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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS
VEGETAIS DE PLANTAS BRASILEIRAS E SUA CONTRIBUIÇÃO AO
ESTUDO DE INIBIÇÃO DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE
JOSÉ CARLOS REBUGLIO VELLOSA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
ORIENTADORA: Profa. Dra. Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira
ARARAQUARA
2005
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS
VEGETAIS DE PLANTAS BRASILEIRAS E SUA CONTRIBUIÇÃO AO
ESTUDO DE INIBIÇÃO DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE
JOSÉ CARLOS REBUGLIO VELLOSA
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS – FCFAr/UNESP
COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
MESTRE EM ANÁLISES CLÍNICAS, ÁREA DE ANÁLISES CLÍNICAS
ORIENTADORA: Profa. Dra. Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira
ARARAQUARA
2005
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Vellosa, José Carlos Rebuglio
V441a Avaliação da capacidade antioxidante de extratos vegetais de plantas
brasileiras e sua contribuição ao estudo de inibição da enzima
mieloperoxidase. / José Carlos Rebuglio Vellosa. – Araraquara, 2005.
129 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de
Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós
Graduação em Análises Clínicas
Orientador: Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira
. 1..Mieoloperoxidase. 2.Radicais livres. 3.Antioxidantes. 4.Produtos
naturais I.Oliveira, Olga Maria Mascarenhas, orient. .II. Título.
CDD: 616.0756
Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
TERMO DE APROVAÇÃO
NOME DO AUTOR: José Carlos Rebuglio Vellosa
TÍTULO DO TRABALHO: “Avaliação da capacidade antioxidante de extratos
vegetais de plantas brasileiras e sua contribuição ao estudo de inibição da enzima
mieloperoxidase”
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE
PRESIDENTE E ORIENTADOR: Profa. Dra. Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira
INSTITUIÇÃO: Instituto de Química – UNESP/Campus Araraquara
SEGUNDO EXAMINADOR: Profa. Dra. Mariza Pires de Melo
INSTITUIÇÃO: Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – USP/Campus
Pirassununga
TERCEIRO EXAMINADOR: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos
INSTITUIÇÃO: Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP/Campus Araraquara
ARARAQUARA, 5 de dezembro de 2005.
Dados Curriculares
1. Dados Pessoais
Nome: José Carlos Rebuglio Vellosa
Nascimento: 19/08/1979
Nacionalidade: brasileiro
Naturalidade: Araraquara/SP
Estado Civil: solteiro
Filiação
Pai: José Carlos Farto Vellosa
Mãe: Celina Rebuglio Vellosa
Profissão: Farmacêutico - Bioquímico
Documento de Identidade: 29782558-6
Cadastro de Pessoa Física: 219190658-30
Endereço Residencial: Av Luiz Alberto, 970, Vila Velosa – Araraquara/SP
Endereço Profissional: R Francisco Degni, s/n, Quitandinha – Araraquara/SP
2. Formação Acadêmica
Bacharel em Farmácia curso de Farmácia-Bioquímica, concluído em 2004, na
Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Campus de Araraquara da Universidade
Estadual Paulista (UNESP)
3. Trabalhos Científicos
3.1 Trabalhos apresentados em Congressos
Vellosa, JCR; Abe, MR; Formenton, VAF; Furlan, M; Brunetti, IL; Oliveira,
OMMF. Avaliação do potencial antioxidante do extrato bruto etanólico da casca da raiz
da Maytenus aquifolium. In: Congresso de Iniciação Científica da UNESP, Araraquara-
SP, 2005.
Vellosa, JCR; Barbosa, VF; Khalil, NM; Formenton, VAF; Furlan, M; Oliveira,
OMMF. Avaliação do potencial scavenger de HOCl e de H
2
O
2
do extrato bruto
etanólico da casca da raiz da Maytenus ilicifolia e de suas partições. In: Congresso de
Iniciação Científica da UNESP, Araraquara-SP, 2005.
Vellosa, JCR. Claudino, CS; Khalil, NM; Fonseca, LM; Brunetti, IL; Oliveira,
OMMF. Avaliação dos efeitos da nicotina e da cotinina na ação de peroxidases. In:
Congresso de Iniciação Científica da UNESP, Araraquara-SP, 2005.
Vellosa, JCR; Barbosa, VF; Brunetti, IL; Oliveira, OMMF. Can Maytenus
ilicifolia aqueous extract act over oxidant species and peroxidases? In: International
Congress of Pharmaceutical Sciences-CIFARP, Ribeirão Preto-SP, 2005.
Vellosa, JCR; Khalil, NM; Ximenes, VF; Fonseca, LM; Brunetti, IL; Oliveira,
OMMF. Hypochlorous acid scavenging properties of drugs with tertiary amine
functional groups. In: International Congress of Pharmaceutical Sciences-CIFARP,
Ribeirão Preto-SP, 2005.
Vellosa, JCR; Khalil, NM; Claudino, CS; Barbosa, VF; Brunetti, IL; Bolzani,
VS; Oliveira, OMMF. Myeloperoxidase inhibition by epicatechin from Banisteriopsis
variabilis (Malpighiaceae) and its scavenger action over HOCl. In: Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular - SBBQ, Aguas de Lindóia-
SP, 2005.
Vellosa, JCR; Khalil, NM; Claudino, CS; Barbosa, VF; Brunetti, IL; Fonseca,
LM; Oliveira, OMMF. A cotinina, principal metabólito da nicotina, interfere na
geração de espécies oxidantes por leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (LPMN)?.
In: Congresso de Iniciação Cientifica da UNESP, Ilha Solteira-SP. 2004.
Vellosa, JCR; Khalil, NM; Claudino, CS; Barbosa, VF; Brunetti, IL; Oliveira,
OMMF. Interferência da nicotina e da cotinina na quimiluminescência dependente de
luminol (QLDL) do Sistema Mieloperoxidase/H
2
O
2
/Luminol. In: Congresso de
Iniciação Cientifica da UNESP, Ilha Solteira-SP. 2004.
Vellosa, JCR; Khalil, NM; Ximenes, VF; Fonseca, LM; Brunetti, IL; Oliveira,
OMMF. Does nicotine exacerbate tissue damage mediated by MPO?. In: Reunião Anual
da Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular - SBBQ, Caxambú-MG,
2004.
Vellosa, JCR; Hakime, RA; Khalil, NM; Ximenes, VF; Brunetti, IL; Oliveira,
OMMF. Efeitos do extrato de Agaricus blazei Murill no oxidative burst de leucócitos
polimorfonucleares (LPMN): mieloperoxidase. In: 38 Congresso Brasileiro de Patologia
Clinica e Medicina Laboratorial, São Paulo-SP, Jornal Brasileiro de Patologia e
Medicina Laboratorial. 2004.
3.2 Trabalhos submetidos para publicação
Vellosa, JCR; Khalil, NM; Formenton, VAF; Ximenes, VF; Fonseca, LM;
Furlan, M; Brunetti, IL; Oliveira, OMMF. Antioxidant activity of Maytenus ilicifolia
root bark. (No Prelo). Fitoterapia, Italia, 2005.
Hakime-Silva, RA; Vellosa, JCR; Fernandes, AS; Ximenes, VF; Brunetti, IL;
Oliveira, OMMF. Antioxidant activity of water extract of Agaricus blazei Muril
(Cogumelo do Sol). Fitoterapia, Italia, 2005.
Qualquer coisa que você possa fazer, ou sonha que possa fazer, comece a fazê-la. A
ousadia tem em si genialidade, força e magia.
(Goethe, 1749 – 1832)
Não tenho um caminho novo.
O que eu tenho de novo é um jeito de caminhar.
(Thiago de Melo, escritor)
Este trabalho foi desenvolvido no laboratório de Enzimologia do Departamento
de Bioquímica e Tecnologia Química do Instituto de Química – UNESP/Campus
Araraquara e no Laboratório de Bioquímica do Departamento de Análises Clínicas da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP/Campus Araraquara.
Fomento: Bolsa CAPES - Mestrado
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação à minha mãe, ao meu pai e à minha avó.
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por guiar os meus passos e proteger minha família.
À minha mãe, Celina, ao meu pai, José Carlos, e à minha avó, Amália,
pela minha vida e educação.
Ao meu avô, Ernesto e à minha tia Nena, por olharem pela família.
Aos meus irmãos, cunhadas e cunhado, pelo apoio.
Aos meus tios, tias, primos e primas pelo apoio.
À Profa. Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira pela amizade, orientação,
oportunidade de amadurecimento profissional, pela compreensão
e apoio em todos os momentos.
Ao professor Iguatemy Lourenço Brunetti pelo apoio e suporte oferecidos, pelas
cobranças que me fortaleceram e pela amizade.
À professora Maysa Furlan
pelo apoio e parceria.
À professora Vanderlan da Silva Bolzani
pelo apoio e parceria.
Ao grande amigo Najeh Maissar Khalil, pelas discussões, parcerias
e pelos momentos de descontração.
Aos grandes amigos Francisco José Antunes Netto, José Mário Lourenço Maia e David
William Quitério, pela amizade e pelos momentos de alegria.
Aos amigos Ricardo Hakime, Adriano, Kátia e Sandra,
pelo apoio e parcerias.
À Vânia, à Adriana, à Andréia e ao Luis Octávio pelas amostras,
pela parceria e discussões
Às amigas Camila, Vanessa e Mariana
pela ajuda e amizade.
Às amigas Ana Paula, Marília, Helen e Helene
pelos momentos de descontração.
Aos técnicos, Marcos e Valéria, do Laboratório de Bioquímica e Valdenir, do
Laboratório de Enzimologia pela amizade e auxílio.
À CAPES pela bolsa concedida.
Muito obrigado!
