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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
AVALIAÇÃO DA BASE GENÉTICA DE GENÓTIPOS DE SOJA
RESISTENTES AO NEMATÓIDE DE CISTO (RAÇA 3) POR
MARCADORES MICROSSATÉLITES
Daniela Garcia Penha Sarti
Bióloga
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
2007
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Milhares de livros grátis para download.
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
AVALIAÇÃO DA BASE GENÉTICA DE GENÓTIPOS DE SOJA
RESISTENTES AO NEMATÓIDE DE CISTO (RAÇA 3) POR
MARCADORES MICROSSATÉLITES
Daniela Garcia Penha Sarti
Orientador: Prof. Dr. Antonio Orlando Di Mauro
Co-orientadores: Dra. Sandra Helena Unêda-Trevisoli
Prof. Dr. José Baldin Pinheiro
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de
Jaboticabal, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Agronomia
(Genética e Melhoramento de Plantas).
Jaboticabal - SP
Julho de 2007
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DADOS CURRICULARES DA AUTORA
DANIELA GARCIA PENHA SARTI – Nasceu em 08 de novembro de 1981,
no município de Orlândia- São Paulo. Em março de 2003 concluiu a graduação em
Ciências Biológicas, modalidade Licenciatura, pela Universidade Estadual
Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio
Preto – São Paulo. Em julho de 2005, obteve o título de Bacharel em Ciências
Biológicas pela Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas de São José do Rio Preto – São Paulo, realizando estágio
curricular para Monografia no Programa de Melhoramento Genético da Soja do
Departamento de Produção Vegetal da Universidade Estadual Paulista, Faculdade
de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal – São Paulo. Obteve o Título
de Mestre em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) em 29 de junho
de 2007, pela Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias de Jaboticabal – São Paulo.
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Aos meus avós
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À nossa prima
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DEDICO
Aos meus pais
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Ao meu irmão
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OFEREÇO
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AGRADECIMENTOS
À Deus,
À Universidade Estadual Paulista - UNESP/FCAV - Câmpus de Jaboticabal, pela
oportunidade oferecida de desenvolver este trabalho.
À CAPES, pelo apoio financeiro no projeto.
Ao Prof. Dr. Antônio Orlando Di Mauro, pela orientação e confiança.
À Dra. Sandra Helena Unêda-Trevisoli, pela co-orientação, pela amizade, atenção
e ensinamentos proporcionados.
Ao Prof. Dr. José Baldin Pinheiro pela co-orientação, por valiosas contribuições e
trocas de informações.
A todos os professores da FCAV/UNESP pelo companheirismo e grande
sabedoria, em especial aos Professores Alberto Cargnelutti Filho, Maria Aparecida
Pessôa da Cruz Centurion, João Carlos de Oliveira, Domingos Fornasieri Filho,
Rinaldo César de Paula, Dilermando Perecin, Rubens Sader e Manoel Victor
Franco Lemos.
Aos amigos-irmãos Daniela Abreu, Marcelo Marchi, Cláudia Demétrio e Melina
Mancini, pelo apoio, conselhos e, acima de tudo, amizade verdadeira.
Aos amigos Ivana Bárbaro, Lizandra Catelli, Franco Muniz, Gustavo Silveira,
Antonio Morceli, Thaiza Morceli e Nair Arriel, pela amizade e incentivo em uma
nova fase em minha vida, de aprendizado e crescimento.
7
Ao Júlio Quierati, pelo bom humor e companheirismo.
Ao Wellington Zanni e todos os estagiários e amigos de Pós-Graduação, pela
ajuda na condução dos experimentos, pela confiança e apoio.
Aos funcionários do Departamento de Produção Vegetal da FCAV/UNESP: Mauro,
Nice, Luís, Rubens, Osmar, Sebastião, Gabi, Marisa, Mariângela e, especialmente
Geraldo, por além da amizade, o auxílio fundamental na condução do
experimento.
Aos queridos amigos do IBILCE, em especial à Joana, Flávia, Cristiane, Ana
Flávia, Sabrina, Marquito, Otávio, Gustavo e Renato, por todos os momentos
inesquecíveis que passamos juntos.
Às amigas de sempre Susana, Roberta, Flávia, Maísa, Ana Clara, Thaís e Mariela,
pelo incentivo, carinho e por fazerem parte de todas as minhas boas lembranças.
A toda minha família, meus pais Tânia e Zito, meu irmão Bruno, vó Elza, Ângela,
meus adorados vô Celé e vó Quininha, pela força e confiança, me ajudando a
ultrapassar os obstáculos e viver sempre com otimismo.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho.
vii
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS............................................................................
ix
LISTA DE FIGURAS............................................................................
xi
RESUMO............................................................................................. xiv
SUMMARY.......................................................................................... xvi
1. INTRODUÇÃO.................................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 4
2.1. A Soja............................................................................................
4
2.2. Importância Econômica.................................................................
5
2.3. Nematóide de Cisto da Soja..........................................................
6
2.4. Genética da Resistência da Soja ao Nematóide de Cisto............ 8
2.5. Marcadores Moleculares............................................................... 11
2.6. Divergência Genética.................................................................... 14
2.6.1. Análise de agrupamento...................................................... 17
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 21
3.1. Local de Condução do Experimento............................................. 21
viii
3.2. Identificação e Coleta do Material................................................. 21
3.3. Atividades em Laboratório.............................................................
23
3.3.1. Extração de DNA................................................................. 23
3.3.2. Identificação de marcadores SSR....................................... 24
3.3.3. Reações de PCR e visualização dos resultados................. 24
3.3.4. Montagem da matriz de dissimilaridade.............................. 26
3.4. Análises Estatísticas..................................................................... 27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................
29
4.1. Coeficientes de Similaridade por Coincidência Simples............... 32
4.2. Coeficientes de Similariadade por Rogers e Tanimoto................. 50
4.3. Correlação entre Matrizes............................................................. 70
4.4. Considerações Finais....................................................................
70
5. CONCLUSÕES....................................................................................
73
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................... 74
ix
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Cultivares e genótipos F8 de soja resistentes ao NCS,
utilizados no estudo de divergência genética, com suas respectivas
fontes de resistência....................................................................................
22
Tabela 2. Grupo de ligação, seqüência e número de alelos encontrados
para os 12 marcadores SSR utilizados nas análises dos 40 genótipos de
soja...............................................................................................................
25
Tabela 3. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através do complemento
aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples.....................................
33
Tabela 4. Formação de grupos pelo método de otimização de Tocher,
utilizando a dissimilaridade através do complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples dos 40 genótipos de soja
resistentes ao NCS .....................................................................................
37
Tabela 5. Dez genótipos mais similares, em ordem decrescente, em
relação a cada um dos 40 genótipos estudados com fonte de resistência
ao nematóide de cisto da soja, através do complemento aritmético do
Coeficiente de Similaridade de Coincidência Simples.................................
51
Tabela 6. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através do complemento
aritmético do Coeficiente de Similaridade de Rogers e Tanimoto...............
52
Tabela 7. Formação de grupos através do método de otimização de
Tocher, utilizando complemento aritmético do Coeficiente de Rogers e
x
Tanimoto dos 40 genótipos de soja resistentes ao NCS
estudados.....................................................................................................
57
Tabela 8. Dez genótipos mais similares, em ordem decrescente, em
relação a cada um dos 40 genótipos estudados com fonte de resistência
ao nematóide de cisto da soja, através do complemento aritmético do
Coeficiente de Rogers e Tanimoto...............................................................
69
xi
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Amostras dos fragmentos produzidos nas reações de
amplificação dos 40 genótipos de soja utilizando o iniciador
Satt308......................................................................................................... 29
Figura 2. Amostras dos fragmentos produzidos nas reações de
amplificação dos 40 genótipos de soja utilizando o iniciador
Satt152......................................................................................................... 30
Figura 3. Amostras dos fragmentos produzidos nas reações de
amplificação dos 40 genótipos de soja utilizando o iniciador
Satt154......................................................................................................... 31
Figura 4. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ligação Simples – Vizinho Mais Próximo, a partir do complemento
aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples..................................... 41
Figura 5. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ligação Completa – Vizinho Mais Distante, a partir do complemento
aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples..................................... 42
Figura 6. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ward, a partir do complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência
Simples.........................................................................................................
43
Figura 7. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ligação Média dentro do grupo, a partir do complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples...........................................................
44
Figura 8. Representação do dendrograma obtido através do Método
xii
UPGMA, a partir do complemento aritmético do Coeficiente de
Coincidência Simples...................................................................................
45
Figura 9. Representação do dendrograma obtido através do Método da
Mediana - WPGMA, a partir do complemento aritmético do Coeficiente de
Coincidência Simples................................................................................... 46
Figura 10. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao NCS, expressa pelo complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples, no espaço bidimensional................. 47
Figura 11. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao NCS, expressa pelo complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples, no espaço tridimensional (3D com
rotação)........................................................................................................
48
Figura 12. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao NCS, expressa pelo complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples, no espaço tridimensional (3D sem
rotação)........................................................................................................
49
Figura 13. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ligação Simples – Vizinho Mais Próximo, a partir do complemento
aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.........................................
60
Figura 14. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ligação Completa - Vizinho mais Distante, a partir do complemento
aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.........................................
61
Figura 15. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ward, a partir do complemento aritmético do Coeficiente de Rogers e
Tanimoto.......................................................................................................
62
xiii
Figura 16. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Ligação Média Dentro de Grupo, a partir do complemento aritmético do
Coeficiente de Rogers e Tanimoto...............................................................
63
Figura 17. Representação do dendrograma obtido através do Método de
Agrupamento UPGMA, a partir do complemento aritmético do Coeficiente
de Rogers e Tanimoto.................................................................................. 64
Figura 18. Representação do dendrograma obtido pelo Método da
Mediana - WPGMA, a partir do complemento aritmético do Coeficiente de
Rogers e Tanimoto....................................................................................... 65
Figura 19. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao NCS, expressa pelo complemento aritmético do
Coeficiente de Rogers e Tanimoto, no espaço bidimensional.....................
66
Figura 20. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao NCS, expressa pelo complemento aritmético do
Coeficiente de Rogers e Tanimoto, no espaço tridimensional (3D com
rotação)........................................................................................................
67
Figura 21. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja
resistentes ao NCS, expressa pelo complemento aritmético do
Coeficiente de Rogers e Tanimoto, no espaço tridimensional (3D sem
rotação)........................................................................................................ 68
Figura 22. Correlação entre as matrizes de dissimilaridade de Rogers e
Tanimoto e de Coincidência Simples...........................................................
71
xiv
AVALIAÇÃO DA BASE GENÉTICA DE GENÓTIPOS DE SOJA RESISTENTES
AO NEMATÓIDE DE CISTO (RAÇA 3) POR MARCADORES
MICROSSATÉLITES
RESUMO - O presente trabalho objetivou a avaliação da divergência
genética entre linhagens e cultivares de soja com resistência ao nematóide de
cisto (NCS) através de marcadores moleculares do tipo microssatélite, a fim de
identificar genótipos similares e grupos heterogêneos. Foram utilizadas 30
cultivares de soja e 10 genótipos em geração F8, todos resistentes ao NCS. As
análises foram realizadas com 12 iniciadores, a saber: Satt185, Satt308, Satt187,
Satt070, Satt009, Satt129, Satt154, Satt152, Satt175, Satt045, Satt162 e Satt163.
As análises de dissimilaridade foram realizadas através do complemento dos
coeficientes de Coincidência Simples e de Rogers e Tanimoto. Os agrupamentos
foram realizados pelos Métodos de Otimização de Tocher, Vizinho mais Próximo,
Vizinho mais Distante, Ward, Ligação Média Dentro de Grupo, UPGMA e
WPGMA. Em adição, foram feitas as projeções no plano bi e tridimensional. Os
resultados mostraram coeficientes de dissimilaridade de Coincidência Simples e
de Rogers e Tanimoto com médias de 0,36 e 0,5, respectivamente. Foram
observados genótipos mais semelhantes e grupos mais divergentes, na maioria
das vezes concordando com as respectivas fontes de resistência. Os resultados
dos diferentes métodos aglomerativos confirmaram a existência de uma estrutura
natural de agrupamento em função da similaridade genética entre os genótipos.
Entretanto, o emprego de mais de um método de agrupamento pode ser
recomendado devido às diferenças entre as metodologias. Alguns métodos mais
comumente utilizados como o Vizinho Mais Distante, Ward, WPGMA e UPGMA
foram considerados adequados ao agrupamento de genótipos no presente estudo,
apresentando coincidência de resultados, inclusive em relação às genealogias dos
genótipos analisados. As projeções no plano não mostraram resultados
xv
satisfatórios, com elevada distorção e estresse. A combinação de resultados pode
ser útil na escolha de parentais de soja para cruzamentos com fonte de resistência
ao NCS, dando continuidade ao Programa de Melhoramento da Soja.
xvi
EVALUATION OF GENETIC BASIS OF SOYBEAN GENOTYPES RESISTANT
TO CYST NEMATODE (RACE 3) BY MICROSATELLITE MARKERS
SUMMARY – The present work aimed the evaluation of the genetic
divergence among soybean lines and cultivars, resistant to cyst nematode (NCS).
Therefore microsatellite molecular markers were used, with the objective of identify
similar genotypes and heterogeneous groups. There were used 30 soybean
cultivars and 10 genotypes in F8 generation, all of them resistant to NCS. The
analyses were made using 20 primers (Satt185, Satt308, Satt187, Satt070,
Satt009, Satt129, Satt154, Satt152, Satt175, Satt045, Satt162 and Satt163). The
dissimilarity analyses were made through the complement of Simple Coincidence
and Rogers and Tanimoto Coefficients. Clusters were performed by the following
methods: Tocher Optimization, Single Linkage, Complete Linkage, Ward, Average
Link Within a Group, UPGMA and WPGMA. In addition, the bi and tridimensional
plan projections were made. The results showed average values of 0,36 and 0,5 in
the Simple Coincidence and Rogers and Tanimoto dissimilarity coefficients,
respectively. Most similar genotypes and most divergent groups were found,
usually according to the respective resistant sources. Results of the different
cluster methods confirmed a group’s structure according to genotypes similarity.
However, the use of many clustering methods should be recommended, because
of their methodology differences. Some of the most used methods, like Complete
Linkage, Ward, WPGMA and UPGMA, were considered adequate for clustering the
genotypes in this case. There were observed coincidence of results confirming the
genotypes genealogies. The plan projections were not satisfactory for these
analyses, showing high distortion and stress. The results combination can be
useful in the parental choice for crosses of Soybean Breeding Programs.
1
1. INTRODUÇÃO
A soja (Glycine max (L.) Merrill) é uma espécie vegetal originária de clima
temperado, com ampla adaptação nos climas subtropicais e tropicais. É considerada
uma das mais importantes leguminosas, que pode crescer em quase todas as latitudes
nas quais as sementes são cultivadas, sendo grande geradora de divisas aos países
produtores (BLACK, 2000).
