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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Avaliação da qualidade microbiológica de leite humano cru recebido
em Banco de Leite Humano
Maria Rita de Cássia Contin Castro
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência e
Tecnologia de Alimentos.
Piracicaba
2006
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1
Maria Rita de Cássia Contin Castro
Nutricionista
Avaliação da qualidade microbiológica de leite humano cru recebido
em Banco de Leite Humano
Orientador:
Prof. Dr. ERNANI PORTO
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência e
Tecnologia de Alimentos.
Piracicaba
2006
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Castro, Maria Rita de Cássia Contin
Avaliação da qualidade microbiológica de leite humano cru recebido em Banco de
Leite Humano / Maria Rita de Cássia Contin Castro. - - Piracicaba, 2006.
61 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2006.
1. Análise de alimentos 2. Bancos de leite 3. Conservação de alimentos pelo frio
4. Leite – Humano 5. Microbiologia de alimentos I. Título
CDD 612.644
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho às mães doadoras do banco de leite humano do Hospital
“Santa Casa de Misericórdia” de Limeira/SP; ao meu esposo Francisco Carlos
e aos meus filhos Manuela, Francisco e Guilherme que sem cobranças ou
exigências caminham ao meu lado.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço:
- a Deus, por sua Graça;
- ao Professor Dr. Ernani Porto, pela sua paciência e orientação;
- à Profa. Dra. Solange Guidolin Canniati Brazaca, pela sua atenção;
- à Dra. Soraya Drago Menconi, pela sua eterna amizade;
- às colaboradoras do Projeto: Bruna Nicolosi Franzini Silva Travagin,
Juliana Aparecida Battistella Berti,
Ligia Dozena Domingos,
Vanessa Cristina Nogueira;
- ao Padre Alquermes Valvassori e ao Comitê de Ética da “Santa Casa de Misericórdia” de Limeira/SP;
- às Técnicas do banco de leite da “Santa Casa de Misericórdia” de Limeira/SP;
- ao Centro Estadual de “Educação Tecnológica” “Paula Souza”, através da ETE “Trajano Camargo” de
Limeira, que permitiu a execução deste projeto;
- aos meus pais Antonio e Maria Isabel;
- às amigas Maria Tereza Trovó de Almeida, Jacqueline D. Páteo Curi e Íris Borges de Almeida, pela
amizade e incentivo; e
- aos funcionários da biblioteca TEC, Beatriz, Raquel e Midiam, pelo trabalho e atenção.
5
“Tecendo a manhã
Um galo sozinho não tece uma manhã;
ele precisará sempre de outros galos:
de um que apanhe o grito que um galo antes
deu e o lance a outros; e de outros galos
que com muitos outros galos se cruzem
os fios de sol de seus gritos de galo,
para que a manhã, desde uma teia tênue,
se vá tecendo, entre todos os galos.”
João Cabral de Melo Neto
6
SUMÁRIO
RESUMO..........................................................................................................................8
ABSTRACT.......................................................................................................................9
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................10
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................11
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................12
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................15
2.1 Valores nutricionais do leite humano........................................................................15
2.2 Proteínas...................................................................................................................17
2.3 Imunoglobulinas........................................................................................................17
2.4 Gorduras...................................................................................................................18
2.5 Vitaminas e sais minerais..........................................................................................19
2.6 Carboidratos..............................................................................................................20
2.7 Efeito bifidogênico.....................................................................................................20
2.8 Microbiologia do Leite Humano.................................................................................20
2.9 Banco de Leite Humano............................................................................................25
2.9.1 A acidez titulável do leite humano..........................................................................27
2.9.2 Pasteurização.........................................................................................................29
2.9.3 Refrigeração após pasteurização...........................................................................29
2.9.4 Congelamento após pasteurização........................................................................30
3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................31
3.1 Descrição do BLH da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Limeira...............31
3.2 Amostragem..............................................................................................................31
3.3 Caracterização microbiológica do leite coletado.......................................................32
3.3.1 Staphylococcus coagulase positivo (+)..................................................................32
3.3.2 Contagem global de microrganismos aeróbios totais............................................34
3.3.3 Contagem de microrganismos do grupo coliforme total e Escherichia coli...........35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................38
5 CONCLUSÕES............................................................................................................50
7
REFERÊNCIAS...............................................................................................................51
APÊNDICES....................................................................................................................59
8
RESUMO
Avaliação da qualidade microbiológica de leite humano cru recebido em banco de
leite humano
Este estudo visou analisar a qualidade microbiológica do leite humano cru
recebido em um banco de leite humano (BLH), quantificando os microrganismos
aeróbios mesófilos, Staphylococcus coagulase positivos (ECP), coliformes totais e
Escherichia coli.
Foram realizadas análises microbiológicas em 60 amostras de leite humano cru
recebidas no BLH e os resultados foram os seguintes: o microrganismo E. coli foi
positivo em 50% das amostras analisadas, os coliformes totais em 75% delas, o ECP
em 46,66% e em 96,66% do total das amostras foram detectados microrganismos
aeróbios mesófilos.
Das amostras analisadas, a população de E. coli foi positiva em 93,33% (28
amostras) com uma variação entre 1 e 99 NMP/mL; 3,33% (1 amostra) entre 10
4
e 9,9 x
10
4
NMP/mL; 3,33% (1 amostra) entre 10
5
e 9,9 x10
5
NMP/mL.
A população de coliformes totais que foi positiva em 57,77% (26 amostras) das
amostras analisadas ficou entre 1 e 99 NMP/mL; 24,4% (11 amostras) ficaram entre 10
2
e 9,9x10
2
NMP/mL; 2,22% (1 amostra) entre 10
3
e 9,9x10
3
NMP/mL; 8,88% (4 amostras)
entre 10
4
e 9,9x10
4
NMP/mL; 4,44% (2 amostras) entre 10
5
e 9,9x10
5
NMP/mL; 2,22%
(1 amostra) entre 10
6
e 9,9x10
6
NMP/mL.
Os microrganismos aeróbios mesófilos apresentaram-se na quase totalidade das
amostras, sendo que 17,24% (10 amostras) variaram de 1 a 99 UFC/mL; 17,24% (10
amostras) entre 10
2
e 9,9x10
2
UFC/mL; 10,34% (6 amostras) ficaram entre 10
3
e 9,9 x
10
3
UFC/mL; 25,86% (15 amostras) entre 10
4
e 9,9 x10
4
UFC/mL; 17,24% (10 amostras)
entre 10
5
e 9,9 x 10
5
UFC/mL; 10,34% (6 amostras) entre 10
6
e 9,9x10
6
UFC/mL e
1,72% (1 amostra) entre 10
7
e 9,9x10
7
UFC/mL. Porém, 3,33% (2 amostras)
apresentaram-se negativas.
Do total de amostras analisadas, o grupo dos microrganismos ECP apresentou-
se em 78,57% (22 amostras) com variação entre 1 e 99 UFC/mL; em 3,57% (1 amostra)
entre 10
2
e 9,9x10
2
UFC/mL; 10,71% (3 amostras) entre 10
3
e 9,9x10
3
UFC/mL e 7,14%
(2 amostras) entre 10
4
e 9,9 x 10
4
UFC/mL.
Palavras chaves: Leite humano; Banco de leite humano; Microrganismos indicadores.
9
ABSTRACT
Evaluation of the microbiological quality of raw human milk received in the human
milk bank
This paper aimed to analyze the microbiological quality of the raw human milk
which is received in a human milk bank (HMB) by quantifying the aerobic mesophiles,
Staphylococcus aureus (SCP), total coliforms and Escherichia coli.
Sixty (60) samples of raw human milk received in HMB were microbiologic
analyzed and the results were as follows: the E. coli microorganism was positive in 50%
of the analyzed samples, the total coliforms were in 75% of them, the ECP in 46,6% and
in 96,6% of the total amount of samples aerobic mesophiles microorganisms were
detected.
From the total analyzed samples, the population of E. coli was positive in 93,33%
(28 samples) with a variation between 1 and 99 NMP/mL; 3,33% (1 sample) was
between 10
4
and 9,9x10
4
NMP/mL; 3,33% (1 sample) was from 10
5
to 9,9x10
5
NMP/mL.
The population of the total coliforms which was positive in 57,77% (26 samples)
of the total analyzed samples were between 1 and 99 NMP/mL; 24,4% (11 samples)
were between 10
2
and 9,9x10
2
NMP/mL; 2,22% (1 sample) were between 10
3
and
9,9x10
3
NMP/mL; 8,88% (4 samples) were between 10
4
and 9,9x10
4
NMP/mL; 4,44% (2
samples) between 10
5
and 9,9x10
5
NMP/mL and in 2,22% (1 sample) from 10
6
to
9,9x10
6
NMP/mL.
The aerobic mesophiles microorganisms were presented in almost all the
samples, being: 17,24% (10 samples) with a variation of 1 to 99 UFC/mL; 17,24% (10
samples) between 10
2
and 9,9x10
2
UFC/mL; 10,34% (6 samples) were between 10
3
and
9,9x10
3
UFC/mL; 25,86% (15 samples) between 10
4
and 9,9x10
4
UFC/mL; 17,24% (10
samples) between 10
5
and 9,9x10
5
UFC/mL; 10,34% (6 samples) between 10
6
and
9,9x10
6
UFC/mL and in 1,72% (1 sample) between 10
7
and 9,9x10
7
UFC/mL. However
3,33% (2 samples) showed to be negative.
From the total analyzed samples, the SCP group presented in 78,57% (22
samples) with a variation between 1 and 99 UFC/mL; 3,57% (1 sample) between 10
2
and 9,9 x 10
2
UFC/mL; 10,71% (3 samples) between 10
3
e 9,9x10
3
UFC/mL and 7,14%
(2 samples) were between 10
4
and 9,9x10
4
UFC/mL.
