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Julia Sumiko Hirasawa
Avaliação da metanogênese e sulfetogênese na presença
de oxigênio, sob diferentes relações etanol/sulfato,
utilizando técnicas de Biologia molecular
Tese apresentada à Escola de
Engenharia de São Carlos, da
Universidade de São Paulo, como parte
dos requisitos para a obtenção do Título
de Doutor em Hidráulica e Saneamento.
Orientadora: Prof
a.
Dr
a.
Maria Bernadete Amâncio Varesche
São Carlos
2007
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Milhares de livros grátis para download.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
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Às novas gerações:
Ana Paula
André
João Gabriel
Marcelo
Vítor
Agradecimentos
À Profa. Dra. Maria Bernadete, pela amizade, orientação e confiança na realização deste
trabalho.
Ao Pós-Doutorando Arnaldo Sarti (LPB-SHS-EESC), pela amizade, paciência e
constante auxílio nesta pesquisa.
Aos Doutores Neyson Martins Mendonça, Andréa Paula Buzzini, Luana Maria Marelli
e Cristina Yuriko Iamamoto pelas sugestões e auxílio no início desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Cristiano dos Santos Neto e Profa. Dra. Odete Rocha (DEBE-UFSCar)
pelo constante incentivo.
Ao Prof. Dr. Edson Luiz Silva (Tininho) (DEQ-UFSCar) pelas sugestões e ajuste no
reator UASB.
À Janja, Beth e Eloisa, pela amizade, descontração e auxílio no Laboratório de
Processos Biológicos (LPB).
À Pós-Doutoranda Katia Saavedra, pelas análises de PCR/DGGE e seqüenciamento dos
microrganismos.
À Sá, Pavi e Rose (Secretaria do PPG-SHS), pelas informações, atenção e disposição.
Aos amigos e colegas-pesquisadores do LPB-SHS; em especial, às minhas turmas de
Mestrado 2001 e Doutorado 2003.
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pela bolsa de
estudos e auxílio financeiro através do Projeto Temático “Desenvolvimento, Análise,
Aprimoramento e otimização de Reatores Anaeróbios para Tratamento de Águas
Residuárias”.
À minha família, pelo constante apoio.
“Na natureza nada se cria,
nada se perde,
tudo se transforma”
Lavoisier
Pavão em origami (23x30x10 cm) constituído de 1200 retângulos dobrados
em papel de revista e sulfite. Da Exposição Reciclando Arte, na Biblioteca
Comunitária (BCo) da UFSCar, de 20 de novembro a 15 de dezembro de
2000; e, na IX Semana do Livro e da Biblioteca, na Biblioteca Central da
EESC-USP, de 16 a 27 de outubro 2006. (Julia SH)
Resumo
HIRASAWA, J. S. (2007) Avaliação da metanogênese e sulfetogênese na presença
de oxigênio, sob diferentes relações etanol/sulfato, utilizando técnicas de Biologia
Molecular. Tese (Doutorado) – Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de
São Paulo, São Carlos.
Neste trabalho foi realizada a caracterização microbiana, por meio de técnicas de
Biologia Molecular, do lodo granulado de reator anaeróbio de fluxo ascendente e manta
de lodo (UASB – Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor) operado sob condições
mesofílicas (30±2
o
C) e sulfetogênicas, com tempo de detenção hidráulica (TDH) de 12
h, na presença de 3,0±0,7 mg/L de oxigênio dissolvido. Essa caracterização foi realizada
no lodo granulado proveniente da manta inferior (P1) e superior (P2) do UASB. O
reator UASB de 10,5 L foi alimentado com meio basal Zinder acrescido de solução de
vitaminas, metais traços e bicarbonato de sódio (10%). O meio foi preparado
diariamente com água de abastecimento público, pH 7-8. Etanol e sulfato de sódio
foram utilizados como fonte orgânica e de enxofre, respectivamente. Nestas condições,
foram estudadas três diferentes relações de demanda química de oxigênio
(DQO)/sulfato (3,0, 1,6 e 2,0). A análise de hibridação in situ fluorescente (FISH)
demonstrou que houve predomínio de arquéias metanogênicas, detectadas com a sonda
ARC915, em todas as condições operacionais, com médias iguais a 75,9, 77,1 e 85,4%
em P1 e 78,6, 73,4 e 83,1% em P2, respectivamente. Methanosaeta sp. foi a arquéia
metanogênica acetoclástica predominante confirmada também por seqüenciamento da
banda recortada do gel de DGGE (eletroforese em gel de cadeia desnaturante), com
similaridade de 96%. As bactérias (sonda EUB338) variaram de 9,6 a 36,2% e de 15,5 a
37,4% em P1 e P2, respectivamente. As bactérias redutoras de sulfato (BRS), detectadas
com a sonda SRB385, variaram de 7,9 a 10,8% e de 8,7 a 19,8% em P1 e P2,
respectivamente. Outros microrganismos identificados foram Shewanella sp. e
Desulfitobacterium hafniense Y51, e a bactéria redutora de sulfato Desulfovibrio
vulgaris subsp. vulgaris DP4. A distribuição do tamanho dos grânulos não sofreu
mudança significativa no decorrer dos ensaios. Grânulos de 2 a 3 mm, que geralmente
representam biomassa ativa no reator, contou com média de 76% do total quantificado;
enquanto, grânulos de 1 a 2 mm, os quais sugerem que novos grânulos estavam sendo
formados representaram 17% no reator UASB. As concentrações médias de metano e
sulfeto no biogás foram iguais a 33 e 1,5 μmol/ mL, respectivamente. Os resultados
obtidos neste trabalho demonstraram que a presença de oxigênio, na concentração
aplicada, não afetou severamente o metabolismo dos microrganismos comumente
considerados estritamente anaeróbios. Esse fato foi evidenciado também pelo valor do
potencial redox obtido que se manteve aproximadamente constante em -208 mV,
mesmo na presença de oxigênio. As eficiências de remoção de matéria orgânica (DQO)
e redução de sulfato também alcançaram resultados favoráveis, com médias superiores a
74%.
Palavras-chaves: oxigênio, FISH, PCR/DGGE, BRS, Methanosaeta sp., UASB
Abstract
HIRASAWA, J. S. (2007) Evaluation of methanogenesis and sulfidogenesis in
presence of oxygen under different ethanol/sulfate ratios using Molecular Biology
techniques. Ph.D. Thesis – Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São
Paulo, São Carlos.
A microbial characterization of granular sludge from an upflow anaerobic sludge
blanket reactor (UASB) was carried out by Molecular Biology techniques. The reactor
with 10,5 L of volume was operated with hydraulic retention time (HRT) of 12 h under
mesophilic (30±2
o
C) and sulfidogenic conditions, in the presence of 3.0±0.7 mg O
2
.l
-1
.
The granular sludge samples were withdrawn from the bottom (P1) and upper (P2) parts
of the reactor. The synthetic substrate used in the reactor feeding was composed by
Zinder basal medium in addition with a solution of vitamins, trace metal and sodium
bicarbonate (10%). The Zinder basal medium was prepared daily with tap water with
pH value varying from 7 to 8. Concentrations of ethanol and sodium sulfate were
applied as organic and sulfur sources, respectively. Three different COD/sulfate ratios
(3,0, 1,6 and 2,0) were evaluated in these conditions. The fluorescent in situ
hibridization (FISH) analysis demonstrated the predominance of methanogenic archaea,
detected by ARC915 specific probe, in all the operational conditions, with mean values
of 75.9%, 77.1% and 85.4% in P1 and 78.6%, 73.4% and 83.1% in P2. The sequencing
of the excised band of DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) showed
similarity of 96% with the acetoclastic archaea Methanosaeta sp. The bacterial
community (EUB338 probe) varied from 9.6% to 36.2% in P1 and from 15.5% to
37.4% in P2. Sulfate-reducing bacteria (SRB), detected by SRB385 probe, varied from
7.9% to 10.8% and from 8.7% to 19.8% in P1 and P2, respectively. Other identified
microorganisms were Shewanella sp. and Desulfitobacterium hafniense Y51 bacteria,
and the sulfate-reducing Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris DP4. Granule-size
distribution did not significantly change during the assays. Granules of size varying
from 2 mm to 3 mm, that generally represent the active biomass inside the reactor,
accounted for 76% of the total quantified percentage; while, granules of size varying
from 1 mm to 2 mm, that suggest the formation of new granules in the reactor,
presented mean percentage of 17% of the total. The mean produced concentrations of
methane and sulfide in the reactor were equal to 33 μmol.ml
-1
and 1.5 μmol.ml
-1
of
biogas, respectively. The obtained results indicated that the applied oxygen
concentration did not severely affect the metabolism of the strictly anaerobic
microorganisms. This fact was evidenced by the obtained result of the oxidation-
reduction potential that remained equal to -208 mV, even in the presence of oxygen.
The mean removal efficiencies of organic matter (COD) and sulfate also achieved
favourable results with values higher than 74%.
Keywords: oxygen, FISH, PCR/DGGE, SRB, Methanosaeta sp., UASB
Sumário
Índice de Figuras..........................................................................................................................i
Índice de Tabelas .......................................................................................................................iv
Índice de Abreviaturas e Símbolos ............................................................................................vi
1. Introdução ...............................................................................................................................1
2. Objetivos.................................................................................................................................3
2.1 Objetivo principal .................................................................................................................3
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................................3
3. Revisão Bibliográfica .............................................................................................................4
3.1 Mecanismos de defesa de microrganismos anaeróbios à presença de oxigênio...................4
3.2 Influência do oxigênio na metanogênese e sulfetogênese ..................................................10
3.3 Relação DQO/sulfato..........................................................................................................20
3.4 Aplicação de técnicas moleculares na avaliação da comunidade microbiana....................23
4. Material e Métodos ...............................................................................................................32
4.1 Instalação experimental ......................................................................................................34
4.2 Sistema de injeção de oxigênio no reator ...........................................................................36
4.3 Meio de cultivo e condições nutricionais ...........................................................................37
4.4 Operação do reator UASB ..................................................................................................39
4.5 Análises físico-químicas e cromatográficas .......................................................................40
4.6 Inóculo ................................................................................................................................42
4.7 Caracterização microbiana por microscopia óptica............................................................42
4.8 Caracterização filogenética da comunidade microbiana por meio de hibridação in
situ fluorescente ........................................................................................................................43
4.8.1 Desprendimento celular ...................................................................................................45
4.8.2 Lavagem e fixação das células do lodo granulado ..........................................................45
4.8.3 Tratamento das lâminas de vidro.....................................................................................46
4.8.4 Hibridação in situ fluorescente ........................................................................................46
4.8.5 Quantificação dos grupos microbianos............................................................................48
4.9 Caracterização da diversidade microbiana .........................................................................49
4.9.1 Extração de DNA.............................................................................................................49
4.9.2 Amplificação por PCR.....................................................................................................49
4.9.3 Eletroforese em gel de gradiente desnaturante ................................................................50
4.9.4 Seqüenciamento...............................................................................................................51
4.9.5 Análise filogenética .........................................................................................................51
4.10 Granulometria...................................................................................................................52
4.11 Espectroscopia dispersiva de raio X .................................................................................52
5. Resultados e Discussão.........................................................................................................53
5.1 Concentração de oxigênio aplicada ao reator..................................................................... 54
5.2 Desempenho do reator........................................................................................................ 55
5.3 Espectroscopia dispersiva de raio X................................................................................... 65
5.4 Balanço de Enxofre ............................................................................................................ 67
5.5 Granulometria do inóculo e da manta de lodo do reator UASB ........................................ 71
5.6 Caracterização microbiana do inóculo e da manta de lodo do UASB ............................... 74
5.6.1 Caracterização microbiana por meio de microscopia óptica........................................... 74
5.6.2 Caracterização microbiana por meio de FISH ................................................................ 80
5.6.3 Caracterização microbiana por meio de PCR/DGGE e seqüenciamento........................ 88
5.6.3.1 Seqüenciamento do RNAr 16S de bandas de DGGE para o Domínio Bacteria.......... 88
5.6.3.2 Seqüenciamento do RNAr 16S de bandas de DGGE para o grupo de bactérias
redutoras de sulfato .................................................................................................................. 91
5.6.3.3 Seqüenciamento do RNAr 16S de bandas de DGGE para o Domínio Archaea.......... 95
5.7 Discussão geral................................................................................................................... 98
6. Conclusões ......................................................................................................................... 103
7. Recomendações.................................................................................................................. 105
8. Referências bibliográficas.................................................................................................. 106
9. Apêndice............................................................................................................................. 114
i
Índice de Figuras
Figura 3.1 Modelos conceituais para a distribuição microbiana do lodo granulado: (a)
anaeróbio; (b) com baixa concentração de OD após 1 mês de operação e (c)
com alta concentração de OD após 3 meses de operação do reator
anaeróbio/aeróbio............................................................................................. 9
Figura 3.2 Processo de hibridação in situ fluorescente: fixação, hibridação, lavagem e
detecção.......................................................................................................... 26
Figura 3.3 Etapas de construção da árvore filogenética através de seqüências parciais de
RNAr 16S obtidas das bandas de géis de DGGE........................................... 28
Figura 4.1. Fluxograma experimental............................................................................. 33
Figura 4.2. Esquema do reator UASB ............................................................................ 34
Figura 4.3. Instalação experimental: (1) reator UASB, (2) bomba dosadora
eletromagnética 1,73 LPH, (3) bomba dosadora eletromagnética 1 LPH, (4)
controlador de fluxo de gás nitrogênio, (5) controlador de fluxo de gás
oxigênio, (6) válvula solenóide, (7) medidor de oxigênio dissolvido, (8) timer,
(9) tubo em U, (10) selo hídrico e (11) banho-maria ..................................... 35
Figura 4.4. Foto da instalação do sistema de injeção de oxigênio no reator: (a) Reator
UASB e (b) tubo em “U”, com pedra porosa em seu interior........................ 37
Figura 4.5. Frasco confeccionado para medir potencial redox no UASB ...................... 42
Figura 4.6. Lâmina de vidro revestida com teflon usada no FISH ................................. 46
Figura 5.1 Concentração média de oxigênio dissolvido obtida nos ensaios................... 54
Figura 5.2 Variação temporal das concentrações de matéria orgânica (DQO) afluente e
efluente (bruta, filtrada, centrifugada e sem sulfeto) ..................................... 57
Figura 5.3. Variação temporal das eficiências de remoção de matéria orgânica (DQO
bruta, filtrada, centrifugada e devido à presença de sulfeto).......................... 58
Figura 5.4. Variação temporal do pH no período experimental ..................................... 59
Figura 5.5. Variação temporal de alcalinidade a bicarbonato e ácidos voláteis totais
(AVT)............................................................................................................. 60
Figura 5.6. Variação temporal da eficiência de redução de sulfato................................ 61
Figura 5.7. Variação temporal da concentração de metano e sulfeto no biogás do reator62
Figura 5.8. Variação temporal do potencial redox na presença de oxigênio dissolvido. 64
Figura 5.9. (a) Foto do material precipitado coletado no efluente do reator UASB e (b)
análise de EDX, mostrando a presença de enxofre nesse material. ............... 66
Figura 5.10. Distribuição de espécies de sulfeto para diferentes valores de pH; faixa
de pH da digestão anaeróbia e
pH ótimo para a digestão metanogênica.68
Figura 5.11. Balanço de enxofre..................................................................................... 70
Figura 5.12. Foto dos grânulos em placa de Petri para realização da granulometria ..... 71
ii
Figura 5.13. Variação dos diâmetros médios dos grânulos do inóculo e da manta de lodo
(P1: Ponto 1, P2: Ponto 2, Estab: estabilização, R3,0: DQO/sulfato=3,0, R1,6:
DQO/sulfato=1,6). As porcentagens dos grânulos de tamanhos 0,5 a 1 mm e 4
a 5 mm foram menores que 1% e não estão representados nesta figura.........73
Figura 5.14. Morfologias de microrganismos observados na amostra do inóculo sob
microscopia óptica (a) diversidade morfológica em contraste de fase e (b)
arquéias metanogênicas semelhantes à Methanosarcina sp. em fluorescência
(1600x)............................................................................................................76
Figura 5.15. Morfologias de microrganismos observadas sob microscopia óptica nas
amostras do reator UASB na presença de oxigênio: (a) diversidade
morfológica e (b) arquéias metanogênicas semelhantes à Methanosaeta sp. no
ponto P1 e DQO/sulfato de 2,0; (c) bacilos ovalados no ponto P1 e
DQO/sulfato de 1,6; (d) presença de enxofre elementar no ponto P2 e
DQO/sulfato de 3,0 (1600x). .........................................................................78
Figura 5.16. Morfologias de microrganismos observados sob microscopia óptica nas
condições DQO/sulfato = 3 e 3 mg/L OD do reator UASB: (a) arquéias
metanogênicas semelhantes a Methanosaeta sp., em P1; (b) bacilos
fluorescentes em P2: (c) diversidade morfológica em P2 e (d) arquéias
metanogênicas semelhantes a Methanosarcina sp. em P2 (1600x)................79
Figura 5.17. Porcentagens de células totais do inóculo representadas pela quantidade de
RNAr 16S microbiano para os membros do Domínio Bacteria (EUB338),
bactérias redutoras de sulfato (BRS) da subdivisão delta de Proteobacteria
(SRB385), Domínio Archaea (ARC915) e a soma dos dois Domínios
(EUB338+ARC915). As barras indicam o erro padrão..................................81
Figura 5.18. Microrganismos do inóculo detectados por meio do FISH: (a) coloração
com DAPI, (b) sonda específica para o Domínio Archaea (ARC915) e (c) em
contraste de fase (1250x)................................................................................81
Figura 5.19. Composição da comunidade microbiana nas amostras (a) do ponto P1 e (b)
do ponto P2 nas respectivas etapas de operação do reator representadas pela
quantidade de RNAr 16S microbiano para os membros do Domínio Bacteria
(EUB338), bactérias redutoras do íon sulfato (BRS) da subdivisão delta de
Proteobacteria (SRB385), Domínio Archaea (ARC915) e a soma dos dois
Domínios (EUB338+ARC915). As barras indicam o erro padrão. A linha
contínua foi traçada apenas para melhor visualização....................................84
Figura 5.20. Microrganismos da amostra do ponto P1 operado com relação DQO/sulfato
de 3,0 na presença de oxigênio detectados por meio do FISH: (a) coloração
com DAPI, (b) sonda específica para o Domínio Bacteria (EUB338) e (c) em
contraste de fase (1250x)................................................................................87
Figura 5.21. Microrganismos da amostra do ponto P2 operado com relação DQO/sulfato
de 1,6 na presença de oxigênio detectados por meio do FISH: (a) coloração
com DAPI, (b) sonda específica para o grupo BRS da subdivisão δ-
Proteobacteria (SRB385) e (c) em contraste de fase (1250x). ......................87
Figura 5.22. Perfil das bandas de DGGE dos produtos de PCR amplificados com
primers para o Domínio Bacteria (968FGC e 1392R) para as amostras do
inóculo e do reator UASB operado nas relações DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0
e na ausência de sulfato. .................................................................................89
iii
Figura 5.23. Árvore filogenética de consenso baseada nas seqüências de bandas
recortadas do DGGE com primer para o domínio Bacteria das amostras do
inóculo e do reator UASB. Os valores nos nós da árvore indicam as
porcentagens de repetição do ramo (500 reamostragens de bootstraps). A
barra de escala indica a taxa de substituição a cada 100 nucleotídeos........... 91
Figura 5.24. Perfil das bandas de DGGE dos produtos de PCR amplificados com
primers para o grupo BRS (341FGC e 907R) para as amostras do inóculo e
do reator UASB operado nas relações DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0 e na
ausência de sulfato. ........................................................................................ 92
Figura 5.25. Árvore filogenética de consenso baseada nas seqüências de bandas
recortadas do DGGE com primer para o grupo das BRS das amostras do
inóculo e do reator UASB. Os valores nos nós da árvore indicam as
porcentagens de repetição do ramo (500 reamostragens de bootstraps). A
barra de escala indica a taxa de substituição a cada 100 nucleotídeos........... 94
Figura 5.26. Perfil das bandas de DGGE dos produtos de PCR amplificados com
primers para o Domínio Archaea (1100FGC e 1400R) para as amostras do
inóculo e do reator UASB operado nas relações DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0
e na ausência de sulfato.................................................................................. 95
Figura 5.27. Árvore filogenética de consenso baseada nas seqüências de bandas
recortadas do DGGE com primer para o domínio Archaea das amostras do
inóculo e do reator UASB. Os valores nos nós da árvore indicam as
porcentagens de repetição do ramo (500 reamostragens de bootstraps). A
barra de escala indica a taxa de substituição a cada 100 nucleotídeos........... 98
iv
Índice de Tabelas
Tabela 3.1 Equações envolvidas na redução de oxigênio à água......................................5
Tabela 3.2 Representações das enzimas nas reações com as formas tóxicas de oxigênio 6
Tabela 3.3 Tempo de tolerância ao O
2
, redução de O
2
, atividades das enzimas SOD,
catalase e peroxidase em bactérias anaeróbias, facultativa e aeróbia...............7
Tabela 4.1. Composição do meio de cultura Zinder .......................................................37
Tabela 4.2. Composição da solução traço de metais para o meio Zinder .......................38
Tabela 4.3. Composição da solução de vitaminas...........................................................38
Tabela 4.4. Etapas de operação e duração dos ensaios com o reator UASB ..................39
Tabela 4.5. Metodologia de análises realizadas ..............................................................40
Tabela 4.6. Sondas de oligonucleotídeos para hibridação in situ fluorescente...............44
Tabela 4.7. Concentrações finais de cada sonda .............................................................44
Tabela 4.8. Protocolos de hibridação ..............................................................................47
Tabela 4.9. Primers usados na PCR................................................................................50
Tabela 4.10. Programação do termociclador para amplificação dos fragmentos do RNAr
16S ..................................................................................................................50
Tabela 5.1. Etapas de operação no UASB ......................................................................56
Tabela 5.2. Resultados de eficiência de remoção de matéria orgânica nas diferentes
etapas de operação do reator UASB ...............................................................58
Tabela 5.3. Potencial de óxido-redução e atividade celular............................................65
Tabela 5.4. Composição química do material precipitado analisado por EDX ..............66
Tabela 5.5. Concentrações médias de sulfato e sulfeto (em mg/L), pH, porcentagem
residual e eficiência de conversão em cada etapa de operação.......................70
Tabela 5.6 Variação dos diâmetros médios dos grânulos do inóculo e da manta de lodo
do UASB.........................................................................................................72
Tabela 5.7.Caracterização morfológica do inóculo sob microscopia óptica...................75
Tabela 5.8. Caracterização morfológica da manta de lodo do reator UASB nos Pontos 1
e 2, sob microscopia óptica, nas condições DQO/ sulfato de 3,0, 1,6, 2,0 e
sem sulfato, na presença de aproximadamente 3 mg/L de OD.......................77
Tabela 5.9 Valores percentuais obtidos no FISH na amostra do ponto P1 e seus
respectivos erros padrões................................................................................82
Tabela 5.10 Valores percentuais obtidos no FISH na amostra do ponto P2 e seus
respectivos erros padrões................................................................................82
Tabela 5.11 Informação das seqüências obtidas das bandas recortadas do DGGE com
primers para o Domínio Bacteria...................................................................89
v
Tabela 5.12 Informação das seqüências obtidas das bandas recortadas do DGGE com
primers para o grupo BRS.............................................................................. 92
Tabela 5.13 Informação das seqüências obtidas das bandas recortadas do DGGE com
primers para o Domínio Archaea................................................................... 95
Tabela 9.1 Dados de operação do reator UASB em escala real da Avícola Dacar S/A114
vi
Índice de Abreviaturas e Símbolos
AGV Ácidos graxos voláteis
AME Atividade metanogênica específica
ARC915 Sonda de oligonucleotídeos complementares ao RNAr de membros do Domínio
Archaea
BRS Bactéria redutora do íon sulfato
DAPI 4’, 6-diamidino-2-fenil indol (corante fluorescente específico ao DNA)
DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio
DGGE Eletroforese em gel de gradiente desnaturante
DNAr Ácido desoxiribonucleico ribossomal
DQO Demanda Química de Oxigênio
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
EDX Espectroscopia dispersiva de raio X
EGSB Reator anaeróbio de leito granular expandido
EP Erro padrão
EUB338 Sonda de oligonucleotídeos complementares ao RNAr de membros do Domínio
Bacteria
EUK516 Sonda de oligonucleotídeos complementares ao RNAr de membros do Domínio
Eukarya
FISH Hibridação in situ fluorescente (“Fluorescent in situ Hybridization”)
MEV Microscopia eletrônica de varredura
NMP Número Mais Provável
NON338 Sonda de oligonucleotídeos não complementar ao RNAr microbiano, utilizado
como controle negativo
PBS Tampão fosfato salino
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
PVC Cloreto de polivinila
RNAr Ácido ribonucléico ribossomal
SDS Dodecil sulfato de sódio (“Sodium dodecyl sulfate”)
vii
SDT Sulfeto dissolvido total
SOD Superóxido dismutase
SRB385 Sonda de oligonucleotídeos complementar ao RNAr das bactérias redutoras do
íon sulfato mesofílicas Gram-negativas, da subdivisão delta de Proteobacteria
SSV Sólidos suspensos voláteis
STV Sólidos totais voláteis
SV Sólidos voláteis
TDH Tempo de detenção hidráulica
Tris (NH
2
C(CH
2
OH)
3
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol
UASB Reator anaeróbio de fluxo ascendente e manta de lodo
UFC Unidade formadora de colônia
1
1. Introdução
O desenvolvimento tecnológico e industrial, com produção de diversos produtos
e insumos alimentícios, químicos, de limpeza e higiene entre outros, gera efluentes que
apresentam os mais diversos compostos orgânicos e inorgânicos. Dentre esses, os
compostos de enxofre têm se despertado grande interesse para pesquisas tecnológicas,
devido aos impactos negativos que estes podem causar no ambiente se presentes em
concentrações indesejadas. Os compostos de enxofre, em forma de sulfato, sulfeto e
sulfito, são comumente encontrados em diversos efluentes de indústrias químicas e
alimentícias, tais como curtumes, papel e polpa celulósica, óleos comestíveis,
fermentação de melaço, processamento de amido de batatas, entre outros.
Dentre as tecnologias de engenharia aplicadas no processo de tratamento de
águas residuárias estão os biodigestores, tais como o reator anaeróbio de fluxo
ascendente e manta de lodo (UASB) e de leito granular expandido (EGSB), que são
baseadas na formação espontânea de lodo granulado. Entretanto, as condições
estritamente anaeróbias requeridas para esse processo de tratamento podem não ser
efetivamente alcançadas, devido às condições operacionais de manipulação dos
reatores, das etapas seqüenciais do processo, ou ainda, de eventuais panes, que tornem
necessária a interrupção da operação do reator para substituição de equipamentos,
abertura do reator etc. Dessa maneira, a presença de determinadas concentrações de
oxigênio pode ser fator crucial para se obterem resultados favoráveis no tratamento sob
condições anaeróbias. Além disso, é importante conhecer as conseqüências dessas
limitações para poder minimizar o estresse causado na fase operacional e não
comprometer o processo de tratamento.
Atualmente vem sendo difundido o uso de outras configurações de reatores
anaeróbios, aeróbios e combinados (anaeróbio/ aeróbio), com determinadas taxas de
reciclo, entre outros, como opção de tratamento de águas residuárias de difícil
degradação ou pós-tratamento, observando os aspectos sociais e econômicos que
viabilizem o tratamento.
Um dos maiores problemas da degradação anaeróbia de águas residuárias
contendo sulfato está relacionado com a inibição de microrganismos devido à presença
de sulfeto de hidrogênio formado no processo de redução de sulfato. Algumas
2
estratégias para minimizar o problema de toxicidade por sulfeto têm sido pesquisadas,
tais como: remoção química de metais pesados e sulfeto por meio de precipitação;
controle de pH para assegurar maior produção de sulfeto na forma ionizada HS
-
, que é
menos tóxica e necessária para a síntese celular; aplicação de concentrações de oxigênio
para promover a oxidação biológica parcial de sulfeto a enxofre elementar.
Nas últimas duas décadas, pesquisadores descobriram que certas bactérias
redutoras de sulfato (BRS), de fato, podem tolerar ou mesmo respirar oxigênio e nitrato.
A capacidade da respiração aeróbia por algumas BRS dulcícolas e marinhas, por
exemplo, foi observada com pelo menos um dos seguintes substratos: H
2
, lactato,
piruvato, formiato, acetato, butirato, etanol, sulfeto, tiossulfato e sulfito. Em ambientes
naturais, as BRS têm apresentado mecanismos de defesa capazes de tolerar os radicais
livres produzidos sob condições óxicas, habilitando a redução de sulfato sob essas
condições.
Especificamente, no caso de biorreatores anaeróbios com aplicação de
determinada concentração de oxigênio dissolvido, o conhecimento da proporção e da
filogenia dos microrganismos tolerantes nestas condições, pode dar subsídios para se
estudar mecanismos que favoreçam tal crescimento e manutenção, viabilizando obter
maior efetividade no tratamento via sulfetogênese e metanogênese. Nesse aspecto, as
ferramentas de Biologia Molecular (FISH, PCR/DGGE, clonagem e seqüenciamento)
têm contribuído na detecção, quantificação e identificação de comunidades microbianas
envolvidos no tratamento de ampla variedade de águas residuárias. A análise dos ácidos
nucléicos extraídos das amostras biológicas permite a determinação filogenética dos
microrganismos presentes, incluindo aqueles não-cultiváveis.
Nesse sentido, com este trabalho pretendeu-se avaliar influência do oxigênio
sobre as arquéias metanogênicas e bactérias redutoras de sulfato, no tratamento de água
residuária sintética contendo sulfato. Tais resultados visam contribuir para o
entendimento da dinâmica populacional e condições operacionais para a viabilidade do
processo.
3
2. Objetivos
2.1 Objetivo principal
O objetivo principal desta pesquisa foi:
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Avaliar a influência do oxigênio na metanogênese e sulfetogênese em reator UASB
operado em diferentes relações DQO/sulfato por meio da caracterização físico-
química, cromatográfica e microbiológica.
2.2 Objetivos específicos
Os objetivos específicos desta pesquisa foram:
Avaliar o desempenho do reator UASB previamente inoculado com lodo anaeróbio
na presença de aproximadamente 3,0 mg/L de oxigênio dissolvido no alfuente.
Analisar a comunidade microbiana da manta de lodo do reator UASB por meio de
técnicas de Biologia Molecular:
realizar a análise quantitativa usando FISH para o Domínio Bacteria, Domínio
Archaea e grupo das bactérias redutoras de sulfato (BRS) da subdivisão δ-
Proteobacteria.
realizar a análise qualitativa da diversidade microbiana usando PCR/DGGE para
o Domínio Bacteria, Domínio Archaea e grupo das bactérias redutoras de
sulfato (BRS) da subdivisão δ-Proteobacteria.
Identificar bactérias, arquéias metanogênicas e bactérias redutoras de sulfato
presentes no reator UASB por meio de seqüenciamento dos fragmentos do RNAr
16S de bandas recortadas dos géis de DGGE.
Avaliar a variação do tamanho dos grânulos da manta de lodo no decorrer dos
ensaios.
4
3. Revisão Bibliográfica
3.1 Mecanismos de defesa de microrganismos anaeróbios à
presença de oxigênio
Os microrganismos são classificados pela capacidade de utilização ou tolerância
ao oxigênio na síntese celular. O oxigênio (O
2
) é um poderoso oxidante e um excelente
aceptor de elétrons para a respiração (MADIGAN et al., 2000).
Os microrganismos aeróbios requerem O
2
para seu crescimento e adquirem mais
energia dos nutrientes disponíveis do que aqueles que não o usam. Nas reações
químicas para a produção de energia, os microaerófilos também podem usar O
2
,
entretanto não resistem à concentração de O
2
atmosférico (21%), alcançando
crescimento mais efetivo a concentrações de 1 a 15%. Esse fato se deve geralmente à
limitação no processo de respiração ou devido à presença de alguma molécula sensível
ao oxigênio.
