( PDF ) Identificação de iGb3 e iGb4 em células de melanoma B16F10-Nex2 e efeito antitumoral de células dendríticas primadas com iGb3 mediado por células iNKT

Download PDF

ads:

BIANCA RACHID DIAS

Identificação de iGb3 e iGb4 em células de

melanoma B16F10-Nex2 e efeito

antitumoral de células dendríticas primadas

com iGb3 mediado por células iNKT.

São Paulo

2010

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina, para obtenção

do título de Doutor em Ciências.

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

BIANCA RACHID DIAS

Identificação de iGb3 e iGb4 em células de

melanoma B16F10-Nex2 e efeito

antitumoral de células dendríticas primadas

com iGb3 mediado por células iNKT.

Orientador: Prof. Dr. Luiz R.Travassos

São Paulo

2010

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo –

Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do título de Doutor

em Ciências.

ads:

Dias, Bianca Rachid

Identificação de iGb3 e iGb4 em células de melanoma murino B16F10-

Nex2 e efeito antitumoral de células dend

ríticas primadas com iGb3

mediado por células iNKT/ Bianca Rachid Dias – São Paulo, 2010.

144 f.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-

graduação em Microbiologia, Imunologia e Parasitologia

Título em inglês: Identification of iGb3 and iGb4 in melanoma

B16F10-Nex2 cells and the iNKT cell-mediated antitumor effect of

dendritic cells primed with iGb3

1. Melanoma B16F10-Nex2 2. Células iNKT

3. Glicoesfingolipídeos iGb3, iGb4 e GM3 4. Células Dendríticas

5. Imuno vigilância

Trabalho realizado na Unidade de Oncologia

Experimental (UNONEX), no Departamento

de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,

da Universidade Federal de São Paulo –

Escola Paulista de Medicina –

com auxílio

financeiro concedido pel

a Fundação de

Amparo à

Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP)

Dedico essa tese

Aos meus pais Angela Lúcia e José Vitor

Ao meu marido Maury Yamazaki

À minha irmã Briana

À minha madrasta Elaine

Aos amigos da Disciplina de Biologia Celular

Amigos meus – Toquinho

Amigos meus está chegando a hora

Em que a tristeza aproveita pra entrar

E todos nós vamos ter que ir embora

Pra vida lá fora continuar.

Tem sempre aquele que

Toma mais uma no bar

Tem sempre um outro que

Vai direitinho pro lar .

Mas tem também

Uma sala que está vazia,

Sem luz, sem amor, sombria,

Prontinha pro show voltar.

E em novo dia

A gente vê novamente

A sala se encher de gente

Pra gente comemorar.

Pai nosso em aramaico

Abwun d’bwashmaya

Nethqadash shmakh

Teytey malkuthakh

Nehwey tzevyanach aykanna d’bwashmaya aph b’arha.

Hawvlan lachma d’sunqanan yaomana

Washboqlan khaubayan (wakhtahayan)

aykana daph khnan shbwoqan l’khayyabayn

Wela tahlan l’nesyuna

Ela patzan min bisha

Metol dilakhie malkutha wahayla wateshbukhta

l’ahlam almin.

Ameyn.

Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me proteger nas estradas entre Campinas / São Paulo / São José dos

Campos, nos dias de chuva e de perigo.

Ao meu orientador, Prof. Luiz R. Travassos que “sofreu” todos esses anos me

orientando e corrigindo meus relatórios, paper e tese. Obrigada por compartilhar sua

sabedoria. E não poderia deixar de lado um agradecimento pelas comemorações no

Outback e pelas celebrações da Queda da Bastilha.

À minha coorientadora Elaine G. Rodrigues, por me ajudar a fazer todo o trabalho

pesado nesses anos, pelos seus ensinamentos, conselhos, conversas e apoio.

Ao Prof. Leonardo Nimrichter, por me auxiliar nos primeiros passos das extrações

lipídicas.

Ao Prof. Igor C. Almeida e seu aluno Ernesto Nakayasu que me socorreram em

todos os momentos difíceis dessa tese e que foram sempre responsáveis por notícias boas.

Aos Professores com quem aprendi a tomar decisões burocráticas nas Comissões e

Representações que participei e que sempre respeitaram minhas opiniões, Profa. Célia,

Profa. Ieda, Profa. Olga, Profa. Rosana, Profa. Tânia, Prof. José Daniel, Prof. Renato e

Prof. Zoilo.

À Fapesp, pelo suporte financeiro dado em todos esses anos.

Aos meus grandes amigos de labuta Alisson, Andrey, Ellen, Fabiana, Márcia,

Manoela e Thaysa pelas conversas e risadas na sala de cultura e por me darem forças

quando encontrava as células contaminadas, enfim por toda a amizade. Apesar da distância

vocês serão sempre meus grandes amigos.

Aos amigos de laboratório Amanda (Profa. Miriam), Ana Beatriz, Carla, Carla

(Profa. Ieda), Carlos, Carol (Profa. Célia), Cíntia, Denise, Eliana, Flávia, Filipe, Felipe,

Jorge, Juliana, Juliana (Profa. Ieda), Karina, Kátia (Profa. Rosana), Luana, Luis, Mariana,

Milene (Profa. Rosana), Natasha, Rafael (Toddy), Sabrina, Simone, Teresa (Prof. Sérgio),

Tiemi, Vanessa (Prof. Sérgio). Obrigada por me apoiarem em todos os momentos, por me

ensinarem e ajudarem nos experimentos, pelas conversas científicas e descontraídas.

Agradecimentos

Aos funcionários da Disciplina de Biologia Celular Seu Américo, Seu Antônio

Furlaneti, Claudeci, Cláudio, José Carlos, Luizão, Márcia, Maria, Marcelo, Rose e D.

Sebastiana que sempre facilitaram meu trabalho me ajudando com os materiais e

experimentos que precisava fazer.

À Mércia secretária da Pós-graduação do Departamento de Microbiologogia,

Imunologia e Parasitologia, que tantas vezes me socorreu.

Agradeço aos meus primos, tios e meus avós que sempre me acharam louca por

querer estudar mais, mas que certamente nesse momento estão muito orgulhosos com

minhas conquistas, principalmente meus tios compadres Tio Élson e Tia Marta, Tio Nilson

e Tia Valéria, Tio Vicente e Tia Sônia, e meus avós Sebastião e Maria.

Aos meus sogros Mirley e Hitoshi que me levaram vários sábados para o laboratório

e ficavam chateados quando as células estavam contaminadas ou quando os experimentos

não davam certo.

Aos meus cunhados Guilherme, Joana, Luciana e Walt que por conhecerem parte da

área de pesquisa, me aturaram discutindo conceitos científicos, obrigada pela paciência.

Aos meus pais que apesar de às ve zes questionarem os caminhos que escolhi,

estiveram sempre presentes me apoiando e incentivando. Sofreram e se alegraram comigo

tantas vezes, além de serem “paitrocinadores” em diversos momentos. Devo tudo à vocês.

Amo vocês.

À minha madrasta Elaine que junto com meu pai me apoiou sempre.

Ao meu marido que sempre foi incentivador e companheiro na minha vida, indo

comigo aos sábados, domingos e madrugadas ao laboratório. Obrigada por entender quando

eu tinha que trabalhar entre Natais e Anos-Novos, quando tinha poucos dias de férias e por

sempre estar ao meu lado. Eu te amo muito muitão.

E por último à pessoa que mais amo no mundo, minha irmã Briana, que me apóia

incondicionalmente, me incentiva, e em quem eu me espelho pela sua ética, determinação,

disciplina e força. Obrigada por tudo, te amo Brizinha.

ÍNDICE

ABREVIAÇÕES.....................................................................................................................i

RESUMO................................................................................................................................ii

ABSTRACT...........................................................................................................................iii

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................1

1.1 Melanoma.....................................................................................................................1

1.2 Células iNKT................................................................................................................5

1.2.1 Células NKT e resposta imune anti-tumoral................................................................5

1.3 CD1...............................................................................................................................7

1.4 Lipídeos ........................................................................................................................9

1.4.1 a-Galactosilceramida ..............................................................................................10

1.4.1.1 Tratamentos com a-GalCer...............................................................................11

1.4.2. Isoglobosil ceramida...............................................................................................12

1.4.3. Gangliosídeos ........................................................................................................14

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................16

3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................17

3.1 Animais.......................................................................................................................17

3.2 Células........................................................................................................................17

3.3 Reagentes ...................................................................................................................18

3.4 Ensaio de citometria de fluxo (FACS)......................................................................19

3.5 Obtenção de células tumorais crescidas in vivo.......................................................19

3.6 Obtenção de células apresentadoras de antígeno (APCs)........................................20

3.6.1 Células monocíticas provenientes de precursores da medula óssea.............................20

3.6.2 Células dendríticas provenientes de precursores de medula óssea...............................21

3.7 Detecção de Mycoplasma sp. através da técnica de PCR.........................................21

3.8 Preparo de lisado de células B16F10 -Nex 2 crescidas in vivo................................22

3.8.1 Obtenção de Lisado com nitrogênio líquido (NL)......................................................22

3.8.2 Ultracentrifugação dos lisados e obtenção das frações membranar e citosólica ............23

3.9 Obtenção de frações lipídicas a partir do melanoma murino B16F10-Nex 2.........23

3.10 Dessalinização das frações ......................................................................................25

3.11 Cromatografia de Camada Delgada (TLC)............................................................25

3.12 Ensaio de ativação do hibridoma DN32.D3...........................................................26

3.12.1 Ensaio com fibroblastos – CD1d como células apresentadoras de antígenos ..............26

3.12.2 Ensaio com macrófagos de medula óssea como células apresentadoras de antígenos ..27

3.12.3 Ensaio com células dendríticas de medula óssea como células apresentadoras de

antígenos ........................................................................................................................27

3.13 Screening das frações lipídicas...............................................................................28

3. 14 Ensaio de detecção de IL -2 e IL-4 por ELISA .....................................................29

3.15 Separação dos componentes lipídicos das frações F3A, através de coluna de sílica

..........................................................................................................................................29

3.16 Separação de iGb3 por TLC preparativa a partir das frações F3A e F4A............30

3.17 Ensaio de estimulação de hibridomas NKT (DN32.D3) utilizando as frações iGb3

F3A e iGb3 F4A...............................................................................................................31

3.18 Separação de glicoesfingolipídeos neutros e de carga negativa...........................31

3.19 Per-N,O-metilação de Glicoesfingolipídeos (GSLs) neutros..................................32

3.20 Analise de GSL permetilados de F3A por espectrometria de massa íon-trap de

ionização linear (ESI-LIT-MS).......................................................................................33

3.21 Ensaio de citotoxicidade de células dendríticas pulsadas com iGb3 e a-GalCer

contra células tumorais B16F10-Nex 2..........................................................................33

3.21.1 Análise de citotoxicidade in vitro ...........................................................................33

3.22 Experimentos in vivo...............................................................................................34

3.22.1 Análise de sobrevida de camundongos WT e CD1dKO............................................34

3.22.2 Ensaio de metástase pulmonar in vivo.....................................................................35

3.23 Análise estatística.....................................................................................................35

4. RESULTADOS................................................................................................................36

4.1 Análise de sobrevida e desenvolvimento tumoral em animais deficientes em CD1d

..........................................................................................................................................36

4.2 Padronização do ensaio de ativação do hibridoma de células NKT, DN32.D3, por

fibroblastos – CD1d.........................................................................................................39

4.2.1 Caracterização por FACS das células utilizadas no ensaio..........................................39

4.2.2 Padronização do ensaio com α-galactosilceramida ....................................................41

4.3 Obtenção de células tumorais B16F10-Nex2 crescidas in vivo...............................42

4.4 Obtenção e isolamento de frações lipídicas das células tumorais B16F10-Nex 2..45

4.5 Dessalinização das frações obtidas ...........................................................................53

4.6 Ensaio de estimulação de células DN32.D3 pelas frações lipídicas do melanoma

murino B16F10-Nex2......................................................................................................53

4.7 Obtenção de células apresentadoras de antígenos murinas maturadas a partir de

precursores de medula óssea para ensaio de ativação de células DN32.D3.................60

4.8 Ensaio de ativação de células DN32.D3 pelas frações lipídicas obtidas a partir do

melanoma murino B16F10-Nex2 apresentadas por BMDC..........................................62

4.9 Dosagem de IL-4 no ensaio de ativação de células DN32.D3 pelas frações F3A e

F4A...................................................................................................................................64

4.10 Inibição da ativação de células DN32.D3 pelo gangliosídeo GM3 adicionado a

células dendríticas de medula óssea (BMDC)................................................................68

4.11 Separação de compostos presentes na fração F3A em coluna de sílica...............68

4.12 Ensaio de ativação das células DN32.D3 NKT por subfrações obtidas após a

fração F3A ser submetida à coluna de sílica..................................................................71

4.13 Análise preliminar dos componentes lipídicos das frações F3A e F4A. Evidência

para a expressão de iGb3 e GM3.....................................................................................71

4.14 Ensaio de estimulação de células DN32.D3 NKT pelos produtos iGb3F3A e

iGb3F4A...........................................................................................................................74

4.15 Caracterização de lipídeos presentes em F3A por ESI-LIT-MS (electronspray

ionization-linear ion trap-mass spectrometry)................................................................76

4.16 Ensaio de Citometria de fluxo de células dendríticas incubadas com a-GalCer e

iGb3..................................................................................................................................87

4.17 Ensaio de citotoxicidade in vitro de células NKT estimuladas com iGb3 contra

células B16F10-Nex2......................................................................................................87

4.18 Proteção anti-tumoral in vivo conferida por células dendríticas de medula óssea

estimuladas com iGb3 e a-GalCer...................................................................................90

5. DISCUSSÃO....................................................................................................................92

6. CONCLUSÕES................................................................................................................97

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................99

8. ANEXOS........................................................................................................................113

8.1 Comitê de Ética........................................................................................................113

8.2 Publicação................................................................................................................114

Abreviações

- i -

ABREVIAÇÕES

a-GalCer – a-galactosilceramida;

B16F10-Nex2 – sublinhagem de melanoma murino B16F10 isolada na UNONEX;

BMDC – células dendríticas de medula óssea;

C34:1 – ácido graxo com 34 carbonos e 1 insaturação;

CD1d-KO – animais knock-out para o gene CD1d;

d18:1- esfingosina com 18 carbonos e 1 insaturação;

DN32.D3 – hibridoma de célula NKT;

ESI-LIT-MS – “electronspray ionization linear ion-trap mass spectrometer”;

Fibroblastos-CD1d – fibroblastos transfectados com o gene CD1d;

Gb3 – globotrihexosilceramida;

Gb4 – globotetraosilceramida;

GD2 – disialil gangliosídeo 2;

GD3 – disialil gangliosídeo 3;

GM1 – monosialil gangliosídeo 1;

GM2 – monosialil gangliosídeo 2;

GM3 – monosialil gangliosídeo 3;

GSL – glicoesfingolipídeo;

Hex – hexose-hexose;

HPTLC – “high performance thin layer chromatography”;

iGb3 – isoglobotrihexosilceramida;

iGb4 – isoglobotetraosilceramida;

iNKT – linfócitos NKT com TCR invariante responsivas à a-Galactosilceramida;

m/z – massa/carga iônica;

MeN-Ac/Me-N-glicolilneuraminico – ácido N-acetilneuramínico metilado / N-

glicolilneuramínico metilado;

NANA – acido N- acetilneuramínico;

TLC – “thin layer chromatography”;

WT – animais selvagens (wild type).

Resumo

- ii -

RESUMO

Células iNKT restritas a CD1d são protetoras contra o desenvolvimento de

melanoma murino, B16F10-Nex2, subcutaneamente em animais singênicos. Essa proteção

pode ser deduzida pelo desenvolvimento acelerado do tumor em animais geneticamente

deficientes na expressão de CD1d (CD1d-KO), com sobrevida significantemente menor do

que a observada com animais WT submetidos ao mesmo desafio de células tumorais.

CD1d é uma família de glicoproteínas relacionadas a MHC classe I, envolvidas na

apresentação, principalmente em células dendríticas, de antígenos lipídicos para células

iNKT. No presente trabalho focalizamos a identificação do lipídeo endógeno expresso em

células de melanoma capaz de induzir uma resposta de vigilância imune baseada em células

iNKT. Verificamos também a possibilidade de proteger animais contra o desenvolvimento

tumoral utilizando células dendríticas primadas com o lipídeo endógeno.

A extração dos componentes lipídicos de melanoma foi realizada a partir de tumores

crescidos in vivo, evitando-se assim artefatos do cultivo celular in vitro. Foram testados três

diferentes protocolos de extração (A, B e C), obtendo-se 14 frações diferentes que foram

testadas na ativação do hibridoma DN32.D3, uma linhagem de células NKT murinas

imortalizadas. A fração F3 do protocolo A (F3A) ativou o hibridoma DN32.D3 medido

pela produção de IL-2. Para uma eficiente apresentação dos lipídeos dessa fração

utilizamos com sucesso células dendríticas de medula óssea (BMDC) nos ensaios in vitro e

in vivo, para apresentação de F3A e glicolipídeos ativadores de células NKT, a-

galactosilceramida (a-GalCer) e isoglobotrihexosilceramida (iGb3).

Na tentativa de isolar o composto estimulatório presente em F3A de melanoma, essa

fração foi analisada por HPTLC revelada com diversos reagentes específicos para resíduos

de ácido siálico, açúcares neutros, fosfato e lipídeos totais. A fração também foi submetida

a separações em colunas de sílica, ensaio de “immunostaining” quimioluminescente com

lectina de Bandeiraea simplicifolia e análises em espectrometria de massa, onde foram

identificados gangliosídeos como GM3 bem como glicoesfingolipídeos neutros como iGb3,

Gb3, iGb4 e Gb4 por ESI-LIT-MS (electrosptray ionization-linear íon trap-mass

spectrometry).

Resumo

- ii -

Quando iGb3 foi incubado com BMDC e testado com células DN32D3 essas foram

ativadas produzindo IL-2. GM3 consistentemente era um inibidor dessa ativação de células

iNKT.

Ensaios de citotoxicidade foram então realizados e verificamos que células de NKT

estimuladas por BMDC incubadas com a-GalCer ou iGb3 circundavam as células tumorais

B16F10-Nex2 visualizadas em microscopia de fluorescência e, em ensaio in vitro, as

células NKT promoviam lise de até 40% das células tumorais B16F10-Nex2.

Realizamos então ensaios in vivo, onde camundongos foram inoculados

endovenosamente com células do melanoma murino e tratados ou não com células

dendríticas primadas com a-GalCer ou iGb3. Ao excisarmos os pulmões dos animais,

notamos que os grupos tratados com lipídeos ativadores de células NKT tinha cerca de 4

vezes menos nódulos pulmonares que o grupo não tratado.

Nossos resultados mostram que o melanoma murino B16F10-Nex2 possui a

molécula iGb3 e sua precursora iGb4, capaz de ativar células NKT conferindo a essas

capacidade citotóxica in vitro contra o melanoma. Esse lipídeo (iGb3) também mostrou um

efeito protetor contra metástases pulmonares oriundas do melanoma murino quando

apresentado por células dendríticas utilizadas em protocolo de terapia celular.

Esse é o primeiro trabalho mostrando que efetivamente um glicolipídeo endógeno

ligante de CD1d é capaz de ativar células NKT com efeito protetor antitumoral, através de

terapia celular com células dendríticas.

Palavras chave: Melanoma B16F10-Nex2, células iNKT, glicoesfingolipídeos iGb3 e iGb4

GM3, células dendríticas, imuno vigilância.

Abstract

- iii -

ABSTRACT

CD1d-restricted iNKT cells are protective against the murine melanoma B16F10-

Nex2 growing subcutaneously in syngeneic animals. This is inferred from the fast tumor

growth in animals genetically deficient in CD1d (CD1d-KO), which showed a survival time

significantly shorter than that of WT animals equally challenged with tumor cells. CD1d

belongs to a family of glycoproteins resembling MHC class I, involved in the presentation,

chiefly in dendritic cells, of lipidic antigens to iNKT cells. In the present work we focus on

the identification of an endogenous lipid component expressed in melanoma cells able to

induce an immunosurveillance response based on iNKT. We also investigated the

possibility of animal protection against tumor development by using dendritic cells primed

with the endogenous lipid.

The extraction of membrane lipid components was carried out from in vivo grown

tumors, thus avoiding artifacts from the in vitro grown cultures. Three different extraction

protocols were tested (A, B, C), and 14 different fractions were obtained and tested for the

activation of hybridoma DN32.D3, a cell line of immortalized murine NKT cells. Fraction

F3 of protocol A (F3A) activated hybridoma DN32.D3 to produce IL-2. For an efficient

presentation of lipids from this fraction we successfully used bone marrow dendritic cells

(BMDC) on in vitro and in vivo assays. F3A and NKT-cell activating glycolipids, a-

galactosylceramide (a-GalCer) and isoglobohexosylceramide (iGb3), were tested.

In the attempt to isolate the stimulatory component present in the melanoma F3A

fraction, HPTLC was used and revealed with several specific reagents for sialic acid

residues, neutral sugars, phosphate and total lipids. The fraction was also separated in silica

columns, immunostained with Bandeiraea simplicifolia BS-1 lectin and analyzed by mass

spectrometry. Ganglioside GM3 and neutral glycosphingolipids iGb3, Gb3, iGb4 and Gb4

were identified by ESI-LIT-MS (electrospray ionization-linear ion trap-mass spectrometry).

By incubation of iGb3 with BMDC and these with DN32.D3 cells, the latter were

activated to produce IL-2. GM3 consistently inhibited the activation of iNKT cells.

Cytotoxicity assays were then carried out, in which we found that NKT cells

stimulated by BMDC, primed with a-GalCer or iGb3, encircled the B16F10-Nex2 tumor

Abstract

- iii -

cells as visualized by fluorescent microscopy. NKT cells promoted lysis of up to 40% of

tumor cells.

In vivo tests showed that mice injected endovenously with murine melanoma cells

and treated with dendritic cells primed with a-GalCer or iGb3, had lungs with 4-fold fewer

nodules than an equally challenged but untreated group.

The present results show that the murine melanoma B16F10-Nex2 expresses iGb3

and its precursor iGb4, being able to activate NKT cells and conferring them a cytotoxic

activity in vitro against melanoma. Such lipid (iGb3) was also protective in vivo reducing

the melanoma pulmonary metastases when presented by dendritic cells used in cellular

therapy protocol.

This is the fist work showing effectively that an endogenous CD1d-restricted

glycolipid able to activate iNKT cells display a protective antitumor effect, using cellular

therapy with dendritic cells.

Key words: B16F10-Nex2 melanoma, iNKT cells, glycosphingolipids iGb3 and iGb4,

GM3, dendritic cells, imunosurveillance.

Introdução

- 1 -

1. INTRODUÇÃO

1.1 O Melanoma

O melanoma é um câncer com origem nos melanócitos. Os melanócitos são células

produtoras de pigmento (melanina) em humanos e outros vertebrados. No desenvolvimento

embrionário essas células migram de seu ponto de origem na crista neural para a camada

basal da epiderme na pele (Baker et al., 1997) (Chudnovsky et al., 2005). A transformação

maligna dos melanócitos leva à proliferação anormal dessas células, com crescimento radial

e vertical com células invadindo a membrana basal, atingindo a derme, infiltrando-se nas

vias linfáticas e nos vasos sanguíneos e dando origem a metástases em sítios distantes do

tumor primário.

A homeostasia dos melanócitos é regulada por queratinócitos presentes na epiderme.

Em resposta a luz ultravioleta, estes queratinócitos secretam fatores que regulam a

sobrevivência, diferenciação, proliferação e motilidade destes melanócitos, estimulando

estas células a produzir melanina. Portanto, os melanócitos têm a função de proteger a

nossa pele contra os danos causados pela luz ultravioleta (Gray-Schopfer et al., 2007).

Existe uma série de fatores de risco para o desencadeamento de tumores da pele. De acordo

com a Organização Mundial da Saúde, sensibilidade ao sol, pele clara e exposição

excessiva ao sol são fatores que predispõem ao desenvolvimento do melanoma maligno.

Dessa forma, medidas preventivas para se evitar a doença devem ser tomadas, tais como,

evitar a exposição prolongada ao sol, principalmente em horários onde a incidência da

radiação ultravioleta (UVB) dos raios solares é maior, além do uso de equipamentos de

proteção, como óculos escuros, chapéu e filtro solar.

Algumas mutações estão ligadas ao processo maligno nos melanócitos, sendo que

cerca de 65% afetam o gene BRAF e 20% o N-RAS. Além disso, Patton et al., 2005,

observou a freqüente perda de função de p53 no melanoma.

Tradicionalmente, o desenvolvimento e a progressão do melanoma apresenta 4 passos

característicos. (1) Melanócitos gerando nevus displásico com estrutura e arquitetura atípica

Introdução

- 2 -

diferente de um nevus comum; (2) Ocorre então uma fase de crescimento radial (RGP) do

melanoma primário seguido pelo crescimento vertical (VGP); (3) No VGP, células do

melanoma podem infiltrar a membrana basal e invadir a derme; (4) inicia-se o processo

metastático com as células tumorais alcançando diversos órgãos (Muller et al., 2009).

Essas transformações celulares apresentam sintomas característicos como o

aparecimento de lesões escuras com bordas irregulares, acompanhada de coceira e

descamação. Em casos de uma lesão pigmentada pré-existente, ocorre aumento no

tamanho, alteração na coloração e na forma da lesão que passa a ser assimétrica com bordas

irregulares (INCA). O ABCD das lesões do melanoma são classicamente definidos como

segue: Assimetria, uma metade diferente da outra; Bordas irregulares, contornos mal

definidos; Cor variável, várias cores numa mesma lesão; Diâmetro, maior que 6 milímetros.

De acordo com o INCA, no Brasil, em 2008, de todos os 470.000 casos de câncer

cerca de 6.000 casos eram de melanoma, com incidência dessa neoplasia em indivíduos

com cor de pele branca. O National Câncer Institute (NCI) estima que em 2009 cerca de

68.720 novos casos ocorreriam nos Estados Unidos com 8.650 mortes devido ao

melanoma.

O melanoma de pele é menos freqüente que outros tumores de pele como

basocelular e espinocelular porém, devido sua alta capacidade metastática a letalidade é

elevada. Nos estágios iniciais do melanoma nos quais as células ainda não se espalharam,

tumor e linfonodos podem ser excisados e o paciente apresenta baixo risco de recorrência.

Pacientes diagnosticados tardiamente ou com melanoma metastático apresentam um pior

prognóstico, pois essas células são resistentes aos tratamentos convencionais, quimioterapia

e radioterapia. Esses pacientes apresentam uma média de sobrevida de apenas 6 meses e, de

5 anos em menos de 5% dos pacientes.

Devido à dificuldade de tratamento do melanoma, pesquisadores concordam que

novas terapias devem ser desenvolvidas (Gray-Schopfer et al, 2007). Pesquisas bioquímicas

têm buscado drogas que possam combater o melanoma ou prevenir sua formação, levando a

descoberta de novas quimioterapias com ação antitumoral. A excisão cirúrgica é sempre a

primeira opção, mas, em determinados casos, existe um espalhamento da lesão que dificulta

essa remoção, justificando um tratamento tópico. Rodrigues et al., 2008, mostraram que

camundongos inoculados subcutaneamente com células de melanoma B16F10-Nex2

Introdução

- 3 -

podiam ser tratados topicamente com gomesina, um peptídeo antimicrobiano isolado de

aranha Acanthoscurria gomesiana. Além de retardar o crescimento tumoral esse tratamento

prolongou significativamente a sobrevida dos animais tratados. Esse é um raro exemplo

desse tipo de intervenção.

