3 4 0 0 1 5
CT 4 2 1 2 0 5
FONTE: Instituto de Ciências Avançadas em Otorrinolaringologia, 2005.
33
Os principais achados histológicos estão representados nas figuras seguintes.
FIGURA 7 – Membrana timpânica normal. Coloração de HE –
400X.
a
b
FIGURA 8 – Fotomicrografia mostrando membrana timpânica
focalmente espessada por proliferação fibrosa (a) e processo
inflamatório agudo com exsudato purulento (neutrófilos) (b). A
membrana de celulose (seta) apresenta-se fragmentada e
contornada por fibroblastos. Coloração de HE – 200X.
34
a
FIGURA 9 – Fotomicrografia mostrando acúmulos de
neutrófilos (a) envolvendo fragmento de membrana de
celulose (seta) que apresenta-se íntegra. Coloração
de HE – 100X.
a
FIGURA 10 – Fotomicrografia mostrando acúmulos difusos de
neutrófilos (a) envolvendo fragmento de membrana de
celulose (classificação 2) (seta). Coloração de HE – 400X.
35
FIGURA 11 – Fotomicrografia mostrando presença de neoformação
vascular (seta). Coloração de HE – 100X.
FIGURA 12 – Fotomicrografia mostrando intensa proliferação
conjuntivo–fibrosa com proliferação fibroblástica reparativa
com espessamento da MT (a) e fragmentação da membrana
de celulose (seta). Coloração de HE – 200X.
a
a
FIGURA 13 – Fotomicrografia mostrando membrana timpânica
discreta e focalmente espessada (fibroblastos isolados), com
área de acúmulo focal de neutrófilos e macrófagos (a).
Membrana de celulose (seta). Coloração de HE – 400X.
36
FIGURA 14 – Fotomicrografia mostrando focos isolados de células
inflamatórias mononucleadas (linfócitos e macrófagos) na
membrana timpânica que se apresenta espessada por proliferação
fibrosa e neoformação vascular. Membrana de celulose
fragmentada (seta) e envolta por fibrose. Coloração de HE – 40X.
FIGURA 15 – Fotomicrografia mostrando fragmento de membrana
de celulose (seta) íntegra na membrana timpânica discreta e
focalmente espessada (fibroblastos isolados).Coloração de HE –
400X.
37
FIGURA 16 – Fotomicrografia mostrando manta de celulose
envolta por epitélio da membrana timpânica (seta). Coloração
de HE – 100X.
FIGURA 17 – Fotomicrografia da membrana timpânica
mostrando membrana de celulose envolta por fibrose. Coloração
de HE – 400X.
38
DISCUSSÃO
39
5 DISCUSSÃO
Os animais utilizados neste trabalho foram cobaias, assim como fizeram os
autores Hoffmann et al (2003) e Szabó (2006). Outros animais também são
utilizados para experimentos com finalidades otológicas como a chinchila (Laidlaw et
al, 2001; Haynes, 2005; Spiegel, Kessler, 2005; Weber et al, 2006), ratos (Willians,
Blayney, 1987; Güneri et al, 2003; Rahman et al, 2005; Stenfeldt et al, 2006) ou
coelhos (Bonzon et al, 1995; Schwager, Geyer, 1998; Trabandt et al, 2004). A
escolha pelas cobaias deu-se por elas apresentarem estrutura anatômica da
cavidade timpânica e dos ossículos semelhante a dos seres humanos e por
oferecerem boas condições de manipulação, acompanhamento e avaliação.
Os estudos de biocompatibilidade de materiais geralmente necessitam de
uma avaliação em períodos diferentes pela fisiopatogenia da resposta tecidual a um
corpo estranho. Por este motivo, houve a necessidade de dividir as amostras em
grupos de seguimento. Enquanto, Laidlaw et al (2001), Hoffmann et al (2003) e
Spiegel, Kessler (2005) utilizaram apenas um período de acompanhamento (seis a
oito semanas, oito e seis semanas, respectivamente). Outros autores avaliaram em
diversos períodos como Schwager, Geyer (1998) por 28, 84, 168, 336, 504 dias e 2
anos; Trabandt et al (2004) por 28, 84 e 300 dias; Rahman et al (2005) por duas e
quatro semanas; Szabó (2006) por um, três, cinco, sete, nove, 14, 21 ou 35 dias e
seis, nove ou 12 meses; Weber et al (2006) em duas, quatro e seis semanas. No
grupo MT, o acompanhamento foi até 30 dias, pois a cicatrização da MT ocorre
neste espaço de tempo, e uma vez cicatrizada, não há mais interação entre o
material implantado e o epitélio da MT. Na avaliação da manta da celulose na
cavidade timpânica estendeu-se o tempo de seguimento até o máximo de 180 dias
devido à sua conformação física mais densa, e também para observarmos qual seria
o desfecho do material nessas circunstâncias.