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO 20
1.1 Leucócitos polimorfonucleares neutrófilos 21
1.2 Explosão Oxidativa (“Oxidative Burst”) em Fagócitos: Geração de
Espécies Reativas do Oxigênio (ERO)
21
1.3 Peroxidases 28
1.4 Patologias associadas às Espécies Reativas do Oxigênio (ERO) 34
1.5 Sistemas antioxidantes no ser humano 38
1.6 Plantas medicinais e antioxidantes 39
2 OBJETIVOS 43
3 MATERIAIS E MÉTODOS 45
3.1 Amostras avaliadas 46
3.1.1 Família Leguminosae
47
3.1.2 Família Celastraceae
48
3.1.3 Família Hippocrateaceae
49
3.1.4 Família Piperaceae
50
3.2 Obtenção do Extrato Bruto de Neutrófilo de Rato 51
3.3 Determinação da atividade da MPO 51
3.4 Sistemas quimiluminescentes 52
3.5 Sistemas espectrofotométricos 53
3.5.1 Avaliação do Potencial Antioxidante
53
3.5.1.1 Atividade Antioxidante Total pelo ABTS
•
+
54
3.5.1.2 Atividade Scavenger de radicais pelo DPPH
55
3.5.1.3 Atividade Scavenger de HOCl, e H
2
O
2
55
3.5.1.4 Atividade Scavenger de Ânion Superóxido
56
3.5.1.5 Atividade Scavenger de Óxido Nítrico
57
3.5.2 Potencial de inibição da ação da MPO
57
3.5.2.1 Cinética de oxidação do luminol pela Hemina (quimiluminescência)
58
3.5.2.2 Cinética de oxidação do guaiacol pela Hemina (UV/Vis)
58
3.5.2.3 Cinética de oxidação do guaiacol pela HRP
58
3.5.2.4 Cinética de oxidação do guaiacol pela mieloperoxidase presente no
extrato bruto de neutrófilo de rato
59
3.5.2.5 Cinética de oxidação do TMB pela mieloperoxidase presente no extrato
bruto de neutrófilo de rato
59
3.6 Análise Estatística 59
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 60
4.1 Avaliação do Potencial Antioxidante 61
4.1.1 Atividade Scavenger de HOCl
61
4.1.2 Atividade Scavenger de H
2
O
2
67
4.1.3 Atividade Scavenger de Ânion Superóxido
68
4.1.4 Atividade Scavenger de Óxido nítrico
72
4.1.5 Atividade Scavenger de radicais pelo DPPH
75
4.1.6 Atividade Antioxidante Total pelo ABTS
• +.
78
4.2 Ensaios enzimáticos 82
5 CONCLUSÃO 95
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 97
ANEXOS 109
Anexo A: Espectros de absorção das amostras avaliadas 110
Anexo B: Gráficos: Avaliação da ação sobre o peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
)
115
Anexo C: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa 121
Anexo D: Trabalhos submetidos para publicação 123
LISTA DE ABREVIATURAS
1C-HEX: fração hexânica do extrato do caule de P. nitens
1C-EtOH: fração etanólica do extrato do caule de P. nitens
1C-AcOEt: fração acetato de etila do extrato do caule de P. nitens
1C-BuOH: fração butanólica do extrato do caule de P. nitens
1F-Hex: fração hexânica do extrato das folhas de P. nitens
1F-EtOH: fração etanólica do extrato das folhas de P. nitens
2-DCM: extrato bruto diclorometânico da casca da raiz da M. ilicifolia
2-EtOH
1
: extrato bruto etanólico da casca da raiz da M. ilicifolia (obtido por maceração)
2-EtOH
2
: extrato bruto etanólico da casca da raiz da M. ilicifolia (obtido por ultrassom)
2-Hex: fração hexânica do extrato bruto 2-EtOH
2
2-HexAcOEt: fração hexano-acetato de etila do extrato bruto 2-EtOH
2
2-Hid: fração hidroalcoólica do extrato bruto 2-EtOH
2
3-HexAcOEt: fração hexano-acetato de etila do extrato da M. aquifolium
3-Hid: fração hidroalcoólica do extrato da M. aquifolium
4-EtOH: extrato bruto etanólico da casca da raiz da S. campestris
A: variação de absorbância
ABTS: 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
A.E.: atividade específica
DPPH: 1,1-difenil-2-picril-hidrazina
DTNB: ácido 5-5’-ditio(2-nitrobenzóico)
EBNR: extrato bruto de neutrófilos de rato
EPO: peroxidase eosinofílica
ERO: espécies reativas do oxigênio
GSH: glutationa reduzida
GSH-Px: glutationa peroxidase
GSH-Rd: glutationa redutase
HRP: horseradish peroxidase
IC
50
: concentração que promove 50% de inibição
K
M
: constante de Michaelis-Menten
LDL: lipoproteína de baixa densidade
LPO: lactoperoxidase
MPO: mieloperoxidase
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NOS: óxido nítrico sintase
PBS-D: solução salina tamponada de fosfatos segundo Dulbecco
PBS-MgSO
4
: tampão PBS-D sem os sais de íons cloreto
PGHS: prostaglandina endoperóxido sintase
PMS: metassulfato de fenazina
S-1: 5,7-diidroxiflavona
S-2: ácido gaudichaudiânico
S-3: 1,4-diidroxi-2-(3’,7’-dimetil-1’-oxo-2’-E-6’-octadienil) benzeno
S-4: 2’,6’-diidroxi-4’-metoxi-diidrochalcona
SOD: superóxido dismutase
SPO: peroxidase salivar
TMB: tetrametilbenzidina
TNB: ácido 5-tio-2nitrobenzóico
TPO: peroxidase da tireóide
U.A.: unidade de atividade
v
0
: velocidade inicial
v
max
: velocidade máxima
RESUMO
Os fagócitos, em especial os leucócitos polimorfonucleares neutrófilos,
produzem ânion superóxido (O
2
• -
) através da redução do oxigênio por um elétron, com
gasto de NADPH. A partir deste processo, grande número de oxidantes altamente
microbicidas são formados, tais como HOCl, HO
•
, ONOO
-
. Tais oxidantes são
produzidos com a finalidade de combater microrganismos invasores, mas eles também
provocam danos e estão envolvidos em grande número de patologias. A formação de
espécies reativas e radicais livres é equilibrada naturalmente pela existência de
compostos e sistemas com atividades antioxidantes.
A busca por opções terapêuticas para diferentes patologias faz da
pesquisa de produtos naturais um campo fértil em opções de moléculas com diferentes
atividades biológicas. A relevância da pesquisa de produtos naturais proporciona a
descoberta de novos fármacos e o estudo de plantas que apresentem substâncias que
possam agir sobre as diferentes espécies oxidantes geradas em nosso organismo torna-se
de grande importância. No estudo da avaliação do potencial antioxidante das amostras
deve-se considerar que: i) um composto deve ser testado em concentrações disponíveis
in vivo e ii) ao avaliar os antioxidantes, deve-se utilizar pelo menos uma espécie
relevante biologicamente. Deve-se perguntar como age o antioxidante, se ele age
diretamente sobre a ERO ou ele inibe a sua geração e ainda, se ele age indiretamente
regulando defesas antioxidantes endógenas.
Foram avaliados extratos ou moléculas dos vegetais: Pterogyne nitens,
Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium, Salacia campestris, Piper gaudichaudianum,
Piper crassinervium e Piper aduncum. A proposta deste trabalho é: i) avaliar a
possibilidade de ação direta destas amostras sobre diferentes espécies reativas modelo e
geradas em nosso organismo e ii) avaliar a inibição da mieloperoxidase, enzima
envolvida em diferentes patologias. Observamos um grande potencial das plantas
estudadas como fonte de compostos com ação antioxidante. Destacam-se as frações
hidroalcoólicas e hexano-acetato da M. ilicifolia e M. aquifolium sobre o ânion
superóxido. Além disso, identificou-se a existência de possíveis inibidores da MPO nos
diferentes vegetais estudados, destacando-se quercetina (IC
50
=1,35µg/mL), 3-
HexAcOEt (IC
50
=1,5µg/mL), 2-Hid (IC
50
=2,2µg/mL), 3-Hid (IC
50
=3,1µg/mL), S-3
(IC
50
=3,1µg/mL), 2-HexAcOEt (IC
50
=4,4µg/mL), 1C-BuOH (IC
50
=6,4µg/mL) e 4EtOH
(IC
50
=8,9µg/mL). Por fim, caracterizou-se o tipo de inibição promovida pela S-3 (1,4–
diidroxi–2-(3’,7’-dimetil-1’-oxo-2’-E-6’-octadienil) benzeno) e pela quercetina como
sendo do tipo mista.
Palavras–chave: mieloperoxidase, radicais livres, estresse oxidativo, antioxidantes,
produtos naturais.
.
ABSTRACT
Phagocytes, mainly polimorphonuclear neutrophils leucocytes, yield
superoxide radical (O
2
• -
), expending NADPH. By this process, many reactive species,
such as HOCl, HO
•
, ONOO
-
, are generated. These oxidants are made to fight
microorganisms, but they are involved in many pathologies. Reactive species and free
radicals generation are equilibrated by antioxidants.
The search of new medicines turns natural products research an
important option for discovering molecules with different biological activities. Natural
products research is relevant for discovering new medicines and molecules able to fight
oxidant species. In evaluating the antioxidant potential of substances, it is important
considerate: i) a compound should be tested at concentrations achievable in vivo and ii)
in assaying putative antioxidants, one should use biologically relevant ROS. It is
important to ask if it works directly over the oxidant or it works by regulating
endogenous antioxidants defenses.
In this work, Pterogyne nitens, Maytenus ilicifolia, Maytenus
aquifolium, Salacia campestris, Piper gaudichaudianum, Piper crassinervium and Piper
aduncum were studied. The purpose of this work is: i) evaluate direct action of samples
over different reactive species and ii) evaluate myeloperoxidase inhibition, an important
enzyme involved in different pathologies. We observed that different evaluated plants
are efficient sources of antioxidants. Moreover, different samples were able to inhibit
myeloperoxidase, detaching quercetin (IC
50
=1,35µg/mL), 3-HexAcOEt
(IC
50
=1,5µg/mL), 2-Hid (IC
50
=2,2µg/mL), 3-Hid (IC
50
=3,1µg/mL), S-3
(IC
50
=3,1µg/mL), 2-HexAcOEt (IC
50
=4,4µg/mL), 1C-BuOH (IC
50
=6,4µg/mL) and
4EtOH (IC
50
=8,9µg/mL). Besides, quercetin and S-3 (1,4-dihydroxi-2-(3’,7’-dimethyl-
1’-oxo-2’-E,6’-octadienyl) benzene) were characterized as mixed MPO inhibitors.
Key words: myeloperoxidase, free radicals, oxidative stress, antioxidants, natural
products.
1 INTRODUÇÃO
1.1 Leucócitos polimorfonucleares neutrófilos
Leucócitos polimorfonucleares neutrófilos são as primeiras células em
seres humanos a serem ativadas na defesa pelo sistema imunológico contra infecções.
Estas células migram dirigidas por gradientes quimiotáticos até o local da inflamação,
onde elas reconhecem e fagocitam o patógeno invasor.