Os microrganismos facultativos são aqueles capazes de crescer na presença de
O
2
atmosférico e compostos inorgânicos (respiram) e também sob condição de
anaerobiose (fermentam). Assim, sob determinadas condições de nutrição e crescimento
esses microrganismos são capazes de crescer na presença ou ausência de O
2
.
Os microrganismos anaeróbios não utilizam O
2
como aceptor final de elétrons e
conseqüentemente obtém crescimento mais eficiente na ausência deste composto;
entretanto, certos anaeróbios toleram concentrações-traços de oxigênio dissolvido. No
entanto, os anaeróbios estritos ou obrigatórios, não sobrevivem mesmo à breve
exposição ao O
2
. A razão para a anaerobiose estrita se deve provavelmente à
intolerância destes microrganismos aos produtos tóxicos do metabolismo do oxigênio
(MADIGAN et al., 2000). Outros microrganismos anaeróbios são considerados
aerotolerantes, ou seja, podem crescer na presença de concentrações limitadas de O
2
,
contudo não usam este gás metabolicamente.
As principais formas tóxicas de oxigênio geradas no processo da respiração são
os compostos intermediários formados na redução de O
2
à água (H
2
O), conforme
reações descritas na Tabela 3.1: ânion superóxido (O
2
-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
e radical hidroxila (OH•). O ânion O
2
-
é altamente reativo, capaz de oxidar compostos
orgânicos da célula, inclusive macromoléculas. Peróxidos (tais como H
2
O
2
) podem
danificar os componentes celulares; entretanto, são menos tóxicos que O
2
-
e OH•. Este
5
último é o mais reativo das formas tóxicas de oxigênio e pode oxidar substâncias
orgânicas da célula (MADIGAN et al., 2000; ROLFE et al., 1978).
Tabela 3.1 Equações envolvidas na redução de oxigênio à água
−−
→+
22
OeO
superóxido
222
OHH2eO →++
+−−
peróxido de hidrogênio
•
+−
+→++ OHOHHeOH
222
radical hidroxila
OHHeOH
2
→++
+−
•
água
OH2H4e4O
22
→++
+−
reação global
Fonte: MADIGAN et al. (2000)
Os ânions superóxido podem reagir com peróxido de hidrogênio na célula para
formar radicais hidroxilas. Subseqüentemente pode ocorrer reação entre ânions
superóxidos e o radical hidroxila que resulta na produção de oxigênio, que também é
danoso às células (MADIGAN et al., 2000).
O efeito tóxico do oxigênio pode danificar o DNA cromossomal, como
verificado em Roseburia cecicola, microrganismo anaeróbio considerado intolerante ao
oxigênio. O DNA só pôde ser isolado quando as células de Roseburia cecicola foram
mantidas sob condições anaeróbias, caso contrário o DNA foi degradado (MARTIN &
SAVAGE, 1988).
A efetividade dos mecanismos de defesa que os microrganismos possuem para
atuar contra os subprodutos tóxicos da redução de O
2
pode determinar a capacidade de
tolerância ao O
2
. Muitos subprodutos tóxicos, incluindo o ânion superóxido (O
2
-
) e
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), são gerados quando o oxigênio molecular (O
2
) interage
com diversos constituintes celulares (ROLFE et al., 1978).
Os microrganismos aeróbios e facultativos possuem mecanismos apropriados de
proteção contra os radicais de O
2
. A principal hipótese para os mecanismos protetores é
a habilidade de estes microrganismos produzirem as enzimas superóxido dismutase
(SOD) e catalase. A enzima SOD parece ser indispensável aos aeróbios. A baixa
concentração ou ausência dessa enzima é a provável razão da toxicidade por oxigênio
aos anaeróbios estritos (MADIGAN et al., 2000).
As reações enzimáticas de neutralização das formas tóxicas de oxigênio estão
apresentadas na Tabela 3.2. Catalases e peroxidases são proteínas contendo porfirina,
embora algumas flavoproteínas também possam consumir espécies tóxicas de oxigênio.
A enzima catalase, a mais comum, reage com peróxido de hidrogênio. A peroxidase
6
também reage com esse composto, porém necessita de um agente redutor, geralmente
NADH. Superóxidos dismutases são proteínas contendo metais, tais como cobre, zinco,
manganês ou ferro. O superóxido é eliminado pela SOD, que combina duas moléculas
de superóxido para formar peróxido de hidrogênio e oxigênio. SOD, em combinação
com catalase, pode converter superóxido a oxigênio.
Tabela 3.2 Representações das enzimas nas reações com as formas tóxicas de oxigênio
catalase
222222
OOH2OHOH
+
→
+
peroxidase
++
+→++ NADOH2HNADHOH
222
superóxido dismutase
22222
OOHH2OO +→++
+−−
combinação superóxido dismutase/catalase
222
O3OH2H4O4 +→+
+−
Fonte: Madigan et al. (2000)
Algumas bactérias anaeróbias facultativas não possuem SOD, mas são capazes
de usar complexos de Mn
2+
para executar a redução de O
2
-
para H
2
O
2
e O
2
. Tal redução
pode ter funcionado como forma primitiva de SOD em organismos ancestrais
(MADIGAN et al., 2000). Esta consideração é suportada pelo fato de que as enzimas
SOD contêm um cofator, geralmente Mn
2+
, Fe
2+
, Cu
2+
ou Zn
2+
, nos sítios ativos da
enzima.
Rolfe et al. (1978) observaram variações na tolerância ao O
2
em treze culturas de
bactérias anaeróbias, duas facultativas e uma aeróbia estudadas. Na Tabela 3.3 estão
apresentados resultados de tolerância ao O
2
, atividades das enzimas SOD, catalase e
peroxidase, e velocidade de redução de O
2
obtidos por estes autores. As bactérias
facultativas suportaram tempo de exposição ao O
2
superior a 72 h; enquanto que, para
as anaeróbias esse tempo de tolerância variou de menos de 45 minutos
(Peptostreptococcus anaerobius) para mais de 72 h (Clostridium perfringens).
Microrganismos com tempo de sobrevivência menor que 2 h de exposição ao O
2
foram
designados como intolerantes. Todas as bactérias anaeróbias moderadamente tolerantes
ao O
2
(4 a 8 h de exposição) possuíam SOD e a catalase estava presente em três delas;
todavia, nenhuma apresentou atividade da peroxidase. As bactérias facultativas
possuíam as enzimas SOD e peroxidase, apresentando correlação entre a atividade desta
enzima com tolerância ao O
2
. A peroxidase não foi detectada em bactérias anaeróbias,
enquanto que a catalase foi variável, não demonstrando relação com tolerância ao O
2
.
Conforme resultados de Rolfe et al. (1978), a velocidade de redução de O
2
pelas
bactérias anaeróbias variou de 0,02 a 0,56 μL O
2
/min.mg de proteína (Tabela 3.3).
7
Aparentemente, os anaeróbios tolerantes ao O
2
que apresentaram baixa atividade de
SOD, tais como Clostridium perfringens e Bifidobacterium adolescentis (0,4 e 0,3
unidades de SOD/ mg de proteína, respectivamente), reduziram O
2
às velocidades
menores (0,03 e 0,06 μL O
2
/min.mg de proteína) do que os microrganismos anaeróbios
tolerantes ao O
2
Bacteroides fragilis (clínico), com 0,4 μL O
2
/ min.mg de proteína. B.
fragilis (clínico) apresentou maior atividade de SOD em relação aos demais
microrganismos tolerantes ao O
2
, com 6,8 unidades de SOD/ mg de proteína.
Tabela 3.3 Tempo de tolerância ao O
2
, redução de O
2
, atividades das enzimas SOD, catalase e
peroxidase em bactérias anaeróbias, facultativa e aeróbia
Nível de enzimas
(unidade / mg proteína)
Microrganismo Tempo de
tolerância
ao O
2
SOD Catalase Peroxidase
Redução de O
2
(μL O
2
/ min.mg
proteína
Anaeróbios intolerantes
Peptostreptococcus anaerobius 45 min - - - 0,46
Clostridium aminovalericum 45 min - - - 0,19
Eubacterium lentum 1 h 3,6 - - 0,15
Fusobacterium nucleatum 1 h - - - 0,13
Bacteroides melaninogenicus 2 h - - - 0,44
Anaeróbios moderadamente
tolerantes
Bacteroides fragilis 4 h 7,0 15,2 - 0,36
Propionibacterium acnes (clínico) 8h 0,9 103,2 - 0,37
Propionibacterium acnes 8 h 0,3 136,2 - 0,37
Bacteroides vulgatus 8 h 12,5 - - 0,56
Anaeróbios tolerantes
Bifidobacterium adolescentis 48 h 0,3 - - 0,06
Bacteroides fragilis (clínico) 48 h 6,8 7,1 - 0,40
Clostridium perfringens (clínico) > 72 h 1,4 - - 0,02
Clostridium perfringens > 72 h 0,4 - - 0,03
Facultativos e aeróbio
Lactobacillus plantarum > 72 h 49,7 32,2 0,227 0,84
Pseudomonas aeruginosa > 72 h 10,9 112,9 0,003 1,48
Escherichia coli (cultivados
anaerobiamente)
> 72 h 15,3 11,0 0,047 0,31
Escherichia coli (cultivados
aerobiamente)
> 72 h 33,4 46,0 0,026 0,25
(-) atividade não observada
Fonte: Adaptada de Rolfe et al. (1978)
As velocidades de redução de O
2
pelas bactérias facultativas e aeróbia variaram
de 0,25 μL O
2
/min.mg de proteína (E. coli cultivados aerobiamente) a 1,48 μL
O
2
/min.mg de proteína (Pseudomonas aeruginosa). Por outro lado, as bactérias
anaeróbias tolerantes ao O
2
que sobreviveram por períodos de tempo mais longos na
presença de O
2
foram os que apresentaram pouca atividade de SOD e reduziram O
2
a
menores velocidades, como no caso de Clostridium perfringens. Portanto, esses fatos
8
demonstraram que a atividade da enzima SOD e velocidades de redução de O
2
pelas
bactérias foram importantes fatores relacionados à tolerância dos microrganismos
anaeróbios ao O
2
. Segundo Rolfe et al. (1978), outros fatores podem ser incluídos, tais
como: (i) a posição ou localização das enzimas na célula (superfície versus citoplasma),
(ii) a velocidade em que os subprodutos tóxicos são formados e (iii) a capacidade
diferencial de defesa dos componentes celulares ao O
2
.
Fareleira et al. (2003) estudaram a resposta bioquímica ao O
2
de BRS
considerada anaeróbia estrita para elucidar as estratégias de sobrevivência em ambientes
óxicos. Culturas puras de Desulfovibrio gigas (NCBI 9332) foram cultivadas em frascos
de 2 L a 35
o
C, em meio contendo lactato e sulfato, sob atmosfera de gás argônio. As
culturas foram expostas ao oxigênio nas concentrações de 5, 10, 20, 40 e 120 μM
(correspondendo a 0,16, 0,32, 0,64, 1,28 e 3,84 mg O
2
/L) por 8 horas. Sob tais
condições, o crescimento de todas as culturas de D. gigas foi cessado, mesmo na
presença de concentração mínima aplicada de 5 μM. Entretanto, tão logo foi submetida
à condição anóxica recuperou o crescimento e atingiu velocidade média de crescimento
de 0,14/h, correspondendo a 70% de valor médio determinado no reator controle sem
oxigênio (0,2/h).
Esses autores detectaram a presença da atividade catalase em todas as amostras e
aumento significativo desta enzima com o aumento das concentrações de oxigênio
aplicadas. No reator controle, sem oxigênio, esta atividade correspondeu a 130±0,1 U/
mg.proteína. Na presença de oxigênio, foram detectadas 206±3, 248±7, 291±22 e
365±0,1 U/ mg.proteína para as concentrações de 5, 20, 40 e 120 μM O
2
aplicada por 8
horas. Portanto, a atividade catalase pode representar um sistema eficiente de defesa
para contrabalancear o dano celular causado pelos radicais tóxicos derivados do
oxigênio e proporcionar a sobrevivência de D. gigas em ambientes óxicos.
Outro importante mecanismo para evitar a toxicidade do oxigênio aos
microrganismos anaeróbios (principalmente arquéias metanogênicas hidrogenotróficas e
bactérias acetogênicas) é a formação de biofilmes estruturados em grânulos.
Shen & Guiot (1996) apresentaram modelos conceituais para a distribuição em
multicamadas das comunidades microbianas predominantes que podem ocorrer em
lodos granulados de reator operado sob diferentes situações. Os modelos propostos
estão apresentados na Figura 3.1. O Modelo 1 apresenta o lodo granulado anaeróbio
(Figura 3.1a), em que as bactérias acidogênicas (anaeróbias facultativas) são
9
predominantes na camada periférica dos grânulos, enquanto que as arquéias
metanogênicas, sensíveis ao oxigênio, estão localizadas na camada interior. Portanto, a
entrada de oxigênio no interior do lodo granulado é limitada na camada periférica
porque é consumido pelas bactérias facultativas. No Modelo 2 está representada a
distribuição microbiana do lodo granulado proveniente do sistema acoplado
anaeróbio/aeróbio, com baixa concentração de oxigênio dissolvido (OD), após 1 mês de
operação (Figura 3.1b). O oxigênio, quando presente no reator, certamente será
consumido pelas bactérias aeróbias e facultativas antes de atingir o centro do grânulo e
inibir os microrganismos anaeróbios estritos (metanogênicas). No Modelo 3, está
representada a comunidade microbiana do lodo granulado do reator acoplado
anaeróbio/aeróbio após 3 meses de operação, com alta concentração de oxigênio, onde a
camada periférica decorre de formação de camada floculenta, com predomínio de
filamentos (Figura 3.1c).
Figura 3.1 Modelos conceituais para a distribuição microbiana do lodo granulado: (a) anaeróbio;
(b) com baixa concentração de OD após 1 mês de operação e (c) com alta concentração de OD
após 3 meses de operação do reator anaeróbio/aeróbio.
Fonte: Adaptada de Shen & Guiot (1996)
Kato et al. (1997) relataram que os microrganismos anaeróbios, particularmente
os metanogênicos em lodos de sistemas de tratamento de águas residuárias, têm alta
tolerância ao oxigênio. A atividade das bactérias aeróbias ou facultativas demonstrou
possuir mecanismos importantes de tolerância ao oxigênio. A coexistência de arquéias
metanogênicas e microrganismos aeróbios, indicados pela simultânea utilização de
10
oxigênio e produção de metano, indicaram a evidência de que co-culturas anaeróbias e
aeróbias podem ser mantidas num único reator.
De acordo com Kato et al. (1997), a espessura e a arquitetura do biofilme
representam barreira física para a difusão do oxigênio, criando zonas segregadas com
baixas concentrações de oxigênio na região central do biofilme. Como podem ocorrer
sistemas muito complexos nesses micronichos, a limitação de oxigênio dentro dos
biofilmes depende do substrato disponível e da concentração deste gás no meio líquido.
A nitrificação e desnitrificação são exemplos de formação de camadas aeróbia e
anóxica, respectivamente. Geralmente, o oxigênio não penetra mais do que poucas
centenas de micrômetros devido ao consumo de oxigênio e limitação da difusão.
Conseqüentemente, os microrganismos anaeróbios existentes no interior dos biofilmes
estariam protegidos do contato com o oxigênio, permitindo a ocorrência de
desnitrificação, redução de sulfato ou metanogênese.
Em ambientes naturais, tais como em camadas estratificadas de lagoas
anaeróbias, Krekeler et al. (1998) concluíram que podem ocorrer ainda três diferentes
estratégias para a BRS escapar do estresse causado pelo oxigênio: migrar para regiões
anóxicas (mais profundas), formar aglomerados ou remover o oxigênio pela respiração
ativa em grupos.
De acordo com Sass et al. (2002), o oxigênio, quando presente, parece governar
a resposta quimiostática. Em altas concentrações, age como repelente. Porém, a
formação de grupos em baixas concentrações sugere a existência de uma rede mais
complexa, que ainda não é totalmente compreendida. O padrão comportamental das
bactérias lembra a estratégia de uma brigada de incêndio: os microrganismos evitam
altas concentrações de oxigênio, mas permanecem na parte fronteira da zona óxica.
Assim, coordenam a remoção de oxigênio pela respiração, e finalmente recuperam a
condição anóxica. Ou seja, as ações conjuntas destas bactérias podem delinear seus
microambientes com alta eficiência, não dependendo de microrganismos aeróbios para
obter condições favoráveis nas circunvizinhanças do seu ambiente.
3.2 Influência do oxigênio na metanogênese e sulfetogênese
Como mencionado anteriormente, o oxigênio é considerado um composto
potencialmente tóxico para o tratamento anaeróbio, especificamente para os
microrganismos da etapa final da cadeia trófica, principalmente arquéias
11
metanogênicas, bactérias redutoras do íon sulfato (BRS) e acetogênicas, que são
consideradas anaeróbias estritas.
Dannenberg et al. (1992) compararam a capacidade da respiração aeróbia de
BRS dulcícolas e marinhas na presença de vários substratos. Todas as catorze culturas
puras de BRS testadas foram capazes de realizar respiração aeróbia com pelo menos um
dos seguintes doadores de elétrons: H
2
, lactato, piruvato, formiato, acetato, butirato,
etanol, sulfeto, tiossulfato e sulfito. As culturas testadas foram: Desulfovibrio sp.,
Desulfobacter sp., Desulfotomaculum orientis, Desulfobulbus propionicus,
Desulfococcus multivorans e Desulfobacterium autotrophicum. As velocidades
específicas de respiração com os diferentes substratos adicionados variaram de 1 a 25
nmol O
2
/min.mg de proteína. Desulfovibrio sp. utilizaram O
2
a taxas comparáveis às
bactérias aeróbias, com valores de até 670 nmol O
2
/min.mg de proteína. Em geral, as
BRS foram microaerófilas, e as espécies dulcícolas oxidaram maior quantidade de
substratos com O
2
do que as marinhas. Portanto, a rota metabólica de enxofre pelas
BRS dissimilatórias não é unidirecional. Além da redução e desproporcionação de
compostos de enxofre, sua oxidação completa possivelmente ocorre com oxigênio ou
mesmo com nitrato como aceptor de elétrons.
Kato et al. (1993) estudaram o efeito da exposição ao oxigênio sobre a atividade
metanogênica de cinco lodos granulados provenientes de reatores anaeróbios de fluxo
ascendente e manta de lodo (UASB, upflow anaerobic sludge blanket) e de leito
granular expandido (EGSB, expanded granular sludge bed). Os autores realizaram
ensaios de toxicidade com microrganismos metanogênicos nos reatores em batelada,
sob condições mesofílicas. Para determinar os mecanismos de tolerância ao oxigênio,
foram investigados o tamanho do grânulo, a taxa de respiração das bactérias
facultativas, o regime de mistura e substrato. A taxa de respiração das bactérias
facultativas foi o mecanismo mais importante de tolerância ao oxigênio. Não houve
correlação da tolerância ao oxigênio com o tamanho do grânulo. Dentre os lodos
testados, dois apresentaram alta tolerância ao oxigênio. A concentração que causou 50%
de inibição da atividade metanogênica do lodo granulado variou de 7 a 41% de oxigênio
no headspace, após 3 dias de exposição ao ar. Os microrganismos metanogênicos
localizados no interior do grânulo tiveram alta tolerância ao oxigênio.
Segundo Kato et al. (1993), o fator mais importante que contribuiu na tolerância
dos microrganismos metanogênicos ao oxigênio foi o consumo de oxigênio pelas
bactérias facultativas no metabolismo de substratos biodegradáveis. A utilização de
12
oxigênio por estas bactérias criou microambientes que protegeram as arquéias
metanogênicas. Além disso, na maioria dos lodos, as condições estáticas durante o
período de exposição aumentaram a tolerância ao oxigênio, comparadas às condições de
mistura. Porém, a mistura não foi detrimental para lodos altamente tolerantes. Ensaios
com lodo macerado apresentaram menores tolerâncias ao oxigênio.
A toxicidade ao oxigênio geralmente não ocorre em reatores anaeróbios sob
condições normais de operação, na qual o oxigênio está presente apenas na forma
dissolvida. A concentração de oxigênio em águas residuárias é menor do que àquela
requerida estequiometricamente para oxidar a Demanda Química de Oxigênio (DQO).
Considerando a baixa solubilidade do oxigênio na água (<10 mg/L), em temperatura
ambiente, encontrada na prática, este nível não será maior mesmo em águas residuárias
diluídas, porque geralmente contém várias centenas de miligramas de DQO por litro. A
prática comum de adicionar agentes químicos redutores como sulfeto de sódio na água
residuária antes do tratamento anaeróbio não é necessário para prevenir a toxicidade por
oxigênio. Pelo contrário, os resultados indicaram que os reatores anaeróbios podem
tolerar certos níveis de aeração sem qualquer efeito detrimental sobre a população
metanogênica (KATO et al., 1993).
Há a possibilidade de se adicionar oxigênio aos sistemas anaeróbios de
tratamento para aumentar a mineralização completa de poluentes (GERRITSE &
GOTTSCHAL
1
, 1992 citado por KATO et al., 1993). O uso combinado de reatores
anaeróbio-aeróbio apresenta-se com potencial prático no polimento ou pós-tratamento
de esgoto sanitário e também para a remoção de outros poluentes (KATO et al., 1999).
A maior parte da remoção de matéria orgânica é realizada no sistema anaeróbio e o
remanescente no aeróbio.
Lens et al. (1995) investigaram a presença de arquéias metanogênicas e BRS em
seis diferentes reatores aeróbios e anaeróbios; dentre eles, reatores de filme fixo, de
crescimento suspenso (lodo ativado) e lodo anaeróbio (UASB). Para realizar a detecção
de BRS, as amostras de biomassa dos diferentes reatores do tratamento de águas
residuárias foram incubadas em meio modificado B de Postgate
2
(1984), contendo 3,5
g/L de doador de elétrons (lactato, acetato ou propionato). Este método proporciona
visualizar a coloração escura proveniente da formação de sulfeto ferroso (FeS) gerado
1
GERRITSE, J.; GOTTSCHAL, J. C. (1992) Mineralization of the herbicide 2,3,6-trichlorobenzoic acid
by a co-culture of anaerobic and aerobic bacteria. FEMS Microbiology and Ecology, 101:89-98.
2
POSTGATE , J. R. (1984) The sulfate reducing bacteria. Cambridge Univ. Press.
13
pela redução dissimilatória de sulfato. Após 84 horas de incubação, todas as amostras
ficaram pretas, exceto a amostra de lodo ativado aerado com oxigênio puro. Nos
biofilmes, as BRS oxidadoras de lactato variaram entre 8,4x10
5
a 1,1x10
8
unidades
formadoras de colônia (UFC)/g sólidos voláteis (SV), que foi comparável ao lodo
anaeróbio (2,9 a 8,7x10
7
UFC/g SV). As velocidades de redução de sulfato nos
biofilmes provenientes de reatores contendo material suporte plástico (11,2 mg SO
4
2-
/g
SV) e do reator biológico rotativo (11,0 mg SO
4
2-
/g SV), foram comparáveis ao reator
anaeróbio de filme fixo (11,6 mg SO
4
2-
/g SV). Esses reatores foram operados com alta
(3000 mg SO
4
2-
/L)
e baixa concentração de sulfato (150 mg SO
4
2-
/L). Nas condições
estudadas, os autores concluíram que a concentração de sulfato da água residuária não
foi fator determinante para a atividade in vitro das BRS. Ou seja, a presença de BRS foi
independente da configuração do reator, da carga orgânica aplicada e da concentração
de sulfato afluente.
Quanto à atividade de arquéias metanogênicas, Lens et al. (1995) avaliaram o
potencial de produção de metano a partir de H
2
/CO
2
e de acetato, em amostras de
biofilmes provenientes de reatores de filme fixo, lodos ativados e lodos anaeróbios. A
produção de metano foi detectada em todas as amostras em 2 semanas, exceto para o
biofilme de lodo ativado, aerado com oxigênio puro (40 mg/L), que não apresentou
resposta positiva mesmo após 2 meses de incubação. A velocidade de produção de
metano em reator UASB (40666 μg CH
4
/ g SV.d) foi muito maior do que a dos demais
reatores, que apresentaram valores menores do que 1% (56 a 289 μg CH
4
/ g SV.d). O
enriquecimento de microrganismos metanogênicos foi realizado para dois tipos de
biofilmes, provenientes de reator de filme fixo e reator biológico sob rotação. Em
ambos os biofilmes, notou-se a presença de três diferentes morfologias de
microrganismos. Em meio contendo acetato, foi verificada presença de filamentos
fluorescentes e sarcinas fluorescentes, mais provavelmente Methanosarcina sp., tanto
em aglomerados quanto em células individuais. Em ensaios de enriquecimento com
H
2
/CO
2
, de biofilmes de reator biológico com rotação, foram observados bacilos
fluorescentes, filamentos e sarcinas fluorescentes. Em todos os ensaios também foi
observada a presença de outros microrganismos não fluorescentes.
Lens et al. (1995) também observaram altas taxas de remoção de sulfeto em
todas as biomassas aeróbias estudadas. Isto indicou que, no caso de limitação por
sulfato, a atividade das BRS pode ser sustentada pela imediata reoxidação de compostos
reduzidos de enxofre. Desta maneira, a reoxidação de HS
-
viabiliza a realização do ciclo
14
do enxofre e as BRS podem ser responsáveis pela parte da remoção de matéria orgânica
em reatores aeróbios.
Shen & Guiot (1996) estudaram o impacto a longo prazo da presença de
concentrações de oxigênio dissolvido (0,55, 2,14, 4,29 e 8,10 mg/L) sobre as
características de lodo granulado anaeróbio. Foi usado reator UASB (volume total de 5
L e volume útil de 4,3 L) com 80 cm de altura e 9,5 cm de diâmetro interno. Para
controlar a taxa de oxigenação foram acopladas colunas de aeração confeccionadas em
vidro, com 65 cm de altura, 3,8 cm de diâmetro interno e volume útil de 0,5 L. O lodo
do inóculo, proveniente de reatores UASB em escala real usado no tratamento de água
residuária de indústria alimentícia, foi adaptado ao meio sintético em UASB de 20 L
durante 1 mês antes da inoculação. O meio sintético era composto de sacarose (2648
mg/L), ácido acético (926,5 mg/L), extrato de levedura (40 mg/L), sulfato de amônia (8
mg/L) e solução traço de metais (2 mL). Cada um dos 4 reatores acoplados
anaeróbio/aeróbio ao UASB, receberam 1000 mL desse inóculo (cerca de 50 g SSV) e
foram operados com tempo de detenção hidráulica de 48 horas e velocidade ascensional
do líquido de 1,4 m/h por 5 semanas. A taxa de reciclo destes reatores foi de 48 L/L
rx
.d
(L
rx
: volume útil do reator). Os reatores foram operados anaerobiamente por 5 a 7 dias
antes da adição de O
2
. O reator UASB foi alimentado com água residuária sintética
contendo 75% de sacarose e 25% de acetato como fontes de carbono.
Nestas condições, Shen & Guiot (1996) não observaram impactos negativos da
presença de oxigênio dissolvido afluente sobre os microrganismos anaeróbios estritos
(tais como, arquéias metanogênicas e bactérias acetogênicas) no período experimental
de 1 mês. A estrutura do biofilme do grânulo protegeu os microrganismos anaeróbios
estritos contra a toxicidade de oxigênio. As arquéias metanogênicas em lodo granulado
também são mais tolerantes a O
2
do que em lodos suspensos. Essa tolerância pode ser
atribuída à presença de bactérias facultativas e aeróbias na parte periférica do lodo
granulado, como mencionado anteriormente.
De acordo com Shen & Guiot (1996), os grânulos mantiveram excelentes
condições metanogênicas à taxa de carregamento de 3 g DQO/ L
rx
.d, mesmo depois de 3
meses de operação com aplicação de OD no reator. Isso demonstra que esse sistema
(reator acoplado anaeróbio/aeróbio) pode ser usado com sucesso a fim de promover a
coexistência de microrganismos anaeróbios e aeróbios na presença de OD pela coluna
de reciclo. As atividades do lodo granulado em meios contendo glicose, propionato,
acetato e hidrogênio como substrato não foram prejudicadas. Porém, com alta taxa de
15
reciclo (8,1 mg/L OD), houve declínio da atividade acetoclástica do lodo granulado
após 3 meses de operação do reator. Nesta condição, a presença de oxigênio resultou no
desenvolvimento de camadas floculentas sobre a superfície do grânulo, que conferiu
impacto negativo sobre a sua sedimentabilidade e arraste do lodo.
Omil et al. (1997) investigaram a competição entre BRS utilizadoras de acetato e
arquéias metanogênicas em reator UASB (velocidade do líquido superficial de 1 m/h)
usado no tratamento água residuária contendo acetato e sulfato (4328 mg/L), na relação
DQO/sulfato de 0,5, a 30°C e pH 8. Neste estudo, diferentes condições foram aplicadas
ao reator: inoculação de cultura pura de BRS degradadora de acetato Desulforhabdus
amnigenus, tratamentos de choque com diminuição dos valores de pH e exposição do
lodo ao ar. A adição de D. amnigenus não foi bem sucedida, apesar de o reator ter sido
operado em batelada por 14 dias para realizar a colonização. A diminuição no valor do
pH de 8 para 7 causou aumento na concentração de sulfeto de hidrogênio livre no reator,
de 5 a 10 mg/L para 90 a 125 mg/L. Entretanto, essa condição exerceu pouco efeito
sobre a competição entre BRS e metanogênicas, e a quantidade de acetato consumido
pelas BRS aumentou cerca de 5%.
Na etapa posterior, Omil et al. (1997) removeram a biomassa do reator e
deixaram sob exposição ao ar a 30
o
C; após 24 h, o lodo foi reintroduzido ao reator. Esta
estratégia reduziu fortemente o desempenho do reator, o qual recuperou a eficiência de
remoção de matéria orgânica (DQO) somente depois de 20 dias de operação, que foi
superior a 70%. Após recuperação do reator, as BRS consumiram maior quantidade de
acetato do que as metanogênicas, cerca de 70% de acetato no final da operação. Por
meio de técnica de hibridação in situ, os autores observaram a presença de
microrganismos semelhantes a Desulfobacterium sp., entre as BRS degradadoras de
acetato, que proliferaram após a exposição do lodo ao ar. Além disso, a caracterização
da biomassa também indicou que Desulfobulbus sp. e Desulfotomaculum acetoxidans
foram responsáveis pela degradação sulfetogênica de acetato neste reator. O
crescimento de BRS degradadoras de acetato mesmo após exposição ao oxigênio
concordou também com resultados reportados por Fukui & Takii (1990) de que as BRS
são tolerantes ao oxigênio molecular.
Zitomer & Shrout (1998) usaram culturas mistas provenientes de digestores
anaeróbios e aeróbios de sistema de tratamento de esgotos. Os autores adaptaram estas
culturas a condições metanogênicas e de oxigenação antes de usá-las como inóculo para
os reatores em batelada. Foram operados 4 reatores em escala de bancada de 3,8 L
16
contendo 3,0 L de cultura, a 35°C. Dois reatores foram inoculados com cultura adaptada
e, sob oxigenação, introduzida por meio de um timer acoplado à válvula solenóide
(fluxionado por 15 segundos a cada 30 minutos). Quando aberta, a válvula solenóide
fornecia fluxo de ar de 900 mL/min para um reator e 95 mL/min para outro,
correspondendo a 1 e 0,1 g de O
2
/L de reator por dia (g O
2
/L
R
-dia). Além desses
reatores, foram operados para fins de comparação, um reator de batelada convencional
anaeróbio (metanogênico) e um aeróbio (OD>2 mg/L). Os 4 reatores foram submetidos
à carga de choque por aumento da taxa de carregamento orgânico para 4 g DQO/ L
R
-dia
para investigar o processo de estabilidade e recuperação.
