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GABRIELA GENNARO
AVALIAÇÃO DA NEOFORMAÇÃO ÓSSEA AO REDOR
DE IMPLANTES DE TITÂNIO INSTALADOS EM RATOS
DIABÉTICOS
FLORIANÓPOLIS
2007
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GABRIELA GENNARO
AVALIAÇÃO DA NEOFORMAÇÃO ÓSSEA AO REDOR
DE IMPLANTES DE TITÂNIO INSTALADOS EM RATOS
DIABÉTICOS
FLORIANÓPOLIS
2007
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia / Área de Concentração
em Implantodontia, Departamento de Estomatologia
do Centro de Ciências da Saúde, Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal de Santa
Catarina, para obtenção do Título de Mestre em
Implantodontia.
Orientador: Prof. Dr. Rubens Rodrigues Filho
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Hoje, sou mestre de mim mesmo.
Amo as pessoas sem que delas tenha que depender.
Reconheço seu valor sem ter que perder.
Aprendo de mim aquilo que preciso saber.
Dou a mim sem ter que pedir.
Experimento Deus em intensidade.
Vivo a condição da humanidade.
Canto de alegria,
choro de tristeza, mas sempre de verdade.
Não sou mais, nem melhor,
nem menos, nem pior.
Apenas vou onde sinto que devo ir,
faço o que sinto que devo fazer,
falo o que sinto que devo falar,
mas o que devo é somente sinceridade
perante mim mesmo.
Hoje, sou meu mestre porque sei o caminho.
Hoje sou mestre de mim mesmo
mas, também, sou mestre de mais ninguém.
DEDICATÓRIA
AOS MEUS PAIS,
Que na luta diária, de esforços infinitos, proporcionaram
as melhores condições para que eu me tornasse quem eu sou,
permitindo que todos os meus planos sempre se concretizassem. Que
mesmo longe, mas incondicionalmente, nunca deixaram de transmitir
força, com as palavras mais certas de coragem e amor, ainda que
fossem firmes na voz.
AO MEU IRMÃO,
Meu grande amigo Lucas, fiel, compreensivo, que tanto me
faz rir, mas que também escuta com toda paciência meus lamentos e,
no final, sempre tem uma sábia palavra a me dizer, devolvendo-me à
razão.
AGRADECIMENTOS
A Deus por dar-me a vida tão maravilhosa que tenho, com todas as
capacidades perfeitas, o que me permitem as realizações profissionais e
pessoais. Além da Sua proteção diária e das energias positivas que vibram,
trazendo-me forças e amor.
A todos da minha família que entenderam e souberam conviver com
a minha ausência durante o período de desenvolvimento deste trabalho.
Em especial, ao Prof. Dr. Rubens Rodrigues Filho, professor de
Farmacologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de
Santa Catarina, pela sua orientação, confiança em meu trabalho,
disponibilidade em me auxiliar arduamente na conclusão deste, com suas
críticas e sugestões que, ao final, resultaram em significantes melhorias.
Finalmente, agradeço por todo conhecimento, atenção, paciência e tempo
dedicados a mim, durante todo esse período de convivência.
Ao Prof. Dr. Ricardo Magini de Souza, coordenador do curso de
Mestrado em Implantodontia da Faculdade de Odontologia da
Universidade Federal de Santa Catarina, por ter me acolhido como aluna do
programa, pelos conhecimentos transmitidos e amizade.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Cardoso, coordenador do curso de
Doutorado em Implantodontia, pelos conhecimentos protéticos transmitidos
e por sua incansável dedicação.
À Prof
a
. Gláucia, professora de Periodontia da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina, pelos
conhecimentos transmitidos, e, muito além, pela amizade tão valiosa que
adquiri, assim, sou grata a toda sua hospitalidade, carinho, apoio,
compreensão e alegrias doadas.
À Prof
a
. Ariadne Cruz, professora substituta do departamento de
Periodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Santa
Catarina, pelos conhecimentos transmitidos como também pelo vínculo de
amizade que estabelecemos, sua generosidade, paciência e lealdade, sempre
disposta a ajudar.
Ao Prof. Dr. Adair dos Santos, professor de Fisiologia do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal de Santa Catarina, por ter
aberto as portas do seu laboratório para a viabilização deste trabalho, com
tanta gentileza.
A todos os pós-graduandos do laboratório de fisiologia que direta
ou indiretamente, auxiliaram-me neste trabalho.
Ao Prof. Dr. Gerson Francisco de Assis, professor de Histologia da
Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo, por
viabilizar a realização de todo o processamento histológico em seu
laboratório e pela sua orientação.
Em especial, à Tânia Mary Cestari, técnica do laboratório de
Histologia da Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São
Paulo, pela inspiração que passa por sua dedicação ao trabalho, pelas
sugestões e conhecimentos decisivos no conteúdo desta pesquisa, além do
seu imensurável auxílio na histologia e estatística, disponibilizando tanto
do seu tempo ao meu trabalho.
À Daniele Santi Ceolin, técnica do laboratório de Histologia da
Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo, pelo
conhecimento, presteza e paciência no auxílio ao processamento
histológico das amostras.
Aos meus amigos do mestrado: André Ricardo Buttendorf, Elisa
Oderich, Gisele Bustamante, Leonardo Bez e Rodrigo Granato, pela
amizade, dedicação, colaboração e pelos bons momentos compartilhados
que ficarão guardados no coração.
Aos amigos do doutorado: Aline Franco Siqueira, César Augusto
Benfatti, Cimara Fortes, Cleide Ribeiro, João Rodrigo Sarotti e Ricardo
Hochheim Neto, pela amizade conquistada, por toda colaboração, pelos
conselhos bem ditos e, também, pelos tantos bons momentos de alegrias
que deixarão saudades.
Aos estagiários Ernesto Barqueiro, Izabelle Goulart, Miriam
Carrard e Newton, pelo auxílio, dedicação e amizade prestados ao longo do
tempo.
Em especial, aos amigos Leonardo Bez, Ernesto Barqueiro e José
Ramon que me auxiliaram de maneira fundamental, com dedicação,
paciência e carinho, durante a fase experimental deste trabalho e, que sem
eles, seria impossível realizar essa etapa principal.
Em especial, às amigas Aline, Cleide, Cimara e Elisa que além de
companheiras dos bons momentos de alegria, balada, praia, foram também
firmes nos momentos difíceis, em que tudo parecia o fim, sem solução, e
com enorme paciência, diziam “calma Gabi, isso vai passar e ainda vamos
todas rir dessa situação”. Amigas, realmente tudo passa!
Em especial, aos amigos César, Ernesto, Leonardo e Rodrigo pela
lealdade e “parceria” nos momentos em que mais precisei. Além da
amizade, em muitas vezes, também fizeram o papel da minha família,
dando conselhos e cuidados como se fossem meus pais.
Em especial, à Patrícia Garcia, colega desde os tempos da faculdade
em Bauru, e que por razões do destino, viemos para a mesma cidade, em
situações tão semelhantes. E aqui, fomos amigas, irmãs, passando juntas
por tudo aquilo que nos fez felizes e mais “humanos como seres”.
Em especial, à Brunna Genaro Pultrin, mais que prima, uma irmã,
que me acolheu em Bauru durante todo o tempo que passei executando
etapas deste trabalho, sempre me incentivando, escutando-me e dizendo
palavras de amor emanadas desse coração tão lindo que possui.
Às funcionárias do CEPID: Dolores Rossi, Gisela Mengaz e Mirian,
responsáveis pelo perfeito funcionamento dessa instituição, pela
competência e atendimento a tantos pedidos de ajuda.
Às funcionárias do Centro Cirúrgico Odontológico: Janete (in
memoriam) e Nilséia Arruda, pela eficiência, dedicação e préstimos.
A Sra. Marilena e aos demais funcionários da limpeza, pelo
trabalho digno e de fundamental importância para a manutenção das boas
condições de higiene dos locais clínicos e de estudo.
Aos pacientes que contribuíram para a minha formação, pela
confiança creditada, paciência e carinho, durante a realização dos trabalhos,
e que, em alguns, extrapolou-se a relação profissional para estabelecer-se
um elo de amizade.
GENNARO, G. Avaliação da neoformação óssea ao redor de implantes de titânio
instalados em ratos diabéticos. 2007. 83 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia –
Área de Concentração Implantodontia) – Programa de Pós-graduação em Odontologia,
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
RESUMO
O diabetes é associado a várias complicações que aumenta a morbidade e
mortalidade em indivíduos afetados. Portanto, existem diversas alterações no
metabolismo ósseo associadas ao diabetes e, que consequentemente, podem afetar o
processo de osseointegração dos implantes dentários. Este estudo visou comparar a
formação óssea ao redor de implantes de superfície lisa e tratada, instalados em ratos
diabético-induzidos e não-diabéticos, investigando se há diferenças na formação óssea
entre os dois quadros metabólicos, melhora no padrão de osteogênese entre as diferentes
superfícies e, sua relação com o diabetes. Foram instalados implantes de titânio de
superfícies lisa e tratada, no fêmur de ratos machos Wistar e os animais divididos em 2
grupos: diabético-induzidos com estreptozotocina (grupo experimental) e não diabéticos
(grupo controle). As análises histomorfológica e histomorfométrica do bloco ósseo
foram realizadas nos períodos de 10 e 21 dias de cicatrização. Os resultados obtidos
foram analisados por meio de ANOVA de duas vias
, seguida pelo teste de
Bonferroni's. O percentual de neoformação óssea, ao redor dos implantes de superfície
lisa e tratada, não apresentou significância estatística comparando os grupos diabético e
controle. Entretanto, no período de 21 dias, nos ratos diabéticos o osso apresentou-se
mais imaturo em relação àquele de aspecto maduro formado nos animais controle.
Quando comparadas as diferentes superfícies (lisa e tratada), observou-se,
aparentemente, que aos 10 dias, a superfície lisa favoreceu a maior formação de osso
cortical e medular ao redor dos implantes Já aos 21 dias, não ocorreu diferença na
neoformação óssea entre as duas superfícies. Os dados presentes sugerem que o atraso
na maturação do tecido ósseo, se deu provavelmente, devido ao diabetes-induzido e suas
implicações no metabolismo ósseo. Além disso, os implantes de superfície lisa, também
na presença de diabetes, parecem ser melhores indutores de neoformação óssea.
Palavra-chave: implante dentário; diabetes mellitus experimental; osteogênese;
osseointegração.
GENNARO, G. Assessment of bone neoformation around titanium implants
inserted in diabetic rats. 2007. 83 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia – Área de
Concentração Implantodontia) – Programa de Pós-graduação em Odontologia,
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
ABSTRACT
Diabetes is associated with many complications that increase morbidity and
mortality in affected individuals. Therefore, there are many changes in bone metabolism
associated with diabetes that can consequently affect the process of osseointegration of
dental implants. This study aimed at comparing bone formation around implants with
smooth and treated surface, inserted in induced diabetic rats and in non-diabetic rats,
investigating whether there are differences in bone formation between both metabolic
conditions, improvement in osteogenesis pattern between different surfaces and their
relation with diabetes. Titanium implants (smooth and treated surface) were inserted in
male Wistar rats, which were divided into two groups: streptozotocin-induced diabetic
rats (experimental group) and non-diabetic rats (control group). Histomorphologic and
histomorphometric analyses of bone block were performed at 10 and 21 days of healing.
Results were analyzed by two-way ANOVA, followed by Bonferroni’s test.
The
percentage of bone neoformation around implants of smooth and treated surface did not
have statistical significance after comparison between diabetic and control groups.
However, at 21 days, the bone was more immature in diabetic rats in relation to that
with a mature aspect formed in control animals. When different surfaces were compared
(smooth and treated), at 10 days the smooth surface apparently favored better formation
of cortical and cancellous bone around the implants. On the other hand, at 21 days there
was no difference in bone neoformation between both surfaces. The present data
suggest that delay in bone tissue maturation was probably a result of induced diabetes
and its implications in bone metabolism. In addition, smooth surface implants, also in
association with diabetes, seem to be better inducers of bone neoformation.
Key Words: dental implant; diabetes mellitus experimental; osteogenisis ;
osseointegration.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA............................................. 14
2 METODOLOGIA..................................................................................................
2.1 ANIMAIS..............................................................................................................
2.2 INDUÇÃO DO DIABETES MELLITUS............................................................
2.3 IMPLANTES........................................................................................................
2.3.1 Superfície dos implantes..................................................................................
2.4 PROTOCOLO CIRÚRGICO...............................................................................
2.5 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO................................................................
2.5.1 Coloração Hematoxilina-Eosina.....................................................................
2.6 ANÁLISE QUALITATIVA.................................................................................
2.7 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA.................................................................
3 ARTIGO EM PORTUGUÊS................................................................................
RESUMO...................................................................................................................
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................
2 MATERIAIS E MÉTODO....................................................................................
3 RESULTADOS.......................................................................................................
4 DISCUSSÃO...........................................................................................................
5 CONCLUSÃO........................................................................................................
REFERÊNCIAS........................................................................................................
4 ARTIGO EM INGLÊS..........................................................................................
ABSTRACT...............................................................................................................
INTRODUCTION.....................................................................................................
MATERIALS AND METHOD................................................................................
RESULTS..................................................................................................................
DISCUSSION............................................................................................................
CONCLUSION..........................................................................................................
REFERENCES..........................................................................................................
REFERÊNCIAS GERAIS........................................................................................
