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UNESP UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE BACTERINAS
COMERCIAIS NO CONTROLE DA INFECÇÃO POR
Salmonella Enteritidis EM GALINHAS DE POSTURA
COMERCIAL.
Aline Mesquita Galvão Moura
Orientador: Prof. Dr. Angelo Berchieri Júnior
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias - UNESP, Campus de Jaboticabal,
para obtenção
do título de Mestre em Medicina Veterinária - Área de
concentração em Patologia Animal
Jaboticabal- São Paulo- Brasil
2007
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DADOS CURRRICULARES DA AUTORA
ALINE MESQUITA GALVÃO MOURA - nascida em 02 de maio de 1977, em
Bebedouro - SP. Médica Veterinária, formada pela Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias - FCAV/UNESP/Jaboticabal em 2002. Fez residência na
área de Ornitopatologia, na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia -
FMVZ/UNESP/Botucatu, de março de 2003 a fevereiro de 2005. Em março de
2005 iniciou o curso de mestrado na FCAV/UNESP/Jaboticabal em Medicina
Veterinária na área de Patologia Animal, terminando o mesmo no ano de 2007.
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SUMÁRIO
Assunto Página
Lista de Tabelas.......................................................................................................vi
Resumo...................................................................................................................vii
Abstract...................................................................................................................viii
1- Introdução............................................................................................................1
2- Revisão de Literatura...........................................................................................3
2.1- Morfologia e Classificação do Gênero Salmonella..........................................3
2.2- Epidemiologia e Patogenia..............................................................................4
2.3- Prevenção e Controle......................................................................................7
2.4- Imunidade para Salmonella.............................................................................9
2.5- Efeito da Vacinação.......................................................................................11
3- Objetivo...............................................................................................................14
4- Material e Métodos.............................................................................................15
4.1- Amostra Bacteriana.......................................................................................15
4.2- Preparo do Inóculo de Salmonella Enteritidis................................................15
4.3-Bacterinas utilizadas.......................................................................................15
4.4- Aves utilizadas...............................................................................................15
4.5- Delineamento Experimental...........................................................................16
4.6- Exames Laboratoriais....................................................................................17
4.6.1- Avaliação da presença de SE nas aves..................................................17
4.6.2- Avaliação da excreção fecal....................................................................17
4.6.3- Análise dos ovos......................................................................................18
4.7- Análise Estatística.........................................................................................18
5- Resultados..........................................................................................................19
6- Discussão...........................................................................................................26
7- Conclusões.........................................................................................................32
8- Referências.........................................................................................................33
4
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Média do número (Log
10
) de células viáveis de SE Nal/Spec
r
em baço,
fígado, ceco e ovário de aves sacrificadas dois dias após o
desafio....................................................................................................................19
Tabela 2. Pesquisa de SE Nal/Spec
r
em fígado, conteúdo cecal e ovário das aves
sacrificadas após 4 suabes de cloaca consecutivos com resultados negativos para
SENal/ Spec
r
.........................................................................................................21
Tabela 3. Inspeção da cloaca de aves comerciais mediante utilização de suabe
para detecção de SE Nal/Spec
r
..............................................................................23
Tabela 4. Análise dos ovos provenientes de poedeiras vacinadas com três
diferentes produtos comerciais e, submetidas a três desafios com SE
Nal/Spec
r
.................................................................................................................25
5
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE BACTERINAS COMERCIAIS NO CONTROLE
DA INFECÇÃO POR Salmonella Enteritidis EM GALINHAS DE POSTURA
COMERCIAL.
RESUMO
Devido ao grande número de casos de toxinfecção alimentar e aos
prejuízos sócio-econômicos causados pela Salmonella Enteritidis aos seres
humanos, tornam-se necessário estudos sobre a prevenção e controle desta
bactéria nos plantéis avícolas. Assim, o objetivo deste trabalho foi a análise do
emprego de bacterinas inativadas oleosas contra Salmonella enterica sorovar
Enteritidis (SE) em aves de postura comercial, visando prevenir a excreção fecal e
a contaminação dos ovos. Foram utilizadas três formulações de bacterinas
comerciais de SE em emulsão oleosa. As aves foram vacinadas na oitava e
décima sexta semana de idade e foi mantido um grupo de aves sem vacinação
(controle). Na vigésima semana de idade, treze aves de cada tratamento foram
desafiadas com uma dose oral de aproximadamente 10
9
células viáveis de SE
fagotipo 4 (resistente ao ácido nalidíxico e a espectomicina), sendo que este
procedimento foi repetido na vigésima quinta e trigésima primeira semanas de
idade. A eficácia das vacinas empregadas foi conferida através de exames
laboratoriais, para pesquisa de SE no conteúdo cecal, baço, ovário e ovos. A
vacinação conferiu proteção parcial contra colonização de SE no ceco e contra
eliminação da bactéria nas fezes e nos ovos, portanto, recomenda-se que o uso
das bacterinas seja complementado com outras formas de controle para SE.
Palavras- chave: Salmonella Enteritidis, bacterinas, galinhas de postura.
6
EVALUATION OF THE EFFICACY OF COMMERCIAL BACTERINS IN THE
CONTROL OF THE INFECTION FOR Salmonella Enteritidis IN THE LAYING
HENS.
ABSTRACT
Due to the great number of outbreaks of food poisoning and the socio-
economic issues caused to the human beings by the Salmonella Enteritidis, it
becomes necessary the study on the prevention and control of this bacterium in the
poultry flocks. Thus, the objective of this work was the analysis of the use of
bacterins against Salmonella Enteritidis infection in commercial birds, aiming to
prevent the fecal excretion and the contamination of eggs. Have been used three
Salmonella Enteritidis oil-emulsion commercial bacterins formulations. The laying
hens were vaccinated in the eighth and sixteenth weeks old and one group of birds
was kept as nonvacinated control. On twentieth weeks ago, thirteen birds of each
treatment were challenged with an oral dose of approximately 10
9
viable cells of
phage type 4 Salmonella Enteritidis (resistant to the acid nalidixic and the
espectomicin), this procedure was repeated in the twentieth fifth and thirtieth first
weeks ago. The efficacy of employed vaccines was conferred through laboratorial
examinations, for research of SE from fecal samples, spleen, ovary and eggs. The
vaccination conferred partial protection against caecal colonization and against
shedding of SE in the feces and eggs, therefore, it is recommended that the use of
the killed bacterins be complemented with other forms of SE control.
Keywords: Salmonella Enteritidis, bacterins, laying hens.
7
1. INTRODUÇÃO
O Brasil vem conquistando novos e exigentes mercados, sendo,
atualmente, o maior exportador e terceiro produtor mundial de carne de aves
(ABEF 2006). Esta condição se deve à utilização de modernas técnicas utilizadas
na avicultura, entre as quais se destaca o manejo durante a criação e a nutrição
das aves (DICKEL, 2004); deve-se também, à oferta de produtos avícolas de alta
competitividade e confiabilidade de segurança alimentar (SONCINI, 2003). Nesse
sentido, tem havido grandes avanços nos processos de produção e nas medidas
sanitárias aplicadas às aves, particularmente no controle de agentes infecciosos,
tais como, a Salmonella.
As salmoneloses aviárias são causadas por bactérias do gênero
Salmonella, pertencentes à família Enterobacteriaceae, e compreendem
microrganismos patogênicos para o homem e animais (GAST,1997; BERCHIERI
JÚNIOR, 2000). Dentre as salmonelas, destaca-se a Salmonella enterica sorovar
Enteritidis (SE), causadora de toxinfecções alimentares em seres humanos,
através do consumo, principalmente, de produtos alimentícios de origem avícola,
como carne, ovos e seus derivados.
A partir da década de 1990, no Brasil, a S. Enteritidis (SE) passou a ser o
sorotipo mais identificado nos casos de toxinfecção alimentar em seres humanos.