Em relação à metodologia, constituímos dois grupos de estudo, avaliação da
celulose na MT e na cavidade timpânica, para estudarmos o comportamento das
diversas estruturas que compõem a orelha média, quando em contato com este
material. Desse modo, houve a necessidade de utilizarmos a membrana de celulose
para ser apoiada na MT e a manta de celulose para ser inserida dentro da cavidade
timpânica, que pela sua estrutura física, isto é, consistência e volume, adaptar-se-
iam melhor.
40
Laidlaw et al (2001) e Spiegel, Kessler (2005) realizaram a perfuração da MT
nas chinchilas com o auxílio de uma pinça angulada consistindo 50% da parte
flácida. Os animais eram reexaminados a cada semana por cinco a oito semanas;
caso houvesse sinais de cicatrização as perfurações eram reabertas. Weber et al
(2006) também produziram perfuração de MT, porém utilizaram eletrocautério, pois
necessitavam de uma perfuração central de 5 mm. Nesses casos, os autores
queriam avaliar a eficácia de um tipo de enxerto no fechamento das perfurações
crônicas. O objetivo deste trabalho foi diferente, observar a MT quando em contato
com a celulose, assim como Szabó et al (2006), que avaliaram a presença da fáscia
do músculo temporal em perfurações agudas de cobaias.
Nos animais do grupo CT, para o acesso à cavidade timpânica com o intuito
de depositar a celulose em manta, rebatemos o retalho timpanomeatal junto ao anel
timpânico, procedimento realizado nas cirurgias de timpanotomia exploradora e
timpanoplastia. Este procedimento em animais de experimentação, também foi feito
por Schwager, Geyer (1998), Hoffmann et al (2003) e Trabandt et al (2004) para
avaliar a biocompatibilidade de próteses de cadeia ossicular.
Nas observações de otomicroscopias por Stenfeldt et al (2006) e
Rahman et al (2005) em ratos, após perfurações realizadas na MT, todas (n= 33 e
n=20, respectivamente) estavam fechadas entre nove e 14 dias. Neste trabalho,
observamos que com sete dias, quase 100% das orelhas apresentavam-se com a
MT perfurada, resultado compatível com a fisiopatogenia das cicatrizações da MT e
com os resultados dos autores citados. Além disso, também houve fechamento da
perfuração em quase todas as orelhas, após 15 dias (uma MT perfurada em 12, do
grupo MT2), assim como encontrado no trabalho dos autores citados.
Segundo Güneri et al (2003), as principais mudanças que levam ao
fechamento da perfuração de uma MT são: o movimento da queratina em direção ao
centro da perfuração, proliferação epitelial, e a eventual formação de uma nova
camada fibrosa. A maioria das perfurações (90%), especialmente quando envolvem
menos de 25% da área total da MT, fecham espontaneamente. As perfurações
maiores ou acompanhadas por doenças na orelha média necessitam de algum tipo
de enxerto para o fechamento. Nas perfurações traumáticas agudas, com grandes
perdas de substâncias, se colocado um vetor, este funcionaria como uma ponte para
a camada escamosa externa crescer, impedindo que penetre na mucosa interna da
orelha, formando uma área de contato inativa, e desse modo perpetuando a
41
perfuração. Nesse sentido, a implantação da celulose na MT perfurada, funcionaria
como o vetor mencionado, assim como outros materiais utilizados com essa mesma
finalidade, por exemplo, a fáscia do músculo temporal, o papel de arroz e o
aloderme. Portanto, esperava-se que houvesse fechamento da perfuração nas
cobaias estudadas, característica observada em todas as orelhas dos grupos MT2 e
MT3 (n=24).
