( PDF ) Avaliação da ação da quitosana em orabase na reparação tecidual quando associada ou não ao laser visível de ?; 660 nm

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA DA UFPB-UFBA

DOUTORADO EM ESTOMATOLOGIA

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DA QUITOSANA EM ORABASE NA REPARAÇÃO

TECIDUAL QUANDO ASSOCIADA OU NÃO AO LASER

VISÍVEL DE λ 660 NM

RICARDO A. S. GURGEL

João Pessoa

2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA DA UFPB-UFBA

DOUTORADO EM ESTOMATOLOGIA

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DA QUITOSANA EM ORABASE NA REPARAÇÃO

TECIDUAL QUANDO ASSOCIADA OU NÃO AO LASER

VISÍVEL DE λ 660 NM

RICARDO ALEXANDRE SOARES GURGEL

Orientadores: Profª. Drª. Tânia Lemos Coelho Rodrigues

Prof. Dr. Francisco de Assis Limeira Júnior

João Pessoa

2008

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Odontologia da Universidade Federal da Paraíba,

área de concentração em Estomatologia, para

obtenção do título de Doutor.

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DATA DA DEFESA: 12 de DEZEMBRO de 2008

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Profª. Drª.Tânia Lemos Coelho Rodrigues

Orientadora

_______________________________________

Prof. Dr. Riedel Frota

Examinador Externo

_______________________________________

Prof. Dr. José Rodrigues Laureno Filho

Examinador Externo

_______________________________________

Profª. Drª. Claudia Roberta Leite Vieira de Figueiredo

Examinadora Interna

_________________________________________

Prof. Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues

Examinador Interno

_________________________________________

Prof. Dr. José Ivo Queiroz do Amaral

Suplente

_________________________________________

Prof. Dr. Francisco de Assis Limeira Júnior

Suplente

Dedico este trabalho a memória de meu Pai Garibaldi

Gurgel, por estar sempre preocupado com minha educação

e apoiando meu crescimento na vida acadêmica e

profissional.

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente a Deus por me proporcionar tantas vitórias, por

me dar forças para superar obstáculos e discernimento nas horas difíceis.

A minha Mãe, Salet, pela preocupação com minha formação profissional

e pelos conselhos pertinentes.

Ao meu Irmão, Garibaldi Jr. e minha Cunhada, Idê, meus orientadores

desde a infância, sempre me guiaram pelo melhor caminho.

Ao meu sogro, Gil Braz e minha sogra, Iara meus fiéis torcedores, me

adotaram como filho e vibram a cada conquista.

A minha esposa, Giliara Carol, devo fazer um agradecimento especial

por ter sido minha companheira em todos os momentos, devo confessar que a

idéia para este trabalho partiu dela, mas isto fica só entre nós, espero que meu

amor por você possa compensar tudo que fez por mim.

Ao meu filho, Demétrio, a inocência e a doçura da infância que

transbordam de você, me revigoram todos os dias.

A minha cunhada Ysa, pela dedicação durante todo período

experimental, cumprindo com louvor todas as tarefas que foram delegadas no

laboratório.

Ao amigo Álvaro, companheiro de caminhada desde a especialização,

compartilhando momentos de incerteza, dificuldades e conquistas.

Aos amigos e colegas de Doutorado Allan, Denise, Karina, Luis,

Marcos e Monique.

A amiga Andréa Queiroga, por nos ajudar durante o período

experimental e pelas dicas diante as dificuldades técnicas da pesquisa.

Aos meus orientadores Profª.Drª. Tânia e Prof. Dr. Limeira amigos e

colegas de profissão, externo aqui minha gratidão pelo estimulo à pesquisa e a

docência.

Aos Coordenadores da Pós-Graduação, Prof. Dr. Ricardo Duarte, Prof.

Dr. Lino e Prof. Dr. Fabiano pela ajuda nas horas de dificuldade.

A Prof. Dr. Claudia Roberta, pela compreensão e dedicação em realizar

as análises histológicas, sempre nos ajudando a melhorar o nosso trabalho.

Ao Prof. Dr Emanuel, por permitir o processamento histotécnico no

Laboratório de Patologia Bucal da FOP-UPE.

Ao Prof. Dr. Frederico, do Laboratório de Microscopia do CCS, pela sua

dedicação em nos ajudar a fotografar as lâminas.

A Drª Célia da Farmácia de manipulação Dilecta, por ter colaborado com

a confecção dos fármacos utilizados durante a pesquisa.

A Armando, Catarina e Silvana, pela paciência e colaboração para

confeccionar nossas lâminas.

A Crispim responsável pelo Biotério do LTF, e todos os funcionários

envolvidos com os cuidados dos animais destinados a pesquisa.

A Fátima, ACD dedicada, ajudou no preparo do instrumental cirúrgico

para os experimentos.

Aos estagiários do LEA, Suênnya, Thiago, Carol, Lariane e em

especial o amigo Adelmo, pela contribuição durante o período experimental.

Enfim, agradeço a todos que colaboraram direta ou indiretamente com o

desenvolvimento deste trabalho, a todos vocês meu carinho e minha

admiração.

“Se não morre o homem que escreve um livro ou planta

uma árvore, com mais razão não morre o educador,

que semeia a vida e escreve na alma”.

Bertold Brecht

RESUMO

O presente trabalho foi desenvolvido como objetivo de avaliar

macroscópicamente e morfológicamente os efeitos da quitosana em orabase

associada ou não ao laser de 660 nm, na reparação tecidual. Neste estudo

experimental foram utilizados 75 ratos, machos, da linhagem Wistar, divididos

aleatoriamente em 5 grupos: G1 (controle), G2 (orabase), G3 (orabase de

quitosana 2%), G4 (laser) e G5 (laser + quitosana em orabase à 2%). Foram

confeccionados feridas no dorso dos animais medindo em torno de 5 mm.

Foram obedecidos os periodos de observação e sacrifício com 3, 7 e 14 dias e

os resultaodos foram submetidos a análise estatística. A partir dos resultados

pode se concluir que: no período inicial da cicatrização, o uso da quitosana em

orabase associado Laserterapia promoveu, macroscopicamente, maior

contração da ferida e melhores padrões de cicatrização; O grupo tratado com

quitosana apresentou resultados semelhantes, ao grupo tratado com

Laserterapia, sobre o controle da inflamação, formação de crosta e

angiogênese, além de promover maior precocidade na reepitelização. O

tratamento com quitosana em orabase apresentou graus de colagenização

semelhantes à Laserterapia.

Descritores: Quitosana, Quitina, Laser, Reparo Tecidual.

ABSTRACT

The present work was developed as objective to evaluate macrocospically and

morphologically the effect of the chitosan in orabase, associated or not to the

660 nm laser in the tissue repair. In this experimental study were used 75 rats,

male, of the Wistar strain, randomly divided into 5 groups: G1 (control), G2

(orabase), G3 (orabase of chitosan 2%), G4 (laser) and G5 (laser + orabase of

chitosan 2%). They had been confectioned wounded in the back of the animals

measuring around 5 mm and had been obeyed to the periods of observation

and sacrifice with 3, 7 and 14. The results were subjected to statistical analysis.

From the results can be concluded that in the initial period of healing, the use of

chitosan in orabase associated laser promoted, macroscopically, greater

contraction of the wound and better standards of healing. The group treated

with chitosan showed similar results, as the group treated with Laser, about the

control of inflammation, formation of crust and angiogenesis, in addition to

promoting greater early in reepithelialization. Treatment with chitosan in

orabase showed levels of collagen similar to the laser.

Key Words: Chitosan, Quitin, Laser, tissue repair.

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1- Estrutura da Quitina e da Quitosana. 31

Fig. 2 – Acondicionamento dos Animais. 51

Fig. 3 – Acondicionamento dos Fármacos. 53

Fig. 4 – Mensuração da Massa Corporal dos Animais. 54

Fig. 5 – Aplicação dos Fármacos nas Feridas. 55

Fig. 6 – Contenção dos Animais. 55

Fig. 7 – Material para Aplicação dos Fármacos Sobre as Feridas. 56

Fig. 8 - Irradiação do Laser. 57

Fig. 9 – Remoção do espécime. 58

Fig. 10 – Aferição do Diâmetro da Ferida com Paquímetro. 60

Fig. 11 – Presença de halo hiperêmico e fundo sangrante (G1A). 65

Fig. 12 – Aspecto da borda necrótica (G1A). 66

Fig.13 – Aspecto da ausência de borda necrótica (G3A) 67

Fig. 14 – Presença da crosta (G4A) 67

Fig. 15 – Ausência da crosta (G5C). 68

Fig. 16 – Presença de crosta intensa, com 03 dias, em HE

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 17 – Presença de crosta intensa, com 03 dias, em HE

(Maior aumento, escala de referência 100 µm).

Fig. 18 – Ausência de crosta, com 07 dias, em HE

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 19 – Presença intensa de células inflamatórias, na crosta, 03 dias,

em HE (Escala de referência 100 µm).

Fig. 20 – Presença intensa de angiogênese, 03 dias, em HE

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 21 – Presença intensa de tecido de granulação, 03 dias, em HE

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 22 – Colagenização discreta, em TM, Grupo Controle com 03 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 23 – Colagenização discreta, em TM, Grupo Controle com 07 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 24 – Colagenização moderada, em TM, Grupo Controle com 14

dias (Escala de referência 100 µm)

Fig. 25 – Colagenização discreta, em TM, Grupo Orabase com 03 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 26 – Colagenização moderada, em TM, Grupo Orabase 07 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 27 – Colagenização moderada, em TM, Grupo Orabase com 14

dias (Escala de referência 100 µm)

Fig. 28 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Quitosana

com 03 dias (Escala de referência 100 µm)

Fig. 29 – Colagenização moderada/intensa, em TM, Grupo Quitosana

com 07dias (Escala de referência 100 µm)

Fig. 30 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Quitosana com 14 dias

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 31 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Laser com

03 dias (Escala de referência 100 µm)

Fig. 32 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Laser com 07 dias

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 33 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Laser com 14 dias

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 34 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Quitosana

e Laser com 03 dias (Escala de referência 100 µm).

Fig. 35 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Quitosana

e Laser com 14 dias (Escala de referência 100 µm).

Fig. 36 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Quitosana e Laser

com 14 dias (Escala de referência 100 µm).

Fig. 37 – Reepitelização da Ferida, em HE, com 14 dias

(Escala de referência 100 µm).

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Avaliação da infecção segundo o grupo por período. 63

Tabela 2 – Avaliação do halo hiperêmico segundo o grupo por período. 64

Tabela 3 – Avaliação da borda necrótica segundo o grupo por período. 66

Tabela 4 – Avaliação da crosta segundo o grupo por período. 68

Tabela 5 – Avaliação do fundo sangrante segundo o grupo por período. 69

Tabela 6 – Avaliação da contração da ferida segundo o grupo por

eríodo.

Tabela 7 – Avaliação da crosta segundo o grupo por período. 72

Tabela 8 – Avaliação da inflamação segundo o grupo por período. 74

Tabela 9 – Avaliação da angiogênese segundo o grupo por período. 76

Tabela 10 – Avaliação da angiogênese segundo o período por grupo. 77

Tabela 11 – Avaliação do tecido de granulação segundo o grupo por

período.

Tabela 12 – Avaliação do colagenização segundo o grupo por período. 81

Tabela 13 – Avaliação da reepitelização segundo o período por grupo. 87

Tabela 14 – Avaliação da reepitelização segundo o grupo por período 88

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Médias do percentual de contração de ferida segundo o tempo

de avaliação e o grupo.

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Divisão da amostra de acordo com os grupos. 51

Quadro 2 – Padronização da Laserterapia nos subgrupos. 57

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ATP: Adenosina Trifosfato.

C3: Convertase.

Fig: Figura.

IL: Interleucina.

HE: Hematoxilina e Eosina.

LASER: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (luz por

emissão estimulada de radiação).

LD 50: Dose letal, capaz de matar 50% dos animais testados.

LEA: Laboratório de Experimentação Animal.

LILT: Low Intensity Laser Therapy (Terapia a Laser de Baixa Intensidade).

LSD: Least significance diferences (Mínimo de Diferença Significante)

LTF: Laboratório de Tecnologia Farmacêutica.

MIP-1: Proteína Inflamatória do Macrófago.

PAF: Fator Ativador de Plaquetas.

PMN: Polimorfonucleares.

PVC: Poli Cloreto de Vinila.

SC: Sistema Complemento.

SPSS: Statistical Package for the Social Sciences (Pacote Estatítico para as

Ciências Sociais).

UFPB: Universidade Federal da Paraíba.

TM: Tricrômico de Masson.

TNF: Fator de Necrose Tumoral.

TGF: Fator de Crescimento Transformador

LISTA DE SÍMBOLOS

I: algarismo romano (um).

III: algarismo romano (três).

%: percentual.

: letra grega “alfa”.

: letra grega “beta”.

γ: letra grega “gama”.

λ: comprimento de onda.

cc: centímetro cúbico.

J: Joule.

J/cm

:Joule por centímetro quadrado.

J/m

: Joule por metro quadrado.

mm: milímetros.

µm: micra

nm: nanômetro.

pH: potencial de Hidrogênio.

s: unidade de tempo (segundo)

: marca registrada

W: Watts.

W/cm

Watts por centímetro quadrado.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 20

2 REVISÃO DA LITERATURA 24

2.1 Histórico 24

2.2 Reparação Tecidual 26

2.3 Quitosana e Suas Propriedades 31

2.4 Laser e Suas Propriedades 39

3 Proposição 48

3.1 Objetivo Geral 48

3.2 Objetivos Específicos 48

4 MATERIAIS E MÉTODOS 50

4.1 Caracterização da Amostra.

4.2 Acondicionamento dos Animais 50

4.3 Divisão dos Grupos de Estudo 50

4.4 Identificação das Gaiolas e dos Animais 52

4.5 Obtenção da Orabase e da Quitosana 52

4.6 Anestesia 53

4.7 Tricotomia e Produção da Ferida Cutânea 54

4.8 Aplicação dos Fármacos nas Feridas 55

4.9 Irradiação da Luz Laser 56

4.10 Ciclo de Sacrifício dos Animais 57

4.11 Obtenção e Processamento Histotécnico dos Espécimes 58

4.12 Avaliação Macroscópica das Feridas 59

4.13 Avaliação Microscópicas das Feridas 60

4.14 Plano de Análise Estatística 61

4.15 Considerações Éticas 61

5 RESULTADOS 63

5.1 Avaliação Macroscópica 63

5.2 Avaliação Morfológica 71

6 DISCUSSÃO 90

7 CONCLUSÃO 103

REFERÊNCIAS 105

APÊNDICE 117

ANEXOS 119

INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

Úlceras ou ulcerações são lesões fundamentais caracterizadas pela

perda da camada do tecido epitelial, o que torna o tecido conjuntivo subjacente

desprotegido e vulnerável às agressões do meio externo. Histologicamente

observa-se a ausência do tecido epitelial e o tecido conjuntivo exibe um intenso

infiltrado inflamatório que pode variar de agudo a crônico de acordo com o tipo

de célula encontrada (DRIESSEN, et al., 2003). Estas, segundo Silva, et al.