Segundo a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), os maiores
produtores e exportadores de soja no mundo são os Estados Unidos com cerca de 86
milhões de toneladas, vindo a seguir o Brasil com 58 milhões de toneladas na safra
2006/07 (CONAB, 2007). A produção mundial concentra-se entre Estados Unidos,
Brasil, Argentina e China, que respondem por cerca de 90% da produção total (BLACK,
2000). A produtividade média das principais regiões produtoras, no Brasil, está
estimada em 2809 kg/ha, com algumas regiões do centro-oeste brasileiro podendo
ultrapassar 3000 kg/ha (CONAB, 2007).
Entretanto, existem fatores que limitam a obtenção de maiores rendimentos da
soja, entre eles estão mais de 100 tipos de doenças e, dentre essas, ao menos 35 são
de considerável importância econômica (YORINORI, 1994).
O nematóide de cisto da soja (NCS), Heterodera glycines, representa um dos
principais problemas da soja no mundo. Tal cultura é hospedeira preferencial deste
patógeno, que possui sua grande severidade aliada ao número de raças existentes e
grande potencial para surgimento de outras. No Brasil, na safra 1999/2000, as doenças
da soja foram responsáveis por prejuízos estimados em U$1,39 bilhão. Desse
montante, o NCS contribuiu com U$133,2 milhões, com área infestada chegando a 22%
da área total de soja no país (BORÉM, 1997;YORINORI, 2000, 2002).
Os programas de melhoramento genético da soja estão voltados à criação de
cultivares mais produtivas, mais estáveis e mais bem adaptadas às diversas regiões
ecológicas e aos vários sistemas de cultivo existentes no Brasil, incluindo a resistência
às possíveis doenças e pragas presentes.
2
Embora o número de cultivares disponíveis no Brasil seja grande, a base
genética do germoplasma de soja brasileiro está extremamente reduzida, aumentando,
dessa forma, a vulnerabilidade para perdas com doenças e pragas (BECELAERE, et al.
2005). BONETTI (1983) estimou que cerca de 70% das cultivares desenvolvidas para o
Rio Grande do Sul, naquela data descendiam das cultivares americanas Hill, Hood ou
ambas. HIROMOTO & VELLO (1986) informaram que todas as cultivares
recomendadas para plantio naquele ano agrícola descendiam de 26 cultivares, sendo
que deste total, apenas quatro eram responsáveis por cerca da metade daquele
conjunto gênico.
Dessa forma estudos de divergência genética e relações filogenéticas entre
espécies vegetais de importância econômica têm merecido atenção cada vez maior,
uma vez que provê informações sobre recursos genéticos disponíveis e auxilia na
localização e no intercâmbio desses (CRUZ et al., 2004). Diversas técnicas de biologia
molecular estão disponíveis atualmente para detecção de polimorfismo genético
diretamente ao nível de DNA, auxiliando na avaliação das relações genéticas entre
genótipos. Os marcadores moleculares fornecem um alto grau de polimorfismo
distribuído aleatoriamente ao longo de todo o genoma e, por serem independentes de
efeitos ambientais e estádios fisiológicos das plantas, permitem uma identificação
precoce e precisa dos genótipos de interesse.
Os marcadores moleculares têm sido amplamente utilizados na caracterização
da diversidade genética entre e dentro de genótipos de uma população, geralmente por
meio da similaridade ou dissimilaridade genética. Nesses trabalhos, os pesquisadores
têm interesse em agrupar os indivíduos semelhantes, de forma que as maiores
diferenças ocorram entre os grupos formados a fim de caracterizar o germoplasma e,
ainda, na escolha de parentais mais divergentes para realização de cruzamentos no
melhoramento de plantas (CORRÊA et al., 1999; MUHLEN et al., 2000; PRIOLLI et al.,
2002; MEYER et al., 2004; ARRIEL et al., 2006).
Dentre os marcadores moleculares disponíveis, os microssatélites, ou SSR
(“Simple Sequence Repeat”) têm sido considerados ideais para a caracterização e
avaliação da variabilidade genética, pois são codominantes, multialélicos, reprodutíveis
3
e amplificados via reação de polimerase em cadeia (PCR – “Polymerase Chain
Reaction” - MULLIS & FALOONA, 1987). Com o uso desses marcadores é possível
identificar o padrão molecular de genótipos com potencial comercial, facilitando estudos
futuros.
Métodos estatísticos de análise podem ser aplicados para auxiliar em estudos de
divergência genética. As matrizes de similaridade, ou distâncias entre genótipos podem
ser calculadas de diversas formas, sendo que diferentes propostas são encontradas na
literatura (SNEATH & SOKAL, 1973; JOHNSON & WICHERN, 1988; WEIR, 1996).
Considerando que os resultados dos agrupamentos podem ser influenciados pela
escolha do coeficiente de similaridade (GOWER & LEGENDRE, 1986; JACKSON et al.,
1989; DUARTE et al., 1999), estes coeficientes precisam ser mais bem estudados, de
forma que os mais eficientes em cada situação específica possam ser empregados
(DUARTE et al., 1999).
Visto que a escolha de genitores e o planejamento dos cruzamentos são etapas
de fundamental importância para o sucesso de um programa de melhoramento, a
avaliação da diversidade genética em soja resistente ao NCS se torna útil no âmbito de
fornecer um padrão de bandas moleculares que fornecerão aos melhoristas
informações genéticas adicionais e mais detalhadas dos genótipos, aumentando a
probabilidade de obtenção de cultivares superiores a serem lançados no mercado
nacional. Dessa forma, o presente trabalho objetivou:
• Estimar coeficientes de similaridade entre genótipos e cultivares com
resistência ao nematóide de cisto da soja (NCS) através de marcadores moleculares do
tipo microssatélite;
• A obtenção de dendrogramas e agrupamentos dos genótipos estudados
através de diferentes critérios aglomerativos (hierárquicos e otimização) e projeções
das distâncias no plano, a fim de identificar genótipos similares e grupos heterogêneos;
• Comparar diversos métodos de agrupamentos, a partir de dados
moleculares, identificando o mais adequado para o estudo de divergência genética
destes genótipos.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A Soja
A soja é uma leguminosa anual de caule ereto, com grande diversidade quanto
ao ciclo de vida. É uma planta milenar, sendo difícil estabelecer com clareza sua origem
e história. O centro de origem do grão parece estar localizado nas partes central e
ocidental da China (SLEPER & SHANNON, 2003), sendo a Manchúria um importante
centro de diversificação (origem secundária) (CARUSO, 1997). HYMOWITZ (1970),
com base em evidências históricas, geográficas e achados arqueológicos, concluiu que
a soja foi domesticada por volta do século XI a.C. Há 3000 anos a soja se espalhou
pela Ásia, onde começou a ser utilizada como alimento (CARUSO, 1997).
Na Europa esta cultura tornou-se conhecida no século XVII, quando pela
primeira vez foi plantada no Jardim Botânico de Paris. Em 1765, foi introduzida no Norte
da América e Sul dos Estados Unidos, sendo no último, muito utilizada para feno e
forragem verde (COSTA & MANICA, 1996).
No Brasil, a soja foi introduzida na Bahia, em 1882, por Gustavo D’Utra. Da Bahia
foi levada para São Paulo onde se obteve os primeiros resultados experimentais,
relatados em 1892 pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC). No Rio Grande do
Sul, a soja foi cultivada em 1900, mas só no final dos anos 40 é que o cultivo comercial
iniciou-se no Rio Grande do Sul e em São Paulo (COSTA & MANICA, 1996).
Na década de 60, a cultura se expandiu inicialmente, em latitudes entre 30ºS e
20ºS, principalmente nos Estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná e São
Paulo, e com a identificação de cultivares mais bem adaptadas às condições
ambientais, os melhoristas passaram a combinar as características destas por meio de
hibridação (BONETTI, 1983).
A expansão da cultura para médias e baixas latitudes foi possível pelo
desenvolvimento de cultivares locais, onde a estratégia de obtenção consistiu no
5
desenvolvimento de plantas com crescimento determinado, semelhante às utilizadas no
sul dos Estados Unidos, e com altura e ciclo adequados a estas condições (KIIHL et al.,
2000).
Por ser uma das espécies mais cultivadas no Brasil a partir dos anos 70, a soja
ocupa posição de destaque na economia agrícola do país. No período entre 1986 e
2003, a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), em parceria com
outras empresas, listaram mais de 200 cultivares recomendadas para plantio na maioria
das regiões sojícolas do Brasil, representando uma maior produção ano após ano em
função do desenvolvimento de novas cultivares com resistência a fatores bióticos e
abióticos (EMBRAPA, 2003).
2.2. Importância Econômica
A soja tem apresentado, nas últimas cinco décadas, uma taxa de crescimento
superior à taxa de crescimento populacional, ocupando lugar de destaque na
alimentação humana e animal dos cinco continentes. Atualmente é uma das mais
importantes oleaginosas cultivadas no mundo.
Levantamentos da Companhia Nacional de Abastecimento do Ministério da
Agricultura mostram que de toda área cultivada com grãos no país, a soja ocupa 44,8%,
ou 20,65 milhões de hectares. A cultura também avança com muita força em novas
fronteiras agrícolas, o que estabelece perspectivas de continuidade no crescimento
verificado nos últimos anos. Deve-se ressaltar ainda a importância da soja no mercado
externo, onde as exportações do complexo agroindustrial do grão representam em torno
de 24% das exportações do agronegócio brasileiro, e em torno de 10% de nossas
exportações totais, segundo estatísticas da CONAB (2007).
Em 2004, o Brasil produziu cerca de 50 milhões de toneladas de soja, ou 25% da
safra mundial, montante menor que o de 2003, quando o País produziu 52 milhões de
toneladas e participou com quase 27% da safra mundial, estimada em cerca de 200
6
milhões de toneladas para 2004. Calcula-se que, aproximadamente 10 milhões de
toneladas, ou 20% da safra brasileira de 2004, tenham sido perdidos devido às
condições climáticas que não foram favoráveis para o desenvolvimento da cultura e
pela falta de controle da ferrugem asiática. Na Região Sul a perda ocorreu pela
estiagem e, na Região Centro-Oeste pelo excesso de chuvas, impedindo o
desempenho sustentável da produção (EMBRAPA, 2004).
No Brasil, a cadeia agroindustrial da soja, gera mais de cinco milhões de
empregos e participa com pelo menos 16% dos mais de 40% do Produto Interno Bruto
(PIB) brasileiro gerado pela agroindústria (EMBRAPA, 2004). Considerando o PIB de
2005, conforme dados do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), isso
significa um montante de cerca de R$ 34 bilhões anuais de ganhos com a cultura.
Esses números mostram a importância econômica da soja para o país. Além disso,
vários setores da sociedade têm a renda diretamente relacionada aos empregos
gerados pelo complexo de produção, transporte e comercialização da soja.
O processamento da soja na indústria dá origem, inicialmente, a dois produtos de
grande consumo: o farelo e o óleo. O farelo é utilizado principalmente na elaboração de
rações, sendo a principal fonte de proteína na nutrição animal. Dos óleos comestíveis
consumidos no Brasil, o consumo do óleo de soja é o mais expressivo, correspondendo
a mais de 90%. A partir deles podem ser feitos dezenas de outros produtos (BLACK,
2000). Na safra 2006/2007, o Brasil produziu 22,8 milhões de toneladas de farelo de
soja e 5,6 milhões de toneladas de óleo de soja (CONAB, 2007).
2.3. Nematóide de Cisto da Soja
O namatóide de cisto da soja (Heterodera glycines Ichinohe) é uma das
principais pragas da cultura. Ele penetra nas raízes das plantas de soja ainda jovens,
dificultando a absorção de água e nutrientes. Os sintomas na lavoura se caracterizam
pela ocorrência de manchas em reboleira, onde as plantas se apresentam cloróticas,
7
com redução do porte e do número de vagens e muitas vezes morrem prematuramente.
O sistema radicular das plantas afetadas fica reduzido e apresenta minúsculas fêmeas
do nematóide, com formato semelhante a um limão. Inicialmente de coloração branca, a
fêmea, posteriormente adquire a coloração amarelada. Após ser fertilizada pelo macho,
cada fêmea produz de 100 a 250 ovos, armazenando a maior parte delas em seu corpo.
Quando a fêmea morre, seu corpo se transforma em uma estrutura dura, de coloração
marrom escuro, cheia de ovos, altamente resistente à deterioração e à dessecação e
muito leve, denominada cisto, que se desprende da raiz e permanece no solo
(YORINORI, 1994; YORINORI, 1998; EMBRAPA, 1999).
O ciclo de vida varia de 21 a 25 dias, sendo muito influenciado pela temperatura,
entre 23°C e 25°C. Dessa forma, é possível até seis gerações do nematóide em um
ciclo de cultivares tardias de soja. O cisto pode sobreviver no solo, na ausência de
planta hospedeira, por mais de oito anos, sendo quase impossível eliminar o parasita
nas áreas onde ele ocorre (ALMEIDA et al., 1997).
Os ovos no interior do cisto, já fertilizados, sofrem embriogênese, dando origem
ao juvenil de primeiro estádio (J1). Esse tem sua ecdise, ou troca de cutícula, dentro do
ovo e torna-se o juvenil de segundo estádio (J2), que eclode, migra no solo e invade as
raízes da planta hospedeira. Após a penetração, o J2 induz a modificação de um
conjunto de células da soja no local de penetração, estabelecendo o sítio de
alimentação, os sincitos, que passam a fornecer alimento para o nematóide. O J2
continua a se desenvolver, sofre mais três ecdises e, finalmente, atinge a fase adulta,
de macho ou fêmea. As fêmeas aumentam de volume, assumem o formato de limão, de
coloração branca amalerada e permanecem fixadas à raiz, com o corpo do lado de fora
e a parte anterior internamente nos tecidos radiculares. Os machos têm corpo
alongado, passam para o solo e, após a fertilização das fêmeas, morrem (TAYLOR,
1971; SCHMITT & BARKER, 1985).
A fecundação cruzada desta espécie de nematóide é a razão da sua elevada
variabilidade genética, determinando a existência de raças. No Brasil a raça
predominante é a 3, embora as raças 1, 2, 4, 5, 6, 10, 14, 4
+
e 14
+
também já tenham
sido identificadas. As raças 4
+
e 14
+
possuem genes adicionais de parasitismo, o que
8
possibilita a quebra da resistência da cultivar Hartwig, anteriormente resistente a todas
as raças do nematóide de cisto (DIAS et al., 1999).
Constatado pela primeira vez no Brasil na safra 1991/92, na região do cerrado,
rapidamente atingiu municípios localizados em Mato Grosso, Mato Grosso do Sul,
Goiás, Minas Gerais, São Paulo e Rio Grande do Sul. (EMBRAPA, 1999).
A cada safra, verifica-se uma disseminação elevada desse nematóide,
principalmente através da intensa movimentação de máquinas, implementos agrícolas e
veículos, que carregam solo contaminado aderido. O nematóide também pode ser
disseminado pelo vento, enxurrada, animais e sementes mal beneficiadas, contendo
partículas de solo. Além do uso de genótipos resistentes, recomenda-se a semeadura
direta como forma de cultivo, dificultando a dispersão dos cistos (YORINORI, 1998).