Os patógenos são expostos a um arsenal de enzimas hidrolíticas e
proteínas bactericidas, estocadas em seus grânulos citoplasmáticos. Os neutrófilos
apresentam quatro tipos de grânulos, que contém diferentes enzimas e proteínas. O
conteúdo destes grânulos é liberado gradualmente no fagolisossoma, ou no meio
extracelular, após a ativação dos neutrófilos. A elevação de íons cálcio intracelular
inicia a degranulação. Para a secreção do conteúdo de grânulos terciários e vesículas
secretórias é necessária uma elevação moderada do nível de cálcio no citoplasma (para
cerca de 0,25 M). Estes tipos de grânulos contêm albumina, gelatinase, colagenase e
outras proteínas. Para a liberação do conteúdo de grânulos secundários é necessária uma
elevação maior no nível de cálcio no citoplasma (para cerca de 0,7 M). Neste caso são
secretadas enzimas direcionadas ao combate do patógeno, tendo por função a destruição
de estruturas da parede celular. Os grânulos azurófilos apresentam níveis elevados de
mieloperoxidase, a qual juntamente com a NADPH oxidase de membrana está
envolvida na geração de espécies reativas do oxigênio e oxidação de biomoléculas
(ARNHOLD, 2004).
1.2 Explosão Oxidativa (“Oxidative Burst”) em Fagócitos: Geração de Espécies
Reativas do Oxigênio (ERO)
A ativação de neutrófilos por estímulos endógenos (frações do
complemento, citocinas, etc.), ou por microrganismos, é seguida da ativação de uma
enzima transmembrana que promove aumento do consumo do oxigênio para a produção
de ânion superóxido, o precursor para uma série de espécies reativas do oxigênio
(MATHY-HARTERT et al., 1997). Fagócitos, como neutrófilos, eosinófilos e
macrófagos, quando estimulados, elevam sensivelmente sua taxa de consumo de
oxigênio no oxidative burst.
A geração de espécies químicas com alto potencial de reatividade
(espécies reativas do oxigênio – ERO; Esq. 1) como resultado do oxidative burst em
neutrófilos, é essencial para a defesa contra microrganismos na fagocitose (BRIHEIM et
al., 1984).
Como podemos observar no esquema 1, duas enzimas-chave estão
envolvidas na explosão oxidativa dos fagócitos, produzindo derivados do oxigênio:
i) NADPH oxidase, um complexo enzimático de membrana, que catalisa a redução
monovalente do oxigênio molecular a ânion superóxido; ii) a mieloperoxidase (MPO),
que utiliza o peróxido de hidrogênio para oxidar o íon cloreto a HOCl (CAPELLÈIRE-
BLANDIN, 1998).
Os leucócitos fagócitos são células especializadas que contém grandes
quantidades de componentes da NADPH oxidase e produzem ânion superóxido em
abundância. Outros tipos celulares, tais como fibroblastos, células endoteliais e células
do músculo liso, também são capazes de produzirem ânion superóxido, mas elas o
fazem em baixas quantidades (FRIDOVICH, 2001).
Durante o oxidative burst há aumento do consumo de oxigênio e da
produção de diferentes ERO, tais como:
Ânion Superóxido
Pode ser escrito O
2
• -
ou O
2
-
e é formado após a primeira redução
monoeletrônica do oxigênio; ocorre em quase todas as células aeróbicas e é produzido
durante a ativação de neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1990; 1986). Tem sido observada lesão biológica associada a sistemas
geradores de superóxido, seja enzimático, fagocítico ou químico (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1990).
Peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A maior parte do oxigênio consumido é convertida em peróxido de
hidrogênio por dismutação do radical ânion superóxido, seja espontânea ou pela ação da
superóxido dismutase (SOD).
2 O
2
• -
+ 2 H
+
H
2
O
2
+ O
2
Apesar de não ser um radical livre, pela ausência de elétrons
desemparelhados na última camada, o H
2
O
2
é um metabólito extremamente deletério,
porque participa da reação que produz o radical hidroxil (FERREIRA; MATSUBARA,
1997). Além disso, o H
2
O
2
é altamente tóxico para as células, pois tem vida longa e é
capaz de atravessar camadas lipídicas, podendo reagir com membranas biológicas ou
com proteínas ligadas ao íon Fe
++
( FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Ácido hipocloroso (HOCl)
O HOCl é formado pela oxidação de íons cloreto, catalisada pela
mieloperoxidase em presença de peróxido de hidrogênio (LAPENNA; CUCCURULLO,
1996).
Cl
-
+ H
2
O
2
ClO
-
+ H
+
+ H
2
O (pH > pKa )
Cl
-
+ H
2
O
2
HOCl + H
2
O (pH < pKa)
O HOCl pode ser considerado como o mais abundante oxidante
gerado por leucócitos do sangue (LAPENNA; CUCCURULLO, 1996). O ácido
hipocloroso é um oxidante extremamente forte e além de atacar biomoléculas de
importância fisiológica, tais como tióis, tioéteres, aminas, aminoácidos, nucleotídeos e
ascorbato (WEISS, 1989; HALLIWELL; GUTTERIDGE,1989; EATON,1993), é capaz
de gerar outras ERO, tais como, oxigênio singlete e radical hidroxil via sua reação com
MPO
MPO
peróxido de hidrogênio e ânion superóxido, respectivamente (WEISS, 1989;
LAPENNA; CUCCURULLO, 1996).
O HOCl apresenta ações: i) protetora ao nosso organismo, à medida
que participa do processo de destruição de microrganismos, mas, ao mesmo tempo, ii)
agressora aos tecidos, pois nem células de mamíferos nem de bactérias podem detoxicar
o HOCl por via catalítica, visto que estão ausentes defesas enzimáticas contra oxidantes
clorados (LAPENNA; CUCCURULLO, 1996).
A mieloperoxidase é uma proteína catiônica em pH fisiológico e,
portanto, capaz de se ligar a estruturas biológicas aniônicas, tais como fosfolipídeos de
membranas celulares, além de catalisar a geração de HOCl e assim favorecer injúria
celular (WEISS, 1989). A mieloperoxidase foi encontrada em lesões de aterosclerose
humana (DAUGHERTY et al., 1994), sugerindo função de oxidantes clorados nos
processos aterogênicos (LAPENNA; CUCCURULLO, 1996). Neste contexto, o HOCl
pode modificar lipoproteínas de baixa densidade para uma forma aterogênica,
aparentemente como resultado da oxidação de resíduos de lisina da apoproteína B-100
(HAZELL; STOCKER, 1993; HAZEL et al., 1994).
O desenvolvimento de substâncias farmacologicamente capazes de
antagonizar o HOCl, como sugerem alguns autores para drogas antinflamatórias
(WASIL et al., 1987), rifampicina e tetraciclina (WASIL et al., 1988) e captopril
(ARUOMA et al., 1991), podem ajudar no combate à injúria tecidual (LAPENNA;
CUCCURULLO, 1996). O seqüestro farmacológico do HOCl será terapeuticamente
significativo se, na concentração da droga in vivo, a reação com o ácido hipocloroso for
rápida o bastante para proteger as moléculas-alvo biologicamente importantes do ataque
pelo HOCl (HALLIWELL,1995; LAPENNA; CUCCURULLO, 1996).
Cloraminas
O HOCl forma grupos de oxidantes conhecidos como cloraminas,
através da sua reação com aminas primárias ou secundárias, prontamente disponíveis
em sistemas biológicos (THOMAS et al.,1986; WEISS, 1989).
ClO
-
+ R-NH
2
R-NHCl + HO
-
(taurina) (cloramina)
HOCl + R-NH
2
R-NHCl + H
2
O
(taurina) (cloramina)
Tais cloraminas são oxidantes de vida longa e sua reatividade depende
de sua lipossolubilidade. A monocloramina (NH
2
Cl), formada pela reação entre HOCl e
amônia, é muito lipossolúvel e mais reativa do que o próprio HOCl (BABIOR, 2000).
O β-aminoácido taurina, de maior abundância em neutrófilos (ZGLICZYNSKI, 1971) e
principal alvo nestas células, reage com o HOCl formando taurina cloramina (TauCl).
As cloraminas, particularmente a monocloramina, estão relacionadas à
injúria gástrica observada na presença de Helicobacter pilori, que produz elevadas
quantidades de amônia e ativa os neutrófilos que produzem ácido hipocloroso
(LAPENNA; CUCCURULLO, 1996).
Oxigênio singlete (
1
O
2
)
O estado excitado singlete do oxigênio não é um radical, visto não ter
os elétrons desemparelhados, mas reage com uma grande variedade de compostos
biológicos, como lipídeos de membrana. Pode ser produzido através da reação do H
2
O
2
com HOCl ou pela dismutação espontânea do O
2
•
••
• -
(HALLIWELL; GUTTERIDGE,
1990):
1/2H
2
O
2
+ 2HOCl
1
O
2
+ Cl
-
+ H
+
+ H
2
O
2 O
2
• -
+ 2 H
+
H
2
O
2
+
1
O
2
Radical hidroxil (HO
•
••
•
)
É um dos mais reativos radicais conhecidos. Pode ser gerado a partir
da reação do HOCl e O
2
• -
ou pelas reações de Fenton e Harber-Weiss.
HOCl + O
2
• -
HO
•
+ Cl
-
+ O
2
Reação de Fenton (FERREIRA; MATSUBARA, 1997)
O
2
+ Fe
2+
O
2
• -
+ Fe
3+
2 O
2
• -
+ 2 H
+
O
2
+ H
2
O
2
Fe
2+
+ H
2
O
2
Fe
3+
+ HO
•
+ HO
-
Reação de Harber-Weiss (FERREIRA; MATSUBARA, 1997)
O
2
• -
+ Fe
3+
O
2
+ Fe
2+
H
2
O
2
+ Fe
2+
HO
•
+ HO
-
+ Fe
3+
O
2
• -
+ H
2
O
2
HO
•
+ HO
-
+ O
2
A combinação extremamente rápida do OH
•
com metais ou outros
radicais no próprio sítio onde foi produzido confirma sua alta reatividade (FERREIRA;
MATSUBARA, 1997). Assim, se o radical hidroxil for produzido próximo ao DNA e a
este DNA estiver fixado um metal, poderão ocorrer modificações de bases nitrogenadas,
levando à inativação ou mutação do DNA (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Além
disso, o radical hidroxil pode inativar várias proteínas ao oxidar seus grupos
sulfidrílicos formando pontes dissulfeto (FERREIRA; MATSUBARA, 1997) e iniciar a
oxidação dos ácidos graxos polinsaturados (lipoperoxidação) das membranas celulares
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1986).