Nos Estados Unidos, entre 1985 e 1995, foram relatados 582 surtos provocados
por SE, relacionados com 24.000 doentes, 2.200 internações e 70 mortes,
incluindo crianças e idosos (DICKEL, 2004).
A complexa epidemiologia da Salmonella na cadeia da produção de aves
envolve a transmissão vertical, via ovo, desencadeando o nascimento de pintos
infectados. Envolve, também, a transmissão horizontal, com a contaminação do
ambiente e da ração, além da existência de diferentes espécies animais que
constituem reservatórios da bactéria.
A prevenção e controle da SE constitui uma tarefa árdua, mas
extremamente necessária. As medidas utilizadas para a redução da bactéria nas
8
aves e no ambiente de criação constituem-se em: biosseguridade; aquisição de
aves, rações e matérias-primas livres de Salmonella; uso de ácidos orgânicos e
peletização da ração; administração de produtos de exclusão competitiva e
imunização com vacinas vivas ou inativadas oleosas (bacterinas).
De acordo com a instrução normativa atual (Brasil,2003), é liberado o uso de
bacterinas contra Salmonella Enteritidis (SE) em reprodutoras comerciais. As
aves matrizes podem ser controladas para SE e Salmonella Typhimurium, mas
devem ser livres de S. Pullorum e S. Gallinarum. Já as linhagens puras e
avozeiros não podem ser vacinadas e devem ser livres dos quatro sorotipos de
Salmonella descritos acima.
A vacinação é um método de prevenção eficaz no controle da SE em aves
(TIMMS et al; 1990,1994; GAST et al. 1992,1993; BARBOUR et al.1993). Contudo
a aplicação de uma estratégia de vacinação eficiente requer um rigoroso
conhecimento e entendimento da epidemiologia da infecção provocada por
Salmonella em aves, juntamente com o entendimento da eficácia e potencial das
vacinas utilizadas (VAN IMMERSEEL et al., 2005). É necessário a análise do
benefício da vacina, o que envolve custo da vacina, da mão de obra, medida de
índices zootécnicos e da excreção fecal e contaminação dos ovos.
Diante das considerações referidas, elaborou-se o presente trabalho com o
objetivo de analisar a utilização de bacterinas inativadas comerciais contra
Salmonella enterica sorovar Enteritidis em aves de postura comercial, visando a
prevenir a excreção fecal e a contaminação dos ovos.
9
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1MORFOLOGIA E CLASSIFICAÇÃO DO GÊNERO SALMONELLA
Os microrganismos do gênero Salmonella são bacilos curtos de 0,7 a 1,5 x
2,5 μm, Gram-negativos, não esporulados. Em sua grande maioria, são móveis
com flagelos peritríquios, embora alguns sorotipos, como S. Pullorum e S.
Gallinarum, sejam imóveis. A temperatura de crescimento está entre 5 e 45
o
C,
sendo ideal a 37°C e o pH entre 4 e 9, sendo ideal em torno de 7. As salmonelas
crescem em meio de cultura para enterobactérias. Em ágar sangue, formam
colônias de 2-4 mm de diâmetro, elevadas, com bordas lisas e arredondadas. As
culturas de Salmonella mantêm-se viáveis por longos períodos em meios que
contenham peptona (HOLT, 1994; GAST, 1997).
São bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas, possuem habilidade
para metabolizar nutrientes, catabolizando D-glicose ou outros carboidratos, com
exceção de lactose e sacarose, com produção de ácido e gás. São catalase
positiva e oxidase negativa como todos os membros da família
Enterobacteriaceae. Não fermentam malonato, não hidrolisam a uréia, não
produzem indol; utilizam citrato como fonte de carbono, reduzem nitrato a nitrito e
podem produzir ácido sulfídrico (DICKEL, 2004).
Na classificação recomendada por POPOFF et al. (1996), os sorotipos de
Salmonella, cerca de 2.500, pertencem a duas espécies: Salmonella enterica com
seis subespécies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica) e
Salmonella bongori, que contém menos de 10 sorotipos e que são extremamente
raros. Os sorotipos são caracterizados com base em antígenos somáticos (O) e
flagelares (H). A Salmonella enterica, subespécie enterica, apresenta o maior
número de sorotipos (RODRIGUES, 2005). Dentre estes, cerca de 80 a 90 são os
mais comuns em casos de infecção dos seres humanos e animais. Alguns deles,
podem infectar as aves, causando ou não o paratifo aviário e, por meio de
produtos alimentícios de origem avícola, estarem associados a casos de
toxinfecção alimentar em humanos (BERCHIERI JÚNIOR, 2000).
10
2.2EPIDEMIOLOGIA E PATOGENIA
As salmonelas, incluindo-se a Salmonella Enteritidis (SE), além de
causarem o paratifo aviário são também os principais agentes de toxinfecção
alimentar em seres humanos, por intermédio da ingestão de alimentos de origem
animal contaminados. As salmonelas são carreadas por uma ampla variedade de
hospedeiros, incluindo animais silvestres, domésticos e o ser humano.
Informações sobre a incidência e distribuição dos sorotipos em populações de
animais domésticos é essencial para o entendimento da relação parasita-
hospedeiro, dentro e entre os reservatórios de agentes das salmoneloses humana
e animal (GAST,1997).
Os alimentos de origem animal são os principais responsáveis pela
infecção humana, entre eles, aqueles de origem avícola (SANTOS et al. 2000;
OLIVEIRA e SILVA, 2000), destacando-se ovos e seus derivados (RODRIGUE et
al.,1990; HUMPHREY,1994), principalmente a maionese caseira (DUARTE e
SILVA, 2002).
Segundo SIMÕES et al. (2001), ovos, seus derivados e pratos contendo os
mesmos mal cozidos, foram os principais responsáveis por 115 surtos alimentares
por SE ocorridos na região de Campinas-SP, sendo que a maionese caseira e a
cobertura de bolos foram responsáveis por 57% e 15% dos casos,
respectivamente.
A primeira evidência do envolvimento de SE com infecção originada do
consumo de alimentos preparados com ovos, ocorreu em um grande surto nos
Estados Unidos em 1986, relacionado a uma massa comercial congelada e
recheada com uma mistura de queijo, condimentos esterilizados e ovos crus
(SILVA E DUARTE, 2002).
No Brasil, o primeiro relato da ocorrência de SE em aves, com sinais
clínicos e mortalidade, foi apresentado por pesquisadores da Universidade de São
Paulo (USP) em 1990 (FERREIRA et al., 1990). Estudos epidemiológicos,
incluindo a fagotipagem e sonda complementar de rRNA, sugerem que a entrada
11
de SE no Brasil, deveu-se à importação de material genético avícola contaminado,
provavelmente no final da década de 80 (SILVA E DUARTE, 2002).
Na Europa, a proporção de casos de SE sobre o total de salmoneloses
humanas aumentou de 9,9% em 1985 para 26,1% em 1994 e; entre 1993 e 1994,
este sorotipo esteve associado a 83% dos surtos relacionados ao consumo de
ovos (BOYCE et al.,1996).
A infecção por SE em aves é importante devido aos problemas
relacionados à saúde pública, implicações na saúde animal e nas exportações
(AMENT et al., 1993). Em um surto ocasionado por SE em 1482 indivíduos, na
Inglaterra e no País de Gales, segundo ROBERTS e SOCKETT (1994), 73% dos
custos devido à toxinfecção alimentar por SE estavam diretamente associados
com diagnóstico, tratamento e faltas ao trabalho.
HUMPHREY et al. (1991a), trabalhando com aves infectadas por
Salmonella, constataram que cinco delas, com resultados de exames de fezes
negativos para a presença da bactéria, produziram ovos positivos, sugerindo que
a glândula da casca, ou outra parte do oviduto, pode ter sido o sítio da infecção.