Outro ponto crítico no desenvolvimento do melanoma murino é a angiogênese.

Diversos pesquisadores vêm buscando formas de impedir a nutrição do tumor inibindo o

suprimento sanguineo. Numerosos trabalhos focalizam esse aspecto do crescimento tumoral

bem como os inibidores da angiogênese que podem ter efeito no câncer. Paschoalin et al.,

2007, mostraram que a secreção de TOP (Thimet oligopeptidase) não foi diretamente tóxica

à célula tumoral, mas protegeu camundongos desafiados com B16F10-Nex 2 quando esses

foram tratados com TOP recombinante. Essa enzima degrada bradicinina que está

envolvida na angiogênese juntamente com NO.

1.2 Células iNKT

Os linfócitos NKT são maturados no timo através de células precursoras CD4

CD8

(em timócitos imaturos do córtex) que interagem com CD1, gerando duas subpopulações

majoritárias, CD4

e CD4

CD8

(DN) conforme descrito por Bendelac (1995) e

Brutkiewicz & Sriram (2002). Essas células produzem citocinas tipo Th1 (IFN-γ) e Th2

(IL-4, IL-13), e cada vez mais tem sido demonstrada sua importância em infecções por

microorganismos e na resposta imune antitumoral. Fígado e baço são os órgãos onde há

maior população de células NKT, e é rara sua presença em linfonodos (Matsuda et al.,

2000).

As células NKT, expressam marcadores das células NK (NK1.1) ao mesmo tempo

que apresentam um repertório de TCRs (T-cell receptors) restrito, onde mais de 90% das

células contem um determinado TCR invariante (Va14Ja18Vβ8 em camundongos e

Va24Ja18Vβ11 em humanos), sendo pois denominadas NKT invariantes ou iNKT. Essas

células reconhecem antígenos apresentados por CD1, uma molécula semelhante a MHC

classe I, associada à β2-microglobulina, relativamente não polimórfica, expressa em células

da linhagem hematopoiética. Foram identificados cinco homólogos para essa molécula,

Introdução

- 4 -

sendo que um deles é expresso em camundongos, o CD1d, responsável pela seleção

positiva de células NKT no timo, resultando na seleção de células NKT CD4+ e NKT

CD4

CD8

(Brutkiewicz & Sriram, 2002).

Essas células dividem-se em dois subtipos. Linfócitos NKT tipo I reagem com a-

GalCer, um glicolipídeo originado da esponja marinha Agellus mauritianus, quando

apresentado por CD1d. O segundo tipo dessas células são restritas a CD1d porém não

reagem com a-GalCer e seu TCR não é considerado invariante. Estudos realizados por Cui

et al. em 1997 mostraram que animais deficientes em Ja281 não tinham células NKT tipo I,

enquanto Mendiratta et al., 1997, mostraram a ausência de ambos os tipos de NKT em

camundongos deficientes em CD1d.

As células NKT podem produzir tanto citocinas tipo Th1 (IFN-γ) como Th2 (IL-4,

IL-13), e cada vez mais tem sido demonstrada sua importância em infecções por

microorganismos bem como na resposta imune anti-tumoral contribuindo para a ativação

de diversas outras células do sistema imune como células dendríticas (DC), NK ou

linfócitos T. Dessa forma, as células NKT podem tanto ter papel citotóxico como efeito

adjuvante (Seino et al, 2006). Azuma et al., 2003, mostraram que outros componentes

celulares podem ser supressores da resposta antitumoral mediada por células NKT,

incluindo células T regulatórias (Treg), que podem suprimir a proliferação, produção de

citocina, e atividade citotóxica de células NKT.

Embora diversas âncoras de GPI isoladas de microorganismos patogênicos

(Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei) tenham se ligado ao

CD1d, nenhuma delas foi capaz de estimular células NKT ex-vivo (Procopio et al., 2002;

Brutkiewicz & Sriram, 2002). O mecanismo da ação protetora dessas células contra esses

patógenos não está esclarecido (Wilson et al., 2002).

Células NKT são ativadas por IL-12, produzida por macrófagos e células

dendríticas. Mas igualmente expressam receptores para IFN-γ, o que as torna células de

ativação muito rápida (Kawamura et al., 1998).

Como já foi referido, vários trabalhos demonstram que há várias subpopulações de

linfócitos NKT com ações distintas, produzindo citocinas pró-inflamatórias e/ou citocinas

com perfil anti-inflamatório (Godfrey e Kronenberg, 2004, Brigl e Brenner, 2004 e Smyth

et al., 2002, Crowe et al., 2005). Taniguchi et al., 2003, Brigl & Brenner, 2004 e Wu et al.,

Introdução

- 5 -

2005, mostraram que linfócitos NKT produzem, dependendo de sua sub-população IL-4,

IL-10, IL-13 e IFN-?, indicando a participação destas células no processo de modulação do

sistema imune.

Atualmente está bem estabelecida a importância de células NKT no sistema imune

(Champagne et al., 2005), apresentando atividades antimicrobiana (Sugawara et al.,, 2002),

auto-imune (Cardell, 2006) e anti-tumoral (Brutkiewicz, 2006).

1.2.1 Células NKT e resposta imune anti-tumoral

Células NKT ativadas induzem a morte celular tumoral, por diversos mechanismos

incluindo liberação de perforina, assim como a expressão de FASL e TRAIL. A

importância das células NKT no desenvolvimento tumoral foi demonstrada pela primeira

vez em trabalho onde os animais desenvolvendo melanoma metastático foram injetados

com IL-12. Animais deficientes em células NKT tipo I (camundongos Ja18 KO) eram

incapazes de controlar o crescimento tumoral nessas condições. Enquanto o animal

selvagem injetado com IL-12 não apresentava metástases, animais KO reconstituídos com

células NKT comportavam-se como os selvagens (Cui et al, 1997).

Park et al., 2003, complementaram esse estudo demonstrando que células NKT

mediaram a rejeição de metástases hepáticas após injeção de IL-12, porém outras células

foram efetoras na rejeição de tumores subcutâneos, possivelmente células dendríticas

linfóides, sugerindo que células efetoras anti-tumorais variam de acordo com o

microambiente tumoral.

A citotoxicidade de células NKT humanas pode ser direta ou via células dendríticas

“cross-primed” com antígenos tumorais apresentados por CD1. Vários grupos têm utilizado

α-galactosilceramida como ligante de CD1 apresentado por células dendríticas, para

ativação de células NKT. Essas podem secretar citocinas como IL-2, IFN-γ, ativadoras de

células NK citotóxicas estabelecendo um ativo infiltrado anti-tumoral (Metelitsa et al.,

2001).

Motohashi et al., 2002, demonstraram que células Va24 NKT estão em menor

número no sangue periférico em pacientes com câncer em estágio avançado e que células

Introdução

- 6 -

NKT tipo 2 atuam como células regulatórias suprimindo a resposta antitumoral mediada

por linfócitos citotóxicos T CD8+. Terabe et al., 2000, mostraram que em um modelo de

recorrência tumoral, fibroblastos transformados produziram tumor em camundongos, o qual

inicialmente regrediu pela atividade de CTLs T CD8

e depois foi reativado por células T

CD4

CD1d dependentes que produziam IL-13. Recentemente os autores compararam os

efeitos da regulação negativa observada em camundongos deficientes em Ja281 (com

ausência de células NKT tipo I) com camundongos CD1d deficientes (ambos os tipos),

identificando células NKT tipo 2 como células regulatórias envolvidas na reativação do

crescimento tumoral (Terabe et al., 2005). Seino e Taniguchi, 2005, relataram que

linfócitos NKT tipo I e tipo II podem interagir mutuamente reprimindo outras funções e

desencadeando um feedback negativo na resposta imune antitumoral. No modelo de Terabe

et al., 2000, enquanto animais selvagens apresentavam alta freqüência de recorrência

tumoral, animais deficientes em CD1d, ou STAT-6 não apresentavam recorrência

sugerindo fortemente que o efeito era dependente de células NKT do tipo 2, produtoras de

IL-13. Na UNONEX (UNIFESP), foi obtida evidência de que células NKT regulatórias

estavam envolvidas na resposta imune contra o melanoma B16F10-Nex2 no camundongo

pelo efeito protetor obtido pela neutralização de IL-13 usando a quimera IL-13Rα2-Fc

(Hebeler-Barbosa et al., 2008).

Dependendo do microambiente tumoral células NKT apresentam um efeito protetor

direto ou mesmo indireto. Para isso, elas devem ser estimuladas via ligante especifico de

natureza lipídica ou glicolipídica com CD1d. Wu et al., 2003 demonstraram que o

gangliosídeo GD3, expresso em altas concentrações em linhagens de melanoma humano,

pode ligar-se à CD1d e reagir com linfócitos NKT murinos. Nesse trabalho, os autores

também sugerem que a apresentação de GD3 ocorra via cross-priming, ou seja, GD3 deve

ser captado e apresentado por uma célula apresentadora de antígenos e não pela própria

célula tumoral, uma vez que esta última não expressa em sua superfície a molécula de

CD1d. O eventual efeito estimulante de células NKT por gangliosídeos como o GD3

relatado nesse trabalho é, no entanto, contrário a um grande número de outras evid ências

que mostram que gangliosídeos agem como moléculas imunosupressoras. De fato, a

liberação de glicolipídeos no meio tem sido considerada como uma forma de evasão do

tumor contra a sua detecção, resultando em disseminação para sítios metastáticos distantes

Introdução

- 7 -

(Zeng et al., 2000a). A supressão da expressão de GD3 reduz o crescimento tumoral,

angiogênese e produção de VEGF (Zeng et al., 2000b). Na prática, estratégias de

quimioterapia e vacinas antitumorais incluem o bloqueio da síntese de glucoesfingolipídeos

bem como anticorpos anti-gangliosideos, respectivamente (Radin, 1999; Livingston, 1998).

A importância das células NKT no controle do desenvolvimento tumoral quando IL-

12 é aplicado ao hospedeiro foi demonstrada por Cui et al., 1997 e por Park et al., 2003. No

entanto, o papel dessas células na rejeição tumoral na ausência dessa interleucina ainda não

foi determinado. Em nosso trabalho, animais deficientes em CD1d tem rápido

desenvolvimento de melanoma implantado subcutaneamente indicando que células efetoras

CD1d-restritas são essenciais para a imunovigilância (ver em Resultados).

1.3 CD1

Ao contrário das moléculas de MHC I, que apresentam peptídeos aos linfócitos T

CD8+ citotóxicos, moléculas de CD1 apresentam lipídeos e glicolipídeos a células NKT

(Porcelli & Modlin, 1999).

O CD1 é uma família de glicoproteínas de membrana composta por heterodímeros

em que a segunda molécula é ß2-microglobulina, de maneira similar a MHC classe I. Em

humanos essas moléculas são codificadas por cinco genes CD1a, CD1b e CD1c

(classificados como grupo I), CD1d (grupo II) e CD1e (considerado um grupo

intermediário). Em camundongos, somente CD1d está presente (Calabi, 1986).

Apesar de CD1d e MHC I terem semelhanças nas suas estruturas secundárias e

terciárias e nos domínios a associados de forma não covalente a ß2-microglobulina, as

diferenças são notadas na topografia e na superfície molecular onde o antígeno se liga,

sendo esta superfície maior, com dois “pockets” de ligação lipídica (A’ e F’) e com

características mais hidrofóbicas (Zeng et al., 1997). Assim, os principais ligantes das

moléculas CD1d são os que possuem características lipídicas.

Uma das várias dificuldades encontradas no estudo das células de mamíferos,

normais e tumorais, é a de encontrar um ligante natural, endógeno para CD1d. Para as

moléculas CD1a, b e c, alguns ligantes já são conhecidos. Lipídeos encontrados na parede

Introdução

- 8 -

celular de micobactérias, como ácido micólico, manosídeo fosfatidilinositol (PIM),

lipoarabinomanose (LAM) são apresentados por CD1b (Sieling et al., 1995), enquanto

CD1a é capaz de reconhecer um lipopeptídeo de Mycobacterium tuberculosis e CD1c

reconhece um glicofosfolipídeo micobacteriano que possui somente uma cauda lipídica

curta (Brigl & Brenner, 2004). Gumperz et al., 2000 descreveu o reconhecimento por CD1d

de glicolipídeos e lipídeos endógenos encontrados em células de mamíferos (self-lipids)

como fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina e fosfatidilglicerol.

O principal ligante conhecido de CD1d que ativa células NKT é a a-

galactosilceramida (a-GalCer), um glicolipídeo extraído da uma esponja marinha Agellus

mauritianus, e provavelmente expresso em bactérias. Experimentos realizados por vários

grupos mostram que a falta de interação CD1d-NKT e da ativação de linfócitos NKT

podem prejudicar a resposta imune murina contra alguns agentes infecciosos, como por

exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Borrelia burgdorferi (Sköld et al., 2003),

Mycobacterium tuberculosis (Sugawara et al., 2002), Plasmodium yoelii (Mannoor et al.,

2001) e Leishmania major (Ishikawa et al., 2000). Quando camundongos são infectados

endovenosamente com esporozoítas de Plasmodium berghei e P. yoelii e tratados com a a-

GalCer, observou-se parasitemia reduzida (Gonzáles-Aseguinolaza et al., 2000).

Zajonc et al., 2008 mostraram a estrutura cristalizada do complexo CD1d-iGb3. A

cadeia ceramida de cada antígeno é geralmente ancorada dentro de um “groove” de ligação

hidrofóbica, onde no pocket A’ liga-se a cadeia de ácido graxo e no pocket F’ insere-se a

esfingosina. A parte glicídica encontra-se na porção externa ao CD1 para ser reconhecida e

interagir com TCR de linfócitos NKT.

Giabbai et al., 2005, também mostraram a estrutura cristalizada de CD1d murino

nesse trabalho ligado a fosfatidilcolina, com ácidos graxos contendo dupla ligação cis

apresentando melhor ligação ao pocket A’ do CD1d murino, o mesmo não sendo observado

para a ligação insaturada trans.

Rauch et al., 2003 demonstraram que um hibridoma de células NKT murinas

reconheceu moléculas de fosfatidiletanolamina que continham pelo menos uma cadeia acil

insaturada em configuração cis, e que a intensidade da ligação ao CD1d aumentava de

acordo com o aumento da insaturação. Fischer et al., 2004 relataram que fosfatidilinositol

Introdução

- 9 -

manosídeo isolado de micobactérias foi capaz de induzir células NKT humanas e murinas a

secretar IFN-γ.

1.4 Lipídeos

Um número cada vez maior de pesquisadores tem demonstrado que moléculas de

natureza lipídica como gangliosídeos, esfingolipídeos neutros e fosfo-esfingolipídeos,

âncoras de glicosilfosfatidilinositol entre outros, interagem com células do sistema imune

induzindo respostas estimulatórias assim como imunosupressoras, sugerindo que receptores

lipídicos podem ser muito importantes na regulação da resposta imune.

Células responsáveis pela resposta imune inata (macrófagos, células dendríticas,

células NKT), assim como células responsáveis pela resposta imune adaptativa (linfócitos T

e B) respondem a estímulos induzidos por determinadas moléculas de natureza lipídica,

como esfingosina-1-fosfato (S1P) que é um esfingolipídeo implicado na regulação de

funções celulares cardíacas (Liliom et al., 2001; Sugiyama et al., 2000b) e pressoras

(Sugyiama et al., 2000a) tendo sua concentração livre no organismo regulada pela atividade

de fosfatases (Mandala et al., 2000), limitando assim os efeitos colaterais desta molécula.

É um conhecimento clássico que moléculas lipídicas isoladas de microorganismos

patogênicos para o homem são capazes de interagir com células do hospedeiro. A mais

estudada é o LPS (lipopolissacarídeo), isolado da membrana externa de bactérias Gram-

negativas, o qual, ao interagir com a proteína-ligante de LPS e CD14, promove a formação

de agregado com TLR-4 (Toll-like receptor-4), que ativa a expressão de genes de moléculas

pro-inflamatórias através de sinalização por NF-κB e MAP quinase.

Diversos estudos foram recentemente desenvolvidos com lipoglicanos de parasitos.

Ancoras GPI altamente purificadas isoladas de Trypanosoma cruzi reagiram com TLR-2

(Toll-like receptor-2) e induziram a produção de IL-12, TNF-α e NO por macrófagos

murinos e humanos (Campos et al., 2001). Um GIPL (glicoinositolfosfolipídeo) isolado

desse mesmo parasita quando associado a LPS apresentou atividade imunoregulatória sobre

macrófagos e células dendríticas humanas, reduzindo a expressão de moléculas de MHC

Introdução

- 10 -

classe I, CD86, CD40, e redução na secreção de TNF-α, IL-10 e IL-12, sendo a porção

ceramida da molécula a responsável pela maior parte das atividades apresentadas

(Brodskyn et al., 2002).

Durante a resposta de fase aguda, a interação de HDL (high density lipoproteins) e

LDL (low density lipoproteins) ativa enzimas complexadas a elas, induzindo o

aparecimento de espécies oxidadas de LDL, que apresentam atividade pro-inflamatória.

Essas moléculas oxidadas, cujo maior componente é a lisofosfatidilcolina, ligam-se à

receptores acoplados à proteína G e promovem a diferenciação de monócitos em células

dendríticas maduras, capazes de secretar IL-12 mas não IL-10 e de estimular a produção de

IL-2 e IFN-γ por linfócitos T singeneicos e alogeneicos. Essa atividade pode ser inibida por

excesso de LDL nativo, refletindo as condições de homeostase do indivíduo e sugerindo

que um aumento na concentração de fosfolipídeos seja um sinal endógeno de ativação do

sistema imune, altamente controlado por lipoproteínas durante a resposta de fase aguda

(Perrin-Cocon et al., 2001; Coutant et al., 2002).

Outros trabalhos têm comentado sobre o reconhecimento de moléculas com

características lipídicas por células NKT. Entre eles estão o de Kinjo et al., 2005, que

descreve o reconhecimento de um glicoesfingolipídeo de Sphingomonas, uma bactéria

gram-negativa que não contém lipopolissacarídeo. Frações glicolipídicas isoladas da

parede celular de M. tuberculosis contendo fosfatidilinositolmanosídios foram as

responsáveis pelo recrutamento de células NKT para as lesões granulomatosas, onde

células NKT são os leucócitos predominantes (Apostolou et al., 1999). Todavia, animais

deficientes em CD1d comportavam-se exatamente da mesma forma que os selvagens

quando infectados com M. tuberculosis (Behar et al., 1999). Quando tratados com a-

GalCer, no entanto, camundongos infectados com M. tuberculosis apresentaram um

aumento no recrutamento de linfócitos ao pulmão, redução de CFU (colony forming units)

micobacteriana pulmonar e aumento na sobrevida (Chackerian et al., 2002)

1.4.1 a-Galactoceramida

Até pouco tempo, o único ligante de CD1d descrito, capaz de eficientemente

estimular e proliferar células NKT com TCR invariante era a α-galactosilceramida (α-

Introdução

- 11 -

GalCer), um glicolipídeo com açúcar α-anomérico contendo uma cadeia acilada de 26

carbonos e esfingosina, isolada da esponja marinha, Agellus mauritianus, pela Kirin

Brewery Company (Japão).

Embora a ligação dessa molécula e de seu equivalente sintético, KRN7000,

provoque forte secreção de IL-4 e IFN-γ por células NKT, o glicolipídeo não foi isolado em

células de mamíferos e outros organismos, que são incapazes de sintetizar

glicoesfingolipídeos com terminais de α-GalCer (Brutkiewicz & Sriram, 2002, Wilson et

al., 2002).

Há estudos que mostram a importância da variação nas porções N-acil de moléculas

de a-galactosilceramidas no reconhecimento por NKT restritas a CD1d. Conforme descrito

por Yu et al., 2005, uma molécula com 20 carbonos e duas insaturações no ácido graxo tem

sua apresentação por células apresentadoras de antígeno não profissionais facilitada

comparativamente à α-GalCer KRN7000, tida com ativadora clássica de linfócitos NKT

via CD1d.

Brossay, 1998 relata que α-Galcer contendo esfingosina com 18 carbonos é capaz

de estimular mais eficientemente células NKT restritas a apresentação via CD1d do que α-

GalCer composta por uma esfingosina com um número menor de carbonos. Da mesma

forma, uma cadeia de ácido graxo composta por 26 carbonos foi mais eficiente na

estimulação do que aquelas moléculas que possuíam 2 carbonos a menos.

Kronemberg (2005) também cita os efeitos da alteração na estrutura molecular de

α-GalCer. Um análogo de α-GalCer com a base esfingóide mais curta, OCH, apresentou

maior secreção de IL-4 do que IFN-? quando adicionado a esplenócitos em cultura. A

secreção de citocinas do tipo Th2 está correlacionada com a redução do comprimento da

cadeia alifática de OCH. Em contraste, molécula C-glicosídica análoga a α-GalCer

Introdução

- 12 -

estimulou mais a produção de IFN-? que IL-4 por células NKT murinas, conforme

descreveram Schmieg et al., 2005.

1.4.1.1 Tratamentos com a-GalCer

Inquéritos clínicos (clinical trials) utilizando injeções endovenosas de a-GalCer

foram realizados como descreve Giaccone et al., 2002. As doses foram bem toleradas

pelos pacientes, entretanto um aumento nos níveis de citocinas TNF-a e GM-CSF foi

observado somente em pacientes com altos níveis de células NKT Va24, sem efeito

antitumoral.

Em compensação, estudos com células dendríticas pulsadas com a-GalCer

aumentaram a resposta antitumoral em camundongos, tendo esse tratamento ativado células

NKT in vivo, inibindo a metástase tumoral. Uma completa inibição de mestástases de

melanoma B16 no fígado foi observada com esse tratamento (Toura et al., 1999).

Em 2005 Ishikawa et al., avaliaram em estudos clínicos de fase I que, de 11

pacientes com câncer de pulmão em estágio avançado, tratados com injeções endovenosas

de células dendríticas pulsadas com a-GalCer, 1 paciente depois da primeira e segunda

dose do tratamento teve um aumento significativo de células NKT Va24 no sangue

periférico. Dois outros pacientes apresentaram respostas significativas após a terceira dose.

Nieda et al., 2004 também desenvolveram um estudo com esse mesmo tratamento em

pacientes com metástases malignas, mostrando que linfócitos NKT ativados induziram uma

ativação de células T e NK e aumentaram os níveis séricos de IFN-?. Efeitos benéficos

desse tratamento foram observados igualmente em pacientes com adenocarcinoma.

Α α-GalCer exerce um efeito tão intenso de ativação de células NKT com uma

única administração que elas ficam anérgicas a re-estimulação por pelo menos 30 dias

(Sullivan et al., 2005; Parekh et al., 2005). Além disso α-GalCer ativa células iNKT a

produzir citocinas do tipo 1 e 2 limitando sua eficácia. Derivados químicos desse

glicoesfingolipídeo com ceramidas modificadas estão sendo investigados tendo como alvo

respostas imunes especificamente ligadas a um tipo, Th-1 ou Th-2 (Savage et al., 2006).

Introdução

- 13 -

1.4.2. Isoglobosilceramida

Existem evidências de respostas imunes do tipo Th-1 contra patógenos exógenos

que seriam induzidas por células iNKT após o reconhecimento de um ligante endógeno na

presença de IL-12. Esse ligante foi identificado como iGb3 (Mattner et al., 2005).

Contudo, células iNKT podem reconhecer outros antígenos endógenos (Porubsky et al.,

2007) e portanto o microambiente de diferentes tecidos ou tipos de inflamação podem

determinar o fenótipo da produção de citocinas por células iNKT.

A molécula de iGb3 é um glicoesfingolipídeo neutro contendo 3 hexoses (2

galactoses e 1 glucose) ligadas a ceramida.

O globosídeo globotriaosilceramida (Gb3) é o principal glicoesfingolipídeo neutro

de leucócitos, plaquetas, fígado, baço e a maioria de outros tecidos não neurais. É o

determinante P

no sistema P de grupo sanguíneo. A sua estrutura contem uma galactose

terminal ligada α-(1-4) a β-lactose. A forma isoglobo (iGb3) contém, ao invés disso, uma

galactose terminal ligada α-(1-3) a β-lactose, e está presente em concentrações muito

inferiores ao Gb3. O iGb3 mas não Gb3 é capaz de estimular células NKT de maneira

similar a a-GalCer.

Zhou et al., 2004 reforçam a importância da estrutura da molécula que se liga ao

CD1d. Da mesma forma que Gb3 e iGb3, existem as isoformas Gb4 e iGb4. Gb4, ou

globotetraosylceramida é o determinante P com a estrutura: GalNAc(β1-3)-Gal(α1-4)-

Gal(β1-4)-GlcCer. O iGb4 tem a Gal subterminal ligada α-(1-3) a lactose-ceramida. Os

autores mostraram que isoglobotetraosilceramida não estimula linfócitos NKT, porém

Introdução

- 14 -

quando a β-hexosaminidase (enzima lisossomal) remove a porção terminal GalNAc desta

molécula, gera iGb3 (isoglobotrihexosilceramida) que apresenta ação estimulatória ao

linfócito, demonstrando assim que a alteração da molécula através do processamento de

iGb4 em iGb3 é importante para o reconhecimento e ativação de NKT. Ainda nesse

trabalho, quando células DN32.D3 são estimuladas com iGb3 e SAP B, ocorre maior

produção de IL-2. Os autores sugerem que iGb3 possa ser um ligante endógeno do Vα14

murino.

Zhou, 2006 e Mattner et al., 2005 obtiveram dados semelhantes, e sugeriram que a

expressão de iGb3 em tecidos periféricos esteja envolvida no controle da resposta de

células NKT contra infecções, tumores e doenças auto-imunes.

Em alguns trabalhos iGb3 não foi encontrado quando timo e células dendríticas

humanas e murinas foram analizadas em HPLC (Speak et al., 2007), apesar do RNA

mensageiro de iGb3 sintase ter sido detectado em diversos tecidos murinos incluindo no

timo (Milland et al., 2006; Porubsky et al., 2007). Outro trabalho (Christiansen et al., 2008)

sugere que a falta de iGb3 seria devida a ausência de uma iGb3-sintase funcional em

humanos. Em contraste a esses resultados, tetraglicosilceramidas de isoglobo e globo séries

foram recentemente identificados no timo humano, assim como iGb3 e iGb4 foram

identificados no timo murino por ESI-LIT-MS extremamente sensível (Li et al, 2008a,

2008b, 2009).

Um dos componentes que pode se ligar ao iGb3 é uma lectina de Bandeiraea

simplicifolia, especificamente a isolectina B4 (BSI-B4) que tem grande afinidade pela

porção terminal de resíduos a-D- galactosil.

1.4.3. Gangliosídeos

Os gangliosídeos são formados por uma ceramida, pelo menos duas moléculas de

hexoses complexadas a pelo menos um ácido siálico, que pode ser ácido N-

acetilneuramínico ou ácido N-glicolilneuramínico. Essa molécula em particular refere-se ao

gangliosídeo GM3.

Introdução

- 15 -

Os gangliosídeos tem diversas funções biológicas incluindo a modulação do sistema

imunológico. Essas moléculas estão diferencialmente expressas em diversas células

neoplásicas se comparadas com suas correspondentes normais, além de estarem envolvidas

na progressão tumoral e na imunossupressão de uma resposta antitumoral produzida pelo

hospedeiro.

