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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE
MAMONEIRA (Ricinus communis L.) PELO TESTE DE TETRAZÓLIO
CAROLINA MARIA GASPAR DE OLIVEIRA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da Unesp - Campus de Botucatu,
para obtenção do título de Doutor em
Agronomia (Agricultura).
BOTUCATU-SP
Dezembro - 2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE
MAMONEIRA (Ricinus communis L.) PELO TESTE DE TETRAZÓLIO
CAROLINA MARIA GASPAR DE OLIVEIRA
Orientador: Profª. Drª. Cibele Chalita Martins
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da Unesp - Campus de Botucatu,
para obtenção do título de Doutor em
Agronomia (Agricultura).
BOTUCATU - SP
Dezembro - 2007
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- LAGEADO - BOTUCATU (SP)
Gaspar-Oliveira, Carolina Maria, 1980-
G249a Avaliação da qualidade fisiológica de sementes de ma-
moneira (Ricinus communis L.) pelo teste de tetrazólio /
Carolina Maria Gaspar de Oliveira. – Botucatu : [s.n.],
2007.
xv, 96 f. : il. color., tabs.
Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2007
Orientador: Cibele Chalita Martins
Inclui bibliografia
1. Mamona. 2. Sementes - Qualidade. 3. Sementes – Via-
bilidade. 4. Tetrazólio. I. Martins, Cibele Chalita. II.
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Campus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agronômicas.
III. Título.
DEDICO
DEDICODEDICO
DEDICO
Aos meus pais, por todo o
carinho, compreensão,
incentivo e amor
incondicional.
OFEREÇO
OFEREÇOOFEREÇO
OFEREÇO
Ao meu amado marido
Marcelo, companheiro para
a vida toda. Obrigada pelo
incentivo, reconhecimento,
e principalmente pela
paciência.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por estar sempre presente em minha vida, me guiando e a quem confio todos os meus
passos.
À minha família pelo apoio e incentivo, em especial, meu irmão Henrique e meus sogros Hélio
e Mafalda, por estarem sempre torcendo por mim.
À Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP, pela oportunidade de realizar este curso.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão
da bolsa de estudos e incentivo à pesquisa.
E às pessoas que, de alguma maneira, contribuíram para a realização deste trabalho,
especialmente:
À Profª Drª Cibele Chalita Martins pela orientação e amizade no decorrer do curso.
Ao Prof. Dr. João Nakagawa pela amizade e ensinamentos durante toda a minha formação.
À Drª Maria Cristina Leme de Lima Dias por ter me iniciado no aprendizado sobre o teste de
tetrazólio.
Ao Prof. Dr. Cláudio Cavariani, responsável pelo Laboratório de Análise de Sementes, pelo
apoio e colaboração.
Aos membros da banca examinadora Dr. José de Barros França Neto, Prof. Dr. Nelson
Moreira de Carvalho e Profª Drª Ana Dionisia da Luz Coelho Novembre pelas sugestões que
enriqueceram este trabalho.
Á Valéria Cristina Giandoni pela amizade e preciosa colaboração durante a realização deste
trabalho.
Aos professores e funcionários do Departamento de Produção Vegetal – Setor Agricultura
pela atenção, ajuda e amizade e pelo excelente período de convivência, em especial, Vera, Lana,
Maurílio e Cirinho.
Aos funcionários da Seção de Pós-graduação e Biblioteca, pela atenção e por todos os
serviços que prestaram sempre de forma solícita.
Aos amigos Fábio Suano de Souza, Claudemir Zucarelli e Maria Filomena de Andrade
Rodrigues, pela colaboração indispensável.
Ao colega José Salvador Foloni, docente da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,
pelo fornecimento de lotes de sementes de mamoneira.
Aos amigos e colegas da Pós-graduação e graduação, em especial Carla, Rogério, Sandra,
Mariana, Nara e Armando.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................
VIII
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................
XI
RESUMO...........................................................................................................................
1
SUMMARY.......................................................................................................................
3
1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................
5
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................................
7
2.1 O teste de tetrazólio na avaliação da qualidade das sementes...............................
7
2.2 A estrutura da semente de mamoneira e o teste de tetrazólio................................
9
2.3 Metodologia do teste de tetrazólio.........................................................................
11
2.4 Interpretação dos resultados do teste de tetrazólio................................................
16
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................
20
3.1 Etapa 1 - Métodos de preparo das sementes para o teste de tetrazólio..................
20
3.2 Etapa 2 - Concentração da solução e período de coloração das sementes para o
teste de tetrazólio....................................................................................
24
3.2.1 Caracterização dos lotes...............................................................................
24
3.2.1.1 Teor de água........................................................................................ 24
3.2.1.2 Teste de germinação em areia..............................................................
24
3.2.1.3 Teste de germinação em papel.............................................................
25
3.2.1.4 Emergência de plântulas em campo.................................................... 26
3.2.1.5 Índice de velocidade de emergência de plântulas (IVE).....................
27
3.2.2 Concentração da solução e período de coloração das sementes...................
27
3.2.2.1 Primeira fase: estudo preliminar para a definição dos tratamentos de
concentração da solução e período de coloração.................................
27
3.2.2.2 Segunda fase: avaliação dos tratamentos.............................................
28
Página
3.2.2.2.1 Comparação dos resultados de viabilidade do teste de
tetrazólio..................................................................................
31
3.2.2.2.2 Qualificação das cores das sementes pelo catálogo de Munsell.
32
3.2.2.2.3 Correlação entre os resultados do teste de tetrazólio e de
germinação...............................................................................
32
3.2.3 Análise estatística.........................................................................................
33
3.3 Etapa 3 – Metodologia de pré-condicionamento das sementes para o teste de
tetrazólio..............................................................................................
33
3.3.1 Primeira fase: seleção dos tratamentos de pré-condicionamento.................
34
3.3.2 Segunda fase: avaliação da uniformidade de embebição dos lotes de
sementes nos tratamentos selecionados.....................................................
36
3.3.3 Terceira fase: comparação dos resultados do teste de tetrazólio com os do
teste de germinação....................................................................................
37
3.3.4 Análise estatística.........................................................................................
39
3.4 Etapa 4 – Metodologia para a avaliação do vigor das sementes pelo teste de
tetrazólio..............................................................................................
39
3.4.1 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes pelo teste de tetrazólio..
40
3.4.2 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes por outros testes............
40
3.4.2.1 Envelhecimento acelerado................................................................
41
3.4.2.2 Teste de classificação do vigor de plântulas.....................................
41
3.4.2.3 Comprimento de plântulas................................................................
42
3.4.2.4 Massa da matéria seca de plântulas..................................................
43
3.4.3 Análise estatística.........................................................................................
43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................
44
4.1 Etapa 1 - Métodos de preparo das sementes para o teste de tetrazólio.................
44
4.2 Etapa 2 - Concentração da solução e período de coloração das sementes para o
teste de tetrazólio.................................................................................
49
4.2.1 Caracterização dos lotes...............................................................................
49
Página
4.2.2 Concentração da solução e período de coloração das sementes...................
50
4.2.2.1 Primeira fase: estudo preliminar para a definição dos tratamentos de
concentração da solução e período de coloração.................................
50
4.2.2.2 Segunda fase: avaliação dos tratamentos.............................................
53
4.2.2.2.1 Comparação dos resultados de viabilidade do teste de
tetrazólio..................................................................................
53
4.2.2.2.2 Qualificação das cores das sementes pelo catálogo de Munsell.
55
4.2.2.2.3 Correlação entre os resultados do teste de tetrazólio e de
germinação...............................................................................
59
4.3 Etapa 3 – Metodologia de pré-condicionamento das sementes para o teste de
tetrazólio..............................................................................................
60
4.3.1 Primeira fase: seleção dos tratamentos de pré-condicionamento.................
62
4.3.2 Segunda fase: avaliação da uniformidade de embebição dos lotes de
sementes nos tratamentos selecionados.....................................................
66
4.3.3 Terceira fase: comparação dos resultados do teste de tetrazólio com os do
teste de germinação....................................................................................
71
4.4 Etapa 4 – Metodologia para a avaliação do vigor das sementes pelo teste de
tetrazólio..............................................................................................
77
4.4.1 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes pelo teste de tetrazólio..
77
4.4.2 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes por outros testes............
83
5 CONCLUSÕES..............................................................................................................
88
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 89
VIII
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 Caracterização física e fisiológica dos cinco lotes de sementes de mamoneira,
utilizados na segunda etapa, determinada pelo teor de água (%) e pelos testes de
germinação em areia (%), germinação em papel (%), emergência de plântulas em
solo (%) (conduzido de 02 a 23 de Fevereiro de 2006) e índice de velocidade de
emergência (IVE)......................................................................................................
50
Tabela 2 Sementes de mamoneira viáveis pelos testes de tetrazólio (TZ), conduzidos nos
diferentes tratamentos de concentração da solução e período de coloração, e pelos
testes de germinação em areia e em papel.................................................................
54
Tabela 3 Porcentagem de sementes de mamoneira distribuídas nas cores do catálogo de
Munsell (1976), após os testes de tetrazólio conduzidos nos diferentes
tratamentos de concentração (%) e período de coloração (minutos).........................
56
Tabela 4 Distribuição das sementes de mamoneira nos grupos de cores, com as
correspondentes cores do catálogo de Munsell, após o teste de tetrazólio,
conduzido nos diferentes tratamentos de concentração da solução (%) e período
de coloração (minutos)..............................................................................................
58
Tabela 5 Correlação simples das médias dos testes de germinação em areia, em papel, e
dos testes de tetrazólio (TZ) conduzidos nos tratamentos de concentração da
solução e período de coloração para sementes de mamoneira..................................
60
Tabela 6 Caracterização física e fisiológica dos cinco lotes de sementes de mamoneira,
utilizados na terceira etapa, determinada pelo teor de água (%) das sementes com
e sem tegumento e pelos testes de germinação em areia (%), emergência de
plântulas em campo (%) (conduzido de 01 a 21 de Abril de 2006) e índice de
velocidade de emergência (IVE)...............................................................................
61
IX
Página
Tabela 7 Teor de água das sementes de mamoneira (lote 6) sem tegumento após o pré-
condicionamento nos métodos entre papel com tegumento (EPC), entre papel sem
tegumento (EPS) e imersão em água com tegumento (IAC), nos 69 tratamentos....
63
Tabela 7 Continuação...............................................................................................................
64
Tabela 8 Teor de água de sementes de mamoneira sem tegumento após o pré-
condicionamento nos métodos entre papel com tegumento (EPC), entre papel sem
tegumento (EPS) e imersão em água com tegumento (IAC), nos 30 tratamentos
selecionados, para a média de cinco lotes.................................................................
67
Tabela 9 Teor de água de cinco lotes de sementes de mamoneira sem tegumento após os
tratamentos de pré-condicionamento no método entre papel com tegumento..........
69
Tabela 10 Teor de água de cinco lotes de sementes de mamoneira sem tegumento após os
tratamentos de pré-condicionamento no método entre papel sem tegumento...........
70
Tabela 11 Porcentagem de sementes viáveis e de sementes viáveis e não viáveis com
coloração desuniforme e com manchas esbranquiçadas, observadas no teste de
tetrazólio realizado após dez tratamentos de pré-condicionamento nos métodos
entre papel com tegumento (EPC) e sem tegumento (EPS), para o lote 6 de
sementes de mamoneira.............................................................................................
71
Tabela 12 Sementes viáveis de mamoneira determinadas pelo teste de tetrazólio, realizado
após seis tratamentos de pré-condicionamento no método entre papel com
tegumento (EPC), e pelo teste de germinação em areia............................................
74
Tabela 13 Sementes viáveis de mamoneira determinadas pelo teste de tetrazólio, realizado
após seis tratamentos de pré-condicionamento no método entre papel com
tegumento (EPC), e pelo teste de germinação em areia, para a média dos cinco
lotes...........................................................................................................................
76
X
Página
Tabela 14 Viabilidade (viáveis vigorosas e não vigorosas) e vigor (viáveis e vigorosas) de
sementes de mamoneira pelo teste de tetrazólio......................................................
83
Tabela 15 Caracterização dos cinco lotes de sementes de mamoneira utilizados na quarta
etapa pelo teor de água (TA) e pelos testes de primeira contagem do teste de
germinação (PC), germinação em papel (GP), germinação entre areia (GA),
normais fortes pelo teste de classificação das plântulas (NF), emergência de
plântulas em campo (EC) (conduzido de 01 a 21 de Novembro de 2006), índice
de velocidade de emergência (IVE), envelhecimento acelerado (EA),
comprimento de plântulas (CP) e massa de matéria seca de plântulas (MS)............
84
Tabela 16 Análise de correlação simples (r) entre as médias dos testes de primeira contagem
da germinação (PC), germinação em papel (GP), germinação entre areia (GA),
normais fortes pelo teste de classificação das plântulas (NF), emergência de
plântulas em campo (EC), índice de velocidade de emergência (IVE), viabilidade
e vigor pelo teste de tetrazólio (TZ), envelhecimento acelerado (EA),
comprimento de plântulas (CP) e massa de matéria seca de plântulas (MS),
realizados para cinco lotes de sementes de mamoneira............................................
85
XI
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 Semente de mamoneira em corte longitudinal, no sentido da espessura, paralelo
aos cotilédones (a) e em corte longitudinal mediano, no sentido do comprimento
(b)............................................................................................................................
9
Figura 2 Preparo da semente de mamoneira mediante corte longitudinal mediano, no
sentido do comprimento da semente, através do tegumento, endosperma e
embrião: corte (a); semente cortada (b); sementes cortadas imersas na solução
de tetrazólio (c).......................................................................................................
21
Figura 3 Preparo da semente de mamoneira mediante corte longitudinal diagonal na
região distal da carúncula, evitando-se atingir o eixo embrionário, no sentido da
largura da semente, através do tegumento, endosperma e embrião: sementes
cortadas (a); sementes cortadas imersas na solução de tetrazólio (b).....................
21
Figura 4 Preparo da semente de mamoneira mediante remoção do tegumento: processo
de remoção do tegumento (a); sementes sem o tegumento (b)...............................
22
Figura 5 Preparo da semente de mamoneira mediante remoção do tegumento, seguida de
corte longitudinal mediano, no sentido do comprimento da semente, através do
endosperma e embrião: corte (a); sementes cortadas imersas na solução de
tetrazólio (b)............................................................................................................
22
Figura 6 Preparo da semente de mamoneira mediante remoção do tegumento, seguida de
corte longitudinal mediano, no sentido da espessura da semente, paralelo aos
cotilédones, através do endosperma e embrião: corte (a); sementes cortadas (b)..
23
Figura 7 Teste de germinação em areia para sementes de mamoneira................................. 25
Figura 8 Teste de emergência de plântulas em campo: visão geral (a), e detalhe das
plântulas de mamoneira emersas, com os cotilédones abertos (b)......................... 26
XII
Página
Figura 9 Corte longitudinal no sentido do comprimento da semente de mamoneira,
mostrando o endosperma (a) e as estruturas embrionárias: cotilédones (b), eixo
hipocótilo-radícula (c), epicótilo (d), córtex e cilindro central (e)......................... 29
Figura 10 Sementes viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando as
estruturas do embrião desenvolvidas, intactas e com cor rosa............................... 30
Figura 11 Sementes viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando
pequenas necroses nos cotilédones, ou no endosperma, sem atingir a junção do
eixo embrionário e dos cotilédones........................................................................ 30
Figura 12 Sementes viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando
pequenas necroses na ponta extrema da radícula, sem atingir o cilindro central... 31
Figura 13 Sementes não viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando
lesões intensas, embriões descoloridos ou com áreas críticas do embrião
descoloridas............................................................................................................
31
Figura 14 Qualificação das sementes de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, nas fichas
de cores do catálogo de Munsell.............................................................................
32
Figura 15 Pré-condicionamento das sementes de mamoneira: entre papel toalha para
germinação (a); imersão em água (b)..................................................................... 35
Figura 16 Sementes de mamoneira apresentando coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) após o teste de tetrazólio; detalhes: mancha no eixo
hipocótilo-radícula em semente vigorosa (c); mancha no endosperma (d)............
38
Figura 17 Teste de classificação de plântulas de mamoneira: normais fortes (a), normais
fracas (b), e anormais (c)........................................................................................ 42
XIII
Página
Figura 18 Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante
remoção do tegumento, seguida de corte longitudinal mediano, no sentido do
comprimento, através do endosperma e embrião....................................................
45
Figura 19 Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante
corte longitudinal mediano, no sentido do comprimento, através do tegumento,
endosperma e embrião............................................................................................
45
Figura 20 Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante
remoção do tegumento, seguida de corte longitudinal mediano no sentido da
espessura da semente, paralelo aos cotilédones, através do endosperma e
embrião................................................................................................................... 46
Figura 21 Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante
corte longitudinal diagonal na região distal da carúncula evitando-se atingir o
eixo embrionário: com tegumento (a); após a retirada do tegumento (b); e após
corte longitudinal mediano através do embrião (c)................................................
47
Figura 22 Sementes de mamoneira preparadas mediante remoção do tegumento, após duas
horas de imersão no tetrazólio (a); e após corte longitudinal mediano através do
embrião (b)..............................................................................................................
47
Figura 23 Sementes de mamoneira preparadas mediante remoção do tegumento, após seis
horas de imersão no tetrazólio (a); e após corte longitudinal mediano através do
embrião (b)..............................................................................................................
48
Figura 24 Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 1,0% por
30 minutos (a), 60 minutos (b) e 90 minutos (c).................................................... 51
Figura 25 Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,5% por
60 minutos (a), 90 minutos (b) e 120 minutos (c).................................................. 51
XIV
Página
Figura 26 Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,2% por
60 minutos (a), 120 minutos (b) e 180 minutos (c)................................................ 52
Figura 27 Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,1% por
120 minutos (a), 180 minutos (b) e 240 minutos (c).............................................. 52
Figura 28 Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,075% por
120 minutos (a), 180 minutos (b) e 240 minutos (c).............................................. 53
Figura 29 Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sementes com tegumento por 10 horas a 35ºC........
72
Figura 30 Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sementes sem tegumento por 6 horas a 25ºC..........
72
Figura 31 Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sementes sem tegumento por 6 horas a 30ºC.......... 73
Figura 32 Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sementes sem tegumento por 6 horas a 40ºC.......... 73
Figura 33 Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, com coloração rosa-claro a rosa
em toda a extensão do embrião e do endosperma, com tecidos firmes e túrgidos,
sem apresentar lesões visíveis.................................................................................
78
Figura 34 Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, apresentando pequenos danos
superficiais em volta dos cotilédones, mas sem atingi-los..................................... 78
XV
Página
Figura 35 Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, com coloração fraca, indicando
restrição à penetração da solução de tetrazólio.......................................................
78
Figura 36 Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, com coloração vermelho carmim
(tecido em deterioração) na extremidade apical inferior do eixo hipocótilo-
radícula....................................................................................................................
79
Figura 37 Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, apresentando áreas com coloração
rosa-escuro a vermelho carmim no endosperma, mas o tecido está túrgido e
brilhante..................................................................................................................
79
Figura 38 Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, apresentando endosperma e/ou
cotilédones com menos de 50% das áreas não coloridas........................................
80
Figura 39 Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, com a extremidade do eixo
hipocótilo-radícula sem coloração, mas com os tecidos firmes e túrgidos.............
80
Figura 40 Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, apresentando endosperma e/ou
embrião com coloração vermelha-escura, porém brilhante e sem alteração de
textura..................................................................................................................... 80
Figura 41 Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, que só teriam possibilidade de
germinar sob condições extremamente favoráveis.................................................
81
Figura 42 Sementes não viáveis de mamoneira, apresentando mais de 50% das áreas dos
cotilédones e/ou endosperma não coloridas............................................................
81
Figura 43 Sementes não viáveis de mamoneira, apresentando ausência de coloração na
região do eixo hipocótilo-radícula e tecidos flácidos e brancos ou amarelados.....
82
Figura 44 Sementes não viáveis de mamoneira, com áreas do endosperma e embrião
totalmente sem coloração........................................................................................