Vários trabalhos verificaram que ovos são contaminados durante a formação ou
passagem pelos órgãos reprodutivos, como oviduto e vagina de aves infectadas
por SE (MIYAMOTO et al., 1997; OKAMURA et al., 2001).
GAST e BEARD (1990) observaram uma correlação entre fezes positivas
de galinhas infectadas artificialmente com SE PT 13a e a contaminação da casca
dos ovos. Resultados similares foram encontrados por BARROW e LOVELL
(1991), os quais, trabalhando com aves adultas infectadas oralmente com SE,
detectaram 0,31% e 5,86% de ovos positivos para SE. Nos primeiros, somente o
conteúdo foi analisado e nos restantes, além do conteúdo, a casca também foi
analisada. Isto sugere que estes, provavelmente, tornaram-se contaminados
durante a passagem através da cloaca, e não de infecção resultante do ovário.
Estudos epidemiológicos têm demonstrado que as principais fontes de
infecção de lotes de aves comerciais são pintos oriundos de lotes de matrizes
infectadas, infecção cruzada no incubatório e contaminação ambiental na granja
(OPITZ et al, 1992).
12
ZANCAN et al. (2000) detectaram Salmonella em 77% das caixas de
transporte de pintos com um dia de idade, de linhagem de aves reprodutoras
pesadas e 44% de linhagem de aves poedeiras comerciais, sendo encontrado o
sorotipo Enteritidis em 50% dessas caixas. GAMA et al., (2003) também
investigaram a presença de Salmonella em amostras de mecônio colhidas de
caixas de transporte de pintainhas para postura comercial e encontraram
Salmonella Enteritidis em 129 das 614 amostras analisadas.
A Salmonella, após invadir o tecido linfóide, incluindo placas de Peyer e
tonsilas cecais em aves (ZHANG-BARBER et al.1999), na mucosa intestinal,
migra da submucosa para vasos linfáticos, sendo ingerida por células fagocíticas
do sistema imune (HORMAECHE et al., 1993). A seguir, alcança a corrente
sanguínea e reside em fígado, baço e medula óssea; nesse estágio ocorre a
multiplicação, que dependerá do sorotipo de Salmonella e da resistência genética
do hospedeiro (HORMAECHE et al., 1993).
GAST e BEARD (1990c), após inoculação oral de 10
9
células de
Salmonella Enteritidis em galinhas, encontraram as seguintes amostras positivas
para SE: 60% cecais, 53% de fígados, 49% de baços, 19% de ovários e 17% de
ovidutos.
Alguns sorotipos de Salmonella como Enteritidis e Typhimurium (ST)
são extremamente invasivos. Causam extensa colonização intestinal com
excreção fecal e provocam doença sistêmica envolvendo o sistema retículo
endotelial (BARROW, 1995). Segundo ZHANG-BARBER et al. (1999), a
epidemiologia da SE e ST pode ser complexa, pois estes sorotipos geralmente
colonizam o trato digestivo de animais sem causar doença, ou podem aparecer
em certas circunstâncias, como em aves jovens que apresentam sistema
imunológico imaturo, ou em períodos de estresse, como extremos de temperatura
e pico de postura.
Os sinais da infecção por salmonelas paratíficas em aves jovens são:
sonolência, diarréia, asas caídas e refugagem (BERCHIERI JÚNIOR, 2000). Em
aves adultas, raramente se observam sinais clínicos, mas as aves podem
apresentar queda na produção de ovos em função de alterações de ovário e
13
oviduto que podem se apresentar atrofiados ou com folículos irregulares,
hemorrágicos e necróticos (BLAXLAND et al. 1982; GAST, 1994; BERCHIERI JR.
2000).
Conforme GAST (1997), a contaminação de ovos por Salmonella pode
provocar mortalidade embrionária e mortalidade em aves recém-nascidas, sem
que ocorra a manifestação de sinais clínicos. Estes diminuem com a idade e são
raramente observados em aves com mais de duas semanas de vida, no entanto
poderá ocorrer aumento da taxa de mortalidade e retardo no crescimento
(BERCHIERI JÚNIOR, 2000).
2.3 PREVENÇÃO E CONTROLE
Os programas de prevenção e controle com as infecções provocadas por
salmonelas paratíficas contemplam várias medidas coordenadas aplicadas
simultaneamente (GAST, 1997), com o objetivo de evitar a transmissão vertical e
horizontal da bactéria (BERCHIERI JÚNIOR, 2000).
Segundo McILROY et al. (1989), o risco de transmissão vertical pode ser
minimizado pela monitoria de lotes de matrizes testados por métodos
bacteriológicos e sorológicos, resultando em aves livres de Salmonella; pela
aquisição de linhagens de aves de produção mais resistentes à infecção por
Salmonella (BUMSTEAD, 2000); por medidas como a eliminação de aves
portadoras da bactéria; por tratamento dos ovos ainda no galpão e cuidados na
incubação de ovos sujos e trincados (BERCHIERI JÚNIOR, 2000).
A biosseguridade e o manejo sanitário das aves constituem-se em
importantes programas para redução de salmonelas no ambiente. Conforme
GAST (1997), um dos métodos empregados é a limpeza e desinfecção do galpão,
através do uso de desinfetantes químicos. Porém, nem todos são eficientes e
dependem, por exemplo, de como se comportam na presença de grandes
quantidades de material orgânico (BERCHIERI & BARROW, 1996). Aliado a isso,
salienta-se o controle de roedores, presentes nos galpões de aves e responsáveis
14
por importante papel na epidemiologia da infecção por Salmonella, ao contaminar
o ambiente e transmitir a bactéria para aves e ovos (HENZLER & OPITZ, 1992).
Procedimentos específicos visando ao controle de salmonelas em rações
de aves incluem a peletização e aplicação de ácidos orgânicos (SILVA, 2005).
Segundo GAMA (2001), como a peletização da ração é realizada em temperatura
superior a 60º C, o processo pode eliminar a Salmonella da ração, desde que não
ocorra recontaminação pelo manuseio, por ratos ou insetos. IBA & BERCHIERI
(1995), verificaram que a mistura de ácido fórmico e propiônico na ração de aves
foi eficaz no controle de Salmonella Typhimurium em ração contaminada
artificialmente.
O uso indiscriminado de antibióticos e a adição de promotores de
crescimento em rações animais contribuíram para a emergência da resistência
entre cepas de Salmonella e de outras bactérias (BERCHIERI JÚNIOR &
BARROW, 1998). Além disso, segundo BARROW (1999), após a retirada do
agente terapêutico, pode ocorrer um período no qual as aves podem se tornar
suscetíveis à infecção por Salmonella, porque a microbiota normal, por si própria
inibitória para Salmonella, também é afetada pelo uso do antibiótico.
A exclusão competitiva consiste na inoculação oral do conteúdo cecal de
aves adultas saudáveis em pintinhos recém-nascidos, acelerando o processo de
instalação da microbiota intestinal desejável (NURMI & RANTALA, 1973). Desse
modo, dificulta-se que microrganismos patogênicos se instalem na mucosa
intestinal, sendo este método importante no controle da infecção por salmonelas
em aves com microbiota intestinal imatura ou debilitada (antibioticoterapia).
Outra medida para prevenção e controle da Salmonella consiste na
vacinação de aves suscetíveis (GAST, 1997). Atualmente, várias pesquisas têm
sido realizadas com o objetivo de analisar a eficácia do uso de vacinas vivas
(BARROW et al., 1991; HASSAN e CURTISS III., 1997) e inativadas (TIMMS et
al.,1990; GAST et al.,1993; NAKAMURA et al.,1994; MIYAMOTO et al.,1999;
WOODWARD et al.,2002). Isso resulta na aplicação deste método de controle,
que pode ser utilizado de maneira segura e eficaz como parte do programa de
15
prevenção da infecção em aves e contaminação dos ovos por SE (GAST et al.