De acordo com Zitomer & Shrout (1998), os 4 reatores foram mantidos sob
condições estáveis por 7 meses. O headspace do reator anaeróbio continha
aproximadamente 47% de metano, cujo gás foi detectado na saída de ambos os reatores
com oxigênio. A eficiência média de remoção de matéria orgânica (DQO solúvel) foi
superior a 93% em todos os sistemas com taxa de carregamento orgânico de 1,5 g
DQO/L
R
-dia (DQO Afluente: 30000 mg/L). Sob as condições de aeração estudadas, os
reatores não apresentaram diminuição na eficiência de remoção de matéria orgânica
quando comparados aos sistemas anaeróbios e aeróbios. Além disso, no reator que
recebeu 1g O
2
/ L
R
-dia ocorreu o menor residual de DQO solúvel (1400 mg/L), enquanto
que, no reator aeróbio o valor foi mais elevado (2400 mg/L), provavelmente em parte
devido à liberação de produtos microbianos solúveis. Após a carga de choque de 4 g
DQO/L
R
-dia, o valor de pH nos reatores diminuiu de 7 para 5. O reator estritamente
anaeróbio não recuperou seu valor de pH inicial após 52 dias de operação, enquanto que
os reatores com 1g O
2
/L
R
-dia e 0,1g O
2
/L
R
-dia recuperaram seu valor de pH inicial após
34 e 28 dias, respectivamente. É possível que o metabolismo aeróbio (ou microaerófilo)
com ácidos graxos voláteis e stripping de dióxido de carbono e hidrogênio (H
2
)
aumentaram a taxa de recuperação dos valores de pH nos sistemas sob baixa aeração.
Zitomer & Shrout (1998) relataram ainda que, taxas reduzidas de aeração não
diminuem necessariamente a eficiência de remoção de matéria orgânica em processos
anaeróbios. As eficiências de remoção para culturas com oxigênio, estritamente
anaeróbia ou aeróbia foram comparáveis à condição de mistura completa. Num dos
casos, os valores de matéria orgânica efluente foram menores para o sistema
metanogênico sob baixa aeração quando comparado com sistema estritamente
anaeróbio. Outras configurações de reatores, tais como UASB e processos de separação
de estágios (acetogênico e metanogênico), poderiam provavelmente ser mais eficientes.
17
Desta maneira, estes autores ressaltaram a importância de investigar o processo da
metanogênese na presença de oxigênio, porque esta configuração pode ser uma opção
de tratamento altamente eficiente para alcançar menores concentrações de matéria
orgânica efluente, geração mínima de biossólidos e mineralização completa de várias
substâncias orgânicas.
Bade et al. (2000) estudaram a resposta das BRS ao estresse de oxigênio sob
condições oligotróficas – em água potável estéril, meio mineral e em co-cultura com
bactéria aeróbia Aquabacterium commune. Duas BRS foram isoladas das águas
profundas de Berlim, Alemanha: a linhagem zt3l que cresceu melhor em lactato 20 mM
e a zt10e em etanol 10mM como doador de elétrons. Pela análise comparativa da
seqüência do gene RNAr 16S estas espécies foram identificadas como pertencentes a
Desulfovibrio sp. e Família Desulfovibrionaceae. Estas linhagens foram comparadas
com Desulfomicrobium baculatum e Desulfovibrio desulfuricans. A incubação em água
potável sob aeração resultou na lise celular da linhagem zt3l após 25 dias, enquanto que
D. baculatum e D. desulfuricans apresentaram esse comportamento após 40 dias.
Apenas a linhagem zt10e foi detectada pela coloração com DAPI após mais de 70 dias
incubadas sob as mesmas condições. Em meio mineral, as células de todas as BRS
permaneceram constantes durante o período de estudo de 73 dias para testes com
culturas puras e 37 dias em co-cultura com A. commune.
De acordo com esses autores, a exposição de Aquabacterium commune aos
mesmos fatores de estresse, como à BRS em meio mineral, resultou em mudanças na
forma e número celular em experimentos com culturas puras ou co-cultura com BRS.
Em testes com culturas puras no meio mineral, A. commune diminuiu de 1,2x10
8
para
5x10
6
células/mL em 10 dias. Após 24 horas da limitação da fonte de carbono em meio
mineral, as células reduziram seu tamanho, em média de 3 para 1 μm. Situação
semelhante ocorreu em ensaios de co-cultura com BRS. A. commune pôde ser
diferenciada pelo tamanho e morfologia celular em relação às BRS; e sua concentração
pôde ser quantificada por meio da coloração por DAPI, cujos valores foram iguais a
1,3x10
8
a 3,0x10
6
células /mL.
Bade et al. (2000) observaram ainda que, as BRS têm a habilidade de sobreviver
em condições oligotróficas em sistemas de distribuição de águas de abastecimento. Esta
habilidade de sobrevivência em ambientes sem fatores de proteção poderia estar
relacionada à possível re-colonização quando recuperadas as condições favoráveis. Tais
condições são, por exemplo, biofilmes formados em áreas protetoras de sistemas de
18
distribuição de águas de abastecimento, onde as BRS podem causar sérios problemas de
corrosão. Além disso, pode apresentar outras características indesejáveis, como a
possível liberação de patogênicos, toxinas e partículas de metais tóxicos na água,
degradação estética – problemas de odor e sabor – e a perda da capacidade hidráulica.
Sigalevich & Cohen (2000) estudaram o crescimento de Desulfovibrio oxyclinae
na presença de oxigênio. Para tanto, as seguintes condições foram testadas: (i)
crescimento anaeróbio na presença de 8 mM de sulfato sob fluxo de nitrogênio por 8
dias, (ii) crescimento microaeróbio na presença de 8 mM de sulfato sob fluxo de mistura
gasosa (90% N
2
, 5% O
2
e 5% CO
2
), resultando em 223 μmol O
2
/min e (iii) crescimento
microaeróbio na ausência de sulfato por 10 dias. O meio sintético para todos os
experimentos continha 19 mM de lactato como fonte de carbono. Os ensaios foram
realizados em quimiostatos de 0,45L e foram mantidos a 35°C, pH 7,4±2 e sob agitação
de 200 rpm. Em crescimentos microaeróbios, foram realizados ensaios com co-cultura
de bactéria aeróbia facultativa heterotrófica Marinobacter sp. linhagem MB. Antes da
inoculação, Desulfovibrio oxyclinae foi enriquecida anaerobiamente em meio contendo
20 mM lactato e 10 mM de sulfato de sódio (Na
2
SO
4
) por 2 dias. Marinobacter sp.
linhagem MB foi enriquecida aerobiamente em 20 mM lactato durante uma noite. Após
24 horas de incubação sob condições anaeróbias, o meio foi mantido a fluxo de 0,05.h
-1
.
Sigalevich & Cohen (2000) observaram que, a redução de sulfato sob condições
microaeróbias diminuiu 45% comparada à quantidade reduzida anaerobiamente.
Quando a adição de sulfato foi suspensa, a sua concentração no meio diminuiu
exponencialmente de 4,1 mM para 2,5 μM. A proporção de células de D. oxyclinae,
determinada pela técnica de hibridação in situ (sonda Dsv698), diminuiu de 86% sob
condições anaeróbias para 70% sob redução de sulfato microaerobiamente; e, 34% sob
condições microaeróbias sem sulfato. Pelo método Número Mais Provável (NMP)
também foi observada diminuição das concentrações de D. oxyclinae sob condições
microaeróbias se comparadas com as anaeróbias. Como microrganismos pertencentes ao
gênero Desulfovibrio, D. oxyclinae é capaz de oxidar lactato apenas incompletamente a
acetato. Portanto, os autores observaram que os possíveis caminhos para produção de
acetato neste sistema foram: (a) fermentação de lactato pela Marinobacter sp. linhagem
MB, (b) oxidação anaeróbia incompleta de lactato pela D. oxyclinae acoplada com
redução de sulfato, (c) oxidação aeróbia incompleta de lactato pela Marinobacter sp.
linhagem MB e (d) oxidação aeróbia incompleta de lactato pela D. oxyclinae.
19
Marinobacter sp. linhagem MB em co-cultura com D. oxyclinae desempenhou oxidação
incompleta de lactato apenas na presença de baixos fluxos de oxigênio. Portanto, D.
oxyclinae foi responsável por toda concentração de acetato (14,3 mM) detectada durante
o ensaio microaeróbio no estágio de redução de sulfato.
Van der Zee et al. (2007) avaliaram a oxigenação moderada em biorreatores
anaeróbios para diminuir a produção de sulfeto no biogás. O reator de leito fluidizado
(17 L) contendo carvão ativado e mistura de lodos granulado e suspenso (30 g SSV/L)
foi operado com TDH de 5 dias a 33±2°C. O reator foi alimentado com água residuária
com baixa concentração de sulfato; com carga orgânica e de sulfato aplicadas de 6g
DQO/d e 1,3 mmol S/d, respectivamente. Após cerca de 1 ano de operação sob
condições anaeróbias estáveis, o oxigênio foi introduzido (1,2 a 1,5 L/d) por 28 dias
subseqüentes. A aplicação dessa concentração de oxigênio, correspondendo à relação
molar O
2
/S de 8 a 10 (em princípio, é a quantidade suficiente para oxidar todo o sulfeto
formado), foi suficiente para reduzir o conteúdo de sulfeto no biogás, em concentrações
abaixo do nível de detecção (0,02%). O sulfeto foi inicialmente oxidado a enxofre
elementar, tiossulfato e, mais provavelmente, a polissulfetos; tal fato pôde ser
evidenciado devido a não ocorrência de produção significativa de sulfato na presença de
oxigênio. Ou seja, não ocorreu a reoxidação de espécies reduzidas de enxofre a sulfato.
Essa oxidação foi muito mais rápida em amostras do lodo de biorreator operado sob
condição microaeróbia do que em reator operado sob condição estritamente anaeróbia.
A reação procedeu mais rapidamente com aumento da relação O
2
/S. Entretanto, a
eficiência de remoção de matéria orgânica (DQO) não foi alterada significativamente
entre o reator microaeróbio e o controle, com médias de 86,3 e 86,6%, respectivamente.
A situação permaneceu estável por todo o período de microaeração do reator (28 dias),
indicando que o processo de oxidação de sulfeto efetivamente competiu por oxigênio
com outro processo oxidativo, tal como a biodegradação aeróbia de matéria orgânica.
20
Rojas
3
(2007) avaliou a atividade metanogênica específica (AME) de lodo
anaeróbio proveniente de reator de leito fixo de fluxo ascendente anaeróbio-aeróbio
operado de modo contínuo, com recirculação da fase líquida, aplicado ao tratamento de
esgoto sanitário. O reator de leito fixo, em escala de bancada (7 L), foi preenchido com
argila expandida e espuma de poliuretano como materiais suportes, em três
compartimentos de volumes distintos, foi desenvolvido e operado por Oliveira Netto
(2007). A primeira etapa foi operada sob condição anaeróbia; na segunda, foi inserida
mais um módulo na parte superior do reator precedido por uma câmara de aeração.
Assim, o reator passou a operar ao mesmo tempo como anaeróbio-aeróbio. Na terceira
etapa o reator anaeróbio-aeróbio foi operado com recirculação do efluente para a zona
anaeróbia. O ensaio de AME foi realizado a partir das amostras coletadas nas três
etapas: da fase anaeróbia do reator, das fases combinada anaeróbia-aeróbia com
recirculação às razões de 0,5 e 1,5.
Os ensaios de AME realizado por Rojas (2007) consistiram na determinação do
biogás para avaliar o potencial da conversão do substrato em metano pela biomassa. Os
reatores consistiram de frascos de aproximadamente 80 mL e incubados a 30
o
C e 40
rpm de agitação. Nestas condições, o autor obteve concentração acumulada de metano
de 1,47 x 10
-2
, 3,1 x 10
-1
e 9,2 x 10
-2
mmol/L para as etapas anaeróbia, anaeróbia-
aeróbia com recirculação à razão de 0,5 e 1,5, respectivamente. Ou seja, a concentração
de metano foi maior no lodo quando na presença de oxigênio em relação à condição
anaeróbia. A eficiência de remoção de matéria orgânica também foi maior nas etapas de
recirculação da biomassa, com 69, 92 e 95% (DQO bruta) para as etapas anaeróbia,
anaeróbia-aeróbia com recirculação a razão de 0,5 e 1,5, respectivamente (OLIVEIRA
NETTO, 2007).
3.3 Relação DQO/sulfato
A presença de sulfato provoca alterações das rotas metabólicas no reator
anaeróbio porque ocorre competição por substrato entre BRS, microrganismos
3
ROJAS, M. P. A. (2007) Actividad metanogénica especifica (AME) de un lodo anaerobio bajo
diferentes condiciones de oxigenación en un reactor anaerobio-aerobio de lecho fijo, operado de modo
continuo, con recirculación de la fase liquida, aplicado al tratamiento de aguas residuales domesticas.
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Processos Biológicos (LPB-SHS-EESC-USP), sob orientação
do Prof. Dr. Marcelo Zaiat, e apresentado à Universidad Manuela Beltran (Bogota D. C.) para conclusão
do curso de graduação em Engenharia Ambiental.
21
fermentativos, acetogênicos e metanogênicos. Essa competição está relacionada com os
valores de pH do meio e a relação da concentração de matéria orgânica (DQO) e sulfato
na água residuária (LENS et al., 1998).
A quantidade de DQO removida pela sulfetogênese pode ser estimada pela
Equação 3.3.1. Desta maneira, a cada 96 g SO
4
2-
da água residuária são consumidos 64
g DQO (razão 1,5 SO
4
2-
: 1,0 DQO, ou seja, DQO/SO
4
2-
de aproximadamente 0,67).
(3.3.1)
−−
⇔+
2
42
2
SOO2S
Isto significa que em águas residuárias com relação DQO/sulfato de 0,67,
teoricamente há sulfato suficiente disponível para remover completamente a matéria
orgânica (DQO) via sulfetogênese. Para relação DQO/sulfato menor que 0,67, a
quantidade de matéria orgânica é insuficiente para a completa redução de sulfato
presente no meio e deve ser adicionada fonte externa de carbono se a remoção de
sulfato é o objetivo do tratamento. Caso contrário, para águas residuárias com relação
DQO/sulfato maiores do que 0,67, a completa remoção de matéria orgânica somente
pode ser alcançada se, além da redução de sulfato também ocorrer a metanogênese
(LENS et al., 1998).
Em reatores anaeróbios operados com excesso de sulfato, as BRS têm sido as
espécies predominantes e efetivamente competem com arquéias metanogênicas
(ALPHENAAR et al., 1993; VISSER et al., 1993). Em reatores limitados por sulfato, as
rotas de degradação de compostos orgânicos tornam-se muito complexas (O’REILLY &
COLLERAN, 2006). Além da competição entre BRS e os consórcios sintróficos por
substratos disponíveis, as BRS também competem, entre elas, pelo sulfato disponível
(OUDE ELFERINK et al., 1998).
Na ausência de aceptor de elétrons, as BRS são capazes de crescer através de
reações fermentativas ou acetogênicas. Piruvato, lactato e etanol são facilmente
fermentados por muitas BRS (WIDDEL, 1988).
Biorreatores de tratamento de águas residuárias são ecossistemas muito
complexos que contém muitas espécies microbianas. Em tais culturas mistas, as BRS
competem na presença de sulfato com arquéias metanogênicas e bactérias produtoras de
hidrogênio por substratos disponíveis. A importância desta competição intensifica-se
com o aumento da relação DQO/sulfato da água residuária. A conseqüência desta
22
competição determinará o grau de produção de biogás (sulfeto de hidrogênio e metano)
(LENS et al., 1998).
O’Reilly & Colleran (2006) estudaram o efeito de diferentes relações
DQO/sulfato (16, 8, 4 e 2) nas interações sintróficas e competitivas entre os grupos
microbianos. O lodo granulado mesofílico (37
o
C), proveniente de digestor de escala real
usado no tratamento de águas residuárias de produção de ácido cítrico (DQO/sulfato de
16), foi inoculado em reator EGSB 5 L, alimentado com água residuária sintética
contendo sulfato. A concentração de matéria orgânica (12 g/L) consistiu de glicose
(15%) e etanol, acetato, butirato e propionato na proporção de 1:1:1:1 aplicada à taxa de
carregamento volumétrico de 6 kg DQO/m
3
.d e TDH de 2 dias. As interações
microbianas foram investigadas por meio de testes de competição (usando inibidores
específicos para BRS e arquéias metanogênicas), microscopia eletrônica de varredura
(MEV) e FISH.
Os autores, mencionados anteriormente, observaram que nenhum substrato foi
completamente degradado por BRS, metanogênicas ou acetogênicas. Entretanto, na
relação DQO/sulfato de 2, houve evidências de que acetato e hidrogênio foram
utilizados principalmente pelas metanogênicas, enquanto que, propionato foi substrato
preferencial das BRS. As arquéias metanogênicas hidrogenotróficas foram responsáveis
pela utilização de H
2
no lodo granulado para a relação DQO/sulfato de 16. Este
predomínio se manteve quando a relação foi reduzida para 4, mas sua concentração
diminuiu para a relação DQO/sulfato de 2. As BRS também estiveram envolvidas na
degradação de propionato. Na relação DQO/sulfato de 16, a conversão de propionato foi
mediada pela ação combinada de BRS degradadoras incompletas de propionato e
arquéias metanogênicas acetoclásticas. Entretanto, para relações DQO/sulfato de 4 e 2,
as BRS degradadoras de propionato competiram com BRS hidrogenotróficas e, as
acetogênicas hidrogenotróficas competiram com as BRS.
De acordo com O’Reilly & Colleran (2006), ampla diversidade de
microrganismos foi observada no inóculo, tais como cocos, microcolônias de
Methanosaeta sp. presentes como bacilos e filamentos, filamentos finos (possivelmente
de Methanobacterium bryantii ou M. formicicum), agregados de Methanosarcina sp. na
superfície dos grânulos. Na relação DQO/sulfato de 4, os microrganismos
predominantes foram bacilos curvos (similares a Desulfovibrio sp.), cocobacilos em
formas de bulbos (semelhantes à Desulfobulbus sp.). Esta diversidade se manteve para
relação DQO/sulfato de 2, mas com predomínio de Desulfovibrio sp. (quando se teve
23
maior concentração de sulfato afluente) determinado por meio de FISH, além do
predomínio de Methanosaeta sp., observado sob MEV. Com os resultados obtidos, os
autores concluíram que, as interações microbianas em reatores de tratamento de águas
residuárias contendo sulfato ainda são bastante complexas.
3.4 Aplicação de técnicas moleculares na avaliação da
comunidade microbiana
As técnicas de Biologia Molecular, tais como reação em cadeia da polimerase
(PCR – Polymerase Chain Reaction), eletroforese em gel de gradiente desnaturante
(DGGE – Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e hibridação
4
in situ com sondas
fluorescentes (FISH – Fluorescent in situ Hybridization), são utilizadas para
identificação específica, quantificação, caracterização da estrutura e da distribuição
espacial da comunidade microbiana presente em lodos e biofilmes (AMANN et al.,
1995). Estes estudos são de grande relevância para o projeto e otimização dos sistemas
de tratamento de águas residuárias, pois os microrganismos são, em grande parte,
agentes responsáveis por promover os processos de degradação de muitos compostos
orgânicos e inorgânicos.
Estas técnicas têm sido aplicadas mais rotineiramente para investigar e
monitorar comunidades microbianas complexas, contornando problemas associados
com métodos tradicionais que dependem de cultivos prévios de microrganismos
(AMANN et al., 1995; MOTER & GÖBEL, 2000). Especialmente, essas ferramentas
podem ser muito úteis em biorreatores anaeróbios, nos quais a estabilidade e eficiência
são fortemente dependentes das interações das comunidades microbianas, uma vez que
podem fornecer subsídios para estabelecer a conexão entre a estrutura microbiana e as
características funcionais do sistema (PEREIRA et al., 2002).
A hibridação in situ fluorescente (FISH) é uma técnica que combina a precisão
da genética molecular com a informação visual a partir da microscopia, permite
visualização e identificação de células microbianas individuais dentro do seu
microhabitat natural ou artificial, como em reatores (MOTER & GÖBEL, 2000).
O objetivo principal da microbiologia do diagnóstico é a rápida e acurada
identificação de microrganismos em seus ambientes naturais. Métodos baseados em
4
O termo “hibridação” refere-se à marcação do RNAr bacteriano com a sonda fluorescente sintetizada
quimicamente (que é complementar à certa região do seu RNAr).
24
culturas são demorados e muitas vezes podem levar à seleção de microrganismos,
particularmente os não-cultivados em laboratório e, portanto, esta abordagem não
representa a composição exata de comunidades microbianas mistas (WAGNER et al.,
1993).
Análises microscópicas de coloração microbiana, tal como coloração de Gram,
são técnicas antigas, rápidas e de baixo custo, combinando visualização direta e
caracterização de microrganismos através da informação sobre a estrutura da parede
celular (MOTER & GÖBEL, 2000). No entanto, para aplicar esse método de coloração,
geralmente é necessário o isolamento das culturas, e a amostra deve ser coletada na fase
exponencial de crescimento, porque certos microrganismos apresentam variações na
constituição da parede celular em outras fases, como na adaptação e senescência. Além
disso, devido à pouca distinção morfológica entre os microrganismos, tais métodos
microscópicos não permitem a identificação completamente confiável.
A técnica de hibridação in situ foi desenvolvida por dois grupos de
pesquisadores independentes: Pardue & Gall
5
(1969) e John
6
et al. (1969) citados por
Moter & Göbel (2000). Esses pesquisadores realizaram hibridações de DNA ou RNAr
28S marcados radioativamente e visualizaram por microrradiografia. Esta técnica
permitiu que as seqüências de ácidos nucléicos fossem examinadas no interior das
células sem alterar a morfologia ou a integridade da sua estrutura celular. Desde então, a
técnica de hibridação in situ tem sido modificada para estudos de evolução
cromossomal e citogenética de ampla variedade de espécies microbianas (MOTER &
GÖBEL, 2000).
Giovannoni et al. (1988) introduziram no estudo da Ecologia Microbiana a
utilização de sondas de oligonucleotídeos de RNAr marcadas radioativamente para a
detecção microscópica de microrganismos. Em seguida, DeLong et al. (1989) foram os
primeiros a utilizar oligonucleotídeos marcados com corante fluorescente para detecção
de células microbianas individuais. Comparadas com as sondas radioativas, o uso de
sondas fluorescentes ofereceu melhor resolução, além de abreviar passos adicionais de
detecção. Além disso, as sondas fluorescentes puderam ser marcadas com corantes de
diferentes emissões de comprimentos de onda, assim tornou capaz a detecção de várias
seqüências-alvo dentro de único passo de hibridação. Na última década, a velocidade da
5
PARDUE, M. L.; GALL, J. G. (1969) Molecular Hybridization of radioactive DNA to the DNA of
cytological preparations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6464:600-604.
25
Biotecnologia tem feito da técnica FISH uma poderosa ferramenta para estudo
filogenético, ecológico, diagnóstico e ambiental na Microbiologia (AMANN et al.,
1990).
A técnica FISH permite detectar seqüências de ácidos nucléicos, utilizando-se
uma sonda marcada com corante fluorescente, que hibrida especificamente à sua
seqüência-alvo complementar no interior da célula íntegra. O procedimento inclui os
seguintes passos (Figura 3.2): (i) fixação; (ii) preparação da amostra, incluindo passos
de pré-tratamento, caso necessário; (iii) hibridação com as respectivas sondas para
detecção das seqüências-alvo; (iv) lavagem para remoção de sondas não-ligadas e
excesso de sais; (v) montagem, visualização e documentação dos resultados. A
preparação da amostra, realizada pela lavagem com solução-tampão, tem como
finalidade tentar separar as células de polímeros e partículas abióticas, pois estes
interferem na hibridação. A fixação consiste em inativar a atividade celular,
permeabilizar a parede celular do microrganismo para que a sonda fluorescente possa
entrar na célula e também proteger o RNA microbiano contra a degradação endógena
(MOTER & GÖBEL, 2000), permitindo conservar as amostras por vários meses.
Os passos de pré-tratamento citados acima são necessários, por exemplo, para
certas bactérias Gram-positivas e células em estágio dormente (como endósporos), que
podem apresentar problemas de permeabilidade quanto à sonda (AMANN et al., 1995).
Nesses casos, pode-se usar outra forma de fixação, com etanol, por exemplo, ou realizar
tratamento com lisozima e EDTA antes da hibridação.
A etapa de hibridação corresponde à ligação específica da sonda à seqüência-
alvo do RNAr. A temperatura exigida para cada sonda específica corresponde àquela de
dissociação da molécula de RNAr. A dissociação é necessária para que o
oligonucleotídeo fluorescente se ligue às bases complementares da cadeia simples de
RNAr. Porém, a molécula de RNAr pode desnaturar-se caso essa temperatura seja
ultrapassada.
6
JOHN, H.; BIRNSTIEL, M.; JONES, K. (1969) RNA:DNA hybrids at the cytogenetical level. Nature
223:582-587.
26
FLUORESCENTE
S
FIXAÇ
ÃO
C
É
LULAS FIXADA
S
HIBRIDAÇ
ÃO
RIBOSSOMO
S
SEQÜ
Ê
NCIA ALVO
SONDA
SONDA MARCADA
CÉLULAS
DETECÇ
Ã
O
MICROSCOPIA DE FLUORESC
Ê
NCIA
LAVAGEM
SONDA
S
Figura 3.2 Processo de hibridação in situ fluorescente: fixação, hibridação, lavagem e detecção.
Fonte: DOMINGUES (2001)
A escolha das sondas para o método FISH deve considerar a especificidade,
sensitividade e permeabilidade da parede celular. Uma sonda de oligonucleotídeos
típica contém entre 15 e 30 pares de bases em comprimento e é gerada num sintetizador
automático. Sondas curtas têm acesso mais fácil ao seu alvo, mas podem conduzir a
poucas marcações. Há diferentes maneiras de marcação, sendo a fluorescente a mais
comumente usada, devido à rapidez e facilidade, porque não requer passo adicional de
detecção após hibridação. Uma ou mais moléculas de corantes fluorescentes são direta
ou quimicamente ligadas aos oligonucleotídeos durante a síntese devido à marcação na
extremidade 5’ da sonda. Os oligonucleotídeos marcados fluorescentemente estão
disponíveis comercialmente e podem ser conservados por vários meses, em ambiente
escuro e sob refrigeração a –20°C (MOTER & GÖBEL, 2000).
A molécula-alvo mais comumente usada para FISH é o RNAr 16S devido à sua
estabilidade genética, sua estrutura de domínio com regiões conservadas e variáveis e
seu alto número de cópias (WOESE, 1987).
As sondas de oligonucleotídeos para cada nível taxonômico – domínios, gêneros
e espécies – podem ser desenhadas de acordo com a região do RNAr-alvo (AMANN et
27
al., 1995). Com o crescente banco de dados de seqüências disponíveis na literatura, os
genes RNAr 16S oferecem facilidade e precisão na identificação de muitos
microrganismos. Isso é especialmente importante na caracterização de populações
microbianas mistas ou microrganismos não-cultivados (AMANN et al., 1995).
Outra técnica de Biologia Molecular amplamente aplicada é a técnica de
PCR/DGGE, que permite caracterizar qualitativamente a diversidade microbiana
presente nas amostras microbiológicas. Além disso, a partir das bandas do gel de DGGE
obtido, pode-se realizar o seqüenciamento parcial dos fragmentos do gene RNAr 16S, e
por análise comparativa às seqüências dos bancos de dados obter a identificação dos
microrganismos.
A Figura 3.3 apresenta o esquema para a obtenção do seqüenciamento e análise
filogenética de microrganismos por meio de recorte de bandas do gel de DGGE. A
técnica consiste nas seguintes etapas: a) extração do ácido nucléico (DNA); b)
amplificação do DNA por PCR; c) separação dos fragmentos do gene RNAr 16S
amplificados por meio da técnica de DGGE; d) recorte das bandas que em seguida são
eluídas e reamplificadas, sem o GC Clamp; e) obtenção do seqüenciamento; f)
construção da árvore filogenética. A seguir são descritas cada etapa deste processo,
conforme apresentada por Sakamoto et al. (2005).
A etapa de extração de DNA é de grande importância para amostras de
comunidades microbianas complexas. Como o processo de extração ocorre por meio de
lise celular, se o tratamento for muito rigoroso poderá fragmentar o ácido nucléico das
células Gram-negativas. Enquanto que, se a lise celular for insuficiente poderá
influenciar na composição da comunidade microbiana. Além disso, em casos de
amostras com presença de substâncias inorgânicas, húmicas, inertes ou poliméricas,
pode ser necessário realizar a purificação prévia das amostras (MUYZER &
RAMSING, 1995). Dessa maneira, é necessário adequar um protocolo para cada tipo de
amostra para realizar a extração adequada de DNA dos microrganismos.
A técnica do PCR consiste em três etapas: desnaturação, anelamento dos primers
(oligonucleotídeos usados como iniciadores na reação de polimelização em cadeia do
DNA) e extensão das novas fitas do DNA. A desnaturação é realizada à determinada
temperatura para promover a separação da dupla fita em duas fitas simples de DNA. No
anelamento, as fitas simples são submetidas à redução de temperatura para que um par
de primer se anele às suas seqüências complementares. Em seguida, na extensão, a
28
temperatura é novamente elevada para que a enzima Taq-DNA polimerase se anexe ao
sítio de reação de cada primer para que ocorra a síntese de uma nova fita de DNA.
Figura 3.3 Etapas de construção da árvore filogenética através de seqüências parciais de RNAr
16S obtidas das bandas de géis de DGGE
Adaptada de Kaksonen (2004)
A técnica do DGGE consiste na separação dos fragmentos do DNA de mesmo
comprimento e seqüências de pares de bases diferentes. A separação do DGGE é
baseada na mobilidade eletroforética da dupla hélice do fragmento do DNA
parcialmente dissociado em gel de poliacrilamida contendo gradiente linear de
desnaturantes (mistura de uréia e formamida), que pode variar de 20 a 80%. A
desnaturação parcial causa a migração pela metade em uma única posição, formando
discreta banda no gel. Cada banda pode representar uma população microbiana.
As bandas do gel de DGGE podem ser recortadas, eluídas, reamplificadas por
PCR e submetidas ao seqüenciamento. As seqüências parciais do gene RNAr 16S
obtidas são comparadas com as seqüências disponíveis em banco de dados, como o
GenBank, obtendo-se a identificação dos microrganismos com determinadas
porcentagens de similaridade. Com esses dados, é possível construir a árvore
29
filogenética usando software específico e determinar a proximidade filogenética dos
microrganismos seqüenciados com os já identificados ou conhecidos.
Portanto, essas metodologias permitem analisar a distribuição da comunidade
microbiana sob o ponto de vista qualitativo (PCR/DGGE) e quantitativo (FISH), além
de obter a identificação dos microrganismos envolvidos nos processos de tratamento
anaeróbio (seqüenciamento). Dessa maneira, essas técnicas em conjunto têm sido
aplicadas mais rotineiramente em estudos de comunidades microbianas complexas e de
lodos granulados.
Okabe et al. (2003) avaliaram a estrutura da comunidade microbiana,
especificamente de grupos filogenéticos de BRS, em relação à mineralização do
carbono em biofilmes do tratamento de esgoto sanitário, sob condições microaerofílicas.
O crescimento do biofilme foi realizado em reatores com disco de rotação submersos
em tanque de sedimentação do efluente do sistema de tratamento de esgotos de Sapporo
(Japão). Os dois reatores consistiam de 10 discos de polimetilmetacrilato operados em
paralelo, com diâmetro de 16 cm cada um. Nessas condições, as concentrações de
oxigênio fornecidas no meio líquido variaram de 6 a 13 μmol/L. A estrutura da
comunidade microbiana nesses biofilmes era composta dos seguintes grupos bacterianos
predominantes: as pertencentes ao grupo Proteobacteria (41%), grupo Cytophaga-
Flexibacter-Bacteroides (CFB; 41%) e grupo Gram-positivo com baixa concentração de
conteúdo G+C (18%). Os clones afiliados aos grupos CFB e Gram-positivos foram
relacionados aos anaeróbios estritos e/ou bactérias fermentativas, tais como
Clostridium, Acetobacterium, Lactosphaera e Bacteróides, que foram responsáveis pela
produção de ácidos voláteis. Acetobacterium é homoacetogênica e um dos mais
importantes microrganismos produtores de acetato que usa H
2
como doador de elétrons
(OKABE et al., 2003).