82
1
RESUMO
O teste de tetrazólio é um método rápido e eficaz para avaliar a
viabilidade e o vigor de sementes. O presente trabalho teve por objetivo padronizar a
metodologia do teste de tetrazólio para a avaliação da qualidade fisiológica de sementes de
mamoneira (Ricinus communis L.). A pesquisa foi realizada em quatro etapas. Na primeira,
testou-se o método de preparo das sementes (corte longitudinal mediano através do tegumento,
endosperma e embrião; corte longitudinal diagonal na região distal da carúncula sem atingir o
eixo embrionário; remoção do tegumento; remoção do tegumento com corte longitudinal
mediano através do endosperma e embrião; e remoção do tegumento com corte longitudinal
mediano, paralelo aos cotilédones, através do endosperma e embrião), avaliando-se a
coloração. Na segunda, a concentração da solução de tetrazólio (1,0%, 0,5%, 0,2%, 0,1% e
0,075%) e o período de coloração (30 a 240 minutos) foram estudados e os resultados
comparados com os obtidos nos testes de germinação. Na terceira, testaram-se os métodos de
pré-condicionamento das sementes (entre papel umedecido, sementes com tegumento, por 6,
8, 10, 12, 14, 16 e 18 horas, a 30ºC, 35ºC e 40ºC; entre papel umedecido, sementes sem
tegumento, e imersão em água das sementes com tegumento, ambos por 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas,
a 25ºC, 30ºC, 35ºC e 40ºC), sendo os resultados avaliados pela uniformidade na coloração e
comparados aos obtidos no teste de germinação. Na quarta, avaliou-se a classificação dos lotes
de sementes quanto à viabilidade e ao vigor pelo teste de tetrazólio, sendo os resultados
comparados aos obtidos nos testes de germinação em areia, em papel, primeira contagem da
germinação em papel, emergência de plântulas em campo, índice de velocidade de
2
emergência, classificação do vigor de plântulas, comprimento e massa da matéria seca de
plântulas e envelhecimento acelerado. O delineamento experimental empregado nas etapas foi
o inteiramente casualizado, e a comparação de médias realizada pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade. Os resultados indicaram que o teste de tetrazólio é eficiente para estimar a
viabilidade e o vigor de sementes de mamoneira. A avaliação da qualidade fisiológica das
sementes de mamoneira pelo teste de tetrazólio deve ser realizada pré-condicionando as
sementes com tegumento, entre papel toalha umedecido, por 16 horas a 35ºC, ou por 18 horas
a 30ºC ou 40ºC. Após esse período, o tegumento deve ser removido e as sementes cortadas
longitudinal e medianamente, no sentido do comprimento, através do endosperma e embrião e,
então, imersas na solução de tetrazólio na concentração de 0,2% por 120 minutos, na
temperatura de 35ºC, para o desenvolvimento da coloração.
3
EVALUATION OF CASTOR BEAN SEED PHYSIOLOGICAL QUALITY BY THE
TETRAZOLIUM TEST. Botucatu, 2007. 111p. Tese (Doutorado em Agronomia/
Agricultura) - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.
Author: CAROLINA MARIA GASPAR DE OLIVEIRA
Adviser: CIBELE CHALITA MARTINS
SUMMARY
The tetrazolium test is a quick and accurate method for estimating
seed viability and vigor. This research had the objective of standardizing the tetrazolium test
methodology for the evaluation of physiological quality of castor bean seeds (Ricinus
communis L.). The research was carried out in four parts. In the first one, seed preparation
methods (longitudinal cut through the middle of the seed coat, endosperm and embryo;
longitudinal and diagonal cut without reaching the embryo; coat removal; coat removal with
longitudinal cut through the middle of the endosperm and embryo; and coat removal with
longitudinal cut parallel to cotyledons through the middle of the endosperm and embryo) were
evaluated by staining evaluations. In the second part tetrazolium solution concentrations
(1.0%, 0.5%, 0.2%, 0.1% and 0.075%) and staining periods (30 to 240 minutes) were tested.
The results were compared to the ones from the germination test. In the third part, seed
preconditioning methods (between moist paper towel, seeds with coat, for 6, 8, 10, 12, 14, 16
and 18 hours, at 30ºC, 35ºC and 40ºC; between moist paper towel, seeds without coat, and
seeds with coat immersed in water, both for 1, 2, 3, 4, 5 and 6 hours, at 25ºC, 30ºC, 35ºC and
40ºC) were evaluated and the results were evaluated by staining uniformity and compared with
germination test values. In the fourth part, seed lot classification for viability and vigor were
evaluated by the tetrazolium test and the results were compared to ones from the germination
test in sand, in paper, first count of the germination test in paper, seedling emergence in the
field, emergence speed index, seedling vigor classification, seedling length and dry matter and
accelerated aging tests. All tests were conducted at the same time. The statistical design was
completely randomized, and the means comparisons were accomplished by the Tukey test at
0.05 level of probability. The results showed that the tetrazolium test is efficient for estimating
castor bean seed viability and vigor. To evaluate physiological quality by the tetrazolium test,
castor bean seeds should be preconditioned with coat between moist paper towel for 16 hours
4
at 35ºC or for 18 hours at 30ºC or 40ºC. After this period, the coat must be removed and the
seeds should be cut longitudinally, in the length direction, through the middle of the
endosperm and embryo and then placed in tetrazolium solution at a concentration of 0.2% for
120 minutes, at 35ºC, for the staining development.
________________________
Keywords: Ricinus communis L., seed, tetrazolium test, physiological quality, vigor.
5
1 INTRODUÇÃO
A mamoneira (Ricinus communis L.) vem ganhando importância no
cenário nacional devido principalmente ao Programa Brasileiro de Desenvolvimento
Tecnológico do Biodiesel - PROBIODIESEL, que busca fontes alternativas de energia,
capazes de substituir o petróleo. Este programa criou um novo mercado para o óleo de
mamona, que exigirá grandes áreas de plantio para atender a demanda do mercado de
combustíveis. De acordo com o IBGE (2007), na safra 2006 a área plantada de mamoneira foi
de 137.555 ha e para 2007 há a previsão de colheita de 195.971 ha, o que representa uma
demanda de 980 a 2000 toneladas de sementes.
Dessa maneira, a produção de sementes de mamoneira tem se
apresentado cada vez mais tecnificada, com a participação de grandes empresas neste
segmento de mercado. A obtenção de informações precisas e completas sobre a qualidade das
sementes produzidas torna-se importante durante a produção e comercialização,
principalmente, em comparação a outras opções para a produção do biodiesel, como a soja, o
amendoim e o girassol, que dispõem de tecnologias estabelecidas de produção de sementes.
O teste de tetrazólio é utilizado na rotina dos laboratórios de análise de
sementes como uma importante ferramenta no controle da qualidade. A rapidez de execução
do teste o torna importante para o setor, agilizando as decisões, pois seus resultados são
empregados no estabelecimento de bases para a comercialização, avaliação da viabilidade e
6
para a identificação de problemas no processamento e armazenamento, além de permitir uma
estimativa do vigor das sementes.
Diversos fatores podem interferir na obtenção de resultados
satisfatórios no teste de tetrazólio, principalmente aqueles relacionados à metodologia de
execução como: preparo das sementes antes da coloração, concentração da solução de
tetrazólio, período e temperatura de exposição à solução e critérios de interpretação.
A eficiência do teste em avaliar a viabilidade e, em alguns casos, o
vigor das sementes está relacionada ao desenvolvimento de metodologia adequada e ao
estabelecimento de critérios complementares para a avaliação de cada espécie, como foi
realizado para amendoim, soja, milho, algodão, braquiária, tomate, abobrinha, melancia,
feijão-vagem, café, seringueira, entre outras.
Assim, o objetivo desse estudo foi padronizar a metodologia do teste
de tetrazólio para a avaliação da qualidade fisiológica de sementes de mamoneira.
7
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O teste de tetrazólio na avaliação da qualidade das sementes
A qualidade fisiológica da semente é avaliada por meio de duas
características fundamentais: viabilidade e vigor, que representam diferentes atributos da
semente. A viabilidade, medida principalmente pela germinação, procura determinar o
máximo potencial germinativo da semente, oferecendo, para isso, as condições ambientais
mais favoráveis para o processo. O vigor representa atributos mais sutis da qualidade
fisiológica, não revelados pelo teste de germinação, e é determinado sob condições
desfavoráveis, ou medindo-se o declínio de alguma função bioquímica ou fisiológica da
semente (MARCOS FILHO et al., 1987).
Entre os testes mais utilizados para avaliar a qualidade das sementes,
destaca-se o teste de tetrazólio, pela sua rapidez, pois os resultados podem ser obtidos em
aproximadamente 24 horas, e pela sua confiabilidade, comprovada na avaliação da qualidade
de sementes de soja (FRANÇA NETO et al., 1998), milho (DIAS e BARROS, 1999), café
(DIAS e SILVA, 1998), feijão-vagem (BHERING et al., 1996), amendoim (BITTENCOURT,
1995), tomate (SANTOS, 2003), capim-colonião e braquiária (DIAS e ALVES, 2001 a, b),
entre outras.
Além disso, os dados obtidos pelo teste de tetrazólio podem ser
empregados no estabelecimento de bases para a comercialização, avaliação da viabilidade das
8
sementes na maturidade, controle de qualidade durante o processamento e período de
armazenamento e a identificação de problemas. Permite, ainda, uma avaliação do vigor das
sementes (MARCOS FILHO et al., 1987; SANTOS, 2003).
Entretanto, o teste de tetrazólio ainda não tem uso generalizado para
algumas espécies como a mamona (Ricinus communis L.), principalmente, devido à falta de
treinamento de pessoal e à deficiência de conhecimentos sobre a metodologia adequada
(MARCOS FILHO et al., 1987). As recomendações encontradas para a realização deste teste
em sementes de mamoneira são restritas e imprecisas em função da carência de pesquisas
relacionadas ao assunto (BRASIL, 1992), e as diferenças entre os métodos sugeridos
acarretam dificuldades para o estabelecimento de padrões a serem seguidos.
As informações gerais para a realização do teste de tetrazólio de várias
espécies estão indicadas nas Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) e têm sido
aprimoradas nos últimos anos. Assim, os estudos desenvolvidos têm procurado estabelecer as
condições de pré-condicionamento, a temperatura, a concentração da solução de tetrazólio, o
período de coloração e os critérios complementares para a avaliação, como pode se observar
nos trabalhos de seringueira (WETZEL et al., 1992), amendoim (BITTENCOURT, 1995), soja
(FRANÇA NETO et al., 1998), milho (DIAS e BARROS, 1999), algodão (VIEIRA e VON
PINHO, 1999), braquiária (DIAS e ALVES, 2001b), tomate (SANTOS, 2003), abobrinha
(BARROS et al., 2005), melancia (BHERING et al., 2005), entre outras espécies.
O teste de tetrazólio baseia-se na atividade de enzimas do grupo das
desidrogenases, particularmente a desidrogenase do ácido málico, envolvidas na atividade
respiratória das sementes, que catalisam a redução dos íons do sal de tetrazólio (cloreto de
2,3,5-trifenil tetrazólio) nos tecidos vivos. Íons de hidrogênio são transferidos para o sal de
tetrazólio, que atua como um receptor desse elemento. O tetrazólio, que é um sal incolor e
difusível é, então, reduzido a um composto não difusível de cor vermelha, conhecido por
trifenilformazan, o que indica que as desidrogenases estão ativas, e consequentemente que há
atividade respiratória nas mitocôndrias e, portanto, há viabilidade celular e do tecido
(DELOUCHE et al., 1976).
Assim, a coloração resultante da reação do tetrazólio é uma indicação
positiva da viabilidade por meio da detecção da respiração das células. As sementes
deterioradas ou danificadas mecanicamente desenvolvem rapidamente uma coloração
9
vermelha-escura intensa e profunda, enquanto as vigorosas apresentam coloração rósea a
vermelha e brilhante (DELOUCHE et al., 1976; BITTENCOURT, 1995; FRANÇA NETO et
al., 1998). Por outro lado, nos tecidos mortos ou muito deteriorados as enzimas desidrogenases
estão inativadas e por isso não ocorre a reação com o sal de tetrazólio e, consequentemente, a
coloração dos tecidos (MARCOS FILHO et al., 1987).
2.2 A estrutura da semente de mamoneira e o teste de tetrazólio
Na interpretação do teste de tetrazólio é necessário o conhecimento das
estruturas anatômicas da semente em análise (FRANÇA NETO et al., 1998). Essas
informações permitem estabelecer corretamente as condições para o preparo e os critérios para
a avaliação da semente. Nesse sentido, as sementes de mamoneira são constituídas por
tegumento, endosperma e embrião (Figura 1).
Figura 1 – Semente de mamoneira em corte longitudinal, no sentido da espessura, paralelo aos
cotilédones (a) e em corte longitudinal mediano, no sentido do comprimento (b).
a b
Tegumento
Endosperma
Cotilédones
Eixo hipocótilo -
radícula
Carúncula
Córtex e Cilindro
central
Epicótilo
10
As substâncias de reserva estão presentes principalmente no
endosperma, que preenche a maior parte do interior da semente, é rico em óleo e proteínas e
tem a função de nutrir o embrião durante o seu desenvolvimento, sendo totalmente absorvido
até a formação da plântula autotrófica (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).
O embrião está inserido no endosperma e é formado pelos cotilédones
e pelo eixo embrionário. As sementes de mamoneira apresentam dois cotilédones delgados,
semelhantes a folhas, e que possuem comprimento e largura similares ao da semente (Figura
1). Durante a germinação, esses cotilédones têm a função de liberar enzimas específicas para o
tecido endospermático, a fim de disponibilizar as reservas ali armazenadas para o
desenvolvimento do eixo embrionário. Os cotilédones emergem acima do solo e passam a
realizar fotossíntese limitada (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).
O eixo embrionário é pequeno em relação ao tamanho da semente. A
porção abaixo do nó cotiledonar é denominada hipocótilo, e na extremidade do eixo situa-se a
radícula e, devido à impossibilidade de se precisar onde termina o hipocótilo e onde começa a
radícula, é denominado de eixo hipocótilo-radícula (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).
Em Ricinus, o tegumento é representado por: uma epiderme externa,
constituída de células alongadas tangencialmente e pigmentadas; uma epiderme interna
constituída de células colunares; e por camadas de células parenquimáticas comprimidas entre
as duas camadas de epiderme (ESAU, 1974). A carúncula desenvolve-se a partir de divisões
das células do tegumento nas proximidades da micrópila e é rica em lipídeos e proteínas, que
atraem insetos, como as formigas, que dispersam as sementes (ESAU, 1974; LEUBNER,
2007).
As sementes de mamoneira são sensíveis aos danos que podem ocorrer
durante a extração de dentro dos frutos, já que estes apresentam certa resistência física à
máquina descascadora, enquanto as sementes apresentam tegumento quebradiço, embrião e
tecidos de reserva macios e delicados e radícula muito próxima à superfície da semente
(Figura 1). Tais danos se manifestam sob as formas de esmagamento total ou de partes da
semente, abrasões, rachaduras, quebras ou até mesmo remoção total do tegumento (LAGO et
al., 1985).
11
A composição química influencia diretamente o vigor e o potencial de
armazenamento das sementes (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000). Assim, as sementes de
mamoneira são constituídas, em média, por 18% a 26% de proteínas e 40% a 60% de óleo
(STREET e OPIK, 1974), sendo estes componentes a fonte de energia e aminoácidos para o
embrião (ESAU, 1974). A quantidade de carboidratos na semente varia de 0,7% a 12,7%, e no
tegumento de 53% a 70%. Ainda, nos tegumentos e cápsulas há compostos fenólicos como o
tanino, presente em até 2,5% do total da semente (MOSHKIN, 1986). A composição química
pode variar com a cultivar e a região de cultivo.
Além disso, de forma geral a semente de mamoneira é muito variável
em cor, forma, tamanho, peso, proporção do tegumento, presença ou ausência de carúncula e
maior ou menor aderência do tegumento ao endosperma (MAZZANI, 1983).
2.3 Metodologia do teste de tetrazólio
A amostra de sementes para o teste de tetrazólio deve ser
representativa do lote e coletada conforme as prescrições das Regras para Análise de Sementes
(BRASIL, 1992), que indicam que o teste deve ser efetuado com 200 sementes, em duas
repetições de 100 ou quatro de 50. Em avaliações internacionais predominam as
recomendações da International Seed Testing Association - ISTA (2004), que prescrevem a
utilização de quatro repetições de 100 sementes para a realização desse teste. Entretanto, as
amostras para testes não oficiais podem ser menores, para sementes de soja, milho, algodão,
amendoim e feijão-de-vagem os estudos realizados sugerem a utilização de duas repetições de
50 sementes (FRANÇA NETO et al., 1998; DIAS e BARROS, 1999; VIEIRA e VON
PINHO, 1999; BITTENCOURT, 1995; BHERING et al., 1999).
O material necessário para a condução do teste de tetrazólio é simples
e barato, podendo ser encontrado na maioria dos laboratórios, e consiste de bisturis ou lâminas
de barbear, pinças, papel-toalha, copinhos de plástico ou béquers de 50 ml, placas de Petri,
estufa ou germinador com controle de temperatura, refrigerador, recipiente de vidro cor âmbar,
sal de tetrazólio ou cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio e lupas com aumento de 6x e iluminação
fluorescente (DIAS e BARROS, 1999).
12
Geralmente, o início do preparo das sementes para a realização do teste
de tetrazólio é o pré-condicionamento, ou hidratação, que promove o amolecimento das
sementes, devido à reidratação dos tecidos e à ativação do sistema enzimático, com
intensificação da respiração e das demais atividades metabólicas. Esse processo facilita o
preparo das sementes para o teste, a penetração da solução de tetrazólio e o desenvolvimento
de uma coloração mais nítida e evidente (MOORE, 1985).
O teor de água das sementes após o período de hidratação é um fator
importante para o desenvolvimento da coloração no teste de tetrazólio (SANTOS, 2003).
Nesse sentido, destaca-se que a semente de mamoneira, no processo de embebição, absorve de
28 a 32% de água, e então inicia a hidrólise das macromoléculas para a nutrição do embrião
(BELTRÃO et al., 2001). Sementes de soja devem atingir no mínimo 27% de água, para que
não ocorram problemas de sementes com manchas mosaico e dificuldade no desenvolvimento
da coloração pelo tetrazólio (COSTA et al., 1998). Em seringueira, Wetzel et al. (1992)
observaram que as sementes devem atingir cerca de 30% de água para obter uma coloração
nítida na avaliação.
Durante o pré-condicionamento a absorção de água deve ser lenta para
evitar a ocorrência de trincas nas sementes, ou mesmo a lixiviação de substâncias solúveis,
principalmente em sementes deterioradas (MOORE, 1985). A temperatura na qual a semente
embebe exerce efeito significativo sobre o processo, interagindo com a disponibilidade de
água; sendo que a velocidade de absorção aumenta com a elevação da temperatura, em função
do aumento na pressão de difusão da solução de embebição (CARVALHO e NAKAGAWA,
2000). Dessa maneira, as temperaturas mais indicadas durante o período de embebição estão
entre 30ºC e 40
o
C (MOORE, 1985), pois promovem a redução do tempo de hidratação e,
consequentemente, de execução do teste, sem comprometer os resultados (COSTA et al.,
1998).
Os componentes da semente também influenciam a velocidade de
embebição e o desenvolvimento da coloração pelo tetrazólio, devido à composição química e a
qualidade fisiológica da semente e do tegumento, que possuem diferentes características
morfológicas, químicas e de impermeabilidade (WOODSTOCK, 1988). Resultados de
pesquisa têm demonstrado que a absorção processa-se mais rapidamente em sementes com
13
alto teor protéico, em função da característica hidrofílica das proteínas (BURCH e
DELOUCHE, 1959; LOPEZ e GRABE, 1973).
O pré-condicionamento das sementes pode ser realizado entre papel-
toalha (ou papel de germinação) umedecido, em forma de rolo ou dobrado em quatro, como
indicado para as sementes de soja, amendoim e seringueira (FRANÇA NETO et al., 1998;
BITTENCOURT, 1995; WETZEL et al., 1992), ou pela imersão das sementes em água, como
para as de abóbora e jenipapo (DIAS et al., 2001; NASCIMENTO e CARVALHO, 1998).