(2000) podem ser classificadas como agudas, recorrentes ou crônicas.

Existem vários fatores desencadeantes citados na literatura que

explicam a causa das úlceras: aspectos hereditários, psicossomáticos,

infecciosos, hormonais (menstruação, gravidez ou período pós-menopausa),

traumatismos, estresse, alergia alimentar, deficiências nutricionais (ferro,

vitamina B12 e ácido fólico), alterações hematológicas, e em casos de ex-

fumantes, pois com a suspensão do tabaco a mucosa apresenta-se mais

delgada e sensível, aumentando a freqüência de úlcera aftosa recorrente. A

hipótese que mais prevalece é da teoria do complexo auto-imune sendo a mais

significativa e aceita hoje. Contudo, por não ter uma uniformidade dos seus

efeitos na população, a etiologia ainda é desconhecida (BORDINI, et al., 2001).

Trabalho elaborado de acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT): NBR

6023:2002 Referências; NBR 6024:2003 Numeração; NBR 6027:2003 Sumário; NBR: 6028:2003

Resumos; NBR 6032:1989 Abreviações; NBR 10520: 2002 Informação e Documentação - Apresentações

de citações e NBR 14724:2002 informações e documentação - Trabalhos acadêmicos.

Pacientes portadores de úlceras bucais sejam elas agudas ou crônicas,

de origem traumática ou sistêmica, apresentam quadro clínico doloroso, que

muitas vezes dificulta a própria alimentação e, por vezes, a higienização bucal.

Quando tecidos moles são escoriados e o tecido conjuntivo é exposto,

ocorre a formação de úlceras, tanto em pele quanto em mucosas, seguindo

uma seqüência específica de processos com o objetivo de reparar o tecido

lesionado (ALEMDAROGLU, et al., 2006).

No processo de reparação tecidual, a regeneração e a cicatrização

devem ser consideradas como eventos distintos, que agem em conjunto a fim

de restaurar a estrutura anatômica e a função da região afetada. Este

fenômeno envolve vários fatores e o desequilíbrio ou a ausência de compostos

(mediadores químicos, elementos figurados do sangue, matriz extracelular e

células parenquimatosas), principalmente os envolvidos na formação do

colágeno, compromete o resultado final da reparação (BLANES, 2004).

As tentativas do homem de intervir no processo de cicatrização de

feridas remontam desde a antiguidade. A quitosana vem sendo utilizada como

método alternativo para aceleração da reparação tecidual desde 1957. Devido

as suas propriedades biológicas, eficácia no tratamento de lesões ulceradas e

por ser economicamente viável, a quitosana vem conquistando cada vez mais

espaço na indústria farmacêutica, sendo utilizada das mais diferentes formas

(UENO, et al., 2001).

No mesmo sentido, o Laser vem despontando como uma importante

ferramenta de trabalho. A Laserterapia tem demonstrado em vários estudos

sua eficiência na cicatrização de úlceras cutâneas e mucosas, agindo na

síntese protéica do colágeno, auxiliando na remodelação e na diminuição da

sensação dolorosa das feridas (BOURGUIGNON-FILHO; et al., 2005).

Apesar de todas as vantagens encontradas no uso da quitosana e do

Laser, ambos são uma realidade ainda pouco conhecida pelos profissionais da

odontologia. Não existindo relatos ou experimentos da quitosana em orabase

ou de sua ação conjunta com a Laserterapia.

Buscamos através deste trabalho, verificar a presença de efeitos

precoces da ação da quitosana na forma de orabase e da Laserterapia de

baixa potência sobre os processos reparativos em lesões cutâneas produzidas

em ratos.

REVISÃO DE LITERATURA

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 HISTÓRICO

Há séculos o homem vem evoluindo no tratamento das feridas. Na pré-

história, vários agentes como extratos de plantas, água, neve, gelo, frutas e

lama eram aplicados sobre as feridas (ANDRADE,et al., 1999).

Na Mesopotâmia, elas eram lavadas com água ou leite, e o curativo era

realizado com mel ou resina. Lã de carneiro, folhas e cascas de árvore eram

utilizadas para sua cobertura. Os egípcios perceberam que uma ferida fechada

cicatrizava mais rápido do que aberta, por isso, utilizavam tiras de pano para

manter unidas as margens da lesão. Hipócrates sugeria que as feridas

contusas fossem tratadas com calor e pomadas para promover a supuração,

remover material necrótico e reduzir a inflamação (BLANES, 2004).

No início da era cristã, Celsus preconizava o fechamento primário das

feridas recentes e desbridamento das contaminadas para posteriormente

poderem ser suturadas. Além disso, classificou os diferentes tipos de lesões de

pele e deu detalhes do tratamento de cada uma delas. A introdução das armas

de fogo nas guerras européias, no século XIV, levou ao surgimento de um novo

tipo de ferida de cura mais difícil, e Ambroise Paré, na Renascença reformulou

seu tratamento. O avanço da química trouxe a descoberta de compostos de

cloro e iodo, que foram utilizados para limpeza do material e da pele nos

séculos XVIII e XIX. Nos últimos anos, muito já foi descoberto sobre a fisiologia

do reparo tecidual e formação das cicatrizes, apesar disto, muitas pesquisas

continuam sendo realizadas em busca de novos fármacos, e da compreensão

de suas interações com os fenômenos moleculares na reparação tecidual

(BLANES, 2004).

A descoberta da quitina ocorreu em 1811, pelo francês Henri Braconnot,

inicialmente isolada em cogumelos e sendo denominada fungina. Em 1823,

Odier isolou um resíduo insolúvel de insetos, chamando-o de quitina, sendo

este nome derivado da palavra grega “Chiton”, que significa carapaça ou capa

protetora. Em 1843, Payen verificou a presença de nitrogênio na composição

da quitina. Posteriormente, em 1859, a quitosana foi descoberta por Rouget,

através da ebulição de uma solução de hidróxido de potássio com quitina,

sendo a quitina a precursora da quitosana (SHAHID; ARACHCHI; JEVON,

1999).

Já o Laser, amplificação da luz por emissão estimulada de radiação,

originou-se da abreviação de Light Amplification by Stimulated Emission of

Radiation, cuja teoria é do físico Albert Einstein, que em seu artigo “Zur

Quantum Theories der Strahlung”, de 1917, expôs os princípios físicos da

emissão estimulada (fenômeno Laser), sendo este classificado como de “alta

potência” (cirúrgico) e em “baixa potência” (terapêutico) (ORTIZ, 2001).

2.2 A REPARAÇÃO TECIDUAL

Ao longo dos anos, muito se tem pesquisado sobre o processo de

reparação das feridas, objetivando esclarecimentos sobre o processo de reparo

normal, bem como fatores que alteram este processo, sejam eles locais ou

sistêmicos (BLANES, 2004).

Danos tissulares de qualquer natureza, seja física química ou biológica,

desencadeiam de imediato uma série de eventos que de forma simplificada se

traduzem como rubor, tumor, calor e dor. Estes sinais resultam da ativação de

células nervosas, estromais, vasculares e circulatórias por estímulos físicos ou

por sinalização química feita por estruturas das células rompidas (porções da

membrana celular e organelas), fragmentos dos elementos inertes dos tecidos

(colágenos, elastinas, fibronectinas, e outros), proteínas séricas que

extravasam dos vasos rompidos e por ação de mediadores inflamatórios pré-

formados ou neo-sintetizados como, por exemplo, o (PAF) fator ativador de

plaquetas (BALBINO; PEREIRA L; CURI, 2005).

A reparação tecidual é um processo complexo e envolve vários

mecanismos, como: coagulação, inflamação, síntese e deposição de matriz,

angiogênese, epitelização, contração e remodelação (ALEMDAROGLU, et al.,

2006).

No processo de reparação, a regeneração e a cicatrização de feridas

devem ser consideradas como eventos distintos. Na regeneração, a reposição

tecidual é realizada por meio de células do mesmo tipo das células perdidas no

momento da lesão, sendo assim, se houver pouca alteração no estroma, a

regeneração será completa. Na cicatrização, entretanto, o tecido lesado é

substituído por um tecido conjuntivo próprio que é a cicatriz (GUYTON, 1998).

A cicatrização compreende várias fases complexas interdependentes e

simultâneas. Na análise morfológica, identificam-se três fases consecutivas

onde ocorre um dinamismo com sobreposição entre elas. Estas fases podem

ser divididas didaticamente em três estágios importantes: inflamação,

proliferação e remodelação (ROBBINS, et al., 2005).

A coagulação sanguínea acontece imediatamente após o surgimento da

ferida, dependendo da atividade plaquetária e da cascata de coagulação.

Ocorre a liberação de substâncias vasoativas, proteínas adesivas, proteases e

fatores de crescimento, contribuindo para a fase seguinte. A formação do

coagulo além de coaptar as bordas da ferida, oferece matriz provisória em que

os fibroblastos, os queratinócitos e células endoteliais possam migrar e atuar

na ferida. A fase inflamatória depende de inúmeros mediadores químicos e das

células inflamatórias como leucócitos, polimorfonucleares, macrófagos e

linfócitos. Essa fase varia de 3 a 5 dias, permanecendo os polimorfonucleares e

os macrófagos por 3 a 10 dias, fagocitando bactérias, removendo materiais

estranhos e facilitando a formação do tecido de granulação (BLANES, 2004).

A fase inflamatória se inicia imediatamente após a lesão, ocorrendo

vasoconstrição por 5 a 10 minutos. Essa vasoconstrição reflexa propicia o

fechamento dos vasos e favorece a hemostasia. Posteriormente, as células

endoteliais retraem-se e perdem suas conexões, aumentando a

permeabilidade, permitindo a passagem de elementos sanguíneos para a ferida

como plasma, eritrócitos e leucócitos, através do fenômeno de diapedese. A

vasodilatação com extravasamento para o exterior dos vasos forma um

exsudato causando calor, rubor e dor. Sua intensidade correlaciona-se com o

tipo e grau de agressão. Juntamente com todas essas alterações, que

correspondem a resposta vascular, existe uma resposta celular. São

importantes nesta fase os neutrófilos, responsáveis pela eliminação das

bactérias e tecidos desvitalizados e os monócitos que se transformam em

macrófagos e auxiliam na fagocitose. Após o trauma, são liberados mediadores

celulares que estimulam a elaboração de substâncias, promovendo o processo

inflamatório tais como: histamina, serotonina, bradicinina, prostaglandinas,

tromboxanos, linfocinas e interleucinas (GUYTON, 1998; STEENKAMP, et al.,

2004; PARK e BARBUL, 2004).

A fase proliferativa ou fibroplástica é responsável pelo fechamento da

ferida. Ocorre a reparação do tecido conjuntivo e do epitélio, formando o tecido

de granulação, que é composto por fibroblastos, que surgem por volta do

segundo e terceiro dia após o trauma, e vasos sanguíneos neoformados. O

fibrinogênio do exsudato inflamatório transforma-se em fibrina, forma uma rede,

onde os fibroblastos depositam-se e passam a multiplicar-se e a secretar os

componentes protéicos do tecido cicatricial. Concomitante a esta fibroplasia

ocorre intensa proliferação vascular. O tecido formado por fibroblastos,

substâncias e vasos denomina-se tecido de granulação, tem aspecto granuloso

e avermelhado. O miofibroblasto é uma célula que esta presente no tecido de

granulação e confere a capacidade contrátil, facilitando a epitelização

(RESENDE; PEREIRA; CASTRO, 2005).

A atividade mitótica do fibroblasto praticamente desaparece em torno do

15° dia, passando a secretar as proteínas presentes no tecido de granulação,

produzindo componentes da substância fundamental e colágeno. A substância

fundamental é composta por água, eletrólitos e glicosaminoglicanos, têm

aspecto semelhante a um gel e está distribuído entre as fibras do tecido

conjuntivo. A formação do epitélio é outro fenômeno que acontece na fase de

fibroplasia. A epitelização faz-se pelo aumento de tamanho e da migração de

células da camada basal da epiderme por sobre a área de reparação do tecido

conjuntivo subjacente (CARVALHO, et al., 2003).

A fase de maturação é caracterizada por eventos importantes:

deposição, agrupamento e remodelação do colágeno e regressão endotelial

(CARVALHO, et al., 2003).

A remodelação do colágeno inicia-se na formação do tecido de

granulação e persiste por meses após a reepitelização. As colagenases e

outras proteínas produzidas por macrófagos e células epidérmicas dão direção

correta às fibras colágenas difusas. Há diminuição de todos os elementos

celulares, inclusive fibroblastos. A regressão endotelial ocorre através da

diminuição progressiva dos vasos neoformados. A cicatriz torna-se menos

espessa passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (GUYTON,

1998).

Alguns fatores inibem o processo de cicatrização, tais como infecção,

desnutrição, hipóxia tecidual, envelhecimento, radiação ionizante e

medicamentos, como quimioterápicos e glicocorticóides (WITTE;

BARBUL,1997).

2.3 A QUITOSANA E SUAS PROPRIEDADES

A quitosana é um polissacarídeo composto por unidades de ß (14)

glucosamina (2-amino-2-deoxi-D-glucose) e da N-acetil-D-glucosamina (2-

acetamino-2deoxi-D-glucose), que é obtida a partir da desacetilização da

quitina (UENO, et al., 1999). Este é o segundo polissacarídeo mais abundante

na natureza depois da celulose, sendo o principal componente do exoesqueleto

de crustáceos e insetos (SENEL e McCLURE, 2004; FREIER, et al., 2005),

podendo também estar naturalmente presente na parede celular de alguns

fungos, como aqueles pertencentes aos gêneros Mucor e Zygomicetes

(KAFETZOULOS; MARTINOV; BOURIOTIS, 1993).