Na literatura, observamos, que para a avaliação da biocompatibilidade do
enxerto em relação ao tecido hospedeiro, existem vários métodos. Têm-se: cultura
de células e tecidos, análise histoquímica (Schadel et al, 1993), estudos bioquímicos
(Sevastjanova et al, 1986; Vince et al, 1991) e histológicos e estudos de perfusão de
todo um órgão. Além de medidas de peso, rigidez, elasticidade, alongamento,
quebras na mecânica e alterações na superfície, que podem ser revelados na
microscopia eletrônica. Mais recentemente, têm-se também usado exames
complementares de radiologia como, por exemplo, a tomografia computadorizada, a
ressonância nuclear magnética associada ou não à injeção de marcadores
radioativos específicos, para avaliar a resposta do tecido à implantes metálicos que
podem se dissolver e causar inflamação (Vince et al, 1991; Dormer et al, 1995).
Porém o método mais utilizado em estudos experimentais á a análise histológica
com coloração de hematoxilina-eosina (Högset, Bredberg, 1986; Willians,Blayney,
1987; Merchant, Nadol, 1994; Bonzon et al, 1995; Schwager, Geyer, 1998; Laidlaw
et al, 2001; Meijer et al, 2002; Hoffman et al, 2003; Trabandt et al, 2004; Spiegel,
Kessler, 2005; Weber et al, 2006).
Neste trabalho optamos pela análise histológica, por ser um método simples e
por fornecer informações gerais da resposta tecidual ao material implantado. Outra
razão para essa escolha foi a necessidade de avaliar a cavidade timpânica como um
conjunto; isso foi possibilitado pelo pequeno tamanho do osso temporal das cobaias.
Não houve utilidade a coleta de exames laboratoriais como marcadores sanguíneos
de inflamação, imunohistquímica ou mesmo do uso de exames muito elaborados
como a ressonância magnética.
A histologia das orelhas das cobaias que sofreram eutanásia logo após o
procedimento cirúrgico (controles) revelou que o procedimento em si, não provocou
alterações ou interferências no local manipulado. Desse modo, estabelecendo o
padrão inflamatório inicial decorrente do procedimento cirúrgico, pudemos utilizá-lo
como referência para o quadro inflamatório determinado pela atividade cicatricial e
42
reações ao material implantado. Assim, os resultados dos parâmetros estudados são
decorrentes da evolução do processo e não do procedimento cirúrgico realizado.
• Neutrófilos e fibrina
Nas orelhas estudadas do grupo MT, não observamos processo inflamatório
agudo exacerbado. A presença de polimorfonucleares neutrófilos foi notada de
forma difusa em quatro de seis orelhas do grupo MT3 que tinha a celulose na MT.
Apesar disso, não houve nenhuma diferença estatística na comparação da “orelha
com celulose” e a “orelha sem celulose”, nem quando comparadas apenas as
“orelhas com celulose” entre MT1, MT2 e MT3. Estes resultados sugerem que o
processo inflamatório agudo tem comportamento semelhante tanto na ausência
quanto na presença da celulose na MT e nesta última situação, também se
apresentou com padrão semelhante aos sete, 15 ou 30 dias de implantação.
A presença de processo inflamatório agudo não foi avaliada por Laidlaw et al
(2001) quando estudou o aloderme como enxerto de perfurações de MT. Baseando-
se na fisiopatogenia da resposta tecidual à biomateriais, Sevastjanova at al (1987),
Robbins et al (1994) e Bonzon et al (1995), descrevem que inicialmente um
processo inflamatório agudo desenvolve-se ao redor do implante, em que nas
primeiras horas ou dias, há exsudação de líquidos e proteínas plasmáticas e
migração de leucócitos (neutrófilos). Com o passar do tempo esse processo vai
diminuindo, dando lugar à inflamação crônica. Desse modo, nas amostras
estudadas, esperávamos reação inflamatória aguda maior nas cobaias dos grupos
MT1 e MT2 em comparação ao grupo MT3 (Tab.3). No entanto, isso não ocorreu,
demonstrando que a celulose não foi capaz de produzir esse tipo de reação de
maneira tão intensa, a ponto de haver diferença estatística entre os grupos de sete e
30 dias.
Na análise do grupo CT, pelo teste de Kruskal-Wallis, verificamos diferença
estatisticamente significativa (p=0,006) nos diferentes tempos de seguimento, o que
implica que os dados desse parâmetro não são semelhantes ao longo do tempo
(quando avaliada a MT). Completando o raciocínio, pelo teste U de Mann-Whitney
analisamos os parâmetros para cada dois períodos a fim de identificar em qual deles
esse resultado era diferente. Assim, verificamos que entre CT1xCT2, CT1xCT3,
CT1xCT4 houve diferença entre os resultados (p=0,036; p=0,036; p=0,008,
respectivamente). Dessa maneira, concluímos que esse parâmetro histológico foi
43
diferente de CT1 para os demais períodos estudados (CT2, CT3 e CT4) e, que após
esse período (CT1), o comportamento desse parâmetro se manteve estável.