O método mais eficiente de controle desse patógeno é o uso de variedades
resistentes, acompanhados da rotação com culturas não hospedeiras, além da
prevenção de entrada do NCS em áreas ainda isentas do mesmo. O planejamento da
rotação de culturas é relativamente simples, em função da limitada gama de
hospedeiros do nematóide. O milho, a cana-de-açúcar, o algodão, o sorgo, o arroz, o
girassol, a mamona, o trigo, assim como as demais pastagens, podem ser cultivadas
em áreas infestadas. O NCS não se reproduz nas plantas daninhas mais comuns nas
lavouras de soja, no Brasil (ALMEIDA ET AL, 1997; YORINORI, 1998; EMBRAPA,
1999).
2.4. Genética da Resistência da Soja ao Nematóide de Cisto
Estudos da base genética das cultivares brasileiras de soja revelaram que o
germoplasma utilizado em programas de melhoramento genético, no país como um
todo, pode ser considerado como uma população de baixo tamanho efetivo (Ne = 11 a
15) (VELLO et al., 1988). Muitos germoplasmas resistentes têm sido identificados e
9
usados com sucesso em programas de melhoramento. Entretanto, a base genética de
cultivares de soja resistente ao NCS é relativamente estreita (YUE et al., 2000).
Durante o ano agrícola 1983/1984, foram traçadas as genealogias de 74
cultivares de soja recomendadas para o cultivo no Brasil, onde se derivou somente 26
ancestrais. Destes, onze contribuíram com 89% do conjunto gênico das cultivares
brasileiras de soja; sendo que seis desses ancestrais são os mais freqüentes nas
genealogias das cultivares americanas (HIROMOTO & VELLO, 1986). Desse modo, o
patógeno pode facilmente superar a resistência dessas cultivares. A coleta e a
caracterização genética de novas fontes de resistência têm que ser atividades
constantes (DIAS, 2003).
A base genética da resistência em soja ao NCS, raça 3, é complexa e ainda não
bem entendida, sendo estudada por diversos autores. Pode estar envolvido um bloco
de genes e/ou um ou poucos genes com vários alelos (CALDWELL, 1960; RAO-ARELLI
& ANAND, 1988; RAO-ARELLI ET AL., 1992). Uma das hipóteses mais aceita indica a
reação de resistência à raça 3 do NCS controlada por um gene dominante e dois genes
recessivos (MYERS & ANAND, 1991; RAO-ARELLI et al., 1992; MAURO et al., 1999).
WEBB et al. (1995) mapearam três QTLs nos grupos de ligação A, G e M, que
conferem completa resistência à raça 3 do NCS na PI 437654, ancestral resistente de
Hartwig. Estudos de YUE et al. (2000) concluíram que a resistência a várias raças do
NCS na PI 438489B é controlada por três ou quatro genes de resistência.
Para desenvolver cultivares de soja resistente ao NCS é necessário o
conhecimento do número de genes relacionados à resistência, bem como o tipo de
ação gênica e a herdabilidade do caráter (MAURO et al., 1999). Muitos genes
envolvidos na resistência a raças específicas de NCS já foram identificados. O gene de
resistência Rhg4 foi identificado e mapeado no grupo de ligação A (KEIM et al., 1990;
WEBB et al., 1995), em cruzamentos envolvendo a PI 290136 (WEISEMANN et al.,
1992) e Peking (MAHALINGAN & SKORUPSKA, 1995). Segundo WEBB et al. (1995), a
PI 437654 e Peking têm os mesmos locos para resistência à raça 3.
O mecanismo de resistência é baseado na hipersensibilidade, a qual determina a
morte de células infectadas e bloqueia o ciclo de vida do nematóide (SCHIMIDT &
10
NOEL, 1984). Também é freqüente a ocorrência de ligação entre os alelos de
resistência às diferentes raças (HARTWIG & YOUNG, 1986) e entre os locos de
resistência (Rhg4) e o loco i, que confere cor preta ao tegumento da semente da soja
(MATSON & WILLIAMS, 1965; YUE et al., 2000). Nessa mesma região, uma família de
genes que codificam a síntese de chalconas (CHS) foi encontrada (TODD & VODKIN,
1998). Deleções nessa região aumentam níveis de mRNA de chalcona sintase, que é
uma enzima chave envolvida em respostas das plantas a ataque de patógenos e
importante na síntese de fitoalexinas e flavonóides (WELLE et al., 1991).
O gene de resistência rhg1 está localizado no grupo de ligação G e tem
demonstrado controlar mais de 50% da variação para resistência, controlando
efetivamente várias raças do NCS (WEBB et al., 1995; CONCIBIDO et al., 1996, 1997).
MUDGE et al. (1996) sugerem em seus estudos a presença de um gene responsável
pela redução da produtividade na mesma região de rhg1, o que deve ser levado em
consideração na seleção de genótipos, concomitantemente à redução do nível de
ligação gênica. PRABHU et al. (1999), em testes da resistência de Hartwig, verificaram
ainda, que os índices médios de parasitismo pelo NCS somente foram baixos naqueles
genótipos contendo ambos os alelos de resistência (Rhg4 e rhg1).
Das fontes de resistência ao NCS já identificadas, a PI 437654 é a única com
resistência a todas as raças (ANAND & GALLO, 1984; ANAND, 1985; RAO-ARELLI et
al., 1992). Como essa planta introduzida (PI) tem sementes com tegumentos pretos e
apresenta estabilidade e produtividade baixas, foi melhorada através do seu
cruzamento com Forrest, sendo produzida Hartwig (ANAND, 1992). Essa cultivar não
chegou a ser muito cultivada por ser pouco produtiva, mas, por apresentar resistência a
todas as raças do NCS conhecidas, passou a ser utilizada em larga escala nos
programas de melhoramento genético da soja.
Segundo HARTWIG (1985) e RAO-ARELLI (1994), a maioria dos materiais de
soja resistentes tem genes de Peking (raças 1, 3 e 5), PI88788 (raças 3 e 14) ou de
ambas. Porém, o uso contínuo de cultivares resistentes derivadas de Peking resultou no
aparecimento de populações do NCS capazes de se multiplicar nesses genótipos
(quebra de resistência). Do cruzamento de Peking com Lee (suscetível) resultou Pickett,
11
a primeira cultivar de soja com semente amarela e resistente às raças 1 e 3 do NCS
(BRIM & ROSS, 1966).
No Brasil, são utilizados como fontes de resistência genótipos originados de
Peking, PI 88788, PI 90763 ou da PI 437654. Os primeiros resultados desse trabalho
possibilitaram o lançamento das cultivares BRSMG Renascença e BRSMG Liderança,
resistentes à raça 3, para Minas Gerais; BRSMG Preciosa, resistente à raça 3 para
Minas Gerais, São Paulo, Goiás e Distrito Federal; BRSMG Robusta, resistente à raça
3, para Minas Gerais, Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso e Bahia; BRSMT Pintado,
BRSMT Tucunaré, BRSMT Caxara, BRSMT Matrinxã e BRSMT Piraíba, resistentes às
raças 1 e 3 para Mato Grosso; BRSGO Chapadões, resistente às raças 1, 3, 4 e 14 e
BRSGO Ipameri, resistentes às raças 3 e 14, para Goiás, dentre outras. Diferentemente
do ocorrido nos Estados Unidos, as primeiras cultivares resistentes brasileiras têm
alcançado altas produtividades e, consequentemente, vêm tendo grande aceitação
pelos sojicultores. Na safra 2001/02, cerca de 2 milhões de hectares foram semeados
com soja resistente ao NCS (DIAS, 2003).
2.5. Marcadores Moleculares
Com os avanços de técnicas modernas de biologia molecular, surgiram diversos
métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente ao nível de DNA
(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Nos últimos anos, novas técnicas, que auxiliam
na avaliação das relações genéticas entre genótipos, foram desenvolvidas,
acompanhando o rápido e constante avanço na área da genética molecular. O
desenvolvimento e aplicação de tecnologias baseadas em marcadores moleculares,
fornecem ferramentas únicas, capazes de revelar polimorfismos ao nível da seqüência
do DNA, suficientes para discriminar a variação genética entre indivíduos e dentro de
populações (KRESOVICH et al., 1995).
12
No melhoramento genético de plantas, tem-se buscado cada vez mais a
manipulação assistida por marcadores moleculares, visando obter maior eficiência na
transferência de fatores genéticos. Marcadores moleculares ligados a diferentes
características de importância econômica têm sido desenvolvidos, permitindo a seleção
indireta de caracteres desejáveis em gerações segregantes precoces. Esta estratégia
reduziria tempo, recursos e energia, necessários não só para desenvolver grandes
populações segregantes por várias gerações, mas também para estimar parâmetros
usados na seleção indireta (CAIXETA et al., 2006).
Os marcadores moleculares também podem auxiliar em estudos de divergência
genética. Estes consistem em métodos bioquímicos que identificam diferenças
diretamente no material genético e podem revelar, para uma dada região do DNA, uma
banda ou marca que permite comparar os indivíduos em estudo quanto à sua presença,
ou ausência. As bandas reveladas são codificadas pelo número 1 e as não reveladas
pelo número 0. Dessa forma os dados aos quais serão aplicados métodos estatísticos
provêm de uma matriz binária, constituída de uns e zeros (MEYER, 2002).
Os primeiros marcadores de DNA a serem utilizados foram os fragmentos
produzidos pela digestão do DNA com enzimas de restrição. A variação do tamanho
dos fragmentos obtidos de diferentes indivíduos, após a digestão com as enzimas de
restrição, deu origem à classe de marcadores denominados RFLP (“Restriction
Fragment Length Polymorphism”; BOTSTEIN et al., 1980). Mais tarde, surge uma nova
técnica denominada Minissatélites ou locos de Seqüências Adjacentes que se Repetem
em Número Variável (VNTR – “Variable Number of Tandem Repeats”; JEFFREY et al.,
1985).
Com o surgimento da técnica de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR –
“Polymerase Chain Reaction”; MULLIS & FALOONA, 1987), aliou-se o poder da
informação gerada por marcadores moleculares e a rapidez da técnica baseada em
ciclos contínuos de desnaturação e amplificação das fitas de DNA mediados pela
enzima DNA polimerase em pontos específicos do genoma, determinados pelo
pareamento de iniciadores ou “primers” (seqüência de nucleotídeos de tamanho
pequeno, variando geralmente entre 20 a 30 bases) específicos de seqüências
13
complementares a este ponto. Várias outras técnicas utilizam o princípio da técnica de
PCR, tais como os marcadores do tipo: Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso
(RAPD – “Random Amplified Polymorphic DNA”; WILLIAMS et al., 1990); Regiões
Amplificadas Caracterizadas por Seqüências (SCAR – “Sequence Characterized
Amplified Regions”; PARAN & MICHELMORE, 1993); Microssatélites ou Seqüências
Simples Repetidas (SSR – “Simple Sequence Repeats”; Litt & Lutty, 1989);
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados (AFLP – “Amplified
Fragment Lenght Polymorphism”; VOS et al., 1995) e os Polimorfismos de Base Única
(SNP’s – “Single Nucleotide Polymorphisms”; COLLINS et al., 1998).
A técnica RFLP tem sido utilizada em um grande número de estudos de
caracterização de cultivares, o que se deve à sua alta consistência e repetibilidade na
obtenção dos resultados. Os RFLP’s cobrem amplamente o genoma da espécie
estudada, pois as sondas utilizadas podem ser obtidas de regiões transcritas (cDNA).
Outra vantagem é sua expressão co-dominante, o que possibilita distinguir os
indivíduos homozigotos dos heterozigotos, gerando volume maior de informações para
estudos genéticos e aplicações no melhoramento. Os RFLPs ainda têm outras
utilidades como a identificação de germoplasma, a identificação de variedades, o
controle de qualidade na produção de sementes híbridas, a caracterização genética de
populações, o monitoramento nos retrocruzamentos e auxílio na identificação e
clonagem de genes, entre outras. Como limitações, pode-se dizer que o
desenvolvimento de marcadores RFLP é um processo caro e trabalhoso, tornando difícil
a geração de grande volume de dados (CAIXETA et al., 2006).
A técnica de Minissatélites é baseada na clivagem do DNA com enzimas de
restrição, separados eletroforeticamente, imobilizado em membrana e a detecção é feita
através da hibridização com sondas. Uma vantagem adicional dos minissatélites é o
alto grau de polimorfismo apresentado, decorrente da variação na distribuição dos sítios
de restrição, das sondas utilizadas e do número e tipos das seqüências repetitivas
(CATELLI, 2005).
Na técnica de RAPD são amplificados fragmentos de DNA distribuídos ao acaso
no genoma, sem a necessidade do conhecimento prévio da seqüência do DNA. Os
14
marcadores RAPD apresentam como característica básica a dominância, ou seja, este
tipo de marcador não permite distinguir indivíduos homozigotos dominantes de
heterozigotos em uma população (CAIXETA et al., 2006).
Os Microssatélites são seqüências curtas repetidas em tandem de 1 a 4
nucleotídeos, bem distribuídos em todo genoma eucarioto; são codominantes,
multialélicos, reprodutíveis e amplificados via reação de polimerase em cadeia (PCR)
utilizando-se um par de iniciadores específicos (de 20 a 30 pb) e complementares que
flanqueiam as regiões de microssatélite (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Tendo
em vista a expressão codominante e o multialelismo, os marcadores microssatélites são
os que possuem o mais elevado conteúdo de informações de polimorfismo, ou seja, PIC
(“Polymorphism Information Content”). Por causa disso, toda e qualquer população
segregante pode ser utilizada como população referência para estudos de ligação e
mapeamento genético (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Nos últimos anos, os Microssatélites têm sido considerados ideais para a
caracterização e avaliação da variabilidade genética, sendo uma das ferramentas mais
utilizadas no melhoramento de plantas. Com o uso desses marcadores é possível
organizar o germoplasma ativo de um programa de melhoramento em conjuntos
gênicos, facilitando a escolha e diminuindo o número de combinações a serem feitas
pelo melhoristas.
2.6. Divergência Genética
A análise da diversidade genética se destina à identificação de genitores
adequados à obtenção de híbridos com maior efeito heterótico e que proporcionem
maior segregação em recombinações, possibilitando o aparecimento de transgressivos
(CRUZ & CARNEIRO, 2006).
A similaridade genética (ou divergência genética) entre os genótipos é muito útil
na seleção de combinações entre parentais para formação de populações segregantes,
15
bem como para a manutenção da diversidade genética em programas de
melhoramento. Essas estimativas revelam disponibilidade de alelos substitutos para
caracteres de interesse, que são a base para ganhos de seleção em longo prazo.
Cruzamentos entre parentais geneticamente divergentes proporcionam uma
variabilidade genética entre progênies bem maior do que as obtidas em cruzamentos
entre plantas com maior grau de parentesco, e com isso aumentam as oportunidades
do melhorista obter progênies superiores (MESSMER et al., 1993).
Segundo FALCONER (1981), a heterose manifestada em híbridos é função dos
efeitos da dominância dos genes para o caráter em questão e do quadrado da diferença
das freqüências gênicas de seus genitores, além de efeitos epistáticos que geralmente
são negligenciados.