Fig. 1- Estrutura da Quitina e da Quitosana (HÉLIO, et al., 2006)

A quitina pode ser encontrada de três formas: α, β e γ, que diferem no

arranjo de suas cadeias. A α encontrada principalmente em crustáceos insetos

e fungos, apresenta um arranjo alternado de cadeias paralelas e antiparalelas.

A ocorrência da forma β é menos comum, sendo encontrada exclusivamente

em organismos marinhos como lulas e algas microscópicas e possui um

arranjo em cadeias paralelas. A forma γ ainda não foi completamente

caracterizada, mas sugeriu-se um arranjo de duas cadeias paralelas e

antiparalelas. A forma α é mais estável que as outras duas β e γ, mas estas

últimas podem ser convertidas à forma α através de tratamentos adequados

(SIGINI, 1998).

A quitosana é insolúvel em água ou em soluções com pH neutro e

alcalino, mas pode ser solúvel em ácidos inorgânicos e orgânicos como: ácido

glutâmico, hidroclorídrico, lático e ácido acético (SENEL; McCLURE, 2004).

A história da quitina e seus derivados utilizados como aceleradores da

reparação tecidual teve início com os estudos de Pruden, et al. (1957), que

verificaram que a cartilagem de tubarão acelerava a reparação tecidual e

sugeriram que a glucosamina, que é um dos compostos da cartilagem, era

responsável por este fenômeno. Posteriormente foi identificado a N-acetil-D-

glucosamina, que é um derivado da glucosamina, seria o acelerador da

reparação. Já com o uso tópico da quitosana foi percebido que este

polissacarídeo acelerava a reparação tecidual devido ao aumento da

granulação. Em grandes ferimentos o processo de formação do novo tecido é

denominado granulação, que precede a epitelização (UENO, et al., 2001).

O estudo e o emprego da quitina e quitosana e as pesquisas por novas

aplicações têm aumentado exponencialmente em diversas áreas, como na

agricultura e indústria de alimentos, mas, especialmente, na indústria

farmacêutica, no desenvolvimento de cosméticos e biomateriais, tais como

géis, filmes, membranas poliméricas (SILVA, et al., 2006) e colutórios (SANO,

et al., 2003).

Uma grande variedade de propriedades físico-químicas e biológicas está

associadas à quitosana: biocompatível, biodegradável, bioadesivo, não tóxico,

não carcinogênico (JAYAKUMARA, et al., 2005), ação aceleradora do reparo

tecidual, até mesmo em regiões previamente irradiadas com Raio-X (UENO, et

al., 2007), ação antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (OKAMOTO, et

al., 2002), Streptococcus mutans, Streptococcus salivaries (SHIMOJOH;

FUKUSHIMA; KURITAS, 1996), Candida (KOIDE, 1998; AKSUNGUR, et al.,

2004), Porphyromonas gingivalis (IKINCI, et al., 2002), ação hemostática,

analgésica, osteoindutora, imuno-moduladora (HÉLIO, et al., 2006), anti-úlcera

(ITO; BAN; ISHIHARA, 2000), entre outras características; sendo bastante

utilizada como auxiliar na reparação de grandes feridas (DENG, et al., 2007).

Alemdaroglu, et al. (2006) comprovaram a eficácia do gel de quitosana

contendo fator de crescimento epidérmico, na reparação de lesões provocadas

por cauterização em pele de ratos. De acordo com os autores, o padrão de

epitelização foi melhor e mais rápido no grupo em que o gel de quitosana foi

utilizado.

O colutório de quitosana a 0,5% possui eficácia na redução da formação

de placa e promove a diminuição significativa das colônias de Streptococos

mutans após 14 dias de uso (SANO, et al., 2003).

Estudos em ratos, comparando o desempenho da quitosana de

diferentes pesos moleculares em úlceras gástricas, comprovaram que as

fórmulas com baixo peso molecular apresentaram maior potencial tanto na

proteção da mucosa como na promoção do reparo. O aumento do muco

gástrico promovido pela quitosana pode, em parte, estar relacionado com o seu

efeito anti-úlcera (ITO; BAN; ISHIARA, 1999).

A quitosana na forma de gel atua como um protetor ideal em ferimentos

extensos, devido as suas propriedades de biocompatibilidade,

biodegradabilidade, hemostasia, anti-infecciosa e a mais importante de todas a,

aceleração da reparação tecidual (ISHIHARA, et al., 2002).

O gel de quitosana possui propriedades adesivas e antimicrobianas

contra a Porphyromonas gingivalis, podendo também servir como veículo para

administração de drogas antimicrobianas como a clorexidina na terapia

periodontal (IKINCI, et al., 2002).

A propriedade imunomoduladora da quitosana é devida à sua

capacidade de ativar quase que exclusivamente o macrófago e explica não

somente seu papel na aceleração da cicatrização de lesões, mas também a

biodegradabilidade desse polímero no organismo (UENO, et al., 2001).

Quando a quitosana é aplicada no organismo é biodegradada por

enzimas (quitanase e quitosanase) e conseqüentemente é transformada em

oligômeros e monômeros. Estudos prévios verificaram que não apenas a

quitosana, mas também seus oligômeros e monômeros influenciam a migração

de fibroblastos e células endoteliais, influenciando a reparação tecidual in vivo.

Entretanto, as relações entre as propriedades químicas da quitosana e a

reparação tecidual permanecem não esclarecidas (MINAGAWA, et al., 2007).

Em estudos realizados em cães, Okamoto (1995) verificou que

aplicações tópicas de quitosana aceleravam a reepitelização e a regeneração

neurovascular, assim como promoviam o aumento da migração de células

polimorfonucleares.

Na fase inicial de reparação da ferida, o infiltrado de leucócitos

polimorfonucleares (PMN) remove os agentes estranhos na área da ferida. A

quitosana acelera a infiltração PMN, conseqüentemente acelerando o reparo.

Estudos recentes demonstram que os PMN respondem produzindo citocinas

em adição a sua função fagocitária. Citocinas derivadas de PMN realizam um

importante papel de iniciação e controle da resposta inflamatória (UENO, et al,

1999).

Segundo Ueno, et al (1999) a quitosana atua na reparação tecidual

acelerando o infiltrado de células PMN no local da injúria, aumentando a

densidade da fibrina e ativando a migração de fibroblastos para a área lesada,

estimulando a proliferação de macrófagos, fibroblastos e a produção de

colágeno tipo III.

Além de acelerar a infiltração de polimorfonucleares para área da ferida,

que por sua vez secretam mediadores como fator de necrose tumoral (TNF),

interleucinas (IL) 1, IL 8, IL 12, proteína inflamatória do macrófago (MIP-1α e

MIP-1β) como adição a fagocitose. A quitosana acelera a produção de

osteopondina pelos PMN, uma fosfoproteína glicosilada, que desempenha

importante função durante o processo de granulação da reação inflamatória,

ligando vários tipos de células (UENO, et al., 2001).

A quitosana influencia a ativação do sistema complemento (SC), essa

ativação pode ser determinada pelo aumento da concentração de C3 no

plasma, isto faz com que os PMN tenham a sua função melhorada direta e

indiretamente pela quitosana, tanto devido a mediação química para produção

de PMN como pelo aumento da ação fagocitária destas células. Os macrófagos

apresentam receptores que reconhecem as unidades ß (14) glucosamina e

da N-acetil-D-glucosamina da quitosana, sendo assim estimulados para

migrarem para o local da ferida. A quitosana promove ainda estimulação para

os macrófagos produzirem citocinas e fatores de crescimento que influenciam

na reparação tecidual. Com o aumento da granulação durante as fases

primárias do reparo tecidual devido a ação da quitosana, ocorre também maior

proliferação de fibroblastos e síntese de matriz extracelular pela ação direta

dos fatores de crescimento (UENO, et al., 2007).

Em pesquisas experimentais com animais, verificou-se que a quitosana

influencia todos os estágios da reparação tecidual. A atividade hemostática da

quitosana pode ser percebida nas fases iniciais da reparação. Ela interage e

regula a migração de neutrófilos e a ativação dos macrófagos no processo de

reparo, assim como a fibroplasia e reepitelização. Durante as fases de

inflamação, a quitosana acelera a infiltração de células inflamatórias, como os

neutrófilos, além de promover a remoção de corpos estranhos.

Simultaneamente, inicia-se a fibroplasia. Geralmente em feridas grandes

abertas, verifica-se a formação de cicatrizes hipertróficas, assim como

desequilíbrio entre a formação de colágeno tipo I e III. Com o uso da quitosana

não se percebe estes fenômenos (HOWLING, et al., 2001).

A segurança do uso da quitosana foi de demonstrada em experimentos

realizados em ratos e cães, onde foram testados aditivos em alimentos e outros

materiais cosméticos a base de quitosana. No teste de toxicidade de dose letal

(LD 50) foi verificado efeito tóxico em dose acima de 1,5g/kg administrada por

via oral, 10g/kg pela via subcutânea e 5,2g/kg pela via peritoneal, em ratos.

Entretanto, um efeito característico foi verificado em cães: várias

concentrações de quitosana (10 – 200/kg) foram administradas pela via

subcutânea. Anorexia e mortalidade foram observadas com o uso de doses

acima de 50mg/kg e 150mg/kg, respectivamente. Após necropsia foi observada

pneumonia em todos os animais que foram a óbito, além de leucocitose e

demais discrasias. Foi confirmado o quadro de pneumonia letal nos cães, com

o uso da quitosana (UENO; et al, 2001).

De acordo com Shigehiro Hirano (1990), a toxicidade da quitosana é

menor do que a glicose (açúcar comum) ou sacarose. A dose letal de glicose

em mamíferos é da ordem de 8 a 12 gramas, por quilograma de peso corporal,

enquanto que a Quitosana é 18 gramas, não apresentando qualquer sinal de

toxicidade ou mortalidade. Esta propriedade é especialmente interessante para

o emprego da quitosana em fármacos a serem aplicados em feridas abertas e

em úlceras.

2.4 LASER E SUAS PROPRIEDADES

O Laser é produzido a partir de elétrons ou moléculas que sofrem salto

quântico quando previamente estimulados, passando de baixo para alto estado

de energia. Neste processo, ocorre a emissão de ondas na mesma freqüência,

comprimento e direção, originando o feixe de Laser que possui mais potência

que outras radiações ópticas não modificadas ou estimuladas (ORTIZ, et al.,

2001).

Quando um fóton ou partícula energética de luz é direcionado a um

átomo, ele pode ser absorvido, refletido ou transmitido. Se a partícula é

transmitida ou refletida não há mudança da energia luminosa. Entretanto, se o

fóton é absorvido, a energia elétrica no orbital é aumentada. Ocorre mudança

na posição de um ou mais elétrons, partindo de uma órbita interna para uma

mais periférica. No momento em que o elétron se encontra num estado de

energia mais alto, diz-se que ele está excitado. Este estado permanece por um

período muito curto (cerca de 10

-8

s), ao retornar a sua órbita original elimina

sua energia na forma de fóton de luz, exatamente com as mesmas

características do fóton incidente. Essa emissão estimulada de radiação, em

pouco tempo, ganha proporções relevantes na ativação atômica, produzindo

uma constante emissão de Laser (LOW; REED, 2001).

Para produzir o feixe luminoso, as fontes de luz Laser dependem de

alguns componentes essenciais. Um deles é a fonte de energia que permita o

bombeamento do meio ativo para o estímulo inicial da excitação atômica,

possibilitando a seqüência na produção da emissão estimulada da radiação.

Esta energia pode ser entregue de vários modos: energia elétrica, luminosa ou

por outro Laser. O meio ativo é constituído por materiais sólidos, gasosos,

líquidos e semi-sólidos, que podem produzir a radiação Laser (GENOVESE,

2000). Outro componente fundamental da produção de radiação é a cavidade

ou câmara ressonante óptica, que é constituída por um tubo reto contendo um

meio ativo. Em cada extremidade do tubo existem espelhos, sendo um deles

totalmente refletivo e outro uma saída de luz semi-refletiva. Quando elétrons

são estimulados por uma fonte de energia externa numa rápida taxa, os fótons

resultantes são alinhados na câmara refletora. Quando eles alcançam o

espelho semi-transparente, são refletidos de volta ao espelho refletor. O

constante retorno e a forte reflexão entre os espelhos promovem a ampliação

da luz. Com a continuidade do processo, mais e mais fótons são estimulados

até que a câmara não pode mais conter o nível energético e libera a emissão

da luz Laser (CORAZZA, 2005).

O Laser possui características que a diferem dos diferentes tipos de

fontes de luz. Toda luz, em geral, pode interagir com a matéria sendo refletida,

refratada ou absorvida (CORAZZA, 2005). O Laser é uma luz amplificada

produzida por radiação eletromagnética que se manifesta como luz

monocromática; enquanto a luz branca (policromática) emitida pelas lâmpadas

comuns, apresenta ondas no mesmo comprimento e nas mesmas fases

ondulatórias, e, portanto, somam energia (ROCHA, 2004).

As propriedades que diferem o Laser das fontes luminosas

incandescentes e fluorescentes são a monocromacidade, coerência, colimação

e a polarização (ORTIZ, et al., 2001).

A monocromacidade indica que cada meio gerador de Laser

corresponde a um comprimento de onda, essa propriedade é considerada o

atributo mais importante da luz Laser, determina quais biomoléculas

absorverão a radiação incidente, portanto, a interação fotobiológica e os efeitos

terapêuticos da Laserterapia. A colimação refere-se ao paralelismo do feixe,

mantendo um pequeno diâmetro de saída por uma distância relativamente

grande, também denominada unidirecionalidade. Genovese (2000) afirma que

a luz colimada permite concentrar a energia em um único ponto focal, mantida

a potência óptica mesmo em distâncias consideráveis. A coerência refere-se à

sincronicidade das ondas de luz, que pode ser temporal ou espacial, quando os

fótons estão ajustados em um plano espacial paralelo entre si. A polaridade

ocorre quando as ondas de luz estão todas orientadas em um só plano, assim

vibrando em seus campos elétricos em uma só direção, podendo ser linear ou

circular (ORTIZ, et al., 2001).

A densidade de potência ou irradiância é a potência de saída da luz,

medida em watts por centímetro quadrado (W/cm

), por área irradiada, já a

fluência ou densidade de energia ou dose é a energia total transmitida por um

feixe de Laser, por unidade de área, é medida em Joule por metro quadrado

(J/m

) ou Joule por centímetro quadrado (J/cm

) (ORTIZ, et al, 2001). A

diferença entre os vários tipos de Lasers é dada pelo comprimento de onda.