Keywords: Human milk; Milk bank; Indicator microorganisms
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Plaqueamento em meio B.P. e teste de coagulase.................................... 33
Figura 2 - Plaqueamento em meio P.C.A................................................................... 35
Figura 3 - Determinação de coliformes em meio LST-MUG....................................... 36
Figura 4 - Determinação de E. coli em câmara de fluorescência............................... 37
Figura 5 - Distribuição das populações de microrganismos E. coli nas amostras
positivas (NMP/mL)....................................................................................
40
Figura 6 - Distribuição das populações de coliformes totais nas amostras positivas
(NMP/mL)...................................................................................................
43
Figura 7 - Distribuição das populações de microrganismos aeróbios mesófilos
positivos encontrados nas amostras (UFC/mL).........................................
45
Figura 8 - Distribuição das populações de Staphylococcus coagulase positivo
encontrados nas amostras (UFC/mL)........................................................
47
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição do leite humano..................................................................... 16
Tabela 2 - Contagens microbiológicas no leite humano cru........................................ 38
Tabela 3 - Distribuição da freqüência da população de microrganismos nas
amostras de leite humano analisadas........................................................
40
12
1 INTRODUÇÃO
O leite materno é o alimento mais adequado ao recém-nascido devido seu valor
nutricional e fisiológico. Possui propriedades imunológicas para proteção do trato-
gastrintestinal e sistema respiratório da criança. O fato de muitas vezes a criança estar
impossibilitada de receber o leite materno pelo aleitamento natural, motivou a criação
dos bancos de leite humano para suprir essa necessidade (GIUGLIANI, 2002).
Contudo, quando o leite humano (LH) é manipulado, como ocorre nos BLHs
(bancos de leite humano), há exigências do emprego de tecnologias adequadas, devido
aos microrganismos presentes ao ambiente comum à mãe, à criança e a utensílios
usados para armazenar o leite humano.
Os BHLs (bancos de leite humano) utilizam o emprego de tecnologias de
conservação para conferir segurança ao leite materno: o uso de tratamentos térmicos
(pasteurização) para reduzir a carga microbiana e eliminar possíveis microrganismos
nocivos à saúde; a refrigeração e o congelamento, visando à estocagem e transporte do
produto.
Atualmente, os BLHs, como práticas de beneficiamento, utilizam a pasteurização
do leite humano a 62,5ºC por trinta minutos.
A partir de 1985, por meio de uma ação conjunta realizada pela Fundação
Oswaldo Cruz - FIOCRUZ - e o Programa Nacional de Aleitamento Materno, PNIAM,
teve início o desenvolvimento de um subprograma, com vistas a promover uma
expansão qualitativa e quantitativa dos bancos de leite humano no Brasil que já conta
com uma rede de 172 BLHs (BORGO et al. 2005; REGO, 2002). (APÊNDICE A).
Contudo o leite humano constitui um excelente meio de cultura que permite a
multiplicação de um grande número de espécies de microrganismos. A manutenção da
qualidade do leite pasteurizado depende de muitos fatores, desde a ordenha até o
consumo, incluindo qualidade bacteriológica do leite cru, condições de pasteurização e
condições higiênico-sanitárias (COSTA; SOUZA; SANTOS, 2004).
13
A Resolução nº12 (BRASIL, 2001) cita para o leite humano pasteurizado de
bancos de leite, os seguintes padrões microbiológicos: microrganismos aeróbios
mesófilos viáveis/mL em 10
2
, ausência de coliformes a 35ºC/mL, ausência de
Staphylococcus coagulase positivo/mL, ausência de Salmonella sp/25 mL.
Como rotina nos BLHs (bancos de leite humano) há necessidade de selecionar o
leite humano cru antes de ser pasteurizado, o que é realizado pela análise da acidez
titulável em Graus Dornic, de acordo com a RNBLH (Rede Nacional de bancos de leite
humano). A acidez normal do leite humano deve estar entre 1,0 a 8,0 graus Dornic para
ser pasteurizado (BRASIL, 2006).
Após a pasteurização do leite recebido, análises de presença ou ausência de
microrganismos do grupo coliformes são realizadas para determinar a aceitação ou
rejeição do leite recebido.
O leite materno processado em bancos de leite atende principalmente bebês
prematuros ou doentes, que não conseguem mamar diretamente na mãe. O incentivo à
amamentação é uma das estratégias para a redução da mortalidade neonatal. Isso é
devido aos benefícios do aleitamento. As principais causas da mortalidade neonatais
têm como motivos, problemas respiratórios e o baixo peso (SALVIANO; CAVALCANTE,
2004).
Seguindo um artigo fundamental da Declaração de Genebra, segundo o qual
toda criança tem direito ao aleitamento materno, e outro, da Declaração de Direitos
Humanos que estabelece que mãe e filho têm direito a cuidados e assistência especial,
os bancos de leite têm revelado a sua grande missão (UNICEF, 1998). São verdadeiros
centros de proteção, promoção e manutenção da prática do aleitamento materno,
mesmo quando seja ela intermediada pelo beneficiamento do leite humano, como
ocorre em bancos de leite humano (ASSIS; SANTOS; SILVA, 1983). O incentivo à
amamentação é uma das estratégias para redução da mortalidade neonatal.
Este estudo analisou os padrões microbiológicos de leite humano cru, maduro,
recebido em bancos de leite. Os microrganismos que foram isolados são indicadores
das condições higiênico-sanitárias do produto. Atualmente os bancos de leite não
realizam análises microbiológicas quantitativas devido ao alto custo, e porque
14
necessitam de métodos rápidos na determinação da qualidade do leite humano
recebido.
Os resultados obtidos deste estudo são decorrentes da manipulação e
armazenamento sob congelamento do leite humano em domicílio pelas doadoras.
Através deste estudo procurou-se contribuir com esse grande trabalho realizado
pelos bancos de leite pela utilização do leite materno, o qual possui propriedades
nutricionais e imunológicas adequadas à recuperação dos recém-nascidos que dele
necessitam.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
Nos bancos de leite humano, os processos de coleta, doação, triagem,
pasteurização, estocagem e conversão em forma de consumo envolvem procedimentos
com riscos de contaminação (BRITTO; BARBOSA; MERCHAN-HAMANN, 2002).
O Centro de Referência Nacional da FioCruz desenvolveu seguras metodologias
de controle de qualidade, para serem praticadas na rotina dos bancos de leite humano.
Enquanto em várias regiões do mundo, os bancos de leite foram fechados, por
segurança operacional e risco biológico, o Brasil viveu franco processo de expansão
(REGO, 2002). A Rede Nacional de bancos de leite humano é uma iniciativa do
Ministério da Saúde e da Fundação Oswaldo Cruz, cuja missão é promover a saúde da
mulher e da criança mediante a integração e a construção de parcerias com órgãos
federais, estaduais, os municipais, iniciativa privada e sociedade.
O programa inclui o processamento e controle de qualidade do leite humano. O
Brasil é reconhecido pela OMS (Organização Mundial da Saúde) como o país que tem a
maior rede de bancos de leite da América Latina e Caribe. É também o que mais
avançou em estudos científicos sobre o leite humano (TULLY, 2001). Todos os bancos
de leite do Brasil são capacitados pelo Ministério da Saúde. Existem 172 no país, em
todos Estados (BRASIL, 1988).
2.1 Valores nutricionais do leite humano
O leite humano é definido como o fluido biológico, destinado a alimentação do
lactente, composto por todos os nutrientes necessários ao seu desenvolvimento e que
contém agentes protetores de infecções (AKRÉ, 1990). A composição química do leite
humano corresponde perfeitamente às necessidades nutricionais e atende às
peculiaridades fisiológicas do recém-nascido (RODRIGUES et al., 2004).
16
O leite humano é ideal para o recém-nascido devido ao seu conteúdo nutricional
e imunológico. A composição do leite varia entre mulheres individuais e grupos étnicos
e também entre amostras obtidas em um mesmo período de lactação (GALHARDO;
ARAUJO; BORGO, 2002) – Tabela 1.
Dentre os macronutrientes, a gordura é o mais variável e a lactose o mais
estável. O conteúdo de vitaminas varia de acordo com a dieta da mãe.
Tabela 1 – Composição do Leite Humano
Leite Humano Composição / Litro
Energia 580 cal.
Lactose 72 g
Proteína total 10,5 g
Lipídios 39 g
Vitamina A
670 µg
Vitamina D
0,55 µg
Vitamina E 2,3 mg
Vitamina K
2,1µg
Tiamina
0,2 µg
Riboflavina 0,35 mg
Niacina 1,5 mg
Ácido fólico
85 µg
Ferro 0,3 mg
Vitamina B
6
93 µg
Ácido ascórbico 40 mg
Cálcio 280 mg
Fósforo 140 mg
Fonte: Euclydes, 2000.
17
2.2 Proteínas
O conteúdo protéico do leite materno é de apenas 1,15g/100mL, calculado a
partir do nitrogênio total (fator 6,25), o que equivale a menos que 1/3 da proteína
encontrada no leite de vaca (AKRÉ, 1990).
O leite adequado para a alimentação é homólogo, ou seja, produzido pela
espécie em atenção às necessidades imunológicas, fisiológicas e nutricionais do recém-
nascido e do lactente. A caseína humana impede a aderência da Heliobacter pylori às
células da mucosa intestinal (REGO, 2002).
Esse baixo teor protéico é relevante, considerando-se a imaturidade do
organismo do recém-nascido. A elevada quantidade de proteína encontrada no leite de
vaca pode levar a distúrbios metabólicos,
principalmente hepático e renal no recém-
nascido. Qualitativamente, também, as proteínas diferem muito, visto que no leite de
vaca predominam as caseínas e no leite humano as proteínas do soro, como a
lactoalbumina (MAHAN; ESCOTT-STUMP, 2002).
Leve-se em consideração que os lactentes recebem os nutrientes específicos
para a espécie humana. Os aminoácidos taurina e cistina, essenciais para prematuros
estão presentes em maior concentração no leite humano (REGO, 2002).
