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AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DAS CÉLULAS B-1 NO
CRESCIMENTO DO CARCINOMA DE EHRLICH
MARIA CAROLINA ANDRADE DE AZEVEDO
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2
UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP
PROGRAMA DE MESTRADO EM MEDICINA
VETERINÁRIA
AVALIAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO DAS CÉLULAS B-1 NO
CRESCIMENTO DO CARCINOMA DE EHRLICH
Dissertação Apresentada ao
Programa de Mestrado em Medicina
Veterinária da Universidade Paulista
–
UNIP para obtenção do Título de
Mestre.
Á
rea de concentração:
Imunopatologia Veterinária.
MARIA CAROLINA ANDRADE DE AZEVEDO
São Paulo
2007
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PROGRAMA DE MESTRADO EM MEDICINA
VETERINÁRIA
AVALIAÇÃO DA PATICIPAÇÃO DAS CÉLULAS B-1 NO
CRESCIMENTO DO CARCINOMA DE EHRLICH
Dissertação Apresentada ao
Programa de Mestrado em Medicina
Veterinária da Universidade Paulista
–
UNIP para obtenção do Título de
Mestre.
Á
rea de concentração:
Imunopatologia Veterinária, sob
orientação do Prof. Dr. Mario
Mariano
MARIA CAROLINA ANDRADE DE AZEVEDO
São Paulo
2007
4
Maria Carolina Andrade de Azevedo
Avaliação da participação das Células B-1 no crescimento do carcinoma
de Ehrlich / Maria Carolina Andrade de Azevedo.
38p.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária. Instituto de Ciências da Saúde (ICS) Universidade Paulista, São
Paulo 2007.
Área de concentração: Imunopatologia Veterinária
Orientador: Mario Mariano
1. Carcinoma de Ehrlich 2. Células B-1 3. Imunidade
5
Aos meus pais Luis Carlos de Azevedo e
Ana Maria de Azevedo, agradeço pelo
apoio e amor incondicional.
Às minhas irmãs Maria Regina e Maria
Cristina pela alegria e companheirismo.
Ao meu querido irmão Luis Carlos de
Azevedo Filho foi capaz de deixar como
exemplo sua força e perseverança frente à
vida.
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço meu orientador Prof. Dr. Mario Mariano que tão gentilmente me
aceitou e me mostrou exatamente o caminho a ser seguido.
Agradeço minha co-orientadora Profa. Dra. Maria Regina Andrade de
Azevedo pelo auxilio na execução deste trabalho, e também pela boa vontade e
paciência, sempre presentes.
Agradeço a Profa. Dra. Maria Martha Bernardi pela atenção e apoio no
início do meu projeto.
Agradeço a Profa. Dra. Maria Lucia Zaidan Dagli pela oportunidade que
me foi concedida no acompanhamento de algumas pesquisas realizadas no
DPMVZ-USP
Agradeço a Patrícia Matsuzaki pela prontidão e disposição a mim
oferecidas.
Agradeço a todos os professores da Pós-graduação, pelos ensinamentos
e lições durante esses anos.
Agradeço aos funcionários da Pós-graduação da UNIP pela amizade e
convivência nesse período.
Agradeço aos meus colegas de Pós-graduação, Luiz, Veranice, Heloisa,
Ruggero, Adriano, Renato, Pricila e João por tantos momentos juntos e por
tantos auxílios recebidos.
Agradeço a todos do Laboratório de Imunologia do Prof. Dr. Mario
Mariano – UNIFESP-EPM, Ana Flavia, Helena, Maria Fernanda, Ricardo, Mauro,
Maiko, Felipe, Ronni e Gennaro por todo apoio e ensinamentos a mim
proporcionados.
Agradeço especialmente a Fabiana Aliperti pela atenção e grande
amizade.
Agradeço aos funcionários da disciplina de imunologia e do departamento
de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia.
Agradeço ao Fernando, Viviane, Rodrigo, Roger e todos meus familiares
que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
7
RESUMO
AZEVEDO, M.C. Avaliação da participação das células B-1 no crescimento do
carcinoma de Ehlich (Evaluation of the participation of B-1 cells in the growth of
Ehrlich´s carcinoma). Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária, área de
concentração Imunopatologia Veterinária) – Instituto de Ciências e Saúde,
Universidade Paulista 2007.
O tumor de Ehrlich é uma neoplasia trasplantável de camundongos que
se desenvolve com duas variáveis de comportamento: a forma ascítica quando a
inoculação de suas células é feita na cavidade peritoneal e a forma sólida
quando a inoculação é feita no tecido subcutâneo. Células B-1, um subtipo
proveniente da linhagem de células B, expressam marcadores de superfície
Mac-1, IgM, IgD e B220, e são encontradas predominantemente no peritônio e
na cavidade pleural. Já foi demonstrado que células de melanoma são capazes
de interagir com células B-1, através de uma molécula de adesão MUC18
tornando o tumor mais invasivo e metastático. Neste trabalho procuramos avaliar
a participação das células B-1 no crescimento e imunidade do carcinoma de
Ehrlich. Utilizando três grupos de camundongos avaliamos o crescimento do
tumor em animais controle, previamente irradiados e reconstituídos com células
peritoniais totais, e não observamos diferença significante entre os grupos, o que
nos sugere que as células B-1 não participam na evolução deste tipo de
neoplasia. Como demonstrado no melanoma, as células B-1 aderem firmemente
às células do melanoma in vitro. Em contrapartida nossos resultados
demonstraram que as células B-1 e as células do carcinoma de Ehrlich não se
aderem in vitro. A citometria de fluxo demonstrou que as células do tumor de
Ehrlich não expressam MUC18 na sua superfície como foi observado nas células
de melanoma. Esses dados demonstram que o efeito promotor que as células B-
1 causam ao crescimento do melanoma não é um fenômeno que possa ser
generalizado.
8
ABSTRACT
AZEVEDO, M.C. Evaluation of the participation of B-1 cells in the growth of
Ehrlich´s carcinoma.
Ehrlich´s carcinoma is a transplantable murine tumor with two forms of growth:
the ascitic form that occurs when the cells are inoculated in the peritoneal cavity
of the animals and the solid form, when the cells are inoculated in subcutaneous
tissue. B-1 cell is a subtype of B cell which expresses surface markers such as
Mac-1, IgM, IgD and B220 and can be found predominantly in peritoneum and
pleural cavity. It was previously demonstrated that the interaction of melanoma
cells with B-1 cells through the adhesion molecule MUC18 turn melanoma cells
more aggressive and metastatic. In this work we evaluate the possible
participation of B-1 cells in the growth and immunity of Ehrlich´s carcinoma. We
evaluated the tumor growth in its solid form in control, irradiated and
reconstituted animals. Reconstitution was made with adoptive transfer of B-1
cells to the peritoneal cavity of irradiated mice. No differences in the evolution
and growth of the tumor was detected with treatments thus indicating that B-1
cells do not participate in the evolution of this type of neoplasia as it does with
melanoma cells. As shown before, B-1 cells firmly adhere to melanoma cells in
vitro. Conversely, results demonstrate that B-1 cells and Ehrlich carcinoma cells
do not adhere to each other in vitro. Flow citometric demonstrated that Ehrlich
cells do not express MUC18 on there surface as observed with melanoma cells.
These data demonstrate that the promoter effect of B-1 cells on melanoma
growth is not a general phenomenon.