De acordo com Okabe et al. (2003), as BRS presentes nesses biofilmes foram
filogeneticamente diversas, distribuídas em 6 gêneros: Desulfomicrobium,
Desulfovibrio, Desulfonema, Desulforegula, Desulfobacterium e Desulfobulbus.
Resultados da quantificação por FISH apontaram que Desulfobulbus e Desulfonema
foram as BRS predominantes, detectadas na superfície do biofilme. Baseado na análise
comparativa do RNAr 16S, dois clones filogeneticamente distintos foram relacionados a
Desulfovibrio burkinabensis e Desulfovibrio vulgaris. Entretanto, quantitativamente,
Desulfovibrio apresentaram-se com cerca de duas ordens de magnitude em menores
concentrações em relação a Desulfobulbus.
30
Okabe et al. (2003) ainda avaliaram a contribuição das BRS na mineralização do
carbono. Em ensaios em batelada usando inibidor específico (molibdato), os autores
verificaram que, as BRS relacionadas a Desulfobulbus estiveram envolvidas na
degradação de propionato a acetato. Esse acetato foi preferencialmente utilizado por
bactérias redutoras de nitrato, e não por BRS e arquéias metanogênicas sob condições
microaerofílicas. A degradação de acetato foi o passo limitante sob condições
sulfetogênicas e microaerofílicas. Assim, os autores concluíram que o acetato é
intermediário mais importante do que o propionato, sob condições microaerofílicas.
Os autores (OKABE et al., 2003) descreveram duas hipóteses para explicar por
que o acetato não foi utilizado pelas BRS sob estas condições: primeiro, a população de
BRS utilizadora de acetato (principalmente Desulfobacteriaceae) foi muito menor do
que Desulfobulbus, provavelmente devido à baixa velocidade de crescimento e baixa
tolerância ao oxigênio; segundo, porque embora Desulfonema possa utilizar acetato, e
encontrava-se relativamente em altas concentrações (5x10
7
filamentos/cm
3
) na
superfície do biofilme, o estresse por oxigênio e nitrato na região superficial foi muito
mais severo para a redução de sulfato.
Díaz et al. (2006) investigaram a composição e estrutura microbiana de três
diferentes tipos de grânulos de reator UASB usado no tratamento de águas residuárias
de cervejaria da Espanha. O reator foi operado com taxa de carregamento orgânico de
11 kg DQO/m
3
.d, TDH de 8 horas, velocidade ascensional de 0,75 m/h e pH 7,2. A
composição da água residuária industrial era composta de 4 g DQO/L, 2,4 g DBO
(demanda bioquímica de oxigênio)/L, 1,3 g SST/L, 0,1 g N-Kjeldahl/L, 15 mg NH
4
+
/L e
15 mg P/L. As eficiências médias de remoção foram de 80 e 85% para DQO e DBO,
respectivamente. Os autores selecionaram aleatoriamente certo volume de grânulos,
dividiram em três categorias por meio da cor (preta, cinza e marrom) e aplicaram as
técnicas moleculares (FISH, DGGE, clonagem e seqüenciamento) e MEV para analisar
a estrutura, função e aparência física dos grânulos metanogênicos.
De acordo com Díaz et al. (2006), os três tipos de grânulos apresentaram
diversidade microbiana similares entre si, embora com diferenças quantitativas. Por
exemplo, nos grânulos de cor cinza, a banda do gel de DGGE correspondente a
Methanosarcina sp. apresentou intensidade mais baixa do que em grânulos de cor preta
e marrom, e não foi detectada por meio de FISH. Os grânulos pretos e marrons
apresentaram predomínio de Methanosaeta concilii e Methanosarcina mazei; enquanto
que, os grânulos de cor cinza apresentaram predomínio de Methanosarcina mazei e
31
Methanospirillum hungatei. Entre os Gram-positivos predominantes nos grânulos de cor
cinza e preta foram identificados Clostridium butyricum e Clostridium difficile. Nos
grânulos marrons, essas bandas correspondentes apresentaram intensidade muito fraca e
também não foram detectados por FISH.
Díaz et al. (2006) observaram também os grânulos sob microscopia confocal a
laser (CLSM – Confocal Laser Scanning Microscope) e MEV, e notaram estrutura em
multicamadas nos grânulos de cor cinza. O centro destes grânulos apresentou
colonização de arquéias metanogênicas com baixa atividade, indicada pela baixa
intensidade fluorescente com a sonda específica para este grupo microbiano (ARC915),
com cerca de 50% do total de células ativas. Os grânulos marrons e pretos apresentaram
porcentagens de 78 e 51% do total de microrganismos detectados com esta sonda.
Entretanto, as células totais ativas foram muito baixas, com 7,7, 7,5 e 9,6%, nos
grânulos pretos, cinzas e marrons, respectivamente, indicando que a quantidade de
ribossomos foi baixo, conseqüentemente, refletindo em baixa atividade metabólica das
células. Os autores observaram ainda a presença de bactérias Gram-positivas com baixo
e alto conteúdo G+C, δ-Proteobacteria (bactérias redutoras de sulfato e bactérias
sintróficas), β-Proteobacteria e λ-Proteobacteria.
São diversos os trabalhos realizados no Laboratório de Processos Biológicos
(LPB) da EESC/USP com reatores UASB no tratamento de diferentes águas residuárias.
Porém, são escassos os trabalhos com minuciosos estudos de microbiologia e Biologia
Molecular dos microrganismos envolvidos nos processos de tratamento de águas
residuárias, especificamente quando na presença de oxigênio.
32
4. Material e Métodos
Um reator UASB de 10,5 litros foi usado para avaliar a influência do oxigênio
dissolvido (OD) na metanogênese e sulfetogênese. O reator foi operado com tempo de
detenção hidráulica (TDH) de 12 horas sob condições mesofílicas (30
o
C±1). O reator
foi alimentado com meio Zinder acrescido de solução de vitaminas, solução traço de
metais e bicarbonato de sódio (10%). Como fontes orgânicas e de enxofre foram usados
etanol e sulfato, respectivamente.
A fase de adaptação do lodo no reator UASB foi realizada em três etapas com
aumento gradativo das concentrações de etanol e sulfato, mas mantendo-se relação
DQO/sulfato de 3,1. Posteriormente, foram estudadas três diferentes relações
DQO/sulfato (3,0, 1,6 e 2,0) na presença de 3,00±0,65 mg/L de OD.
Em todas as condições foram realizadas as caracterizações microbianas por
microscopia óptica de contraste de fase e fluorescência e por meio de técnicas de
Biologia Molecular. A caracterização microbiana quantitativa foi realizada por
hibridação in situ fluorescente (FISH) usando sondas de oligonucleotídeos específicos
para quantificar bactérias totais (sonda EUB338), bactérias redutoras de sulfato (BRS)
do subgrupo delta de Proteobacteria (sonda SRB385) e arquéias metanogênicas (sonda
ARC915). A caracterização microbiana qualitativa foi realizada por meio de reação em
cadeia da polimerase (PCR) seguida de eletroforese em gel de gradiente desnaturante
(DGGE). Posteriormente, algumas culturas observadas em bandas dos géis de DGGE
foram selecionadas, recortadas e submetidas para a identificação por meio do
seqüenciamento de fragmentos do gene RNAr 16S. Dessa maneira, foi possível
identificar algumas culturas de bactérias, BRS e arquéias metanogências que estiveram
presentes nos ensaios.
Os resultados desta caracterização foram discutidos comparando-se com as
análises físico-químicas e cromatográficas, tais como eficiências de remoção de DQO,
redução de sulfato, concentração do biogás e potencial redox.
Na Figura 4.1 apresenta-se o fluxograma experimental, salientando as análises
realizadas em cada etapa deste trabalho.
33
Oxigênio Dissolvido
DQO
Ácidos Voláteis
Biogás (metano e
sulfeto)
Sulfato e Sulfeto
dissolvido
Potencial redox
Granulometria
Microscopia óptica
FISH
PCR/DGGE
Seqüenciamento
Análise Filogenética
Microscopia óptica,
FISH, PCR/DGGE,
STV
Inóculo
Lodo granulado de UASB usado no
tratamento de águas residuárias de
abatedouro de aves
Adaptação do lodo no UASB
Aplicação de aumento gradativo da
vazão e das concentrações de DQO e
sulfato com DQO/sulfato de 3,1
Relação DQO/sulfato de 3,0
+
3,0 mg/L de Oxigênio Dissolvido
Relação DQO/sulfato de 1,6
+
3,0 mg/L de Oxigênio Dissolvido
Relação DQO/sulfato de 2,0
+
3,0 mg/L de Oxigênio Dissolvido
Sem sulfato
+
3,0 mg/L de Oxigênio Dissolvido
Ensaios preliminares
Avaliar o sistema de injeção de
oxigênio na alimentação do UASB
Figura 4.1. Fluxograma experimental
34
4.1 Instalação experimental
O experimento foi montado no Laboratório de Processos Biológicos (LPB),
Departamento de Hidráulica e Saneamento (SHS-EESC-USP), e constituiu-se de um
reator UASB de 10,5 litros, barrilete de 25 litros usado como reservatório para
alimentação (substrato), refrigerador para evitar possível degradação do substrato,
banho-maria para aquecer o substrato à temperatura de trabalho, duas bombas dosadoras
eletromagnéticas com vazão de 1,73 LPH (litros por hora; Premia 75) e 1 LPH
(ProMinent), cilindros de alta pressão contendo nitrogênio e oxigênio (White Martins
Gases Industriais Ltda.), válvula solenóide, tubo em “U” para injeção de oxigênio no
reator contendo pedra microporosa, medidor de oxigênio dissolvido (Orion 810), selo
hídrico e câmara climatizada a 30±1 °C. O esquema do experimento está ilustrado na
Figura 4.2.
4C
o
N
2
O
2
30 C
o
2
3
1
5
6
7
12
13
14
15
16
17
18
19
20
8
9
11
10
4
1- Ci lindro de ni trogêni o
2, 9 - Fluxômetr os
3 - Pedra porosa
4 - Tanque de alimentação
5 - Banho-maria
6, 14 - Bombas
7 - Tubo em “U”
8 - Cil indro de oxigênio
10 - Timer
11 - Válvula solenóide
12 - Pedra microporosa
13 - Saíd a de excesso d e oxigênio
15 - Medi dor de oxi gênio di ssolvi do
em “by-pass”
16 - Reat or UASB
17 - Selo hídrico
18 - Amostrador de biogás
19 - Portas de amostragem
20 - Efluente
P1
P2
P5
Figura 4.2. Esquema do reator UASB
As faces frontal e dorsal do reator UASB eram de acrílico transparente (30 cm x
78 cm) e as faces laterais, de aço inoxidável. As placas de acrílico foram fixadas e
parafusadas sob pressão e isoladas do contorno de aço inoxidável por meio de “O-ring”
de borracha, seladas com cola de silicone para vedação da junta. Quatro tomadas
intermediárias ao longo da altura do reator permitiram a coleta de amostras para análise
do desempenho do reator ao longo do perfil, além dos pontos de entrada e saída. A
35
região de entrada era constituída por um tronco de pirâmide com 5 cm de altura, provido
de uma placa de aço inoxidável perfurada para distribuição uniforme do afluente, com
finalidade de minimizar a ocorrência de escoamento preferencial. O corpo do reator
tinha forma prismática com 45 cm de altura e seção quadrada de 12 cm de lado e era
destinado ao desenvolvimento da manta de lodo.
Figura 4.3. Instalação experimental: (1) reator UASB, (2) bomba dosadora eletromagnética 1,73
LPH, (3) bomba dosadora eletromagnética 1 LPH, (4) controlador de fluxo de gás nitrogênio,
(5) controlador de fluxo de gás oxigênio, (6) válvula solenóide, (7) medidor de oxigênio
dissolvido, (8) timer, (9) tubo em U, (10) selo hídrico e (11) banho-maria
O separador de fases encontrava-se a 50 cm da entrada do reator, construído em
aço inoxidável e com formato de prisma com faces laterais cortadas e sobrepostas com o
objetivo de facilitar a separação dos gases. Este dispositivo, com inclinação entre 50
o
e
60
o
, permite a sedimentação dos sólidos biológicos junto às placas e seu retorno à região
da manta de lodo. Esse sistema conduz os efluentes líquido e gasoso para os seus
respectivos compartimentos. Na Figura 4.3 apresenta-se uma fotografia da instalação
experimental do reator UASB.
Este reator já foi estudado por vários pesquisadores do Programa de Pós-
Graduação do Departamento de Hidráulica e Saneamento, Escola de Engenharia de São
Carlos (USP), resultando em várias Dissertações e Teses. Dentre estes trabalhos estão
36
incluídos: Del Nery (1987), Paula Jr. (1992), Torres (1992), Callado Sarmento(1992),
Buzzini (2000), Carmo (2004) entre outros.
4.2 Sistema de injeção de oxigênio no reator
O oxigênio é pouco solúvel na água e requer condições especiais para assegurar
elevada eficiência de absorção desse gás. Uma característica-chave que deve ser
incorporada nos sistemas de dissolução do oxigênio comercial é o tempo de detenção do
oxigênio. Para maximizar a absorção do oxigênio puro em meio líquido é requerido
tempo de detenção de 100 segundos (METCALF & EDDY, 2003). Um dos sistemas de
transferência de oxigênio com reduzido consumo de energia é o tubo em “U”
(METCALF & EDDY, 2003).
Para reproduzir o sistema de tubo em forma de “U” foi usada uma mangueira em
PVC cristal transparente de ¾”, de forma que promovesse TDH de aproximadamente
100 segundos na passagem do substrato na presença de oxigênio. Uma pedra
microporosa de 2 μm de porosidade (Alltech Hastalloy) foi conectada na extremidade
da mangueira que conduzia o gás e introduzida nesse tubo para melhor formação e
distribuição no meio de microbolhas de oxigênio. Foi também instalado um timer para
injetar oxigênio de forma intermitente, sendo programado para fluxionar durante 30
minutos com parada de 15 minutos. Esta condição foi necessária após observar a
ocorrência de oxidação do substrato nesse tubo. A vazão de oxigênio injetado no
sistema foi controlada por meio de um fluxômetro (15 mL/min - Unilec) ou rotâmetro
de baixa vazão (150 mL/min - Omel). Porém, não foi possível quantificar a vazão
injetada, devido à pressão do cilindro dos gases. O fluxômetro foi instalado de modo a
manter a concentração de oxigênio de aproximadamente 3 mg/L. Este sistema de
injeção de oxigênio foi conectado na entrada do reator UASB. Na Figura 4.4 encontra-
se a fotografia destacando o sistema de injeção de oxigênio no reator. Para este estudo
foi usado oxigênio puro industrial (White Martins Gases Industriais Ltda.).
A concentração média de oxigênio dissolvido (OD) a ser aplicada no afluente foi
previamente obtida por meio de ensaios realizados no reator UASB instalado nas
condições de estudo. Dessa maneira, a concentração média de OD foi obtida pela média
aritmética dos ensaios (OD
1
, OD
2
, OD
3
), cuja medida foi tomada da entrada do reator
em “by-pass”, conforme ilustrada nas Figuras 4.2 e 4.3 Cada ensaio foi realizado por
cerca de 1 hora tomando-se medidas de concentração de OD a cada 5 minutos.
37
(a) (b)
Figura 4.4. Foto da instalação do sistema de injeção de oxigênio no reator: (a) Reator UASB e
(b) tubo em “U”, com pedra porosa em seu interior
4.3 Meio de cultivo e condições nutricionais
O substrato usado foi o meio basal Zinder (ZINDER et al., 1984), acrescido de
solução de vitaminas (adaptada de Widdel & Pfennig, 1984 e Dubourguier et al., 1987),
traço de metais (ZINDER et al., 1984) e bicarbonato de sódio (10%). As composições
dessas soluções estão descritas nas Tabelas 4.1, 4.2 e 4.3.
Tabela 4.1. Composição do meio de cultura Zinder
Componentes
Quantidades – q.s.p.
1000 mL de água
NH
4
Cl
K
2
HPO
4
MgCl
2
.H
2
O
CaCl
2
.2H
2
O
Solução traço de metais*
Solução de vitaminas*
0,5 g
0,4 g
0,1 g
0,05 g
10,0 mL
10,0 mL
Fonte: Zinder et al. (1984); * Retirados a partir de soluções-estoques.
38
Tabela 4.2. Composição da solução traço de metais para o meio Zinder
Componentes
Quantidades – q.s.p.
1000 mL de água
NTA (ácido Nitrilotriacético)
FeSO
4
.7H
2
O
MnSO
4
.H
2
O
CoCl2.6H
2
O
ZnSO
4
.7H
2
O
H
3
BO
3
NiCl
2
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
4,5 g
0,556 g
0,086 g
0,17 g
0,21 g
0,19 g
0,02 g
0,01 g
Fonte: Zinder et al. (1984)
Tabela 4.3. Composição da solução de vitaminas
Compontentes*
Quantidades – q.s.p.
1000 mL de água
Biotina
Ácido fólico
Piridoxina HCl
Tiamina HCl.2H
2
O
Riboflavina
Ácido nicotínico
D-pantotenato de Cálcio
Vitamina B
12
Ácido p-aminobenzóico
Ácido lipóico
0,002 g
0,002 g
0,010 g
0,005 g
0,005 g
0,005 g
0,005 g
0,0001 g
0,005 g
0,005 g
* Adaptada de Widdel & Pfennig (1984) e Dubourguier et al. (1987)
O substrato foi preparado diariamente em barrilete plástico de 25 litros com água
de abastecimento público da cidade de São Carlos (SP). As fontes orgânica e de enxofre
usadas foram etanol (P. A.) e sulfato (na forma de sulfato de sódio), respectivamente. O
meio Zinder não possui fonte orgânica, por isso a carga orgânica era fornecida pelo
etanol adicionado ao meio, além de cerca de 40 mg/L proveniente da solução de
vitaminas. Dessa maneira, o volume de etanol a ser adicionado para obter a
concentração orgânica (DQO) necessária para o estudo foi calculado
estequiometricamente a partir da reação seguinte (4.3.1).
OH3CO2O3OHHC
22252
+
→+ (4.3.1)
Depois de preparado, fluxionou-se gás nitrogênio comercial (White Martins
Gases Industriais Ltda.) no meio por 30 a 40 minutos à vazão de aproximadamente 1
L/h no meio. Para melhor distribuição de N
2
no meio, foi colocado um distribuidor de
aquário (em forma de mangueira perfurada) na extremidade da mangueira de fluxo do
39
gás. A vazão de entrada de gás N
2
foi controlada por meio de fluxômetro (15 mL/min,
Unilec).
4.4 Operação do reator UASB
O reator UASB foi operado com TDH de 12 horas, a 30 °C, pH de 7-8, com
duração de 469 dias em sete etapas sob diferentes condições, conforme descritas na
Tabela 4.4. O lodo granulado do inóculo, proveniente de reator UASB de abatedouro de
aves, apresentou 52 ± 3 g/L de sólidos totais voláteis (STV) e 59 ± 3 g/L de sólidos
totais (ST). Esta análise foi feita em triplicata tomando-se 50 mL de volume de lodo
granulado.
Tabela 4.4. Etapas de operação e duração dos ensaios com o reator UASB
Etapa Tempo
(dia)
Duração
(dias)
DQO Afluente
(mg/L)
Sulfato Afluente
(mg/L)
DQO /
Sulfato
Condição
I 1-49 49
500 ± 40 157 ± 29 3,3 ± 0,5
adaptação /
sem oxigênio
II 50-84 34
675 ± 56 240 ± 23 2,8 ± 0,4
adaptação /
sem oxigênio
III 85-252 167
1013 ± 56 345 ± 74 3,1 ± 0,8
adaptação /
sem oxigênio
IV 253-298 45
995 ± 96 370 ± 80 3,0 ± 0,7
com oxigênio
V 299-347 48
1158 ± 170 758 ± 124 1,6 ± 0,4
com oxigênio
VI 348-458 110
1448 ± 134 729 ± 89 2,0 ± 0,2
com oxigênio
VII 459-469 10
1386 ± 82
--- ---
com oxigênio /
sem sulfato
A adaptação do lodo granulado no reator ocorreu em três etapas (I a III) com
aumento gradativo da concentração de etanol e sulfato, mantendo-se a relação DQO/
sulfato média de 3,1. Em seguida, foram estudadas três diferentes relações DQO/sulfato
(3,0, 1,6 e 2,0) com injeção de 3,00±0,65 mg/L de OD (Etapas IV a VI). Na última
etapa (VII) foi avaliada a condição do reator sem a adição de sulfato no meio com
adição de oxigênio.
Estas relações foram escolhidas considerando-se as pesquisas realizadas no
Laboratório de Processos Biológicos (LPB-SHS-EESC-USP), na qual melhores
40
eficiências de redução de sulfato ocorrem para relações DQO/sulfato acima de 1,5
(SARTI et al., 2006). Quanto à concentração de oxigênio, pretendeu-se tentar estudar a
concentração intermediária entre condição anaeróbia, anóxica e aeróbia.
4.5 Análises físico-químicas e cromatográficas
Durante o período operacional, duas a três vezes por semana, amostras brutas
(afluente e efluente) foram coletadas para a determinação de alcalinidade, ácidos
voláteis totais e DQO bruta. Com a amostra filtrada do efluente foram realizadas
determinações de sulfato e DQO filtrada. A partir da condição DQO/Sulfato de 1,6, foi
realizada a precipitação prévia do sulfeto dissolvido na amostra do efluente bruto devido
à interferência deste na medida de DQO. A amostra do efluente foi homogeneizada com
sulfato de zinco (2-5 mg ou ½ espátula) em tubo Falcon de 15 mL e centrifugada a 5000
rpm por 1 minuto. O sobrenadante desta amostra foi usado para analisar a concentração
de DQO efluente. A concentração de sulfeto dissolvido foi analisada no efluente bruto.
A determinação de sulfato (Ampolas Sulfaver AccuVac, kit da Hach), sulfeto dissolvido
total (Reagentes 1 e 2, kit da Hach), DQO, Sólidos Suspensos Totais (SST), Sólidos
Totais Voláteis (STV) e Sólidos Totais (ST) do lodo granulado do inóculo foram
realizados de acordo com APHA-AWWA-WPCF (1999). As análises de DQO (bruta,
filtrada e centrifugada) foram feitas em duplicata.
Na Tabela 4.5 encontra-se resumida a metodologia usada para cada análise.
Tabela 4.5. Metodologia de análises realizadas
Amostra Análise* Metodologia
Afluente e Efluente Brutos
pH
Alcalinidade à Bicarbonato (AB)
Ácidos Voláteis Totais (AVT)
Demanda Química de Oxigênio (DQO)
Composição de gases
Sulfato
Sulfeto
Ácidos voláteis
Potenciométrica
Titulométrica
Titulométrica
Espectrofotométrica
Cromatográfica
Espectrofotométrica
Espectrofotométrica
Cromatográfica
Efluente Filtrado Sulfato
Demanda Química de Oxigênio (DQO)
Espectrofotométrica
Espectrofotométrica
Amostras brutas do perfil
do reator
Redox Potenciométrica
* Realizadas duas a três vezes por semana
41
Os ácidos voláteis totais (AVT) foram analisados de acordo com metodologia
descrita por Dilallo & Albertson (1961). A determinação de alcalinidade a bicarbonato
foi realizada de acordo com o método descrito por Dilallo & Albertson (1961)
modificado por Ripley et al. (1986). As concentrações de AVT e alcalinidade a
bicarbonato foram expressas como mg de ácido acético (Hac)/L e mg de CaCO
3
/L,
respectivamente.
Ácidos voláteis foram analisadas em cromatógrafo a gás HP6890, com detector
de ionização de chama a 300°C, equipado com coluna HP INNOWAX (cross Linked
Polyethylene) com 300 x 0,25 mm e 0,25 μm de espessura do filme. O injetor foi
operado a 250 °C, com taxa de split de 1:20. Os gases usados foram hidrogênio (gás
arraste), nitrogênio (gás auxiliar) e ar sintético com vazões de 30, 33 e 300 mL/min,
respectivamente. A preparação das amostras foi realizada pela metodologia descrita por
Moraes et al. (2000).
A composição do biogás produzido no reator UASB (metano e sulfeto de
hidrogênio) foi determinada em cromatógrafo Gow-Mac (Gow-Mac Instrument Co.,
Shannon, Ireland), equipado com detector de condutividade térmica e colunas
PORAPAK-Q (de análise) e PORAPAK-T (de referência), ambas de 2 cm de
comprimento, ¼” de diâmetro interno e 80-100 mesh. O hidrogênio foi utilizado como
gás de arraste a 50 °C. As amostras de gases foram coletadas em seringas de 1 mL, com
dispositivo de fechamento para evitar perda de gases durante o percurso até a injeção no
cromatógrafo. A análise da composição do biogás foi feita em duplicata.
O potencial de óxido-redução (POR ou redox) foi monitorado com medidor de
redox (Modelo UB-10, Denver Instruments) e eletrodo combinado de platina –
referência Ag/AgCl (Modelo DMR-CP1, Digimed). O valor de redox foi transformado
em relação ao padrão de hidrogênio (Eh) de acordo com APHA-AWWA-WPCF (1999)
usando a Equação 4.5.1:
Eh (sistema) = E (observado) + Eh (ZoBell) – Eh (ZoBell observado) (4.5.1)
onde, Eh (ZoBell) = 417 mV e Eh (ZoBell) observado = 224 mV, a 30°C.
Albuquerque et al. (2005) também usou eletrodo de redox com mesma
referência (Ag/AgCl) e estabeleceu a transformação, conforme manual do fabricante
(Equação 4.5.2).
42
Eh(mV) = E
Ag/AgCl
(mV) + 207, a 25
o
C (4.5.2)
Na impossibilidade de se inserir o eletrodo de potencial redox no reator UASB,
foi confeccionado um frasco de vidro com tampa de teflon selado com anel de “O-ring”
para vedação do eletrodo e impedir o contato do ar com o meio líquido a ser analisado
(Figura 4.5). As medidas de redox foram tomadas dos pontos P1 e P2 (manta de lodo),
P5 (na altura do separador de gases) e do efluente (saída do reator) (Figuras 4.2 e 4.3).
Figura 4.5. Frasco confeccionado para medir potencial redox no UASB
4.6 Inóculo
O inóculo usado foi o lodo granulado proveniente de reator anaeróbio de fluxo
ascendente e manta de lodo (UASB) usado no tratamento de efluente do abatedouro de
aves (Avícola Dacar S/A, Tietê – SP). O reator foi inoculado com cerca de 4 L deste
lodo, previamente lavado com água destilada para a remoção do excesso de nitrogênio
amoniacal.
4.7 Caracterização microbiana por microscopia óptica
A caracterização microbiana do inóculo e da manta de lodo do UASB foi
realizada por observação sob microscopia óptica de contraste de fase e epifluorescência
em microscópio Olympus BX60-FLA, com câmara acoplada para captura de imagem
(Media Cybernetics Inc., USA). O programa de aquisição e tratamento de imagens foi
Image Pro-Plus 4.5. As amostras do reator UASB foram coletadas de dois pontos de
43
amostragem (P1 e P2), permitindo-se avaliar as mantas de lodo inferior e superior do
lodo.
Para essa observação microscópica foi utilizada a técnica de preparação de
lâminas descrita pela DSM
7
(1991) citado por Vazoller (1995). Solução ágar 2% foi
aquecida por aproximadamente 1 minuto em forno microondas e distribuída sobre a
lâmina de vidro. Após solidificação do ágar, foi colocada alíquota da amostra e
recoberta com lamínula. Essa técnica possibilitou que o excesso de água da amostra
fosse absorvido pela solução gelatinosa do ágar otimizando a qualidade da observação.
Para distribuir a amostra do lodo granulado (inóculo e manta de lodo) sobre a
lâmina, macerou-se cerca de 1 mL do lodo com auxílio de pistilo e almofariz. Alíquota
desse lodo macerado foi derramada sobre o ágar por meio de uma seringa de 1 mL.
Para a construção das tabelas de freqüências para realizar a caracterização
morfológica (Tabelas 5.7 e 5.8) foram capturadas imagens de 30 a 40 campos
microscópicos aleatórios de cada amostra e armazenadas em microcomputador. Em
seguida, foram estimadas visualmente as freqüências das morfologias em cada campo.
Essas tabelas auxiliaram na obtenção da primeira estimativa de microrganismos
presentes e na seleção das sondas e primers a serem utilizadas na caracterização pelas
técnicas de Biologia Molecular: FISH e PCR/DGGE.
4.8 Caracterização filogenética da comunidade microbiana por
meio de hibridação in situ fluorescente
As quantificações microbianas do lodo granulado do inóculo e das amostras das
diferentes condições de operação do reator UASB foram realizadas por meio da técnica
de hibridação in situ fluorescente (FISH) usando sondas de oligonucleotídeos
específicos para os membros do Domínio Bacteria (EUB338; AMANN et al. 1990), o
controle negativo NON338 (MANZ et al., 1992), Domínio Archaea (ARC915; STAHL
& AMANN, 1991) e bactérias redutoras de sulfato (BRS) da subdivisão delta de
Proteobacteria (SRB385; AMANN et al., 1990), com marcação fluorescente Rodamina
7
DSM (Deutsche Sammlung von Mikrrorganismen und Zellkulturen GMBH-DSM) (1991) Curso:
Scientific services of culture collections - The DSM experience, Fundação Tropical de Pesquisas "André
Tosello" - Campinas, SP.
44
ou CY3 na extremidade 5’, conforme descritas na Tabela 4.6. As concentrações finais
das sondas usadas no FISH estão apresentadas na Tabela 4.7.
A sonda NON338 foi utilizada como controle negativo (MANZ et al., 1992)
para quantificar a porcentagem de hibridações não-específicas. Estas hibridações
referem-se àquelas que ocorrem entre a sonda e uma porção do RNAr bacteriano não
complementar a este. Isso pode ocorrer em função de temperaturas inadequadas, ou pela
secagem indevida do tampão de hibridação ou de lavagem durante a aplicação do FISH
(ABE, 1998).
Tabela 4.6. Sondas de oligonucleotídeos para hibridação in situ fluorescente
Sonda Especificidade
Seqüência (5’→ 3’)
Sítio do
RNAr 16S*
Referência
NON338 Controle Negativo ACT CCT ACG GGA GGC AGC 338-355
Manz et al.,
1992
EUB338 Domínio Bacteria GCT GCC TCC CGT AGG AGT 338-355
Amann et al.,
1990
SRB385
Bactérias redutoras de
sulfato, mesofílicas, gram-
negativas, da subdivisão
delta de Proteobacteria e
algumas gram-positivas
CGG CGT CGC TGC GTC AGG 385-402
Amann et al.,
1990
ARC915
Domínio Archaea
GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT
915-934
Stahl & Amann,
1991
*Posição RNAr 16S de acordo com a numeração de Escherichia coli
Tabela 4.7. Concentrações finais de cada sonda
Sonda
Concentração final usada na hibridação (ηg/μL)
NON338 41,8
EUB338 44,0
SRB385 35,4
ARC915 39,5
* Concentração obtida conforme descrito por ARAÚJO (2001)
Os microrganismos controle-positivo usados no FISH foram as culturas puras de
Escherichia coli ou Pseudomonas putida para o domínio Bacteria; e Methanosarcina
barkeri (ATCC 43241) para o domínio Archaea. O controle positivo para BRS não foi
aplicado porque nenhuma cultura estava disponível no laboratório para uso; entretanto,
foi usada a cultura de E. coli como controle negativo.