Quanto menor o comprimento de onda, maior sua ação e poder de penetração.

Os Lasers podem ser contínuos ou pulsáteis. Sua potência é expressa em

watts (W), variando de deciwatts a megawatts e a energia medida em joules

por centímetro quadrado (J/cm2), sendo igual à potência multiplicada pelo

tempo de aplicação (DALLAN; OLIVEIRA, 2000).

O Laser terapêutico de baixa intensidade (LILT) ganhou aplicabilidade

clínica após os estudos realizados por Mester e colaboradores no inicio dos

anos 70. Foi verificada a efetividade da cicatrização das feridas mediante

análise histológicas, imunológicas e testes funcionais. Os resultados

demonstraram melhora na síntese do colágeno, indução da neovascularização

e melhora da síntese de enzimas em toda área irradiada (SIMUNOVIC, et al,

2000; VINCK, et al, 2003).

Tecnologias luminosas de baixa intensidade e monocromáticas exercem

elevada ação biomoduladora sobre as células irradiadas. As interações da luz

com o tecido vivo dependem da penetração, absorção e espalhamento da luz

no tecido (CORAZZA, 2005).

A profundidade de penetração no tecido é relacionada ao comprimento

de onda da radiação, sendo 0,5 a 2,0 mm para a luz vermelha e de 2,0 a 4,0

mm para infravermelho (LOW; REED, 2001).

A energia do Laser é absorvida apenas por uma fina camada de tecido

adjacente além do ponto atingido pela radiação, sendo por esta razão a

recomendação atual para a aplicação de Lasers de baixo poder de penetração,

com comprimentos de onda entre 640 a 940nm, é que esta aplicação seja

realizada de modo pontual à lesão (PARIZOTTO; BARANAUSKAS, 1998).

A absorção da radiação equivale à energia transportada pelo fóton,

sendo esta absorção específica para comprimento de onda o que determina

qual o tipo de tecido irá preferencialmente absorver a radiação incidente e a

profundidade de penetração desta energia (ROCHA, 2004).

O espalhamento é a mudança de direção da propagação da luz,

enquanto esta transita nos tecidos, devendo-se a variabilidade dos índices

refratários dos componentes do tecido, com relação à água. O espalhamento

provocará o aumento do diâmetro do feixe, durante sua passagem no tecido

irradiado, ocorrendo rápida perda da coerência (CORAZZA, 2005).

Os efeitos fisiológicos do Laser podem ser divididos em: efeitos

primários, efeitos secundários e efeitos terapêuticos (COLLS, 1984). Os efeitos

primários por sua vez podem ser divididos em bioquímico, bioelétrico e

bioenergético (ROCHA, 2004):

Efeito Bioquímico: o Laser pode provocar a liberação de substâncias

pré-formadas como a histamina, serotonina e bradicinina, bem como modificar

reações enzimáticas normais, tanto acelerando como retardando essas

reações.

Efeito Bioelétrico: a radiação Laser proporciona aumento na produção de

ATP, o que promoveria um aumento na eficiência da bomba sódio-potássio,

com isso a diferença de potencial elétrico existente entre o interior e o exterior

da célula é mantida com melhores resultados.

Efeito Bioenergético: defende-se que o aporte energético da radiação

Laser tem capacidade de normalizar o contingente energético que coexiste

com o contingente físico dos indivíduos.

Dentre os efeitos secundários ou indiretos da irradiação Laser verifica-se

o estímulo à microcirculação, a histamina liberada faz com que os esfíncteres

pré-capilares paralisem-se, como conseqüência ocorre o aumento do fluxo

sangüíneo. Estímulo ao trofismo celular, com o estímulo à produção do ATP, a

atividade mitótica é também aumentada, o que proporciona em escala tissular,

aumento na velocidade de cicatrização e melhor trofismo dos tecidos. Os

efeitos terapêuticos do Laser estão relacionados com a ação analgésica,

antiinflamatória, antiedematoso e cicatrizante (AMORIM, 2001). Em nível local

a Laserterapia de baixa intensidade provoca a redução da inflamação e

reabsorção dos exsudatos, favorecendo a eliminação de substâncias alógenas,

através do estímulo a microcirculação, que por sua vez garante o aporte de

nutrientes e células de defesa para região lesada e permite a drenagem do

plasma, que forma o edema (COOLS, 1984).

Ocorre também diminuição da sensação dolorosa, pois o Laser mantém

o potencial da membrana dificultando a sua despolarização; normaliza e

mantém o equilíbrio da energia no local da lesão, com o aumento da

permeabilidade das vênulas e dilatação das arteríolas, corrigindo os níveis de

histamina e bradicinina, além de atuar direta e indiretamente na liberação de

beta endorfinas. A interferência na síntese de prostaglandinas, provocada pelo

Laser, faz decrescer a alterações proporcionadas pela inflamação (VEÇOSO,

1993).

O efeito de maior destaque na Laserterapia é sua ação cicatrizante, pois

o Laser eleva a produção do ATP, promovendo o aumento da atividade mitótica

e aumento da síntese de proteína por intermédio da mitocôndria. O estimulo a

microcirculação e a formação de novos vasos, à partir de vasos pré-exixtentes,

associado ao aumento da atividade mitótica aceleram a cicatrização dos

tecidos (COOLS, 1984).

Baseando-se em estudos prévios, Kitchen e Partridge (1991) relataram

efeitos danosos, provocados por crescentes aplicações do Laser de Baixa

Potência, sem o devido da dosimetria necessária para determinado tecido a ser

irradiado. Assim afirmaram que a densidade média de energia de ou acima,

pode resultar em um processo inibidor ou danoso, sendo mais seguro a

inibição da dose. Baxter (1998), afirmou que a dose não deve ser mais de 1J

por ponto, ou aproximadamente 10 J/cm

, entretanto a dose comumente

recomendada no leito da ferida é de 4J/cm

Em Odontologia, o emprego terapêutico dos Lasers de baixa potência é

conhecido pela sigla LILT (“Low Intensity Laser Therapy” ou Terapia a Laser

em baixa Intensidade). Dentre esses, os mais conhecidos e estudados no

momento são os de diodo (GaAlAs ou GaAs), com comprimento de onda

variando de 660 a 909 nm e os de Hélio-Neônio (HeNe), com comprimento de

onda de 632 nm (LENHARO, et al, 2006).

PROPOSIÇÃO

3. PROPOSIÇÃO

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar macroscopicamente e morfologicamente, a ação da quitosana

em orabase na cicatrização tecidual in vivo, quando associada ou não ao Laser

de 660 nm.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

3.2.1 Comparar macroscopicamente a cicatrização tecidual entre os grupos, de

acordo com os períodos observacionais.

3.2.2 Comparar microscopicamente a cicatrização tecidual entre os grupos do

estudo.

3.2.3 Avaliar microscopicamente, através do Tricrômico de Masson, a

colagenização em cada grupo.

Ingredient C

MATERIAIS E MÉTODOS

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

A amostra foi composta por 75 ratos albinos, da linhagem Wistar,

adultos, machos, pesando em torno de 350g, procedentes do biotério do

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF) da Universidade Federal da

Paraíba (UFPB).

4.2 ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS

Os animais foram mantidos no Laboratório de Experimentação Animal

(LEA) do Centro de Ciências da Saúde, em gaiolas individuais, em fotoperíodos

de 12 horas, temperatura e umidade controladas (Fig. 2). Os animais

receberam água e ração sólida peletizada

, com alto teor de proteína (20 a

27%) ad libitum.

4.3 DIVISÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO

Os animais foram aleatoriamente divididos em cinco grupos distintos

(GRUPOS 1, 2, 3, 4 e 5), sendo cada um destes, composto por 15 animais, que

por sua vez foram divididos em três subgrupos (A, B e C), contendo cinco

animais cada, obedecendo os períodos observacionais de três, sete e quatorze

dias, respectivamente. Os animais do grupo 1 foram o controle; no grupo 2 foi

utilizado a orabase sem quitosana; no grupo 3 orabase com quitosana à 2%; no

Labina

- Purina Nutrimentos

grupo 4 foi realizada a laserterapia de baixa potência e no grupo 5 a

associação da orabase de quitosana à 2% com a Laserterapia (Quadro 1).

Fig. 2 – Acondicionamento dos Animais.

GRUPOS DESCRIÇÃO QUANTIDADE

GRUPO 1 (G1) CONTROLE 15 ANIMAIS

GRUPO 2 (G2) ORABASE 15 ANIMAIS

GRUPO 3 (G3) QUITOSANA 2% 15 ANIMAIS

GRUPO 4 (G4) LILT 15 ANIMAIS

GRUPO 5 (G5)

QUITOSANA 2 % e LILT

15 ANIMAIS

Quadro 1 – Divisão dos amostra de acordo com os grupos.

O tamanho da amostra configurada esta baseada na literatura científica

correlata, na qual se pode constatar um número de animais compatível com a

necessidade de resultados confiáveis, do ponto de vista de significância

estatística, bem como com o respeito às questões bioéticas. Além disso,

estudos anteriores realizados e publicados pelo grupo de pesquisa, corroboram

o tamanho da amostra previsto neste estudo (LIMEIRA JÚNIOR, 2003;

LIMEIRA JÚNIOR, et al, 2004, QUEIROGA, 2007).

Cada procedimento foi realizado por um único operador, seguindo

rigorosamente a mesma metodologia. Cada animal foi identificado de acordo

com o grupo, no qual foi incluído.

4.4 IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS

Cada gaiola foi identificada com etiquetas (Apêndice), onde constavam:

data de nascimento, cirurgia, sacrifício, massa corporal, nome do experimento

e responsáveis pela pesquisa. Os animais foram identificados com marcações

na cauda, de forma circular, realizados com caneta piloto de ponta romba, cada

anel pintado correspondeu a um número específico.

4.5 OBTENÇÃO DA ORABASE E DA QUITOSANA

Todos os fármacos necessários para este estudo foram obtidos com o

auxílio da Farmácia Dilecta

®4

,ou seja, a orabase pura e a associação da

orabase com a quitosana à 2%, evitando-se assim o viés de veículo.

Os produtos foram acondicionados em bisnagas plásticas estéreis

apropriadas, rotulados e conservados em temperatura ambiente e ao abrigo do

sol até o início do trabalho experimental (Fig. 3).

A opção pela Orabase deveu-se ao fato de padronizar o veículo e por

ser de uso consagrado em odontologia. Muito embora a Orabase não seja de

uso dermatológico, como foi testada em todos os grupos como veículo,

Dilecta

– Farmácia de Manipulação (João Pessoa – PB).

credencia ao fármaco testado o resultado obtido, já que se evitou o viés de

veículo. A escolha da concentração baseou-se na literatura correlata

(ALEMDAROGLU, 2006) que comprova a sua eficácia da quitosana a 2% na

cicatrização dos tecidos.

Fig. 3 – Acondicionamento dos Fármacos.

4.6 ANESTESIA

Os animais inicialmente foram pesados e posteriormente devolvidos à

gaiola de origem (Fig. 4). Conhecido o peso dos animais, eles foram

anestesiados conforme preconizado em 2003 por Massone, através da

mistura de cloridrato de ketamina

a 5% e cloridrato de xilazina

a 2%,

diluídas na proporção de 1:1. A partir desta solução, calculou-se a dose

individual de cada animal obedecendo a proporção de 0,2 ml da referida

mistura para cada 100g de peso animal, injetadas profundamente na

musculatura das patas traseiras. Após um período de latência médio de sete

Vetanarcol

- König

Kensol

, König

minutos, foi observada a prostração completa de cada animal, a confirmar

pela diurese espontânea comumente apresentada e abolição total de

reflexos palpebrais.

Fig. 4 – Mensuração da Massa Corporal dos Animais

4.7 TRICOTOMIA E PRODUÇÃO DA FERIDA CUTÂNEA

Os animais foram mantidos em decúbito dorsal, em seguida realizada a

tricotomia manual do dorso, seguindo-se a anti-sepsia do campo operatório

com Clorexidina

a 2% e, posteriormente, a excisão cirúrgica de um fragmento

de pele, em sua extensão total, medindo em torno de 5 mm, com o auxilio de

um punch

, padronizando desta forma a ferida e tomando-se o cuidado para

que todas as camadas fossem removidas, restando apenas a musculatura

subjacente.

Gluconato aquoso de clorexidina 2% - Manipulação Dilecta

Bisturi circular – ABC

4.8 APLICAÇÃO DOS FÁRMACOS NAS FERIDAS

Para aplicação dos fármacos (Fig. 5) os animais foram contidos com o

auxílio de um dispositivo artesanal (Fig. 6), que consistia em tubo de plástico,

no qual foi confeccionado uma abertura onde os animais eram delicadamente

inseridos, permanecendo em seu interior durante todo o procedimento, sendo

também confeccionado na extremidade orifício para permitir a respiração dos

mesmos. A orabase de quitosana foi utilizada diariamente, obedecendo sempre

o mesmo horário. Foi padronizada a quantidade do fármaco com o auxílio de

seringas de insulina (0,1cc) e com o auxilio de espátulas estéreis os fármacos

eram aplicados, cobrindo toda a extensão da ferida com margem ultrapassando

as bordas em 5 mm (Fig. 7). As aplicações seguiram até a véspera do último

dia de sacrifício dos grupos.

Fig. 5 – Aplicação dos Fármacos nas Feridas.

Fig. 6 – Contenção dos Animais.

Fig. 7 – Material para Aplicação dos Fármacos Sobre as Feridas.

4.9 IRRADIAÇÃO DA LUZ LASER

Para os procedimentos de Laserterapia (Fig. 8), foi utilizado um diodo

Laser

GaAlInP com comprimento de onda de 660 nm e potência de 40 mW.

Os animais foram irradiados imediatamente após o procedimento cirúrgico e o

protocolo de irradiação seguia os respectivos períodos de observação de cada

subgrupo. A dose de irradiação foi aplicada em dois pontos padronizados de

cada lado da ferida cirúrgica, sendo para cada ponto aplicada uma energia de

2J (25J/cm

). O número de sessões e a quantidade de energia aplicada

variaram de acordo com cada subgrupo (Quadro 2).

Twin Laser (MM Optics

) – diodo de Gálio, Aluminio, Índio e Fósforo.

Fig. 8- Irradiação do Laser.

