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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CAMPUS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE APARENTE DE SELÊNIO
PELA TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) UTILIZANDO-SE
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA EM FORNO DE
GRAFITE
FÁBIO ARLINDO SILVA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Zootecnia como parte
dos requisitos para a obtenção do título
de Mestre em Zootecnia.
Botucatu – SP
Agosto - 2006
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CAMPUS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE APARENTE DE SELÊNIO
PELA TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) UTILIZANDO-SE
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA EM FORNO DE
GRAFITE
FÁBIO ARLINDO SILVA
Biólogo
Orientador: Prof. Dr. Pedro de Magalhães Padilha
Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Edivaldo Pezzato
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Zootecnia como parte
dos requisitos para a obtenção do título
de Mestre em Zootecnia.
Botucatu – SP
Agosto - 2006
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DEDICATÓRIA
“À minha esposa, Lucía, sem o seu apoio eu jamais conseguiria realizar este trabalho.
Muito obrigado. Eu te amo muito;
Aos meus pais, Arlindo e Quitéria e aos meus irmão, Álvaro, Ariane e Lúcia;
Aos meus grandes amigos, Alessandro, Clayton, Tuca, Paraná, Renato, Gabriel,
Blanca, Sandro e Carla;
À Tia Ná, Vó Benedicta, Egle, Paula e Alex;
À Maria, do Departamento de Química, que por inúmeras vezes foi muito solicita
comigo;
Ao meu orientador e amigo Pedro de Magalhães Padilha, realmente não há palavras
para explicar o quanto eu lhe sou grato. Muitíssimo obrigado.”
AGRADECIMENTOS
“Agradeço a todos que contribuíram para a realização desse trabalho, direta ou
indiretamente;
Aos amigos da Pós-graduação da Zootecnia, Gabriel, Blanca, André, Altevir,
Igo, Xuxa, Dario;
Aos Professores e amigos do Departamento de Melhoramento e Nutrição
Animal da UNESP/Botucatu, Prof. Pezzato, Prof ª Margarida;
Aos amigos do Departamento de Química e Bioquímica da UNESP/Botucatu,
Maria, Vânia, Fabinho, Lurdinha, Elaine, Prof. Ariovaldo, Prof. Júlio, Prof ª Sônia,
Prof. Zé Pedro;
Aos companheiros de Pós-graduação do Departamento de Química,
Jorge, Adriana, Jomílson, Sílvio, Alberto, Renato;
E a Deus. Pois ele está acima de tudo.”
SUMÁRIO
CAPÍTULO I..............................................................................................................
1. Introdução................................................................................................................
1.1. Considerações iniciais e justificativas.....................................................................
1.1.1. Estudo da digestibilidade dos alimentos na nutrição de
peixes............................
1.1.2. Os nutrientes metálicos e suas funções na nutrição animal.................................
1.1.3. Interação entre minerais e outros nutrientes.......................................................
1.1.4. Espectrometria de absorção atômica por chama – FAAS...................................
1.1.4.1. Conceitos básicos em Espectrometria Atômica..............................
1.1.4.2. Análises Quantitativas em Absorção Atômica................................
1.1.5. Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite – GFAAS...................
1.1.6. Determinação de nutrientes metálicos em amostras biológicas por
espectrometria de absorção atômica em forno de grafite....................................
1.1.7. Outras aplicações da técnica de espectrometria de absorção atômica em forno
de grafite...........................................................................................................
2. Referências Bibliográficas.........................................................................................
Anexo I: Lista de abreviações.......................................................................................
CAPÍTULO II............................................................................................................
Determinação de Cr em suspensões de fezes de peixes por GFAAS para estimativa do
coeficiente de digestibilidade aparente de nutrientes em rações utilizadas em
piscicultura...................................................................................................................
Resumo........................................................................................................................
Abstract.......................................................................................................................
1. Introdução ...............................................................................................................
2. Experimental............................................................................................................
2.1. Reagentes, soluções padrão e vidrarias..................................................................
2.2. Preparo das amostras.............................................................................................
2.2.1. Preparo das suspensões das amostras....................................................
2.3. Preparo do tubo de grafite recoberto internamente com paládio metálico...............
2.4. Preparo das curvas analíticas..................................................................................
2.5. Procedimentos analíticos........................................................................................
1
2
2
2
4
5
7
7
12
14
18
18
21
27
28
29
29
30
31
32
32
33
34
34
35
35
Implicações..................................................................................................................
3. Resultados e discussão..............................................................................................
3.1. Otimização das condições experimentais................................................................
3.2. Determinação do tempo ótimo de sonificação das suspensões das amostras...........
3.3. Obtenção das curvas analíticas...............................................................................
3.4. Aplicação do método proposto .............................................................................
4. Conclusões...............................................................................................................
5. Referências Bibliográficas.........................................................................................
Anexo I: Lista de abreviações.......................................................................................
CAPITULO III...........................................................................................................
Determinação de selênio por GFAAS em suspensões de amostras de fezes de peixes
para estimativa da biodisponibilidade deste micronutriente em rações utilizadas em
piscicultura...................................................................................................................
Resumo........................................................................................................................
Abstract.......................................................................................................................
1. Introdução................................................................................................................
2. Experimental............................................................................................................
2.1. Reagentes, soluções padrão e vidrarias..................................................................
2.2. Preparo das amostras.............................................................................................
2.2.1. Preparo das suspensões das amostras ................................................................
2.3. Preparo do tubo de grafite recoberto internamente com tungstênio metálico..........
2.4. Preparo das curvas analíticas .................................................................................
2.5. Procedimentos analíticos........................................................................................
3. Resultados e discussão..............................................................................................
3.1.Otimização das condições experimentais.................................................................
3.2. Determinação do tempo ótimo de sonificação das suspensões das amostras...........
3.3. Obtenção das curvas analíticas...............................................................................
3.4. Aplicação do método proposto..............................................................................
4. Conclusões...............................................................................................................
5. Referências
Bibliográficas……………………………………………………………
Anexo III: Lista de abreviações…………………………………………………….......
CAPITULO IV...........................................................................................................
36
36
39
40
42
44
44
48
49
50
50
51
52
53
53
54
55
55
56
56
57
57
61
61
63
65
65
69
70
71
CAPÍTULO- I
2
I. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações iniciais e justificativas
1.1.1. Estudo da digestibilidade dos alimentos na nutrição de peixes
A determinação química e os testes alimentares são os primeiros procedimentos
para se determinar o valor nutritivo de um alimento. Entretanto, após a ingestão, sua
efetiva assimilação depende da digestibilidade pelo organismo animal, ou seja, da
habilidade com que o animal irá digerir e absorver os nutrientes e a energia contidos no
alimento.
1,2
No estudo de nutrição de peixes, a determinação da digestibilidade dos
nutrientes das rações utilizadas na alimentação desses animais, é o primeiro cuidado
quando se pretende avaliar o potencial de inclusão da dieta.
3
Conhecendo-se o grau de
digestibilidade do alimento, pode-se descrever a fração do nutriente ou da energia do
alimento que não é excretada nas fezes do animal.
4
A substituição de determinados
produtos e subprodutos da agroindústria, empregados como ingredientes das dietas de
peixes, por produtos sucedâneos, tem sido feita com base em estudos de digestibilidade
dos nutrientes desses alimentos e tem se apresentado como prática econômica
alternativa.
5,6
Independentemente do método utilizado para determinação do coeficiente de
digestibilidade de uma dieta ou ingrediente, os resultados finais podem ser afetados por
fatores dependentes do meio ambiente, do estado de saúde do animal, dos hábitos
alimentares e da composição e processamento da dieta.
7
Na determinação da digestibilidade de alimentos por peixes, utilizam-se os
chamados indicadores fecais. Esses indicadores se dividem em internos e externos. Os
marcadores internos ocorrem naturalmente nos alimentos, enquanto que os marcadores
externos são adicionados à dieta ou administrados por outra via ao animal.
8
Os
marcadores externos são os mais utilizados nos estudos de digestibilidadas com peixes,
sendo o óxido de crômio III (Cr
2
O
3
) o marcador que apresenta melhor aceitação por ser
completamente indigerível e não absorvível, por não ter ação farmacológica no aparelho
digestório, passando, dessa forma, uniformemente através do aparelho digestório.
9-11
3
A determinação da porcentagem de Cr
2
O
3
nas fezes dos peixes permite estimar o
coeficiente de digestibilidade total ou parcial dos nutrientes metabolizados,
comparando-se com a porcentagem desse óxido que é misturado inicialmente na
ração.
12
Para isso, os peixes são mantidos em aquários onde são alimentados com rações
marcadas com 0,1% de Cr
2
O
3
. Decorrido o período de alimentação, os peixes são
transferidos para aquários de coleta de fezes, com fundo cônico para favorecer a
decantação das fezes. As fezes são coletadas após decantação e retiradas da água
sobrenadante, sendo em seguida centrifugadas, secas em estufa, moídas e conservadas a
–20
o
C.
13
Após determinação da composição química-bromatológica e da porcentagem
de Cr
2
O
3
nas rações e fezes, o coeficiente de digestibilidade pode ser calculado
utilizando-se a equação 1:
14
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
×
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−=
%Nr
%Nf
fO%Cr
rO%Cr
100100Da
32
32
Equação 1
onde:
Da = Digestibilidade aparente;
%Cr
2
O
3
r
= Porcentagem de óxido de crômio na ração;
%Cr
2
O
3
f
= Porcentagem de óxido de crômio nas fezes;
%Nr
= Porcentagem de nutriente na ração;
%Nf
= Porcentagem de nutriente nas fezes.
A determinação da porcentagem de óxido de crômio tanto nas fezes como nas
rações, apresenta dificuldades nos procedimentos de preparo das amostras.
Normalmente a mineralização das amostras são feitas por aquecimento lento (60-80
o
C)
em blocos digestores, utilizando-se mistura nítrica-perclórica (5 mL de HNO
3
concentrado + 2 mL de HClO
4
concentrado).
15
Os extratos resultantes são soluções
ácidas de dicromato (Cr
2
O
7
2-
), que normalmente é quantificado pelo método
colorimétrico da difenilcarbazida.
16
Este procedimento além de demorado, apresenta o
inconveniente de oxidar o crômio (III) a crômio (VI), espécie altamente tóxica. A
quantificação de alguns nutrientes metálicos, colocados nas rações em baixas
concentrações, como o cobre e o selênio, por exemplo, apresenta a mesma dificuldade
nas suas determinações.
Considerando-se o exposto, o desenvolvimento de novas metodologias que
permitam a quantificação segura dos nutrientes metálicos e do óxido de crômio (III),
4
utilizado como marcador de rações, para determinação da digestibilidade nutricional
aparente nos estudos de nutrição animal, particularmente nutrição de peixes, torna-se
fundamental. Neste contexto, a determinação de analitos metálicos em suspensões por
espectrometria de absorção atômica em forno de grafite, apresenta-se como uma técnica
bastante promissora, principalmente porque permite a eliminação da etapa de
mineralização das amostras e também a produção de crômio (VI), que pela metodologia
clássica utilizada nos estudos de nutrição animal, constitui o principal problema.
1.1.2. Os nutrientes metálicos e suas funções na nutrição animal
Todos os tecidos possuem elementos químicos (minerais) em proporções e
quantidades variáveis. Assim, são componentes essenciais ao metabolismo, refletindo
na maior ou menor produtividade do animal.
17
Dois a cinco por cento do corpo do
animal é constituído pela fração mineral, ocorrendo variação em função da espécie, da
raça e do próprio indivíduo.
17,18
Os minerais são classificados como macrominerais
(minerais que o organismo necessita em grandes quantidades) e microminerais
(minerais que o organismo necessita em menores quantidades). Dos elementos químicos
presentes na tabela periódica, 25 podem ser classificados como essenciais, no entanto,
do ponto de vista prático, podemos classificar os elementos essenciais em:
• Macroelementos: cálcio, fósforo, magnésio, potássio, sódio, cloro e enxofre.
• Microelementos: ferro, iodo, selênio, cobalto, manganês, zinco e cobre.
A evolução da ciência animal, aliada à modernização dos sistemas de análises nos
últimos anos, tem levado a descobertas de outras espécies metálicas que participam de
ciclos metabólicos importantes no organismo de diversos animais. Assim, já existem
evidências da necessidade do molibdênio, do níquel, do crômio, do silício, do vanádio,
do flúor e até do arsênio. Por outro lado, alguns desses elementos, preocupam mais pela
sua toxicidade e antagonismo, como flúor, níquel e arsênio, que se não forem bem
controladas suas dosagens, tornam-se nocivos ao animal.
19
Genericamente, as funções dos sais minerais podem ser classificadas em:
20
• Função estrutural – minerais com participação nos órgãos e tecidos, como o
cálcio, o fósforo e o magnésio, integrantes dos ossos e dos dentes. Os minerais que
participam da constituição das proteínas musculares, como fósforo e enxofre, também
se enquadram dentro dessa função.