Os aminoácidos livres são encontrados em quantidades significativas no leite
humano. A taurina e a glutamina são encontradas em concentrações elevadas. A
taurina transporta o zinco e é encontrada em grande quantidade no tecido cerebral,
parecendo atuar como neurotransmissor excitatório cerebral (AKRÉ, 1990).
2.3 Imunoglobulinas
O complexo imune presente no leite humano é formado por substâncias:
antimicrobianos, antiinflamatórios e imunomoduladores. Os componentes de defesa
principais são as S-IgA, lactoferrina, lisozima, complexo C3, mucinas, oligossacarídeos,
18
e alguns lipídeos, e cada um deles apresenta características diferentes (SCHANLER,
1989).
O colostro humano, que é a primeira secreção da glândula mamária, é rico em
imunoglobulinas, apesar da concentração no leite decrescer significantemente após os
primeiros dias de lactação (LÖNNERDAL, 1985).
A lactoferrina, uma glicoproteína insaturada, cuja fração no leite humano
corresponde a 26%, praticamente não é encontrada no leite de vaca. Cada molécula de
lactoferrina transporta 2 íons de ferro, com concomitante incorporação de íons de
bicarbonato. Ela é capaz de transportar cerca de 20% a 30% do ferro encontrado no
leite humano, sendo mais estável; resiste à degradação de tripsina e apresenta função
bacteriostática por inibir o crescimento de coliformes ao retirar do seu meio o ferro
necessário para suas funções vitais (SCHANLER, 1989).
A principal imunoglobulina contida no leite humano e que representa 90% do
total de IgA é a S-IgA (GRASSI; COSTA; VAZ, 2001). Ela é produzida pelos linfócitos
beta no intestino delgado, trato respiratório, glândulas salivar, glândula lacrimal e
glândula mamária, exercendo papel de defesa contra diversos antígenos (VINAGRE,
2002).
Algumas evidências sugerem que a presença de imunoglobulinas moduladoras
no leite materno, nos primeiros dias de lactação, favoreceria a diminuição do risco de
certas doenças, como diabetes melitus tipo 1, linfomas, doenças de Crohn, e outras de
causas imunológicas, tendo também papel importante na nutrição trófica do prematuro
no período pré-natal (VINAGRE, 2002).
2.4 Gorduras
A gordura do leite humano é secretada em glóbulos microscópicos, menores que
os glóbulos de gordura do leite de vaca. Os triglicérides predominam perfazendo 98%
dos lipídeos dos glóbulos. As membranas globulares são compostas por fosfolipídios,
esteróis (colesterol) e proteínas. A composição de ácidos graxos é relativamente
19
estável: cerca de 42% de ácidos graxos saturados e 57% de ácidos graxos insaturados
(GALHARDO; ARAUJO; BORGO, 2002). Apesar da concentração de ácido linoleico e
outras gorduras poliinsaturadas ser influenciada pela dieta e composição dos lipídeos
corpóreos da mãe, o leite materno é rico em ácidos graxos insaturados de cadeia longa,
importante para o desenvolvimento e mielinização do cérebro (GALHARDO; ARAUJO;
BORGO, 2002). O leite humano proporciona de 35% a 50% da ingestão energética
diária em forma de gorduras (GALHARDO; ARAUJO; BORGO, 2002).
Sua concentração pode se alterar com o tempo da gestação, período de
lactação, durante o dia, e de pessoa para pessoa. Além disso, sua qualidade varia
conforme a alimentação materna (ANDERSON et al., 1988).
A presença de lipase é importante para a absorção de gordura. Ela não é
inativada pelo pH baixo do estômago, mas sim pelo calor. É ativa com baixas
concentrações de sais biliares, o que permite atuar no intestino dos neonatos, inclusive
prematuros (AKRÉ, 1990).
2.5 Vitaminas e sais minerais
O cálcio é absorvido mais eficientemente devido à alta relação cálcio: fósforo no
leite do leite humano (2:1). A alta disponibilidade do ferro no leite humano resulta de
interações complexas entre os componentes do leite materno e o organismo do bebê. A
maior acidez do trato gastrintestinal, a presença de quantidades adequadas de zinco,
cobre e lactoferrina – fatores de transferência que impedem a disponibilidade do ferro
às bactérias intestinais, são fatores importantes para aumentar a absorção de ferro.
Quase 70% do ferro do leite materno é absorvido, contra 30% do leite de vaca e 10%
dos substitutos do leite materno. Para compensar a baixa disponibilidade, grandes
quantidades de ferro devem ser adicionadas às fórmulas, o que favorece o
desenvolvimento de bactérias intestinais e patogênicas (AKRÉ, 1990). O zinco é
essencial na estrutura de enzimas e imunidade celulares. As quantidades de zinco no
leite humano são pequenas. Sua disponibilidade é alta, se comparada aos substitutos
20
do leite materno. O leite humano apresenta alta biodisponibilidade de ferro
(SILVA et al., 2002).
2.6 Carboidratos
A lactose é o principal carboidrato do leite humano, no qual também estão
presentes pequenas quantidades de galactose, frutose e outros oligoelementos
(PASCHOA, 1997). Esse carboidrato facilita a absorção de cálcio e ferro e promove a
colonização intestinal com Bifidobacterium bifidus, que são bactérias lácticas. A ação
destas bactérias é promover o meio ácido no trato gastrintestinal e inibir o crescimento
de bactérias patogênicas, fungos e parasitas no intestino (OLIVEIRA, 1998).
2.7 Efeito bifidogênico
O crescimento do Bifidobacterium bifidus em presença do leite humano resulta
em um carboidrato nitrogenado chamado “fator bífidus”, o qual em meio rico em lactose,
produz ácido láctico, ácido acético e traços de ácido fórmico e ácido succínico,
ocorrendo diminuição do pH intestinal, tornando assim o meio desfavorável ao
crescimento de enterobactérias (REGO, 2002).
2.8 Microbiologia do leite humano
Como o leite humano pode ser um veículo de microrganismos patogênicos, sua
qualidade microbiológica é fundamental para garantir ao lactente um alimento seguro
(BORTOLOZO et al., 2004).
21
O leite constitui um excelente meio de cultura que permite a multiplicação de
várias espécies de microrganismos (COSTA; SOUZA; SANTOS, 2004).
No leite humano, comumente são encontrados bactérias como Staphylococcus
aureus, Streptococcus viridans, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter e Serratia
(SERAFINI et al., 2003). Na quase totalidade das vezes, o mesmo microrganismo é
isolado no leite humano e na pele da mama e mamilo (SERAFINI et al., 2003).
Pereira et al. (1995) relataram em um estudo, a presença de Staphylococcus em
todas as amostras de leite materno procedentes de 19 mulheres que apresentavam
sintomas de mastite. Novak et al. (2000), isolaram de 500 amostras analisadas de leite
cru, 171 (34,2%) amostras contaminadas com S. aureus.
Quanto à patogenicidade, a microbiota do leite humano é classificada como
saprófita ou patogênica (BRASIL, 1988).
Devido a importância da qualidade microbiológica e nutricional do leite humano
utilizado em bancos de leite humano, tornam-se fundamentais a obtenção de dados
epidemiológicos sobre a contaminação bacteriana no leite humano e o desenvolvimento
de um trabalho educativo com as mães, enfermeiras, técnicos de enfermagem,
nutricionistas, médicos pediatras e intensivistas, e outros profissionais ligados a essa
área (SERAFINI et al., 2003).
Serafini et al. (2003), determinaram a prevalência de microrganismos indicadores
e patogênicos em leite humano. Foram realizadas análises microbiológicas de 338
amostras de leite humano, 194 de leite cru e 144 pasteurizado, coletados em banco de
leite humano do Hospital Materno-Infantil em Goiânia, GO. Das 194 amostras de LHO
(leite humano ordenhado) não pasteurizado, 136 cepas (70,4%) de microrganismos
indicadores e/ou potencialmente patogênicos, e das 144 amostras de leite pasteurizado,
73 (50,7%) apresentaram contaminação.
No leite cru, de 136 cepas isoladas, foram encontradas três (2,2%) cepas de
Streptococcus do grupo viridans; 10 (7,35%) Staphylococcus aureus; 28 (20,59%),
S. epidermidis; e 49 (36%) amostras contaminadas por enterobactérias. Foram isolados
ainda 43 (31,6%) amostras de leite cru contaminadas por bolores e leveduras.
Das 144 amostras de leite humano pasteurizado, foram encontradas 2,7%
(2 amostras) de Staphylococcus lugdenesis; 6,9% (5 amostras) de Staphylococcus
22
aureus; 20,6% (15 amostras) de S. epidermis e em 12,3% das amostras foram
detectadas Enterobacteriae; 50,7% (37 amostras) foram positivas para bolores e
leveduras (SERAFINI et al., 2003).
Bortolozo et al. (2004), estudando o padrão microbiológico do leite processado
em BLH, analisaram amostras de leite do banco de Ponta Grossa-PR. As amostras
foram descongeladas (“tempo zero”) e mantidas em refrigeração por 12 horas (“tempo
12”) e 24 horas (“tempo 24”). Foi repetido o padrão de aquecimento e pesquisados os
microrganismos aeróbios mesófilos, coliformes a 35ºC, Staphylococcus coagulase
positiva e Salmonella sp/25 mL. Para tempo “zero” todas as amostras estavam dentro
dos padrões desejáveis. Nas amostras do “tempo 12” e “24 horas”, os resultados
revelaram manutenção do padrão microbiológico referente a Staphylococcus aureus,
coliformes e Salmonella. A população de mesófilos aumentou conforme o tempo de
estocagem do leite. Na amostra 2, no “tempo 12” e no “tempo 24” tornou-se impróprio
para o consumo, conforme a Resolução nº12 (BRASIL, 2001).