A técnica de FISH envolveu as seguintes etapas: desprendimento, lavagem e
fixação das células do lodo granulado, tratamento da lâmina de vidro, hibridação,
45
microscopia de fluorescência e quantificação dos microrganismos. Estas etapas estão
descritas a seguir.
4.8.1 Desprendimento celular
Para desprender as células das amostras do inóculo e do reator UASB foram
tomados cerca de 1 mL do lodo macerado, com auxílio de um pistilo, e colocados num
frasco de antibiótico esterilizado, contendo 2 g de pérolas de vidro. Foram adicionados
cerca de 4 mL de solução tampão fosfato salino (PBS 1X: 130 mM NaCl, 7 mM
Na
2
HPO
4
, 3 mM NaH
2
PO
4
, pH 7,2) ou solução PBS 1X com 0,1 % de detergente
Nonidet P-40 (Sigma). Depois de lacrado, o frasco foi agitado manualmente em ângulo
de 45° por 20 minutos e submetido à homogeneização adicional por 5 minutos em
agitador magnético. A amostra desprendida foi colocada em tubos apropriados (1 mL de
amostra em triplicata) e centrifugada sob refrigeração (15°C) a 9000 rpm por 1 minuto.
Em seguida, as amostras foram submetidas à lavagem e fixação.
4.8.2 Lavagem e fixação das células do lodo granulado
A lavagem com PBS (1X) e fixação de células com paraformaldeído 4% foram
realizadas conforme descritas por Araújo (2001) e Domingues (2001). A lavagem das
células foi realizada com PBS (1X), por duas vezes, através de centrifugação nas
mesmas condições anteriores (15
o
C a 9000 rpm por 1 minuto). O material foi
ressuspendido em 200 μL de PBS (1X) com 600 μL de tampão de fixação gelado e
colocado por 12 a 16 horas a –4°C. Posteriormente, as amostras foram lavadas por duas
vezes com PBS (1X) e ressuspendidas em PBS (1X)/ etanol (1:1, v/v). As amostras
foram armazenadas a –20 °C até seu uso.
A solução tampão de fixação foi preparada em água ultrapurificada, previamente
aquecida a 60°C, dissolvendo-se 2 g de paraformaldeído e adicionando-se 150 μL de
NaOH 1N e 5 mL de PBS 10X (1,3 M NaCl, 70 mM Na
2
HPO
4
e 30 mM NaH
2
PO
4
em
pH 7,2), em aproximadamente 2 minutos. O pH foi corrigido em 7,2 a 7,4 (com HCl
30% ou NaOH 1N) e o volume final aferido em 50 mL com água ultrapurificada. O
tampão ficou armazenado sob refrigeração a –4°C por no máximo 48 horas, para
prevenir o aumento da autofluorescência, conforme Amann et al. (1990).
46
4.8.3 Tratamento das lâminas de vidro
Para a realização da hibridação in situ foram utilizadas lâminas de vidro
revestidas com teflon (Cel-Line/Erie Scientific Co.), com 12 pocinhos de 8 mm de
diâmetro cada um (Figura 4.6). Antes de usá-las, as lâminas foram devidamente tratadas
para que as soluções utilizadas no processo se mantenham sobre a lâmina.
As lâminas foram submersas em solução 10% de KOH dissolvida em álcool
etílico comercial, num recipiente plástico, por 1 hora. Em seguida, as lâminas foram
lavadas em água corrente e destilada. Após a secagem em temperatura ambiente as
lâminas foram mergulhadas em etanol (P.A.) para desidratá-las. Em seguida, as lâminas
foram tratadas com solução 0,1% de gelatina em pó e alguns grânulos de
KCr(SO
4
)
2
.12H
2
O e secas em temperatura ambiente, em posição vertical, tornando-as
hidrófobas. As lâminas foram estocadas sob refrigeração a –4°C até seu uso.
Figura 4.6. Lâmina de vidro revestida com teflon usada no FISH
4.8.4 Hibridação in situ fluorescente
Para caracterizar a comunidade microbiana pela técnica de FISH foi utilizado o
protocolo descrito por Araújo (2001).
Alíquotas de 1μL da amostra fixada foram espalhadas sobre cada pocinho da
lâmina e levada ao forno de hibridação a 45°C por 20 minutos para promover a fixação
das células na lâmina. Após esse tempo, foi realizada a desidratação em série gradativa
de etanol, 50%, 80% e 100%, por 3 minutos cada uma e secas em temperatura ambiente.
Em seguida, foi colocado 9μL do tampão de hibridação, previamente aquecido à
temperatura de hibridação, em cada pocinho, na presença de concentrações apropriadas
de formamida para a estringência de cada sonda específica. Cerca de 1μL de sonda foi
adicionada, para concentração final de 25 a 50ηg/μL (Tabela 4.7).
Para promover a hibridação, a lâmina foi transferida para tubo de polipropileno
(50 mL) com tampa de rosca, com papel filtro umedecido em tampão de hibridação no
47
interior do tubo. Este tubo foi revestido externamente com papel alumínio e funcionou
como câmara úmida e escura, que serviu para evitar a secagem indevida das células e
manter a concentração de hibridação inalterada, em temperatura e período de tempo
apropriados para cada sonda. O tubo foi levado ao forno de hibridação com tempo e
temperatura específicos para cada sonda (Tabela 4.8).
Após essa etapa, a lâmina foi submersa no tubo de polipropileno (50 mL)
contendo respectivo tampão de lavagem, por tempo e temperatura específicos para cada
sonda, com concentração apropriada de NaCl (Tabela 4.8), em banho-maria. Em
seguida, foi levemente borrifada com água ultrapurificada para a remoção de sais e
sondas não-hibridadas, e finalmente corada com 10 a 20 μL de solução DAPI 10 μg/mL
(4’,6-diamidino-2-fenil indol; Sigma), em cada pocinho, por 10 minutos em temperatura
ambiente e ausência de luz. Depois, foi novamente borrifada com água ultrapurificada
para retirar o excesso de DAPI. O DAPI é um corante para DNA, que permite visualizar
facilmente os microrganismos presentes na amostra por observação microscópica.
Tabela 4.8. Protocolos de hibridação
Sonda
Temperatura e
tempo de
hibridação
Tampão de
Hibridação
Temperatura
e tempo de
lavagem
Tampão de
lavagem
Referência
ARC915
45°C
2h
0,9 M NaCl, 20 mM
Tris-HCl (pH 7,2), 10
mM EDTA, 0,01%
SDS + 20% formamida
48°C
20 min
20mM Tris-HCl
(pH 7,2, 10 mM
EDTA, 0,01%
SDS) com 225 mM
NaCl
Hahn et al.,
1992
SRB385
45°C
2h
0,9 M NaCl, 20 mM
Tris-HCl (pH 7,2), 10
mM EDTA, 0,01%
SDS + 30% formamida
48°C
20 min
20mM Tris-HCl
(pH 7,2), 10 mM
EDTA, 0,01% SDS
com 80 mM NaCl
Hahn et al.,
1992
EUB338
NON338
46°C
1h30min
0,9 M NaCl, 20 mM
Tris-HCl (pH 7,2), 10
mM EDTA, 0,01%
SDS + 20% formamida
48°C
15 min
20mM Tris-HCl
(pH 7,2), 10 mM
EDTA, 0,01% SDS
com 225 mM NaCl
Abe, 1998
Após a secagem da lâmina, foram colocadas 1 a 2 μL de solução glicerol/PBS
(80/20, v/v), em pH maior que 8,5, para a observação em microscopia de
epifluorescência. Esse tratamento serviu para evitar o branqueamento das células devido
à exposição prolongada à luz durante o exame microscópio. Foram utilizados filtros
específicos, com excitação na região ultravioleta (UV) do espectro (para a observação
das células coradas com DAPI) e com excitação na região verde do espectro (para as
48
células hibridadas com sondas marcadas com rodamina). As imagens foram
fotografadas e arquivadas em computador, com auxílio do sistema com câmara acoplada
para captura de imagem, em tempos de exposição de 0,08s para contraste de fase e 0,5 a
4s para fluorescência.
Para cada amostra também foram verificadas a autofluorescência das células,
colocando apenas as amostras fixadas em cada pocinho na lâmina de vidro e
visualizadas na excitação na região UV do microscópio. As morfologias das células
quando emitiam autofluorescência e quando coravam com a sonda NON338 foram
anotadas e desconsideradas na contagem final. As arquéias metanogênicas, com exceção
das pertencentes aos gêneros Methanosaeta sp., apresentam autofluorescência devido à
presença do fator F
420
quando submetida a raios UV.
4.8.5 Quantificação dos grupos microbianos
Para quantificar os microrganismos por meio de FISH foram capturadas três
imagens do mesmo campo microscópico e arquivadas na memória do
microcomputador: em contraste de fase, uma correspondente à excitação do DAPI
(referente ao total de células) e outra correspondente à excitação da marcação com
rodamina ou CY3 (referente às células hibridadas), com magnificação de 1000 ou
1250x. Dessa maneira, possibilitou a contagem posterior, evitando problemas de perda
de fluorescência devido ao longo tempo de exposição à luz. As três imagens foram
colocadas lado a lado para realizar a contagem e diferenciar células hibridadas de
partículas abióticas, que às vezes apresentavam fluorescência com a sonda.
Para avaliar as proporções dos grupos microbianos presentes nas amostras usou-
se o seguinte procedimento: (a) contagem do número total de células coradas com DAPI
e (b) contagem do número de células hibridadas com a sonda específica. Foram feitas
contagens de 800 a 1000 células em 10 a 20 campos microscópicos aleatórios,
independente do número de pocinhos da lâmina. A porcentagem de células hibridadas
em cada campo microscópico foi calculada em relação ao número total de células
coradas com DAPI.
Na metodologia do FISH, a visualização e o cálculo da proporção de células
coradas com rodamina ou CY3 e àquelas coradas com DAPI são realizados em cada
campo microscópico. Desta maneira, para efetuar a contagem e minimizar os erros
49
estatísticos, os campos microscópicos selecionados para quantificação devem ser
semelhantes no número total de células e na proporção de células coradas com
DAPI/rodamina ou CY3 (ARAÚJO, 2001). Assim sendo, as amostras também sempre
foram homogeneizadas antes de realizar a hibridação. Este procedimento permitiu
estimar a concentração de microrganismos em porcentagem, cujos cálculos foram
realizados nas planilhas do Microsoft Office Excel 2003.
4.9 Caracterização da diversidade microbiana
A caracterização qualitativa da comunidade microbiana do reator UASB foi
realizada por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida da
eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) nas amostras do inóculo e da
manta de lodo coletado no final de cada etapa de operação do reator.
A técnica de PCR/DGGE consiste nas seguintes etapas: a) extração do DNA
ribossomal, b) amplificação por reação em cadeia da polimerase do fragmento de
interesse, c) separação do fragmento-alvo pela desnaturação parcial da dupla hélice.
Esta metodologia está descrita detalhadamente em Sakamoto et al. (2005), Duarte
(2006) e Saavedra (2007).
4.9.1 Extração de DNA
As extrações de DNA das amostras de lodo granulado do reator UASB foram
realizadas com glass beads, fenol equilibrado com Tris e clorofórmio, conforme
protocolo descrito por Griffiths et al. (2000).
4.9.2 Amplificação por PCR
Na amplificação dos fragmentos do gene RNAr 16S do DNA extraído, foram
usados primers específicos para os Domínios Archaea (KUDO et al., 1997) e Bacteria
(NIELSEN et al., 1999), e para o grupo BRS (NAKAGAWA et al., 2002) (Tabela 4.9).
Os microrganismos controle-positivos usados para PCR foram: Methanosarcina
barkeri (ATCC 43241) para o Domínio Archaea, Pseudomonas sp. para o Domínio
Bacteria e Desulfotomaculum ruminis (ATCC 23193) para o grupo das BRS.
50
Tabela 4.9. Primers usados na PCR
Microrganismos Primers e seqüência (5’ - 3’) Referência
Domínio Archaea
1100 FGC (5’ – AAC CGT CGA CAG TCA GGY AAC
GAG CGAG – 3’).
1400R (5’ – CGC CCG CCG CGC GCG GGC GGG GCG
GGG GCA CGG GGGG – 3’)
Kudo et al.
(1997)
Domínio Bacteria
968 FGC (5’ – AAC CGC GAA GAA CCT TAC – 3’)
1392 R (5’ – AACG GGC GGT GTG TAC – 3’)
GC clamp (5’- CGC CCG CCG GGG CGC CCG GGC
GGG GCG GGG GCA CGG GGGG – 3’)
Nielsen et al.
(1999)
Grupo BRS
341FGC (5’ – CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)
907 R (5’ – CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT-3’)
CG clamp (5’ – CCG CCG CCG CGC CCC GCG CCC
GTC CCG CCG CCC CCG CCC – 3’)
Nakagawa et al.
(2002)
Na reação de amplificação do fragmento do RNAr 16S dos microrganismos dos
Domínio Bacteria, Archaea e grupo BRS foram usadas as seguintes soluções: 0,5 μL de
Taq-DNA polymerase (5U/μL); 5 μL de tampão PCR 10X; 1,5 μL de MgCl2 (50 mM);
5 μL de dNTP (2 mM); 1μL de “primer forward” (100 pmol) e 1 μL do “primer
reverse” (100 pmol) e 2 μL de DNA extraído. Foi usado termociclador “Gene Amp.
PCR System 2400” (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn). Na Tabela 4.10 estão
apresentadas as condições usadas na programação do termociclador para amplificação
do fragmento de RNAr 16S.
Tabela 4.10. Programação do termociclador para amplificação dos fragmentos do RNAr 16S
Microrganismos
Nº de
ciclos
Desnaturação
Inicial
Desnaturação Anelamento Extensão
Extensão
Final
Resfriamento
Domínio
Archaea
35
94ºC
1,30 min
94ºC
30 s
55ºC
30 s
72ºC
1,30 min
94ºC
3 min
4ºC
Domínio
Bacteria
35
94ºC
5 min
94ºC
45 s
38ºC
1 min
72ºC
2 min
72ºC
10 min
4ºC
10
94ºC
5 min
94ºC
45 s
62ºC
1 min
72ºC
1,30 min
Grupo BRS
25
94ºC
45 s
57ºC
1 min
72ºC
1,30 min
72ºC
10 min
4ºC
4.9.3 Eletroforese em gel de gradiente desnaturante
A técnica de DGGE (eletroforese de gel com gradiente desnaturante) permite a
separação dos fragmentos de RNAr de mesmo tamanho, porém com seqüências de
nucleotídeos diferentes. A separação desses fragmentos ocorre de acordo com o grau de
51
desnaturação da dupla hélice de DNA, sob a ação do gel de poliacrilamida, com
gradiente crescente dos agentes desnaturantes (formamida e uréia).
Para o grupo das BRS e Domínio Bacteria foram usadas concentrações de 30% e
60% do gel de gradiente desnaturante (gel acrilamida - 40%; solução 50X de TAE-Tris
Ácido Acético EDTA; formamida e uréia), enquanto para o Domínio Archaea os
valores foram de 40% e 60%. Os géis foram preparados com 111 μL de APS
(perssulfato de amônia 10%) e 11 μL de temed (tetrametiletilenodiamina). Após a
solidificação do gel (1h), as placas contendo o gel foram colocadas em suporte
apropriado e levado à cuba de DGGE. Nesta cuba foram adicionados 7 L de água
destilada e 140 mL de TAE 50X. A temperatura de “corrida” do gel foi constante
(65ºC), voltagem de 175 Volts, com duração de 16 horas. O gel foi retirado da cuba e
corado com brometo de etídio por 20 minutos e depois transferido para o
fotodocumentador Eagle Eye TM III (Stratagene) acoplado ao computador e software
Eagle Slight UV para visualização das bandas, sob exposição a raios UV de 254 nm.
4.9.4 Seqüenciamento
Bandas específicas dos géis de DGGE foram recortadas, eluídas, reamplificadas
e submetidas ao seqüenciamento para identificar e determinar a porcentagem de
aproximação filogenética dos microrganismos. Foram seqüenciados aproximadamente
400, 500 e 300 pares de bases (pb) para o Domínio Bacteria, grupo das BRS e Domínio
Archaea, respectivamente. O seqüenciamento foi realizado pelo Centro de Estudos do
Genoma Humano (CEGH), do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB-USP/SP).
4.9.5 Análise filogenética
As seqüências parciais do gene RNAr 16S obtidas com os diferentes primers
foram verificadas utilizando o programa DNA Star (SeqMan) e comparadas às
seqüências do RNAr 16S de organismos representados na base de dados do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). As árvores filogenéticas de consenso para os
microrganismos identificados dos Domínios Bacteria e Archaea, e BRS foram
construídas com algoritmo Neighbor-joining do software Mega 3.1 (KUMAR et al.,
2001).
52
4.10 Granulometria
A variação do tamanho dos grânulos no reator UASB foi acompanhada por meio
de granulometria realizada no final de cada etapa de operação do reator.
A granulometria das amostras do inóculo e da manta de lodo foi realizada em
microscópio Olympus BHZT com câmara acoplada para captura de imagem no
Laboratório de Controle Ambiental 1, do Departamento de Engenharia Química (DEQ)
da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). O software Image Pro-Plus 4.5 foi
usado para tratamento de imagens, contagem e medição do diâmetro médio dos
grânulos. Foi tomado certo volume de lodo granulado, lavado em água destilada para
eliminar resíduos e peneirado para a retirada do excesso de água. Os grânulos foram
distribuídos em placas de Petri, tomando-se o cuidado para colocá-los separadamente
para possibilitar a posterior medição por meio dos recursos do software. Ao capturar a
imagem dos grânulos foi colocada uma régua graduada junto às placas de Petri que
serviu de referência para a medição no software. Todo esse procedimento foi realizado
de forma rápida para evitar a desidratação e alteração das características dos grânulos. O
software possui recursos que permitem a quantificação e medição automática dos
objetos e exportação dos dados em forma de planilhas. Foram medidas cerca de 1000
grânulos e tratados estatisticamente em Microsoft Excel 7,0. Os resultados da
granulometria do lodo granulado do inóculo e da manta de lodo do reator UASB foram
tratados estatisticamente usando o teste Anova (α=0,05) em Microsoft Office Excel
2003. Esta metodologia foi adaptada de Alphenaar et al. (1993).
4.11 Espectroscopia dispersiva de raio X
Para analisar a composição do material precipitado observado no efluente do
reator UASB foi realizado a análise de espectroscopia dispersiva de raio X (EDX), no
Instituto de Química de São Carlos (IQSC-USP), com detector de silício-lítio (Si-Li), da
Oxford.
53
5. Resultados e Discussão
Neste item estão apresentados e discutidos os resultados obtidos no período
experimental. O reator UASB foi operado por 469 dias em sete diferentes etapas.
As Etapas I, II e III corresponderam à fase de adaptação do lodo granulado no
reator UASB, com aumento gradativo da vazão e das concentrações de etanol e sulfato.
Esta fase teve duração de 252 dias, com relação DQO/sulfato de 3,1, sem injeção de
oxigênio. A manta de lodo no reator UASB tinha estabilizado (sem arraste de lodo no
efluente) algumas semanas antes desse período, mas devido ao atraso na montagem do
sistema de injeção de oxigênio no reator ocorreu o prolongamento desta fase.
Na Etapa IV iniciou-se a injeção de 3 mg/L de oxigênio dissolvido no afluente.
Esta etapa foi operada com DQO/sulfato de 3,0. Em seguida, foram estudadas as
condições DQO/sulfato de 1,6 e 2,0 (Etapas V e VI). Na última etapa (VII) foi esgotada
a fonte de sulfato para avaliar o comportamento da comunidade microbiana sem sulfato
na presença de oxigênio. Estas etapas tiveram duração de 219 dias, ou seja, com
aplicação de 3 mg/L de oxigênio dissolvido no afluente.
O monitoramento do reator foi realizado por meio de análises de DQO (bruta,
filtrada, centrifugada – com precipitação prévia de sulfeto dissolvido), sulfato, biogás
(metano e sulfeto de hidrogênio), pH, alcalinidade, ácidos voláteis totais, potencial
redox, granulometria da manta de lodo, análises microbiológicas e moleculares
(microscopia óptica, FISH, PCR/DGGE e seqüenciamento).
Entretanto, foi dada maior ênfase nas análises microbiológicas, de bactérias,
arquéias metanogênicas e bactérias redutoras de sulfato, na presença de oxigênio.
54
5.1 Concentração de oxigênio aplicada ao reator
Observou-se nos ensaios prévios que, mesmo com o fluxo de oxigênio
desligado, uma vez que o sistema foi instalado de forma intermitente, a concentração de
oxigênio foi de aproximadamente 1,85 mg/L. A concentração média de oxigênio
aplicada foi de 3,00±0,65 mg/L, com valores máximo e mínimo de 4,15 e 1,85 mg/L,
respectivamente (Figura 5.1). A faixa de intervalo “com injeção de O
2
” é o tempo em
que o timer foi acionado para a abertura da válvula solenóide. OD1, OD2, OD3
corresponderam aos valores de OD obtidos nos diferentes ensaios realizados; OD médio
é a média aritmética de OD1, OD2 e OD3. As concentrações de oxigênio dissolvido
foram quantificadas com medidor de OD instalado na entrada do reator UASB,
conforme está ilustrada na Figura 4.2.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (min)
Concentração de OD (mg/L)
OD1
OD2
OD3
OD Médio
sem injeção de O
2
com injeção de O
2
sem injeção de O
2
Figura 5.1 Concentração média de oxigênio dissolvido obtida nos ensaios
Existe, como em outros parâmetros, uma variação da quantidade de oxigênio. O
valor da concentração de oxigênio pode ser representado em porcentagem de saturação
deste gás, que é sua porcentagem existente na água de acordo com o máximo possível.
Esse valor máximo é determinado em função da temperatura e pressão. Por exemplo, a
pressão de 760 mm Hg, 100% de umidade relativa e temperatura de 0 ºC, solubilizam-se
14,6 mg de oxigênio por litro de água, enquanto que nas mesmas condições e à
temperatura de 30 ºC, solubilizam-se apenas 7,6 mg de oxigênio por litro de água, ou
seja, cerca da metade do valor a 0 ºC. A porcentagem de saturação pode ser calculada
por meio da Equação 5.1.1.
55
100
PODs
760OD
Saturação% ⋅
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
⋅
⋅
=
(5.1.1)
Desta maneira, sendo:
OD = 3,00 mg/L (oxigênio dissolvido em estudo),
ODs = 7,6 mg/L (oxigênio dissolvido a 760 mm Hg e 30
o
C) e
P = 690 mm Hg (pressão atmosférica a aproximadamente 856 m de
altitude, na cidade de São Carlos, SP)
Então, a concentração de oxigênio aplicada correspondeu à aproximadamente
44% de saturação de oxigênio.
Depois de obtida a concentração de OD requerida nestes ensaios, o fluxômetro
foi fixado de forma a manter esta concentração no afluente do reator UASB. Foram
estudadas as relações DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0, nesta ordem, variando-se as
concentrações de etanol e sulfato adicionadas ao afluente.
A injeção de oxigênio foi realizada continuamente, ou seja, não foi interrompida
a cada relação DQO/sulfato estudada.
5.2 Desempenho do reator
O reator UASB foi inoculado com cerca de 4 litros de lodo granulado e operado
em batelada por 24 horas. O sulfato foi adicionado somente no 9º. dia do início da
inoculação. No 32º. dia foi possível adotar TDH de 12 horas, quando se observou
diminuição ou ausência de arraste do lodo, e seguiu esta condição até o 49º. dia.
Na Tabela 5.1 estão resumidas as etapas de operação de cada ensaio. As etapas I,
II e III corresponderam ao tempo de adaptação da manta de lodo no reator UASB com
aumento gradativo das concentrações de etanol e sulfato. A etapa I teve duração de 49
dias com adição afluente com DQO de 500±40 e 157±29 mg/L de etanol e sulfato,
respectivamente. Posteriormente, foram aplicadas concentrações de etanol de 675±56 e
1013±56 mg/L, e de sulfato de 240±23 e 345±74 mg/L, com duração de 34 e 167 dias,
respectivamente. Considerando-se as etapas I, II e III como sendo única fase, obteve-se
relação DQO/Sulfato média de 3,1±0,7.
56
Tabela 5.1. Etapas de operação no UASB
Etapa Tempo
(dia)
DQO
Afluente
(mg/L)
DQO
Efluente
(mg/L)
Sulfato
Afluente
(mg/L)
Sulfato
Efluente
(mg/L)
DQO/
Sulfato
Condição
I 1-49 500 ± 40
138 ± 24
157 ± 29
19 ± 27
3,3 ± 0,5 adaptação / sem oxigênio
II 50-84 675 ± 56
158 ± 17
240 ± 23
16 ± 27
2,8 ± 0,4 adaptação / sem oxigênio
III 85-252 1013 ± 56
211 ± 34
345 ± 74
39 ± 28
3,1 ± 0,8 adaptação / sem oxigênio
IV 253-298 995 ± 96
242 ± 23
370 ± 80
27 ± 30
3,0 ± 0,7 com oxigênio
V 299-347 1158 ± 170
302 ± 51
758 ± 124
204 ± 138
1,6 ± 0,4 com oxigênio
VI 348-458 1448 ± 134
326 ± 34
729 ± 89
159 ± 84
2,0 ± 0,2 com oxigênio
VII 459-469 1386 ± 82
252 ± 81
--- --- --- com oxigênio / sem sulfato
Na etapa IV teve-se o início da injeção de 3,00 ± 0,65 mg/L de oxigênio
dissolvido no reator. Como a eficiência de redução de sulfato na etapa V diminuiu,
atingindo 40-60%, provavelmente devido à falta de fonte orgânica, foi acrescido volume
de etanol e mantido a concentração de sulfato afluente da condição anterior. Assim,
manteve-se a relação de DQO/sulfato de 1,6.
Na Figura 5.2 estão representadas as concentrações de matéria orgânica afluente
e efluente (bruta, filtrada, centrifugada e ‘sem sulfeto’). DQO centrifugada refere-se
àquela obtida após precipitação de sulfeto da amostra do efluente bruto usando sulfato
de zinco em excesso. Esta análise foi realizada nas etapas V e VI, quando se verificou
aumento na produção de sulfeto no meio líquido comparado com as etapas anteriores.
A DQO filtrada foi analisada somente até a etapa V, quando não se verificou
diferença desta com a DQO bruta, não demonstrando perda significativa de SST no
efluente do reator (< 64 mg/L). DQO ‘sem sulfeto’ refere-se aos valores calculados
estequiometricamente a partir da Reação 5.2.1 Conforme esta reação, cada 64 g de
DQO, 32 g provém de sulfeto presente no meio líquido.
−−
→+
2
42
2
SOO2S (5.2.1)
Desta maneira, DQO ‘sem sulfeto’ e centrifugada representam valor teórico e
medido, respectivamente, da concentração de matéria orgânica retirando-se a
interferência do sulfeto dissolvido. Similarmente, foi calculada a eficiência de remoção
de matéria orgânica sem a interferência do sulfeto dissolvido no reator (Figura 5.3).
57
É importante salientar que os pontos experimentais dos gráficos estão
representados por linhas contínuas somente para facilitar a visualização do
comportamento dos resultados obtidos. Como não foram realizadas análises
intermediárias ou ajustes de curvas, não há garantia de que os valores intermediários
possam ser obtidos por interpolação.
0
500
1000
1500
2000
2500
0 100 200 300 400 500
Tempo de Operação (dia)
Concentração de DQO (mg/L)
Afluente Efluente Bruto Efluente Filtrado Efluente Centrifugado Efluente sem sulfeto
I II III IV V VI VII
Figura 5.2 Variação temporal das concentrações de matéria orgânica (DQO) afluente e efluente
(bruta, filtrada, centrifugada e sem sulfeto)
Na Figura 5.3 estão representadas as eficiências de remoção de matéria orgânica
(bruta, filtrada, centrifugada e devido ao sulfeto, calculada estequiometricamente pela
Reação 5.2). Na etapa de adaptação do lodo no reator, as eficiências médias de remoção
da matéria orgânica (DQO bruta) foram iguais a 72±5, 77±2 e 79±2% nas etapas I, II e
III, respectivamente (Tabela 5.2). Quanto às eficiências médias de remoção de matéria
orgânica, medida como DQO filtrada, esses valores corresponderam a 77±5, 83±2 e
84±2%, para as etapas I, II e III, respectivamente. Considerando estas etapas como
única fase, as eficiências médias foram iguais a 77±4 e 83±4, para DQO bruta e filtrada,
respectivamente.
Nas etapas seguintes, as eficiências médias de remoção de matéria orgânica
(DQO bruta) foram iguais a 76±2, 74±4, 77±3 e 82±7% em IV, V, VI e VII,
respectivamente. As eficiências médias deremocao de matéria orgânica (DQO filtrada)
foram de 81±3 e 77±3% para as etapas IV e V, respectivamente, para valores médios
afluentes de 995±96 e 1158±170 mg/L. Portanto, mesmo na presença de oxigênio no
58
reator, as eficiências médias de remoção de matéria orgânica (DQO) atingiram valores
superiores a 70% (Figura 5.3).
Tabela 5.2. Resultados de eficiência de remoção de matéria orgânica nas diferentes etapas de
operação do reator UASB
Etapa Eficiência
Bruta
(%)
Eficiência
Filtrada
(%)
Eficiência
Centrifugada
(%)
Efic. sem
DQO Sulfeto
(%)
Condição
I
72,3 ± 5,2 78,6 ± 4,6
---
82,8 ± 5,1
adaptação / sem oxigênio
II
76,5 ± 2,1 83,2 ± 2,2
---
88,4 ± 3,1
adaptação / sem oxigênio
III
79,1 ± 1,8 84,1 ± 2,0
---
90,1 ± 2,1
adaptação / sem oxigênio
IV
75,6 ± 2,0 80,5 ± 2,6
---
89,2 ± 1,9
com oxigênio
V
73,8 ± 3,6 77,0 ± 3,3 96,0 ± 1,5 90,4 ± 3,5
com oxigênio
VI
77,4 ± 2,6
---
95,4 ± 1,1 90,0 ± 1,7
com oxigênio
VII
81,5 ± 7,0
--- ---
82,0 ± 6,4
com oxigênio / sem sulfato
Remoção
Global (%)
76,0 ± 3,8 81,0 ± 3,7 96,0 ± 1,3 90,0 ± 2,4
Nas etapas V e VI, as eficiências médias de DQO centrifugada foram superiores
a 95%, com 96±2 e 95±1% para as etapas V e VI, respectivamente (Figura 5.3). Como
média final das etapas estudadas, as eficiências médias de remoção de matéria orgânica,
medidas como DQO bruta, filtrada, centrifugada e devido ao sulfeto, foram iguais a
76±4, 81±4, 96±1 e 90±2%, respectivamente.
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo de operação (dia)
Remoção de Matéria Orgânica (%)
E Bruta E Filtrada E Centrifugada E Sulfeto
I II III IV V VI VII
Figura 5.3. Variação temporal das eficiências de remoção de matéria orgânica (DQO bruta,
filtrada, centrifugada e devido à presença de sulfeto)
O pH manteve-se relativamente constante em todo o período operacional, com
valores médios iguais a 7
,8±0,3 (mínimo: 7,0 e máximo: 8,4) e 7,6±0,1 (mínimo: 7,1 e
59
máximo: 7
,9) no afluente e efluente do reator, respectivamente (Figura 5.4). Estes
valores mostraram sistema tamponado mesmo na presença de oxigênio e, portanto,
adequado para operação sob condições anaeróbias. De acordo com Zitomer & Shrout
(1998), os reatores anaeróbios de mistura completa, após diminuição dos valores de pH,
recuperaram o valor inicial na presença de oxigênio de 1 e 0,1 g O
2
/L
R
.d (L
R
: litro de
reator; que corresponderam a 2,93 e 0,29 mg O
2
/L) após 34 e 28 dias de operação,
respectivamente. Entretanto, em reator controle, estritamente anaeróbio, não ocorreu a
recuperação do valor do pH inicial mesmo após 52 dias. Similarmente, baixas taxas de
aeração podem prevenir a diminuição dos valores de pH em sistemas de alta carga, uma
vez que os ácidos voláteis são potencialmente oxidados, enquanto dióxido de carbono e
hidrogênio são retirados do sistema por arraste.