Existem duas maneiras básicas de se inferir a diversidade genética, sendo a
primeira de natureza quantitativa e a outra de natureza preditiva. Entre os métodos de
natureza quantitativa de avaliação da diversidade, ou da heterose manifestada nos
híbridos, citam-se as análises dialélicas, que, por serem necessárias avaliações de p
genitores e de todas (ou amostras de) as suas combinações híbridas, resultam
dificuldades de avaliação e execução (CRUZ & CARNEIRO, 2006).
Entre os métodos preditivos da heterose citam-se aqueles que tomam por base
as diferenças morfológicas, fisiológicas ou moleculares, quantificando-as em alguma
medida de dissimilaridade que expressa o grau de diversidade genética entre os
genitores (CRUZ & CARNEIRO, 2006).
A avaliação por meio de estudos genealógicos, normalmente, é dificultada pela
falta de registro da genealogia das populações. A diversidade geográfica tem sido
utilizada frequentemente como indicação da divergência genética, embora a origem
geográfica não quantifique a divergência genética entre populações, fato este que tem
sido constatado para muitas espécies, como melão, tomate, grão-de-bico, batata,
algodão, mostarda e cana-de-açúcar. Por outro lado, a deriva genética e a seleção em
diferentes ambientes podem causar maior divergência que a distância geográfica. Outro
fato a ser considerado, é que para, muitas espécies, o intenso intercâmbio de materiais
entre pesquisadores e instituições de diferentes regiões, tem provocado uma
16
recombinação geral de todo germoplasma, com o conseqüente desaparecimento de
tipos particulares (PEREIRA, 1989).
Atualmente os marcadores moleculares têm sido empregados como forma de
avaliar a similaridade genética de maneira mais precisa (CAIXETA et al., 2006). O
desenvolvimento e aplicação de tecnologias baseadas em marcadores moleculares,
fornecem ferramentas únicas, capazes de revelar polimorfismos ao nível da seqüência
do DNA, suficientes para discriminar a variação genética entre indivíduos e dentro de
populações (KRESOVICH et al., 1995). Dessa forma, a diversidade genética entre
acessos é avaliada por meio de variáveis binárias, a partir das quais é avaliada a
presença ou ausência de marcas (bandas), codificadas em zeros e uns. Nessa
situação, os coeficientes de similaridade entre pares de genótipos podem ser obtidos
levando-se em conta os valores:
a) Valor que quantifica o número de coincidência de tipo 1-1 para cada par de
genótipo;
b) Valor que quantifica o número de discordância do tipo 1-0 para cada par de
genótipo;
c) Valor que quantifica o número de discordância o tipo 0-1 para cada par de
genótipo;
d) Valor que quantifica o número de coincidência do tipo 0-0 para cada par de
genótipo.
Com base nesses valores podem ser obtidas as medidas de similaridade. Apesar
de existirem vários coeficientes de similaridade e dissimilaridade, na prática tem sido de
uso mais rotineiro o coeficiente de Coincidência Simples, o de Jaccard e o de Nei e Li.
Por ser objeto de estudo desse trabalho, abordaremos apenas os Coeficientes de
Similaridade de Coincidência Simples e o de Rogers e Tanimoto. O Coeficiente de
Coincidência Simples é igual ao quadrado da Distância Euclidiana Média, medida
bastante utilizada em características quantitativas, além de ter a característica de
considerar como fator de similaridade o número de coincidência de ausência da marca
molecular (coincidência tipo “0-0”) (CRUZ & CARNEIRO, 2006). O Coeficiente de
Rogers e Tanimoto segue a mesma linha, incluindo o d, ou seja, considerando como
17
válida a coincidência “0-0”; somente diferindo do método de coincidência simples pelo
fato de dobrar a importância de b e c no denominador, ou seja, as discordâncias “1-0” e
“0-1”.
2.6.1. Análise de agrupamento
A análise de agrupamento permite classificar n itens (populações, clones,
variedades, indivíduos, etc.) avaliados por um conjunto p de variáveis, cujo objetivo é
identificar e separar os itens em grupos, de forma que os mais semelhantes
permaneçam no mesmo grupo. Em todos os casos se desconhece “a priori” o número e
a composição dos diferentes grupos ou “clusters” a serem formados.
Atualmente, a técnica é muito usada principalmente por pesquisadores da área
de melhoramento genético, em estudos de divergência e estudos evolutivos. Esse tipo
de análise tem por finalidade reunir, por algum critério de classificação, qualquer tipo de
unidade amostral em vários grupos, de tal forma que exista homogeneidade dentro do
grupo e heterogeneidade entre grupos (BUSSAB et al., 1990; DIAS, 1998; MEYER,
2002; CRUZ et al., 2004).
Inicia-se o processo definindo-se os indivíduos e os objetivos desejados para a
aplicação da análise, além dos critérios que irão definir as similaridades entre eles.
Obtidos esses dados, eles são dispostos na forma de uma matriz, que representam os
indivíduos de interesse e as linhas representam as variáveis. A matriz de distância é
gerada a partir de amostras de n itens, totalizando n(n-1)/2 pares de distâncias. A seguir
um algorítimo de agrupamento é aplicado sobre essa matriz, de modo a identificar e
conectar grupos homogêneos. Tais grupos são representados graficamente em um
diagrama de árvore denominado dendrograma (DIAS, 1998; MEYER, 2002; ARRIEL,
2004).
Existem inúmeros métodos de agrupamento, que se distinguem pelo tipo de
resultado a ser fornecido e pelas diferentes formas de definir a proximidade entre um
18
indivíduo e um grupo já formado ou entre dois grupos quaisquer. Cada critério de
análise de agrupamento impõe certo grau de estrutura nos dados, e para se assegurar
que o resultado obtido não é um artefato da técnica utilizada, é recomendado que
diferentes critérios de agrupamento sejam aplicados e se aceite a estrutura resultante
da maior parte deles. (DIAS, 1998; CRUZ & CARNEIRO, 2006).
Dos métodos de agrupamento, os mais utilizados são os hierárquicos e os de
otimização. Nos métodos hierárquicos, os genótipos são agrupados por um processo
que se repete em vários níveis, até que seja estabelecido o dendrograma ou o
diagrama de árvore. As delimitações podem ser estabelecidas por um exame visual do
dendrograma, em que se avaliam pontos de alta mudança de nível, tomando-os em
geral como delimitadores do número de genótipos para determinado grupo (CRUZ &
CARNEIRO, 2006).
No agrupamento hierárquico denominado Método do Vizinho Mais Próximo ou
Método de Ligação Simples (“Single Linkage Method”), forma-se um grupo inicial de
indivíduos mais similares e em seguida são calculadas as distâncias daquele grupo em
relação aos demais indivíduos usando-se a menor distância do conjunto. Neste método,
as conexões entre indivíduos e grupos são feitas por ligações simples entre pares de
indivíduos, ou seja, a distância entre os grupos é definida como sendo aquela entre os
indivíduos mais parecidos entre esses grupos (CRUZ & CARNEIRO, 2006). Este
método leva a grupos longos e os dendrogramas resultantes deste procedimento são
geralmente pouco informativos, devido à informação dos indivíduos intermediários que
não são evidentes (CARLINI-GARCIA, 1998).
Quando a semelhança entre dois grupos é definida como a máxima distância
entre pares de indivíduos tem-se o Método do Vizinho Mais Distante ou Método de
Ligação Completa (“Complete Linkage Method”). A similaridade entre dois grupos é
definida como aquela apresentada pelos indivíduos de cada grupo que menos se
parecem, formando-se todos os pares com um membro de cada grupo. Este método,
geralmente leva a grupos compactos e discretos, tendo os seus valores de similaridade
relativamente pequenos (MEYER, 2002).
19
O Método de Ward considera, para a formação inicial do grupo, aqueles
indivíduos que proporcionam a menor soma de quadrados dos desvios entre acessos,
admitindo perdas de informações em razão do agrupamento realizado (CRUZ &
CARNEIRO, 2006).
Se a distância entre os pares de grupos for estimada com base na média
aritmética dos indivíduos tem-se o UPGMA (“Unweighted Pair-Group Method Using
Arithmetic Averages”), ou Ligação média entre grupo. Este último evita caracterizar a
dissimilaridade por valores extremos entre os genótipos, não considera a estrutura de
subdivisão do grupo, dando pesos iguais a cada indivíduo do grupo calculando a
similaridade média de um indivíduo que pretende se juntar ao grupo existente. É um
dos mais empregados nos estudos de divergência genética (CRUZ et al., 2004; CRUZ
& CARNEIRO, 2006).
O Método da Ligação Média Dentro de Grupos, também se baseia em
agrupamentos em função da média aritmética, calculando os coeficientes de
similaridade médios entre o indivíduo que se pretende agrupar e os indivíduos do grupo
já existente (MEYER, 2002).
O Método da Mediana ou WPGMA (“Weighted Pair-Group Method Using
Arithmetic Averages”) difere do UPGMA pelo fato de atribuir aos indivíduos admitidos
mais recentemente a um grupo, peso igual aos dos demais indivíduos já pertencentes
ao grupo (ROMESBURG, 1984).
Nos métodos de otimização, os grupos são formados pela adequação de algum
critério de agrupamento, ou seja, o objetivo é alcançar uma partição dos indivíduos que
otimize (maximize ou minimize) alguma medida predefinida. Um dos métodos mais
comumente utilizados no melhoramento genético é o proposto por Tocher, citado por
RAO (1952). Ele identifica o par de indivíduos mais similares para formação do grupo
inicial e a partir daí avalia a possibilidade de inclusão de novos indivíduos, adotando-se
o critério de que a distância média intragrupo deve ser menor que a distância média
intergrupo (CRUZ & CARNEIRO, 2006).
Ressalta-se que o agrupamento conduz à perda de informações ao nível de
indivíduos, restando apenas informações sobre grupos similares. Por esse motivo, o
20
estudo da divergência pode ser conduzido também simultaneamente, por componentes
ou coordenadas principais, isto é particularmente importante quando o número de
indivíduos é grande (CRUZ & CARNEIRO, 2006).
Uma alternativa de análise da diversidade genética foi proposta por CRUZ &
VIANA (1994) a qual apresenta características similares às técnicas de agrupamento e
de coordenadas principais, sendo denominada de Projeção de Medidas de
Dissimilaridade no Plano bi ou tridimensional. Neste procedimento, as medidas são
convertidas em escores relativos às variáveis X e Y, que quando representadas em
gráficos irão refletir, no espaço bi ou tridimensional, as distâncias originalmente obtidas
a partir do espaço n-dimensional (n = número de caracteres utilizados para obtenção
das distâncias). Inicialmente, é necessário estabelecer uma ordem decrescente de
dissimilaridade entre os pares de indivíduos. Estimam-se coordenadas para cada
indivíduo, a partir da matriz de dissimilaridades, por procedimentos estatísticos que
minimizam as diferenças entre as distâncias originais e as obtidas no espaço
bidimensional. A viabilidade do uso desta técnica pode ser avaliada pela correlação
entre as distâncias, pelo grau de distorção () ou pela adequação da representação
gráfica (coeficiente de estresse – s).
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Local de Condução do Experimento
Os experimentos foram conduzidos na casa de vegetação do Departamento de
Produção Vegetal e no Laboratório de Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento de
Plantas da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP – Campus de
Jaboticabal – SP.
3.2. Identificação e Coleta do Material
No presente estudo, foram analisadas 10 linhagens de soja em geração F
8
de
endogamia, desenvolvidas pelo Programa de Melhoramento da Soja da UNESP-FCAV,
e 30 cultivares disponíveis no mercado. Tais genótipos foram selecionados por
possuírem resistência ao nematóide de cisto da soja, raça 3 (Tabela 1).
Os genótipos foram semeados em vasos de plástico em casa de vegetação, com
condições de luz e umidade controladas. As amostras foram coletadas quando as
plantas apresentaram o segundo par de trifólios desenvolvidos (estádio V2), com coleta
de um ou dois folíolos jovens por planta, de cinco plantas por genótipo. A seguir, foram
armazenadas, etiquetadas e depositadas em gelo. Na seqüência, foram levadas ao
laboratório para armazenamento em freezer a –80
o
C para posterior extração de DNA.
22
Tabela 1. Cultivares e genótipos F
8
de soja resistentes ao NCS, utilizados no estudo de
divergência genética, com suas respectivas fontes de resistência.
N° Cultivares/Genótipos Fontes de Resistência envolvidas na
genealogia
1/
1
FMT Matrinxã PI 437654 e PI 88788 e Peking
2
BRS Jiripoca Peking e PI 437654
3
BRS Piraíba PI 437654 e PI 90763, PI 88788 e Peking
4
BRS Tambaqui PI 437654 e Peking
5
FMT Tucunaré Peking e PI 437654
6
BRSGO Ipameri PI 88788 e Peking
7
BRSGO Chapadões PI 437654
8
BRS 231 Peking e PI 437654
9
FMT Cachara Peking e PI 437654
10
BRSMG Liderança (BR91-10569) Peking
11
BRSMG 250 (Nobreza) Peking
12
BRSMG 251(Robusta) Peking
13
M-SOY 7901 Peking
14
M-SOY 8001 Peking
15
M-SOY 8200 Kirby
16
M-SOY 8400 Peking
17
M-SOY 8329 Peking
18
M-SOY 8757 Peking
19
BRSMT Pintado (MTBR95-123247)
PI 437654
20
BRSMG Renascença Kirby e Forrest (Peking)
21
Hartwig PI 437654
22
MGBR 9520937 Forrest (Peking)
23
98N41 Peking
24
98N71 Peking
25
98N82 Peking
Continua...
23
Tabela 1. Cultivares e genótipos F
8
de soja resistentes ao NCS, utilizados no estudo de
divergência genética, com suas respectivas fontes de resistência
(Continuação).
26
Foster Peking
27
Fayette PI 88788
28
Egyptiam
-
29
Leflore Peking
30
Jeff PI 88788
31
JAB 99102/4.5 BR92-15440 - Peking
32
JAB 99102/8.1 BR92-15440 - Peking
33
JAB 99103/8.2 BR92-15440 - Peking
34
JAB 99174/9.1 PI 437654
35
JAB 99174/9.15 PI 437654
36
JAB 99101/2.5 BR92-15440 - Peking
37
JAB 99102/4.2 BR92-15440 - Peking
38
JAB 99174/9.10 PI 437654
39
JAB 994311/15.20 PI 437654
40
JAB 994012/1.2 BR92-1554 - Peking
1/
espaços com hífen indicam falta de informação sobre a fonte de resistência da cultivar.
3.3. Atividades em Laboratório
3.3.1. Extração de DNA
O DNA genômico foi extraído seguindo o protocolo de extração descrito em
FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1998), sendo conhecido como método CTAB. A seguir,
24
realizou-se a quantificação do DNA extraído, mediante leitura da densidade ótica a 260
e 280 nm em aparelho biofotômetro BioPhotometer Eppendorf AG. Posteriormente à
quantificação, a integridade do DNA foi observada pela visualização em gel de agarose
1,5%, corado com brometo de etídeo. Por fim, alíquotas das amostras de DNA foram
diluídas para a concentração desejada e parte foi estocada a –20
o
C para uso posterior.