Gangliosídeos secretados por tumores de origem neuroectodérmica (neuroblastoma

e melanoma) interferem na maturação de células dendríticas. Na presença de GM2,

precursores monocíticos mostram aderência aumentada, expressão reduzida de MHC classe

II, de moléculas estimulatórias e receptor para GM-CSF (CD116), bem como reduzida

estimulação de linfócitos T, células dendríticas maduras não foram afetadas pela presença

do gangliosídeo. Os autores sugerem que a diferenciação interrompida por GM2 dos

precursores de células dendríticas possa ser um mecanismo de escape tumoral (Wolfl et al.,

2002). Anticorpos anti-gangliosídeos (ex. GD3, GD2, GM2) reagem com células de

melanoma as quais hiper-expressam esses glicolipídeos. Um anticorpo monoclonal (R24),

específico pra GD3, foi utilizado para a regressão de lesões metastáticas de melanoma

humano (Houghton et al., 1985).

Moléculas do gangliosídeo GM3 contendo ácido N-glicolilneuramínico foi capaz de

modular negativamente a expressão de células T CD4

murinas, especialmente quando

essas células não estavam ativadas (de Leòn et al., 2006). Da mesma forma Deng et al.,

2000 mostrou que células de melanoma MEB4 (ricas em GM3) depletadas do gangliosídeo

endógeno [através do tratamento com 1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-3-

propanol (PPPP)], apresentou baixa capacidade tumorigênica quando injetadas em

camundongos.

Introdução

- 16 -

Anteriormente, em 1987, Ladish et al., já havia relatado que entre várias células da

sublinhagem de linfoma AKR, as que apresentavam maiores concentrações de

gangliosídeos eram altamente tumorigênicas e tinham mais capacidade metastática. Estas

publicações demonstram a atividade inibitória dos gangliosídeos sobre o sistema imune,

dando suporte a nossa hipótese que gangliosídeos presentes no melanoma murino B16F10

regulam negativamente a atividade estimulatória de outros componentes lipídicos dessas

células.

Células dendríticas derivadas de medula óssea, tratadas com GD3 e GM3 antes da

maturação induzida por LPS, tiveram suprimidas a expressão de CD40, CD80, CD86 e

MHC II, além de apresentarem uma queda na produção das citocinas IL-6, IL-10, IL-2 e

TNF-a no ensaio com GD3 (Bronnum et al., 2005).

Shurin, 2001 já havia demonstrado por citometria de fluxo que o gangliosídeo GD2

derivado de células tumorais de neuroblastoma murino (N2a), conferiu significativa

redução de CD11c, CD86 e MHC II em células dendríticas de camundongo tratadas em

cultura com o gangliosídeo.

É sabido que linhagens de melanoma murino e humano liberam (“shedding”)

antígenos tumorais no meio de cultura e isso ocorre igualmente in vivo.

Aparentemente, entre os glicolipídeos liberados, e atuando em baixas

concentrações, alguns são estimulatórios de respostas imunes como as que envolvem

células NKT, e outros são imunomoduladores negativos como os gangliosídeos. O

crescimento tumoral é combatido pelas células iNKT (produtoras de IFN-g) mas é

favorecido pelos gangliosídeos

Objetivos

- 16 -

2. OBJETIVOS

Os objetivos deste trabalho centraram-se na obtenção e identificação de um composto

lipídico do melanoma murino B16F10-Nex2 capaz de estimular células NKT a exercer uma

atividade imune antitumoral. Eles se basearam na determinação prévia de que células NKT

tem um papel importante na imunidade inata contra o melanoma num modelo singênico.

Nossos esforços procuraram pois:

• Obter frações lipídicas provenientes de protocolos de extração lipídica de melanoma

murino obtido de crescimento in vivo;

• Testar as frações obtidas nos protocolos de extração lipídica quanto ao seu potencial

de ativação de hibridomas de células NKT;

• Obter células apresentadoras de antígenos provenientes de medula óssea em

especial células dendríticas (BMDC);

• Em colaboração com a Universidade do Texas El Paso (Prof. Igor C. Almeida),

identificar possíveis lipídeos estimulatórios utilizando espectrometria de massa (íon-

trap);

• Realizar ensaios de citotoxicidade de hibridomas NKT ativados após cultivo com

BMDC primadas com iGb3 contra células tumorais B16F10-Nex 2;

• Realizar ensaios in vivo com BMDC incubadas com glicoesfingolipídeos a fim de

testar a proteção com esse tratamento contra a metástase pulmonar por células de

B16F10-Nex2.

Materiais e Métodos

- 17 -

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos C57Bl/6 machos de seis a oito semanas (WT),

adquiridos do Biotério do ICB-USP e camundongos C57Bl/6 machos geneticamente

deletados de CD1d (KO) da mesma idade, cedidos pelo professor Ricardo T. Gazzinelli

(UFMG). Os camundongos foram mantidos no CEDEME (UNIFESP) em condições “spf”

(sala isolada de acesso restrito, em isoladores, com água, ração e serragem autoclavadas, e

manipulação em fluxo laminar). Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo

Comitê de Ética da UNIFESP.

3.2 Células

Células B16F10-Nex 2, sublinhagem isolada na UNONEX-UNIFESP do melanoma

murino B16F10, foram mantidas em meio RPMI 1640 (GIBCO) suplementado com 10%

de Soro Fetal Bovino (SFB, GIBCO). A linhagem B16F10 foi isolada por Fidler (1975) de

um tumor espontâneo e é singênica em camundongos C57Bl/6.

Em alguns experimentos foram utilizados fibroblastos murinos (linhagem RBL)

transfectados com o gene de CD1d murino (fibroblastos-CD1d), cedidos pelo professor

Ricardo T. Gazzinelli, foram mantidos em meio RPMI 1640 sup lementado com 10% SFB

em presença do antibiótico G418 (Geneticin, GIBCO). Hibridomas DN32.D3 (NKT),

também cedidos pelo professor Ricardo T. Gazzinelli foram mantidos em um meio de

cultura constituído de 50% de RPMI e 50% de α-MEM (GIBCO), suplementado com 5%

SFB, 2mM de L-glutamina, 100U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina e 50 µM

de 2-β-mercaptoetanol, todos os reagentes adquiridos da Gibco.

Materiais e Métodos

- 18 -

Células L929 (NCTC clone 929), um fibrossarcoma murino capaz de produzir TNF,

foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% SFB. Quando as células estavam

quase com 70% de confluência o meio foi trocado, as células foram lavadas na garrafa com

PBS 1x e adicionado 50 ml de meio para a garrafa de 150 cm

. O meio foi recolhido a cada

sete dias e testado para micoplasma, e os sobrenadantes negativos foram centrifugados por

5 minutos a 2.000 rpm, filtrados e congelados a -20º C, originando o meio L usado na

diferenciação dos macrófagos.

3.3 Reagentes

α-Galactosilceramida (cedida pelo Prof. Dapeng Zhou, MD Anderson Cancer

Center, Houston, TX), foi utilizada como ligante clássico na estimulação de hibridomas

NKT e ensaios in vivo.

GD3 e GM3 (Matreya, USA), foram utilizados para cromatografias HPTLC e

ensaio de estimulação do hibridoma DN32.D3 in vitro.

Isoglobotrihexosilceramida (Aléxis Biochemical) foi utilizado como padrão em

cromatografias HPTLC, para ensaios de immunostaining, estimulação de hibridoma NKT e

ensaios in vivo.

Metanol, clorofórmio, 1-butanol, diisopropil-éter, n-propanol, acetona (Merck), e

hidróxido de amônia (QUIMIS), coluna Sep-Pak Plus C18 (Waters) foram utilizados nas

extrações de frações lipídicas de células tumorais, e placas de TLC (thin layer

chromatography) de alumínio com sílica (Merck) para a verificação da composição geral

das frações tumorais de natureza lipídica obtidas.

As placas de TLC foram reveladas com solução de resorcinol (USB) – HCl (200mg

de resorcinol diluídos em 80mL de HCl e 0,25 mL de 0,1M de sulfato de cobre,

completando o volume para 100mL com água), coloração específica para resíduos de ácido

siálico, a 150°C durante 10 minutos. Os glicoconjugados foram revelados com solução de

orcinol (USB) – H

(0,5g de orcinol em 100mL de 3M de ácido sulfúrico) a 130°C,

lipídeos e fosfolipídeos foram revelados com uma solução de ácido orto-fosfórico (5,16g de

sulfato de cobre pentahidratado diluído em 80 mL de água, adicionado de 9,4 mL de ácido

Materiais e Métodos

- 19 -

orto-fosfórico, volume final de 100mL com água) a 180°C; fosfolipídios especificamente,

foram corados com solução de molibdênio (SIGMA) (4g de trióxido de molibdênio

dissolvido por aquecimento em 50mL de ácido sulfúrico) à temperatura ambiente, e

lipídeos foram visualizados através de iodo sublimado à temperatura ambiente.

3.4 Ensaio de citometria de fluxo (FACS)

Entre 5x10

a 10

células/marcador foram lavadas uma vez com PBS-BSA (Sigma)

1% e centrifugadas a 1.500 rpm por 3 minutos. As células foram novamente lavadas uma

vez com PBS, centrifugadas e o pellet ressuspendido em 60µl de PBS contendo 2µl do

anticorpo biotinilado conjugado com o fluorocromo, sendo em seguida incubadas em gelo

durante uma hora. Lavou-se duas vezes com PBS e 500 µl de paraformaldeído 2% foi

adicionado para fixação, seguindo-se a leitura das amostras em equipamento FACScalibur,

Becton and Dickinson.

As células DN32.D3 foram incubadas com anticorpos reativos para os seguintes

marcadores: NK1.1-FITC, Vβ8-PE e CD3ε-PE. Os fibroblastos transfectados com CD1d

foram incubados com anticorpos contra MHC classe I-FITC e CD1d-FITC. Células

dendríticas provenientes de medula óssea (BMDC) foram marcadas para CD1d-FITC,

CD86-FITC, CD80-FITC, CD11c-PE, MHC I-FITC e MHC II-FITC. Macrófagos de

medula óssea foram marcados com F4/80-FITC, CD1d-FITC, MHC II-FITC, CD11b-PE e

CD11c-PE.

Todos os anticorpos utilizados foram da Pharmingen.

3.5 Obtenção de células tumorais crescidas in vivo

Para extração das frações lipídicas das células B16F10-Nex 2, optou-se pela

utilização das células crescidas in vivo, ao invés das células cultivadas in vitro, chegando

desta forma mais próximo da forma nativa de desenvolvimento tumoral. Animais C57Bl/6

foram injetados subcutaneamente com 5x10

células em 100 µl. O crescimento tumoral foi

Materiais e Métodos

- 20 -

acompanhado com paquímetro a cada dois ou três dias a partir do surgimento de nódulo

tumoral. O cálculo do volume tumoral foi realizado utilizando-se dois diâmetros, sendo o

diâmetro maior D e o menor d, compondo a seguinte fórmula: V= (D x d

) 0,52/1000

(cm

). A fórmula baseia-se num volume apresentando uma forma geométrica elíptica. Em

todas as circunstâncias todos os animais foram sacrificados com tumores máximos

subcutâneos de 3 cm

Para efeito de obtenção dos tumores para extração asséptica de lipídeos, volumes de

1cm³ foram utilizados. Antes do armazenamento, uma amostra foi retirada com alça de

platina flambada e colocada em 5 ml de meio LB para controle de contaminação bacteriana

e uma outra alíquota foi utilizada para verificação de contaminação por Mycoplasma sp.

Alguns tumores foram congelados a -70°C e outros foram congelados e liofilizados.

3.6 Obtenção de células apresentadoras de antígeno (APCs)

3.6.1 Células monocíticas provenientes de precursores da medula óssea

Ossos femurais de camundongos machos C57Bl/6 foram excisados e limpos,

retirando-se toda a musculatura a eles aderida, lavados em álcool 70%, posteriormente em

álcool iodado e por último em PBS 1X/antibiótico [50 ml de PBS 1X, 500 µl de

penicilina/estreptomicina (100x) e 50 µl de garamicina (40 mg/ml)]. As epífises foram

cortadas com o auxílio de uma tesoura estéril e as células da medula óssea foram obtidas

após a lavagem do seu interior utilizando-se seringa. Para cada fêmur foi utilizado 10 ml de

meio de diferenciação (meio RPMI + 30% meio L + 20% SFB), e as células foram

plaqueadas em placas de Petri. No quarto dia a partir da extração foi adicionado à placa de

Petri mais 10 ml de meio de diferenciação. As células foram mantidas em estufa com 5%

de CO

a 37

C e estavam aptas a serem utilizadas para os ensaios de ativação no sétimo dia

após a extração.

Materiais e Métodos

- 21 -

A maturação de macrófagos a partir de precursores medulares foi confirmada pela

presença de marcadores específicos em FACS como descrito a seguir: CD11c, CD1d,

CD11b, MHC II, F4/80.

3.6.2 Células dendríticas provenientes de precursores de medula óssea

A mesma técnica descrita no item anterior foi utilizada e as células de medula óssea

foram obtidas após a lavagem interna dos ossos femurais com 10 mL de uma solução de

PBS/antibióticos [50 ml de PBS 1X, 500 µl de penicilina/estreptomicina (100x) e 50 µl de

garamicina (40 mg/ml)] utilizando-se seringa. As células foram centrifugadas por 3 minutos

a 1.000 rpm, e ressuspensas em meio para diferenciação (RPMI suplementado com 10%

SFB, aminoácidos não-essenciais (50x) GIBCO, 50 µM ß-mercaptoetanol GIBCO, 30

ng/ml de GM-CSF PEPROTECH e 10 ng/ml de IL-4 PEPROTECH), sendo então

plaqueadas 2,5x10

células/ 800 µl/ well em placas de 24 poços. No terceiro e sexto dias a

partir da extração o meio foi trocado lentamente e as células mantidas em estufa com 5% de

a 37

C. As células estavam aptas a serem utilizadas para os ensaios no sétimo dia após

a extração.

A maturação de células dendríticas a partir de precursores medulares foi confirmada

pela presença de marcadores específicos em FACS citados a seguir: CD11c, CD1d, MHC I,

F4/80, CD80, CD86

3.7 Detecção de Mycoplasma sp. através da técnica de PCR

A fim de excluir contaminação com Mycoplasma sp. dos tumores crescidos in vivo,

a amostra foi aquecida durante 5 minutos a 95°C com 50 µl de tampão LOTE (3 mM de

Tris-HCl pH 7,5, 0,2 mM de EDTA) e 10 µl dessa solução foram incubados com 10

pmol/µl de primers sense 5´GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG 3´ e anti-sense 5´CGG

ATA ACG CTT GCG ACC TAT 3’, 50 mM de MgCl

, buffer 10x para PCR (200 mM

Materiais e Métodos

- 22 -

Tris-HCl pH 8,4, 500 mM KCL), 10 mM de dNTP , 5 U (1µl) de Taq e água para um

volume final de 30 µl (todos os reagentes são da GIBCO).

A reação foi realizada em aparelho termociclador PTC-200 (MJ Reaearch), em 30

ciclos de 94°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto e 72°C por 1,5 minutos, com uma extensão

final de 72°C por 10 minutos, mantendo-se a reação a 4

C ao final. Os produtos obtidos

foram analizados em gel de agarose 1,2% e o fragmento esperado deve conter

aproximadamente 350 pb.

Todas as células utilizadas nos ensaios de estimulação de DN32.D3 também foram

testadas para Mycoplasma sp. Retiramos 1 ml de cada cultura de células, a amostra foi

centrifugada a 12.000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante descartado e adicionado tampão

LOTE como descrito acima.

3.8 Preparo de lisado de células B16F10 -Nex 2 crescidas in vivo

Foi utilizado o método de lise das células tumorais com nitrogênio líquido

alternando congelamento e descongelamento do tumor. O tumor foi primeiramente

macerado com êmbolo de seringa em placa de Petri adicionando-se 5 ml de PBS 1x e

transferido para um tubo Falcon de 15 ml, e colocado para repousar por 10 minutos. Com

pipeta Pasteur somente o sobrenadante foi transferido para um tubo Falcon com 50 ml e o

volume completado com PBS 1x, o sobrenadante foi filtrado em filtro “Cell Strainer”

(COSTAR) com pipeta, centrifugado e lavado com PBS 1x por 5 minutos a 1.500 rpm. O

procedimento foi repetido três vezes.

3.8.2 Obtenção de Lisado com nitrogênio líquido (NL)

O sobrenadante foi transferido para tubo Falcon de 50 ml e passou por sessões

consecutivas de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento em banho a 37º C.

O procedimento foi realizado 6 vezes e a eficiência da lise foi verificada em microscópio

Materiais e Métodos

- 23 -

óptico, o sobrenadante após centrifugação a 1.500 rpm foi reservado para a

ultracentifugação.

3.8.3 Ultracentrifugação dos lisados e obtenção das frações membranar e citosólica

Os sobrenadantes foram transferidos para tubos utilizados em rotor SW 41ti, e

ultracentrifugados por 1h 30 minutos a 100.000g. O sobrenadante (referente ao citosol -

NLc) foi separado do pellet (referente à membrana - NLm) e as amostras foram irradiadas

com 30.000 rads a fim de esterilizar a amostra, estando essas prontas para os ensaios de

estimulação. As frações foram padronizadas pela quantidade em mg/ml de proteína

presente nas amostras.

3.9 Obtenção de frações lipídicas a partir do melanoma murino B16F10-Nex 2

Foram utilizados três protocolos de extração lipídica dos tumores crescidos in vivo.

O Protocolo A utiliza a clássica partição de Folch. Sobre 200 mg de tumor liofilizado foi

adicionado 1 ml de solução de clorofórmio : metanol (C:M) 1:1 (v/v) e agitado em vortex à

temperatura ambiente em alta velocidade por 1 minuto, sendo em seguida a amostra

centrifugada a 3.000 rpm por 10 minutos. Todos os sobrenadantes foram recolhidos e o

processo foi repetido três vezes sobre o pellet. Dos sobrenadantes recuperados, parte foi

reservada e parte foi evaporada em fluxo de nitrogênio gasoso (N

). Ambas as partes foram

consideradas como primeira fração denominada F1A. O pellet sofreu nova extração com os

solventes clorofórmio : metanol : água (C:M:W) 1:2:0,8 (v/v/v) a extração foi realizada por

três vezes obtendo dos sobrenadantes combinados a segunda fração, F2A.

À fração F1A foram adicionados 6 ml de clorofórmio : metanol (2:1) com 1 ml de

água, a mistura foi vigorosamente agitada em vortex e centrifugada a 3.000 rpm por 10

minutos gerando duas fases, a fase superior (F3A) e a fase inferior (F4A). Assim como a

Materiais e Métodos

- 24 -

fração F1A, parte do sobrenadante de F4A foi reservado e a outra parte foi seca em N

Sobre F4A seca adicionamos 5 ml de clorofórmio : metanol : água 1:100:100. Essa mistura

foi vortexada e centrifugada (da mesma forma descrita acima) obtendo duas novas fases

correspondentes às frações F5A e F6A.

Foi utilizado um segundo protocolo de extração de componentes lipídicos das

células tumorais, o Protocolo B, onde 1g de tumor liofilizado foi sonicado em 20 ml de

clorofórmio : metanol 1:1 (v/v), o tubo preenchido com nitrogênio gasoso, fechado

hermeticamente e a mistura foi agitada com magneto por 18 horas a 4°C. A amostra foi

então centrifugada a 2.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante transferido para outro

tubo. O pellet foi re-extraído com clorofórmio : metanol 1:1 por 4 horas a 4°C. Os

sobrenadantes foram combinados e reduzidos a ¼ do volume em N

e deixado por 18 horas

a -20°C. A amostra foi novamente centrifugada e o sobrenadante originou a fração F1B,

que foi seca em N

e liofilizado. Ao material liofilizado adicionou-se diisopropiléter (DIPE)

: 1-butanol 3:2, agitou-se no vortex e em seguida a mistura foi sonicada por 1 minuto,

adicionando 0,3% de NaCl aquoso (10 ml para cada 1 g de tumor). A amostra foi

novamente agitada em vortex seguida de sonicação por 2 minutos, centrifugada a 2.000

rpm por 10 minutos, originando uma fase superior (F2B) e uma fase inferior (F3B). Sobre a

fase inferior adicionou-se 20 ml DIPE : 1-butanol 3:2. A amostra foi agitada em vortex, e

sonicada por 2 minutos, centrifugada, originando uma nova fase superior (F4B) e inferior

(F5B).

No Protocolo C, ao tumor não liofilizado adicionou-se 3 mL de água; ele foi

macerado em um homogeneizador de tecidos tipo Potter, mantendo-se sempre a amostra

em gelo. Em seguida, adicionamos metanol, a amostra foi agitada, e finalmente

completamos com clorofórmio na proporção final de clorofórmio : metanol : água (C:M:W)

4:8:3. A amostra foi agitada em agitador orbital em temperatura ambiente por 1 hora,

centrifugada a 3.000 rpm por 10 minutos, e os sobrenadante reservado. O pellet foi re-

extraído com C:M:W 4:8:3, e todos os sobrenadantes foram combinados observando o

volume exato obtido. Aos sobrenadantes combinados que continham a concentração de

C:M:W 4:8:3, adicionou-se água até obter a proporção 4:8:5,6. Após essa etapa a amostra

foi centrifugada por 10 minutos a 3.000 rpm, formando uma fase superior (F1C), e uma

inferior (F2C). A fração F2C foi seca em nitrogênio e foi re-extraída com C:M:W 4:8:5,6 ,

Materiais e Métodos

- 25 -

combinando a fase superior à F1C. A fase F1C foi seca em nitrogênio e ressuspendida em

3 mL de C:M:W 2:43:55 e purificada em coluna SepPak C18. A eluição do material da

coluna foi feita com 3 ml metanol 100% seguida de 3 ml de C:M 1:1. A combinação de

ambos eluentes originaram a fração F3C.

Todas as frações obtidas foram mantidas secas, a -20

C, sendo todas as frações

diluídas em metanol, exceto F2C que é diluída em clorofórmio, antes de serem

cromatografadas. Para um primeiro ensaio de estimulação do hibridoma DN32.D3, as

frações foram diluídas em 500 µl e uma alíquota de 50 µl foi retirada e transferida para um

tubo estéril. Essas alíquotas foram secas em nitrogênio e posteriormente ressuspendidas em

de meio RPMI 1640, diluídas e incubadas com as células como descrito no ensaio de

estimulação.

Após essa etapa, todas as amostras foram padronizadas por peso seco obtido na

fração.

3.10 Dessalinização das frações

As frações foram passadas por uma coluna SepPack C18 (WATERS) para retirar

contaminantes por sais. A coluna foi lavada com o auxílio de uma seringa de vidro com 5

ml de água destilada, 3 ml metanol : água 1:1, 3 ml metanol, 3 ml metanol : água (1:1) e

equilibrada com clorofórmio : metanol : água (C:M:W) 2:43:55. Cada amostra foi diluída

em 1 ml de C:M:W 2:43:55 e aplicadas na coluna. O material não ligado foi recolhido e

testado em TLC para certificar que toda a amostra estava ligada na coluna. Lavamos a

coluna com 10 ml de C:M:W 2:43:55 para retirar excesso de contaminantes e então a

amostra foi eluída com 4 ml de metanol e 4 ml de C:M 1:1. Todas as frações obtidas foram

mantidas secas, a -20

3.11 Cromatografia de Camada Delgada (TLC)

Materiais e Métodos

- 26 -

Todas as frações obtidas foram diluídas em 500 µl de C:M 1:1 e foram aplicados 4

µl de cada uma delas em placas de alumínio com sílica para cromatografia (Merck). As

amostras foram cromatografadas em cuba de vidro contendo uma solução de clorofórmio :

metanol : 0,25% KCl aquoso na proporção de 60:35:8. Alteramos a fase móvel (solvente)

para HPTLC a fim de melhorarmos a visualização das bandas lipídicas, passamos a utilizar

a combinação de n-propanol: NH4OH: água na proporção 60 : 9,5 : 11,5.

Por fim com o mesmo objetivo alteramos novamente o sistema de solvente para

C:M:W 60:35:8, permitindo que as bandas nas TLCs não migrassem até o front e

possibilitando a migração de todo iGb3 aplicado.

As placas foram secas e reveladas com iodo, resorcinol, orcinol, solução de sulfato

de cobre e molibdênio e queimadas em estufa nas temperaturas de 25°C, 150°C, 130°C,

180°C e temperatura ambiente, respectivamente. Todas as placas coradas foram

fotografadas com câmera digital.

3.12 Ensaio de ativação do hibridoma DN32.D3

3.12.1 Ensaio com fibroblastos – CD1d como células apresentadoras de antígenos

Fibroblastos-CD1d foram plaqueados em placas para cultura com 96 poços,

5x10

células/50 µl/poço. Após 1 hora, quando as células já estavam aderidas, o meio foi

aspirado adicionando-se em seguida 100 µl/poço de α-galactosilceramida (a-GalCer),

diluído em meio RPMI 10% SFB com 5% DMSO, partindo-se da concentração de 10

ng/mL e realizando-se diluições seriadas até 1,25 ng/mL. A cada diluição seriada realizada

a suspensão foi sonicada por 1 minuto em banho com gelo. Incubou-se as células por 4

horas em estufa com 5% CO

a 37°C, e em seguida adicionou-se o hibridoma DN32.D3,

5x10

células/100 µl/poço incubando-se a reação por 18 horas em estufa com 5% CO

37°C. Ao término do período de incubação, recolheu-se o sobrenadante para dosagem da

IL-2 secretada pelo hibridoma estimulado via ligação com CD1d expressando o antígeno

Em alguns experimentos, o protocolo sofreu algumas variações na quantidade de DMSO

Materiais e Métodos

- 27 -

utilizada e no tempo de incubação, como descrito em Resultados. Utilizando concentrações

de 5 ng/ml até 0,15 ng/ml de a-GalCer fibroblastos-CD1d foram incubados por 24 h, o

ensaio desenvolvendo-se como o anterior. Como controles foram utilizados fibroblastos-

CD1d incubados com DN32.D3, sem estímulo, e a detecção de IL-2 nesse controle

denominamos de produção basal de IL-2.

3.12.2 Ensaio com macrófagos de medula óssea como células apresentadoras de

antígenos

Macrófagos provenientes de medula óssea foram plaqueados em placas para cultura

com 12 poços, 5x10

células/600µL/poço. Após 1 hora, quando as células já estavam

aderidas, ao meio foi adicionado 50 µl/poço de α-galactosilceramida (controle positivo),

iGb3 ou frações, diluídos em meio RPMI 10% SFB em diversas concentrações. Incubaram-

se as células por 24 horas em estufa com 5% CO

a 37°C, e em seguida adicionou-se o

hibridoma DN32.D3, 5x10

células/600µl/poço incubando-se a reação por 18 horas em

estufa com 5% CO

a 37°C. Ao término do período de incubação, recolheu-se o

sobrenadante para dosagem da IL-2 secretada pelo hibridoma estimulado via ligação com

CD1d expressando o antígeno. Como controles foram utilizadas células dendríticas (DC),

DN32.D3, e estas duas células juntas, todas sem estímulo, sendo esta última combinação

considerada como o branco da reação.