Subgrupo

G4A

G5A

G4B

G5B

G4C

G5C

Sessões 2 sessões

3 sessões

7sessões

Energia 8J 12J 28J

Quadro 2 – Padronização da Laserterapia nos subgrupos.

4.10 CICLO DE SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS

Os animais em cada grupo eram divididos em três subgrupos (contendo

cinco animais cada), de acordo com a cronologia de sacrifício sendo

obedecidos os períodos de 3, 7 e 14 dias de pós-operatório. Os animais foram

sacrificados com dose letal dos anestésicos utilizados anteriormente.

4.11 OBTENÇÃO E PROCESSAMENTO HISTOTÉCNICO DOS ESPÉCIMES

Imediatamente após o sacrifício dos animais as feridas cicatriciais foram

removidas por excisão cirúrgica com margem de segurança de 10 mm em toda

sua extensão (Fig. 9), com o auxílio de lamina de bisturi

n° 15, montada em

cabo

n° 3 pinça de Adisson

e tesoura de Metzenbaum

. As peças foram

fixadas em formol tamponado a 4% por 24 horas.

Todo processamento histotécnico foi realizado no Laboratório de

Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia de Pernambuco. As peças foram

incluídas em blocos de parafina e submetidas a cortes transversais de 4 µm.

Cada lâmina foi corada com hematoxilina e eosina (HE) e com Tricrômico de

Masson (TM).

Fig. 9 – Remoção do espécime.

Laminas SurgiBlade

– Sunshine Int’l

Cabo de Bisturi - Quinelato

- Schobell Industrial Ltda.

Pinça para manipulação de tecido (12 cm) - Quinelato

- Schobell Industrial Ltda.

Tesoura romba para dissecção (15 cm) - Quinelato

- Schobell Industrial Ltda.

4.12 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DAS FERIDAS

Esta avaliação foi realizada em todos os animais no dia do sacrifício dos

animais em cada subgrupo por 2 avaliadores independentes, previamente

calibrados. Foram avaliados quanto a ausência (0) ou a presença (1) as

seguintes características: infecção; halo hiperêmico em torno da ferida;

formação de crosta; borda necrótica e fundo sangrante da ferida.

A contração foi avaliado mediante cálculo da área da ferida, pela

aferição dos diâmetros maior e menor, com auxílio de um paquímetro digital

(Fig. 10), foi utilizada a equação matemática proposta por Prata, et al. (1988):

A = . R. r

Onde "A" representa a área, "R" o raio maior e "r" o raio menor da ferida.

O cálculo do percentual de contração foi expresso através da equação

matemática sugerida por Ramsey et al. (1995), onde Wo representa a área

inicial da ferida, Wi área da ferida:

% de contração = 100. [(Wo –Wi)/Wo]

Os dados foram registrados em tabelas confeccionadas para cada

período de análise.

Paquímetro Digital 500-144B - Mitutoyo

Fig. 10 – Aferição do Diâmetro da Ferida com Paquímetro.

4.13 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DAS FERIDAS

As lâminas foram observadas através de microscopia de luz, por dois

examinadores devidamente calibrados. Foram observados na análise em HE

os seguintes critérios: formação de crostas, inflamação, angiogênese, tecido de

granulação e reepitelização. Todas essas características forma graduadas em:

ausente (0), discreta (1), moderada (2) e intensa (3), de acordo com o seu

aspecto histológico. Na análise com Tricrômico de Masson foi evidenciada a

colagenização, sendo esta graduada em: ausente (0), leve (1), entre leve e

moderado (2), moderado (3), entre moderado e intenso (4) e intenso (5). Os

dados foram registrados em tabelas confeccionadas para cada período de

análise.

4.14 PLANO DE ANÁLISE ESTATÍSCA

Para análise dos dados foram obtidas distribuições absolutas e

percentuais (Técnicas de estatística descritiva) e foi utilizado o teste Exato de

Fisher desde que as condições para utilização do teste Qui-quadrado não

foram verificadas e o teste F (ANOVA) com comparações pareadas de LSD

(Least significance diferences), desde que as comparações pelo teste de Tukey

não mostraram coerência com os resultados do teste F (ANOVA).

O nível de significância utilizado na decisão dos testes estatísticos foi de

5,0%. Os dados foram digitados na planilha Excel e o “software” estatístico

utilizado para a obtenção dos cálculos estatísticos foi o SPSS (Statistical

Package for the Social Sciences) na versão 13.

4.15 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Este projeto pauta-se pelos preceitos éticos, conforme as Normas do

Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA): quando estes são

utilizados em pesquisas, objetiva-se adequar os animais ao menor desconforto,

angústia ou dor. Considerando que os animais submetidos a tais estudos são

indefesos e não podem escapar aos procedimentos, foram respeitadas as

normas para prática didático-científica da vivisseção de animais de acordo com

a Lei Federal nº 6638 de maio de 1979. Esta pesquisa foi aprovada pelo

Comitê de Ética em Pesquisa em Animais conforme parecer em anexo.

RESULTADOS

5. RESULTADOS

5.1 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA

A análise macroscópica foi baseada de acordo com a presença ou ausência das

determinadas características clínicas das feridas. Foi verificado durante os períodos

observacionais que todos os animais avaliados nos períodos observacionais apresentaram

ausência de infecção e por este motivo os resultados dos testes comparativos não são

apresentados (Tabela 1).

Tabela 1 – Avaliação da infecção segundo o grupo por período.

Infecção

Tempo de

Grupo

(1)

Presente Ausente TOTAL Valor de p

Avaliação

 3 dias

- 5 100,0 5 100,0 **

- 5 100,0 5 100,0

Grupo Total

100,0

 7 dias

- 5 100,0 5 100,0 **

- 5 100,0 5 100,0

Grupo Total

100,0

 14 dias

- 5 100,0 5 100,0 **

- 5 100,0 5 100,0

Grupo Total

100,0

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

Na Tabela 2 analisa-se a ocorrência de halo hiperêmico (Fig. 11) por grupo e tempo de

avaliação. Desta tabela destaca-se que: na avaliação com 03 dias, no grupo 1, 40% dos

animais apresentaram halo hiperêmico; em todos os animais do grupo 2 o halo hiperêmico

estava presente; no grupo 3, 60% dos animais apresentaram hiperemia ao redor da ferida; no

grupo 4 houve ausência de hiperemia em 100% dos animais e no grupo 5, em 20% dos

animais houve hiperemia. Existe diferença significante entre os grupos em relação ao halo

hiperêmico (p = 0,018).

Na avaliação com 7 dias, com exceção do grupo 5, que apresentou 100% dos animais

com halo hiperêmico, em todos os demais animais avaliados verificou-se a ausência halo

hiperêmico e comprova-se diferença estatisticamente significante (p < 0,001).

Na avaliação com 14 dias nenhum animal apresentava halo hiperêmico e por este

motivo não se apresenta teste estatístico comparativo.

Tabela 2 – Avaliação do halo hiperêmico segundo o grupo por período

Halo hiperêmico

Tempo de

Grupo

(1)

Presente Ausente TOTAL Valor de p

Avaliação

 3 dias

2 40,0 3 60,0 5

100,0 p

(2)

= 0,018*

5 100,0 - - 5

100,0

3 60,0 2 40,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

1 20,0 4 80,0 5

100,0

Grupo Total

100,0

 7 dias

- - 5 100,0 5

100,0 p

(2)

< 0,001*

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

5 100,0 - - 5

100,0

Grupo Total

100,0

 14 dias

- - 5 100,0 5

100,0 **

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

Grupo Total

100

100,0

(*): Associação significante a 5,0%.

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

Através do teste Exato de Fisher.

Fig. 11 – Presença de halo hiperêmico e fundo sangrante (G1A).

Na Tabela 3 referente ao estudo de borda necrótica destaca-se que: na avaliação com

03 dias (Fig.12 e 13) a maioria (76,0%) dos animais apresentava borda necrótica e entre os

grupos as freqüências variaram de 2 (grupo 5) a 5 casos (grupos 3 e 4) e não se comprova

diferença significante entre os grupos (p > 0,05).

Na avaliação com 7 dias observa-se que: no grupo 1, 100% dos animais apresentavam

borda necrótica, enquanto que no grupo 5 apresentavam ausência borda necrótica. Nos outros

três grupos a freqüência variou de 2 a 3 casos com presença de borda necróticas e comprova-

se diferença significante entre os grupos.

Na avaliação com 14 dias nenhum animal apresentava borda necrótica, por este motivo

não se apresenta teste estatístico comparativo.

Tabela 3 – Avaliação da borda necrótica segundo o grupo por período.

Borda necrótica

Tempo de

Grupo

(1)

Presente Ausente TOTAL Valor de p

Avaliação

 3 dias

4 80 1 20 5

100,0 p

(2)

= 0,202

3 60 2 40 5

100,0

5 100 - - 5

100,0

5 100 - - 5

100,0

2 40 3 60 5

100,0

Grupo Total

100,0

 7 dias

5 100 - - 5

100,0 p

(2)

= 0,026*

3 60 2 40 5

100,0

2 40 3 60 5

100,0

2 40 3 60 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

Grupo Total

100,0

 14 dias

- - 5 100,0 5

100,0 **

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

- - 5 100,0 5

100,0

Grupo Total

100

100,0

(*): Associação significante a 5,0%.

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

Fig. 12 – Aspecto da borda necrótica (G1A).

Fig.13 – Aspecto da ausência de borda necrótica (G3A)

Quanto a avaliação da crosta nas feridas, com 3 dias, todos os animais do experimento

apresentavam crosta (Fig. 14). Na avaliação com 7 dias nos grupos 1 e 3 nenhum animal

apresentava crosta, enquanto que, 100% dos animais dos grupos 2 e 5 apresentavam crosta;

no grupo 4, 60% dos animais apresentavam crosta, diferenças estas que se revelam

signficantes entre os grupos. Na avaliação com 14 dias todos os animais havia ausência de

crosta (Fig. 15) e por este motivo não se apresenta teste estatístico comparativo.

Fig. 14 – Presença da crosta (G4A)

Fig. 15 – Ausência da crosta (G5C).

Tabela 4 – Avaliação da crosta segundo o grupo por período.

Crosta

Tempo de

Grupo

(1)

Presente Ausente TOTAL Valor de p

Avaliação

 3 dias

5 100 - - 5

100,0 **

5 100 - - 5

100,0

5 100 - - 5

100,0

5 100 - - 5

100,0

5 100 - - 5

100,0

Grupo Total

100

100,0

 7 dias

- - 5 100 5

100,0 p

(2)

< 0,001*

5 100 - - 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

3 60 2 40 5

100,0

5 100 - - 5

100,0

Grupo Total

100,0

 14 dias

- - 5 100 5

100,0 **

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

Grupo Total

100

100,0

(*): Associação significante a 5,0%.

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

A ausência de fundo sangrante nas feridas foi verificada em todos os grupos em todos

os períodos de observação, com exceção de um animal (20%) do grupo 1 (Fig. 11) que,

apresentava fundo da ferida sangrante na avaliação com 3 dias (Tabela 5).

Tabela 5 – Avaliação do fundo sangrante segundo o grupo por período.

Fundo sangrante

Tempo de

Grupo

(1)

Presente Ausente TOTAL Valor de p

Avaliação

 3 dias

1 20,0 4 80,0 5

100,0 p

(2)

= 1,000

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

Grupo Total

4,0

96,0

100,0

 7 dias

- - 5 100 5

100,0 **

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

Grupo Total

100

100,0

 14 dias

- - 5 100 5

100,0 **

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

- - 5 100 5

100,0

Grupo Total

100

100,0

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

A média e o desvio padrão do percentual da contração da ferida segundo os grupos em

cada uma das avaliações, pode ser verificada na Tabela 6; nesta é possível destacar que: no

período de 03 dias os grupos 3 e 5 apresentaram maior média de contração, em comparação

aos demais grupos. Através do testes de comparações pareadas, comprova-se diferença

significante entre cada um dos grupos. Em cada um dos grupos a média aumentou com o

tempo de avaliação; em todos os grupos a média foi igual ao valor máximo de 100,0% na

avaliação com 14 dias. Diferenças significantes foram registradas entre os tempos de avaliação

para cada um dos grupos e se comprova diferenças significantes entre cada um dos tempos de

avaliação.

Tabela 6 – Avaliação da contração da ferida segundo o grupo por período.

Grupo

Tempo de

1 2 3 4 5 Valor de p

Avaliação Média  DP Média  DP Média  DP Média  DP Média  DP

3 dias

32,24  7,77

(A, a)

34,88  19,64

(A, a)

51,94  9,14

(B, a)

32,98  8,56

(A, a)

50,26  10,74

(B, a)

(2)

= 0,030*

7 dias

70,92  6,20

(b)

79,58  2,91

(b)

79,34  4,13

(b)

79,20  9,51

(b)

81,24  5,86

(b)

(2)

=0,106

14 dias

100,00  0,00

(c)

100,00  0,00

(c)

100,00  0,00

(c)

100,00  0,00

(c)

100,00  0,00

(c)

Valor de p p

(3)

< 0,001* p

(3)

< 0,001* p

(3)

< 0,001* p

(3)

< 0,001* p

(3)

< 0,001*

(*): Diferença significante a 5,0%.

(**): Não foi determinado devido à ocorrência de resultados iguais em todos os grupos.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste F(ANOVA).

Obs.: Se todas as letras maiúsculas entre parênteses são distintas comprova-se diferença significante entre os

grupos correspondentes através das comparações pareadas de LSD.

Obs.: Se todas as letras minúsculas entre parênteses são distintas comprova-se diferença significante entre os

tempos de avaliação correspondentes através das comparações pareadas de Tamhane’s T2.

No gráfico 1 pode ser percebido o aumento da contração em todos os grupos com os

tempos de avaliação, sendo mais acentuado nos grupos 3 e 5, no terceiro dia, com diferença

estatística comprovada (p = 0,030). No sétimo dia o a diferença entre os grupos não foi

significativa, seguindo uma tendência de equilíbrio até o décimo quarto dia.

100

120

3 dias 7 dias 14 dias

Média

Gr 1

Gr 2

Gr 3

Gr 4

Gr 5

Gráfico 1 – Médias do percentual de contração de ferida segundo o tempo de avaliação e o

grupo.