5
• Função eletrolítica – minerais que participam como constituintes dos fluídos e
dos tecidos orgânicos, como o sódio, o potássio, o cálcio e o magnésio, sendo
responsáveis pela manutenção da pressão osmótica, pelo equilíbrio ácido-base e pela
permeabilidade da membrana e dos tecidos, enquadram-se dentro dessa função.
• Função catalisadora – minerais que atuam como catalisadores nos sistemas
enzimáticos e hormonais, como integrantes específicos das metaloenzimas. São
representantes nessa função os microelementos minerais. Dentre eles, podemos destacar
o iodo, pela sua função na tiroxina. A Tabela 1 mostra os principais microelementos que
participam dessa função e seus respectivos sistemas enzimáticos.
Tabela 1 – Microelementos e seus respectivos sistemas enzimáticos.
Minerais Sistemas enzimáticos
Ferro Citocromos, catalases e desidrogenase do ácido fumárico.
Cobre Citocromo-oxidase, oxidase do ácido ascórbico, catalases e
aminoxidase.
Manganês Hidrolases, tiaminases, descarboxilases e quinases.
Molibdênio Xantino-oxidase e aldeído-oxidase.
Selênio Glutationa-peroxidase
Zinco Anidrase-carbônica, fosfatase-alcalina e carboxipeptidase.
1.1.3. Interação entre minerais e outros nutrientes
Os minerais podem interagir entre si, com outros nutrientes e também com
alguns fatores não nutritivos da dieta. As interações do tipo sinérgica ou antagônica
podem ocorrer na própria dieta ou durante o metabolismo no trato gastrointestinal. O
conhecimento dessas interações assume importância fundamental para a correção das
deficiências minerais causadas principalmente pelos desequilíbrios entre os elementos
constituintes da dieta.
21
O conceito de sinergismo e antagonismo dos minerais não está bem esclarecido.
No aspecto sinérgico, parece que ocorre uma melhoria na absorção de um elemento em
função de outro, desempenhando alguma função metabólica em nível do tecido ou em
nível celular.
22
6
O sinergismo dos minerais no trato gastrointestinal segue os possíveis
mecanismos de interação:
22
• Interação direta entre os elementos, sendo que os níveis de absorção são
determinados por suas proporções na dieta;
• Interação através de processo intermediário da fosforilação na parede intestinal e
a atividade das enzimas digestivas. Um exemplo é o efeito do fósforo, do zinco e
do cobalto na liberação do alimento e na absorção de outros minerais;
• Interação indireta pelo estímulo do crescimento e atividade da flora microbiana
do rúmen. Um exemplo é o cobalto, que estimula a flora, intensificando o
processo biossintético.
Em nível de tecido e metabolismo celular, o sinergismo pode ocorrer devido à:
23
• Interação indireta de elementos na função estrutural (cálcio e fósforo na
formação dos ossos, cobre e ferro na formação da hemoglobina, manganês e
zinco na conformação do DNA);
• Participação simultânea no centro ativo de algumas enzimas (ferro e molibdênio
na xantinoxidase, cobre e ferro na citocromoxidase);
• Ativação de sistemas enzimáticos e intensificação de processos sintéticos que
requerem a presença de outros minerais (magnésio nas sintetases, com
subseqüente participação do fósforo, enxofre e outros elementos);
• Ativação das funções endócrinas e efeito sobre o metabolismo de outros
minerais (iodo → tiroxina → aumento do anabolismo → maior retenção de
potássio e magnésio no corpo).
A interação do tipo antagônica pode ser definida como um elemento inibindo a
absorção de outro no trato gastrointestinal e produz efeito oposto sobre uma função
bioquímica no organismo.
24
O mecanismo poderá ocorrer em nível gastrointestinal ou
em nível de tecido muscular.
Em nível gastrointestinal, temos:
• Reação química entre elementos (formação de fosfato de magnésio na presença
de excesso de magnésio na dieta; formação de complexos entre cobre ou zinco,
com fósforo, sulfato ou amônio);
• Adsorção sobre a superfície das partículas coloidais (fixação de magnésio e ferro
em partículas de sais insolúveis);
7
• Efeito inibidor com função antimetabólica. Ação do boro ou do titânio sobre a
fosforização oxidativa;
• Competição entre íons. Agindo como material carregador na parede intestinal
(cobalto com ferro).
Em nível de tecido muscular, a interação antagônica pode ocorrer:
• Diretamente entre íons simples e complexos orgânicos;
• Por competição entre íons no centro ativo de sistemas enzimáticos (magnésio e
manganês nas metaloenzimas);
• Por competição para ligação com substâncias carregadoras no sangue (ferro com
zinco);
• Interferências de diferentes íons sobre uma dada enzima (ativação da ATPase
pelo magnésio e inibição pelo cálcio);
• Por abrandamento do nível tóxico dos metais pesados como chumbo e vanádio
por íons ou elementos bióticos (redução da concentração de chumbo no corpo
pela absorção de cobre, zinco e manganês).
1.1.4. Espectrometria de absorção atômica por chama – FAAS
25-27
1.1.4.1. Conceitos básicos em Espectrometria Atômica
O átomo é constituído de um núcleo rodeado de elétrons. Todos os elementos
possuem um número de elétrons que está associado com o núcleo atômico dentro da
estrutura orbital que é única de cada elemento. Os elétrons ocupam posições nos orbitais
em uma ordem e em caminhos definidos. A energia mais baixa, que corresponde a
configuração eletrônica estável do átomo, conhecida como “estado fundamental”, é a
configuração normal para os átomos.
Se alguma energia de grande magnitude é aplicada ao átomo, a energia será
absorvida pelo átomo, e os elétrons mais externos (elétrons de valência) serão
promovidos para configurações menos estáveis, denominadas “estados excitados”.
Como este estado é instável, o átomo tende imediatamente e espontaneamente a retornar
para a configuração do estado fundamental. O elétron irá retornar para o estado inicial,
posição estável no orbital, e a energia radiante equivalente à quantidade absorvida no
processo inicial de excitação será emitida.
8
O processo descrito acima é representado pela Figura 1. Na primeira etapa
ocorre a excitação forçada proporcionada por fonte externa de energia, e na segunda
etapa ocorre o processo espontâneo de decaimento, envolvendo emissão de luz.
O comprimento de onda da energia radiante emitida está diretamente relacionado
com a transição eletrônica ocorrida. Sabendo-se que todos os elementos possuem uma
estrutura eletrônica única, e que o comprimento de onda da luz emitida é uma
propriedade individual de cada elemento, é possível determinar qualitativamente qual é
o elemento, por este comprimento de onda ser característico de cada elemento, algo
como uma “impressão digital do elemento”.
Primeira Etapa
Segunda Etapa
Figura 1 - Processos de excitação e decaimento dos elétrons de valência.
Como a configuração do orbital dos átomos pode ser complexa, podem ocorrer
algumas transições eletrônicas, estas transições resultam na emissão de comprimentos
de onda característicos da luz, como é ilustrado pela Figura 2.
E
ner
g
ia
Estado
f
undamenta
l
E
XCITA
Ç
ÃO
Estado
excitado
D
ECAIMENTO
Estado
Fundamental
+
Energia
luminosa
λ
Estado
Excitado
9
E
XCITAÇÃO
E
MISSÃO
Estados
Excitados
Estado
F
undamenta
l
Estados
Excitados
Estado
F
undamenta
l
λ
1
λ
2
λ
3
Energia
L
uminosa
Figura 2 - Transições de energia.
O processo de excitação e decaimento para o estado fundamental está envolvido
nas 3 linhas de espectroscopia atômica (emissão, absorção e fluorescência atômica).
Essa energia absorvida no processo de excitação e essa energia emitida no processo de
decaimento é quantificada e utilizada para propósitos analíticos.
Em emissão atômica, a amostra é submetida à alta energia, de natureza térmica,
para produzir átomos no estado excitado, capazes de emitir luz (Figura 3). A fonte de
energia pode ser um arco elétrico, uma chama, ou mais recentemente, um plasma. O
espectro de emissão de um elemento exposto à fonte consiste em uma coleção dos
comprimentos de onda emitidos, comumente denominados “linhas de emissão”, devido
à natureza discreta dos comprimentos de onda emitidos. O espectro de emissão pode ser
utilizado como uma característica única do elemento para identificação qualitativa. A
emissão atômica utilizando arco elétrico vem sendo amplamente utilizada em análises
qualitativas.
I
Queimador Monocromador Detector
Figura 3: Espectroscopia de emissão atômica
10
Técnicas de emissão também podem ser utilizadas para determinações
quantitativas. A intensidade da luz emitida no comprimento de onda característico do
elemento a ser determinado é quantificada, e esta emissão será maior de acordo com o
número de átomos do analito presente na amostra. A técnica de Fotometria de Chama é
uma aplicação da emissão atômica para análises quantitativas.
Quando a luz de um único e exato comprimento de onda incidir em átomos no
estado fundamental, os átomos podem absorver esta luz e atingirem um estado excitado,
e este é o princípio fundamental da Absorção Atômica, processo ilustrado na Figura 4.
A quantidade de interesse em determinações por absorção atômica é a quantidade de luz
que é absorvida durante a passagem pelo interior da nuvem de átomos. Quando o
número de átomos no caminho do feixe de luz aumenta, a quantidade de luz absorvida
aumenta proporcionalmente. A quantificação da diferença entre a quantidade de luz
emitida pela fonte e a quantidade de luz que passou pelo interior da nuvem de átomos
corresponde à concentração de átomos do analito na amostra.
O uso de fontes especiais de radiação em comprimentos de onda cuidadosamente
selecionados permite determinações individuais de elementos em presença de outros.
A nuvem atômica necessária para as determinações por absorção atômica é
produzida por suplemento suficiente de energia térmica, que promove a dissociação dos
componentes químicos em átomos livres. Estes átomos livres, em contato com a
radiação proveniente da fonte externa, são então promovidos para estados excitados, e
esta energia absorvida para promover a mudança é o fator que possibilita a
quantificação dos elementos na amostra. Todo o processo de quantificação do analito
está diretamente relacionado com a eficiência da etapa de atomização, se esta for
eficiente, a maioria dos átomos estará na forma do estado fundamental e serão capazes
de absorver a radiação proveniente da fonte.
I
0
I
Fonte Queimador Monocromador Detector
Figura 4 - Espectroscopia de Absorção Atômica.
11
A facilidade, a velocidade, a exatidão e a precisão das determinações fazem da
absorção atômica um dos mais populares métodos para determinação de metais nos
mais variados tipos de amostras.
O último campo em Espectroscopia Atômica é a fluorescência atômica (Figura
5), técnica que incorpora fundamentos da absorção atômica e da emissão atômica.
Como em absorção atômica, os átomos no estado fundamental são introduzidos na
chama e excitados pela radiação que atravessa a nuvem atômica pelo processo de
atomização. A quantidade de radiação absorvida durante o processo assemelha-se ao
que é observado na absorção atômica, no entanto, a emissão resultante do decaimento
de energia dos átomos excitados, é quantificada como é observado no processo de
emissão atômica. A intensidade desta ”fluorescência” aumenta com o aumento da
concentração de átomos, proporcionando as bases para as análises quantitativas.
Outra diferença básica da fluorescência está no posicionamento da fonte de
radiação, que se encontra formando um ângulo com o resto do sistema óptico. Desta
maneira, o detector de radiação recebe somente a fluorescência criada dentro da chama,
e não diretamente a radiação proveniente da fonte. Este fato é uma vantagem, pois
minimiza o efeito da intensidade da fonte, aumentando a sensibilidade do equipamento
devido a maior facilidade de quantificação da energia emitida pelos átomos excitados
sem a interferência da emissão proveniente da fonte.
I
0
I
Fonte Queimador Monocromador Detector
Figura 5. Espectroscopia de Fluorescência Atômica.
12
A técnica de emissão atômica é a mais adequada na determinação do metais
alcalinos, dentre eles o sódio, o potássio e o lítio, devido ao fato de eles emitirem no
visível e não necessitarem de uma fonte térmica muito potente para promover os
elétrons de valência ao estado excitado.
Dentre as aplicações da técnica de fluorescência atômica estão as suas análises
de metais, principalmente alumínio, em materiais como óleos lubrificantes, substâncias
biológicas, etc.
A técnica de absorção atômica é uma forma mais sensível para a determinação
quantitativa de mais de 60 metais e metalóides. A absorção atômica é a mais utilizada
entre as três técnicas e normalmente oferece inúmeras vantagens sobre as demais, mas
dependendo do tipo de amostra e do analito em questão, benefícios particulares podem
ser obtidos pelo uso da emissão atômica ou pelo uso da fluorescência atômica.