Ainda, de acordo com a espécie, variam o tempo e a temperatura para
a hidratação das sementes. Em algodão, o pré-condicionamento é realizado por 14 a 16 horas a
25ºC (VIEIRA e VON PINHO, 1999). A recomendação para sementes de soja é de 16 horas a
25ºC (FRANÇA NETO et al., 1998) ou por seis horas a 41ºC (COSTA et al., 1998). Já, para
sementes de amendoim, Bittencourt (1995) observou que a embebição deve ser realizada por
16 horas à temperatura de 20ºC. Em sementes de seringueira, que possuem o tegumento
rígido, este deve ser retirado antes do pré-condicionamento, o qual pode ser realizado por seis
ou 18 horas, à temperatura ambiente (WETZEL et al., 1992).
Entretanto, as condições para o condicionamento satisfatório ainda não
foram estabelecidas para a algumas espécies, como a mamoneira, para a qual o pré-
condicionamento tem sido executado de diversas maneiras: entre papel-toalha umedecido por
16 horas (GRABE, 1976) ou por 18 horas (BRASIL, 1992), ou imersão direta em água morna
durante três a quatro horas (GRABE, 1976). Destaca-se que não há especificação da
temperatura que deve ser utilizada para nenhum dos procedimentos descritos.
A velocidade com que a solução de tetrazólio atinge e colore os tecidos
das sementes depende do número de barreiras que este encontra (PIÑA-RODRIGUES e
SANTOS, 1988). Assim, em muitas espécies, o preparo da semente é necessário visando uma
rápida, mas não brusca, penetração do tetrazólio. O método de preparo das sementes depende
das características da espécie em exame, sendo que os mais utilizados são: bissecção (ou
corte) longitudinal, transversal ou lateral, puncionamento e remoção dos tegumentos
(MARCOS FILHO et al., 1987).
Sementes pequenas de leguminosas e de alguns outros gêneros não
requerem preparo, podendo ser colocadas diretamente na solução de tetrazólio (FRANÇA
NETO et al., 1998). Outras espécies, no entanto, possuem sementes com tegumento espesso e
14
duro que deve ser removido antes da coloração. É o caso de algumas espécies florestais como
a copaíba (Copaifera langsdorffii Desf.) (FOGAÇA et al., 2001), a sucará (Gleditschia
amorphoides Taub.) (FOGAÇA et al., 2006), a pata-de-vaca (Bauhinia forficata Link.)
(KROHN et al., 2001) e o guapuruvu (Schizolobium parahyba Vell. Blake) (PAULA et al.,
2001).
Sementes de amendoim possuem o tegumento fino, entretanto, a
remoção do tegumento antes da imersão das sementes na solução de tetrazólio possibilita a
redução do período de coloração em cinco horas, além de permitir a utilização de solução de
menor concentração (BITTENCOURT, 1995). Em sementes de algodão e de melancia, é
recomendado remover o tegumento anteriormente à imersão das sementes na solução de
tetrazólio (VIEIRA e VON PINHO, 1999; BHERING et al., 2005). Para essas espécies, nos
períodos de tempo estabelecidos, se os tegumentos não forem retirados não há absorção da
solução de tetrazólio.
A remoção do tegumento após o pré-condicionamento, geralmente,
possibilita maior uniformidade e rapidez no desenvolvimento da coloração. No entanto, este
procedimento pode prejudicar os resultados pela ocorrência de danos ao embrião durante a
remoção (MARCOS FILHO et al., 1987; VIEIRA e VON PINHO, 1999).
Algumas espécies necessitam que seja realizado o corte da semente
para a exposição do embrião e o contato direto deste com a solução de tetrazólio. Wetzel et al.
(1992) recomendam que após a embebição, as sementes de seringueira devem ser cortadas
longitudinalmente, de forma paralela aos cotilédones. As sementes de diversas gramíneas
como milho (DIAS e BARROS, 1999), trigo (DELOUCHE et al., 1976), arroz (DIAS e
SHIOGA, 1997), capim-colonião e braquiária (DIAS e ALVES, 2001 a, b), entre outras,
devem ser seccionadas longitudinal e medianamente através do embrião, pois o tetrazólio não
penetra o pericarpo das gramíneas.
Na literatura encontram-se recomendações relacionadas ao preparo das
sementes de mamoneira, indicando que este pode ser realizado de diversas formas: corte
longitudinal através do tegumento e do tecido de reserva, corte longitudinal diagonal evitando-
se atingir o eixo embrionário, remoção ou separação da extremidade distal da semente,
incluindo um fragmento do tecido de reserva (BRASIL, 1992), ou remoção do tegumento
(GRABE, 1976).
15
No processo de coloração, as sementes são colocadas em recipientes e
cobertas com solução de tetrazólio suficiente para mantê-las submersas. O período de
coloração das sementes depende das características de cada espécie, da temperatura ambiente e
da concentração da solução de tetrazólio, mas geralmente está entre 30 e 240 minutos
(DELOUCHE et al., 1976; MARCOS FILHO et al., 1987).
Várias concentrações da solução de tetrazólio podem ser utilizadas no
teste, dependendo da espécie avaliada, do método de preparo das sementes e da
permeabilidade do tegumento, sendo as mais utilizadas 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,5% e 1,0%
(DELOUCHE et al., 1976; MARCOS FILHO et al., 1987). Entretanto, são recomendadas as
menores concentrações do sal por possibilitarem melhor visualização da coloração dos tecidos
e dos diferentes tipos de injúrias (MARCOS FILHO et al., 1987; FRANÇA NETO et al.,
1998). Para a obtenção de uma coloração adequada, a solução de tetrazólio deve apresentar
valores de pH entre seis a oito, pois soluções ácidas alteram a velocidade e a intensidade de
coloração dos tecidos, dificultando a interpretação dos resultados (PIÑA-RODRIGUES e
SANTOS, 1988).
A precisão do teste de tetrazólio não é afetada por temperaturas entre
20ºC e 45ºC, mas a coloração se estabelece mais rapidamente nas temperaturas mais elevadas
(GRABE, 1976). Por esse motivo, Marcos Filho et al. (1987) recomendaram que as sementes
imersas na solução de tetrazólio sejam colocadas em uma câmara regulada à temperatura de
30ºC a 40
º
C, e mantidas no escuro, pois a solução de tetrazólio é fotossensível e, assim, a luz
pode alterar a coloração e comprometer os resultados do teste.
Wetzel et al. (1992) recomendaram a coloração de sementes de
seringueira em solução de tetrazólio de 0,5% por duas a três horas a 40ºC. Esses autores
verificaram que para esta espécie quanto maior o período de pré-condicionamento, menor o
período de coloração e vice-versa. Em sementes de soja, a recomendação é de concentração da
solução de 0,075% e temperatura de 35ºC a 40ºC, por 150 a 180 minutos (FRANÇA NETO et
al., 1998). Bittencourt (1995) recomendou a exposição das sementes de amendoim sem
tegumento em solução 0,05% de tetrazólio por três horas a 40ºC. Para algodão, a
recomendação é de solução de tetrazólio a 0,1% a 30ºC por, aproximadamente, quatro horas
(VIEIRA e VON PINHO, 1999).
16
Em sementes de mamoneira a prescrição das Regras para Análise de
Sementes (BRASIL, 1992) é de coloração na solução de tetrazólio a 1,0% à temperatura de
30ºC e por um período de seis a 24 horas. Também para esta espécie, Grabe (1976)
recomendou a concentração da solução de tetrazólio de 1,0% por duas a três horas a 35ºC.
Após o período de coloração, as sementes devem ser lavadas e
mantidas submersas em água até o momento da avaliação, que deve ser realizada
imediatamente. Porém, existe a possibilidade de manter as sementes de café e de milho
imersas em água sob 5ºC por até 24 horas, sem que ocorra alteração nas estruturas vitais das
sementes e na interpretação dos resultados (DIAS e SILVA, 1998; DIAS e BARROS, 1999).
No entanto, em sementes de amendoim, Bittencourt (1995) constatou que a manutenção das
sementes em refrigerador por períodos maiores que seis horas favorece o desenvolvimento de
fungos na superfície interna dos cotilédones e sobre o eixo embrionário, dificultando a análise.
Em sementes de feijão-de-vagem e de soja a avaliação deve ser feita em, no máximo, 12 horas
e as sementes mantidas em refrigerador (BHERING et al., 1996; FRANÇA NETO et al.,
1998).
2.4 Interpretação dos resultados do teste de tetrazólio
No início da interpretação é necessário identificar a intensidade da
coloração das diferentes estruturas da semente. Os tecidos vivos e vigorosos, geralmente
túrgidos, colorem-se de forma lenta e uniforme e apresentam coloração rosa ou vermelha,
brilhante e limpa, bem superficial (DELOUCHE et al., 1976; FRANÇA NETO et al., 1998).
Tecidos de sementes vigorosas podem restringir a entrada rápida da solução de tetrazólio,
propiciando o desenvolvimento de uma coloração rosa-claro ou até mesmo a ausência de
coloração dos tecidos localizados mais internamente. Porém, observa-se nesses casos que os
tecidos encontram-se firmes, túrgidos e brilhantes, indicando forte resistência do sistema de
membranas à penetração da solução de tetrazólio (VIEIRA e VON PINHO, 1999).
A ocorrência da coloração vermelho-escuro é característica de tecidos
em deterioração, que permitem maior intensidade de difusão da solução de tetrazólio nas
membranas celulares danificadas (DELOUCHE et al., 1976; FRANÇA NETO et al., 1998).
Os tecidos deteriorados muitas vezes estão vivos, porém, fracos e são identificados por
17
apresentarem-se flácidos e colorirem-se mais rápido e escuro que os tecidos normais (VIEIRA
e VON PINHO, 1999).
A ausência de coloração identifica tecidos mortos, que não apresentam
atividade enzimática suficiente para a produção do trifenilformazan. Esses tecidos
normalmente são flácidos e apresentam cor branca opaca, mas podem ser amarelados,
cinzentos ou esverdeados e apresentar pontuações ou manchas avermelhadas, dependendo da
presença de fungos, bactérias ou compostos formados durante a deterioração (DELOUCHE et
al., 1976; FRANÇA NETO et al., 1998).
A intensidade de coloração das sementes no teste de tetrazólio é
variável entre as espécies. Por exemplo, a cor rosa observada em sementes viáveis e de alto
vigor de soja é mais clara que a verificada em sementes de milho e algodão de mesma
qualidade. Nestas espécies, a cor que sinaliza um tecido de alto vigor é a rosa-escura ou
vermelha. Em sementes de soja essa cor rosa-escura significaria tecido em deterioração
(FRANÇA NETO et al., 1998; VIEIRA e VON PINHO, 1999; DIAS e BARROS, 1999).
A terminologia utilizada para denominar as cores observadas nas
sementes no teste de tetrazólio costuma ser estabelecida pelos autores e, por isso, pode variar
entre os trabalhos. Sementes de soja e de amendoim apresentam tonalidades de coloração
semelhantes, entretanto, de acordo com Bittencourt (1995), em amendoim, a cor rosa suave
designa tecidos vigorosos, as cores vermelha intenso e rosa muito intenso indicam tecido em
deterioração e as cores vermelha muito intenso e roxa indicam tecidos muito deteriorados.
Para sementes de soja, França Neto et al. (1998) descrevem a cor vermelha carmim para tecido
vivo e vigoroso e a cor vermelha carmim forte ou vermelho intenso para tecidos em
deterioração. Essas diferenças podem acarretar problemas de interpretação durante a avaliação
das sementes. Por essa razão, é interessante utilizar-se de uma terminologia padronizada,
correlacionando-se as cores observadas nas sementes com uma referência não subjetiva.
Nesse contexto, o catálogo de cores de Munsell (MUNSELL, 1976)
apresenta-se como um padrão de classificação de cores, sendo muito utilizado em diversas
áreas da ciência, como na classificação de solos, descrição de cores de frutos, alimentos e
bebidas, fabricação de tintas, desenhos gráficos, e outros. Esse catálogo surgiu da necessidade
de medir a cor qualitativa e quantitativamente de uma forma objetiva e apresenta a distribuição
da cor em três dimensões: tonalidade (espécie de cor ou matizes, determinadas pelo
18
comprimento de onda), valor (definido pelo brilho ou intensidade luminosa), e cromaticidade
(saturação da cor ou intensidade cromática) (ARAÚJO, 2004; PAULI, 2007). Entretanto, não
há descrições na literatura que indiquem a utilização deste catálogo, ou de qualquer outra
referência, para descrever as cores apresentadas pelas sementes no teste de tetrazólio.
Além da coloração, na interpretação dos resultados do teste de
tetrazólio também devem ser observadas a turgescência dos tecidos, a ausência de fraturas ou
lesões nas regiões vitais, danos causados por insetos e a formação morfológica da semente.
Deve ser considerada, ainda, a região de transição entre os tecidos normais e os tecidos mortos
ou deteriorados, bem como a extensão e localização das regiões coloridas e descoloridas
(FRANÇA NETO et al., 1998).
As Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) prescrevem para
a avaliação de Ricinus spp que se considere a semente viável aquela com o embrião e o
endosperma coloridos, podendo o endosperma apresentar pequenas necroses na superfície,
desde que não estejam em contato com o embrião.
Já, de acordo com Grabe (1976), a avaliação da viabilidade de
sementes de mamoneira deve ser realizada segundo os parâmetros do grupo “outras
dicotiledôneas não leguminosas”, por ele estabelecidos, segundo os quais uma semente é
viável quando as estruturas do embrião estão bem desenvolvidas, intactas e apresentam
coloração vermelha após a exposição ao sal de tetrazólio. Além disso, a semente viável pode
apresentar pequenas necroses nos cotilédones, em outras áreas que não sejam a junção do eixo
embrionário e dos cotilédones, ou pequenas necroses na ponta extrema da radícula.
Para aferir a interpretação dos resultados devem ser realizados testes
de germinação paralelos aos testes de tetrazólio, pois há uma correlação positiva e
significativa entre esses testes (FRANÇA NETO et al., 1998; CARBONERA e LEMANSKI,
1997; VIEIRA e VON PINHO, 1999). São aceitáveis diferenças de até 5% entre os resultados
dos dois testes, pois diferenças maiores indicam problemas na execução ou na avaliação de um
deles. Falhas na amostragem, presença de sementes dormentes ou duras, microrganismos nas
sementes ou no germinador, também podem causar discrepâncias entre os resultados destes
testes (DIAS e BARROS, 1995; FRANÇA NETO, 1999).
A determinação de níveis de viabilidade e de vigor pode ser efetuada
mediante a separação das sementes em diferentes classes durante a interpretação. Foram
19
estabelecidas oito classes para as sementes de soja, de feijão-vagem e de algodão (FRANÇA
NETO et al., 1998; BHERING et al., 1996; VIEIRA e VON PINHO, 1999). Nesses casos, a
soma das porcentagens de sementes incluídas nas classes 1 a 3 expressa os resultados do
vigor; a soma das classes 1 a 5, a viabilidade. As sementes pertencentes às classes 6 a 8 não
são viáveis. Por outro lado, a Association of Official Seed Analystis - AOSA (1983)
recomenda a interpretação do teste procurando enquadrar as sementes em três classes; as
classes 1 e 2 representam as sementes viáveis e a 3, as não-viáveis; nesse caso, as da classe 1
são computadas para a avaliação do vigor. Esse procedimento foi adotado para a interpretação
de testes conduzidos com sementes de milho, café, amendoim e tomate (DIAS e BARROS,
1999; DIAS e SILVA, 1998; BITTENCOURT, 1995; SANTOS, 2003).
Entre as vantagens do teste de tetrazólio destaca-se o fato de
possibilitar o exame das condições físicas e fisiológicas das estruturas do embrião de cada
semente individualmente; ser realizado com amostra menor que a exigida para o teste de
germinação; permitir rápida avaliação, na maioria dos casos em menos de 24 horas; requerer
equipamento simples e barato; e dependendo da espécie, permitir a identificação de diferentes
níveis de vigor e possibilitar o diagnóstico da causa da queda de viabilidade da semente. No
entanto, podem ser verificadas também algumas limitações como: necessitar de pessoal com
treinamento especial sobre a estrutura embrionária da semente e técnicas de interpretação; ser
relativamente tedioso, uma vez que as sementes são avaliadas uma a uma; necessitar de um
maior número de mão-de-obra por hora se comparado a outros testes; não mostrar a eficácia de
tratamentos químicos nem as injúrias que estes possam causar; não detectar a presença de
patógenos nas sementes; não identificar as sementes dormentes; e nem sempre possibilitar a
detecção de danos mecânicos recentes (MARCOS FILHO et al., 1987; VIEIRA e
CARVALHO, 1994; FRANÇA NETO, 1999).
Embora existindo dificuldades na condução do teste de tetrazólio, as
pesquisas têm trazido resultados positivos, com possibilidade de aprimoramento do método
para as sementes de várias espécies. Em sementes de mamoneira, a padronização do método
para o teste de tetrazólio irá expandir a utilização pelas empresas e laboratórios de análise de
sementes, que devido à demanda, necessitam de um método rápido de avaliação da qualidade
dessas sementes.
20
3 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi conduzida no Laboratório de Análise de Sementes do
Departamento de Produção Vegetal, setor de Agricultura, da Faculdade de Ciências
Agronômicas, da Universidade Estadual Paulista, em Botucatu - SP.
Utilizaram-se 15 lotes de sementes de mamoneira, cultivar AL
Guarany 2002, de diversas procedências, numerados de 1 a 15, homogeneizados e amostrados
em 2.000g cada um, para a realização das análises (BRASIL, 1992). A pesquisa foi realizada
em quatro etapas descritas a seguir.
3.1 Etapa 1 - Métodos de preparo das sementes para o teste de tetrazólio
Nesta etapa, foram avaliados cinco métodos de preparo das sementes
para o teste de tetrazólio, utilizando-se apenas o lote 1, em duas repetições de 25 sementes
para cada preparo, que estão descritos e ilustrados a seguir:
• Corte longitudinal mediano, no sentido do comprimento da semente, através do tegumento,
endosperma e embrião (Figura 2) (BRASIL, 1992);
21
• Corte longitudinal diagonal, no sentido da largura da semente, na região distal da
carúncula, evitando-se atingir o eixo embrionário, através do tegumento, endosperma e
embrião (Figura 3) (BRASIL, 1992);
• Remoção do tegumento (Figura 4) (GRABE, 1976);
• Remoção do tegumento, seguida de corte longitudinal mediano, no sentido do
comprimento da semente, através do endosperma e embrião (Figura 5).
• Remoção do tegumento, seguida de corte longitudinal mediano, no sentido da espessura da
semente, paralelo aos cotilédones, através do endosperma e embrião (Figura 6).
Figura 2 – Preparo da semente de mamoneira mediante corte longitudinal mediano, no sentido
do comprimento da semente, através do tegumento, endosperma e embrião: corte
(a); semente cortada (b); sementes cortadas imersas na solução de tetrazólio (c).
Figura 3 – Preparo da semente de mamoneira mediante corte longitudinal diagonal na região
distal da carúncula, evitando-se atingir o eixo embrionário, no sentido da largura da
semente, através do tegumento, endosperma e embrião: sementes cortadas (a);
sementes cortadas imersas na solução de tetrazólio (b).
a b
c
a b
22
Figura 4 – Preparo da semente de mamoneira mediante remoção do tegumento: processo de
remoção do tegumento (a); sementes sem o tegumento (b).
Figura 5 – Preparo da semente de mamoneira mediante remoção do tegumento, seguida de
corte longitudinal mediano, no sentido do comprimento da semente, através do
endosperma e embrião: corte (a); sementes cortadas imersas na solução do
tetrazólio (b).
a b
a
b
23
Figura 6 – Preparo da semente de mamoneira mediante remoção do tegumento, seguida de
corte longitudinal mediano, no sentido da espessura da semente, paralelo aos
cotilédones, através do endosperma e embrião: corte (a); sementes cortadas (b).
Antes dos preparos, as sementes foram pré-condicionadas entre papel
toalha de germinação, previamente umedecido com 2,5 vezes a massa (g) do papel em água
destilada, dobrado em quatro e colocado dentro de sacos plásticos de 0,05mm, para manter a
umidade, por 18 horas a 30ºC em câmara de germinação tipo B.O.D. (MOORE, 1985;
BRASIL, 1992; FRANÇA NETO et al., 1998).