Em números absolutos, este parâmetro foi representado pela presença de
focos difusos de neutrófilos e fibrina em todas as cinco MT do grupo CT1 e em
nenhuma MT dos grupos CT2, CT3 e CT4, mostrando diferença entre o grupo que
sobreviveu sete dias em relação aos demais (Tab. 4). Isto é compatível com o que
está descrito na literatura, na qual a reação inflamatória tecidual ao corpo estranho é
mais intensa nos primeiros dias. Além disso, a manipulação da MT, da forma como
foi feita, pode ser uma causa para o aparecimento dessas células em grandes
quantidades aos sete dias de avaliação. Da mesma maneira, não foi encontrado
infiltrado inflamatório evidente nas orelhas de ratos frente a polímeros sintéticos
implantados na cadeia ossicular em seis e 12 semanas estudados por Williams,
Blayney (1987); a partir dos 84 dias com as próteses de titânio e cimento de vidro
estudados por Schwager, Geyer (1998); com seis a nove semanas no estudo de
biocompatibilidade de cimento de osso realizado por Hoffmann et al (2003) e a partir
de 28 dias no estudo das próteses de titânio de Trabandt et al (2004).
Especificamente neste grupo que recebeu a manta de celulose, que é mais
volumosa do que a membrana, mesmo que tenha ocorrido uma resposta tecidual
maior pode ser considerada esperada, e por esse motivo não observamos
diferenças relevantes entre os grupos M. Assim, em ambos os casos, grupo MT e
grupo CT, a formação de células (neutrófilos e fibrina) ocorreu de maneira
fisiológica, não demonstrando uma reação exacerbada à celulose.
• Neoformação vascular
Não houve diferença estatística nos resultados entre a “orelha com celulose”
e a “orelha sem celulose” e dentro dos grupos de seguimento (MT1xMT2xMT3 e
CT1xCT2xCT3xCT4) (Tab. 5 e Tab. 6), assim como Güneri et al (2003) observaram
nas MT tratadas ou não com ácido hialurônico, fator de crescimento epidermal ou
mitomicina C, demonstrando que a celulose não influência a angiogênese.
Particularmente no grupo CT1, observamos que em três orelhas que
receberam a manta de celulose, a MT apresentou-se com neoformação vascular, o
que pode ser correspondente a cinco amostras que tiveram focos difusos de
polimorfonucleares neutrófilos, caracterizando talvez, o processo inflamatório agudo
típico após uma fase recente a um procedimento.
44
• Proliferação conjuntivo-fibrosa
De uma maneira geral, quando avaliamos os grupos MT (Tab. 7) e CT (Tab.
8), não encontramos nenhuma diferença estatística na comparação das orelhas que
receberam o implante de celulose com aquelas que não o receberam, demonstrando
que para o parâmetro “proliferação conjuntivo-fibrosa”, independente de ter ou não a
celulose na cavidade timpânica, o comportamento é semelhante, indicando uma boa
incorporação do material ao tecido hospedeiro. Güneri et al (2003) também
obtiveram este mesmo resultado no estudo de comparação entre ácido hialurônico,
fator de crescimento epidérmicol e mitomicina C para eficácia no fechamento de
perfurações.
A avaliação do grupo MT demostrou que pelo teste de Kruskal-Wallis houve
diferença estatisticamente significativa (p=0,033), predizendo que ao observar os
dados desse parâmetro, não tem o mesmo resultado ao longo do tempo.
Completando o raciocínio, pelo teste U de Mann-Whitney analisamos os
parâmetros para cada dois períodos a fim de identificar o período em que esse
resultado foi diferente. Verificamos que entre MT2xMT3 nenhum parâmetro foi
diferente de forma estatisticamente significativa, porém MT1xMT2 e MT1xMT3,
houve diferença entre os resultados (p=0,041, para ambos). Desse modo, podemos
dizer que a “proliferação conjuntivo-fibrosa” foi diferente de MT1 para os demais
períodos estudados (MT2 e MT3). E, que após esse período (MT1) o
comportamento desse parâmetro manteve-se estável, isto é, as cobaias avaliadas
com 15 e 30 dias apresentaram padrão de “proliferação conjuntivo-fibrosa”
semelhantes entre si e diferente em relação aos sete dias.