1.1.4.2. Análises Quantitativas em Absorção Atômica
Uma fonte, geralmente uma lâmpada de catodo oco (HCL), emite radiação em
um comprimento de onda determinado, e com intensidade inicial I
o
. Esta radiação esta
direcionada para a chama que contém os átomos no estado fundamental. A intensidade
inicial de radiação (I
o
) sofre decréscimo devido à absorção de parte desta energia pelos
átomos que passaram do estado fundamental para o estado excitado. A radiação que
chega até o sistema detector com diminuição de intensidade, é denominada I, e a
quantidade de radiação absorvida pelos átomos do analito na nuvem atômica é
determinada pela comparação entre os valores de I e I
o
. A diferença de intensidade entre
I e I
o
corresponde à concentração do analito dentro da amostra, como será detalhado a
seguir.
Relação entre I
o
, I e concentração:
Diversos termos são utilizados para definir a quantidade de radiação que sofreu
variação. A “transmitância”, que é um desses termos, é definida como a razão entre a
intensidade final e inicial de radiação (Equação 2).
0
I
I
T =
Equação 2
13
A transmitância indica uma fração inicial da radiação que passa pelo caminho da
chama e chega até o sistema detector. A porcentagem de transmitância é simplesmente a
transmitância expressa em termos de porcentagem (Equação 3).
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
×=
0
I
I
100T %
Equação 3
A porcentagem de absorção é um complemento da porcentagem de transmitância
definida como a porcentagem da intensidade de radiação que é absorvida dentro da
chama pelos átomos (Equação 4).
T %100A %
−
=
Equação 4
O termo absorbância é puramente uma quantidade matemática que pode ser
representado pela Equação 5:
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
=
I
0
I
logA
Equação 5
A absorbância também é o termo mais conveniente para caracterizar a radiação
em espectrometria de absorção, principalmente porque a absorbância segue uma relação
linear com a concentração, definida pela ”Lei de Beer” (Equação 6).
abcA
=
Equação 6
onde:
A = absorbância;
a = coeficiente de absorção (uma constante que é característica da espécie absorvendo
em um comprimento de onda específico);
b = comprimento do caminho percorrido pela radiação dentro da chama;
c = concentração das espécies.
Esta equação representa, simplificadamente, que a concentração é diretamente
proporcional à concentração dos átomos que absorvem dentro dos parâmetros pré-
estabelecidos de análise.
A proporção direta entre concentração e absorbância é claramente evidenciada
quando soluções com concentrações conhecidas são utilizadas na construção das curvas
analíticas. Quando a absorbância é “plotada” em função da concentração, uma relação
de linearidade é observada para certos intervalos de concentração (Figura 6). Dentro
14
destas regiões aonde a Lei de Beer é mantida, o crescimento da absorbância é
diretamente proporcional ao crescimento da concentração.
Figura 6. Curva analítica para o íon metálico cobre.
Quando a concentração e a absorbância aumentam, observa-se um
comportamento não ideal no processo de absorção em função da concentração, o que
acarreta desvios da linearidade (não representado na Figura 6).
O comportamento linear apresentado entre concentração e absorbância em
determinados intervalos de concentração é a base para a construção das “curvas de
calibração” (ou curvas analíticas). Com o uso das curvas de calibração é possível
determinar a concentração dos analitos nas amostras por interpolação, ou por
extrapolação dos valores obtidos nestas curvas.
1.1.5. Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite – GFAAS
25-27
O conceito de atomização eletrotérmica foi introduzido por L'vov em 1959, mas
tornou-se bem conhecido a partir de uma publicação de 1961. Neste trabalho, a amostra
era depositada na superfície de um eletrodo móvel de grafite e, em seguida, introduzida
em um tubo de grafite revestido com uma folha de tântalo, o qual era aquecido
eletricamente. Este sistema possibilitava a atomização da amostra numa única etapa,
fornecendo uma nuvem atômica mais concentrada e, dessa maneira, uma melhor
sensibilidade era alcançada, com menor consumo da amostra.
26
A técnica de espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica
(ETAAS), apesar de ser geralmente monoelementar, é adequada para a determinação de
15
baixas concentrações de metais e semimetais, apresentando alta sensibilidade, uma vez
que a alíquota da amostra colocada dentro de tubo de grafite (forno) é atomizada em um
curto período de tempo, e o tempo de residência média dos átomos no caminho óptico é
de aproximadamente 1 segundo (Figuras 7 e 8). Além disso, a técnica apresenta boa
seletividade, requer pequenos volumes de amostra e possui limites de detecção, para a
maioria dos elementos, em concentrações da ordem de ηg L
-1
e µg L
-1
.
27
Figura 7. Espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica em forno
de grafite.
Figura 8. Representação de corte de forno de grafite com aquecimento longitudinal
Varian.
Na atomização eletrotérmica em forno de grafite, o solvente, o ácido ou a
mistura azeotrópica da amostra é evaporada em temperaturas da ordem de 200-250
o
C,
etapa denominada de secagem (Figura 9).
16
Figura 9. Etapa de secagem da amostras no programa de aquecimento para
determinação de metais por GFAAS.
Após a etapa de secagem, a matéria orgânica e outros concomitantes da amostras
são incinerados em temperaturas da ordem de 450-1600
o
C, separando assim o analito
(metal, semimetal) dos outros componentes da matriz sólida. Esta etapa do processo é
denominada de pirólise (Figura 10). Após a etapa de pirólise, a corrente elétrica
responsável pelo aquecimento do tubo de grafite é aumentada rapidamente até uma
amperagem que eleve a temperatura na ordem de 2000
o
C a 3.000
o
C, provocando
formação de uma nuvem atômica dos analitos metálicos. Esta etapa é denominada de
atomização (Figura 11) e ocorre em um período de milissegundos até segundos. Nesta
etapa a medida de absorção da radiação é feita na região imediatamente acima da
superfície do tubo.
Figura 10. Etapa de pirólise da amostras no programa de aquecimento para
determinação de metais por GFAAS.
17
Figura 11. Etapa de atomização da amostras no programa de aquecimento para
determinação de metais por GFAAS.
Após a medida da absorbância da analito, é feita então uma etapa de limpeza,
para remoção de traços do analito metálico evitando assim o chamado “efeito de
memória”. As etapas de secagem, pirólise e limpeza, são assistidas por uma corrente de
argônio (fluxo de ≅ 1 L min
-1
) para remover os componentes da matriz volatilizados em
cada etapa. As quatro etapas envolvidas no processo de atomização para determinação
de um analito por GFAAS estão sumarizadas no gráfico da Figura 12.
Figura 12. Etapas envolvidas no programa de aquecimento para atomização de um
analito na espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS).
18
1.1.6. Determinação de nutrientes metálicos em amostras biológicas por
espectrometria de absorção atômica em forno de grafite
A determinação de nutrientes metálicos em amostras biológicas (vegetais,
sangue, fezes de animais, alimentos, etc.) por espectrometria de absorção atômica em
forno de grafite (GFAAS) proporciona diversas vantagens. Dentre elas podemos citar a
alta sensibilidade da técnica, com limites de detecção em níveis de ηg kg
-1
, a utilização
de pequenos volumes de amostra, a determinação de uma ampla variedade de elementos
traços e considerando-se que o atomizador pode agir como um reator químico, tem-se a
possibilidade de amostragem sólida, o que elimina a etapa de decomposição prévia total
da amostra.
28
A amostragem de sólidos na forma de suspensão apresenta vantagens sobre os
procedimentos de digestão convencionais, como redução no tempo de preparo da
amostra, diminuição nas perdas do analito, por manipulação excessiva ou retenção sobre
produtos insolúveis, redução da possibilidade de contaminação da amostra e
principalmente a minimização da ação de ácidos perigosos ao analista.
29, 30
A pré-concentração da amostra por evaporação do solvente, utilizando-se a
queima da matriz em mufla a 600
o
C, é uma das formas utilizadas para aumentar a
sensibilidade da técnica de quantificação do analito, quando fatores de pré-concentração
de 10 a 40 podem ser obtidos. Este procedimento de pré-concentração é utilizado
principalmente na determinação de elementos traço em amostras de sangue.
31
Quando se trabalha com amostragem de sólidos na forma de suspensões, a
homogeneidade da suspensão, a utilização de agentes protetores e antiaglutinantes, o
tamanho das partículas, a utilização de modificadores químicos e de corretor de fundo
adequados, são os principais fatores para se conseguir uma boa exatidão e precisão nas
medidas analíticas.
32
1.1.7. Outras aplicações da técnica de espectrometria de absorção atômica em
forno de grafite
A determinação de elementos voláteis em amostras de solos e sedimentos tem
sido feita utilizando-se suspensões dessas matrizes. Suspensões da ordem de 0,5 a 3 %
(m/v) em ácido fluorídrico (HF), com injeção de 1% (m/v) de níquel (Ni) como
modificador químico, possibilita a determinação de selênio (Se) nessas amostras,
19
eliminando-se assim a etapa de extração/digestão manual que envolve a utilização de
reagentes perigosos.
33
Determinações de chumbo, selênio e cádmio em suspensões de alimentos para
bebês por GFAAS, podem ser feitas em meio de Triton X-100 0,1 % (m/v), H
2
O
2
30%
(v/v) e HNO
3
1 % (v/v). Os modificadores de matriz mais eficientes neste método são:
Ni 0,5 % (m/v) para selênio, Ni + NH
4
H
2
PO
4
1 % (m/v) para cádmio e NH
4
H
2
PO
4
1 %
(m/v) para chumbo. A calibração do equipamento pode ser feita utilizando-se padrões
aquosos para selênio e chumbo, para cádmio deve-se utilizar o método da adição de
analito.
34
Nas últimas décadas diversos trabalhos têm destacado a importância da
utilização de modificadores químicos adequados nas determinações de metais traços por
GFAAS, tanto em amostras líquidas quanto em suspensão.
35-46
O uso do modificador
nessas determinações, visa obter uma temperatura de pirólise o mais elevada possível ao
analito, para garantir a remoção da matriz com eficiência. De uma maneira geral,
temperaturas a partir de 1000
o
C têm se mostrados suficientes para a pirólise total da
matriz.
Modificadores químicos como níquel e paládio estão entre os mais utilizados em
determinações de elementos traços por GFAAS. A mistura desses modificadores
estabiliza elementos voláteis, como o selênio, permitindo a utilização de temperaturas
de pirólise da ordem de 1000
o
C, permitindo assim a eliminação quase que total dos
componentes da matriz.
35
A utilizações de níquel e cobre e a mistura de cobre com nitratos de ferro e
magnésio tem se mostrado eficiente na estabilização de diferentes espécies químicas de
selênio para posterior determinação desse analito por GFAAS. A mistura de cobre com
nitrato de magnésio apresenta-se como melhor modificador, quando comparado ao
níquel. Essa mistura de modificadores, proporciona melhor sensibilidade e estabilização
do selênio em seus três estados de oxidação até 1100
o
C.
36
O paládio, quando misturado com nitrato de magnésio, proporciona a
estabilidade térmica de cerca de 21 elementos a altas temperaturas, eliminando a maior
parte dos componentes de várias matrizes. Essa mistura é considerada como
modificador químico universal.
37
Essa mistura de modificadores, destaca-se
principalmente na determinação de elementos voláteis (Ex. arsênio, selênio), presentes
na forma de traços em amostras de água mineralizadas utilizadas na medicina. O uso
desses modificadores elimina principalmente a alta absorção de fundo, causada pela
20
grande concentração de sódio presente nessas amostras, e a contaminação do tubo de
grafite devido à alta concentração de sulfato.
38
A mistura de cloreto paládio com cloreto de cádmio permite a determinação de
elementos voláteis, como selênio, em amostras de aerodispersóides (Ex. fuligem de
carvão) por GFAAS. Essa mistura de modificadores, permite a remoção dos
concomitantes da matriz, e elimina a interferência do ferro, elemento comum presente
nesse tipo de amostra.
39
A utilização de compostos orgânicos como modificadores químicos, como a
glicose, tem sido proposta para determinação de antimônio e selênio em suspensões de
amostras biológicas por GFAAS. Misturas da amostra com a glicose nas proporções
0,001 % (m/v) e 2% (m/v), permite a estabilização térmica do selênio e antimônio até
1300
o
C. A interferência espectral causada pela presença de fosfato, principalmente em
relação ao selênio, é bastante minimizada.
40
Outra mistura alternativa de modificadores
utilizada na determinação de selênio, é a de platina com níquel. O uso desse
modificador na determinação direta de selênio em amostras de sucos de frutas silvestres
por GFAAS, permite a eliminação de interferências espectrais causadas principalmente
por potássio, fosfato e cálcio.
41
Um método alternativo para determinação direta de elementos voláteis em
amostras biológicas por GFAAS, consiste na diluição da amostra em solução a 10% de
aminas terciárias e a adição de nitrato de paládio como modificador químico. Nessas
condições, consegue-se diminuir o tempo de análise, o consumo de reagentes, o risco de
contaminação, além disso, a sensibilidade aumenta significativamente, principalmente
para elementos como o selênio.