A alcalinidade efluente manteve-se superior à afluente, indicando que o
metabolismo anaeróbio equilibrou a produção e consumo de AVT (Figura 5.5). As
concentrações médias foram iguais a 511±99 mg CaCO
3
/L (máximo: 651 e mínimo:
151) e 848±141 mg CaCO
3
/L (máximo: 1157 e mínimo: 510) no afluente e efluente,
respectivamente. A concentração de AVT afluente e efluente atingiu valores médios
iguais a 180±79 mg HAc/L (máximo: 524 e mínimo: 91) e 124±21 mg HAc/L
(máximo:
199 e mínimo: 93), respectivamente. Estes dados demonstram que o sistema apresentou-
se estável.
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo de operação (dia)
pH
pH Afluente pH Efluente
I II III IV V VI VII
Figura 5.4. Variação temporal do pH no período experimental
60
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo de operação (dia)
Alcalinidade a bicarbonato (mg/L)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
AVT (mg/L)
AB Afluente AB Efluente AVT Afluente AVT Efluente
I II III IV V VI VII
Figura 5.5. Variação temporal de alcalinidade a bicarbonato e ácidos voláteis totais (AVT)
As concentrações médias de ácidos voláteis efluente analisados por
cromatografia gasosa foram iguais a 9,8, 9,1 e 18,5 mg ácido acético/L nas etapas IV, V
e VI, respectivamente. Ácido propiônico foi detectado apenas em concentrações-traços,
abaixo do limite de detecção.
A eficiência média de remoção de sulfato em cada etapa está representada na
Figura 5.6. Na etapa de adaptação (I, II e III), a média de redução de sulfato foi de
89±11%. Nas etapas IV, V e VI, com a relação DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0, atingiram
redução de sulfato de 92±10, 74±19 e 81±12%, respectivamente, para valores afluentes
médios de 370±80, 758±124 e 729±89 mg/L de sulfato. Observa-se que a etapa V,
quando o reator foi operado com relação DQO/sulfato de 1,6 (1158 mg DQO/L e 758
mg sulfato/L), na presença de oxigênio, apresentou menor redução de sulfato que as
demais condições, atingindo mínimo de 42%. Essa baixa remoção ocorreu devido à
limitação de matéria orgânica afluente em relação à concentração de sulfato aplicada.
Na etapa seguinte (VI), quando tão logo a concentração de DQO foi aumentada para
1448 mg/L, mantendo a concentração de sulfato similar (729 mg/L), a eficiência de
redução de sulfato aumentou para 81%. Este fato reforça a ocorrência de falta de
substrato orgânico no processo de redução de sulfato na condição estudada (referente à
etapa V). A falta pode também ser devido à competição por substrato orgânico para a
redução, uma vez que as populações, nas condições aplicadas, foram mais versáteis e
cresceram em menor tempo do que as próprias BRS.
Entretanto, mesmo ocorrendo algumas variações na redução de sulfato, a
eficiência média global atingiu valor igual a 86±13%.
61
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300 400 500
Tempo de Operação (dia)
Eficiência de Redução de Sulfato (%)
I II III IV V VI VII
Figura 5.6. Variação temporal da eficiência de redução de sulfato
Em todo o período operacional, mesmo após a injeção de oxigênio, a
concentração de metano no sistema foi relativamente constante, com valores médios de
32,9±3,3 μmol/mL de biogás (Figura 5.7). Estas concentrações variaram de 29,9 a 35,2
μmol/mL, respectivamente, na etapa I (início da etapa de adaptação do lodo no reator
com 500 mg DQO/L e 157 mg SO
4
2-
/L, sem oxigênio) e etapa V (1158 mg DQO/L e
758 mg SO
4
2-
/L, na presença de 3 mg/L OD). Portanto, neste trabalho, não foi
observada a inibição da metanogênese em relação à condição controle, representada
pela etapa de adaptação (I, II e III), sem aplicação de oxigênio, com predomínio de
arquéias metanogênicas, conforme observado em análises microbiológicas discutidas
mais adiante. Pelo contrário, a concentração de metano foi ligeiramente superior na
presença de oxigênio comparando-se às demais condições sem oxigênio (Figura 5.7).
Pode-se supor, portanto que, as bactérias facultativas presentes na manta inferior do
reator (P1) tenham consumido o oxigênio e favorecido o crescimento das arquéias
produtoras de metano. Rojas (2007; citado na página 20) também observou maior
produção de metano nos ensaios de AME de amostras do reator em que foi aplicada
oxigênio em relação ao anaeróbio. Zitomer & Shrout (1998) também detectaram
produção de metano na presença de oxigênio em reator anaeróbio em batelada tratando
água residuária contendo sacarose.
62
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 100 200 300 400 500
Tempo de Operação (dia)
Concentração de CH
4
(
μ
mol/mL)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Concentração de H
2
S (
μ
mol/mL)
Concentração de Metano Concentração de Sulfeto
I II III IV V VI VII
Figura 5.7. Variação temporal da concentração de metano e sulfeto no biogás do reator
A partir da etapa II, em que foram adicionadas 240 mg/L de sulfato afluente,
notou-se também a presença de sulfeto nas análises cromatográficas do biogás. As
etapas II, III e IV apresentaram concentrações de sulfeto de 1,2, 1,4 e 1,3 μmol/mL de
biogás. As etapas V e VI apresentaram maiores concentrações de sulfeto, com 1,8
μmol/mL de biogás, onde foram aplicadas 1158 mg DQO/L e 758 mg SO
4
2-
/L, 1448 mg
DQO/L e 729 mg SO
4
2-
/L, respectivamente, e na presença de oxigênio. A concentração
média global de sulfeto no biogás, de todo o período operacional, resultou em 1,5±0,3
μmol/mL de amostra do biogás (Figura 5.7).
Menores eficiências de remoção de matéria orgânica (DQO bruta) e redução de
sulfato ocorreram na etapa V (relação DQO/sulfato de 1,6), ambos com 74%, apesar da
maior concentração de metano observado nessa condição em relação às demais etapas.
Nesta etapa, foram também obtidas maiores concentrações de sulfeto de hidrogênio
(H
2
S) no biogás (1,8±0,3 μmol/mL) e sulfeto dissolvido total (SDT: H
2
S, HS
-
e S
2-
;
96±30 mg/L). O valor do pH efluente foi igual a 7,6±0,1. Portanto, sob estas condições,
foi verificado que mais de 80% de STD apresentou-se na forma ionizada HS
-
, ou seja,
79±24 mg/L.
Dentre as espécies ionizadas (HS
-
e S
2-
) e não-ionizadas (H
2
S), apenas o último é
capaz de atravessar a membrana celular, sendo a forma mais tóxica de sulfeto
(SPEECE, 1996). A forma HS
-
é utilizada na síntese celular de microrganismos
anaeróbios (OUDE ELFERINK et al., 1994).
63
As relações entre sulfeto produzido e quantidade de sulfato removido variaram
de 0,16 a 0,20 durante o período experimental. Entretanto, esses resultados foram
menores do que a relação teórica de 0,33 (S
2-
/SO
4
2-
) porque parte do sulfeto presente no
meio líquido do reator foram convertidos a enxofre elementar (S
0
), ou seja, foi oxidado
biologicamente. A presença de S
0
foi evidenciada pelo material precipitado de cor
amarelada observada nas camadas intersticiais da manta de lodo e no efluente do reator,
que puderam ser verificadas nas amostras do lodo granulado observadas sob
microscopia óptica (Figura 5.15d) e confirmada por EDX (Figura 5.9). A oxidação
biológica parcial de sulfeto a S
0
na presença de baixas concentrações de oxigênio é
também uma alternativa conhecida de conversão biológica de compostos de enxofre
(LENS et al., 1998).
Greben & Maree (2005) obtiveram valores de relações sulfeto/sulfato que
variaram de 0,13 a 0,24 para reator anaeróbio de mistura completa e clarificador
externo, usado no tratamento de efluente de minas de cobre e níquel. Os autores
observaram também a presença de S
0
na interface ar-líquido, no topo do clarificador.
O monitoramento do potencial redox foi realizado a partir da etapa IV, quando
da injeção de oxigênio, uma vez que não foi possível medir a sua concentração no
interior do reator UASB. A biomassa granulada e gás sulfeto causaram interferências na
leitura do OD usado neste experimento. Deste modo, a medida de potencial redox foi
usada para verificar a condição do reator. Essas medidas foram tomadas de quatro
diferentes pontos de amostragem do reator UASB: P1 (parte inferior da manta de lodo),
P2 (parte superior da manta de lodo), P5 (localizado próximo ao sistema separador de
gases) e do efluente do reator. Apesar de estar mais próximo da entrada de oxigênio no
reator, o valor médio de potencial redox na parte inferior da manta (P1) foi igual a
-211±9 milivolts (mV). Nos outros pontos de amostragem, esses valores médios
atingiram -207±9 mV nos pontos 2 e 5 e -208±9 mV no efluente (Figura 5.8). Esses
valores mostraram que esse sistema foi homogêneo e não foi alterado significativamente
nas etapas com presença de oxigênio.
Sarti (2007) avaliou a influência do oxigênio em reatores em batelada (2 L), sob
condições semelhantes deste estudo. O reator alimentado com etanol apresentou valor
inicial de potencial redox igual a 370 mV quando foi aplicada a concentração de 4,4
mg/L de OD. Ao final do ensaio, após 34 dias de operação, esse valor foi igual a -186
mV. O reator controle (sem oxigênio) alimentado com etanol apresentou valor de
potencial redox inicial e final iguais a -29 e -168 mV, respectivamente. Ou seja, o reator
64
com oxigênio apresentou potencial redox mais reduzido no final do ensaio do que o
controle.
-240
-230
-220
-210
-200
-190
-180
-170
-160
250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450
Tempo de Operação (dia)
Potencial Redox (Eh, mV)
Ponto 1 Ponto 2 Ponto 5 Efluente
IV V VI
Figura 5.8. Variação temporal do potencial redox na presença de oxigênio dissolvido
De acordo com Widdel (1988), o potencial redox de redução de sulfato pode
variar de +200 a -200 mV, entre as camadas aeróbias e anaeróbias do ambiente. Desse
modo, no reator UASB, além do oxigênio, em todas as etapas de operação, excetuando-
se a última, o reator era alimentado também com sulfato, propiciando a formação de
sulfeto. Essa forma reduzida, com certeza também contribuiu para seqüestrar o oxigênio
na região inferior da manta de lodo. Portanto, os valores de potencial redox mais
reduzidos, com certeza favoreceram o crescimento e manutenção de bactérias
anaeróbias e arquéias metanogênicas.
O potencial redox mede as quantidades relativas de materiais oxidados, tais
como íons nitrato (NO
3-
) e íons sulfato (SO
4
2-
); e reduzidos, tais como íons amônio
(NH
4
+
). O potencial redox é, portanto indicador da capacidade das moléculas na água
residuária de doar (oxidação) ou receber (redução) elétrons. Esta medida é também
indicador do tipo de respiração que pode ocorrer em determinado ambiente (GERARDI,
2003), conforme valores descritos na Tabela 5.3.
Desta maneira, em águas residuárias ou lodos, para valores de potencial redox
menores do que -50 mV, a degradação de compostos orgânicos é mediada pelos íons
SO
4
2-
, que ocorre na ausência de O
2
. Para valores de potencial redox menores do que
65
-300 mV, ocorre a degradação anaeróbia de compostos orgânicos e a produção de
metano (Tabela 5.3; GERARDI, 2003).
Tabela 5.3. Potencial de óxido-redução e atividade celular
POR
(mV)
Molécula responsável na
degradação de compostos orgânicos
Condição Tipo de respiração
> +50
+50 a -50
< -50
< -100
< -300
O
2
NO
3
-
ou NO
2
-
SO
4
2-
Composto orgânico
CO
2
óxica
anaeróbia
anaeróbia
anaeróbia
anaeróbia
aeróbia ou óxica
anaeróbia ou anóxica
fermentação, redução de sulfato
fermentação, produção de ácidos
fermentação, produção de metano
Fonte: Adaptada de Gerardi (2003)
Portanto, neste trabalho, apesar de o valor de potencial redox ter sido menos
favorável à metanogênese (-200 mV), outros fatores, tais como pH, alcalinidade,
temperatura, concentração de ácidos e condições operacionais devem ter contribuído na
manutenção do processo. Além disso, a estrutura dos lodos granulados fornece também
mais tolerância às condições adversas do meio.
Zitomer & Shrout (1998) relataram que o monitoramento de um sistema pelo
potencial redox pode ser bastante promissor devido à dificuldade de se obterem medidas
acuradas de OD muito próximos de zero. Embora a sobrevivência de microrganismos
metanogênicos sob condições de baixa aeração seja geralmente atribuída à formação de
micronichos anaeróbios, os autores observaram também crescimentos de células
suspensas nessas condições.
5.3 Espectroscopia dispersiva de raio X
Material precipitado de coloração amarela foi observado no efluente do reator
UASB após várias semanas de operação do reator com injeção de oxigênio, causando
entupimento na mangueira do efluente (Figura 5.9a). A estrutura química desse material
foi analisada por meio de EDX (Figura 5.9b) e era composta de enxofre (S) e oxigênio
(O), com porcentagens médias de 93,5±1,3% e 6,5±1,3%, respectivamente. Estas
médias foram obtidas a partir da média aritmética da observação em três pontos
aleatórios do material.
É importante salientar que a produção deste enxofre elementar (S
0
) ocorreu
devido ao contato do efluente com o ar (oxigênio), visto que a parte superior do reator
UASB ficava aberta. Entretanto, ressalta-se a possibilidade de se obter S
0
do tratamento
66
anaeróbio de águas residuárias contendo sulfato e a necessidade de se desenvolver um
mecanismo eficiente de produção e coleta deste material.
C
2 4 6
Energy (keV)
0
2000
4000
6000
ounts
C
O
S
(a) (b)
Figura 5.9. (a) Foto do material precipitado coletado no efluente do reator UASB e (b) análise
de EDX, mostrando a presença de enxofre nesse material.
Tabela 5.4. Composição química do material precipitado analisado por EDX
Composição
química*
Ponto 1
(%)
Ponto 2
(%)
Ponto 3
(%)
Média
(%)
Desvio
Padrão
O 7,86 5,30 6,45 6,5 1,3
S 92,14 94,70 93,55 93,5 1,3
* O: oxigênio e S: enxofre
Na presença de oxigênio, o sulfeto pode ser removido por meio de oxidação
biológica de compostos de enxofre, mediada pelas bactérias redutoras, conforme
reações 5.3.1 e 5.3.2 (JANSSEN et al., 1998).
−−
+→+ OH2S2OHS2
0
2
ΔG
0
= −169,35 kJ/mol (5.3.1)
+−−
+→+ H2SO2O4HS2
2
42
ΔG
0
= −732,58 kJ/mol (5.3.2)
Nessas reações, ΔG
0
é a energia-livre de Gibbs por mol de sulfeto. Sob
condições limitadas de oxigênio, o enxofre elementar é o maior produto final da
oxidação de sulfeto (Reação 5.3.1), enquanto que o sulfato é formado sob condições
limitadas de sulfeto (Reação 5.3.2).
Por questões ecológicas e ambientais, a formação de enxofre elementar é
preferencial, porque é insolúvel, e assim pode ser removido de meios líquidos,
reduzindo-se o conteúdo total do composto enxofre de águas residuárias. Além disso, o
67
enxofre elementar pode ser recuperado e reutilizado. Para a formação de sulfato
consomem-se quatro vezes mais oxigênio (Reação 5.3.2) do que a formação de S
0
(Reação 5.3.1), a partir de sulfeto dissolvido na forma HS
-
e, conseqüentemente, maior
consumo de energia para aeração. Por outro lado, se o objetivo do tratamento é a
redução de sulfato do sistema, a Reação 5.3.2 não é desejada; além de causar
desequilíbrio no ciclo do enxofre, pode causar problemas alimentares e de sabor em
águas de abastecimento (JANSSEN et al., 1999). Outra importante vantagem da
formação de S
0
é que são produzidos simultaneamente os íons hidróxidos, que podem
ser usados para absorver H
2
S do biogás do tratamento de diversas águas residuárias
(JANSSEN et al., 1998).
Especificamente neste trabalho, a reação de formação de enxofre elementar deve
ter sido favorecida (Reação 5.3.1), uma vez que foram obtidas remoções médias de
sulfato de 86% e observados materiais precipitados amarelados no interior do reator,
conforme observados por microscopia óptica, nos pontos P1 e P2 da manta de lodo.
Entretanto, a quantidade de enxofre formado não foi medida, devido à dificuldade de
separação dos precipitados do meio líquido e também por, em princípio, não ter sido
este o objetivo deste trabalho.
5.4 Balanço de Enxofre
O sulfeto de hidrogênio (H
2
S) é um ácido diprótico fraco que se encontra em
equilíbrio de acordo com as seguintes reações (5.4.1):
H
2
S
(aq)
HS
-
(aq)
+ H
+
S
2-
(aq)
(5.4.1)
A reação ácido-base ocorre rapidamente para atingir o equilíbrio.
Conseqüentemente, como o sulfeto é produzido pelas bactérias, rapidamente se ganham
e se perdem prótons para se estabelecer novo equilíbrio com outras espécies de sulfeto.
É, portanto, conveniente considerar a quantidade de sulfeto dissolvido total (SDT) pela
Equação 5.4.2, expressos em mg S/L.
SDT = H
2
S
(aq)
+ HS
-
(aq)
+ S
-
(aq)
(5.4.2)
68
A distribuição das espécies de sulfeto depende do valor de pH (Figura 5.10).
Assim, para que o sulfeto seja extraído da forma líquida, é necessário que esteja
disponível na forma aquosa (H
2
S
(aq)
). Este surge em maior quantidade quando o valor
do pH é menor do que 7 e a forma ionizada (S
2-
) em valor de pH próximo a 14.
A inibição por sulfeto é dependente da sua concentração na forma não-
dissociada (H
2
S) no meio. Para pH de 7, por exemplo, 50% do sulfeto estarão presentes
na forma não-dissociada (H
2
S), mais tóxica, e os outros 50% na forma dissociada (HS
-
e
S
2-
) (Figura 5.10). Sulfeto de hidrogênio também pode ser encontrado na forma gasosa
ou dissolvida na fase líquida.
Figura 5.10. Distribuição de espécies de sulfeto para diferentes valores de pH; faixa de pH
da digestão anaeróbia e
pH ótimo para a digestão metanogênica.
Fonte: Adaptada de Lens et al. (1998)
Reatores anaeróbios com elevada capacidade de retenção de biomassa, tais como
os reatores UASB e filtros anaeróbios, podem tolerar níveis elevados de sulfetos, da
ordem de 170 mg H
2
S/L (SPEECE, 1996) ou 180 a 200 mg H
2
S/L (VISSER et al.,
1993). Especificamente, neste trabalho, as BRS e arquéias metanogênicas não foram
inibidas pelas concentrações de sulfeto produzidas, em nenhuma das relações
DQO/sulfato estudadas, na qual as concentrações de SDT variaram de 44 a 96 mg/L.
Na Tabela 5.5 apresentam-se os resultados para o balanço do enxofre. As
concentrações de espécies H
2
S
(aq)
e HS
-
(aq)
foram calculadas por meio das Equações
(5.4.3) e (5.4.4), respectivamente (KALYUZHNYI et al., 1997), que são dependentes de
valores de pH.
69
]SDT[*
101
1
]SH[
)pKpH(
)aq(2
−
+
=
(5.4.3)
aq2)aq(
]SH[]SDT[]HS[ −=
−
(5.4.4)
Nas reações 5.4.3 e 5.4.4, pK = 6,95 (a 35
o
C) e [STD] é a concentração de
sulfeto dissolvido efluente.
Os valores de S- SO
4
2-
Af
, S- SO
4
2-
Ef
, S-H
2
S
(aq)
, S-HS
-
(aq)
e S-H
2
S
(gás)
da Tabela
5.5 foram calculadas estequiometricamente. Demais cálculos foram realizados pelas
Equações 5.4.5 a 5.4.8.
S-Total
Ef
= S-H
2
S
(aq)
+ S-HS
-
(aq)
+ S-H
2
S(gas) (5.4.5)
S-Residual = S- SO
4
2-
Af
– S-Total
Ef
(5.4.6)
100*
SOS
sidualReS
sidualRemPorcentage
2
Af4
−
=
-
-
(5.4.7)
(
)
100*
SOS
sidualReSSOS
ConversãodeEficiência
2
Af4
2
Af4
−
−
−
=
-
--
(5.4.8)
Desta maneira, o balanço de enxofre foi realizado a partir de concentrações
conhecidas (analisadas) de sulfato afluente (S-SO
4
2-
Af
) e efluente (S-SO
4
2-
Ef
), sulfeto
dissolvido no meio líquido e no biogás, apresentadas na Tabela 5.5. Observa-se que a
fração de S-S
2-
provavelmente não foi produzida ou foi mínima porque esta espécie de
sulfeto é favorecida em valores de pH maiores do que 8 (Figura 5.10), e os valores de
pH de operação do reator UASB variaram de 7 a 8.
Nos cálculos do balanço de enxofre da Tabela 5.5 foram usadas as concentrações
médias de cada etapa de operação do reator UASB.
70
Tabela 5.5. Concentrações médias de sulfato e sulfeto (em mg/L), pH, porcentagem residual e
eficiência de conversão em cada etapa de operação
Etapa
S-SO
4
Af
S-SO
4
Ef
S-H
2
S
(aq)
S-HS
-
(aq)
S-H
2
S
(gas)
pH
Ef
S-Total
Ef
S
Residual
Residual
%
Eficiência de
Conversão (%)
I 52,3 6,2 4,3 21,7 7,7 32,1 20,2 38,6 61,4
II 80,0 5,0 7,0 33,2 38,4 7,6 83,6 -3,6 -4,6 * 104,6 *
III 115,0 13,0 12,2 42,0 44,8 7,5 111,9 3,1 2,7 97,3
IV 123,3 9,1 14,3 53,0 41,6 7,5 118,0 5,3 4,3 95,7
V 252,7 68,0 17,3 78,6 57,6 7,6 221,5 31,2 12,3 87,7
VI 243,0 53,0 17,0 73,5 57,6 7,6 201,1 41,9 17,3 82,7
VII - - - - - - - - - -
(-) não-observado; *resultados provenientes de erro no balanço
0
50
100
150
200
250
300
I II III IV V VI VII
Etapas de Operação
S (mg/L)
S-SO4 Af S-SO4 Ef S-H2S(aq) S-HS-(aq) S-Total Ef
Figura 5.11. Balanço de enxofre
S-SO
4
Af: sulfato afluente, S-SO
4
Ef: sulfato efluente, H
2
S(aq): sulfeto de hidrogênio,
HS
-
(aq): sulfeto na forma ionizada
As frações de enxofre provenientes da oxidação química ou utilizados no
metabolismo microbiano para as formas de sulfito (S
2
O
3
) e enxofre elementar (S
0
) não
foram consideradas nesses cálculos, uma vez que não foram quantificadas. Sarti (2007)
não observou quantidades significativas de S
2
O
3
no final de operação do reator em
batelada contendo sulfato e oxigênio (4,4 mg OD/L). Esse reator foi alimentado com o
mesmo meio sintético e inoculado com mesmo lodo (na forma suspensa) usados no
presente trabalho, e acrescido de etanol como fonte orgânica. Portanto, no reator UASB
as frações de enxofre provenientes de S
2
O
3
devem ter sido mínimas ou ausentes.
De acordo com o balanço de enxofre realizado, em termos globais, a eficiência
média de conversão atingiu 88%. Este valor é equivalente à remoção de sulfato obtido
nos ensaios, com eficiência média global de 86% (Figura 5.6).
71
5.5 Granulometria do inóculo e da manta de lodo do reator
UASB
Na Figura 5.12 apresenta-se uma imagem dos grânulos do lodo dispostos em
placa de Petri, capturados em câmera acoplada ao microscópio, para realizar sua
contagem e medição. A distribuição dos grânulos foi baseada no diâmetro médio de
cerca de 1000 grânulos dispostos em 5 a 7 placas de Petri.
Figura 5.12. Foto dos grânulos em placa de Petri para realização da granulometria
A porcentagem dos diâmetros médios dos grânulos coletados no decorrer dos
ensaios está apresentada na Tabela 5.6 e representada na Figura 5.13. Os diâmetros
médios dos grânulos do inóculo variaram de 0,5 a 4,7 mm. Os grânulos com 2 a 3 mm
de diâmetro médio contaram com 71%. Valores de 19, 10 e 0,6% foram obtidos para os
grânulos de diâmetros médios variando de 1 a 2 mm, 3 a 4 mm e 4 a 5 mm,
respectivamente.
Em todas as etapas estudadas, os grânulos com diâmetros médios de 2 a 3 mm
apresentaram-se em maiores porcentagens, com variações de 68 a 83%. Os grânulos
com diâmetros médios de 1 a 2 mm e 3 a 4 mm variaram de 6 a 29% e 0,7 a 14%,
respectivamente. A condição DQO/sulfato de 1,6 (com oxigênio) apresentou menor
porcentagem média de grânulos de 2 a 3 mm (72 e 68% em P1 e P2, respectivamente) e
maior porcentagem média de grânulos de 1 a 2 mm (27 e 29% em P1 e P2,
respectivamente). Demais tamanhos, com 0,5 a 1 mm e 4 a 5 mm contaram com
porcentagens menores que 1% do total dos grânulos amostrados.
Saiki et al. (2002) também observaram o predomínio de grânulos de 2 a 3 mm de
diâmetro em todos os dez lodos granulados estudados. Os autores investigaram as
72
características dos lodos granulados provenientes de reatores UASB em escala real
usados no tratamento de águas residuárias de cervejaria.
De acordo com o teste estatístico Anova (α = 0,05), não houve diferença
significativa na variação dos tamanhos dos grânulos no perfil do reator no período
operacional estudado (Tabela 5.6 e Figura 5.13). O diâmetro médio geral dos grânulos
da manta do lodo nos pontos P1 e P2 durante o período operacional foi igual a 2,3±0,4
mm (média ponderada de todas as amostras). A porcentagem média geral de grânulos de
diâmetros de 1 a 2 mm, 2 a 3 mm e 3 a 4 mm foram iguais a 18±9%, 76±5% e 6±5%,
respectivamente.
Tabela 5.6 Variação dos diâmetros médios dos grânulos do inóculo e da manta de lodo do
UASB
Variação do tamanho dos grânulos (%)
Amostra *
0,5 a 1 (mm) 1 a 2 (mm) 2 a 3 (mm) 3 a 4 (mm) 4 a 5 (mm)
Inóculo - 19 71 10 0,6
P1-Estab - 7 83 10 0,1
P2-Estab 0,2 13 80 7 0,3
P1-R3,0 0,2 7 79 14 0,2
P2-R3,0 0,4 6 82 12 0,1
P1-R1,6 0,1 27 72 2 -
P2-R1,6 0,1 29 68 3 -
P1-R2,0 0,0 12 82 5 -
P2-R2,0 0,2 22 75 2 -
P1-Sem sulfato 0,2 25 75 1 -
P2-Sem sulfato - 27 71 2 -
Média Geral 0,1 18 76 6 0,1
Desvio Padrão 0,1 9 5 5 0,2
* P1: Ponto 1, P2: Ponto 2, Estab: estabilização, R3,0: DQO/sulfato=3,0, R1,6: DQO/sulfato=1,6,
(-) não foram observados
No decorrer dos ensaios observaram-se também grânulos com diferentes
colorações (marrom, cinza ou preto), mas não foram analisados profundamente, porque
o objetivo era analisar a comunidade microbiana dos grânulos nas diferentes etapas de
operação do reator UASB. Observou-se também “fragmentos”, em forma de “cascas”,
provavelmente provenientes de grânulos desfeitos durante a operação do reator. Como o
lodo granulado foi inicialmente bem adaptado às condições do reator, não se observou
arraste significativo do lodo no decorrer da operação. Isto pode também indicar que não
houve perda significativa de lodo por problemas operacionais ou presença de grânulos
floculentos ou ocos.
73
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 a 2 2 a 3 3 a 4
Diâmetro médio (mm)
Total de grânulos (%)
Inóculo
P1-Estab
P2-Estab
P1-R3,0
P2-R3,0
P1-R1,6
P2-R1,6
P1-R2,0
P2-R2,0
P1-Sem sulfato
P2-Sem sulfato
Figura 5.13. Variação dos diâmetros médios dos grânulos do inóculo e da manta de lodo (P1:
Ponto 1, P2: Ponto 2, Estab: estabilização, R3,0: DQO/sulfato=3,0, R1,6: DQO/sulfato=1,6). As
porcentagens dos grânulos de tamanhos 0,5 a 1 mm e 4 a 5 mm foram menores que 1% e não
estão representados nesta figura.
De acordo com Díaz et al. (2006), diferentes tipos morfológicos de grânulos
refletem estágios distintos no desenvolvimento do lodo granulado, como descritos a
seguir: (1) grânulos “jovens” são pequenos, de cor preta e compacta, correspondendo às
células ativas, geralmente associadas às bactérias Gram-negativas (principalmente α-
Proteobacteria) e arquéias metanogênicas, tais como Methanospirullum sp. e
Methanosarcina sp.; (2) os grânulos mais abundantes são de cor cinza de forma esférica
ou elipsoidal. O crescimento microbiano nesses grânulos ocorre principalmente nas
camadas periféricas devido à falta de nutrientes e problemas de difusão no meio líquido.
As bactérias predominantes são as Gram-positivas e as arquéias metanogênicas
pertencentes principalmente a
Methanosaeta sp. e (3) os grânulos de cor marrom, de
maiores tamanhos, apresentam estruturas amorfas com áreas vazias na parte central e
canais que penetram para o interior dos grânulos, correspondem a grânulos “velhos”.
Methanosaeta sp. podem desempenhar papel importante neste estágio do grânulo.
Del Nery et al. (2002) monitorou as características dos grânulos em um reator
UASB retangular de 450 m
3
de tratamento de águas residuárias de abatedouro de aves.
Os grânulos foram coletados de três pontos de amostragem distintos (P1: 0,6 m, P2: 1,2
m e P3: 1,8 m de altura do reator) no final de operação do reator (1228 dias), com
eficiência média de remoção de matéria orgânica (DQO) de 85%. Os grânulos com
diâmetros médios de 0,6 a 1,5 mm predominaram no ponto P1; e os de 0,5 a 1,0 mm nos
74
pontos P2 e P3. Os autores verificaram predomínio de arquéias metanogênicas nas três
amostras de grânulos, com 80,8, 77,7 e 85,4% em P1, P2 e P3, respectivamente, de
células detectadas com a sonda ARC915 por meio de FISH. Dentre estas populações
metanogênicas, as porcentagens de
Methanosaeta sp. contaram com 27,6, 21,0 e 20,5
em P1, P2 e P3, respectivamente, de células detectadas com a sonda MX825, específica
para esse grupo microbiano. Portanto, embora o reator tenha sido operado por longo
período (1228 dias), as populações microbianas nos grânulos cresceram ou decaíram, ou
ambos, devido ao balanço dinâmico entre os processos.
Especificamente, neste trabalho, os grânulos de tamanho intermediário (2 a 3
mm) apresentaram-se em maiores porcentagens com 76% dos grânulos quantificados
(Figura 5.13). Como os grânulos de tamanhos menores, de 1 a 2 mm, apresentaram-se
em porcentagens significativas (17%), provavelmente, ocorreu formação de novos
grânulos durante o processo operacional e, portanto, não houve diminuição significativa
da biomassa. O monitoramento da biomassa não foi realizado, mas observou-se
diariamente por meio visual, que a manta de lodo não diminuiu significativamente no
decorrer dos ensaios, mantendo-se na altura correspondente à aproximadamente 3,5
litros de lodo no reator UASB.