Em termos quantitativos, essa diferença está representada pela ausência de
fibroblastos em quatro MT do grupo MT1, uma do MT2 e uma do MT3, e
conseqüentemente, presença difusa dessas células em nenhuma MT do grupo MT1,
e em quatro dos grupos MT2 e MT3, nos quais as MT apresentaram-se na histologia
de forma espessada.
Segundo Sevastjanova et al (1987), Vince et al (1991) e Robbins et al (1994),
o processo inflamatório crônico ocorre após alguns dias da lesão, sendo
caracterizado pela presença de células como os fibroblastos, linfócitos e
macrófagos, adicionalmente à proliferação de tecido conjuntivo. Além disso, Bonzon
et al (1995) afirmam encontrar o início da resposta fibroblástica em torno de 21 dias
45
de implantação de um enxerto. Essas informações justificam a maior quantidade de
casos com proliferação difusa de fibroblastos na MT nos grupos de seguimento com
maior tempo de sobrevida, salientando o processo fisiológico da reparação tecidual
e não uma resposta negativa do tecido hospedeiro em relação à presença da
celulose.
Rahman et al (2005) observaram que no local de uma perfuração da MT,
ocorre formação de tecido novo mais espesso devido à proliferação do tecido
conjuntivo com presença de maiores quantidades de fibroblastos, da mesma forma
que Güneri et al (2003), Spiegel, Kessler (2005) e Weber et al (2006), observaram
em estudos experimentais para a avaliação de biomateriais implantados na MT,
cujos resultados são semelhantes aos encontrados neste estudo.
Em relação ao grupo CT (Tab. 8), observamos uma maior quantidade de
casos sem fibroblastos nos grupos de maior sobrevida (90 e 180 dias),
provavelmente porque são períodos mais longos e nesta fase o tecido já está
regenerado e não apresenta mais reação. Isso também foi observado nos estudos
experimentais para avaliação de biomateriais que foram implantados na orelha
média realizados com polímeros por 12 e 26 semanas (Willians, Blaybey, 1987),
titânio e cimento de vidro a partir de 84 dias de implantação (Schwager, Geyer,
1998), cimento de osso por seis a nove semanas (Hoffmann et al, 2003) e titânio e
óxido de alumínio aos 84 e 300 dias de implantação (Trabandt et al, 2004).
Nos estudos realizados com a celulose em cães, Mello et al (1997), Mello et al
(1998) e Nemetz et al (2001), notaram proliferação de fibroblastos evidente em torno
dos 30 e 45 dias de implantação, compatível com este estudo.
No entanto, na comparação entre os grupos CT1xCT4, houve diferença
estatística (p=0,016), sugerindo um comportamento tecidual diferente para a
proliferação conjuntivo-fibrosa. Esse resultado seria mais adequado se tivesse
ocorrido na comparação entre os grupos CT2xCT3 ou CT2xCT4, ou seja, entre 30 e
90 dias ou 30 e 180 dias, justamente por causa da fisiopatogenia da inflamação,
contando que com 30 dias de implantação haveria um incremento na quantidade de
fibroblastos. Porém, como não houve outra diferença estatisticamente significativa,
entre os demais grupos CT, a “proliferação conjuntivo-fibrosa” foi semelhante ao
longo do tempo.
46
• Células inflamatórias mononucleadas (linfócitos e macrófagos)
Essas células não foram observadas na maioria das amostras de ambos os
grupos (MT e CT) (Tab. 9 e Tab. 10), ocorrendo focos isolados e difusos, apenas no
grupo MT3, na presença da celulose, podendo caracterizar uma tentativa do tecido
hospedeiro em absorver e incorporar o material, já que não foi notada a presença de
células gigantes tipo corpo estranho, o que por outro lado, representaria uma
resposta negativa.
Mesmo assim, nenhuma diferença estatisticamente significante entre os
grupos MT foi encontrada, demonstrando que a resposta tecidual quando em
contato com a celulose é semelhante ao que ocorre quando este material não está
presente, mesmo ao longo do tempo. Este resultado também é citado por Hoffmann
et al (2003), Trabandt et al (2004) e Weber et al (2006) em estudos de
biocompatibilidade de materiais na orelha média e Mello et al (1997) e Mello et al
(1998) em observações feitas com a celulose.
