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Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Departamento de Saúde Coletiva
Avaliação da resposta imune celular de
pacientes chagásicos após estímulo
in
vitro
com os antígenos recombinantes
CRA e FRA de
Trypanosoma cruzi
Recife, 2006
Virginia Maria Barros de Lorena
Mestrado em Saúde Pública
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Virginia Maria Barros de Lorena
Avaliação da resposta imune celular de pacientes
chagásicos após estímulo
in vitro
com antígenos
recombinantes CRA e FRA de
Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada à Pós-graduação em Saúde Pública do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães/ Fiocruz com vistas à obtenção do título de Mestre na
área de concentração Controle de Endemias e Métodos Diagnósticos.
Orientadora: Yara de Miranda Gomes
Co-orientadora: Valéria Rêgo Alves Pereira
Recife, 2006
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Catalogação na fonte: Biblioteca do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
L868a Lorena, Virginia Maria Barros de.
Avaliação da resposta celular de pacientes chagásicos
após estímulo in vitro com antígenos recombinantes
CRA e FRA de Trypanosoma cruzi / Virginia Maria
Barros de Lorena. — Recife: V. M. B. de Lorena, 2006.
109 p. : il., tabs.
Dissertação (mestrado em saúde pública) — Centro
de Pesquisas Aggeu, Magalhães, Fundação Oswaldo
Cruz, 16 fev. 2006.
Orientadora: Yara de Miranda Gomes
Co-orientadora: Valéria Rêgo Alves Pereira.
1. Doença de Chagas - imunologia. 2. Citocinas -
secreção. 3. Marcadores biológicos. 4. Proteínas
recombinantes. I. Gomes, Yara de Miranda. II. Pereira,
Valéria Rêgo Alves. III. Título.
CDU 616.937
Esta dissertação intitulada:
Avaliação da resposta celular de pacientes chagásicos após estímulo
in
vitro
com antígenos recombinantes CRA e FRA de
Trypanosoma cruzi
Apresentada por Virginia Maria Barros de Lorena
Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Revisor/ 1°
°°
° Titular:
___________________________________
Dra. Sílvia Lucena Montenegro
Pesquisadora titular do Departamento de Imunologia do CPqAM/ Fiocruz
2°
°°
° Titular:
___________________________________
Dra. Valdênia Maria Oliveira de Souza
Professora adjunta do Departamento de Patologia da UPE
Suplentes:
___________________________________
Dr. Frederico Guilherme Abath
Pesquisador titular do Departamento de Imunologia do CPqAM/ Fiocruz
___________________________________
Dra. Silvana de Fátima Ferreira da Silva
Professora titular do Departamento de Patologia da UPE
Recife, 16 de fevereiro de 2006.
Aos portadores da doença de Chagas que com toda boa vontade permitiram a
coleta de seu sangue contribuindo com este estudo. Sem os quais essa dissertação
não seria possível.
AGRADECIMENTOS
Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães;
à coordenação do curso de Mestrado em Saúde Pública;
ao Ambulatório de Doença de Chagas do Hospital Universitário Oswaldo Cruz;
ao Ambulatório de Doença de Chagas do Hospital das Clínicas;
à Bio-Manguinhos;
à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradeço de coração àquelas que contribuíram com meu crescimento profissional
ensinando e repassando seus sábios conhecimentos. Agradeço àquelas pessoas
que contribuíram com este trabalho de alguma forma. E agradeço àquelas que,
mais que tudo, torceram por mim e pelos experimentos, sofreram com os
problemas enfrentados, ajudaram com pequenos e grandes gestos, riram nos
momentos de descontração e amizade.
Obrigada a todos vocês!!!!!
RESUMO
Diversos estudos têm demonstrado que as diferentes manifestações clínicas da
doença de Chagas humana estão associadas com as distintas e complexas relações
parasito-hospedeiro que envolvem diretamente o sistema imune. Nesse contexto,
nos propomos analisar a relação entre a resposta imune celular de pacientes
chagásicos, após estímulo
in vitro
de células mononucleares de sangue periférico
(PBMC)
com os antígenos recombinantes CRA (
Cytoplasmatic Repetitive Antigen)
ou FRA (
Flagellar Repetitive Antigen
) de
Trypanosoma cruzi,
e as formas clínicas
crônicas da doença de Chagas. O grupo de pacientes chagásicos consistiu de 36
indivíduos que foram selecionados no Ambulatório de Doença de Chagas do
Hospital Universitário Oswaldo Cruz da Universidade de Pernambuco e submetidos
a uma triagem padronizada que incluiu, exame físico, sorologia para a infecção
pelo
T. cruzi
, eletrocardiograma, raios-X de tórax e de esôfago. Dezessete
portadores da forma cardíaca (FC) e 19 da forma indeterminada (FI) participaram
deste estudo. Um grupo de 19 indivíduos não chagásicos (NC) foi incluído como
um grupo controle. PBMC foram isoladas por centrifugação através de um
gradiente de densidade de Ficoll-Paque. As células foram estimuladas com
Fitohemaglutinina, Concanavalina, CRA, FRA ou com antígeno solúvel de
Epimastigota (Ag-Epi) por 24h, 72h ou 6 dias. Culturas sem estímulo foram
utilizadas como controles negativos. A proliferação celular foi avaliada após
estímulo por 6 dias de cultivo através da quantificação de
3
H-timidina incorporada.
As citocinas foram detectadas em sobrenandantes de cultura obtidos após 24h
(TNF-α e IL-4), 72h (IL-10) e 6 dias (IFN-γ) através de ELISA de captura. Os
resultados mostraram que apesar de apresentarem índices de estimulação baixos,
as células dos pacientes chagásicos estimuladas com os antígenos recombinantes
apresentaram maiores respostas proliferativas quando comparados com as dos
indivíduos NC. Porém, não foi possível estabelecer um padrão de resposta
linfoproliferativa entre os pacientes portadores das formas clínicas FC e FI da
doença. Com relação às citocinas secretadas no sobrenadante de cultura após
estímulo com antígenos de
T. cruzi
, os resultados mostraram que CRA, bem como
Ag-Epi, foram capazes de estimular a produção de TNF-α e IFN-γ em pacientes
chagásicos quando comparado aos indivíduos NC. Porém, os níveis dessas
citocinas mostraram-se similares entre os pacientes chagásicos portadores das
formas clínicas FC e FI. Apesar de não apresentarem a capacidade de diferenciar
as formas clínicas da doença de Chagas através do ensaio de linfoproliferação e da
detecção de citocinas de sobrenadante de cultura por ELISA, os antígenos
poderiam ser utilizados em estudos sobre a imunopatogênese da doença,
investigando papéis imunorregulatórios antígeno-específicos. Além disso, esses
antígenos poderiam dar continuidade ao desenvolvimento de marcadores de
evolução de prognóstico das formas clínicas severas da doença de Chagas através
da avaliação de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo.
Palavras-chave: Doença de Chagas, Citocinas, Antígenos recombinantes
ABSTRACT
Several studies have demonstrated that different clinical manifestations of human
Chagas' disease are associated with distinct and complex host-parasite
relationships directly involving the immune system. Given this, we propose to
analyze the relation between the cellular immune response of Chagas patients,
after stimulaton
in vitro
of PBMC (peripheral blood mononuclear cells) with the
recombinant antigens CRA (Cytoplasmatic Repetitive Antigen) or FRA (Flagellar
Repetitive Antigen) of Trypanosoma
cruzi,
and the chronic clinical forms of Chagas’
disease. The group of patients with Chagas’ disease, 36 individuals in total, were
selected at the Chagas’ disease clinic at the University of Pernambuco’s Oswaldo
Cruz Hospital and submitted to a standard screening protocol that included
physical examination, serological test for
T. cruzi
infection, eletrocardiogram, chest
and esophagus X-ray. Seventeen patients with the cardiac form (CF) and 19 with
the indeterminate form (IF) participated in this study. One group of 19 healthy
individuals was included as a control group. The PBMC were isolated by
centrifugation using the Ficoll-Paque density gradient. The cells were stimulated
using Phytohemaglutinin, Concanavalin, CRA, FRA or a soluble antigen of
Epimastigota (Ag-Epi) for 24h, 72h or 6 days. Cultures not submitted to stimulation
were used as negative controls. The proliferation of cells was evaluated after 6
days of culture by quantification of incorporated
3
H-timidine. Cytokines were
measured in the supernatants obtained after 24h (TNF-α e IL-4), 72h (IL-10) and
6 days (IFN-γ) using ELISA. The results showed that, although the index of
stimulation was small, the cells of the Chagas patients stimulated with the
recombinant
antigens exhibited higher proliferation responses compared with that
of NC individuals. However, when proliferation was compared between patients
with the CF or IF of the disease, it was not possible to establish a difference in the
response. So far as the cytokines secreted in the culture supernatants after
stimulation in vitro with
T. cruzi
antigens were concerned, the results showed that
CRA, as well as Ag-Epi, were able to stimulate the production of TNF-α and IFN-γ
in Chagas patients as compared with NI individuals. However, the cytokine levels
after stimulation with the
T. cruzi
antigens were not different between the patients
with CF and IF. Although they do not show the ability to differentiate the clinical
forms of Chagas’ disease using cellular proliferation and detection of cytokines in
culture supernatants by ELISA, the recombinant antigens could be used in studies
of the pathology of the Chagas’ disease, investigating possible mechanisms that
regulate parasite-specific lymphocyte responses. Moreover, these antigens could
be used in further studies that aim to discover prognostic markers of the evolution
of severe clinical forms of Chagas’ disease by evaluating intracytoplasmic cytokines
using flow cytometry.
Keywords: Chagas’ disease, Cytokines, Recombinant antigens
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 Resposta proliferativa de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com
mitógenos............................................................................ 45
Figura 2 Resposta proliferativa de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com antígenos de
T.
cruzi
.................................................................................... 46
Figura 3 Detecção de TNF-α em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após
estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo................ 48
Figura 4 Detecção de TNF-α em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após
estímulo com antígenos de
T. cruzi
........................................ 49
Figura 5 Detecção de IL-4 em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após
estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo................ 51
Figura 6 Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após
estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo................ 53
Figura 7 Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após
estímulo com antígenos de
T. cruzi
........................................ 54
Figura 8 Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após
estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo................ 56
Figura 9 Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após
estímulo com antígenos de
T. cruzi
........................................ 57
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1 Características dos pacientes chagásicos estudados................ 35
Tabela 2 Estatísticas descritivas da produção de TNF-α em
sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após comparação das culturas
estimuladas com a cultura sem estímulo................................ 47
Tabela 3 Estatísticas descritivas da produção de IL-4 em sobrenadante
de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e indivíduos não
chagásicos após comparação das culturas estimuladas com a
cultura sem estímulo............................................................ 50
Tabela 4 Estatísticas descritivas da produção de IL-10 em
sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após comparação das culturas
estimuladas com a cultura sem estímulo................................ 52
Tabela 5 Estatísticas descritivas da produção de IFN-γ em
sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após comparação das culturas
estimuladas com a cultura sem estímulo................................
55
Tabela 6 Perfil de citocinas produzidas e detectadas em sobrenadantes
de cultura após estímulo
in vitro
com os antígenos de
T. cruzi.
58
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
x g Aceleração da gravidade
ABTS 2,2’-azino-di[sulfato (6) de 3-etil benzitiazolina]
Ag-Epi Antígeno solúvel de formas epimastigotas da cepa Y de
T. cruzi
Ags-Recs Antígenos recombinantes
BSA Albumina sérica bovina
CD28
Cluster of differentiation
28
CD4
Cluster of differentiation
4
CD8
Cluster of differentiation
8
CO
2
Dióxido de Carbono
ConA Concanavalina
CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
CPM Contagem por minuto
CRA
Cytoplasmic Repetitive Antigen
EIE Ensaio Imunoenzimático
EIE-Rec Ensaio Imunoenzimático-Recombinante-Chagas-Bio-Manguinhos
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FC Forma cardíaca
FD Forma digestiva
FI Forma indeterminada
FRA
Flagellar Repetitive Antigen
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
°C
Graus Celsius
h hora
HC Hospital das Clínicas
HLA-DR
Human Leukocyte Antigens-D-related
HUOC Hospital Universitário Oswaldo Cruz
H
2
O
2
Peróxido de Hidrogênio
3
H-Timidina Timidina triciada
IE Índice de estimulação
IFN-γ
Interferon gama
IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G
IgG1 Imunoglobulina G 1
IgG3 Imunoglobulina G 3
INSS Instituto Nacional do Seguro Social
IL-4 Interleucina 4
IL-10 Interleucina 10
Marca registrada
µCi
Micro Curie
µg
Micrograma
µL
Microlitro
M Molar
min. Minutos
mL Mililitro
n Número de amostra
NC Não chagásico
ng Nanograma
nm Nanômetro
NaCl Cloreto de sódio
OMS Organização Mundial de Saúde
PBMC Células mononucleares de sangue periférico
PBS Salina tamponada com fosfato
PFR
Paraflagellar Rod Proteins
pg Picograma
pH Potencial hidrogeniônico
PHA Fitohemaglutinina
RPMI Meio
Roswell Park Memorial Institute
SBF Soro bovino fetal
TGF-β
Fator de crescimento beta e transformação
TA Temperatura ambiente
Th1 Linfócitos T auxiliar do tipo 1
Th2 Linfócitos T auxiliar do tipo 2
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UPE Universidade de Pernambuco
WHO
World Health Organization
SUMÁRIO
Pág.
Folha de rosto
Folha de avaliação
Dedicatória
Agradecimentos
Lista de tabelas
Lista de figuras
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
Resumo
Abstract
1 Introdução...........................................................................................
17
1.1. Aspectos gerais sobre a doença de Chagas......................................
17
1.2. Indicadores preditivos de progressão para as formas clínicas
crônicas da doença de Chagas.............................................................. 21
1.3. Os antígenos recombinantes CRA e FRA de
T. cruzi
..........................
25
2 Justificativa..........................................................................................
28
3 Pergunta condutora..............................................................................
29
4 Objetivos..............................................................................................
29
4.1. Objetivo geral................................................................................
29
4.2. Objetivos específicos......................................................................
29
5 Materiais e Métodos..............................................................................
30
5.1. Materiais.......................................................................................
30
5.1.1. Equipamentos......................................................................
30
5.1.2. Reagentes e produtos...........................................................
31
5.2. Métodos........................................................................................
32
5.2.1. Antígenos de
T. cruzi
............................................................
32
5.2.2. População do estudo............................................................
33
5.2.2.1. Aspectos éticos........................................................
36
5.2.3. Coleta de sangue.................................................................
36
5.2.4. Sorologia para infecção pelo
T. cruzi
......................................
37
5.2.5. Obtenção das células mononucleares do sangue periférico......
37
5.2.6. Ensaio de proliferação celular................................................
38
5.2.6.1. Padronização do ensaio............................................
38
5.2.6.2. Avaliação da proliferação celular................................
39
5.2.7. Citocinas de sobrenadante de cultura....................................
40
5.2.7.1. Padronização da cultura celular ................................
40
5.2.7.2. Obtenção do sobrenadante de cultura........................
41
5.2.7.3. Detecção das citocinas .............................................
41
5.2.8. Análise estatística.................................................................
43
6 Resultados...........................................................................................
44
6.1. Proliferação celular........................................................................
44
6.1.1. Resposta induzida por mitógenos..........................................
44
6.1.2. Resposta induzida por antígenos de
T. cruzi
...........................
45
6.2. Detecção de citocinas de sobrenandante de cultura.........................
46
6.2.1. Produção de TNF-α..............................................................
46
6.2.2. Produção de IL-4..................................................................
49
6.2.3. Produção de IL-10................................................................
51
6.2.4. Produção de IFN-γ................................................................
54
6.3. Resumo do perfil de citocinas identificado em pacientes chagásicos
portadores das formas clínicas crônicas da doença de Chagas................. 57
7 Discussão.............................................................................................
59
7.1. Resposta proliferativa dos pacientes chagásicos...............................
61
7.2. Produção das citocinas por PBMC de pacientes chagásicos................
63
7.3. Considerações finais......................................................................
67
8 Conclusões...........................................................................................
70
9 Perspectivas.........................................................................................
70
Referências.............................................................................................
71
Anexo A - Aprovação pelo Comitê de Ética do CPqAM/ Fiocruz....................
80
Apêndice A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Paciente.....
81
Apêndice B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Voluntário..
82
Apêndice C - Formulário de Pesquisa.........................................................
83
Apêndice D - Artigo em preparação...........................................................
84
Lorena V. M. B.
17
1 Introdução
1. 1. Aspectos gerais sobre a doença de Chagas
A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado
Trypanosoma
cruzi,
é um sério problema endêmico que afeta milhões de pessoas na América
Central e na América do Sul. A forma clássica de transmissão é a vetorial, através
de insetos hematófagos, conhecidos como barbeiros. Porém, várias são as formas
de transmissão da doença. Dentre elas, a mais importante é a transmissão
transfusional (WENDEL, 1998), além da congênita, via oral, transplante de órgãos
contaminados, aleitamento e acidentes de laboratório.