1992).
2.4 IMUNIDADE PARA SALMONELLA
Respostas imunes para Salmonella dependem da espécie hospedeira e do
sorotipo infectante. Muito do que se conhece sobre a imunidade contra Salmonella
advém de estudos sobre a infecção experimental de camundongos por Salmonella
Typhimurium e as informações obtidas são extrapoladas para infecções causadas
por Salmonella Enteritidis em aves (VAN IMMERSEEL et al., 2005).
Imunoglobulina A (IgA), leucócitos e linfócitos associados à mucosa,
constituem-se na primeira linha de defesa contra infecções causadas por
Salmonella Enteritidis (SHEELA et al.,2003). A secreção de IgA limita a
colonização da mucosa intestinal por SE, prevenindo a aderência e subseqüente
invasão e multiplicação da bactéria no intestino (SHROFF et al., 1995).
Na pesquisa realizada por SHEELA et al. (2003), verificou-se que no pico
de secreção de IgA, ocorrido 28 dias pós inoculação oral de SE em aves, houve
uma redução de lesões na mucosa intestinal, sugerindo que esta imunoglobulina
pode ter um importante papel no controle da infecção por SE no intestino.
DESMIDT et al. (1998), após desafio experimental via oral de SE em
poedeiras, verificaram que nas aves do grupo controle houve uma redução da
excreção fecal da bactéria associada a um pico de IgA no lúmen intestinal, quando
comparadas ao grupo de aves bursectomizadas. Isto indica um efeito protetor
desta imunoglobulina contra colonização intestinal. Resultados similares foram
obtidos na pesquisa de BROWNELL et al. (1970), trabalhando com S.
Typhimurium.
Segundo SHEELA et al., (2003), a infecção via oral por SE provocou
aumento nos títulos de imunoglobulina G séricas específicas, mas não induziu a
uma proliferação significante de células mononucleares do sangue e do baço,
16
sugerindo que a infecção através desta via não é capaz de ativar linfócitos
periféricos ou circulantes específicos para SE.
Vários estudos mostram a importância da resposta inata do hospedeiro nas
infecções por Salmonella. Em camundongos, as células polimorfonucleares têm
um importante papel na resistência a infecções por Salmonella (HARGIS et al.,
1999; FIERER, 2001). Em frangos de corte, granulócitos heterofílicos
acumulam-se na mucosa cecal 18 horas após a infecção por SE (VAN
IMMERSEEL et al., 2005).
O controle de infecções primárias com vacinas contendo cepas mortas de
Salmonella estimulam a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6,
IL-8 e IFN-γ (OKAMURA et al.,2004). Pesquisas com camundongos,
demonstraram que a IL-1 e a IL-6 podem apresentar um importante papel na
resposta do hospedeiro contra Salmonella (KLIMPEL et al., 1995). Por outro lado,
a IL-8 recruta leucócitos polimorfonucleares para o sítio primário da infecção
(KOGUT, 2002).
O IFN-γ ativa macrófagos e induz à produção de óxido nítrico (NO)
(OKAMURA et al., 2004), o qual forma peroxinitrito, um potente oxidante com
propriedades anti-microbianas (ALAM et al., 2002); Além de melhorar a expressão
de MHC-II pelos macrófagos (KASPERS et al., 1994). O MHC-II são moléculas
que apresentam antígenos peptídicos às células T helper ou T auxiliares (T
CD4+), estes peptídeos são derivados de salmonelas fagocitadas pelos
macrófagos (JANEWAY et al., 2002).
Os macrófagos estimulados pelo IFN-γ ativam a enzima óxido nítrico-
sintase que catalisa a produção de óxido nítrico (ON) a partir de l-arginina. O ON é
tóxico para muitas bactérias, especialmente as bactérias que residem dentro de
macrófagos, como Salmonella e Listeria (KASPERS et al., 1994). Porém, é
importante salientar que existem mecanismos de evasão da Salmonella contra a
ação do sistema imune do hospedeiro. Existem dois sistemas de secreção tipo III,
SPI1-TTSS e SPI2-TTSS, o primeiro participa das etapas iniciais da infecção,
como a invasão das células epiteliais da mucosa intestinal pela Salmonella, o
segundo, promove a sobrevivência e proliferação da bactéria dentro dos
17
macrófagos (ARROYAVE, 2005). A resistência à fagocitose é também uma razão
pela qual as bactérias intracelulares tendem a causar infecções crônicas que
podem durar anos, muitas vezes recidivar ou recrudescer após uma cura
aparente, e são difíceis de erradicar (JANEWAY et al., 2002).
A imunidade mediada por células é considerada mais importante que a
resposta humoral na proteção contra Salmonella (VAN IMMERSEEL et al., 2005),
atuando na lise da célula infectada (DESMIDT et al., 1998). A resposta mediada
por células também é responsável pelo “clearance” tecidual de cepas virulentas
de Salmonella em aves, enquanto que para o “clearance” intestinal destacam-se
as respostas de IgA e leucócitos polimorfonucleares (NAGARAJA &
RAJASHEKARA, 1999; BARROW & WALLIS, 2000).
Devido ao fato das salmonelas realizarem uma fase do ciclo de vida dentro
das células de seus hospedeiros, principalmente células do baço e fígado
(SHEELA et al., 2003; DE BUCK et al.,2004), a resposta humoral sozinha não é
capaz de debelar a infecção (DESMIDT et al., 1998). O processo de “clearance”
do organismo infectado, realizado através de mecanismos imune dependentes de
anticorpos como a opsonização e fagocitose, ocorre quando as salmonelas são
liberadas extracelularmente (ROITT, 2003).
Resultados de pesquisa realizada por SHEELA et al. (2003) sugeriram que
a infecção oral de aves com Salmonella não pode induzir resposta imune que seja
efetiva no controle da infecção. Assim, a bactéria persiste nas aves por um grande
período de tempo, sem ser eliminada pelo sistema imune (DUNLAP et al., 1991).
2.5EFEITO DA VACINAÇÃO
Os critérios para uma vacina ideal contra as salmonelas, incluem a
proteção efetiva sistêmica e de mucosa e a eficácia na redução da contaminação
ambiental e dos ovos. E, ainda, deve oferecer baixo risco à saúde humana e
animal, compatibilidade com outras medidas de controle e ser economicamente
viável (PRITCHARD et al.,1978)
18
O objetivo da vacinação contra as salmonelas é impedir a aderência no
intestino, a multiplicação e excreção da bactéria pelo organismo de aves
infectadas, e também a redução da colonização de órgãos, incluindo fígado, baço
e ovário. Assim, aves apropriadamente vacinadas podem suportar uma infecção e
eliminar pelas fezes a bactéria, mais rapidamente e efetivamente do que aves não
imunizadas (SCHARR, 2003).
Respostas imunes para Salmonella dependem do sorotipo, da espécie do
hospedeiro infectado e da formulação da bacterina utilizada. Sorotipos espécie-
hospedeiro não específicos, como a SE (RODRIGUES, 2005), são aqueles que
geralmente provocam gastroenterite em várias espécies hospedeiras e podem
induzir doença sistêmica (VAN IMMERSEEL et al., 2004). Segundo VAN
IMMERSEEL et al. (2004), bacterinas autógenas, contendo cepa morta da
bactéria, têm sido usadas com sucesso variável no controle de infecções
causadas por estes sorotipos.
Pesquisas como a de TIMMS et al. (1990) comprovam que aves
imunizadas com bacterina contendo cepa de SE em emulsão oleosa e inativada
com formalina, apresentam redução dos sinais clínicos, mortalidade e lesões em
órgãos, quando comparadas ao grupo de aves controle, sendo que ambos foram
desafiados experimentalmente com SE.