42
De uma maneira geral, a utilização de paládio como modificador de matriz, mais
especificamente de nitrato de paládio, tem se mostrado mais eficiente. Mesmo em
determinações de suspensões de amostras biológicas, esse modificador proporciona a
quantificação de diversos elementos, principalmente os voláteis como selênio, arsênio e
antimônio, uma melhoria da estabilidade térmica e do perfil do sinal transiente, uma
melhoria da exatidão e da precisão do método, além é claro de proporcionar o aumento
significativo da sensibilidade.
43-45
A capacidade do paládio em estabilizar elementos,
como o selênio, em elevadas temperaturas de pirólise, está relacionada à formação de
um composto intermetálico, que mantém o elemento estável termicamente em
temperaturas superiores a 900
o
C.
46
21
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27
Anexo I
Lista de abreviações
Cr
2
O
3
: Óxido de Crômio (III)
HNO
3
: Ácido Nítrico
HClO
4
: Ácido Perclórico
Cr
2
O
7
2-
: Íons Dicromato
H
2
O
2
: Peróxido de Hidrogênio
HF: Ácido Fluorídrico
Ni: Níquel
Ni + NH
4
H
2
PO
4
: Níquel + Fosfato diácido de amônio
NH
4
H
2
PO
4
: Fosfato diácido de amônio
FAAS: Espectrometria de absorção atômica por chama
GFAAS: Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite
λ: Comprimento de onda
HCL: “Hollow cathode lamp” ou Lâmpada de catodo oco
I
0
: Intensidade de radiação que chega à chama
I: Intensidade de radiação que não foi absorvida na chama
T: Transmitância
%T: porcentagem de Transmitância
A: Absorbância
%A: porcentagem de Absorbância
CAPÍTULO- II
29
Determinação de Cr em suspensões de fezes de peixes por GFAAS para estimativa
do coeficiente de digestibilidade aparente de nutrientes em rações utilizadas em
piscicultura
Resumo
No presente trabalho um método simples, rápido e sensível é proposto para
determinação de crômio (utilizado como marcador biológico de rações de peixes) em
amostras de fezes de peixes por GFAAS utilizando-se a introdução direta de suspensões
das amostras no tubo de grafite do espectrômetro. Amostras de fezes e de rações
contendo de 0,10 a 1,00 mg kg
-1
de Cr
2
O
3
(isentas de minerais) foram moídas em
moinho criogênico. Após este procedimento as amostras apresentaram granulometria
menor que 60 μm. As suspensões foram preparadas misturando-se, diretamente no copo
do amostrador automático do espectrômetro, 20 mg de amostras de ração, ou fezes, com
1 mL de solução contendo 0,005% v/v de Triton X-100 e 0,50% v/v de HNO
3
suprapuro. Após sonificação durante 20 segundos, 10 μL de suspensão foram injetados
para dentro do tubo de grafite que continha, na sua parede interna, uma película de
paládio metálico que atuou como modificador químico permanente. Os limites de
detecção (LOD) e de quantificação (LOQ), calculados em relação a 20 leituras do
branco das suspensões (2% m/v de fezes ou ração isentas de minerais), foram de 0,81 e
2,70 μg L
-1
de Cr
2
O
3
para as suspensões padrão de fezes, 0,84 e 2,83 μg L
-1
de Cr
2
O
3
para as suspensões padrão de ração. O método proposto foi aplicado em estudos de
digestibilidade/disponibilidade de nutrientes em diferentes rações de peixes e
mostraram-se de acordo com os resultados obtidos, utilizando-se amostras previamente
mineralizadas por digestões ácidas.
Palavras-chave: Suspensões de rações e fezes de peixe; GFAAS; Modificador químico;
Paládio metálico.
30
Determination of chromium by GFAAS in slurries of fish feces to estimate
the apparent digestibility of nutrients in feed used in pisciculture
Abstract
This paper presents a simple, fast and sensitive method to determine chromic
oxide (used as a biological marker of fish feed) in samples of fish feces by GFAAS
through the direct introduction of slurries of the samples into the spectrometer’s
graphite tube. The standard samples of feces and of fish feed containing 0.10 to 1.00 mg
kg
-1
of Cr
2
O
3
were pre-frozen for 1 minute in liquid nitrogen and then ground a
cryogenic mill for 2 minutes, which reduced the samples’ grain size to less than 60 µm.
The standard slurries were prepared by mixing 20 mg of standard samples of fish feed
or feces with 1 mL of a solution containing 0.05 % v/v of Triton X-100 and 0.50 % v/v
of suprapure HNO
3
directly in the spectrometer’s automatic sampling glass. The final
concentrations of Cr
2
O
3
present
in the
standard slurries were 2, 4, 8, 16 and 20 μg L
-1
.
After sonicating the mixture for 20 seconds, 10 μL of standard slurries were injected
into the graphite tube, whose internal wall was lined with a metallic palladium film that
acted as a permanent chemical modifier. The limits of detection (LOD) and
quantification (LOQ) calculated for 20 readings of the blank of the standard slurries
(2% m/v of feces or feed devoid of minerals) were 0.81 and 2.70 μg L
-1
of
Cr
2
O
3
for the
standard feces slurries, 0.84 and 2.83 μg L
-1
of
Cr
2
O
3
for the standard feed slurries. The
proposed method was applied in studies of nutrient digestibility of different fish feeds
and its results proved compatible with the results obtained from samples pre-
mineralized by acid digestion.
Keywords: Slurries samples; GFAAS; Metallic palladium; chromic oxide.
31
1. INTRODUÇÃO
No estudo de nutrição de peixes, a determinação da digestibilidade dos
nutrientes das rações utilizadas na alimentação desses animais, é o primeiro cuidado
quando se pretende avaliar o potencial de inclusão da dieta.
1
Conhecendo-se o grau de
digestibilidade do alimento, pode-se descrever a fração do nutriente ou da energia do
alimento que não é excretado nas fezes do animal.
2
A substituição de determinados
produtos e subprodutos da agroindústria, empregados como ingredientes das dietas de
peixes, por produtos sucedâneos, tem sido feita com bases em estudos de digestibilidade
dos nutrientes desses alimentos e tem-se apresentado como prática econômica
alternativa.
3
Na determinação da digestibilidade de alimentos por peixes, utilizam-se os
chamados indicadores fecais. Esses indicadores se dividem em internos e externos. Os
marcadores internos ocorrem naturalmente nos alimentos, enquanto que os marcadores
externos são adicionados à dieta ou administrados por outra via ao animal.
4
Os
marcadores externos são os mais utilizados nos estudos de digestibilidade com peixes,
sendo o Cr
2
O
3
o marcador que apresenta melhor aceitação por ser completamente
indigestível e não absorvível, não ter ação farmacológica no aparelho digestório e passar
uniformemente através do aparelho digestório.
5-7
A determinação da porcentagem de Cr
2
O
3
nas fezes dos peixes permite estimar o
coeficiente de digestibilidade total ou parcial dos nutrientes metabolizados,
comparando-se com a porcentagem desse óxido que é misturado inicialmente na ração.
8
Para isso, os peixes são mantidos em aquários circulares com volume de 250 L onde são
alimentados com rações marcadas com 0,1% de Cr
2
O
3
. Decorrido o período de
alimentação, os peixes são transferidos para aquários de coleta de fezes (também com
volume de 250 L), que possuem o fundo cônico para favorecer a decantação das fezes.
As fezes são coletadas após decantação e retirada da água sobrenadante, sendo em
seguida centrifugadas, secas em estufa, moídas e conservadas a –20
o
C.
9
A determinação
da composição química-bromatológica e da porcentagem de Cr
2
O
3
nas rações e fezes,
permite estimar o coeficiente de digestibilidade total ou parcial dos nutrientes
metabolizados pelo animal.
10
A determinação da porcentagem de óxido tanto nas fezes como nas rações,
apresenta dificuldades nos procedimentos de preparo das amostras. Normalmente a
32
mineralização das amostras é feita por aquecimento lento (60-80
o
C) em blocos
digestores, utilizando-se mistura nítrica-perclórica (5mL de HNO
3
conc. + 2 mL de
HClO
4
conc.).
11
Os extratos resultantes são soluções ácidas de dicromato (Cr
2
O
7
2-
), que
normalmente é quantificado pelo método espectrofotométrico da difenilcarbazida.
12
Este procedimento além de demorado, apresenta o inconveniente de oxidar o crômio
(III) a crômio (VI), espécie altamente tóxica.
A determinação de nutrientes metálicos em amostras biológicas (vegetais,
sangue, fezes de animais, alimentos, etc.) por espectrometria de absorção atômica em
forno de grafite (GFAAS) proporciona diversas vantagens, como alta sensibilidade,
limites de detecção em níveis de ηg kg
-1
, utilização de pequenos volumes de amostra,
determinação de uma ampla variedade de elementos traços e considerando-se que o
atomizador pode agir como um reator químico, tem-se a possibilidade de amostragem
sólida, o que elimina a etapa de decomposição prévia total da amostra.
13
Considerando a
etapa de tratamento da amostra, procedimentos utilizando amostragem de sólidos na
forma de suspensão permitem obter vantagens sobre os procedimentos de digestão
convencionais, como redução no tempo de preparo da amostra, diminuição nas perdas
do analito por manipulação excessiva ou retenção sobre produtos insolúveis, redução da
possibilidade de contaminação da amostra e principalmente a minimização da ação de
ácidos perigosos ao analista.
14,15
Considerando o exposto, este trabalho descreve o desenvolvimento de um
método para determinação de crômio, em suspensões de amostras de rações e fezes de
peixes por GFAAS, de modo a eliminar a etapa de mineralização das amostras e
permitir a estimativa da digestibilidade de nutrientes em amostras de rações utilizadas
na nutrição de peixes.
2. EXPERIMENTAL
2.1. Reagentes, soluções padrão e vidrarias
Água deionizada de alta pureza (18,2 MΩ cm
-1
) obtida por sistema Milli-Q
®
(Millipore, Bedford, EUA), HNO
3
suprapuro (Merck), HClO
4
(Merck) e Triton X-100
(Merck) foram utilizados em todo o trabalho. A solução de trabalho contendo Pd,
empregada no recobrimento interno do tubo de grafite e utilizada como modificador
33
permanente, foi preparado pela diluição apropriada com água ultrapura de uma solução
estoque contendo 50 g L
-1
de Pd(NO
3
)
2
(Merck).
Soluções estoque dos analitos e dos concomitantes foram preparadas a partir de
reagentes de pureza espectroscópica (Johnson & Matthey, Royston, Hertfordshire, UK).
As demais soluções utilizadas, incluindo as soluções ácidas concentradas utilizadas nas
mineralizações das amostras, foram todas de grau analítico. Todas as soluções foram
estocadas em frascos de polipropileno.
Todos os frascos de estocagem de amostras e soluções padrão, vidrarias e os
copos do autoamostrador do espectrômetro de absorção atômica foram lavados com
HNO
3
10% v/v por 24 horas e em seguida enxaguados com água ultrapura e secos por
agitação antes da utilização.
2.2. Preparo das amostras
As amostras de fezes e rações de peixes após secagem a 50
o
C em estufa de
circulação forçada de ar por 48 horas, foram submetidas à moagem criogênica, em
moinho criogênico (SPEX – Freezer, modelo Mill 6750). Para isso, uma massa de
aproximadamente 1,0 g da amostra foi colocada em frasco de policarbonato juntamente
com a barra magnética, o qual devidamente fechado, foi imerso em nitrogênio líquido.
Pelo impacto entre a amostra e a barra magnética submetida a um campo magnético
oscilante (20 impactos s
-1
) a amostra foi pulverizada. O programa utilizado na moagem
das amostras compreendeu uma primeira etapa de 2 minutos para o pré-congelamento, 1
minuto de pulverização, novamente 1 minuto de congelamento, e uma segunda etapa
que compreendeu dois ciclos com dois estágios de pulverização e congelamento,
perfazendo um tempo total de 8 minutos. Este procedimento permitiu obter partículas
com granulometria menor que 60 μm.
16
Uma parte das amostras foi também mineralizada em forno de microondas
(Provecto Analítica – Campinas/SP, modelo DGT plus). Para isso, massas de 100 mg de
amostras, moídas criogenicamente, foram transferidas diretamente para os frascos de
teflon do forno de microondas, adicionando-se em seguida 2,5 mL de HNO
3
suprapuro
concentrado mais 0,50 mL de HClO
4
concentrado. O programa de aquecimento
utilizado foi o proposto no manual do equipamento.