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1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
A osseointegração é caracterizada como a formação de osso vital em
contato direto com a superfície de titânio sem a presença de qualquer outro
tecido interposto Branemark et al. (1969). Desde então, a longevidade e a
taxa de sucesso dos implantes endósseos de titânio vêm sendo discutidas e
mostram que a reabilitação do paciente ocorre tanto no âmbito funcional,
estético e fonético, como também no aspecto psico-social, facilitando seu
reenquadramento ao meio (Adell et al., 1981).
Imediatamente após a instalação do implante, uma série de eventos
ocorre entre o hospedeiro e a superfície dos implantes. Esta seqüência de
eventos inicia-se com a interação entre o coágulo e a superfície do
implante, em que fatores de crescimento e células são dinamicamente
recrutados. Posteriormente, há um processo inflamatório, com reabsorção
do coágulo e formação de um tecido altamente vascularizado, seguido da
diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, os quais secretam
a matriz osteóide, que será mineralizada e constituirá o tecido ósseo
primário. Finalmente, a osseointegração completa-se após a remodelação,
formando o tecido ósseo secundário (maduro) (Lemons, 2004).
Otha (1993), estudando o processo de cicatrização óssea ao redor de
implantes fixados em mandíbulas de macacos, sugeriu a seqüência de 4
estágios evolutivos 1) angiogênese; 2) osteogênese; 3) crescimento ósseo e
4) manutenção do tecido ósseo. A angiogênese, mais intensa nas
superfícies anguladas dos sulcos do implante, desenvolve-se do 3º ao 7º dia
após a instalação do mesmo. Os sulcos são preenchidos por uma camada de
fibras colágenas, fibroblastos e mesênquima indiferenciado. A osteogênese
inicial consiste na formação de tecido ósseo, esponjoso primário e
secundário, ao redor de uma rede capilar na superfície do implante. Há um
avanço do trabeculado ósseo em direção ao implante. A maturação do
15
tecido constitui-se da compactação óssea em pequenas áreas. Os sulcos são
completados e preenchidos por tecido ósseo. Estudos de microscopia
eletrônica evidenciam que a presença de fibras de colágeno mineralizadas,
material proteináceo, matriz fibrilar e osteoblastos, na interface osso-
implante, é indicativa de que essa região remodela-se (Albrektsson, 1985;
Listgarten et al., 1996).
Além da função de sustentação, o osso é o reservatório natural de
cálcio e fósforo. Muitos fatores de ação local ou sistêmica influenciam o
metabolismo ósseo. Entre os fatores sistêmicos encontram-se os hormônios
(glicocorticóides, hormônio do crescimento, hormônios tireoideanos e
paratireoideanos, insulina, estrógeno) e as vitaminas (C, D). Os fatores
locais são representados por prostaglandinas (PGs); interleucina-1(IL-1) e
fator de necrose tumoral (TNF) (Canalis et al., 1991).
O osso é considerado fonte abundante de fatores de crescimento que
ficam imersos em sua matriz e têm ação autócrina ou parácrina. Estes
fatores, produzidos por células da linhagem osteoblástica e por macrófagos,
são polipeptídeos que estimulam a síntese protéica, a migração e a
multiplicação celular. Os fatores de crescimento relacionados ao
metabolismo ósseo icluem: Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas
(PDGF), Fator Transformador do Crescimento (TGF A e B), Fator de
Crescimento Fibroblástico (FGF a e b), Fator de Crescimento semelhante à
Insulina (IGF I e II), Fator de Crescimento Epitelial (EGF) e Proteína
Óssea Morfogenética (BMP) (Canalis et al., 1991).
A insulina é o hormônio responsável, primariamente, pelo controle
da captação, utilização e armazenagem de nutrientes celulares, sendo
indispensável em processos anabólicos que incluem a utilização e
armazenagem de glicose, aminoácidos e gorduras (Davis & Granner,
1996). É um hormônio esteotrópico e, de forma similar ao que acontece nos
16
tecidos adiposo e muscular, a expressão de seu receptor depende do estágio
de diferenciação do osteoblasto (Hill et al., 1995).
O sistema IGF compreende os fatores de crescimento semelhantes à
insulina (IGF-I e II) e as proteínas de ligação desses fatores (IGFBPs). Os
IGFs atuam em receptores específicos e no receptor da insulina, têm alta
afinidade pelas IGFBPs e atuam nas células do tecido ósseo regulando sua
atividade em sinergismo com outros fatores de crescimento como o PDGF
e o FGF. As IGFBPs têm diferentes efeitos sobre os IGFs; algumas inibem
e outras potencializam seus efeitos metabólicos e mitogênicos (Cohick et
al., 1993). O IGF-I é considerado um dos principais responsáveis pela
manutenção da massa óssea (Canalis et al., 1991). A síntese de colágeno, in
vitro, é aumentada pela insulina e pelo IGF-I, o qual também reduz a
degradação de colágeno na matriz e, consequentemente, aumenta a área de
matriz depositada. Portanto, é indiscutível o papel regulador da insulina e
do sistema IGF na atividade celular do tecido ósseo (Cohick et al., 1993).
O Diabetes, classificado em tipo I e tipo II, é associado a uma ampla
amostra de complicações que aumenta a morbidade e mortalidade em
indivíduos afetados. Essas complicações resultam de uma regulação
anormal do metabolismo de glicose, devido à ausência ou redução da
produção de insulina (Oliver & Ternovem, 1994).
O diabetes tipo I, usualmente, resulta da destruição auto-imune da
insulina produzida pelas células β do pâncreas. Um ou mais marcadores de
destruição auto-imune estão geralmente presentes, como os anticorpos para
as células das ilhotas pancreáticas e para insulina. As células β do pâncreas
são destruídas quando indivíduos geneticamente predispostos são expostos
a eventos desencadeantes, como infecções virais, que induzem uma
resposta auto-imune. Há também as formas idiopáticas de diabetes tipo I
em que não há evidência de auto-imunidade. O início é geralmente abrupto,
17
o tratamento pode ser difícil e predispõe a cetoacidose se não for bem
controlada (Mealey & Moritz, 2003).
O diabetes tipo II pode resultar da resistência à insulina; de uma
relativa deficiência desta, entretanto, não de uma absoluta ausência de
produção do hormônio, como ocorre no tipo I; ou ainda, do aumento na
produção de glicose. O pâncreas ainda produz insulina, entretanto a
resistência tecidual ao hormônio diminui sua atividade e capacidade de
metabolizar a glicose em níveis celulares. A maioria dos pacientes são
obesos e isto, por si só, leva à resistência à insulina. O início da doença é
gradual, não sendo diagnosticada por um longo período, às vezes, durante
anos (Mealey, 2000).
Classicamente, a doença está associada a um grupo de complicações
micro e macrovasculares. As alterações na macrovascularização causam
aterosclerose agressiva que predispõe ao desenvolvimento precoce de
eventos cardiovasculares e cerebrovasculares. Os danos microvasculares
podem levar a complicações que resultam em retinopatias, nefropatias e
atraso na cicatrização de feridas (Lalla et al., 2000). A hiperglicemia resulta
em alterações no metabolismo de lipídeos e na glicozilação não-enzimática
de proteínas como o colágeno. Essas mudanças resultam em funções
alteradas de membranas celulares e mudanças nas interações célula-célula
ou matriz-célula. Isto pode levar a aumento na espessura dos vasos,
formação de ateromas e microtrombos em vasos grandes; na
microvasculatura pode ocorrer alterações funcionais em células endoteliais
e na permeabilidade vascular (Mealey; Moritz, 2003).
A glicozilação de proteínas e ácido nucléico nos diabéticos resulta
em acumulação de proteínas glicoziladas em pequenos e grandes vasos
sanguíneos, em órgãos como a retina, glomérulos e na região endoneural.
Essas proteínas glicoziladas são conhecidas como produtos finais da
glicozilação (AGEs) e se formam tanto nos diabéticos como nos indivíduos
18
não-diabéticos, entretanto, seu acúmulo é bem maior nos primeiros, com a
hiperglicemia sustentada. O resultado disso é o aumento da espessura da
membrana basal na retina e ao redor dos nervos, espessamento dos
glomérulos e acúmulo de colágeno nos vasos grandes. O efeito cumulativo
é um estreitamento progressivo do lúmen dos vasos e perfusão diminuída
nos órgãos afetados (Schmidt et al., 1996).
Um outro fator notável é que, no paciente diabético, a imunidade do
hospedeiro prejudicada, relacionada à resposta alterada às infecções, pode
ser explicada pela deficiência na quimiotaxia e fagocitose de neutrófilos, o
que leva a uma excessiva destruição tecidual por bactérias patogênicas.
Em adição, uma resposta inflamatória exacerbada por mediadores, como os
lipopolissacarídeos, contribui para um dano tecidual agressivo (Molvig et
al., 1988; Owen et al., 1998). Nesse contexto, demonstra-se que, em
diabéticos, uma resposta inflamatória aumentada, regulada por monócitos,
resulta em maior produção de TNF α, IL 1-β e PGE-2. Junto a esse fator, a
deficiência na produção de colágeno, bem como a atividade exacerbada da
colagenase, causa uma maior destruição periodontal e, consequentemente,
agrava a severidade das doenças periodontais (Ramamurthy & Golub,
1983; Sasaki, 1992).
Também, existem diversas alterações no metabolismo ósseo
associadas ao diabético. A insulina não é somente um hormônio importante
para o controle glicêmico, mas tem um papel na modulação do crescimento
esqueletal normal. Esta não regula a reabsorção óssea, mas estimula a
síntese de matriz; os efeitos são diretos e indiretos no metabolismo ósseo.
Diretamente, estimula a síntese de matriz osteoblástica e, indiretamente,
induz a produção de IGF-I pelo hospedeiro. Consequentemente, o IGF-I
aumenta a síntese de matriz por dois mecanismos: aumenta o número de
osteoblastos presentes e regula a diferenciação osteoblástica (Canalis,
1980). Isso é possível provar em modelos diabéticos experimentais, uma
19
vez que os estudos demonstram redução na mineralização, na produção de
osteóide e formação óssea total e, contrariamente, os animais tratados com
insulina demonstram crescimento ósseo e formação de osteóide em níveis
similares aos controles (Glajchen et al., 1988). Os experimentos realizados
in vitro indicam que a aplicação tópica de insulina estimula o processo de
ossificação intramembranosa em fraturas (Yano et al., 1996); aumenta a
área de osteóide, o número e a sobrevida dos osteoblastos, reduzindo seu
índice de apoptose (Hill et al., 1997). Ainda, outro estudo in vitro avaliou a
proliferação e a mineralização dos osteoblastos cultivados em diferentes
condições (glicose normal, hiperglicemia, hiperglicemia com IGF-I e
hiperglicemia com insulina); como resultado, observou-se que a
hiperglicemia aumentou a proliferação e inibiu a mineralização das células
ósseas, enquanto o IGF-I pareceu reverter esses efeitos, recuperando o
balanço entre proliferação e diferenciação (Fang, 2006).
Glajchen et al., em 1988, estudaram, durante 7 semanas, aspectos do
metabolismo ósseo em ratos diabético-induzidos por estreptozotocina e
utilizaram a osteocalcina sérica (BGP) como um marcador de
anormalidades ósseas. Puderam observar histomorfometricamente que, a
remodelação óssea, o volume de osteóide e o número de osteoclastos
estavam reduzidos nos animais diabéticos.
Em um trabalho realizado por Takeshita et al. (1997), foram
instalados implantes de hidroxiapatita nas tíbias de ratos induzidos a
diabetes por estreptozotocina e, durante 84 dias, administraram marcadores
de cálcio para mapear a deposição óssea. Sob microscopia de luz
observaram que a superfície do implante estava completamente adaptada ao
osso cortical, tanto nos animais controle como nos diabéticos. Porém,
quando analisado o osso medular, perceberam que nos animais saudáveis o
implante apresentava-se envolvido por uma fina camada de osso lamelar,
enquanto que nos diabéticos, estava parcialmente circundado por osso
20
lamelar e com células fibroblasto-aparentes dispostas paralelamente a sua
superfície, onde não existia contato osso-implante. Sob microscopia de
varredura, observaram que existia somente um pequeno aumento de tecido
ósseo formado entre o 28º e o 84º dia tanto nos animais controle como nos
experimentais. No entanto, concluíram que a porcentagem de tecido ósseo
em contato com o implante e a espessura da lâmina óssea, eram maiores
nos ratos controle que nos diabéticos.
Iyama et al. (1997) realizaram um estudo com o objetivo de
compararem a quantidade e distribuição regional de formação óssea ao
redor de implantes de hidroxiapatita em ratos normais e diabético-
induzidos por estreptozotocina. Foram injetados os marcadores calceína,
alizarina e tetraciclina no 7º, 14º e 21º, respectivamente após a implantação
e os animais foram sacrificados no 28º dia. Em ambos os grupos, a
formação óssea desenvolveu-se da superfície da hidroxiapatita em direção
ao endósteo, ao periósteo ou ao osso medular. No grupo controle,
circundando a superfície do implante próxima ao periósteo e endósteo, o
novo osso mostrou uma extensa marcação com as três camadas de cores,
mas no grupo diabético, a densidade do marcador tetraciclina, no 21º dia,
estava baixa. Em contraste, na área lateral ao implante, distante do
periósteo e endósteo, houve consideravelmente menos formação óssea no
grupo controle e quase completa supressão no grupo diabético-induzido.