Estudos relacionados com a eficácia de bacterinas para o controle de SE
em aves são extremamente necessários, pois, as vacinas vivas não são liberadas
para uso comercial nos Estados Unidos, Brasil e em muitos outros países
(BARROW,1999; Brasil,2003). Isso devido aos riscos associados ao uso de cepas
vivas atenuadas, tais como reversão da virulência da bactéria (BARROW &
LOVELL,1991., DE BUCK et al.,2004) e imunossupressão das aves vacinadas
(EISENSTEIN et al.,1984., LEE et al.,1985., HASSAN e CURTISS III.,1994.,
ARNOLD e HOLT.,1995).
A eficácia de uma vacina é avaliada pelo nível de colonização intestinal e
sistêmica do agente patogênico, bem como por taxas de morbidade e mortalidade
do hospedeiro infectado, pós-vacinação e infecção experimental, assim como o
nível de proteção das vacinas depende da cepa desafio, da via de administração,
19
da dose infectante, idade, espécies ou linhagens de aves utilizadas (VAN
IMMERSEEL et al.,2004).
A qualidade e eficácia das bacterinas estão relacionadas com a cepa da
bactéria utilizada e com o procedimento de inativação, além do meio de cultura e
do adjuvante utilizados no preparo da vacina (BARBOUR et al., 1993).
Várias pesquisas avaliaram a eficácia de vacinas inativadas. GAST et
al.(1992) evidenciaram que, após desafio de SE, poedeiras vacinadas com
bacterina oleosa, inativada em acetona e contendo SE fagotipo 13 a,
apresentaram menor isolamento da bactéria de baço, ovário e oviduto. Todavia a
proporção da eliminação de SE nas fezes não diferiu estatisticamente do grupo de
aves vacinadas (59,8%) e não vacinadas (58,8%). Resultados similares foram
encontrados por BARROW et al. (1990), os quais também notaram que aves
vacinadas com bacterina continuaram a excretar S. Typhimurium pelas fezes.
GAST et al. (1993) estudando o uso de bacterina oleosa preparada com
SE fagotipo 13a e inativada em acetona, isolaram 58% de amostras de fezes
positivas para a presença de SE em poedeiras vacinadas e 81% no grupo de
aves não vacinadas. Provaram, assim, que o uso da vacinação poderia reduzir o
nível de contaminação ambiental e a transmissão horizontal dentro e entre os
lotes.
BARBOUR et al. (1993) analisaram seis formulações de bacterinas
contendo os fagotipos 8, 13ª e 23 de SE , preparadas com diferentes métodos de
inativação e natureza de adjuvantes. Concluíram que, após desafio experimental
de SE, aves vacinadas com bacterina inativada com 20% de acetona e contendo
adjuvante incompleto modificado de Freund, foram protegidas contra eliminação
de SE nas fezes por até 7 dias; enquanto nos outros tratamentos este período de
proteção foi de apenas 3 dias pós- desafio.
NAKAMURA et al.(1994) imunizaram poedeiras com bacterina contendo
SE fagotipo 4, inativada em 1% de formalina e preparada com adjuvante
incompleto de Freund. Verificaram que, após desafio experimental com SE,
isolaram menor número de bactérias de conteúdo cecal, de baço e de fígado das
aves vacinadas quando comparadas às do grupo controle.
20
MIYAMOTO et al. (1999) avaliaram a eficácia da bacterina oleosa
(Layermune SE
®
) na redução da contaminação de ovos. Verificaram que aves
vacinadas e desafiadas com SE por via vaginal apresentaram isolamento da
bactéria de somente 8% dos ovos, comparados a 15,8% no grupo de aves não
vacinadas.
DAVISON et al.(1999) trabalharam com 11 lotes de poedeiras comerciais
vacinadas com bacterina autógena e/ ou bacterina comercial (Layermune SE
®
)
contra SE. Através de análises mensais, durante o período de vida das aves, os
pesquisadores verificaram que, apesar do uso da vacina, 63,6% e 100% dos lotes
apresentaram amostras ambientais e cultura de órgãos positivos para SE,
respectivamente.
LIU et al.(2001) pesquisaram aves vacinadas, via oral ou intramuscular,
com cepa de SE fagotipo 4, inativada em 1% de formalina e encapsulada em
microesferas biodegradáveis. Verificaram que, após desafio oral com SE, ocorreu
uma significativa diminuição da eliminação fecal e colonização de órgãos em
relação ao grupo de aves não vacinadas.
WOODWARD et al. (2002), trabalharam com aves vacinadas com bacterina
comercial preparada com SE fagotipo 4 e desafiadas via endovenosa com cepa
de SE. Verificaram nestas aves, além de redução dos sinais clínicos, o isolamento
de 12% de ovos positivos para a bactéria, em relação a 39% de aves do grupo
controle.
3.OBJETIVO
Analisar a utilização de três bacterinas contra Salmonella enterica sorovar
Enteritidis (SE) em aves de postura comercial, avaliando a eficácia através da
análise da colonização de órgãos internos, como fígado, baço, ceco e ovário, da
excreção fecal e da contaminação dos ovos.
21
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostra bacteriana
Utilizou-se uma cepa mutante de Salmonella Enteritidis pertencente ao
fagotipo 4, resistente ao ácido nalidíxico e a espectomicina (SE Nal/Spec),
mantida pelo laboratório de Ornitopatologia do Departamento de Patologia
Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Unesp-
Campus de Jaboticabal, estado de São Paulo.
4.2 Preparo do inóculo de Salmonella Enteritidis
O inóculo consistiu de 2 mL da cultura da cepa de SE Nal/Spec, semeada
em caldo nutriente (DIFCO 0003-17) e incubada a 37º C por 24 horas, sob
agitação. Esta cultura continha aproximadamente 3,4 x 10
9
UFC/mL.
4.3 Bacterinas utilizadas
Foram utilizadas três bacterinas comerciais V1, V2 e V3, na dosagem e
recomendações prescritas pelos laboratórios fabricantes. Todas as vacinas foram
mantidas sobre refrigeração, na temperatura entre 2 e 6
o
C e no momento do uso
estavam na temperatura ambiente, entre 20 a 30
o
C.
4.4 Aves utilizadas
Foram utilizadas 400 pintinhas brancas, com um dia de idade, da linhagem
W-36, provenientes do incubatório comercial de aves para postura da Hy-Line do
Brasil. O manejo das aves e o programa nutricional e profilático foram realizados
conforme as recomendações para a linhagem utilizada. As pintinhas com um dia
de idade foram alojadas no aviário da FCAV, onde receberam aquecimento, ração
e água ad libitum, também foram pesadas e amostras de mecônio presentes no
fundo das caixas de transporte foram analisadas para pesquisa de Salmonella sp
(Zancan et al.,2000).
22
4.5 Delineamento experimental
Inicialmente, no aviário da FCAV, as quatrocentas pintinhas com um dia de
idade foram alojadas no galpão de cria em 20 gaiolas suspensas contendo 20
aves cada e permaneceram até a oitava semana de idade. Na oitava semana,
todas as aves foram divididas em quatro grupos contendo 100 aves cada, sendo
que aves de três tratamentos (V1, V2 e V3) foram vacinadas com a primeira dose
das bacterinas oleosas comerciais doadas por diferentes laboratórios, e o grupo
de aves restantes, não vacinadas, constituiu-se no grupo controle (C).
Posteriormente, as aves foram transferidas para o galpão de recria.
No galpão de recria, as aves foram divididas em 80 gaiolas contendo 5 aves
cada e na décima sexta semana de vida, as aves receberam a segunda dose das
três bacterinas comerciais testadas, logo em seguida, as aves foram transferidas
para o galpão de postura, onde permaneceram em gaiolas contendo 8 aves cada,
sendo 2 aves por repartição.