3.3.2. Identificação de marcadores SSR
Foram selecionados 12 pares de iniciadores SSR ou microssatélites, que
flanqueiam regiões repetitivas dispersas no genoma da soja, em diferentes grupos de
ligação: Satt185 (E), Satt308 (M), Satt187 (A2), Satt070 (B2), Satt009 (N), Satt129
(D1a), Satt154 (D2), Satt152 (N), Satt175 (M), Satt045 (E), Satt162 (A2) e Satt163 (G)
(Tabela 2).
3.3.3. Reações de PCR e visualização dos resultados
As reações de amplificação por PCR, foram realizadas para cada um dos 40
genótipos, utilizando os diferentes iniciadores SSR. A reação foi preparada com um
volume total de 20 L, contendo 300 ng de DNA genômico de soja, 1,5 mM de MgCl2,
Tampão PCR 1X (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 e 50 mM KCl), 0,2 mM de dNTP’s, 1U de
Taq-DNA polimerase e 10 µM de cada iniciador “Forward” e “Reverse”.
25
Tabela 2. Grupo de ligação, seqüência e número de alelos encontrados para os 12
marcadores SSR utilizados nas análises dos 40 genótipos de soja.
Iniciador GL Seqüências T NA
Satt308 M
F
GCGTTAAGGTTGGCAGGGTGGAAGTG
55°C
3
R
GCGCAGCTTTATACAAAAATCAACAA
Satt154 D2
F
AGATACTAACAAGAGGCATAAAACT
55°C
2
R
AAAGAAACGGAACTAATACTACATT
Satt152 N
F
GCGCTATTCCTATCACAACACA
55°C
3
R
TAGGGTTGTCACTGTTTTGTTCTTA
Satt070 B2
F
TAAAAATTAAAATACTAGAAGACAAC
50°C
3
R
TGGCATTAGAAAATGATATG
Satt129 D1a
F
TTCAGTACAAGTCGGGTGAATAATAATA
59°C
3
R
TCACATGTTCGGGACTTAAGGTAT
Satt175 M
F
GACCTCGCTCTCTGTTTCTCAT
60°C
3
R
GGTGACCACCCCTATTCCTTAT
Satt185 E
F
GCGCATATGAATAGGTAAGTTGCACTAA
55°C
3
R
GCGTTTTCCTACAATAATATTTCAT
Satt045 E
F
TGGTTTCTACTTTCTATAATTATTT
50°C
3
R
ATGCCTCTCCCTCCT
Satt009 N
F
CCAACTTGAAATTACTAGAGAAA
55°C
5
R
CTTACTAGCGTATTAACCCTT
Satt187 A2
F
GCGTTTTAATTTATGATATAACCAA
55°C
3
R
GCGTTTTATCTCTTTTTCCACAAC
Satt162 A2
F
GCGTGGTTTTTCGCTGGATATA
46-57°C
2
R
GCGCATTTCGTAACATATTTTTCAC
Satt163 G
F
GCGGTATATATGTTTGCAAGACATATT
46-57°C
3
R
GCGGAATCTCGCCCAGGAGGAACTT
GL: grupo de ligação; T: temperatura de pareamento; NA: n° de alelos encontrados;
F: Foward; R: Reverse
26
O programa de termociclagem foi composto por um ciclo inicial de
desnaturação a 95°C por 30 s, seguido de 94°C por 30 s, 22 ciclos para o anelamento
do iniciador, onde a temperatura variou de acordo com cada iniciador (Tabela 2) e 68°C
durante 30 s, para extensão pela Taq Polimerase. Em seguida finalizou-se o programa
com 4
o
C, até que os microtubos fossem retirados do aparelho. Após a retirada,
adicionou-se 3 µL de tampão de carregamento (5,75 mL de glicerol; 2 mL de EDTA 0,5
M, pH 8,0; 0,5 mL de dodecilsulfato de sódio - SDS; 1,75 mL de água e 0,01% de azul
de bromofenol) em cada microtubo, imediatamente antes da aplicação da amostra no
gel.
Os produtos amplificados foram separados por eletroforese em gel de
agarose de alta resolução (agarose 1000), a uma concentração de 3,0% para um
melhor padrão de diferenciação de bandas, em tampão TAE (2 M Tris, 100 mM EDTA,
1M ácido acético) e corados com brometo de etídeo. A eletroforese procedeu-se a 80 V
por cerca de duas horas. A visualização foi feita em luz UV através de transluminador e
fotografada pelo sistema Kodak EDAS 290. A amplitude de variação do tamanho de
cada loco foi estimada por meio de comparação com o marcador de tamanho 100 pb e
também através de das ferramentas digitais do Programa Kodak EDAS 290.
3.3.4. Organização da matriz de dissimilaridade
A partir dos resultados moleculares observados nos géis, foi organizada uma
matriz binária baseada na presença (1) ou ausência (0) de marcas (bandas) para cada
alelo encontrado. Com base nessas observações, foram obtidas as estimativas de
similaridade entre todos os pares de acessos.
27
3.4. Análises Estatísticas
As medidas de similaridade (C
ii
’) foram convertidas em dissimilaridade
através do complemento aritmético (D), utilizando-se dois coeficientes:
• Coincidência Simples (Cruz & Carneiro, 2006), dado por:
'ii
C =
d
c
b
a
da
+++
+
;
• Rogers e Tanimoto (Cruz & Carneiro, 2006), dado por:
'ii
C =
])(2[ dcba
da
+++
+
;
Sendo: D
ii’
= 1 – C
ii’,
Onde,
a: número de concordâncias do tipo 1-1;
b: número de discordâncias do tipo 1-0;
c: número de discordâncias 0-1;
d: número de concordâncias 0-0.
Tais coeficientes foram utilizados devido ao fato de considerarem como fator
de similaridade, o número de coincidências da ausência da marca molecular (tipo “0-0”),
fator importante para dados obtidos a partir de marcadores SSR. Considerando a base
genética de marcadores SSR, a ausência de amplificação de uma determinada banda
em dois genótipos, pode indicar uma similaridade genética entre eles. Desta forma,
coeficientes que incluem a co-ocorrência negativa (d: 0,0) das expressões de
similaridade tornam-se mais adequados em análises que utilizam marcadores desta
natureza.
Após a obtenção das informações sobre o grau de diferença apresentado
entre os genótipos, foram realizados os agrupamentos de acordo com vários métodos
28
aglomerativos, que se distinguem pelo tipo de resultado fornecido e pelas diferentes
formas de definir proximidade entre um indivíduo e um grupo já formado ou entre dois
grupos quaisquer.
Foram realizados agrupamentos através do método de otimização de Tocher
(RAO, 1952) e de métodos hierárquicos (CRUZ et al., 2004) como:
• Ligação simples – Vizinho mais próximo (“Single Linkage Clustering”);
• Ligação completa – Vizinho mais distante (“Complete Linkage
Clustering”);
• Método de Ward;
• Ligação média dentro de grupo;
• Ligação média entre grupo - UPGMA (“Unweighted Pair-Group Method
Arithmetic Average”);
• Método da Mediana - WPGMA (“Weighted Pair-Group Method Using
Arithmetic Averages”).
Após os agrupamentos, foi calculada a matriz dos genótipos mais e menos
similares em relação a cada um dos genótipos estudados. Foram realizadas também,
as projeções das medidas de dissimilaridade em gráficos bi e tridimensionais,
calculando-se a coordenada das medidas mais divergentes e, a seguir, daquelas que
demonstraram, em ordem crescente, a maior diversidade com os genótipos já
considerados (CRUZ & VIANA, 1994).
Depois de obtidos todos os possíveis agrupamentos, as medidas de
dissimilaridade foram correlacionadas através do Teste de Mantel e tal relação foi
quantificada e projetada em um gráfico de correlação, no qual cada eixo representa
uma medida de similaridade. Todas as análises foram realizadas através do Programa
GENES, versão 4.1 (CRUZ, 2001).
29
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Conforme observado na Tabela 2, todos os 12 marcadores SSR
apresentaram polimorfismo. O número de alelos por loco variou de dois (Satt 154 e Satt
162) a cinco (Satt 009), com número médio de três alelos por loco, obtendo um total de
36 alelos, distribuídos entre os 40 genótipos. Exemplos de padrões de bandas e
polimorfismos detectados pelos iniciadores Satt 308, Satt 152 e Satt 154 são
apresentados nas Figuras 1, 2 e 3.
Figura 1. Amostras dos fragmentos produzidos nas reações de amplificação dos 40
genótipos de soja utilizando o iniciador Satt308.
30
Figura 2. Amostras dos fragmentos produzidos nas reações de amplificação dos 40
genótipos de soja utilizando o iniciador Satt152.
31
Figura 3. Amostras dos fragmentos produzidos nas reações de amplificação dos 40
genótipos de soja utilizando o iniciador Satt154.
32
4.1. Coeficientes de Similaridade pelo Método de Coincidência
Simples
O coeficiente de dissimilaridade médio obtido pelo complemento aritmético
do Coeficiente de Similaridade de Coincidência Simples entre todos os genótipos foi de
0,356297. Esta média pode ser indicativa da estreita base genética da soja, já reportada
por YUE et al. (2000), pois baixa dissimilaridade significa alta semelhança entre os
genótipos. Os pares de genótipos mais divergentes foram 4 (BRS Tambaqui) e 16 (M-
SOY 8400), 13 (M-SOY 7901) e 38 (JAB 99174/9.10), 15 (M-SOY 8200) e 28
(Egyptiam), 16 (M-SOY 8400) e 28 (Egyptiam), 17 (M-SOY 8329) e 28 (Egyptiam), 16
(M-SOY 8400) e 34 (JAB 99174/9.1), 16 (M-SOY 8400) e 35 (JAB 99174/9.15), com
coeficiente de dissimilaridade igual a 0,64 Os pares de genótipos menos divergentes
foram 11 (Nobreza) e 31 (JAB 99102/4.5), 31 (JAB 99102/4.5) e 32 (JAB 99102/8.1), 32
(JAB 99102/8.1) e 33 (JAB 99103/8.2), 16 (M-SOY 8400) e 17 (M-SOY 8329), com
coeficiente de dissimilaridade de 0,06.
A partir da matriz de dissimilaridade com as distâncias genéticas entre os 40
genótipos analisados (Tabela 3), foram obtidos os agrupamentos, através de diferentes
métodos aglomerativos.
O método de otimização de Tocher resultou na formação de 17 grupos, com
distribuição dos genótipos em um grupo maior, além de 6 grupos unitários, formados
por apenas um genótipo (Tabela 4). Os grupos 2 (genótipos 10 - Liderança, 16 – M-
SOY 8400 e 17 M-SOY 8329) e 13 (genótipo 35 – JAB 99174/9.15) foram os mais
divergentes, com distância média intergrupo de 0,59. Os grupos que apresentaram
menor distância entre si foram o 9 (genótipos 14 – M-SOY 8001 e 36 – JAB 99101/2.5)
e o 12 (genótipo 39 – JAB 994311/15.20), com média intergrupo de 0,22. Tal método
apresenta a vantagem da fácil interpretação dos grupos formados, porém, não houve
informações sobre a similaridade dos genótipos dentro de cada grupo. Essa
desvantagem do método também foi observada em MEYER et al. (2004), em
experimentos com linhagens de milho e ARRIEL et al. (2006), com gergelim.
Tabela 3. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através do
complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples.
Genótipo 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1
0,36 0,47 0,39 0,33 0,19 0,39 0,36 0,50 0,50 0,47 0,42 0,56 0,44 0,42 0,58 0,53 0,36 0,47 0,39
2
0,33 0,25 0,08 0,22 0,36 0,22 0,31 0,42 0,28 0,28 0,36 0,42 0,56 0,44 0,50 0,28 0,44 0,42
3
0,36 0,36 0,39 0,36 0,44 0,47 0,36 0,22 0,56 0,42 0,25 0,28 0,39 0,44 0,39 0,33 0,42
4
0,17 0,31 0,22 0,19 0,39 0,50 0,36 0,36 0,39 0,5 0,47 0,64 0,58 0,31 0,47 0,33
5
0,19 0,28 0,14 0,22 0,33 0,19 0,19 0,28 0,44 0,47 0,47 0,42 0,19 0,36 0,33
6
0,25 0,22 0,36 0,31 0,28 0,33 0,42 0,36 0,39 0,44 0,39 0,22 0,39 0,31
7
0,19 0,28 0,39 0,36 0,31 0,39 0,39 0,42 0,53 0,47 0,25 0,36 0,17
8
0,25 0,42 0,28 0,22 0,36 0,47 0,50 0,56 0,50 0,17 0,33 0,25
9
0,28 0,31 0,14 0,22 0,39 0,42 0,36 0,31 0,14 0,25 0,33
10
0,19 0,42 0,22 0,22 0,31 0,14 0,08 0,31 0,25 0,33
11
0,39 0,31 0,31 0,33 0,33 0,28 0,28 0,28 0,36
12
0,36 0,53 0,39 0,39 0,33 0,28 0,39 0,36
13
0,39 0,47 0,36 0,31 0,25 0,25 0,39
14
0,25 0,25 0,31 0,36 0,31 0,28
15
0,28 0,22 0,44 0,39 0,42
16
0,06 0,44 0,39 0,47
17
0,39 0,33 0,42
18
0,22 0,31
19
0,25
Continua...
33
34
Tabela 3. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através do
complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples (Continuação).
Genótipo 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
1
0,31
0,47 0,28 0,36 0,44
0,39 0,22 0,5 0,33
0,25 0,42 0,36 0,42
0,28 0,33 0,36 0,42
0,22 0,36 0,28
2
0,33
0,33 0,25 0,22 0,42
0,31 0,31 0,31 0,42
0,33 0,33 0,33 0,39
0,25 0,36 0,39 0,33
0,36 0,33 0,31
3
0,33
0,39 0,47 0,22 0,42
0,42 0,47 0,53 0,19
0,28 0,22 0,17 0,22
0,36 0,53 0,28 0,28
0,42 0,39 0,42
4
0,36
0,47 0,33 0,36 0,22
0,28 0,39 0,22 0,39
0,36 0,36 0,36 0,42
0,17 0,28 0,53 0,42
0,39 0,36 0,44
5
0,31
0,31 0,22 0,19 0,33
0,22 0,28 0,28 0,33
0,31 0,25 0,25 0,31
0,22 0,33 0,42 0,42
0,44 0,36 0,39
6
0,33
0,28 0,31 0,22 0,47
0,36 0,19 0,36 0,31
0,22 0,22 0,22 0,28
0,25 0,36 0,44 0,39
0,36 0,39 0,31
7
0,36
0,31 0,33 0,36 0,44
0,22 0,33 0,28 0,28
0,36 0,36 0,36 0,42
0,17 0,28 0,53 0,47
0,39 0,36 0,44
8
0,39
0,33 0,25 0,33 0,31
0,25 0,25 0,14 0,31
0,39 0,28 0,33 0,39
0,14 0,19 0,5 0,44
0,42 0,33 0,36
9
0,36
0,19 0,28 0,31 0,44
0,22 0,33 0,33 0,33
0,36 0,36 0,36 0,36
0,33 0,39 0,36 0,36
0,5 0,36 0,44
10
0,36
0,19 0,44 0,25 0,5 0,44 0,44 0,56 0,33
0,36 0,25 0,25 0,25
0,5 0,56 0,31 0,42
0,56 0,42 0,5
11
0,28
0,22 0,42 0,11 0,31
0,42 0,42 0,42 0,25
0,28 0,06 0,11 0,17
0,42 0,47 0,33 0,44
0,58 0,5 0,47
12
0,5 0,33 0,25 0,39 0,42
0,19 0,31 0,31 0,42
0,44 0,44 0,44 0,44
0,31 0,31 0,44 0,44
0,42 0,39 0,42
13
0,31
0,25 0,39 0,31 0,44
0,33 0,39 0,44 0,39
0,36 0,31 0,31 0,25
0,44 0,44 0,47 0,42
0,61 0,47 0,56
14
0,25
0,31 0,44 0,36 0,44
0,5 0,5 0,56 0,28
0,31 0,31 0,31 0,31
0,5 0,56 0,19 0,25
0,44 0,25 0,33
15
0,39
0,39 0,47 0,33 0,42
0,42 0,47 0,64 0,31
0,33 0,33 0,28 0,28
0,42 0,47 0,28 0,22
0,36 0,39 0,47
16
0,50
0,33 0,58 0,39 0,53
0,58 0,58 0,64 0,47
0,50 0,39 0,39 0,39
0,64 0,64 0,28 0,39
0,47 0,39 0,47
Continua...