9
Lista de abreviaturas
AgNORs- Técnica histoquímica de impregnação pela prata
AOE- Enzimas antioxidantes
B220- Marcador de superfície
BCR- Receptor de células B
ºC- Graus Celsius
CAMs- Moléculas de adesão celular
CD- Molécula acessória
cGy- Centigray
FACS- Citômetro de fluxo
FITC- Anticorpo secundário conjugado a fluoresceína
g- Gramas
Gy- Gray
huMUC18- Molécula de adesão celular humana
ICAM- Molécula de adesão celular não dependente de
cálcio
Ig- Imunoglobulina
L-CAM- Molécula de adesão celular dependente de cálcio
LPS- Lipopolissacarídeo
MAC-1- Complexo de ataque a membrana
mL- Mililitros
mm³- Milímetros cúbicos
mm²- Milímetros quadrados
mM- Milimolar
muMUC18- Molécula de adesão celular murina
MUC18- Molécula de adesão celular mucina
NK- Natural killer ou matadora natural
Nu/nu- Camundongos desnudos
N-CAM- Molécula de adesão celular não dependente de
cálcio
PBS- Tampão fosfato salina
PCNA- Antígeno nuclear de proliferação celular
PE- Ficoeritrina
RNAhuMUC18- Expressão de RNA de molécula de adesão humana
RNAmuMUC18- Expressão de RNA de molécula de adesão murina
rpm- Rotações por minuto
SFB- Soro fetal bovino
VCAM- Molécula de adesão celular
VEGF- Fator de crescimento vascular endotelial
µL- Microlitros
µg- Microgramas
Δ- Delta
10
Listas de figuras
Figura 1- Padronização da curva de crescimento do tumor de Ehrlich.
Análise do Δ da espessura da pata em mm, durante sete dias, dos animais
inoculados com volume de 0,05 mL contendo 5X10⁶ células do tumor de Ehrlich
no coxim plantar do membro posterior direito......................................................22
Figura 2- Massa tumoral no coxim plantar com 7 dias de evolução. Massa
tumoral firme de superfície lisa, formato irregular e consistência fibrosa............23
Figura 3: Irradiação: os animais foram dispostos com a parte anterior,
posterior e os membros protegidos da irradiação por placa de chumbo....24
Figura 4- Analise do Δ da espessura da pata em mm, durante 7 dias, de
animais inoculados com 5X10⁶ células do tumor de Ehrlich, no volume de
0,05 mL no coxim plantar do membro posterior direito. Animais divididos em
grupo controle; grupo de animais previamente irradiados e grupo de animais
irradiados e reconstituídos com células peritoniais totais....................................24
Figura 5- Analise do Δ da espessura da pata em mm, durante 7 dias, de
animais inoculados com 2,5X10⁶ células do tumor de Ehrlich, no volume de
0,05 mL no coxim plantar do membro posterior direito. Animais divididos em
grupo controle; grupo de animais previamente irradiados e grupo de animais
irradiados e reconstituídos com células peritoniais totais....................................25
Figura 6- Cultura de células do tumor de Ehrlich (10⁵ células) (RPMI 10%
SFB). Aumento 20X.............................................................................................26
Figura 7- Cultura de células B-1(5X10⁵ células) (RPMI 10% SFB). Aumento
20X.......................................................................................................................27
.
Figura 8- Cultura de células de melanoma (10⁵ células) (RPMI 10% SFB).
Aumento 10X.......................................................................................................27
Figura 9- Co-cultura de células de melanoma e células B-1. Foram
utilizadas 5x10⁵ células B-1 e 10⁵ células de melanoma. (RPMI 10% SFB).
Células B-1 ficam próximas as células de melanoma formando grumos. Aumento
10X.......................................................................................................................28
Figura 10- Co-cultura de células do tumor de Ehrlich e células B-1. Foram
utilizadas 5X10⁵ células B-1 e 10⁵ células do tumor de Ehrlich.
(RPMI 10%
SFB). Células dispostas ao acaso. Aumento 20X...............................................29
11
Figura 11- Expressão de MUC18 em células de melanoma. Análise em
citômetro de fluxo comprovando maior expressão de MUC18 na superfície de
melanoma previamente exposto a linfócitos B-1. (a) melanoma; (b) melanoma
cultivado com B-1; (c) sobreposição dos gráficos................................................30
Figura 12- Expressão da Muc18 em células do tumor de Ehrlich. Analise
com citômetro de fluxo não foi observada a expressão significante de MUC18 na
superfície das células do tumor de Ehrlich previamente expostos a linfócitos B-
1...........................................................................................................................30
12
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................14
2. REVISÂO BIBLIOGRAFICA............................................................................16
2.1 Neoplasias.................................................................................................16
2.2 Tumor de Ehrlich .......................................................................................17
2.3 Imunidade Tumoral ...................................................................................18
2.4 Células B...................................................................................................22
2.5 Subpopulações de células B .....................................................................23
2.6 Moléculas de adesão celular MUC18........................................................25
3. OBJETIVO ......................................................................................................26
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................27
4.1 Animais......................................................................................................27
4.2 Irradiação dos animais ..............................................................................27
4.3 Reconstituição dos animais.......................................................................28
4.4 Modelos experimentais..............................................................................28
4.4.1 Tumor de ehrlich.................................................................................28
4.4.2 Obtenção da forma sólida e ascítica do tumor....................................28
4.4.3 Contagem de células do fluido ascítico...............................................29
4.5 Delineamento experimental.......................................................................30
4.5.1 Padronização da curva de crescimento da forma sólida do tumor de
Ehrlich em camundongos ............................................................................30
4.5.2 Índice de crescimento do tumor de Ehrlich, na sua forma sólida, em
camundongos irradiados e camundongos irradiados e reconstituídos. .......30
4.6 Cultura de células do tumor de Ehrlich......................................................31
4.8 Cultura de células B1 ................................................................................31
4.9 Cultura de células de melanoma ...............................................................31
4.10 Citometria de fluxo para analise de expressão de MUC18 na superfície de
células do Tumor de Ehrlich............................................................................32
4.11 Analise dos resultados ............................................................................32
5. RESULTADOS................................................................................................33
5.1 Padronização da curva de crescimento da forma sólida do tumor de Ehrlich
em camundongos............................................................................................33
5.2 Animais reconstituídos com 5X10⁶ células................................................34
5.3 Animais reconstituídos com 2,5X10⁶ células.............................................36
5.4 Culturas de células....................................................................................37
5.5 Citometria de fluxo para analise de expressão de MUC18 na superfície de
células do Tumor de Ehrlich............................................................................40
Resultados comprovam mais uma vez a expressão da MUC18 em células do
melanoma não estando esta proteína presente de modo significativo na
superfície celular das células do tumor de Ehrlich..............................................41
6. DISCUSSÂO...................................................................................................42
14
1. INTRODUÇÃO
A visão científica atual apresenta grande diferença quando comparada
com aquela de algum tempo. Hoje um organismo vivo e seus sistemas já não
são observados individualmente. Pesquisas recentes demonstram a existência
de uma série de interações decisivas entre cada sistema encontrado no
organismo. O sistema imune, por exemplo, está intimamente ligado ao sistema
nervoso e ao endócrino e isso explica a nomenclatura utilizada mais
recentemente de sistema neuroimuno-endócrino. Nesse contexto, destaca-se o
processo inflamatório com os seus componentes humoral e celular, constituindo
um mecanismo de constante controle da homeostasia. A relação entre o
processo inflamatório e a atuação do sistema imunológico é hoje fato
estabelecido.
A palavra imune é originaria do latim, de “munis”, cargo, ofício, dever; que
se refere aquele que cumpre seu dever. Assim “in munis”, significa livre de
deveres ou encargos.