Os cortes e as remoções do tegumento foram realizados com o auxílio
de bisturi e de lâmina de barbear. Após os preparos, as sementes foram imersas na solução de
tetrazólio na concentração de 0,5% e mantidas em câmara escura a 35ºC (GRABE, 1976). A
uniformidade da coloração foi avaliada a cada hora até o período de duas horas, exceto para o
método de preparo remoção do tegumento, cujo período de coloração foi de até seis horas,
para permitir maior absorção da solução de tetrazólio pelas sementes.
Nos métodos de preparo mediante corte longitudinal diagonal
evitando-se atingir o eixo embrionário e mediante remoção do tegumento, nos quais o embrião
não estava exposto diretamente à solução de tetrazólio, para a avaliação da parte interna da
semente, realizou-se o corte longitudinal mediano através do embrião, após o período de
coloração.
Na avaliação do melhor método de preparo para o teste de tetrazólio
em sementes de mamoneira, considerou-se aquele que proporcionou o desenvolvimento da
a
b
24
coloração mais nítida para as sementes, sendo este parâmetro avaliado visualmente por
comparação entre os métodos. Assim, nesta etapa, não foi realizada análise estatística.
O melhor método de preparo das sementes de mamoneira para o teste
de tetrazólio estabelecido nesta etapa foi utilizado nas etapas seguintes desta pesquisa.
3.2 Etapa 2 – Concentração da solução e período de coloração das sementes para o
teste de tetrazólio.
No estudo da concentração da solução e do período de coloração das
sementes de mamoneira para o teste de tetrazólio foram utilizados cinco lotes de sementes de
mamoneira, numerados de 1 a 5, devidamente caracterizados quanto a sua qualidade
fisiológica inicial, para uma melhor interpretação dos resultados.
3.2.1 Caracterização dos lotes
A caracterização física e fisiológica dos lotes de sementes foi realizada
pela avaliação do teor de água, da germinação em areia, da germinação em papel e da
emergência de plântulas em campo (porcentagem e velocidade de emergência de plântulas).
3.2.1.1 Teor de água
O teor de água das sementes foi determinado pelo método da estufa a
105 ± 3ºC por 24 horas (BRASIL, 1992), utilizando duas repetições de 15 sementes.
3.2.1.2 Teste de germinação em areia
O teste de germinação em areia foi realizado com oito repetições de 25
sementes, semeadas entre areia esterilizada (EA), previamente umedecida com água destilada,
na proporção de 50% da capacidade de retenção (BRASIL, 1992). O teste foi conduzido
dentro de caixas plásticas transparentes (110 x 110 x 35mm), sendo utilizadas duas por
repetição, acondicionadas em sacos plásticos, com 0,033mm de espessura, para a manutenção
25
da umidade (Figura 7), sob alternância de temperatura de 20ºC por 16 horas e 30ºC por oito
horas sob luz (78 µmol s
-1
m
-2
/ 8 horas). Aos 14 dias após a instalação do teste,
contabilizaram-se as plântulas normais e anormais e as sementes mortas.
Para verificar a viabilidade das sementes não germinadas após este
período, as sementes remanescentes foram escarificadas com lixa d´água número 80, e
colocadas para germinar por mais sete dias, em rolo de papel toalha para germinação,
umedecido com 2,5 vezes a massa (g) do papel em água destilada, sob mesma alternância de
temperatura, contabilizando as plântulas normais e anormais e as sementes mortas, que foram
somadas ao resultado obtido no 14º dia após a instalação do teste.
Figura 7 – Teste de germinação em areia para sementes de mamoneira.
3.2.1.3 Teste de germinação em papel
No teste de germinação em papel semearam-se oito repetições de 25
sementes, em rolos de papel toalha para germinação (RP), previamente umedecidos com 2,5
vezes a massa (g) do papel em água destilada, acondicionados em sacos plásticos, de 0,033
mm de espessura, para a manutenção da umidade (BRASIL, 1992; COIMBRA et al., 2007;
GASPAR-OLIVEIRA et al., 2007). Os rolos foram dispostos na posição horizontal em
26
germinador, sob temperaturas alternadas de 20ºC por 16 horas e 30ºC por oito horas sob luz
(78 µmol s
-1
m
-2
/ 8 horas), realizando-se a primeira contagem e a retirada das plântulas
normais aos sete dias após a semeadura (BRASIL, 1992). Aos 14 dias após a instalação do
teste, contabilizaram-se as plântulas normais e anormais e as sementes mortas. A viabilidade
das sementes não germinadas após este período foi verificada adotando-se o mesmo
procedimento descrito no teste de germinação em areia.
3.2.1.4 Emergência de plântulas em campo
No teste de emergência de plântulas em campo foram utilizadas quatro
repetições de 50 sementes por lote, semeadas diretamente no solo, a cinco centímetros de
profundidade, no espaçamento de vinte centímetros entre linhas, dentro de túnel plástico, com
irrigação controlada. Consideraram-se plântulas emersas aquelas em que o cotilédone saiu do
solo e estava aberto, aos 21 dias após a semeadura (Figura 8). Os testes foram conduzidos nos
meses de Fevereiro, Abril e Novembro do ano de 2006, e não foram observados períodos de
baixa temperatura.
Figura 8 – Teste de emergência de plântulas em campo: visão geral (a), e detalhe das plântulas
de mamoneira emersas, com os cotilédones abertos (b).
a
b
27
3.2.1.5 Índice de velocidade de emergência de plântulas (IVE)
O índice de velocidade de emergência de plântulas foi conduzido em
conjunto com o teste de emergência de plântulas em campo, contabilizando-se diariamente o
número de plântulas emersas até os 21 dias após a semeadura, e calculando-se o IVE pela
fórmula proposta por Maguire (1962).
3.2.2 Concentração da solução e período de coloração das sementes
Esta pesquisa foi realizada em duas fases. A primeira, consistiu de um
estudo preliminar para definir os tratamentos de concentração da solução e período de
coloração, utilizando-se apenas um dos lotes de sementes (lote 1). Na segunda fase, os
tratamentos estabelecidos foram avaliados nos cinco lotes de sementes (1 ao 5), pela
comparação com os resultados dos testes de germinação.
3.2.2.1 Primeira fase: estudo preliminar para a definição dos tratamentos de
concentração da solução e período de coloração
Nesta fase as concentrações da solução de tetrazólio estudadas foram
1,0%, 0,5%, 0,2%, 0,1% e 0,075% (DELOUCHE et al., 1976; BRASIL, 1992). O preparo e o
armazenamento das soluções seguiram metodologia descrita por Grabe (1976).
Em cada concentração testada, duas repetições de 25 sementes, do lote
1, foram pré-condicionadas entre papel toalha de germinação, previamente umedecido com 2,5
vezes a massa (g) do papel em água destilada, dobrado em quatro e colocado dentro de sacos
plásticos de 0,05mm para manter a umidade, por 18 horas a 30ºC (MOORE, 1985; BRASIL,
1992; FRANÇA NETO et al., 1998). Após esse período, as sementes foram preparadas
seguindo os melhores resultados da Etapa 1, assim, o tegumento foi removido e as sementes
cortadas longitudinal e medianamente, no sentido do comprimento da semente, através do
endosperma e embrião, mantendo as duas partes de cada uma das sementes unidas, colocadas
em copos plásticos e imersas na solução de tetrazólio.
28
As amostras foram mantidas em câmara de germinação a 35ºC, na
ausência de luz, verificando-se a coloração em intervalos de 30 minutos, para todas as
concentrações, até que a maioria das sementes apresentasse coloração vermelha (GRABE,
1976). O período necessário para que cada amostra colorisse foi denominado de período
médio de coloração.
Para cada concentração, além deste período médio de coloração,
estabeleceram-se mais dois períodos para serem testados como tratamentos, que foram
superior e inferior ao período médio em 30 minutos para as concentrações de 1,0% e 0,5%, e
superior e inferior em 60 minutos para as demais concentrações, compondo 15 tratamentos
(cinco concentrações x três períodos de coloração).
3.2.2.2 Segunda fase: avaliação dos tratamentos
Nesta fase, os tratamentos de concentração da solução e período de
coloração para o teste de tetrazólio foram avaliados quanto à comparação dos resultados de
viabilidade com o teste de germinação, quanto à coloração resultante nas sementes e também
quanto à correlação dos resultados de viabilidade entre o teste de tetrazólio e os testes de
germinação em areia e em papel.
Em cada tratamento avaliado, quatro repetições de 25 sementes, de
cada um dos cinco lotes, foram pré-condicionadas e preparadas da mesma forma descrita na
primeira fase desta etapa. Entretanto, nesta segunda fase, optou-se pela utilização de apenas
uma das metades da semente no teste de tetrazólio, devido à dificuldade em se manter unidas
as duas partes, escolhendo aquela que apresentava o embrião mais íntegro ou de melhor
visualização (DIAS e BARROS, 1999). Após a coloração, a solução de tetrazólio foi drenada
e as sementes lavadas em água corrente para estacionar o processo.
As sementes foram avaliadas uma a uma e classificadas em viáveis e
não viáveis. Os critérios para a interpretação da viabilidade das sementes foram baseados no
estudo das partes vitais do embrião, no desenvolvimento das estruturas essenciais durante a
germinação, na tonalidade e uniformidade da coloração, e na comparação dos testes de
tetrazólio já estabelecidos para espécies similares (WETZEL et al., 1992; BITTENCOURT,
1995; FRANÇA NETO et al., 1998; VIEIRA e VON PINHO, 1999).
29
Em sementes de mamoneira, para a avaliação do teste de tetrazólio, as
estruturas que devem ser observadas são: os cotilédones, a área de ligação entre os cotilédones
e o eixo embrionário, o eixo hipocótilo-radícula, o córtex e o cilindro central (Figura 9).
Figura 9 – Corte longitudinal no sentido do comprimento da semente de mamoneira,
mostrando o endosperma (a) e as estruturas embrionárias: cotilédones (b), eixo
hipocótilo-radícula (c), epicótilo (d), córtex e cilindro central (e).
Consideraram-se sementes viáveis as que apresentaram as estruturas
do embrião desenvolvidas, intactas e com cor rosa a vermelha após a exposição ao sal de
tetrazólio (Figura 10), e também as que o embrião apresentava pequenas necroses nos
cotilédones, ou no endosperma, sem atingir a junção do eixo embrionário e dos cotilédones
(nó cotiledonar) (Figura 11) ou pequenas necroses na ponta extrema da radícula, sem atingir o
cilindro central (Figura 12). Foram consideradas sementes não viáveis aquelas com embriões
completamente descoloridos ou com áreas críticas do embrião descoloridas (Figura 13)
(GRABE, 1976; BRASIL, 1992).
a
b
c
d
a
b
e
30
Figura 10 – Sementes viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando as
estruturas do embrião desenvolvidas, intactas e com cor rosa.
Figura 11 – Sementes viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando pequenas
necroses nos cotilédones, ou no endosperma, sem atingir a junção do eixo
embrionário e dos cotilédones.
31
Figura 12 – Sementes viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando pequenas
necroses na ponta extrema da radícula, sem atingir o cilindro central.
Figura 13 – Sementes não viáveis de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, apresentando
lesões intensas, embriões descoloridos ou com áreas críticas do embrião
descoloridas.
3.2.2.2.1 Comparação dos resultados de viabilidade do teste de tetrazólio
Os resultados de viabilidade do teste de tetrazólio foram comparados
com os resultados dos testes de germinação em areia e em papel e foram considerados os
melhores tratamentos aqueles que apresentaram diferença de até 5% entre os resultados dos
testes (DIAS e BARROS, 1995; FRANÇA NETO, 1999).
32
3.2.2.2.2 Qualificação das cores das sementes pelo catálogo de Munsell
Em cada tratamento, para os cinco lotes de sementes, a coloração das
sementes após o teste de tetrazólio foi avaliada mediante comparação com as fichas de cor do
catálogo de Munsell (MUNSELL, 1976), determinando-se a porcentagem de sementes
observada em cada cor (Figura 14). Considerou-se a cor predominante em mais da metade da
semente, observando o endosperma e o embrião.
Figura 14 – Qualificação das sementes de mamoneira, coloridas pelo tetrazólio, nas fichas de
cores do catálogo de Munsell.
As cores do catálogo são designadas por meio de números e letras,
entretanto essa nomenclatura dificulta o reconhecimento e a identificação da cor quando não
há visualização da ficha. Por essa razão, as cores observadas para as sementes de mamoneira
após o teste de tetrazólio foram, subjetivamente, renomeadas e classificadas nos grupos de
cores rosa-pálido, rosa-claro, rosa, rosa-escuro, vermelho-carmim e vermelho-carmim escuro,
pois essas denominações são mais usuais na literatura sobre o teste de tetrazólio (DELOUCHE
et al., 1976; GRABE, 1976; BITTENCOURT, 1995; FRANÇA NETO et al., 1998; SANTOS,
2003).
3.2.2.2.3 Correlação entre os resultados do teste de tetrazólio e de germinação
Realizou-se a correlação entre os resultados do teste de tetrazólio,
conduzido nos tratamentos de concentração da solução e período de coloração e os testes de
33
germinação em areia e em papel. Considerou-se o melhor tratamento aquele que proporcionou
para a média dos lotes a melhor correlação com os testes de germinação. Havendo mais de um
tratamento nessas condições, optou-se por aquele que apresentou o menor período de
coloração e/ou a menor concentração do sal de tetrazólio.
3.2.3 Análise estatística
Na análise estatística foi utilizado o delineamento inteiramente
casualizado, com comparação de médias pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade
(PIMENTEL - GOMES, 1973).
Nos testes de germinação em areia e em papel, em que se utilizaram
oito repetições de 25 sementes, as mesmas foram agrupadas antes das avaliações, formando
quatro repetições de 50 sementes.
Na comparação dos resultados de viabilidade do teste de tetrazólio,
conduzido nos tratamentos de concentração da solução e período de coloração, e da
germinação em areia e em papel, as médias foram comparadas considerando cada lote
separadamente e também a média dos lotes. Realizou-se, também, a análise de correlação
simples (r) entre os dados dos testes de tetrazólio, germinação em areia e em papel.
Na análise da qualificação das cores das sementes foram comparadas
as médias dos cinco lotes para os tratamentos do teste de tetrazólio nos parâmetros cores do
catálogo e grupos de cores. Os dados foram transformados em arcsen raiz (x+alfa)
(BANZATTO e KRONKA, 2006) e as médias apresentadas nas tabelas referem-se aos dados
originais.
3.3 Etapa 3 – Metodologia de pré-condicionamento das sementes para o teste de
tetrazólio
Nesta etapa foram avaliados três métodos de pré-condicionamento das
sementes para o teste de tetrazólio em diferentes períodos e temperaturas.
A pesquisa foi realizada em três fases: a primeira consistiu de um
estudo preliminar, com o objetivo de selecionar os tratamentos de pré-condicionamento que
34
promovessem a embebição adequada das sementes; na segunda fase, os tratamentos
selecionados na fase anterior foram testados em cinco lotes de sementes, para avaliar se todos
os lotes atingiriam teor de água semelhante no mesmo tratamento; na terceira fase, realizou-se
a comparação entre os resultados do teste de tetrazólio, conduzido nos tratamentos de pré-
condicionamento com os resultados do teste de germinação. Os melhores tratamentos de cada
fase foram avaliados nas fases seguintes.
A caracterização da qualidade física e fisiológica dos lotes de sementes
foi realizada pela determinação do teor de água inicial das sementes com tegumento e sem
tegumento, pelo teste de germinação em areia e pela porcentagem e velocidade de emergência
de plântulas em campo (IVE), seguindo os procedimentos descritos na segunda etapa dessa
pesquisa.
3.3.1 Primeira fase: seleção dos tratamentos de pré-condicionamento
Na primeira fase realizou-se um estudo preliminar de embebição das
sementes, utilizando-se apenas um dos lotes (lote 6), em duas repetições de 15 sementes para
cada tratamento, selecionando-se as que não apresentavam dano visível no tegumento.
A absorção de água pelas sementes foi avaliada em 69 tratamentos de
pré-condicionamento, assim distribuídos:
• Entre papel, sementes com tegumento, por 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 horas a 30ºC, 35ºC e
40ºC;
• Entre papel, sementes sem tegumento, por 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas a 25ºC, 30ºC, 35ºC e
40ºC;
• Imersão em água das sementes com tegumento, por 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas a 25ºC, 30ºC,
35ºC e 40ºC.
Dentre esses, o tratamento entre papel, sementes com tegumento, por
18 horas é o recomendado pelas Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) para
sementes de mamoneira; e a temperatura de 30ºC é a mais baixa dentre as indicadas para o
35
pré-condicionamento das sementes no teste de tetrazólio por Moore (1985). Assim, esse
tratamento foi considerado a testemunha.
Nos métodos entre papel as sementes com e sem tegumento foram
colocadas para embeber em papel-toalha para germinação, previamente umedecido na
proporção de 2,5 vezes seu peso com água destilada, dobrado em quatro e colocado dentro de
sacos plásticos de 0,05mm para manutenção da umidade (Figura 15a) (BRASIL, 1992;
FRANÇA NETO et al., 1998). No método imersão em água, as sementes com tegumento
foram colocadas em copos plásticos descartáveis com capacidade de 200 ml, com 120 ml de
água destilada (Figura 15b) (GRABE, 1976).
Figura 15 – Pré-condicionamento das sementes de mamoneira: entre papel toalha para
germinação (a); imersão em água (b).
Após os períodos de embebição, as amostras foram retiradas do
germinador e determinou-se o teor de água das sementes. Nos métodos de pré-
condicionamento nos quais as sementes estavam com tegumento, o mesmo foi removido antes
da avaliação do teor de água, de forma que os métodos com e sem tegumento pudessem ser
comparados sem a influência da água presente no tegumento.
Os tratamentos de pré-condicionamento que apresentaram resultados
de teor de água das sementes menores e diferentes estatisticamente do apresentado pela
testemunha, foram eliminados deste estudo, pois não promoveram a embebição adequada das
sementes, não sendo avaliados na próxima fase.
a
b
36
3.3.2 Segunda fase: avaliação da uniformidade de embebição dos lotes de
sementes nos tratamentos selecionados
Nesta fase, os tratamentos de pré-condicionamento foram avaliados
para cinco lotes (lotes 6 a 10), em duas repetições de 15 sementes para cada tratamento,
selecionando-se as que não apresentavam dano visível no tegumento.
Em uma primeira avaliação, os lotes foram utilizados como repetições
com o objetivo de eliminar os tratamentos que proporcionassem para a média dos lotes teor de
água menor e diferente estatisticamente do apresentado pela testemunha.
Foram testados os seguintes tratamentos de pré-condicionamento:
• Entre papel, sementes com tegumento, por 8 e 10 horas a 35ºC e 40ºC, e por 12, 14, 16 e
18 horas a 30ºC, 35ºC e 40ºC;
• Entre papel, sementes sem tegumento, por 3 horas a 35ºC e 40ºC, por 4 e 5 horas a 30ºC,
35ºC e 40ºC, e por 6 horas a 25ºC, 30ºC, 35ºC e 40ºC;
• Imersão em água das sementes com tegumento, por 6 horas a 35ºC e 40ºC.
Após os períodos de embebição, as amostras foram retiradas do
germinador e determinou-se o teor de água das sementes sem o tegumento, seguindo o mesmo
procedimento descrito na primeira fase desta etapa. Os resultados dos tratamentos foram
comparados com os da testemunha e os tratamentos eliminados não foram avaliados na
segunda análise.
Na segunda análise, os tratamentos de pré-condicionamento foram
conduzidos para os cinco lotes separadamente, com o objetivo de avaliar se, dentro do mesmo
tratamento, os lotes apresentavam teores de água estatisticamente semelhantes. Como os lotes
partiram de mesmo teor de água inicial, após os tratamentos de embebição deveriam
apresentar teores de água similares.
37
Foram avaliados os seguintes tratamentos de pré-condicionamento:
• Entre papel, sementes com tegumento, por 10 e 12 horas a 35ºC e 40ºC, e por 14, 16 e 18
horas a 30ºC, 35ºC e 40ºC;
• Entre papel, sementes sem tegumento, por 4 horas a 35ºC e 40ºC, por 5 horas a 30ºC, 35ºC
e 40ºC, e por 6 horas a 25ºC, 30ºC, 35ºC e 40ºC;
Os tratamentos foram avaliados pela determinação do teor de água
após a embebição das sementes sem tegumento, seguindo o mesmo procedimento descrito na
primeira fase desta etapa. Selecionaram-se os tratamentos de pré-condicionamento que
apresentaram teor de água semelhante estatisticamente nos cinco lotes estudados.