3.12.3 Ensaio com células dendríticas de medula óssea como células apresentadoras de

antígenos

Células dendríticas provenientes de medula óssea foram plaqueadas em placas para

cultura com 12 poços, 5x10

células/600µL/poço. Após 1 hora, quando as células já estavam

aderidas, ao meio foi adicionado 50 µl/poço de α-galactosilceramida (controle positivo),

iGb3 ou frações, diluídos em meio RPMI 10% SFB em diversas concentrações. Incubaram-

se as células por 24 horas em estufa com 5% CO

a 37°C, e em seguida adiciono u-se o

Materiais e Métodos

- 28 -

hibridoma DN32.D3, 5x10

células/600µl/poço incubando-se a reação por 18 horas em

estufa com 5% CO

a 37°C. Ao término do período de incubação, recolheu-se o

sobrenadante para dosagem da IL-2 secretada pelo hibridoma estimulado via ligação com

CD1d expressando o antígeno. Como controles foram utilizados células dendríticas (DC),

DN32.D3, e estas duas células juntas, todas sem estímulo, sendo esta última combinação

considerada como o branco da reação.

3.13 Screening das frações lipídicas

Todas as frações obtidas nos 3 protocolos de extração de componentes lipídicos das

células tumorais foram testadas quanto à sua capacidade de ligação ao CD1d e consequente

ativação do hibridoma de células NKT, DN32.D3.

Fibroblastos-CD1d, 5x10

células/50 µl/poço em placa de 96 poços, foram mantidos

por 1 hora em estufa com 5% CO

a 37°C. Durante esse período, as frações foram

solubilizadas em 500 µl de metanol (exceto F2C que foi solubilizada em clorofórmio),

agitadas em vortex e sonicadas. Uma alíquota correspondente a 10% do volume de cada

fração foi retirada, transferida para um tubo estéril e seca em fluxo de nitrogênio gasoso.

Essas alíquotas foram então solubilizadas em 500 µl de meio RPMI contendo 10% SFB

para o ensaio com 24 horas de incubação. Foram realizadas diluições seriadas para cada

fração a ser testada, e a cada nova diluição a amostra foi agitada em vortex e sonicada.

O meio de cultura dos fibroblastos-CD1d foi substituído por 100 µl do meio acima

citado contendo as frações diluídas, incubando-se por 24 horas. Ao final desta incubação

adicionaram-se 5x10

células/100µL/poço de DN32.D3, incubando-se em seguida em estufa

com 5% CO

a 37°C por 18 horas. Os sobrenadantes foram recolhidos para dosagem de IL-

Como controle positivo foi utilizado α-galactosilceramida em diluições seriadas a

partir das concentrações iniciais de 10 ng/ml ou 5 ng/ml. O “background” da reação foi

quantificado pela incubação da DN32.D3 com os fibroblastos não estimulados em meio

RPMI.

Materiais e Métodos

- 29 -

3. 14 Ensaio de detecção de IL -2 e IL-4 por ELISA

Nos sobrenadantes dos ensaios descritos foram quantificadas a interleucina-2 (IL-2)

e também a IL-4, somente para as frações F3A, F4A e a-GalCer . Placa de ELISA Maxi-

Sorb (NUNC) foi sensibilizada com 2µg/mL de anticorpo de captura anti-IL-2 murina e

com 4µg/mL de anticorpo de captura anti-IL-4 murina em um volume de 50 µl/poço,

diluído em PBS e incubada por 12 horas à temperatura ambiente (t.a.). As placas foram

lavadas três vezes cada com PBS/Tween 20- 0,05% e incubada com 200 µl de PBS/BSA

1% por uma hora à t.a., e novamente lavada 3 vezes com PBS/Tween. Adicionaram-se os

sobrenadantes de cultura descritos no item anterior e a IL-2 e a IL-4 recombinantes em suas

respectivas placas, 50 µl/poço, durante 2 horas à t.a. As placas foram lavadas com

PBS/Tween e adicionou-se 50 µl/poço de anticorpo anti-IL-2 e anti-IL-4 biotinilados na

concentração de 200 ng/ml de cada anticorpo incubando-se à t.a. por duas horas. As placas

foram novamente lavadas por mais 3 vezes e então 50 µl/poço de streptavidina-peroxidase

diluída 1:1000 foi adicionada, incubando-se por 1 hora à t.a.. Lavou-se mais três vezes as

placas com PBS/Tween, mais três vezes com PBS e a revelação foi realizada com uma

solução de 5 ml de tampão citrato-fosfato, 2 mg de OPD (SIGMA), 2,5 ml de água e 10 µl

de água oxigenada 30%, 50 µl/poço, em estufa a 37°C por 10 minutos envolvendo as placas

com papel alumínio. Para parar a reação adicionou-se 50 µl/poço de ácido sulfúrico 4N, e

realizamos a leitura em leitor de ELISA Multiskan Titertek em comprimento de onda de

492 nm. Todos os anticorpos e as interleucinas recombinantes foram adquiridos da

Pharmingen e diluídos em PBS-BSA 0,1%.

3.15 Separação dos componentes lipídicos das frações F3A, através de coluna de sílica

Materiais e Métodos

- 30 -

A coluna de sílica, com volume de 15 ml (HPLC sorbent, 60µ - SIGMA), foi

equilibrada com clorofórmio. As frações F3A após serem dessalinizadas em coluna C18

foram ressuspendidas em clorofórmio : metanol (2:1) e aplicado no máximo 2 mg da fração

com uma pipeta Pasteur de vidro sobre o topo da sílica. Para cada solvente utilizado para a

eluição, amostras de 4 ml foram recolhidas.

O material foi eluído da coluna de acordo com sua polaridade, utilizando-se

solventes com polaridades crescentes. Iniciou-se a eluição com clorofórmio

(aproximadamente 60 ml) e compostos de baixa polaridade, denominados C, foram

recolhidos. Foi realizado um dot-blot de cada alíquota coletada em placas de sílica para

TLC, posteriormente coradas com iodo sublimado. Após a eluição completa das moléculas

lipídicas com afinidade pelo clorofórmio, iniciou-se a eluição da amostra com acetona (Ac),

utilizando aproximadamente 50 ml do solvente, obtendo-se lipídeos com características

mais polares. O mesmo procedimento de dot-blot foi realizado para controle da eluição dos

componentes solúveis em acetona, finalizando a eluição com metanol (M) (cerca de 50 ml),

por fim recolhendo o restante dos lipídeos com características mais polares. O processo de

eluição de F3A durou de 9 - 11 horas, em fluxo gravitacional.

As alíquotas contendo o material eluído com cada solvente foram combinadas, secas

e pesadas, submetidas à cromatografia e testes quanto à capacidade de ativação de células

NKT.

3.16 Separação de iGb3 por TLC preparativa a partir das frações F3A e F4A

As frações lipídicas obtidas após extração usada no protocolo A foram secas em

nitrogênio e ressuspendidas em C:M 1:1 em concentração final 1 mg/ml para serem

aplicadas em placas de HPTLC como já descrito anteriormente. A aplicação da amostra foi

feita de forma preparativa, contínua em 9cm de extensão e no 10º cm foi aplicado 10µg de

iGb3 como padrão. Após a cromatografia a porção final da TLC (contendo iGb3 padrão e

parte da amostra aplicada) foi recortada e corada com iodo para detecção das bandas. O Rf

da banda única de iGb3 padrão foi marcado e usado como guia para a amostra

cromatografada. Toda sílica da TLC que estava na altura da banda de iGb3 foi raspada e

Materiais e Métodos

- 31 -

reservada para a extração dos lipídeos ligados à sílica. Os lipídeos foram extraídos da sílica

com C:M (1:2), C:M (1:1) e C:M (2:1), e o extrato centrifugado a 3.000 rpm por 10

minutos e seco em nitrogênio gasoso. As amostras denominadas iGb3 F3A e iGb3 F4A

foram novamente cromatografadas e coradas com iodo, orcinol e resorcinol para

verificação de sua purificação. As frações foram também testadas no ensaio de estimulação

do hibridoma de células NKT, DN32.D3

3.17 Ensaio de estimulação de hibridomas NKT (DN32.D3) utilizando as frações iGb3

F3A e iGb3 F4A

As frações iGb3 F3A e iGb3 F4A foram testadas quanto à sua capacidade de

ativação do hibridoma de células NKT, DN32.D3.

Células dendríticas da medula foram plaqueadas em placa de 96 poços,

5x10

células/50 µl/poço, e mantidas por 2 horas em estufa com 5% CO

a 37°C. Durante

esse período, as frações foram solubilizadas em C:M (1:1) 1 mg/ml, agitadas em vortex e

sonicadas. Alíquotas de diferentes concentrações de cada fração foram retiradas,

transferidas para um tubo estéril e secas em fluxo de nitrogênio gasoso. Essas alíquotas

foram então solubilizadas em meio RPMI contendo 10% SFB nas concentrações finais de

100 µg/ml, 12 µg/ml, 3 µg/ml, 1 µg/ml e controle (células sem estímulo) para iGb3 F3A e

100 µg/ml, 25 µg/ml, 5 µg/ml, 1 µg/ml e controle (para iGb3 F4A), todos em volume final

de 100 µl/poço. A cada nova diluição a amostra foi sonicada. As amostras foram incubadas

por 24 horas. Ao final desta incubação adicionaram-se 5x10

células/100 µl/poço de

DN32.D3, incubando-se em seguida em estufa com 5% CO

a 37°C por 18 horas. Os

sobrenadantes foram recolhidos para dosagem de IL-2.

3.18 Separação de glicoesfingolipídeos neutros e de carga negativa

A fração F3A foi cromatografada em uma resina de troca de ânions forte (SAX)

(POROS 50 HQ, Applied Biosystems, São Paulo, Brazil) para separação de

Materiais e Métodos

- 32 -

glicoesfingolipídeos neutros e carregados. A coluna foi previamente lavada com 4 ml de

metanol, 2 ml de 80% acetonitrila / ácido trifluoroacético 0,05%, e finalmente equilibrada

com 10 ml de metanol. Amostras foram diluídas a um volume final de 5 ml com metanol

100% e passada pela coluna.

A coluna foi então lavada com 6 ml de metanol e eluída com 6 ml de 250mM de

acetato de amônia em metanol 100%. Glicolipídeos neutros foram recolhidas da fração não

ligada, enquanto a fração eluída era composta principalmente de gangliosídeos. Todas as

amostras foram secas em fluxo de nitrogênio gasoso.

As frações foram dessalinizadas em coluna de fase reversa (Discovery DSC-18,

Supelco, Bellefonte, PA, USA). A coluna possuía 3 ml e foi lavada com 4 ml de metanol,

equilibrada com 5 ml de água deionizada e as amostras foram ligadas à coluna com 5 ml de

0,1M de KCl.

Depois de lavada com 10 ml de água as amostras foram eluídas com 10 ml de

metanol e secas em fluxo de nitrogênio gasoso.

3.19 Per-N,O-metilação de Glicoesfingolipídeos (GSLs) neutros

Modificações realizadas no método de Ciucanu e Kerek (1984 e 2003) foram

empregadas para per-N,O-metilação de GLSs. Glicoesfingolipídeos (1-20µg) foram

colocados em um vial de vidro cônico adicionado de 150 µl de DMSO sem o uso de

condições secadoras especiais ou atmosfera de gás inerte. Hidróxido de sódio (algumas

miligramas) em pó foi adicionado à amostra em solução e misturada a temperatura

ambiente até completa dissolução por agitação vigorosa em vortex. Em seguida 80 µl de

iodometano foi adicionado com uma seringa, e a mistura foi agitada em shaker orbital à

temperatura ambiente por 1 hora. A reação de metilação foi interrompida com 2 ml água e

2 ml de diclorometano antes da mistura ser vortexada. As amostras foram centrifugadas, a

fase aquosa foi removida e a fase orgânica foi lavada duas vezes com água. Após a lavagem

final as amostras foram secas em nitrogênio gasoso e ressuspendidas em 200 µl de metanol

puro para a análise em espectrometria de massa.

Materiais e Métodos

- 33 -

3.20 Analise de GSL permetilados de F3A por espectrometria de massa íon-trap de

ionização linear (ESI-LIT-MS)

Os glicoesfingolipídeos permetilados foram analisados por espectrometria de massa

íon-trap de ionização linear (ESI-LIT-MS) como descrito por Li et al. As amostras

permetiladas foram ligadas em tips de nanospray e analisadas em espectômetro íon-trap

(LTQ XL com ETD, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). A voltagem do spray foi

ajustada para 0,7 to 1,5 kV conforme a variação dos tips. Depois da detecção de

glicolipídeos permetilados inteiros por MS

, seguiram-se as fragmentações sequenciais

(MS

-MS

), gerando as espécies glicolipídicas representadas por fragmentação manual ou

por mapeamento total de íons (TIM) de m/z 667 (marcadores de Gb3 e iGb3) ou m/z 912

(marcadores de Gb4 e iGb4) de acordo com Li et al., 2008a e b. A energia de colisão foi

ajustada para 60% da análise manual ou TIM. Para calcular a quantidade de iGb3 na fração

F3A nós usamos a seguinte equação: A(iGb3)

amostra

= (A(iGb3)

211corr

A(iGb3)

371

) /

[A(iGb3)

211corr

+ A(iGb3)

371

+ (2x A(Gb3)

329

, onde A(iGb3)

211 corr

= A(iGb3)

esperado

A(iGb3)

máximo de iGb3 detectado

, onde A(iGb3)

211

e A(iGb3)

371

são a abundancia (A) de

marcadores iGb3 m/z 211 e m/z 371, e A(Gb3)

329

marcador de Gb3 m/z 329 (Li et al.,

2008b).

3.21 Ensaio de citotoxicidade de células dendríticas pulsadas com iGb3 e a-GalCer

contra células tumorais B16F10-Nex 2

3.21.1 Análise de citotoxicidade in vitro

Materiais e Métodos

- 34 -

Células B16F10-Nex 2 (2x10

) foram incubadas em garrafas de 25 cm

com 0,5 µCi

de [

H] timidina (NEN, Boston, MA) por 24 h. Os hibridomas de células NKT, DN32.D3,

foram ativados com prévia incubação com células dendríticas pulsadas com ou sem iGb3

por 4-6 h. As células NKT ativadas e células do melanoma [

H] B16F10-Nex 2 foram co-

cultivadas por 4 horas em placa de 96-well de fundo chato nas razões de 1/12 to 1/400, em

triplicatas. Todas as células foram coletadas em Cell Harvester e a radioatividade foi

medida em um contador beta. A percentagem de lise (citotoxicidade específica) foi

calculada utilizando a seguinte fórmula: (E-C)/E x 100, onde E é a radioatividade (cpm) no

sistema de DCs pulsadas com glicolipídeo e C é o controle do valor de radioatividade nas

células dendríticas não estimuladas. Os valores foram subtraídos do valor máximo de

radioatividade de células de melanoma não ligadas com a timidina.

3.22 Experimentos in vivo

Foram utilizados animais machos C57Bl/6 wild type (WT) obtidos do CEDEME

(UNIFESP) e animais machos geneticamente deficientes em CD1d (CD1dKO) obtidos do

Profº Ricardo T. Gazzineli, UFMG. Os animais tinham entre 6 a 8 semanas de idade. Eles

foram mantidos em isoladores no biotério da Disciplina de Biologia Celular da UNIFESP e

sempre manuseados dentro de fluxo laminar estéril, utilizando-se ração e água esterilizada.

3.22.1 Análise de sobrevida de camundongos WT e CD1dKO

Injeções subcutâneas de células B16F10-Nex 2 em dose de 5x10

, 5x10

e 5x10

foram utilizadas. O acompanhamento da sobrevida foi realizado, sacrificando-se os animais

quando esses apresentavam volume tumoral máximo de 3.000 mm

. O volume tumoral em

era obtido através da mensuração de dois diâmetros tumorais em milímetros

utilizando-se paquímetro e calculado pela fórmula V= (D x d

x 0.52)/1000 (cm

), onde D

corresponde ao maior diâmetro e d ao menor diâmetro.

Materiais e Métodos

- 35 -

3.22.2 Ensaio de metástase pulmonar in vivo

Para o modelo metastático, animais C57Bl/6 WT e CD1dKO foram injetados por

via endovenosa com 1x10

células/100 µl de B16F10-Nex2 e tratados nos dias 2 e 4 com

uma suspensão contendo 5x10

células/ml pela veia da cauda (BMDC ativadas com 20

µg/ml de iGb3 ou com 200ng/ml de a-GalCer). Após 21 dias os animais foram sacrificados,

os pulmões foram retirados, lavados com PBS 1x e o número de nódulos pulmonares foi

quantificado com o auxílio de uma lupa. Após a contagem os pulmões foram novamente

lavados e colocados em solução de paraformaldeído.

3.23 Análise estatística

Experimentos in vitro e in vivo foram analisados utilizando teste “t” de Student. O

experimento de sobrevida animal foi testado para Kaplan-Meyer e logrank. Valores de p ≤

0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

- 36 -

4. RESULTADOS

4.1 Análise de sobrevida e desenvolvimento tumoral em animais deficientes em CD1d

Animais knock-out (KO) para CD1d, molécula responsável pela apresentação de

antígenos lipídicos e glicolipídicos às células NKT, e camundongos machos C57Bl/6 (WT)

foram inoculados subcutaneamente com células de melanoma murino B16F10-Nex2, para

comparar o desenvolvimento tumoral e a mortalidade desses animais. Os animais foram

divididos em grupos de 5 indivíduos, e foram inoculados com 5x10

, 5x10

ou 5x10

células/animal. O volume tumoral foi quantificado a cada 2-3 dias com uso de paquímetro,

e foi permitido que o tumor chegasse a um máximo de 3 cm

, quando então os animais

eram sacrificados.

Na Figura 1 observa-se que os animais CD1d-KO foram mais sensíveis ao

desenvolvimento subcutâneo do melanoma murino B16F10-Nex2, nas 3 concentrações de

células implantadas, apresentando menor sobrevida quando comparados aos animais WT.

Esse efeito mostrou-se mais significante nas doses de 5x10

e 5x10

, com a dose de 5x10

apresentando uma diferença discreta entre os 2 grupos de animais. Os animais WT e CD1d-

KO injetados com a maior dose de células tumorais foram os que apresentaram maior

diferença significativa na sobrevida (Figura 1A). Enquanto todos os animais KO haviam

morrido ou sacrificados até o dia 25 após o inóculo, somente 20% dos animais WT tinham

morrido e desses, 60% dos animais tinham tumores menores que 0,5 cm

Na Figura 1B observamos a sobrevida de animais WT e CD1d KO inoculados com

5x10

B16F10-Nex 2. Os animais KO tiveram uma sobrevida maior que no ensaio anterior,

porém ainda muito abaixo quando comparados ao grupo WT que apresentou sua primeira

morte depois que todos os animais do outro grupo já haviam morrido ou foram sacrificados

com tumor de máximo volume. No ensaio onde os grupos foram injetados com 5x10

células tumorais, o período de sobrevivência não foi maior para o grupo WT e não

encontramos diferença significativa com essa dosagem (Figura 1C).

Resultados

- 37 -

Ensaio de sobrevida – 5 x 10

B16F10-Nex 2

Dias após inóculo

Sobreviventes (%)

Ensaio de sobrevida – 5 x 10

B16F10-Nex 2

Dias após inóculo

Sobreviventes (%)

Dias após inóculo

Ensaio de sobrevida – 5 x 10

B16F10-Nex 2

Sobreviventes (%)

CD1dKO

Dias após inóculo

Ensaio de sobrevida – 5 x 10

B16F10-Nex 2

Sobreviventes (%)

Dias após inóculo

Ensaio de sobrevida – 5 x 10

B16F10-Nex 2

Sobreviventes (%)

CD1dKO

Resultados

- 38 -

FIGURA 1 - Sobrevida de animais C57Bl/6 (WT) e CD1dKO. Grupos de 5 camundongos

machos foram inoculados subcutaneamente com A) 5x10

células, B) 5x10

células, C)

5x10

células B16F10-Nex2. Os animais foram observados para anotar a sobrevida e o

volume tumoral foi quantificado a cada 2 dias, sacrificando-se os animais que

apresentavam volume de no máximo 3 cm

Ensaio de sobrevida – 5 x 10

B16F10-Nex 2

Sobreviventes (%)

Dias após inóculo

Ensaio de sobrevida – 5 x 10

B16F10-Nex 2

Sobreviventes (%)

Dias após inóculo

Resultados

- 39 -

Com base nesses experimentos mostramos que células NKT tem forte influência na

resposta anti-tumoral, e decidimos que para nossos próximos ensaios utilizaríamos a dose

de 5x10

células B16F10-Nex 2.

4.2 Padronização do ensaio de ativação do hibridoma de células NKT, DN32.D3, por

fibroblastos – CD1d

4.2.1 Caracterização por FACS das células utilizadas no ensaio

Para a realização desse ensaio, foram necessárias 2 linhagens celulares: uma de

fibroblasto s murinos transfectados com o gene de CD1d (Fibroblastos-CD1d), responsável

pela apresentação dos antígenos de origem lipídica às células NKT, e a segunda, o

hibridoma DN32.D3, originário de células NKT murinas, ambos cedidos pelo Prof. Ricardo

T. Gazzinelli.

Primeiramente, as células a serem utilizadas no ensaio foram analisadas quanto à

expressão de marcadores específicos de superfície por citometria de fluxo.

Na Figura 2A observa-se um resultado esperado. Verificou-se que as células

DN32.D3 são formadas por duas populações, cerca de 20% das células têm em sua

superfície os marcadores NK1.1 (marcador de célula NK); dessas, 12,6% co-expressam o

marcador CD3e (presente em linfócitos) e 16,1% expressam NK1.1 e Vβ8 (representativo

do TCR invariante da célula NKT), confirmando que esse hibridoma apresenta

características de um linfócito NKT. A linhagem celular fib roblastos-CD1d tem 93% da

população co-expressando marcadores de CD1d e MHC I em sua superfície (Figura 2B).

Essas células foram cultivadas em presença de G418, utilizado para eliminar células que

porventura tenham perdido o inserto transfectante. Como controle positivo analisou-se a

presença de moléculas de MHC classe I, sempre presentes (98% da população).

Essas análises foram repetidas diversas vezes para confirmar a estabilidade das

características necessárias a cada tipo de células. As células apresentavam algumas

variações nos marcadores, mas nada que comprometesse os ensaios.

Resultados

- 40 -

FIGURA 2- Análise de marcadores de superfície das células DN32.D3 e fibroblastos

transfectados com o gene de CD1d murino, por citometria de fluxo (FACS). A) Células

DN32.D3 duplo marcadas para NK1.1/CD3e e anticorpos anti-Vβ8-PE. B) Fibroblastos-

CD1d duplo marcados com CD1d/MHC I.

12,6 %

7 %

12,6 %

7 %

16,1 %16,1 %

CD1d

MHC I

93,3 %

CD1d

MHC I

CD1d

MHC I

93,3 %

Resultados

- 41 -

4.2.2 Padronização do ensaio com α-galactosilceramida

O ativador clássico de células NKT via CD1d é a α-galactosilceramida (α-GalCer),

e por esse motivo, o composto foi utilizado na padronização do ensaio de ativação de

células DN32.D3. A α-GalCer, um glicolipídeo, é mantido seco, a -20

C. Para sua

utilização no ensaio, foi diluido em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino e DMSO,

seguido de sonicação em gelo por 1 minuto. Foram testadas duas concentrações de DMSO

com 5% e 2%, sendo elas não-tóxicas para os fibroblastos- CD1d em um período de 4 horas

de incubação. Para incubação de 24 horas a concentração de 5% de DMSO foi prejudicial

aos fibroblastos.

A apresentação de α-GalCer via CD1d pode ocorrer pela ligação direta do

glicolipídeo ao receptor na superfície celular ou através de processamento endógeno do

mesmo previamente à apresentação na superfície. Na hipótese de que as frações de natureza

lipídica extraídas do tumor pudessem ser apresentadas após processamento endógeno,

implicando talvez em um tempo de incubação maior, padronizamos o ensaio de

estimulação para 24 horas de incubação com o estímulo (α-GalCer) e os fibroblastos-

CD1d. Realizamos um ensaio sem DMSO e o resultado foi muito satisfatório, assim

optamos por utilizar meio sem DMSO e período de incubação de 24 horas em todos o

ensaios de ativação.

Fibroblastos-CD1d foram então incubados com α-GalCer por 24h a 37 °C, 5% CO

Ao final do período de incubação, foram adicionadas as células DN32.D3, incubando-se a

reação por 18 horas a 37

C, 5% CO

. O sobrenadante de cultura foi recolhido e a

interleucina IL-2 secretada pelas células DN32.D3 ativadas foi quantificada por ELISA.

Em todos os ensaios de ativação, fibroblastos-CD1d incubados com as células

DN32.D3 em meio de cultura sem adição de α-GalCer foram consideradas como controle

(ou o “branco” da reação).

Como mostra a Figura 3A, a α-GalCer foi diluída seriadamente partindo-se da

concentração de 10 ng/ml até 1,25 ng/ml. Observa-se uma resposta dependente da dose de

Resultados

- 42 -

α−GalCer utilizada. A produção máxima de IL-2 foi de 0,8 ng/ml quando as células foram

estimuladas com 10 ng/ml do lipídeo. Na Figura 3B temos o ensaio sem o uso de DMSO e

tempo de incubação de 24 horas. Os resultados foram melhores que o ensaio anterior, pois

com 5 ng/ml de a-GalCer foram detectados 2,3 ng/ml e mesmo na menor concentração de

0,15ng/ml, o glicolipídio foi capaz de ativar as células a secretar cerca de 200pg/ml de IL-2.

Concluímos, portanto, que o melhor ensaio foi aquele sem adição de DMSO e com

24 horas de incubação. Mesmo em menores concentrações os fibroblastos foram capazes de

apresentar a α-GalCer de forma eficiente sendo o complexo capaz de ativar o hibridoma

DN23.D3.

4.3 Obtenção de células tumorais B16F10-Nex2 crescidas in vivo.

Com o ensaio de ativação funcionando, o próximo passo foi tentar isolar e averiguar

a presença de componentes presentes no melanoma murino capazes de estimular uma

resposta imune antitumoral. Para tanto, animais C57Bl/6 foram inoculados com 5x10

células B16F10-Nex2 subcutaneamente e os tumores foram extraídos assepticamente

quando o seu volume atingia cerca de 1 cm

. Para excluir a possibilidade de que moléculas

lipídicas de microorganismos contaminantes pudessem interferir na ativação das células

DN32.D3, testes para detecção de Mycoplasma sp. por técnica de PCR foram realizados em

todos os tumores retirados dos camundongos (Figura 4). Além de teste para presença de

bactérias, coletando-se amostras do tumor com alça de platina e cultivando-se em caldo LB,

por pelo menos 48 horas em estufa a 37

C, todos os tumores apresentaram-se livres de

Mycoplasma sp. Os tumores que apresentaram resultado positivo para Mycoplasma sp ou

bactérias foram descartados.

Descartada a possibilidade de alguma contaminação, preparamos um lisado de

células crescidas in vivo utilizando alternadamente, ciclos repetidos de congelamento e

descongelamento em nitrogênio líquido e banho a 37

C. Em seguida, os lisados foram

ultracentrifugados como descrito em Materiais e Métodos para separação das frações de

Membrana e Citosol. As concentrações utilizadas nos ensaios foram baseadas na

quantidade de mg de proteína/ml presente em cada fração, assim para a fração de

Resultados

- 43 -

FIGURA 3 - Padronização do ensaio de ativação do hibridoma DN32.D3 via ligação com

CD1d apresentando α-galactosilceramida (α-GalCer). A reação ocorreu na presença de A)

5% de DMSO com 4 horas de incubação; B) ausência de DMSO durante 24 horas. Os

controles (células DN32.D3 e fibroblastos transfectados incubados sem estímulo)

considerado zero.