Nevins et al. (1998) induziram diabetes, por meio de
estreptozotocina, em 20 ratos que foram acompanhados por 28 e 56 dias. A
osseointegração se deu em ambos os grupos, entretanto, a análise em
microscopia de luz revelou diferenças no padrão de formação óssea. Os
implantes instalados nos ratos controle foram consistentemente envoltos
por osso, com mínimo de ausência de formação óssea, localizada no espaço
medular distante da superfície do implante. Nos ratos diabéticos, o osso
neoformado parecia imaturo e desorganizado. Além disso, para ambos os
21
grupos, a taxa de osteogênese não aumentou significativamente da 4ª para a
8ª semana. Entretanto, houve mais contato osso-implante no grupo controle
comparado ao diabético, o que corresponde a uma porcentagem de
osseointegração menor no segundo em relação ao primeiro.
Fiorellini et al., em 1999, propuseram um estudo, utilizando
parâmetros histomorfométricos, em que avaliaram o processo de
cicatrização óssea ao redor de implantes de titânio, com superfície tratada
por spray de plasma, instalados em ratos normais e em animais diabéticos
tratados com insulina. Os resultados indicaram que a insulino-terapia foi
capaz de regular a formação de osso ao redor dos implantes inseridos nos
animais diabético-induzidos. Embora a densidade óssea tenha sido maior
no grupo insulino-tratado, houve significativamente menos contato osso
medular/implante nesse grupo quando comparado ao controle.
McCracken et al., em 2000, instalaram implantes em 16 ratos
diabético-induzidos por estreptozotocina e em 16 animais com glicemia
normal, que foram acompanhados durante 14 dias. O grupo de estudo
demonstrou significativamente menos osseointegração que o controle.
Entretanto, contrariamente ao esperado, a quantidade total de volume ósseo
ao redor dos implantes foi 4 vezes maior nos diabéticos que nos animais
controlados.
Com o objetivo de investigar o curso histológico e as mudanças
ultra-estruturais no processo de osseointegração, sob influência da insulina,
foram instalados implantes em 3 diferentes grupos de ratos: diabético-
induzidos por aloxana; tratados com insulina e não-diabéticos. Os animais
foram sacrificados 10 e 21 dias após a cirurgia. Relativo aos valores
controle, os ratos diabético-induzidos exibiram uma redução de 50% na
área óssea formada e na superfície de contato osso-implante, 21 dias após a
instalação. Mas, não houve diferenças estatísticas entre os grupos, quando
avaliados 10 dias após a cirurgia. Os valores retornaram aos níveis normais
22
nos ratos diabéticos após o tratamento com insulina. A presença de células
condrócito-semelhantes circundando uma matriz semelhante à cartilagem,
sugere um atraso no processo de reparo ósseo. As características ultra-
estruturais da interface osso-implante, em ratos tratados com insulina,
foram semelhantes àquelas observadas nos controles. Assim, pôde-se
concluir que o reparo ósseo ao redor dos implantes é regulado, ao menos
em parte, pela insulina. Esses resultados levaram os autores a afirmar que,
o controle do “status” metabólico dos pacientes diabéticos, é essencial para
o sucesso da osseointegração (Siqueira et al., 2003).
Ottoni & Chopard (2004) quantificaram a neoformação óssea ao
redor de implantes instalados em ratos diabético-induzidos por
estreptozotocina. Os animais foram avaliados por um período cicatricial de
8 semanas, durante o qual, administrou-se marcadores de deposição óssea
(calceína, tetraciclina e alizarina). O período de maior atividade
osteogênica foi entre o início da quarta semana e o final da quinta. A
neoformação óssea na região periostal e na cortical junto ao implante não
mostraram diferença estatística entre os grupos. Essa se mostrou
significativa quando avaliado o canal medular; na avaliação do tecido
neoformado como um todo e na área de contato osso-implante, quando
analisada sua porção intramedular.
Seguindo o propósito de avaliar a osseointegração dos implantes, em
situações de hiperglicemia não-controlada e controlada com insulina; foram
instalados, em ratos diabético-induzidos por estreptozotocina, implantes de
superfície tratada com spray de plasma. Durante 28 dias de
acompanhamento, foram ministradas injeções diárias de insulina em
metade da amostra, enquanto a outra permaneceu não-controlada. Os
resultados mostraram que o contato osso-implante foi maior nos animais
que receberam a insulina e que esse contato pareceu diminuir com o tempo
23
nos ratos diabéticos não-controlados, sugerindo menor osseointegração
(Kwon et al., 2005).
Com o intuito de se obter a modulação dos efeitos do diabetes na
osseointegração, 4 grupos de ratos foram submetidos a diferentes
tratamentos. Um deles serviu como controle enquanto os outros foram
induzidos a diabetes. Após a instalação de implantes de titânio com
superfície de plasma-spray, foi dado aminoguanidina a um grupo diabético,
doxiciclina a outro e nenhuma medicação ao terceiro. Após 28 dias
observou-se que o contato osso medular-implante (COMI) foi maior no
grupo controle que no diabético. Os animais tratados com aminoguanidina
tiveram maior COMI que os diabéticos não-medicados. Já o grupo que
recebeu doxiciclina não apresentou diferenças quando comparado aquele
não-tratado. Assim, concluiu-se que a diabetes inibe a osseointegração, mas
isso pode ser modificado administrando aminoguanidina sistemicamente
(Kopman et al., 2005).
Com base nos resultados obtidos nos diversos trabalhos, que
encontraram redução do contato osso-implante, Shyng et al. (2006)
testaram a hipótese de que essa menor osseointegração pode ser devido à
diminuição da taxa de deposição mineral. Em 20 ratos normais e 20
diabéticos, foram instalados implantes nos alvéolos, imediatamente após a
exodontia dos molares. Realmente, houve uma significativa redução na
taxa de aposição mineral no grupo teste, o que sugere uma função
osteoblástica prejudicada ou mineralização deficiente. Mas, não houve
diferenças entre os ratos sacrificados em 20 e 40 dias. Extrapolando para a
situação clínica, os autores sugerem que a inserção de implantes,
imediatamente após a exodontia, pode estar contra-indicada, em pacientes
com glicemia mal controlada.
Em um trabalho recente, 122 ratos divididos em três grupos
(controle, diabéticos não-controlados e diabéticos insulino-tratados),
24
receberam implantes de titânio. A análise histológica procedeu-se após 2, 7,
14 e 24 dias de período cicatricial. O volume ósseo teve seu pico no 7º dia
e diminuiu até o 24º dia, para todos os grupos avaliados. Entretanto, nos
ratos diabéticos, a quantidade de osso adjacente aos implantes foi
significativamente maior que nos animais controle, confirmando os
resultados encontrados no estudo de McCracken et al. (2000). Já naquele
grupo tratado com insulina, não houve diferenças estatísticas em relação ao
controle. Uma das justificativas para esses achados é que, devido às
anormalidades cicatriciais relacionadas ao diabetes, haja um atraso na
remodelação e maturação do osso adjacente ao implante, assim, os animais
diabéticos apresentariam maior volume ósseo associado aos implantes
devido à cicatrização comprometida, em que a atividade osteoclástica e a
diferenciação osteoblástica estão inibidas (McCracken et al., 2006).
Além dos estudos in vitro e dos realizados em animais, a literatura
apresenta alguns trabalhos que avaliaram a osseointegração dos implantes
dentários instalados em pacientes diabéticos. Entretanto, o tratamento com
implantes nesses indivíduos é controverso. Os critérios gerais a serem
estabelecidos incluem o tipo de diabetes, a idade de início e o nível de
controle glicêmico. Um paciente com início tardio da desordem, controle
dietético adequado, perdas dentárias não associadas às periodontites e
reabilitação unitária, pode ter um risco diminuído de falhas.
Contrariamente, um paciente com diabetes tipo I, perda de dente como
resultado de doença periodontal e indicação de reabilitação total pode ter
um risco alto para perda dos implantes (Fiorellini & Nevins, 2000).
Accursi, em 2000, examinou, retrospectivamente, o impacto do
diabetes nos implantes dentários em pacientes que foram acompanhados de
1 a 17 anos. Um total de 59 implantes no grupo diabético foi comparado a
111 instalados no controle, concordando com os critérios de sucesso
estabelecidos. Portanto, concluíram que os pacientes diabéticos não
25
estavam mais relacionados às experiências de falhas nos implantes que os
não-diabéticos.
Em um estudo prospectivo, analisou-se o sucesso de implantes
dentários instalados na região da sínfese mandibular em 89 pacientes
diabéticos tipo II. Os dados foram coletados após 60 meses da instalação da
prótese (overdenture tipo barra-clipe) e obteve-se 88% de sucesso para as
reabilitações. Mesmo com uma taxa de sucesso inferior a média para
procedimentos semelhantes (Lindquist et al., 1996), os autores suportam o
conceito de que a instalação de implantes em pacientes diabéticos é
previsível. Entretanto, os resultados sugerem que a duração da doença foi
um fator significante para a falha dos implantes (Olson et al., 2000).
Abdulwassie & Dhanrajani em 2002, instalaram 113 implantes
dentários em 25 pacientes diabéticos, mas com controle metabólico
adequado. A taxa de sucesso foi de 95,57%, correspondendo a cinco
implantes perdidos, todos no período pós-cirúrgico, antes da instalação das
próteses. Assim, os autores afirmam que é possível obter sucesso no
tratamento com implantes, em pacientes diabéticos que mantêm níveis
glicêmicos sob controle.
Kotsovilis et al. (2006) realizaram uma revisão de 8 estudos que
reabilitaram pacientes diabéticos com a instalação de implantes dentários.
As conclusões gerais foram que a maioria não contra-indica a instalação
dos implantes em diabéticos, desde que haja o controle metabólico, além
disso, a duração da doença tem sido estatisticamente correlacionada com a
taxa de sobrevivência dos implantes.
Diante das implicações observadas no processo de osseointegração
dos implantes em quadros diabéticos, um dos tópicos de maior interesse
para clínicos e pacientes é a obtenção de resultados tão favoráveis quanto
aqueles encontrados em condições metabólicas normais. Considerando-se a
interação que ocorre entre a superfície do material implantado e o tecido
26
ósseo, as condições sistêmicas do indivíduo e a biocompatibilidade do
material são requisitos fundamentais, durante o processo de cicatrização,
para o estabelecimento de um contato íntimo entre o osso e a superfície do
implante dentário (Lacefield, 1998). Assim, o “design” dos implantes tem
sido modificado, ao longo dos anos, por diversos propósitos, incluindo
facilidade de inserção intra-óssea, capacidade de melhorar a distribuição de
carga, bem como o aumento da biocompatibilidade e das propriedades de
osseocondutividade, buscando facilitar a osseointegração e seu tempo
(Buser et al., 2004).
Uma vez que, a superfície do implante é o primeiro componente a
reagir com o hospedeiro, as modificações nela são extensivamente
empregadas como uma tentativa de acelerar a cicatrização. Superfícies com
alta osseocondutividade podem promover aposição e cicatrização ósseas,
que levam à rápida fixação biológica do implante ao osso (Lemons, 2004).
Estudos apontam que, as modificações de superfície têm fundamental
importância na resposta biológica em ossos de menor densidade, bem
como, na redução do período de latência entre os procedimentos cirúrgico e
restaurador (Albrektsson & Wennerberg, 2004b; Butz, 2006). As
modificações topográficas de superfícies [especialmente se os valores de
rugosidade (Ra) estiverem entre 0,5 a 1,5 µm] tendem a não somente
aumentar o contato implante-osso, como também, a resistência da interface
entre eles (Albrektsson & Wennerberg, 2004). Baseado nisso, desde
meados da década de 90, dados experimentais obtidos de superfícies
rugosas com valores de Ra próximos a 1,5 µm, mostraram melhor resposta
óssea comparados a implantes de superfície lisa ou aos de superfície tratada
com Ra > 2,0 µm (Albrektsson & Wennerberg, 2004a). Todavia, apesar de
existirem diferenças entre os princípios físicos utilizados, todas as técnicas
visam aperfeiçoar o binômio osseocondução/osseoindução,
27
proporcionando, assim, um aumento na capacidade de ancoragem da
interface osso-biomaterial a curto, médio e longo prazo (Lemons, 2004).
Estudos in vitro testaram a biocompatibilidade do titânio, usando
células osteobláticas, e demonstraram que superfícies rugosas favorecem o
aumento da adesão celular, a síntese de colágeno, de matriz extra celular,
de fatores de crescimento e, consequentemente, a formação óssea. O perfil
topográfico mostra importante relação no que diz respeito ao
posicionamento e alinhamento celular e, assim, torna as superfícies
texturizadas preferíveis às superfícies lisas (Brunette et al., 2005).
A dinâmica do remodelamento ósseo ao redor de implantes de titânio
de superfícies lisas e rugosas foi observada em ovelhas, por um período de
3, 6, 12 e 18 meses. Avaliou-se, histomorfometricamente, a quantidade de
osso ao redor dos implantes (volume, fração em volume de osso imaturo,
espessura e interface de contato), a atividade osteoblástica (taxa de
aposição e formação ósseas), bem como, a taxa de reabsorção. Decorridos
12 e 18 meses da implantação, o volume ósseo e a interface de contato
continuaram aumentando, havendo sempre, uma tendência positiva dos
implantes de superfície rugosa estarem associados aos maiores valores
(Grizon et al., 2002).