Óxido Nítrico (NO
•
••
•
) e Peróxinitrito (OONO
-
)
Em meio biológico as diferentes espécies formam-se rapidamente a
partir do momento que a óxido nítrico sintase (NOS) torna-se cataliticamente ativa
(MACMICKING et al., 1997). A NOS é a enzima responsável pela produção endógena
de óxido nítrico através da oxidação de uma molécula de L-arginina em óxido nítrico e
L-citrulina (esquema 1; MACMICKING et al., 1997). Existem duas formas de NO
sintase: i) a constitutiva, com baixa atividade, está presente no endotélio vascular e
sistema nervoso central e produz baixas quantidades de óxido nítrico como molécula
sinalizadora; ii) a indutiva, que possui alta atividade e é produzida por fagócitos quando
estes são estimulados (BABIOR, 2000).
O óxido nítrico, um radical gasoso lipossolúvel e hidrossolúvel, é uma
espécie reativa do nitrogênio que, em meio aquoso, reage com o oxigênio para formar
outras espécies reativas (MACMICKING et al., 1997).
O peróxinitrito (OONO
-
), produto formado pela reação do O
2
•
••
• -
com
o óxido nítrico (NO
•
••
•
) é um potente oxidante, com propriedades similares ao radical
hidroxil, e reage com íon H
+
formando ONOOH que após se decompõe em HO
•
••
•
e
radical dióxido de nitrogênio (NO
2
•
). As etapas descritas encontram-se representadas a
seguir:
NO + O
2
•
••
• -
ONOO
-
ONOO
-
+ H
+
ONOOH
ONOOH HO
•
+ NO
2
•
Radical hidroperoxil (HO
2
•
••
• -
)
Representa a forma protonada do radical superóxido; existem
evidências de que este seja mais reativo do que o superóxido, por sua maior facilidade
em iniciar a destruição de membranas biológicas (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
1990).
1.3 Peroxidases
As peroxidases são enzimas que oxidam uma variedade de
xenobióticos através do peróxido de hidrogênio (SAUNDERS, 1973). A enzima nativa
contém um grupamento heme, geralmente ferriprotoporfirina IX, com quatro
nitrogênios pirrólicos ligados ao Fe(III). A quinta posição de coordenação na porção
proximal do heme está ocupada por um resíduo de histidina. A sexta posição de
coordenação permanece livre na enzima nativa na porção distal do heme (O’BRIEN,
2000).
Peroxidases são encontradas tanto em animais como em vegetais,
sugerindo que tais enzimas devam ser uma parte essencial de todos os seres vivos
(BRUNETTI; FARIA-OLIVEIRA, 1995). As peroxidases de plantas, como a
horseradish peroxidase, consistem de cadeias polipeptídicas contendo cerca de 300
resíduos de aminoácidos e o heme ligado não covalentemente. As peroxidases de
mamíferos são muito maiores (576-738 aminoácidos) e apresentam o grupamento heme
ligado covalentemente (O’BRIEN, 2000).
A oxidação de xenobióticos (XOH) por peroxidases pode ser
representada pelo ciclo de reações a seguir:
Peroxidase + H
2
O
2
Composto I + HOH
Composto I + XOH Composto II + XO
•
••
•
Composto II + XOH Peroxidase + XO
•
••
•
+ H
2
O
2
Horseradish peroxidase (HRP)
A peroxidase de raiz forte (HRP) é, provavelmente, a peroxidase
mais estudada e pode ser facilmente extraída da planta “rábano silvestre - raiz forte”, da
qual provém seu nome.
Essa enzima tem uma massa molecular de 42,1 KDa, é uma
hemeproteína cujo grupo prostético, a protoporfirina IX, está ligada não-covalentemente
à parte protéica da molécula (O’BRIEN, 2000).
Peroxidases humanas e Mieloperoxidase
A família de peroxidases humanas inclui: mieloperoxidase (MPO),
peroxidase eosinofílica (EPO), lactoperoxidase (LPO), peroxidase salivar (SPO),
peroxidase da tireóide (TPO) e a prostaglandina endoperóxido sintase (PGHS). A
histidina distal das peroxidases de mamíferos age como um catalisador do tipo
ácido/básico auxiliando a desprotonação do hidroperóxido e a protonação da água após
a clivagem da ligação “oxigênio-oxigênio” (O’BRIEN, 2000).
A TPO é responsável por catalisar a iodinação dos resíduos de tirosina
da tireoglobulina e também por catalisar a formação da tiroxina.
MPO, EPO e LPO são encontradas, respectivamente, em grânulos de
neutrófilos (lisossomos), grânulos de eosinófilos e nas células secretórias das glândulas
exócrinas. A MPO e a EPO são secretadas para o fagolisossoma e para o plasma,
enquanto a LPO é secretada para o leite, saliva e lágrima. Elas são capazes de oxidar
respectivamente cloreto, brometo ou tiocianato (O’BRIEN, 2000).
A mieloperoxidase é um constituinte dos grânulos azurófilos de
neutrófilos e, correspondendo a cerca de 5% da massa seca total (ZUURBIER et al.,
1992), é secretada no meio extracelular e fagolisossomal. Está envolvida no sistema
enzimático microbicida dos fagócitos (ANDREWS; KRINSKY, 1986; ARNHOLD,
2004), sendo que, na presença de peróxido de hidrogênio, catalisa a oxidação de íons Cl
-
com a formação de HOCl (HARRISON; SCHULTZ, 1976; PODREZ et al., 2000).
A MPO tem sua síntese durante os estágios mielocíticos e
promielocítico da maturação de granulócitos (ANDREWS; KRINSKY, 1986). As
fontes reconhecidas de mieloperoxidase são os neutrófilos e monócitos, sendo que em
macrófagos teciduais ela é usualmente considerada ausente (ROS et al., 1978).
Entretanto, a MPO parece atuar em macrófagos, onde se observa a ocorrência do
oxidative burst (LEFKOWITZ et al., 1992). Alguns trabalhos sugerem que os
macrófagos apresentem conteúdo de MPO adquirida de neutrófilos por dois
mecanismos possíveis: i) engolfamento de neutrófilos pelos macrófagos, ou ii)
engolfamento da MPO liberada pelos neutrófilos no sítio inflamatório (RODRIGUES et
al., 2002).Alguns autores descrevem a capacidade de certos macrógagos em expressar
mieloperoxidase quando estimulados por certas citocinas, como o fator estimulador de
colônias granulocíticas-monocíticas (GM-CSF), em alguns processos patológicos, como
a aterogênese (SUGIYAMA et al., 2001; RODRIGUES et al., 2002).
A estrutura da MPO compreende uma hemeproteína glicosilada de
cerca de 144 KDa, catiônica em pH fisiológico, com ponto isoelétrico (pI) maior do que
11 (ANDREWS; KRYNSKI, 1986). A MPO é constituída por duas cadeias idênticas
unidas por ponte dissulfeto. Cada subunidade apresenta uma cadeia leve e uma cadeia
pesada. Ambas as subunidades apresentam um grupamento heme, sendo que estes
operam independentemente na oxidação de íons cloreto. Esta enzima apresenta uma
peculiaridade frente às demais peroxidases no que diz respeito ao seu grupamento heme.
Este apresenta uma distorção como resultado da ligação covalente da protoporfirina IX
ao resíduo de metionina da posição 243 (Met243) e duas ligações do tipo éster com
Glu408 e Asp260. Em pH ácido a ligação à histidina distal (His95) é liberada e o heme
torna-se menos distorcido, o que facilita a ligação de íons cloreto. Uma mutação na
Met243 diminui a afinidade por íons cloreto (YUE et al., 1997; KOOTER et al., 1999).
O mecanismo de ação da MPO (Esq. 2) envolve a reação de sua forma
férrica com o H
2
O
2
, para formar um intermediário redox, o composto I (MPO I), o qual
oxida os íons Cl
-
, Br
-
e I
-
e outros substratos. A MPO também pode oxidar vários
substratos orgânicos (principalmente fenóis, a tirosina é um dos mais importantes desses
compostos no fagolisossoma, havendo formação do radical tirosil) através de
transferências sucessivas de um elétron envolvendo os intermediários MPO I e MPO II
(composto II; HAMPTON et al., 1998). A MPO-FeIII reage rapidamente e de maneira
reversível com o H
2
O
2
formando a MPO I, que oxida haletos através de uma
transferência sucessiva de 2 elétrons, em um único passo, formando seus respectivos
ácidos. A MPO nativa pode ser reduzida por diferentes espécies gerando um
intermediário inativo, a MPO-FeII. O composto III é formado pela ligação do ânion
superóxido à MPO nativa ou pela ligação do oxigênio à MPO-FeII.
O NO
•
reage com o ferro central de hemeproteínas. Ele é capaz de se
ligar às formas férrica (Fe-III) e ferrosa (Fe-II) da MPO para gerar complexos
hexacoordenados estáveis (Esq. 2). Em baixas concentrações o óxido nítrico liga-se à
forma ferrosa exacerbando a atividade catalítica da MPO. Em elevadas concentrações o
óxido nítrico forma o complexo com a forma férrica da MPO inativando-a (Esq. 2;
ABU-SOUD; HAZEN, 2000).
Esquema 2: Mecanismo de ação da mieloperoxidase. A- ciclo peroxidásico clássico. B-
reação do grupamento heme com o oxigênio. C-Ligação do óxido nítrico/modulação da
atividade (ABU-SOUD; HAZEN, 2000).
e
-
B
O
2
O
2
•
-
MPO-Fe(II)-NO MPO-Fe(III)-NO
e
-
C
NO
•
NO
•
MPO-Fe(II)
MPO
-
Fe(II
I
)
(nativa)
MPO-Fe(II)-O
2
(composto III)
MPO-Fe(IV)
•
π
+
(composto I)
MPO-Fe(IV)
(composto II)
A
AH
H
+
+ A
•
H
+
+ A
•
AH
H
2
O
2
HOCl Cl
-
Usando o H
2
O
2
como doador de hidrogênio, a mieloperoxidase
catalisa a oxidação de doadores não específicos de elétrons, tais como o guaiacol
(MERRILL, 1980), O-dianisidina (BRADLEY et al., 1982) e a tetrametilbenzidina
(SCHIERWAGEN et al., 1990), cujas estruturas moleculares são apresentadas na figura
1.