Resultados

- 44 -

FIGURA 4 - PCR para verificação da presença de contaminação por Mycoplasma sp. nos

tumores extraídos. Tumores de 7 animais foram coletados (T1 a T7), e reações de PCR

realizadas com primers específicos para Mycoplasma sp. Std, Padrão de Peso molecular;

DN, células DN32.D3; Ct+, controle positivo; Ct-, controle negativo; Fib-CD1d,

fibroblastos-CD1d.

Resultados

- 45 -

membrana foram feitas diluições nas concentrações de 1,1 mg proteína/ml até 0,007 mg

proteína/ml e para o citosol utilizamos de 3,4 mg proteína/ml até 0,008 mg proteína/ml.

Todas as soluções diluídas foram sonicadas por 1 minuto em banho com gelo antes de

serem adicionadas ao ensaio. Na Figura 5 observamos que a fração citosólica de 0,085 mg

proteína/ml induziu a maior secreção de IL-2 (350 pg/mL, Figura 5A), enquanto que a

fração membranar com 0,44 mg proteína/ml induziu a secreção de quantidades superiores a

500 pg/mL (Figura 5B) e com 0,03 mg proteína/ml a produção foi de 320 pg/ml de IL-2.

Estes resultados sugerem que existe um componente lipídico capaz de estimular linfócitos

NKT via CD1d no melanoma murino e que encontra-se majoritariamente na fração de

membrana da célula tumoral.

4.4 Obtenção e isolamento de frações lipídicas das células tumorais B16F10-Nex 2

Nosso objetivo era identificar e caracterizar possíveis compostos lipídicos presentes

no tumor de melanoma B16F10-Nex2, capaz de estimular uma resposta imune antitumoral.

Para o isolamento das frações lipídicas de células B16F10-Nex2 foram utilizados tumores

crescidos in vivo, evitando-se desta forma as condições artificiais de cultivo in vitro de

células tumorais. Camundongos C57Bl/6 foram injetados com células tumorais, e os

tumores foram extraídos assepticamente quando o volume destes atingia cerca de 1 cm

Todo material utilizado estava livre se contaminações por bactérias ou Mycoplasma sp.,

assim como as células utilizadas.

Para o isolamento das frações lipídicas, foram testados três diferentes protocolos de

extração de lipídeos denominados de A, B e C, os quais se referem à extração por Folch,

extração final com diisopropil-éter (DIPE)/1-butanol e extração com passagem por coluna

SepPak C18, respectivamente (maiores detalhes em Materiais e Métodos).

Todas as frações resultantes das diferentes extrações, as mais brutas e as mais

purificadas, foram cromatografadas em placa de sílica para cromatografia de camada fina

(HPTLC, High Performance Thin Layer Chromatography), e reveladas com resorcinol para

visualização da presença de resíduos de ácido siálico, orcinol para verificação da presença

de glicolipídeos e outros açúcares, e também com ácido orto-fosfórico, para visualização de

Resultados

- 46 -

FIGURA 5 - Ensaio de ativação das células DN32.D3 por células dendríticas estimuladas

por frações citosólica e de membrana de melanoma B16F10-Nex2. A) fração citosólica; B)

fração de membrana. Como controle foram utilizadas células DN32.D3 e células

dendríticas sem estímulo.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

3,4 1,36 0,34 0,085 0,034 0,023 0,008 ctr

Fração citosólica (mg proteína/ml)

IL-2 (ng/ml)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1,1 0,44 0,11 0,03 0,01 0,007 ctr

Fração de membrana (mg proteína/ml)

IL-2 (ng/ml)

Resultados

- 47 -

fosfolipídeos. As corridas foram realizadas com o sistema solvente, clorofórmio-metanol-

KCl aquoso 0,25% (60 : 35 : 8, v/v/v).

O Esquema 1 mostra o resultado de extração referente ao protocolo A, onde

partindo de uma massa tumoral liofilizada, foram obtidas 6 frações provenientes de todo o

processo de extração, denominadas F1A a F6A. Todo o processo de extração está

detalhado em Materiais e Métodos, podendo-se notar que as frações iniciais apresentam

uma hidrofobicidade maior que as frações finais, extraídas com maior quantidade de água.

Na Figura 6 encontram-se as HPTLCs referentes às frações obtidas com esse

primeiro protocolo de extração. As placas reveladas com orcinol (Figura 6A) e resorcinol

(Figura 6B) mostram que as frações F1A, F2A, F3A, F4A e F6A contém 2 bandas que

representam glico-componentes que contém ácido siálico. A fração F5A também apresenta

2 bandas em orcinol, porém somente um dos componentes dessa fração contém resíduos de

ácido siálico. A terceira banda observada em F2A revelada com resorcinol necessitaria de

confirmação, uma vez que essa banda não é revelada na placa com orcinol. Com exceção

da fração F3A, todas as outras frações contém fosfolipídeos (Figura 6C).

Utilizando-se o protocolo B, foram obtidas 5 frações ao longo do processo de

extração, F1B a F5B, também partindo de tumor liofilizado (Esquema 2). Na Figura 7

encontram-se as TLCs referentes às frações obtidas com o protocolo B de extração. As

placas de HPTLC dessas frações reveladas com orcinol (Figura 7A) e resorcinol (Figura

7B) mostram que as frações F1B, F3B e F5B contém 3 bandas distintas de

glicoconjugados, sendo que 1 desses componentes contém resíduos de ácido siálico. F2B e

F4B apresentam 2 bandas reveladas com orcinol, porém nenhuma banda foi revelada com

resorcinol, sugerindo que esses componentes não contenham resíduos de ácido siálico. Na

coloração para fosfolipídeos (Figura 7C), mostra que as frações F1B e F2B contém a

maior parte dos fosfolipídeos extraídos nesse protocolo (cada fração apresenta 1 banda bem

corada), com as demais frações apresentando uma leve contaminação por essas moléculas

(em F3B nota-se duas bandas fracamente reveladas, e em F4B e F5B aparece uma banda

fracamente revelada).

No protocolo C (Esquema 3) as três frações (F1C a F3C) foram obtidas a partir de

massa tumoral não liofilizada, sendo extraídas no primeiro sistema de solventes utilizado

(clorofórmio-metanol-água). Nas placas de sílica reveladas com orcinol (Figura

Resultados

- 48 -

ESQUEMA 1 – Esquema da extração de lipídios do melanoma murino B16F10-Nex2.

Seis frações (F1A a F6A) foram obtidas dos tumores crescidos subcutaneamente e

liofilizados.

Pellet

Liofilizado

M (2:1) 3x

Pellet

W (1:2:0,8) 3x

M (2:1)

+ água

Pellet

Sobrenadante

F2A

Sobrenadante

F1A

Fase superior

F3A

Fase inferior

F4A

(1:100:100)

Fase superior

F5A

Fase inferior

F6A

Resultados

- 49 -

A) B)

FIGURA 6 - Cromatografia de camada fina (HPTLC) das frações F1A a F6A, obtidas utilizando

protocolo de extração A. As frações foram diluídas em 50 µl de C-M 1:1 e cerca de 4 µl foram

aplicados. A) Placa revelada com orcinol para açúcares ou glicoconjugados; B) Placa revelada com

resorcinol para ácido siálico; C) Placa revelada com ácido orto-fosfórico para fosfolipídeos. O

sistema de solventes utilizado foi Clorofórmio – Metanol – KCL aquoso 0,25% (60:35:8)

F 1A F2A F3A F4A F5A F6AF 1A F2A F3A F4A F5A F6A

F1A

F2A

F3A

F4A

F5A F6AF1A

F2A

F3A

F4A

F5A F6A

Resultados

- 50 -

ESQUEMA 2 – Esquema da extração de lipídios do melanoma murino B16F10-Nex2.

Cinco frações (F1B a F5B) foram obtidas dos tumores crescidos subcutaneamente e

liofilizados.

Pellet

Liofilizado

M(1:1)

Agitador magnético

18 horas - 4°C

Pellet (2a. Extração)

C-M (1:1)

Sobrenadante

18h

–

-25°C

centrifuga

Pellet

Sobrenadante

F1B

DIPE/1

butanol

(3:2)

10mL

0,3% NaCl

Fase superior

F2B

Fase inferior

F3B

DIPE/1

butanol

(3:2)

Fase supe

rior

F4B

Fase inferior

F5B

Resultados

- 51 -

A) B)

FIGURA 7 - Cromatografia de camada fina (HPTLC) das frações F1B a F5B, obtidas

utilizando protocolo de extração B. As frações foram diluídas em 100 µl de C-M 1:1 e 4 µl

foram aplicados. A) revelação com orcinol; B) revelação com resorcinol; C) revelação com

ácido orto-fosfórico. Ver Figura 9 para os alvos revelados. O sistema de solventes utilizado foi

Clorofórmio – Metanol – KCL aquoso 0,25% (60:35:8)

F1B F2B F3B F4B F5BF1B F2B F3B F4B F5B

F1B F2B F3B F4B F5BF1B F2B F3B F4B F5BF1B F2B F3B F4B F5B

Resultados

- 52 -

ESQUEMA 3 – Esquema da extração de lipídios do melanoma murino B16F10-Nex2.

Três frações (F1C a F3C) foram obtidas dos tumores crescidos subcutaneamente e não

liofilizados.

Células

tumorais

C-M-W (4:8:3)

Pellet re

extração

C-M-W (4:8:3)

Sobrenadante

Fase superior 1

Fase inferior 2

F2C

Agitador orbital

centrifuga

C-M-W (4:8:5,6)

Fase inferior 1

(4:8:5,6)

Fase superior 2

F1C

Coluna Sep

Pak

C18

F3C

Resultados

- 53 -

8A) e resorcinol (Figura 8B), observa-se a presença de 2 bandas de glicoconjugados em

F1C e F3C, ambas contendo resíduos de ácido siálico. F2C apresenta uma banda revelada

com orcinol, porém não revelada com resorcinol, sugerindo que esse componente contenha

resíduos de açúcares, porém não de ácido siálico. Enquanto as frações F1C e F3C não

apresentam componentes que sugerem a presença de fosfolipídeos, a fração F2C apresenta

uma banda fortemente revelada com ácido orto-fosfórico (Figura 8C).

Os gangliosídeos GD3, GM3 e GM1 foram utilizados como padrões e revelados

com orcinol (Figura 9A), resorcinol (Figura 9B) e ácido orto-fosfórico (Figura 9C) e seus

s comparados nas HPTLCs com as frações de melanoma murino.

4.5 Dessalinização das frações obtidas

Todas as frações foram dessalinizadas em coluna SepPack C18 antes de todas as

cromatografias e ensaios de estimulação. Controlamos a quantidade e qualidade dos

componentes presentes nas frações através da revelação das placas de HPTLC por iodo

sublimado, que se liga em todo componente lipídico, antes e depois da dessalinização da

amostra em coluna C18. Comparando as TLCs, verificamos que nenhuma perda qualitativa

ou quantitativa dos componentes presentes na amostra foram notadas. Após toda a eluição

da amostra a coluna foi lavada. Os sobrenadantes da lavagem foram reunidos, concentrados

e aplicados em dot-blot em HPTLC para ser revelada com iodo (dados não mostrados).

Nenhum componente lipídico foi detectado, concluindo assim que não houve perda

significativa de material.

4.6 Ensaio de estimulação de células DN32.D3 pelas frações lipídicas do melanoma

murino B16F10-Nex2.

As frações obtidas nos três diferentes protocolos foram testadas como ligantes no

ensaio de estimulação de células NKT para detectarmos se alguma fração era capaz de

induzir a produção de IL-2 pelo hibridoma.

Resultados

- 54 -

A) B) C)

FIGURA 8 - Cromatografia de camada fina (TLC) das frações F1C a F3C, obtidas

utilizando protocolo de extração C. As frações foram diluídas em 100 µl de C-M 1:1

(exceto a fração F2C que foi diluída só em clorofórmio) e 4 µl foram aplicados. A)

revelação com orcinol; B) revelação com resorcinol; C) revelação com ácido orto-fosfórico.

Ver Figura 9 para os alvos revelados. O sistema de solventes utilizado foi Clorofórmio –

Metanol – KCL aquoso 0,25% (60:35:8)

F1C F3C F2CF1C F3C F2C

F1C

F3C

F2CF1C

F3C

F2C

F1C F3C F2CF1C F3C F2C

Resultados

- 55 -

A) B) C)

FIGURA 9 - Cromatografia de camada fina (HPTLC) de GD3, GM3 e GM1 usados como

padrão. Foram aplicados 5 µg de cada gangliosídeo. A) Placa revelada com orcinol; B)

Placa revelada com resorcinol; C) Placa revelada com ácido orto-fosfórico.

GD3 GM3 GM1

GD3 GM3 GM1GD3 GM3 GM1

GD3 GM3 GM1GD3 GM3 GM1GD3 GM3 GM1

Resultados

- 56 -

Todas as frações foram secas com nitrogênio gas e ressuspendidas em 500 µl de

metanol (ou clorofórmio para F2C), retirada uma alíquota de 50 µl e transferida para um

tubo estéril. Essa alíquota foi novamente seca em nitrogênio e ressuspendida em meio

RPMI completo, sonicando-se por 1 minuto em banho com gelo. A partir dessa suspensão,

as frações foram diluídas sequencialmente, iniciando-se em 10X até 320X diluídas. Todas

as diluições foram seguidas de um ciclo de sonicação em banho com gelo de 1 minuto.

Observa-se na Figura 10A que somente a fração F3A induziu a produção de IL-2

em diferentes diluições, superior à citocina detectada no controle. Notamos que com o

aumento da diluição a produção da interleucina foi mais eficiente alcançando níveis de

cerca de 650 pg/ml de IL-2. As concentrações mais diluídas de F1A e F2A apresentaram

uma pequena detecção de IL-2, níveis muito baixos próximos de 40 pg/ml acima do basal

em ambas frações. Também nas maiores diluições das frações F4A e F5A detectamos a

produção de IL-2, cerca de 90 pg/ml e 100 pg/ml a mais que no controle, enquanto todas as

diluições de F6A produziram menos interleucina que a reação basal (Figura 10B).

Em nenhuma das frações do protocolo B (Figura 10C e D) foram detectados níveis

de produção de IL-2 superiores ao encontrado no controle. Assim esse protocolo não gerou

frações capazes de estimular as células DN32.D3.

No protocolo C somente a fração F3C ativou as células DN32.D3 a secretar IL-2

(Figura 10E) chegando a 150 pg/ml de IL-2 a mais que no controle, porém essas

quantidades foram inferiores às encontradas em F3A. As frações F1C e F2C não

produziram níveis de IL-2 próximos ao encontrado no basal.

Em sistemas controle, colocamos as células utilizadas no ensaio em contato, sem a

presença de qualquer lipídeo e dosamos a quantidade de IL-2, considerada como produção

basal da citocina no ensaio. Exceto para as frações F3A e F3C, todas as outras frações

lipídicas obtidas apresentaram níveis de produção de IL-2 menores que o basal.

Curiosamente conforme as frações foram diluídas, a produção de IL-2 aproximava-se do

nível basal detectado no controle, sugerindo que além da presença de lipídeos capazes de

ativar hibridomas de células NKT, também estariam presentes nas frações do melanoma

murino componentes com atividade inibitória dessas células.

Devido a esses ensaios, optamos por focar a evolução do nosso trabalho na fração

F3A por ter sido ativadora e F4A, por ser a inferior de uma mesma etapa de extração de

Resultados

- 57 -

Frações Protocolo A

-0,15

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,35

0,45

0,55

0,65

0,75

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F4A

F5A

F6A

ctr

Frações Protocolo A

-0,15

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,35

0,45

0,55

0,65

0,75

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F4A

F5A

F6A

ctr

Frações Protocolo A

-0,15

0,15

0,3

0,45

0,6

0,75

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F1A

F2A

F3A

ctr

Frações Protocolo A

-0,15

0,15

0,3

0,45

0,6

0,75

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F1A

F2A

F3A

ctr

F1A

F2A

F3A

ctr

Resultados

- 58 -

Frações Protocolo B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F1B

F2B

F3B

ctr

Frações Protocolo B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F1B

F2B

F3B

ctr

Frações Protocolo B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F1B

F2B

F3B

ctr

F1B

F2B

F3B

ctr

Frações Protocolo B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F4B

F5B

ctr

Frações Protocolo B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

10 x

20 x

40 x

80 x

160 x

320 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F4B

F5B

ctr

Resultados

- 59 -

FIGURA 10 - Ativação de células DN32.D3 via CD1d apresentando frações de natureza

lipídica extraídas de células tumorais utilizando-se o Protocolo A (F1A a F6A), Protocolo

B (F1B a F5B) e Protocolo C (F1C a F3C). As frações diluídas de 10 a 320X foram

incubadas com as células na ausência de DMSO e por 24 horas. A) Frações F1A a F3A e

controle (ctr); B) Frações F4A a F6A e ctr; C) Frações F1B a F3B e ctr; D) Frações F4B,

F5B e ctr; E) Frações F1C a F3C e ctr; os controles são as células DN32.D3 incubadas com

os fibroblastos-CD1d na ausência de estímulo. A linha vermelha mostra o nível basal de IL-

2 encontrado no controle.

Frações Protocolo C

3,1

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

40 x

60 x

80 x

100 x

120 x

150 x

40 x

60 x

80 x

100 x

120 x

150 x

40 x

60 x

80 x

100 x

120 x

150 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F1C

F2C

F3C

ctr

Frações Protocolo C

3,1

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

40 x

60 x

80 x

100 x

120 x

150 x

40 x

60 x

80 x

100 x

120 x

150 x

40 x

60 x

80 x

100 x

120 x

150 x

ctr

Diluição das frações

IL-2 ng/ml

F1C

F2C

F3C

ctr

F1C

F2C

F3C

ctr

Resultados

- 60 -

F3A. A partir de então todas as frações extraídas foram secas e pesadas para serem

padronizadas pelo peso seco. Para cada 200 mg de tumor liofilizado, cerca de 2 mg a 2,5

mg de fração F3A e de 85mg a 87mg da fração F4A foram obtidos.

4.7 Obtenção de células apresentadoras de antígenos murinas maturadas a partir de

precursores de medula óssea para ensaio de ativação de células DN32.D3

A fim de otimizar a apresentação das frações lipídicas obtidas de células de

melanoma murino B16F10, buscamos avaliar a eficiência de células apresentadoras de

antígeno, macrófagos e células dendríticas murinas, em nosso sistema de estimulação de

linfócitos NKT DN32.D3. Após várias tentativas de obtenção de células dendríticas a partir

de esplenócitos murinos, os resultados não corresponderam às nossas expectativas. Assim,

optamos por obter células apresentadoras a partir de precursores de medula óssea. As

células foram maturadas com os fatores adequados para cada tipo celular, como é descrito

em Materiais e Métodos. Para verificarmos se a maturação dos precursores foi eficiente

utilizamos anticorpos conjugados com fluorocromos para marcadores de superfície de

macrófagos e células dendríticas.

Utilizando-se de protocolo de maturação para macrófagos (meio L), cerca de 74%

das células eram positivas para F4/80 (Figura 11A), e quase metade da população (49%)

apresentava marcadores para CD1d na superfície (Figura 11B). A presença deste marcador

na superfície da célula é fundamental para que esta população seja utilizada em nossos

ensaios de estimulação, uma vez que os lipídeos de nossas frações serão apresentados via

CD1d. Cerca de 68% da população de macrófagos apresentava coloração positiva para

MHC II e 91,5% tinha CD11b em sua superfície (Figura 11C e 11D, respectivamente) e

somente 11,5% das células coraram para o marcador CD11c (dado não mostrado). A forte

marcação para F4/80 e CD11b sugere a eficiência na maturação de macrófagos neste

protocolo, e a forte marcação para CD1d permite a utilização dessas células em nossos

ensaios.

Como já foi descrito em Materiais e Métodos, para a maturação de células

dendríticas a partir de precursores de medula óssea, as células foram primeiramente

Resultados

- 61 -

A) B)

C) D)

FIGURA 11 - Análise de marcadores de superfície de macrófagos murinos maturados a

partir de precursores de medula óssea por citometria de fluxo (FACS). Marcação simples

positiva para : A) F4/80- FITC, 74%, B) CD1d- FITC, 49%, C) MHC classe II- FITC 68%

e D) CD11b-PE 91,5%

MHC II

68%

CD11b

91,5%

MHC II

68%

MHC II

68%

CD11b

91,5%

CD11b

91,5%

F4/80

74%

CD1d

49%

F4/80

74%

F4/80

74%

CD1d

49%

CD1d

49%

Resultados

- 62 -

cultivadas em presença de GM-CSF. Todavia, ajustes ao protocolo foram necessários, pois

o rendimento da maturação das células era baixo: abolimos a lise de hemácias, e

acrescentamos IL-4 ao meio de maturação observando que o rendimento aumentou quase

30%. Como principal marcador para observarmos a maturação dessas células, utilizamos

CD11c, CD86 e CD1d visualizado na Figura 12, onde as células foram duplo coradas.

Cerca de 46% das células de medula óssea, após a diferenciação com GM-CSF e IL-4,

coraram para CD11c e CD1d, ao total, 48% das células coraram para CD11c e 68% para

CD1d (Figura 12A). Quando as células foram coradas com anti- CD86 e CD1d, cerca de

7% dessas eram duplo positivas, sendo 7,8% das células marcadas só com anti- CD86 e

49,7% das células coraram para CD11c (Figura 12B). As células duplo coradas para

F4/80/CD11b representaram menos de 30% das células (dados não mostrados).

4.8 Ensaio de ativação de células DN32.D3 pelas frações lipídicas obtidas a partir do

melanoma murino B16F10-Nex2 apresentadas por BMDC

Com as frações F3A e F4A obtidas em cada extração, novos ensaios foram

realizados a fim de confirmar a ativação de células DN32.D3 via CD1d pela fração F3A

dessa vez apresentada por células dendríticas maturadas de medula óssea, quantificando a

produção de IL-2 pelas células NKT.

As frações individualizadas foram secas em fluxo de nitrogênio gas e

ressuspendidas em 500 µl metanol, retirada uma alíquota correspondente a 2µg/ml e

transferida para tubo estéril. Essa alíquota foi novamente seca em fluxo de nitrogênio e

ressuspendida em meio de cultura celular e sonicada por 1 minuto em banho com gelo a

cada diluição. A partir dessa suspensão, as frações foram diluídas sequencialmente, sendo

que o primeiro poço continha aproximadamente 1mg/ml F3A e incubadas com macrófagos

e precursores de células dendríticas da medula óssea. Os resultados dos novos experimentos

estão representados na Figura 13A. Nessa figura vemos a produção de IL-2 no ensaio com

a fração F3A apresentada por macrófagos. Como esperado, a ativação das células NKT por

essa fração (125 µg/ml) se manteve, com níveis de IL-2 de 310 pg/ml, acima do controle, e

maiores do que os obtidos com F3A apresentada por fibroblastos-CD1d. Com a

Resultados

- 63 -

A) B)

FIGURA 12 - Análise de marcadores de superfície de células dendríticas murinas

maturadas a partir de precursores da medula óssea por citometria de fluxo (FACS).

Marcação duplo-positiva para: A) CD1d-FITC/CD11c-PE, 46%, B) CD86-FITC/CD11c-

PE, 7%.

CD1d

CD11c

CD86

CD11c

CD1d

CD11c

CD1d

CD11c

CD86

CD11c

CD86

CD11c

Resultados

- 64 -

mesma concentração de F3A testada no ensaio anterior, a apresentação dessa fração por

células dendríticas (BMDC) chegou a produzir quase 3 vezes mais IL-2, cerca de 900 pg/ml

de citocina (Figura 13B). Ainda nesse ensaio vemos que a produção de IL-2 chegou a

1.025 pg/ml para 250 µg/ml de F3A e foi de 600 pg/ml com 15µg/ml de fração.

Partindo de uma concentração de 56 µg/ml da fração F4A, o perfil de ativação foi

mantido, ou seja, mesmo sendo essa fração apresentada por células dendríticas somente

uma concentração apresentou a produção de IL-2 superior à encontrada no controle.

Enquanto 28 µg/ml da fração produziu 0,17ng/ml de IL-2 a mais que o controle, todas as

outras concentrações de F4A produziram menos IL-2 que o controle, que produziu um total

de 2,2 ng/ml de citocina (Figura 13C).

Comparando a produção de IL-2 pelas células DN32.D3, com as 3 células

apresentadoras utilizadas nos ensaios de estimulação, concluímos que as células dendríticas

foram as que melhor ativaram as células NKT. Passamos então a utilizar essas células nos

próximos ensaios de ativação.

Em seguida, avaliamos a produção de IL-4 pelas células NKT ativadas por essas

frações.

4.9 Dosagem de IL-4 no ensaio de ativação de células DN32.D3 pelas frações F3A e F4A

A produção de interleucina IL-4 em resposta às frações F3A e F4A foi também

determinada. Na Figura 14 observamos que tanto F3A como F4C induziram a produção

de IL-4 onde todas as concentrações das frações atingiram níveis superiores ao encontrado

no controle. Em geral, as concentrações de F3A mostraram tendência de titulação no

ensaio, mas produziram menos IL-4 que em F4A.

Resultados

- 65 -

Ensaio de ativação com F3A apresentada por macrófagos

0,1

0,2

0,3

0,4

1000 500 250 125 63 31 15 ctr

F3A µg/ml

IL-2 ng/ml

Ensaio de ativação com F3A apresentada por BMDC

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1000 500 250 125 63 31 15 ctr

F3A µg/ml

IL-2 (ng/ml)

Resultados

- 66 -

FIGURA 13 - Ensaio de ativação de células DN32.D3 por macrófagos e células dendríticas

apresentando F3A e F4A. A reação foi incubada por 24 h. A) apresentação de F3A por

macrófagos; B) apresentação de F3A por células dendríticas (BMDC); e C) apresentação de

F4A por células dendríticas BMDC). Como controle foram utilizadas células DN32.D3 e

células apresentadoras sem estímulo. Em A e B o valor do controle foi subtraído das

frações.

Ensaio de ativação de F4A apresentada por BMDC

2,5

56 28 14 7 3,5 1,75 ctr

F4A µg/ml

IL-2 ng/ml

F4A

ctr

Ensaio de ativação de F4A apresentada por BMDC

2,5

56 28 14 7 3,5 1,75 ctr

F4A µg/ml

IL-2 ng/ml

F4A

ctr

Ensaio de ativação de F4A apresentada por BMDC

2,5

56 28 14 7 3,5 1,75 ctr

F4A µg/ml

IL-2 ng/ml

F4A

ctr

Resultados

- 67 -

FIGURA 14 – Produção de IL-4 no ensaio de ativação de células DN32.D3 via CD1d

apresentando F3A e F4A extraídas de células tumorais. Os controles são as células

DN32.D3 incubadas com BMDC na ausência de estímulo. O valor do controle foi subtraído

das frações.

Produção de IL-4 utilizando F3A e F4A

0,1

0,2

0,3

0,4

3,5

1,75

0,87

0,43

3,5

1,75

0,87

ctr

Frações µg/ml

IL-4 ng/ml

F3A

F4A

Resultados

- 68 -

4.10 Inibição da ativação de células DN32.D3 pelo gangliosídeo GM3 adicionado a

células dendríticas de medula óssea (BMDC)

Tendo em vista os efeitos descritos de gangliosídeos sobre a ativação de células

NKT, investigamos as atividades de GM3 incubado por 24 horas com BMDC previamente

a adição de células NKT. Na Figura 15 é mostrado que o gangliosídeo, mesmo nas

menores concentrações inibe a produção basal de IL-2 pelas células NKT.