Butz (2006), em um estudo experimental realizado em ratos, afirmou
que, em geral, as diferentes superfícies rugosas, como as obtidas por meio
de jateamento, ataque ácido ou anodização, demonstram maiores valores de
torque, no período inicial de implantação, se comparadas às superfícies
lisas. Entretanto, é necessário observar que os testes de resistência à
remoção tendem a favorecer os implantes de superfícies rugosas devido ao
travamento mecânico entre esses e o osso. Por isso, são fundamentais as
investigações para esclarecer se as superfícies rugosas favorecem a resposta
hospedeiro/implante, aumentando as propriedades mecânicas do osso no
período inicial da implantação, ou se o travamento mecânico, entre a
28
superfície rugosa e o osso, é o responsável por aumentar os valores dos
testes de resistência (Butz, 2006).
No entanto, a maioria dos estudos, compara superfícies rugosas e
lisas, utilizando um número moderado de parâmetros (torque e superfície
de contato), falta a avaliação da dinâmica óssea ao redor de diferentes tipos
de implantes. Isso leva a especulações infundadas a respeito do mecanismo
que as superfícies rugosas podem exercer a favor da resposta
hospedeiro/implante, não fornecendo nenhuma contribuição adicional ao
desenvolvimento tecnológico das superfícies. Entretanto, deve haver
estudos considerando parâmetros histomorfométricos estáticos e dinâmicos,
comparando várias superfícies rugosas e lisas, para que, assim,
determinem-se as características críticas no “design” dessas superfícies
(espessura da camada de óxido, tratamento químico e textura) com o
objetivo de aprimorar a resposta hospedeiro/implante, nas próximas
gerações de materiais disponíveis na implantodontia.
Este estudo visou comparar a formação óssea ao redor de implantes
de superfície lisa e tratada, instalados em ratos diabético-induzidos e não-
diabéticos, com o intuito de investigar se há diferenças na formação óssea e
melhora no padrão de osteogênese entre as diferentes superfícies e sua
relação com o diabetes.
29
2 METODOLOGIA
Os procedimentos realizados neste experimento foram conduzidos de
acordo com os princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e tiveram sua aprovação pelo Comitê de
Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa
Catarina.
2.1 ANIMAIS
Foram utilizados 20 ratos Wistar, machos, com idade aproximada de
3 meses e peso médio de 350g, provenientes do biotério central da
Universidade Federal de Santa Catarina. Os animais foram mantidos em
ambiente com temperatura controlada (22 ± 2ºC), ciclo claro/escuro de 12h,
(luz após as 7:00 horas) e com livre acesso a água e comida. Os ratos
foram divididos em 2 grupos, teste (10 diabético-induzidos) e controle (10
não-diabéticos).
2.2 INDUÇÃO DO DIABETES MELLITUS
O diabetes foi induzido por injeção i.p. de estreptozotocina
(Streptozocin Sigma-Aldrich), 70mg/Kg, em dose única, de acordo com o
protocolo estabelecido por Fiorellini et al. (1999) e Kwon et al. (2005). O
estado de hiperglicemia foi verificado semanalmente, durante todo o
experimento, desde previamente à indução até a data do óbito. As amostras
de sangue foram coletadas por punção na extremidade da cauda dos
animais (Figura 1) e mensuradas pelo método da glicose-oxidase,
utilizando-se um glicosímetro digital (Accu-Chek Active, Roche,
Alemanha). Foram considerados diabéticos aqueles ratos, cuja glicemia
30
apresentava-se acima de 200 mg/dL de sangue (Figura 2). Após 7 dias da
indução, os animais foram submetidos à cirurgia para instalação dos
implantes.
Figura 1 – Punção na extremidade da cauda do rato para a coleta do sangue na fita, para
mensurar a glicemia
Figura 2 – Glicosímetro digital usado para medir os níveis de glicemia
31
2.3 IMPLANTES
Os implantes (Systhex, Brasil) foram confeccionados em titânio
comercialmente puro e desenhados de tal forma a conferir estabilidade ao
implante e reduzir ao mínimo o trauma ósseo.
O implante é constituído por uma cabeça de 2,6 mm de diâmetro e
0,5 mm de altura, com um furo central para adaptação de chave hexagonal;
corpo cilíndrico, de 2 mm de diâmetro, com roscas para permitir maior
estabilidade e possui uma altura total de 4 mm.
2.3.1 Superfície dos implantes
Foram utilizados 2 tipos de implantes: a) denominados U, que foram
usinados convencionalmente e b) denominados T, os quais, após a
usinagem, receberam um tratamento químico de superfície, com ataque
ácido, para produzir rugosidades adicionais.
2.4 PROTOCOLO CIRÚRGICO
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados usando técnica
asséptica, sob anestesia profunda, induzida por injeção i.p. de solução de
hidrato de cloral a 7% (0,6 mL/100 gramas de peso corporal). Em seguida,
realizou-se a tricotomia na região do fêmur esquerdo e antissepsia com
álcool 70%. Após a incisão da pele e tecido subcutâneo, descolou-se o
periósteo para exposição do fêmur (Figuras 3 e 4). Cada animal recebeu 2
implantes distando entre eles, aproximadamente, 5mm. O implante U foi
instalado na diáfise e o T na epífise. As perfurações ósseas foram realizadas
com o auxílio de uma peça reta (Kavo, Brasil), acoplada a um motor
elétrico (Driller, Alemanha) a 900 rpm e irrigação abundante com solução
32
salina 0,9% . Inicialmente, utilizou-se uma broca elicoidal de 1,5 mm de
diâmetro e, em seguida, outra semelhante, medindo 3 mm (Figura 5).
A fixação endóstea dos implantes se deu por rosqueamento com
chave manual hexagonal, até a cabeça do implante tocar completamante a
cortical óssea (Figura 6). Todos os implantes, ao término desse
procedimento, permaneciam com boa estabilidade e sem sinais de
mobilidade. A sutura foi realizada por planos com fio de nylon 4.0 (Figura
7). No pós-operatório imediato, administrou-se Benzilpenicilina benzatina
(Benzetacil 1.200.000 U.I., Eurofarma Laboratórios Ltda.) 0,06 mL/Kg em
dose única intramuscular e, como analgésico, o Paracetamol (Paracetamol,
Eurofarma Laboratórios Ltda.) 10mg/Kg, em gotas diluídas na água de
consumo, por dois dias consecutivos, trocada diariamente. Essa diluição
tomou como base que o consumo médio de água por um rato adulto é de
aproximadamente 20 mL/dia (Waynforth et al., 1988).
Cada grupo (controle e teste) foi subdividido em dois outros grupos,
sendo: a) 5 animais monitorados por 10 dias e b) 5 animais monitorados
por 21 dias.
Assim, no 10º ou 21º dias após a cirurgia, os ratos foram sacrificados
por inalação de dióxido de carbono. Com a exposição do fêmur, procedeu-
se a avaliação visual dos tecidos e da cabeça dos implantes, bem como, o
teste de mobilidade dos implantes, para certificar-se a osseointegração.
Posteriormente, os blocos ósseos, contendo os implantes, foram removidos,
utilizando-se uma peça reta com um disco de carburundum, irrigado com
solução salina, acoplada ao motor elétrico (Figuras 8 e 9). As amostras
foram fixadas em formaldeído a 10%.
33
Figura 3 – Delimitação cutânea da incisão a ser realizada
Figura 4 – Acesso ao fêmur do rato, após divulsão dos tecidos por planos
34
Figura 5 – Preparo do leito ósseo, por meio das perfurações na epífise e diáfise, para
receber os implantes
Figura 6 – Implantes de superfícies lisa (seta amarela) e tratada instalados no fêmur
esquerdo dos ratos
35
Figura 7 – Sutura realizada por planos
Figura 8 – Remoção do fêmur após período cicatricial
Figura 9 – Vista interna do fêmur, mostrando osso
cortical e medular, onde os implantes
foram ancorados
36
2.5 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Primeiramente as 20 amostras foram desmineralizadas em solução de
Morse (ácido fórmico 50% + citrato de sódio 20%, na proporção de 1:1),
durante 15 dias, controladas radiograficamente, até que toda a porção
mineral do osso fosse removida. Após a desmineralização, os implantes
foram retirados, as peças banhadas em soluções de diferentes
concentrações de álcool e xilol, incluídas em parafina. Os blocos
parafinados foram cortados no micrótomo convencional para tecido mole, a
uma espessura de 5µm, seguindo, paralelamente, o longo eixo da loja óssea
dos implantes.
2.5.1 Coloração Hematoxilina-Eosina
A coloração em HE dos cortes foi realizada, convencionalmente,
conforme a seguinte seqüência:
Desparafinar:
Xilol 1: 2 banhos de 15’
Xilol 2: 1 banho de 15’
Hidratar:
Álcool absoluto 1: 2 banhos de 5’
Álcool absoluto 2: 1 banho de 5’
Álcool 70%: 1 banho de 5’
Água corrente: 10’
Hematoxilina:
Corar durante 40’’
Lavar 10’em água corrente
Eosina:
Corar durante 2’
37
Lavar ligeiramente apenas para remover o excesso, pois o corante é
solúvel em água
Desidratar:
Álcool 70%: 1 banho rápido
Álcool absoluto 1: 2 banhos rápidos
Álcool absoluto 2: 1 banho de 3’
Álcool absoluto 3: 1 banho de 3’
Diafanizar:
Xilol 1: 1 banho de 3’
Xilol 2: 1 banho de 3’
Xilol 3: permanecer no líquido até a montagem das lâminas, em que
é colada a lamínula de vidro sobre o corte histológico já corado.
2.6 ANÁLISE QUALITATIVA
Foram selecionadas 2 lâminas de cada animal, que apresentavam os
cortes mais centrais nas regiões dos implantes. Os grupos teste e controle
foram divididos de acordo com o período de cicatrização (10 e 21 dias),
além disso, diferenciou-se, dentro de cada amostra, os implantes de
superfície lisa e tratada, subdividindo-os em lado mesial e distal. A leitura
das lâminas foi realizada em microscópio óptico, analizando-se em cada
lado a presença ou ausência de tecido ósseo neoformado, diferentes estados
de maturação deste (nos períodos de 10 e 21 dias), além da existência de
tecido conjuntivo e infiltrado inflamatório.
2.7 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA
Foi selecionada apenas 1 lâmina de cada animal, com corte mais
central, seguindo o mesmo padrão de subdivisão da análise qualitativa.
38
Procedeu-se a leitura das lâminas em um microscópio óptico acoplado a
uma câmera de vídeo e a um computador com um programa (KS300) capaz
de capturar as imagens em um aumento de 40 vezes. Assim, cada lateral,
dos diferentes implantes, foi analisada, delimitando-se campos, baseados
nas regiões em que, antes, estavam as roscas dos implantes removidos.
Portanto, com a imagem projetada na tela do computador, em cada rosca,
determinou-se uma área. Nesta região, analisou-se a área total, de osso
neoformado (AT), de tecido conjuntivo (TC), de infiltrado inflamatório
(II), de osso autógeno pré-existente (AO) e de osso medular (OM). Assim,
quantificando todas as superfícies mesiais e distais (de coronal a apical),
onde antes estavam instalados os implantes.
39
ARTIGO EM PORTUGUÊS
Avaliação da Neoformação Óssea ao Redor de Implantes de
Titânio Instalados em Ratos Diabéticos
Gabriela GENNARO, Mestre em Implantodontia
Departamento de Estomatologia, Faculdade de Odontologia, Universidade
Federal de Santa Catarina.
Gerson Francisco de ASSIS, Mestre e Doutor em Patologia Bucal
Professor Associado, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de
Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo.
Tânia Mary CESTARI, Doutora em Biologia Oral
Técnica Especializada, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de
Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo.
Rubens RODRIGUES Filho, Mestre e Doutor em Farmacologia
Professor Adjunto, Departamento de Estomatologia, Faculdade de Odontologia,
Universidade Federal de Santa Catarina.
Endereço de Correspondência do Autor:
Rubens Rodrigues Filho
Departamento de Estomatologia
Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC
Trindade, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil, CEP: 88040-970
Tel: 55 (48) 3721 9520
Fax: 55 (48) 37219542
Email:
rubens_ccs@yahoo.com.br
40
Avaliação da Neoformação Óssea ao Redor de Implantes de
Titânio Instalados em Ratos Diabéticos
Palavra-chave: implante dentário; diabetes mellitus experimental,
osteogênese.
RESUMO
Introdução: O diabetes é associado a várias complicações que aumenta a
morbidade e mortalidade em indivíduos afetados. Portanto, existem diversas
alterações no metabolismo ósseo associadas ao diabetes e, que consequentemente,
podem afetar o processo de osseointegração dos implantes dentários. Objetivos: Este
estudo visou comparar a formação óssea ao redor de implantes de superfícies lisa e
tratada, instalados em ratos diabético-induzidos e não-diabéticos, investigando se há
diferenças na formação óssea entre os dois quadros metabólicos, melhora no padrão
de osteogênese entre as diferentes superfícies e, sua relação com o diabetes.
Materiais e método: Foram instalados implantes de titânio com superfícies tratada e
lisa, no fêmur de ratos machos Wistar e os animais divididos em 2 grupos: diabético-
induzidos com estreptozotocina (grupo experimental) e não diabéticos (grupo
controle). As análises histomorfológica e histomorfométrica do bloco ósseo foram
realizadas nos períodos de 10 e 21 dias de cicatrização. Os resultados obtidos foram
analisados por meio de ANOVA de duas vias, seguida pelo teste de Bonferroni's.