A mieloperoxidase é inibida (Figura 2), dentre outros, pela azida
(DAVIES; EDWARDS, 1989), diclofenaco (ZUURBIER et al., 1990), metimazol
(PINCEMAIL et al., 1988), quercetina, (PINCEMAIL et al., 1988), rutina
(PINCEMAIL et al., 1988), sulfato de rutina (PINCEMAIL et al., 1988) e ácido
salicilidroxâmico (DAVIES; EDWARDS, 1989).
OH
OCH
3
guaiacol
NH
2
H
2
N
tetrametilbenzidina
O
-dianisidina
NH
2
OCH
3
H
2
N
H
3
CO
Figura 1: Estrutura molecular de alguns substratos da MPO
Atualmente a mieloperoxidase tem sido objeto de estudo como
marcador de patologias no auxílio diagnóstico e na terapêutica. Relatos recentes
sugerem que a mieloperoxidase pode ser útil como: i) indicador precoce da necessidade
da inserção de sonda torácica na efusão pleural (SEGURA, 2004); ii) valor prognóstico
em pacientes com doenças torácicas (ASSELBERGS et al., 2004); iii) índice com valor
preditivo de risco em pacientes com doenças coronárias agudas (BALDUS et al., 2003).
1.4 Patologias associadas às Espécies Reativas do Oxigênio (ERO)
Os fagócitos, em especial os leucócitos polimorfonucleares
neutrófilos, produzem ânion superóxido através da redução do oxigênio por um elétron,
com gasto de NADPH. A maior parte do O
2
• -
reage com ele mesmo para formar
peróxido de hidrogênio (BABIOR, 2000). A partir destes agentes, grande número de
oxidantes altamente microbicidas são formados, tais como HOCl, HO
•
, ONOO
-
, dentre
diclofenaco
quercetina
rutina
ácido salicil
idroxâmico
Figura 2: Estrutura molecular de alguns inibidores da MPO
NH
Cl
Cl
O
O
Na
+
OHO
OOH
OH
OH
OH
OHO
O
O
H
O
OH
rutinos
e
OH
OH
OH
N
OH
outros (BABIOR, 2000). Tais oxidantes são produzidos com a finalidade de combater
microrganismos invasores, mas eles também provocam danos nos tecidos próximos,
conhecendo-se seu envolvimento em grande número de patologias (FLOYD, 1990;
HATHERILL, 1991; BABIOR, 2000). Existem evidências de que as ERO possam estar
envolvidas em mais de 50 doenças (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Nas últimas
décadas, foram realizadas inúmeras pesquisas para esclarecer o papel dos radicais livres
em processos fisiopatológicos como envelhecimento, câncer, aterosclerose, inflamação
(FERREIRA; MATSUBARA, 1997), enfisema, doença respiratória aguda, injúria por
reperfusão e artrite reumatóide (BABIOR, 2000).
O envelhecimento é um evento que pode estar relacionado com as
ERO (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). A teoria dos radicais do oxigênio,
desenvolvida por Harman em 1956, propõe que o envelhecimento poderia ser
secundário ao estresse oxidativo, o qual levaria a reação de oxidação lipídica, protéica, e
com o DNA, que desencadeariam alterações lentas e progressivas dos tecidos e do
código genético (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Doenças freqüentes na velhice e
relacionadas com o estresse oxidativo, são a Doença de Parkinson, o Acidente Vascular
Cerebral, a Doença de Alzheimer, a esclerose múltipla e catarata (FERREIRA;
MATSUBARA, 1997).
A modificação química de proteínas é parte do processo de
desenvolvimento de diferentes patologias, desde desordens como diabetes e
aterosclerose até o envolvimento no processo de envelhecimento. Aldeídos são
importantes agentes modificadores de proteínas que podem ser gerados no organismo
por uma variedade de processos enzimáticos ou não enzimáticos. Aldeídos reativos
podem ser produzidos por oxidases, desidrogenases e peroxidação lipídica. A
mieloperoxidase também pode gerar aldeídos reativos a partir de aminoácidos livres, via
geração de ácido hipocloroso (ANDERSON et al., 1999)
Muitos estudos demonstram que os fagócitos são capazes de promover
a oxidação da LDL (lipoproteína de baixa densidade) através da produção de espécies
oxidantes (Esquema 3; MERTENS, 2001). Na aterosclerose ocorre o influxo de
macrófagos e liberação de peróxido de hidrogênio e enzimas hidrolíticas, que ao
lesarem as células vizinhas estimulam a proliferação de músculo liso subendotelial
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1990). A LDL também é modificada pelas espécies
oxidantes liberadas pelos neutrófilos (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; JERLICH et
al., 2000; WOODS; DAVIES, 2003). A enzima MPO liga-se à LDL, com implicações
importantes em sua modificação oxidativa (CARR et al., 2000). Os macrófagos
geralmente englobam a LDL por meio do receptor de LDL, sendo que o processo cessa
quando o conteúdo de LDL no macrófago está elevado. Entretanto, a LDL oxidada não
entra na célula por meio deste receptor, mas sim através do receptor scavenger (na
verdade um grupo de receptores). A internalização de LDL oxidada, diferentemente da
nativa, não é regulada pelo receptor, o que permite que quantidades mais elevadas de
LDL sejam englobadas e formem-se as células espumosas como parte do processo
aterogênico (BABIOR, 2000). A lesão pode ser exacerbada pela fumaça do cigarro que
por ser rica em ferro, catalisa a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), o
que estimula a internalização de colesterol nos macrófagos, os quais, conseqüentemente,
se convertem em células espumosas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1990).
As complicações cardiovasculares, tais como o infarto do miocárdio, o
derrame cerebral, a ulceração venosa, e a isquemia com injúria por reperfusão, parecem
estar associadas com a ativação de fagócitos na microcirculação e produção de ERO
(MAZZONI; SCHMIDT-SHONBERN, 1996). A injúria por reperfusão é um dano
provocado após a restauração da circulação em uma área isquêmica; tal injúria é
atribuída às ERO que são produzidas por neutrófilos no sítio da lesão (BABIOR, 2000).
Células
Endoteliais/
Células do músculo
liso
Macrófagos/monóc
itos e
neut
rófilos
Mieloperox
idase
Ácidos
graxos
polinsatur
ados/
hidroperóx
idos
NO
•
1. consumo de anti-
oxidantes endógenos
2. lipoperoxidação
3.formação de
aldeídos reativos
Espécies reativas:
- HOCl
- Cloraminas
- Radicais
tirosil
- NO
2
•
Interação com receptores de células
endoteliais, macrófagos e células do
músculo liso
Oxidação de
proteínas e
LDL
:
NO
•
LDL oxidada
Aldeídos reagem
com resíduos de
lisina da Apo
B
-
100
Esquema 3: Mecanismo da oxidação da LDL
(MERTENS, 2001)
Íons metálicos
(Cu
+2
; Fe
+2
)
Dentre os processos pulmonares associados às ERO estão: lesão
conseqüente ao tabagismo, asma, enfisema, displasia broncopulmonar, pneumoconiose
e toxicidade a fármacos ou xenobióticos, tais como bleomicina, paraquat e
butilidroxitolueno, (BAST et al., 1991; BOVERIS et al., 1986). Está bem documentado
que após a chegada dos neutrófilos no interstício pulmonar, a ativação destas células
gera o radical ânion superóxido, que lesa diretamente a membrana das células
intersticiais e do endotélio e, como conseqüência, ocorre lesão tissular progressiva, pois
o neutrófilo ativado também libera enzimas proteolíticas que degradam a elastina do
arcabouço pulmonar (SEOW et al., 1994; CRYSTAL, 1991). Há fortes indícios de que a
formação do edema pulmonar seja resultante da produção exagerada de peróxido de
hidrogênio, radical hidroxil e superóxido pelos neutrófilos (BOVERIS, et al., 1986).
Estudos têm relacionado algumas das doenças associadas ao hábito de fumar com o
aumento de neutrófilos e macrófagos em tabagistas. No pulmão normal os macrófagos
são células residentes enquanto os neutrófilos são praticamente inexistentes. Entretanto,
em indivíduos fumantes há um grande aumento no número dessas células e com
alterações morfológicas, que podem ser as responsáveis pela bronquite crônica e o
enfisema (REPINE et al., 1997).
A asma é uma desordem inflamatória na qual os eosinófilos são as
principais células efetoras. Estas células sanguíneas acumulam-se nas vias aéreas e,
como conseqüência de sua ativação, promovem danos tissulares. A concentração de
peroxidase eosinofílica encontra-se aumentada nos fluidos broncoalveolares de
asmáticos. Os neutrófilos também são frequentemente encontrados nas vias aéreas e,
como conseqüência de sua ativação, promovem danos tissulares. Ambos, eosinófilos e
neutrófilos, geram diferentes oxidantes que participam dos danos tissulares nas vias
aéreas (ALDRIDGE et al., 2002).
1.5 Sistemas antioxidantes no ser humano
A formação de espécies reativas é equilibrada naturalmente pela
existência de compostos conhecidos como antioxidantes (PERCIVAL, 1988).
Um antioxidante é definido como qualquer substância, quando em
pequenas quantidades, capaz de retardar ou inibir processos oxidativos, como, por
exemplo, a lipoperoxidação (ATOUI et al, 2005; CHUN et al, 2005).
Em sistemas aeróbios, é essencial o equilíbrio entre agentes óxido-
redutores (como as ERO) e o sistema de defesa antioxidante. As ERO, como exposto
anteriormente, são geradas endogenamente como conseqüência direta do metabolismo
do O
2
, mas também em situações não-fisiológicas, como a exposição da célula a
xenobióticos, o que provoca a redução incompleta de O
2
(ROSS; MOLDEUS, 1991).
Para proteger-se, a célula possui um sistema de defesa que pode atuar em duas linhas: i)
uma delas atua como detoxificadora do agente antes que ele cause lesão, e é constituída
pela glutationa reduzida (GSH), superóxido-dismutase (SOD), catalase, glutationa-
peroxidase (GSH-Px) e vitamina E; ii) a outra linha de defesa tem a função de reparar a
lesão ocorrida, sendo constituída pelo ácido ascórbico, pela glutationa-redutase (GSH-
Rd) e pela GSH-Px. Com exceção da vitamina E (-tocoferol), que é um antioxidante
estrutural da membrana, a maior parte dos agentes antioxidantes está no meio
intracelular (ROSS; MOLDEUS, 1991; HEBBEL, 1986).
Quando a disponibilidade de antioxidantes encontra-se limitada, o
dano por espécies reativas pode resultar no estresse oxidativo (SWANSON, 1998).