4.11 Separação de compostos presentes na fração F3A em coluna de sílica

Na tentativa de encontrar moléculas responsáveis pela ativação das células NKT

utilizamos uma coluna de sílica para separação de fase normal por adsorção (Barreto-

Bergter et al., 2004) e a fração F4A foi utilizada para padronização do método devido ao

seu maior rendimento. As amostras foram eluídas em alíquotas de 4 mL de clorofórmio,

acetona e metanol, seqüencialmente aumentando assim a polaridade dos componentes

separados a cada solvente.

Baseado nessa padronização utilizamos o mesmo método com a fração F3A. As

diversas subfrações, eluídas, foram examinadas através de dot-blots revelados com iodo

sublimado, acido orto-fosfórico com sulfato de Cu, orcinol, resorcinol e molibdenio. Os

resultados mostraram que os componentes de F3A eluídos com clorofórmio em coluna de

sílica são possivelmente lipídeos/glicolipídeos menos polares e a eluição com metanol traz

glicolipídeos/fosfolipídeos, mais polares. Os gangliosídeos foram eluídos na transição dos

solventes acetona e metanol, possivelmente carreados juntamente a glicolipídeos com

polaridade intermediária.

As frações resultantes da cromatografia em sílica foram reunidas da seguinte forma:

1-3Cs, 15-22Ac, 23-25Ac e 26-30M. A fração F3A apresentou 4 bandas, reveladas com

iodo, sulfato de cobre/ácido orto-fosfórico e orcinol. A Figura 16 mostra a separação dos

componentes da fração 3A e subfrações reveladas diferencialmente.

Resultados

- 69 -

FIGURA 15. Inibiç ão da ativação de células NKT por GM3 apresentado por células

dendríticas (DC). DCs foram tratadas com GM3 a 5 ng/ml e concentrações menores até

0,035 ng/ml por 24 h, e colocadas em co-cultura com células DN32.D3 NKT por 18 h.

Os sobrenadantes foram analisados por ELISA. Mesmo nas menores concentrações a

inibição da ativação de células NKT (produção de IL-2) foi intensa. Os resultados são

representativos de 3 experimentos independentes.

0,5

1,5

2,5

5 2,5 0,62 0,31 0,15 0,07 0,035 ctr

GM3 comercial ng/ml

IL-2 ng/ml

GM3

ctr

Resultados

- 70 -

A) B) C)

D) E)

FIGURA 16 - Cromatografia em camada fina (HPTLC) da fração F3A e das frações

obtidas após cromatografia em coluna de sílica. As amostras foram diluídas nos mesmos

solventes que foram separados na coluna de sílica e 5 µg a 10 µg foram aplicados. A)

revelação com iodo sublimado; B) revelação com ácido orto-fosfórico; C) revelação com

orcinol; D) revelação com resorcinol; GM3 foi utilizado como controle positivo; E)

revelação com molibdênio. O solvente utilizado para a corrida na placa foi n-

propanol:amônia:água (60:9:11). “a” a “d”, bandas coradas.

F3A

1-3C 15-22Ac 23-25Ac 26-32M

“a”

“b”

“c”

“d”

F3A

1-3C 15-22Ac 23-25Ac 26-32M

“a”

“b”

“c”

“d”

“c”

“d”

“c”

“d”

F3A

1-3C 15-22Ac

23-25Ac 26-32M GM3

“c”

“d”

“c”

“d”

F3A

1-3C 15-22Ac

23-25Ac 26-32M GM3

F3A

“a”

“b”

“c”

“d”

1-3C 15-22Ac 23-25Ac

26-32M

F3A

“a”

“b”

“c”

“d”

1-3C 15-22Ac 23-25Ac

26-32M

F3A

“a”

“b”

“c”

“d”

1-3C 15-22Ac 23-25Ac

26-32M

“a”

“b”

“c”

“d”

F3A 1-3C

15-22Ac

23-25Ac

26-32M

“a”

“b”

“c”

“d”

F3A 1-3C

15-22Ac

23-25Ac

26-32M

“a”

“b”

“c”

“d”

F3A 1-3C

15-22Ac

23-25Ac

26-32M

“c”

“d”

F3A 1-3C 15-22Ac 23-25Ac 26-32M

“c”

“d”

F3A 1-3C 15-22Ac 23-25Ac 26-32M

“c”

“d”

F3A 1-3C 15-22Ac 23-25Ac 26-32M

Resultados

- 71 -

4.12 Ensaio de ativação das células DN32.D3 NKT por subfrações obtidas após a fração

F3A ser submetida à coluna de sílica

As subfrações provenientes da separação de F3A em coluna de sílica foram testadas

a fim de avaliarmos sua capacidade de ativação de células DN32.D3 via CD1d presente em

APCs quantificada através da produção de IL-2 pelas células NKT.

As subfrações de F3A cromatografadas em coluna de sílica foram secas em fluxo de

nitrogênio gasoso e ressuspendidas em acetona para a subfração acetona de F3A após a

coluna de sílica (Ac), em clorofórmio para a subfração clorofórmio (Cs), em metanol para a

subfração metanólica (M ).

Testamos as frações 1-3C (Cs), 22-25Ac (Ac) e 26-32M (M). No ensaio onde a

amostra (Cs), que favoreceu a separação de lipídeos menos polares, ao ser apresentada

pelas células dendríticas levou os hibridomas a produzir IL-2 abaixo de 0,05ng/mL (Figura

17A). A subfração Ac (que favorece a separação de gangliosídeos) promoveu níveis de IL-

2 abaixo do controle, sugerindo inibição da ativação de células NKT. A capacidade de

estimular linfócitos NKT a produzir IL-2 foi detectada na subfração M (Figura 17C), cuja

extração favorece a presença de fosfolipídeos e outros lipídeos de maior polaridade como

glicolipídeos neutros. A concentração de IL-2 chegou a 0,25 ng/mL. Todos os ensaios

foram repetidos mais de 3 vezes e em vários deles notamos que a produção de IL-2

observada para essa subfração era muito próxima dos níveis detectados nos ensaios com a

fração F3A total.

4.13 Análise preliminar dos componentes lipídicos das frações F3A e F4A. Evidência

para a expressão de iGb3 e GM3.

Os dados recentes sobre iGb3 como um possível ligante endógeno de moléculas

CD1, capaz de estimular linfócitos NKT (Zhou et al., 2004) estimulou-nos a verificar se

esse glicolipídeo estaria presente nas frações F3A e F4A e se teria um papel relevante na

Resultados

- 72 -

Subfração de acetona da coluna de sílica

3,3

3,4

3,5

3,6

3,7

3,8

20 5 1 0,1 ctr

Subfração Ac µg/ml

IL-2 ng/ml

ctr

Subfração de acetona da coluna de sílica

3,3

3,4

3,5

3,6

3,7

3,8

20 5 1 0,1 ctr

Subfração Ac µg/ml

IL-2 ng/ml

ctr

Subfração de clorofórmio coluna de sílica

0,02

0,04

0,06

500 50 10 ctr

Subfração Cs µg/ml

IL-2 ng/ml

Resultados

- 73 -

FIGURA 17 - Ensaio de ativação das células DN32.D3 NKT com células dendríticas

apresentando as subfrações de F3A após fracionamento em coluna de sílica. A) subfração

Cs de F3A; B) subfração Ac de F3A; C) subfração M de F3A. Como controle células

DN32.D3 NKT e células dendríticas incubadas sem estímulo.

Subfração metanólica da coluna de sílica

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

100 50 5 2 1 0,1 ctr

Subfrações M µg/ml

IL-2 ng/ml

Resultados

- 74 -

resposta antitumoral. Na Figura 18A observa-se na HPTLC a presença em F3A de um

componente com R

semelhante ao GM3 (indicado pela seta), corado por orcinol e

resorcinol, o que sugere ser um glicolipídeo contendo resíduos de ácido siálico,

característico de gangliosídeos. A presença majoritária de GM3 poderia dificultar a

observação da possível presença de iGb3 na amostra se este fosse minoritário, desta forma,

recorremos à utilização de HPTLCs preparativas usando como padrão iGb3 comercial

purificado (Axxora). Após coloração com iodo sublimado, a faixa de sílica correspondente

ao R

do iGb3 da fração F3A foi coletada por raspagem, combinadas em um tubo e em

seguida os lipídeos ali presentes foram separados da sílica utilizando C-M (1:2), C-M (1:1)

e C-M (2:1) (alternando centrifugações de 3.000rpm por 10 minutos), os sobrenadantes

foram reunidos e secos em nitrogênio gasoso obtendo-se 1 mg de substância.

Essa nova fração, denominada iGb3 F3A, foi submetida a nova cromatografia e

analisada como mostra a Figura 18B, na qual observa-se a presença de um componente em

F3A com R

semelhante ao iGb3 comercial utilizado como controle, corado por orcinol e

não por resorcinol, sugerindo ser um glicolipídeo que não contém resíduos de ácido siálico.

Ainda nessa figura observamos que esse método de separação propiciou a obtenção de uma

amostra enriquecida de iGb3, com ausência de GM3.

O mesmo protocolo foi realizado para a fração F4A, que não apresentou atividade

estimulatória para células NKT. Em F4A também observou-se a presença majoritária de

GM3 e uma presença de menores quantidades de iGb3 (Figuras 19A, B), e obtivemos uma

fração enriquecida denominada iGb3 F4A.

Ambos os produtos obtidos dessas TLCs foram submetidos ao ensaio de

estimulação de células NKT.

4.14 Ensaio de estimulação de células DN32.D3 NKT pelos produtos iGb3F3A e

iGb3F4A

Para o ensaio primeiro utilizamos iGb3 comercial purificado apresentado por

células dendríticas de medula óssea com as concentrações entre 100 µg/ml e 1 µg/ml de

lipídeo. A Figura 20A mostra a titulação nos níveis de IL-2 sendo dose-dependentes à

Resultados

- 75 -

A) B)

FIGURA 18 - Cromatografia de camada fina (HPTLC) da fração F3A. As frações foram

diluídas em clorofórmio-metanol (1:1) na concentração de 1mg/ml e 6 µl foram aplicados.

A) Placa antes da cromatografia preparativa, revelada com orcinol (seta indicando banda

dupla com Rf similar ao Rf de GM3), resorcinol e controles de GM3 e iGb3 comerciais

corados com orcinol; B) Placa após a cromatografia preparativa, revelada com orcinol (seta

identificando banda com Rf semelhante ao Rf de iGb3, antes não visualizada), resorcinol e

controles GM3 e iGb3 corados com orcinol. As placas foram corridas no sistema solvente

clorofórmio-metanol-água (C:M:W) (60:35:8).

Resultados

- 76 -

concentração de iGb3. Com 50 µg/ml obtivemos 3,3 ng/ml interleucina. A amostra iGb3

F3A foi então testada no ensaio de estimulação de células DN32.D3 NKT e o sobrenadante

foi dosado para IL-2. O iGb3F3A foi utilizado nas concentrações de 100 µg/ml a 1 µg/ml e

controle sem o lipídeo. Os níveis de IL-2 foram de quase 50 pg/ml de IL-2 com 25 µg/ml

de lipídeo atingindo o máximo de 58 pg/ml com 5 µg/ml (Figura 20B).

A fração iGb3F4A também foi testada no ensaio de estimulação de células

DN32.D3. Na Figura 20C, o lipídeo na concentração de 25 µg/ml, induziu a produção de

160 pg/ml de IL-2.

4.15 Caracterização de lipídeos presentes em F3A por ESI-LIT-MS (electronspray

ionization-linear ion trap-mass spectrometry)

A fração F3A foi examinada na Universidade do Texas El Paso por Ernesto

Nakayasu e Igor C. Almeida, sendo os lipídeos extraídos, permetilados pelo método de

Ciucano & Kerek (1984), e então examinados por ESI-LIT-MS. Assim como obtido em

uma primeira análise de espectroscopia de massa da fração F3A não metilada, realizada no

ICB da USP, detectou-se grande quantidade de GM3. Foi necessário diluir parte da amostra

em metanol puro, para posteriormente aplicá-la em uma coluna de troca aniônica (strong-

anion-exchange – SAX). Ao lavar a coluna com metanol os glicolipídeos neutros foram

recolhidos e secos em nitrogênio gasoso, para depois serem metilados e analisados. Os

gangliosídeos foram eluídos da coluna com acetato de amônio 250mM preparado em

metanol 100%. Todas as análises descritas a seguir foram com os lipídeos permetilados.

Espécies iônicas com cargas únicas foram observadas na faixa de 1300-1600 m/z

(Figura 21A ). Esses ions eram compatíveis com espécies de GM3 trazendo grupos N-

acetil ou N-glicolilneuramínico (∆MeN-Ac/Me-N-glicolil = 30 m/z) e moléculas lípídicas

diferentes. Para confirmar a predição inicial, o pico majoritário de m/z 1372 (massa

monoisotópica de m/z 1371.8), representando uma espécie iônica com aduto de Na ([M-H

+ 2Na]

) foi submetido a fragmentações MS

e MS

(Figuras 21B, C). O espectro MS

mostra um pico em 996.7 m/z resultante da perda de N-acetilneuramínico (NANA). Dois

outros íons em m/z 824.4 e 449.2 correspondendo a NANA-Hex-Hex com aduto de Na e

Resultados

- 77 -

A) B)

FIGURA 19 – Cromatografia de camada fina (HPTLC) da fração F4A. As frações

foram diluídas em clorofórmio-metanol (1:1) na concentração de 1mg/ml e 6 µl foram

aplicados. A) Placa antes da cromatografia preparativa, revelada com orcinol (seta

indicando banda com Rf similar ao Rf de GM3 e * indicando banda com Rf semelhante

ao Rf de iGb3), resorcinol e controles GM3 e iGb3 comerciais corados com orcinol; B)

Placa após cromatografia preparativa, revelada com orcinol (seta identificando banda com

Rf semelhante ao Rf de iGb3, antes não visualizada), resorcinol e controles GM3 e iGb3

corados com orcinol. As placas foram corridas no sistema solvente clorofórmio- metanol-

água (C-M-W) (60:35:8).

Resultados

- 78 -

Ensaio de estimulação com iGb3 comercial

0,5

1,5

2,5

100 12 3 1 ctr

iGb3 comercial µg/ml

IL-2 (ng/ml)

Ensaio de ativação com fração enriquecida de F3A

100 25 5 1 ctr

iF3A µg/ml

IL-2 (pg/ml)

Resultados

- 79 -

FIGURA 20 - Dosagem de IL-2 após ensaio de ativação das células DN32.D3 NKT por

iGb3 comercial e isolado das frações de melanoma F3A e de F4A. A) Apresentação de

iGb3 comercial por BMDC em diversas concentrações partindo de 100 µg/ml até 1 µg/ml;

B) Apresentação de iGb3 de F3A por células dendríticas (BMDC), nas concentrações de

100 µg/ml, 25 µg/ml , 5 µg/ml e 1 µg/ml; C) Apresentação de iGb3 de F4A por DC nas

concentrações de 50 µg/ml, 25 µg/ml, 10 µg/ml e 5 µg/ml. Como controle (Ctr) foram

utilizadas células DN32.D3 NKT + BMDC sem estímulos.

Ensaio de estimulação com fração enriquecida de

F4A

120

150

180

50 25 10 5 ctr

iF4A µg/ml

IL-2 (pg/ml)

Resultados

- 80 -

GM3

species

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

m/z

100

Relative Abundance (%)

1372

1402

1484

1456

1514

1358

ITMS + p NSI

Full ms

NL: 3.94e6

1428

996.7

824.4

449.2

1341.8

1371.8

[M – NANA + Na]

[M – H

COH + Na]

[NANA-Hex-Hex + Na]

[Hex-Hex + Na]

MS2: 1371.8@55%

NL: 7.60e5

[M + Na]

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

100

Relative Abundance (%)

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

100

Relative Abundance (%)

449.2

966.7

996.7

792.6

548.6

[M – NANA + Na]

[M – NANA – H

COH + Na]

[C34:1(OH)

-Cer – H

O + H]

[Hex-Cer + Na]

[Hex-Hex + Na]

MS3: 1371.8@55% ? 996.7@55%

NL: 2.55e5

+ Na

1371.8 996.7 792.6

548.6

NANA Gal Glc

Cer

824.4

449.2

Resultados

- 81 -

FIGURA 21 ESI-LIT-MS (electrospray ionization-linear ion trap-mass spectrometry)

do glicolipídeo preponderante na fração 3A. A) Espectro MS

de F3A permetilada; B)

Espectro MS

de espécie iônica de única carga ([M –H + 2Na]

) de m/z 1371.8 observada

em (A). C) Espectro MS

da principal espécie iônica derivada em m/z 996.7 observada em

(B). D) Resumo dos fragmentos chave observados nos espectros de MS

e MS

de GM3

permetilado com m/z 1372. A estrutura do GM3, para simplificar está representada sem

permetilação. m/z relação massa/carga. A Figura é reproduzida de nosso trabalho

publicado no Molecular Cancer 2009, 8: 116 (Dias et al., 2009).

Resultados

- 82 -

Hex-Hex, respectivamente, foram observados. Para confirmar a natureza de GM3 no m/z

1372, o íon derivado 996.7 m/z foi submetido a fragmentação MS

(Figura 21C). Os ions

derivados de 792.6 e 548.6 m/z correspondiam a Hex-Cer + Na e C34:1 (OH

) ceramida,

respectivamente, provavelmente contendo esfingosina (d18:1) e ácido palmítico (C16:0). A

Figura 21D mostra os fragmentos principais dos espectros MS

e MS

de GM3 da fração

F3A.

Para a análise dos glicolipídeos neutros, utilizou-se como base o espectro de iGb3

comercial purificado (d18:1; C26:0), permetilado (Figura 22). O iGb3 apresentou m/z

1355 e esse ion foi submetido ao processo de fragmentação multistep gerando m/z 667

(MS

) ? m/z 445 (MS

) ? m/z 371 e 211 (MS

), sendo esses dois últimos fragmentos

marcadores característicos de iGb3. Na primeira fragmentação houve a perda da ceramida

composta por uma cadeia de esfingosina (d18:1) e outra cadeia de ácido graxo saturado

(C26:0); na fragmentação seguinte houve a perda de uma glucose (Glc), sendo o pico m/z

445 correspondente ao dissacarídeo Gala3/4Gal. A abundância relativa máxima (A

max

) de

m/z 371 foi de 100 e para o m/z 211 foi de 79.

Analisando agora os glicolipídeos neutros permetilados da fração F3A, o espectro

da Figura 23A mostra o pico m/z 1215 como o mais abundante. Sua fragmentação (MS

)

gerou o pico m/z 667 devido a perda da ceramida (d18:1; C16:0). Em MS

o pico anterior

gerou m/z 445 (perda de Glc) que após ser fragmentado (MS

) gerou os picos m/z 371, m/z

211, característicos de iGb3 e m/z 329 marcador para Gb3 sendo esse o pico mais

abundante (Figura 23B). Para estimar a abundância de iGb3 na amostra, calculamos

inicialmente a abundância corrigida de um pico, A(iGb3)corr = A(iGb3) esperado/ A(iGb3)

max., para esse caso A(iGb3 padrão)

211

corr = 1.27.

Para A(iGb3 amostra) é necessário o seguinte cálculo:

A(iGb3)

amostra

= (A(iGb3)

211corr +

A(iGb3)

371

) / [A(iGb3)

211corr

+ A(iGb3)

371

+ 2x A(Gb3)

329

ou seja (1,65+3,4) / [1,65+3,4+ (2x 100)] = 0.025 ( 2,5% ) (Figura 23C).

A presença de iGb4 e Gb4 da fração F3A foi caracterizada através dos espectros de

ESI-LIT-MS mostrados na Figura 24. O íon mais abundante tinha m/z 1460. Ao ser

fragmentado diversas vezes obtivemos os picos m/z 912 (MS

) ? m/z 690 (MS

)? m/z

431 (MS

) ? m/z 369, m/z 357, m/z 329 e m/z 315 (MS

) (Figura 24B), que referem-se a

perda de ceramida com ácido palmítico (MS

), perda de uma glucose (MS

), perda de N-

Resultados

- 83 -

FIGURA 22 – ESI-LIT-MS de iGb3 comercial permetilado. A partir de m/z 1355, a

fragmentação MS

gerou m/z 667, marcador de Gb3 e iGb3. MS

do ion derivado de MS

m/z 445, gerou fragmentos característicos de iGb3 com m/z 371 e m/z 211.

Marcadores de iGb3

MS4 do pico m/z 445 de iGb3 comercial

Abundância relativa

Marcadores de iGb3

MS4 do pico m/z 445 de iGb3 comercial

Marcadores de iGb3

MS4 do pico m/z 445 de iGb3 comercial

Abundância relativa

Resultados

- 84 -

Glicoesfingolipídeos neutros (iGb3 e Gb3) encontrados em F3A

Abundância relativa

m/z

Glicoesfingolipídeos neutros (iGb3 e Gb3) encontrados em F3A

Abundância relativa

m/z

marcador

(1,3%)

marcador

(3,4%)

marcador

(100%)

MS4 do pico m/z 445 encontrado em F3A

Abundância relativa

marcador

(1,3%)

marcador

(3,4%)

marcador

(100%)

MS4 do pico m/z 445 encontrado em F3A

marcador

(1,3%)

marcador

(3,4%)

marcador

(100%)

MS4 do pico m/z 445 encontrado em F3A

Abundância relativa

Resultados

- 85 -

FIGURA 23 – ESI-LIT-MS de glicoesfingolipídeos neutros permetilados da fração

F3A. Os glicolipídeos neutros da amostra F3A foram depletados de GM3 em coluna SAX.

A) Espectro MS

da amostra indica o pico majoritário m/z 1215; a estrutura de iGb3 é

mostrada ao lado com indicação das ligações glicosídicas e clivagem por glicosidases; B)

fragmentação do pico m/z 1215 (MS

) ? m/z 667 (MS

) ? m/z 445 (MS

) ? m/z 211

(iGb3), m/z 371 (iGb3) e m/z 329 (Gb3) (MS

). Os picos característicos de iGb3 estão

indicados com os valores m/z 371 e m/z 211 e de Gb3 corresponde a m/z 329, confirmando

presença de iGb3 e de Gb3 na fração F3A. C) Equações que permitem quantificar iGb3

presente na amostra em função da resposta de iGb3 padrão e presença majoritária de Gb3.

Resultados

- 86 -

FIGURA 24 – ESI-LIT-MS de glicoesfingolipídeos neutros permetilados da fração

F3A. Os glicolipídeos neutros da amostra F3A foram depletados de GM3 em coluna SAX.

A) Espectro MS

da amostra indica o pico majoritário m/z 1460; a estrutura de iGb4 é

mostrada ao lado com indicação das ligações glicosídicas e clivagem por glicosidases; B)

fragmentação do pico m/z 1460 (MS

) ? m/z 912 (MS

) ? m/z 690 (MS

) ? m/z 431

(MS

) ? m/z 329 (iGb4), m/z 357 (iGb4), m/z 369 (iGb4) e m/z 315 (Gb4) (MS

). Os picos

característicos de iGb4 estão indicados com os valores m/z 329, m/z 357, m/z 369 e de Gb4

corresponde a m/z 315, confirmando presença de iGb4 e de Gb4 na fração F3A.

Abundância relativa

Glicoesfingolipídeos neutros (iGb4 e Gb4) encontrados em F3A

m/z

Abundância relativa

Glicoesfingolipídeos neutros (iGb4 e Gb4) encontrados em F3A

m/z

marcador

(2,5%)

marcador

(1,4%)

marcador

(2,7%)

marcador

(100%)

MS5 do pico m/z 431 encontrado em F3A

Abundância relativa

marcador

(2,5%)

marcador

(1,4%)

marcador

(2,7%)

marcador

(100%)

MS5 do pico m/z 431 encontrado em F3A

marcador

(2,5%)

marcador

(1,4%)

marcador

(2,7%)

marcador

(100%)

MS5 do pico m/z 431 encontrado em F3A

Abundância relativa

Resultados

- 87 -

acetilgalactosamina (MS

), sobrando um dissacarídeo Gala1/4Gal ou Gala1/3Gal. Os picos

resultantes de MS

m/z 369, m/z 357 e m/z 329 são marcadores característicos de iGb4

enquanto m/z 315 é marcador de Gb4. Diferente da análise de MS da Figura anterior

(mistura de iGb3/Gb3), a análise da mistura iGb4/Gb4 não permite uma análise

quantitativa.

4.16 Ensaio de Citometria de fluxo de células dendríticas incubadas com a-GalCer e

iGb3

DCs 5x10

foram primadas com 100 ng/ml de a-GalCer e com 1 µg/ml de iGb3 por

24 horas. Após esse período as células foram recolhidas e incubadas com anticorpos anti-

CD1d-FITC, CD80-PE, CD86-PE, MHCII-FITC, MHCI-FITC e CD11c-PE, para análise

por citometria de fluxo.

Na Figura 25 observa-se que as células dendríticas cultivadas com a-GalCer e com

iGb3 apresentaram CD1d aumentado significativamente de 34,2% (controle) para 62,5% e

60,3% respectivamente. Os demais marcadores mantiveram o mesmo nível de expressão

que o controle não tratado.

4.17 Ensaio de citotoxicidade in vitro de células NKT estimuladas com iGb3 contra

células B16F10-Nex2

Células DN32.D3 NKT ativadas por células dendríticas de medula óssea primadas

ou não com 20 µg/ml de iGb3 foram co-cultivadas por 4 horas com células B16F10-Nex 2.

As células tumorais foram incubadas por 24 horas com [

H] Timidina. As células efetoras

(NKT) foram adicionadas nas razões de 1/12 até 1/400 célula alvo (target, T)/célula efetora

(E).

Nas relações 1/100 (T/E) e 1/200 (T/E) ocorreu 40% de lise das células tumorais

(Figura 26) subtraindo-se a lise controle (células NKT não estimuladas com lipídeo).

Resultados

- 88 -

FIGURA 25 – Análise de marcadores de superfície de células dendríticas murinas

maturadas a partir de precursores de medula óssea por citometria de fluxo (FACS). Células

controle (ctr), primadas com 100 ng/ml de a-GalCer ou com 1µg/mL de iGb3. Anticorpos

marcados com FITC ou PE.

Marcadores de superfície

CD1d CD80 CD86 MHCII MHCI CD11c

valor em %

ctr

a-GalCer

100ng/mL

iGb3

1µg/mL

Resultados

- 89 -

FIGURA 26 – Células DN32.D3 NKT ativadas por células dendríticas de medula óssea

primadas ou não com 20 µg/ml de iGb3 foram co-cultivadas por 4 horas com células

B16F10-Nex 2. As células de B16F10-Nex 2 foram previamente incubadas com [

timidina por 24 horas. Melanoma e células NKT foram co-cultivadas na razão de células

alvo/efetora conforme indicado e o efeito citotóxico foi medido pelo efeito lítico, como

descrito em Materiais e Métodos.

Citotoxicidade de células NKT contra B16F10-Nex 2

1/12 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400

Relação de células alvo/efetora

Lise (%)

Resultados

- 90 -

4.18 Proteção anti-tumoral in vivo conferida por células dendríticas de medula óssea

primadas com iGb3 e a-GalCer

Camundongos foram injetados intravenosamente com 1x10

células de melanoma

murino B16F10-Nex2 em 100µl/animal para desenvolvimento de metástases pulmonares.

Esses animais foram então tratados com 5x10

BMDC não estimuladas ou primadas com

iGb3 (20 µg/ml) ou com a-GalCer (200 ng/ml) nos dias 2 e 4 após o desafio com células de

melanoma.

Na Figura 27A notamos que tanto os animais tratados com BMDC tratadas com

iGb3 como com a-GalCer tiveram cerca de 4x menos nódulos quando comparados aos

animais controle, tratados com as células BMDC sem estímulo. Na Figura 27B pulmões

com os nódulos pulmonares estão apresentados, representativos desse tipo de experimento.