O estudo de Assis Neto et al. (2001), com leite humano cru encontrou na
contagem de microrganismos aeróbios mesófilos uma média de 5,7 x 10
5
UFC/mL. Na
pesquisa de Pontes; Ivasaki e Oliveira (2003) analisando 27 amostras de leite humano
pasteurizado, em 48,2% (13) amostras apresentaram contagens de microrganismos
aeróbios mesófilos.
Mesmo que patógenos estejam ausentes, um número alto de microrganismos
aeróbios mesófilos pode indicar um processamento insatisfatório, havendo condições
para que os mesmos se multipliquem (FRANCO; LANDGRAFF, 2003).
No trabalho desenvolvido por Costa; Souza e Santos (2004), em amostras
fornecidas pelo banco de leite humano Anita Cabral, em João Pessoa, as análises
evidenciaram 100% de positividade para microrganismos mesófilos, em leite humano
cru. O número de bactérias aeróbias mesófilas apresentou valores que variaram de 1,1
x 10
2
a 3,7 x 10
5
UFC/mL. Em relação aos microrganismos isolados, resultou-se em K.
pneumonae (25,5%), E. coli (1,8%), Staphylococcus coagulase negativa (41,8%),
S.aureus (12,7%), E. faecalis (1,8%), P. aeruginosa (5,5%) e C. albicans (9,1%).
Outro estudo relatando uma contaminação por Pseudomonas aeruginosa 010 foi
realizado no ano de 2001 em uma unidade neonatal de cuidados intensivos. A fonte de
23
contaminação eram os frascos de armazenamento do banco de leite. A infecção afetou
31 pacientes dentro da unidade intensiva neonatal. Os leites pasteurizados que
estavam nos vidros contaminados foram descartados imediatamente e técnicas de
higiene foram intensificadas durante o envase do leite nos vidros. Essas medidas foram
avaliadas até outubro de 2001. Não foram registrados mais casos de infecção por P.
aeruginosa depois dos cuidados tomados (CGRAS-LE et al., 2003).
Musgrove et al. (1989), mediante tratamento térmico no leite humano,
observaram redução no número de microrganismos viáveis. No leite pasteurizado foram
encontradas bactérias não patogênicas, mas o leite “in natura” apresentou
Pseudomonas e outras bactérias Gram negativas.
Segundo Moulin et al. (1998), que estudaram a avaliação bacteriológica do leite
humano estocado à temperatura ambiente por 9 horas, tendo como controle as mesmas
amostras mantidas sob refrigeração, a orientação dada às mães fora lavar as mãos em
água corrente com sabão de coco e secá-las em toalha papel. Não foi dada nenhuma
instrução em relação à limpeza das mamas. Os primeiros mililitros foram desprezados e
os próximos 40 mL foram coletados em vasilhas plásticas previamente esterilizadas
pela fervura em água por 15 minutos. O total de 33 amostras de leite humano foi
analisado bacteriologicamente no tempo zero, três, seis, e nove horas após expressão
manual. As amostras foram mantidas à temperatura ambiente e monitorizadas (variação
entre 17ºC e 30,5ºC) tendo como controle o mesmo leite entre 2ºC e 6°C. Foram
realizadas contagens total de bactérias aeróbias facultativas mesófilas, contagens de S.
aureus e determinação do NMP/mL (número mais provável) de bactérias coliformes
totais e fecais. A análise bacteriológica do leite humano realizado no tempo zero de
coleta expressou o grau de contaminação bacteriana inicial, em que a assepsia e a
técnica de ordenha exercem efeito decisivo sobre a qualidade microbiológica do leite,
resultando na população de microrganismos aeróbios mesófilos que variou de 2x10
UFC/mL a 10
6
UFC/mL, sendo que 85% das amostras resultaram entre 10
2
e 10
3
UFC/mL. Em 24 (vinte e quatro) amostras, 72,7% não evidenciaram coliformes totais. A
presença de Escherichia coli foi detectada em 4 amostras (12,1%). O microrganismo
Staphylococcus aureus foi encontrado em seis amostras (18,8%), variando de 10 a 10
4
UFC/mL.
24
O estudo de Novak e Almeida (2002), analisando 343 amostras de leite humano
cru de banco de leite, obtidos a partir de frascos de coleta domiciliar, detectou o grupo
dos microrganismos coliformes em 31,2% das amostras analisadas, com populações
variando de 3,0 x 10 a 1,1 x 10
4
NMP/mL.
Lin et al. (1988), analisando o perfil microbiológico do leite humano de doadoras
individuais e de um “pool” de amostras de banco de leite comercial, identificaram que
todas as amostras mostraram-se negativas para coliformes. No “pool” de amostras, a
contagem de coliformes alcançou valores de: <1,0 a 3,4 x 10
5
. Os microrganismos
isolados de doadoras individuais foram identificados como Staphylococcus, sendo 82%
de S. epidermis e 10% S. hominis e S. aureus, além de outras espécies detectadas em
apenas 1% das amostras. Dos microrganismos isolados do “pool” de amostras, 39%
eram S. epidermis, 11% Klebsiella pneumoniae, 11% Citrobacter spp., 7% Serratia
liquefaciens, 5% Gram negativos não identificados e 3% Pseudomonas paumobilis.
Outro estudo, analisando amostras de leite humano cru do banco de leite
humano do Instituto Fernandes Figueira, recebidas em coleta domiciliar, em 837
amostras, identificou 71 (8,48%) amostras contaminadas com coliformes, porém em
nenhuma das amostras a população ultrapassou 1,0 x 10
3
NMP/mL. Após a
identificação, os resultados obtidos revelaram a presença de três gêneros e cinco
espécies da família das enterobactérias. A maioria dos microrganismos (65% a 91%)
pertencia a duas espécies, Enterobacter cloacae e Klebsiella pneumoniae, sendo a
ocorrência de E. coli entre 3% a 4,2%. Os resultados encontrados nessas 71 amostras
foram classificados como: E. cloacae (56,4%), K. pneumoniae (35,2%), E. coli (4,2%),
Enterobacter sakazakii (2,8%) e Enterobacter taylorae (1,4%) (NOVAK et al., 2001).
Enterobacter sakazakii tem provocado enfermidades em bebês. Entre os
lactentes, os que correm maior risco de infecção por Enterobacter sakazakii são os
recém-nascidos com idade de 28 dias ou menos, particularmente os prematuros com
baixo peso ao nascer ou com imunodepressão (OMS, 2004).
Há uma elevada resistência térmica das cepas de E. sakazakii em comparação
com outras enterobactérias podendo explicar sua alta prevalência em leite em pó e
preparados (NAZAROWEC-WHITE; FARBER, 1997).
25
Quanto aos microrganismos Staphylococcus coagulase positivos (ECP), a
legislação RDC nº 12 (BRASIL, 2001) para padrões microbiológicos de leite humano de
banco de leite destaca a ausência de ECP, sendo que sua presença produz toxinas que
quando presentes poderão causar intoxicação alimentar (SILVA; GRANDA, 2004).
Quanto à presença constante de S.aureus nas amostras de leite humano pode
ser explicado pela colonização da pele, dos seios, da cavidade nasal da doadora e do
profissional de saúde ou, alternativamente, às condições insatisfatórias de utensílios
empregados na ordenha (NOVAK et al., 2000).
Apesar de ser um habitante normal da pele, contagens de Staphylococcus
coagulase positivo acima de 10
2
UFC/mL em leite humano podem ser indicativo de
mastite (JAY,2005; NOVAK et al.,2000). Segundo Franco e Landgraff (2003), a
presença de S. aureus é uma indicação de perigo potencial à saúde pública devido a
enterotoxina estafilocócica termorresistente. No estudo de Carrol; Davies e Osma
(1979) foram isoladas 13 amostras (6,23%) positivas para S.aureus das 207 amostras
de leite humano pesquisadas.
No trabalho de Rodrigues (2005), o microrganismo estafilococos coagulase
positivo foi identificado em 90% das amostras analisadas. Muitas amostras
apresentaram contagem elevada, atingindo até 1,3 x 10
3
UFC/mL.
A qualidade do leite humano distribuído por BLH (bancos de leite humano) é de
interesse de saúde pública (LAW et al., 1989).
2.9 Banco de leite humano
Banco de leite humano é um centro especializado obrigatoriamente vinculado a
um hospital materno e/ou infantil, responsável pela promoção do incentivo ao
aleitamento materno e execução das atividades da coleta, processamento e controle de
qualidade de colostro, leite de transição e leite humano maduro, para posterior
distribuição, sob prescrição do médico ou do nutricionista. É de responsabilidade dos
bancos de leite o fornecimento de produtos seguros, inócuos e que cumpram a sua
26
função como alimento, promovendo e mantendo a saúde, principalmente ao considerar
o grupo ao qual se destinam: crianças altamente vulneráveis (REGO, 2002).
Ao beneficiamento correspondem seleção, classificação, acondicionamento,
pasteurização, resfriamento, rotulagem e estocagem, etapas que devem seguir as
recomendações do Ministério da Saúde (BRASIL, 1988).
O LH (leite humano) deve ser distribuído de acordo com os critérios
estabelecidos pela Portaria nº 322 (BRASIL, 1988). Normalmente são selecionados
como receptores os lactentes que apresentam uma ou mais das indicações entre as
que se seguem:
• Prematuros e recém-nascidos de baixo peso que não sugam;
• Recém-nascidos infectados, especialmente com enteroinfecções;
• Portadores de deficiências imunológicas;
• Portadores de diarréia protaída;
• Casos excepcionais a critério médico;
• Portadores de alergias a proteínas heterólogas.
Rotulagem
• Todo produto processado /estocado será obrigatoriamente rotulado.
Estocagem
• O tipo clássico de estocagem, após o tratamento de pasteurização, é o
congelamento por até seis meses em freezer a -18ºC.
Controle de Qualidade
A adoção de um sistema preventivo e dinâmico de controle de qualidade assume
particular importância para os bancos de leite, pois reduz os riscos operacionais. Esse
controle é realizado ao longo de todo o processo e baseia-se no emprego de técnicas
adequadas no preparo de material, na orientação técnica aos funcionários e às
27
doadoras; nas condições higiênicas da coleta; na seleção e classificação; no
processamento; na estocagem; na distribuição e no transporte (REGO, 2002).