34
2.2.1. Preparo das suspensões das amostras
Após a moagem criogênica, 20 mg de amostras do material biológico (ração ou
fezes de peixes), foram transferidas diretamente para os copos do autoamostrador do
espectrômetro de absorção atômica e em seguida foram adicionados 5 μL de HNO
3
suprapuro 14 mol L
-1
, 50 μL de Triton X-100 a 1% v/v e 945 μL de água ultrapura. As
amostras de suspensão dos materiais biológicos foram em seguida agitadas por
sonificação durante 20 segundos diretamente nos copos do autoamostrador,
empregando-se um Desruptor de células ultra-sônico (UNIQUE).
2.3. Preparo do tubo de grafite recoberto internamente com paládio metálico
Os tubos de grafite pirolítico com plataforma integrada utilizados nas
determinações de crômio tiveram suas paredes internas recobertas com paládio
metálico. Para isso, alíquotas de 10 μL de solução contendo 10 g L
-1
do modificador
Pd(NO
3
)
2
foi injetada dentro do atomizador, o qual em seguida foi submetido às etapas
do programa de aquecimento descrito na Tabela 1. Com aquecimento até 500
o
C o
Pd(II) depositado sobre a parede do tubo de grafite, forma uma camada de Pd
0
que atua
como modificador químico.
17
A massa de Pd
0
depositado na plataforma do tubo de
grafite foi de 506 mg. Com esse tratamento foi possível utilizar o tubo de grafite em 260
queimas de amostras.
Tabela 1. Programa de aquecimento utilizado para o recobrimento da parede interna do
tubo de grafite com paládio metálico (Pd
0
)
Etapas
Temperatura
(
o
C)
Rampa
(s)
Aquecimento
(s)
Fluxo de Argônio
(L min
-1
)
Secagem 95 40 0 0,30
Secagem 120 10 0 0,30
Redução 500 10 5 0,30
Redução 550 5 1 0,30
o
C: graus Celsius; s: segundo; L min
-1
: litros por minuto.
35
2.4. Preparo das curvas analíticas
Curvas analíticas foram preparadas utilizando-se suspensões de rações e de fezes
de peixes contendo 2, 4, 8, 16 e 20 μg L
-1
de Cr
2
O
3
(Merck), sendo as leituras das
absorbâncias feitas por GFAAS. Essas suspensões padrão foram preparadas nas mesmas
condições descritas para o preparo das suspensões de amostras de ração e fezes.
Também foram preparadas curvas analíticas solubilizando-se 20 mg de cada uma das
misturas padrões descritas acima, em solução nítrica/perclórica 1:3 sob aquecimento em
forno de microondas, de modo a obter soluções padrão que contivessem 1, 2, 4, 8 e 10
mg L
-1
de Cr
2
O
3
, sendo que as leituras de absorbâncias dessas soluções foram feitas por
FAAS.
2.5. Procedimentos analíticos
Após a etapa de sonificação da amostra de suspensão e/ou suspensão padrão,
feita diretamente nos copos do autoamostrador, um volume de 10 μL de padrão ou
amostra foi injetado no tubo de grafite (recoberto internamente com paládio metálico)
pela micropipeta do autoamostrador. As medidas foram feitas com cinco repetições. O
programa de aquecimento do tubo de grafite otimizado para determinação de crômio
encontra-se descrito na Tabela 2.
Tabela 2. Programa de aquecimento do tubo de grafite otimizado para determinação de
Cr
2
O
3
em suspensões de amostras de fezes e rações
Etapas
Temperatura
(
o
C)
Rampa
(s)
Aquecimento
(s)
Fluxo de Argônio
(L min
-1
)
Secagem 120 10 0 1
Secagem 250 10 0 1
Pirólise 1400 10 20 1
Pirólise 1400 5 10 1
Atomização 2500 1 5 0
Limpeza 2800 5 0 1
o
C: graus Celsius; s: segundo; L min
-1
: litros por minuto.
36
Para determinação de crômio foi utilizado espectrômetro de absorção atômica
(SHIMADZU modelo AA-6800), equipado com corretor de absorção de fundo com
lâmpada de deutério e sistema self-reverse (SR), tubo de grafite pirolítico com
plataforma integrada e amostrador automático (ASC-6100). Foi utilizada lâmpada de
catodo oco de crômio SHIMADZU, operada com 10 mA de corrente. O comprimento
de onda utilizado foi de 357,9 nm e a resolução espectral foi de 0,5 nm. Argônio foi
utilizado como gás inerte, mantendo-se um fluxo constante de 1 L min
-1
durante todo o
programa de aquecimento, exceto na etapa de atomização, na qual o fluxo de gás foi
interrompido. Os sinais de absorbância foram medidos em área de pico. Nas leituras de
absorbância pelo modulo de chama (FAAS), o gás combustível utilizado foi acetileno,
com fluxo constante de 2 L min
-1
e ar como gás oxidante, com fluxo constante de 2 L
min
-1
.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Otimização das condições instrumentais
Nas determinações de metais por GFAAS utilizando-se a técnica de amostragem
em suspensão, a obtenção de resultados analíticos exatos e reprodutivos, depende da
otimização das temperaturas de pirólise e atomização do analito presente na amostra em
suspensão. Dessa forma curvas de pirólise e de atomização foram feitas para se
determinar às temperaturas ótimas de pirólise e atomização do Cr em suspensões padrão
de rações e fezes de peixes que continham 16 μg L
-1
de Cr
2
O
3
, utilizando-se tubo de
grafite recoberto internamente com Pd
0
, que atou como modificador permanente, e as
condições de preparo das amostras descritas no item 2.2. As Figuras 1 e 2 mostram a
influência das temperaturas de pirólise e atomização sobre sinal de absorbância obtido
para o crômio nas suspensões padrão dos materiais biológicos.
37
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
b -
a -
b
a
Suspensão Padrão de Rações
Suspensões Padrão de Fezes
Absorbancia
Temperatura de Pirólise /
o
C
Figura 1. Curvas de temperatura de pirólise das suspensões de amostras de fezes e ração
contendo 16 μg L
-1
de Cr
2
O
3
.
1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
0,27
0,30
b -
a -
b
a
Suspensões padrão de ração
Suspensões padrão de fezes
Absorbância
Temperatura de Atomização /
o
C
Figura 2. Curvas de temperatura de atomização do Cr nas suspensões de amostras de
fezes e ração contendo 16 μg L
-1
de Cr
2
O
3
.
A temperatura de pirólise de 1400
o
C foi escolhida, porque conforme mostra a
Figura 1, os sinais de absorbância obtidos para o Cr permanecem constantes a partir de
800
o
C, sofrendo um rápido decréscimo a partir de 1400
o
C. Em relação à temperatura de
38
atomização (Figura 2), observa-se que os sinais de absorbância obtidos para o Cr são
constantes a partir de 2300
o
C para ambas as suspensões padrão, dessa forma, a
temperatura de atomização de 2500
o
C foi selecionada para todos os demais
experimentos.
Os sinais de absorbância do analito (AA) e de absorção de fundo (BG) para as
suspensões padrão dos materiais biológicos estão ilustrados nas Figuras 3 e 4. Observa-
se em ambas as Figuras uma absorção de fundo relativamente baixa, demonstrando a
eficiência do Pd
0
como modificador químico. Como os materiais biológicos em estudo
apresentam teores de magnésio em torno de 0,12 %, esse elemento presente na matriz
pode auxiliar na estabilização térmica do crômio.
16,18
0123456
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
AA
BG
Absorbância
Tempo / s
Figura 3. Sinais transientes de absorção atômica (AA) e de fundo (BG) na atomização
de Cr nas suspensões de amostras de fezes contendo 16 μg L
-1
de Cr
2
O
3.
39
0123456
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
AA
BG
Absorbância
Tempo / s
Figura 4. Sinais transientes de absorção atômica (AA) e de fundo (BG) na atomização
de Cr nas suspensões de amostras de ração contendo 16 μg L
-1
de Cr
2
O
3
3.2. Determinação do tempo ótimo de sonificação das suspensões das amostras
A agitação ultra-sônica para análise de suspensões de materiais sólidos garante
uma boa homogeneização da amostra, o que permite obter melhor reprodutibilidade
entre as medidas.
19
Dessa forma, o tempo de sonificação das amostras foi avaliado no
intervalo de 5 a 60 s de agitação. Na Figura 5 é mostrada a influência do tempo de
sonificação das amostras sobre os sinais de absorbância obtidos para o Cr. Analisando-
se a Figura 5, observa-se que os sinais de absorbância permanecem constantes a partir
de 20 s de sonificação. Esse tempo de sonificação foi considerado ótimo, pois além de
se obter um bom sinal de absorbância, o RSD entre as medidas foi relativamente baixo
(3,4%).
40
0 10203040506070
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
b -
a -
b
a
Suspensões padrão de ração
Suspensões padrão de fezes
Absorbância
Tempo de sonificação / s
Figura 5. Influência do tempo de ultrasonificação sobre o sinal de absorbância do Cr nas
suspensões padrão de fezes e ração de peixe contendo 16 μg L
-1
de Cr
2
O
3
3.3. Obtenção das curvas analíticas
Considerando-se os parâmetros como temperatura de pirólise e atomização e o
perfil de sinal de absorção atômica otimizados, foram construídas curvas analíticas
utilizando-se suspensões padrão de fezes e ração de peixes contendo Cr
2
O
3
na faixa de 2
- 20 μg L
-1
(conforme descrito no
item 2.5). A Figura 6 mostra as curvas analíticas
obtidas com as suas respectivas equações das retas. Comparando-se a curva analítica
preparada com fezes de peixes (curva a) com a preparada com rações de peixe (curva b),
observa-se que estas não apresentam diferenças significativas nas inclinações (k =
0,0145 para curva a e k = 0,0135 para a curva b).
41
024681012141618202224
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
b-Suspensão Padrão de Rações
A =0,001 - 0,0135C
Cr
2
O
3
r =0,9999
a-Suspensão Padrão de Fezes
A=0,0011 - 0,0145C
Cr
2
O
3
r = 0,9999
b
a
Absorbância
Concentração/ug L
-1
Figura 6. Curvas analíticas obtidas a partir de suspensões padrão de fezes e rações de
peixes contendo 2, 4, 8, 16,e 20 μg L
-1
de Cr
2
O
3
.
Ambas as curvas analíticas, apresentaram valores de absorbância cerca de 10 -
15 % menores que os valores da curva analítica obtida a partir das soluções padrão
preparadas na faixa de concentração de 1 – 10 mg L
-1
de Cr
2
O
3
, cujas leituras de
absorbância foram feitas no módulo FAAS
(Equação da reta obtida; A = 0,0038 +
0,0291K). No entanto as inclinações das retas obtidas para as suspensões padrão são
maiores cerca de 5 vezes, logo a sensibilidade do método proposto também é maior, o
que comprova a eficiência da temperatura nas etapas de pirólise e atomização do
programa de aquecimento utilizado. O acúmulo de resíduos carbonáceos no interior do
tubo de grafite, que provoca a obstrução parcial da radiação proveniente da lâmpada de
catodo oco, pode prejudicar as medidas de absorbância.
18
No entanto, os baixos sinais
de fundo (BG) obtidos na etapa de otimização do crômio no procedimento proposto,
indicam que o resíduo de carvão remanescente da etapa de pirólise não comprometeu as
medidas de absorbância. O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ)
foram calculados considerando o desvio padrão de 20 leituras obtidas em relação ao
branco das suspensões padrão e as inclinações das curvas analíticas (LOD =3σ/slope e
LOQ =10σ/slope). Esses valores foram de 0,80 e 2,70 μg L
-1
de
Cr
2
O
3
, o que
corresponde a 40 e 135 μg kg
-1
,
para as suspensões
padrão de fezes e de 0,85 e 2,80 μg
42
L
-1
de
Cr
2
O
3
,
o que corresponde a 42,50 e 140 μg kg
-1
,
para as suspensões padrão de
ração.
16
A comparação entre os valores do limite de detecção obtido pelo método
proposto com os valores obtidos por FAAS (76 μg L
-1
de Cr
2
O
3
), demonstram que é
possível detectar concentrações aproximadamente 95 vezes menores utilizando o
método proposto. A porcentagem de recuperação obtida foi de 98±3 para o padrão de
suspensão de fezes e 97±2 para o padrão de suspensão de ração. Os resultados obtidos
demonstram que o método proposto apresenta precisão aceitável. O tempo de vida útil
do tubo de grafite foi equivalente a 260 queimas. Considerando-se a complexidade das
matrizes biológicas, a vida útil do tubo obtida para o método proposto é aceitável
quando comparada com outros métodos descritos na literatura.