• Integridade e posição da celulose
A diferença estatisticamente significante (p=0,041) na comparação MT1xMT2
(Tab. 11), que em números absolutos seriam cinco de seis amostras íntegras e
nenhuma fragmentada em MT1 e apenas duas de seis amostras íntegras e quatro
de seis fragmentadas em MT2, e pelas observações das lâminas de histologia,
revelaram que a celulose em períodos maiores de contato com o organismo, vai
sendo degradada até desaparecer, pois em algumas amostras não foi possível
visualizar a celulose.
Essa fragmentação e incorporação ocorreram mesmo não sendo visualizadas
grandes quantidades de macrófagos ou células de corpo estranho, assim como
Laidlaw et al (2001) observaram com o aloderme em chinchilas, Mello et al (1997) e
Nemetz et al (2001) observaram com a celulose em cães, Saunders (2006) relata a
reabsorção da cartilagem, osso e hidroxiapatita e Szabó (2006) com a fáscia
temporal em cobaias. Questionamos se isso seria um indicativo de boa reação
tecidual e boa qualidade do biomaterial.
A manta de celulose também é absorvida ao longo do tempo, na medida em
que encontramos fragmentação ou ausência na maioria dos casos nos quais o
tempo de sobrevida era maior (Tab. 12). Isso pode ter ocorrido pelo pequeno
tamanho do material que foi inserido ou pelas características próprias da celulose.
47
Desse modo, podemos dizer que a manta dentro da cavidade timpânica tem vida
limitada, se usada temporariamente como material de preenchimento ou apoio para
a cadeia ossicular, teria sua utilidade estabelecida, mas não podemos dizer o
mesmo para a substituição de ossículos.
É importante salientar que apesar de ter ocorrido a absorção da celulose, não
houve o aparecimento de outras doenças como, por exemplo, o colesteatoma nos
casos de enxertos de pele utilizados nos primeiros procedimentos otológicos
A posição da celulose em todos os grupos de estudo comportou-se de modo
semelhante visto que não houve nenhuma diferença estatisticamente significante.
Em alguns casos a celulose estava envolvida pelo epitélio, fato mais freqüente
quando usamos a membrana de celulose (sete casos em 12 para a membrana e
dois casos em 20 para a manta). Talvez por estar em maior contato com o epitélio
do que a manta, que foi depositada na cavidade. O envolvimento do epitélio
adjacente ao material implantado é citado por vários autores como uma resposta
positiva do organismo, por exemplo, com formação de fina cápsula fibrosa (Willians,
Blaybey, 1987; Dormer et al, 1995; Mello et al, 1997; Schwager, Geyer, 1998; Meijer
et al, 2002; Trabandt et al, 2004; Rahman et al, 2005, Weber et al, 2006) ou
formação de camada trilaminar da MT com camada fibrosa fina (Laidlaw et al, 2001;
Spiegel, Kessler, 2005; Szabó, 2006).
Considerando todas as idéias discutidas, pela análise dos parâmetros
histológicos de inflamação aguda (neutrófilos, fibrina e neoformação vascular) e de
inflamação crônica (fibroblastos, células mononucleadas - linfócitos e macrófagos),
de um modo geral, podemos dizer que a mucosa da orelha média comporta-se de
maneira semelhante na presença ou não da membrana e da manta de celulose.
Esse comportamento também é semelhante na avaliação ao longo do tempo. A
fragmentação da celulose é um sinal positivo de incorporação ao tecido sem
ocorrência de resposta inflamatória exacerbada e patológica.
Atualmente a celulose já tem usos, indicações e eficácia estabelecidos em
outras áreas como nos curativos de pele (Obara et al, 1997), nos curativos cirúrgicos
de outras estruturas (He et al, 1997; Mello et al, 1997; Mello et al, 1998; Nemetz et
al, 2001), queimaduras (Fontana et al, 1990; Costa et al, 2005; Czaja et al, 2006). As
possibilidades de uso desse material na otorrinolaringologia podem trazer soluções a
problemas antigos ou auxiliar e inovar técnicas já existentes.
48
A celulose na forma de manta que foi depositada na cavidade timpânica pode
não ser o melhor ou mais adequado material para ser usado na reconstrução da
cadeia ossicular, pois não apresenta características necessárias para essa
finalidade, como citado por Sprekelsen, Algarra, 1992, Pou, 2003 e Menéndez-
Colino et al, 2004, que seriam a rigidez e estabilidade. Embora não tenha essas
propriedades, a manta pode ser uma boa opção de material para ser usado em
interposição de estruturas, apoio de ossículos ou mesmo como barreira temporárias,
uma vez que é reabsorvida.