Resultados: O percentual de neoformação óssea, ao redor dos implantes de
superfície lisa e tratada, não apresentou significância estatística comparando os
grupos diabético e controle. Entretanto, no período de 21 dias, nos ratos diabéticos o
osso apresentou-se mais imaturo em relação àquele de aspecto maduro formado nos
animais controle. Quando comparadas as diferentes superfícies (lisa e tratada),
observou-se, aparentemente, que aos 10 dias, a superfície lisa favoreceu a maior
formação de osso cortical e medular ao redor dos implantes Já aos 21 dias, não
ocorreu diferença na neoformação óssea entre as duas superfícies. Conclusão: Os
dados presentes sugerem que o atraso na maturação do tecido ósseo, se deu
provavelmente, devido ao diabetes-induzido e suas implicações no metabolismo
ósseo. Além disso, os implantes de superfície lisa, também na presença de diabetes,
parecem ser melhores indutores de neoformação óssea.
41
1 INTRODUÇÃO
O diabetes, classificado em tipo I e II, é associado a várias complicações que
aumentam a morbidade e mortalidade em indivíduos afetados. Essas complicações
resultam de uma regulação anormal do metabolismo de glicose, devido à ausência,
redução da produção de insulina ou resistência a esta (Oliver & Ternovem
18
, 1994).
Existem diversas alterações no metabolismo ósseo associadas ao diabetes e,
que consequentemente, podem afetar o processo de osseointegração dos implantes
dentários. A insulina atua direta ou indiretamente na síntese de matriz óssea e no
metabolismo ósseo. Diretamente, estimula a síntese de matriz osteoblástica e,
indiretamente, induz a produção do Fator de Crescimento Insulínico (IGF-I) pelo
organismo. O IGF-I regula a síntese de matriz óssea por dois mecanismos: aumenta o
número de osteoblastos presentes e controla a função de diferenciação osteoblástica
(Canalis
5
, 1980). Os experimentos realizados in vitro indicam que a aplicação tópica de
insulina estimula o processo de ossificação intramembranosa em fraturas (Yano et
al
24
, 1996); aumenta a área de osteóide, o número e a sobrevida dos osteoblastos,
reduzindo seu índice de apoptose (Hill et al
9
, 1997). Ainda, outro estudo in vitro
verificou que a hiperglicemia aumentou a proliferação e inibiu a mineralização dos
osteoblastos cultivados, enquanto o IGF-I reverteu esse quadro (Fang
6
, 2006).
Estudos em que foram instalados implantes, nas tíbias de ratos, induzidos a
diabetes por estreptozotocina e que administraram marcadores de deposição óssea,
demonstraram que a superfície do implante estava completamente adaptada ao osso
cortical, tanto nos animais controle como nos diabéticos, não havendo diferença
estatística entre os grupos. Porém, quando analisado o osso medular, perceberam que
a porcentagem de tecido ósseo em contato com implante e a espessura do tecido
neoformado eram maiores nos ratos controle que nos diabéticos, o que corresponde a
uma porcentagem de osseointegração menor no segundo grupo em relação ao
primeiro (Takeshita et al
23
1997; Iyama et al
10
1997; Ottoni & Chopard
19
2004).
Com base nos resultados obtidos dos diversos trabalhos, que encontraram
redução do contato osso-implante na presença do diabetes, Shyng; Devlin; Liang
21
(2006) testaram a hipótese de que essa menor osseointegração poderia ser devido à
diminuição da taxa de deposição mineral. Assim, foram instalados implantes nos
alvéolos de ratos, imediatamente após a exodontia dos molares e foi observado que
realmente, houve uma significativa redução na taxa de aposição mineral no grupo
teste, o que sugere uma função osteoblástica prejudicada ou mineralização deficiente.
Extrapolando para a situação clínica, os autores sugeriram que a inserção de implante,
42
imediatamente após a exodontia, pode estar contra-indicada em pacientes com
glicemia mal controlada.
Na tentativa de se favorecer a osteogênese, principalmente em pacientes que
apresentam condições sistêmicas desfavoráveis a mesma, tem-se alterado a
topografia superficial dos implantes, de tal forma que esta apresente uma energia de
superfície maior, favorecendo a adesão, organização e maturação do coágulo, bem
como a posterior deposição de matriz óssea, proporcionando, assim, um aumento na
capacidade de ancoragem da interface osso-biomaterial a curto, médio e longo prazo
(Albrektsson & Wennerberg
1
, 2004; Lemons
13
, 2004).
Seguindo esses princípios, alguns autores sugerem a utilização de implantes
de superfície tratada por diversos propósitos, incluindo capacidade de melhorar a
distribuição de carga, bem como o aumento da biocompatibilidade e das propriedades
de osseocondutividade, buscando facilitar a osseointegração e seu tempo
(Albrektsson, Wennerberg
2
, 2004b; Buser et al
3
, 2004; Butz
4
, 2006).
Este estudo visou comparar a formação óssea ao redor de implantes de
superfície lisa e tratada, instalados em ratos diabético-induzidos e não-diabéticos
investigando se há diferenças na formação óssea entre os dois quadros metabólicos,
melhora no padrão de osteogênese entre as diferentes superfícies e, sua relação com
o diabetes.
2 MATERIAIS E MÉTODO
Os procedimentos realizados neste experimento tiveram sua aprovação pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa
Catarina.
2.1 ANIMAIS
Foram utilizados 20 ratos Wistar, machos, com idade aproximada de 3 meses e
peso médio de 350g, mantidos em ambiente com temperatura controlada ((22 ± 2ºC),
ciclo claro/escuro de 12h e livre acesso a água e a comida. Os animais foram divididos
em 2 grupos: teste (10 ratos diabético-induzidos) e controle (10 ratos não-diabéticos).
2.2 INDUÇÃO DO DIABETES
O diabetes mellitus foi induzido por meio de injeção intraperitoneal de
estreptozotocina (Streptozocin Sigma-Aldrich) na dosagem de 70mg/Kg corporal.
Foram considerados diabéticos aqueles animais cuja glicemia apresentava-se acima
de 200mg/dL de sangue e o estado hiperglicêmico foi verificado semanalmente,
durante todo o experimento. As amostras de sangue foram coletadas por punção na
43
extremidade da cauda dos animais e mensuradas pelo método da glicose-oxidase,
utilizando-se um glicosímetro digital (Accu-Chek Active, Roche, Alemanha).
2.3 PROTOCOLO CIRÚRGICO DE INSTALAÇÃO DOS IMPLANTES
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados usando técnica asséptica,
sob anestesia profunda, induzida pela injeção i.p. de solução de hidrato de cloral a 7%
(0,6 mL/100 gramas de peso corporal). Em seguida, instalou-se, no fêmur de cada
animal, 2 implantes (2mm de diâmetro por 4 mm de altura - Systhex, Brasil) distando
entre eles, aproximadamente, 5mm. O implante de superfície lisa foi instalado próximo
à diáfise e o tratado (superfície atacada por ácido) mais próximo à epífise.
No pós-operatório imediato, administrou-se Benzilpenicilina benzatina
(Benzetacil 1.200.000 U.I., Eurofarma Laboratórios Ltda.) 0,06 mL/Kg em dose única
intramuscular e, como analgésico, o Paracetamol (Paracetamol, Eurofarma
Laboratórios Ltda.) 10mg/Kg, em gotas diluídas na água de consumo, por três dias
consecutivos, trocada diariamente.
Cada grupo (controle e teste) foi subdividido em dois outros grupos, sendo: a) 5
animais monitorados por 10 dias e b) 5 animais monitorados por 21 dias. Assim, no
10º ou 21º dias após a cirurgia, os ratos foram sacrificados por inalação de dióxido de
carbono. Os blocos ósseos, contendo os implantes, foram removidos e fixados em
formaldeído a 10%.
2.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Primeiramente, as 20 amostras foram desmineralizadas em solução de Morse
(ácido fórmico 50% + citrato de sódio 20%, na proporção de 1:1), durante 15 dias e
controladas radiograficamente. Após a desmineralização, os implantes foram retirados,
as peças banhadas em soluções de álcool e xilol e incluídas em parafina. As amostras
foram cortadas a uma espessura de 5µm e coradas por hematoxilina e eosina (HE).
2.5 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA
Foi selecionada uma lâmina de cada animal e nesta, o corte mais central foi
estudado. Procedeu-se a leitura das lâminas em um microscópio óptico acoplado a um
sistema de captura e análise de imagem (KS300), estas foram avaliadas
histomorfometricamente. Assim, cada lateral, dos diferentes implantes, foi analisada,
delimitando-se campos, baseados nas regiões em que, antes, estavam as roscas dos
implantes removidos. Portanto, com a imagem projetada na tela do computador,
determinou-se uma área em cada rosca. Nesta região, analisou-se a quantidade de
44
0
100
200
300
400
500
600
10 dias
pré-indução
pós-indução
grupo controle
21 dias
osso neoformado (ON), de tecido conjuntivo (TC), de infiltrado inflamatório (II), de osso
autógeno pré-existente (OA) e de medula óssea (MO).
2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística das diferenças entre superfícies (lisa e tratada) e
condição (diabético e não-diabético), utilizou-se ANOVA a dois critérios,
complementada pelo teste de Bonferroni's para comparações múltiplas, sendo
adotado o valor de P < 0,05 como nível significância.
3 RESULTADOS
O estado diabético (glicemia acima de 200mg/dL) foi previsivelmente induzido e
mantido durante os períodos cicatriciais. Nos grupos diabéticos de 10 e 21 dias, a
glicemia média foi de 456 ± 128 e 496 ± 174, respectivamente, enquanto que nos
grupos controle (não-diabéticos) as médias obtidas foram de 111 ± 29 e 103 ± 12, na
mesma ordem (Figura 1).
Figura 1 – Índice glicêmico de ratos (n=5) diabético-induzidos e controles, nos diferentes tempos
experimentais
Conforme o esperado, os ratos não-diabéticos tiveram, aproximadamente, um
aumento de 5% de massa corporal ao longo dos 10 e 21 dias. Contrariamente, os
diabéticos apresentaram uma perda de peso de 17% para o grupo de 10 dias de
cicatrização pós-cirúrgica e de 13% para o grupo de 21 dias (Figura 2).
45
Figura 2 – Massa corporal dos animais (n=5)
avaliados em relação ao tempo experimental
3.1 Histomorfologia
Quando comparados os ratos diabético-induzidos aos não-diabéticos, aparentemente,
no período inicial de 10 dias, ambos apresentaram o mesmo quadro histomorfológico,
tanto ao redor dos implantes de superfície lisa quanto daqueles tratados (Figuras 3 e
4). Entretanto, quando avaliados no tempo cicatricial de 21 dias, a quantidade de
tecido ósseo neoformado foi similar, porém, no grupo diabético-induzido, esse osso
apresentou-se mais imaturo em relação àquele de aspecto maduro formado nos
animais controle, assim, observou-se áreas de tecido ósseo imaturo associado ao
infiltrado inflamatório e ao tecido conjuntivo (Figuras 5 e 6).
Quando comparadas as diferentes superfícies (lisa e tratada), observou-se,
aparentemente, que aos 10 dias, a superfície lisa favoreceu a maior formação de osso
cortical e medular ao redor dos implantes (Figuras 3 e 4). Já aos 21 dias, não ocorreu
diferenças na neoformação óssea entre as duas superfícies. Entretanto, curiosamente,
ao redor dos implantes tratados, ocorreu uma necrose tecidual que, lentamente, foi
sendo substituída por tecido de granulação e, mais tardiamente, por tecido ósseo, o
que favoreceu maior interposição de tecido conjuntivo entre osso e o implante e a
menor neoformação óssea próxima a rosca. Além disso, esteve sempre presente uma
quantidade de infiltrado inflamatório, ao redor dos implantes de superfície tratada
(Figuras 5 e 6).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
10 dias
controle
diabético
21 dias
46
Figura 3
–
Fotomicrografia da região do fêmur do grupo controle (10 dias)
Superfície lisa: a) visão panorâmica mostrando a cortical voltada para cabeça do implante
(C1), tecido conjuntivo e restos de osso autógeno na porção mesial (M) e tecido ósseo na
porção distal (D); b) detalhe do tecido ósseo neoformado (ON), localizado próximo a
superfície da rosca do implante (seta branca), e da medula óssea (MO) entre as trabéculas.
Superfície tratada: c) Visão panorâmica mostrando cortical voltada para cabeça do
implante (C1) e presença de osso autógeno e tecido necrosado tanto na superfície mesial
(M) quanto distal (D); e d) detalhe do tecido necrosado (TN), próximo a superfície da rosca
do implante e dos fragmentos de osso autógeno (seta azul). HE, objetivas 4X / 40X.
47
Figura 4
–
Fotomicrografia da região do fêmur do grupo experimental (10 dias)
Superfície lisa: a) visão panorâmica mostrando a cortical voltada para cabeça do
implante (C1), mistura de tecido conjuntivo, de infiltrado inflamatório e de tecido ósseo
neoformado na porção distal (D) e de tecido ósseo na porção mesial (M); b) detalhe do
tecido ósseo neoformado (ON) de arranjo trabecular, localizado próximo a superfície da
rosca do implante (seta branca), e da medula óssea (MO) entre as trabéculas.
Superfície Tratada: c) Visão panorâmica mostrando cortical voltada para cabeça do
implante (C1) e presença de osso autógeno e tecido necrosado tanto na superfície mesial
(M) quanto na distal (D), mas com pequena neoformação óssea na distal próximo a
cortical (C2); d) detalhe do tecido conjuntivo localizado próximo a superfície da rosca do
implante (seta branca), do tecido ósseo (ON) e dos fragmentos de osso autógeno (seta
azul). HE, objetivas de 4X/ 40X.