Nas últimas décadas, a doença expandiu-se por vários países em
virtude dos movimentos migratórios. O crescente número de indivíduos infectados
e o risco real de contaminação por transfusões sanguíneas (DIAS et al., 2002)
foram determinantes para a criação da Comissão Intergovernamental de Doença
de Chagas, em 1991. Formada por países do Cone Sul, a comissão tinha o
propósito de elaborar um plano de ação para a eliminação do vetor e para a
interrupção da transmissão por via transfusional (SILVEIRA, 2002). Desde então,
métodos para eliminar o barbeiro, como o uso de inseticidas, e práticas para
melhorar a qualidade da triagem de sangue vêm sendo utilizados.
No entanto, apesar dos avanços alcançados no controle da transmissão
natural da doença, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que a
prevalência da infecção humana em 15 países endêmicos é de 17 milhões de
Lorena V. M. B.
18
casos (MONCAYO, 2003) e que cerca de 120 milhões de pessoas estão sob o risco
de contrair a doença (WHO, 2002a).
Ainda não existe uma quimioterapia segura para o tratamento da
doença. Os tradicionais antiparasitários, nifurtimox e benzonidazol, são
parcialmente eficazes apenas na fase aguda da infecção (CANÇADO, 1985), e o
potencial de cura parasitológica é dependente do tipo de cepa albergada pelo
hospedeiro (ANDRADE et al., 1985). Além disso, podem provocar diversos efeitos
colaterais.
A doença é dividida em duas fases: aguda e crônica. A fase aguda, que
pode durar de um a três meses após a infecção, é caracterizada por uma intensa
parasitemia. Esta fase pode ser sintomática ou assintomática e inicia-se após o
período de incubação que varia de quatro a dez dias quando a transmissão é
vetorial (CHAGAS, 1916). Geralmente, quando sintomática, o indivíduo pode
apresentar febre, mal-estar, anorexia e cefaléia. Os sinais de porta de entrada do
parasito (sinal de Romaña e chagoma de inoculação) e manifestações sistêmicas
(hepatomegalia, esplenomegalia, edema, alterações nervosas, comprometimento
cardíaco) também podem estar presentes (HUGGINS, 1996). Porém, na maioria
dos indivíduos, a fase aguda é imperceptível devido à escassez ou ausência de
manifestações clínicas.
A fase crônica da doença inicia-se cerca de dois a quatro meses após o
final da fase aguda. Este período é marcado pela escassez de parasitos no sangue
e pelos elevados níveis de anticorpos. Geralmente, o indivíduo chagásico
permanece por um longo período de latência clínica chamada de forma
indeterminada (FI), que pode durar de dez a trinta anos ou por toda a vida do
Lorena V. M. B.
19
doente. Ao final destes anos, os indivíduos infectados podem ou não apresentar
manifestações relacionadas ao envolvimento de órgãos como o coração, esôfago,
cólon e/ou sistema nervoso, caracterizando as formas clínicas sintomáticas da
doença de Chagas (PRATA, 2001).
No entanto, a evolução clínica dos indivíduos chagásicos não é
previsível. A maioria dos pacientes (cerca de 50-60%) permanece com a forma
indeterminada (FI), e não apresentam sintomatologia relacionada com o coração e
o sistema digestivo. Cerca de 20-30% dos indivíduos infectados desenvolvem a
forma cardíaca (FC), caracterizada pela cardiomiopatia chagásica, e 8-10%
apresentam a forma digestiva (FD), caracterizada por vários graus de alterações
anatômicas e funcionais do esôfago e/ ou do cólon (DIAS, 1989). Menos
freqüentemente, há alterações no sistema nervoso, caracterizando a forma clínica
nervosa da doença.
Em virtude da ausência de sintomas entre os pacientes chagásicos
portadores da FI, a descoberta da doença ocorre geralmente através da realização
de provas sorológicas por ocasião de inquéritos epidemiológicos em áreas
endêmicas, triagem para doações de sangue ou órgãos e ainda na avaliação para
admissão em empresas. Neste caso, a identificação de infecção pelo
T. cruzi
poderia prejudicar ou até mesmo provocar a recusa desses indivíduos durante o
processo de admissão ao emprego.
A FI desperta grande interesse entre médicos e pesquisadores, pois é
nesta fase que parece se determinar a evolução do paciente chagásico. Este
aspecto da evolução da FI para as formas clínicas sintomáticas ainda é muito
Lorena V. M. B.
20
obscuro. Em razão dos questionamentos sobre a evolução do doente portador da
FI, a comunidade médica ainda não possui uma conduta terapêutica universal.
O diagnóstico clínico nos pacientes chagásicos é bastante limitado. De
acordo com os critérios estabelecidos pela OMS, os pacientes portadores da FI
possuem eletrocardiograma e exames radiológicos do tórax, esôfago e cólon
normais (WHO, 2002b). Embora, essas técnicas convencionais sejam
rotineiramente utilizadas para caracterizar as formas clínicas da doença de
Chagas, elas possuem limitações na detecção de alterações precoces da função
cardíaca e digestiva. Assim, quando se quer avaliar mais profundamente o estado
clínico do indivíduo, outras técnicas mais sensíveis podem ser utilizadas.
Métodos propedêuticos não-invasivos e invasivos têm detectado
alterações no coração e/ou no tubo digestivo de alguns dos pacientes chagásicos
portadores da FI (OLIVEIRA JR., 1996). Porém ainda é questionável a avaliação da
evolução para as fases severas da doença, pois essas técnicas apenas mostram o
estado de saúde atual do paciente, não tendo o poder de prever quando e para
qual forma clínica crônica o indivíduo evoluirá.
Nesse sentido, investigações que elucidem o potencial evolutivo da
doença de Chagas através de estudos longitudinais em pacientes chagásicos, por
meio do desenvolvimento de marcadores de formas clínicas devem ser assumidos
por grupos de pesquisas, a fim de progredir nas condutas terapêuticas,
melhorando a qualidade de vida dos doentes, e contribuir para a garantia dos
direitos trabalhistas dos pacientes frente às empresas e ao INSS.
Lorena V. M. B.
21
1. 2. Indicadores preditivos de progressão para as formas
clínicas crônicas da doença de Chagas
Um estudo clínico realizado no Seviço de Cardiologia do Hospital Eva
Peron em Buenos Aires, na Argentina, acompanhou, por 8 anos, 856 chagásicos
distribuídos em portadores das formas clínicas indeterminada, e cardíaca com
graus variados de acometimento cardíaco. O acompanhamento foi feito através de
eletrocardiograma, ecocardiograma e avaliação clínica. Desta análise, a equipe
médica construiu um
score
de risco clínico que poderia ser utilizado para predizer
a progressão da miocardite chagásica crônica (VIOTTI et al., 2005). Um estudo
tão grandioso como este poderia estar aliado a outros tipos de avaliações que
pudessem auxiliar no prognóstico dos indivíduos chagásicos.
Nesse sentido, diversos trabalhos têm demonstrado o envolvimento da
imunidade celular em todas as formas clínicas da doença de Chagas. No entanto,
a patogenia das lesões que levam às formas severas da doença ainda é
desconhecida. Estudos sugerem que a resposta imune do indivíduo contra o
parasito contribui para a evolução da doença (DUTRA et al, 1994; GOMES et al,
2003; BARROS-MAZON et al., 2004). Neste contexto, o possível papel dos
mecanismos imunes para o desenvolvimento das formas clínicas severas da
doença de Chagas tem sido avaliado. Assim, vários grupos de pesquisa têm
buscado um padrão de resposta imune entre os pacientes chagásicos portadores
das diferentes formas clínicas.
Trabalhos têm estudado a resposta imune humoral nos pacientes
chagásicos utilizando antígenos do parasito para identificar um padrão de
Lorena V. M. B.
22
anticorpos nas diferentes formas clínicas da doença. Estudos realizados por
Primavera et al. (1988, 1990) identificaram uma estreita correlação entre IgA anti-
amastigota e a FD da doença. Zauza e Borges-Pereira (2001) monitoraram os
títulos de IgG contra antígenos complexos do parasito de pacientes portadores da
FC durante 10 anos. O estudo concluiu que a progressão da cardiopatia chagásica
possui correlação positiva com o aumento dos níveis de IgG. As subclasses IgG1 e
IgG3, têm sido identificadas como predominantes na doença de Chagas (GUSMÃO
et al., 1982; MICHAILOWSKY et al., 2003), porém, nenhuma correlação com as
formas clínicas crônicas tem sido observada (VAN VOORHIS et al., 1991; CETRON
et al, 1993).
Ensaios de proliferação celular, utilizando células mononucleares de
sangue periférico (PBMC), foram realizados entre os pacientes chagásicos após
estímulos com antígenos complexos de formas epimastigotas e tripomastigotas ou
frações celulares do
T. cruzi.
Diferenças na intensidade da resposta proliferativa
entre a FI e as formas sintomáticas foram reportadas, sugerindo que este padrão
de reatividade imune poderia estar envolvido na patogenia das lesões tissulares na
doença de Chagas (DE TITTO et al. 1985; CETRON et al. 1993; BARROS-MAZON
et al. 2004). Porém, outros estudos não encontraram diferenças nas respostas
proliferativas entre os pacientes chagásicos portadores da FI e aqueles portadores
das formas sintomáticas (MORATO et al., 1986; GAZZINELLI et al., 1990;
MICHAILOWSKY et al., 2003).
As dificuldades de estabelecer um perfil distinto de linfoproliferação
entre os pacientes chagásicos, através apenas do ensaio de proliferação celular,
Lorena V. M. B.
23
têm levado os estudos para a detecção das citocinas secretadas por PBMC após
estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Abordagens para a investigação de padrões de secreção de citocinas
em PBMC de pacientes chagásicos têm sido realizadas utilizando antígenos
complexos das formas epimastigotas e tripomastigotas de
T. cruzi
. Esses trabalhos
demonstraram que a IL-10 é a citocina secretada por pacientes portadores da FI.
Já os pacientes chagásicos com doença cardíaca têm maiores níveis de IFN-γ
(BAHIA-OLIVEIRA et al, 1998; CORREA-OLIVEIRA et al., 1999; GOMES et al.,
2003). Além disso, os elevados níveis de IFN-γ estão correlacionados com o nível
de severidade do envolvimento cardíaco, sugerindo que esta citocina poderia estar
envolvida com a evolução da FC. Por outro lado, a IL-10 poderia estar associada
com a proteção do hospedeiro portador da FI contra o desenvolvimento das
formas crônicas sintomáticas (GOMES et al., 2003). Diante desses achados, os
autores sugerem que pacientes portadores da FI, que são capazes de manter
baixos níveis de IFN-γ e altos níveis de IL-10, poderiam não desenvolver a doença
cardíaca.
Essa proposta de que o dano tissular poderia ser mais severo na
ausência de mecanismos regulatórios que envolvessem as respostas imunológicas
entusiasmou as pesquisas na área da imunologia básica. A ausência da molécula
co-estimulatória CD28 em linfócitos T foi estudada por Menezes et al. (2004),
mostrando que essas células, em indivíduos com a FI, têm papel de controlar a
resposta inflamatória através da secreção de IL-10. Já em pacientes chagásicos
portadores da FC a presença de linfócitos T CD28- pode estar relacionada com o
dano cardíaco por secretarem altos níveis de TNF-α.
Nessa mesma linha de
Lorena V. M. B.
24
investigação, foi demonstrado que pacientes chagásicos portadores da FI possuem
células T regulatórias, que poderiam ser capazes de controlar a atividade
citotóxica deletéria por inibir a ativação de células T CD8+ HLA-DR+ (VITELLI-
AVELAR et al., 2005).
Em contraposição a esses estudos, Laucella et al. (2004) ao analisarem
as respostas de células T CD8+ específicas a peptídeos (derivados de amastigotas
e tripomastigotas) e lisado (de formas amastigotas) de
T. cruzi
em PBMC de
pacientes chagásicos portadores da FI e em indivíduos com diferentes níveis de
acometimento cardíaco, mostraram que pacientes com a forma mais severa da
doença cardíaca apresentaram baixos níveis de IFN-γ quando comparados aos
pacientes portadores da FI.
Assim, apesar de pouco entendimento sobre os mecanismos
imunopatológicos da doença de Chagas e, consequentemente, poucos
conhecimentos para predizer a evolução para as formas clínicas severas da
doença, as citocinas secretadas pelas células dos pacientes poderiam ser a chave
para o estabelecimento de marcadores biológicos que auxiliassem no prognóstico
das formas graves da doença.
Porém, a maioria dos estudos para investigação da resposta
imunológica de pacientes chagásicos é realizada utilizando preparações
antigênicas solúveis do parasito. Essas preparações, por apresentarem uma
mistura complexa de antígenos, não permitem a detecção de uma resposta imune
específica.
O uso de materiais definidos do parasito é claramente um requisito não
apenas para o desenvolvimento de testes sorológicos e
screening
em bancos de
Lorena V. M. B.
25
sangue, mas também para a identificação de moléculas importantes na interação
parasito-hospedeiro e nos estudos para o entendimento da imunopatologia da
doença de Chagas (LORCA et al., 1992). Assim, antígenos específicos do
T. cruzi
poderiam ter bom desempenho na discriminação das formas clínicas crônicas da
doença de Chagas.
Poucos estudos foram realizados com antígenos purificados do parasito.
Estudo recente mostrou que PBMC de pacientes chagásicos após estímulo
in vitro
com PFR (
Paraflagellar Rod Proteins
), antígenos derivado da porção flagelar do
parasito, secretavam altos níveis de IFN-γ e TNF-α, porém, nenhuma diferença foi
encontrada entre os pacientes portadores das formas clínicas cardíaca e
indeterminada (MICHAILOWSKY et al., 2003). Uma resposta predominante de
IFN-γ foi relatada em pacientes portadores de cardiomiopatia quando PBMC foram
estimuladas com trans-sialidase (RIBEIRÃO et al., 2000), com a proteína
recombinante B13 de
T. cruzi
(ABEL et al., 2001) e com subfrações purificadas de
antígeno de tripomastigotas (CUNA et al., 2000). Um outro trabalho, realizado por
Arnholdt et al. (1993), também evidenciou a produção de IFN-γ por linhagens de
células T após estímulo com cruzipaína.
1. 3. Os antígenos recombinantes CRA e FRA de
T. cruzi
Em 1989, Lafaille et al. realizaram a clonagem e a caracterização de
dois genes de
T. cruzi
. Estes genes codificam proteínas com estruturas onde há a
repetição de um mesmo epítopo. Em função de suas estruturas e localização,
Lorena V. M. B.
26
esses antígenos foram denominados de CRA (
Cytoplasmic Repetitive Antigen
ou
antígeno citoplasmático repetitivo), presente nas formas epimastigotas e
amastigotas, e FRA (
Flagellar Repetitive Antigen
ou antígeno flagelar repetitivo),
presente nas formas epimastigotas e tripomastigotas do
T. cruzi
(LAFAILLE et al.
1989; KRIEGER et al., 1992).
Esses dois antígenos recombinantes (Ags-Recs) foram desenvolvidos
pelo grupo do Dr. Samuel Goldenberg do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular do Instituto Oswaldo Cruz/ Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) e,
atualmente, são produzidos na forma de
kit
para diagnóstico da infecção
chagásica por Bio-Manguinhos/ Fiocruz. O referido
kit
(Ensaio-Imunoenzimático-
Recombinante-Chagas-Bio-Manguinhos, EIE-Rec) foi utilizado com sucesso no
imunodiagnóstico da doença de Chagas (GOLDENBERG, 1991; KRIEGER et al.,
1992; GOMES et al, 2001). O EIE-Rec também foi utilizado para avaliar a cura da
doença de Chagas em pacientes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal
de Minas Gerais em Belo Horizonte, que foram tratados na fase aguda da infecção
(SILVA et al., 2002), podendo ser utilizado para monitoramento do tratamento
etiológico.
Além disso, um estudo comparativo do EIE-Rec e de um ELISA (
Enzyme
Linked Immunosorbent Assay
) convencional frente ao teste de hemaglutinação
indireta, utilizado na ocasião em bancos de sangue, mostrou que o uso de dois
ELISAs com preparações antigênicas diferentes é mais eficaz e poderia ser
adotado para o
screening
de doadores de sangue (GADELHA et al., 2003). Esse
trabalho foi reconhecido através de dois prêmios: 1) Prêmio Edmundo Chapadeiro
durante a XVII Reunião Anual de Pesquisa Aplicada em Doença de Chagas
Lorena V. M. B.
27
realizada em Uberaba-MG, em 2001; 2) Prêmio de Incentivo em Ciências e
Tecnologias para o SUS, em 2003. Ainda na área de diagnóstico, os Ags-Recs CRA
e FRA foram avaliados para o desenvolvimento de um biosensor no departamento
de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) em
Recife (DINIZ et al., 2003).
As características moleculares dessas proteínas, associadas à resposta
anticórpica dos pacientes portadores da doença de Chagas, incentivaram as
investigações sobre as propriedades imunogênicas do CRA e do FRA dissociados,
pelo grupo de Dra. Yara Gomes do Departamento de Imunologia do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM)/ Fiocruz. Assim, os Ags-Recs foram
avaliados em protocolos de imunizações em camundongos isogênicos mostrando
serem capazes de induzir respostas imune humoral e celular (PEREIRA et al.,
2003a; 2003b; 2004; 2005).