A membrana de celulose pode favorecer a ponte mucosa para o crescimento
fisiológico da MT auxiliando o fechamento das perfurações. Por ser um material de
fácil obtenção e manejo durante a cirurgia e por causar o mínimo de resposta
inflamatória, promete ser uma ótima alternativa aos enxertos atualmente em uso
para essa finalidade como a fáscia do músculo temporal, aloderme ou papel de
arroz. Ajulo et al (1993), Youssef (1999), Benecke (2001), Saadat et al (2001), Fayad
et al (2003), Vos et al (2005), Fishman et al (2005) e Haynes et al (2006) afirmam
que outras vantagens do uso de biomateriais são: menor tempo cirúrgico, menor
morbidade do paciente e ausência de manipulação de outras áreas para a retirada
de material, menor tempo de recuperação e conseqüentemente menor custo.
Uma outra opção de uso seria ambulatorial, no auxílio ao tratamento de
perfurações traumáticas ou após OMA supurada tratada com perfurações residuais,
principalmente por favorecer o fechamento da MT com retorno à integridade com
mais rapidez, diminuindo o tempo de cicatrização e evitando a perpetuação da
perfuração.
A grande variedade de materiais usados em cirurgias otológicas sugere que o
material ideal ainda não foi encontrado. Embora a taxa de sucesso em reconstrução
de cadeia ossicular e membrana timpânica sejam razoáveis, mais pesquisas são
necessárias para o desenvolvimento de novos materiais apropriados para suprir as
necessidades de doenças que não são solucionadas com os materiais disponíveis e
também aprimorar os procedimentos e resultados obtidos com as técnicas atuais.
CONCLUSÃO
50
6 CONCLUSÃO
Com o estudo da celulose, sintetizada pela bactéria Acetobacter xylinum, na
orelha média de cobaias foi possível concluir que:
• A resposta tecidual da mucosa da orelha média, pela avaliação dos parâmetros
histológicos (inflamação aguda e crônica), comparando as orelhas que
receberam e as que não receberam o implante de membrana e manta de
celulose, apresentou-se de forma semelhante;
• A resposta tecidual da mucosa da orelha média, pela avaliação dos parâmetros
histológicos (inflamação aguda e crônica), apresentou-se semelhante ao longo
do tempo, ao contato com a manta e a membrana de celulose;
• Houve, ao longo do tempo, sinais de fragmentação e incorporação da membrana
e da manta de celulose na orelha média.
51
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56
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Normatização para apresentação de dissertações e teses - Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo. Aprovada pela Comissão de Pós-Graduação
em 13 de julho de 2004.
57
RESUMO
As perfurações da membrana timpânica (MT) e as perdas de integridade da cadeia
ossicular são seqüelas freqüentemente vistas e decorrentes de várias situações
patológicas. Os procedimentos cirúrgicos para a reabilitação dessas seqüelas
procuram reconstituir a MT ou o sistema tímpano-ossicular em sua maioria com
colocação de enxertos autólogos. Na impossibilidade de se usarem esses enxertos,
há os biomateriais como a celulose, atualmente utilizada como substituto temporário
da pele. Não há estudos desse material na orelha média. O objetivo deste trabalho
foi o de avaliar a resposta tecidual da mucosa da orelha média na presença de
membrana e de manta de celulose produzida pela bactéria Acetobacter xylinum .
Foram utilizadas 42 cobaias (cavia porcellus), divididas em: 18 para o grupo MT
(implante de membrana de celulose - Bionext
®
, na MT, subdividido em três grupos
com seis cobaias), 20 para o grupo CT (implante de manta de celulose - Bionext
®
, na
cavidade timpânica, subdividido em quatro grupos com cinco cobaias) e quatro
controles do procedimento cirúrgico (dois para cada grupo e sacrificadas no pós-
operatório imediato). Em cada cobaia foi implantado o material em apenas uma
orelha; ficando a contralateral como orelha controle. Após um período de
implantação de sete, 15 e 30 dias nas MT das cobaias do grupo MT e de sete, 30,
90 e 180 dias na cavidade timpânica do grupo CT, os ossos temporais foram
removidos e realizado estudo histopatológico, levando-se em consideração
parâmetros de inflamação aguda (neutrófilos, fibrina e neoformação vascular),
inflamação crônica (fibroblastos, linfócitos e macrófagos), posição e integridade da
celulose.