Na vigésima semana de vida, treze aves de cada tratamento foram
retiradas do galpão de postura e transferidas para gaiolas individuais de produção
em ambiente controlado, onde foram desafiadas com 2 mL de cultura de
Salmonella Enteritidis, preparada conforme o item 4.2 e inoculada via
intraesofagiana com ajuda de uma cânula esofágica. Outros dois desafios foram
realizados na vigésima quinta e trigésima primeira semana de vida das aves.
No segundo dia pós-inoculação e duas vezes por semana, foram feitos
suabes de cloaca para pesquisa de Salmonella.
No segundo dia após o desafio, foram sacrificadas três aves de cada
tratamento para estimativa da presença de Salmonella Enteritidis no fígado, baço
e conteúdo cecal. O ovário também foi colhido para análise microbiológica, assim
como todos os ovos produzidos.
Em cada desafio, após a detecção de quatro suabes de cloaca
consecutivos, com resultados negativos da presença de Salmonella Enteritidis
(SE), as 10 aves remanescentes de cada tratamento foram sacrificadas para
pesquisa de Salmonella em fígado, conteúdo cecal e ovário.
23
4.6 Exames laboratoriais
4.6.1 Avaliação da presença de SE nas aves
No segundo dia após cada desafio, três aves de cada grupo foram
sacrificadas para colheitas de amostras de fígado, baço e conteúdo cecal para
estimativa do número de SE Nal/Spec. As amostras foram pesadas, e as de fígado
e baço foram maceradas em graal com pistilo, antes do procedimento de diluição
decimal. Em seguida, adicionou-se solução salina tamponada (PBS) pH 7,4 na
razão de 1:10 e foram feitas diluições decimais em PBS pH 7,4. De cada diluição,
0,1 mL foi dispensado em ágar VB/Nal/Spec para contagem do número de
colônias (UFC/g), e transformado em log
10
. Na ausência de crescimento da
bactéria, foi adicionado caldo SN em dupla concentração aos frascos, sendo,
posteriormente, incubados a 37ºC/24h e plaqueados em ágar VB/Nal/Spec,
também incubados a 37ºC/24h.
O ovário também foi colhido e colocado em jarra contendo caldo SN, e
incubado a 37º C/ 24 h. Posteriormente, a cultura do caldo SN foi cultivada em
ágar VB Nal/Spec.
As amostras do conteúdo cecal e do fígado das dez aves restantes de cada
desafio foram colhidas com suabes, os quais foram colocados em tubos contendo
caldo SN, seguindo-se a rotina de exame prescrita anteriormente. Da mesma
forma, o ovário também foi processado conforme descrição prévia.
4.6.2 Avaliação da excreção fecal
A avaliação da excreção fecal foi feita utilizando-se suabes de algodão
estéreis que foram introduzidos na cloaca das aves. Levados ao laboratório, os
suabes foram imersos em caldo selenito/novobiocina (SN) (OXOID CM 395),
agitados e imediatamente semeados em ágar verde brilhante (OXOID CM 263),
contendo ácido nalidíxico e espectomicina (VB Nal/Spec). O suabe dentro do tubo
contendo caldo SN e as placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Na ausência
de crescimento em placas, o suabe correspondente foi novamente semeado em
ágar VB/Nal/Spec e incubado a 37ºC por 24 horas.
24
4.6.3 Análise dos ovos
Os ovos foram colhidos diariamente, depois de cada desafio e durante dezesseis
dias após a inoculação da SENal/Spec. Foram examinados individualmente em
recipientes de plástico, quebrados e agitados para promover a homogeneização
de seus componentes. Logo após, os frascos foram incubados a 37ºC/24h. Após a
incubação, a mistura foi semeada, com auxílio de suabe de algodão estéril, em
ágar VB/Nal/Spec e incubada a 37ºC/24h.
4.7 Análise estatística
Os resultados relacionados à contagem de células viáveis de SENal/Spec
(log
10
) do fígado, baço, conteúdo cecal e ovário foram submetidos ao teste F e as
médias de cada tratamento comparadas pelo teste de Tukey com 5% de
probabilidade. Os dados referentes à excreção fecal foram analisados pelo teste
não paramétrico do qui-quadrado.
25
5. RESULTADOS
A Tabela 1 apresenta a média do número (Log
10
) de células viáveis de SE
Nal/Spec
r
isoladas dos seguintes órgãos: baço, fígado e ceco de aves sacrificadas
dois dias após desafio intra-esofágico da bactéria. Observa-se que, em todos os
tratamentos e em todos os desafios, o número de colônias de SE isoladas do baço
e fígado das aves não foram estatisticamente diferente (p< 0,05) entre si. Todavia,
com relação as amostras cecais, no terceiro desafio, as aves que receberam a
vacina V1 apresentaram uma menor contagem significativa (p< 0,05) da bactéria
em comparação com os outros tratamentos. Da mesma forma, o tratamento V3
apresentou menor número de células viáveis de SENal/Spec no primeiro desafio
em relação ao terceiro desafio.
Tabela 1: Média do número (Log
10
) de células viáveis de SE Nal/Spec
r
em baço,
fígado, ceco e ovário de aves sacrificadas dois dias após o desafio.
Tratamentos
Órgãos Desafio
V1 V2 V3 C
1
2,33 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa
Baço 2
< 2,00 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa
3
< 2,00 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa 2,67 Aa
1
2,33 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa 2,30 Aa
Fígado 2
< 2,00 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa
3
< 2,00 Aa < 2,00 Aa < 2,00 Aa 2,33 Aa
1
3,36 Aa 2,33 Aa < 2,00 Ab 3,19 Aa
Ceco 2
2,53 Aa 2,59 Aa 3,07 Aab 3,67 Aa
3
2,67 Ba 3,57 ABa 3,43 ABa 4,50 Aa
A - B, a – b: Médias seguidas de letras distintas (linhas e colunas, respectivamente) diferem
significativamente pelo teste de Tukey ( p
≤ 0,05)
26
A Tabela 2 representa a pesquisa de SE Nal/Spec
r
em fígado, conteúdo
cecal e ovário de aves tratadas (V1, V2 e V3) e não tratadas (C), sacrificadas após
4 suabes de cloaca consecutivos negativos para isolamento de SE. Observa-se
que, apesar de serem encontrados duas e três amostras cecais positivas, no
segundo e terceiro desafios respectivamente e, uma amostra de fígado positiva no
terceiro desafio, a diferença não foi estatisticamente significativa (p< 0,05) entre os
tratamentos e em nenhum dos desafios pelo teste do Qui-quadrado.
27
Tabela 2: Pesquisa de SE Nal/Spec
r
em fígado, conteúdo cecal e ovário das aves
sacrificadas após 4 suabes de cloaca consecutivos com resultados negativos para
SENal/Spec.