Além disso, em um estudo piloto realizado por Pereira et al. (2002) CRA
e FRA foram capazes de estimular PBMC de pacientes chagásicos (n=6)
a produzir
determinado padrão de citocinas intracitoplasmáticas avaliadas através de
citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostraram que FRA estimulou PBMC de
pacientes portadores da FC a produzirem IFN-γ e TNF-α e, CRA estimulou a
produção de IL-10 por indivíduos portadores da FI, sugerindo que os Ags-Recs,
juntos, poderiam identificar distintos perfis de citocinas entre os indivíduos
chagásicos portadores das diferentes formas clínicas crônicas da doença. Sendo
assim, a continuação do estudo de Pereira et al. (2002), aumentando o número da
amostra, assim como a detecção de citocinas no sobrenadante de PBMC, desses
Lorena V. M. B.
28
pacientes, estimuladas com CRA ou FRA também seria uma abordagem
interessante.
2 Justificativa
Considerando a importância da resposta imune contra os antígenos do
parasito evidenciada pela produção de anticorpos específicos contra CRA ou FRA
por pacientes chagásicos, e o potencial valor prognóstico dos Ags-Recs mostrado
por Pereira et al (2002), nos propomos a avaliar a resposta imune celular
específica de pacientes chagásicos a esses antígenos e correlacioná-la com a
presença das formas clínicas da doença.
Um estudo longitudinal com seguimento do grupo de pacientes
portadores da FI se faria necessário se este perfil diferenciado fosse devidamente
confirmado. Desta forma, mecanismos capazes de bloquear ou amenizar o
desenvolvimento das formas severas da doença, como por exemplo, estratégias
de tratamento durante a fase crônica da doença, poderiam melhorar a qualidade
vida dos indivíduos.
Lorena V. M. B.
29
3 Pergunta condutora
Qual a relação da resposta imune celular de pacientes chagásicos após
estímulo
in vitro
com os antígenos recombinantes CRA ou FRA de
T. cruzi
e as
formas clínicas crônicas da doença Chagas?
4 Objetivos
4.1. Objetivo geral
Analisar a relação entre a resposta imune celular de pacientes
chagásicos após estímulo
in vitro
de PBMC
com os Ags-Recs CRA ou FRA de
T.
cruzi
e as formas clínicas crônicas da doença de Chagas.
4. 2. Objetivos específicos
• Relacionar a resposta de proliferação de PBMC com as formas
clínicas crônicas da doença de Chagas;
• Relacionar o perfil das citocinas TNF-α, IL-4, IL-10 e IFN-γ com as
formas clínicas crônicas da doença de Chagas.
Lorena V. M. B.
30
5 Materiais e Métodos
5. 1. Materiais
5. 1. 1. Equipamentos
• Balanças analíticas: Hangping FA 1604; Ohaus Corporation modelo
TS 400 D.
• Câmara de Neubauer: Loptik Labor
• Capela de fluxo laminar vertical: modelo MR 115, Núcleo
equipamentos.
• Centrífuga refrigerada: modelo TJ-6R, Beckman Instruments, Inc.
• Centrífuga para placas: modelo Z 320, BHG HERMLE
• Coletor semi-automático de células: Skatron Instruments AS.
• Cintilador: LKB-Wallac Rack Beta, modelo 1209, Pharmacia.
• Deep-freezer (-70°C): Revco INC
• Espectrofotômetro: modelo Ultrospec 3000, Pharmacia.
• Estufa de CO
2
: Forma Scientific Inc.
• Leitor de ELISA: modelo 3550, Biorad Laboratories.
• Microscópio invertido: Leitz Labovert FS.
• PHmetro: modelo Chemcadet pHmeter 5984-50, Cole Parmer
Instruments.
Lorena V. M. B.
31
5. 1. 2. Reagentes e produtos
• Ácido cítrico – VETEC Química fina
• Albumina Sérica Bovina - SIGMA
• Anticorpos anti-citocinas e padrões - RD Systems
• Azul de Trypan - SIGMA
• Concanavalina - SIGMA
• Ficoll-Paque - Ficoll-Paque
TM
Plus, Amersham Biosciences
• Fitohemaglutinina - Cultilab
• Fosfato de sódio bibásico P.A. - Nuclear
• Fosfato de sódio monobásico P.A. - Reagentes analíticos Dinâmica
• Líquido de cintilação Scintisafe Plus
TM
50% - Fisher Scientific
• Meio RPMI 1640 - SIGMA ou Cultilab
• Membrana filtrante - Millipore Corporation
• Cloreto de Sódio P.A. - ISOFAR
• Papel de filtro (102 x 256 mm) para 12 poços - Skatron Instruments
• Placas de cultura - Corning Incorporated Costar, 3548 (placas de 48
poços), 3595 (placas de 96 poços).
• Placas para ELISA (96 poços) Maxisorp - Nalge Nunc International
Corporation
• Solução reveladora para ELISA - KPL
• Solução de Penicilina/ Estreptomicina - SIGMA
• Soro bovino fetal - SIGMA
Lorena V. M. B.
32
• Streptavidina-peroxidase - Pharmingen
•
3
H-timidina - Amersham Biosciences
• Tris - VETEC
• Tubos de coleta à vácuo com heparina - BD Systems ou VACUETTE
• Tween 20 - SIGMA
5. 2. Métodos
5. 2. 1. Antígenos de
T. cruzi
Os Ags-Recs CRA e FRA, obtidos como descrito por Krieger et al.
(1992), foram preparados no Departamento de Reativos para Diagnóstico de Bio-
Manguinhos e enviados para o Laboratório de Imunoparasitologia do
CPqAM/Fiocruz. Todos os lotes de antígenos tiveram seus perfis protéicos
analisados através de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil
sulfato de sódio (LAEMLI, 1970) e coloração para proteínas
Comassie Blue
. Além
disso, contaminação por proteínas e carboidratos bacterianos também foi
analisada através da coloração pela prata (MORRISSEY, 1981) e pelo ácido
periódico de Schiff (JANN et al., 1975) respectivamente. O antígeno solúvel de
epimastigota (Ag-Epi) da cepa Y de
T. cruzi
, obtido segundo Pereira et al. (1997),
foi utilizado a partir do descongelamento de alíquotas armazenadas no Laboratório
de Imunoparasitologia do CPqAM/ Fiocruz.
Lorena V. M. B.
33
5. 2. 2. População do estudo
Trinta e seis pacientes chagásicos portadores das formas crônicas
chagásicas foram selecionados no Ambulatório de Doença de Chagas do Hospital
Universitário Osvaldo Cruz – HUOC, na Universidade de Pernambuco – UPE. A
seleção dos indivíduos chagásicos foi baseada no preenchimento de 3 critérios: 1)
realização dos exames clínicos para a caracterização das formas clínicas; 2)
sorologia positiva para a infecção chagásica (dois testes com princípios
metodológicos ou preparações antigênicas diferentes); e 3) não ter sido
submetido ao tratamento etiológico.
Os pacientes foram atendidos e examinados por médicos que fazem
parte do ambulatório após instruções detalhadas repassadas pela Dra. Glória
Cavalcanti, médica do HUOC/ UPE e colaboradora deste estudo, sobre a
caracterização das formas clínicas. Para esta caracterização foram realizadas
análises clínicas e laboratoriais: exame físico, sorologia para a infecção pelo
T.
cruzi
(ELISA e/ou hemaglutinação indireta e/ou imunofluorescência indireta),
eletrocardiograma, raios-X de tórax e de esôfago.
Os pacientes portadores da FC (n=19) foram selecionados por
apresentarem alteração no eletrocardiograma e/ou dilatação do coração, ausência
de dilatação do esôfago, ausência de queixas digestivas (engasgos e constipação)
e sorologia positiva para infecção pelo
T. cruzi
.
Lorena V. M. B.
34
Os pacientes portadores da FI (n=17) foram selecionados por não
apresentarem quaisquer alterações cardíacas e digestivas, mas com sorologia
positiva para infecção pelo
T. cruzi
.
Um grupo de indivíduos voluntários não chagásicos (NC) (n=19) foi
composto para comparação com indivíduos chagásicos através do preenchimento
de 3 critérios: 1) nunca ter habitado em área endêmica para a doença de Chagas;
2) nunca ter recebido transfusão de sangue; e 3) ter apresentado teste sorológico
negativo para a doença de Chagas.
As características dos pacientes chagásicos que participaram desse
estudo encontram-se presente na tabela 1.
Lorena V. M. B.
35
Tabela 1: Características dos pacientes chagásicos estudados
Registro
CPqAM
Sexo
Idade
Naturalidade
Forma
clínica
1. HUOC 041 F 65 Limoeiro-PE FC
2. HUOC 043 M 51 Iguaraci-PE FI
3. HUOV 045 M 53 Timbaúba-PE FC
4. HUOV 049 F 51 Orobó-PE FI
5. HUOV 050 M 59 Itambé-PE FC
6. HUOC 051 M 68 Nazaré da Mata-PE FC
7. HUOC 052 F NI Limoeiro-PE FC
8. HUOC 054 M 33 União dos Palmares-PE FC
9. HUOC 056 M 43 São José do Egito-PE FI
10.
HUOC 057 F 45 Recife-PE FI
11.
HUOC 061 M 58 Nazaré da Mata-PE FC
12.
HUOC 062 F 61 Vicência-PE FC
13.
HUOC 064 M 48 Santana do Mandaú-PE FI
14.
HUOC 065 F 63 São José da Laje-PE FI
15.
HUOC 067 M 59 Buíque-PE FC
16.
HUOC 074 M 36 Monteiro-PE FI
17.
HUOC 075 M 36 Maraial-PE FC
18.
HUOC 078 F 23 São Paulo-SP FI
19.
HUOC 079 F 62 Timbaúba-PE FC
20.
HUOC 080 F 52 Timbaúba-PE FI
21 HUOC 081 F 69 Recife-PE FI
22.
HUOC 082 F 82 Limoeiro-PE FC
23.
HUOC 084 F 52 Pedra de Buíque-PE FI
24.
HUOC 087 M 22 Pedra-PE FI
25.
HUOC 088 M 44 Serra Talhada-PE FI
26.
HUOC 089 M 59 Igarassu-PE FC
27.
HUOC 090 F 62 Pindobinha-PE FC
28.
HUOC 091 F 55 Cachoeirinha-PE FI
29.
HUOC 092 F 41 Buenos Aires-PE FI
30.
HUOC 093 M 46 Recife-PE FC
31.
HUOC 094 F 53 Floresta-PE FC
32.
HUOC 096 M 51 Nazaré da Mata-PE FI
33.
HUOC 097 F 56 São Benedito do Sul-PE FC
34.
HUOC 098 M 73 São Sebastião do Umbuzeiro-PE
FC
35.
HUOC 102 F 29 Sumé-PE FI
36.
HUOC 103 M 66 Limoeiro-PE FC
NI: não informado
Lorena V. M. B.
36
5. 2. 2. 1. Aspectos éticos
As abordagens utilizadas no presente estudo foram aprovadas pelo
Comitê de Ética do CPqAM/ Fiocruz (Anexo A).
Todos os indivíduos que participaram do estudo assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido por escrito: para pacientes chagásicos
(Apêndice A) e para indivíduos voluntários NC (Apêndice B). Além disso, um
questionário clínico-epidemiológico foi aplicado em indivíduos chagásicos
(Apêndice C).
5. 2. 3. Coleta de sangue
De trinta a quarenta mililitros de sangue foram coletados em tubos
contendo heparina sódica para utilização nos ensaios de cultura celular. Cinco
mililitros de sangue foram coletados em tubo seco para obtenção de soro através
de centrifugação (1800 x g/ 10min a temperatura ambiente-TA) dos tubos após a
retração do coágulo. As alíquotas de soro foram devidamente identificadas e
armazenadas a -20°C.
Lorena V. M. B.
37
5. 2. 4. Sorologia para infecção pelo
T. cruzi
Como os pacientes chagásicos selecionados já apresentavam um ou
mais testes sorológicos positivos, e como é recomendada a realização de dois
testes sorológicos diferentes para o diagnóstico da infecção pelo
T. cruzi
, foi
realizado mais um teste diagnóstico visando atender esta recomendação para
todos os indivíduos. Para isso, foi utilizado um teste imunoenzimático que utiliza
uma mistura de antígenos do
T. cruzi
adsorvidos à placa de ELISA (EIE-Chagas-
Biomanguinhos) proveniente de Bio-Manguinhos/ Fiocruz. Ainda foi aplicado ao
referido
kit
as amostras de soro dos indivíduos voluntários NC.
5. 2. 5. Obtenção das células mononucleares do sangue
periférico
Em condições estéreis, o sangue heparinizado foi misturado a PBS pH
7,2 na proporção de 1:2 e adicionado a tubos falcons 50mL contendo Ficoll-
hypaque (1 parte de Ficoll-Paque e 3 da mistura sangue-PBS). Em seguida, os
tubos foram submetidos a uma centrifugação (900 x g/ 40 min a 20° C) e através
de pipeta
transfer
o anel de PBMC foi removido e depositado em tubos falcons de
15mL. As células foram lavadas duas vezes por centrifugação (400 x g/ 10 min a
20° C) em meio RPMI 1640 (na proporção de 1 parte de células para 2 partes de
meio). Ao fim das lavagens, as células foram contadas em câmara de Neubauer
Lorena V. M. B.
38
através do corante de vitalidade Azul de Trypan e ajustadas para as concentrações
desejadas (ver itens 5.2.6.2. e 5.2.7.2.) adicionando meio RPMI 1640
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF).
5. 2. 6. Ensaio de proliferação celular
5. 2. 6. 1. Padronização do ensaio
Três pacientes chagásicos do Ambulatório de Doença de Chagas do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco-UFPE foram
selecionados para investigar as condições ideais para o ensaio de proliferação
celular. Como controle negativo, um indivíduo NC foi incluído nesse estudo. PBMC
foram estimuladas com diferentes concentrações de CRA ou FRA obtidas por
diluição seriada com fator 2 (20 a 0,156µg/mL) e com Fitohemaglutinina-PHA (10
a 1,25µg/mL) por 5 ou 6 dias. As concentrações dos estímulos foram escolhidas
de acordo com a resposta proliferativa desempenhada após os períodos de cultivo,
levando-se em consideração os mínimos custos. Assim, as concentrações
estabelecidas foram: 1) CRA=0,312µg/mL; 2) FRA=0,156µg/mL; 3)
PHA=2,5µg/mL. A proliferação celular foi mais elevada após 6 dias de cultivo.
(LORENA et al., 2005a). No entanto, ao realizar ensaios de proliferação celular
aumentando o número de pacientes foi verificado que não havia diferenças
significativas entre as diversas concentrações de Ags-Recs utilizadas. Assim, após
Lorena V. M. B.
39
resultados da padronização da cultura celular para obtenção de sobrenadante de
cultura (ver o item 5.2.7.1. adiante) as concentrações dos estímulos utilizadas na
proliferação foram as mesmas utilizadas para a obtenção de sobrenadante de
cultura.
5. 2. 6. 2. Avaliação da proliferação celular
As suspensões celulares (2x10
5
células/poço) foram depositadas em
placas de cultura de 96 poços, em triplicata, e estimuladas com PHA (2,5µg/mL),
Concanavalina-ConA (2,5µg/mL) e Ags-Recs CRA ou FRA (2µg/mL). Suspensões
celulares sem nenhum estímulo foram usadas como controle negativo. O volume
total foi 200µL por poço. As placas foram levadas à estufa (37ºC a 5% CO
2
) por 6
dias. Dezesseis horas antes do fim do tempo de incubação, 0,5µCi de
3
H-timidina
foi adicionada aos poços da placa. Após o fim do tempo de incubação, o material
da cultura celular foi coletado através do coletor semi-automático de células e
depositado em papel de fibra de vidro. A incorporação de
3
H-timidina foi
quantificada através da adição de 1,8mL de líquido de cintilação aos tubos
contendo o material. A leitura foi processada no cintilador, onde as radiações β
emitidas são expressas em contagem por minuto (CPM). O índice de estimulação
(IE) foi calculado dividindo-se a média da CPM das culturas estimuladas pela
média da CPM das culturas sem estímulo.
Lorena V. M. B.
40
5. 2. 7. Citocinas de sobrenadante de cultura
5. 2. 7. 1. Padronização da cultura celular
Nove portadores da FC e cinco da FI foram selecionados no
Ambulatório de Doença de Chagas do HUOC/ UPE. Como controle negativo, dois
indivíduos NC foram incluídos no estudo. PBMC foram estimuladas com diferentes
concentrações de CRA ou FRA obtidas por diluição seriada com fator 2 (2 a
0,125µg/mL) e com PHA (10 a 2,5µg/mL) por 24h, 48h, 72h e 6 dias de cultivo.
As concentrações dos estímulos foram escolhidas de acordo com as maiores
médias de densidade óptica apresentadas pelos pacientes chagásicos após a
realização do ELISA de captura para detectar as citocinas nos sobrenadantes das
culturas. Da mesma forma, foram analisados os períodos de cultivo para a coleta
de sobrenadante. Assim, as concentrações dos estímulos escolhidas foram: 1)
Ags-Recs CRA ou FRA=2µg/mL e 2) PHA=10µg/mL. Os tempos de cultivo
escolhidos foram: 24h para detecção de TNF-α; 72h para detecção de IL-10 e 6
dias para detecção de IFN-γ (LORENA et al., 2005b). Para a IL-4 apenas
realizamos o ELISA com amostras coletadas após 24h de cultivo.