1.6 Plantas medicinais e antioxidantes
A prevenção às doenças tem sido aceita como a maneira mais
promissora de se controlar patologias. O consumo de frutas e vegetais auxilia na
prevenção de processos degenerativos diminuindo a incidência e a taxa de mortalidade
por câncer ou doenças cardiovasculares, por exemplo. A prevenção que as frutas e os
vegetais promovem contra estas patologias tem sido atribuída à ação de antioxidantes
presentes nestes alimentos (YEN et al., 2001).
Devido ao potencial carcinogênico de antioxidantes sintéticos, os
antioxidantes naturais são alvos alternativos para minimizar ou retardar os processos de
deterioração oxidativa em alimentos e para o desenvolvimento de alimentos funcionais.
Diferentes compostos antioxidantes presentes na dieta desempenham importantes
funções em retardar o desenvolvimento de doenças crônicas tais como doenças
cardiovasculares, câncer, reações inflamatórias e Mal de Alzheimer. A atividade
antioxidante de compostos fenólicos de plantas deve-se às suas propriedades REDOX e
estruturas químicas, que possibilitam a estes compostos exercerem a função de
neutralizar radicais livres, quelar metais reativos e agirem como quenchers de oxigênio
no estado singlete e triplete (CHUN et al., 2005).
Compostos fenólicos oriundos do metabolismo secundário das plantas
são bons agentes antioxidantes naturais (ATOUI et al., 2005). Os antioxidantes
presentes em extratos de plantas vêm atraindo cada vez mais a atenção dos
consumidores e o uso de plantas com propriedades farmacológicas também chama a
atenção dos pesquisadores. As plantas medicinais desempenham um papel muito
importante em saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento (MOSSI et
al., 2004). Extratos de frutas, cereais, e de diferentes vegetais, e seus produtos
derivados, têm mostrado atividades antioxidantes efetivas em diferentes sistemas
modelos (SUN; HO, 2005).
A atividade antioxidante de compostos orgânicos é dependente de
algumas características estruturais, que incluem, na maioria dos casos, a presença de
grupamentos fenólicos. Desta forma, flavonóides, fenilpropanóides e outros compostos
aromáticos são os principais alvos da busca por antioxidantes.
O uso de extratos de vegetais no tratamento de patologias é um hábito
difundido no Brasil, o que pode ser explicado, ao menos em parte, pelo baixo custo e
pela crença de que tais produtos não promovem efeitos tóxicos.
Bolzani et al. (1995) identificaram ação anticâncer por parte do
extrato metanólico das folhas de Pterogyne nitens. O fracionamento de extratos de
plantas através de estudos bio-dirigidos levam ao isolamento de moléculas com
atividades biológicas (BOLZANI et al., 1999).
A Família Celastraceae compreende cerca de 50 gêneros e 800
espécies distribuídas principalmente nas regiões tropical e subtropical. O gênero
Maytenus consiste de espécies lenhosas e arbustivas, tradicionalmente empregadas na
medicina popular, tais como a Maytenus ilicifolia e a Maytenus aquifolium. Foram
relatadas a presença de triterpenos aromáticos, agentes oxidantes, flavonóides,
triterpenos e glucosídeos nestas espécies (DUARTE; DEBUR, 2005). A Maytenus
ilicifolia e Maytenus aquifolium são popularmente conhecidas no Brasil como
“Espinheira Santa” devido à aparência de suas folhas e às suas propriedades terapêuticas
(JORGE et al., 2004). As folhas de plantas da família Celastraceae são amplamente
usadas na medicina popular no Brasil como analgésicos, antinflamatórios e anti-
ulcerogênicos, sendo a eficácia e segurança confirmadas por estudos farmacológicos e
clínicos (CORREA, 1984; SOARES et al., 2004). Souza-Formigoni et al. (1991)
comprovaram a ação protetora do chá de folhas de M. ilicifolia e M. aquifolium contra o
desenvolvimento de úlceras em animais, com ação comparada à da cimetidina.
Triterpenos quinonametídeos são produtos naturais de ocorrência
restrita às famílias Celastraceae e Hippocrateaceae. Muitos representantes desta classe
são conhecidos por suas propriedades medicinais, sendo usados como agentes
antimicrobianos, agentes anticâncer e agentes antimaláricos. Algumas espécies de
Salacia (família Hippocrateaceae) são utilizadas na Índia, Sri-Lanka e China como
medicamentos tradicionais da medicina popular para o tratamento de reumatismo,
doenças de pele e antinflamatórios. Terpenos com propriedades antioxidantes são raros,
mas alguns exemplos são conhecidos, como o rosmanol, e também alguns triterpenos
quinonametídeos como o celastrol e a pristimerina. Carvalho et al. (2005) observaram a
ação anti-radical de triterpenos quinonametídeos presentes no extrato diclorometânico
da casca da raiz da Salacia campestris. O uso de espécies de Hippocrateaceae e
Celastraceae na medicina popular deve estar relacionado ao seu conteúdo de
flavonóides e triterpenos quinonametídeos (CARVALHO et al., 2005).
O gênero Piper da família Piperaceae está amplamente distribuído em
vegetações de florestas tropicais. Este gênero contém mais de 1000 espécies e é
caracterizado por plantas arbustivas (WADT et al., 2004). Piper aduncum, uma pequena
árvore cujo nome popular é “pimenta-de-macaco” (BASTOS; ALBUQUERQUE,
2004), ao invadir um ambiente, geralmente suprime as espécies dominantes e naturais
daquele ambiente (NOVOTNY et al., 2003). A população dos trópicos utiliza as plantas
do gênero Piper para muitos propósitos, tais como alimento, ornamento, perfumes,
inseticida, alucinógenos e como medicamento. Muitos dos compostos isolados destas
plantas apresentam atividade antimicrobiana (WADT et al., 2004). Extratos de P.
aduncum são popularmente usados na América do Sul como medicamento, devido à sua
ação antimicrobiana e antifúngica (HARTEMINK, 2001), sendo usada também contra
dores de estômago. Foi identificada, em extrato de folhas da P. crassinervium, ação
contra fungos do gênero Cladosporium (DANELUTTE et al., 2003). São comumente
isolados de espécies de Piper, cromenos e derivados do ácido benzóico, moléculas que
exibem atividades antimicrobianas, fungicida e inseticida (BALDOQUI et al., 1999).
A busca por opções terapêuticas para diferentes patologias faz da
pesquisa de produtos naturais um campo fértil em opções de moléculas com diferentes
atividades biológicas. As plantas apresentam em seus metabólitos secundários uma
grande fonte de possíveis fármacos devido à diversidade de moléculas com as mais
variadas estruturas e propriedades químicas. A relevância da pesquisa de produtos
naturais proporciona a descoberta de novos fármacos e o estudo de plantas que
apresentem substâncias que possam agir sobre as diferentes espécies oxidantes geradas
em nosso organismo torna-se de grande importância.
2 OBJETIVOS
Considerando-se o crescente uso de substâncias naturais no combate a
diferentes patologias, a participação da MPO em processos patológicos e a importância
do combate às espécies oxidantes formadas no organismo, são objetivos deste trabalho:
i) avaliar o potencial antioxidante/anti-radical do ácido úrico e do trolox (padrões
antioxidantes) e de amostras (extratos, frações e compostos isolados obtidos de vegetais
da flora brasileira) fornecidas pelas professoras Dra. Vanderlan da Silva Bolzani e Dra.
Maysa Furlan (Dep. de Química Orgânica-IQ/UNESP - Projeto Biota); ii) avaliar tais
amostras frente à catálise enzimática da mieloperoxidase buscando identificar a
presença de possíveis inibidores desta enzima. Nesse sentido avaliou-se o efeito das
diferentes amostras nos seguintes sistemas:
A) Sistemas químicos – avaliação do potencial antioxidante/anti-radical
i) DPPH
ii) ABTS
•
+
iii) TNB/HOCl
iv) TNB/H
2
O
2
v) NADH/PMS/NBT – ação sobre o O
2
• -
vi) Nitroprussiato de sódio/ Reagente de Griess – ação sobre o NO
•
B) Sistemas enzimáticos e modelo - avaliação da inibição da MPO
i) Hemina/H
2
O
2
/luminol
ii) Hemina/ H
2
O
2
/guaiacol
iii) HRP/ H
2
O
2
/guaiacol
iv) EBNR/ H
2
O
2
/guaiacol
v) EBNR/H
2
O
2
/Cl
-
/TMB
3 MATERIAIS E MÉTODOS
As reações quimiluminescentes foram monitoradas em Luminômetro
BioOrbit, Modelo 1251, dotado de dispensadores automatizados, acoplado a uma
workstation com o software Multiuse v 2.0 for 1251 luminometer by BioOrbit. Para os
Ensaios espectrofotométricos foram utilizadas celas de quartzo (volume de 1mL ou
2mL) com 1 cm de caminho ótico (c.o.) e as leituras foram realizadas no
Espectrofotômetro HP 8453, Diiode Array, com cela termostatizada, acoplado a um
computador tipo PC Pentium III da HP.
Para a realização dos ensaios as amostras foram dissolvidas em
etanol absoluto na concentração de 1mg/mL. A partir destas, foram feitas diluições
necessárias para os testes.
3.1 Amostras avaliadas
As amostras testadas são provenientes de pesquisas desenvolvidas no
Laboratório de Química Orgânica do Instituto de Química de Araraquara-UNESP pelas
professoras Dra. Maysa Furlan e Dra. Vanderlan da Silva Bolzani e seus alunos
colaboradores, mestrandos e doutorandos. Tais pesquisas visam identificar e isolar os
compostos presentes nos extratos de diferentes órgãos das plantas estudadas. São
plantas da flora brasileira que apresentam aplicação na medicina popular ou, que
apresentem, em sua composição, componentes com potencial antioxidante.
Como este estudo foi realizado em parceria e concomitante às
pesquisas desenvolvidas naquele laboratório, no momento, poucas das amostras
fornecidas puderam ser de compostos isolados, sendo que em sua maioria foram
avaliados extratos brutos e frações de diferentes órgãos vegetais. A identificação das
amostras é feita nos itens 3.1.1 a 3.1.4, onde são esquematizados os métodos de
obtenção dos extratos e frações e também são mostradas as estruturas moleculares dos
compostos isolados. Os espectros de absorção das amostras são mostrados no ANEXO
A.
3.1.1 Família Leguminosae
3.1.2 Família Celastraceae
3.1.3 Família Hippocrateaceae
3.1.4 Família Piperaceae
3.2 Obtenção do Extrato Bruto de Neutrófilo de Rato (EBNR) com MPO
(KHALIL, 2002)
Em cada animal (macho, entre 100-160 gramas) injetou-se,
intraperitonealmente, 5 mL de solução de glicogênio de ostra a 1% em NaCl a 0,85%.