Entre a seleção das doadoras, considerar-se-ão inaptas, a critério médico, as
nutrizes portadoras de moléstia infecto-contagiosa; as que usam drogas ou
medicamentos excretáveis pelo leite em níveis que promovam efeitos colaterais nos
receptores. O leite humano é submetido a testes microbiológicos e físico-químicos para
avaliação de sua qualidade (BRASIL, 2006).
Em visão mais ampla, estas características tornam o produto mais agradável,
nutritivo e isento de substâncias nocivas. No leite humano, a qualidade pode ser
avaliada por parâmetros físico-químicos, higiênicos sanitários e sensoriais, e pela
segurança do produto observada durante todo o processamento (CARDOSO; CHAVES;
BRANDÃO, 2000).
Devido à possibilidade do leite humano ser veículo de microrganismos
patogênicos, sua qualidade microbiológica é importante para um produto seguro
(BORTOLOZO et al., 2004).
Atualmente a pasteurização é a prática comum dos bancos de leite com a
inspeção de 100% para análise qualitativa de microrganismos coliformes (CARDOSO;
CHAVES; BRANDÃO, 2000).
2.9.1 A acidez titulável do leite humano
A Rede Nacional de bancos de leite humano utilizam como controle físico-
químico a determinação da acidez titulável, para o controle das condições de
manipulação do leite cru. A acidez titulável expressa em graus Dornic no leite deve
estar entre 1,0 a 8,0 graus para ser pasteurizado (BRASIL, 2006).
A titulação do leite em graus Dornic consiste em neutralizar a acidez com solução
de NaOH 0,1N ou solução Dornic, usando como indicador a solução alcoólica de
fenolftaleína a 1%, até a obtenção da cor rosa clara persistente (BRASIL, 1981).
28
Para o leite humano foi estabelecida uma quantidade de 1 mL da amostra onde
cada 0,01mL de NaOH gasto na reação equivale a 1 grau Dornic (°D) neutralizado
(BRASIL, 2006).
A conservação do leite humano cru a baixa temperatura afeta a acidez titulável.
Quando a temperatura diminui, passando de 20°C/3h para 4°C/48hs de armazenagem,
a acidez titulável pode variar de 8 a 13°D ou mais. Sendo a concentração de ácido
lático invariável a baixa temperatura, a acidez Dornic poderá ser diretamente
influenciada pela concentração de ácidos graxos não esterificados de cadeia longa. O
pH do leite humano encontra-se entre 5,47 e 7,84 e varia diretamente com as semanas
de lactação e, indiretamente, com o percentual lipídico (COLLARES; GONÇALVES;
FERREIRA, 1997).
Como o controle físico químico do leite humano cru requer métodos rápidos,
práticos e com baixo custo operacional, o Centro de Referência Nacional dos Bancos
de Leite Humano do Instituto Fernandez Figueira da Fundação Oswaldo Cruz
(RNBLH/IFF/FIOCRUZ) vem promovendo estudos que visam desenvolver metodologias
alternativas para o controle de qualidade do leite humano dos BLHs do Brasil (BRASIL,
2006).
Segundo Cavalcante et al. (2005), não existem na literatura especializada dados
sobre acidez Dornic de leite humano cru congelado e sua relação com o binômio
tempo/temperatura; nem com os teores de creme, gordura total e valor energético, e a
acidez titulável como ferramenta para selecionar amostras de leite humano destinado
ao consumo nos bancos de leite. Os padrões de acidez titulável medida em graus
Dornic (D°) é determinada, através do Ministério da Agricultura (BRASIL, 1981), pela
adaptação da técnica usada em leite de vaca para leite humano.
Portanto, melhorias nas técnicas de coleta manual e de armazenamento do leite
humano em congeladores domésticos com temperaturas entre -10 e -18ºC, poderão
reduzir a quantidade de leite humano desprezado por acidez titulável elevada
(CAVALCANTE et al., 2005).
29
2.9.2 Pasteurização
Segundo descrição de Rego (2002), trata-se de um tratamento aplicado ao leite,
que visa a inativação térmica de 100% das bactérias patogênicas e 90% de sua
microbiota saprófita, por meio de um binômio de tempo-temperatura de 62,5ºC, por 30
minutos ou equivalente, calculado de modo a promover a equivalência a um tratamento
de 15 D para inativação térmica de Coxiella burnetti.
Atualmente o controle de qualidade da pasteurização é realizado através de
análise microbiológica descrita nas Recomendações técnicas para o funcionamento de
bancos de leite humano do Ministério da Saúde, que consiste na inoculação de quatro
alíquotas de 1 mL cada (pipetadas independentemente, após agitação em vórtex por 15
segundos), em tubos de 10 mL de Caldo Verde Brilhante (CVB) a 5% p/v, com tubo de
Durhan em seu interior. Após, a inoculação os tubos devem ser incubados a 36 + / -1ºC
por 48 horas, com replicação para tubos de CVB à concentração de 40 g/L, no caso de
resultados positivos (PONTES; IVASAKI; OLIVEIRA, 2003).
Falhas no beneficiamento do leite humano não são somente um perigo
presumível para as propriedades benéficas do leite humano, mas podem aumentar a
susceptibilidade para conseqüentes contaminações (BJÖRKSTÉN et al., 1980).
2.9.3 Refrigeração após pasteurização
A refrigeração visa obter uma diminuição na velocidade de reprodução
bacteriana e deve ser de 4ºC no mínimo (WEST; HEWITT; MURPHY, 1979). Segundo
Björkstén et al. (1980), na refrigeração a 4ºC não há crescimento bacteriano; já entre 6
e 8ºC, bactérias Gram-negativas podem multiplicar-se lentamente e deteriorar o leite.
As recomendações técnicas determinam uma manutenção em refrigeração a 5ºC por
24h para o leite humano pasteurizado e descongelado (BRASIL, 2006).
30
2.9.4 Congelamento após pasteurização
De acordo com a Rede Nacional de Bancos de Leite Humano (BRASIL, 2006),
uma vez pasteurizado, o leite pode permanecer até 6 meses congelado a uma
temperatura máxima de -10°C (dez graus Celsius negativos).
31
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Descrição do BLH da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Limeira
As doadoras passam por exames de saúde, não sendo aceito leite de mães com
moléstias. O leite é retirado por ordenha manual, após higienização dos mamilos e
mãos, armazenado por até 7 dias em congelador ou freezer e transportado em caixas
de isopor com gelo reciclável até o BLH.
Na recepção do leite é realizado teste de acidez, com o acidímetro de Dornic: os
valores médios são de 3 a 4ºD, podendo se aceitar valores menores que 8ºD. A
pasteurização ocorre em frascos com 300 mL de leite em cada um. Há um frasco
controle, com termômetro para verificação da temperatura, que deve atingir 62,5ºC no
período de 30 minutos.
Os frascos são colocados em imersão em água destilada e álcool com a
temperatura de 5ºC para rápido resfriamento.
3.2 Amostragem
A pesquisa foi realizada em leite maduro (obtido a partir do 15º dia pós-parto, em
média). Foram fornecidas 60 amostras de 20 mL de leite humano cru congelado de
diferentes doadoras com excedente de produção láctea. As amostras individuais de 20
mL de leite foram acondicionadas em frascos de vidro esterilizado com tampa. As
amostras foram transportadas ao laboratório da Escola Superior de Agricultura ESALQ-
USP, em Piracicaba, em caixas isotérmicas, contendo gelo reciclável, no período de no
máximo 1 hora, com uma temperatura máxima de 4ºC.
Para que este estudo fosse concretizado, foi necessária aprovação do Comitê de
Ética da Santa Casa de Misericórdia de Limeira, de acordo com a resolução 196
32
(BRASIL, 1996) do Conselho Nacional da Saúde, Diretrizes e Normas
Regulamentadoras envolvendo seres humanos e também que as mães envolvidas
assinassem um termo de consentimento livre e esclarecido para a doação do leite
destinado ao estudo (APÊNDICE B).
3.3 Caracterização microbiológica do leite coletado
Foram realizadas a contagem de Staphylococcus coagulase + e contagem global
de microrganismos aeróbios mesófilos; coliformes totais e Escherichia coli. Foram feitas
diluições decimais de 10
-1
a 10
-7
, em tubos com água salina peptonada estéril, contendo
9 mL.
3.3.1 Staphylococcus coagulase positivo (+)
Para contagem de ECP foi utilizado o método de contagem direta em placas,
semeadura em superfície e espalhamento com alça de Drigalski, descrito por Downes e
Ito (2001). Foi inoculado 1,0 mL da amostra de leite, distribuído por 3 placas de ágar
Baird-Parker (BP), previamente preparadas e secas, com emulsão de ovo salina mais
solução aquosa de telurito de potássio a 1%, sendo 3 com 0,3mL; uma com 0,1mL.
Inoculou-se em duplicata 0,1mL da amostra com diluições de 10
-3
e 10
-4
. Espalhou-se
o inóculo com uma alça de Drigalski. As placas foram incubadas invertidas a 35ºC por
48 horas em estufa bacteriológica. Contaram-se as colônias típicas: negras, pequenas,
com halo translúcido ao seu redor. Estas colônias foram submetidas aos testes de
catalase, coloração de Gram e coagulase.
Para o teste de catalase foi adicionado em uma lâmina de vidro para
microscopia, parte da colônia suspeita e adicionada solução de H
2
O
2
a 3% sendo
positivo para as colônias que borbulharam.
33
As colônias selecionadas foram inoculadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion-
Infusão de cérebro e coração), incubada a 35ºC/24 horas. Parte deste cultivo foi
transferida com alça microscópica para uma lâmina de microscopia. Foram feitos
esfregaços seguindo a técnica de coloração de Gram, sendo positivas as colônias que
apresentaram coloração azul e cocos em forma de cacho irregulares.