Lorena V. M. B.
41
5. 2. 7. 2. Obtenção do sobrenadante de cultura
Suspensões celulares (5 x 10
5
células/ poço) foram depositadas em
placas de cultura de fundo plano de 48 poços e estimuladas com PHA (10µg/mL),
ConA (2,5µg/mL) e Ags-Recs CRA ou FRA (2µg/mL). Suspensões celulares sem
nenhum estímulo, foram usadas como controle negativo. O volume total foi 500µL
por poço. As placas foram incubadas (37ºC a 5% CO
2
) por diferentes períodos (24
horas, 72 horas e 6 dias). Os sobrenadantes de cultura foram coletados ao fim do
tempo de incubação através da centrifugação da placa (400 x g/ 5min a TA). As
alíquotas de sobrenadante foram devidamente identificadas e estocadas
imediatamente a -70°C.
5. 2. 7. 3. Detecção das citocinas
As citocinas de sobrenadante de cultura celular foram determinadas
através de ELISA de captura. Placas de microtitulação de 96 poços foram
sensibilizadas com 50µL/poço dos anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas
(TNF-α=2µg/mL, IL-4=2µg/mL, IL-10=2µg/mL, e IFN-γ=0,5µg/mL) diluídos em
PBS pH 7,2 e incubadas
overnight
a 4°C. Após lavagem (3 x 200µL/poço de PBS-
Tween 0,05%), as placas foram bloqueadas com uma solução de PBS-Tween
0,05% e albumina sérica bovina-BSA 1% por 4h à TA. Após lavagem (3 x 200µL
de PBS-Tween 0,05%), 50µL/poço de sobrenadante de cultura, bem como dos
Lorena V. M. B.
42
padrões (citocinas recombinantes) foram adicionados em duplicata e incubados
overnight
a 4°C. As diferentes concentrações de padrões foram obtidas através de
diluição seriada com fator 2 (TNF-α=2.000 a 3,9pg/mL; IL-4=8.000 a 15,6pg/mL;
IL-10=8.000 a 15,6pg/mL; IFN-γ=32.000 a 62,5pg/mL) em RPMI 1640 2% SBF.
Após lavagem (3 x 200µL de PBS-Tween 0,05%), 50µL/poço dos anticorpos
monoclonais anti-citocinas conjugados à biotina (TNF-α=100ng/mL; IL-
4=12,5ng/mL; IL-10=500ng/mL e IFN-γ=125ng/mL) diluídos em tampão Tris-NaCl
pH 7,2 foram adicionados por 2h à TA. Após lavagem (3 x 200µL de PBS-Tween
0,05%), 50µl de streptavidina-peroxidase diluída 1:10.000 em PBS-Tween 0,1%
BSA foram adicionados por 1,5h à TA. Após lavagem (3 x 200µL de PBS-Tween
0,05%), os imunocomplexos foram detectados utilizando 50µl da solução
reveladora (H
2
O
2
e ABTS) durante 15 min para TNF-α, 35 min para IL-4, 35 min
para IL-10, e 35 min para IFN-γ à TA. A reação foi bloqueada com ácido cítrico
0,2M e a leitura foi realizada no espectofotômetro a 405nm.
As referidas concentrações de anticorpos (de captura e biotinilado) e
padrões foram estabelecidas previamente através de ensaios de titulação
recomendados pelo fabricante.
O programa Microplate Manager versão 4.0 (Bio-Rad Laboratories,
Inc. Molecular Bioscience Group) foi utilizado para a obtenção da média da
duplicata e para a determinação das concentrações de citocinas das amostras
através da construção de uma curva-padrão obtida com a diluição seriada das
citocinas recombinantes identificando a sensibilidade do ensaio para cada citocina.
Lorena V. M. B.
43
5. 2. 8. Análise estatística
Foi realizada uma análise descritiva para expor os resultados obtidos. A
apresentação das variáveis mensuradas foi feita através de medidas descritivas
como: média e desvio padrão. Para testar a suposição de normalidade dos dados
foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov. Para verificar a existência de
diferenças entre as culturas estimuladas e sem estímulo dentro de cada grupo
estudado foi utilizado o teste Wilcoxon para amostras pareadas. Para comparar a
diferença de médias entre os grupos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis,
seguido do teste de Mann-Whitney, quando existiu diferença entre médias. Todas
as conclusões foram tomadas ao nível de significância de 5%. Os softwares
utilizados foram o Excel 2000 e o Statistical Package for Social Sciences
Incorporation 13.0.
Lorena V. M. B.
44
6 Resultados
6. 1. Proliferação celular
6. 1. 1. Resposta induzida por mitógenos
A estimulação mitogênica através de PHA e ConA foi usada como
controle positivo para verificar a capacidade proliferativa de PBMC cultivadas em
resposta aos antígenos de
T. cruzi.
A resposta de PBMC estimuladas com os
mitógenos foi inicialmente comparada entre os grupos de pacientes chagásicos e
indivíduos NC. Como mostrado na Figura 1, a incorporação de
3
H-timidina foi
significativamente maior em pacientes chagásicos após estímulo com ConA,
quando comparado aos indivíduos NC. Apesar de elevados IEs, não houve
diferença significativa quando os grupos de pacientes chagásicos foram
comparados ao grupo de indivíduos NC após estímulo com PHA. Ao analisar a
proliferação celular entre os pacientes chagásicos, ou seja, entre os pacientes
portadores da FC e da FI, não observamos diferença entre os dois grupos de
pacientes.
Lorena V. M. B.
45
0
10
20
30
40
50
60
70
80
FC
FI
NC
PHA
ConA
p=0,015
p=0,03
Índice de estimulação
Figura 1: Resposta proliferativa de PBMC de pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos
após estímulo com mitógenos. Fitohemaglutinina (PHA) e Concanavalina (ConA). Pacientes
portadores das formas clínicas cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI) (n=17) e indivíduos não-
chagásicos (NC) (n=19). Os símbolos (, , ∇) representam a média das triplicatas em CPM dos
estímulos dividida pela média das triplicatas em CPM da cultura sem estímulo de cada indivíduo. As
barras horizontais representam a média aritmética e as diferenças estatísticas estão mostradas na
figura com o valor de p≤0,05.
6. 1. 2. Resposta induzida por antígenos de
T. cruzi
Quando a proliferação celular antígeno-específica foi avaliada,
observou-se que tanto os pacientes chagásicos da FC quanto da FI apresentaram
uma resposta proliferativa maior que os indivíduos NC após estímulos com CRA,
FRA e Ag-Epi (Figura 2). Porém, não houve diferença da resposta proliferativa
entre os indivíduos FC e FI após estímulo com ambos os Ags-Recs, bem como com
Ag-Epi.
Lorena V. M. B.
46
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
Índice de Estimulação
Figura 2: Resposta proliferativa de PBMC de pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos
após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
(CRA),
Flagellar
Repetitive Antigen
(FRA) e antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
(Ag-Epi).
Pacientes portadores das formas clínicas cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI) (n=17) e
indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os símbolos (, , ∇) representam a média das
triplicatas em CPM dos estímulos dividida pela média das triplicatas em CPM da cultura sem
estímulo de cada indivíduo. As barras horizontais representam a média aritmética e as diferenças
estatísticas estão mostradas na figura com o valor de p≤0,05.
6. 2. Detecção de citocinas de sobrenandante de cultura
6. 2. 1. Produção de TNF-α
αα
α
A produção de TNF-α, avaliada através da comparação das culturas
estimuladas com as culturas sem estímulo, dentro de cada grupo, está indicada na
Tabela 2.
Lorena V. M. B.
47
Tabela 2: Estatísticas descritivas da produção de TNF-α em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após comparação das culturas estimuladas com a
cultura sem estímulo.
Grupo
Culturas n
Média
(pg/mL)
Desvio
padrão
p-valor
FC 19
Sem Estímulo
432,63 259,96
PHA 698,35 273,91 <0,001 *
ConA 837,50 295,64 <0,001 *
CRA 662,52 294,01 <0,001 *
FRA 805,08 352,03 <0,001 *
AgEpi 478,97 259,93 0,007 *
FI 17
Sem Estímulo
356,17 237,26
PHA 712,68 232,63 <0,001 *
ConA 855,80 236,49 <0,001 *
CRA 652,16 239,88 <0,001 *
FRA 844,78 221,89 <0,001 *
AgEpi 460,64 270,72 0,001 *
NC 19
Sem Estímulo
237,56 189,67
PHA 447,17 224,63 <0,001 *
ConA 718,04 239,82 <0,001 *
CRA 386,60 203,80 <0,001 *
FRA 736,40 247,82 <0,001 *
AgEpi 253,55 207,51 0,085
FC= Forma cardíaca
FI= Forma indeterminada
NC= não chagásico
PHA= Fitohemaglutinina
ConA= Concanavalina
CRA=
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
FRA
= Flagellar Repetitive Antigen
Ag-Epi= Antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
* = p≤0,05
Após estímulo com os mitógenos, os pacientes portadores da FC e da
FI produziram mais TNF-α que os indivíduos NC quando as células foram
estimuladas com PHA e com ConA. Porém, apenas houve diferença estatística
após estímulo com PHA. Os pacientes portadores da FC e da FI apresentaram
Lorena V. M. B.
48
níveis elevados de TNF-α nas culturas celulares sem estímulo antigênico, quando
comparado às culturas dos indivíduos NC. No entanto, apenas a produção de TNF-
α pelos pacientes chagásicos portadores da FC foi estatisticamente diferente
quando comparado ao grupo de indivíduos NC (Figura 3).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
FC
FI
NC
PHA
ConA
S/ estímulo
p=0,02
p=0,05
p=0,009
TNF-
α
(pg/mL)
Figura 3: Detecção de TNF-α em sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo.
Fitohemaglutinina (PHA) e Concanavalina (ConA). Pacientes portadores das formas clínicas
cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI) (n=17) e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os
símbolos (, , ∇) representam a média da duplicata. As barras horizontais representam a média
aritmética e as diferenças estatísticas estão indicadas na figura com o valor de p≤0,05.
A avaliação da capacidade de produção de TNF-α entre os grupos de
pacientes chagásicos e indivíduos NC após estímulo com antígenos de
T. cruzi
está
mostrada na Figura 4. Sob estimulação com o Ag-Rec CRA, os níveis de TNF-α
detectados foram estatisticamente maiores tanto nos pacientes portadores da FC,
quanto nos indivíduos portadores da FI, quando comparados aos indivíduos NC. O
mesmo ocorreu após estímulo com Ag-Epi (Figura 4).
Lorena V. M. B.
49
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
p=0,02
p=0,04
p=0,011
p=0,03
TNF-
α
(pg/mL)
Figura 4: Detecção de TNF-α em sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive
Antigen
(CRA),
Flagellar Repetitive Antigen
(FRA) e antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T.
cruzi
(Ag-Epi). Pacientes portadores das formas clínicas cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI)
(n=17) e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os símbolos (, , ∇) representam a média da
duplicata. As barras horizontais representam a média aritmética e as diferenças estatísticas estão
indicadas na figura com o valor de p≤0,05.
6. 2. 2. Produção de IL-4
A produção de IL-4, avaliada através da comparação das culturas
estimuladas com as culturas sem estímulo, dentro de cada grupo, está indicada na
Tabela 3. Não houve diferença estatística quando as células foram estimuladas
com antígenos de
T. cruzi,
quando comparado à cultura sem estímulo.
Lorena V. M. B.
50
Tabela 3: Estatísticas descritivas da produção de IL-4 em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após comparação das culturas estimuladas com a
cultura sem estímulo.
Grupo
Culturas n
Média
(pg/mL)
Desvio
padrão
p-valor
FC 19
Sem Estímulo
39,66 69,84
PHA 196,10 230,21 0,005 *
ConA 238,57 281,91 0,001 *
CRA 131,98 254,17 0,123
FRA 67,58 102,89 0,221
AgEpi 68,14 125,43 0,260
FI 17
Sem Estímulo
52,04 127,25
PHA 84,44 95,72 0,770
ConA 114,69 145,99 0,041 *
CRA 36,67 66,28 1,000
FRA 42,83 75,86 0,594
AgEpi 63,99 79,46 0,075
NC 19
Sem Estímulo
10,60 26,41
PHA 38,78 60,58 0,058
ConA 62,47 86,03 0,011 *
CRA 5,08 12,49 0,465
FRA 12,54 36,00 0,917
AgEpi 1,02 0,07 0,109
FC= Forma cardíaca
FI= Forma indeterminada
NC= não chagásico
PHA= Fitohemaglutinina
ConA= Concanavalina
CRA=
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
FRA
= Flagellar Repetitive Antigen
Ag-Epi= Antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
* = p≤0,05
A produção de IL-4 por PBMC de pacientes chagásicos e NC após
estimulação com os mitógenos PHA e ConA e sem estímulo está apresentada na
Figura 5. Os pacientes chagásicos apresentaram maiores níveis de IL-4 na
presença dos mitógenos, quando comparados aos indivíduos NC. No entanto,
Lorena V. M. B.
51
apenas os pacientes portadores da FC apresentaram produção de IL-4
estatisticamente significativas quando comparados aos indivíduos NC (Figura 5).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
FC
FI
NC
PHA
ConA
S/ estímulo
p=0,009
p=0,012
IL-4 (pg/mL)
Figura 5: Detecção de IL-4 em sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo.
Fitohemaglutinina (PHA) e Concanavalina (ConA). Pacientes portadores das formas clínicas
cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI) (n=17) e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os
símbolos (, , ∇) representam a média da duplicata. As barras horizontais representam a média
aritmética e as diferenças estatísticas estão indicadas na figura com o valor de p≤0,05.
6. 2. 3. Produção de IL-10
A produção de IL-10, avaliada através da comparação das culturas
estimuladas com as culturas sem estímulo, dentro de cada grupo, está indicada na
Tabela 4.
Lorena V. M. B.
52
Tabela 4: Estatísticas descritivas da produção de IL-10 em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após comparação das culturas estimuladas com a
cultura sem estímulo.
Grupo
Culturas n
Média
(pg/mL)
Desvio
padrão
p-valor
FC 19
Sem Estímulo
177,65 184,11
PHA 693,47 297,64 <0,001 *
ConA 748,19 419,06 <0,001 *
CRA 244,76 232,86 0,011 *
FRA 533,64 425,36 <0,001 *
AgEpi 180,98 187,32 0,605
FI 17
Sem Estímulo
158,09 127,67
PHA 562,50 266,16 <0,001 *
ConA 712,23 399,21 <0,001 *
CRA 260,30 176,98 0,001 *
FRA 649,09 398,54 <0,001 *
AgEpi 195,00 185,30 0,074
NC 19
Sem Estímulo
88,38 94,38
PHA 515,21 231,52 <0,001 *
ConA 735,24 350,01 <0,001 *
CRA 219,12 165,40 <0,001 *
FRA 641,48 376,14 <0,001 *
AgEpi 133,33 122,30 0,003 *
FC= Forma cardíaca
FI= Forma indeterminada
NC= não chagásico
PHA= Fitohemaglutinina
ConA= Concanavalina
CRA=
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
FRA
= Flagellar Repetitive Antigen
Ag-Epi= Antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
* = p≤0,05
Apesar da produção de IL-10 por PBMC de pacientes chagásicos, tanto
portadores da FC como da FI, após estímulos com mitógenos e com os Ags-Recs,
ter sido detectada (Tabela 4) nenhuma diferença foi observada entre os grupos
estudados (Figuras 6 e 7).
Lorena V. M. B.
53
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
FC
FI
NC
PHA
ConA
S/ estímulo
IL-10 (pg/mL)
Figura 6: Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo.
Fitohemaglutinina (PHA) e Concanavalina (ConA). Pacientes portadores das formas clínicas
cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI) (n=17) e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os
símbolos (, , ∇) representam a média da duplicata. As barras horizontais representam a média
aritmética e as diferenças estatísticas estão indicadas na figura com o valor de p≤0,05.
Lorena V. M. B.
54
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
IL-10 (pg/mL)
Figura 7: Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive
Antigen
(CRA),
Flagellar Repetitive Antigen
(FRA) e antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T.
cruzi
(Ag-Epi). Pacientes portadores das formas clínicas cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI)
(n=17) e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os símbolos (, , ∇) representam a média da
duplicata. As barras horizontais representam a média aritmética e as diferenças estatísticas estão
indicadas na figura com o valor de p≤0,05.
6. 2. 4. Produção de IFN-γ
γγ
γ
A produção de IFN-γ, avaliada através da comparação das culturas
estimuladas com as culturas sem estímulo, dentro de cada grupo, está indicada na
Tabela 5.
Lorena V. M. B.
55
Tabela 5: Estatísticas descritivas da produção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de PBMC de
pacientes chagásicos e indivíduos não chagásicos após comparação das culturas estimuladas com a
cultura sem estímulo.