16,18
3.4. Aplicação do método proposto
Depois dos procedimentos de otimização, determinação do LOD e LOQ, a
aplicabilidade do método desenvolvido foi testada na determinação de Cr
2
O
3
em
quatro
amostras de diferentes suplementos alimentares utilizados na dieta de alevinos de
Tilápia do Nilo e em amostras de fezes dessa espécie de peixe. Com os valores da
porcentagem de Cr
2
O
3
e da análise bromatólogica dessas amostras, foi calculada a
estimativa do coeficiente de digestibilidade aparente (CDA) das frações de matéria seca
(MS), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE) e energia bruta (EB), utilizando-se a
equação 1:
10
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
×
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−=
%Nr
%Nf
fO%Cr
rO%Cr
100100CDA
32
32
Equação I
onde:
CDA = Coeficiente de digestibilidade aparente;
%Cr
2
O
3
r
= Porcentagem de óxido de crômio na ração;
%Cr
2
O
3f
= Porcentagem de óxido de crômio nas fezes;
%Nr
= Porcentagem de nutriente na ração;
%Nf
= Porcentagem de nutriente nas fezes.
A Tabela 3 mostra os valores dos coeficientes de digestibilidade aparente
calculados utilizando-se as porcentagens de Cr
2
O
3
determinados pelo método proposto e
por FAAS após mineralização das amostras em forno de microondas.
43
Tabela 3. Coeficiente de digestibilidade aparente (CDA) da Matéria Seca (MS),
Proteína Bruta (PB), Extrato Etéreo (EE) e Energia Bruta (EB) de alevinos de tilápia do
Nilo alimentados com diferentes suplementos alimentares.
CDA (%)
MS PB EE EB
Ingredientes
GFAAS FAAS GFAAS FAAS GFAAS FAAS GFAAS FAAS
Levedura
67±2 65±2 89±4 87±3 84±3 83±3 69±2 68±3
Milho
69±2 67±2 91±4 89±3 85±2 86±2 73±3 74±3
Farelo de
soja
68±2 69±2 91±3 90±2 87±3 89±4 71±3 70±3
Farelo de
arroz
69±2 68±2 77±2 78±2 78±2 76±2 73±2 72±2
Média (%)
68,25 67,25 87,00 86,00 83,50 83,50 71,50 71,00
Índice de
Comparação
(%)
101,50 100,00 101,20 100,00 100,00 100,00 100,70 100,00
GFAAS: Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite. Cálculo baseado na % Cr
2
O
3
determinado pelo método proposto.
FAAS: Espectrometria de absorção atômica por chama. Cálculo baseado na % Cr
2
O
3
determinado por FAAS após mineralização das
amostras de rações e fezes de peixes
Comparando-se os valores dos coeficientes de digestibilidade aparente (CDA)
dos nutrientes presentes nos quatro tipos de ingredientes utilizados na dieta de alevinos
de Tilápia do Nilo, mostrados na Tabela 3, observa-se que os valores determinados
utilizando-se determinações da porcentagem de Cr
2
O
3
feitas pelo método proposto,
estão de acordo com os valores obtidos utilizando-se o método por FAAS após
mineralização das amostras de rações e fezes, método utilizado normalmente nos
estudos de digestibilidade em nutrição de peixes.
20-22
A média geral calculada, para os
quatro tipos de ingredientes, considerando-se o método por GFAAS apresenta-se de
acordo média geral calculada para esses ingredientes, em relação ao método por FAAS.
O índice médio de comparação do método proposto (GFAAS) com o método por
44
mineralização prévia das amostras (FAAS) foi de 100,85 %, o que reforça a
aplicabilidade do método proposto nesses estudos.
4. CONCLUSÕES
O método proposto de quantificação de Cr
2
O
3
utilizando-se amostras de rações e
fezes de peixes na forma de suspensões, para se estimar a disponibilidade aparente de
nutrientes de rações utilizadas em nutrição de peixes, obteve resultados equivalentes ao
método de quantificação por FAAS, método este que exige a mineralização das
amostras como etapa inicial. No entanto apresenta a vantagem de não gerar resíduos
tóxicos de dicromato, que podem comprometer a saúde da analista e contaminar o meio
ambiente. Além disso, como não exige a necessidade da mineralização das amostras, o
tempo das determinações analíticas em análises dentro da área de nutrição de peixes, é
reduzido consideravelmente, obtendo-se também limites de detecção (LOD) e de
quantificação (LOQ) da ordem de 0.80 μg L
-1
e 2.80 μg L
-1
respectivamente, o que
corresponde a 40 μg kg
-1
e 140 μg kg
-1
, utilizando-se somente 10 μL das suspensões de
amostras por determinação analítica. Os valores dos limites de detecção calculados para
o método proposto apresentaram-se cerca de 95 vezes menores do que os limites de
detecção calculada para a técnica FAAS.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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18. ALEIXO, P.C.; NOBREGA, J.A.; SANTOS JR., D.; MULLER, R.C.S.
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19. MINAMI, H.; YADA, M.; YOSHIDA, T.; ZHANG, Q.; INOUE, S.; ATSUYA, I.
Simultaneous direct determination of aluminum, calcium and iron in silicon carbide and
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47
20. FURUYA, W.M.; PEZZATO, L.E.; PEZZATO, A.C.; BARROS, M.M.;
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Zootecnia, v.30, n.4, p.1143-1149, 2001.
21. PEZZATO, L.E.; MIRANDA, E.C.; BARROS, M.M.; PINTO, L.G.Q.; FURUYA,
W.M.; PEZZATO, A.C. Digestibilidade aparente de ingredientes pela tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus). Revista Brasileira de Zootecnia, v.31, n.4, p.1595-1604,
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22. SA, M.V.C.; PEZZATO, L.E.; BARROS, M.M.; PADILHA, P.M. Optimum zinc
supplementation level in Nile tilapia (Oreochcromis niloticus) juveniles diets.
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48
Anexo II
Lista de abreviações
Cr
2
O
3
: Óxido de Crômio (III);
HNO
3
: Ácido Nítrico;
HClO
4
: Ácido Perclórico;
Cr
2
O
7
2-
: Íons Dicromato;
Pd(NO
3
)
2
: Nitrato de Paládio;
Pd
0
: Paládio Metálico;
FAAS: Espectrometria de absorção atômica por chama;
GFAAS: Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite;
RSD: Desvio padrão médio
LOD: Limite de Detecção do método; Definifo por: LOD =3σ/slope
LOQ: Limite de Quantificação do método; Definido por: LOQ =10σ/slope
CAPÍTULO- III
50
Determinação de selênio por GFAAS em suspensões de amostras de fezes de peixes
para estimativa da biodisponibilidade deste micronutriente em rações utilizadas
em piscicultura
Resumo
Neste presente trabalho um método simples, rápido e sensível é proposto para
determinação de selênio em amostras de fezes e rações de peixes por GFAAS
utilizando-se a introdução direta de suspensões das amostras no tubo de grafite do
espectrômetro. Os limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) calculados em
relação a 20 leituras do branco das suspensões (0,50 % m/v de fezes ou ração isentas de
selênio) foram de 0,63 e 2,20 μg L
-1
para as suspensões padrão de fezes e de 0,72 e 2,71
μg L
-1
para as suspensões padrão de ração. O método proposto foi aplicado em estudos
de biodisponibilidade de selênio em diferentes amostras de rações de peixes e
mostraram-se de acordo com os resultados obtidos utilizando-se amostras previamente
mineralizadas por digestões ácidas utilizando-se forno de microondas.
Palavras-chave: Suspensões de rações e fezes de peixe; GFAAS; Modificador químico;
Paládio metálico.
51
Determination of selenium by GFAAS in slurries of fish feces to estimate the
bioavailability of this micronutrient in feed used in pisciculture
Abstract
This paper presents a simple, fast and sensitive method to determine selenium in
samples of feces and of fish feed by GFAAS through the direct introduction of slurries
of the samples into the spectrometer’s graphite tube. The limits of detection (LOD) and
quantification (LOQ) calculated for 20 readings of the blank of the standard slurries
(0.50 % m/v of feces or feed devoid of selenium) were 0.63 and 2.20 μg L
-1
for the
standard feces slurries and 0.72 and 2.71 μg L
-1
for the standard feed slurries. The
proposed method was applied in studies of bioavailability of selenium in different fish
feeds and their results proved compatible with that obtained from samples mineralized
by acid digestion using microwave oven.
Keywords: Slurries samples; GFAAS; Metallic tungsten; Selenium determination.
52
1. INTRODUÇÃO
Os tecidos dos animais possuem elementos químicos em proporções e
quantidades variáveis. Assim, os minerais são componentes essenciais ao metabolismo,
refletindo na maior ou menor produtividade do animal.
1
Dois a cinco por cento do corpo
do animal é constituído pela fração mineral, que varia em função da espécie, da raça e
do próprio indivíduo.
1,2
Os minerais são classificados como macrominerais (minerais
que o organismo necessita em grandes quantidades) e microminerais (minerais que o
organismo necessita em menores quantidades). Dos elementos químicos presentes na
tabela periódica, 25 podem ser classificados como essenciais, no entanto, do ponto de
vista prático, podemos classificar os elementos essenciais em macroelementos, cálcio,
fósforo, magnésio, potássio, sódio, cloro e enxofre, e microelementos, ferro, iodo,
selênio, cobalto, manganês, zinco e cobre.
3
O selênio é um micronutriente essencial presente nos tecidos do corpo. É parte
integrante da enzima glutationa peroxidase que atua no citosol celular convertendo
peróxido de hidrogênio em compostos atóxicos, o nível de atividade dessa enzima no
fígado ou plasma é indicativo do suprimento de selênio do organismo.
4,5
Em peixes o
indicador bioquímico principal da deficiência do Se é similar ao observado nos
mamíferos e inclui a redução da atividade da glutationa peroxidase.
6-8
A glutationa
peroxidase atua junto com a vitamina E como antioxidante biológico, protegendo os
fosfolipídios insaturados de membranas celulares e subcelulares contra a ação danosa
dos peróxidos, e são capazes de prevenir a distrofia muscular nutricional.
9
A
proliferação de células B e a produção de anticorpos também são reduzidas na
deficiência de selênio.
10
Combinações de selênio também são capazes de proteger da
toxicidade de metais pesados como cádmio e mercúrio.
6
Na nutrição de peixes, o animal pode ingerir selênio da água e da dieta. Níveis
altos de selênio na água são tóxicos ao peixe, e podem acarretar em diminuição do
crescimento e levar à morte do peixe. Normalmente a concentração em água é menor
que 0,1 μg L
-1
, conseqüentemente a captação por brânquias é muito efetiva e o elemento
é armazenado em vários tecidos, na sua forma inorgânica, com exceção do fígado.
Selênio como selenito é capturado eficazmente pelas brânquias. Para selênio dietético
que é armazenado na forma orgânica, a margem entre a exigência nutricional e o limite
tóxico é muito estreito, o que dificulta a quantidade exata desse micronutriente a ser
53
adicionada na dieta do animal.
6
Vários fatores associados à quantidade de selênio dos
alimentos ou com outros alimentos em dietas misturadas podem afetar a
biodisponibilidade do elemento da dieta, influenciando a utilização da sua quantidade
ingerida nas fases de digestão/absorção, ou metabolismo/excreção.
5
A comparação de
dietas com composições fundamentalmente diferentes mostraram influência
significativa na utilização de suplementação com selenito de sódio.
11,12
O desenvolvimento de novas metodologias que permitam a quantificação segura
dos nutrientes metálicos que são colocados nas rações em baixas concentrações, como
por exemplo, o selênio, nos estudos de nutrição de peixes, torna-se fundamental. Neste
contexto, a determinação de analitos metálicos em suspensões por espectrometria de
absorção atômica em forno de grafite (GFAAS), apresenta-se como uma técnica
promissora.
13-15
Essa técnica proporciona diversas vantagens, como alta sensibilidade,
limites de detecção em níveis de ηg kg
-1
, utilização de pequenos volumes de amostra,
determinação de uma ampla variedade de elementos traços e, considerando-se que o
atomizador pode agir como um reator químico, tem-se a possibilidade de amostragem
sólida, o que elimina a etapa de decomposição prévia total da amostra.
15
Além disso, a
amostragem de sólidos na forma de suspensão apresenta vantagens sobre os
procedimentos de digestão convencionais, como redução no tempo de preparo da
amostra, diminuição nas perdas do analito por manipulação excessiva ou retenção sobre
produtos insolúveis, redução da possibilidade de contaminação da amostra e
principalmente a minimização da ação de ácidos perigosos ao analista.
13-15
Considerando o exposto, este trabalho descreve o desenvolvimento de um
método para determinação de selênio, em suspensões de amostras de rações e fezes de
peixes por GFAAS, de modo a eliminar a etapa de mineralização das amostras e
permitir a estimativa da disponibilidade desse micronutriente em amostras de rações
utilizadas na nutrição de peixes.
2. EXPERIMENTAL
2.1. Reagentes, soluções padrão e vidrarias
Água deionizada de alta pureza (18,2 MΩ cm
-1
) obtida por sistema Elga Ionic
(PURELAB Option, USA), HNO
3
suprapuro (Merck), H
2
O
2
(Merck) e Triton X-100
54
(Merck) foram utilizados em todo o trabalho. A solução de trabalho contendo W,
empregada no recobrimento interno do tubo de grafite e utilizada como modificador
permanente, foi preparado pela diluição apropriada com água ultrapura de uma solução
estoque contendo 1000 mg L
-1
de Na
2
WO
4
(Merck). Solução de Pd(II), utilizada
também como modificador químico, foi preparada nas mesmas condições, utilizando no
entanto Pd(NO
3
)
2
(Merck).