Para o teste de coagulase foram colocados em um tubo de ensaio previamente
estéril, 0,2 mL do cultivo do caldo BHI com 0,5 mL de Plasma-EDTA, plasma de coelho
com EDTA, incubados em banho-maria a 37ºC/4 h observando-se a formação do
coágulo; o resultado foi expresso em UFC/mL.
Inoculação em placas com BP
(continua)
Figura 1 – Plaqueamento em meio B.P. e teste de coagulase.
0,3 mL
0,3 mL 0,3 mL 0,1 mL
34
Teste de coagulase
(conclusão)
Figura 1 – Plaqueamento em meio B.P. e teste de coagulase.
3.3.2 Contagem global de microrganismos aeróbios totais
Para determinação da contagem de microrganismos aeróbios mesófilos, foram
realizadas diluições decimais em tubos, com água peptonada estéreis. As diluições
decimais foram de 10
-1
a 10
-7
.
Segundo Downes e Ito (2001), alíquotas de 1,0 mL foram inoculadas em
profundidade em Plate Count Agar (PCA) em duplicata e incubadas a 35º/48 horas em
estufa bacteriológica, considerando-se para a contagem as placas que continham entre
25 e 250 colônias. O resultado foi expresso em UFC/mL.
35
Plaqueamento com PCA
Figura 2 – Plaqueamento em meio P.C.A.
3.3.3 Contagem de microrganismos do grupo coliforme total e Escherichia coli
Seguiu-se a metodologia segundo Downes e Ito (2001) em diluições decimais de
10
-1
a 10
-7
, em tubos com água peptonada estéreis. Utilizou-se para contagem a técnica
do número mais provável, série de 3 tubos. Os microrganismos coliformes totais e E.
coli foram determinados pelo meio LST-MUG Test (Lauril Sulfato Triptose modificado
com MUG-4-metil umbeliferil-β-D-glucuronídeo). O meio LST-MUG Test para coliformes
totais e E. coli contém MUG que é um substrato fluorescente.
Após o período de 24-48h, foi realizada a leitura dos tubos que indicaram
formação de gás e então foram expostos à luz ultravioleta ( 6 w e λ = 325.nm ). Os
tubos com fluorescência azul foram considerados positivos, pois a E. coli hidrolisa o
MUG, liberando 4-metilumbeliferona, que exibe fluorescência verde azulada sob a luz
ultravioleta.
36
Após a leitura dos tubos na luz de UV, todos os tubos que apresentaram
formação de gás foram inoculados com alça microbiológica em meio Verde Brilhante
Bile a 2% em tubos com tubos de Durhan invertidos à de 35°C por 24-48 h, em estufa
bacteriológica verificando-se a formação de gás e confirmação da presença de
coliformes totais.
Os tubos que apresentaram formação de gás foram contados como positivos a
partir da tabela dos NMP/mL (números mais prováveis). Os resultados foram expressos
em NMP/mL .
Figura 3 – Determinação de coliformes em meio LST- MUG.
Meio LST-MUG
(Verificação de tubos com
produção de gás)
Amostra de leite humano.
Foram realizadas diluições
até 10
7
(triplicata)
37
Meio LST-MUG (tubo positivo)
Tubos LST-MUG com produção de gás
Câmara de fluorescência
Tubos positivos com fluorescência
Figura 4 – Determinação de Escherichia coli em câmara de fluorescência.
Meio verde-brilhante
(contagem de coliformes totais)
Tubo com produção de gás.
38
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 2 mostra os resultados obtidos a partir das amostras de leite humano
fornecidas:
Tabela 2 – Contagens microbiológicas no leite humano cru.
(continua)
Amostra E. coli
NMP/mL
Coliformes
NMP/mL
Mesófilos
UFC/mL
ECP
UFC/mL
1 <0,3 <0,3 4,8 x 10
2
0,4 x 10
2 <0,3 <0,3 5,1 x 10
2
<0,1
3 <0,3 <0,3 3,1 x 10 8,0
4 0,4 0,4 1,0 6,0
5 4,6 x 10 4,6 x 1 0 2,7 x 10
4
>10
2
6 <0,3 <0,3 1,5 x 10 <1,0
7 2,3 4,6 x 10
5
4,6 x 10
6
<1,0
8 4,3 x 10
4
1,1 x 10
6
2,5 x 10
6
>10
2
9 2,4 x 10
5
2,1 x 10
5
5,5 x 10
7
>10
2
10 <0,3 <0,3 1,2 x 10
4
<1,0
11 <0,3 <0,3 4,7 x 10
4
<1,0
12 <0,3 <0,3 4,4 x 10
5
<1,0
13 <0,3 0,9 2,1 x 10
3
<1,0
14 <0,3 9,3 5,3 x 10
2
<1,0
15 <0,3 7,5 x 10
2
5,6 x 10
4
<1,0
16 <0,3 4,3 x 10
2
7,0 x 10
5
<1,0
17 <0,3 7,5 1,8 x 10
2
<1,0
18 <0,3 2,4 x 10
2
5,9 x 10
4
3,0
19 <0,3 <0,3 2,8 x 10
5
1,8 x 10
20 <0,3 <0,3 5,2 x 10
5
5,0
21 0,4 0,7 1,7 x 10
2
3,0 x 10
22 <0,3 <0,3 4,6 x 10
2
5,0
23 0,4 0,9 x 10 3,7 x 10
1
4,0 x 10
24 0,9 x 10 1,1 x 10
2
1,5 x 10
2
<1
25 2,4 x 10
1
2,4 x 10
3
4,3 x 10
3
<1
26 2,3 7,5 x 10
2
3,0 x 10 1,4 x 10
39
(conclusão)
Amostra E. coli
NMP/mL
Coliformes
NMP/mL
Mesófilos
UFC/mL
ECP
UFC/mL
27 2,3 9,3 x 10
2
3,6 x 10
2
3,3 x 10
1
28 2,3 2,4 x 10
4
9,2 x 10
4
9,0
29 2,3 2,4 x 10
4
1,6 x 10
6
1,5 x 10
30 2,3 9,3 x 10 2,9 x 10
4
1,0 x 10
2
31 0,4 0,4 8,3 x 10
3
2,4 x 10
32 0,4 0,4 1,1 x 10
5
2,0
33 7,0 1,1 5,0 x 10
4
7,5 x 10
34 4,0 0,4 3,5 x 10
5
<1
35 9,0 9,3 1,1 x 10
5
<1
36 2,3 x 10 2,8 1,0 x 10
5
<1
37 <0,3 4,3 4,8 x 10
4
<1
38 <0,3 <0,3 <1 1,0 x 10
39 0,4 2,1 9,4 x 10
3
<1
40 <1 1,5 1,5 x 10
2
<1
41 0,4 0,7 5,5 x 10
4
2,0 x 10
4
42 0,7 1,5 5,0 x 10
4
5,0 x 10
4
43 0,9 9,3 1,0 x 10
5
<1
44 0,4 9,3 1,4 x 10
4
<1
45 <0,3 1,0 x 10
2
1,7 x 10
4
3,0
46 <0,3 9,3 1,3 x 10
4
4,3 x 10
47 <0,3 <0,3 <1 4
48 <0,3 0,4 1,0 x 10 <1
49 <0,3 <0,3 0,7 x 10 <1
50 <0,3 <0,3 4,5 x 10 <1
51 <0,3 0,4 5,4 x 10
3
<1
52 <0,3 0,9 1,0 x 10
1
<1
53 <0,3 <0,3 2,5 x 10
3
1
54 <0,3 0,4 3,0 x 10 <1
55 <0,3 7,2 x 10
2
1,4 x 10
6
<1
56 0,9 7,5 x 10
2
1,5 x 10
6
<1
57 2,3 2,3 x 10
2
8,6 x 10
6
19
58 0,9 4,6 x 10
2
2,1 x 10
4
<1
59 2,3 1,1 x 10
4
9,8 x 10
5
<1
60 2,3 2,4 x 10
4
2,3 x 10
2
<1
40
Tabela 3 – Distribuição da freqüência da população de microrganismos nas amostras positivas de leite
humano analisadas.
Micror-
ganismos.
+/n
%
Total
1 a 99
10
2
a
9,9x10
2
10
3
a
9,9x10
3
10
4
a
9,9x10
4
10
5
a
9,9x10
5
10
6
a
9,9x10
6
10
7
a
9,9x10
7
E. coli
NMP/mL
30/60
50,00
28
93,33%
<0,3
<0,3
1
3,33%
1
3,33%
<0,3
<0,3
Coliformes
totais
NMP/mL
45/60
75,00
26
57,77%
11
24,4%
1
2,22%
4
8,88 %
2
4,44%
1
2,22%
<0,3
Mesófilos
UFC/mL
58/60
96,66
10
17,24%
10
17,24%
6
10,34%
15
25,86 %
10
17,24%
6
10,34%
1
1,72%
ECP
1
UFC/mL
28/60
46,66
22
78,57%
1
3,57%
3
10,71%
2
7,14%
<1,0
<1,0
<1,0
93,33%
3,33%
3,33%
Figura 5 – Distribuição das freqüências das populações de E. coli nas amostras positivas (NMP/mL).
1
Estafilococos coagulase positivo
■ 1 a 99
■ 10
4
a 9,9x10
4
■ 10
5
a 9,9x10
5
41
Como indica a Tabela 2, em relação ao microrganismo Escherichia coli, o
resultado deste estudo encontrou 50% (30 amostras) contaminadas, embora
apresentando populações pequenas na maioria delas. Na Figura 5, que ilustra a
freqüência das populações, encontram-se: 93,33% (28 amostras) das amostras
contaminadas com populações de 1 a 99 NMP/mL; 3,33% (1 amostra) com população
de 10
4
a 9,9x10
4
NMP/mL; 3,33% (1 amostra) com populações de 10
5
a 9,9x10
5
NMP/mL.