Grupo
Culturas n
Média
(pg/mL)
Desvio
padrão
p-valor
FC 19
Sem Estímulo
1976,04 2642,32
PHA 7030,56 5569,61 <0,001 *
ConA 12980,05 7157,83 <0,001 *
CRA 2725,56 2786,60 0,013 *
FRA 2793,87 2853,60 0,028 *
AgEpi 5749,14 5084,95 <0,001 *
FI 15
Sem Estímulo
1367,38 1479,65
PHA 7331,44 4497,26 0,001 *
ConA 14646,62 5767,15 0,001 *
CRA 1821,22 1578,22 0,055
FRA 1716,34 1546,41 0,133
AgEpi 8181,38 4683,94 0,001 *
NC 19
Sem Estímulo
670,09 1538,69
PHA 5230,96 4891,16 <0,001 *
ConA 17538,21 5542,98 <0,001 *
CRA 977,80 2087,44 0,346
FRA 1071,77 1669,32 0,013 *
AgEpi 600,67 1331,80 0,508
FC= Forma cardíaca
FI= Forma indeterminada
NC= não chagásico
PHA= Fitohemaglutinina
ConA= Concanavalina
CRA=
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
FRA
= Flagellar Repetitive Antigen
Ag-Epi= Antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
* = p≤0,05
Não houve diferença entre os grupos estudados quanto à detecção de
IFN-γ em sobrenadantes de cultura após estímulo com os mitógenos PHA e ConA.
A produção de IFN-γ foi significativamente mais elevada em pacientes portadores
da FC, quando comparados aos indivíduos do grupo NC, em culturas sem estímulo
(Figura 8).
Lorena V. M. B.
56
0
1500
3000
4500
6000
7500
9000
10500
12000
13500
15000
16500
18000
19500
21000
22500
24000
25500
27000
28500
30000
FC
FI
NC
PHA
ConA
S/ estímulo
p=0,008
IFN-
γ
(pg/mL)
Figura 8:
Detecção de IFN-
γ
em sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com mitógenos e em cultura sem estímulo.
Fitohemaglutinina (PHA) e Concanavalina (ConA). Pacientes portadores das formas clínicas
cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI) (n=15) e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os
símbolos (
,
,
∇
) representam a média da duplicata. As barras horizontais representam a média
aritmética e as diferenças estatísticas estão indicadas na figura com o valor de p
≤
0,05.
Com relação à produção de IFN-γ após estímulo com os Ags-Recs,
apenas o Ag-Rec CRA foi capaz de induzir a produção da citocina em pacientes
chagásicos. No entanto, nenhuma diferença foi observada entre os grupos de
pacientes portadores das formas clínicas estudadas. O mesmo ocorreu quando o
estímulo foi o Ag-Epi (Figura 9).
Lorena V. M. B.
57
0
1500
3000
4500
6000
7500
9000
10500
12000
13500
15000
16500
18000
19500
21000
22500
24000
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
p=0,011
p=0,003
p∠0,001
p∠0,001
IFN-γ (pg/mL)
Figura 9:
Detecção de IFN-
γ
em sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes chagásicos e
indivíduos não chagásicos após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive
Antigen
(CRA),
Flagellar Repetitive Antigen
(FRA) e antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T.
cruzi
(Ag-Epi). Pacientes portadores das formas clínicas cardíaca (FC) (n=19) e indeterminada (FI)
(n=15) e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os símbolos (
,
,
∇
) representam a média da
duplicata. As barras horizontais representam a média aritmética e as diferenças estatísticas estão
indicadas na figura com o valor de p
≤
0,05.
6. 3. Resumo do perfil de citocinas identificado em pacientes
chagásicos portadores das formas clínicas crônicas da doença de Chagas
A caracterização de um perfil de citocinas produzidas e detectadas em
sobrenadantes de cultura após estímulo
in vitro
com os antígenos de
T. cruzi
é
apresentada na Tabela 6.
Lorena V. M. B.
58
Tabela 6:
Perfil de citocinas produzidas e detectadas em sobrenadantes de cultura após estímulo
in vitro
com os antígenos de
T. cruzi
Antígenos de
T. cruzi
CRA FRA Ag-Epi
Citocinas estudadas FC FI FC FI FC FI
TNF-
α
x x - - x x
IL-4 - - - - - -
IL-10 - - - - - -
IFN-
γ
x x - - x x
FC= Forma cardíaca
FI= Forma indeterminada
CRA=
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
FRA
= Flagellar Repetitive Antigen
Ag-Epi= Antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
X= indicação da detecção da citocina com diferença estatística
- = indicação de ausência de diferença estatística
A tabela mostra, de forma resumida, os resultados obtidos após análise
da produção de citocinas. São expressos apenas os resultados em que houve
produção de citocinas, que apresentaram diferença estatística, quando os grupos
de indivíduos chagásicos (FC ou FI) foram comparados com o grupo de indivíduos
NC, lembrando que não houve diferenças estatísticas entre os indivíduos FC e FI
para nenhuma das citocinas estudadas.
Lorena V. M. B.
59
7 Discussão
Vários estudos têm sugerido uma participação efetiva da imunidade
celular na patologia da doença de Chagas, sobretudo na cardiopatia chagásica. De
fato, as células T compreendem quase a totalidade das células presentes nos
infiltrados inflamatórios de pacientes com miocardiopatia (REIS et al., 1993;
HIGUCHI et al., 1997). Desta forma, a habilidade das células T na reatividade
contra o parasito e seus antígenos tem sido demonstrada, encorajando trabalhos
que caracterizassem fenotipicamente e funcionalmente essas células com o intuito
de investigar seus papéis no estabelecimento das respostas patológicas
(indivíduos portadores das formas severas) ou protetoras (indivíduos da forma
indeterminada) (DUTRA et al., 2005).
Da avaliação dessas características imunológicas, poderia surgir o
desenvolvimento de um marcador de evolução de prognóstico das formas clínicas
severas. A utilização de marcadores biológicos identificaria antecipadamente a
evolução das formas clínicas da doença de Chagas, auxiliando no
redirecionamento da conduta terapêutica pelos médicos. Nesse sentido, muitos
estudos foram propostos (GOMES et al., 2003; MICHAILOWSKY et al., 2003;
BARROS-MAZON et al., 2004; LAUCELLA et al., 2004).
Apesar de vários achados importantes ao se estudar a imunidade
celular na infecção chagásica, pouco foi encontrado sobre distintos perfis de
resposta celular entre os pacientes chagásicos portadores das formas cardíaca,
digestiva ou indeterminada da doença. Muitas vezes, isso se deve ao fato desses
trabalhos fazerem uso de antígenos complexos de formas tripomastigota e
Lorena V. M. B.
60
epimastigota de
T. cruzi
com mais frequência
.
A utilização de antígenos que
pudessem identificar respostas específicas ao
T. cruzi
aliada aos resultados prévios
obtidos por Pereira et al. (2002), onde distintos perfis de citocinas foram
encontrados entre os pacientes portadores das formas clínicas cardíaca e
indeterminada, impulsionaram o presente estudo com os Ags-Recs CRA e FRA.
Dessa forma, a pergunta que conduziu esse estudo foi: Qual a relação
da resposta imune celular de pacientes chagásicos após estímulo
in vitro
com os
Ags-Recs CRA ou FRA de
T. cruzi
e as formas clínicas crônicas da doença de
Chagas? Para isso, estudamos a linfoproliferação e a produção de TNF-α, IL-4, IL-
10 e IFN-γ em sobrenadantes de cultura de PBMC de pacientes chagásicos com as
formas cardíaca e indeterminada da doença.
Apesar de Pernambuco possuir maiores freqüências de megaesôfago e
megacólon chagásicos na Região Nordeste (VASCONCELOS, 1996), nesse estudo,
apenas utilizamos células de pacientes chagásicos portadores das formas clínicas
cardíaca e indeterminada da doença. Não foi possível selecionar pacientes
portadores da forma clínica FD, pois os poucos indivíduos com comprometimento
digestivo que foram atendidos pelos médicos do HUOC/ UPE, também
apresentavam alterações cardíacas, sendo denominados da forma clínica mista.
Além disso, alguns pacientes não apresentavam os exames clínicos completos e,
assim, não podiam fazer parte da população de estudo. Durante a seleção dos
pacientes, apenas um indivíduo portador da FD foi selecionado para a realização
das culturas celulares. No entanto, não foi possível incluí-lo na análise dos
resultados em virtude da restrita amostragem.
Lorena V. M. B.
61
7.1. Resposta proliferativa dos pacientes chagásicos
O ensaio de proliferação celular mostrou que a imunidade celular está
bem preservada entre os indivíduos chagásicos, já que a resposta linfoproliferativa
dos linfócitos aos mitógenos PHA e ConA foi similar a dos indivíduos NC (Figura 1).
Apesar de evidenciada uma resposta proliferativa contra os Ags-Recs
nos indivíduos chagásicos, quando comparada com o grupo de indivíduos NC, essa
resposta dos pacientes poderia ser considerada bastante baixa (Figura 2). Muitos
trabalhos que investigam a resposta proliferativa consideram positivas as
respostas com IE igual ou acima de 2 ou de 3 (DE TITTO et al., 1985;
MICHAILOWSKY et al., 2003).
Morato et al. (1986) identificaram que 30% dos pacientes chagásicos
portadores da FI e 33,3% portadores da FC apresentaram baixa responsividade a
seis antígenos derivados de diferentes cepas e clones de
T. cruzi
. A diminuição da
resposta linfoproliferativa também foi relatada em um estudo longitudinal da
resposta imune feito por Mosca et al. (1985), onde níveis de parasitemia (avaliada
através de xenodiagnóstico artificial) estavam correlacionados com diminuição da
proliferação celular em pacientes chagásicos portadores da FI, sugerindo que, em
pacientes com a doença cardíaca, um mecanismo modulatório poderia ter sido
perdido. Além disso, pacientes curados mostraram altas respostas proliferativas
em comparação com os indivíduos não-curados após estímulo com antígeno
solúvel de epimastigota e/ ou tripomastigota (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000).
Segundo os autores, uma possível explicação para este fato, é um número maior
Lorena V. M. B.
62
de células T de memória em pacientes que foram submetidos ao tratamento e
considerados curados.
A proliferação celular, decorrente da ativação de antígeno solúvel de
tripomastigota, foi significativamente maior em pacientes chagásicos (tanto
portadores da FC, quanto da FI, quando comparados aos indivíduos NC, após as
culturas terem sido tratadas com indometacina, um inibidor da síntese de
prostaglandinas (BARROS-MAZON et al., 2004), indicando que as respostas
celulares de pacientes chagásicos são reguladas negativamente por
prostaglandinas. Além disso, as prostaglandinas podem induzir a diminuição dos
níveis de IL-2 e de seu receptor (RINCON et al., 1988), contribuindo para a
inibição da proliferação celular.
Macrófagos e/ou células dendríticas sintetizam citocinas ou mediadores
solúveis, como os intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio, que podem
aumentar ou suprimir as respostas proliferativas (SCHLEIFER & MANSFILED,
1993; PINGE FILHO et al., 1999). A IL-10 é sintetizada por macrófagos, entre
outras células, e é considerada uma potente supressora das respostas
proliferativas de linfócitos (DE WALL MALEFYT et al., 1993).
De forma geral, há poucas informações sobre os mecanismos que
regulam as respostas linfocitárias parasito-específicas em pacientes chagásicos. A
proliferação celular, após estímulos com os Ags-Recs, poderia ser investigada com
relação ao papel imunorregulatório das células T e seus fatores solúveis na cultura
celular entre indivíduos portadores das formas severas da doença e portadores da
FI.
Lorena V. M. B.
63
7. 2. Produção das citocinas por PBMC de pacientes chagásicos
Vários estudos utilizando animais, especialmente camundongos, têm
mostrado que a infecção pelo
T. cruzi
induz a produção de citocinas. Estas têm o
papel de modular a resposta imune na resistência do hospedeiro contra o parasito.
Porém, pouco ainda é conhecido sobre a participação das citocinas na proteção e/
ou nos mecanismos patológicos da doença de Chagas humana.
Estudos em pacientes chagásicos cardíacos têm revelado uma resposta
imune do tipo 1, com produção elevada de TNF-α e IFN-γ. Cunha-Neto et al.
(1998) estudaram a produção de citocinas em sobrenadantes de cultura de células
T obtidas de biópsias de coração de 8 pacientes portadores da FC. Os resultados
mostraram que as células de 7/8 biópsias produziram IFN-γ, 6/8 produziram TNF-
α e 3/8 produziram IL-10. IL-4 e IL-12 não foram detectadas. A presença de IFN-γ
e TNF-α, na ausência de IL-4, indica um padrão de resposta inflamatória do tipo 1
em indivíduos portadores da cardiomiopatia chagásica. Apesar de um número
bastante pequeno de indivíduos estudados por Cunha-Neto et al. (1998), essa
predominância de TNF-α e IFN-γ está em concordância com outros estudos
anteriores (REIS et al., 1993; REIS et al., 1997). Além disso, TNF-α tem sido
demonstrada por modular a expressão de moléculas de adesão, participando,
desta forma, dos processos inflamatórios por recrutar linfócitos ao sítio de
inflamação e contribuindo com a progressão da reação inflamatória local na
cardiopatia chagásica (BACHMAIER et al., 1997).
Apesar de alguns estudos mostrarem que os pacientes portadores da FI
da doença produzem níveis elevados de IFN-γ por PBMC (GOMES et al., 2003;
Lorena V. M. B.
64
LAUCELLA et al., 2004), além de outras citocinas inflamatórias, está claro que IFN-
γ está relacionada com a FC da doença. Elevados níveis de IFN-γ têm sido
associados com a severidade da doença cardíaca em pacientes chagásicos
crônicos (DUTRA et al., 1997; GOMES et al., 2003; BARROS-MAZON et al., 2004),
provavelmente por uma exacerbação da resposta imune, particularmente nas
fibras cardíacas, promovendo a destruição dessas células. Por outro lado, também
existe uma correlação positiva entre os níveis da citocina e a cura parasitológica
da doença de Chagas, quando o tratamento foi feito na fase aguda da doença,
sugerindo que IFN-γ poderia estar agindo sinergicamente com a quimioterapia
durante o início da doença, apresentando um papel protetor contra o parasito
(BAHIA-OLIVEIRA et al., 1998; 2000).
Se células T do tipo 1 são relatadas por estarem envolvidas com a
severidade da doença de Chagas, seria esperado que PBMC de pacientes
portadores da FC produzissem níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias
quando estimuladas pelos antígenos de
T. cruzi
(CRA, FRA e Ag-Epi). No presente
estudo, altos níveis de TNF-α e IFN-γ foram detectados em pacientes chagásicos
após estímulo de PBMC com CRA e com Ag-Epi quando comparado aos indivíduos
NC. Porém, ao contrário da literatura relatada, não foi identificada a presença de
maiores níveis em pacientes portadores da FC, quando comparados aos pacientes
portadores da FI (Figuras 4 e 9).
É importante salientar que, por se tratar de um estudo com humanos,
apesar de categorizado clinicamente, são grupos extremamente heterogêneos. Os
pacientes têm idades diferentes (Tabela 1) e certamente apresentam respostas
imunológicas distintas de acordo com seus estágios de infecção (DUTRA et al.,
Lorena V. M. B.
65
1997). Nesse sentido, Gomes et al. (2003), ao estudarem a produção de IFN-γ,
dividiram o grupo de pacientes com alterações cardíacas de acordo com a
severidade da doença através de exames clínicos mais sensíveis. Desta forma, foi
possível estabelecer uma correlação entre “altos” e “baixos” produtores de IFN-γ e
o estado clínico do paciente.
Com relação aos pacientes chagásicos portadores da FI da doença,
estes têm sido identificados por apresentarem uma resposta do tipo 2, com
secreção elevada de IL-10 (GOMES et al., 2003), sugerindo, assim, uma proteção
imunológica para o desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica.
De fato, citocinas imunorreguladoras (IL-10, IL-4 e TGF-β) são
importantes por controlar a infecção pelo
T. cruzi
(SILVA et al., 1992). As células
T regulatórias têm sido descritas como uma população de células T que regulam
as respostas imunes inata e adaptativa e têm a capacidade de controlar as
respostas imunes excessivas ou mal direcionadas, incluindo as respostas aos
patógenos ou a antígenos próprios (MALOY & POWRIE, 2001; TRZONSKOWSKI et
al., 2004). No entanto, podem contribuir com o escape do
T. cruzi
do sistema
imunológico do hospedeiro e com o estabelecimento da fase crônica da doença
(SILVA et al., 1992).
Monócitos/ macrófagos em PBMC, de indivíduos com a FI da doença,
são as principais células produtoras de IL-10 (GOMES et al., 2003) e podem estar
envolvidas na regulação da resposta imune na doença de Chagas, que podem
modular a expressão e a função de IL-12 e IFN-γ (BRENER & GAZZINELLI, 1997).
O processo destrutivo nos pacientes portadores da FC poderia, por esta razão,
resultar de uma falha na regulação da resposta Th1 pela IL-10.
Lorena V. M. B.