35
Tabela 3. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através do
complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples (Continuação).
Genótipo
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
17
0,44
0,28
0,53 0,33 0,47
0,53 0,53 0,64 0,42
0,44 0,33 0,33 0,33
0,58
0,58 0,33 0,44
0,53 0,44 0,53
18
0,28
0,22
0,31 0,28 0,36
0,31
0,25 0,31 0,25
0,28 0,22
0,22
0,28
0,25 0,36
0,44
0,39 0,53
0,39 0,47
19
0,28
0,17
0,36 0,33 0,47
0,36
0,25 0,47 0,25
0,39 0,28
0,28
0,22
0,42 0,42
0,33
0,44 0,53
0,44 0,42
20
0,36
0,25
0,22 0,42 0,39
0,28
0,28 0,39 0,28
0,31 0,36
0,36
0,31
0,28 0,28
0,42
0,53 0,44
0,25 0,39
21
0,28
0,36 0,22 0,36
0,47
0,36 0,53 0,25
0,22 0,28
0,28
0,33
0,36 0,47
0,33
0,33 0,47
0,44 0,36
22
0,25 0,17 0,53
0,31
0,25 0,47 0,25
0,28 0,28
0,28
0,22
0,36 0,36
0,39
0,39 0,53
0,50 0,47
23
0,31 0,44
0,11
0,17 0,39 0,28
0,25 0,47
0,42
0,36
0,17 0,22
0,36
0,36 0,39
0,31 0,33
24
0,42
0,36
0,31 0,47 0,19
0,17 0,17
0,11
0,17
0,31 0,47
0,33
0,33 0,47
0,50 0,47
25
0,50
0,56 0,33 0,39
0,36 0,31
0,36
0,42
0,39 0,39
0,47
0,53 0,56
0,42 0,5
26
0,22 0,33 0,33
0,36 0,47
0,42
0,36
0,17 0,22
0,42
0,36 0,39
0,36 0,44
27
0,39 0,33
0,25 0,36
0,31
0,25
0,22 0,28
0,42
0,42 0,33
0,42 0,33
28
0,44
0,53 0,42
0,47
0,53
0,28 0,33
0,58
0,53 0,50
0,42 0,44
29
0,19 0,25
0,19
0,25
0,28 0,44
0,31
0,36 0,50
0,42 0,39
30
0,22
0,17
0,17
0,31 0,42
0,33
0,33 0,42
0,39 0,36
31
0,06
0,11
0,42 0,47
0,39
0,44 0,58
0,50 0,47
32
0,06
0,36 0,53
0,33
0,39 0,53
0,44 0,53
Continua...
36
Tabela 3. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através do
complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples (Continuação).
Genótipo 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
33
0,42 0,47
0,33
0,39
0,53 0,44
0,53
34
0,17
0,47
0,31
0,28 0,31
0,39
35
0,58
0,42
0,28 0,42
0,39
36
0,22
0,31 0,22
0,25
37
0,25 0,28
0,31
38
0,25
0,22
39
0,25
Tabela 4. Formação de grupos pelo método de otimização de Tocher, utilizando a
dissimilaridade através do complemento aritmético do Coeficiente de
Coincidência Simples dos 40 genótipos de soja resistentes ao NCS.
Grupo Indivíduos
I
11, 31, 32, 33, 24, 30, 29, 3
II
16, 17, 10
III
2, 5, 8, 4, 34
IV
23, 26, 27
V
9, 12, 18
VI
7, 20
VII
19, 22
VIII
1, 6
IX
14, 36
X
15, 37
XI
38, 40
XII
39
XIII
35
XIV
21
XV
28
XVI
25
XVII
13
Nos agrupamentos hierárquicos, a delimitação dos grupos é feita de maneira
subjetiva, observando os pontos de alta mudança de nível no dendrograma, por isso,
diferentes padrões de agrupamento podem ocorrer. Quando não se tem informação
sobre a relação genética entre a maioria dos genótipos, não se pode determinar qual
método de agrupamento é mais acurado. Assim, ao se comparar os resultados de
diferentes critérios, podem-se evitar inferências errôneas (ARRIEL, 2004). De acordo
com SNEATH & SOKAL (1973), a formação de um único grupo pode ser enganosa, se
37
38
os indivíduos em extremidades opostas da cadeia forem, de fato, completamente
dissimilares.
Adotou-se um percentual de similaridade genética em torno de 65%, de acordo
com as altas mudanças de níveis observadas nos dendrogramas, além da observação
de dados na literatura. Dessa forma, foi constatada a formação de diferentes
agrupamentos.
No método do Vizinho Mais Próximo (Figura 4), foram formados 27 grupos,
destacando-se vários grupos formados por apenas um genótipo. Formou-se dois
grupos envolvendo 5 genótipos (11, 24, 31, 32, 33) e (2, 5, 8, 28, 34), dois grupos que
envolveram 3 genótipos (10, 16, 17) e (9, 12, 18), e um grupo englobando os genótipos
23 e 26. Os demais grupos apresentaram-se constituídos por apenas um genótipo. Tal
método não se apresentou muito eficaz no agrupamento dos genótipos, pois não
distinguiu grupos, o que permitiu a formação separação da maioria dos genótipos em
grupos distintos.
O método do Vizinho Mais Distante (Figura 5) formou 8 grupos, com os
genótipos bem distribuídos, sendo dois grupos maiores: I (32, 33, 11, 31, 3, 29, 24, 30,
21) e II (7, 20, 23, 26, 8, 34, 35) e os outros grupos menores, com 3 a 5 genótipos. Os
grupos apresentaram-se compactos e discretos. A maioria dos genótipos de geração F8
foram agrupados juntos, confirmando o fato de serem oriundos de um mesmo programa
de melhoramento e possuírem fontes de resistência comuns. Os genótipos 31 (JAB
99102/4.5), 32 (JAB 99102/8.1), 33 (JAB 99103/8.2) e 11 (Nobreza) permaneceram
juntos no agrupamento, além dos genótipos 16 (M-SOY 8400) e 17 (M-SOY 8329), que
também foram os genótipos menos dissimilares de acordo com a matriz de
Coincidência Simples.
Por sua vez, o Método de Ward (Figura 6) formou apenas cinco grupos, a saber:
I (32, 33, 11, 31, 24, 29, 30, 3, 21), II (16, 17, 10, 15, 37, 14, 36, 39), III (6, 27, 1, 38,
40), IV (23, 26, 7, 20, 8, 34, 35, 4, 28, 25) e V (19, 22, 13, 2, 5, 9, 18, 12) e se
diferenciou apenas pela formação de um menor número de grupos, aglomerando
genótipos que foram considerados menos divergentes e separando os genótipos mais
dissimilares em agrupamentos diferentes.
39
O método de Ligação Média Dentro de Grupo (Figura 7.) possibilitou a formação
de 12 grupos englobando de 1 a 9 genótipos cada. Novamente houve coincidência dos
agrupamentos com as distâncias genéticas entre os genótipos, porém esse método
separou alguns genótipos que apareceram juntos em outros métodos e formou um
maior número de agrupamentos.
O agrupamento WPGMA (Figura 9), ou Método da Mediana, apresentou dez
agrupamentos, também muito semelhantes ao UPGMA, Ward, Vizinho mais distante e
Ligação Média Dentro de Grupo. Apresentou apenas o genótipo 25 (98N82) separado
dos demais e manteve os genótipos mais similares em conjunto.
Pode-se observar ainda que, não houve muitas divergências entre os
agrupamentos derivados da matriz de dissimilaridade, oriunda do complemento
aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples, o que pode sugerir uma boa
precisão dos dados obtidos. Com exceção dos métodos de Tocher e Vizinho mais
Próximo, ocorreu o compartilhamento de grupos pela maioria dos métodos. Observa-se
que alguns grupos aparecem iguais nos demais métodos, são eles: um primeiro grupo
formado pelos genótipos 3 (BRS Piraíba), 11 (Nobreza), 21 (Hartwig), 24 (98N71), 29
(Leflore), 30 (Jeff), 31 (JAB 99102/4.5), 32 (JAB 99102/8.1), 33 (JAB 99103/8.2) e 34
(JAB 99174/9.1), com fonte de resistência de Peking e da PI 437654; e outro grupo
constituído pelos genótipos 16 (M-SOY 8400),17 (M-SOY 8329) e 10 (Liderança), todos
derivados de Peking.
No geral, são muitas as coincidências de agrupamentos hierárquicos e também
do de otimização de Tocher. Alguns genótipos aparecem sempre no mesmo grupo,
independente do método aglomerativo, tais como: 32 (JAB 99102/8.1), 33 (JAB
99103/8.2), 11 (Nobreza), 31 (JAB 99102/4.5) e 24 (98N71), com o parental resistente
em comum; 16 (M-SOY 8400),17 (M-SOY 8329) e 10 (Liderança), todos compartilhando
a mesma fonte de resistência; os genótipos 2 (BRS Jiripoca) e 5 (FMT Tucunaré), com
Peking e PI 437654 na genealogia; 9 (FMT Cachara), 12 (Robusta) e 18 (M-SOY 8757),
com fonte de resistência ao NCS derivada de Peking.
Além disso, foram realizadas as projeções das distâncias no plano, que
convertem as medidas de dissimilaridade em escores relativos às variáveis X e Y, que,
40
quando representadas em gráficos de dispersão, refletem no espaço bidimensional, as
distâncias originalmente obtidas a partir do espaço n-dimensional (n = número de
caracteres utilizados para obtenção das distâncias) (Cruz & Carneiro, 2006). Os dados
originais foram calculados e projetados no plano através de diferentes tipos de análise
gráfica. A projeção 2D (bidimensional) revelou uma distorção de 35,8% e estresse de
44,2%, com correlações entre as distâncias originais e as estimadas de 0,58 (Figura
10). Já as projeções 3D (tridimensionais) apresentaram uma menor distorção, de 20,9%
e estresse de 29,7%; a correlação entre as distâncias originais e as estimadas foi de
0,73 (Figura 11 e 12).
O processo de dispersão das medidas de dissimilaridade no plano pode ser
considerado satisfatório quando os coeficientes que expressam o grau de distorção e o
estresse são inferiores a 20% (Cruz & Carneiro, 2006). Dessa forma, as projeções mais
adequadas são as tridimensionais, que apresentam valores de distorção e estresse
mais próximos do adequado, além de alta correlação entre as distâncias originais e as
distâncias estimadas.
A dispersão bidimensional evidencia alguns genótipos mais distantes, tais como
12 (Robusta), 16 (MSOY 8400) e 21 (Hartwig) e alguns genótipos bem próximos como 4
(Tambaqui), 23 (98N41) e 27 (Fayette), além de 31(JAB 99102/4.5), 33 (JAB 99103/8.2)
e 11 (Nobreza); concordando em parte com os resultados dos dendrogramas.
As projeções tridimensionais ilustram um grupo bem adensado, com alguns
genótipos mais distantes, como o 12 (Robusta), 16 (M-SOY 8400), 17 (M-SOY 8329),
21 (Hartwig), 32 (JAB 99102/8.1) e 35 (JAB 99174/9.15). As projeções 3D com rotação
apresentaram-se mais adequadas para visualização e análise, com 3 eixos (x: x1, y: x2
e z: x3). Esse método não obteve muito sucesso na distinção dos genótipos em grupos,
além de não haver adequada distinção entre as coincidências com os resultados dos
agrupamentos hierárquicos.
Figura 4. Representação do dendrograma obtido através do método de Ligação Simples – Vizinho Mais Próximo, a partir
do complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples.
41
42
Figura 5. Representação do dendrograma obtido através do método de Ligação Completa – Vizinho Mais Distante, a
partir do complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples.
43
Figura 6. Representação do dendrograma obtido através do método de Ward, a partir do complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples.
44
Figura 7. Representação do dendrograma obtido através do método de Ligação Média dentro do grupo, a partir do
complemento aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples.
45
Figura 8. Representação do dendrograma obtido através do método de UPGMA, a partir do complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples.
46
Figura 9. Representação do dendrograma obtido através do método WPGMA, a partir do complemento aritmético do
Coeficiente de Coincidência Simples.
47
Figura 10.Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao NCS, expressa pelo complemento
aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples, no espaço bidimensional.
48
Figura 11. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao NCS, expressa pelo complemento
aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples, no espaço tridimensional (3D com rotação).
49
Figura 12. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao NCS, expressa pelo complemento
aritmético do Coeficiente de Coincidência Simples, no espaço tridimensional (3D sem rotação).
Após as análises de agrupamentos foi calculada a matriz dos mais e menos
similares, com a finalidade de Identificar, para cada acesso, aqueles outros que lhes
são mais ou menos similares. São fornecidas as médias gerais e do grupo de acesso
considerado. Foram constatadas algumas coincidências, ainda, entre os agrupamentos
hierárquicos e a matriz dos genótipos mais similares (Tabela 5), havendo confirmação
de alguns agrupamentos observados nos dendrogramas com os dados obtidos pela
matriz que revela os genótipos mais similares.
4.2. Coeficientes de Similaridade pelo Método de Rogers e
Tanimoto
A média aritmética do complemento do coeficiente de similaridade obtido
pelo coeficiente de Rogers e Tanimoto entre todos os genótipos foi de 0,5033 (Tabela
6), sendo pouco superior ao valor encontrado pelo coeficiente de Coincidência Simples.
Os pares de genótipos mais divergentes foram: 4 (Tambaqui) e 16 (M-SOY 8400), 34
(JAB99174/9.1) e 16 (M-SOY 8400), 35 (JAB99174/9.15) e 16 (M-SOY 8400) e o
genótipo 28 (Egyptiam) com os genótipos 15 (M-SOY 8200), 16 (M-SOY 8400) e 17 (M-
SOY 8329), com coeficiente de dissimilaridade igual a 0,7797. Os pares de genótipos
mais similares foram: 16 (M-SOY 8400) e 17 (M-SOY 8329), 11 (Nobreza) e 31
(JAB99102/4.5), 31 (JAB99102/4.5) e 32 (JAB99102/8.1), 32 (JAB99102/8.1) e 33
(JAB99103/8.2), com coeficientes de dissimilaridade igual a 0,11. Os resultados foram
coincidentes com o método anterior (Coincidência Simples).