Os autores Serafini et al. (2003) relataram que, de 194 amostras de LHO (leite
humano ordenhado) cru não pasteurizado, foi encontrada contaminação em 70,4% das
amostras com microrganismos indicadores e/ou patogênicos, sendo 1,66% (3 amostras)
contaminadas por E. coli. Das 144 amostras de leite pasteurizado analisadas, foram
encontradas 73 amostras (50,7%) apresentando contaminação; sendo que 2,7% (2
amostras) com Staphylococcus lugdenensis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
do grupo viridans; 6,9% (5 amostras) com S. aureus; 20,6% (15 amostras) com S.
epidermis e 12,3% das amostras foram detectadas enterobactérias. Ainda 50,7%
(37amostras) foram positivas para bolores e leveduras.
Em outro estudo, Pontes; Ivasaki e Oliveira (2003) analisaram 27 amostras de
leite humano pasteurizado e verificaram que 25,9% (7 amostras) foram positivas para
coliformes fecais.
Segundo Novak et al. (2001), em estudo sobre microrganismos do grupo
coliformes de 837 amostras de leite ordenhado, oriundas do banco de leite humano do
Instituto Figueira da Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, somente (4,2%)
foram positivas para E. coli.
Esses estudos verificaram uma contaminação bem menor do que a presente
pesquisa, a qual encontrou 50% das amostras contaminadas pelo microrganismo
Escherichia coli.
Costa; Souza e Santos (2004) encontraram 1,8% de amostras positivas para E.
coli em 30 amostras de leite humano cru do banco de leite de João Pessoa, PB. A
amostra com maior contagem apresentou 2,4x10
2
UFC/mL.
Comparando os estudos de Costa; Souza e Santos (2004) e Novak et al. (2001),
observa-se que os resultados obtidos desses estudos apresentaram-se com menor
42
ocorrência do microrganismo Escherichia coli que o presente estudo no qual 50% das
amostras foram positivas.
Durante o aleitamento materno diretamente ao seio da mãe, não há
transferência destes microrganismos, que são contaminantes secundários, isto é, a sua
presença é indicativa de contaminantes externos provenientes de manipuladores,
utensílios e equipamentos (PONTES; IVASAKI; OLIVEIRA, 2003).
Em outro estudo, Moulin et al. (1998) relataram que no leite humano, no tempo
zero de coleta, a presença do microrganismo E. coli foi detectada em 12,1% (4
amostras).
Considerando-se que o leite humano doado é submetido ao processo de
pasteurização e manutenção da cadeia do frio, após a pasteurização de acordo com as
diretrizes da RNBLH (Rede Nacional de Bancos de Leite Humano), tais procedimentos
tornarão o produto analisado por este presente estudo adequado ao consumo a que se
destina, dada a reduzida população encontrada na maioria das amostras. Nos bancos
de leite humano, após a pasteurização o leite processado é submetido ao teste CVB a
5% p/v, com tubo de Durhan em seu interior, para a pesquisa de coliformes. Segundo
Pontes; Ivasaki e Oliveira (2003), este teste confirmará a qualidade do leite após a
pasteurização, pois se ocorrer presença de microrganismos, o leite pasteurizado será
descartado.
Mas, salienta-se que, a presença de E. coli no leite humano de banco de leite é
indicativa de contaminação de origem fecal e observa-se que as amostras desse estudo
indicam problemas higiênico-sanitários (FRANCO; LANDGRAFF, 2003).
43
57,77%
2,22%
8,88%
24,40%
4,44%
2,22%
Figura 6 – Distribuição das freqüências das populações de coliformes totais nas amostras positivas
(NMP/mL).
Na Tabela 2, observa-se que nas amostras analisadas foram encontradas 75%
das amostras positivas para microrganismos coliformes totais.
Na Figura 6, observa-se a distribuição da freqüência das populações de
coliformes totais nas amostras analisadas. Em 57,77% (26 amostras) apresentaram
populações entre 1 a 99 NMP/mL; em 24,4% (11 amostras) com populações entre 10
2
e
9,9x10
2
UFC/mL; em 2,22% (1 amostra) com populações de 10
3
a 9,9x10
3
NMP/mL;
em 8,88% (4 amostras) com populações de 10
4
a 9,9x10
4
NMP/mL; em 4,44% (2
amostras) com populações de 10
5
a 9,9x10
5
NMP/mL;
em
2,22% (1 amostra) com
população de 10
6
a 9,9x10
6
NMP/mL. Quanto à qualidade do leite humano ordenhado
deste estudo, após a pasteurização ele provavelmente atingiria os padrões da
legislação quanto à ausência de coliformes a 35ºC requerida para o leite humano
pasteurizado, na maioria das amostras.
Segundo o estudo de Bortolozo et al. (2004) com 5 amostras de leite humano
processado do Instituto de Ponta Grossa/PR, não foram detectados coliformes.
Enquanto que no estudo de Pontes; Ivasaki e Oliveira (2003), na avaliação
microbiológica de leite materno processado em 27 amostras, detectou-se contaminação
com coliformes totais em 33,3% das amostras positivas.
■ 1 a 99
■ 10
2
a 9,9x10
2
■ 10
3
a 9,9x10
3
■ 10
4
a 9,9x10
4
■ 10
5
a 9,9x10
5
■ 10
6
a 9,9x10
6
44
No estudo de Serafini et al. (2003) houve detecção de coliformes em 21,1% das
amostras de leite humano cru e em 5,6% das amostras de pasteurização, mostrando
que a eficiência da pasteurização pode ser comprometida por uma carga microbiana
inicial elevada.
No estudo de Costa; Souza e Santos (2004), em 15 amostras de leite
pasteurizado rejeitadas pelo controle de qualidade do banco de leite humano Anita
Cabral (BLHAC), 20% (3 amostras) delas foram positivas para coliformes totais, 40%
para microrganismos aeróbios mesófilos e 13% para Bacillus cereus.
Um outro estudo realizado com 343 amostras de leite humano ordenhado,
obtidas a partir de frascos oriundos de coleta domiciliar, recebidos pelo banco de leite
humano do Instituto Fernandez Figueira – IFF, os microrganismos do grupo coliformes
totais foram detectados em 31,2% das amostras analisadas, com populações de
coliformes variando de 3,0x10 a 1,1x10
4
NMP/mL (NOVAK; ALMEIDA, 2002).
Novak et al. (2001) verificaram que de 837 amostras de leite ordenhado, 31%
estavam contaminadas com coliformes. Identificaram 0,23% de amostras positivas para
E. sakazakii. Recentemente cepas de E. sakazakii começaram a ser associadas à
infecção em neonatos (SIMMONS et al., 1989).
Os estudos de Lin et al. (1988) encontraram um resultado negativo para
coliformes em amostras de leite humano cru de 10 (dez) doadoras individuais. Mas, na
amostras em “pool”, a contagem para coliformes alcançou valores de <1 a 3,4x10
5
UFC/mL, tendo como média 6,8x10
4
UFC/mL.
Os resultados obtidos por Moulin et al. (1998), apresentaram população de
coliformes totais de zero a 15 NMP/mL, sendo que, em 24 amostras (72,7%) não
evidenciaram coliformes totais.
Rodrigues (2005) analisou 60 amostras de leite humano cru de BLH encontrando
(20%) 12 amostras positivas para coliformes totais.
No presente estudo encontrou-se uma maior porcentagem de amostras positivas
para coliformes (75%), salientando a importância da educação das mães doadoras
quanto às técnicas de manipulação e armazenamento do LHO (leite humano
ordenhado), segundo a RNBLH (Rede Nacional de Bancos de Leite Humano).
45
17,24%
17,24%
10,34%
25,86%
17,24%
10,34%
1,72%
Figura 7 – Distribuição das freqüências das populações de microrganismos aeróbios mesófilos positivos
encontrados nas amostras positivas (UFC/mL).
Neste estudo, conforme Tabela 1, os resultados obtidos em relação aos
microrganismos aeróbios mesófilos foram positivos em 96,66% das amostras
analisadas (58 amostras). Apenas 17,24% (10 amostras) apresentaram populações de
1 a 99 UFC/mL, enquanto 17,24% (10 amostras) apresentaram populações de 10
2
a
9,9x10
2
UFC/mL; em 10,34% (6 amostras) foram detectados de 10
3
a 9,9x10
3
UFC/mL;
25,86% (15 amostras) apresentaram entre 10
4
e 9,9x10
4
UFC/mL; 17,24% (10 amostras)
entre 10
5
e 9,9x10
5
UFC/mL; 10,34% (6 amostras) ficaram entre 10
6
e 9,9x10
6
UFC/mL;
1,72% (1 amostra) entre 10
7
e 9,9 x 10
7
UFC/mL. A Figura 7 mostra a distribuição da
população desses microrganismos.
O estudo de Pontes; Ivasaki e Oliveira (2003) encontrou 13 amostras (48,2%)
positivas para os microrganismos aeróbios mesófilos em leite humano pasteurizado.
Apesar dos melhores resultados citados e os obtidos no presente estudo,
populações maiores não significam necessariamente falhas no processamento do leite
de banco, pois é normal o leite conter bactérias aeróbias mesófilas.
Resultados semelhantes a este estudo ocorreram na avaliação de 24 amostras
de leite materno do banco da Maternidade Evangelista Rosa (Teresina, PI), onde 96%
das amostras analisadas foram positivas quanto à presença de microrganismos
■ 1 a 99
■ 10
2
a 9,9x10
2
■ 10
3
a 9,9x10
3
■ 10
4
a 9,9x10
4
■ 10
5
a 9,9x10
5
■ 10
6
a 9,9x10
6
■ 10
7
a 9,9x10
7
46
aeróbios mesófilos (ASSIS NETO et al., 2001). No presente estudo foram detectados
microrganismos aeróbios mesófilos em 96,6% das amostras analisadas.