Soluções estoque dos analitos foram preparadas a partir de reagentes de pureza
espectroscópica (Johnson & Matthey, Royston, Hertfordshire, UK). As demais soluções
utilizadas, incluindo as soluções ácidas concentradas utilizadas nas mineralizações das
amostras, foram todas de grau analítico. Todas as soluções foram estocadas em frascos
de polipropileno.
Todos os frascos de estocagem de amostras e soluções padrão, vidrarias e os
copos do autoamostrador do espectrômetro de absorção atômica foram lavados com
HNO
3
10% v/v por 24 horas e em seguida enxaguados com água ultrapura e secos por
agitação antes da utilização.
2.2. Preparo das amostras
As amostras de fezes e rações de peixes após secagem a 50
o
C em estufa de
circulação forçada de ar por 48 horas, foram submetidas à moagem criogênica, em
moinho criogênico (SPEX – Freezer, modelo Mill 6750). Para isso, uma massa de
aproximadamente 1,0 g da amostra foi colocada em frasco de policarbonato juntamente
com a barra magnética, o qual devidamente fechado, foi imerso em nitrogênio líquido.
Pelo impacto entre a amostra e a barra magnética submetida a um campo magnético
oscilante (20 impactos s
-1
) a amostra foi pulverizada. O programa utilizado na moagem
das amostras compreendeu uma primeira etapa de 2 minutos para o pré-congelamento, 1
minuto de pulverização, novamente 1 minuto de congelamento, e uma segunda etapa
que compreendeu dois ciclos com dois estágios de pulverização e congelamento,
perfazendo um tempo total de 8 minutos. Este procedimento permitiu obter partículas
com granulometria menor que 60 μm.
16
Uma parte das amostras foi também mineralizada em forno de microondas
(Provecto Analítica – Campinas/SP, modelo DGT plus). Para isso, massas de 100 mg de
amostras moídas criogenicamente, foram transferidas diretamente para os frascos de
teflon do forno de microondas, adicionando-se em seguida 2,5 mL de HNO
3
suprapuro
55
14 mol L
-1
mais 0,50 mL de H
2
O
2
30% m/m. O programa de aquecimento utilizado foi o
proposto no manual do equipamento.
2.2.1. Preparo das suspensões das amostras
Após a moagem criogênica, 5 mg de amostras do material biológico (ração ou
fezes de peixes), foram transferidas diretamente para os copos do autoamostrador do
espectrômetro de absorção atômica e em seguida foram adicionados 5 μL HNO
3
suprapuro 14 mol L
-1
, 50 μL de Triton X-100 a 1% v/v, 100 μL de solução 1000 mg L
-1
de Pd(II) e 845 μL de água ultrapura. As amostras de suspensão dos materiais
biológicos foram em seguida agitadas por sonificação durante 40 segundos diretamente
nos copos do autoamostrador, empregando-se um Desruptor de células ultra-sônico
(UNIQUE).
2.3. Preparo do tubo de grafite recoberto internamente com tungstênio metálico
Os tubos de grafite pirolítico com plataforma integrada utilizados nas
determinações de selênio tiveram suas paredes internas recobertas com tungstênio
metálico. Para isso, alíquotas de 25 μL de solução contendo 1000 mg L
-1
do
modificador tungstato de sódio foi injetada dentro do atomizador, o qual em seguida foi
submetido às etapas do programa de aquecimento descrito na Tabela 1. Esse
procedimento foi repetido 20 vezes. Com aquecimento até 500
o
C o tungstênio
depositado sobre a parede do tubo de grafite, forma uma camada de W
0
que atua como
modificador químico.
17
A massa de W
0
depositado na plataforma do tubo de grafite foi
de 500 μg. Com esse tratamento foi possível utilizar o tubo de grafite em 572 queimas
de amostras.
56
Tabela 1. Programa de aquecimento utilizado para o recobrimento da parede interna do
tubo de grafite com tungstênio metálico (W
0
).
Estágios Etapa Temperatura
(
o
C)
Rampa (s) Aquecimento (s)
Fluxo de Argônio
(L min
-1
)
Secagem 110 10 25 0.30
Secagem 150 10 25 0.30
Redução 600 10 20 0.30
Redução 1200 10 20 0.30
Limpeza 2600 0 5 0.30
o
C: graus Celsius; s: segundo; L min
-1
: litros por minuto.
2.4. Preparo das curvas analíticas
Curvas analíticas foram preparadas utilizando-se suspensões de rações e de fezes
de peixes contendo 5, 10, 15, 20 e 25 μg L
-1
de selênio (Merck), sendo as leituras das
absorbâncias feitas por GFAAS. Essas suspensões padrão foram preparadas nas mesmas
condições descritas para o preparo das suspensões de amostras de ração e fezes,
utilizando, no entanto, 5 mg de amostra do material biológico isento de selênio. Desta
forma, no preparo das curvas analíticas, volumes de 10, 20, 30, 40 e 50 μL de solução
padrão contendo 500 μg L
-1
de selênio foram transferidos para os frascos do
autoamostrador do espectrômetro antes do volume final ser acertado para 1000 μL com
água ultrapura, de modo que a concentração final selênio nas suspensões ficassem na
faixa de 5 a 25 μg L
-1
. Soluções padrão contendo de 1 a 10 μg L
-1
de selênio em meio de
HNO
3
suprapuro 10% v/v, foram também utilizadas no preparo de curvas analíticas para
determinação de selênio nas amostras de fezes e rações mineralizadas por digestão ácida
utilizando forno de microondas.
2.5. Procedimentos analíticos
Após a etapa de sonificação da amostra de suspensão e/ou suspensão padrão,
feita diretamente nos copos do autoamostrador, um volume de 20 μL de padrão ou
amostra foi injetado no tubo de grafite (recoberto internamente com tungstênio
metálico) pela micropipeta do autoamostrador. As medidas foram feitas com cinco
57
repetições. O programa de aquecimento do tubo de grafite otimizado para determinação
de selênio encontra-se descrito na Tabela 2.
Tabela 2. Programa de aquecimento do tubo de grafite otimizado para determinação de
selênio em suspensões de amostras de fezes e rações.
Estágios
Etapas
Temperatura
(
o
C)
Rampa (s) Aquecimento (s)
Fluxo de Argônio
(L min
-1
)
Secagem 90 10 0 1
Secagem 150 10 5 1
Secagem 250 10 5 1
Pirólise 1400 10 20 1
Pirólise 1400 5 10 1
Atomização 2400 1 5 0
Limpeza 2800 5 0 1
o
C: graus Celsius; s: segundo; L min
-1
: litros por minuto.
Para determinação de selênio foi utilizado espectrômetro de absorção atômica
(SHIMADZU modelo AA-6800), equipado com corretor de absorção de fundo com
lâmpada de deutério e sistema self-reverse (SR), tubo de grafite pirolítico com
plataforma integrada e amostrador automático (ASC-6100). Foi utilizada lâmpada de
cátodo oco de selênio SHIMADZU, operada com 10 mA de corrente. O comprimento
de onda utilizado foi de 196,0 nm e a resolução espectral foi de 0,5 nm. Argônio foi
utilizado como gás inerte, mantendo-se um fluxo constante de 1 L min
-1
durante todo o
programa de aquecimento, exceto na etapa de atomização, na qual o fluxo de gás foi
interrompido. Os sinais de absorbância foram medidos em área de pico.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Otimização das condições instrumentais
A otimização das temperaturas de pirólise da amostras e de atomização do
analito é de fundamental importância para obtenção de resultados analíticos exatos e
reprodutivos em determinações de metais por GFAAS utilizando-se a técnica de
58
amostragem em suspensão. Dessa forma, curvas de pirólise e de atomização foram
feitas para se determinar às temperaturas ótimas de pirólise e atomização do Se em
suspensões padrão de rações e fezes de peixes que continham 10 μg L
-1
de Se e 100 mg
L
-1
de Pd(II), utilizando-se tubo de grafite recoberto internamente com W
0
, que atou
como modificador permanente e as condições de preparo das amostras descritas no item
2.2. A influência da temperaturas de pirólise e atomização sobre sinal de absorbância
obtido para o Se nas suspensões padrão dos materiais biológicos, são mostradas nas
Figuras 1 e 2.
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
b -
a -
b
a
Suspensões padrão de ração
Suspensões padrão de fezes
Absorbância
Temperatura de pirólise /
o
C
Figura 1. Curvas de temperatura de pirólise das suspensões de amostras de fezes e ração
contendo 10 μg L
-1
de analito
.
59
1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
b -
a -
b
a
Suspensões padrão de ração
Suspensões padrão de fezes
Absorbância
Temperatura de atomização /
o
C
Figura 2. Curvas de temperatura de atomização do Se nas suspensões de amostras de
fezes e ração contendo 10 μg L
-1
do analito.
A temperatura de pirólise de 1400
o
C foi escolhida, conforme mostra a Figura 1,
porque os sinais de absorbância obtidos para o Se permanecem constantes a partir de
600
o
C, sofrendo um rápido decréscimo a partir de 1400
o
C, dessa forma, todos os
demais experimentos foram feitos utilizando-se essa temperatura na etapa de pirólise.
Em relação à temperatura de atomização (Figura 2), observa-se que os sinais de
absorbância obtidos para o Se são constantes a partir de 2100
o
C para ambas as
suspensões padrão, dessa forma, a temperatura de atomização de 2400
o
C foi
selecionada para todos os demais experimentos.
Nas Figuras 3 e 4, são mostrados os sinais de absorbância do analito (AA) e de
absorção de fundo (BG) para as suspensões padrão dos materiais biológicos. Um sinal
de absorção de fundo relativamente baixo pode ser observado em ambas as Figuras.
Estes baixos sinais de absorção de fundo demonstram a eficiência do modificador
químico Pd(II) co-injetado junto com a amostra e do W
0
que atuou como modificador
químico permanente. Como os materiais biológicos em estudo apresentam teores de
magnésio em torno de 0,12 %, esse elemento presente na matriz pode também auxiliar
na estabilização térmica do selênio.
16,18
60
0123456
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
AA
BG
Absorbância
Tempo / s
Figura 3. Sinais transientes de absorção atômica (AA) e de fundo (BG) na atomização
de Se nas suspensões de amostras de fezes contendo 10 μg L
-1
de analito.
0123456
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
AA
BG
Absorbância
Tempo / s
Figura 4. Sinais transientes de absorção atômica (AA) e de fundo (BG) na atomização
de Se nas suspensões de amostras de ração contendo 10 μg L
-1
de analito.
61
3.2. Determinação do tempo ótimo de sonificação das suspensões das amostras
A agitação ultra-sônica para análise de suspensões de materiais sólidos garante
uma boa homogeneização da amostra, o que permite obter melhor reprodutibilidade
entre as medidas.
19
Dessa forma, o tempo de sonificação das amostras foi avaliado no
intervalo de 5 a 60 s de agitação. Na Figura 5 é mostrada a influência do tempo de
sonificação das amostras sobre os sinais de absorbância obtidos para o Se. Analisando-
se a Figura 5, observa-se que os sinais de absorbância permanecem constantes a partir
de 20 s de sonificação. O tempo de sonificação de 40 s considerado ótimo, pois além de
se obter um bom sinal de absorbância, o RSD entre as medidas foi relativamente baixo
(2,7%).
0 10203040506070
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
b -
a -
b
a
Suspensões padrão de ração
Suspensões padrão de fezes
Absorbância
Tempo de sonificação / s
Figura 5. Influência do tempo de ultrasonificação sobre o sinal de absorbância do Se nas
suspensões padrão de fezes e ração de peixe contendo 10 μg L
-1
de analito.
3.3. Obtenção das curvas analíticas
Considerando-se os parâmetros físico-químicos otimizados (temperatura de
pirólise e atomização e o perfil de sinal de absorção atômica), curvas analíticas foram
construídas utilizando-se suspensões padrão de fezes e ração de peixe contendo Se na
62
faixa de concentração de 5 - 25 μg L
-1
(conforme descrito no
item 2.5). A Figura 6
mostra as curvas analíticas obtidas com as suas respectivas equações das retas.
Comparando-se a curva analítica preparada com fezes de peixes com a preparada com
rações de peixe, observa-se que estas não apresentam diferenças significativas nas
inclinações (k = 0.0052 para a curva de fezes e k = 0.0042 para a curva de ração).