5.6 Caracterização microbiana do inóculo e da manta de lodo
do UASB
A caracterização microbiana do lodo granulado do inóculo e da manta do reator
UASB foi realizada por microscopia óptica, FISH, PCR/DGGE e seqüenciamento. As
amostras de manta de lodo foram coletadas de dois pontos de amostragem (P1 e P2) do
reator, no final de cada etapa experimental (DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0 e na ausência
de sulfato, na presença de 3,00±0,65 mg O
2
/L). Desta maneira, foi possível analisar a
comunidade microbiana da manta inferior e superior do lodo.
5.6.1 Caracterização microbiana por meio de microscopia óptica
Na Tabela 5.7 está apresentada a caracterização morfológica do lodo granulado
do inóculo realizado sob microscopia óptica. Neste lodo, foi observado predomínio de
bacilos com extremidades arredondadas, bacilos ovalados e cocos, além de arquéias
75
metanogênicas semelhantes à
Methanosaeta sp. Foram observados também presença de
bacilos e cocos fluorescentes e bacilos delgados (Tabela 5.7 e Figura 5.14).
Este inóculo tem sido usado em vários estudos no Laboratório de Processos
Biológicos (LPB) – SHS-EESC-USP, tais como trabalhos de Ribeiro (2001), Hirasawa
(2003), Carmo (2004) devido à sua diversidade microbiana.
Tabela 5.7.Caracterização morfológica do inóculo sob microscopia óptica
MORFOLOGIA Inóculo
Arquéias Metanogênicas
Methanosarcina sp. ++
Methanosaeta sp. ++++
Cistos de sarcinas +
Bacilos fluorescentes + ++
Cocos fluorescentes +++
Bactérias
Bacilos com extremidades afiladas -
Bacilos com extremidades arredondadas + + ++
Bacilos curvos: Tipo I +
Tipo II + +
Bacilos delgados + ++
Bacilos ovalados +++ +
Bacilos com grânulos -
Bacilos esporulados -
Cocos ++++
Cocos em cadeia -
Espiroqueta -
Filamentos ++
Filamento septado -
(++++) predominantes, (+++) freqüentes, (++) pouco freqüentes, (+) raros, (-) não foram observados
Esta observação
in situ das amostras biológicas é importante para se decidir na
escolha de sondas ou
primers específicos a serem aplicadas nas análises por técnicas de
Biologia Molecular (FISH e PCR/DGGE). Esta escolha, com conhecimento prévio da
amostra, é importante pelo fato de que essas técnicas ainda são sofisticadas e, portanto,
requer minimizar custos e evitar usos inconvenientes.
76
(a) (b)
Figura 5.14. Morfologias de microrganismos observados na amostra do inóculo sob microscopia
óptica (a) diversidade morfológica em contraste de fase e (b) arquéias metanogênicas
semelhantes à Methanosarcina sp. em fluorescência (1600x).
Na Tabela 5.8 está apresentada a caracterização morfológica da manta de lodo
do reator UASB em dois diferentes pontos de amostragem: manta inferior (P1) e
superior (P2). As amostras foram coletadas no final de cada condição DQO/sulfato (3,0,
1,6 e 2,0) e na ausência de sulfato, na presença de aproximadamente 3 mg O
2
/L.
Observou-se que, após a injeção de oxigênio, não houve mudança brusca na
freqüência de morfologias das comunidades microbianas no reator UASB nas condições
estudadas. Evidenciando assim que, a presença de oxigênio não afetou
significativamente a comunidade microbiana na manta de lodo do reator. Em todas as
amostras observou-se predomínio de arquéias metanogênicas semelhantes à
Methanosaeta sp. (Tabela 5.8).
A condição DQO/ sulfato de 1,6 favoreceu ligeiramente o crescimento de
bacilos ovalados em relação às demais condições, como indicada na Figura 5.15c.
Outras morfologias também foram observadas nas diferentes condições de operação,
sob microscopia óptica, como apresentada nas Figuras 5.15 e 5.16. Foram observados
também precipitados de enxofre elementar, de coloração amarela (Figura 5.15d).
77
Tabela 5.8. Caracterização morfológica da manta de lodo do reator UASB nos Pontos 1 e 2, sob
microscopia óptica, nas condições DQO/ sulfato de 3,0, 1,6, 2,0 e sem sulfato, na presença de
aproximadamente 3 mg/L de OD
DQO/SO4 = 3,0 DQO/SO4 = 1,6 DQO/SO4 = 2,0 Sem sulfato
MORFOLOGIA
Ponto 1 Ponto 2 Ponto 1 Ponto 2 Ponto 1 Ponto 2 Ponto 1 Ponto 2
Arquéias Metanogênicas
Methanosarcina sp. + ++ ++ ++ + + ++
++
Methanosaeta sp. ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
++++
Cistos de sarcinas - - - - - - -
-
Bacilos fluorescentes ++ ++ + + + ++ +
+
Cocos fluorescentes - - - - - - -
-
Bactérias
Bacilos com extremidades
afiladas
- -
-
Bacilos com extremidades
arredondadas
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Bacilos curvos: Tipo I ++ + + + + + +
+
Tipo II ++ + + + + + +
+
Bacilos delgados + + + ++ + +
Bacilos ovalados +++ +++ ++++ ++++ +++ +++ +++
++
Bacilos com grânulos - - - - - - -
-
Bacilos esporulados + + + + + ++ +
+
Cocos ++ ++ + + ++ ++ +
+
Cocos em cadeia + + +++ +++ ++ ++ +
+
Espiroqueta - - + + - - -
-
Filamentos + + + + + + +
+
Filamento septado - - - - - - -
-
(++++) predominantes, (+++) freqüentes, (++) pouco freqüentes, (+) raros, (-) não foram observados
Os bacilos ovalados (Figura 5.15c) podem ser associados ao grupo
Desulfobacter sp., pertencentes às BRS da subdivisão δ-Proteobacteria, do grupo II
(oxidadoras completas), usam acetato como único doador de elétrons e oxidam a CO
2
por meio do ciclo do ácido cítrico (MADIGAN
et al., 2000).
Laanbroek et al. (1984) observaram a coexistência de
Desulfobacter postgatei
D.A41 e Desulfovibrio baculatus H.L21 na presença de sulfato (3840 mg/L) e etanol
(920 mg/L), ou seja na relação DQO/sulfato de 0,24. Esses ensaios foram executados
em quimiostatos a 30
o
C, pH 7 e com taxa de diluição de 0,02/h. Após a mistura das
duas culturas, a porcentagem de
Desulfobacter postgatei D.A41 diminuiu de 74 para
16%; entretanto, o consumo de acetato foi maior. Deste modo, essa coexistência foi
resultado do consumo total por
Desulfobacter postgatei D.A41 do acetato, produzido na
oxidação do etanol, pelas culturas de
Desulfovibrio baculatus H.L21. Entretanto, o uso
adicional de etanol por
Desulfobacter postgatei D.A41 também pode ter ocorrido.
78
(a) (b)
(c) (d)
Figura 5.15. Morfologias de microrganismos observadas sob microscopia óptica nas amostras
do reator UASB na presença de oxigênio: (a) diversidade morfológica e (b) arquéias
metanogênicas semelhantes à Methanosaeta sp. no ponto P1 e DQO/sulfato de 2,0; (c) bacilos
ovalados no ponto P1 e DQO/sulfato de 1,6; (d) presença de enxofre elementar no ponto P2 e
DQO/sulfato de 3,0 (1600x).
Geralmente, as arquéias metanogênicas, tais como
Methanosarcina sp. e bacilos
fluorescentes, são consideradas serem mais sensíveis ao oxigênio, fixando-se nas
camadas interiores dos grânulos. Neste estudo, não foi possível verificar a distribuição
espacial das bactérias e arquéias metanogênicas nos grânulos. Entretanto, após a
desestruturação da forma granulada esses últimos microrganismos foram observados em
todas as amostras (Figura 5.16b, d).
79
(a) (b)
(c) (d)
Figura 5.16. Morfologias de microrganismos observados sob microscopia óptica nas condições
DQO/sulfato = 3 e 3 mg/L OD do reator UASB: (a) arquéias metanogênicas semelhantes a
Methanosaeta sp., em P1; (b) bacilos fluorescentes em P2: (c) diversidade morfológica em P2 e
(d) arquéias metanogênicas semelhantes a Methanosarcina sp. em P2 (1600x).
De acordo com Kato et al. (1997), a espessura e arquitetura do biofilme dos
grânulos representam barreira física para a difusão do oxigênio, criando zonas
segregadas com baixas concentrações de oxigênio na sua região central. Desse modo,
pode existir nesses micronichos, a limitação de oxigênio, a qual estará correlacionada ao
substrato disponível e concentração de oxigênio na camada superficial em contato com
microrganismos. Os microrganismos anaeróbios do interior dos biofilmes estariam
protegidos do contato com o oxigênio, permitindo a ocorrência de desnitrificação,
redução de sulfato ou metanogênese.
80
5.6.2 Caracterização microbiana por meio de FISH
O resultado da quantificação microbiana na amostra do inóculo por meio de
hibridação
in situ fluorescente (FISH) está apresentado na Figura 5.17. O lodo
granulado apresentou-se predominantemente metanogênico, com 68,1% (erro padrão –
EP: 3,1%) de microrganismos detectados com a sonda ARC915. As morfologias
predominantes foram arquéias metanogênicas semelhantes à
Methanosaeta sp. As
porcentagens de bactérias totais (detectadas com a sonda EUB338) e BRS (detectadas
com a sonda SRB385), contaram com 37,9% (EP: 1,4%) e 14,5% (EP: 0,8%),
respectivamente (Figura 5.17).
A condição metanogênica desse lodo granulado foi relatada anteriormente por
Hirasawa (2003), cujas porcentagens médias de bactérias totais (EUB338) e arquéias
metanogênicas (ARC915) foram iguais a 44,8% (EP: 2,7%) e 59,5% (EP: 1,8%),
respectivamente. As arquéias metanogênicas predominantes foram os bacilos,
filamentos e sarcinas.
Ambos os lodos granulados, quantificados por Hirasawa (2003) e a do presente
estudo, foram provenientes do mesmo reator UASB usado no tratamento de águas
residuárias de abatedouro de aves (Avícola Dacar S/A, Tietê – SP), porém coletado em
períodos diferentes.
Em todas as amostras, tanto no lodo granulado do inóculo quanto da manta de
lodo do reator UASB coletadas nas diferentes etapas experimentais deste estudo, os
microrganismos corados com a sonda NON338 (controle negativo) foram mínimas ou
ausentes. O teste de autofluorescência dos microrganismos também não indicou
quantidades significativas nas amostras. Portanto, a quantificação por meio do FISH
pôde ser realizada com eficiência neste trabalho.
Microrganismos semelhantes à
Methanosaeta sp. detectados com a sonda
específica para o Domínio
Archaea (ARC915) estão apresentados na Figura 5.18.
81
0
20
40
60
80
100
120
Inóculo
Total de células (%)
EUB338
ARC915
SRB385
EUB338+ARC915
Figura 5.17. Porcentagens de células totais do inóculo representadas pela quantidade de RNAr
16S microbiano para os membros do Domínio Bacteria (EUB338), bactérias redutoras de
sulfato (BRS) da subdivisão delta de Proteobacteria (SRB385), Domínio Archaea (ARC915) e
a soma dos dois Domínios (EUB338+ARC915). As barras indicam o erro padrão.
(a) (b) (c)
Figura 5.18. Microrganismos do inóculo detectados por meio do FISH: (a) coloração com
DAPI, (b) sonda específica para o Domínio Archaea (ARC915) e (c) em contraste de fase
(1250x).
Os resultados da análise da comunidade microbiana das amostras da manta de
lodo realizada por meio de FISH estão apresentados nas Tabelas 5.9 e 5.10 e
representados na Figura 5.19. As amostras foram coletadas no final de cada etapa
estudada, ou seja, antes de alterar as condições para a etapa seguinte. Foram coletadas
amostras dos pontos P1 e P2 do reator UASB, permitindo-se analisar a comunidade
microbiana da manta inferior e superior do lodo. Em todas as etapas de operação do
reator houve predomínio de arquéias metanogênicas detectadas pela sonda ARC915.
Nas etapas I, II e III, as quais corresponderam ao período de adaptação da manta
de lodo no reator UASB, com aumento gradativo das concentrações de etanol (500±40,
675±56 e 1013±56 mg/L) e de sulfato (157±29, 240±23 e 345±74 mg/L), a
82
quantificação por FISH só foi realizada no final da condição de estabilização da manta
no reator, ou seja, no final da etapa III.
Tabela 5.9 Valores percentuais obtidos no FISH na amostra do ponto P1 e seus
respectivos erros padrões
Etapa
EUB338
(%)
ARC915
(%)
SRB385
(%)
SRB 385
% rel. a EUB 338
EUB338+ARC915
(%)
Inóculo
37,9 (1,4) 68,1 (3,1) 14,5 (0,8) 38,3 106,0
III
36,2 (1,4) 68,0 (2,7) 10,1 (0,6) 27,9 104,3
IV
25,6 (1,6) 75,9 (2,2) 9,6 (1,0) 37,4 101,5
V
24,1 (1,6) 77,1 (1,0) 10,8 (0,5) 44,7 101,2
VI
14,0 (1,4) 85,4 (0,7) 8,9 (0,9) 63,8 99,4
VII
9,6 (0,9) 90,1 (0,8) 7,9 (0,5) 82,4 99,7
Tabela 5.10 Valores percentuais obtidos no FISH na amostra do ponto P2 e seus
respectivos erros padrões
Etapa
EUB338
(%)
ARC915
(%)
SRB385
(%)
SRB 385
% rel. a EUB 338
EUB338+ARC915
(%)
III
37,4 (1,7) 67,0 (1,4) 10,9 (0,6) 29,2 104,4
IV
21,0 (1,2) 78,6 (0,8) 10,8 (0,7) 51,4 99,6
V
27,5 (2,0) 73,4 (0,8) 19,8 (1,5) 72,0 101,0
VI
17,2 (1,2) 83,1 (2,7) 9,0 (0,6) 52,4 100,2
VII
15,5 (0,8) 84,5 (1,7) 8,7 (1,1) 55,9 100,0
A soma das porcentagens de células hibridadas com as sondas específicas para
os Domínios
Bacteria (EUB338), Archaea (ARC915) e Eukarya (EUK516) seria igual
a 100, considerando que todas as formas vivas conhecidas pertencem a um desses três
domínios (WOESE, 1987). Neste trabalho, a sonda EUK516 não foi aplicada, porque os
microrganismos deste Domínio não são comumente encontrados no ambiente estudado.
Portanto, a soma das porcentagens de células hibridadas com as sondas EUB338 e
ARC915 deveria ser próxima de 100. Os resultados obtidos neste trabalho (Figura 5.19)
variaram de 99,4% a 106,0%. Essa subestimação e superestimação nos valores podem
ter ocorrido devido à presença de polímeros e partículas abióticas que interferiram na
metodologia. Variações semelhantes na contagem foram observadas também por Araújo
(2001), no estudo da dinâmica e composição microbiana dos biofilmes anaeróbios no
sistema “Modified Robbins Device” (MRD), e Domingues (2001), na avaliação da
metanogênese e sulfetogênese na presença de lactato, acetato, propionato e sulfato, sob
condições termofílicas (55±1°C), utilizando espuma como material suporte para
imobilização da biomassa.
83
Observa-se nas Figuras 5.19a e 5.19b que, houve ligeiro aumento nas
comunidades de arquéias metanogênicas nas amostras dos pontos P1 e P2 das etapas de
estabilização (III) até o esgotamento do sulfato no meio (VII). As porcentagens destes
microrganismos detectados com a sonda ARC915 variaram de 68,0 a 90,1% no ponto
P1 e de 67,0 a 84,5% no ponto P2 (Tabelas 5.9 e 5.10). Sendo que, esses maiores
valores corresponderam à etapa final, sem sulfato (VII).
As porcentagens de bactérias totais (EUB338) variaram de 9,6 a 36,2% no ponto
P1 e de 15,5 a 37,4 no ponto P2 (Tabelas 5.9 e 5.10).
Estes resultados demonstraram que as relações sintróficas entre bactérias
facultativas e arquéias metanogênicas, na presença de sulfato, foram favorecidas na
presença de 3,00±0,65 mg O
2
/L (etapas IV, V e VI), especificamente na condição
DQO/sulfato de 2,0 (VI: 1448±134 mg DQO /L e 729±89 mg SO
4
2-
/L), que contaram
com 85,4 e 83,1% em P1 e P2, respectivamente, destes microrganismos em relação ao
total de células quantificadas. A concentração de metano também foi ligeiramente maior
nas etapas IV e V, na presença de oxigênio, com médias iguais a 34,9 e 35,2 μmol/mL
de biogás, respectivamente. Sendo que, no período de adaptação (sem oxigênio), estas
médias foram de 31,9 μmol/mL de biogás.
Por outro lado, as condições nutricionais impostas no experimento (meio basal
Zinder, acrescido de etanol e sulfato), provavelmente foram restritivas para sustentar o
crescimento de 37,9% de bactérias totais detectadas no inóculo. Esta comunidade
diminuiu gradualmente em função do tempo de operação (Figura 5.19), provavelmente
desfavorecida pela reduzida diversidade de compostos orgânicos presentes no meio, que
propiciou um grupo metabólico seletivo capaz de usar etanol na presença de oxigênio.
Todavia, as arquéias metanogênicas utilizam compostos finais da degradação anaeróbia,
tais como hidrogênio, acetato, dióxido de carbono, metanol e metilaminas (MADIGAN
et al., 2000).
Portanto, nas condições estudadas, os consórcios de bactérias aeróbias ou
facultativas possivelmente presentes na manta inferior (P1) do reator UASB podem ter
favorecido a produção de tais compostos para promover crescimento e manutenção de
arquéias metanogênicas. A presença desses consórcios microbianos pode ter sido maior
em P1 do que em P2 porque o gás oxigênio foi adicionado na entrada do reator UASB.
Entretanto, esses dados não foram avaliados na prática.
84
0
20
40
60
80
100
120
III IV V VI VII
Etapa de operação
Total de Células (%)
EUB338 ARC915 SRB385 EUB338+ARC915
(a)
0
20
40
60
80
100
120
III IV V VI VII
Etapa de operação
Total de Células (%)
EUB338 ARC915 SRB385 EUB338+ARC915
(b)
Figura 5.19. Composição da comunidade microbiana nas amostras (a) do ponto P1 e (b) do
ponto P2 nas respectivas etapas de operação do reator representadas pela quantidade de RNAr
16S microbiano para os membros do Domínio Bacteria (EUB338), bactérias redutoras do íon
sulfato (BRS) da subdivisão delta de Proteobacteria (SRB385), Domínio Archaea (ARC915) e
a soma dos dois Domínios (EUB338+ARC915). As barras indicam o erro padrão. A linha
contínua foi traçada apenas para melhor visualização.
85
Lodos anaeróbios granulados também têm apresentado alta tolerância ao
oxigênio na presença de etanol e levado à produção de metano na presença de até 23 mg
O
2
/L no meio líquido (KATO et al., 1993).
Concomitantemente, as bactérias acetogênicas podem ter usado etanol,
produzindo ácido acético e hidrogênio. Além disso, a energia disponível na oxidação de
etanol é dependente do aceptor final de elétrons presente no sistema anaeróbio, ou
ainda, da presença de bactérias hidrogenotróficos presentes no reator. Assim,
possivelmente as BRS utilizadoras de etanol podem ter conduzido a degradação via
sulfetogênese.
Quanto às BRS detectadas com a sonda SRB385, as porcentagens médias
variaram de 7,9 a 10,8% nas amostras do ponto P1 e de 8,7 a 19,8% no ponto P2
(Tabelas 5.9 e 5.10; Figura 5.19). Essas porcentagens correspondem aos valores em
relação ao total de microrganismos quantificados. Em todas as condições, as
morfologias predominantes de BRS foram bacilos ovalados.
Portanto, estes resultados demonstraram que, na presença de 3,00±0,65 mg/L de
oxigênio no meio, a condição da etapa V (DQO/sulfato de 1,6: 1158 mg DQO/L e 758
mg SO
4
2-
/L) favoreceu maior crescimento de BRS (17,6%, média de P1 e P2). Esses
valores foram próximos às médias quantificadas no lodo granulado do inóculo (15,8%).
Nesta etapa, as eficiências médias de redução de sulfato e remoção de matéria orgânica
(DQO) foram ambas iguais a 74%. Possivelmente, as BRS foram favorecidas devido à
maior disponibilidade de sulfato do que nas etapas operadas com relação DQO/sulfato
de 3,0 e 2,0, em condições semelhantes, ou seja, na presença de oxigênio.
O’Reilly & Colleran (2006) também observaram ampla diversidade de
microrganismos no lodo granulado do inóculo, proveniente de reator UASB de
tratamento de águas residuárias de indústria de processamento de ácido cítrico. Na
condição DQO/sulfato de 4, os microrganismos predominantes foram bacilos curvos
(similares a
Desulfovibrio sp.), cocobacilos em formas de bulbos (semelhantes à
Desulfobulbus sp.). Esta diversidade se manteve na condição DQO/sulfato de 2, mas
houve predomínio de
Desulfovibrio sp. (quando se teve maior concentração de sulfato
afluente) determinado por meio de FISH e predomínio de
Methanosaeta sp. observados
sob MEV.
Para estimar as proporções de bactérias e BRS presentes em cada etapa deve-se
estimar a porcentagem de BRS em relação ao número total de bactérias totais detectadas
pela sonda EUB338, uma vez que esta sonda hibrida também as populações de BRS.
86
Então, estimando-se as porcentagens médias de BRS em relação ao número total de
bactérias (EUB338), esses valores corresponderam à 27,9, 37,5, 44,8, 63,6 e 82,0% nas
etapas III, IV, V, VI e VII do ponto P1, respectivamente. Para as amostras quantificadas
no ponto P2, estes valores foram correspondentes a 29,1, 51,4, 72,0, 52,3, e 56,1% nas
etapas III, IV, V, VI e VII, respectivamente (Tabelas 5.9 e 5.10). Desta maneira, na
presença de sulfato, as BRS foram mais tolerantes à presença de oxigênio do que as
demais bactérias, principalmente nas etapas VI (63,6% em P1) e V (72,0% em P2).
Na etapa VII, quando foi esgotada a fonte de sulfato afluente, a porcentagem de
BRS em relação às bactérias totais quantificadas atingiu 82,0%, no ponto P1 da manta
de lodo. No ponto P2, esta porcentagem foi igual a 56,1%. Isso também evidencia o fato
de que as BRS foram mais tolerantes ao oxigênio do que outras bactérias presentes no
reator e capazes de manterem-se no sistema utilizando outra via metabólica, ou seja,
respiração aeróbia e fermentativa. A presença de populações de BRS foi também
relatada em ambientes sem sulfato por Wu et al. (1992). O’Flaherty & Colleran (1999)
verificaram que as BRS cresceram fermentativa e acetogenicamente em lodos adaptados
a etanol e outros ácidos graxos voláteis, mas sem sulfato. A habilidade das BRS em se
adaptar aos sistemas metabólicos alternativos explicou a resposta rápida obtida no reator
alimentado com sulfato quando da adição deste composto.
De acordo com Amann et al. (1995), o FISH apresenta limite de detecção
celular, ou seja, células em concentrações inferiores a 10
4
organismos/mL não são
detectadas por esta técnica. Assim, pode ser necessário concentrar as células-alvo das
amostras. Entretanto, muitas vezes, esse procedimento pode ser problemático, por
exemplo, para amostras de sedimentos e de solo, na qual as partículas abióticas devem
ser removidas antes de concentrá-las.
Especificamente neste trabalho, não houve problemas adicionais, nem
necessidade de realizar a concentração das amostras, porque o lodo granulado
apresentou pouca presença de polímeros e outras partículas abióticas se comparados
com materiais suportes, problemas estes verificados por Domingues (2001) e Hirasawa
(2003) quando avaliaram a porcentagem microbiana em amostras de biofilme
estabelecido em materiais suportes, tais como espuma de poliuretano e carvão vegetal.
Portanto, foi possível realizar a contagem através do FISH em todas as amostras sem
grandes interferentes metodológicos.
87
Nas Figuras 5.20 e 5.21 estão apresentadas algumas morfologias de
microrganismos detectados por meio de FISH.
(a) (b) (c)
Figura 5.20. Microrganismos da amostra do ponto P1 operado com relação DQO/sulfato de 3,0
na presença de oxigênio detectados por meio do FISH: (a) coloração com DAPI, (b) sonda
específica para o Domínio Bacteria (EUB338) e (c) em contraste de fase (1250x).
(a) (b) (c)
Figura 5.21. Microrganismos da amostra do ponto P2 operado com relação DQO/sulfato de 1,6
na presença de oxigênio detectados por meio do FISH: (a) coloração com DAPI, (b) sonda
específica para o grupo BRS da subdivisão δ-Proteobacteria (SRB385) e (c) em contraste de
fase (1250x).
O grupo das BRS é dividido em (MADIGAN et al., 2000): grupo I (oxidadoras
incompletas – utilizam o substrato orgânico e levam à formação de acetato) incluem
Desulfovibrio sp., Desulfobulbus sp. e Desulfotomaculum sp.; e grupo II (oxidadoras
completas – utilizam completamente o substrato orgânico, inclusive acetato) incluem
Desulfobacter sp., Desulfobacterium sp., Desulfosarcina sp. e Desulfococcus sp. BRS
do grupo I utilizam lactato, piruvato, etanol e certos ácidos graxos como doadores de
elétrons, reduzindo sulfato a sulfeto de hidrogênio (H
2
S). Os gêneros do grupo II são
especializados em oxidar os ácidos graxos, principalmente acetato, reduzindo sulfato a
H
2
S. Portanto, no presente estudo, ambos os grupos de BRS (I e II) estiveram presentes
na manta de lodo do reator UASB, coexistindo com arquéias metanogênicas
88
acetoclásticas (
Methanosaeta sp.), uma vez que não houve diminuição da eficiência de
redução de sulfato nem da concentração de metano em todo o período operacional.
O tipo de gás produzido na digestão anaeróbia (metano) mostra a importância
das interações microbianas que podem evitar o acúmulo de ácidos orgânicos e álcoois
na reação de fermentação. A posterior degradação dos ácidos dependerá também da
presença de hidrogênio, sendo mediada pelos microrganismos produtores e utilizadores
desse gás. Sob condições ambientais, as degradações de propionato, butirato e etanol
são termodinamicamente favoráveis às pressões parciais de hidrogênio menores do que
10
-4
, 10
-3
e 10
-1
, respectivamente (SPEECE, 1996).
Neste trabalho, a metanogênese foi favorecida devido ao predomínio de arquéias
acetoclásticas, especificamente
Methanosaeta sp., especialista na utilização do acetato,
proveniente do inóculo predominantemente metanogênico. Portanto, a oxidação de
etanol a ácido acético também ocorreu, favorecendo crescimento e manutenção de tais
microrganismos.
5.6.3 Caracterização microbiana por meio de PCR/DGGE e
seqüenciamento
A caracterização qualitativa da comunidade microbiana foi realizada por meio
da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida da eletroforese em gel de
gradiente desnaturante (DGGE).
Algumas bandas dos géis de DGGE foram selecionadas para realizar a
identificação. As bandas indicadas pelas setas enumeradas das Figuras 5.22, 7.23 e 5.24
foram recortadas, eluídas e reamplificadas; posteriormente, foram submetidas ao Centro
de Estudos do Genoma Humano (CEGH-ICB-USP) para realizar o seqüenciamento.
5.6.3.1 Seqüenciamento do RNAr 16S de bandas de DGGE para o
Domínio Bacteria
A Figura 5.22 apresenta o perfil das bandas de DGGE da comunidade de
bactérias obtidas, após amplificação do DNA por PCR, das amostras de lodo granulado
do inóculo e da manta de lodo do reator UASB nas diferentes etapas de operação.
Observou-se que, a presença de oxigênio não afetou significativamente a diversidade de
89
bactérias no decorrer dos ensaios do reator UASB, visto que as bandas apresentadas no
inóculo (canaleta 1) foram observadas em praticamente todas as amostras das diferentes
etapas e nos pontos P1 e P2 (canaletas 2 a 9). Especificamente, as bandas E1, E2 e E3,
que foram seqüenciadas, foram observadas em todas as etapas estudadas (canaletas 2 a
8), inclusive na ausência de sulfato (canaleta 9).
1: Inóculo
2: P1 DQO/sulfato=3,0
3: P2 DQO/sulfato=3,0
4: P1 DQO/sulfato=1,6
5: P2 DQO/sulfato=1,6
6: P1 DQO/sulfato=2,0
7: P2 DQO/sulfato=2,0
8: P1 sem sulfato
9: P2 sem sulfato
Figura 5.22. Perfil das bandas de DGGE dos produtos de PCR amplificados com primers para o
Domínio Bacteria (968FGC e 1392R) para as amostras do inóculo e do reator UASB operado
nas relações DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0 e na ausência de sulfato.
Na Tabela 5.11 apresentam-se as informações obtidas no seqüenciamento das
bactérias com o nome dos microrganismos identificados, número de acesso ao banco de
dados GenBank, a porcentagem de similaridade e as respectivas referências.
As seqüências obtidas foram similares a
Shewanella sp. MR-7 (banda E1) e
bactéria não-cultivada clone SS-97 (banda E2), ambos com similaridade de 95% e
Desulfitobacterium hafniense Y51 (banda E3) com similaridade de 99%.
Tabela 5.11 Informação das seqüências obtidas das bandas recortadas do DGGE com primers
para o Domínio Bacteria
Bandas Microrganismo N
o
. de
acesso
Similaridade
(%)
Referência*
E1 Shewanella sp. MR-7 CP000444 95 Copeland et al. (2006)
(não-publicado)
E2 Bactéria não-cultivada AY945891 95 Liu et al. (2006)
E3 Desulfitobacterium hafniense Y51 AP008230 99 Nonaka et al. (2006)
90
Copeland et al. (2006, não-publicado) obtiveram a seqüência completa do
genoma de
Shewanella sp. Essas bactérias são bastante versáteis e capazes de utilizar
diversos compostos como aceptor de elétrons. Na presença de oxigênio, podem usar
Fe(III), Mn(IV), S
o
, S
2
O
3
2-
, NO
3
-
, NO
2
-
entre outros (SCOTT & NEALSON, 1994).
Portanto,
Shewanella sp. esteve envolvida no ciclo do enxofre, provavelmente usando
S
0
, cuja presença deste composto foi verificado nas camadas intersticiais da manta de
lodo do reator UASB (Figura 5.15d).
A seqüência referente ao microrganismo da banda E2 (bactéria não-cultivada
clone SS-97) foi identificada no tanque de sedimentação do sistema de tratamento de
águas residuárias de indústria química de Shangai (China), que foi aplicada na remoção
de matéria orgânica e
quinoline (um dos principais hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos nitrogenados), sob condições desnitrificantes (LIU et al., 2006).
Desulfitobacterium hafniense Y51 (banda E3) foram isolados de ambiente
contaminado com tetracloroeteno declorado (PCE), do Japão, e obtiveram eficiências na
dehalogenação de tetracloroetenos e policloroetanos (NONAKA et al., 2006).
Entretanto, Suyama et al. (2001) observaram que
D. hafniense Y51 foram
capazes de reduzir sulfato ou nitrato na presença de piruvato. Os autores não
observaram crescimento no meio contendo succinato, citrato, malato, acetato,
glutamato, alanina, metanol, etanol, glicose, frutose, lactose e maltose. Além disso, o
oxigênio inibiu completamente o crescimento de linhagem Y51. Entretanto,
especificamente neste trabalho, a banda referente a este microrganismo (E3) foi
observada em todas as amostras do reator UASB (Figura 5.22). Este fato pode sugerir a
presença de consórcios de bactérias aeróbias e facultativas (consumidoras de oxigênio),
além da possível presença de outros subprodutos da degradação anaeróbia na presença
de sulfato e etanol que suportaram a manutenção de
Desulfitobacterium hafniense Y51
no reator UASB.