Segundo Assis Neto et al. (2001), os resultados encontrados no estudo em
relação aos microrganismos aeróbios mesófilos nas amostras de leite humano cru
apresentaram uma população média de 5,7x10
5
UFC/mL.
Outro trabalho, analisando 30 amostras de leite cru pelo banco de leite humano
Anita Cabral, apresentou 100% de positividade para bactérias aeróbias mesófilas, com
contagens que variaram entre 1,1x10
2
e 3,7x10
5
UFC/mL. Nas amostras de leite
humano pasteurizado, 40% (15 amostras) foram rejeitadas pelo controle da qualidade
do banco de leite, pois eram positivas para microrganismos aeróbios mesófilos
(COSTA; SOUZA; SANTOS, 2004).
O estudo de Moulin et al. (1998) relatou, no tempo zero de coleta de leite
humano cru, uma população que variou de 2x10 a 10
6
UFC/mL de microrganismos
aeróbios mesófilos.
Rodrigues (2005) encontrou 56 amostras positivas para microrganismos aeróbios
mesófilos no leite humano cru de banco de leite humano, representando 93,33% das
amostras analisadas. As populações encontradas apresentaram populações reduzidas,
sendo que apenas uma amostra atingiu a população de 1,9x10
5
UFC/mL.
Mesmo que o alimento não tenha sofrido alterações organolépticas, um número
elevado de microrganismos aeróbios mesófilos indica que houve condições para que os
patógenos, se presentes, se multiplicassem, podendo chegar a níveis perigosos,
principalmente porque a maioria das bactérias patogênicas de origem alimentar é
mesófila (FRANCO; LANDGRAFF, 2003).
O resultado microbiológico deste estudo destaca que o leite humano apresenta
uma contaminação microbiana, sugerindo que existe risco de alteração da qualidade do
leite em algumas amostras.
Provavelmente, a maioria das amostras desse estudo estaria dentro do padrão
da legislação RDC nº 12 (BRASIL, 2001) após a pasteurização, visto que somente
27,7% do leite analisado apresentaram populações de microrganismos aeróbios
mesófilos elevadas, isto é, acima ou igual a 10
6
UFC/mL.
47
O grupo de microrganismos aeróbios mesófilos inclui a maioria dos
contaminantes presentes, permitindo uma visão do padrão microbiológico do leite
(MARSHAL, 1992).
Pela população de microrganismos aeróbios mesófilos obtidos em 96,66% das
amostras analisadas, o presente estudo salienta a importância de boas práticas de
manipulação e de armazenamento do LHO (leite humano ordenhado).
78,57%
3,57%
10,71%
7,14%
Figura 8 – Distribuição das populações de Staphylococcus coagulase positivo encontrados nas amostras
(UFC/mL).
Na Tabela 2, observa-se que das 60 amostras de leite humano cru analisadas,
46,66% foram positivas para Staphylococcus coagulase positiva.
Na Figura 8, observa-se a distribuição da freqüência nas amostras, onde o
resultado encontrado foi de: 78,57% (22 amostras) com populações de 1 a 99 UFC/mL;
3,57% (1 amostra) com populações de 10
2
a 9,9x10
2
UFC/mL; 10,71% (3 amostras)
com populações de 10
3
a 9,9x10
3
UFC/mL e 7,14% (2 amostras) com populações de
10
4
a 9,9x10
4
UFC/mL.
■ 1 a 99
■ 10
2
a 9,9x10
2
■ 10
3
a 9,9x10
3
■ 10
4
a 9,9x10
4
48
Esse resultado é facilmente explicável, visto que o microrganismo
Staphylococcus aureus é encontrado na orofaringe dos seres humanos com prevalência
de 35 a 40% e na boca e saliva, de 10 a 35% (SERAFINI et al., 2003).
Assim, sua presença no leite humano cru pode ser interpretada como
contaminação secundária a partir da pele e das fossas nasais das doadoras. A maior
preocupação quanto a sua presença incide sobre a ocorrência de cepas produtoras de
enterotoxinas resistentes ao calor (JAY, 2005).
Pereira et al. (1995) relataram a presença de Staphylococcus em todas as
amostras do leite materno procedentes de 19 mulheres com sintomas de mastite. Das
19 cepas isoladas, oito sintetizavam quantidades detectáveis de enterotoxinas. As
populações encontradas de Staphylococcus coagulase positiva (ECP) foram de 10
2
a
10
4
UFC/mL. Em alimentos é aceito que a população de Staphylococcus aureus possa
multiplicar-se e atingir uma população de até 10
6
UFC/mL para que haja produção de
enterotoxinas em quantidades suficientes para causar um quadro de intoxicação
(MILIOTS; BIER, 2003).
Em relação ao leite humano cru, os resultados do estudo de Serafini et al. (2003)
que encontraram 7,35% (10 amostras) foram semelhantes ao de Carrol; Davies e Osma
(1979), que observaram S. aureus em 13 amostras (6,2%) das 207 de leite humano
pesquisados.
No estudo de Moulin et al. (1998), as amostras provenientes do tempo zero de
coleta apresentaram Staphylococcus aureus em 18,8% (6 amostras) analisadas.
Pontes; Ivasaki e Oliveira (2003) encontraram no estudo 12 amostras positivas
(44,4%) e Serafini et al. (2003) encontraram 5 amostras positivas (6,9%) contaminadas
com ECP, ambos em leite humano pasteurizado.
Rodrigues (2005) encontrou 54 (90%) amostras positivas para ECP
(Staphylococccus coagulase positivo) o que foi superior ao presente estudo, onde
somente 46,6% (28 amostras) estavam positivas para ECP. Os resultados encontrados
por Costa, Souza e Santos (2004) encontraram 12,7% das amostras contaminadas com
Staphylococcus aureus no leite humano cru e 7% das amostras contaminadas eram
provenientes do leite humano pasteurizado. Neste estudo encontraram-se as seguintes
populações: 78,57% das amostras positivas entre 1 a 99 UFC/mL; 3,57%
49
apresentaram entre 10
2
e 9,9 x 10
2
UFC/mL; 10,71 % (3 amostras) entre 10
3
e 9,9 x 10
3
e 7,14% apresentaram de 10
4
a 9,9 x 10
4
UFC/mL.
A RDC (Resolução de Diretoria Colegiada) nº12 (BRASIL, 2001) estabelece
como ausência o padrão de referência para ECP no leite humano pasteurizado, uma
vez que sua presença em alimentos pode indicar deficiência de processamento ou de
condições inadequadas do processo. Além do mais, este microrganismo produz toxinas,
que presentes, podem causar intoxicação alimentar (SILVA; GANDRA, 2004).
No caso de enterotoxinas, há necessidade de um número considerável de
células de 10
5
e 10
6
UFC/mL para que haja produção de enterotoxinas em quantidades
suficientes para haver quadro de intoxicação (MILIOTS; BIER, 2003). Comparando-se o
resultado obtido, a conclusão deste estudo apresenta segurança do leite, pois a
população maior encontrada foi de 10
4
UFC/mL. Contudo, deve ser lembrado que o leite
humano é destinado ao consumo de uma população altamente vulnerável, que são
crianças recém-nascidas em UTI (Unidade de Tratamento Intensivo).
A RDC (Resolução de Diretoria Colegiada) nº12 (BRASIL, 2001) prevê sua
ausência de ECP no leite humano pasteurizado, que também provavelmente seria
alcançado nas amostras analisadas por este estudo. O risco que permanece é a toxina,
que uma vez secretada no leite e sendo termorresistente, permaneceria no produto
pasteurizado.
Assim, são sugeridos cuidados higiênicos aos manipuladores de leite humano, já
que esse microrganismo é naturalmente encontrado na pele e fossas nasais de
manipuladores e são indicadores da qualidade sanitária do produto.
50
5 CONCLUSÕES
• Nas amostras analisadas, o E. coli foi positivo em 50% e os coliformes totais em
75% das amostras, sendo sugestivo de falhas na manipulação do produto pelas
doadoras.
• O resultado de 46,66% de amostras positivas para Staphylococcus coagulase
positivo apresenta-se próximo aos encontrados em outros estudos.
• A maioria das amostras contaminadas apresentou contagens reduzidas dos
microrganismos estudados.
• Os resultados obtidos por este estudo ressaltam a importância de práticas
adequadas de manipulação e armazenamento do leite humano cru devido às
suas características nutricionais, à garantia de qualidade e à segurança do
alimento.
• Este estudo ressalta a importância do beneficiamento ao qual o leite humano
recebe em bancos de leite, onde a pasteurização é fundamental para que o
produto seja seguro do ponto de vista microbiológico, por ser utilizado em
neonatos prematuros de UTI’s (Unidade de terapia intensiva).
51
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59
APÊNDICES
60
APÊNDICE A
61
APÊNDICE B
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu, Maria Rita, escrevo-lhe para que você faça parte da pesquisa intitulada
“Avaliação da qualidade microbiológica de leite humano cru recebido em banco de leite
humano”, que busca o efeito da pasteurização sobre o leite humano. O leite utilizado
para análise será o que você doou e que não atingiu um volume necessário para a
pasteurização.
Seu nome não irá aparecer na pesquisa, ou seja, seu anonimato será respeitado,
e você terá o direito de, após a doação, ou durante a fase de análise dos dados, se
recusar a participar da mesma. A não participação ou abandono não acarretarão
penalidades ao seu filho ou a sua pessoa. Não será utilizado nenhum dado que poderá
identificá-la.
Sabendo dos direitos a mim reservados, descritos acima, eu
___________________________________________________ afirmo que fui
devidamente esclarecida e concordo em participar desta pesquisa, assinando o termo
de consentimento em 2 vias, sendo uma (1) para mim e outra para o pesquisador.
Limeira, 18 de maio de 2005.
Nome por extenso: ______________________________________
RG. __________________________________________________
Assinatura _____________________________________________
Tel. Para contato: 3442-1988
Reclamações: telefone Comitê de Ética – Santa Casa de Limeira – 3446-6122
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