5.2 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA

Na avaliação morfológica, as lâminas foram coradas em HE e em TM, para

evidenciação da colagenização. Os critérios analisados em HE foram: formação de crostas,

inflamação, angiogênese, tecido de granulação e reepitelização. Todas essas características

forma graduadas em: ausente (0), discreta (1), moderada (2) e intensa (3), de acordo com o

seu aspecto histológico. Na análise com TM, foi evidenciada a colagenização, sendo esta

graduada em: ausente (0), leve (1), entre leve e moderado (2), moderado (3), entre moderado e

intenso (4) e intenso (5).

Na Tabela 7 analise-se a formação da crosta de acordo com o período. Com 03 dias de

observação, 100% dos espécimes nos grupos 1 e 3 apresentaram crosta intensa (Fig. 16 e 17);

no grupo 2 foi verificada a presença intensa de crosta em 60% dos espécimes e em 40%,

presença moderada de crosta; nos grupos 4 e 5, em 80% dos espécimes houve presença de

crosta intensa, e nos demais a crosta apresentava-se moderada em ambos os grupos.

Na avaliação com 07 dias, 100% dos espécimes dos grupos 1 e 3 a crosta estava

ausente (Fig. 18); no grupo 2, 100% foram classificados com crosta no grau leve; no grupo 4,

40% apresentaram ausência, 20% com crosta no grau leve e 40% com grau moderado; no

grupo 5, 75% dos espécimes com grau leve e 25% no grau intenso de crosta. Sendo a

diferença significante ao nível de 5,0% apenas para este período de avaliação (p < 0,05).

Na avaliação com 14 dias com exceção de um espécime do grupo 2, que apresentou

grau leve de crosta, todos os demais analisados apresentavam ausência de crosta.

Tabela 7 – Avaliação da crosta segundo o grupo por período.

Crosta

Tempo de Grupo

(1)

Ausente Leve Moderado Intenso TOTAL Valor de p

Avaliação n % n % n % n % n %

 3 dias

- - - - - - 5 100,0 5 100,0 p

(2)

= 0,753

- - - - 2 40,0 3 60,0 5 100,0

- - - - - - 5 100,0 5 100,0

- - - - 1 20,0 4 80,0 5 100,0

Grupo Total

16,0

84,0

100,0

 7 dias

4 100,0 - - - - - - 4 100,0 p

(2)

< 0,001*

- - 4 100,0 - - - - 4 100,0

5 100,0 - - - - - - 5 100,0

2 40,0 1 20,0 2 40,0 - - 5 100,0

- - 3 75,0 - - 1 25,0 4 100,0

Grupo Total 11 50,0 8 36,4 2 9,1 1 4,5 22 100,0

 14 dias

5 100,0 - - - - - - 5 100,0 p

(2)

= 1,000

4 80,0 1 20,0 - - - - 5 100,0

5 100,0 - - - - - - 5 100,0

Grupo Total 24 96,0 1 4,0 - - - - 25 100,0

(*): Associação significante a 5,0%

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3 Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

Fig. 16 – Presença de crosta intensa, com 03

dias, em HE (Escala de referência 100 µm).

Fig. 17 – Presença de crosta intensa, com 03

dias, em HE (Maior aumento, escala de

referência 100 µm).

Fig. 18 – Ausência de crosta, com 07 dias, em HE (Escala de referência

100 µm).

Na avaliação da inflamação (Tabela 8) destaca-se que: com 03 dias 80% dos animais

do grupo 1 apresentaram inflamação intensa (Fig. 19) e 20% inflamação moderada; no grupo 2,

100% apresentaram grau intenso de inflamação; no grupo 3 em 20% dos espécimes houve

ausência de inflamação, 20% com grau leve e 60% com inflamação intensa; no grupo 4, 80%

apresentaram grau leve e 20% inflamação moderada; no grupo 5, 40% com grau moderado e

60% com grau intenso de inflamação. Foi verificada diferença significante entre os grupos na

referida avaliação (p < 0,05).

Com 07 dias no grupo 1 verificou-se que 25% dos espécimes apresentavam grau leve

de inflamação e os demais (75%) inflamação intensa, no grupo 2 todos apresentaram

inflamação no grau intenso; o grupo 3 verificou-se que 20% apresentava inflamação leve e

80% inflamação intensa; no grupo 4, 40% apresentaram grau leve e 60% grau intenso de

inflamação; no grupo 5, 75% com inflamação leve e 25% inflamação moderado, entretanto ao

nível de 5,0% não se comprova diferença significante entre os grupos.

Na avaliação com 14 dias no grupo 1 a inflamação estava ausente em 40 % dos

animais e 60% apresentaram inflamação leve; no grupo 2, 20% apresentaram inflamação leve,

20% moderada e 60% inflamação intensa, no grupo 3, 60% grau leve de inflamação e 40%

com inflamação moderada; no grupo 4, 60% com grau leve, 20% com moderado e 20% com

inflamação intensa e no grupo 5, 40% dos espécimes apresentaram grau leve e 60% com

inflamação moderada. Entretanto, não se comprova diferença significante entre os grupos na

avaliação com 14 dias (p >0,05).

Tabela 8 – Avaliação da inflamação segundo o grupo por período.

Inflamação

Tempo de Grupo

(1)

Ausente Leve Moderado Intenso TOTAL Valor de p

Avaliação n % n % n % n % n %

 3 dias

- - - - 1 20,0 4 80,0 5 100,0 p

(2)

= 0,004*

- - - - - - 5 100,0 5 100,0

1 20,0 1 20,0 - - 3 60,0 5 100,0

- - 4 80,0 1 20,0 - - 5 100,0

- - - - 2 40,0 3 60,0 5 100,0

Grupo Total 1 4,0 5 20,0 4 16,0 15 60,0 25 100,0

 7 dias

- - 1 25,0 - - 3 75,0 4 100,0 p

(2)

= 0,087

- - - - - - 4 100,0 4 100,0

- - 1 20,0 - - 4 80,0 5 100,0

- - 2 40,0 - - 3 60,0 5 100,0

- - 3 75,0 1 25,0 - - 4 100,0

Grupo Total - - 7 31,8 1 4,5 14 63,6 22 100,0

 14 dias

2 40,0 3 60,0 - - - - 5 100,0 p

(2)

= 0,117

- - 1 20,0 1 20,0 3 60,0 5 100,0

- - 3 60,0 2 40,0 - - 5 100,0

- - 3 60,0 1 20,0 1 20,0 5 100,0

- - 2 40,0 3 60,0 - - 5 100,0

Grupo Total

8,0

48,0

28,0

16,0

100,0

(*): Associação significante a 5,0%

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

No estudo do grau de angiogênese na avaliação com 03 dias todos os animais dos

grupos 1 e 4 apresentaram grau intenso (Fig. 20); no grupo 2, 20% com grau leve, 20 % com

grau moderado e 60% com grau intenso de angiogênese; no grupo 3, 40% com grau leve, 20%

Fig. 19 – Presença intensa de células inflamatórias, na crosta, 03 dias, em HE (Escala de

referência 100 µm).

com moderado e 40% com angiogênese intensa; no grupo 5, 40% com grau moderado e 60%

com angiogênese intensa. Não existindo significância estatística para este período (Tabela 9).

Na avaliação com 07 dias 100% dos espécimes do grupo 1 apresentaram grau leve de

angiogênese, enquanto 100% do grupo 2 apresentaram intensa; no grupo 3, 20%

apresentaram grau moderado e 80% angiogênese intensa; no grupo 4, 20% com grau leve,

20% moderado e 60% intensa; no grupo 5, 75% com grau leve e 25% com angiogênese

moderada (p = 0,002).

Com 14 dias: no grupo 1, 20% com ausência de angiogênese e 80% com grau leve; no

grupo 2, 20% com grau leve, 20% moderada e 60% intensa; no grupo 3, 40% com grau leve,

40% moderado e 20% intensa; no grupo 4, 60% com grau leve e 40% intensa e no grupo 5,

100% grau moderado de angiogênese (p = 0,004).

Tabela 9 – Avaliação da angiogênese segundo o grupo por período.

Angiogênese

Tempo de Grupo

(1)

Ausente Leve Moderado Intenso TOTAL Valor de p

Avaliação n % n % n % n % n %

 3 dias

- - - - - - 5 100,0 5 100,0 p

(2)

= 0,196

- - 1 20,0 1 20,0 3 60,0 5 100,0

- - 2 40,0 1 20,0 2 40,0 5 100,0

- - - - - - 5 100,0 5 100,0

- - - - 2 40,0 3 60,0 5 100,0

Grupo Total - - 3 12,0 4 16,0 18 72,0 25 100,0

- -

 7 dias

- - 4 100,0 - - - - 4 100,0 p

(2)

= 0,002*

- - - - - - 4 100,0 4 100,0

- - - - 1 20,0 4 80,0 5 100,0

- - 1 20,0 1 20,0 3 60,0 5 100,0

- - 3 75,0 1 25,0 - - 4 100,0

Grupo Total - - 8 36,4 3 13,6 11 50,0 22 100,0

 14 dias

1 20,0 4 80,0 - - - - 5 100,0 p

(2)

= 0,004*

- - 1 20,0 1 20,0 3 60,0 5 100,0

- - 2 40,0 2 40,0 1 20,0 5 100,0

- - 3 60,0 - - 2 40,0 5 100,0

- - - - 5 100,0 - - 5 100,0

Grupo Total 1 4,0 10 40,0 8 32,0 6 24,0 25 100,0

(*): Associação significante a 5,0%

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

Avaliando-se a angiogênese segundo o período, percebe-se que houve diferença

significativa nos três períodos nos grupos 1 e 5. No grupo 1, a angiogênese diminuiu

gradativamente, já no grupo 5, houve diminuição do terceiro para o sétimo dia e aumento do

sétimo para o décimo quarto dia (Tabela 10).

Tabela 10 – Avaliação da angiogênese segundo o período por grupo.

Angiogênese

Grupo

(1)

Período

Ausente Leve Moderado Intenso TOTAL Valor de p

n % n % n % n % n %

 1

3 dias

- - - - - - 5 100,0 5 100,0 p

(2)

= 0,001*

7 dias

- - 4 100,0 - - - - 4 100,0

14 dias

1 20,0 4 80,0 - - - - 5 100,0

Grupo Total 1 7,1 8 57,1 - - 5 35,7 14 100,0

 2

3 dias

- - 1 20,0 1 20,0 3 60,0 5 100,0 p

(2)

= 1,000

Fig. 20 – Presença intensa de angiogênese, 03 dias, em HE (Escala de referência 100

µm).

7 dias

- - - - - - 4 100,0 4 100,0

14 dias

- - 1 20,0 1 20,0 3 60,0 5 100,0

Grupo Total - - 2 14,3 2 14,3 10 71,4 14 100,0

 3

3 dias

- - 2 40,0 1 20,0 2 40,0 5 100,0 p

(2)

= 0,560

7 dias

- - - - 1 20,0 4 80,0 5 100,0

14 dias

- - 2 40,0 2 40,0 1 20,0 5 100,0

Grupo Total - - 4 26,7 4 26,7 7 46,7 15 100,0

 4

3 dias

- - - - - - 5 100,0 5 100,0 p

(2)

= 0,131

7 dias

- - 1 20,0 1 20,0 3 60,0 5 100,0

14 dias

- - 3 60,0 - - 2 40,0 5 100,0

Grupo Total - - 4 26,7 1 6,7 10 66,7 15 100,0

 5

3 dias

- - - - 2 40,0 3 60,0 5 100,0 p

(2)

= 0,008*

7 dias

- - 3 75,0 1 25,0 - - 4 100,0

14 dias

- - - - 5 100,0 - - 5 100,0

Grupo Total - - 3 21,4 8 57,1 3 21,4 14 100,0

(*): Associação significante a 5,0%.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

Com relação à presença de tecido de granulação verifica-se que: na avaliação com 3

dias com exceção de dois espécimes do grupo 1 e um espécime do grupo 2 que apresentavam

granulação no grau intenso os demais animais não apresentavam tecido de granulação. Mas

sem significância estatística (Tabela 11).

Na avaliação com 07 dias observou-se que: no grupo 1, 50% apresentaram tecido de

granulação no grau leve e 50% com grau intenso; no grupo 2, 25% apresentaram ausência de

granulação, 50% grau leve e 25% grau intenso de tecido de granulação; no grupo 3, 20% com

grau moderado e 80% granulação intensa; no grupo 4, 40% apresentaram grau leve e 60% no

grau intenso de granulação e no grupo 5, 50% com grau leve, 25% moderado e 25%

granulação intensa. Para as avaliações com 3 e 7 dias não se comprova diferença significante

para nenhum dos grupos (p > 0,05).

Com 14 dias, todos os espécimes apresentavam tecido de granulação; no grupo 1

todos os espécimes apresentaram granulação no grau leve; no grupo 2, 20% apresentaram

grau leve e 80% grau intenso; no grupo 3, 60% dos espécimes com grau leve e 40% com

moderado; no grupo 4, 60% com grau leve e 40% com intenso de granulação e no grupo 5,

40% grau moderado e 60% com grau intenso. Comprova-se diferença significante entre os

grupos (p < 0,05).

Tabela 11 – Avaliação do tecido de granulação segundo o grupo por período.

Granulação

Tempo de Grupo

(1)

Ausente Leve Moderado Intenso TOTAL Valor de p

Avaliação n % N % n % n % n %

 3 dias

3 60,0 - - - - 2 40,0 5 100,0 P

(2)

= 0,457

4 80,0 - - - - 1 20,0 5 100,0

5 100,0 - - - - - - 5 100,0

Grupo Total 22 88,0 - - - - 3 12,0 25 100,0

 7 dias

- - 2 50,0 - - 2 50,0 4 100,0 P

(2)

= 0,458

1 25,0 2 50,0 - - 1 25,0 4 100,0

- - - - 1 20,0 4 80,0 5 100,0

- - 2 40,0 - - 3 60,0 5 100,0

- - 2 50,0 1 25,0 1 25,0 4 100,0

Grupo Total 1 4,5 8 36,4 2 9,1 11 50,0 22 100,0

 14 dias

- - 5 100,0 - - - - 5 100,0 P

(2)

= 0,004*

- - 1 20,0 - - 4 80,0 5 100,0

- - 3 60,0 2 40,0 - - 5 100,0

- - 3 60,0 - - 2 40,0 5 100,0

- - - - 2 40,0 3 60,0 5 100,0

Grupo Total - - 12 48,0 4 16,0 9 36,0 25 100,0

(*): Associação significante a 5,0%.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3: Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

A Tabela 12 demonstra a avaliação da colagenização (Fig. 22 à 36) através de

coloração especial em Tricrômico de Masson. Com 03 dias a maioria (79,2%) dos espécimes

apresentava colagenização discreta e os 20,8% restantes apresentaram colagenização entre

discreta e moderada, sendo que entre os grupos as freqüências com colagenização discreta,

variaram de 3 a 5 espécimes, em cada grupo, sem comprovação de diferença significante.