5 1015202530
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
b
a
b-Suspensão Padrão de Rações
A=0,0013 + 0,0042C
Se
r = 0,9999
a-Suspensão Padrão de Fezes
A=0,0018 + 0,0052C
Se
r = 0,9999
Absorbância
Concentração/ug L
-1
Figura 6. Curvas analíticas obtidas a partir de suspensões padrão de fezes e rações de
peixes contendo 5, 10, 15, 20e 25 μg L
-1
de Se.
Ambas as curvas analíticas, apresentaram valores de absorbância cerca de 5-10
% menores que os valores da curva analítica obtida a partir das soluções padrão
preparadas na faixa de concentração de 1 – 10 µg L
-1
de Se em meio de HNO
3
suprapuro a10% v/v
(Equação da reta: A = 0,0038 + 0,0017k). Entretanto, a
sensibilidade do método proposto é maior, porque as inclinações das retas obtidas para
as suspensões padrão são cerca de 5 vezes maiores que as inclinações das curvas obtidas
em meio de HNO
3
a 5 % v/v. Este fato que reforça a eficiência da temperatura nas
etapas de pirólise e atomização do programa de aquecimento utilizado. Um dos
problemas que pode ocorrer na etapa de pirólise, quando se utiliza suspensão de
amostras, é o acúmulo de resíduos carbonáceos no interior do tubo de grafite, que
63
provoca a obstrução parcial da radiação proveniente da lâmpada de catodo oco, o que
pode prejudicar as medidas de absorbância.
18
No entanto, os possíveis resíduos de
carvão remanescente da etapa de pirólise não comprometeram as medidas de
absorbância, considerando os baixos sinais de fundo (BG) obtidos na etapa de
otimização do selênio no procedimento proposto.
As massas características calculadas em relação à suspensão padrão de 8 μg L
-1
de Se foram de 34 e 53 pg para a suspensão padrão de fezes e ração, respectivamente
.
O
limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) foram calculados
considerando o desvio padrão de 20 leituras obtidas em relação ao branco das
suspensões padrão e as inclinações das curvas analíticas (LOD =3σ/slope e LOQ
=10σ/slope). Esses valores foram de 0,63 e 2,20 μg L
-1
de
Se, o que corresponde a 2,52
e 8,80 μg kg
-1
,
para as suspensões
padrão de fezes e de 0,72 e 2,71 μg L
-1
de
Se,
o que
corresponde a 2,90 e 10,84 μg kg
-1
,
para as suspensões padrão de ração.
16
A
comparação entre os valores do limites de detecção obtidos pelo método proposto com
os valores obtidos por GFAAS utilizando padrões aquosos (0.70 μg L
-1
of Se),
mostraram-se equivalentes. A porcentagem de recuperação obtida foi de 97±4 para o
padrão de suspensão de fezes e 98±3 para o padrão de suspensão de ração. Os resultados
obtidos demonstram que o método proposto apresenta precisão aceitável. O tempo de
vida útil do tubo de grafite foi equivalente a 572 queimas. Considerando-se a
complexidade das matrizes biológicas, a vida útil do tubo obtida para o método proposto
é aceitável quando comparada com outros métodos descritos na literatura.
16,18
3.4. Aplicação do método proposto
Após os procedimentos de otimização, determinação do LOD e LOQ, a
aplicabilidade do método desenvolvido foi testada na determinação de selênio
de
quatro
amostras de rações contendo diferentes suplementos alimentares utilizadas na dieta de
alevinos de Tilápia do Nilo e em amostras de fezes dessa espécie de peixe. Com base
nos valores da determinação da porcentagem de Cr
2
O
3
20
(marcador biológico utilizado
em estudos de digestibilidade/biodisponibilidade de nutriente na nutrição animal) e de
Se nas amostras de rações e fezes dos animais em estudo, foi calculada a estimativa do
coeficiente de biodisponibilidade aparente deste micronutriente na dieta dos alevinos de
tilápia do Nilo, utilizando-se a equação 1:
10
64
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
×
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−=
%Ser
%Sef
fO%Cr
rO%Cr
100100Da
32
32
Equação 1
onde:
Da = Biodisponibilidade aparente de Selênio;
%Cr
2
O
3
r = Porcentagem de óxido de crômio na ração;
%Cr
2
O
3
f
= Porcentagem de óxido de crômio nas fezes;
%Ser
= Porcentagem de Se na ração;
%Sef
= Porcentagem de Se nas fezes.
A Tabela 3 mostra os valores dos coeficientes de biodisponibilidade aparente
calculados utilizando-se os resultados das determinações de selênio pelo método
proposto e por GFAAS após mineralização prévia das amostras em forno de
microondas.
Tabela 3. Coeficiente de biodisponibilidade de Se de alevinos de Tilápia do Nilo
alimentados com diferentes suplementos alimentares.
Coeficiente de Biodisponibilidade de Selênio (%) Ingredientes
GFAAS
*
GFAAS
#
Levedura
61±2 63±2
Milho
60±4 63±3
Farelo de soja
62±2 64±2
Farelo de arroz
63±3 65±3
Média (%) 61,50 63,75
Índice de comparação (%) 96,50 100
*Cálculo baseado na % Se
determinado pelo método proposto
# Cálculo baseado na % Se
determinado por GFAAS após mineralização das amostras em forno de microondas
A comparação dos valores dos coeficientes de biodisponibilidade aparente de
selênio presentes nos quatro tipos de ingredientes utilizados na dieta de alevinos de
Tilápia do Nilo, mostrados na Tabela 3, indica que os valores determinados utilizando-
se determinações de Se feitas pelo método proposto, estão de acordo com os valores
obtidos utilizando-se o método por GFAAS após mineralização das amostras de rações
65
e fezes em forno de microondas, método utilizado normalmente nos estudos de
digestibilidade em nutrição de peixes.
21-23
A média geral calculada, para os quatro tipos
de ingredientes, considerando-se o método proposto apresenta-se de acordo média geral
calculada para esses ingredientes, em relação ao método por GFAAS após
mineralização das amostras. O índice médio de comparação do método proposto com o
método por mineralização prévia das amostras foi de 96,50 %, o que reforça a
aplicabilidade do método proposto nesses estudos.
4. CONCLUSÕES
O método proposto de quantificação de Se
utilizando-se amostras de rações e
fezes de peixes na forma de suspensões, para se estimar a biodisponibilidade aparente
desse micronutriente de rações utilizadas em nutrição de peixes, obteve resultados
equivalentes ao método de quantificação por GFAAS, método este que exige a
mineralização das amostras em forno de microondas como etapa inicial. No entanto
apresenta a vantagem de não gerar resíduos tóxicos que podem comprometer a saúde da
analista e contaminar o meio ambiente. Além disso, como não exige a necessidade da
mineralização das amostras, o tempo das determinações analíticas, é reduzido
consideravelmente. Destacam-se também, os limites de detecção (LOD) e de
quantificação (LOQ) obtidos, da ordem de 0,63 μg L
-1
e 2,71 μg L
-1
respectivamente, o
que corresponde a 2,52 μg kg
-1
e 10,54 μg kg
-1
, utilizando-se somente 20 μL das
suspensões de amostras por determinação analítica. Os valores dos limites de detecção
calculados para o método proposto são equivalentes aos limites de detecção calculados
para a técnica GFAAS utilizando padrões aquosos de Se.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Academic Press, 1992. p.1-18.
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York: Alan R. Liss, New York, 1992. 125p.
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Academic Press, 1987. 480p.
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Press, 1986, 180p.
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biochemical deficiency signs. Journal of Nutrition, v.106, n.7, p.892–904, 1976.
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10. COMBS, G.F.; LIU, C.H.; LU, Z.H.; SU Q. Uncomplicated selenium deficiency
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976, 1984.
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arsenic and cadmium. Journal of Nutrition, v.77, n.2, p.210-218, 1962.
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and Nutrition. New York: Academic Press, 1964.
67
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489, mar. 1993.
14. BENDICHO. C.; LOOS-VOLLEBREGT, M. T. C. Solid sampling in electrothermal
atomic absorption using commercial atomizes. Journal of Analytical Atomic
Spectrometry, v.6, n.5, p.353-374, aug. 1991.
15. LIANG, Y.Z.; LI, M.; RAO, Z. Nickel and strontium nitrates as modifier for
determination of selenium in urine by zeeman platform graphite-furnace atomic
absorption spectrometry. Analytical Science, v.12, n.4, p.629-633, aug.1996
16. ROSA, C.R.; MORAES, M.; NETO, J.A.G.: NOBREGA, J.A.; NOGUEIRA, A.R.
Effect of modifiers on thermal behaviour of Se in acid digestates and slurry of
vegetables by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Food Chemistry, v.79,
n.4, p.517-523. 2002.
17. FISCHER; J.L., RADEMEYER, C.J. Kinetics selenium atomization in
electrothermal atomization atomic absorption spectrometry (ETA-AAS) Part 2:
selenium with palladium modifiers. Spectrochimica Acta Part B: Atomic
Spectroscopy, v.53, n.4, p.549-567, apr.1998.
18. ALEIXO, P.C.; NOBREGA, J.A.; SANTOS JR., D.; MULLER, R.C.S.
Determinação de selênio em água de coco e em leite de coco utilizando espectrometria
de absorção atômica com atomização em forno de grafite. Química Nova, v.23, n.3, p.
310-312, jun.2000.
19. MINAMI, H.; YADA, M.; YOSHIDA, T.; ZHANG, Q.; INOUE, S.; ATSUYA, I.
Simultaneous direct determination of aluminum, calcium and iron in silicon carbide and
silicon nitride powders by slurry-sampling graphite furnace AAS. Analytical Sciences,
v.20, n.3, p.455-459, 2004.
20. SILVA, F.A.; PADILHA, C.C.F.; PEZZATO, L.E.; BARROS, M.M.; PADILHA,
P.M. Determination of chromium by GFAAS in slurries of fish feces to estimate the
68
apparent digestibility of nutrients in feed used in pisciculture. Talanta, v.69, p.1025-
1030, 2006.
21. FURUYA, W.M.; PEZZATO, L.E.; PEZZATO, A.C.; BARROS, M.M.;
MIRANDA, E.C. Coeficiente de digestibilidade e valores de aminoácidos digestíveis de
alguns ingredientes para tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Revista Brasileira de
Zootecnia, v.30, n.4, p.1143-1149, 2001.
22. PEZZATO, L.E.; MIRANDA, E.C.; BARROS, M.M.; PINTO, L.G.Q.; FURUYA,
W.M.; PEZZATO, A.C. Digestibilidade aparente de ingredientes pela tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus). Revista Brasileira de Zootecnia, v.31, n.4, p.1595-1604,
2002.
23. SA, M.V.C.; PEZZATO, L.E.; BARROS, M.M.; PADILHA, P.M. Optimum zinc
supplementation level in Nile tilapia (Oreochcromis niloticus) juveniles diets.
Aquaculture, v.238, n.1-4, p.385-401, 2004.
69
Anexo III
Lista de abreviações
Se: Selênio
HNO
3
: Ácido Nítrico;
H
2
O
2
: Peróxido de Hidrogênio;
W: Tungstênio
Na
2
WO
4
: Tungastato de Sódio
Pd(NO
3
)
2
: Nitrato de Paládio;
GFAAS: Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite;
RSD: Desvio padrão médio
LOD: Limite de Detecção do método; Definifo por: LOD =3σ/slope
LOQ: Limite de Quantificação do método; Definido por: LOQ =10σ/slope
CAPÍTULO- IV
71
IMPLICAÇÕES
Para se avaliar o potencial de inclusão de um nutriente da dieta são feitos os
chamados “estudos de digestibilidade”. Estes estudos utilizam como marcador o óxido
de crômio (III). Para se determinar um nutriente metálico em estudo é necessário
determinar também o percentual do marcador nas fezes e na dieta. Estas determinações,
tanto para o nutriente metálico quanto para o crômio, apresentam alguns problemas no
preparo das amostras. Normalmente, é feita a mineralização nítrica-perclórica por
aquecimento lento em blocos digestores, que além de demorada e perigosa ao analista,
tem o inconveniente de oxidar o crômio (III) a crômio (VI), espécie altamente tóxica.
Os resultados obtidos neste trabalho permitem as seguintes implicações:
a) O novo método proposto para determinação de óxido de crômio por
espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) em amostras de fezes
e rações de peixes pode ser usado como uma nova metodologia para determinação deste
composto. Por não ser necessária a mineralização nítrica-perclórica das amostras tem-
se: a diminuição da contaminação do ambiente, por não produzir crômio (VI), como
resíduo tóxico; a eliminação do efeito de ácidos perigosos ao analista; além é claro de
uma considerável diminuição no tempo de análise.
b) O novo método proposto para determinação de selênio por espectrometria de
absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) em amostras de fezes e rações de peixes
pode ser usado como uma nova metodologia para análise deste micronutriente. Por não
ser necessária a mineralização nítrica-perclórica das amostras a possível perda do
selênio por volatilização é eliminada, além é claro de uma considerável diminuição no
tempo de análise.
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