66
Linfócitos T também estão envolvidos na imunorregulação da doença
de Chagas e são estudados para a diferenciar os pacientes portadores da FI
daqueles que apresentam as formas severas da doença (MENEZES et al., 2004;
VITELLI-AVELAR et al., 2005). Linfócitos T secretam diferente perfil de citocinas
entre as duas formas clínicas cardíaca e indeterminada da doença, exercendo
papel oposto por secretar IL-10 em pacientes chagásicos portadores da FI e, TNF-
α em pacientes com a FC (MENEZES et al., 2004). Segundo os autores, essas
células são importantes na imunorregulação da doença chagásica, sugerindo que
podem ter participação nos mecanismos imunológicos para o controle ou para o
desenvolvimento da patologia.
Além disso, indivíduos com sorologia positiva para a infecção, e sem
alterações eletrocardiográficas e residentes em áreas endêmicas apresentaram
níveis elevados de IL-4, uma outra citocina secretada por células T do tipo 2
(SAMUDIO et al., 1998), sugerindo que as repetidas exposições ao parasito
poderiam influenciar um perfil diferenciado de citocinas. Os resultados do presente
estudo mostraram que não houve produção de IL-4 após estímulo com antígenos
de
T. cruzi
(Tabela 3)
,
estando de acordo com recentes estudos (CUNA et al.,
2000; ABEL et al., 2001; MICHAILOWSKY et al., 2003; LAUCELLA et al., 2004),
onde a seleção de pacientes não ocorreu restritamente a uma área endêmica da
doença. Além disso, apesar da detecção de produção de níveis elevados de IL-10
em sobrenadantes de PBMC de indivíduos chagásicos (FC e FI) após estímulo com
antígenos de
T. cruzi
, sobretudo com FRA (Figura 7), não houve diferença
significativa desta produção quando comparado ao grupo de indivíduos NC.
Lorena V. M. B.
67
Os resultados do presente estudo mostraram que, através da detecção
de citocinas em sobrenadantes de cultura, não foi possível discriminar as formas
clínicas da doença de Chagas utilizando os Ags-Recs. É importante salientar que o
Ag-Epi foi utilizado para uma comparação com respostas obtidas em estudos
anteriores que tinham a mesma proposta de investigação. Nossos dados
discordam com os da literatura onde Ag-Epi foi capaz de induzir a produção de
IFN-γ por pacientes chagásicos portadores da FC, e IL-10 por chagásicos
portadores da FI (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000; GOMES et al., 2003). Assim,
outros fatores poderiam estar envolvidos e interferindo nesta resposta.
7.3. Considerações finais
Os achados descritos por Pereira et al. (2002), onde foi evidenciado um
perfil distinto de citocinas entre os indivíduos das formas FC e FI utilizando os
Ags-Recs CRA e FRA, poderiam ser explicados através de alguns aspectos: o
pequeno número de indivíduos estudados por Pereira et al. (2002) poderia não ser
representativo. Além disso, as diferenças observadas entre nossos resultados e
aqueles apresentados anteriormente podem ser devido à sensibilidade do ELISA
de captura, metodologia utilizada no presente estudo, e ao fato que, na avaliação
das citocinas intracitoplasmáticas através de citometria de fluxo realizado por
esses autores, as citocinas são aprisionadas no interior do citoplasma. Deste
modo, a detecção de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo é mais
representativa (PRUSSIN & METCALFE, 1995). Os resultados encontrados no
Lorena V. M. B.
68
presente trabalho poderiam estar relacionados aos baixos níveis das citocinas nas
culturas e/ou ao consumo por receptores celulares, impedindo sua detecção
através de ELISA (BAROJA & CEUPPENS, 1987).
Uma outra justificativa para a não identificação de um perfil de
secreção de citocinas após estímulo
in vitro
com os Ags-Recs de
T. cruzi
poderia
estar relacionado às diferentes localidades para a realização das pesquisas. O
estudo realizado por Pereira et al. (2002) foi realizado com pacientes do estado de
Minas Gerais e o nosso grupo analisou indivíduos provenientes do estado de
Pernambuco (Tabela 1). Estudos em áreas endêmicas distintas, como foi feito por
Pereira et al. (2002) e por nosso grupo, poderiam identificar distintas respostas
imunológicas já estabelecidas, devido aos diferentes tipos de cepas do parasito.
Uma forte correlação evidenciada entre níveis de anticorpos e a
severidade da doença de Chagas foi estudada (TIBAYRENE et al., 1986; PEREZ-
FUENTES et al., 2003) em pacientes de um estado mexicano. Os autores
concluíram que isto poderia ocorrer em virtude das respostas imunes
naturalmente iniciadas contra clones de
T. cruzi
circulantes da área. Da mesma
forma, Samudio et al.
(1998) ao estudarem indivíduos chagásicos residentes de
áreas endêmicas, com ou sem alterações eletrocardiográficas, sugeriram que a
freqüência de exposição ao parasito poderia influenciar a progressão clínica da
cardiomiopatia chagásica através da expressão diferenciada de citocinas.
Um outro ponto a ser comentado é que, apesar de haver uma
classificação clínica para os indivíduos chagásicos estabelecida pela OMS (WHO,
2002b), sendo esta adotada pelo presente trabalho, estes critérios podem ser
falhos em classificar fidedignamente as formas crônicas da doença. Segundo Dutra
Lorena V. M. B.
69
et al. (2005), a categorização dos pacientes chagásicos é baseada na presença e
severidade dos sintomas e não faz uso de exames refinados, sendo de grande
importância para estudos epidemiológicos, e não necessariamente para estudos
clínicos e imunológicos. Assim, pequenas alterações clínicas podem não terem sido
identificadas pelos exames convencionais utilizados.
Desta forma, os estudos imunológicos que visem o desenvolvimento de
marcadores biológicos devem incluir diferentes metodologias, onde a
sensibilidade, especificidade e desempenho devam ser levados em consideração. A
possibilidade de avaliação de indivíduos residentes em diferentes áreas
endêmicas, onde circulam outras cepas de
T. cruzi,
também é um ponto
importante a ser estudado. Porém, preocupação maior seria o estabelecimento da
utilização de exames clínicos mais sensíveis para categorizar devidamente as
formas clínicas e os níveis de acometimento dos órgãos (coração, esôfago e cólon)
dos pacientes chagásicos.
Lorena V. M. B.
70
8 Conclusões
O ensaio de proliferação de PBMC, bem como a detecção de citocinas
presentes no sobrenadante de cultura, após estímulo
in vitro
com os Ags-Recs,
não foram capazes de distinguir os indivíduos portadores da FC dos indivíduos
portadores da FI, indicando que esses antígenos, nas condições utilizadas, não
induzem a produção de citocinas que pudessem funcionar como marcadores
biológicos da doença de Chagas. Contudo, apesar de o ensaio de proliferação
celular não discriminar as respostas de pacientes chagásicos portadores das
formas clínicas cardíaca e indeterminada, os resultados obtidos podem sugerir que
existam mecanismos imunorreguladores presentes nesses pacientes.
9 Perspectivas
• Estudar o papel imunorregulatório das células T e seus fatores
solúveis na cultura celular entre indivíduos portadores das formas clínicas crônicas
após estímulos
in vitro
com o CRA e FRA.
• Continuar a investigação dos Ags-Recs para o desenvolvimento de
marcadores biológicos das formas clínicas da doença de Chagas através da
avaliação de citocinas intracitoplasmáticas, por citometria de fluxo, em pacientes
chagásicos de diferentes áreas endêmicas, onde circulam cepas de
T. cruzi
de
diferentes biodemas.
Lorena V. M. B.
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Campus da UFPE - Av. Moraes Rego, s/n - Cx. Postal 7472 - Fone: 0XX81 3012500 - Fax: 0XX81 4531911 - CEP: 50670-420
Recife - PE - Brasil - http://www.cpqam.fiocruz.br
81
FIOCRUZ
Ministério da Saúde
Centro de Pesquisas
AGGEU MAGALHÃES
Apêndice A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PACIENTE
Titulo de projeto: Avaliação dos antígenos recombinantes CRA e FRA de
Trypanosoma cruzi
como
marcadores das formas clínicas crônicas da doença de Chagas.
Objetivo: Investigar o potencial dos antígenos recombinantes CRA e FRA como marcadores das formas
clínicas crônicas da doença de Chagas.
Metodologia: Serão coletados 30 a 40mL de sangue por punção venosa no antebraço, através de um
tubo vacuntainer estéril contendo anticoagulante. O sangue será cultivado e avaliado quanto a
proliferação celular e dosagens de citocinas, quando estimulado com os antígenos acima citados.
Riscos: Todo o procedimento para coleta de sangue será realizado com material estéril descartável,
podendo ser considerado um procedimento isento de riscos.
Benefícios: Os antígenos CRA e FRA funcionando como marcadores das formas clinicas da doença será
de grande auxílio para direcionar a conduta médica relacionada ao tratamento do paciente.
Desta forma, eu _________________________________________________________
RG nº_______________________________expedido por________________________
Abaixo assinado, atesto que entendi o conteúdo deste consentimento informado e concordo de livre e
espontânea vontade participar desse estudo. E que esclareci todas as minhas dúvidas com o médico (a)
responsável pela avaliação clínica.
_______________________________________ Data:___/___/___
Assinatura do Paciente
_______________________________________ Data:___/___/___
Testemunha
_______________________________________ Data:___/___/___
Assinatura do médico responsável
Responsáveis pelo projeto:
Dra. Yara de Miranda Gomes
Pesquisadora Titular do departamento de Imuniologia do CPqAM/FIOCRUZ
Telefone para contato: 2101-2559
Virginia Maria Barros de Lorena
Mestranda do Curso em Saúde Pública do CPqAM/FIOCRUZ
Telefone para contato: 2101-2559 e 2101-2566
11
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82
FIOCRUZ
Ministério da Saúde
Centro de Pesquisas
AGGEU MAGALHÃES
Apêndice B - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA VOLUNTÁRIO
Titulo de projeto: Avaliação dos antígenos recombinantes CRA e FRA de
Trypanosoma cruzi
como
marcadores das formas clínicas crônicas da doença de Chagas.
Objetivo: Investigar o potencial dos antígenos recombinantes CRA e FRA como marcadores das formas
clínicas crônicas da doença de Chagas.
Metodologia: Serão coletados 30 a 40mL de sangue por punção venosa no antebraço, através de um
tubo vacuntainer estéril contendo anticoagulante. O sangue será cultivado e avaliado quanto a
proliferação celular e dosagens de citocinas , quando estimulado com os antígenos acima citados.
Riscos: Todo o procedimento para coleta de sangue será realizado com material estéril descartável,
podendo ser considerado um procedimento isento de riscos.
Benefícios: Os antígenos CRA e FRA funcionando como marcadores das formas clinicas da doença será
de grande auxílio para direcionar a conduta médica relacionada ao tratamento do paciente.
Desta forma, eu _________________________________________________________
RG nº_______________________________expedido por________________________
Abaixo assinado, atesto que entendi o conteúdo deste consentimento informado e concordo de livre e
espontânea vontade participar desse estudo como voluntário e que esclareci todas as minhas dúvidas com
os responsáveis pelo projeto.
_______________________________________ Data:___/___/___
Assinatura do voluntário
_______________________________________ Data:___/___/___
Testemunha
_______________________________________ Data:___/___/___
Assinatura do médico responsável
Responsáveis pelo projeto:
Dra. Yara de Miranda Gomes
Pesquisadora Titular do departamento de Imuniologia do CPqAM/FIOCRUZ
Telefone para contato: 2101-2559
Virginia Maria Barros de Lorena
Mestranda do Curso em saúde Pública do CPqAM/FIOCRUZ
Telefone para contato: 2101-2559 e 2101-2566
Campus da UFPE - Av. Moraes Rego, s/n - Cx. Postal 7472 - Fone: 0XX81 3012500 - Fax: 0XX81 4531911 - CEP: 50670-420
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83
FIOCRUZ
Ministério da Saúde
Centro de Pesquisas
AGGEU MAGALHÃES
Apêndice C – Formulário de pesquisa
1. Nome: _______________________________________________________________________
Prontuário HUOC n°:________________________ Registro CPqAM: ____________________
Data da coleta:_______________ Amostra para: ( ) Alinne ( ) Virginia ( ) Dra Glória
2. Sexo: (1) Feminino (2) Masculino
3. Idade: _____ (1) De 0 a 12 anos
(2) De 13 a 19 anos
(3) De 20 a 59 anos
(4) A partir de 60 anos
(9) IGN
Endereço: ______________________________________________________________________
Bairro:______________________________Município:_________________________Estado:____
Telefone: (__) - ______________ Celular: (__) - ______________
5. Município de nascimento: __________________________________________ 6. Estado: ____
6. Forma de contaminação: (1) Vetorial
(2) Transfusional
(3) Congênita
(4) Oral
(5) Transplante de órgão
(6) Acidente de laboratório
(9) IGN
7. Exames clínicos convencionais:
RX coração: (1) normal (2) dilatação
ECG: (1) normal (2) anormal
RX esôfago (1) normal (2) dilatação
9. Forma clínica crônica: (1) Forma cardíaca
(2) Forma digestiva
(3) Forma indeterminada
(4) Forma mista
10. Medicação: (1) Sim - ano:_____ (2) Não
4. Situação trabalhista: (1) Empregado
(2) Desempregado
(3) Aposentado
(4) Do lar
(5) INSS
(9) IGN
8. Sorol
ogia
:
IFI: (1) positivo (2) negativo
HAI: (1) positivo (2) negativo
ELISA: (1) positivo (2) negativo
Lorena V. M. B.
84
Apêndice D – Artigo em preparação
Resposta Imune Celular de Indivíduos Chagásicos frente a C
ytoplasmic
Repetitive Antigen e Flagellar Repetitive Antigen
de
Trypanosoma cruzi
Lorena VMB¹, Verçosa AFA¹, Machado RCA¹, Silva L.M¹, Melo MFAD¹, Carvalho
CL¹, Modesto T¹, Cavalcanti MGA
2
, Silva ED
3
, Ferreira AGP
3
, Correa-Oliveira R
4
,
Pereira VRA¹, Gomes YM¹
1
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães-CPqAM/Fiocruz, Recife-PE,
2
Hospital
Oswaldo Cruz – HUOC/Universidade de Pernambuco/UPE, Recife-PE,
3
Bio-
Manguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro-RJ,
4
Centro de Pesquisas René Rachou-
CPqRR/Fiocruz, Belo Horizonte, MG.
Correspondência para: Yara M. Gomes, Departamento de Imunologia, Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, Av. Moraes Rego s/n, Cidade
Universitária, 50670-420, Recife, PE, Brazil. Fax: 55-81-34532449, Phone: 55-81-
2101-2559. email: yara@cpqam.fiocruz.br
Abstract
Several studies have demonstrated that different clinical manifestations of human
Chagas' disease are associated with distinct and complex host-parasite
relationships directly involving the immune system. Given this, we propose to
analyze the relation between the cellular immune response of Chagas patients,
after stimulaton
in vitro
of PBMC (peripheral blood mononuclear cells) with the
recombinant antigens CRA (Cytoplasmatic Repetitive Antigen) or FRA (Flagellar
Repetitive Antigen) of Trypanosoma
cruzi,
and the chronic clinical forms of
Chagas’ disease. Seventeen patients with the cardiac form (CF) and 19 with the
indeterminate form (IF) participated in this study. One group of 19 healthy
individuals was included as a control group. The PBMC were isolated by
Lorena V. M. B.
85
centrifugation using the Ficoll-Paque density gradient. The cells were stimulated
using Phytohemaglutinin, Concanavalin, CRA, FRA or a soluble antigen of
Epimastigota (Ag-Epi) for 24h, 72h or 6 days. The proliferation of cells was
evaluated after 6 days of culture by quantification of incorporated
3
H-timidine.
Cytokines were measured in the supernatants obtained after 24h (TNF-α e IL-4),
72h (IL-10) and 6 days (IFN-γ) using ELISA. Although they do not show the ability
to differentiate the clinical forms of Chagas’ disease using cellular proliferation and
detection of cytokines in culture supernatants, the recombinant antigens could be
used in studies of the pathology of the Chagas’ disease, investigating possible
mechanisms that regulate parasite-specific lymphocyte responses. Moreover,
these antigens could be used in further studies that aim to discover prognostic
markers of the evolution of severe clinical forms of Chagas’ disease by evaluating
intracytoplasmic cytokines using flow cytometry.
Keywords: Chagas’ disease, Cytokines, Recombinant antigens
RESUMO
Diversos estudos têm demonstrado que as diferentes manifestações clínicas da
doença de Chagas humana estão associadas com as distintas e complexas
relações parasito-hospedeiro que envolvem diretamente o sistema imune. Nesse
contexto, nos propomos analisar a relação entre a resposta imune celular de
pacientes chagásicos, após estímulo
in vitro
de PBMC
com os antígenos
recombinantes CRA (
Cytoplasmatic Repetitive Antigen)
ou FRA (
Flagellar
Repetitive Antigen
) de
T. cruzi,
e as formas clínicas crônicas da doença de Chagas.
Dezessete portadores da forma cardíaca (FC) e 19 da forma indeterminada (FI)
participaram deste estudo. Um grupo de 19 indivíduos não infectados (NC) foi
incluído como um grupo controle. PBMC foram estimuladas com CRA, FRA ou com
antígeno solúvel de Epimastigota (Ag-Epi) por 24h, 72h ou 6 dias. A proliferação
celular foi avaliada após estímulo por 6 dias de cultivo através da quantificação de
3
H-timidina incorporada. As citocinas foram detectadas em sobrenandantes de
cultura obtidos após 24h (TNF-α e IL-4), 72h (IL-10) e 6 dias (IFN-γ) através de
ELISA de captura. Apesar de não apresentarem a capacidade de diferenciar as
Lorena V. M. B.