Na avaliação com 07 dias, no grupo 1, 100% dos espécimes apresentaram

colagenização discreta; no grupo 2, 80% com colagenização discreta e 20% com

colagenização moderada; no grupo 3, 60% com colagenização discreta, 20% moderada e 20%

entre moderada e intensa; no grupo 4, 60% entre discreta e moderada, 20% moderada e 20%

com colagenização intensa; no grupo 5, 50% com grau discreto de colagenização e 50 com

grau moderado. As diferenças se revelam significantes entre os grupos.

Fig. 21 – Presença intensa de tecido de granulação, 03 dias, em HE (Escala de

referência 100 µm).

Com 14 dias, no grupo 1, 100% apresentavam colagenização moderada; no grupo 2,

40% com grau moderada e 60% com grau entre moderado e intenso de colagenização; nos

grupos 3 e 4, 20% com colagenização entre moderada e intensa e 80% com colagenização

intensa; no grupo 5, 20% com colagenização discreta, 20% com colagenização moderada, 20%

entre moderada e intensa e 40% com colagenização intensa. Comprova-se diferença

significante entre os grupos em relação aos resultados da questão.

Tabela 12 – Avaliação do colagenização segundo o grupo por período.

Colagenização

Tempo de Grupo

(1)

Discreta

Discreta/

Moderada

Moderada/

Intensa

Intensa TOTAL Valor de p

Avaliação n % n % n % n % n % n %

 3 dias

4 100,0

- - - - - - - - 4 100,0 p

(2)

= 0,471

5 100,0

- - - - - - - - 5 100,0

4 80,0 1 20,0 - - - - - - 5 100,0

3 60,0 2 40,0 - - - - - - 5 100,0

Grupo Total 19 79,2 5 20,8 - - - - - - 24 100,0

 7 dias

100,0

- - - - - - - -

100,0 p

(2)

= 0,029*

4 80,0

- -

1 20,0

- - - -

100,0

3 60,0

- -

1 20,0 1 20,0

- -

100,0

- -

60,0

20,0

- -

20,0

100,0

2 50,0

- -

2 50,0

- - - -

100,0

Grupo Total

56,5

13,0

21,7

4,3

100,0

 14 dias

- - - -

100,0

- - - -

100,0 p

(2)

= 0,005*

- - - -

2 40,0 3 60,0

- -

100,0

- - - - - -

1 20,0 4 80,0 5

100,0

- - - - - -

20,0

80,0

100,0

1 20,0

- -

1 20,0 1 20,0 2 40,0 5

100,0

Grupo Total 1 4,2 - - 7 29,2 6 25,0 10 41,7 24 100,0

(*): Associação significante a 5,0%.

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3 Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

(2): Através do teste Exato de Fisher.

Fig. 22 – Colagenização discreta, em TM, Grupo Controle com 03 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 23 – Colagenização discreta, em TM, Grupo Controle com 07 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 24 – Colagenização moderada, em TM, Grupo Controle com 14 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 25 – Colagenização discreta, em TM, Grupo Orabase com 03 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 26 – Colagenização moderada, em TM, Grupo Orabse 07 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 27 – Colagenização moderada, em TM, Grupo Orabase com 14 dias (Escala de

referência 100 µm)

Fig. 28 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Quitosana com 03 dias (Escala de

referência 100 µm)

Fig. 29 – Colagenização moderada/intensa, em TM, Grupo Quitosana com 07dias (Escala de

referência 100 µm)

Fig. 30 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Quitosana com

14 dias (Escala de referência 100 µm).

Fig. 31 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Laser com 03 dias (Escala de

referência 100 µm)

Fig. 32 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Laser com 07 dias

(Escala de referência 100 µm)

Fig. 33 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Laser com 14 dias

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 34 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Quitosana e Laser com 03 dias

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 35 – Colagenização discreta /moderada, em TM, Grupo Quitosana e Laser com 7 dias

(Escala de referência 100 µm).

Fig. 36 – Colagenização intensa, em TM, Grupo Quitosana e Laser com 14 dias (Escala de

referência 100 µm).

No estudo da reepitelização destaca-se que: houve um aumento gradativo desta de

acordo com o tempo, em cada grupo, sendo a diferença, entre os períodos observacionais, de

forma significativa (Tabela 13 e Fig. 37).

Tabela 13 – Avaliação da reepitelização segundo o período por grupo.

Reepitelização

Grupo

(1)

Período

Ausente Leve Moderado Intenso TOTAL Valor de p

 1

3 dias

5 100,0 - - - - - - 5 100,0 p

(2)

= 0,002*

7 dias

4 100,0 - - - - - - 4 100,0

14 dias

- - 4 80,0 1 20,0 - - 5 100,0

Grupo Total 9 64,3 4 28,6 1 7,1 - - 14 100,0

 2

3 dias

5 100,0 - - - - - - 5 100,0 p

(2)

= 0,001*

7 dias

4 100,0 - - - - - - 4 100,0

14 dias

- - 3 60,0 2 40,0 - - 5 100,0

Grupo Total 9 64,3 3 21,4 2 14,3 - - 14 100,0

 3

3 dias

5 100,0 - - - - 5 100,0 p

(2)

= 0,006*

7 dias

4 80,0 - - - - 1 20,0 5 100,0

14 dias

- - - - 3 60,0 2 40,0 5 100,0

Grupo Total

60,0

20,0

100,0

 4

3 dias

5 100,0 - - - - - - 5 100,0 p

(2)

= 0,001*

7 dias

5 100,0 - - - - - - 5 100,0

14 dias

- - 1 20,0 4 80,0 - - 5 100,0

Grupo Total 10 66,7 1 6,7 4 26,7 - - 15 100,0

 5

3 dias

5 100,0 - - - - - - 5 100,0 p

(2)

= 0,001*

7 dias

4 100,0 - - - - - - 4 100,0

14 dias

- - 2 40,0 3 60,0 - - 5 100,0

Grupo Total 9 64,3 2 14,3 3 21,4 - - 14 100,0

(*): Associação significante a 5,0%.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3 Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

( (2): Através do teste Exato de Fisher.

Fig. 37 – Reepitelização da Ferida, em HE, com 14 dias

(Escala de referência 100 µm).

Na avaliação baseada no período, com 03 dias, em 100% dos espécimes, em todos os

grupos, não houve reepitelização. Na avaliação com 07 dias com exceção de um animal do

grupo 3 com reepitelização no grau intenso, todos os demais apresentavam ausência desta

característica (Tabela 14).

Com 14 dias todos os animais apresentavam reepitelização, sendo no grupo 1, 80%

reepitelização leve e 20% moderado; no grupo 2, 60% com reepitelização leve e 40%

moderado; no grupo 3, 60% moderado e 40% com reepitelização intensa; no grupo 4, 20%

apresentaram reepitelização com grau leve e 80% moderado; no grupo 5, 40% apresentaram

grau leve e 60% moderado. Para as avaliações que foram possíveis ser aplicado o teste

estatístico comparativo não foi comprovado diferença significante entre os grupos em nenhuma

delas. (p > 0,05).

Tabela 14 – Avaliação da reepitelização segundo o grupo por período

Reepitelização

Tempo de Grupo

(1)

Ausente Leve Moderado Intenso TOTAL Valor de p

Avaliação

 3 dias

5 100,0 - - - - - - 5 100,0 **

5 100,0 - - - - - - 5 100,0

Grupo Total 25 100,0 - - - - - - 25 100,0

 7 dias

4 100,0 - - - - - - 4 100,0 p

(2)

= 1,000

4 100,0 - - - - - - 4 100,0

4 80,0 - - - - 1 20,0 5 100,0

5 100,0 - - - - - - 5 100,0

4 100,0 - - - - - - 4 100,0

Grupo Total

95,5

4,5

100,0

 14 dias

- - 4 80,0 1 20,0 - - 5 100,0 p

(2)

= 0,110

- - 3 60,0 2 40,0 - - 5 100,0

- - - - 3 60,0 2 40,0 5 100,0

- - 1 20,0 4 80,0 - - 5 100,0

- - 2 40,0 3 60,0 - - 5 100,0

Grupo Total - - 10 40,0 13 52,0 2 8,0 25 100,0

(**): Não foi possível determinar devido à ausência de uma das categorias.

(1): Grupo 1: Controle; Grupo 2: Orabase; Grupo 3 Quitosana em Orabase; Grupo 4: Laser 660 Nm; Grupo 5:

Quitosana em Orabase + Laser 660 Nm.

( (2): Através do teste Exato de Fisher.

DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

A cicatrização de uma maneira geral é assunto relevante para a comunidade científica.

O tema continua sendo alvo de novos estudos visto que, apesar do atual avanço da ciência, é

ainda grande o número de complicações decorrentes de problemas inerentes a esse fenômeno

biológico.

A cicatrização por segunda intenção, sem o uso de suturas e com maior quantidade de

tecido de granulação, tem sido descrita com diferentes fases e características: inicia com a

hemorragia e formação de coágulo e crosta, continua-se com a limpeza da ferida, decorrente

da exsudação fibrinosa formadora de crosta por ressecamento e contendo leucócitos ativos

para eliminação de microrganismos e corpos estranhos. Ocorre então a formação do tecido de

granulação composto por fibroblastos, neovascularização e miofibroblastos, sendo estes

últimos responsáveis pela retração da ferida. Apoiando-se no tecido de granulação e a partir de

diversos pontos, há a epitelização da lesão e deposição colágena no tecido formador da

cicatriz (ANDRADE, 1999; SWAIM e HENDERSON, 1997).

Paralelamente a isto é importante ressaltar que os aspectos locais como a localização

das lesões e a proteção que as crostas exercem, devendo-se evitar qualquer fator que

prolongue o processo inflamatório (ANDRADE, 1999).

A melhoria das opções terapêuticas para várias lesões da cavidade oral deve ser uma

constante preocupação da Odontologia moderna, objetivando promover uma melhor reparação

tecidual da área lesada em combinação com a minimização da sintomatologia dos processos

inflamatórios agudos, com o mínimo de agressão e efeitos colaterais ao paciente

(MARTORELLI, 2006).

O uso de determinados fármacos, mesmo de uso tópico, podem favorecer ou

atrapalhar o processo de cicatrização e migração epitelial. Assim, é importante conhecer a

ação dos medicamentos e suas interações no processo de cura das feridas para escolha

acertada do tratamento (FAZIO; ZIETLLI e GOLSLEN, 2000).

As dificuldades de tratamento e as complicações das feridas, como nos casos do

diabetes, têm estimulado a ciência na busca de métodos alternativos e seguros, que auxiliem

ou até mesmo acelerem os estágios da reparação tecidual, promovendo a precocidade na cura

das feridas.

Seguindo este pensamento, encontra-se em ênfase a utilização de produtos naturais,

como a quitosana, e o desenvolvimento da biomodulação tecidual através da Lasertarapia.

Ambos pelas suas propriedades estão sendo amplamente utilizados, não apenas para o

tratamento de feridas, mas nas mais variadas áreas da terapêutica e da cosmética.

Todos esses fatos anteriormente discutidos motivaram o desenvolvimento da presente

pesquisa.

Com relação a metodologia do presente estudo, nossa escolha pela execução de

feridas em pele e não em mucosa, baseia-se no fato da necessidade de aplicação diária dos

fármacos e da Laserterapia, o que obrigaria a aplicação de sedação cotidiana durante o

período experimental. Tal fato inviabilizaria o andamento da pesquisa pelo aumento do custo e

comprometimento da saúde dos animais. A aplicação diária na mucosa bucal implicaria

trabalhar com animais de maior porte, onde a metodologia necessária ao desenvolvimento

desta pesquisa, obrigaria a reduzir o número de amostras, podendo interferir na confiabilidade

dos resultados. Além disso, a inflamação e cicatrização da pele ou da mucosa, qualquer que

seja a etiologia de sua origem, ou seja, química, (LIMA et al., 2004) eletro-térmica (PAULO et

al., 1998) ou térmica, (MEIRELES, 2005), sugerem seguir um processo bem semelhante de

reparo, sendo métodos válidos neste tipo de experimento.

A escolha pela utilização de ratos da linhagem Wistar, foi definida por ter sido

padronizada anteriormente em estudos recentes e mostrou-se eficiente, visto que todos os

animais sobreviveram até o fim do experimento e não apresentaram complicações pós-

operatórias. O sexo dos animais foi definido propositalmente, devido a variabilidade do ciclo

hormonal das fêmeas, assim optamos por ratos machos (BRITO FILHO, et al, 2006).

Os estudos como ratos são amplamente utilizados para testar novas terapêuticas, as

vantagens de sua utilização superam as inadequações dos resultados com aplicações diretas

nos seres humanos (SHIELDS; O’KANE, 1994). As conclusões extraídas desses estudos não

devem ser totalmente direcionadas aos seres humanos, mas sim, utilizadas como guias para

novos estudos (WALKER, et al, 2000).

A escolha do método anestésico, sacrifício e seus agentes foram

baseados na Resolução Nº 714, De 20 de Junho de 2002, do Conselho

Federal De Medicina Veterinária, sendo escolhida uma técnica compatível

com os fins desejados e seguro para quem o executa, causando o mínimo

de estresse no animal, no operador e no observador.

A confecção das feridas no dorso do animal seguiu os parâmetros utilizados pelos

estudos de MARTORELLI (2006). Entretanto não seguimos a técnica de eletrocauterização,

por acreditarmos que ocorram variações na profundidade da lesão, devido a impossibilidade de

padronização da pressão da mão do operador, durante a confecção das feridas através desta

técnica. Com o auxilio de um “punch”, medindo 05 mm de diâmetro, realizamos a confecção

das feridas, removendo a derme em sua extensão total, padronizando desta forma todos os

experimentos, obtendo assim feridas cicatrizadas por segunda intenção.

A determinação da dose terapêutica tanto da quitosana como do laser foi baseado na

literatura pesquisada. Entretanto encontramos diferentes protocolos para ambas as formas de

tratamento. A enorme variação quanto aos parâmetros utilizados em processos de cicatrização,

tem dificultado uma interpretação adequada de seus efeitos, bem como a diversidade de

modelos usados. Isso porque a escolha dos parâmetros para a definição dos protocolos para a

utilização tanto da quitosana como do laser é realizada segundo a experiência dos autores,

uma vez que não existem parâmetros universalmente aceitos (PINHEIRO e GERBI, 2006).