Esses resultados demonstraram claramente que no ensaio de terapia celular com

BMDCs ambos os lipídeos utilizados estimularam uma resposta anti-tumoral, dependente

de células NKT, protetora contra o melanoma murino.

Resultados

- 91 -

FIGURA 27 - A) Proteção in vivo por BMDCs primadas com a-GalCer (200 ng/ml) ou

iGb3 (20 µg/ml) contra a colonização pulmonar por células de melanoma murino B16F10-

Nex 2 (1x10

) injetadas i.v. em camundongos C57Bl/6 (5 animais/grupo). BMDC

incubadas ou não com glicolipídeos foram administradas nos dias 2 e 4 depois do desafio.

Ctr, controle, BMDC naive não estimuladas; B) nódulos tumorais encontrados nos pulmões

murinos após 21 dias da injeção tumoral, e representativos do experimento. Os

experimentos são representativos de pelo menos 2 experimentos independentes. *p<0.05,

comparado ao controle.

Ensaio in vivo de metátase pulmonar

100

150

200

250

ctr a-GalCer iGb3

Grupos tratados

No. de nódulos pulmonares

ctr iGb3 (20

g/ml)

GalCer (200ng/ml)

ctr iGb3 (20

GalCer (200ng/ml)

Discussão

- 92 -

5. DISCUSSÃO

A resposta imune protetora contra o câncer envolve células efetoras e anticorpos.

Entre as células efetoras grande destaque tem sido dado aos linfócitos citotóxicos T-CD8

utilizando-se antígenos específicos apresentados por MHC classe I para esquemas de

vacinação principalmente através de terapia gênica (Yuan et al., 2009; Saenger et al.,

2008). No presente trabalho, observamos que células NKT restritas a CD1d são importantes

na resposta antitumoral, baseado no desenvolvimento acelerado do melanoma B16F10-

Nex2 em animais deficientes homozigotos (knock-out) para CD1d. Linfócitos iNKT,

possuem um TCR invariante e apresentam marcadores NK1.1 na sua superfície (Taniguchi

et al, 2003). Essas células têm sido amplamente estudadas nas doenças infecciosas,

autoimunes e na atividade modulatória do câncer. Elas fazem uma ponte entre a resposta

imune inata e a adaptativa podendo ser ativadas por células apresentadoras de antígenos,

que expressam CD1, semelhante a MHC classe I, mas ligando-se às moléculas lipídicas e

glicolipídicas. A ativação de células NKT pode levar a uma resposta antitumoral (Brigl &

Brenner, 2004).

Smyth et al., 2000, observaram a rejeição tumoral quando células iNKT foram

ativadas por um ligante tumoral não identificado promovendo uma resposta imune

adaptativa CD4

CD8

. Várias moléculas lipídicas foram identificadas capazes de ser

apresentadas por CD1. Entre elas, por exemplo estão as moléculas lipídicas de

Mycobacterium tuberculosis, apresentadas por CD1a, CD1b e CD1c.

Em nosso trabalho, investigamos a molécula lipídica de melanoma que fosse

reconhecida por linfócitos NKT ativando-os e assim, desencadeando uma resposta imune

antitumoral. Frações de natureza lipídica foram obtidas através da extração de tumores

crescidos in vivo e extraídos de forma estéril. Confirmamos que esses extratos estavam

livres de contaminação por Mycoplasma sp. ou outras bactérias, os quais poderiam

introduzir componentes de natureza lipídica que interfeririam com nossos estudos. Os

tumores passaram por três diferentes processos de extração, originando várias frações, que

Discussão

- 93 -

foram cromatografadas em HPTLC e testadas no ensaio de ativação das células DN32.D3

NKT.

De todas as frações obtidas, somente a fração F3A, gerada pelo Protocolo A de

extração, pareceu ser promissora, pois ativou células NKT, através da apresentação por

CD1d de seus componentes lipídicos, a produzir quantidades significantes de IL-2. Essa

ativação foi comparada com a das mesma células incubadas com α-GalCer. As demais

frações obtidas, com exceção de F3C, apresentadas por fibroblastos-CD1d ou células

dendríticas de medula óssea (BMDC) reduziram a produção basal de IL-2 das células NKT

sugerindo a presença de componentes inibitórios nessas frações. F3C quando incubada por

24 horas com fibroblastos-CD1d ativou os linfócitos NKT a secretarem IL-2, mas em

menor grau que F3A.

A separação de F3A por HPTLC forneceu bandas reveladas com orcinol e

resorcinol, sugerindo que essa fração contenha gangliosídeos. Uma dessas bandas tinha um

semelhante ao do gangliosídeo GM3. Esse gangliosídeo foi efetivamente caracterizado

na fração por espectrometria de massa (ESI-LIT-MS) de sua forma permetilada, contendo

uma base de esfingosina (d18:1) e ácido palmítico (C16:0). Moléculas de GM3 com ácido

N-acetil ou N-glicolilneuramínico foram identificadas.

Ao contrário dos resultados de Wu et al., 2003, que sugeriram a apresentação de

GD3 para ativação de células NKT, a incubação com GM3 (gangliosídeo majoritário do

melanoma murino) inibiu a produção de IL-2 por células NKT. Esses resultados são

corroborados pelos de Park et al., 2008, que mostraram que GM3 tem atividade inibitória

em células NKT. Essa característica inibitória de gangliosídeos tem sido geralmente aceita,

considerando-se mesmo que os gangliosídeos são imunossupressores e estão presentes em

altas concentrações em células tumorais. Anticorpos monoclonais como o R24 mostraram-

se ativos contra células de melanoma humano e não contra células normais devido a

hiperexpressão de gangliosídeos, particularmente GD3 e GM3 nas células tumorais (Pukel

et al., 1982).

A separação dos componentes da fração reativa F3A foi ensaiada utilizando-se uma

coluna de sílica de fase normal eluída seqüencialmente com 3 solventes, clorofórmio,

acetona e metanol. As frações foram reunidas de acordo com a presença de lipídeos (reação

com iodo sublimado) na eluição com cada solvente e testadas no ensaio de estimulação de

Discussão

- 94 -

células DN32.D3 NKT. A amostra oriunda da eluição com clorofórmio estimulou baixa

produção de IL-2, enquanto a eluição com acetona, trazia gangliosídeos que como foi visto

inibiam a produção basal de IL-2. Ao contrário, nas amostras eluidas com metanol,

detectamos a ativação das células NKT, produzindo níveis de IL-2 semelhantes aos obtidos

com a fração F3A. Esses resultados eram compatíveis com a presença de fosfolipídeos e/ou

glicolipídeos neutros como candidatos à ativação de células iNKT.

Em 2004 Zhou et al. demonstraram que animais deficientes na subunidade b da

enzima ß-hexosaminidase apresentaram redução de 95% das células NKT incluindo todas

as suas subpopulações. Essa enzima, presente em células dendríticas, é responsável por

remover resíduos ß-GalNAc (N-acetilgalactosamina) que são encontrados em

glicoesfingolipídeos da ganglio-series, globo e isoglobo-series. Ao sintetizar moléculas

características de cada grupo somente o isoglobosil iGb3 (isoglobotrihexosilceramida) foi

capaz de estimular e promover a expansão de células NKT humanas. Nesse trabalho os

autores sugeriram que iGb3 possa ser um ligante endógeno de Vα14 murino.

Ainda não havia sido descrito o isolamento de iGb3 a partir de linhagens tumorais, e

pouco ainda está esclarecido sobre a relação entre tumor e iGb3 ou seu precursor iGb4.

Empenhamo-nos então em verificar se a fração F3A poderia conter esse glicolipídeo.

Preliminarmente, mostramos em immunostaining (reação de dot-blotting) que a fração F3A

reagia com Bandeiraea simplicifolia (BS-I) da mesma forma que iGb3 padrão. Essa lectina

reconhece resíduos de α-galactosil terminais como os presentes em iGb3. Reações

similares nos cromatogramas não foram detectadas provavelmente pela pequena quantidade

desse glicolipídeo (resultados não mostrados).

Utilizamos então uma HPTLC preparativa para tentar isolar iGb3 das frações F3A e

F4A, mesmo não sendo esse componente detectado na primeira fração. Após a

cromatografia preparativa submetamos as amostras obtidas a nova HPTLC e detectamos a

presença do glicolipídeo (provavelmente Gb3 e iGb3) em ambas as frações. Tanto o iGb3

comercial purificado, como o iGb3 de F3A e F4A obtidos das TLCs preparativas foram

capazes de ativar células NKT murinas medido pela produção de IL-2.

A confirmação da natureza química desses glicoesfingolipídeos identificados nas

frações F3A e F4A foi feita utilizando-se espectrometria de massas, inicialmente no ICB da

USP (amostras não metiladas) e em seguida no The Border Biomedical Research Center,

Discussão

- 95 -

University of Texas El Paso, em colaboração com Igor C. Almeida e Ernesto S. Nakayasu,

utilizando ESI-LIT-MS com todos glicolipídeos extraidos na forma permetilada. No

conjunto, essas análises mostraram a presença predominante de GM3 com diferentes

cadeias de ácidos graxos, mas predominando ácido palmítico (C16:0) ligado a esfingosina

(d18:1). A alta quantidade de GM3 na fração F3A dificultava a detecção de outras espécies

lipídicas presentes em menor concentração. A melhor solução foi a separação de lipídeos

carregados e neutros utilizando uma coluna forte de troca aniônica (SAX), onde o

gangliosídeo fica preso na resina e os glicoesfingolipídeos neutros passam direto pela

coluna. Os glicolipídeos neutros foram então permetilados e examinados por ESI-LIT-MS.

Após multifragmentações do ion majoritário m/z 1215 detectamos fragmentos

característicos de iGb3 (m/z 211 e 371), e de Gb3 (m/z 329). Das multifragmentações

sofridas pelo ion m/z 1460 encontramos marcadores característicos de iGb4 (m/z 329, m/z

357 e m/z 369 de pequena abundância) e o marcador de Gb4 (m/z 315 de grande

abundância). Esses resultados mostram, pois que além da expressão predominante de GM3

contendo ácidos N-acetil e N-glicolilneutramínico, as células de melanoma B16F10-Nex2

sintetizam a série de globosidios, Gb3 e iGb3, Gb4 e iGb4, sendo as formas iso presentes

em quantidades bem inferiores às formas globo.

A análise fenotípica de células dendríticas incubadas por 24 horas com a-GalCer e

iGb3 foi igualmente explorada. Apesar de moléculas como MHC I, CD86 e CD80 não

apresentassem alterações significativas foi observado aumento na expressão de CD1d, de

34,2% do controle para 62,5% para a-GalCer e 60,4% para iGb3. Esse resultado é relevante

pois está associado a maior apresentação dos glicolipídeos ligantes, e pode se traduzir em

uma resposta antitumoral mais eficiente mediada por células iNKT.

A atividade citotóxica das células NKT estimulados com iGb3 contra as células

B16F10-Nex 2 foi ensaiada a seguir. Através de microscopia de fluorescência observamos

que células NKT ativadas com a-GalCer ou iGb3 rodeavam preferentemente as células

tumorais sugerindo uma interação entre as duas populações (resultados não mostrados).

Essa interação resultou em lise das células de melanoma medida utilizando-se células

tumorais marcadas com timidina. Após a realização do ensaio notamos que as células

efetoras estimuladas com iGb3, provocaram nas condições do experimento, 40% de lise das

células tumorais comparado ao ensaio onde células NKT não foram estimuladas. Esse

Discussão

- 96 -

resultado é bastante relevante, e provavelmente melhores condições para otimização das

respostas líticas podem ser alcançadas.

No modelo de melanoma metastático, utilizando-se um desafio endovenoso de

células tumorais, vimos que células CD11

CD1d

provenientes de medula óssea incubadas

com 20µg/ml de iGb3 reduziu em 75% o número de metástases no pulmão de

camundongos. O mesmo foi visto quando essas células foram estimuladas com a-GalCer

(200ng/ml). A apresentação de iGb3 e seu reconhecimento pode levar à proteção contra o

tumor, provavelmente mediada por células iNKT e em decorrência dessa reatividade

levando a uma resposta concomitante do tipo Th-1. Em termos de atividade funcional α-

GalCer é 100 vezes mais ativo que iGb3. Contudo em condições naturais α-GalCer não é

produzido em mamíferos embora não esteja excluída a sua produção por bacterias da flora

indígena. Ao contrário, isoglobosídeos são expressos em células de mamíferos e células

tumorais. Como iGb3 e iGb4 são moléculas efetoras naturais, elas podem ser liberadas no

microambiente tumoral e serem processadas e apresentadas por células dendríticas aos

linfócitos NKT, e esses reagirem contra o tumor e adicionalmente estimularem outras

células do sistema imunológico devido à produção de diversas citocinas. Gangliosídeos

como GM3 podem levar a um balanço da resposta ativadora e inibir essa estimulação

representando, pois um mecanismo de escape do tumor.

Como já foi referido anteriormente, o estímulo de células iNKT por α-GalCer é tão

forte que induz a anergia. Por outro lado o estímulo por α-GalCer pode levar a respostas

mixtas secundárias do tipo Th-1 e Th-2 diminuindo a sua eficácia. Modificações químicas

tem, por essa razão sido feitas tanto no α-GalCer como em iGb3 para aumentar a sua

eficácia e especificidade da resposta imunológica (Shang et al., 2008).

É possivel que outros componentes lipídicos presentes no melanoma murino possam

ativar células NKT. Análises mais completas da fração lipídica dessas células será

necessária para identificá-los. Há uma dificuldade em determinar a atividade estimulatória

de componentes em misturas que envolvam GM3 ou outras moléculas lipídicas inibitórias

que possam camuflar seus efeitos.

Conclusões

- 97 -

6. CONCLUSÕES

No presente trabalho, mostramos que células NKT restritas a CD1d tem um papel

importante na imuno vigilância contra o desenvolvimento de tumores, e em nosso caso

melanoma murino B16F10-Nex 2. Na procura de ligantes endógenos de CD1d em células

apresentadoras, especialmente dendríticas de medula óssea, extraimos glicolipídeos das

células de melanoma murino B16F10-Nex2 desenvolvendo-se in vivo, e identificamos que

uma fração, F3A, era capaz de ativar células NKT do hibridoma DN32.D3 a secretar IL-2.

Essa fração F3A foi investigada por cromatografia em coluna de silica e HPTLC

preparativa identificando-se espécies de glicolipídeos acídicos, em particular gangliosídeo

GM3, e neutros, como Gb3/iGb3. Através de ESI-LIT-MS dessas espécies permetiladas,

caracterizou-se GM3, com esfingosina e ácido palmítico, e com N-acetil e N-

glicolilneuramínico. Na fração de glicolipídeos neutros foram caracterizados Gb3 e iGb3,

Gb4 e iGb4. Células dendríticas primadas com iGb3 ativaram celulas NKT a produzir IL-2

da mesma forma que a fração F3A. GM3 consistentemente apresentou um efeito inibitório

da ativação de células NKT. Dessa forma, o crescimento tumoral in vivo pode depender do

balanço entre essas moléculas ativadoras e inibitórias da resposta imune.

Ensaios de citotoxicidade mostraram que células iNKT ativadas com iGb3 foram

capazes de lisar in vitro células de melanoma murino B16F10-Nex2. Adicionalmente,

terapia celular com células dendríticas primadas com iGb3 ou α-GalCer exerceram

significante efeito protetor contra melanoma murino metastático com redução dos nódulos

pulmonares em até 75%.

Esses dados reforçam a idéia de que iGb3 e seu precursor iGb4 podem ser

ativadores endógenos de células NKT, com efeito protetor contra o melanoma e

potencialmente outros tumores. A terapia celular com células dendríticas primadas com

iGb3 demonstra pela primeira vez que esse isoglobosídeo pode ter um papel na resposta

imune antitumoral. Não se descarta a possibilidade de outros mediadores, inclusive com

estruturas “estendidas” similares a iGb3, participarem na ativação de células NKT.

Conclusões

- 98 -

Nossos resultados estimulam novas investigações visando o uso de iGb3 e de

derivados eventualmente mais eficientes na imunofarmacologia do melanoma e de outros

tumores.

Referências Bibliográficas

- 99 -

8. REFERÊNCIAS

Apostolou I, Takahama Y, Belmant C, et al. 1999. Murine natural killer (NKT) cells

contribute to the granulomatous reaction caused by mycobacterial cell walls. Proc Natl

Acad Sci USA. 96: 5141-5146.

Azuma T, Takahashi T, Kunisato A, Kitamura T, Hirai H. 2003. Human CD4+

CD25+ regulatory T cells suppress NKT cell functions. Cancer Res. 63(15): 4516-4520.

Baker CV, Bronner-Fraser M, Le Douarin NM, Teillet MA. 1997. Early-and late-

migrating cranial neural crest cell populations have equivalent developmental potential in

vivo. Development. 124: 3077–3087.

Behar SM, Dascher CC, Grusby MJ, Wang CR, Brenner MB. 1999. Susceptibility

of mice deficient in CD1d or TAP1 to infection with Mycobacterium tuberculosis. J Exp

Med. 189: 1973-1980.

Bendelac A. 1995. Positive selection of mouse NK1+ T cells by CD1-expressing

cortical thymocytes. J Exp Med. 182: 2091-2096.

Brigl M, Brenner MB. 2004. CD1: antigen presentation and T cell function. Annu

Rev Immunol. 22: 817-890.

Brodskyn C, Patricio J, Oliveira R, Lobo L, Arnholdt A, Mendonça- Previato L,

Barral A, Barral-Netto M. 2002. Glycoinositolphospholipids from Trypanosoma cruzi

interfere with macrophages and dendritic cell responses. Infect Immun. 70(7): 3736-3743.

Bronnum H, Seested T, Hellgren LI, Brix S, Frokiaer H. 2005. Milk-derived GM(3)

and GD(3) differentially inhibit dendritic cell maturation and effector functionalities. Scand

J Immunol. 61(6): 551-557.

Referências Bibliográficas

- 100 -

Brossay L, Naidenko O, Burdin N, Matsuda J, Sakai T, Kronenberg N. 1998.

Structural requirements for galactosylceramide recognition by CD1-restricted NKT cells. J

Immunol. 161: 5124-5128.

Brutkiewicz RR and Sriram V. 2002. Natural killer T (NKT) cells and their role in

antitumor immunity. Crit Rev Oncol/Hematol. 41: 287-298.

Brutkiewicz RR. 2006. CD1d ligands: the good, the bad, and the ugly. J Immunol.

177: 769–775.

Calabi, F, Milstein, C. 1986. A novel family of human major histocompatibility

complex-related genes not mapping to chromossome 6. Nature. 323: 540-543.

Campos, MA, Almeida, IC, Takeuchi, O, Akira, S, Valente, EP, Procopio, DO,

Travassos, LR, Smith, JA, Golenbock, DT, Gazzinelli, RT. 2001. Activation of Toll-like

receptor-2 by glycosylphosphatidylinositol anchors from a protozoan parasite. J Immunol.

167: 416-423.

Cardell, SL. 2006. The natural killer T lymphocyte: a player in the complex

regulation of autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice. Clin Exp Immunol. 143(2):

194-202. Review.

Chackerian, A, Alt, J, Perera, V, Behar, SM. 2002. Activation of NKT cells protects

mice from tuberculosis. Infect. Immun. 17: 6302-6309.

Champagne E, Martinez LO, Vantourout P, Collet X, Barbaras R. 2005. Role of

apolipoproteins in gammadelta and NKT cell-mediated innate immunity. Immunol Res.

33(3): 241-55

Referências Bibliográficas

- 101 -

Christiansen D, Milland J, Mouhtouris E, Vaughan H, Pellicci DG, McConville

MJ, Godfrey DI, Mauro S. Sandrin MS. 2008. Humans lack iGb3 due to the absence

of functional iGb3-synthase: Implications for NKT cell development and transplantation.

PLoS Biol. 6: 1527-1538.

Chudnovsky Y, Khavari PA, Adams AE. 2005 Melanoma genetics and the

development of rational therapeutics. J Clin Invest. 115(4): 813-24. Review

Ciucanu I, & Kerek F. 1984. A simple and rapid method for the permethylation of

carbohydrates. Carbohydrate Research. 131: 209–217.

Ciucanu I. 2003. Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation

of carbohydrates. J Am Chem Soc. 125(52): 16213-9.

Coutant, F, Perrin-Cocon, L, Agaugue, S, Delair, T, Andre, P, Lotteau, V. 2002.

Mature dendritic cell generation promoted by lysophosphatidylcholine. J Immunol. 169:

1688-1695.

Crowe

NY, Coquet JM, Berzins

SP, Kyparissoudis

K, Keating

R, Pellicci

DG,

Hayakawa

Y, Godfrey

DI and Smyth

MJ. 2005. Differential antitumor immunity mediated

by NKT cell subsets in vivo. J Exp Med. 202(9): 1279-1288

Cui, J, Shin, T, Kawano, T, et al. 1997. Requirement for Va14 NKT cells in IL-12-

mediated rejection of tumors. Science 278: 1623-1626.

de León J, Fernández A, Mesa C, Clavel M, Fernández LE. 2006. Role of tumour-

associated N-glycolylated variant of GM3 ganglioside in cancer progression: effect over

CD4 expression on T cells. Cancer Immunol Immunother. 55: 443-450.

Referências Bibliográficas

- 102 -

Dias BR, Rodrigues EG, Nimrichter L, Nakayasu ES, Almeida IC, Travassos LR.

2009. Identification of iGb3 and iGb4 in melanoma B16F10-Nex2 cells and the iNKT cell-

mediated antitumor effect of dendritic cells primed with iGb3. Mol Cancer. 8: 116-130.

Fidler, IJ. 1975. Biological behaviour of malignant melanoma cells correlated to

their survival in vivo. Cancer Res. 35: 218-224.

Fischer K, Scotet E, Niemeyer M, Koebernick H, Zerrahn J, Maillet S, Hurwitz R,

Kursar M, Bonneville M, Kaufmann SH, Schaible UE. 2004. Mycobacterial

phosphatidylinositol mannoside is a natural antigen for CD1d-restricted T cells. Proc Natl

Acad Sci. 101(29): 10685-90.

Giabbai B, Sidobre S, Crispin MD, Sanchez-Ruiz Y, Bachi A, Kronenberg M, et al.

2005. Crystal structure of mouse CD1d bound to the self ligand phosphatidylcholine: a

molecular basis for NKT cell activation. J Immunol. 175: 977–984.

Giaccone G, Punt CJ, Ando Y, Ruijter R, Nishi N, Peters M, von Blomberg BM,

Scheper RJ, van der Vliet HJ, van den Eertwegh AJ, Roelvink M, Beijnen J, Zwierzina H,

Pinedo HM. 2002. A phase I study of the natural killer T-cell ligand alpha-

galactosylceramide (KRN7000) in patients with solid tumors. Clin Cancer Res. 8(12):

3702-3709.

Godfrey, DI, and Kronenberg, M. 2004. Going both ways: immune regulation via

CD1d-dependent NKT cells. J Clin Invest. 114: 1379–1388.

Gonzalez-Asseguinoloza, G, Oliveira, C, Tomaska, M, Hong, S, Bruna-Romero, O,

et al. 2000. Alpha-galactosylceramide-activated Valpha 14 natural killer T cells mediated

against murine malaria. Proc Natl Acad Sci. 97: 8461-8466.

Gray-Schopfer V, Wellbrock C, Marais R. 2007. Melanoma biology and new

targeted therapy. Nature. 445(7130): 851-857. Review.

Referências Bibliográficas

- 103 -

Gumperz, JE, Roy, C, Makowska, A, Lum, D, Sugita, M, et al. 2000. Murine CD1d-

restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12: 211-221.

Hebeler-Barbosa F, Rodrigues EG, Puccia R, Caires ACF, Travassos LR. 2008.

Gene therapy against murine melanoma B16F10-Nex2 using IL-13Ra2-Fc chimera and

interleukin 12 in association with a cyclopalladated drug. Trans Oncol 1: 110-120.

Houghton AN, Mintzer D, Cordon-Cardo C, Welt S, Fliegel B, Vadhan S, Carswell

E, Melamed MR, Oettgen HF, and Old LJ. 1985. Mouse monoclonal IgG3 antibody

detecting GD3 ganglioside: A phase I trial in patients with malignant melanoma. Proc Natl

Acad Sci USA 82: 1242-1246.

Instituto Nacional de Câncer http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/

tiposdecancer/site/home/pele_melanoma/definicao

Ishikawa, H, Hisaeda, H, Taniguchi, M, Nakayama, T, Sakai, T, et al. 2000. CD4(+)

v(alpha)14 NKT cells play a crucial role in an early stage of protective immunity against

infection with Leishmania major. Int Immunol. 12: 1267-1274.

Ishikawa A, Motohashi S, Ishikawa E, Fuchida H, Higashino K, Otsuji M, Iizasa T,

Nakayama T, Taniguchi M, Fujisawa T. 2005. A phase I study of alpha-galactosylceramide

(KRN7000)-pulsed dendritic cells in patients with advanced and recurrent non-small cell

lung cancer. Clin Cancer Res. 11(5): 1910-1917.

Kawamura T, Takeda K, Mendiratta SK, Kawamura H, Van Kaer L, Yagita H, Abo

T, Okumura K. 1998. Critical role of NK1+ T cells in IL-12-induced immune responses in

vivo. J Immunol. 160(1): 16-19.

Kinjo Y, Wu D, Kim G, Xing GW, Poles MA, et al. 2005. Recognition of bacterial

glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature 434: 520-525.

Referências Bibliográficas

- 104 -

Kronenberg M. 2005. Toward an Understanding of NKT cell biology: progress and

paradoxes. Annu Rev Immunol. 26: 877-900.

Ladisch S, Kitada S, Hays EF. 1987. Gangliosides shed by tumor cells enhance

tumor formation in mice. J Clin Invest. 79: 1879-1882.

Li,Y, Teneberg S, Thapa P, Bendelac A, Levery SB, Zhou D. 2008a. Sensitive

deteccion of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in humam thymus by íon

trap mass espectrometry. Glycobiology. 18: 151-165.

Li Y, Zhou D, Xia C, Wang PG, Levery SB. 2008b. Sensitive quantification of

isoglotriaosylceramides in the presence of isobaric components using eletrospray

ionization-ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18: 166-176.

Li Y, Thapa P, Hawke D, Kondo Y, Furukawa K, Furukawa K, Hsu F-F,

Adlercreutz D, Weadge J, Palcic MM, Wang PG, Levery SB, Zhou D. 2009. Immunologic

glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus. J Proteome Res 8:

2740-2751.

Liliom K, Sun G, Bunemann M, Virag T, Nusser N, Baker DL, Wang D. et al. 2001.

Sphingosylphosphocoline is a naturally occurring lipid mediator in blood plasma: a

possible role in regulating cardiac function via sphingolipid receptors. Biochem J. 355: 189-

197

Livingston P. 1998. Ganglioside vaccines with emphasis on GM2. Semin Oncol. 25:

636-645.

Mandala SM, Thornton R, Galve-Roperh I, Poulton S, Peterson C, Olivera, A, et al.

2000. Molecular cloning and characterization of a lipid phosphohydrolase that degrades

sphingosine-1-phosphate and induces cell death. Proc Natl Acad Sci USA 97: 7859-7864.

Referências Bibliográficas

- 105 -

Mannoor MK, Weerasinghe A, Halder RC, Reza S, Morshed M, et al. 2001.