86
formas clínicas da doença de Chagas através do ensaio de linfoproliferação e da
detecção de citocinas de sobrenadante de cultura, os antígenos poderiam ser
utilizados em estudos sobre a imunopatogênese da doença, investigando papéis
imunorregulatórios antígeno-específicos. Além disso, esses antígenos poderiam
dar continuidade ao desenvolvimento de marcadores de evolução de prognóstico
das formas clínicas severas da doença de Chagas através da avaliação de citocinas
intracitoplasmáticas por citometria de fluxo.
Palavras-chave: Doença de Chagas, Citocinas, Antígenos recombinantes
Introdução
Diversos trabalhos têm demonstrado o envolvimento da imunidade
celular em todas as formas clínicas da doença de Chagas. No entanto, a patogenia
das lesões que levam às formas severas da doença ainda é desconhecida. Estudos
sugerem que a resposta imune do indivíduo contra o parasito contribui para a
evolução da doença (DUTRA et al, 1994; GOMES et al, 2003; BARROS-MAZON et
al., 2004). Neste contexto, o possível papel dos mecanismos imunes para o
desenvolvimento das formas clínicas severas da doença de Chagas tem sido
avaliado. Assim, vários grupos de pesquisa têm buscado um padrão de resposta
imune entre os indivíduos chagásicos portadores das diferentes formas clínicas.
Ensaios de proliferação celular, utilizando células mononucleares de
sangue periférico (PBMC), foram realizados entre os pacientes chagásicos após
estímulos com antígenos complexos de formas epimastigotas e tripomastigotas ou
frações celulares do
T. cruzi.
Diferenças na intensidade da resposta proliferativa
entre a FI e as formas sintomáticas foram reportadas, sugerindo que este padrão
de reatividade imune poderia estar envolvido na patogenia das lesões tissulares na
doença de Chagas (DE TITTO et al. 1985; CETRON et al. 1993; BARROS-MAZON
et al. 2004). Porém, outros estudos não encontraram diferenças nas respostas
proliferativas entre os pacientes assintomátiocos e aqueles portadores das formas
sintomáticas (MORATO et al., 1986; GAZZINELLI et al., 1990; MICHAILOWSKY et
al., 2003).
Lorena V. M. B.
87
Abordagens para a investigação de padrões de secreção de citocinas
em PBMC de pacientes chagásicos têm sido realizadas utilizando antígenos
complexos de
T. cruzi
. Esses trabalhos demonstraram que a IL-10 é a citocina
secretada por pacientes na FI. Já os pacientes com a FC têm maiores níveis de
IFN-γ (BAHIA-OLIVEIRA et al, 1998; CORREA-OLIVEIRA et al., 1999; GOMES et
al., 2003).
Além disso, os elevados níveis de IFN-γ estão correlacionados com o
nível de severidade do envolvimento cardíaco, sugerindo que esta citocina poderia
estar envolvida com a evolução da FC. Por outro lado, a IL-10 poderia estar
associada com a proteção do hospedeiro na FI contra o desenvolvimento das
formas crônicas sintomáticas (GOMES et al., 2003). Diante desses achados, é
oportuno especular que pacientes na FI que são capazes de manter baixos níveis
de IFN-γ e altos níveis de IL-10 poderiam não desenvolver a doença cardíaca.
Essa proposta de que o dano tissular poderia ser mais severo na
ausência de mecanismos regulatórios que envolvessem as respostas imunológicas
entusiamou as pesquisas na área da imunologia básica. A ausência da molécula
co-estimulatória CD28 em linfócitos T foi estudada por Menezes et al. (2004),
mostrando que essas células, em indivíduos FI, tem papel protetor. Já em
indivíduos com a FC podem estar relacionadas com o dano cardíaco.
Nessa
mesma linha de investigação, foi demonstrado que pacientes chagásicos
portadores da FI possuem células T regulatórias, que poderiam ser capazes de
controlar a atividade citotóxica deletéria por inibir a ativação de células T CD8+
HLA-DR+ (VITELLI-AVELAR et al., 2005).
Em contraposição a esses estudos, Laucella et al. (2004) ao analisarem
as respostas de células T CD8+ específicas a peptídeos (derivados de amastigotas
e tripomastigotas) e lisado (de formas amastigotas) de
T. cruzi
em PBMC de
pacientes chagásicos com a FI e com diferentes níveis de acometimento cardíaco,
mostraram que pacientes com a forma mais severa da doença cardíaca
apresentaram baixos níveis de IFN-γ quando comparados aos indivíduos com a FI.
A utilização de materiais definidos do parasito é claramente um
requisito não apenas para o desenvolvimento de testes sorológicos e
screening
em
Lorena V. M. B.
88
bancos de sangue, mas também para a identificação de moléculas importantes na
interação parasito-hospedeiro e nos estudos para o entendimento da
imunopatologia da doença de Chagas (LORCA et al., 1992). Assim, antígenos
específicos do
T. cruzi
poderiam ter bom desempenho na discriminação das
formas clínicas crônicas da doença de Chagas.
Poucos estudos foram realizados com antígenos purificados do parasito.
Estudo recente mostrou que PBMC de indivíduos chagásicos após estímulo
in vitro
com PFR, antígenos derivado da porção flagelar do parasito, secretavam altos
níveis de IFN-γ e TNF-α, porém, nenhuma diferença foi encontrada entre os
indivíduos FC e FI (MICHAILOWSKY et al., 2003). Uma resposta predominante de
IFN-γ foi relatada em pacientes portadores de cardiomiopatia quando PBMC foram
estimuladas com trans-sialidase (RIBEIRÃO et al., 2000), com a proteína
recombinante B13 de
T. cruzi
(ABEL et al., 2001) e com subfrações purificadas de
antígeno de tripomastigotas (CUNA et al., 2000) . Um outro trabalho, realizado por
Arnholdt et al. (1993), também evidenciou a produção de IFN-γ por linhagens de
células T após estímulo com cruzipaína.
Dois antígenos recombinantes (Ags-Recs) foram utilizados com sucesso
no imunodiagnóstico da doença de Chagas (GOLDENBERG, 1991; KRIEGER et al.,
1992; GOMES et al, 2001; GADELHA et al., 2003). Os Ags-Recs também foram
utilizados para avaliar a cura da doença de Chagas em pacientes de Minas Gerais
que foram tratados na fase aguda da infecção (SILVA et al., 2002) Em função de
suas estruturas e localização, esses antígenos foram denominados de CRA
(
Cytoplasmic Repetitive Antigen
ou antígeno citoplasmático repetitivo), presente
nas formas epimastigotas e amastigotas, e FRA (
Flagellar Repetitive Antigen
ou
antígeno flagelar repetitivo), presente nas formas epimastigotas e tripomastigotas
do
T. cruzi
(LAFAILLE et al. 1989; KRIEGER et al., 1992).
Os Ags-Recs foram avaliados em protocolos de imunizações em
camundongos isogênicos mostrando serem capazes de induzir respostas imune
humoral e celular (PEREIRA et al., 2003a; 2003b; 2004; 2005). Além disso, em um
estudo piloto realizado por Pereira et al. (2002) CRA e FRA foram capazes de
induzir a produção de citocinas, avaliadas através de citometria de fluxo, por
Lorena V. M. B.
89
PBMC de indivíduos chagásicos. FRA estimulou PBMC de pacientes com a FC a
produzirem IFN-γ e TNF-α e, CRA estimulou a produção de IL-10 por indivíduos
portadores da FI da doença, sugerindo que os Ags-Recs, juntos, poderiam
identificar distintos perfis de citocinas entre os indivíduos portadores das
diferentes formas clínicas da doença.
Considerando a importância da resposta imune contra os antígenos do
parasito evidenciada pela produção de anticorpos específicos contra CRA ou FRA
por indivíduos chagásicos, e o potencial valor prognóstico dos Ags-Recs mostrado
por Pereira et al (2002), nos propomos a avaliar a resposta imune celular
específica de indivíduos chagásicos a esses antígenos e correlacioná-la com a
presença das formas clínicas da doença.
Metodologia
Antígenos de
T. cruzi
Os Ags-Recs CRA e FRA, obtidos como descrito por Krieger et al. (1992), foram
preparados no Departamento de Reativos para Diagnóstico de Bio-Manguinhos e
enviados para o Laboratório de Imunoparasitologia do CPqAM/Fiocruz. O antígeno
solúvel de epimastigota (Ag-Epi) da cepa Y de
T. cruzi
, obtido segundo Pereira et
al. (1997), foi utilizado a partir do descongelamento de alíquotas armazenadas no
Laboratório de Imunoparasitologia do CPqAM/ Fiocruz.
População do estudo
Trinta e seis pacientes chagásicos portadores das formas crônicas chagásicas
foram selecionados no Ambulatório de Doença de Chagas do Hospital Universitário
Osvaldo Cruz – HUOC, na Universidade de Pernambuco – UPE. A seleção dos
indivíduos chagásicos foi baseada no preenchimento de 3 critérios: 1) realização
dos exames clínicos para a caracterização das formas clínicas; 2) sorologia positiva
para a infecção chagásica (dois testes com princípios metodológicos ou
preparações antigênicas diferentes); e 3) não ter sido submetido ao tratamento
etiológico. Para esta caracterização foram realizadas análises clínicas e
laboratoriais: exame físico, sorologia para a infecção pelo
T. cruzi
(ELISA e/ou
Lorena V. M. B.
90
hemaglutinação indireta e/ou imunofluorescência indireta), raio-X de tórax, raio-X
de esôfago e eletrocardiograma. Os indivíduos portadores da FC (n=19) foram
selecionados por apresentarem alteração no eletrocardiograma e/ou dilatação do
coração, ausência de dilatação do esôfago, ausência de queixas digestivas
(entalos e constipação) e sorologia positiva para infecção pelo
T. cruzi
. Os
indivíduos portadores da FI (n=17) foram selecionados por não apresentarem
quaisquer alterações cardíacas e digestivas, mas com sorologia positiva para
infecção pelo
T. cruzi
.
Um grupo de indivíduos voluntários não chagásicos (NC)
(n=19) foi composto para comparação com indivíduos chagásicos através do
preenchimento de 3 critérios: 1) nunca ter habitado em área endêmica para a
doença de Chagas; 2) nunca ter recebido transfusão de sangue; e 3) ter
apresentado testes sorológicos negativos para a doença de Chagas. As
abordagens utilizadas no presente estudo foram aprovadas pelo Comitê de Ética
do CPqAM/ Fiocruz. Todos os indivíduos que participaram do estudo assinaram o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido por escrito.
Obtenção das Células Mononucleares do Sangue Periférico
De 30 a 40mL de sangue heparinizado foi misturado a PBS pH 7,2 (1:2) e
adicionado a tubos contendo Ficoll-hypaque (1:3 da mistura sangue-PBS). Em
seguida, os tubos foram submetidos a uma centrifugação (900 x g por 40 min. a
20° C) onde o anel de PBMC foi removido. As células foram lavadas duas vezes
por centrifugação (400 x g por 10 min. a 20° C) em meio RPMI 1640. Ao fim das
lavagens, as células foram contadas em câmara de Neubauer através do corante
de vitalidade Azul de Trypan e ajustadas para as concentrações desejadas
adicionando meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal (SBF).
Ensaio de proliferação celular
As suspensões celulares (2x10
5
células/poço) foram depositadas em placas de
cultura de 96 poços e estimuladas com Fitohemaglutinina-PHA (2,5µg/mL),
Concanavalina-ConA (2,5µg/mL) e Ags-Recs CRA ou FRA (2µg/mL). Suspensões
celulares sem nenhum estímulo foram usadas como controle negativo. O volume
Lorena V. M. B.
91
total foi 200µL por poço. As placas foram levadas à estufa (37ºC/5% CO
2
) por 6
dias. Dezesseis horas antes do fim do tempo de incubação, 0,5µCi de
3
H-timidina/
poço foi adicionada. O material da cultura celular foi coletado através do coletor
semi-automático de células e depositado em papel de fibra de vidro. A
incorporação de
3
H-timidina foi quantificada através das radiações β emitidas
expressas em contagem por minuto (CPM). O índice de estimulação (IE) foi
calculado dividindo-se a média da CPM das culturas estimuladas pela média da
CPM das culturas sem estímulo.
Avaliação das citocinas de sobrenadante de cultura
Suspensões celulares (5 x 10
5
células/ poço) foram depositadas em placas de
cultura de fundo plano de 48 poços e estimuladas com PHA (10µg/mL), ConA
(2,5µg/mL) e Ags-Recs CRA ou FRA (2µg/mL). Suspensões celulares sem nenhum
estímulo, foram usadas como controle negativo. O volume total foi 500µL por
poço. As placas foram incubadas (37ºC/5% CO
2
) por diferentes períodos (24
horas, 72 horas e 6 dias). As alíquotas de sobrenadante foram devidamente
identificadas e estocadas imediatamente a -70°C. As citocinas foram determinadas
através de ELISA de captura. Placas de microtitulação de 96 poços sensibilizadas
com os anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas (TNF-α=2µg/mL, IL-
4=2µg/mL, IL-10=µg/mL, e IFN-γ=0,5µg/mL) e incubadas
overnight
a 4°C. O
sobrenadante de cultura (50µL/poço), bem como os padrões (citocinas
recombinantes) foram adicionados em duplicata e incubados
overnight
a 4°C. Os
padrões foram obtidos através de diluição seriada com fator 2 a partir das
concentrações iniciais: TNF-α=2.000 pg/mL; IL-4=8.000 pg/mL; IL-10=8.000
pg/mL; IFN-γ=16.000 pg/mL em RPMI 1640 2% SBF. Os anticorpos monoclonais
anti-citocinas conjugados à biotina (TNF-α=100ng/mL; IL-4=12,5ng/mL; IL-
10=500ng/mL e IFN-γ=125ng/mL) foram adicionados por 2h à TA e em seguida, a
streptavidina-peroxidase (1:10.000) foi adicionada por 1,5h à TA. Os
imunocomplexos foram detectados utilizando 50µl da solução reveladora (H
2
O
2
e
ABTS) durante 15 min a 35 min à TA. A reação foi bloqueada com ácido cítrico
0,2M e a leitura foi realizada no espectofotômetro a 405nm.
Lorena V. M. B.
92
Análise estatística
Foi realizada uma análise descritiva para expor os resultados obtidos. Para testar a
suposição de normalidade dos dados foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov.
Para verificar a existência de diferenças entre os estímulos e a cultura sem
estímulo dentro de cada grupo estudado foi utilizado o teste Wilcoxon para
amostras pareadas. Para comparar a diferença de médias entre os grupos foi
utilizado o teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Mann-Whitney, quando
existiu diferença entre médias. Todas as conclusões foram tomadas ao nível de
significância de 5%. Os softwares utilizados foram o Excel 2000 e o Statistical
Package for Social Sciences Incorporation 13.0.
Resultados e Discussão
Vários estudos têm sugerido uma participação efetiva da imunidade
celular na patologia da doença de Chagas, sobretudo na cardiopatia chagásica. De
fato, as células T compreendem quase a totalidade das células presentes nos
infiltrados inflamatórios de pacientes com miocardiopatia (REIS et al., 1993;
HIGUCHI et al., 1997). Desta forma, a habilidade das células T na reatividade
contra o parasito e seus antígenos tem sido demonstrada, encorajando trabalhos
que caracterizassem fenotipicamente e funcionalmente essas células com o intuito
de investigar seus papéis no estabelecimento das respostas patológicas
(indivíduos portadores das formas severas) ou protetoras (indivíduos da forma
indeterminada) (DUTRA et al., 2005).
Da avaliação dessas características imunológicas, poderia surgir o
desenvolvimento de um marcador de evolução de prognóstico das formas clínicas
severas. A utilização de marcadores biológicos identificaria antecipadamente a
evolução das formas clínicas da doença de Chagas, auxiliando no
redirecionamento da conduta terapêutica pelos médicos. Nesse sentido, muitos
estudos foram propostos (GOMES et al., 2003; MICHAILOWSKY et al., 2003;
BARROS-MAZON et al., 2004; LAUCELLA et al., 2004).
Lorena V. M. B.
93
O ensaio de proliferação celular mostrou que a imunidade celular está
bem preservada entre os indivíduos chagásicos, já que a resposta linfoproliferativa
dos linfócitos aos mitógenos PHA e ConA foi similar a dos indivíduos NC
Apesar de evidenciada uma resposta proliferativa contra os Ags-Recs
nos indivíduos chagásicos, quando comparada com o grupo de indivíduos NC, essa
resposta dos pacientes poderia ser considerada bastante baixa (Figura 1). Muitos
trabalhos que investigam a resposta proliferativa consideram positivas as
respostas com IE igual ou acima de 2 ou de 3 (DE TITTO et al., 1985;
MICHAILOWSKY et al., 2003).