3.3.3 Terceira fase: comparação dos resultados do teste de tetrazólio com os do
teste de germinação
Nesta fase, inicialmente realizou-se uma análise preliminar, utilizando-
se apenas um lote de sementes (lote 6), com o objetivo de eliminar os tratamentos que não
promovessem uniformidade na coloração das sementes após o teste de tetrazólio. Foram
avaliados os seguintes tratamentos de pré-condicionamento:
• Entre papel, sementes com tegumento por 10, 12 e 16 horas a 35ºC, por 14 horas a 35ºC e
40ºC, e por 18 horas a 30ºC e 40ºC;
• Entre papel, sementes sem tegumento por 6 horas a 25ºC, 30ºC e 40ºC.
O teste de tetrazólio foi realizado para cada tratamento de pré-
condicionamento com quatro repetições de 25 sementes. Após o pré-condicionamento, o
tegumento foi removido e as sementes cortadas longitudinal e medianamente, no sentido do
comprimento, através do endosperma e embrião, selecionando-se a melhor metade de cada
uma delas. As amostras foram colocadas em copos plásticos e imersas na solução de tetrazólio
a 0,2%, mantidas em câmara de germinação a 35ºC, na ausência de luz, por 120 minutos, de
acordo com os melhores resultados observados nas etapas 1 e 2 desta pesquisa. As sementes
38
foram avaliadas, considerando-se as sementes viáveis e não viáveis, pelos mesmos parâmetros
descritos na segunda etapa dessa pesquisa.
Avaliou-se também a porcentagem de sementes que apresentaram
coloração desuniforme e, ou, manchas esbranquiçadas (Figura 16). Os tratamentos de pré-
condicionamento que proporcionaram, estatisticamente, as maiores quantidades de sementes
com essas características não foram utilizados na aferição dos resultados com o teste de
germinação.
Figura 16 – Sementes de mamoneira apresentando coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) após o teste de tetrazólio; detalhes: mancha no eixo
hipocótilo-radícula em semente vigorosa (c); mancha no endosperma (d).
Posteriormente, o teste de tetrazólio foi realizado para cinco lotes de
sementes (6 ao 10), com os mesmos procedimentos descritos anteriormente, avaliando-se os
seguintes tratamentos de pré-condicionamento: entre papel, sementes com tegumento por 12 e
16 horas a 35ºC, por 14 horas a 35ºC e 40ºC, e por 18 horas a 30ºC e 40ºC.
Os resultados dos testes de tetrazólio foram comparados com o teste de
germinação em areia, realizado na caracterização dos lotes, e foi considerado o melhor
tratamento de pré-condicionamento aquele que apresentou resultados semelhantes ao do teste
de germinação, com 5% de tolerância na diferença entre as médias (DIAS e BARROS, 1995;
a
b
b
a a
a
b
a
b
c
d
39
FRANÇA NETO, 1999). Havendo mais de um tratamento nessas condições, optou-se pelo
mais rápido e adaptável à rotina de um laboratório de análise de sementes.
3.3.4 Análise estatística
A análise estatística das três fases deste estudo foi realizada em
delineamento experimental inteiramente casualizado e as médias comparadas pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade (PIMENTEL-GOMES, 1973).
Na segunda fase foram realizadas duas análises estatísticas: na
primeira, os lotes foram empregados como repetições e considerou-se a média dos lotes e, na
segunda, os lotes foram considerados separadamente.
Na terceira fase foram realizadas três análises estatísticas: na primeira
foram comparadas as médias dos tratamentos do teste de tetrazólio para um lote de sementes,
avaliando a porcentagem de sementes viáveis, não viáveis, coloração desuniforme e manchas
esbranquiçadas; na segunda foram comparados os resultados de viabilidade nos seis
tratamentos do teste de tetrazólio com o resultado do teste de germinação em areia para cada
um dos cinco lotes separadamente, em um fatorial 5 x 7 (lotes x tratamentos); na terceira
análise, os lotes foram considerados como repetições e compararam-se as médias dos lotes da
viabilidade pelo teste de tetrazólio com as médias do teste de germinação.
No teste de germinação em areia, em que se utilizaram oito repetições
de 25 sementes, as mesmas foram agrupadas antes das avaliações, formando quatro repetições
de 50 sementes.
3.4 Etapa 4 – Metodologia para a avaliação do vigor das sementes pelo teste de
tetrazólio
Nesta etapa, foram realizadas análises complementares em cinco lotes
de sementes de mamoneira (lotes 11 a 15), com o objetivo de identificar alterações nos tecidos
das sementes viáveis que possibilitassem a classificação das sementes quanto ao vigor pelo
teste de tetrazólio.
40
3.4.1 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes pelo teste de tetrazólio
O teste de tetrazólio foi executado para cinco lotes (11 ao 15) com
quatro repetições de 50 sementes, de acordo com os melhores resultados observados nas
etapas 1, 2 e 3 desta pesquisa. As sementes foram pré-condicionadas com tegumento entre
papel toalha de germinação, previamente umedecido com 2,5 vezes a massa (g) do papel em
água destilada, dobrado em quatro e colocado dentro de sacos plásticos de 0,05mm, para
manter a umidade, por 18 horas a 30ºC (MOORE, 1985; BRASIL, 1992; FRANÇA NETO et
al., 1998). Após esse período, o tegumento foi removido e as sementes cortadas longitudinal e
medianamente, no sentido do comprimento, através do endosperma e embrião, selecionando-
se a melhor metade de cada uma delas. As amostras foram colocadas em copos plásticos e
imersas na solução de tetrazólio a 0,2%, mantidas em câmara de germinação a 35ºC na
ausência de luz por 120 minutos.
As sementes foram analisadas minuciosamente e divididas em três
classes: viáveis e vigorosas, viáveis e não vigorosas e não viáveis. As considerações da
classificação do vigor foram baseadas nos critérios estabelecidos por Bittencourt (1995),
Vieira e Von Pinho (1999) e Santos (2003), em sementes de amendoim, algodão e tomate,
respectivamente, adaptados para as características morfológicas das estruturas das sementes de
mamoneira e, também, nas prescrições das Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992)
e de Grabe (1976) para esta espécie.
Após a classificação nas três classes, determinou-se a porcentagem de
sementes alocadas em cada uma delas, calculando em seguida, o potencial de vigor (viáveis e
vigorosas) e o potencial de germinação ou viabilidade (somatório da porcentagem de sementes
viáveis vigorosas e não vigorosas).
3.4.2 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes por outros testes
Os resultados de viabilidade e vigor dos lotes pelo teste de tetrazólio
foram aferidos mediante comparação com outros testes de avaliação de qualidade. Assim, para
todos os lotes avaliaram-se o teor de água, a germinação em areia, a germinação em papel, a
primeira contagem do teste de germinação em papel, a emergência de plântulas em campo e o
41
índice de velocidade de emergência (IVE), seguindo os procedimentos descritos na segunda
etapa dessa pesquisa. Também foram realizados os testes de envelhecimento acelerado,
classificação do vigor de plântulas, comprimento e massa da matéria seca de plântulas, que
estão descritos a seguir.
3.4.2.1 Envelhecimento acelerado
As sementes foram colocadas para envelhecer em uma camada única
sobre tela em caixas plásticas transparentes (110 x 110 x 35 mm), contendo 40 ml de água,
fechadas com saco plástico de 0,033mm de espessura, e mantidas a 42°C por 24 horas, em
câmara de germinação sem controle de umidade. Após esse período seguiu-se o teste de
germinação, com oito repetições de 25 sementes em rolo de papel toalha para germinação,
umedecido com duas vezes a massa (g) do papel em água, mantido em temperatura constante
de 25ºC por 14 dias, quando a contagem foi realizada (VIEIRA e CARVALHO, 1994;
SOUZA, et al., 2007).
3.4.2.2 Teste de classificação do vigor de plântulas
Realizou-se o teste de classificação do vigor de plântulas em conjunto
com o teste de germinação em areia. A avaliação foi realizada aos 14 dias após a instalação do
teste e classificaram-se as plântulas em: normais fortes (vigorosas), para aquelas com as
estruturas essenciais bem formadas e maiores que as demais; e normais fracas (pouco
vigorosas), para as bem formadas, porém menores que as anteriores e pouco desenvolvidas
(Figura 17) (NAKAGAWA, 1999). A porcentagem foi calculada sobre o total de sementes
instaladas no teste, ou seja, 25 sementes para cada uma das quatro repetições.
42
Figura 17 – Teste de classificação do vigor de plântulas de mamoneira: normais fortes (a),
normais fracas (b), e anormais (c).
3.4.2.3 Comprimento de plântulas
No teste de comprimento de plântulas utilizaram-se quatro repetições
de dez sementes, instaladas sobre uma linha traçada no terço superior do papel toalha para
germinação, pré-umedecido com 2,5 vezes a massa (g) do papel em água destilada. Os rolos
de papel foram colocados em posição vertical na câmara de germinação e acondicionados em
sacos plásticos de 0,033mm de espessura para evitar a desidratação (VIEIRA e CARVALHO,
1994). O teste foi conduzido em temperatura constante de 30ºC por sete dias, quando foram
realizadas as avaliações do comprimento da radícula, da parte aérea (do hipocótilo até a
inserção dos cotilédones) e total das plântulas normais com régua em milímetros. O cálculo do
comprimento das plântulas foi obtido dividindo-se o resultado total pelo número de sementes
do teste (NAKAGAWA, 1999; VANZOLINI et al., 2007).
a
a
a
a
b
b
b
b
c
c
c
c
43
3.4.2.4 Massa da matéria seca de plântulas
As plântulas normais do teste de crescimento de plântulas tiveram os
tecidos de reserva removidos com bisturi e foram colocadas dentro de sacos de papel para
secar em estufa de circulação de ar a 80°C por 24 horas (VIEIRA e CARVALHO, 1994).
Após esse período, as amostras foram pesadas, e foi calculada a massa da matéria seca por
plântula (mg/plântula), mediante a divisão da massa total pelo número de plântulas do teste.
3.4.3 Análise estatística
Em todos os testes, o delineamento experimental empregado foi o
inteiramente casualizado e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade. Os resultados de viabilidade e vigor dos lotes, obtidos pelo teste de tetrazólio,
foram comparados com os resultados dos demais testes realizados, mediante análise de
correlação simples (PIMENTEL - GOMES, 1973).
Nos testes em que se utilizaram oito repetições de 25 sementes, as
mesmas foram agrupadas antes das análises, formando quatro repetições de 50 sementes.
44
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Etapa 1 – Métodos de preparo das sementes para o teste de tetrazólio
Os preparos da semente mediante corte longitudinal mediano, no
sentido do comprimento e da espessura, através do endosperma e embrião com e sem a
remoção do tegumento (Figuras 18, 19 e 20) favoreceram o contato da parte interna da
semente com a solução de tetrazólio, resultando em uma coloração uniforme de todo o
embrião e endosperma. Entretanto, o preparo sem a remoção do tegumento (Figura 19) causou
danos ao embrião e, em alguns casos, destruição do eixo hipocótilo-radícula, devido à pressão
exercida pela lâmina para ultrapassar o tegumento da semente no corte. Já o preparo remoção
do tegumento, seguida de corte longitudinal mediano, no sentido da espessura, através do
endosperma e embrião (Figura 20) causou danos aos cotilédones, pois os mesmos estão
fortemente aderidos, o que casou a dificuldade em separá-los. Esses danos ao embrião
dificultam a identificação de injúrias pré-existentes, assim como a avaliação correta da
viabilidade. Fogaça (2003) também observou ocorrência de danos em sementes de guaritá
(Astronium graveolens Jacq.), devido à presença do tegumento no momento do corte da
semente.
45
Figura 18 – Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante
remoção do tegumento, seguida de corte longitudinal mediano, no sentido do
comprimento, através do endosperma e embrião.
Figura 19 – Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante corte
longitudinal mediano, no sentido do comprimento, através do tegumento,
endosperma e embrião.
46
Figura 20 – Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante
remoção do tegumento, seguida de corte longitudinal mediano, no sentido da
espessura, paralelo aos cotilédones, através do endosperma e embrião.
Nos preparos mediante corte longitudinal diagonal na região distal da
carúncula evitando-se atingir o eixo embrionário (Figura 21) e mediante remoção do
tegumento (Figura 22), as sementes não apresentaram coloração na região central do tecido de
reserva e no embrião. Somente as regiões periféricas das sementes, que tiveram contato direto
com a solução de tetrazólio, ficaram coloridas. No caso do preparo mediante remoção do
tegumento, mesmo após seis horas imersas na solução de tetrazólio (Figura 23), as sementes
apresentaram embrião e endosperma sem coloração. Considerando que o embrião está
localizado na parte interna da semente e é a principal estrutura a ser analisada na avaliação da
viabilidade e do vigor no teste de tetrazólio, estes métodos de preparo mostraram-se
ineficientes.
Além disso, no preparo mediante corte longitudinal diagonal na região
distal da carúncula evitando-se atingir o eixo embrionário, após a imersão na solução de
tetrazólio, o endosperma amolece e a semente aumenta de tamanho, dificultando a remoção do
tegumento na avaliação, o que pode causar danos às sementes (Figura 21). Por essa razão, não
foram testados períodos maiores que duas horas para esse método.
47
Figura 21 – Sementes de mamoneira após a imersão no tetrazólio, preparadas mediante corte
longitudinal diagonal na região distal da carúncula evitando-se atingir o eixo
embrionário: com tegumento (a); após a retirada do tegumento (b); e após corte
longitudinal mediano através do embrião (c).
Figura 22 – Sementes de mamoneira preparadas mediante remoção do tegumento, após duas
horas de imersão no tetrazólio (a); e após corte longitudinal mediano através do
embrião (b).
a b
c
a
b
48
Figura 23 – Sementes de mamoneira preparadas mediante remoção do tegumento, após seis
horas de imersão no tetrazólio (a); e após corte longitudinal mediano através do
embrião (b).
Esses resultados mostraram que, nos períodos de coloração
empregados nesta pesquisa, o tegumento e o endosperma não permitiram a difusão da solução
de tetrazólio até o embrião. Portanto, no preparo das sementes para o teste o tegumento deve
ser removido e as sementes devem ser cortadas longitudinal e medianamente através do
endosperma e embrião antes de serem submetidas à coloração.
Os resultados observados neste estudo discordam das Regras para
Análise de Sementes (BRASIL, 1992) e de Grabe (1976), pois os métodos de preparo
indicados por estes autores para mamoneira não proporcionaram coloração adequada das
sementes, dificultando a diferenciação dos tecidos e a avaliação da qualidade das sementes
pelo teste de tetrazólio.
A remoção do tegumento das sementes de mamoneira após a
embebição e antes da coloração, embora seja uma operação relativamente delicada e
trabalhosa, possibilitou considerável facilidade no corte, não danificando as sementes, e
permitindo a correta avaliação da viabilidade pelo teste de tetrazólio. A necessidade da
remoção do tegumento, como parte do preparo das sementes antes da coloração, também é
relatada para sementes de amendoim (BITTENCOURT, 1995), algodão (VIEIRA e VON
PINHO, 1999), melancia (BHERING et al., 2005), seringueira (WETZEL et al., 1992),
copaíba (FOGAÇA et al., 2001), sucará (FOGAÇA et al., 2006), pata-de-vaca (KROHN et al.,
2001), guapuruvu (PAULA et al., 2001) e guaritá (FOGAÇA, 2003).
a b
49
O corte longitudinal mediano antes da coloração (Figuras 18, 19 e 20)
possibilitou o contato direto dos tecidos internos (embrião e endosperma) com a solução de
tetrazólio e a coloração das regiões vitais da semente. A exposição do embrião diretamente na
solução de tetrazólio também é necessária para o desenvolvimento de uma coloração adequada
em sementes de milho (DIAS e BARROS, 1999), trigo (DELOUCHE et al., 1976), arroz
(DIAS e SHIOGA, 1997), capim-colonião e braquiária (DIAS e ALVES, 2001 a, b),
seringueira (WETZEL et al., 1992), tomate (SANTOS, 2003) entre outros.
A coloração do endosperma no teste de tetrazólio não é comum, mas
foi verificada nas sementes de mamoneira. Nesta espécie o endosperma é um tecido vivo, e
contem proteínas em forma de grãos de aleurona que secretam enzimas hidrolíticas
(CARVALHO e NAKAGAWA, 2000). Esse fato também foi observado em sementes de
seringueira, embora, para essa espécie, o preparo recomendado seria o corte longitudinal
paralelo aos cotilédones (WETZEL et al., 1992).
Portanto, o método de preparo das sementes de mamoneira para o teste
de tetrazólio que apresentou os melhores resultados foi o de remoção do tegumento seguida de
corte longitudinal mediano, no sentido do comprimento da semente, através do endosperma e
embrião.
4.2 Etapa 2 – Concentração da solução e período de coloração das sementes para o
teste de tetrazólio.
4.2.1 Caracterização dos lotes
A caracterização da qualidade física e fisiológica dos lotes de sementes
de mamoneira utilizados nesta etapa está apresentada na Tabela 1. Todos os lotes
apresentaram o mínimo de germinação estabelecido para a comercialização que é de 80%
(D.O.U., 2005) e teor de água semelhante, o que garante que os testes de avaliação de
qualidade estão isentos de possíveis variações de resultados entre os lotes devido ao teor de
água.
O teste de germinação em papel não diferenciou os lotes. Os demais
testes indicaram diferença de qualidade entre os lotes. No teste de germinação em areia os
50
dados indicaram superioridade dos lotes 1, 2, 3 e 4, entretanto, este último lote não diferiu do
lote 5, que foi inferior aos anteriores. Os resultados do teste de emergência de plântulas em
campo mostraram que os lotes 2, 3 e 4 e os lotes 3, 4 e 1 tinham vigor similar, entretanto,
numericamente, os lotes 2 e 3, e foram superiores ao lote 4, e o lote 3 foi superior aos lotes 4 e
1. O lote 5 apresentou resultado inferior aos demais, sem diferir dos lotes 1 e 4. O índice de
velocidade de emergência (IVE) demonstrou que os lotes 2 e 3 germinaram mais rapidamente
que os demais.
Tabela 1 – Caracterização física e fisiológica dos cinco lotes de sementes de mamoneira,
utilizados na segunda etapa, determinada pelo teor de água (%) e pelos testes de
germinação em areia (%), germinação em papel (%), emergência de plântulas em
campo (%) (conduzido de 02 a 23 de Fevereiro de 2006) e índice de velocidade
de emergência (IVE).
Lotes
Teor de água
(%)
Germinação
em areia (%)
Germinação
em papel (%)
Emergência de
plântulas (%)
IVE
1
5,0 A 98 A
1
100 A 78 BC 4,0 B
2
5,5 A 99 A 97 A 91 A 5,0 A
3
5,0 A 98 A 98 A 90 AB 5,0 A
4
5,0 A 91 AB 96 A 80 ABC 4,0 B
5
5,5 A 86 B 94 A 74 C 4,0 B
CV%
8,6 4,7 3,1 6,9 8,3
DMS
1,8 9,7 6,7 12,4 0,8
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
4.2.2 Concentração da solução de tetrazólio e período de coloração das sementes
4.2.2.1 Primeira fase: estudo preliminar para a definição dos tratamentos de
concentração da solução e período de coloração
Nas concentrações da solução de tetrazólio de 1,0 e 0,5%, a maioria
das sementes adquiriu coloração vermelha característica do teste (GRABE, 1976) após 60 e 90
51
minutos de imersão na solução (Figuras 24 e 25), respectivamente, sendo estes os períodos
médios. Nessas concentrações, intervalos de 30 minutos de período de coloração foram
suficientes para que se detectassem diferenças acentuadas na cor das sementes. Assim, os
períodos de 30, 60 e 90 minutos e os períodos de 60, 90 e 120 minutos foram os mais
promissores para as concentrações de 1,0% e 0,5%, respectivamente.
Figura 24 – Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 1,0% por 30
minutos (a), 60 minutos (b) e 90 minutos (c).
Figura 25 – Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,5% por 60
minutos (a), 90 minutos (b), e 120 minutos (c).