V1 V2 V3 C
Desafio Aves F C O F C O F C O F C O
1
a
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
2
a
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
3
a
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
4
a
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
1º 5
a
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
6
b
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
7
b
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
8
b
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
9
b
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
10
b
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
T 1 - -
-
- -
-
- -
-
- -
-
V1 V2 V3 C
Aves
c
F C O F C O F C O F C O
1
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
2
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
3
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
4
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
2º 5
- +
-
- -
-
- -
-
- -
-
6
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
7
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
8
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
9
- -
-
- +
-
- -
-
- -
-
10
- -
-
- -
-
- -
-
- -
-
T 2 - 1
-
- 1
-
- -
-
- -
-
V1 V2 V3 C
Aves
d
F C O F C O F C O F C O
1
- - - - - - - - - - - -
2
- - - - - - - - - - - -
3
- - - -
+
- - - - - - -
4
- - - - - - - - - - - -
3º 5
- - - - - - - - - -
+
-
6
- - - - - - - - - - - -
7
- - -
+
- - - - - - - -
8
- - - - - - - - - - - -
9
- - - - - - - - - - - -
10
- - - -
+
- - - - - - -
T 3 - - - 1 2 - - - - - 1 -
F = Fígado; C = Conteúdo cecal; O = Ovário; T 1 = Total de positivos do 1º desafio; T 2 = Total de
positivos do 2º desafio;
T 3 = Total de positivos do 3º desafio;
a
= aves sacrificadas com 24 dias pós-infecção
submetidas a jejum alimentar de 24 horas;
b
= aves sacrificadas com 22 dias pós-infecção;
c
= aves
sacrificadas com 17 dias pós-infecção;
d
= aves sacrificadas com 15 dias pós-infecção; não houve diferenças
significativas (p < 0,05) entre os tratamentos e os desafios pelo Chi-Square Test
28
A Tabela 3 representa a análise da excreção fecal de SENal/Spec nos
diferentes tratamentos após desafio experimental com SE. Verifica-se que, no
primeiro desafio, as aves tratadas com a vacina V3 não apresentaram eliminação
de SENal/Spec pelas fezes, diferindo estatisticamente (p< 0,05) do grupo
controle, ao contrário das aves dos demais tratamentos. Em relação ao segundo e
terceiro desafios, nenhum dos tratamento diferiram estatisticamente do grupo de
aves que não receberam vacina (C).
29
Tabela 3: Inspeção da cloaca de aves comerciais mediante utilização de suabe para detecção de SE Nal/Spec
r
.
1º Desafio 2º Desafio 3º Desafio
V
1
V
2
V
3
C
V
1
V
2
V
3
C
V
1
V
2
V
3
C
Dpi
D E T
D E T D E T D E T D E T D E T D E T D E T D E T D E T D E T D E T
2
0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 2 3 0 0 0 0 2 2 0 1 1 0 2 2 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
7
0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0
10
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
13
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tota
l
1
ab
4
a
0
b
5
a
0
a
2
a
1
a
2
a
0
a
3
a
0
a
0
a
Obs
1
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
%
2
2 8 0 10 0 4 2 4 0 6 0 0
D: Resultado positivo no plaqueamento direto em ágar VB Nal/Spec; E: Resultado positivo após enriquecimento em caldo selenito-novabiocina/42ºC/24h; T:
Total, soma dos resultados D+E; Dpi: dias pós infecção; Número de aves por tratamento = 10;
ab
= letras diferente na mesma linha diferem entre si (p< 0,05) pelo
Chi-Square Test.
1
= número total de observações (suabes de cloaca);
2
= porcentagem de suabes de cloaca contaminados.
30
A Tabela 4 contém os resultados referentes à análise de ovos positivos para
Salmonella Enteritidis (SE) provenientes de aves vacinadas (V1, V2 e V3) e de
aves do grupo controle (C) .Pelos dados contidos na tabela 4 observa-se que, no
primeiro desafio, as aves que receberam a vacina V3 apresentaram um percentual
significativamente menor (1,59%, p< 0,05) que as aves do grupo controle (6,56%,
p < 0,05). No segundo desafio, não houve diferença significativa (p< 0,05) entre os
tratamentos. Por outro lado, no terceiro desafio, todos os grupos tratados
apresentaram porcentagem significativamente menor (p< 0,05) do que o grupo
controle.
31
Tabela 4: Análise dos ovos provenientes de poedeiras vacinadas com três
diferentes produtos comerciais e, submetidas a três desafios com SE Nal/Spec
r
.
1° Desafio 2° Desafio 3° Desafio
Dpi
V1 V2 V3 C V1 V2 V3 C V1 V2 V3 C
1º
1 5 1 5 3 3 0 3 2 1 1 4
2º
1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
3º
0 0 1 2 0 0 1 1 0 0 0 1
4º
0 1 0 0 2 1 3 3 0 0 0 1
5º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
6º
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
8º
0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
9º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
10º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
11º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
13º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
15º
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16º
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
Pos.
1
3
ab
7
ab
2
b
8
a
5
a
5
a
4
a
8
a
2
b
2
b
1
b
8
a
Obs.
2
123 136 126 122 125 126 121 124 145 149 145 133
%
3
2,44 5,15 1,59 6,56 4,00 3,97 3,31 6,45 1,38 1,34 0,69 6,02
1
= Número de amostras positivas;
2
= número total de observações;
3
= porcentagem de ovos
contaminados;
ab
= letras diferente na mesma linha diferem entre si (p< 0,05) pelo Chi-Square Test.
32
6. DISCUSSÃO
Várias medidas de controle de SE em aves são utilizadas nos plantéis
avícolas; dentre elas, a vacinação com bacterinas tem sido uma importante
medida para a prevenção de infecções causadas por salmonelas em aves (VAN
IMMERSEEL et al., 2005). A vacina ideal e eficaz contra infecção por SE deveria
impedir a colonização intestinal da bactéria, a disseminação para órgãos internos,
a eliminação de SE através das fezes e ovos, bem como induzir uma resposta
imune mediada por células e por anticorpos (VAN IMMERSEEL et al., 2005).
Como no Brasil, a utilização de bacterinas contra SE em aves matrizes foi
liberada em novembro de 2003 pela Instrução Normativa 78 do Programa
Nacional de Sanidade Avícola do Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento (MAPA), a estratégia de aplicação destas vacinas requer um
conhecimento detalhado e profundo sobre a eficácia deste método de controle.
Após a infecção oral em poedeiras, a SE coloniza o trato intestinal, invade
órgãos internos, e pode se depositar nos ovos (GAST & BEARD, 1990; GAST et
al, 2004), podendo assim se disseminar verticalmente via ovo, desencadeando o
nascimento de pintos infectados ou espalhar horizontalmente pela criação,
infectando outras aves e, através dos ovos, os seres humanos.
Desta forma, investigações a respeito da eficácia de vacinas na proteção de
galinhas contra Salmonella Enteritidis, podem se basear em análises sorológicas
como pesquisa de anticorpos no soro de aves vacinadas e infectadas
33
experimentalmente (MIYAMOTO et al., 1999, BABU et al., 2004). Como também
bacteriológica, através da análise qualitativa e/ou quantitativa, ou seja, através da
pesquisa ou contagem da bactéria em órgãos como fígado, baço, ceco e ovário,
além de fezes e ovos, utilizando-se caldos e meios de cultura em placa seletivos
para isolamento de Salmonella (TIMMS et al., 1990; GAST et al., 1992, 1993;
NAKAMURA et al.,1994; MIYAMOTO et al.,1999; WOODWARD et al.,2002; BABU
et al., 2004).
Seguindo esses conceitos, os resultados dos exames realizados no
presente trabalho compararam a eficiência de três bacterinas comerciais contra
Salmonella Enteritidis, frente a três desafios experimentais por SE em poedeiras
comerciais.
O ceco é o principal local de multiplicação de SE no organismo da ave,
enquanto que o baço e o fígado constituem-se nos principais órgãos não-
intestinais, onde a bactéria pode ser encontrada (GORHAM et al., 1991).
NAKAMURA et al.(1994) imunizaram poedeiras com bacterina contra SE e
verificaram que, uma semana após o desafio, isolaram menor número de SE de
fígado e baço das aves vacinadas em comparação ao grupo controle. GAST et
al.(1992) evidenciaram que, após desafio com SE, poedeiras vacinadas com
bacterina oleosa inativada contra SE apresentaram menor isolamento da bactéria
em baço, ovário e oviduto, no sétimo e vigésimo oitavo dia após a inoculação.