48
Figura 5
-
Fotomicrografia da região do fêmur do grupo controle (21 dias)
Superfície Lisa: a) Visão panorâmica mostrando a cortical voltada para cabeça do
implante (C1), tecido ósseo cortical e medular na porção distal (D) e mesial (M); b) detalhe
da superfície (seta branca) próxima ao implante mostrando o tecido ósseo neoformado
(ON) mais maduro, com alguns fragmentos de osso autógeno (seta azul) aprisionado no
seu interior e a medula óssea (MO).
Superfície tratada: c) Visão panorâmica mostrando a cortical voltada para cabeça do
implante (C1), predomínio de tecido conjuntivo na porção mesial (M) e presença de tecido
ósseo na porção distal (D), próximos a superfície da rosca do implante; d) detalhe do tecido
ósseo neoformado (ON) mais maduro, contendo alguns fragmentos de osso autógeno (seta
azul) aprisionado em seu interior, medula óssea (MO) e da fina camada de tecido
conjuntivo (seta branca) interposto entre o implante e o tecido ósseo neoformado. HE,
objetivas de 4X/ 40X.
49
Figura 6
-
Fotomicrografia da região do fêmur do grupo experimental (21dias)
Superfície Lisa: a) Visão panorâmica mostrando presença de tecido conjuntivo, restos
de osso autógeno e de infiltrado inflamatório na metade da superfície mesial (M) e distal
(D), próximos a cortical voltada para cabeça do implante (C1) e neoformação óssea e
medular próximas a cortical apical (C2); b) detalhe do tecido ósseo neoformado (ON), da
medula óssea (MO) e da fina cápsula de tecido conjuntivo (seta branca) interposta entre
o implante e o tecido ósseo neoformado.
Superfície tratada: c) visão panorâmica mostrando presença de espessa cápsula de
tecido conjuntivo recobrindo toda a superfície mesial (M) e distal (D) voltada o implante,
reabsorção da cortical C1 e tecido ósseo neoformado próximos a cortical apical (C2); d)
detalhe do tecido ósseo neoformado (ON) e da espessa cápsula de tecido conjuntivo
(TC) interposta entre o implante e o tecido ósseo neof
ormado. HE, objetivas de 4X/
40
X.
50
3.2 Histomorfometria
Quando foram comparadas as superfícies lisa e tratada dos implantes, em cada grupo
individualmente, observamos que, 10 dias após a instalação dos implantes, houve
maior neoformação óssea ao redor das superfícies lisas, em ambos os grupos
(controle e diabético-induzidos); a quantidade de osso medular formado foi
significativamente maior apenas no grupo controle. Já no período de 21 dias, a
neoformação óssea ao redor dos diferentes tipos de superfície, não foi
estatisticamente significante. Entretanto, a superfície lisa favoreceu a formação de
osso medular, especialmente no grupo controle. Em relação à presença de infiltrado
inflamatório, encontrou-se uma quantidade significativamente maior ao redor dos
implantes de superfície tratada instalados em ambos os grupos e avaliados durante os
diferentes tempos (Tabela 3)
Tabela 1 – Média e Desvio Padrão da porcentagem (%) das estruturas observadas entre o
tecido ósseo e o implante. Comparação entre as diferentes superfícies dos
implantes nos ratos controle e diabéticos
Grupo controle Grupo Experimental
Parâmetros
Liso Tratado
Nível de
significância
(P)
Liso Tratado
Nível de
significância
(P)
Período 10 dias
Osso neoformado
23,74 ± 3,83 12,87 ± 3,51
p<0,05
20,96 ± 7,92 6,22 ± 4,95
p<0,05
Medula óssea
16,29 ± 4,91 5,34 ± 1,02
p<0,05
17,68 ± 7,65 15,58 ± 4,30
p>0,05
Necrose/Tecido Conjuntivo
28,52 ± 9,64 30,58 ± 8,49
p>0,05
33,02 ± 4,64 26,28 ± 2,67
p>0,05
Infiltrado inflamatório
14,54 ± 4,66 31,47 ± 6,09
p<0,05
14,47 ± 11,24
31,54 ± 8,57
p<0,05
Osso autógeno
16,90 ± 3,93 21,74 ± 4,07
p>0,05
13,88 ± 4,74 20,08 ± 10,56
p>0,05
Período 21 dias
Osso neoformado
20,39 ± 2,48 19,44± 7,09
p>0,05
17,10 ± 4,77 16,88 ± 8,62
p>0,05
Medula óssea
36,02 ± 9,22 19,35 ± 1,68
p<0,05
22,93 ± 10,40
15,07 ± 6,66
p>0,05
Necrose/Tecido Conjuntivo
18,52 ± 3,00 33,01 ± 5,96
p<0,05
26,99 ± 6,58 31,27 ± 4,99
p>0,05
Infiltrado inflamatório
6,81 ± 3,51 15,96 ± 4,46
p<0,05
19,17 ± 5,29 22,15 ± 6,96
p<0,05
Osso autógeno
18,26 ± 12,37
12,25 ± 4,75
p>0,05
13,81 ± 5,35 14,62 ± 5,55
p>0,05
As medidas histomorfométricas, comparando os grupos diabético-induzido e
controle, não apresentaram significância estatística para a quantidade de neoformação
óssea ao redor dos implantes de superfície lisa e tratada, avaliados durante os
períodos cicatriciais de 10 e 21 dias. Porém, em relação à quantidade de infiltrado
inflamatório, no período de 21 dias, o grupo diabético-induzido apresentou uma
quantidade significativamente maior em relação grupo controle ao redor dos implantes
de superfície lisa. Além disso, quando comparado ao grupo controle, a quantidade de
osso medular foi significativamente maior ao redor dos implantes tratados instalados
51
nos ratos diabéticos-induzidos, no período de 10 dias. Por isso, nessa mesma área,
houve uma maior neoformação óssea cortical para o grupo controle (12,87 ±
±±
± 3,51) em
relação ao grupo teste (6,22 ±
±±
± 4,95), mas sem significância estatística (Tabela 2).
Tabela 2 – Média e Desvio Padrão da porcentagem (%) das estruturas observadas entre o
tecido ósseo e o implante. Comparação entre diferentes condições (ratos
controles e diabéticos) para as superfícies lisa e tratada dos implantes
Liso Tratado
Parâmetros
Controle Experimental
Nível de
significância
(P)
Controle Experimental
Nível de
significância
(P)
Período 10 dias
Osso neoformado
23,74 ± 3,83 20,96 ± 7,92
p>0,05
12,87 ± 3,51 6,22 ± 4,95
p>0,05
Medula óssea
16,29 ± 4,91 17,68 ± 7,65
p>0,05
5,34 ± 1,02 15,58 ± 4,30
p<0,05
Necrose/Tecido Conjuntivo
28,52 ± 9,64 33,02 ± 4,64
p>0,05
30,58 ± 8,49 26,28 ± 2,67
p>0,05
Infiltrado inflamatório
14,54 ± 4,66 14,47 ± 11,24
p>0,05
31,47 ± 6,09 31,54 ± 8,57
p>0,05
Osso autógeno
16,90 ± 3,93 13,88 ± 4,74
p>0,05
21,74 ± 4,07 20,08 ± 10,56
p>0,05
Período 21 dias
Osso neoformado
20,39 ± 2,48 17,10 ± 4,77
p>0,05
19,44± 7,09 16,88 ± 8,62
p>0,05
Medula óssea
36,02 ± 9,22 22,93 ± 10,40
p>0,05
19,35 ± 1,68 15,07 ± 6,66
p>0,05
Necrose/Tecido Conjuntivo
18,52 ± 3,00 26,99 ± 6,58
p>0,05
33,01 ± 5,96 31,27 ± 4,99
p>0,05
Infiltrado inflamatório
6,81 ± 3,51 19,17 ± 5,29
p<0,05
15,96 ± 4,46 22,15 ± 6,96
p>0,05
Osso autógeno
18,26 ± 12,37
13,81 ± 5,35
p>0,05
12,25 ± 4,75 14,62 ± 5,55
p>0,05
4 DISCUSSÃO
Os sintomas de diabetes apresentados pelos ratos induzidos por
estreptozotocina são bem estabelecidos (Wong
25
, 1993). Neste estudo, os diabéticos
apresentaram uma perda de peso, enquanto que os ratos-controle continuaram
ganhando massa corporal ao longo do experimento, estando esses resultados de
acordo com outros trabalhos (Nevins et al.
17
, 1998; McCracken et al.
15
, 2000; Siqueira
et al.
22
, 2003; Kwon et al.
12
, 2005).
A indução de diabetes oferece um ambiente sistêmico adverso, caracterizado
por altos níveis de glicemia sanguínea. Com isso, há uma cicatrização prejudicada que
está associada com distúrbios microvasculares e celulares (Mealey & Moritz
14
, 2003).
Também, são notadas mudanças típicas na cicatrização óssea que incluem diminuição
da osteogênese, menor renovação celular, osso neoformado com baixa densidade
mineral e atraso no reparo das fraturas (Canalis
5
, 1980; Glajchen et al.
8
, 1988; Yano et
al.
24
, 1996; Fang
6
, 2006).
Este estudo relata os efeitos do diabetes experimental sobre a cicatrização
óssea ao redor de implantes de superfície lisa e tratada. Assim, foi possível notar que
ocorreu formação óssea para os grupos diabético e controle, nos períodos cicatriciais
52
de 10 e 21 dias. A análise histomorfométrica revelou diferenças na formação óssea
apenas entre as superfícies dos implantes. Assim, a quantidade de osso neoformado,
em 10 dias, foi significativamente maior ao redor dos implantes lisos tanto no grupo
controle quanto no diabético-induzido. Além disso, o infiltrado inflamatório esteve
sempre presente ao redor dos implantes tratados, tanto nos animais diabéticos quanto
nos controles. Assim, essa neoformação óssea desfavorável encontrada ao redor dos
implantes tratados pode ser justificada pela grande presença de inflamação, como
também, por terem sido instalados mais próximos à diáfise. Já no período de 21 dias,
ao redor dos implantes tratados, ocorreu uma necrose tecidual que lentamente foi
sendo substituída por tecido de granulação e, mais tardiamente por tecido ósseo, por
isso justifica o percentual de tecido ósseo ter sido similar para ambas as superfícies,
pois o tecido primário (imaturo) é mais trabeculado, menos organizado e mais
volumoso em relação aquele osso cortical maduro formado ao redor dos implantes
lisos em 21 dias.
Nesse estudo, apesar da quantidade de osso neoformado, ao redor dos
implantes, não diferir entre os grupos controle e diabético, foi possível notar que, aos
21 dias, a maturidade do tecido ósseo no grupo diabético-induzido era menor,
apresentando áreas de osso imaturo associado a um intenso infiltrado inflamatório e
tecido conjuntivo.
Assim, os altos níveis de infiltrado inflamatório encontrados, circundando os
implantes nos animais diabéticos, pode ser devido à resposta aumentada
monócito/macrófago, presente nos quadros diabéticos, a qual resulta em um dramático
aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral-
α (TNF-α). Dessa maneira, a formação de produtos finais da glicozilação do colágeno
(AGEs) tem um papel importante na regulação da linhagem de monócitos/macrófagos.
O acúmulo de AGEs estimula a migração de monócitos para o local e, uma vez estes
no tecido, os AGEs interagem com os seus respectivos receptores, na superfície das
células dos monócitos. Esta interação resulta na mobilização de monócitos até o local
da inflamação, o que induz uma mudança no fenótipo monocítico, um crescimento na
população celular e, consequentemente, um significativo aumento do infiltrado
inflamatório e da produção de citocinas, resultando em maior destruição tecidual
(Schmidt et al
20
, 1996).
Semelhantemente aos resultados encontrados nesse trabalho, em relação à
quantidade de osso neoformado não diferir entre os grupos controle e diabético e à
existência de diferenças no padrão de maturação ósseo; Nevins et al
17
. (1998) ao
induzirem diabetes em ratos, por meio de estreptozotocina, afirmaram que a
osseointegração se deu semelhantemente em ambos os grupos, entretanto, a análise
53
em microscopia de luz revelou diferenças no padrão de formação óssea, pois nos
ratos diabéticos, o osso neoformado parecia imaturo e desorganizado. Em trabalhos
utilizando marcadores de deposição óssea, com o objetivo de quantificar o osso
neoformado, ao redor de implantes instalados em ratos normais e diabéticos, também
se encontrou que a neoformação óssea junto ao implante não mostrou diferença
estatística entre os dois grupos. Entretanto, essa mostrou-se significativa quando
avaliado o canal medular (Iyama et al
10
.1997; Ottoni & Chopard
19
2004).
Siqueira et
al
22
(2003), com o objetivo de investigar o curso histológico e as mudanças ultra-
estruturais no processo de osseointegração, instalaram implantes em ratos diabético-
induzidos, não-diabéticos e tratados com insulina. Os animais foram sacrificados em
10 e 21 dias após a cirurgia. Os ratos diabético-induzidos exibiram uma redução de
50% na área óssea formada, após 21 dias à instalação, observando também um
atraso no processo de neoformação óssea. Porém, não houve diferenças estatísticas
entre os grupos, quando avaliados 10 dias após a cirurgia, sendo esses resultados
muito semelhantes aos encontrados neste estudo. De maneira contrária às
observações aqui feitas, em relação à ausência de diferenças na quantidade de osso
neoformado, em um trabalho recente, encontrou-se que a quantidade de osso formado
adjacente aos implantes, foi significativamente maior nos ratos diabéticos que nos
animais controle. Uma das justificativas para esse achado foi que, devido às
anormalidades cicatriciais relacionadas ao diabetes, houve um atraso na remodelação
e maturação do osso adjacente ao implante, assim, os animais diabéticos
apresentariam maior volume ósseo associado aos implantes devido à cicatrização
comprometida, uma vez que a atividade osteoclástica e a diferenciação osteoblástica
estão inibidas (McCracken et al
16
, 2006).