Após análise de dissimilaridade, foram realizados os agrupamentos dos 40
genótipos resistentes ao NCS, raça 3, estudados, adotando-se um percentual de
similaridade genética em torno de 65%, também utilizada no Coeficiente de
Coincidência Simples.
50
51
Tabela 5. Dez genótipos mais similares, em ordem decrescente, em relação a cada um
dos 40 genótipos estudados com fonte de resistência ao nematóide de
cisto da soja, através do complemento aritmético do Coeficiente de
Similaridade de Coincidência Simples.
Gen
1/
Mais similares Gen Mais similares
1
6, 27, 38, 30, 23, 34, 40, 21, 5, 29
21
24, 30, 14, 29, 11, 18, 19, 22, 31, 32
2
5, 6, 8, 24, 4, 23, 34, 11, 12, 18
22
19, 24, 9, 10, 11, 18, 33, 13, 20, 23
3
32, 29, 11, 24, 31, 33, 14, 15, 30, 36
23
26, 27, 34, 5, 20, 35, 2, 8, 12, 22
4
5, 34, 8, 7, 25, 28, 2, 26, 35, 6
24
11, 32, 22, 30, 31, 33, 5, 29, 2, 3
5
2, 8, 4, 6, 11, 12, 18, 24, 9, 23
25
4, 8, 11, 31, 5, 28, 18, 21, 30, 32
6
1, 5, 27, 2, 8, 18, 24, 30, 31, 32
26
23, 34, 12, 5, 7, 9, 27, 35, 8, 4
7
20, 34, 8, 4, 26, 6, 18, 5, 9, 28
27
23, 6, 1, 26, 34, 8, 18, 19, 22, 30
8
5, 28, 34, 18, 4, 7, 35, 2, 6, 12
28
8, 4, 5, 7, 34, 2, 12, 18, 9, 25
9
12, 18, 22, 5, 13, 26, 8, 19, 7, 10
29
3, 24, 30, 32, 11, 18, 19, 21, 22, 31
10
17, 16, 11, 22, 13, 14, 19, 24, 31, 32
30
24, 32, 33, 29, 6, 21, 31, 1, 23, 27
11
31, 24, 32, 33, 5, 10, 3, 22, 29, 2
31
11, 32, 33, 24, 3, 6, 18, 30, 5, 10
12
9, 5, 26, 8, 23, 2, 18, 7, 27, 28
32
31, 33, 11, 24, 3, 30, 29, 6, 18, 5
13
9, 10, 18, 19, 22, 33, 5, 11, 17, 21
33
32, 31, 11, 24, 30, 3, 19, 22, 10, 13
14
36, 10, 3, 15, 16, 21, 37, 39, 20, 29
34
8, 4, 7, 23, 26, 35, 5, 27, 2, 6
15
17, 37, 14, 3, 16, 32, 33, 36, 10, 29
35
34, 8, 23, 26, 4, 7, 20, 27, 38, 12
16
17, 10, 14, 15, 36, 11, 22, 9, 13, 3
36
14, 37, 39, 40, 3, 15, 16, 10, 29, 38
17
16, 10, 15, 11, 22, 9, 13, 14, 12, 19
37
15, 36, 14, 38, 3, 39, 34, 40 2, 21
18
9, 8, 5, 6, 19, 22, 31, 32, 7, 13
38
1, 40, 37, 39, 34, 35, 36, 27, 2, 6
19
22, 18, 33, 9, 10, 13, 20, 27, 29, 11
39
36, 14, 20, 38, 40, 37, 23, 34, 2, 8
20
7, 23, 8, 19, 22, 39, 14, 26, 27, 29
40
38, 36, 39, 1, 2, 6, 37, 14, 23, 27
1/
Gen = genótipos estudados
Tabela 6. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através
do complemento aritmético do Coeficiente de Similaridade de Rogers e Tanimoto.
Genótipo 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1
0,53
0,64
0,56
0,50
0,33
0,56
0,53
0,67
0,67
0,64
0,59
0,71
0,62
0,59
0,74
0,69
0,53
0,64
0,56
2
0,50
0,40
0,15
0,36
0,53
0,36
0,47
0,59
0,43
0,43
0,53
0,59
0,71
0,62
0,67
0,43
0,62
0,59
3
0,53
0,53
0,56
0,53
0,62
0,64
0,53
0,36
0,71
0,59
0,40
0,43
0,56
0,62
0,56
0,50
0,59
4
0,29
0,47
0,36
0,33
0,56
0,67
0,53
0,53
0,56
0,67
0,64
0,78
0,74
0,47
0,64
0,50
5
0,33
0,43
0,24
0,36
0,50
0,33
0,33
0,43
0,62
0,64
0,64
0,59
0,33
0,53
0,50
6
0,40
0,36
0,53
0,47
0,43
0,50
0,59
0,53
0,56
0,62
0,56
0,36
0,56
0,47
7
0,33
0,43
0,56
0,53
0,47
0,56
0,56
0,59
0,69
0,64
0,40
0,53
0,29
8
0,40
0,59
0,43
0,36
0,53
0,64
0,67
0,71
0,67
0,29
0,50
0,40
9
0,43
0,47
0,24
0,36
0,56
0,59
0,53
0,47
0,24
0,40
0,50
10
0,33
0,59
0,36
0,36
0,47
0,24
0,15
0,47
0,40
0,50
11
0,56
0,47
0,47
0,50
0,50
0,43
0,43
0,43
0,53
12
0,53
0,69
0,56
0,56
0,50
0,43
0,56
0,53
13
0,56
0,64
0,53
0,47
0,40
0,40
0,56
14
0,40
0,40
0,47
0,53
0,47
0,43
15
0,43
0,36
0,62
0,56
0,59
16
0,11
0,62
0,56
0,64
17
0,56
0,50
0,59
18
0,36
0,47
19
0,40
Continua...
52
53
Tabela 6. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através
do complemento aritmético do Coeficiente de Similaridade de Rogers e Tanimoto (Continuação).
Genótipo 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
1
0,47
0,64
0,43
0,53
0,62
0,56
0,36
0,67
0,50
0,40
0,59
0,53
0,59
0,43
0,50
0,53
0,59
0,36
0,53
0,43
2
0,50
0,50
0,40
0,36
0,59
0,47
0,47
0,47
0,59
0,50
0,50
0,50
0,56
0,40
0,53
0,56
0,50
0,53
0,50
0,47
3
0,50
0,56
0,64
0,36
0,59
0,59
0,64
0,69
0,33
0,43
0,36
0,29
0,36
0,53
0,69
0,43
0,43
0,59
0,56
0,59
4
0,53
0,64
0,50
0,53
0,36
0,43
0,56
0,36
0,56
0,53
0,53
0,53
0,59
0,29
0,43
0,69
0,59
0,56
0,53
0,62
5
0,47
0,47
0,36
0,33
0,50
0,36
0,43
0,43
0,50
0,47
0,40
0,40
0,47
0,36
0,50
0,59
0,59
0,62
0,53
0,56
6
0,50
0,43
0,47
0,36
0,64
0,53
0,33
0,53
0,47
0,36
0,36
0,36
0,43
0,40
0,53
0,62
0,56
0,53
0,56
0,47
7
0,53
0,47
0,50
0,53
0,62
0,36
0,50
0,43
0,43
0,53
0,53
0,53
0,59
0,29
0,43
0,69
0,64
0,56
0,53
0,62
8
0,56
0,50
0,40
0,50
0,47
0,40
0,40
0,24
0,47
0,56
0,43
0,50
0,56
0,24
0,33
0,67
0,62
0,59
0,50
0,53
9
0,53
0,33
0,43
0,47
0,62
0,36
0,50
0,50
0,50
0,53
0,53
0,53
0,53
0,50
0,56
0,53
0,53
0,67
0,53
0,62
10
0,53
0,33
0,62
0,40
0,67
0,62
0,62
0,71
0,50
0,53
0,40
0,40
0,40
0,67
0,71
0,47
0,59
0,71
0,59
0,67
11
0,43
0,36
0,59
0,20
0,47
0,59
0,59
0,59
0,40
0,43
0,11
0,20
0,29
0,59
0,64
0,50
0,62
0,74
0,67
0,64
12
0,67
0,50
0,40
0,56
0,59
0,33
0,47
0,47
0,59
0,62
0,62
0,62
0,62
0,47
0,47
0,62
0,62
0,59
0,56
0,59
13
0,47
0,40
0,56
0,47
0,62
0,50
0,56
0,62
0,56
0,53
0,47
0,47
0,40
0,62
0,62
0,64
0,59
0,76
0,64
0,71
14
0,40
0,47
0,62
0,53
0,62
0,67
0,67
0,71
0,43
0,47
0,47
0,47
0,47
0,67
0,71
0,33
0,40
0,62
0,40
0,50
15
0,56
0,56
0,64
0,50
0,59
0,59
0,64
0,78
0,47
0,50
0,50
0,43
0,43
0,59
0,64
0,43
0,36
0,53
0,56
0,64
16
0,67
0,50
0,74
0,56
0,69
0,74
0,74
0,78
0,64
0,67
0,56
0,56
0,56
0,78
0,78
0,43
0,56
0,64
0,56
0,64
Continua...
54
Tabela 6. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através
do complemento aritmético do Coeficiente de Similaridade de Rogers e Tanimoto (Continuação).
Genótipo 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
17
0,62
0,43
0,69
0,50
0,64
0,69
0,69
0,78
0,59
0,62
0,50
0,50
0,50
0,74
0,74
0,50
0,62
0,69
0,62
0,69
18
0,43
0,36
0,47
0,43
0,53
0,47
0,40
0,47
0,40
0,43
0,36
0,36
0,43
0,40
0,53
0,62
0,56
0,69
0,56
0,64
19
0,43
0,29
0,53
0,50
0,64
0,53
0,40
0,64
0,40
0,56
0,43
0,43
0,36
0,59
0,59
0,50
0,62
0,69
0,62
0,59
20
0,53
0,40
0,36
0,59
0,56
0,43
0,43
0,56
0,43
0,47
0,53
0,53
0,47
0,43
0,43
0,59
0,69
0,62
0,40
0,56
21
0,43
0,53
0,36
0,53
0,64
0,53
0,69
0,40
0,36
0,43
0,43
0,50
0,53
0,64
0,50
0,50
0,64
0,62
0,53
22
0,40
0,29
0,69
0,47
0,40
0,64
0,40
0,43
0,43
0,43
0,36
0,53
0,53
0,56
0,56
0,69
0,67
0,64
23
0,47
0,62
0,20
0,29
0,56
0,43
0,40
0,64
0,59
0,53
0,29
0,36
0,53
0,53
0,56
0,47
0,50
24
0,59
0,53
0,47
0,64
0,33
0,29
0,29
0,20
0,29
0,47
0,64
0,50
0,50
0,64
0,67
0,64
25
0,67
0,71
0,50
0,56
0,53
0,47
0,53
0,59
0,56
0,56
0,64
0,69
0,71
0,59
0,67
26
0,36
0,50
0,50
0,53
0,64
0,59
0,53
0,29
0,36
0,59
0,53
0,56
0,53
0,62
27
0,56
0,50
0,40
0,53
0,47
0,40
0,36
0,43
0,59
0,59
0,50
0,59
0,50
28
0,62
0,69
0,59
0,64
0,69
0,43
0,50
0,74
0,69
0,67
0,59
0,62
29
0,33
0,40
0,33
0,40
0,43
0,62
0,47
0,53
0,67
0,59
0,56
30
0,36
0,29
0,29
0,47
0,59
0,50
0,50
0,59
0,56
0,53
31
0,11
0,20
0,59
0,64
0,56
0,62
0,74
0,67
0,64
32
0,11
0,53
0,69
0,50
0,56
0,69
0,62
0,69
Continua...
55
Tabela 6. Medidas de dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto, calculadas através
do complemento aritmético do Coeficiente de Similaridade de Rogers e Tanimoto (Continuação).
Genótipo 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
33
0,59
0,64 0,50
0,56 0,69
0,62
0,69
34
0,29 0,64
0,47 0,43
0,47
0,56
35
0,74
0,59 0,43
0,59
0,56
36
0,36 0,47
0,36
0,40
37
0,40
0,43
0,47
38
0,40
0,36
39
0,40
O Método de Otimização de Tocher (Tabela 7) identifica o par de indivíduos mais
similares para formar o grupo inicial e a partir daí avalia a possibilidade de inclusão de
novos indivíduos com o critério que a distância média intragrupo deve ser menor que a
distância média intergrupo (CRUZ & CARNEIRO, 2006). Apresentou a formação de 17
grupos, idênticos aos grupos apresentados pelo Coeficiente de Coincidência Simples.
Os grupos mais divergentes, foram 2 e 15 englobando os genótipos: 16 (M-SOY 8400),
17 (M-SOY 8329) e 10 (BRSMG Liderança); e 15 (M-SOY 8200) e 37 (JAB 99102/4.2),
respectivamente, com coeficiente de dissimilaridade igual a 0,76. Os grupos mais
semelhantes foram 9 e 12, com 0,38 de dissimilaridade. O grupo 9 foi formado pelos
genótipos 14 (M-SOY 8001) e 36 (JAB 99101/2.5) e o grupo 12 composto por 39 (JAB
994311/15.20). Nota-se que os agrupamentos realizados a partir das dissimilaridades
de Rogers e Tanimoto foram exatamente iguais aos resultados obtidos pelo método de
Coincidência Simples, com alteração apenas nos valores médios das distâncias intra e
intergrupos, o que acarretou em alterações nos grupos mais e menos similares.
No método hierárquico de Ligação Simples – Vizinho mais Próximo (Figura 13)
as conexões entre grupos são feitas por ligações simples entre pares de indivíduos, ou
seja, as distâncias entre grupos são definidas como sendo aquela entre os indivíduos
mais parecidos entre esses grupos (CRUZ & CARNEIRO, 2006). Foram formados 32
grupos, sendo 28 destes compostos por um só genótipo (1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14,
15, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 27, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40). Um grupo maior
englobou os genótipos 11 (Nobreza), 24 (98N71), 31 (JAB 99102/4.2), 32 (JAB
99102/8.1) e 33 (JAB 99103/8.2). Houve ainda a formação de mais dois grupos: um
formado pelos genótipos 10 (BRSMG Liderança), 16 (M-SOY 8400) e 17 (M-SOY
8329) e outro pelos genótipos 23 (98N41) e 26 (Foster). Tais resultados apresentaram-
se bem diferentes daqueles obtidos pelo coeficiente de Coincidência Simples.
56
57
Tabela 7. Formação de grupos através do método de otimização de Tocher, utilizando
o complemento aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto dos 40
genótipos de soja resistentes ao NCS estudados.