Na construção da árvore filogenética de consenso com
primers para o domínio
Bacteria foram acrescentadas as seqüências conhecidas de Clostridium perfringens
(BA000016),
Bacillus cereus (NC006274), Pseudomonas aeruginosa (NC002516),
Escherichia coli (NC002695), Shewanella sp. SMM (EF492019) e Shewanella sp.
(CP000444) (Figura 5.23).
91
Clostridium perfringens (BA000016)
Bacillus cereus (NC006274)
Pseudomonas aeruginosa (NC002516)
Banda E2
Bacteria não-cultivada (AY945891)
Shewanella sp. SMM (EF492019)
Escherichia coli (NC002695)
Banda E3
Desulfitobacterium hafniense Y51
(AP008230)
Banda E1
Shewanella sp. MR-7 (CP000444)
100
99
80
30
48
98
99
0.1
Figura 5.23. Árvore filogenética de consenso baseada nas seqüências de bandas recortadas do
DGGE com primer para o domínio Bacteria das amostras do inóculo e do reator UASB. Os
valores nos nós da árvore indicam as porcentagens de repetição do ramo (500 reamostragens de
bootstraps). A barra de escala indica a taxa de substituição a cada 100 nucleotídeos.
5.6.3.2 Seqüenciamento do RNAr 16S de bandas de DGGE para o
grupo de bactérias redutoras de sulfato
A Figura 5.24 apresenta o perfil das bandas de DGGE da comunidade de BRS
do subgrupo δ-
Proteobacteria obtidas, após amplificação do DNA por PCR, das
amostras do inóculo e da manta de lodo do reator UASB nas diferentes etapas de
operação. As bandas seqüenciadas (B1, B2 e B3) estiveram presentes em todas as
amostras. Por outro lado, algumas alterações ocorreram nas comunidades de BRS, como
na primeira banda das canaleta 1 (inóculo) e 2 (P1, DQO/sulfato de 3,0, com oxigênio)
que não apareceu nas outras condições. Entretanto, não foi observada considerável
diferença nas comunidades de BRS predominantes nos ensaios, especificamente das
populações representadas na parte central do gel (Figura 5.24), com exceção da canaleta
7 (P2, DQO/sulfato de 2,0, com oxigênio). Provavelmente, as populações de BRS foram
prejudicadas pelas condições nutricionais aplicadas no sistema nesta condição; resultado
do FISH também apontou que a comunidade de BRS foi menos favorecida em relação
às demais etapas estudadas (9±0,8%). Por outro lado, as BRS podem ter se apresentado
em concentrações menores do que o limite de detecção (10
4
células/mL; AMANN et al.,
1995) e, conseqüentemente, não foi detectada por esta técnica.
92
1: Inóculo
2: P1 DQO/sulfato=3,0
3: P2 DQO/sulfato=3,0
4: P1 DQO/sulfato=1,6
5: P2 DQO/sulfato=1,6
6: P1 DQO/sulfato=2,0
7; P2 DQO/sulfato=2,0
8: P1 sem sulfato
9: P2 sem sulfato
Figura 5.24. Perfil das bandas de DGGE dos produtos de PCR amplificados com
primers para o grupo BRS (341FGC e 907R) para as amostras do inóculo e do reator
UASB operado nas relações DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0 e na ausência de sulfato.
Na Tabela 5.12 apresentam-se as informações obtidas no seqüenciamento das
BRS da subdivisão δ-
Proteobacteria verificadas no lodo granulado do inóculo e nas
amostras da manta de lodo do reator UASB operado em diferentes etapas e coletadas
dos pontos P1 e P2. As informações incluem o nome dos microrganismos identificados,
número de acesso ao banco de dados GenBank, a porcentagem de similaridade e as
respectivas referências.
Tabela 5.12 Informação das seqüências obtidas das bandas recortadas do DGGE com primers
para o grupo BRS
Bandas Microrganismo N
o
. de
acesso
Similaridade
(%)
Referência
B1 Eubactéria não-cultivada AF050594.1 94 Dojka et al. (1998)
B2 Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris CP0005227.1 99 Copeland et al. (2007)
(não publicado)
B3 Bactéria não-cultivada DQ191727.1 94 Enright et al. (2005)
(não publicado)
A bactéria não-cultivada (banda B1) foi previamente estudada na
biorremediação de aqüífero contaminado com solventes clorados e hidrocarbonetos por
Dojka et al. (1998). Neste estudo, este microrganismo esteve presente em todas as
amostras (Figura 5.24), com predomínio na condição DQO/sulfato de 1,6 na presença
de oxigênio (canaletas 4 e 5). Análise do FISH também apontou maior porcentagem de
BRS nesta condição, com 10,8 e 19,8% em P1 e P2, respectivamente. Curiosamente, as
BRS predominaram no ponto P1 em todas as condições analisadas (canaletas 2, 4, 6 e
93
8), demonstrando que a presença de oxigênio não foi limitante para a proliferação
desses microrganismos na manta de lodo inferior do reator UASB.
A seqüência referente à banda B2 foi similar a
Desulfovibrio vulgaris subsp.
vulgaris DP4, cuja seqüência completa já foi obtida (COPELAND et al., 2007, não-
publicado).
Desulfovibrio sp., comumente são encontrados em sistemas de tratamento de
águas residuárias, bastante versáteis e capazes de adaptação ao oxigênio, formando
agregados ou migrando para as zonas anóxicas ou ainda usando oxigênio como aceptor
de elétrons (CYPIONKA, 2000; DANNENBERG et al., 1992). Uma característica
interessante das BRS é que são capazes de desempenhar oxidação em sintrofia com as
metanogênicas hidrogenotróficas, como reportado em estudos com culturas de
Desulfovibrio sp. usando lactato e etanol (OUDE ELFERINK et al., 1994; WIDDEL,
1988). Além disso, as BRS podem reduzir oxigênio usando os mesmos substratos
orgânicos comumente usados para a redução de sulfato, tais como hidrogênio, lactato,
álcoois, acetato e entre outros; podem ainda oxidar compostos de enxofre como H
2
S na
respiração anaeróbia (HOLMER & STORKHOLM, 2001).
Neste estudo, a população de
Desulfovibrio sp. esteve presente em todas as
amostras do reator UASB, com maior predomínio em P1 da condição DQO/sulfato de
1,6 e em P1 sem sulfato (Figura 5.24). Portanto, as condições nutricionais aplicadas
propiciaram crescimento de
Desulfovibrio sp. devido à sua versatilidade metabólica.
A bactéria não-cultivada, referente ao microrganismo da banda B3, foi
previamente identificada em estudos de dinâmica da comunidade microbiana de
biorreatores anaeróbios psicrofílicos do tratamento de águas residuárias farmacêuticas
contendo solventes (ENRIGHT et al., 2005, não-publicado).
Conforme árvore filogenética construída para o grupo das BRS (Figura 5.25),
esta bactéria apresentou aproximação filogenética à
Desulfobacter sp. Neste trabalho,
esta BRS foi detectada em todas as amostras do reator UASB (Figura 5.24), com
predomínio em P1 da condição DQO/sulfato de 1,6 na presença de oxigênio (canaleta
4). Foi também similar à morfologia observada por microscopia óptica (Figura 5.15c) e
detectadas por FISH (Figura 5.21). Laanbroek et al. (1984) salientou que
Desulfobacter
sp. foi menos competitiva por etanol e sulfato do que
Desulfovibrio sp. e Desulfobulbus
sp.; por outro lado,
Desulfobacter sp. apresentou a maior velocidade de crescimento
máximo específico dentre estas três BRS na presença de excesso de etanol e sulfato.
94
Além disso,
Desulfobacter sp. tem a particular característica de usar acetato na presença
de sulfato (WIDDEL, 1988).
De acordo com Widdel & Pfennig (1989),
Desulfobacter sp. são estritamente
anaeróbios, apresentam metabolismo respiratório com sulfato ou outros compostos
oxidados de enxofre como aceptor final de elétrons, sendo reduzido a H
2
S. A
temperatura e pH ótimos de crescimento são 28-32
o
C e 6,2 a 8,5, respectivamente. A
maioria das linhagens de
Desulfobacter sp. requer NaCl e MgCl
2
.6H
2
O, ácido p-
aminobenzóico e biotina como fatores de crescimento. Estes componentes constaram na
alimentação do reator UASB do presente estudo (meio basal Zinder adicionado com
solução de vitaminas), favorecendo tal crescimento.
Ainda,
Desulfobacter sp. são quimioorganotróficas, usam acetato ou outros
compostos simples como fontes de carbono e também como doador de elétrons para a
respiração anaeróbia, que são completamente oxidados a CO
2
. Algumas linhagens,
como
D. postgatei usam apenas acetato como doador de elétrons e fonte de carbono;
entretanto, outras linhagens podem também usar etanol e/ou lactato (WIDDEL &
PFENNIG, 1989). Portanto, neste trabalho,
Desulfobacter sp. participaram do ciclo do
enxofre na presença de etanol.
Na construção da árvore filogenética para o grupo BRS
foram acrescentadas as
seguintes seqüências conhecidas de BRS:
Desulfovibrio vulgaris (AB252583),
Desulfobacter sp. (AB238992) e Desulfovibrio oxyclinae (AY626034) (Figura 5.25). A
banda 3, por exemplo, foi relacionado filogeneticamente a microrganismo não-cultivada
de
Desulfobacter sp.
Eubacteria não-cultivada (AF050594)
Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris (CP000527.1)
Desulfobacter sp. (AB238992)
Banda B1
Banda B2
Banda B3
Bacteria não-cultivada (DQ191727.1)
Desulfovibrio oxyclinae (AY626034)
65
74
65
37
90
0.1
Figura 5.25. Árvore filogenética de consenso baseada nas seqüências de bandas recortadas do
DGGE com primer para o grupo das BRS das amostras do inóculo e do reator UASB. Os
valores nos nós da árvore indicam as porcentagens de repetição do ramo (500 reamostragens de
bootstraps). A barra de escala indica a taxa de substituição a cada 100 nucleotídeos.
95
5.6.3.3 Seqüenciamento do RNAr 16S de bandas de DGGE para o
Domínio Archaea
A Figura 5.26 apresenta o perfil das bandas de DGGE da comunidade de
arquéias metanogênicas, após amplificação do DNA por PCR, das amostras de lodo
granulado do inóculo e da manta de lodo do reator UASB nas diferentes etapas de
operação. O perfil mostra três espécies (bandas A1, A2 e A3) predominantes desse
grupo microbiano no inóculo (canaleta 1), que permaneceu nas amostras das diferentes
condições estudadas (canaletas 2 a 9).
Na Tabela 5.13 apresentam-se as informações obtidas no seqüenciamento das
arquéias metanogênicas, com o nome dos microrganismos identificados, número de
acesso ao banco de dados GenBank, a porcentagem de similaridade e as respectivas
referências.
1: Inóculo
2: P1 DQO/sulfato=3,0
3: P2 DQO/sulfato=3,0
4: P1 DQO/sulfato=1,6
5: P2 DQO/sulfato=1,6
6: P1 DQO/sulfato=2,0
7: P2 DQO/sulfato=2,0
8: P1 sem sulfato
9: P2 sem sulfato
Figura 5.26. Perfil das bandas de DGGE dos produtos de PCR amplificados com primers para o
Domínio Archaea (1100FGC e 1400R)
para as amostras do inóculo e do reator UASB
operado nas relações DQO/sulfato de 3,0, 1,6 e 2,0 e na ausência de sulfato.
Tabela 5.13 Informação das seqüências obtidas das bandas recortadas do DGGE com primers
para o Domínio Archaea
Bandas Microrganismo N
o
. de
acesso
Similaridade
(%)
Referência
A1 Methanosaeta sp. AB288619 96 Ishii & Watanabe
(2006) (não publicado)
A2 Arquéia não-cultivada DQ478742 97 Díaz et al. (2006)
A3 Arquéia não-cultivada AY570646 99 Grabowski et al.
(2005)
96
A seqüência obtida a partir da banda A1 confirmou a similaridade com espécie
não-cultivada de
Methanosaeta sp., com similaridade de 96%. Este microrganismo foi
previamente identificado no estudo da caracterização de fluxo de elétrons na geração de
energia e formação de metano em células químicas para produção de energia (ISHII &
WATANABE, 2006, não-publicado).
Neste trabalho, houve predomínio de
Methanosaeta sp. em todas as amostras das
diferentes etapas de operação do reator UASB (Figura 5.26), com predomínio em P2
sem sulfato (canaleta 9). O predomínio de
Methanosaeta sp. também foi observado sob
microscopia óptica (Figura 5.15b) e detectada por FISH (Figura 5.18).
Pender et al. (2004) também observaram o predomínio de
Methanosaeta sp. na
presença e ausência de sulfato em reatores anaeróbios híbridos. Tais arquéias são
metanogênicas acetotróficas que desempenham papel importante na granulação e na
manutenção de grânulos estáveis após perturbações do sistema (GROTHENHUIS et al.,
1991).
Omil et al. (1997) também verificaram o predomínio de
Methanosaeta sp. por
meio de FISH (40-95%) em um reator UASB alimentado com acetato e sulfato após 24
h de exposição ao ar.
Em geral as BRS apresentam maior velocidade de crescimento do que as
arquéias metanogênicas na presença de baixa ou alta concentração de acetato (LENS et
al., 1998; OUDE ELFERINK et al., 1994). Entretanto, Yoda et al. (1987) observaram
que a velocidade de crescimento de arquéias metanogênicas foi mais alta do que as
BRS, com valores de Ks de 32,8 e 9,5 mg acetato/L, respectivamente, em biofilmes de
reator de leito fluidizado. De acordo com Yoda et al. (1987), as BRS e arquéias
metanogênicas competiram por acetato quando na presença de baixa concentração de
acetato (8,8 mg/L), enquanto que as arquéias metanogênicas tornaram-se predominantes
sob altas concentrações de acetato.
Portanto, neste trabalho, as arquéias metanogênicas acetoclásticas,
principalmente
Methanosaeta sp., consumiram o acetato proveniente da degradação de
etanol e foram mais favoráveis em relação a BRS, na presença de oxigênio. Esta
vantagem competitiva das arquéias metanogênicas provavelmente dependeu também de
outros fatores, tais como, concentração de sulfato, pH e temperatura.
Outras seqüências obtidas de arquéias metanogênicas foram similares aos clones
de duas arquéias não-cultivadas (banda A2 e A3).
97
A arquéia não-cultivada (banda A2), associada à Ordem
Methanomicrobiales,
foi obtida com similaridade de 97% (Tabela 5.13). Este microrganismo foi previamente
caracterizado em estudo da diversidade microbiana de grânulos metanogênicos de reator
UASB em escala real tratando águas residuárias de cervejaria (DÍAZ et al., 2006).
Especificamente nas amostras do reator UASB, este microrganismo foi
predominante em todas as amostras (Figura 5.26), exceto na canaleta 7 (P2 da condição
DQO/sulfato de 2,0, na presença de oxigênio).
A arquéia não-cultivada (banda A3) foi identificada com similaridade de 99%
(Tabela 5.13). Grabowski et al. (2005) identificaram este microrganismo em estudo da
diversidade microbiana em reservatório de biodegradação de compostos petrolíferos sob
baixas temperaturas (18 a 20
o
C) e foi filogeneticamente relacionada à Methanosaeta
concilii
(X16932). Neste estudo, este microrganismo foi observado com maior
predomínio na amostra da etapa final do reator UASB, ou seja, na ausência de sulfato
(canaleta 9 da Figura 5.26).
Díaz et al. (2006) identificaram, por DGGE e seqüenciamento, as arquéias
metanogênicas
Methanosaeta concilii, Methanosaeta mazei e Methanospirilulum
hungatei na avaliação da diversidade microbiana em diversos tipos de grânulos
provenientes de reator UASB tratando águas residuárias de cervejaria. De acordo com
os autores, esses microrganismos podem desempenhar papel importante na granulação.
Methanosaeta concilii desempenham metabolismo acetoclástico mesofílico,
desse modo, consumiram o acetato proveniente da degradação de etanol, mantendo altas
eficiências na remoção de matéria orgânica (DQO) e baixas concentrações de acetato no
efluente (< 30 mg/L). O crescimento destes organismos, que utilizam especificamente o
acetato, é mais favorável do que outras arquéias metanogênicas acetoclásticas (tais
como
Methanosarcina sp.) quando em baixas concentrações de acetato no meio devido
ao baixo valor de Ks para este substrato (SCHMIDT & AHRING, 1999). Bandas A2 e
A3 mostraram também aproximação filogenética a A1 (
Methanosaeta sp. não-cultivada)
(Figura 5.27).
Na construção da árvore filogenética para o domínio
Archaea foram
acrescentadas as seqüências conhecidas de
Methanothrix soehngenii (X51423),
Methanosaeta concilii (AB212065), arquéia não-cultivada (AF376788) e Methanosaeta
não-cultivada (AB288619) (Figura 5.27). As três bandas seqüenciadas foram
relacionadas filogeneticamente à
Methanosaeta sp.
98
Methanothrix soehngenii (X51423)
Methanosaeta concilii (AB212065)
Arquéia não-cultivada (DQ478742)
Arquéia não-cultivada (AF376788)
Methanosaeta não-cultivada (AB288619)
Arquéia não-cultivada (AY570646)
Banda A1
Banda A2
Banda A3
67
100
85
90
99
0.2
Figura 5.27. Árvore filogenética de consenso baseada nas seqüências de bandas recortadas do
DGGE com primer para o domínio Archaea das amostras do inóculo e do reator UASB. Os
valores nos nós da árvore indicam as porcentagens de repetição do ramo (500 reamostragens de
bootstraps). A barra de escala indica a taxa de substituição a cada 100 nucleotídeos.
5.7 Discussão geral
Neste trabalho foi avaliada a influência da presença de oxigênio na
metanogênese e sulfetogênese, sob condições mesofílicas (30
o
C±1), em reator UASB
operado com TDH de 12 h. O etanol foi usado como fonte orgânica por causa do baixo
custo, acessibilidade e também por ser de fácil degradação e consumo por vários tipos
microbianos e, portanto, para tentar favorecer amplo grupo de microrganismos. Nestas
condições, foram estudadas três diferentes relações DQO/sulfato (3,0, 1,6 e 2,0), na
presença de concentração média de oxigênio dissolvido (OD) de 3,00±0,65 mg/L. No
final da operação, foi avaliada também a condição sem a adição de sulfato na
alimentação do reator.
Conforme análises físico-químicas, o reator apresentou eficiências médias de
remoção de matéria orgânica de 76% (DQO bruta) e 82% (DQO filtrada), mesmo na
presença de oxigênio. As eficiências médias de redução de sulfato, nas etapas em que o
oxigênio foi adicionado, atingiram valores iguais a 92, 74 e 81% em IV, V e VI,
respectivamente. A eficiência média global, de todo o período operacional, foi igual a
86%. Este resultado também foi consistente com o resultado obtido pelo balanço de
enxofre, onde a remoção de S-SO
4
2-
atingiu 88%.
O sistema experimental estudado, portanto, apresentou condições favoráveis
para remoção de matéria orgânica e sulfato. Na presença de oxigênio houve também
99
produção de enxofre elementar (S
0
), como observado na análise por meio de EDX,
pureza de 93,5%. Esse fator é ambientalmente desejado, porque S
0
é material inerte e
poderia ser retirado do meio líquido no tratamento de águas residuárias contendo altas
concentrações de sulfato, além de poder ser reutilizado como complemento em adubos
químicos, por exemplo. Entretanto, deve-se estudar um processo eficiente de coleta,
uma vez que esse material foi obtido casualmente quando se verificou entupimento da
mangueira do efluente.
Mesmo na presença de oxigênio no meio, as concentrações de alcalinidade a
bicarbonato (AB) e ácidos voláteis totais (AVT) não apresentaram alterações
significativas. Conseqüentemente, os valores de pH efluente do reator mantiveram-se
próximos à condição neutra em todo o período operacional, variando de 7,0 a 8,4.
Portanto, estes fatores indicaram que o sistema apresentou-se estável e tamponado para
o desempenho do processo anaeróbio. As arquéias metanogênicas são consideradas
sensíveis ao pH, ou seja, o crescimento ótimo ocorre em faixa relativamente estreita de
pH. De acordo com Speece (1996), estes valores oscilam entre 6,5 e 8,2.
As análises microbiológicas e moleculares (microscopia óptica, FISH,
PCR/DGGE e seqüenciamento) demonstraram o predomínio de arquéias metanogênicas
em todas as etapas de operação do reator UASB.
Methanosaeta sp., metanogênica
acetoclástica, tem sido reportada freqüentemente na literatura como sendo bastante
tolerante ao oxigênio (KATO et al., 1993, 1997; OMIL et al., 1997), o que também foi
confirmado no presente estudo.
O predomínio de arquéias metanogênicas também pôde ser evidenciado pela
presença de metano nas amostras do biogás. As concentrações médias observadas nas
etapas com presença de oxigênio (33,8 μmol/mL de biogás) foram ligeiramente
superiores ao controle (etapa I, II e III, sem oxigênio: 31,9 μmol/mL de biogás).
Por outro lado, o sulfeto gerado no processo de redução de sulfato pode inibir o
crescimento de microrganismos anaeróbios. Em reatores UASB ou filtros anaeróbios,
podem tolerar cerca de 170 mg H
2
S/L (SPEECE, 1996) ou 180-200 mg H
2
S/L (VISSER
et al., 1993). Especificamente neste estudo, não ocorreu inibição das BRS e arquéias
metanogênicas pelas concentrações de sulfato afluente aplicadas (157 a 729 mg
SO
4
2-
/L) no reator UASB, e concentração de sulfeto dissolvido total (SDT: H
2
S, HS
-
e
S
2-
) formado, a qual variou de 44 a 96 mg/L nas diferentes etapas do experimento.
Além disso, como o pH efluente variou de 7,0 a 8,4 durante o período
operacional, e conseqüentemente cerca de 80% de SDT foi produzido na forma HS
-
.
100
Esta forma de sulfeto é utilizada na síntese celular de microrganismos anaeróbios
(OUDE ELFERINK et al., 1994). Parte do sulfeto também esteve presente no biogás
(1,3 a 1,8 μmol/mL de biogás) e como enxofre elementar (S
0
).
Em relação às BRS, foram identificadas dois importantes gêneros,
Desulfovibrio
sp. e
Desulfobacter sp. nesse sistema. O primeiro comumente é encontrado em
tratamento de águas residuárias contendo sulfato, representam o grupo das degradadoras
incompletas, na qual dentre vários compostos utilizam etanol como doador de elétrons;
e o último, BRS degradadoras completas, especialistas na oxidação de vários ácidos,
principalmente acetato, reduzindo sulfato a sulfeto (MADIGAN et al., 2000). Portanto,
ambos os grupos participaram do ciclo do enxofre no presente estudo nas condições
avaliadas. Entretanto, não foi possível precisar a porcentagem destes gêneros no reator,
uma vez que não foram usadas sondas específicas para tais BRS nas análises por meio
de FISH para estes gêneros. As proporções de grupos específicos de bactérias
anaeróbias ou facultativas também não foram quantificadas.
Portanto, os resultados da avaliação da manta de lodo realizada de forma
estratificada (P1: manta inferior e P2: superior) demonstraram que não houve diferenças
significativas nas comunidades microbianas observadas. A variação do potencial de
óxido-redução (redox) examinada em quatro diferentes pontos (P1, P2, P5: próximo ao
sistema separador de gases e efluente) também não apresentou alteração significativa
em seus valores no decorrer dos ensaios, mesmo após injeção de oxigênio no reator.
Duas razões podem explicar tais ocorrências:
(a) o sistema estudado foi de mistura completa, como verificado nos ensaios
hidrodinâmicos, realizados neste reator alimentado nas mesmas condições de operação
do presente estudo (resultados não apresentados). O ensaio realizado foi do tipo pulso,
usando o cloreto de sódio (NaCl) como indicador de condutividade elétrica (traçador);
(b) as alturas em que foram coletadas as amostras de lodo granulado e levando-se em
conta a escala do reator UASB de bancada (volume total de 10,5 L) não representaram
diferenças significativas para colonização dos microrganismos. P1 e P2 localizavam-se
a 6 e 16 cm da base do reator UASB, respectivamente.
Por outro lado, como o inóculo foi bem adaptado inicialmente no reator, com
aumento gradativo das concentrações de etanol e sulfato, provavelmente tenha
proporcionado condições favoráveis para o crescimento desses microrganismos sem que
a presença de oxigênio causasse impactos negativos. Outro fator que pode ter
contribuído para esse fato é que a adição de oxigênio na alimentação do reator foi
101
realizada de forma contínua entre os ensaios, não reiniciando o sistema a cada etapa de
operação avaliada. Isto pode ter propiciado presença de microrganismos bem adaptados
às condições impostas; por exemplo, de bactérias facultativas ou mesmo outras
anaeróbias estritas tolerantes ao oxigênio, sendo que as primeiras provavelmente
consumiram este gás e amenizaram as condições para as etapas posteriores da
degradação anaeróbia.
É importante ressaltar também que os grânulos apresentam características bem-
estruturadas, que propiciam condições de barreira (KATO et al., 1997) para as
condições antagônicas encontradas pelos microrganismos nos meios de cultura.
Não foram realizadas análises de conteúdo enzimático (catalase, SOD e
peroxidase) dos microrganismos seqüenciados. Mas, conforme literatura abordada, a
principal hipótese para os mecanismos protetores ao oxigênio para microrganismos
aeróbios e facultativos é a habilidade de estes produzirem as enzimas SOD e catalase
(MADIGAN et al., 2000; ROLFE et al., 1978). A enzima catalase também foi
observada em BRS considerada anaeróbia estrita,
Desulfovibrio gigas (NCBI 9332), por
Fareleira et al. (2003); sendo que, apresentou aumento significativo desta atividade
enzimática com o aumento das concentrações de oxigênio aplicadas.
Os resultados da distribuição dos grânulos no reator UASB demonstraram o
predomínio de grânulos de diâmetros médios de 2-3 mm (76%), que geralmente
correspondem aos grânulos ativos, conforme Díaz et al. (2006). Entretanto, os grânulos
de 1-2 mm também se apresentaram em porcentagens significativas (17%), indicando
que ocorreu formação de novos grânulos durante a operação do reator. Portanto, apesar
de longo período de operação do reator UASB (469 dias) e de observar ligeira
diminuição no tamanho dos grânulos (10%), o processo de granulação não foi
prejudicado nas condições estudadas. Este fato foi confirmado pelo teste estatístico
Anova (α=0,05).
Portanto, pôde-se observar que o sistema foi viável na degradação de água
residuária sintética contendo sulfato e etanol, com injeção de 3,0 mg/L de oxigênio, sem
efetivamente causar danos significativos tanto para a metanogênese quanto para a
sulfetogênese.
Deste modo, os resultados obtidos neste estudo representam contribuições
importantes para as pesquisas biotecnológicas de tratamento de águas residuárias
contendo sulfato, uma vez que a aplicação de sistemas de tratamento acoplados
anaeróbio/aeróbio tem sido bastante difundida. Este caso é bastante atraente quando há
102
presença de compostos recalcitrantes ou outros de difícil degradação sob condições
anaeróbias (LENS et al., 1998), cujos efluentes cada vez mais apresentam componentes
bastantes complexos devido aos avanços tecnológicos e industriais. Desta maneira, é
necessário apreender novas opções e condições de tratamento que viabilizem custo
operacional, eficiência de tratamento e condições que minimizem danos ecológico-
ambientais.
As ferramentas de Biologia Molecular, como as aplicadas neste estudo (FISH,
PCR/DGGE e seqüenciamento), surgiram, portanto, para contribuir na caracterização
minuciosa dos microrganismos envolvidos em cada etapa de degradação, seja sua
distribuição espacial ou sua identificação. Deste modo, conhecendo-se as suas
características e condições fisiológicas, possibilitam delinear as estratégias e condições
necessárias para se alcançar os objetivos nos tratamentos de determinadas águas
residuárias.
103
6. Conclusões
A principal conclusão deste estudo foi a constatação de que a presença de
aproximadamente 3 mg/L de oxigênio dissolvido não afetou a eficiência de operação do
reator UASB.
Foi também possível observar as seguintes conclusões:
¾
¾
¾
¾
¾
A presença de oxigênio não afetou a comunidade microbiana da manta de lodo do
reator, na qual houve predomínio de arquéias metanogênicas, em todas as etapas de
operação, detectadas pela sonda específica (ARC915) para o Domínio
Archaea. A
presença desse grupo microbiano foi evidenciada também pela concentração de
metano que mesmo após a injeção de oxigênio no meio a concentração desse biogás
não diminuiu significativamente.
A presença de arquéias metanogênicas semelhantes à Methanosaeta sp. foi
confirmada pela obtenção do seqüenciamento desse microrganismo. Outros
microrganismos identificados no reator foram semelhantes à
Desulfovibrio vulgaris
subsp. vulgaris DP4 e bactérias Shewanella sp. e Desulfitobacterium hafniense Y51.
A relação DQO/sulfato de 1,6 foi mais favorável ao crescimento de bactérias
redutoras de sulfato (BRS) em relação às demais condições estudadas, observada
pela análise do FISH, apesar de condições físico-químicas não terem sido favoráveis
para a redução de sulfato.
O tamanho dos grânulos não foi afetado significativamente pela presença de
oxigênio dissolvido no meio. A diminuição do tamanho médio dos grânulos
observada no final de operação pode ser atribuída a efeitos de cisalhamento devido
ao longo tempo de operação do reator (469 dias), uma vez que não foi detectada
diferença significativa na variação por meio de teste estatístico Anova (α = 0,05).
O potencial de óxido-redução (redox) do perfil do reator esteve sempre na faixa de
redução de sulfato (-200 mV a +200 mV) mesmo na presença de oxigênio
dissolvido no meio.
104
¾
¾
Com a presença de oxigênio no meio, houve produção de enxofre elementar no
sistema. De acordo com análise de EDX, esse material era composto de 93,5±1,3%
de enxofre (S) e 6,5±1,3% de oxigênio (O). Entretanto, no interior do reator deve ter
se apresentado em concentrações mínimas, senão o balanço de enxofre teria
apresentado maiores discrepâncias entre frações de S-Afluente e S-Efluente.
As aplicações de técnicas tradicionais de microbiologia para anaeróbios (condições
de assepsia, microscopia óptica e fluorescência) acoplados com análises de Biologia
Molecular (FISH, PCR/DGGE e seqüenciamento) foram muito relevantes nesta
pesquisa.
105
7. Recomendações
¾ Avaliar as condições microbiológicas para outras concentrações de oxigênio
dissolvido e determinar a velocidade de consumo.
¾ Avaliar a diversidade de bactérias, BRS e arquéias metanogênicas usando
sondas específicas para diversos níveis taxonômicos, incluindo os
microrganismos Gram-positivos.
¾ Determinar os grupos microbianos predominantes na presença de outros
substratos orgânicos.
¾ Elaborar um mecanismo eficiente para a coleta e purificação de enxofre
elementar (S
0
) em reatores anaeróbios de tratamento de águas residuárias
contendo sulfato.
106
8. Referências bibliográficas
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9. Apêndice
Na Tabela 9.1 estão apresentadas informações de operação do reator UASB do
tratamento de águas residuárias de abatedouro de aves usado como inóculo.
Tabela 9.1 Dados de operação do reator UASB em escala real da Avícola Dacar S/A
Parâmetros Valores
Vazão média (Qm)
Volume
TDH
DQO afluente
COV
Tempo de operação
600 m
3
/dia
990 m
3
1,65 dia
2700 mg/L
1,64 kg DQO/m
3
.dia
24 horas
Fonte: Avícola Dacar S/A, Tietê (SP)
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