A maioria das sementes apresentou coloração vermelha característica
para o teste de tetrazólio (GRABE, 1976) após 120 minutos para a solução de 0,2% (Figura
26) e após 180 minutos para as concentrações de 0,1% e 0,075% (Figuras 27 e 28), sendo estes
os períodos médios. Nessas concentrações, somente foram observadas diferenças acentuadas
a
a
b
b
c
c
a
a
b
b
c
c
52
na cor das sementes com intervalos de 60 minutos de período de coloração. Assim, os
períodos mais promissores para a concentração de 0,2% foram 60, 120 e 180 minutos e para as
concentrações de 0,1% e 0,075% foram 120, 180 e 240 minutos. Neste caso, o período
máximo avaliado de 240 minutos não proporcionou coloração mais escura que é a
característica para o teste de tetrazólio, entretanto, não foram testados períodos mais longos
que este para não prolongar demasiadamente a duração do teste, já que a coloração padrão já
havia sido alcançada. Além disso, para a maioria das espécies, o período de coloração das
sementes encontra-se entre 30 a 240 minutos (DELOUCHE et al., 1976; MARCOS FILHO et
al., 1987).
Figura 26 – Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,2% por 60
minutos (a), 120 minutos (b), e 180 minutos (c).
Figura 27 – Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,1% por 120
minutos (a), 180 minutos (b), e 240 minutos (c).
a
a
b
b
c
c
a
a
b
b
c
c
53
Figura 28 – Sementes de mamoneira após a coloração na solução de tetrazólio a 0,075% por
120 minutos (a), 180 minutos (b), e 240 minutos (c).
Observou-se que quanto maior a concentração, menor é o período
necessário para as sementes adquirirem a cor adequada para a avaliação pelo teste de
tetrazólio.
Assim, os tratamentos de concentração da solução de tetrazólio e
períodos de coloração mais favoráveis ao desenvolvimento da coloração das sementes de
mamoneira, selecionados nesta etapa da pesquisa foram:
• 0,075 % por 120, 180 e 240 minutos;
• 0,1% por 120, 180 e 240 minutos;
• 0,2% por 60, 120 e 180 minutos;
• 0,5% por 60, 90 e 120 minutos; e
• 1,0% por 30, 60 e 90 minutos.
4.2.2.2 Segunda fase: avaliação dos tratamentos
4.2.2.2.1 Comparação dos resultados de viabilidade do teste de tetrazólio
Os dados da análise de comparação de médias, realizada para cada lote
separadamente (Tabela 2), indicaram que não houve diferença estatística significativa entre os
resultados dos testes de tetrazólio e de germinação para os lotes 1 e 5.
a
a
b
b
c
c
54
Tabela 2 – Sementes de mamoneira viáveis pelos testes de tetrazólio (TZ), conduzidos nos
diferentes tratamentos de concentração da solução e período de coloração, e pelos
testes de germinação em areia e em papel.
Sementes viáveis (%)
Tratamentos
Lote 1 Lote 2 Lote 3 Lote 4 Lote 5 Média dos lotes
Germinação em areia
98 99 A
1
98 A 91 AB 86 94 A
1
Germinação em papel
100 97 A 98 A 96 A 94 97 A
TZ
0,075% x 120 min
93 93 A 88 AB
93 A 95 92 AB
x 180 min
98 98 A 97 A 98 A 92 97 A
x 240 min
97 98 A 93 AB
94 A 90 94 A
TZ
0,1% x 120 min
94 93 A 88 AB
98 A 88 92 AB
x 180 min
99 92 A 96 A 97 A 93 95 A
x 240 min
97 95 A 93 AB
98 A 94 95 A
TZ
0,2% x 60 min
99 94 A 95 A 95 A 89 94 A
x 120 min
98 94 A 94 AB
92 A 91 94 A
x 180 min
97 89 A 91 AB
96 A 93 93 AB
TZ
0,5% x 60 min
99 91 A 90 AB
90 AB
92 92 AB
x 90 min
100 74 AB 87 AB
81 BC
91 87 ABC
x 120 min
99 83 A 89 AB
79 C 87 87 ABC
TZ
1,0% x 30 min
97 85 A 87 AB
97 A 96 92 AB
x 60 min
96 75 AB
79 AB
77 C 85 82 BC
x 90 min
96 47 B 75 B 79 C 89 77 C
CV%
2,0 8,0 5,3 2,7 3,4 7,7
DMS
7,9 28,3 19,4 10,0 12,4 11,1
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Nos demais lotes podem-se observar diferenças estatísticas na
porcentagem de sementes viáveis entre os testes. Destacam-se nos lotes 2 e 3 o tratamento
1,0% por 90 minutos, e no lote 4 os tratamentos 0,5% por 90 e 120 minutos, e 1,0% por 60 e
90 minutos como os que apresentaram os resultados mais discrepantes dos observados nos
55
testes de germinação. Portanto, esses tratamentos não devem ser utilizados na condução do
teste de tetrazólio de sementes de mamoneira, pois resultaram na coloração excessiva das
sementes, mesmo as pouco vigorosas e, por isso, os resultados diferiram dos observados no
teste de germinação. Wetzel et al. (1992) também verificaram problemas de avaliação do teste
de tetrazólio na concentração da solução de 1,0% para sementes de seringueira.
Comparando-se os resultados médios dos lotes, observa-se que houve
diferença estatística significativa entre os testes de tetrazólio e os testes de germinação para os
tratamentos 1,0% por 60 e 90 minutos; os demais foram iguais ou intermediários.
Sendo assim, os resultados indicaram que as maiores concentrações da
solução de tetrazólio proporcionaram aumento da discrepância entre os resultados do teste de
tetrazólio.
4.2.2.2.2 Qualificação das cores das sementes pelo catálogo de Munsell
A distribuição das sementes dos cinco lotes segundo as cores do
catálogo, após o teste de tetrazólio conduzido em diferentes tratamentos de concentração da
solução e período de coloração, pode ser observada na Tabela 3.
Os dados indicaram que houve diferença estatística significativa entre
as cores do catálogo para todos os tratamentos. Dentre eles, destacam-se os que foram
considerados os melhores na comparação com os resultados de viabilidade pelo teste de
tetrazólio (Tabela 2).
De maneira geral, os tratamentos com as concentrações de 0,075% e
de 0,1%, em todos os períodos, e de 0,2% por 60 e 120 minutos, apresentaram mais de 50%
das sementes nas cores 2,5R 8/6, 7/8 e 6/12 (Tabela 3). Nos tratamentos de concentração da
solução de 0,2% por 180 minutos e de 0,5% por 60 minutos a maioria das sementes
apresentou-se nas cores 2,5R 6/12 e 1,25R 6/12, observadas também na maioria das sementes
do tratamento de 1,0% por 30 minutos, que além dessas cores, também apresentou sementes
com as cores 2,5R 6/10, 5/12 e 5/10.
56
Tabela 3 – Porcentagem das sementes de mamoneira distribuídas nas cores do catálogo Munsell (1976), após os testes de tetrazólio
conduzidos nos diferentes tratamentos de concentração da solução (%) e período de coloração (minutos).
Tratamentos do teste de tetrazólio
0,075%
0,1%
0,2%
0,5%
1,0%
Cores
120 180 240
120 180 240
60 120 180
60 90 120
30 60 90
2,5R 9/2
1 EF
1
1 CD 1 D
1 CD 0 E 0 D
1 D 0 E 0 D
0 EF 1 FG 1 D
0 D 0 EF 1 CD
5R 8/4
6 CDE 1 CD 0 D
1 CD 0 E 1 D
1 D 1 E 0 D
0 F 1 G 0 D
0 D 0 F 0 D
5R 8/6
8 CD 9 B 4 CD
10 B 5 DE 4 CD
9 BC 3 DE 0 D
0 F 0 G 0 D
0 D 0 F 1 CD
2,5R 8/6
46 A 26 A 23 B
31 A 29 AB 11 BC
16 B 11 CD 2 CD
1 EF 0 G 0 D
1 D 0 F 0 D
2,5R 7/6
0 F 1 CD 1 D
0 D 0 E 1 D
0 D 0 E 0 D
0 F 0 G 0 D
0 D 0 F 0 D
2,5R 7/8
21 B 37 A 40 A
35 A 34 A 33 A
41 A 37 A 14 B
11 BC 3 EFG 2 D
4 CD 0 F 0 D
2,5R 6/10
2 EF 4 BC 3 D
2 CD 3 DE 5 CD
3 CD 4 DE 7 BC
16 B 8 CDE 10 BC
22 A 5 CDE 1 CD
2,5R 6/12
12 BC 11 B 12 BC
13 B 17 BC 26 AB
18 B 21 B 27 A
27 A 19 BC 15 AB
17 AB 4 CDEF 1 CD
1,25R 6/12
2 DEF 8 B 13 BC
5 BC 8 CD 13 BC
7 BC 16 BC 37 A
27 A 31 A 23 A
13 AB 9 BC 2 CD
2,5R 5/12
0 F 1 CD 2 D
0 D 1 E 2 D
0 D 2 E 4 CD
6 CD 10 BCD 21 A
17 AB 31 A 36 A
2,5R 5/10
1 EF 1 CD 1 D
1 CD 1 E 1 D
1 D 0 E 2 CD
5 CD 6 DEF 8 BC
16 AB 14 B 8 BC
1,25R 5/14
0 F 0 CD 1 D
1 D 0 E 2 D
1 D 2 E 6 BC
4 DE 19 B 14 AB
8 BC 25 A 13 B
2,5R 4/14
0 F 0 CD 0 D
0 D 0 E 0 D
0 D 1 E 0 D
1 EF 2 EFG 2 D
2 CD 2 DEF 3 BCD
2,5R 4/10
0 F 0 D 0 D
0 D 0 E 0 D
2 D 0 E 0 D
0 F 0 G 1 D
0 D 1 EF 4 CD
2,5R 4/12
0 F 0 D 0 D
0 D 0 E 0 D
0 D 0 E 0 D
0 EF 1 G 4 CD
0 D 8 BCD 29 A
CV%
64,9 53,5 71,2
55,9 69,6 67,1
58,8 60,5 59,3
45,3 58,0 51,7
60,3 55,0 73,7
1
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Análise realizada com os dados transformados em arcsen raiz (x+alfa).
57
A classificação subjetiva das cores do catálogo de Munsell, observadas
nas sementes de mamoneira após o teste de tetrazólio (Tabela 3), nos grupos de cores usuais na
literatura sobre o teste, e a análise de variância entre os grupos de cores e os tratamentos de
concentração da solução e período de coloração podem ser observadas na Tabela 4. Houve
diferença estatística significativa entre os grupos de cores para todos os tratamentos. Dentre eles,
destacam-se os que foram considerados os melhores na comparação com os resultados de
viabilidade pelo teste de tetrazólio (Tabela 2).
Assim, de maneira geral, nos tratamentos com as concentrações de
0,075% e de 0,1%, em todos os períodos, e de 0,2% por 60 e 120 minutos, a maior parte das
sementes apresentou-se nos grupos de cores rosa-claro, rosa e rosa-escuro (Tabela 4). Nos
tratamentos de concentração da solução de 0,2% por 180 minutos, de 0,5% por 60 minutos e de
1,0% por 30 minutos, a maioria das sementes apresentou-se nos grupos de cores rosa, rosa-escuro
e vermelho carmim.
Os resultados observados na distribuição das sementes nas cores do
catálogo e nos grupos de cores (Tabelas 3 e 4) indicam que as cores mais escuras nas sementes
refletem o aumento gradativo da concentração da solução de tetrazólio e do período de coloração,
e que, quanto mais escura a cor da semente, maior é a dificuldade de visualização dos tecidos e a
identificação das injúrias, podendo confundir tecidos vivos com aqueles em deterioração
(MARCOS FILHO et al., 1987). Isso ocorreu nos tratamentos de concentração 0,5% por 120
minutos e 1,0% por 60 e 90 minutos, para os quais a cor mais escura apresentada pelas sementes
resultou na dificuldade de avaliação da viabilidade, contribuindo para que esses tratamentos
apresentassem resultados do teste de tetrazólio muito discrepantes dos observados pelos testes de
germinação (Tabela 2).
58
Tabela 4 – Distribuição das sementes de mamoneira nos grupos de cores, com as correspondentes cores do catálogo de Munsell, após
teste de tetrazólio, conduzido nos diferentes tratamentos de concentração da solução (%) e período de coloração (minutos).
Tratamentos do teste de tetrazólio
0,075%
0,1%
0,2%
0,5%
1,0%
Grupos de cores (%)
120 180 240
120 180 240
60 120 180
60 90 120
30 60 90
Rosa-pálido
2,5R 9/2 1 C
1
1 C 1 C
1 C 0 B 0 D
1 C 0 C 0 C
0 D 1 C 1 C
0 B 0 C 1 C
5R 8/4
5R 8/6
Rosa-claro
2,5R 8/6
60 A 36 A 28 B
42 A 34 A 17 B
25 B 16 B 2 C
1 D 1 C 0 C
1 B 0 C 1 C
2,5R 7/6
2,5R 7/8
Rosa
2,5R 6/10
23 B 42 A 44 A
37 A 37 A 39 A
44 A 41 A 21 B
28 B
11 B 11 B
26 A
6 B 1 C
2,5R 6/12
Rosa-escuro
1,25R 6/12
14 B 19 B 24 B
17 B 26 A 39 A
25 B 38 A 64 A
52 A
50 A 38 A
30 A
13 B 3 C
2,5R 5/12
2,5R 5/10
1,25R 5/14
Vermelho carmim
2,5R 4/14
2 C 2 C 3 C
2 C 3 B 5 C
2 C 6 BC
12 B
16 C
37 A 45 A
42 A
72 A 60 A
2,5R 4/10
Vermelho
carmim-escuro
2,5R 4/12
0 C 0 C 0 C
0 C 0 B 0 D
2 C 0 C 0 C
0 D 1 C 5 BC
0 B 9 B 33 B
CV%
40,5 33,2 42,3
36,4 46,7 35,3
37,0 42,3 35,4
20,1
33,8 38,2
48,0
34,6 50,1
1
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Análise realizada com os dados transformados em arcsen raiz (x+alfa).
59
A avaliação da coloração das sementes após o teste de tetrazólio mediante
comparação com as fichas de cor do catálogo de Munsell (MUNSELL, 1976) possibilitou a
identificação precisa das cores apresentadas pelas sementes. Sugere-se a utilização deste catálogo
em trabalhos de pesquisa sobre o teste de tetrazólio para padronizar e auxiliar na reprodução da
metodologia, como uma forma de especificar a cor das sementes após a coloração pela solução de
tetrazólio, podendo ser uma referência inclusive em âmbito internacional, já que esse catálogo é
reconhecido em todo o mundo. Entretanto, não é recomendada a utilização desta comparação na
rotina da análise de sementes, pois é muito trabalhosa e pouco prática. Além disso, para facilitar a
identificação das cores, estas devem ser renomeadas e classificadas em grupos de cores comuns,
mais usuais na literatura sobre o teste de tetrazólio.
4.2.2.2.3 Correlação entre os resultados do teste de tetrazólio e de germinação
Na análise da correlação pode-se observar que houve correlação positiva
e significativa entre os testes de germinação em areia e em papel e, também, entre o teste de
germinação em areia e o teste de tetrazólio na concentração de 0,075% por 180 e 240 minutos e
de 0,2% por 120 minutos, e entre o teste de germinação em papel e o teste de tetrazólio na
concentração de 0,2% por 60 e 120 minutos (Tabela 5). Por esse motivo, estes tratamentos foram
considerados os melhores e qualquer um deles pode ser utilizado para a condução do teste de
tetrazólio em sementes de mamoneira.
Apesar das recomendações existentes para sementes de mamoneira
(GRABE, 1976; BRASIL, 1992) prescreverem a utilização de solução de tetrazólio a 1,0%, essa
metodologia foi ineficiente neste estudo. Pesquisas realizadas com sementes de outras espécies
também têm mostrado que soluções menos concentradas que as prescritas pelas Regras para
Análise de Sementes (BRASIL, 1992) têm possibilitado melhores resultados (BITTENCOURT,
1995; BHERING et al., 1996; FRANÇA NETO et al., 1998; DIAS e BARROS, 1999; VIEIRA e
VON PINHO, 1999; BHERING et al., 2005).
Considerando-se a eficiência na seleção dos lotes (Tabela 2), aliada à
correlação com os testes de germinação em areia e em papel (Tabela 5) para a identificação do
melhor tratamento de concentração da solução e período de coloração para o teste de tetrazólio,
conclui-se que os melhores resultados foram obtidos com a imersão das sementes em solução de
60
tetrazólio a 0,2% por 120 minutos. Neste tratamento, a maioria das sementes apresentou-se nos
grupos de cores rosa e rosa-escuro (Tabela 4), portanto essas podem ser consideradas como as
cores características para o teste de tetrazólio em sementes de mamoneira.
Tabela 5 – Correlação simples das médias dos testes de germinação em areia, em papel, e dos
testes de tetrazólio (TZ) conduzidos nos tratamentos de concentração da solução e
período de coloração, para sementes de mamoneira.
Tratamentos Germinação em areia Germinação em papel
Germinação em papel
0,85** ---
TZ
0,075% x 120 min
-0,59
ns
-0,47
ns
x 180 min
0,79* 0,73
ns
x 240 min
0,85* 0,70
ns
TZ
0,1% x 120 min
0,11
ns
0,21
ns
x 180 min
0,22
ns
0,66
ns
x 240 min
-0,04
ns
0,22
ns
TZ
0,2% x 60 min
0,74
ns
0,94**
x 120 min
0,76* 0,96**
x 180 min
-0,28
ns
0,23
ns
TZ
0,5% x 60 min
0,23
ns
0,62
ns
x 90 min
-0,12
ns
0,37
ns
x 120 min
0,35
ns
0,68
ns
TZ
1,0% x 30 min
-0,62
ns
-0,13
ns
x 60 min
0,00
ns
0,46
ns
x 90 min
-0,43
ns
0,10
ns
ns
não significativo; * significativo a 5%; ** significativo a 1%.
4.3 Etapa 3 – Metodologia de pré-condicionamento das sementes para o teste de
tetrazólio
Na Tabela 6 estão apresentados o teor de água das sementes com e sem
tegumento, a germinação em areia, a emergência de plântulas em campo e o índice de velocidade
de emergência, para a caracterização da qualidade física e fisiológica dos cinco lotes de sementes
61
de mamoneira utilizados nesta etapa. Os resultados do teor de água inicial indicaram diferença
estatística significativa entre os lotes, entretanto pode-se considerá-los semelhantes, pois as
diferenças foram pequenas, aproximadamente 0,6% e, portanto, não devem ter interferido nas
avaliações.
Os dados de germinação indicaram superioridade dos lotes 10, 9, 6, e 7,
entretanto, este último lote não diferiu do lote 8, que foi inferior aos anteriores. Observou-se que
todos os lotes apresentaram o mínimo de germinação estabelecido para a comercialização, que é
de 80% (D.O.U., 2005).
Os resultados do teste de emergência de plântulas em campo mostraram
que os lotes tinham vigor similar, entretanto, numericamente, os lotes 10, 7 e 6 foram superiores
aos lotes 8 e 9. O índice de velocidade de emergência (IVE) demonstrou que os lotes 6 e 7
germinaram mais rapidamente que os demais, enquanto o lote 8 apresentou a germinação mais
lenta, e os lotes 9 e 10 apresentaram velocidade intermediária sem diferir dos demais.
Tabela 6 – Caracterização física e fisiológica dos cinco lotes de sementes de mamoneira,
utilizados na terceira etapa, determinada pelo teor de água (%) das sementes com e
sem tegumento e pelos testes de germinação em areia (%), emergência de plântulas
em campo (%) (conduzido de 01 a 21 de Abril de 2006) e índice de velocidade de
emergência (IVE).