Segundo Fonseca (1991), 12 horas após a administração de 10mL de glicogênio de ostra
0,5% no peritôneo do rato, são encontrados cerca de 94% de neutrófilos e 3% de
macrófagos/monócitos no exsudato peritoneal. Sendo assim, após doze horas o animal
foi sacrificado e a cavidade abdominal foi lavada, injetando-se 20 mL de tampão PBS-D
sem cálcio e colhendo-se o lavado peritoneal através de sucção com seringa
heparinizada (10 UI) e agulha; este foi, então, transferido para um tubo cônico
siliconizado e centrifugado a 200 x g, por 3 minutos. As células sedimentadas foram
lavadas por duas vezes com PBS-MgSO
4
e ressuspensas em 500µL do mesmo tampão.
Esta suspensão é mantida em freezer a –20ºC, por aproximadamente 12 horas. Após, tal
tratamento, ocorre a ruptura de todas as células, sendo esse extrato centrifugado (2
minutos/200 x g) e o sobrenadante separado, sendo este o EBNR. Os procedimentos
aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em pesquisa da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Araraquara-UNESP, parecer n
o
09/2005 (ANEXO C).
3.3 Determinação da atividade da MPO no EBNR (DESSER et al., 1972).
DEFINIÇÃO: Uma unidade de atividade de MPO promove aumento
da absorbância, em 470nm, da ordem de 1,0 por minuto, em pH 7,0 (tampão fosfato de
potássio 50mM) e 25
0
C, calculada através da velocidade inicial da cinética da reação na
presença de H
2
O
2
(0,5mM) e de guaiacol (100mM) como substrato.
O cálculo para a determinação da U.A. segue a equação 1 (tubo
“branco”: substitui-se o EBNR por igual volume de tampão).
- A
1min
470nm
= absorbância do “teste” em 470nm, após 1minuto.
- B
1min
470nm
= absorbância do “branco” em 470nm, após 1minuto.
- V
T
= volume total da reação.
- V
EBNR
= volume de extrato bruto adicionado na reação.
- 1,0 = caminho óptico da cubeta.
Com os dados de U.A. de MPO e conteúdo protéico total do EBNR,
pode-se calcular a atividade específica (A.E.) da MPO no extrato bruto: A.E. = U.A. /
mg proteína dosada.
Dosagem de proteína totais: A dosagem de proteínas totais no EBNR foi feita
utilizando-se o kit Microprote segundo BRADFORD modificado, o qual utiliza o
corante Comassie azul brilhante para detectar quantidades mínimas de proteínas
(BRADFORD, 1976).
3.4 Sistemas quimiluminescentes
Em meio tamponado e na presença de hemina, ou de enzimas como HRP ou MPO, e
H
2
O
2
, o luminol sofre oxidação gerando diferentes radicais e emitindo luz. O sinal é
intensificado na presença de íons cloreto no sistema com mieloperoxidase, pois há
formação de ácido hipocloroso que também oxida o luminol (MERENYI et al., 1990;
MIYASAWA et al., 1994; DODEIGNE et al., 2000; XIAO et al., 2000; ALLEN, 2000).
Na avaliação da atividade peroxidásica, ao serem utilizados ensaios quimiluminescentes
(os quais utilizam luminol como substrato, em meio neutro), exige-se controle rigoroso,
pois se deve estar atento ao potencial antioxidante das amostras a serem testadas, pois
elas podem interagir com os radicais formados pela ação da MPO ao invés de inibirem
sua atividade catalítica, o que levaria a uma interpretação errônea dos resultados.
Avaliou-se a interferência das amostras sobre a oxidação do luminol
(100µM) pela hemina (80nM) e peróxido de hidrogênio (50µM). A concentração final
de luminol foi determinada pelo seu coeficiente de extinção molar, ε
347 nm
= 7636 M
-
1
cm
-1
(ALLEN; LOOSE, 1976). Comparou-se os valores das integrais das curvas
INTENSIDADE DE LUZ(mV) x TEMPO(segundos) na presença e na ausência das
amostras testadas.
3.5 Sistemas espectrofotométricos
3.5.1 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE
Para os ensaios antioxidantes foram avaliados, além das amostras de
vegetais, também o ácido úrico e trolox (Figura 4) como agentes antioxidantes padrão.
Figura 4: Estruturas moleculares dos padrões antioxidantes
ácido úrico
trolox
N
N
OH
HO
N
H
N
OH
O
HO
OH
O
Para os cálculos das porcentagens de inibição foi utilizada uma das
seguintes equações, sendo “X” o comprimento de onda (nm) em que são feitas as
leituras e específico para cada cromóforo dos sistemas utilizados:
INIBIÇÃO (%) = 1 – x 100
Onde: A
Xnm
MAX
é a absorbância na ausência de amostra e
A
Xnm TESTE
é a absorbância na presença de amostra.
INIBIÇÃO (%) = 1 – x 100
Onde: A
Xnm MAX
é a absorbância na ausência do agente oxidante e de amostra,
A
Xnm MIN
é a absorbância na presença do agente oxidante e ausência de amostra
A
Xnm TESTE
é a absorbância na presença do agente oxidante e de amostra.
3.5.1.1 Atividade Antioxidante Total pelo ABTS
•
••
•+
O radical catiônico do ABTS [2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonic acid)] (Figura 5) é corriqueiramente utilizado para avaliar as habilidades dos
flavonóides e agentes fenólicos como scavengers de radicais (PELLEGRINI et al.,
1999). Este radical é gerado em solução segundo Pellegrini et al. (1999), com
substituição, em nossos ensaios, do etanol por tampão fosfato de potássio 10mM. Este
radical é utilizado nas reções em concentrações de 55µM (diluição de 1:88 em relação
ao radical preparado). O ABTS
•+
apresenta picos nos comprimentos de onda 630nm,
A
Xnm
TESTE
A
Xnm
MAX
A
Xnm
MAX
– A
Xnm
TESTE
A
–
A
Eq
uação
2
Eq
uação
3
734nm e 812nm (PELLEGRINI et al., 1999). Nos ensaios avaliou-se a ação
antioxidante pelo decréscimo da absorbância em 734nm, após 30 minutos de incubação
na presença das amostras. Os resultados foram expressos em média + desvio padrão das
porcentagens de inibição calculadas através da equação 2.
3.5.1.2 Atividade Scavenger de radicais pelo DPPH (SOARES et al., 1997)
Em tubos de ensaio pipetou-se a amostra (em diferentes
concentrações), e, a seguir, DPPH (Figura 6) em concentração final 60µM.
Completaram-se os volumes para 1mL com etanol absoluto. Incubou-se a mistura por
15 minutos, ao fim dos quais se leu a absorbância em 531nm. Os resultados foram
expressos em média + desvio padrão das porcentagens de inibição calculadas através da
equação 2.
Figura 5: Estrutura molecular do ABTS.
Figura 6: Estrutura molecular do DPPH (1,1-difenil-2-
picril-hidrazina)
O
2
N N N
NO
2
NO
2
S
N
O
3
S
N N
SO
3
S
N
3.5.1.3 Atividade Scavenger de HOCl, e H
2
O
2
O TNB (ácido 5-tio-2nitrobenzóico; Figura 7) foi preparado, a partir
do DTNB (ácido 5-5’-ditio(2-nitrobenzóico); Figura 7), segundo Ching et al. (1994) e
sua concentração foi determinada espectrofotometricamente, através de seu coeficiente
de extinção molar em 412nm (13600 M
-1
cm
-1
; CHING et al., 1994). Da mesma forma
determinou-se as concentrações para o HOCl (350 M
-1
cm
-1
em 295nm
;
ZGLICZYNSKI
et al., 1971) e para o H
2
O
2
(80M
-1
cm
-1
em 230nm;
BRESTEL, 1985). As reações foram
efetuadas em tampão fosfato de sódio 50mM, pH 7,0 à 25
0
C. Em tubos de ensaio
pipetou-se a amostra (em diferentes concentrações), seguida por tampão (q.s.p. volume
final da reação=1mL), TNB (80µM) e HOCl (22µM), ou H
2
O
2
(100µM). Incubou-se
por 15 minutos (para ensaio com HOCl) ou por 2 horas (para ensaio com peróxido de
hidrogênio) e leu-se a absorbância em 412nm. Os resultados foram expressos em média
+ desvio padrão das porcentagens de inibição calculadas através da equação 3.
3.5.1.4 Atividade Scavenger de Ânion Superóxido
O ânion superóxido reage com o NBT para formar uma formazana. A
intensidade de cor é diretamente proporcional à concentração do radical (KAKKAR et
al., 1984). O ensaio foi realizado em solução de pirofosfato de sódio (25mM, pH 8,3),
sendo que a mistura reacional continha 25µL de metasulfato de fenazina 372µM, 75µL
de NBT 600µM, 50µL de NADH 1560µM e diferentes concentrações das amostras
Figura 7: Estruturas moleculares do DTNB e do TNB
S
O OH
O
2
N
S
O
HO
O
2
N
DTNB
TN
SH
O OH
O
2
N
vegetais em volume final de 1mL. As reações foram iniciadas pela adição de NADH.
Após incubação por 90 segundos a 25
0
C foram adicionados 100µL de ácido acético
glacial e 900µL tampão pirofosfato de sódio. Após vigorosa agitação a intensidade de
cor da mistura foi medida em 560nm. Os resultados foram expressos em média + desvio
padrão das porcentagens de inibição calculadas através da equação 2.
3.5.1.5 Atividade Scavenger de Óxido Nítrico
O efeito scavenger das amostras sobre o óxido nítrico foi medido de
acordo com Yen et al. (2001). Foram adicionadas em tubos diferentes concentrações das
diferentes amostras. A seguir adicionou-se tampão fosfato 50mM, pH 7,0 (q.s.p. volume
final de 1mL) e nitroprussiato de sódio (concentração final 25mM; Figura 8). Incubou-
se, na ausência de luz e em 25
0
C, por 1hora e meia e retirou-se uma alíquota de 250µL à
qual foi adicionado 150µL do reagente de Griess (YEN et al., 2001). Esta nova mistura
foi incubada, na ausência de luz e em 25
0
C, por 15 minutos. Finalmente, fez-se a leitura
das absorbâncias em 570nm. Durante a incubação de 1hora e meia, nitrito é liberado em
solução. Este nitrito reage com a sulfanilamida e com o dihidrocloreto de
naftiletilenodiamino em uma reação de diazotação, formando um cromóforo com pico
de absorbância em 570nm. Os resultados foram expressos em média + desvio padrão
das porcentagens de inibição calculadas através da equação 2.