O termo imunidade refere-se a um conjunto de privilégios, vantagens,
isenções de ônus ou de encargos; sob o ponto de vista científico é um conjunto
de mecanismos que garante a homeostasia dos seres vivos.
Há muito tempo a célula tumoral tem sido interpretada como um agente
autônomo capaz de pelo crescimento expansivo, invadir os tecidos e se localizar
e multiplicar a distância, mimetizando um verdadeiro parasita. Ao realizar o
presente trabalho a indagação que desde logo se estabelece tem a ver com a
importância do processo inflamatório na interação entre o tumor e o hospedeiro
(GUERRA, 1983).
Recentemente, STAQUICINI et al. (2004), demonstraram que células B-1
facilitam o crescimento e difusão do melanoma B16 no camundongo Balb/c. E
também, que esse efeito se dá pelo contato célula B-1 X melanoma, mediado
pela molécula de adesão MUC18. Com o intuito de esclarecer se esse fenômeno
também ocorre em tumor de origem epitelial, no presente trabalho investigamos
15
a possível participação de células B-1 na evolução do tumor de Ehrlich no
camundongo.
16
2. REVISÂO BIBLIOGRAFICA
2.1 Neoplasias
“Neoplasma”, palavra de etiologia grega onde: neos significa novo e
plasma significa formação, é literalmente, crescimento novo anormal,
especificamente um crescimento tecidual novo, progressivo e incontrolável
(CHEVILLE, 1994)
Os primeiros estudos com o microscópio óptico revelaram a natureza das
neoplasias e indicaram que crescem independentemente. Em 1876 foi
estabelecida a transplantabilidade do tumor venéreo canino. No início do século
XX, suspensões teciduais de tumores mamários de camundongos foram
transplantadas para os mesmos por varias gerações (CHEVILLE, 1994).
Conhecia-se, ate o inicio do século XIX, que o câncer ocorria em seres
humanos, e se questionava, na época, se este processo era de natureza celular
ou infecciosa (DAGLI, 1989). Foi demonstrada então a composição celular das
neoplasias, um marco importante na evolução do conhecimento desses
processos, pois desde então se passou a estudá-los também sob o ponto de
vista histológico (DAGLI, 1989).
Evidencias da existência de neoplasias em animais surgiram quando um
veterinário francês publicou seus estudos sobre tumores em animais,
demonstrando serem estes constituídos por células semelhantes a dos
humanos. Tornou-se claro que tumores humanos e de animais mostram
semelhanças essenciais e, de maneira geral, comportam-se como crescimentos
de células que adquiriram o atributo de se multiplicarem indefinidamente,
originarias do próprio organismo. Esta constatação possibilitou o surgimento da
“Oncologia Comparada” um ramo da Oncologia que procura melhorar o
conhecimento das neoplasias que ocorrem em outros seres vivos (DAGLI,
1989).
17
Um grande avanço da cancerologia, entretanto, ocorreu após o
surgimento da Oncologia Experimental, um ramo da Oncologia Comparada, cuja
existência deu-se pela introdução dos chamados tumores transplantáveis ou
transmissíveis. Estes são tumores de animais, mantidos em laboratório pelo
transplante de células tumorais a hospedeiros susceptíveis. (DAGLI, 1989).
Com a surpreendente evolução da oncologia experimental nestas ultimas
décadas, foram descritos numerosos blastomas transplantáveis nas diferentes
espécies de animais de laboratório. (DAGLI, 1989).
Este fato, aliado ao progresso o conhecimento da imunologia, da
inflamação e de outras áreas envolvidas nos mecanismos de homeostase de
hospedeiros portadores de tumor, resultou em um arsenal de investigações
sobre a relação tumor versus hospedeiro (DAGLI, 1989).
2.2 Tumor de Ehrlich
Para realização do presente trabalho, utilizamos o tumor de Ehrlich,
descrito em 1906 (EHRLICH, 1906). Trata-se de uma neoplasia originaria de
carcinoma mamário de camundongos fêmeos, transplantada em animais desta
espécie inicialmente na forma sólida. O tumor de Ehrlich foi convertido para a
forma ascitica pela passagem seriada de fluido ascítico de animais inoculados
intraperitonealmente com células tumorais. A conversão para forma ascítica
trouxe grandes vantagens, como a possibilidade de padronização do número de
células inoculadas, a quantificação da regressão e do crescimento tumoral, bem
como o estudo da célula tumoral propriamente dita, entre outras (DAGLI, 1989).
Pode-se afirmar que o tumor de Ehrlich, por ser um dos primeiros tumores
transplantáveis conhecido, é o mais extensamente utilizado para
experimentação (GUERRA, 1983).
A vantagem da utilização de neoplasias transplantáveis, em comparação
às demais recai sobre o conhecimento prévio da quantidade e das
características iniciais das células tumorais a serem inoculadas e sobre o
18
desenvolvimento rápido da neoplasia, que restringe o tempo de estudo (SILVA et
al., 2006).
O tumor de Ehrlich se desenvolve com duas variáveis de comportamento,
de conformidade com o local do implante. Quando a inoculação de suas células
e feita na cavidade peritoneal, este cresce em suspensão, traduzindo-se na
forma ascítica do referido tumor. Contudo, quando a inoculação de células é feita
no tecido celular subcutâneo de qualquer localização do tegumento do animal,
este cresce sob a forma sólida. Por essa razão é que se justifica a denominação,
habitualmente usada, de forma sólida ou ascítica do tumor (GUERRA, 1983).
Ao exame macroscópico a forma ascítica, depois de aproximadamente
sete dias de implante na cavidade peritoneal, se caracteriza pela presença de
grande quantidade de fluido discretamente viscoso e de aspecto leitoso. Por
outro lado, a forma sólida neste mesmo período de evolução, apresenta-se como
uma massa palpável, de consistência firme, coloração esbranquiçada, aspecto
homogêneo e brilhante, pouco aderente aos planos profundo e relativamente
móvel. A histologia típica do tumor se caracteriza por apresentar parênquima
indiferenciado e estroma delicado. As células tumorais são arredondadas, com
limites celulares distintos, citoplasma escasso, núcleo central redondo ou ovóide,
denso, com nucléolos proeminentes e pleomorfismo celular evidente. Mitoses
quase sempre presentes e com figuras aberrantes são observadas. O arranjo
destas células simula paliçadas, entretanto na maioria das vezes, estas se
distribuem caoticamente. Seu estroma é formado de fibras colágenas e
delicados capilares (GUERRA, 1983).
2.3 Imunidade Tumoral
Apesar das variações observadas em diferentes tipos de tumores, e das
teorias propostas para explicar os principais eventos determinantes de
malignidade, o microambiente tumoral tem sido alvo de intensa investigação por
mais de 100 anos. Dentre as células do hospedeiro capazes de interferir no
19
destino e proliferação de células malignas encontram-se as células do sistema
imune (STAQUICINI et al., 2004).
A possibilidade de que cânceres possam ser erradicados por respostas
imunes específicas foi o ímpeto de grande quantidade de trabalhos no campo da
imunologia tumoral. O conceito de vigilância imunológica, na década de 1950,
afirma que a função fisiológica do sistema imune é reconhecer e destruir os
clones de células transformadas antes que eles se transformem em tumores. O
sistema imune de fato reage contra tumores, e o aproveitamento dessas reações
para destruir tumores de forma específica continua sendo um importante objetivo
para imunologistas (ABBAS & LICHTMAN, 2005).