Morato et al. (1986) identificaram que 30% dos indivíduos chagásicos
da FI e 33,3% da FC apresentaram baixa responsividade a seis antígenos
derivados de diferentes cepas e clones de
T. cruzi
. A diminuição da resposta
linfoproliferativa também foi relatada em um estudo longitudinal da resposta
imune feito por Mosca et al. (1985), onde níveis de parasitemia (avaliada através
de xenodiagnóstico artificial) estavam correlacionados com diminuição da
proliferação celular em indivíduos com a FI, sugerindo que, em pacientes com a
FC, um mecanismo modulatório poderia ter sido perdido. Além disso, pacientes
curados mostraram altas respostas proliferativas em comparação com os
indivíduos não-curados após estímulo com antígeno solúvel de epimastigota e/ ou
tripomastigota (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000). Segundo os autores, uma possível
explicação para este fato, é um número maior de células T de memória em
pacientes que foram submetidos ao tratamento e considerados curados.
Estudos têm demonstrado que vários fatores poderiam interferir nessa
supressão linfocitária. Proliferação celular, decorrente da ativação de antígeno
solúvel de tripomastigota, foi significativamente maior em indivíduos chagásicos
(tanto portadores da FC, quanto da FI) e não em indivíduos NC, quando as
culturas foram tratadas com indometacina, um inibidor da síntese de
prostaglandinas (BARROS-MAZON et al., 2004), indicando que as respostas
celulares de pacientes chagásicos são reguladas negativamente por
prostaglandinas. Além disso, as prostaglandinas podem induzir a diminuição dos
Lorena V. M. B.
94
níveis de IL-2 e de seu receptor (RINCON et al., 1988), contribuindo para a
inibição da proliferação celular.
Macrófagos e/ou células dendríticas sintetizam citocinas ou mediadores
solúveis, como os intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio, que podem
aumentar ou suprimir as respostas proliferativas (SCHLEIFER & MANSFILED,
1993; PINGE FILHO et al., 1999). A IL-10 é sintetizada por macrófagos, entre
outras células, e é considerada uma potente supressora das respostas
proliferativas de linfócitos (DE WALL MALEFYT et al., 1993).
De forma geral, há poucas informações sobre os mecanismos que
regulam as respostas linfocitárias parasito-específicas em pacientes chagásicos. A
proliferação celular, após estímulos com os Ags-Recs, poderia ser investigada com
relação ao papel imunorregulatório das células T e seus fatores solúveis na cultura
celular entre indivíduos portadores das formas severas da doença e portadores da
FI.
Com relação à produção de citocinas, estudos em pacientes cardíacos
têm revelado uma resposta imune do tipo 1, com produção elevada de TNF-α e
IFN-γ. Cunha-Neto et al. (1998) estudaram a produção de citocinas em
sobrenadantes de cultura de células T obtidas de biópsias de coração de 8
pacientes com a FC. Os resultados mostraram que as células de 7/8 biópsias
produziram IFN-γ, 6/8 produziram TNF-α e 3/8 produziram IL-10. IL-4 e IL-12 não
foram detectadas. A presença de IFN-γ e TNF-α, na ausência de IL-4, indica um
padrão de resposta inflamatória do tipo 1 em indivíduos portadores da
cardiomiopatia chagásica. Apesar de um número bastante pequeno de indivíduos
estudados por Cunha-Neto et al. (1998), essa predominância de TNF-α e IFN-γ
está em concordância com outros estudos anteriores (REIS et al., 1993; REIS et
al., 1997). Além disso, TNF-α tem sido demonstrada por modular a expressão de
moléculas de adesão, participando, desta forma, dos processos inflamatórios por
recrutar linfócitos ao sítio de inflamação e contribuindo com a progressão da
reação inflamatória local na cardiopatia chagásica (BACHMAIER et al., 1997).
Apesar de alguns estudos mostrarem que os indivíduos com a FI da
doença produzem níveis elevados de IFN-γ por PBMC (GOMES et al., 2003;
Lorena V. M. B.
95
LAUCELLA et al., 2004), além de outras citocinas inflamatórias, está claro que IFN-
γ está relacionada com a FC da doença. Elevados níveis de IFN-γ têm sido
associados com a severidade da doença cardíaca em indivíduos chagásicos
crônicos (DUTRA et al., 1997; GOMES et al., 2003; BARROS-MAZON et al., 2004),
provavelmente por uma exacerbação da resposta imune, particularmente nas
fibras cardíacas, promovendo a destruição dessas células. Por outro lado, também
existe uma correlação positiva entre os níveis da citocina e a cura parasitológica
da doença de Chagas, quando o tratamento foi feito na fase aguda da doença,
sugerindo que IFN-γ poderia estar agindo sinergicamente com a quimioterapia
durante o início da doença, apresentando um papel protetor contra o parasito
(BAHIA-OLIVEIRA et al., 1998; 2000).
Se células T do tipo 1 são relatadas por estarem envolvidas com a
severidade da doença de Chagas, seria esperado que PBMC de pacientes com a
FC produzissem níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias quando estimuladas
pelos antígenos de
T. cruzi
(CRA, FRA e Ag-Epi). No presente estudo, altos níveis
de TNF-α e IFN-γ foram detectados em indivíduos chagásicos após estímulo de
PBMC com CRA e com Ag-Epi. Porém, ao contrário da literatura relatada, não foi
identificada a presença de maiores níveis em pacientes com a FC da doença de
Chagas, quando comparados aos indivíduos da FI (Figuras 2 e 3).
É importante salientar que, por se tratar de um estudo com humanos,
apesar de categorizado clinicamente, são grupos extremamente heterogêneos. Os
pacientes têm idades diferentes e certamente apresentam respostas imunológicas
distintas de acordo com seus estágios de infecção (DUTRA et al., 1997). Nesse
sentido, Gomes et al. (2003), ao estudarem a produção de IFN-γ, dividiram o
grupo de pacientes com alterações cardíacas de acordo com a severidade da
doença através de exames clínicos mais sensíveis. Desta forma, foi possível
estabelecer uma correlação entre “altos” e “baixos” produtores de IFN-γ e o
estado clínico do paciente.
Com relação aos indivíduos portadores da FI da doença, estes têm sido
identificados por apresentarem uma resposta do tipo 2, com secreção elevada de
Lorena V. M. B.
96
IL-10 (GOMES et al., 2003), sugerindo, assim, uma proteção imunológica para o
desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica.
De fato, citocinas imunorreguladoras (IL-10, IL-4 e TGF-β) são
importantes por controlar a infecção pelo
T. cruzi
(SILVA et al., 1992). As células
T regulatórias têm sido descritas como uma população de células T que regulam
as respostas imunes inata e adaptativa e têm a capacidade de controlar as
respostas imunes excessivas ou mal direcionadas, incluindo as respostas aos
patógenos ou a antígenos próprios (MALOY & POWRIE, 2001; TRZONSKOWSKI et
al., 2004). No entanto, podem contribuir com o escape do
T. cruzi
do sistema
imunológico do hospedeiro e com o estabelecimento da fase crônica da doença
(SILVA et al., 1992).
Monócitos/ macrófagos em PBMC, de indivíduos com a FI da doença,
são as principais células produtoras de IL-10 (GOMES et al., 2003) e podem estar
envolvidas na regulação da resposta imune na doença de Chagas, que podem
modular a expressão e a função de IL-12 e IFN-γ (BRENER & GAZZINELLI, 1997).
O processo destrutivo nos pacientes com a FC poderia, por esta razão, resultar de
uma falha na regulação da resposta Th1 pela IL-10.
Linfócitos T também estão envolvidos na imunorregulação da doença
de Chagas e são estudados para a diferenciar os pacientes assintomáticos
daqueles que apresentam as formas severas da doença (MENEZES et al., 2004;
VITELLI-AVELAR et al., 2005). Linfócitos T secretam diferente perfil de citocinas
entre as duas formas clínica cardíaca e assintomática da doença, exercendo papel
oposto por secretar IL-10 em pacientes com FI e, TNF-α em pacientes com a FC
(MENEZES et al., 2004). Segundo os autores, essas células são importantes na
imunorregulação da doença chagásica, sugerindo que podem ter participação nos
mecanismos imunológicos para o controle ou para o desenvolvimento da
patologia.
Além disso, indivíduos com sorologia positiva para a infecção, e sem
alterações eletrocardiográficas e residentes em áreas endêmicas apresentaram
níveis elevados de IL-4, uma outra citocina secretada por células T do tipo 2
(SAMUDIO et al., 1998), sugerindo que as repetidas exposições ao parasito
Lorena V. M. B.
97
poderiam influenciar um perfil diferenciado de citocinas. Os resultados do presente
estudo mostraram que não houve produção de IL-4 após estímulo com antígenos
de
T. cruzi,
estando de acordo com recentes estudos (CUNA et al., 2000; ABEL et
al., 2001; MICHAILOWSKY et al., 2003; LAUCELLA et al., 2004), onde a seleção de
pacientes não ocorreu restritamente a uma área endêmica da doença. Além disso,
apesar da detecção de produção de níveis elevados de IL-10 em sobrenadantes de
PBMC de indivíduos chagásicos (FC e FI) após estímulo com antígenos de
T. cruzi
,
sobretudo com FRA (Figura 4), não houve diferença significativa desta produção
com o grupo de indivíduos NC.
Os resultados do presente estudo mostraram que, através da detecção
de citocinas em sobrenadantes de cultura, não foi possível discriminar as formas
clínicas da doença de Chagas utilizando os Ags-Recs. É importante salientar que o
Ag-Epi foi utilizado para uma comparação com respostas obtidas em estudos
anteriores que tinham a mesma proposta de investigação. Nossos dados
discordam com os da literatura onde Ag-Epi foi capaz de induzir a produção de
IFN-γ por indivíduos FC, e IL-10 por chagásicos com a FI (BAHIA-OLIVEIRA et al.,
2000; GOMES et al., 2003). Assim, outros fatores poderiam estar envolvidos e
interferindo nesta resposta.
Os achados descritos por Pereira et al. (2002), onde foi evidenciado um
perfil distinto de citocinas entre os indivíduos das formas FC e FI utilizando os
Ags-Recs CRA e FRA, poderiam ser explicados através de alguns aspectos: o
pequeno número de indivíduos estudados por Pereira et al. (2002) poderia não ser
representativo. Além disso, as diferenças observadas entre nossos resultados e
aqueles apresentados anteriormente podem ser devido à sensibilidade do ELISA
de captura, metodologia utilizada no presente estudo, e ao fato que, na avaliação
das citocinas intracitoplasmáticas através de citomentria de fluxo realizado por
esses autores, as citocinas são aprisionadas no interior do citoplasma. Deste
modo, a detecção de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo é mais
representativa (PRUSSIN & METCALFE, 1995). Os resultados encontrados no
presente trabalho poderiam estar relacionados aos baixos níveis das citocinas nas
Lorena V. M. B.
98
culturas e/ou ao consumo por receptores celulares, impedindo sua detecção
através de ELISA (BAROJA & CEUPPENS, 1987).
Uma outra justificativa para a não identificação de um perfil de
secreção de citocinas após estímulo
in vitro
com os Ags-Recs de
T. cruzi
poderia
estar relacionado aos diferentes localidades para a realização das pesquisas. O
estudo realizado por Pereira et al. (2002) foi realizado com pacientes do Estado de
Minas Gerais e o nosso grupo analisou indivíduos provenientes do Estado de
Pernambuco (Tabela 1). Estudos em áreas endêmicas distintas, como foi feito por
Pereira et al. (2002) e por nosso grupo, poderiam identificar distintas respostas
imunológicas já estabelecidas, devido aos diferentes tipos de cepas do parasito.
Uma forte correlação evidenciada entre níveis de anticorpos e a
severidade da doença de Chagas foi estudada (TIBAYRENE et al., 1986; PEREZ-
FUENTES et al., 2003) em pacientes de um Estado mexicano. Os autores
concluíram que isto poderia ocorrer em virtude das respostas imunes
naturalmente iniciadas contra clones de
T. cruzi
circulantes da área. Da mesma
forma, Samudio et al.
(1998) ao estudarem indivíduos chagásicos residentes de
áreas endêmicas, com ou sem alterações eletrocardiográficas, sugeriram que a
freqüência de exposição ao parasito poderia influenciar a progressão clínica da
cardiomiopatia chagásica através da expressão diferenciada de citocinas.
Um outro ponto a ser comentado é que, apesar de haver uma
classificação clínica para os indivíduos chagásicos estabelecida pela OMS (WHO,
2002), sendo esta adotada pelo presente trabalho, estes critérios podem ser
falhos em classificar fidedignamente as formas crônicas da doença. Segundo Dutra
et al. (2005), a categorização dos pacientes chagásicos é baseada na presença e
severidade dos sintomas e não faz uso de exames refinados, sendo de grande
importância para estudos epidemiológicos, e não necessariamente para estudos
clínicos e imunológicos. Assim, pequenas alterações clínicas podem não terem sido
identificadas pelos exames convencionais utilizados.
Desta forma, os estudos imunológicos que visem o desenvolvimento de
marcadores biológicos devem incluir diferentes metodologias, onde a
sensibilidade, especificidade e desempenho devam ser levados em consideração. A
Lorena V. M. B.
99
possibilidade de avaliação de indivíduos residentes em diferentes áreas
endêmicas, onde circulam outras cepas de
T. cruzi,
também é um ponto
importante a ser estudado. Porém, preocupação maior seria o estabelecimento da
utilização de exames clínicos mais sensíveis para categorizar devidamente as
formas clínicas e os níveis de acomentimento dos órgãos (coração, esôfago e
cólon) dos pacientes chagásicos.
Agradecimentos
Nós agradecemos a Mineo Nakazawa pela sua excelente assitência técnica, a
Carlos Luna, Vanessa e Alessandro pela assistência na análise estatística, e as
Dras. Cristina Tavares, Marisa Melo e Sílvia, e ao Dr. Jarabas Malta pela seleção de
alguns pacientes chagásicos que foram selecionados neste estudo Este trabalho
foi financiado por Biomanguinhos/Fiocruz, (grant Nº 239/05), CNPq e CAPES.
Gomes Y. M. é pesquisadora do CNPq, Carvalho C. L., Melo M. F. A. D. e Machado
R. C. A. são bolsistas do PIBIC/Fiocruz, Verçosa A. F. A. e Lorena V. M. B. são
bolsitas da CAPES do curso de Mestrado em Saúde Pública-CPqAM/Fiocruz.
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Figuras
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
p∠0,01
Índice de Estimulação
Figura 1: Resposta proliferativa de PBMC de indivíduos chagásicos e indivíduos
não chagásicos após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive
Antigen
(CRA),
Flagellar Repetitive Antigen
(FRA) e antígeno solúvel de formas
epimastigotas de
T. cruzi
(Ag-Epi). Indivíduos portadores da forma cardíaca (FC)
(n=19) e da forma indeterminada (FI) (n=17) e indivíduos não-chagásicos (NC)
(n=19). Os pontos (, , ∇) representam a média das triplicatas em CPM dos
estímulos dividida pela média das triplicatas em CPM da cultura sem estímulo de
cada indivíduo. As barras horizontais representam a média aritmética. As
diferenças estatísiticas estão mostradas na figura com o valor de p≤0,05.
Lorena V. M. B.
107
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
p=0,02
p=0,04
p=0,011
p=0,03
TNF-
α
(pg/mL)
Figura 2: Detecção de TNF-α em sobrenadante de cultura de PBMC de indivíduos
chagásicos e indivíduos não chagásicos após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
(CRA),
Flagellar Repetitive Antigen
(FRA) e
antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
(Ag-Epi). Indivíduos
portadores da forma cardíaca (FC) (n=19) e da forma indeterminada (FI) (n=17)
e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os pontos (, , ∇) representam a
média da duplicata. As barras horizontais representam a média aritmética. As
diferenças estatísiticas estão indicadas na figura com o valor de p.
Lorena V. M. B.
108
0
1500
3000
4500
6000
7500
9000
10500
12000
13500
15000
16500
18000
19500
21000
22500
24000
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
p=0,011
p=0,003
p∠0,001
p∠0,001
IFN-γ (pg/mL)
Figura 3: Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de PBMC de indivíduos
chagásicos e indivíduos não chagásicos após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
(CRA),
Flagellar Repetitive Antigen
(FRA) e
antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
(Ag-Epi). Indivíduos
portadores da forma cardíaca (FC) (n=19) e da forma indeterminada (FI) (n=17)
e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os pontos (, , ∇) representam a
média da duplicata. As barras horizontais representam a média aritmética. As
diferenças estatísiticas estão indicadas na figura com o valor de p.
Lorena V. M. B.
109
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
FC
FI
NC
CRA
FRA
Ag-Epi
IL-10 (pg/mL)
Figura 4: Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de PBMC de indivíduos
chagásicos e indivíduos não chagásicos após estímulo com antígenos de
T. cruzi
.
Cytoplasmatic Repetitive Antigen
(CRA),
Flagellar Repetitive Antigen
(FRA) e
antígeno solúvel de formas epimastigotas de
T. cruzi
(Ag-Epi). Indivíduos
portadores da forma cardíaca (FC) (n=19) e da forma indeterminada (FI) (n=17)
e indivíduos não-chagásicos (NC) (n=19). Os pontos (, , ∇) representam a
média da duplicata. As barras horizontais representam a média aritmética. As
diferenças estatísiticas estão indicadas na figura com o valor de p.
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