Portanto, a maioria das investigações indicam que um nível elevado de glicose,
devido à ausência de insulina, apresenta um efeito negativo no processo de
maturação óssea. Como já visto, a insulina é um hormônio fundamental não somente
para o controle da glicose, mas também para o crescimento esqueletal, pois atua
direta ou indiretamente na síntese de matriz óssea e no metabolismo ósseo.
Diretamente, estimula a síntese de matriz osteoblástica e, indiretamente, induz a
produção de IGF-I pelo organismo. (Canalis
5
, 1980). No entanto, as diferenças no
padrão de formação óssea neste estudo e naqueles envolvendo diabetes não-
controlada, também podem resultar da interação de produtos finais da glicozilação do
colágeno (AGEs) com a superfície do implante. Talvez, a presença de AGEs no tecido
ósseo produza um ambiente menos favorável para a regeneração óssea. Essas
moléculas podem inibir, competitivamente, a adesão das proteínas formadoras de
54
osso à superfície dos implantes, bloqueando o início normal da osteogênese,
causando um atraso na maturação tecidual (Fiorellini et al
7
.,1999).
5 CONCLUSÃO
Apesar não ter sido encontrada diferença na quantidade de osso neoformado
entre os ratos diabético-induzidos e controles, foi possível observar, para o período
cicatricial de 21 dias, que o tecido ósseo neoformado apresentou-se mais imaturo em
relação àquele de aspecto maduro formado nos animais controle. Assim, podemos
concluir que, esse atraso na maturação do tecido se deu, provavelmente, devido ao
diabetes-induzido e suas implicações no metabolismo ósseo, mas que parecem não
se constituir numa contra-indicação definitiva para a implantodontia. Além disso, os
implantes de superfície lisa, também na presença de diabetes, foram melhores
indutores de neoformação óssea.
55
REFERÊNCIAS
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58
ARTIGO EM INGLÊS
Assessment of bone neoformation around titanium implants
inserted in diabetic rats
Running Title: Implants in diabetic rats
Gabriela Gennaro
1
Gerson Francisco de Assis
2
Tânia Mary Cestari
3
Rubens Rodrigues Filho
4
1. PhD Student, Department of Estomatology, School of Dentistry, Federal
University Santa Catarina, Florianópolis, Brazil.
2. Associate Professor, Department of Biologic Sciences, Bauru Dental School,
University of São Paulo, Bauru, Brazil.
3. PhD Student, Department of Biologic Science, Bauru Dental School, University
of São Paulo, Bauru, Brazil.
4. Associate Professor, Department of Estomatology, School of Dentistry,
Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, Brazil.
Corresponding author:
Rubens Rodrigues Filho
Department of Estomatology
Health Sciences Center
School of Dentistry, Federal University of Santa Catarina - UFSC
Trindade, Florianópolis, Santa Catarina, Brazil, CEP: 88040-970
Tel: 55 (48) 3721 9520
Fax: 55 (48) 37219542
Email:
rubens_ccs@yahoo.com.br
59
Assessment of bone neoformation around titanium implants
inserted in diabetic rats
Key Words: dental implant; diabetes mellitus; osteogenisis; bone quantity
ABSTRACT
Objectives: This study aimed at comparing bone formation around implants
with smooth and treated surface, inserted in induced diabetic rats and in non-diabetic
rats, investigating whether there are differences in bone formation between both
metabolic conditions, improvement in osteogenesis pattern between different surfaces
and their relation with diabetes. Materials and method: Titanium implants (smooth
and treated surface) were inserted in male Wistar rats, which were divided into two
groups: streptozotocin-induced diabetic rats (experimental group) and non-diabetic rats
(control group). Histomorphologic and histomorphometric analyses of bone block were
performed at 10 and 21 days of healing. Results were analyzed by two-way ANOVA,
followed by Bonferroni’s test. Results: The percentage of bone neoformation around
implants of smooth and treated surface did not have statistical significance after
comparison between diabetic and control groups. However, at 21 days, the bone was
more immature in diabetic rats in relation to that with a mature aspect formed in control
animals. When different surfaces were compared (smooth and treated), at 10 days the
smooth surface apparently favored better formation of cortical and cancellous bone
around the implants. On the other hand, at 21 days there was no difference in bone
neoformation between both surfaces.
Conclusion: The present data suggest that
delay in bone tissue maturation was probably a result of induced diabetes and its
implications in bone metabolism. In addition, smooth surface implants, also in
association with diabetes, seem to be better inducers of bone neoformation.
60
INTRODUCTION
Diabetes, classified into type I and II, is associated with many complications that
increase morbidity and mortality in affected individuals. Such complications result from
an abnormal regulation of glucose metabolism, due to absence or reduction in insulin
production or resistance to it (Oliver & Ternovem 1994).
There are many changes in bone metabolism associated with diabetes that can
consequently affect the process of osseointegration of dental implants. Insulin acts
directly or indirectly in the synthesis of bone matrix and in bone metabolism. It directly
stimulates synthesis of osteoblastic matrix, and indirectly induces production of insulin
growth factor (IGF-I) by the organism. IGF-I regulates synthesis of bone matrix by two
mechanisms: it increases the number of osteoblasts and controls function of
osteoblastic differentiation (Canalis 1980). In vitro experiments indicate that topic
application of insulin stimulates the process of intramembranous ossification in
fractures (Yano et al.1996), besides increasing osteoid area, number and survival of
osteoblasts, reducing their level of apoptosis. Also, another in vitro study verified that
hyperglycemia increased proliferation and inhibited mineralization of cultivated
osteoblasts, whereas IGF-I reverted that condition (Fang et al. 2006).
Studies in which implants were inserted in tibias of streptozotocin-induced
diabetic rats and markers of bone deposition were used showed that implant surface
was completely adapted to the cortical bone, both in control and diabetic animals, and
there was no statistical difference between groups. However, when the cancellous
bone was analyzed, it was observed that the percentage of bone tissue in contact with
the implant and thickness of neoformed tissue were higher in control rats than in
diabetic rats, which corresponds to a percentage of osseointegration lower in the latter
group in relation to the former (Takeshita et al.
1997; Iyama et al. 1997; Ottoni &
Chopard
2004).
Based on the results obtained in several studies that found reduced bone-
implant contact in the presence of diabetes, Shyng et al. 2006, tested the hypothesis
that such lower osseointegration could be due to reduction in rate of mineral
deposition. Thus, implants were installed in alveoli of rats immediately after molar
extraction and it was observed that there was a significant reduction in mineral
apposition rate in the test group, suggesting impaired osteoblastic function of deficient
mineralization. Extrapolating to a clinical situation, the authors suggested that implant
insertion immediately after extraction can be contraindicated in patients with poorly
controlled blood glucose.
61
As an attempt to favor osteogenesis, especially in patients who have
unfavorable systemic conditions, superficial topography of implants has been changed,
so that it has a larger surface energy, favoring clot adhesion, organization and
maturation, as well as further deposition of bone matrix. Thus, there is an increase in
anchoring capacity of bone-biomaterial interface in the short-, medium- and long-term
(Albrektsson & Wennerberg 2004; Lemons 2004).
According to these principles, some authors suggest use of treated surface
implants for several purposes, including ability to improve load distribution, as well as
increase biocompatibility and properties of bone conductivity, aiming to facilitate
osseointegration and its time (Albrektsson & Wennerberg 2004b; Buser et al. 2004;
Butz et al. 2006).
This study aimed at comparing bone formation around implants with smooth
and treated surface, inserted in induced diabetic rats and in non-diabetic rats,
investigating whether there are differences in bone formation between both metabolic
conditions, improvement in osteogenesis pattern between different surfaces and their
relation with diabetes.
MATERIALS AND METHOD
The procedures performed in this experiment were approved by the Animal
Ethics Committee (CEUA) at Federal University of Santa Catarina, by protocol
PP00094.
Animals
Twenty male Wistar rats were used, aged approximately 3 months and mean
weight of 350 g, maintained at controlled temperature (22 ± 2ºC), 12:12-h light-dark
cycle and free access to water and food. The animals were divided into two groups:
test (10 induced diabetic rats) and control (10 non-diabetic rats).
Induction of diabetes
Diabetes mellitus was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin
(Streptozocin Sigma-Aldrich) at a dosage of 70 mg/kg of body weight. Diabetic animal
were those whose blood glucose was above 200 mg/dL of blood and the
hyperglycemic status was verified weekly throughout the whole experiment. Blood
samples were collected by puncture at tail end and measured by the glucose-oxidase
method using a digital glucometer (Accu-Chek Active, Roche, Germany).
62
Surgical protocol for implant insertion
All surgical procedures were performed using aseptic techniques, under deep
anesthesia, induced by intraperitoneal injection of 7% solution of chloral hydrate (0.6
mL/100 g of body weight). Next, two implants were inserted in the femur of each animal
(2 mm in diameter by 4 mm in height - Systhex, Brazil), with an approximate distance
of 5 mm between them. Implant of smooth surface was inserted close to the diaphysis
and treated implant (acid-etched surface) closer to the epiphysis.
In the immediate postoperative period, 0.06 mL/Kg of benzathine
benzylpenicillin (Benzetacil 1.200.
000 IU, Eurofarma Laboratórios Ltda.) was
administered
at a single intramuscular dose and 10 mg/Kg paracetamol was used as
analgesic (Paracetamol, Eurofarma Laboratórios Ltda.) in drops diluted in consumption
water for three consecutive days, changed daily.
Each group (control and test) was subdivided into two other groups: a) 5
animals monitored for 10 days and b) 5 animals monitored for 21 days. Thus, at 10 or
21 days after the surgery, the rats were sacrificed by inhalation of carbon dioxide. Bone
blocks containing the implants were removed and fixed in 10% formaldehyde.
Histological processing
Firstly, all 20 samples were demineralized in Morse solution (50% formic acid +
20% sodium citrate, at a proportion of 1:1) for 15 days and radiographically controlled.
After demineralization, the implants were removed and bathed in alcohol and xylol
solutions and included in paraffin. The samples were cut at a thickness of 5 µm and
stained with hematoxylin and eosin (HE).
Histomorphometric analysis
One blade for each animal was selected, which had its most central section
analyzed. Histomorphometric analysis of the blades was performed at an optical
microscope attached to a system of image capture and analysis (KS300). Thus, each
lateral of different implants was analyzed, establishing fields based on regions in
which the screw threads of removed implants were located. Therefore, having the
image projected in the computer screen, an area in each screw thread was
determined. In that region, amounts of neoformed bone (NB), connective tissue (CT),
inflammatory infiltrate (II), preexisting autogenous bone (AB) and bone marrow (BM)
were analyzed.
63
Statistical Analysis
Two-way ANOVA, complemented by Bonferroni's test for multiple comparisons
was used for statistical analysis of differences between surfaces (smooth and treated)
and conditions (diabetic and non-diabetic). P < 0.05 was set as significance level.
RESULTS
Diabetic status (blood glucose above 200 mg/dL) was predictably induced and
maintained over healing periods. In diabetic groups at 10 and 21 days, mean blood
glucose was 456 ± 128 and 496 ± 174, respectively, whereas in control groups (non-
diabetic) means were 111 ± 29 and 103 ± 12, respectively (Figure 1).
Figure 1 – Glycemic index of induced diabetic rats (n=5) and controls, in different experimental times
As expected, non-diabetic rats had an increase in body mass of approximately
5% at 10 and 21 days. On the other hand, diabetic rats had a 17% weight loss for the
group of 10 days of postsurgical healing and 13% for the group of 21 days (Figure 2).
Figure 2 – Body mass of assessed animals (n=5) in relation to experimental time
0
100
200
300
400
500
600
10 days
pre-induction
post-induction
control group
21 days
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
10 days
control
diabetic
21 days
64
Histomorphology
When induced diabetic rats were compared to non-diabetic rats, at the initial 10-
day period, both apparently had the same histomorphologic status, around implants of
smooth and treated surface (Figures 3 and 4). However, when analyzed at healing
time of 21 days, the amount of neoformed bone tissue was similar, but in the induced
diabetic group, that bone was more immature in relation to that of a mature aspect
formed in control animals; thus there were areas of immature bone tissue associated
with inflammatory infiltrate and connective tissue (Figures 5 and 6).
When different surfaces were compared (smooth and treated), at 10 days the
smooth surface apparently favored better formation of cortical and cancellous bone
around the implants (Figures 3 and 4). On the other hand, at 21 days there was no
difference in bone neoformation between both surfaces.
However, around treated implants there was tissue necrosis that was slowly
being replaced by granulation tissue and, later, by bone tissue, which favored higher
interposition of connective tissue between bone and implant and lower bone
neoformation close to the screw thread. In addition, an amount of inflammatory infiltrate
was always present around treated surface implants (Figures 5 and 6).
65
Figure 3
- Photomicrography of the femur region in the control group (10 days)
Smooth surface: a) panoramic view showing cortical facing the implant head (C1),
connective tissue and rests of autogenous bone in the mesial region (M) and bone tissue in
the distal region (D); b) detail of neoformed bone tissue (ON), located close to the surface of
implant screw thread (white arrow), and bone marrow (MO) between trabecules.
Treated surface: c) panoramic view showing cortical facing the implant head (C1) and
presence of autogenous bone and necrosed tissue both in the mesial (M) and distal surface
(D); and d) detail of necrosed tissue (TN), close to the surface of implant screw thread and
fragments of autogenous bone (blue arrow).