Embora a diferença essencial entre uma célula normal e uma célula
tumoral seja a perda do controle da divisão celular, as células tumorais também
podem demonstrar outras anormalidades. Por exemplo, as proteínas na
superfície de uma célula tumoral podem ser reconhecidas pelas células do
sistema imune ativando-o. Algumas células tumorais podem perder as proteínas
superficiais, perda essa reconhecida pelo sistema imune (TIZARD, 2002).
A imunidade tumoral é resultado da interação entre as células do sistema
imune e as células do tumor. Contudo, a regressão espontânea de neoplasias
malignas é rara. A presença de infiltrado linfóide próximo ao tumor indica um
mecanismo de reação imunológica que pode interferir no desenvolvimento e
crescimento do tumor (MISDORP et al., 2002),
Células tumorais podem ser reconhecidas pela expressão de antígenos
tumorais únicos específicos. Esses antígenos se originam de mutação nos
genes dessas células. Células tumorais também podem carregar antígenos que
estão presentes em outras células do corpo (antígenos oncofetais, por exemplo)
(MISDORP et al., 2002).
Sob este aspecto foi que MAHONEY & LEIGHTON (1962),
revolucionaram a área de estudo da oncologia experimental, demonstrando que
o tecido neoplásico inflamava-se muito menos pronunciadamente que tecidos
normais. Estes autores conseguiram, muito engenhosamente, evidenciar pela
passagem de um fio de algodão pela massa tumoral, in vivo, que o tecido
20
neoplásico, ao ser comparado com o processo inflamatório, provocado no
subcutâneo do mesmo animal, utilizando-se a mesma metodologia, era
significantemente menos intenso. Pode-se afirmar que foi a partir do trabalho
desses autores, que se iniciou uma nova linha de pesquisa na oncologia
experimental, qual seja, a das relações entre tumor, resposta inflamatória e
mecanismos imunológicos de controle do crescimento neoplásico (GUERRA,
1983).
Quando o transplante de órgãos se tornou um procedimento comum e
disseminado, como resultado do desenvolvimento de agentes
imunossupressores potentes, observou-se que os pacientes com sobrevivência
de transplante prolongada eram muitas vezes mais predispostos a desenvolver
câncer quando comparado com indivíduos não imunossuprimidos. Também se
observou que os pacientes com síndromes de imunodeficiência congênita ou
adquirida demonstram aumento da tendência de desenvolvimento de tumores
malignos. Dessa maneira, também foi sugerido que o sistema imune seja
responsável pela prevenção do câncer. Foi dessa sugestão que se desenvolveu
o conceito de função fiscalizadora do sistema imunomediado por células
(TIZARD, 2002).
A visão de que o sistema de células T identificaria e destruiria as células
tumorais não é mais completamente sustentável. Uma das peças de evidência
mais importante para desacreditar essa teoria é a observação de que os
camundongos desnudos (nu/nu), embora deficientes de células T, não são mais
susceptíveis que os camundongos normais aos tumores quimicamente induzidos
ou espontâneos.
A resistência natural dos camundongos desnudos e de todos os animais
normais aos tumores depende provavelmente das células NK (natural killer ou
exterminadoras naturais). Camundongos deficientes de células NK
(camundongos bege) têm aumento da susceptibilidade aos tumores
espontâneos (TIZARD, 2002).
Estudos histopatológicos mostram que tumores são circundados por
infiltrados de células mononucleares compostos de linfócitos T, células NK e
21
macrófagos, e que linfócitos e macrófagos ativados encontram-se presentes nos
linfonodos, drenando os sítios de crescimento tumoral. A presença de infiltrados
linfocíticos em alguns tipos de melanomas e cânceres de mama indica melhor
prognóstico (ABBAS & LICHTMAN, 2005; TIZARD, 2002).
A Resposta imune freqüentemente falha na prevenção do crescimento de
tumores. São diversos os mecanismos pelos quais a imunidade antitumoral não
é eficiente no sentido de erradicar as células transformadas. Primeiro, as células
tumorais derivam de células do hospedeiro e, portanto, se parecem com as
células normais em muitos aspectos. Em outras palavras, a maioria dos tumores
expressa apenas alguns antígenos que podem ser reconhecidos como não-
próprios, e assim a maior parte dos tumores tendem a ser fracamente
imunogênica. Tumores que provocam respostas imunes fortes incluem aqueles
induzidos por vírus oncogênicos, nos quais as proteínas virais são antígenos
estranhos. Muitos tumores espontâneos provocam imunidade fraca ou mesmo
não detectável, e estudos desses tumores levaram a um considerável ceticismo
quanto ao conceito de vigilância imunológica. De fato, como afirmamos
anteriormente, a importância da vigilância imunológica e da imunidade tumoral
provavelmente varia conforme o tipo do tumor. Segundo, o rápido crescimento e
disseminação do tumor podem superar a capacidade do sistema imune de
erradicar as células tumorais. Terceiro muitos tumores têm mecanismos
especializados para evadir as respostas imunes do hospedeiro (ABBAS &
LICHTMAN, 2005).
Existem dois meios de seleção por meio dos quais as células tumorais
podem escapar da resposta imune do hospedeiro e assim potencializar sua
própria sobrevivência. Um consiste em inibir a resposta imune até que tenha
atingido um tamanho que não possa ser controlado pelo hospedeiro.
Conseqüentemente, nos tumores experimentais, um pequeno número de células
tumorais pode crescer após a inoculação subcutânea, enquanto um grande
número delas não pode fazê-lo. Pode ocorrer que as células tumorais não
alcancem os linfonodos e disparem uma resposta imune ate que a carga tumoral
seja demasiadamente grande para ser controlada. Até um tumor muito pequeno
22
pode conter um elevado número de células. Por exemplo, um tumor de 10 mm
contém cerca de 10⁹ células. No outro, as células tumorais antigenicamente
diferentes do hospedeiro induzirão uma forte resposta imune e serão eliminadas
sem induzir uma doença. Essas células devem, portanto, serem selecionadas
quanto a sua falta de antigenicidade e sua incapacidade de estimular o sistema
imune do hospedeiro (TIZARD, 2002).
2.4 Células B
As células B são encontradas no córtex dos linfonodos, na zona marginal
do baço, na medula óssea e nas placas de Peyer. Só um pequeno número delas
circula no sangue. Semelhantemente às células T, cada célula B possui um
grande numero de receptores antigênicos idênticos. Cada célula B pode, dessa
maneira, somente se ligar e responder a um antígeno simples (TIZARD, 2002).
Quando um antígeno entra no corpo, ele poderá estimular uma célula B
por meio de receptores específicos. O termo clonótipo é utilizado para descrever
um clone de células B com um BCR (receptor de célula B) capaz de reconhecer
a um único epitopo. Em animais recém nascidos, ocorre um número
razoavelmente pequeno de diferentes clonótipos, que aumenta à medida que o
animal envelhece. Essas modificações ocorrem como resultado do aumento do
uso de grupos alternativos de genes V e de mutações somáticas nesses genes.
Em um animal adulto, o numero de células B dentro de um dado clonótipo varia
como resultado da exposição a antígenos diferentes por toda vida do animal. À
medida que o animal envelhece, no entanto, os clonótipos mais utilizados são
expandidos (TIZARD, 2002).
Células B desenvolvem-se de precursores presentes na medula óssea de
animais adultos a partir da ativação de rede de fatores de transcrição específicos
para linfócitos. A principal característica imunofisiológica dessas células é a
produção de anticorpos dirigidos a antígenos específicos (POPI et al., 2005).
23
2.5 Subpopulações de células B
Em roedores, as células B são divididas em duas subpopulações: células
B-1 e células B-2. Células B-1 são ainda subdivididas em B-1a CD5+ e as
células B-1b CD5
-.