Lotes Teor de água (%)
Com
tegumento
Sem
tegumento
Germinação
em areia (%)
Emergência de
plântulas (%)
IVE
6
5,5 A
1
4,0 A 93 A 91 A 8,4 A
7
5,0 C 3,6 B 90 AB 92 A 8,4 A
8
4,9 C 3,4 B 80 B 72 A 5,4 B
9
5,1 AB 3,6 B 96 A 74 A 7,3 AB
10
5,2 B 3,6 B 96 A 87 A 7,6 AB
CV%
0,8 2,2 3,1 14,0 14,4
DMS
0,2 0,3 11,3 25,5 2,3
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
62
4.3.1 Primeira fase: seleção dos tratamentos de pré-condicionamento
Os dados do teor de água após a embebição, para os 69 tratamentos de
pré-condicionamento do teste de tetrazólio estudados podem ser observados na Tabela 7. O teor
de água das sementes de mamoneira após o tratamento entre papel, sementes com tegumento por
18 horas à 30ºC (BRASIL, 1992), considerado a testemunha e indicado na tabela com hachuriado
na cor cinza escura, foi de 18,8%. Todos os tratamentos de pré-condicionamento que
apresentaram resultados de teor de água menores e diferentes estatisticamente do apresentado
pela testemunha foram eliminados, pois não atingiram o teor de água mínimo para o
estabelecimento de uma coloração uniforme e nítida durante o teste de tetrazólio.
Assim, os 30 tratamentos selecionados estão marcados na tabela com
hachuriado na cor cinza claro, e foram: método entre papel, sementes com tegumento, por 8 e 10
horas a 35ºC e 40ºC, por 12, 14, 16 e 18 horas a 30ºC, 35ºC e 40ºC; método entre papel, sementes
sem tegumento, por 3 horas a 35ºC e 40ºC, por 4 e 5 horas a 30ºC, 35ºC e 40ºC, e por 6 horas a
25ºC, 30ºC, 35ºC e 40ºC; e método imersão em água das sementes com tegumento, por 6 horas a
35ºC e 40ºC.
Nos resultados de teor de água após a embebição verificou-se que
independente do tratamento, quanto maior a temperatura, maior a quantidade de água absorvida,
assim como relataram Carvalho e Nakagawa (2000).
63
Tabela 7 – Teor de água das sementes de mamoneira (lote 6) sem tegumento após o pré-
condicionamento nos métodos entre papel com tegumento (EPC), entre papel sem
tegumento (EPS) e imersão em água com tegumento (IAC), nos 69 tratamentos.
Tratamentos Teor de água (%)
EPC 6h 30ºC
10,7
A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29
1
35ºC
14,0
A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23
40ºC
13,9
A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23
8h 30ºC
12,8
A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26
35ºC
15,7
A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17
40ºC
16,0
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16
10 h 30ºC
14,8
A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20
35ºC
16,8
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14
40ºC
19,1
A2 A3 A4 A5 A6
12 h 30ºC
15,6
A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18
35ºC
18,9
A2 A3 A4 A5 A6
40ºC
19,3
A2 A3 A4 A5
14 h 30ºC
17,1
A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13
35ºC
17,8
A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9
40ºC
20,5
A1 A2 A3 A4
16 h 30ºC
17,6
A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10
35ºC
21,4
A1 A2
40ºC
21,4
A1 A2
18 h 30ºC
18,8
A2 A3 A4 A5 A6 A7
35ºC
20,8
A1 A2 A3
40ºC
23,1
A1
EPS 1h 25ºC
8,8
A27 A28 A29 A30 A31 A32
30ºC
9,2
A27 A28 A29 A30 A31 A32
35ºC
9,3
A26 A27 A28 A29 A30 A31
40ºC
9,3
A26 A27 A28 A29 A30 A31
2h 25ºC
12,3
A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27
30ºC
11,4
A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28
35ºC
12,2
A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27
40ºC
14,2
A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22
3h 25ºC
12,2
A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27
30ºC
13,7
A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23
35ºC
16,1
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16
40ºC
17,4
A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11
4h 25ºC
14,6
A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21
30ºC
16,1
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16
1
Médias seguidas de mesmo índice An não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
64
Tabela 7 – Continuação.
Tratamentos Teor de água (%)
EPS 4h 35ºC
18,7
A2 A3 A4 A5 A6 A7
1
40ºC
17,4
A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
5h 25ºC
15,2
A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19
30ºC
16,6
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14
35ºC
20,3
A1 A2 A3 A4
40ºC
17,8
A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9
6h 25ºC
18,3
A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
30ºC
18,5
A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
35ºC
22,8
A1
40ºC
23,1
A1
IAC 1h 25ºC
5,8
A32
30ºC
6,4
A30 A31 A32
35ºC
6,2
A31 A32
40ºC
7,3
A29 A30 A31 A32
2h 25ºC
8,2
A28 A29 A30 A31 A32
30ºC
9,2
A27 A28 A29 A30 A31 A32
35ºC
8,9
A27 A28 A29 A30 A31 A32
40ºC
10,8
A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28
3h 25ºC
8,9
A27 A28 A29 A30 A31 A32
30ºC
10,0
A24 A25 A26 A27 A28 A29
35ºC
9,7
A25 A26 A27 A28 A29 A30
40ºC
11,7
A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28
4h 25ºC
10,7
A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29
30ºC
11,2
A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28
35ºC
11,8
A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27
40ºC
13,0
A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25
5h 25ºC
11,3
A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28
30ºC
12,8
A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26
35ºC
14,3
A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22
40ºC
15,2
A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19
6h 25ºC
13,4
A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24
30ºC
13,9
A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23
35ºC
15,4
A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18
40ºC
16,2
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15
CV%
5,5
DMS
3,5
1
Médias seguidas de mesmo índice An não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
65
Entre os tratamentos selecionados, o maior teor de água foi obtido para o
pré-condicionamento no método entre papel sem tegumento por 6 horas a 40ºC e no método entre
papel com tegumento por 18 horas a 40ºC, e o menor para o método imersão em água das
sementes com tegumento por 6 horas a 35ºC. Assim, a faixa de teor de água obtida no pré-
condicionamento foi de 15,4% a 23,1%.
Esses teores de água são inferiores a 28%, que é o valor necessário para
que a semente de mamona inicie a hidrólise das macromoléculas (BELTRÃO et al., 2001).
Entretanto, pode-se afirmar que o teor de água de aproximadamente 19%, alcançado com o pré-
condicionamento das sementes por 18 horas a 30ºC entre papel com tegumento (testemunha)
(BRASIL, 1992), foi suficiente para ativar as enzimas, assim como para a realização do teste de
tetrazólio, pois possibilitou o desenvolvimento da coloração adequada para a avaliação correta da
viabilidade das sementes nas etapas anteriores desta pesquisa.
As sementes de mamoneira apresentaram teor de água inicial sem
tegumento de aproximadamente 4,0% (Tabela 6), assim sendo, houve um ganho de 11,4% a
19,1% de teor de água, de acordo com o tratamento de pré-condicionamento (Tabela 7).
Entre os métodos, a imersão em água das sementes com tegumento foi o
que apresentou menor eficiência no aumento do teor de água das sementes, considerando-se os
períodos e temperaturas testadas, com apenas dois tratamentos selecionados para a segunda fase.
Como não houve interesse em prolongar o período para a realização do teste de tetrazólio e o
método entre papel sem tegumento com seis horas já apresentou teor de água suficiente, não
foram testados outros tratamentos para o método imersão em água. Além disso, a imersão direta
das sementes em água pode acarretar problemas devido à redução na disponibilidade de oxigênio,
comprometendo a qualidade das sementes e, assim, podendo levar à obtenção de resultados
incorretos, se realizada por período excessivo (BARROS et al., 2005).
66
4.3.2 Segunda fase: avaliação da uniformidade de embebição dos lotes de sementes
nos tratamentos selecionados
Na primeira análise, na qual os lotes foram utilizados como repetições, os
resultados de teor de água após a embebição para os 30 tratamentos de pré-condicionamento
estão apresentados na Tabela 8. O teor de água das sementes de mamoneira no tratamento
testemunha foi de 20,6%, indicado na tabela com linha cinza escura.
Os tratamentos que apresentaram teor de água estatisticamente menor que
o da testemunha foram considerados inadequados para a metodologia do teste de tetrazólio, pois
não atingiram o teor de água mínimo para a coloração adequada das sementes, quando testados
para cinco lotes. Assim, os 22 tratamentos selecionados estão indicados na tabela com linha cinza
clara: entre papel sementes com tegumento por 10 e 12 horas a 35ºC e 40ºC, e por 14, 16 e 18
horas a 30ºC, 35ºC e 40ºC; entre papel sementes sem tegumento por 4 horas a 35ºC e 40ºC, por 5
horas 30ºC, 35ºC e 40ºC, e por 6 horas a 25ºC, 30ºC, 35ºC e 40ºC. A faixa do teor de água das
sementes variou de 17,4% a 23,7% entre os tratamentos.
67
Tabela 8 – Teor de água de sementes de mamoneira sem tegumento após o pré-condicionamento
nos métodos entre papel com tegumento (EPC), entre papel sem tegumento (EPS) e
imersão em água com tegumento (IAC), nos 30 tratamentos selecionados, para a
média de cinco lotes.
Tratamentos
Teor de água (%)
EPC 8h 35ºC 15,5 K
40ºC 16,7 IJK
10 h 35ºC 17,4 FGHIJK
40ºC 18,6 DEFGHIJK
12 h 30ºC 17,2 GHIJK
35ºC 18,8 CDEFGHIJK
40ºC 20,9 ABCDE
14 h 30ºC 18,8 CDEFGHIJK
35ºC 19,2 CDEFGHIJ
40ºC 21,4 ABCDE
16 h 30ºC 19,2 CDEFGHIJ
35ºC 21,1 ABCDE
40ºC 23,1 AB
18 h 30ºC 20,6 ABCDEF
35ºC 22,0 ABCD
40ºC 23,7 A
EPS 3h 35ºC 16,2 JK
40ºC 16,7 HIJK
4h 30ºC 17,2 GHIJK
35ºC 19,4 CDEFGHIJ
40ºC 19,9 BCDEFGHI
5h 30ºC 18,6 EFGHIJK
35ºC 20,1 BCDEFGH
40ºC 20,9 ABCDE
6h 25ºC 18,6 DEFGHIJK
30ºC 20,3 BCDEFG
35ºC 22,2 ABC
40ºC 22,8 AB
IAC 6h 35ºC 15,8 K
40ºC 16,7 IJK
CV%
DMS
7,1
3,4
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
68
Os resultados da segunda análise, realizada com os dados do teor de água
de cinco lotes de sementes após 22 tratamentos de pré-condicionamento selecionados na análise
anterior, indicaram que os tratamentos entre papel sementes com tegumento por 10, 12 e 16 horas
a 35ºC, por 14 horas a 35ºC e 40ºC, e por 18 horas a 30ºC e 40ºC (Tabela 9) e entre papel
sementes sem tegumento por 6 horas a 25ºC, 30ºC e 40ºC (Tabela 10) promoveram a
uniformidade de absorção de água pelas sementes, com todos os lotes apresentando teor de água
semelhante. Assim, esses dez tratamentos foram selecionados para a fase seguinte.
A qualidade fisiológica das sementes de mamoneira não influenciou na
absorção de água, nos métodos de pré-condicionamento estudados. Da mesma maneira, em
sementes de amendoim, Bittencourt (1995) verificou que após 16 horas de embebição na
temperatura de 20ºC as sementes com níveis diferenciados de vigor (alto, médio e baixo)
alcançaram a mesma faixa de teor de água. Diferente do observado nesta pesquisa, para sementes
algodão, o período de embebição deve ser de 14 a 16 horas a 25ºC; no entanto, lotes de qualidade
inferior, devem ser embebidos por um maior período, para que ocorra ativação suficiente do
sistema enzimático (VIEIRA e VON PINHO, 1999).
69
Tabela 9 – Teor de água de cinco lotes de sementes de mamoneira sem tegumento após os tratamentos de pré-condicionamento no
método entre papel com tegumento.
Teor de água (%)
Entre papel com tegumento
Período
10h
12h
14h
16h
18h
Temperatura
35ºC 40ºC
35ºC 40ºC
30ºC 35ºC 40ºC
30ºC 35ºC 40ºC
30ºC 35ºC
40ºC
Lotes
6
16,8 A
1
19,1 AB
18,9 A 19,3 B
17,1 B 17,8 A 20,5 A
17,6 B 21,4 A
21,4 B 18,8 A
20,8 B
23,1 A
7
17,4 A 18,6 AB
19,0 A
23,1 A
19,9 AB
20,1 A 22,3 A
19,7 AB
22,3 A
23,8 AB
22,3 A
21,0 B
24,7 A
8
16,2 A 16,5 B 16,8 A 18,2 B
18,0 AB
18,9 A 20,6 A
18,1 AB
19,6 A
22,4 AB
19,4 A
23,2 A
22,3 A
9
18,6 A 20,3 A 19,9 A 22,0 B
20,3 A 20,4 A 22,0 A
20,5 A 21,3 A
24,8 A 21,9 A
24,3 A
25,3 A
10
18,2 A 18,7 AB
19,5 A 21,7 A
18,8 AB
18,8 A 21,6 A
20,0 AB
21,8 A
23,1 AB
20,4 A
20,5 B
23,2 A
CV%
5,4 4,5
6,5 2,4
4,0 3,5 5,1
3,6 4,4 3,0
5,8 1,6 5,5
DMS
3,8 3,3
4,9 2,0
3,0 2,7 4,4
2,8 3,8 2,7
4,8 1,4 5,2
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
70
Tabela 10 – Teor de água de cinco lotes de sementes de mamoneira sem tegumento após os tratamentos de pré-condicionamento no
método entre papel sem tegumento.
Teor de água (%)
Entre papel sem tegumento
Período
4h
5h
6h
Temperatura
35ºC 40ºC
30ºC 35ºC 40ºC
25ºC 30ºC 35ºC
40ºC
Lotes
6
18,7 AB 17,4 B
16,6 B 20,3 AB 17,8 B
18,3 A 18,5 A 22,8 AB
23,1 A
7
21,9 A 21,3 A
21,7 A 21,5 A 23,5 A
19,0 A 20,5 A 24,5 A 25,5 A
8
19,2 AB 20,7 A
16,6 B 17,5 B 19,7 AB
17,5 A 20,2 A 20,3 B 22,2 A
9
19,7 AB 20,6 A
19,7 A 21,3 AB 23,1 A
19,2 A 21,8 A 22,0 AB 23,0 A
10
17,5 B 19,6 AB
18,4 B 19,8 AB 20,3 AB
19,1 A 20,6 A 21,1 AB 20,4 A
CV%
4,4 3,5
4,4 4,9 5,5
4,4 5,9 4,1 6,3
DMS
3,4 2,8
3,3 4,0 4,6
3,3 4,8 3,7 5,8
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
71
4.3.3 Terceira fase: comparação dos resultados do teste de tetrazólio com os do teste
de germinação
Os resultados dos testes de tetrazólio mostraram que houve diferença
estatisticamente significativa entre os tratamentos de pré-condicionamento para todas as
características avaliadas (Tabela 11), embora para porcentagem de sementes viáveis essas
diferenças sejam insuficientes para desqualificar qualquer um dos tratamentos. Entretanto, a
avaliação da porcentagem de sementes com coloração desuniforme e/ou manchas esbranquiçadas
mostrou que alguns tratamentos podem ocasionar estes sintomas, os quais dificultam a
interpretação correta do teste, influenciando nos resultados, como o tratamento entre papel com
tegumento por 10 horas a 35ºC (Figura 29) e o entre papel sem tegumento por 6 horas a 25ºC,
30ºC e 40ºC (Figuras 30, 31 e 32, respectivamente).
Tabela 11 – Porcentagem de sementes viáveis e de sementes viáveis e não viáveis com coloração
desuniforme e com manchas esbranquiçadas, observadas no teste de tetrazólio
realizado após dez tratamentos de pré-condicionamento nos métodos entre papel
com tegumento (EPC) e sem tegumento (EPS), para o lote 6 de sementes de
mamoneira.
Tratamentos
Viáveis
(%)
Coloração
desuniforme (%)
Manchas
esbranquiçadas (%)
EPC 10 h 35ºC
92 BC
1
45 AB 25 ABC
12 h 35ºC
98 A 22 BC 30 AB
14 h 35ºC
96 ABC 27 BC 11 BC
40ºC
97 AB 20 BC 8 BC
16 h 35ºC
98 A 9 C 18 ABC
18 h 30ºC
91 C 8 C 6 BC
40ºC
99 A 10 C 3 C
EPS 6h 25ºC
95 ABC 76 A 41 A
30ºC
96 ABC 63 A 28 AB
40ºC
95 ABC 52 AB 14 BC
CV%
1,4 26,1 33,3
DMS
5,3 34,3 24,3
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
72
O pré-condicionamento inadequado também resultou em coloração
desuniforme e manchas nas sementes de amendoim (BITTENCOURT, 1995), canafístula
(Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert) (OLIVEIRA et al., 2005) e soja (COSTA et al., 1998).
A principal característica da coloração desuniforme eram áreas com
coloração mais escura, avermelhadas, no sentido do centro da semente para as laterais, as quais
não apresentavam qualquer sinal de tecido em deterioração, ou seja, o tecido da semente
apresentava-se túrgido e firme (Figuras 29 a 32). As principais características das manchas
esbranquiçadas eram: o tecido em volta estar túrgido e firme e, embaixo da mancha, o tecido
estava vermelho e túrgido (Figuras 29 a 32).
Figura 29 – Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sementes com tegumento por 10 horas a 35ºC.
Figura 30 – Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sementes sem tegumento por 6 horas a 25ºC.
a
b
a
a a
a a
a a
a
a
a
b
b
b
b
b
a a
a
a
a
a
a
a
a
a a
a
a a
a
a a
b
b
b
b
b
b
b
b
73
Figura 31 – Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e/ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sementes sem tegumento por 6 horas a 30ºC.
Figura 32 – Sementes de mamoneira com coloração desuniforme (a) e /ou manchas
esbranquiçadas (b) (lote 6), após o teste de tetrazólio realizado com o pré-
condicionamento entre papel sem tegumento por 6 horas a 40ºC.
A presença de coloração desuniforme e de manchas nas sementes foi
causada pelas condições inadequadas proporcionadas pelos tratamentos no pré-condicionamento.
Esses tratamentos provocaram uma rápida absorção de água, o que justifica as sementes
apresentarem teor de água semelhante aos demais tratamentos, entretanto o período de embebição
não foi suficiente para que a distribuição da água ocorresse de forma uniforme em toda a
semente. Assim, não houve o estímulo adequado ao processo respiratório e atividade enzimática,
comprometendo a uniformidade da coloração e a avaliação do teste (MARCOS FILHO et al.,
1987; BITTENCOURT, 1995). De acordo com Copeland et al. (1959), o pré-condicionamento
antes da coloração das sementes constitui uma das etapas críticas do teste de tetrazólio, pois a
b
a
a
a
a
a
a
a a
a
a
a
a
a
a b
b
b
b
b
b
b
b
b
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
74
absorção lenta de água, em temperatura controlada, é importante e necessária para prevenir
injúrias por embebição.
Os resultados indicaram que o tegumento tem um papel de destaque no
processo de embebição das sementes, regulando a entrada de água e fazendo com que a
embebição ocorra de forma lenta e uniforme (WOODSTOCK, 1988). Isso pode ser verificado
neste estudo, pois nenhum dos tratamentos do método de pré-condicionamento com sementes
sem tegumento resultou em teor de água nas sementes necessário à realização do teste de
tetrazólio, levando ao aparecimento de coloração desuniforme e manchas.
Os tratamentos que apresentaram maior porcentagem de sementes com
coloração desuniforme e manchas esbranquiçadas foram considerados inadequados para o pré-
condicionamento de sementes de mamoneira, visando a realização do teste de tetrazólio e, por
isso, foram eliminados das análises seguintes.
Os resultados da segunda análise para sementes viáveis dos testes de
germinação e de tetrazólio, considerando cada lote separadamente, estão na Tabela 12.
Tabela 12 – Sementes viáveis de mamoneira determinadas pelo teste de tetrazólio, realizado após
seis tratamentos de pré-condicionamento no método entre papel com tegumento
(EPC), e pelo teste de germinação em areia.