Embora tenha se encontrado resultados favoráveis aos efeitos da vacina na
redução de SE no ceco de aves do grupo V1 no segundo dia após o terceiro
desafio, não se pode constatar proteção contra a invasão dos órgãos em nenhum
34
dos grupos vacinais, pois na pesquisa de SENal/Spec no final dos desafios,
algumas aves vacinadas apresentaram isolamento positivo da bactéria em fígado
e ceco. Resultados semelhantes foram obtidos por DAVISON et al., 1999, os quais
verificaram que lotes de aves vacinadas apresentaram cultura de órgãos positiva
para SE e com resultados estatísticos similares ao lote de aves não vacinadas..
No presente estudo, não foi encontrado o isolamento de níveis máximos de
contaminação de SE em fígado e baço, como verificados 3 dias após a infecção
em pesquisa realizada por VAN IMMERSEL et al., (2002). MIYAMOTO et al.,
1999, também concluiu que o uso de bacterinas poderia reduzir apenas
parcialmente a disseminação de SE para órgãos internos e colonização da cloaca.
Portanto, as bacterinas utilizadas neste trabalho não impediram a infecção
sistêmica da bactéria inoculada.
No presente trabalho verificou-se que somente as aves do tratamento V3
,
no primeiro desafio, não eliminaram SE pelas fezes (Tabela 3), diferindo
estatisticamente do grupo de aves controle (p < 0,05%), mas não do V1.
BARBOUR et al. (1993) também encontraram resultados semelhantes ao
comparar o uso de seis diferentes bacterinas em aves de postura desafiadas com
SE. Sendo que o número de suabes fecais positivos para SE, em dois grupos
vacinais diferiu, e em outros quatro não do grupo controle no sétimo dia após o
desafio. Segundo os mesmos autores, essa diferença parece estar relacionada à
natureza do adjuvante, à cepa da bactéria e ao método de inativação da SE
empregado na produção da vacina. WOODWARD et al. (2002) trabalharam com
aves vacinadas com uma bacterina comercial, desafiadas via endovenosa com
35
cepa de SE verificando, nestas aves, o isolamento de SE em 9,2 % dos suabes
cloacais, em relação a 37,2% de aves do grupo controle; ao contrário de GAST et
al. (1992), que não obtiveram diferenças na eliminação de SE em aves vacinadas
e não vacinadas com bacterinas e desafiadas oralmente com SE. Resultados
semelhantes foram obtidos no presente trabalho no segundo e terceiro desafios.
Outro trabalho de GAST et al. (1993), verificou um maior isolamento de SE de
amostras fecais ocorrido em todos os tratamentos, na primeira semana após o
desafio oral de SE, o que está de acordo com o presente trabalho, no qual a
bactéria também foi isolada nos primeiros sete dias após os desafios. Percebe-se
que os resultados da excreção fecal de SE encontrados nos trabalhos com
bacterinas contra SE, são variados; fatores como idade das aves na vacinação e
no desafio, vias de inoculação e de imunização interferem nas taxas de excreção
da Salmonella Enteritidis (GAST et al., 1990; GAST et al.,1992; HUMPHREY, et
al., 1991; MIYAMOTO et al., 1999; TIMMS et al.,1990; WOODWARD et al.,2002),
bem como, fatores estressantes aplicados às aves, como retirada de água, ração,
exposição à altas temperaturas externas (NAKAMURA et al., 1994) e período de
muda das aves (HOLT et al., 2003).
No presente estudo não foi possível a obtenção de informações
referentes aos componentes utilizados na produção das vacinas. Mas sabe-se que
a inclusão de adjuvantes e imunomoduladores nas fórmulas vacinais pode
aumentar a quantidade e qualidade da resposta imune (MUIR et al., 2000).
Todavia, pode se deduzir ainda que, fatores relacionados com a produção das
vacinas estiveram implicados nas diferenças de excreção de SE encontradas
36
entre os grupos vacinais. É importante salientar que, a diminuição da eliminação
de SE pelas fezes pode controlar o nível de contaminação ambiental e a
transmissão horizontal da bactéria dentro e entre os lotes pode ser marcadamente
reduzida, como também a contaminação dos ovos (GAST et al., 1993).
Os resultados da pesquisa de SE em ovos (Tabela 4) demonstraram um
efeito positivo da vacina administrada ao grupo V3 no primeiro desafio e em todos
os grupos vacinais no terceiro desafio. Concordando com GAST et al.(1992), que
avaliando a proteção de uma bacterina em aves de postura vacinadas e
desafiadas em diferentes idades, obteve uma menor porcentagem de ovos
positivos para SE nas aves que receberam a primeira dose da vacina na vigésima
terceira semana de vida em comparação com o grupo não vacinado, aliado a isso,
os ovos positivos para SE foram detectados nas aves não vacinadas, nos
primeiros dez dias após desafio experimental da bactéria, semelhantemente aos
resultados encontrados no presente estudo.
Embora não se tenha conseguido eliminar completamente a SE das aves
vacinadas com as bacterinas, pôde-se considerar que as mesmas, principalmente
a administrada ao grupo V3, diminuiu a contaminação dos ovos ao longo da
avaliação. O que é relevante, pois o consumo de ovos contaminados tem sido
considerado como a principal causa de toxinfecções alimentares em seres
humanos (HUMPHREY, 2006).
Os resultados da excreção fecal e eliminação de SE em ovos no presente
estudo mostraram-se semelhantes no primeiro e segundo desafios. GAST e
BEARD (1990) também observaram uma correlação entre fezes positivas de
37
galinhas infectadas artificialmente com SE e a contaminação da casca dos ovos.
Dados similares foram encontrados por BARROW e LOVELL (1991), os quais,
trabalhando com aves adultas infectadas oralmente com SE, detectaram 0,31% e
5,86% de ovos positivos para SE, sendo que nos primeiros, somente o conteúdo
foi analisado e nos restantes, além do conteúdo, a casca também foi analisada,
sugerindo que estes, provavelmente tornaram-se contaminados durante a
passagem através da cloaca, e não de infecção resultante do ovário. Como a
metodologia empregada para analisar os ovos no presente trabalho avaliou a
casca juntamente com os componentes internos, parte da SE isolada dos ovos
pode ser oriunda da casca. Portanto a diminuição da excreção fecal de Salmonella
Enteritidis e a correta desinfecção da casca dos ovos, reduz as toxinfecções
alimentares.
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, percebe-se que a vacinação
de poedeiras comerciais com as bacterinas testadas, não foi capaz de promover
uma proteção total das aves frente aos desafios por Salmonella Enteritidis. Assim,
recomenda-se que o uso das bacterinas em poedeiras ou em matrizes comerciais
seja complementado com outras formas de controle, como a desinfecção, o
monitoramento bacteriológico, o uso de produtos de exclusão competitiva e de
ácidos orgânicos; medidas empregadas com bons resultados na redução da
Salmonella Enteritidis nas aves e no ambiente das granjas. Ainda, é necessário
uma profunda análise da relação custo- benefício quando se opta pelo uso das
bacterinas, fatores relacionados ao manejo empregado durante a vacinação, custo
da vacina e aos índices zootécnicos das aves, também devem ser avaliados.
38
7. CONCLUSÕES
Nas condições experimentais adotadas no presente trabalho, pode-se concluir
que:
1. Não se pode constatar proteção total contra a invasão dos órgãos pela
bactéria em nenhum dos grupos vacinais
2. As vacinas não protegeram contra eliminação de fezes positivas para SE.
3. Em dois dos desafios, os resultados da excreção fecal e eliminação de SE
em ovos mostraram-se estatisticamente semelhantes, demonstrando que
os ovos foram contaminados pelas fezes cloacais e não de infecção
resultante do ovário.
4. Com base nos parâmetros analisados, o uso das bacterinas é eficaz
quando complementado com outras formas de controle para SE.
39
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