O CD5 é um receptor cujo ligante é o CD72. Células B-1
também diferem das células B-2 convencionais por serem encontradas nas
cavidades peritoneal e pleural e apresentam potencial de auto-renovação. É
possível que as células B-1a sejam uma linhagem distinta das células B
originaria provavelmente de precursores do fígado fetal ou omento e pouco
provável da medula óssea (TIZARD, 2002).
Células B-1 foram classificadas como subtipo de linfócitos B por sua
capacidade de rearranjar o gene de imunoglobina e sintetizar IgM e IgD. Além
disso, células B-1 dividem algumas características fenotípicas e há hipóteses
sobre a relação da origem dessas células com progenitor de linfócitos B
convencionais (POPI et al., 2005).
Duas hipóteses são consideradas para explicar a ontogenia das células
B-1. HAUGHTON et al. (1993), consideram que a célula pró B, em fase antes do
rearranjo gênico para porção variável de imunoglobulinas, possa originar os três
subtipos de células B. Dessa forma, a ativação de células B por antígenos T
independentes como α(1-3) dextran, LPS e fosforilcolina poderiam induzir à
diferenciação dessas células para o subtipo B-1. Por outro lado, HERZENBERG
& KANTOR (1993), defendem a idéia que as diferentes linhagens de célula B, B-
1 e B convencional são descendentes de precursores distintos, ativos em
diferentes fases de desenvolvimento do sistema imune (POPI et al., 2005).
Células B-1 são proeminentes na cavidade peritoneal, mas raras no baço
e linfonodos e camundongos adultos. Durante a vida adulta, os progenitores da
célula B-1a na medula óssea são raros ou não funcionais, não sendo capazes
de reconstituir esta população em animais irradiados. Em contraste, existem
precursores inativos de células B-1b na medula óssea adulta de camundongos
normais. Estes precursores são capazes de promover a reconstituição em
animais irradiados ou sob condições onde a regulação por feedback esta
24
suspensa como, por exemplo, em animais com população de B-1b depletada
pelo tratamento com anticorpo anti-IgM (POPI et al., 2005).
Além disso, células B-1 apresentam características peculiares em sua
morfologia ultraestrutural que permitem distingui-los dos demais. O núcleo das
células B-1 apresenta irregularidades na distribuição de heterocromatina.
Usualmente são observadas lâminas de cromatina unindo os lóbulos do núcleo,
que é entremeado por citoplasma (ABRAHÃO et al., 2003).
Apesar das considerações feitas sobre a célula B-1 como outro tipo de
linfócito e ainda, as especulações quanto a sua origem relacionada à célula B
convencional, é válido ressaltar que as células B-1 possuem características
semelhantes a macrófagos. Além de marcadores de superfície para linfócito B
(IgM, IgD, B220), células B-1 também expressam marcadores para macrófago
(Mac-1) e linfócito T(CD5), no caso das células B-1a (POPI et al., 2005). Ainda
ALMEIDA et al.(2001), demonstraram que as células B-1 se transformam em
fagócitos mononucleares indistinguíveis morfologicamente de macrófagos
derivados de monócitos (ALMEIDA et al., 2001).
STAQUICINI et al. (2004), demonstraram que Linfócitos B-1 exercem
influência positiva no crescimento primário e na produção de metástases de
melanoma murino. Mostraram ainda que o contato in vitro de células B-1 com
células de baixa malignidade induzem transformação maligna nessas últimas.
Evidências da participação de linfócitos B-1 no crescimento e progressão
do melanoma murino experimental foram obtidas quando animais submetidos à
irradiação seletiva (cavidades peritoneal e pleural) e, portanto depletados de
linfócitos B-1, foi capaz de retardar o crescimento de tumores primários e
diminuir a incidência de metástases pulmonares após injeção intravenosa de
células de melanoma. Por sua vez a reposição da população de linfócitos B-1
em animais irradiados promoveu aumento no número de metástases
experimentais de células de melanoma (STAQUICINI et al., 2004).
Almeida et al., (2001), demonstraram que a célula B-1 estão presentes no
sobrrenadante de culturas de células peritoneais aderentes de camundongo.
Demonstraram ainda que essas células são radiossensíveis e que a irradiação
25
dos animais (700 cGy) depleta as células B-1 da cavidade peritoneal de
camundongos A/Sn. Além disso, o recultivo dessas células induz a expressão de
características fenotípicas e fisiológicas de fagócitos mononucleares (ALMEIDA
et al., 2001, POPI et al., 2004).
A eliminação de linfócitos B-1 positivos para marcação com anticorpos
anti-Mac-1 e anti-B220 das cavidades peritoneal e pleural de camundongos foi
comprovada por citometria de fluxo nos períodos de 1 semana, 2 semanas, e 1
mês após irradiação. A reposição natural da população de células B-1 ocorre
após 1 mês da irradiação (STAQUICINI et al., 2004).
2.6 Moléculas de adesão celular MUC18
Moléculas de adesão celular (CAMs) incluindo membros de varias famílias
de genes, como as integrinas, selectinas, ligantes dependentes de cálcio (L-
CAM) e ligantes não dependentes de cálcio (N-CAM), a MUC18, ICAM e VCAM
fazem parte da superfamília das N-CAM. As CAMs têm um papel importante na
formação de órgãos durante a embriogênese, manutenção da arquitetura
tecidual, resposta inflamatória imune e na cicatrização dos tecidos. Além disso, a
expressão aberrante de diferentes CAMs pode ter um papel central no
desenvolvimento tumoral e no estabelecimento de metástases em neoplasias
(YANG et al.,2001).
A MUC18 possui um papel relevante na patogenia da progressão do
melanoma. Foi demonstrado que os níveis de expressão de RNA de molécula de
adesão murina muMUC18mRNA são diretamente proporcionais a sua habilidade
de estabelecer metástases nos pulmões de camundongos. Nesse trabalho foi
avaliado também a muMUC18 comparada a huMUC18 (molécula primeiramente
identificada nas células de melanoma humano) e como resultado obteve-se que
provavelmente a maioria das funções biológicas da muMUC18 são similares a
huMUC18 (YANG et al., 2001).
26
3. OBJETIVO
Sabendo-se da importância da interação do processo inflamatório com o
processo tumoral e da observação do papel das células B-1 em determinadas
neoplasias resultou a indagação que se constitui no tema principal do presente
trabalho cujo objetivo é avaliar a possível participação das células B-1 no
crescimento do carcinoma de Ehrlich.
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Para realização do presente estudo foram utilizados camundongos
fêmeos da linhagem Balb/c, pesando de 15g a 20g, fornecidos pelo Biotério do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo e CEDEME – Universidade Federal de São Paulo
(Centro de desenvolvimento de modelos experimentais).
Durante a fase experimental, os animais foram mantidos no biotério do
Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da UNIFESP,
recebendo ração balanceada e água ad libitum.
4.2 Irradiação dos animais
Inicialmente os animais foram anestesiados com a Ketamina (Dopalen®) e
Xilasina (Xilasin®) nas doses de 0,15 mL e 0,3 mL respectivamente e acrescidas
de 0,55 mL de água destilada. Cada animal recebeu a dose de 0,06 mL
utilizando seringa de 1 mL e agulha descartável de 0,40X10.
Para a irradiação foi utilizado (700 cGy). de acordo com a técnica
proposta por Novaes e Brito et al. (2007), os animais foram dispostos com a
parte anterior, posterior e os membros protegidos da irradiação por placa de
chumbo. O equipamento utilizado foi GAMMACELL® 3000 ELAN NORDION
International inc.