Sementes viáveis (%)
Tratamentos
Lote 6 Lote 7 Lote 8 Lote 9 Lote 10
Germinação em areia
93 a
1
90 ab 80 B b 96 A a 96 a
EPC 12 h 35ºC
98 a 86 b 91 AB ab 86 AB b 96 ab
14 h 35ºC
96 a 91 a 97 A a 80 B b 97 a
40ºC
97 88 98 A 90 AB 96
16 h 35ºC
98 ab 97 ab 99 A a 88 AB b 99 a
18 h 30ºC
91 a 89 ab 97 A a 80 B b 99 a
40ºC
99 94 97 A 90 AB 98
CV%
3,8
DMS lotes
11,1
DMS tratamentos
10,2
1
Médias seguidas da mesma letra, maiúscula na coluna, e minúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
75
Foi possível observar diferenças significativas entre os lotes, contudo
apenas para os lotes 8 e 9 houve interação com os tratamentos. No lote 8, apenas o tratamento
entre papel com tegumento por 12 horas a 35ºC apresentou resultado estatisticamente semelhante
ao da germinação. Já no lote 9 os tratamentos entre papel com tegumento por 14 horas a 35ºC e
por 18 horas a 30ºC apresentaram resultados estatisticamente diferentes da germinação.
Somente os tratamentos de pré-condicionamento entre papel com
tegumento pelos períodos de 14 e 18 horas a 40ºC não diferenciaram os lotes no teste de
tetrazólio. Os demais tratamentos indicaram os lotes 6 e 10 como superiores e o lote 7 como
intermediário. Entretanto, o teste de tetrazólio parece ter superestimado o potencial do lote 8, que
apresentou valores baixos de emergência de plântulas em campo e IVE, na caracterização dos
lotes desta etapa (Tabela 6). Isso pode ter ocorrido devido à presença de sementes duras e
também de fungos no teste de germinação em areia, que não são identificados no teste de
tetrazólio.
Da mesma maneira como observado nesta pesquisa, a avaliação da
germinação pode ser prejudicada pela presença de fungos, verificando-se diferenças maiores que
5% entre os resultados do teste de tetrazólio e de germinação em sementes de algodão (SANTOS
et al., 1992; VIEIRA e VON PINHO, 1999), soja (FRANÇA NETO et al., 1998), amendoim
(BITTENCOURT, 1995) e canafístula (Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert) (OLIVEIRA et
al., 2005).
No lote 9, o teste de tetrazólio parece ter subestimado o potencial
germinativo (Tabela 12). No entanto, quando os resultados foram comparados com os testes de
emergência de plântulas em campo e IVE, realizados na caracterização dos lotes (Tabela 6),
verificou-se que este lote tinha qualidade inferior aos lotes 6 e 7, assim como indicou o teste de
tetrazólio. Isso pode ter ocorrido, pois os danos observados nas sementes no teste de tetrazólio
não se manifestaram no teste de germinação em areia, conduzido em condições controladas.
O teste de tetrazólio (Tabela 12) não possibilitou o ranqueamento desses
lotes de forma semelhante à indicada pelos testes de germinação, emergência de plântulas em
campo e IVE realizados na caracterização dos lotes desta etapa (Tabela 6). Entretanto, identificou
um potencial de germinação para o lote 8, indicando que se as sementes forem tratadas, a
germinação poderá aumentar e mostrou que o lote 9 poderá perder sua capacidade germinativa
rapidamente.
76
Assim, este fato não deve ser um problema que afete a confiabilidade do
teste de tetrazólio, pois, segundo Marcos Filho (1999), a emergência de plântulas em campo e os
testes diretos de avaliação da qualidade das sementes são afetados por fatores muitas vezes não
observados durante a condução de testes indiretos, como o tetrazólio, de modo que os resultados
precisam ser interpretados com a devida cautela. Dentro deste enfoque, o teste de tetrazólio
possibilita a avaliação da capacidade potencial inerente aos lotes de sementes e que a possível
falta de concordância entre os resultados deste teste e a emergência das plântulas no campo não
implica necessariamente em baixa eficiência, pois um analista experiente poderá pesquisar as
causas destas diferenças e obter novos parâmetros que contribuam para a maior precisão dos
resultados (MOORE, 1985; BITTENCOURT, 1995).
Na terceira análise, quando os lotes foram considerados como repetições
(Tabela 13) não houve diferença estatística entre os resultados de germinação e de tetrazólio para
os tratamentos estudados.
Tabela 13 – Sementes viáveis de mamoneira determinadas pelo teste de tetrazólio, realizado após
seis tratamentos de pré-condicionamento no método entre papel com tegumento
(EPC), e pelo teste de germinação em areia, para a média dos cinco lotes.
Tratamentos Sementes viáveis (%)
Germinação em areia
91
EPC 12 h 35ºC
91
14 h 35ºC
92
40ºC
94
16 h 35ºC
96
18 h 30ºC
91
40ºC
96
Média
93
CV%
6,5
DMS
8,3
Dessa maneira, qualquer um dos seis tratamentos de pré-condicionamento
estudados pode ser utilizado na condução do teste de tetrazólio para sementes de mamoneira. A
escolha vai depender da rotina, das condições de cada laboratório de análise de sementes e da
rapidez com que as informações são requeridas. Porém, sob o aspecto prático, o pré-
77
condicionamento por 16 ou 18 horas são os mais indicados, pois estes períodos possibilitam
colocar as sementes para embeber no final da tarde e submetê-las ao preparo e coloração no dia
seguinte pela manhã. A escolha da temperatura vai depender da disponibilidade dos
equipamentos dos laboratórios, e a maioria das câmaras de germinação permite alcançar a
temperatura máxima recomendada de 40ºC.
Esses resultados concordam com as prescrições encontradas nas Regras
para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) para mamona, que prescrevem o pré-
condicionamento das sementes entre papel por 18 horas e concordam parcialmente com Grabe
(1976), para sementes classificadas em “outras dicotiledôneas não leguminosas”, que é o caso da
mamona, pois esse autor recomendou o pré-condicionamento por 16 horas entre papel umedecido
ou a embebição direta em água morna durante três a quatro horas.
4.4 Etapa 4 – Metodologia para a avaliação do vigor das sementes pelo teste de
tetrazólio
4.4.1 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes pelo teste de tetrazólio
Para a avaliação do vigor, as sementes foram classificadas em viáveis e
vigorosas, viáveis e não vigorosas e não viáveis, sendo:
1) viáveis e vigorosas: sementes com coloração rosa-claro a rosa em toda a extensão do
embrião e do endosperma, com tecidos firmes e túrgidos, sem apresentar lesões
visíveis (Figura 33); podem apresentar pequenos danos superficiais em volta dos
cotilédones, mas sem atingi-los (Figura 34); podem apresentar coloração fraca,
indicando restrição à penetração da solução de tetrazólio (Figura 35), mas com os
tecidos túrgidos; sementes com coloração vermelha carmim (tecido em deterioração)
na extremidade apical inferior do eixo hipocótilo radícula (Figura 36); ainda podem
apresentar áreas com coloração rosa-escuro a vermelho carmim no endosperma, mas o
tecido deve estar túrgido e brilhante (Figura 37).
78
Figura 33 – Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, com coloração rosa-claro a rosa em toda
a extensão do embrião e do endosperma, com tecidos firmes e túrgidos, sem
apresentar lesões visíveis.
Figura 34 - Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, apresentando pequenos danos
superficiais em volta dos cotilédones, mas sem atingi-los.
Figura 35 - Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, com coloração fraca, indicando restrição
à penetração da solução de tetrazólio.
79
Figura 36 - Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, com coloração vermelho carmim (tecido
em deterioração) na extremidade apical inferior do eixo hipocótilo-radícula.
Figura 37 - Sementes viáveis e vigorosas de mamoneira, apresentando áreas com coloração rosa-
escuro a vermelho carmim no endosperma, mas o tecido está túrgido e brilhante.
2) viáveis e não vigorosas: sementes com endosperma e/ou cotilédones com menos de
50% das áreas não coloridas (Figura 38); a extremidade do eixo hipocótilo-radícula
pode apresentar-se sem coloração, desde que os tecidos estejam firmes e túrgidos
(Figura 39), sem lesões visíveis, com possibilidade de originar plântulas normais;
endosperma e/ou embrião com coloração vermelha carmim-escura, porém brilhante e
sem alteração de textura (Figura 40); incluem-se as sementes que só teriam
possibilidade de germinar sob condições extremamente favoráveis (Figura 41).
80
Figura 38 - Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, apresentando endosperma e/ou
cotilédones com menos de 50% das áreas não coloridas.
Figura 39 - Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, com a extremidade do eixo
hipocótilo-radícula sem coloração, mas com os tecidos firmes e túrgidos.
Figura 40 - Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, apresentando endosperma e/ou
embrião com coloração vermelha-escura, porém brilhante e sem alteração de
textura.
81
Figura 41 - Sementes viáveis e não vigorosas de mamoneira, que só teriam possibilidade de
germinar sob condições extremamente favoráveis.
3) não viáveis: sementes apresentando mais de 50% das áreas dos cotilédones e/ou
endosperma não coloridas (Figura 42); com ausência de coloração na região do eixo
hipocótilo-radícula, apresentando tecidos flácidos e brancos ou amarelados (Figura
43); com áreas do endosperma e embrião totalmente sem coloração (Figura 44),
indicando a possibilidade de originarem plântulas anormais, ou ainda apresentando
estado metabólico característico de sementes mortas.
Figura 42 - Sementes não viáveis de mamoneira, apresentando mais de 50% das áreas dos
cotilédones e/ou endosperma não coloridas.
82
Figura 43 - Sementes não viáveis de mamoneira, apresentando ausência de coloração na região
do eixo hipocótilo-radícula e tecidos flácidos e brancos ou amarelados.
Figura 44 - Sementes não viáveis de mamoneira, com áreas do endosperma e embrião totalmente
sem coloração.
83
Os resultados do potencial de vigor (viáveis e vigorosas) e do potencial de
germinação ou viabilidade (viáveis e vigorosas e não vigorosas) dos lotes podem ser observados
na Tabela 14. Os resultados de viabilidade mostraram superioridade do lote 12 em relação aos
lotes 14 e 15. Para o vigor verificou-se que o lote 11 mostrou-se superior aos lotes 12 e 13.
Tabela 14 – Viabilidade (viáveis vigorosas e não vigorosas) e vigor (viáveis e vigorosas) de
sementes de mamoneira pelo teste de tetrazólio.
Teste de tetrazólio
Lotes
Viabilidade (%) Vigor (%)
11
99 AB 66 A
12
100 A 52 B
13
99 AB 49 B
14
95 BC 54 AB
15
94 C 56 AB
CV %
2,2 10,5
DMS
4,7 12,7
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
4.4.2 Avaliação da viabilidade e do vigor das sementes por outros testes
Na Tabela 15 estão os resultados da comparação de médias realizada para
os testes utilizados para a avaliação da viabilidade e do vigor dos cinco lotes de sementes
utilizados nesta etapa e, na Tabela 16, a análise de correlação simples entre as médias desses
testes e entre os resultados de viabilidade e vigor pelo teste de tetrazólio.
Nos resultados de comparação de médias (Tabela 15) verifica-se que os
testes de germinação em papel, IVE e massa da matéria seca de plântulas não diferenciaram
estatisticamente os lotes. Entretanto, quando os testes foram correlacionados entre si (Tabela 16),
houve correlação positiva significativa entre o IVE e o teste de emergência de plântulas em
campo, e entre a massa da matéria seca de plântulas e os testes de viabilidade pelo tetrazólio e
comprimento de plântulas total e raiz.
84
Tabela 15 – Caracterização dos cinco lotes de sementes de mamoneira utilizados na quarta etapa pelo teor de água (TA) e pelos testes
de primeira contagem do teste de germinação (PC), germinação em papel (GP), germinação entre areia (GA), normais
fortes pelo teste de classificação das plântulas (NF), emergência de plântulas em campo (EC) (conduzido de 01 a 21 de
Novembro de 2006), índice de velocidade de emergência (IVE), envelhecimento acelerado (EA), comprimento de
plântulas (CP) e massa de matéria seca de plântulas (MS).
CP (cm)
Lotes TA (%) PC (%)
GP (%) GA (%) NF (%) EC (%) IVE EA (%)
Total Raiz
MS
(mg/plân
tula)
11
5,0 B 51 B
1
86 93 A 70 A 91 A 8,4 60 C 10,2 AB
7,3 AB 54,0
12
5,1 B 51 B 82 96 A 62 AB 87 AB 7,6 62 BC 14,5 A 11,2 A 80,1
13
5,7 A 60 AB 87 92 A 51 B 92 A 8,4 84 A 9,6 AB
7,5 AB 62,9
14
5,2 B 64 A 78 81 B 54 B 87 AB 8,4 72 B 5,8 B 3,8 B 37,7
15
5,1 B 55 AB 82 80 B 60 AB 81 B 7,6 68 BC 7,3 B 5,2 B 45,5
CV %
1,4 10,2 6,2 4,1 11,2 4,0 7,4 7,2 28,9 31,2 34,9
DMS
0,3 12,6 11,2 7,9 14,5 7,6 1,3 10,9 6,0 4,8 42,7
1
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
85
Tabela 16 – Análise de correlação simples (r) entre as médias dos testes de primeira contagem da germinação (PC), germinação em
papel (GP), germinação entre areia (GA), normais fortes pelo teste de classificação das plântulas (NF), emergência de
plântulas em campo (EC), índice de velocidade de emergência (IVE), viabilidade e vigor pelo teste de tetrazólio (TZ),
envelhecimento acelerado (EA), comprimento de plântulas (CP) e massa de matéria seca de plântulas (MS), realizados
para cinco lotes de sementes de mamoneira.
CP
Correlação PC GP GA NF EC IVE
Viabilidade
TZ
Vigor
TZ
EA
Total Raiz
GP
-0,33
ns
GA
-0,55
ns
0,58
ns
NF
-0,84
ns
0,16
ns
0,35
ns
EC
0,06
ns
0,61
ns
0,71
ns
0,00
ns
IVE
0,52
ns
0,35
ns
0,09
ns
-0,21
ns
0,76*
Viabilidade TZ
-0,53
ns
0,55
ns
1,00**
0,34
ns
0,72* 0,11
ns
Vigor TZ
-0,49
ns
0,17
ns
0,07
ns
0,86** 0,10
ns
0,20
ns
0,07
ns
EA
0,73
* 0,27
ns
-0,18
ns
-0,90
ns
0,25
ns
0,43
ns
-0,19
ns
-0,69
ns
CP Total
-0,73
ns
0,30
ns
0,87**
0,41
ns
0,28
ns
-0,40
ns
0,87** -0,05
ns
-0,39
ns
CP Raiz
-0,69
ns
0,35
ns
0,88**
0,32
ns
0,30
ns
-0,38
ns
0,87** -0,13
ns
-0,29
ns
0,99**
MS
-0,58
ns
0,36
ns
0,86**
0,17
ns
0,32
ns
-0,36
ns
0,85** -0,28
ns
-0,14
ns
0,97** 0,99**
ns
não significativo; * significativo a 10%; ** significativo a 1%.
86
Somente a primeira contagem da germinação em papel e o
envelhecimento acelerado apresentaram classificação dos lotes diferente dos demais testes
(Tabela 15), e também não se correlacionaram com nenhum outro teste, apenas entre si
(Tabela 16). De acordo com Marcos Filho (1999), o teste de envelhecimento acelerado
depende da influência de vários fatores e pode indicar um potencial para uma amostra que
pode não ser confirmado na prática. Isto foi verificado no presente estudo. Assim, esse teste
foi considerado inadequado para a avaliação da qualidade dos lotes de sementes de mamoneira
utilizados nesta pesquisa.
Os resultados dos testes de germinação entre areia (Tabela 15) e de
viabilidade pelo tetrazólio (Tabela 14) indicaram os lotes 11, 12 e 13 como de qualidade
semelhante, e superiores numericamente aos lotes 14 e 15. O teste de vigor pelo tetrazólio
diferenciou os lotes, destacando o lote 11 como o de qualidade superior, da mesma maneira
que o teste de classificação de plântulas (normais fortes) (Tabela 15). Esses resultados podem
ser comprovados pela correlação altamente significativa entre os testes citados (Tabela 16).
O teste de viabilidade pelo tetrazólio também se correlacionou com o
teste de emergência de plântulas em campo, e com os testes de comprimento de plântulas total
e raiz, os quais também tiveram correlação com o teste de germinação em areia. Além disso, o
teste de germinação em areia revelou correlação não significativa, mas positiva com a
emergência de plântulas em campo, apresentando coeficiente de correlação de 0,71.
No presente estudo, as diferenças verificadas entre os resultados do
teste de tetrazólio e do teste de germinação em areia, confirmaram a precisão do método, pois
apresentaram diferenças de até 5% em relação aos valores do teste padrão de germinação
(FRANÇA NETO et al., 1998). Por outro lado, quando esta comparação foi efetuada com os
valores do teste de germinação conduzido em rolo de papel, observaram-se maiores
diferenças. Porém, estes resultados podem ter sido mascarados pelo excessivo
desenvolvimento de fungos, observado durante a condução dos experimentos (Tabelas 14 e
15). Outros autores também verificaram diferenças maiores que 5% entre os resultados do
teste de tetrazólio e do teste padrão de germinação em sementes de soja, amendoim e algodão,
quando estas se encontraram infectadas por fungos (FRANÇA NETO et al., 1998;
BITTENCOURT, 1995; SANTOS et al., 1992).
87
Entretanto, apesar do teste de germinação em papel não ter
apresentado correlação significativa com nenhum outro teste, os valores do coeficiente de
correlação foram positivos e, quando comparado com o teste de emergência de plântulas em
campo, foi de 0,61 e com o teste de tetrazólio de 0,55 (Tabela 16).
Entre os testes realizados para a avaliação da qualidade dos lotes de
sementes, nem todos apresentaram a mesma classificação para os lotes, como pode ser
verificado comparando-se os resultados dos testes de classificação de plântulas, emergência de
plântulas em campo e comprimento de plântulas (Tabela 15). Os três testes avaliam
características semelhantes das sementes, porém em condições totalmente diferentes. Assim, é
preciso considerar que os testes de vigor oferecem apenas comparações entre o potencial
fisiológico das sementes, não permitindo estimar o comportamento destas sob as mais variadas
condições de ambiente e que, por isso, é conveniente a tomada de decisões baseada na
interpretação conjunta dos resultados de dois ou três testes, cujos princípios estejam
intimamente relacionados aos objetivos que se deseja atingir (MARCOS FILHO et al., 1987).
Outros pesquisadores também constataram que amostras de sementes
classificadas nas categorias intermediárias apresentam, frequentemente, comportamento
semelhante ao das sementes de alto vigor ou das de vigor mais baixo, dependendo do método
empregado na sua avaliação (MARCOS FILHO et al., 1987; MARCOS FILHO, 1999;
VIEIRA e CARVALHO, 1994; BITTENCOURT, 1995).
Dessa maneira, os resultados obtidos indicaram que os procedimentos
definidos para a padronização da metodologia do teste de tetrazólio são eficientes para estimar
a viabilidade de sementes de mamoneira.
Quanto à estimativa do vigor das sementes de mamoneira pelo teste de
tetrazólio, recomenda-se que sejam realizados outros estudos, relacionados também a outros
testes de avaliação de vigor, pois como mostram os trabalhos conduzidos com outras espécies
como o amendoim (BITTENCOURT, 1995), soja (FRANÇA NETO et al., 1998), milho
(DIAS e BARROS, 1999), algodão (VIEIRA e VON PINHO, 1999), tomate (SANTOS,
2003), abóbora (DIAS et al., 2001), jenipapo (NASCIMENTO e CARVALHO, 1998) e feijão-
de-vagem (BHERING et al., 1996), o teste de tetrazólio é eficiente para estimar o vigor das
sementes.
88
5 CONCLUSÕES
O teste de tetrazólio é eficiente para estimar a viabilidade e o vigor de
sementes de mamoneira.
A avaliação da qualidade fisiológica das sementes de mamoneira pelo
teste de tetrazólio deve ser realizada pré-condicionando as sementes com tegumento, entre
papel toalha umedecido, por 16 horas a 35ºC ou por 18 horas a 30ºC ou 40ºC. Após esse
período, o tegumento deve ser removido e as sementes cortadas longitudinal e medianamente
através do embrião e, então, imersas na solução de tetrazólio na concentração de 0,2% por 120
minutos, na temperatura de 35ºC, para o desenvolvimento da coloração.
As sementes de mamoneira podem ser classificadas quanto ao vigor
em viáveis e vigorosas, viáveis e não vigorosas e não viáveis.
89
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