HE, magnification 4X / 40X.
66
Figure 4
- Photomicrography of the femur region in the experimental group (10 days)
Smooth surface: a) panoramic view showing cortical facing the implant head (C1),
mixture of connective tissue, inflammatory infiltrate and neoformed bone tissue in the
distal region (D) and bone tissue in the mesial region (M);
b) detail of trabecular
neoformed bone tissue (ON), located close to the surface of implant screw thread (white
arrow), and bone marrow (MO) between trabecules.
Treated surface: c) Panoramic view showing cortical facing the implant head (C1) and
presence of autogenous bone and necrosed tissue both in the mesial (M) and distal
surface (D), but with small bone neoformation in the distal region close to the cortical (C2);
d) detail of connective tissue located close to the surface of implant screw thread (white
arrow), bone tissue (ON) and fragments of autogenous bone (blue arrow). HE,
magnification 4X / 40X.
67
Figure 5
- Photomicrography of the femur region in the control group (21 days)
Smooth surface:
a) Panoramic view showing cortical facing the implant head (C1), cortical
and cancellous bone tissue in the mesial (M) and distal region (D);
b) detail of the surface
(white arrow) close to the implant showing more mature neoformed bone tissue (ON), with
some fragments of autogenous bone (blue arrow) fixed inside it and the bone marrow (MO);
Treated surface:
c) Panoramic view showing cortical facing the implant head (C1),
prevalence of connective tissue in the mesial region (M) and presence of bone tissue in the
distal region (D)m, close to the implant screw thread surface;
b) detail of more mature
neoformed bone tissue (ON), with some fragments of autogenous bone (blue arrow) fixed
inside it, bone marrow (MO) and thin layer of connective tissue (white arrow) interposed
between the implant and the neoformed bone tissue.
HE, magnification 4X / 40X.
68
Figure 6
- Photomicrography of the femur region in the experimental group (21 days)
Smooth surface: a) Panoramic view showing presence of connective tissue, rests of
autogenous bone and inflammatory infiltrate in the middle of the mesial (M) and distal
surface (D), close to the cortical facing the implant head (C1) and bone and marrow
neoformation close to the apical cortical (C2); b) detail of neoformed bone tissue (ON), bone
marrow (MO) and thin capsule of connective tissue (white arrow) interposed between the
implant and the neoformed bone tissue.
Treated surface: c) panoramic view showing presence of thick capsule of connective tissue
covering the whole mesial (M) and distal (D) surface facing the implant, reabsorption of
cortical C1 and neoformed bone tissue close to the apical cortical (C2); d) detail of
neoformed bone tissue (ON) and thick capsule of connective tissue (TC) interposed between
the implant and the neoformed bone tissue.
HE, magnification 4X / 40X.
69
Histomorphometry
When comparing smooth and treated surfaces of the implants in each groups
individually, we observed that 10 days after insertion of implants there was higher bone
neoformation around smooth surfaces in both groups (control and induced diabetic);
the amount of formed cancellous bone was significantly higher only in the control
group. In the period of 21 days, bone neoformation around different types of surface
was not statistically significant. However, smooth surface favored formation of
cancellous bone, especially in the control group. In relation to presence of inflammatory
infiltrate, there was a significantly higher amount around treated surface implants
inserted in both groups and assessed during both times (Table 3).
Table 1 – Mean and Standard Deviation of percentage (%) of the structures observed between
bone tissue and implant.
Comparison between different implant surfaces in control
and diabetic rats
Control group Experimental Group
Parameters
Smooth Treated
Significance
level (P)
Smooth Treated
Significance
level (P)
10-day period
Neoformed bone
23.74 ± 3.83 12.87 ± 3.51
p<0.05
20.96 ± 7.92 6.22 ± 4.95
p<0.05
Bone marrow
16.29 ± 4.91 5.34 ± 1.02
p<0.05
17.68 ± 7.65 15.58 ± 4.30
p>0.05
Necrosis/Connective
Tissue
28.52 ± 9.64 30.58 ± 8.49
p>0.05
33.02 ± 4.64 26.28 ± 2.67
p>0.05
Inflammatory infiltrate
14.54 ± 4.66 31.47 ± 6.09
p<0.05
14.47 ± 11.24
31.54 ± 8.57
p<0.05
Autogenous bone
16.90 ± 3.93 21.74 ± 4.07
p>0.05
13.88 ± 4.74 20.08 ± 10.56
p>0.05
21-day period
Neoformed bone
20.39 ± 2.48 19.44± 7.09
p>0.05
17.10 ± 4.77 16.88 ± 8.62
p>0.05
Bone marrow
36.02 ± 9.22 19.35 ± 1.68
p<0.05
22.93 ± 10.40
15.07 ± 6.66
p>0.05
Necrosis/Connective Tissue
18.52 ± 3.00 33.01 ± 5.96
p<0.05
26.99 ± 6.58 31.27 ± 4.99
p>0.05
Inflammatory infiltrate
6.81 ± 3.51 15.96 ± 4.46
p<0.05
19.17 ± 5.29 22.15 ± 6.96
p<0.05
Autogenous bone
18.26 ± 12.37
12.25 ± 4.75
p>0.05
13.81 ± 5.35 14.62 ± 5.55
p>0.05
Histomorphometric measures, when induced diabetic and control groups were
compared, were not statistically significant for the amount of bone neoformation around
implants of smooth and treated surface, assessed at healing periods of 10 and 21
days. However, as to amount of inflammatory infiltrate at 21 days, the induced diabetic
group had a significantly higher amount in relation to the control group around smooth
surface implants. Furthermore, when compared to the control group, amount of
cancellous bone was significantly higher around treated surface implants inserted in
induced diabetic rats at 10 days. For that reason, in the same area there was higher
cortical bone neoformation for the control group (12.87 ±
±±
± 3.51) in relation to the test
group (6.22 ±
±±
± 4.95), but without statistical significance (Table 2).
70
Table 2 – Mean and Standard Deviation of percentage (%) of the structures observed between
bone tissue and implant.
Comparison between different conditions (control and
diabetic rats) for smooth and treated implant surfaces
Smooth Treated
Parameters
Control Experimental
Significance
level (P)
Control Experimental
Significance
level (P)
10-day period
Neoformed bone
23.74 ± 3.83 20.96 ± 7.92
p>0.05
12.87 ± 3.51 6.22 ± 4.95
p>0.05
Bone marrow
16.29 ± 4.91 17.68 ± 7.65
p>0.05
5.34 ± 1.02 15.58 ± 4.30
p<0.05
Necrosis/Connective Tissue
28.52 ± 9.64 33.02 ± 4.64
p>0.05
30.58 ± 8.49 26.28 ± 2.67
p>0.05
Inflammatory infiltrate
14.54 ± 4.66 14.47 ± 11.24
p>0.05
31.47 ± 6.09 31.54 ± 8.57
p>0.05
Autogenous bone
16.90 ± 3.93 13.88 ± 4.74
p>0.05
21.74 ± 4.07 20.08 ± 10.56
p>0.05
21-day period
Neoformed bone
20.39 ± 2.48 17.10 ± 4.77
p>0.05
19.44± 7.09 16.88 ± 8.62
p>0.05
Bone marrow
36.02 ± 9.22 22.93 ± 10.40
p>0.05
19.35 ± 1.68 15.07 ± 6.66
p>0.05
Necrosis/Connective Tissue
18.52 ± 3.00 26.99 ± 6.58
p>0.05
33.01 ± 5.96 31.27 ± 4.99
p>0.05
Inflammatory infiltrate
6.81 ± 3.51 19.17 ± 5.29
p<0.05
15.96 ± 4.46 22.15 ± 6.96
p>0.05
Autogenous bone
18.26 ±
12.37
13.81 ± 5.35
p>0.05
12.25 ± 4.75 14.62 ± 5.55
p>0.05
DISCUSSION
Diabetic symptoms presented by streptozotocin-induced rats are well
established (Wong 1993). In this study, diabetic rats had weight loss, whereas control
rats kept gaining body mass during the experiment. These results are in accordance
with other studies (Nevins et al.1998; McCracken et al.2000; Siqueira et al. 2003; Kwon
et al. 2005).
Induction of diabetes offers an adverse systemic environment, characterized by
high levels of blood glucose. That results in impaired healing that is associated with
microvascular and cellular disorders (Mealey & Moritz 2003). Also, there are typical
changes in bone healing, including reduction in osteogenesis, less cell renewal,
neoformed bone with low mineral density and delay in healing of fractures (Canalis
1980; Glajchen et al. 1988; Yano et al. 1996; Fang 2006).
This study reports the effects of experimental diabetes on bone healing around
smooth and treated surface implants. Thus, it was possible to observe that there was
bone formation for both diabetic and control groups at healing periods of 10 and 21
days. Histomorphometric analysis showed differences in bone formation only between
implant surfaces. Thus, the amount of neoformed bone at 10 days was significantly
higher around smooth implants both in the control and induced diabetic group. In
addition, inflammatory infiltrate was always present around treated implants, both in
diabetic and in control animals. Therefore, such unfavorable bone neoformation found
71
around treated implants can be justified by large presence of inflammation, as well as
for being inserted closer to the diaphysis. At 21 days, there was tissue necrosis around
treated implants, which was slowly being replaced by granulation tissue and, later, by
bone tissue. This justifies the similar percentage of bone tissue for both surfaces, since
the primary tissue (immature) is more trabecular, less organized and more voluminous
in relation to the mature cortical bone formed around smooth implants at 21 days.
In this study, despite the amount of neoformed bone around the implants not
being different between control and diabetic groups, it was possible to observe that, at
21 days, maturity of bone tissue in the induced diabetic group was lower, presenting
areas of immature bone associated with an intense inflammatory infiltrate and
connective tissue.
Thus, high levels of inflammatory infiltrate surrounding implants in diabetic
animals found in this study can be due to increased monocyte/macrophage response,
present in diabetic cases, which results in a dramatic increase in production of pro-
inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor-α (TNF-α). Therefore, formation
of collagen glycosylation endproducts (AGEs) plays a major role in the regulation of
monocyte/macrophage lineage. Accumulation of AGEs stimulates migration of
monocytes for the site and, once they reach the tissue, AGEs interact with their
respective receptors in the surface of monocyte cells. That interaction results in
mobilization of monocytes until the inflammation site, which induces change in
monocytic phenotype, growth in cellular population and consequently significant
increase in inflammatory infiltrate and in production of cytokines, resulting in more
tissue destruction (Schmidt et al.1996).
Similarly to the results found in this study in relation to amount of neoformed
bone not being different between control and diabetic groups and to existence of
differences in bone maturation pattern, Nevins et al. 1998 by inducing diabetes in rats
using streptozotocin, claimed that osseointegration occurred similarly in both groups;
however, analysis by light microscopy revealed differences in bone formation pattern,
since in diabetic rats the neoformed bone seemed immature and disorganized.
In studies using markers of bone deposition, with the aim of quantifying
neoformed bone around implants inserted in normal and diabetic rats, bone
neoformation around the implant did not show statistical difference between both
groups. However, it was significant when the spinal canal was assessed (Iyama et al.
1997; Ottoni & Chopard 2004).
Siqueira et al 2003, aiming to investigate the
histological course and ultra-structural changes in the process of osseointegration,
inserted implants in induced diabetic, non-diabetic and insulin-treated rats.
72
The animals were sacrificed at 10 and 21 days after the surgery. Induced
diabetic rats showed a 50% reduction in formed bone area 21 days after implant
insertion, with delay in the process of bone neoformation. However, there were no
statistical differences between groups when assessed 10 days after the surgery. These
results are very similar to those found in our study. Opposed to our observations in
relation to absence of differences in amount of neoformed bone, a recent study found
that the amount of neoformed bone adjacent to implants was significantly higher in
diabetic rats than in control animals.
One of the justifications for that finding was that, due to healing abnormalities
associated with diabetes, there was a delay in remodeling and maturation of the bone
adjacent to the implant, therefore diabetic animals had higher bone volume associated
with implants due to impaired healing, since osteoclastic activity and osteoblastic
differentiation are inhibited (McCracken et al. 2006).
Therefore, most investigations indicate that a high level of glucose, due to
insulin absence, has a negative effect on the process of bone maturation. It is known
that insulin is a hormone essential not only for glucose control, but also for skeletal
growth, since it acts directly or indirectly on the synthesis of bone matrix and on bone
metabolism. It directly stimulates synthesis of osteoblastic matrix, and indirectly
induces production of IGF-I by the organism (Canalis 1980). However, differences in
bone formation pattern in this study and in those involving non-controlled diabetes can
also result from interaction of endproducts of collagen glycosylation (AGEs) with
implant surface.
Perhaps the presence of AGEs in the bone tissue produces a less favorable
environment for bone regeneration. These molecules can competitively inhibit adhesion
of bone-forming proteins to implant surface, blocking normal start of osteogenesis and
causing a delay in tissue maturation (Fiorellini et al.1999).
CONCLUSION
Despite not having any difference in amount of neoformed bone between
induced diabetic rats and controls, it was possible to observe, for the healing period of
21 days, that the neoformed bone tissue was more immature in relation to that of a
mature aspect formed in control animals. Thus, we can conclude that such delay in
tissue maturation was probably due to induced diabetes and its implications in bone
metabolism, but this does not seem to represent a definite contraindication to oral
implantology. In addition, smooth surface implants, also in association with diabetes,
were better inducers of bone neoformation.
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