STAQUICINI et al., (2004) utilizou a irradiação dos animais para avaliar a
participação das células B-1 no crescimento e potencial metastático do
melanoma murino. Nesse caso a eliminação destas células foi confirmada por
citometria de fluxo (FACScallibur/Becton-Dickinson) após dupla marcação com
anticorpos anti-CD45/B220 conjugado a ficoeritrina(PE) e anti-CD11 (Mac-
1)conjugado a fluoresceína (FICTC)(Pharmingen)
28
4.3 Reconstituição dos animais
Após serem irradiados, no da seguinte, grupos de camundongos foram
reconstituídos com células peritoniais totais. Para a reconstituição dos animais
foi realizada lavagem peritoneal de seis animais utilizando 10 mL de PBS e
seringas e agulhas descartáveis de 10 mL e 25/7 mm respectivamente. O
conteúdo retirado foi colocado em tubos de centrífuga de 15 mL,
individualmente, e centrifugado durante 5 minutos a 1.200 rpm.
Depois deste procedimento o sobrenadante foi desprezado e o botão
celular ressuspenso em 500 µL de PBS e inoculado no peritônio de cada animal.
Foi utilizado um tubo contendo o lavado de células peritoneais totais para cada
animal reconstituído.
4.4 Modelos experimentais
4.4.1 Tumor de ehrlich
Foi utilizado o tumor de Ehrlich, neoplasia trasplantável originária de um
carcinoma mamário de camundongo fêmeo. Este se apresenta sob duas formas:
a ascítica, obtida por meio de inoculação de suspensão de células no peritônio, e
a forma sólida, mediante inoculação da mesma suspensão no subcutâneo ou por
via intramuscular em camundongos. (GUERRA, 1983).
O tumor foi cedido pelo Biotério do Departamento de Patologia da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo e
sua manutenção foi realizada no laboratório do Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia da UNIFESP, por meio de transplantes
intraperitoniais das células neoplásicas.
4.4.2 Obtenção da forma sólida e ascítica do tumor
Camundongos portadores do tumor na sua forma ascítica com oito dias
de evolução foram anestesiados com éter etílico e sacrificados por
29
deslocamento cervical. Após assepsia da parede abdominal com álcool, esta era
excisada com tesoura cirúrgica de ponta fina para introdução de seringa de
plástico de 3 mL com agulha de 25/7, a fim de se retirar o fluido ascítico. Este
fluido, contendo células tumorais, era colocado em tubos falcon de 15 mL e
mantido em gelo. As células eram diluídas com PBS e centrifugadas a 1000 rpm.
durante 5 minutos a 4ºC. Esta operação era repetida 3 vezes.
Para se obter o tumor na sua forma sólida, as células tumorais, nas
concentrações desejadas, eram inoculadas no tecido celular subcutâneo do
coxim plantar de um dos membros posteriores, em um volume de 0,05 mL. Esta
forma do tumor tornava-se macroscopicamente visível e palpável quatro dias
após o implante.
Para manutenção da forma ascítica do tumor, aproximadamente 10⁶
células tumorais, em volume de 0,2 mL eram inoculadas intraperitonealmente
em camundongos receptores, repetindo-se essa operação semanalmente.
4.4.3 Contagem de células do fluido ascítico
O fluído ascítico era diluído à 1:200 em Azul de Tripan. Para avaliação da
viabilidade celular. As células eram contadas na câmara de Neubauer e o
número de células/mL, obtido de acordo com a fórmula descrita abaixo.
N° de células da suspensão = nº células contadas X fator final
Sendo que: Fator final =
fator de profundidade X fator de diluição
Área contada
Onde:
Fator de profundidade = 10
Fator de diluição = 200
Área contada = 4mm²
mm³ para ml = X10³
Fator final = 5X10⁵
30
Foi padronizado um total de 2,5X10⁶ e 5X10⁶ células por mL de suspensão, com
no mínimo 90% de viabilidade.
4.5 Delineamento experimental
4.5.1 Padronização da curva de crescimento da forma sólida do
tumor de Ehrlich em camundongos
A curva de crescimento da forma sólida do tumor de Ehrlich foi feita de
acordo com o método estabelecido por GUERRA (1983).
Utilizou-se uma concentração de 5X10⁶ células em um volume de 0,05
mL inoculados no coxim plantar do membro posterior direito.
A espessura do coxim plantar de cada animal foi avaliada a cada 24 horas
durante 7 dias, utilizando paquímetro Eletronic Digital Vernier Caliper
UTUSTOOLS®.
4.5.2 Índice de crescimento do tumor de Ehrlich, na sua forma sólida,
em camundongos irradiados e camundongos irradiados e
reconstituídos.
Foi utilizado, o protocolo descrito anteriormente, para irradiação dos
animais com o propósito de avaliar a participação das células B-1 no
crescimento do carcinoma de Ehrlich.
Os animais foram divididos em três grupos, cada grupo contendo seis
animais, conforme descrito abaixo:
Grupo 1: controle
Grupo 2: animais irradiados
Grupo 3: animais irradiados e reconstituídos com células peritoneais totais
O experimento foi realizado duas vezes, utilizando-se uma concentração
da solução de células tumorais inoculadas de 5X10⁶ células, e de 2,5X10⁶
31
células, os animais foram avaliados a cada 24 horas por um período de sete
dias.
4.6 Cultura de células do tumor de Ehrlich
As células do tumor de Ehrlich (10⁵ células) foram cultivadas em meio RPMI-
1640 (Sigma), contendo 2mM de bicarbonato de sódio (Sigma), 40 µg/mL de
sulfato de gentamicina (Schering), suplementado com 10% de soro fetal bovino
(SFB) (Cultilab) (meio R-10) em estufa úmida a 37ºC e 5% de CO₂. Foram
utilizadas 10⁵ células em 1 mL.
4.7 Cultura de células B1
A cultura de células B-1 (5X10⁵ células) foi obtida a partir de lavagens
sucessivas da cavidade abdominal, utilizando-se aproximadamente 8 mL de
RPMI-1640 (Sigma). A suspensão celular foi incubada em garrafas de cultura de
10 mL, em estufa contendo 5% de CO₂ a 37 °C por 40 minutos para aderência
celular. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e as células aderentes
cultivadas em meio R-10 por 5 dias.
4.8 Cultura de células de melanoma
A linhagem de células de melanoma murino B16F10 (10⁵ células) foi
cultivada em meio R-10 em estufa úmida a 37 °C e 5% de CO₂. As alíquotas
foram mantidas em nitrogênio liquido.
32
4.9 Citometria de fluxo para analise de expressão de MUC18 na superfície
de células do Tumor de Ehrlich
A expressão do MUC18, glicoproteína de superfície celular altamente
expressa em células de melanoma metastático, foi investigada em célula do
tumor de Ehrlich. Foram utilizadas células de melanoma murino como controle
uma vez que já foi descrita a sua presença na superfície dessas células. Para
isso, 10⁵ células de melanoma purificadas e 10⁵ células do tumor de Ehlich
foram incubadas separadamente com anti-MUC18 (Santa Cruz) por uma hora no
gelo. As amostras foram lavadas 3X com PBS. Posteriormente, foram incubadas
com anticorpo secundário anti IgG de camundongo conjugado com fluoresceína
(FITC)(Molecular Probes) por 45 minutos no gelo. As amostras foram lavadas 3X
com PBS e a análise de dados foi feita em FACScalibur/Becton-Dickinson e
programa CELLQUEST.