Grupo Indivíduos
I
11, 31, 32, 33, 24, 30, 3, 29
II
16, 17, 10
III
2, 5, 8, 34, 4
IV
23, 26, 27
V
9, 12, 18
VI
7, 20
VII
19, 22
VIII
1, 6
IX
14, 36
X
15, 37
XI
38, 40
XII
39
XIII
35
XIV
21
XV
28
XVI
25
XVII
13
O método Ligação Completa – Vizinho Mais Distante (Figura 14) define a
similaridade entre dois grupos como aquela apresentada pelos indivíduos de cada
grupo que menos se identificam (MEYER, 2002). A partir desse método, 10
agrupamentos foram formados, abrangendo de 2 a 9 genótipos, revelando alguns
grupos bem semelhantes ao mesmo agrupamento utilizando o complemento aritmético
do Coeficiente de Coincidência Simples. Alguns grupos apresentaram-se iguais ao
58
método aplicado anteriormente, tais como: I (32, 33, 11, 31, 3, 29, 24, 30, 21); II (16,
17, 10); III (4, 28, 25); IV (9, 18, 19, 22, 13); V (2, 5, 12); VI (7, 20, 23, 26, 8, 34, 35).
O método de Ward (Figura 15) considera para formação inicial do grupo, aqueles
indivíduos que proporcionam a menor soma de quadrados dos desvios (CRUZ &
CARNEIRO, 2006). Tal método revelou 6 grandes grupos: I (32, 33, 11, 31, 24, 29, 30,
3, 21); II (16, 17, 10); III (15, 37, 14, 36, 39); IV (9, 18, 12, 19, 22, 13); V (6, 27, 1, 38,
40) e VI (23, 26, 7, 20, 2, 5, 8, 34, 35, 4, 28, 25).
A Ligação Média Dentro de Grupo (Figura 16) calcula a similaridade média dos
indivíduos do grupo e depois os coeficientes de similaridade do indivíduo que pretende
se juntar ao grupo. Este método apresentou 18 grupos com muita distribuição dos
genótipos e muitos grupos formados por apenas um genótipo. Alguns genótipos
mantiveram-se agrupados de forma semelhante aos outros métodos, mas com
alterações na composição geral dos grupos.
O agrupamento por UPGMA (Figura 17) é, recentemente, o mais utilizado nos
estudos de divergência genética (DIAS, 1998; CRUZ & CARNEIRO, 2006), este
algoritmo não considera a estrutura de subdivisão do grupo, dando pesos iguais a cada
indivíduo do grupo e calcula a similaridade média de um indivíduo que pretende se
juntar ao grupo já existente (MEYER, 2002). Tal método propôs a formação de 15
grupos, assim como o WPGMA (Figura 18), que difere do método anterior por ser não
ponderado, ou seja, não aferir pesos diferentes aos indivíduos que já se uniram o grupo
e aos que pretender se unir. Ambos, UPGMA e WPGMA apresentaram um padrão de
agrupamento completamente semelhante, com formação de grupos iguais, fato também
observado em partes em relação ao Coeficiente de Coincidência Simples.
Na maioria das vezes, verifica-se que, apesar da estrutura final mostrar-se
parecida, ocorreram algumas alterações nos níveis em que os genótipos são
agrupados. Entretanto, apesar de tal fato, existem genótipos que se mantiveram no
mesmo grupo na maioria dos métodos aglomerativos, como os genótipos 10 (BRSMG
Liderança), 16 (M-SOY 8400), 17 (M-SOY 8329), todos com fonte de resistência de
Peking; os genótipos 3 (BRS Piraíba), 11 (Nobreza), 24 (98N71), 29 (Leflore), 30 (Jeff),
31 (JAB 99102/4.5), 32 (JAB 99102/8.1), 33 (JAB 99103/8.2), com a cultivar Peking
59
envolvida na genealogia; os genótipos 9 (FMT Cachara), 12 (Robusta), 18 (M-SOY
8757), também oriundos de Peking; os genótipos 2 (BRS Jiripoca) e 5 (FMT Tucunaré),
compartilhando Peking e PI 437654 em sua genealogia; os genótipos 19 (BRSMT
Pintado) e 22 (MGBR 9520937); entre outros.
As projeções das distâncias das dissimilaridades calculadas pelo Coeficiente de
Rogers e Tanimoto no espaço bidimensional e tridimensional apresentaram-se menos
satisfatórias do que as obtidas pelo coeficiente de Coincidência Simples. A projeção 2D
(bidimensional) revelou uma distorção de 47% e estresse de 51,8%, com correlações
entre as distâncias originais e as estimadas de 0,55 (Figura 19). Já as projeções 3D
(tridimensionais) apresentaram uma menor distorção, de 34,95% e estresse de 39,85%;
onde a correlação entre as distâncias originais e as estimadas foi de 0,66 (Figuras 20 e
21).
Enquanto que as projeções 2D apresentaram uma certa dispersão dos genótipos,
com os indivíduos 12 (Robusta), 16 (M-SOY 8400), 21 (Hartwig) e 35 (JAB99174/9.15)
mais afastados dos demais; as projeções tridimensionais no plano revelaram uma
grande proximidade entre todos os genótipos. Podem-se verificar claramente os
genótipos 10 (Liderança), 16 (M-SOY 8400) e 17 (M-SOY 8329) mais unidos entre si e
um pouco mais afastados dos outros, concordando com métodos de agrupamento
hierárquicos e de otimização. Novamente o genótipo 21 (Hartwig) aparece mais
distanciado dos grupos, assim como o genótipo 12 (Robusta) e o 35 (JAB99174/9.15).
A matriz dos genótipos mais similares revelou muitas coincidências de
agrupamento, sendo útil como complemento para as análises (Tabela 8).
60
Figura 13.Representação do dendrograma obtido através do Método de Ligação Simples – Vizinho Mais Próximo, a partir
do complemento aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.
61
Figura 14. Representação do dendrograma obtido através do Método de Ligação Completa - Vizinho mais Distante, a
partir do complemento aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.
62
Figura 15. Representação do dendrograma obtido pelo Método de Ward, a partir do complemento aritmético do
Coeficiente de Rogers e Tanimoto.
63
Figura 16. Representação do dendrograma obtido através do Método de Ligação Média Dentro de Grupo, a partir
do complemento aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.
64
Figura 17. Representação do dendrograma obtido através do Método de Agrupamento UPGMA, a partir do complemento
aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.
65
Figura 18. Representação do dendrograma obtido pelo Método da Mediana - WPGMA, a partir do complemento
aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.
66
Figura 19. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao NCS, expressa pelo complemento
aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto, no espaço bidimensional.
67
Figura 20. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao NCS, expressa pelo complemento
aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto, no espaço tridimensional (3D com rotação).
68
Figura 21. Projeção da dissimilaridade entre 40 genótipos de soja resistentes ao NCS, expressa pelo complemento
aritmético do Coeficiente de Rogers e Tanimoto, no espaço tridimensional (3D sem rotação).
69
Tabela 8. Dez genótipos mais similares, em ordem decrescente, em relação a cada um
dos 40 genótipos estudados com fonte de resistência ao nematóide de
cisto da soja, através do Coeficiente de Rogers e Tanimoto.
Gen
1/
Mais similares Gen Mais similares
1
6, 27, 38, 30, 23, 34, 40, 21, 5, 29
21
24, 30, 14, 29, 11, 18, 19, 22, 31, 32
2
5, 6, 8, 24, 4, 23, 34, 11, 12, 18
22
19, 24, 9, 10, 11, 18, 33, 13, 20, 23
3
32, 29, 11, 24, 31, 33, 14, 15, 30, 36
23
26, 27, 34, 5, 20, 35, 2, 8, 12, 22
4
5, 34, 8, 7, 25, 28, 2, 26, 35, 6
24
11, 32, 22, 30, 31, 33, 5, 29, 2, 3
5
2, 8, 4, 6, 11, 12, 18, 24, 9, 23
25
4, 8, 11, 31, 5, 28, 18, 21, 30, 32
6
1, 5, 27, 2, 8, 18, 24, 30, 31, 32
26
23, 34, 12, 5, 7, 9, 27, 35, 8, 4
7
20, 34, 8, 4, 26, 6, 18, 5, 9, 28
27
23, 6, 1, 26, 34, 8, 18, 19, 22, 30
8
5, 28, 34, 18, 4, 7, 35, 2, 6, 12
28
8, 4, 5, 7, 34, 2, 12, 18, 9, 25
9
12, 18, 22, 5, 13, 26, 8, 19, 7, 10
29
3, 24, 30, 32, 11, 18, 19, 21, 22, 31
10
17, 16, 11, 22, 13, 14, 19, 24, 31, 32
30
24, 32, 33, 29, 6, 21, 31, 1, 23, 27
11
31, 24, 32, 33, 5, 10, 3, 22, 29, 2
31
11, 32, 33, 24, 3, 6, 18, 30, 5, 10
12
9, 5, 26, 8, 23, 2, 18, 7, 27, 28
32
31, 33, 11, 24, 3, 30, 29, 6, 18, 5
13
9, 10, 18, 19, 22, 33, 5, 11, 17, 21
33
32, 31, 11, 24, 30, 3, 19, 22, 10, 13
14
36, 10, 3, 15, 16, 21, 37, 39, 20, 29
34
8, 4, 7, 23, 26, 35, 5, 27, 2, 6
15
17, 37, 14, 3, 16, 32, 33, 36, 10, 29
35
34, 8, 23, 26, 4, 7, 20, 27, 38, 12
16
17, 10, 14, 15, 36, 11, 22, 9, 13, 3
36
14, 37, 39, 40, 3, 15, 16, 10, 29, 38
17
16, 10, 15, 11, 22, 9, 13, 14, 12, 19
37
15, 36, 14, 38, 3, 39, 34, 40, 2, 21
18
9, 8, 5, 6, 19, 22, 31, 32, 7, 13
38
1, 40, 37, 39, 34, 35, 36, 27, 2, 6
19
22, 18, 33, 9, 10, 13, 20, 27, 29, 11
39
36, 14, 20, 38, 40, 37, 23, 34, 2, 8
20
7, 23, 8, 19, 22, 39, 14, 26, 27, 29
40
38, 36, 39, 1, 2, 6, 37, 14, 23, 27
1/
Gen = genótipos estudados
70
4.3. Correlação entre Matrizes
A correlação entre as matrizes de dissimilaridade obtidas pelos Coeficientes de
Coincidência Simples e de Rogers e Tanimoto revelou-se significativa a 1% de
probabilidade pelo Teste t e pelo Teste de Mantel baseado em 1000 simulações,
demonstrando-se altamente correlacionadas, com valor de correlação igual a 0,99409
(Figura 22).
O emprego dos dois coeficientes causou poucas alterações no agrupamento das
cultivares, o que também foi observado por DUARTE et al. (1999), na comparação de
oito coeficientes de similaridade, baseados em marcadores RAPD, em feijão; e ROCHA
(2000), que comparou oito coeficientes de similaridade por meio de marcadores RAPD
em batata e não observou alteração no agrupamento dos genótipos estudados.
4.4. Considerações Finais
A média aritmética dos coeficientes de dissimilaridade obtidos através do
complemento aritmético dos coeficientes de Coincidência Simples e Rogers e Tanimoto
apresentaram valores de reduzidos a médios, 0,36 e 0,50, respectivamente. PRIOLLI et
al. (2002), encontraram em seus estudos coeficientes de dissimilaridade entre 0,4 e 0,9,
quando realizam-se comparações entre cultivares brasileiras de soja, através de
marcadores SSR. Os valores médios de similaridade também variaram em outros
estudos, como em SMITH et al. (2000), que evidenciou um valor médio de similaridade
de 0,38, utilizando marcadores RFLP e 0,36 utilizando marcadores SSR, em sorgo. Por
sua vez, ABDELNOOR et al. (1995) obtiveram média de similaridade de 0,82 em
estudos com marcadores RAPD em soja.
71
Figura 22. Correlação entre as matrizes de dissimilaridade de Rogers e Tanimoto e de
Coincidência Simples.
Os resultados dos diferentes métodos aglomerativos confirmaram a existência de
uma estrutura natural de agrupamento em função da similaridade genética entre os
genótipos. Ressalta-se, entretanto, a importância do emprego de mais de um método
de agrupamento, em função das diferenças na hierarquização, otimização e ordenação
dos mesmos. Isto permite que as classificações dos grupos se complementem em
função dos critérios que cada técnica utiliza, impedindo que inferências errôneas sejam
adotadas na alocação de genótipos dentro de um determinado subgrupo (Arriel, 2004).
Alguns métodos mais comumente utilizados como o Vizinho Mais Distante, Ward,
WPGMA e UPGMA foram considerados adequados ao agrupamento de genótipos no
72
presente estudo, apresentando coincidência de resultados, inclusive com relação às
fontes de resistências encontradas nas genealogias dos genótipos. Conclusões
semelhantes foram obtidas por ARRIEL et al. (2006) para gergelim e MEYER et al.
(2004) para genótipos de milho. Além disso, muitos estudos atualmente adotam apenas
o método UPGMA para análises de agrupamentos, como SMITH et al. (2000) com SSR
em sorgo; PEREIRA & KERR (2001) com RAPD em abacaxizeiro; OLIVEIRA et al.
(2002) com RAPD em citrus e AREIAS et al. (2006) com RAPD em arroz.
As projeções bi e tridimensionais não apresentaram índices satisfatórios,
sugerindo que tal método não é o mais adequado para esses tipos de dados e as
projeções não são eficientes para representar as matrizes de similaridade. De acordo
com CRUZ & CARNEIRO (2006) o processo de dispersão das medidas de
dissimilaridade no plano pode ser considerado satisfatório quando os coeficientes que
expressam o grau de distorção e o estresse são inferiores a 20%, fato que não ocorreu
no presente estudo para quaisquer dos métodos utilizados. Tais resultados também
foram obtidos por MEYER et al (2004), que obtiveram valores de distorção entre 44 e
67% e estresse chegando a 71,35%, para marcadores AFLP e RAPD e para vários
coeficientes de similaridade ou dissimilaridade. EMYGDIO et al. (2003) em estudos com
genótipos de feijão obtiveram, para o coeficiente de Coincidência Simples, distorção de
29,7%, correlação de 0,924 e estresse de 32,9% na projeção das distâncias genéticas
em um espaço bidimensional. Para o coeficiente de Rogers e Tanimoto, encontraram
maiores problemas, assim como no presente estudo (51,8%), com distorção de 33%,
correlação de 0,008 e estresse de 61,4%, sendo o maior valor de estresse observado
pelos coeficientes de Russel e Rao e Rogers e Tanimoto, com níveis considerados
insatisfatórios.
Apesar de algumas diferenças na estrutura dos agrupamentos, e alterações nas
relações entre os genótipos nos diferentes coeficientes, alguns genótipos mantiveram-
se agrupados, com baixa dissimilaridade genética e outros se apresentaram mais
divergentes, em todos os agrupamentos.
73
5. CONCLUSÕES
De acordo com os dados obtidos, pode-se concluir que:
1. Os genótipos de soja resistentes ao nematóide de cisto
apresentaram baixa divergência genética entre si;
2. Os marcadores microssatélites permitem identificar grupos similares
e genótipos divergentes, apresentando-se eficientes no estudo de divergência
genética entre genótipos de soja;
3. As projeções no plano não apresentaram resultados satisfatórios;
4. A combinação das informações provenientes dos diferentes
métodos de agrupamentos mostrou-se eficiente na separação dos genótipos e
cultivares de soja em grupos distintos.
74
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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