Sendo assim, na composição da orabase de quitosana tomamos como base os

estudos de Alemdaroglu (2006), onde se comprova a eficácia na cicatrização do gel de

quitosana a 2%. A incorporação da quitosana nesta porcentagem permitiu a confecção de uma

orabase com características de fluidez e adesividade, aparentemente, semelhantes às

encontradas em outros tipos de orabase comercializadas atualmente.

Com relação à Laserterapia muitos pesquisadores que utilizam protocolos e unidades

de laser similares têm relatado resultados conflitantes. Acredita-se que não há um determinado

parâmetro que, por si só, produza os efeitos biomoduladores, mas a conjugação de diferentes

parâmetros e suas variações de acordo com o modelo experimental (PINHEIRO e GERBI,

2006). Mesmo com todas as divergências entre os autores, optamos por seguir o que

preconiza Baxter (1998), utilização do laser vermelho (660 Nm) e energia de 4J, para

cicatrização tecidual.

A avaliação macroscópica empregada, embora de caráter subjetivo, é de fundamental

importância no acompanhamento do processo de cura. Na prática corrente, é o meio disponível

mais usual, já que em humanos, não se justificaria retirada de tecidos cirurgicamente, tão

somente para acompanhamento da evolução de uma ferida no controle de eficácia dos

tratamentos.

Na avaliação microscópica, a análise da colagenização, através de técnicas

histológicas mais específicas, como o Tricrômico de Masson, apresenta-se como uma

ferramenta fidedigna, na avaliação da cicatrização tecidual; sua aplicabilidade fica mais do que

clara, já que o novo tecido é formado basicamente por uma matriz de colágeno (O’ LEARY; et

al, 2002). Com coloração de rotina em HE, sua diferenciação é muito difícil, as estruturas

apresentam aspectos de forma e coloração muito semelhantes, o que pode confundir o

examinador, por este motivo discordamos de Brito Filho (2006), no que se refere a eficiência na

quantificação e identificação das alterações celulares cicatriciais, com o uso do HE. Com a

utilização da Técnica do Tricrômico de Masson, em nossa pesquisa, todas as estruturas em

que continham fibras colágenas ficaram evidenciadas em azul, o que permitiu a fácil

diferenciação do colágeno.

A ausência de infecção, comprova que todos os cuidados necessários com relação a

anti-sepsia dos animais e a assepsia das gaiolas e dos instrumentos utilizados, foram

rigorosamente obedecidas em todos os períodos do experimento, sendo o resultado padrão

para todos os grupos do estudo.

A hiperemia ao redor da ferida é um fenômeno vascular, da inflamação no reparo

tecidual, tendo inicio alguns minutos após a ação do agente flogístico, intervalo em que se

processa a liberação de mediadores químicos, principalmente a histamina. Este característica

sofre modulações tanto pela intensidade do agente agressor como pela respostas dos tecidos

lesados (GUYTON, 1998). Nos resultados obtidos no estudo a hiperemia foi visualizada

durante o terceiro dia de observação, principalmente no grupo 2 (100% dos animais) e 3 (60%).

Já no grupo 4, em todos os animais, assim como 80% dos animais do grupo 5, nesse período,

não apresentaram hiperemia peri-lesional. O que corrobora com os estudos de Cools, (1984)

Veçoso (1993) e Medrado (2003), no que se refere à ação esperada da fotobiomodulação no

controle da hiperemia resultante da reação inflamatória. O aparecimento de hiperemia em

todos os animais do grupo 5 no sétimo dia, pode ser um sinal de uma reação não benéfica,

resultante da associação das terapias com quitosana e laser.

A crosta formada logo nas fases iniciais da cicatrização é composta primariamente por

concentração de fibrina, agregação plaquetária, embebidas em células sanguíneas (MARTIN,

1997). Este processo protege a ferida contra a ampla perda de eletrólitos e fluidos e contra a

contaminação por agentes nocivos (MONACO e LAWRENCE, 2003). A presença da crosta

pode ser observada tanto macroscopicamente como microscopicamente.

Macroscopicamente a presença da crosta foi comum para todos os grupos no terceiro

dia, assim como sua ausência no décimo quarto dia. A sua ausência clinica com sete dias de

observação, pode ser interpretada como um aspecto de melhor reparação da superfície

epitelial (RIBEIRO, et al, 2003) sendo bem evidenciada em todos os animas do grupo 1 e 3 e

em 40% dos animais do grupo 4. Microscopicamente sua intensidade no período inicial pode

ser um diferencial da reparação, sendo os dados das análises micro e macroscópicos

coincidentes nos períodos de três dias iniciais, quando se observa crosta com grau intenso nos

grupos 1 e 3, e uma perda precoce com sete dias, também nos mesmos grupos.

A presença de bordas necróticas foi significante apenas no período de sete dias. No

grupo 1, todos os animais apresentaram bordas necróticas, neste período. O grupo 5

apresentou o melhor resultado, sendo percebida a ausência das bordas necróticas, seguido do

grupos 3 e 4 com resultados idênticos (60% com ausência de bordas necróticas). De acordo

com o aspecto clínico das feridas, com bordas mais regulares, evidencia-se, nesses últimos

grupos, um padrão macroscópico de cicatrização melhorado (OLIVEIRA, 1992; RAMSEY,

1995; BLANES, 2004).

O aspecto sangrante no fundo das feridas pode ser considerado como um fator

negativo, um eventual retardo no processo de coagulação, na fase inicial da cicatrização

(BAXTER, 1994; RAMSEY, 1995; MONACO e LAWRENCE, 2003; MARTORELLI, 2006).

Durante o experimento, apenas um animal no grupo 1, apresentou esta característica, apesar

de não ser estatisticamente significativo.

A contração da ferida é mediada por citocinas e em particular pelo Fator de

Crescimento Transformador (TGF). Através da contração, o tamanho da ferida diminui

substancialmente, isto é primariamente causado pelos fibroblastos encontrados no tecido de

granulação e muitos deles se diferenciam em um fenótipo, que são referidos como

miofibroblastos (O’ LEARY, 2002). A ocorrência da contração da ferida mais lenta no grupo

controle, deve ser considera, isto comprova macroscopicamente a ação aceleradora da

quitosana (HOWLING, et al., 2001; SENEL e McCLURE, 2004; ALEMDAROGLU, et al., 2006;

DENG, et al.,2007; MUZARELLI, 2008) e da fotobiomodulação no processo cicatricial,

principalmente nos períodos iniciais, possivelmente pela estimulação dos miofibroblastos

(RESENDE; PEREIRA; CASTRO, 2005).

Após todo traumatismo tecidual desencadeia-se uma resposta inflamatória, que

possibilita o início da cicatrização. Porém uma resposta inflamatória muito exacerbada acaba

sendo nociva à cicatrização, pois compromete a microcirculação e a proliferação de

fibroblastos (MAZZINI, 1999). Durante a avaliação morfológica do nosso estudo, foi verificado

menor grau de inflamação, no primeiro período observacional, no grupo 4, isto esta de acordo

com Cools, (1984) Veçoso (1993), Ortiz (2001), Medrado (2003), Marcon e Sanfelice (2005), já

que o laser atua na reação inflamatória nos primeiros dias da reparação. Da mesma forma no

grupo 3 foi observada um bom controle inflamatório, pela ação da quitosana em orabase à 2%,

o que corrobora com os estudos de Howling, et al. (2001);Ishihara, et al. (2002); Ueno, et al.

(1999, 2001, 2007) e Muzzarelli (2008), nos quais todos eles são unânimes em relação a

melhora no desempenho dos PMN, principalmente macrófagos, acelerando desta forma a

cicatrização. A associação das duas formas de tratamento (Laserterapia e Quitosana)

apresentou um resultado mais modesto em comparação com os grupos anteriores, mas

percebe-se que há um controle mais acentuado da inflamação comparando-se com o grupo 1

(controle). No grupo 2, foi verificado que o uso apenas da orabase provocou o maior nível de

reação inflamatória. Possivelmente algum dos componentes da orabase desencadeou tal

reação. Com sete dias houve um aumento da inflamação em todos os grupos, com exceção do

grupo 5, no qual ocorreu diminuição da resposta inflamatória, mas sem correlação estatística

significante. A tendência de diminuição da inflamação continuou no período de observação

seguinte, o que corresponde a transição esperada das fases do reparo (GUYTON, 1998;

BLANES, 2004).

Através da neovascularização ou angiogênese, ocorre o aporte de células,

mediadores químicos e nutrição sanguínea para o local lesado. Em todos os grupos da

nossa pesquisa, a maioria dos espécimes apresentou grau de angiogênese entre moderado

e intenso no terceiro dia, com exceção do grupo 3, que apresentou menor grau de

angiogênese (40% leve). Já no sétimo dia os grupos 1, 4 e 5 apresentaram diminuição da

angiogênese, mesmo assim, com persistência de graus mais intensos de angiogênese no

grupo 4, característico da fotobiomodulação (BAXTER, 1994; GENOVESE, 2000; ORTIZ et

al., 2001; MEDRADO, et al., 2003; ROCHA, 2004; CORAZZA, 2005; BOURGUIGNON-

FILHO, et al., 2005). Nos grupos 2 e 3 houve uma tendência de aumento da angiogênese

no mesmo período, demonstrando que a orabase e a quitosana estimularam a angiogênese

de forma mais considerável nesse período de observação. Com 14 dias, todos os grupos

seguem um padrão de diminuição, mas ainda foi observada angiogênese intensa e

moderada nos grupos 2, 3 e 5, podendo ser interpretado como um efeito mantenedor da

neovascularização nas feridas protegidas pelos fármacos (RAMSEY, et al, 1995).

A formação do tecido de granulação, de acordo com Guyton (1998) e Blanes (2004),

percebe-se a partir do segundo ou terceiro dias, após o trauma. Na maioria dos espécimes

estudados não foi observada a formação do tecido de granulação com 03 dias. Com sete dias

de observação, já foi possível verificar a formação do tecido de granulação em todos os

grupos, mais intensamente nos grupos 3 e 4, mas ainda sem diferença significativa entre os

grupos. Já com quatorze dias a maioria dos espécimes, dos grupos dos grupos 1, 3 e 4,

apresentaram significativa queda no nível de tecido de granulação, enquanto que os grupos 2 e

5 apresentaram tecido de granulação aumentado no mesmo período. O tecido de granulação é

importantíssimo para reparação tecidual, mas a sua presença em intensidades variadas, em

períodos intermediários ou tardios foi comum de acordo com nossos resultados, não sendo um

parâmetro auxiliar para avaliação do grau de cicatrização, pois podem ser encontradas feridas

em graus avançados de colagenização ou reepitelização, com diferentes intensidades de

tecido de granulação.

Na avaliação da formação do colágeno, pode ser verificado que houve maior

colagenização nos grupos 4 e 5, no terceiro dia, mas ainda de forma não significativa

estatisticamente. Na continuação das observações no sétimo dia, os grupos 3, 4 e 5

apresentaram maiores níveis de colagenização, principalmente no grupo 4. No último período

observacional os grupos 3 e 4 apresentam resultados equivalentes, e o grupo 5 com resultados

mais modestos que os grupos anteriores. Isto sugere que a terapêutica com quitosana e o

laser, isoladamente, podem atuar de maneira favorável no processo de cicatrização tecidual

(DENG, et al.,2007; MUZARELLI, 2008; MEDRADO, et al., 2003; ROCHA, 2004; CORAZZA,

2005; BOURGUIGNON-FILHO, et al., 2005). Mas a associação das terapêuticas não causou o

efeito esperado, potencialização da cicatrização tecidual, não estando claro ainda o mecanismo

desta interação.

No estudo da reepitelização tecidual, nos dois primeiros períodos observacionais os

espécimes apresentaram características semelhantes. Já em uma observação mais tardia,

houve reepitelização mais evidente nos grupos 3 e 4, seguido pelo grupo 5, o que comprova

novamente que a associação da quitosana com a Laserterapia não apresenta potencialização

na cicatrização, não justificando desta forma o seu uso em conjunto, para tratamento desse

tipo de ferida.

De acordo com a literatura pesquisada e com os resultados desta pesquisa podemos

afirmar que, o uso da Quitosana e da Laserterapia são formas de tratamento de feridas

cutâneas, consagradas clínica e cientificamente. Na área Odontológica, a orabase apresenta-

se como um bom veículo farmacológico, sendo possível, de acordo com nosso estudo, a

associação com a quitosana, podendo ser utilizada como uma alternativa de tratamento, de

baixo custo e satisfatório, para úlceras e estomatites.

100

CONCLUSÃO

101

7. CONCLUSÃO

Nas condições experimentais utilizadas, de acordo com os resultados obtidos durante este

trabalho, podemos concluir que:

 No período inicial da cicatrização, o uso da quitosana em orabase associado à

Laserterapia promoveu, macroscopicamente, maior contração da ferida e melhores

padrões de cicatrização, quando comparado aos outros grupos.

 O grupo tratado com quitosana apresentou resultados semelhantes, ao grupo tratado

com Laserterapia, sobre o controle da inflamação, formação de crosta e angiogênese.

 Com o uso da quitosana em orabase a 2%, foi observada maior precocidade na

reepitelização.

 Com o Tricrômico de Masson, foi possível evidenciar que houve maior colagenização

entre os grupos 3 e 4 de forma equivalente.

 A associação das terapias com Laser e Quitosana, apresentou melhores resultados em

comparação com o grupo controle, mas sem causar potencialização da cicatrização,

comparando-se com as duas formas de tratamento utilizadas isoladamente.

102

REFERÊNCIAS

103

8. REFERÊNCIAS

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111

APÊNDICE

112

APÊNDICE – FICHA DE IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS

PESQUISA:

AVALIAÇÃO DA ORABASE DE QUITOSANA ASSOCIADA OU

NÃO AO LASER VISÍVEL DE λ 660 NM NA REPARAÇÃO

TECIDUAL

RESPONSÁVEIS PELA PESQUISA:

Orientadores – Tânia Lemos Coelho Rodrigues/ Francisco Limeira Júnior

Doutorando – Ricardo A. S. Gurgel

GRUPO:

Animais Nascimento

Massa

corporal

Sacríficio

ÓBITOS:

113

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