4.10 Analise dos resultados
Para as curvas de crescimento do tumor inoculado no coxim plantar
murino, os valores absolutos das medidas de lesão podal de cada indivíduo
foram subtraídos da espessura basal respectiva. A este valor deu-se o nome de
delta (Δ). Foi efetuada, então, a média dos Δ, de maneira que cada ponto no
gráfico represente esta média e as barras, seu erro padrão correspondente.
Para a analise das medidas das patas aplicou-se a análise de variância
(ANOVA) de duas vias.
33
5. RESULTADOS
5.1 Padronização da curva de crescimento da forma sólida do tumor de
Ehrlich em camundongos
Grupo único com 10 animais foi inoculado com o volume de 0,05 mL onde
5X10⁶ células do tumor de Ehrlich (Figura 1).
0 2 4 6 8 10
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
controle
tempo / dias
Δ
espessura da pata / mm
Figura 1- Padronização da curva de crescimento do tumor de Ehrlich. Análise do Δ da
espessura da pata em mm, durante sete dias, dos animais inoculados com volume de 0,05 mL
contendo 5X10⁶ células do tumor de Ehrlich no coxim plantar do membro posterior direito.
O crescimento do tumor de Ehrlich assume uma forma característica da
neoplasia uma vez que repete resultados obtidos anteriormente. A lesão torna-
se macroscopicamente visível a partir do 4º dia após a inoculação e se
desenvolve progressivamente nos dias subseqüentes. (Figura 2).
34
Figura 2- Massa tumoral no coxim plantar com 7 dias de evolução. Massa tumoral firme de
superfície lisa, formato irregular e consistência fibrosa.
5.2 Animais reconstituídos com 5X10⁶ células.
Os animais foram divididos em três grupos cada grupo contendo seis
animais.
Grupo 1: Grupo controle, animais inoculados no coxim plantar do membro
posterior direito, com volume de 0,05 mL de suspensão contendo 5X10⁶ células
do tumor de Ehrlich.
Grupo 2: Animais irradiados, os animais foram previamente irradiados,
conforme descrito anteriormente, e depois inoculado com o mesmo volume e a
mesma quantidade de células do tumor de Ehrlich do grupo controle (Figura 3).
Grupo 3: Animais reconstituídos, animais previamente irradiados como o
grupo anterior, e após a irradiação foram reconstituídos com células peritoniais
totais, sendo inoculados com o mesmo volume e a mesma quantidade de células
do tumor de Ehrlich do grupo controle.
35
Figura 3: Irradiação: Os animais foram dispostos com a parte anterior, posterior e os
membros protegidos da irradiação por placa de chumbo.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
controle
irradiado
reconstituído
tempo / dias
Δ
espessura da pata / mm
Figura 4- Analise do Δ da espessura da pata em mm, durante 7 dias, de animais
inoculados com 5X10⁶ células do tumor de Ehrlich, no volume de 0,05 mL no coxim plantar
do membro posterior direito. Animais divididos em grupo controle, grupo de animais previamente
irradiados e grupo de animais irradiados e reconstituídos com células peritoneais totais.
Conforme os resultados obtidos, o procedimento de irradiação realizado
nos animais não alterou significativamente o crescimento do carcinoma de
36
Ehrlich, uma vez que o Δ da curva de crescimento manteve-se sem diferenças
significativas em relação à obtida no grupo controle (Figura 4).
5.3 Animais reconstituídos com 2,5X10⁶ células.
Os animais foram divididos em três grupos cada grupo contendo seis
animais conforme descrito no item 5.2.1.
Neste experimento utilizando a concentração de 2,5X10⁶ para verificar se
a diminuição da concentração de células altera o Δ de crescimento do tumor de
Ehrlich.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
1
2
3
controle
irradiado
reconstituído
tempo / dias
Δ
espessura da pata / mm
Figura 5- Analise do Δ da espessura da pata em mm, durante 7 dias, de animais
inoculados com 2,5X10⁶ células do tumor de Ehrlich, no volume de 0,05 mL no coxim plantar
do membro posterior direito. Animais divididos em grupo controle, grupo de animais previamente
irradiados e grupo de animais irradiados e reconstituídos com células peritoneais totais.
Os resultados apresentados não demonstram diferenças entre os grupos
(Figura 5).
37
5.4 Culturas de células
As culturas de células foram realizadas como descrito nos itens: 4.6, 4.7 e
4.8, para avaliar a interação das mesmas quanto colocadas em co-cultura. A
cultura de células do tumor de Ehrlich (10⁵ células) foi mantida por 3 dias em
estufa a 37ºC com 5% de CO₂ em meio RPMI acrescido com 10% de soro fetal
bovino (SFB) (Figura 6). A cultura de células B-1 (5X10⁵ células) foi purificada
para aderência e mantida por 5 dias em estufa a 37ºC com 5% CO₂ em meio
RPMI acrescido com 10% SFB (Figura 7). A cultura de células de melanoma
(10⁵ células) B16F10 foi mantida por 3 dias em estufa a 37ºC com 5% de CO₂
em meio RPMI acrescido de 10% de SFB (Figura 8).
Figura 6- Cultura de Células do tumor de Ehrlich (10⁵ células) (RPMI 10% SFB). Aumento
20X.
38
Figura 7- Cultura de células B-1 após 5 dias (5X10⁵ células) (RPMI 10% SFB). Aumento 20X.
Figura 8- Cultura de células de melanoma (10⁵ células) (RPMI 10%SFB). Aumento 10X.
Foram realizadas co-culturas contendo, células B-1 e células do tumor de
Ehrlich ou células B-1 junto com células de melanoma B16F10. Uma vez que já
foi descrito que as células de melanoma interagem com as células B-1
(STAQUICINI et al., 2004), a finalidade desse experimento foi de avaliar a
interação das células B-1 com as células do tumor de Ehlich.
Desta forma 5X10⁵ células B-1 com 10⁵ células do tumor de Ehrlich, e
5X10⁵ células B-1 com 10⁵ células de melanoma em 1 mL de meio de cultura
39
foram cultivadas em placa de 24 poços durante 3 dias, sem troca de meio de
cultura. No caso das células de melanoma a interação física entre as células
pôde ser observada em microscópio óptico a partir de 48 horas de co-cultivo
(Figura 9). As células do tumor de Ehrlich em co-cultura com as células B-1
foram observadas no mesmo intervalo de tempo e não apresentaram qualquer
interação física (Figura 10).
Figura 9- Co-cultura de células de melanoma e células B-1. Foram utilizadas 5x10⁵ células
B-1 e 10⁵ células de melanoma. (RPMI 10% SFB). Células B-1 ficam próximas as células de
melanoma formando grumos. Aumento 10X.
40
Figura 10- Co-cultura de células do tumor de Ehrlich e células B-1. Foram utilizadas 5X10⁵
células B-1 e 10⁵ células do tumor de Ehrlich. (RPMI 10% SFB). Células dispostas ao acaso.
Aumento 20X
5.5 Citometria de fluxo para analise de expressão de MUC18 na superfície
de células do Tumor de Ehrlich
Considerando a interação entre as células de melanoma e as células B-1
e a demonstração da participação, da proteína de superfície celular, MUC18
como decisiva nessa interação a análise por citometria de fluxo dessas células
comprovaram a maior expressão de MUC18 nas células de melanoma após
contato com linfócitos B-1 (Figura 11). Realizamos a analise da presença da
mesma proteína nas células do tumor de Ehrlich para que pudéssemos excluir,
de fato, a interação das células B-1 com as células do tumor de Ehrlich pelo
mesmo mecanismo (Figura 12).
Foram utilizadas diferentes titulações para concentração das células do
tumor de Ehlich junto com o anticorpo conjugado com FITC, sendo as células de
melanoma utilizadas como controle.