Figura 8: Estrutura molecular do
nitroprussiato de sódio.
3.5.2 POTENCIAL DE INIBIÇÃO DA AÇÃO DA MPO
No ensaio quimiluminescente comparou-se as integrais das cinéticas
de emissão de luz, com e sem amostras (1 minuto de reação), enquanto nos ensaios
espectrofotométricos compararam-se as velocidades iniciais das cinéticas (v
0
),
calculadas através dos gráficos “produto formado vs. tempo de reação” (v
0
=∆A/ ∆t).
3.5.2.1 Cinética de oxidação do luminol pela hemina (quimiluminescência)
Em tampão Fosfato de potássio 50mM, pH 7,4, testou-se as
amostras (10µg/mL, 1µg/mL e 0,1µg/mL) na cinética de oxidação do luminol
(0,1mM) pela hemina (80nM) e peróxido de hidrogênio (0,05mM).
3.5.2.2 Cinética de oxidação do guaiacol pela hemina (UV/Vis)
Em tampão fosfato de potássio 50mM, pH 7,4, testou-se as
amostras (10µg/mL, 1µg/mL e 0,1µg/mL) na cinética de oxidação do guaiacol
(5mM) pela hemina (3µM) e peróxido de hidrogênio (2,5mM). A cinética foi
monitorada em 470nm pela formação do produto da reação (guaiacol oxidado).
3.5.2.3 Cinética de oxidação do guaiacol pela HRP (KHALIL, 2002)
A concentração da HRP em solução foi determinada através de seu
coeficiente de extinção molar em 403nm (1,02 x 10
5
M
-1
cm
-1
; OHLSON; PAUL,
1976). Em tampão PBS-D, a 37
0
C, temos HRP 7nM e guaiacol 2mM, com e sem
amostras (10µg/mL, 1µg/mL e 0,1µg/mL). A reação é iniciada com a adição de
peróxido de hidrogênio (0,1mM) e monitorada em 470nm por 1minuto. Determinou-
se v
0
.
3.5.2.4 Cinética de oxidação do guaiacol pela mieloperoxidase presente no
extrato bruto de neutrófilo de rato (DESSER et al., 1972)
Em tampão PBS-MgSO
4
, a 37
0
C, EBNR (MPO 0,10U) e guaiacol
100mM, com e sem amostras (10µg/mL). A reação é iniciada com a adição de peróxido
de hidrogênio (0,5mM) e monitorada em 470nm por 1minuto. Determinou-se v
0
.
Para a determinação dos valores de IC
50
das amostras na cinética de
oxidação do guaiacol pela MPO, testaram-se diferentes concentrações das mesmas no
sistema EBNR(MPO 0,10U)/H
2
O
2
(0,2mM)/guaiacol(20mM).
3.5.2.5 Cinética de oxidação do TMB pela mieloperoxidase presente no extrato
bruto de neutrófilo de rato (ANDREWS; KRYNSKI, 1986)
Em tampão fosfato 20mM/NaCl 100mM, pH 6,0, a 37
0
C, EBNR
(MPO 0,10U) e TMB 1,6mM, com e sem amostras (10g/mL). A reação é iniciada
com a adição de peróxido de hidrogênio (0,5mM) e monitorada em 655nm por
1minuto. Determinou-se v
0
.
3.6 Análise Estatística
Os resultados, de triplicatas (exceto quando indicado), são expressos
em média ± desvio padrão (DP). Análises realizadas através de ANOVA onde se
estabelece o nível de significância como p<0,05.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE
Quando as ERO são geradas in vivo
, muitos antioxidantes as combatem.
Suas importâncias relativas dependem de qual espécie foi gerada, como, onde e qual alvo de
dano é avaliado. Por exemplo: quando o plasma é exposto
ao dióxido de nitrogênio ou ozônio,
o ácido úrico é protetor, mas este promove ínfima proteção contra o ácido hipocloroso. Mas,
quando o estresse oxidativo é o mesmo e avaliam-se diferentes alvos, obtêm-
se diferentes
respostas. Por exemplo: a fase gasosa d
a fumaça do cigarro causa lipoperoxidação no plasma,
que pode ser evitada pelo ácido ascórbico; entretanto, este não protege contra o dano
oxidativo das proteínas (HALLIWELL, 1995).
No estudo da avaliação do potencial antioxidante das amostras deve-
se
considerar que: i) um composto deve ser testado em concentrações disponíveis in vivo
e ii) ao
avaliar os antioxidantes, deve-
se utilizar pelo menos uma espécie relevante biologicamente.
Deve-se perguntar como age o antioxidante, se ele age diretamente sobre
a ERO ou ele inibe a
sua geração e ainda, se ele age indiretamente regulando defesas antioxidantes endógenas.
Foram analisadas diferentes espécies reativas
(radicalares ou não) modelos
(DPPH e ABTS
•+
) ou existentes em sistemas biológicos (HOCl, H
2
O
2
, O
2
• -
e NO
•
). Além das
amostras de fonte vegetal, testaram-
se também substâncias com reconhecida ação
antioxidante: o ácido úrico (um antioxidante endógeno) e Trolox (um análogo da vitamina E).
4.1.1 Atividade Scavenger de HOCl
A ação das amostras sobre o ácid
o hipocloroso foi avaliada através do
ensaio de oxidação do TNB a DTNB, acompanhada através do desaparecimento de TNB pela
queda da absorbância em 412nm (gráfico 1). Esta queda é comparada na ausência e na
presença da amostra avaliada pelo cálculo de porce
ntagem de inibição apresentado
anteriormente (equação 3). Constroem-se os gráficos dose-
resposta, relacionando a inibição à
4.2 ENSAIOS ENZIMÁTICOS
Neste caso, buscou-
se avaliar a possível interferência das amostras sobre a
ação da: i) hemina/heme (grupamento prostético de peroxidases), ii)
HRP (peroxidase modelo
extraída de vegetal) e iii) MPO presente no EBNR.
No ensaio quimiluminescente, procurou-
se avaliar a área dos gráficos
obtidos pela medição da intensidade de luz (mV) em função do tempo de reação. Neste tipo
de metodologia com luminol, onde diferentes radicais são gerados (KHALIL, 2002), a
interferência da ação antioxidante/anti-
radical das amostras já era esperada. Isto foi
constatado pelo fato de todas as amostras em todas as concentrações avaliadas terem
diminuído o valor da integral da curva em comparação à obtida na ausência das amostras.
Observou-se que todas as
amostras inibiram as reações quimiluminescentes (hemina/luminol)
em todas as doses testadas (Tabela I). Entretanto, q
uando o substrato revelador foi o guaiacol,
apenas as amostras 4-EtOH, 2-Hid, 3-HexAcOEt, S-3, 1C-EtOH e 1C-BuOH
promoveram
inibição e somente na maior dose testada, como pode ser visto na tabela II.
Devido à interferência do potencial antioxidante das amostras sobre o ensaio
quimiluminescente, optou-
se por não se realizar a análise da cinética da HRP ou da MPO por
este método. Os estudos continuaram através de espectrofotometria UV/Vis; analisando-
se
neste caso a velocidade inicial da reação enzimática.
5 CONCLUSÃO
Existem homens que lutam um dia e são bons.
Existem homens que lutam um ano e são melhores.
Outros que lutam vários anos e são muito bons.
Mas existem aqueles que lutam a vida inteira. Estes são imprescindíveis
(Bertold Brecht)
Neste trabalho, avaliou-se in vitro
a possibilidade de ação direta das
amostras sobre diferentes espécies reativas modelo e geradas em nosso organismo. Além
disso, procurou-
se avaliar a inibição da mieloperoxidase, enzima responsável por gerar ácido
hipocloroso, uma espécie envolvida em diferentes patologias.
Pelos resultados obtidos, verificou-
se o grande potencial das plantas
estudadas como fonte de compostos com ação antioxidante e anti-
radical. Obviamente,
estudos posteriores em sistemas ex vivo (com células) e in vivo
merecem ser realizados e, este
estudo inicial, aqui realizado, abre diferentes possibilidades para tal pesquisa.
Além disso, identificou-
se a existência de possíveis inibidores da MPO nos
diferentes vegetais estudados e ainda caracterizamo
s o tipo de inibição promovida por parte
de uma das substâncias isoladas, a S-
3 e do padrão inibidor, a quercetina, como sendo do tipo
mista.
6
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A N E X O S
ANEXO A
Espectros de absorção das amostras avaliadas
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
A
λ (nm)
1F-EtOH
210 280 350 420 490 560 630 700
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
A
λ (nm)
1F-Hex
200 225 250 275 300 325 350 375
0,00
0,08
0,16
0,24
0,32
0,40
1C-EtOH
A
λ (nm)
200 250 300 350 400 450 500
0,00
0,09
0,18
0,27
0,36
0,45
1C-Hex
A
λ (nm)
210 252 294 336 378 420
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
A
λ (nm)
1C-AcOEt
200 225 250 275 300 325 350 375
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1C-BuOH
λ (nm)
A
Gráfico A1: espectros de absorção das amostras (20
µ
g/mL) de P. nitens.
ANEXO B
Gráficos: Avaliação da ação sobre o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,5 2,0 5,0 10,0 20,0
concentração (µg/mL)
1C-Hex
TNB + H
2
O
2
TNB
A
(412nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0,5 2,0 5,0 10,0 20,0
concentração (µg/mL)
TNB + H
2
O
2
TNB
1C-EtOH
A
(412nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1C-BuOH
TNB
TNB + H
2
O
2
0,5 2,0 5,0 10,0 20,0
concentração (µg/mL)
A
(412nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,5 2,0 5,0 10,0 20,0
concentração (µg/mL)
TNB
TNB + H
2
O
2
1C-AcOEt
A
(412nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,5 2,0 5,0 10,0 20,0
concentração (µg/mL)
1F-Hex
TNB + H
2
O
2
TNB
A
(412nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
TNB
TNB + H
2
O
2
1F-EtOH
0,5 2,0 5,0 10,0 20,0
concentração (µg/mL)
A
(412nm)
Gráfico B1: Acão das amostras de P. nitens no sistema TNB(80
µ
M)/ H
2
O
2
(100
µ
M)
ANEXO C
Parecer do Comitê de ética em pesquisa
ANEXO D
Trabalhos submetidos para publicação
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