Neutrófilos e fibrina ocorreram em maior freqüência nas MT das cobaias do grupo
CT que sobreviveram sete dias em relação aos demais (30, 90 e 180 dias)
(p=0,006). Além disso, houve maior proliferação conjuntivo-fibrosa nas MT das
cobaias do grupo MT que sobreviveram 15 e 30 dias (p=0,041) em relação a sete
dias, representadas por espessamento dessa estrutura. Nos demais parâmetros
histológicos, não foram encontradas nenhuma diferença estatisticamente
significante.
Concluímos que a mucosa da orelha média comporta-se de maneira semelhante na
presença ou não da membrana e da manta de celulose. Esse comportamento
também é semelhante na avaliação ao longo do tempo. Ocorreu fragmentação e
incorporação da membrana e da manta de celulose na mucosa da orelha média.
58
ABSTRACT
Tympanic membrane (TM) perforation and lost of integrity of ossicular chain are
consequences frequently seen and resulted from various pathologic situations.
Surgical treatment to restore these consequences will reconstruct the TM or the
tympanic-ossicular system usually with autologous grafts. If it is not possible to use
these grafts, there are others biomaterials like cellulose, which, nowadays, is used as
a temporary skin substitute. There are no studies about this material in the middle
ear.
The objective of this study was to assess the tissue response of the middle ear
mucosal epithelium with cellulose pellicle and blanket synthesized by Acetobacter
xylinum.
Forty two guinea pigs were used, divided in: 18 to group MT (cellulose pellicle-
Bionext
®
, implanted in TM, subdivided in three groups with six animals each), 20 to
group CT (cellulose blanket-Bionext
®
, implanted in tympanic cavity, subdivided in
four groups with five animals each) and four surgical procedure control (two for each
group, killed immediately after surgery). In each guinea pig the material were
implanted in only one ear, so that the contralateral ear was the control. After a
implantation period of seven, 15 and 30 days in TM of group MT and seven, 30, 90
and 180 days in tympanic cavity of group CT, all temporal bones were removed and
processed histologically, considering acute inflammatory parameters (neutrophiles,
fibrine and vascular angiogenesis), chronic inflammatory parameters (fibroblasts,
linphocites and macrophages), position and integrity of cellulose.
Neutrophiles and fibrines were more frequently in TM of group CT that survived
seven days in comparison with others (30, 90 and 180 days) (p=0.006). Moreover,
there were much more proliferation of fibroblasts in TM of group MT that survived 15
and 30 days (p=0.041) in comparison with seven days survival group, represented by
TM thickens. In the rest of the histological parameters, there were no significant
differences.
We concluded that, the middle ear mucosal epithelium has a similar behaviour with
or without cellulose pellicle and blanket. This behaviour is similar in the evaluation as
long as the time passed. Fragmentation and incorporation occurred in cellulose in the
middle ear mucosal epithelium, as well.
59
APÊNDICE
Aprovação do estudo pela Comissão de Ética em Experimentação Animal.
60
ANEXO 1
Caracterização de algumas propriedades da membrana de celulose bacteriana
(Bionext
®
).
Característica Especificações Método
Aparência Membrana flexível
Semitransparente
Tom amarelado por luz
transmitida
Tom azulado por luz refletida
Visual
Dimensões 8x10x0,2cm Régua em mm
Integridade de superfície Livre de rasgos, buracos ou
micro-perfurações
Visual e microscopia
eletrônica de varredura
Gramatura 21g.MT2 ABCP-P23/70
Identificação Bandas e picos
característicos
Espectroscopia
vibracional no
infravermelho e difração
de raios-x (método do pó)
pH do extrato aquoso
(36cMT2/50ml de água)*
6,5 ABCP-23/80
Umidade
(posição entre 6 e 20min)
<5%
(2,3%)
Termogravimetria
% de celulose >95%
(96,2%)
USP XXII
Cinzas sulfúricas <0,5%
(0,3%)
USP XXII
Metal pesado <10ppm USP XXII
Conteúdo de proteína <1,5%
(1,14%)
Kjeldahl
ACC46-12
Resíduo de óxido de etileno Não necessário
(esterelizado por radiação
gama)
GLC (BIO XXI)
* pH do branco (água destilada sob refluxo)= 6,6
FONTE: Departamento de Química Geral e inorgânica do Instituto de Química da
UNESP – Araraquara
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