41
(a) (b)
(c)
Figura 11- Expressão de MUC18 em células de melanoma. Análise em citômetro de fluxo
comprovando maior expressão de MUC18 na superfície de melanoma previamente exposto a
linfócitos B-1. (a) melanoma; (b) melanoma cultivado com B-1; (c) sobreposição dos gráficos.
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
M1
M1
M1
Figura 12- Expressão da Muc18 em células do tumor de Ehrlich. Analise com citômetro de
fluxo não foi observada a expressão significante de MUC18 na superfície das células do tumor
de Ehrlich previamente expostos a linfócitos B-1.
Resultados comprovam mais uma vez a expressão da MUC18 em células
do melanoma não estando esta proteína presente de modo significativo na
superfície celular das células do tumor de Ehrlich.
42
6. DISCUSSÂO
No que se referem à biologia do tumor de Ehrlich, os resultados mostram
que o crescimento do mesmo é contínuo, apresentando escape de crescimento
5 dias após o seu implante no tecido celular subcutâneo sendo esse crescimento
dependente da concentração celular (GUERRA, 1983).
Os experimentos realizados e os resultados descritos neste trabalho,
seguindo os protocolos anteriormente estabelecidos, foram compatíveis com os
resultados obtidos por GUERRA (1983) e DAGLI (1989). O tumor possui curva
de crescimento característica que se repete de maneira uniforme em todos os
experimentos aqui observados, podendo então ter seus resultados
padronizados.
Quando as cavidades peritoneal e pleural são irradiadas a porcentagem
de células B-1 diminui de aproximadamente 21% (células que se marcam para
IgM e Mac-1 caracterizando células B-1) para 2% sendo, em média, 12% dessas
células detectadas na cavidade peritoneal dos animais após 7 dias da irradiação
e reconstituição (BOGSAN et al., 2005).
A irradiação dos animais não alterou a dinâmica de crescimento do tumor.
Este experimento foi realizado com concentrações diferentes de células e os
resultados indicam que o procedimento de irradiação não altera de maneira
significativa o crescimento tumoral. A curva de crescimento tumoral dos animais
irradiados permanece praticamente igual à curva de crescimento tumoral dos
animais do grupo controle e dos animais do grupo que foi reconstituído.
A participação das células inflamatórias no crescimento tumoral, apesar
de muito significativa, não é totalmente compreendida. Diferentes tumores
possuem particularidades de crescimento e desenvolvimento, assim como sua
interação com células imunes do hospedeiro. Algumas neoplasias possuem
melhor prognóstico quando é observada infiltração de linfócitos ao redor e na
massa tumoral como ocorre por exemplo, em alguns cânceres de mama
(STAQUICINI et al., 2004).
A influência dos linfócitos B-1 no crescimento e potencial metastático do
melanoma foi demonstrado em camundongos irradiados ou Xid (geneticamente
43
depletados de linfócitos B maduros e com intensa redução no número de
linfócitos B-1). Os animais utilizados foram irradiados e reconstituídos com 10⁵
células de melanoma no coxim plantar de sua pata traseira esquerda com
volume de 0,3 mL. O crescimento da massa tumoral foi acompanhado a cada 24
horas. Nesses modelos, houve diminuição do crescimento primário do
melanoma e supressão na formação de nódulos metastáticos (STAQUICINI et
al., 2004).
A participação de outras células residentes no peritônio foi descartada
quando camundongos irradiados foram reconstituídos com células totais de
peritônio, depletados de linfócitos B-1. Nesse último caso, não foram observadas
diferenças entre grupo controle e experimental. Além disso, a reconstituição de
animais irradiados com linfócitos B-1 purificado em cultura restabeleceu o
número de metástases encontrado no grupo controle, comprovando
efetivamente que linfócitos B-1 facilitam a formação de metástases por células
de melanoma (STAQUICINI et al., 2004).
Também já foi descrito que linfócitos B-1, células normais do sistema
imune e residentes nas cavidades peritoneal e pleural, promovem aumento do
crescimento tumoral primário e do potencial metastático de células de melanoma
murino. Íntimo contato entre linfócitos B-1 e melanoma foi identificado,
mostrando-se suficiente para alterar a capacidade invasiva das células tumorais.
Os resultados descritos revelam importante e inesperado mecanismo regulatório
pelo qual linfócitos B-1, nesse caso incapazes de proteger o hospedeiro,
promovendo crescimento e progressão do melanoma (STAQUICINI et al., 2004).
Quando repetimos o mesmo protocolo experimental com diferentes
concentrações de células do tumor de Ehrlich o resultado foi diferente. As
células do tumor de Ehrlich não demonstraram nenhum tipo de interação com as
células imunes do hospedeiro uma vez que o experimento, mesmo após
repetições, não revelou diferenças significantes no Δ do crescimento, do coxim
plantar dos animais inoculados.
Confirmando as observações de STAQUICINI et al. (2004), foi
investigada a interação física entre melanoma e linfócitos B-1 em um sistema de
44
co-cultivo in vitro. A interação entre as células foi observada a partir de 48 horas
de co-cultura. Linfócitos B-1 são capazes de envolver as células de melanoma,
impedindo sua adesão e formando grumos em formato de roseta. Os grumos de
células podem ser recolhidos cuidadosamente sem que seja observada perda ou
diminuição da interação entre as células. Já foi descrito que o melanoma quando
inoculado em animais previamente irradiados apresenta um crescimento mais
lento e menos invasivo. A realização de uma co-cultura contendo células de
melanoma e células B-1 demonstrou que ocorre interação física entre as células.
Uma vez observada essa interação entre as células, utilizando a técnica do
citometro de fluxo, foi comprovada a presença da molécula de adesão MUC18,
diretamente envolvida com o aumento do potencial invasivo do melanoma.
O crescimento do tumor de Ehrlich por sua vez não foi alterado com o
procedimento de irradiação. Para que possamos descartar a hipótese de
interação entre as células do tumor de Ehrlich e as células B-1 estas também
foram colocadas em co-cultura e observadas.
Quando colocadas em co-cultura, as células do tumor de Ehrlich e as
células B-1, seguindo o mesmo protocolo realizado com as células de
melanoma, não demonstraram nenhum tipo de interação ou organização entre
si.
A glicoproteína MUC18 foi identificada como uma das moléculas
mediadoras do contato entre as células, sendo que sua maior expressão por
células de melanoma após contato com linfócitos B-1 explica, ao menos
parcialmente a capacidade invasiva dessas células (STAQUICINI et al.,2004).
Com o intuito de pesquisar a presença da proteína MUC18 nas células do
tumor de Ehrlich, estas foram submetidas a analise com FACS. As células foram
incubadas com anticorpo anti-MUC18. Resultados mostraram que a expressão
de MUC18 nas células do tumor de Ehrlich é pouco significativa.
O tumor de Ehrlich, ao contrário do que foi observado no melanoma, não
possui seu crescimento alterado com a irradiação prévia dos animais. As células
do tumor de Ehrlich quando em co-cultura com células B-1 não apresentam
nenhum tipo de interação, e por fim, a presença da proteína MUC18 nas células
45
do tumor de Ehrlich é baixa, demonstrando que a interação celular observada no
melanoma não se repete da mesma forma com as células do tumor de Ehrlich.
46
7. CONCLUSÂO
Nossos resultados permitem concluir que células B-1, contrariamente ao
observado no melanoma B16, não participam na evolução do tumor de Ehrlich
na sua forma sólida.
Esses dados, mais uma vez, confirmam a heterogeneidade bioquímica e
funcional da célula neoplásica.
47
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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