Resistence to malaria infection is achieve by the cooperation of NK1.1(+) and NK1.1(-)

subsets of intermediate TCR cells which are constituents of innate immunity. Cell

Immunol. 211: 96-104.

Matsuda JL, Naidenko OV, Gapin L, Nakayama T, Taniguchi M, et al. 2000.

Tracking the response of natural killer T cells to a glycolipid antigen using CD1d tetramers.

J Exp Med. 192: 741-754.

Mattner J, Debord KL, Ismail N, Goff RD, Cantu C 3rd, Zhou D, Saint-Mezard P,

Wang V, Gao Y, Yin N, Hoebe K, Schneewind O, Walker D, Beutler B, Teyton L, Savage

PB, Bendelac A. 2005. Exogenous and endogenous glycolipid antigens activate NKT cells

during microbial infections. Nature. 434: 525-529.

Mendiratta SK, Martin WD, Hong S, Boesteanu A, Joyce S, Van Kaer L. 1997.

CD1d1 mutant mice are deficient in natural T cells that promptly produce IL-4. Immunity.

6(4): 469-477

Metlitsa LS, Naidenko OV, Kant A, Wu HW, Loza MJ, Perussia B, Kronenberg M,

Seeger RC. 2001. Human NKT cells mediate antitumor cytotoxicity directly by recognizing

target cell CD1d with bound ligand or indirectly by producing IL-2 to activate NK cells. J

Immunol. 167(6): 3114-3122

Milland J, Christiansen D, Lazarus BD, Taylor SG, Xing PX, et al. 2006. The

molecular basis for galalpha(1,3)gal expression in animals with a deletion of the

alpha1,3galactosyltransferase gene. J Immunol. 176: 2448–2454.

Motohashi S, Kobayashi S, Ito T, Magara KK, Mikuni O, Kamada N, Iizasa T,

Nakayama T, Fujisawa T, Taniguchi M. 2002. Preserved IFN-alpha production of

circulating Valpha24 NKT cells in primary lung cancer patients. Int J Cancer. 102(2): 159-

165.

Referências Bibliográficas

- 106 -

Mueller DW, Bosserhoff AK. (2009). Role of miRNAs in the progression of

malignant melanoma. British Journal of Cancer. 101: 551– 558. Mini-Review.

National Cancer Institute. http://www.cancer.gov/cancertopics/types/melanoma

Nieda M, Okai M, Tazbirkova A, Lin H, Yamaura A, Ide K, Abraham R, Juji T,

Macfarlane DJ, Nicol AJ. 2004. Therapeutic activation of Valpha24+Vbeta11+ NKT cells

in human subjects results in highly coordinated secondary activation of acquired and innate

immunity. Blood. 103(2): 383-389.

Parekh W, Wilson MT, Olivares-Villagomez D, Singh AK, Wu L, Wang CR, Joyce

S, Van Kaer L. 2005. Glycolipid antigen induces long-term natural killer T cell anergy in

mice. J Clin Invest. 115: 2572-2583.

Park SH, Kyin T, Bendelac A, Carnaud C. 2003. The contribution of NKT cells, NK

cells and other gamma-chain-dependent non-T non-B cells to IL-12 mediated rejection of

tumors. J Immunol. 170: 1197-1201.

Park J-E, Wu DY, Prendes M, Lu SX, Ragupathi G, Schrantz N, Chapman

PB.

2008. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of

GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123: 145–155.

Paschoalin T, Carmona AK, Rodrigues EG, Oliveira V, Monteiro HP, Juliano MA,

Juliano L, Travassos LR. 2007. Characterization of thimet oligopeptidase and neurolysin

activities in B16F10-Nex2 tumor cells and their involvement in angiogenesis and tumor

growth. Mol Cancer. 6: 44-58.

Patton EE, Widlund HR, Kutok JL, Kopani KR, Amatruda JF, Murphey RD,

Berghmans S, Mayhall EA, TraverD, Fletcher CD, Aster JC, Granter SR, Look AT, Lee C,

Referências Bibliográficas

- 107 -

Fisher DE, Zon LI. 2005. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and

cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr Biol. 15: 249–254.

Perrin-Cocon L , Coutant F, Agaugue S, Deforges S, Andre P, Lotteau V. 2001.

Oxidized low-density lipoprotein promotes mature dendritic cell transition from

differentiating monocyte. J Immunol. 167: 3785-3791.

Porcelli SA and Modlin RL. 1999. The CD1 system: antigen-presenting molecules

for T cell recognition of lipids and glycolipids. Annu Rev Immunol. 17: 297-329.

Porubsky S, Speak AO, Luckow B, Cerundolo V, Platt FM, Grone HJ. 2007.

Normal development and function of invariant natural killer T cells in mice with

isoglobotrihexosylceramide (iGb3) deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(14): 5977-

5982.

Procopio DO, Almeida IC, Torrecilhas AC, Cardoso JE, Teyton L, Travassos LR,

Bendelac A, Gazzinelli RT. 2002. Glycosylphosphatidylinositol-anchored mucin-like

glycoproteins from Trypanosoma cruzi bind to CD1d but do not elicit dominant innate or

adaptative immune responses via the CD1d/NKT cell pathway. J Immunol. 169: 3926-

3933.

Pukel CS, Lloyd KO, Travassos LR, Dippold WG, Oettgen HF, Old LJ. 1982. GD3,

a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse

monoclonal antibody. J Exp Med. 155: 1133-1147.

Radin NS. 1999. Chemotherapy by slowing glucosphingolipid synthesis. Biochem

Pharmacol. 57: 589-595.

Rauch J, Gumperz J, Robinson C, Skold M, Roy C, Young DC, Lafleur M, Moody

DB, Brenner MB, Costello CE, Behar SM. 2003. Structural features of the acyl chain

determine self-phospholipid antigen recognition by a CD1d-restricted invariant NKT

(iNKT) cell. J Biol Chem. 278(48): 47508-47515.

Referências Bibliográficas

- 108 -

Rodrigues GR, Dobroff ASS, Cavarsan CF, Paschoalin T, Nimrichter L, Mortara

RA, Santos EL, Fázio MA, Miranda A, Daffre S, Travassos LR. 2008. Effective topical

treatment of subcutaneous murine B16F10-Nex2 melanoma by antimicrobial peptide

gomesin. Neoplasia. 10(1): 61-68.

Saenger YM, Li Y, Chiou KC, Chan B, Rizzuto G, Terzulli SL, Merghoub T,

Houghton AN, Wolchok JD. 2008. Improved tumor immunity using anti-tyrosinase related

protein-1 monoclonal antibody combined with DNA vaccines in murine melanoma. Cancer

Res. 68: 9884-9891.

Savage PB, Teyton L, Bendelac A. 2006. Glycolipids for natural killer T cells.

Chem Soc Rev. 35: 771-779.

Schmieg J, Yang G, Franck RW, Rooijen NV, Tsuji M. 2005. Glycolipid

presentation to natural killer T cells differs in an organ-dependent fashion. Proc Natl Acad

Sci U S A. 102(4): 1127-1132.

Seino K, Motohashi S, Fujisawa T, Nakayama T, Taniguchi M. 2006. Natural killer

T cell-mediated antitumor immune responses and their clinical applications. Cancer Sci.

97(9): 807-12. Review.

Seino K, Taniguchi M. 2005. Functionally distinct NKT cell subsets and subtypes. J

Exp Med. 202: 1623-1626.

Shang P, Zhang C, Xia C, Chen W, Han Q, Wang PG, Zhang J, Tian Z. 2008.

Chemical modification of iGb3 increases IFN-γ production by hepatic NKT cells. Int

Immunopharm. 8: 645-653

Shurin GV, Shurin MR, Bykovskaia S, Shogan J, Lotze MT, Barksdale EM Jr.

2001. Neuroblastoma-derived gangliosides inhibit dendritic cell generation and function.

Cancer Res. 61(1): 363-369.

Referências Bibliográficas

- 109 -

Sieling PA, Chatterjee D, Porcelli SA, Prigozy TY, Mazzaccaro RJ, et al. 1995.

Cd1-restricted T cell recognition of microbial lipoglycan antigens. Science. 269: 227-230.

Sköld M, Behar SM. 2003. Role of CD1d-restricted NKT cells in microbial

immunity. Infec Immun. 71: 5447-5455.

Smyth MJ, Thia KY, Street SE, Cretney E, Trapani JA, Taniguchi M, Kawano T,

Pelikan SB, Crowe NY, Godfrey DI. 2000. Differential tumor surveillance by natural killer

(NK) and NKT cells. J Exp Med. 191: 661-668.

Smyth MJ, Crowe NY, Hayakawa Y, Takeda K, Yagita H, and Godfrey DI. 2002.

NKT cells—conductors of tumor immunity?. Curr Opin Immunol. 14: 165–171.

Speak AO, Salio M, Neville DC, Fontaine J, Priestman DA, Platt N, Heare T,

Butters TD, Dwek RA, Trottein F, Exley MA, Cerundolo V, Platt FM. 2007. Implications

for invariant natural killer T cell ligands due to the restricted presence of

isoglobotrihexosylceramide in mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(14): 5971-5076.

Sugawara I, Yamada H, Mizuno S, Li CY, Nakayama T, Taniguchi M. 2002.

Mycobacterial infection in natural Killer T cell knockout mice. Tuberculosis. 82: 97-104.

Sugiyama A, Aye NN, Yatomi Y, Ozaki Y, Hashimoto K. 2000a. Effects of

sphingosine 1-phosphate, a naturally occurring biologically active lysophospholipid, on the

rat cardiovascular system. Jpn J Pharmacol. 82: 338-342.

Sugiyama A, Yatomi Y, Ozaki Y, Hashimoto K. 2000b. Sphingosine 1-phosphate

induces sinus tachycardia and coronary vasoconstriction in the canine heart. Cardiovasc

Res 46: 119-125.

Referências Bibliográficas

- 110 -

Sullivan BA, Kronenberg M. 2005. Activation or anergy: NKT cells are stunned by

alpha-galactosylceramide. J Clin Invest. 115: 2328-2329.

Taniguchi M, Harada M, Kojo S, Nakayama T, Wakao H. 2003. The regulatory role

of Valpha14 NKT cells in innate and acquired immune response. Annu Rev Immunol. 21:

483-513.

Terabe M, Matsui S, Noben-Trauth N, et al. 2000. NKT cell-mediated repression of

tumor surveillance by IL-13 and the IL-4-STAT6 pathway. Nat Immunol. 1: 515-520.

Terabe M, Swann J, Ambrosino E, Sinha P, Takaku S, Hayakawa Y, Godfrey DI,

Ostrand-Rosenberg S, Smyth MJ, and Berzofsky JA. 2005. A nonclassical non–

Valpha14Jalpha18 CD1d-restricted (type II) NKT cell is sufficient for downregulation

of tumor immunosurveillance. J Exp Med. 202: 1627–1633.

Toura I, Kawano T, Akutsu Y, Nakayama T, Ochiai T, Taniguchi M. 1999. Cutting

edge: inhibition of experimental tumor metastasis by dendritic cells pulsed with alpha-

galactosylceramide. J Immunl. 163: 2387-2391.

Wilson MT, Singh AK, Kaer LV. 2002. Immunotherapy with ligands of natural

killer T cells. Trends in Mol Med. 8: 225-231.

Wolfl M, Batten WY, Psovszky C, Bernhard H, Berthold F. 2002. Gangliosides

inhibit the development from monocytes to dendritic cells. Clin Exp Immunol. 130: 441-

448.

Wu DY, Segal NH, Sidobre S, Kronenberg M, Chapman PB. 2003. Cross-

presentation of disialoganglioside GD3 to natural killer T cells. J Exp Med. 198: 173-181.

Referências Bibliográficas

- 111 -

Wu D, Xing GW, Poles MA, Horowitz A, Kinjo Y, et al. 2005. Bacterial glycolipids

and analogs as antigens for CD1d-restricted NKT cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102:

1351-1356.

Yuan J, Ku GY, Gallardo HF, Orlandi F, Manukian G, Rasalan TS, Xu Y, Li H,

Vyas S, Mu Z, Chapman PB, Krown SE, Panageas K, Terzulli SL, Old LJ, Houghton AN,

Wolchok JD. 2009. Safety and immunogenicity of a human and mouse gp100 DNA

vaccine in a phase I trial of patients with melanoma. Cancer Immun. 9: 5-12.

Yu KO, Im JS, Molano A, Dutronc Y, Illarionov PA et al. 2005. Modulation of

CD1d-restricted NKT cell responses by using N-acyl variants of a-galactosylceramides.

Proct Natl Acad Sci USA. 102(9): 3383-8.

Zajonc DM, Savage PB, Bendelac A, Ian A, Wilson IA, Teyton L. 2008. Crystal

structures of mouse CD1d-iGb3 complex and its cognate Va14 T Cell receptor suggest a

model for dual recognition of foreign and self glycolipids. J Mol Biol. 377: 1104–1116.

Zeng G, Gao L, Yu RK. 2000a. Reduced cell migration, tumor growth and

experimental metastasis of rat F-11 cells whose expression of GD3-synthase is suppressed.

Int J Cancer. 88: 53-57.

Zeng G, Gao L, Birklé S, Yu RK. 2000b. Suppression of ganglioside GD3

expression in a rat F-11 tumor cell line reduces tumor growth, angiogenesis, and vascular

endothelial growth factor production. Cancer Res. 60: 6670-6676.

Zeng Z, Castano AR, Segelke BW, Stura EA, Peterson PA, Wilson YA. 1997.

Crystal structure of mouse CD1: an MHC-like fold with a large hydrophobic binding

groove. Science. 277: 339-345.

Zhou D, Mattner J, Cantu III C, Schrantz N, Yin N, et al. 2004. Lysosomal

glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306: 1786-1789.

Referências Bibliográficas

- 112 -

Zhou D. 2006. The immunological function of iGb3. Curr Protein Pept Sci. 7: 325-

333.

Anexos

- 113 -

Anexos

- 114 -

PUBLICAÇÃO

O trabalho foi publicado em dezembro de 2009 na revista Molecular Câncer (volume 8

página 116), com índice de impacto de 5,34 sob o título:

Identification of iGb3 and iGb4 in melanoma B16F10-Nex2 cells and the iNKT

cell-mediated antitumor effect of dendritic cells primed with iGb3.

BioMed Central

Page 1 of 14

(page number not for citation purposes)

Molecular Cancer

Open Access

Research

Identification of iGb3 and iGb4 in melanoma B16F10-Nex2 cells and

the iNKT cell-mediated antitumor effect of dendritic cells primed

with iGb3

Bianca R Dias

, Elaine G Rodrigues

, Leonardo Nimrichter

Ernesto S Nakayasu

, Igor C Almeida

and Luiz R Travassos*

Address:

Experimental Oncology Unit (UNONEX), Department of Microbiology, Immunology and Parasitology, Universidade Federal de São

Paulo, São Paulo, Brazil,

Instituto de Microbiologia Prof Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil and

The

Border Biomedical Research Center, Department of Biological Sciences, University of Texas at El Paso, Texas, USA

Email: Bianca R Dias - coquiek@yahoo.com; Elaine G Rodrigues - rodrigues.elaine@unifesp.br;

Leonardo Nimrichter - [email protected]; Ernesto S Nakayasu - [email protected]; Igor C Almeida - icalmei[email protected];

Luiz R Travassos* - [email protected]

* Corresponding author

Abstract

Background: CD1d-restricted iNKT cells are protective against murine melanoma B16F10-Nex2

growing subcutaneously in syngeneic C57Bl/6 mice as inferred from the fast tumor development in

CD1d-KO in comparison with wild type animals. CD1d glycoproteins are related to the class I

MHC molecules, and are involved in the presentation, particularly by dentritic cells (DC), of lipid

antigens to iNKT cells. In the present work we attempted to identify the endogenous lipid mediator

expressed in melanoma cells inducing such immunesurveillance response and study the possibility

of protecting animals challenged with tumor cells with lipid-primed DC.

Results: Crude cytosolic and membrane fractions from in vivo growing melanoma contained iNKT-

stimulating substances. Lipids were then extracted from these cells and one of the fractions (i.e.

F3A) was shown to prime bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) to stimulate iNKT murine

hybridoma (DN32D3) cells to produce IL-2. The active fraction was analyzed by electrospray

ionization-mass spectrometry (ESI-LIT-MS) and both iGb3 and iGb4 were identified along with

GM3. When iGb3 was incubated with BMDC and tested with DN32D3 cells, IL-2 was equally

produced indicating iNKT cell activation. GM3 consistently inhibited this response. To assess the

antitumor response-induced by iGb3, a cytotoxicity assay in vitro was used with [

H]-thymidine

labeled B16F10-Nex2 cells. At target/effector (iGb3-activated iNKT) cell ratio of 100

-1

-100

-4

tumor

cell lysis was shown. The antitumor activity in vivo was tested in mice challenged i.v. with B16F10-

Nex2 cells and treated with iGb3- or α-galactosylceramide-primed DCs. A 4-fold lower tumor load

in the lungs was observed with either treatment.

Conclusion: Our results show the expression of globo and isoglobohexosylceramides in murine

melanoma B16F10-Nex2. The expression of iGb3 and its precursor, iGb4, on tumor cells may

prime an effective iNKT cell-dependent antitumor response, modulated negatively by GM3 which

is also produced in these cells. iGb3-primed BMDC exerted a significant iNKT cell-mediated anti-

tumor activity in mice challenged with melanoma cells.

Published: 7 December 2009

Molecular Cancer 2009, 8:116 doi:10.1186/1476-4598-8-116

Received: 29 September 2009

Accepted: 7 December 2009

This article is available from: http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0

which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 2 of 14

(page number not for citation purposes)

Background

Murine tumors are poorly immunogenic in syngeneic

mice that display the same set of major antigens and show

a high degree of autologous antigen tolerance. Tumor

cells grow silently in the syngeneic host until the immune

system is activated either by exogenous elicitors or endog-

enous products of apoptotic and necrotic tumor cells. The

host outcome is then determined by the imbalance

between tumor cell destruction and growth, in most cases

tending to the second condition, with deadly metastases.

Attempts at combating the tumor cells have used proin-

flammatory cytokines, particularly IL-12. A gene gun-

mediated skin transfection with IL-12 gene resulted in

regression of established primary and metastatic syn-

geneic murine tumors [1]. The protective effect by IL-12

required CD8

, but not CD4

T cells. A tumor-specific

immunological memory against a secondary tumor chal-

lenge was also observed. It is clear now that IL-12 stimu-

lates diverse resistance mechanisms in tumors depending

on the cell type, tumor microenvironment, and mouse

strain [2]. It is well recognized the association of IL-12

with NK cells to produce IFN-γ, a potent antitumor agent

acting directly against tumor cells [3] or upon macro-

phage activation. This seems to represent the immunolog-

ical core of the defense mechanisms against syngeneic

murine melanoma B16F10. Cui et al. [4] examined the

immune cellular response in B16 melanoma, Lewis lung

carcinoma, and FBL3 erythroleukemia elicited by IL-12

administration and found that Vα14-Jα18NKT cells were

mainly implicated in tumor rejection.

Natural killer T (NKT) cells are subsets of lymphocytes

expressing the T-cell receptor (TCR) and surface markers

characteristic of NK cells such as NK1.1. Type I NKT cells

express an invariant T cell receptor α-chain, Vα 14-Jα 18

in mice and Vα 24-Jα 18 in humans [5]. These cells are

activated by lipid antigens presented by CD1, a molecule

similar to MHC class I molecule. Type II NKT cells like-

wise require CD1 but have a more diverse TCR repertoire

and do not recognize the most potent glycolipid known to

activate NKT cells, the α-galactosylceramide (α-GalCer),

derived from the marine sponge Agelas mauritianus.

Rodents have a single CD1d gene whereas humans have 3

more CD1 antigen-presenting molecules. NKT cells have

innate-like responses which may include secretion of both

IFN-γ (Th-1) and IL-4 (Th-2) cytokines. Seino et al [6]

showed that α-GalCer induced expansion of Vα14 NKT

cells promoting inhibition of murine lung cancer. Toura

et al. [7] showed that α-GalCer-pulsed dendritic cells

(DC) exerted a potent antitumor cytotoxic activity against

tumor metastasis mediated by NKT cells. Besides α-Gal-

Cer, many other lipids have been described to activate

NKT cells such as glycosphingolipids from Sphingomonas

spp [8], the galactosyldiacylglycerol of Borrelia burgdorferi

[9], surface lipophosphoglycan of Leishmania donovani

[10], and the Mycobacterium leprae phosphatidylinositol

tetramannoside [11].

A lysosomal glycosphingolipid, isoglobotrihexosylcera-

mide (iGb3) was found to be stimulatory in both mouse

and human NKT cells [12]. Its expression in peripheral tis-

sues could induce NKT cell activation under pathophysio-

logical conditions such as cancer and autoimmune

disease [13]. The presence of iGb4 was also detected in

human thymus using mass spectrometry (MS) [14]. Mice

deficient in β-hexosaminidase B (a lysosomal enzyme that

converts iGb4 into iGb3) showed impaired NKT-cell

development [12]. More recently, MS has been used to

generate a database for glycosphingolipids from mouse

thymus and among the identified species, only iGb3 is a

stimulatory ligand of NKT cells [15].

In our study, we explored the anti-tumor effect of NKT

cells and identified iGb3 and iGb4 as glycolipids from

murine melanoma B16F10- Nex2 cells, the former being

able to activate NKT DN32D3 hybridoma cells to exert

antitumor responses in vitro and in vivo.

Methods

Reagents

Isoglobotri- and tetrahexosylceramide (iGb3 and iGb4)

were purchased from Alexis - Biochemical, PA and mono-

sialoganglioside 3 (GM3) from Matreya, PA. The α-galac-

tosylceramide (α-GalCer) was provided by Dapeng Zhou,

MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. Solvents and

reagents used for high performance thin layer chromatog-

raphy (HPTLC) were purchased from Merck, Germany:

methanol, chloroform, precoated Silica Gel-60 HPTLC

plates (10 × 10 cm); orcinol reagent (0.5 g orcinol in 100

ml 3 M sulfuric acid); resorcinol reagent (200 mg resorci-

nol in 80 ml HCl and 0.25 mL 0.1 M copper sulfate, and

water to 100 ml); iodine.

Mice

Inbred male 6-8 week-old C57Bl/6 mice (WT) were pur-

chased from the Center for Development of Experimental

Models, Federal University of São Paulo (UNIFESP).

CD1d knockout (KO) mice of C57Bl/6 genetic back-

ground were provided by Ricardo T. Gazzinelli (Rene

Rachou Institute, Fiocruz, Belo Horizonte Brazil). KO ani-

mals were bred and maintained at the Animal Facility of

Cellular Biology Division/Experimental Oncology Unit,

UNIFESP. All animals were maintained in spf (specific

pathogen-free) conditions, and were used in accordance

with Animal Ethics Committee of UNIFESP, protocol no.

01561/2004.

Cell Lines and Culture Conditions

The murine melanoma B16F10-Nex2 was subcloned at

the Experimental Oncology Unit (UNONEX) from the

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 3 of 14

(page number not for citation purposes)

cell line B16F10 obtained from Ludwig Institute for Can-

cer Research (São Paulo, Brazil). CD1d-transfected B6

mouse C57SV fibroblasts [16] and the NKT DN32D3

hybridoma [17] were provided by Ricardo T. Gazzinelli

(Fiocruz, Belo Horizonte, Brazil). Hybridoma cells were

maintained in 50% RPMI-1640 medium and 50% α-

MEM medium (both from GIBCO), supplemented with

5% heat-inactivated fetal calf serum (FCS), 2 mM L-

glutamine, 100 U/ml penicillin/streptomycin and 50 μM

2-mercaptoethanol (all reagents from Invitrogen, Brazil).

Other cell lines were maintained in RPMI-1640 medium

supplemented with 10% FBS, 10 mM N-(2-hydroxye-

thyl)-piperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES), 24

mM sodium bicarbonate (both from Sigma, St.Louis,

MO), 40 mg/ml gentamycin (Schering-Plough, São Paulo,

Brazil), pH 7.2. All cells were maintained at 37°C in

humidified atmosphere containing 5% CO

Dendritic cell differentiation from murine bone marrow

progenitors (BMDC)

Femurs from C57Bl/6 WT and KO mice were collected,

muscular tissue removed, and bones were washed sequen-

tially with 70% ethanol, iodide alcohol and PBS supple-

mented with gentamycin 40 mg/ml, penicillin 100 U/ml,

streptomycin 100 μg/ml (PBS gen/pen/str). After cutting

both ends of the femurs, the bone marrow was flushed

out with PBS gen/pen/str and the cells were centrifuged at

1,200 rpm for 5 min. The cells were suspended in 10 ml/

femur of RPMI 1640 supplemented with 10% of FCS,

non-essential aminoacids (50×), 50 μM 2-mercaptoetha-

nol (all from Gibco, Minneapolis, MN), 30 ng/ml murine

rGM-CSF, and 10 ng/ml murine rIL-4 (both cytokines

from PeproTech, Mexico) and placed in Petri tissue cul-

ture dishes (100 mm, Corning, NY). The cultures were fed

with complete medium every 3 d after gently swirling the

plates and replacing 80% of the spent medium. After 6-7

days of culture, large numbers of typical dendritic cells

were released. These cells were thereafter pulsed with α-

GalCer, iGb3 or lipid fractions extracted from B16F10-

Nex2 tumor cells.

Phenotypic analysis of mature BMDC

Bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) were plated

in 96-well plates (TPP, Switzerland) and stimulated with

200 ng/ml LPS (Sigma, São Paulo, Brazil) or 200 ng/ml

LPS associated to IFN-γ 100 U (PeproTech, Mexico) for 24

h. Cells were harvested and incubated with normal

murine serum for 30 min on ice to block Fc receptors and

inhibit nonspecific staining. After 2 rounds of PBS wash-

ing, 5 × 10

to 10

cells/sample were incubated for 1 h on

ice with combinations of the following antibodies (1:30

dilution), purchased from Pharmingen (San Diego, CA):

anti-CD86 (B7.2)-PE, anti-MHC-II-FITC, anti-CD1d-

FITC, biotinylated anti-CD11c (revealed with streptavi-

din-PE). Surface fluorescence was measured on a FACS

Calibur flow cytometer (BD Biosciences, São Paulo, Bra-

zil), and data analyzed by the CellQuest Pro software

(Becton Dickinson, San Jose, CA).

Subcellular fractions from in vivo grown murine melanoma

B16F10-Nex2 cells

WT mice were inoculated subcutaneously with 5 × 10

B16F10-Nex2 murine melanoma cells. Tumor volumes

were measured every 3 days using a caliper and the for-

mula V = 0.52 (D × d

), where D and d are long and short

tumor diameters respectively. Tumors were excised at

1,500 mm

and maintained frozen at -80°C. Cytosolic and

membrane fractions were obtained by freezing-thawing

tumors in liquid nitrogen. Lysed tumors were suspended

in 50 ml PBS, filtered in nylon mesh and centrifuged at

441 g for 5 min for debris removal. The supernatant was

then submitted to ultracentrifugation at 100,000 g for 90

min. The cytosolic fraction is represented by the resulting

supernatant, and the pellet resuspended in RPMI 1640

medium supplemented with 10% FCS and 2% of DMSO,

contained the membrane fraction. Total protein was meas-

ured in both fractions, as described [18]. To isolate lipid

fractions from B16F10-Nex2 tumor cells, frozen tumors

were lyophilized and 200 mg (dry weight) were extracted

3× with chloroform/methanol (2:1, v/v). The suspension

was centrifuged in glass tubes (Pyrex) for 30 minutes at

1,764 g, the supernatant was collected, dried in nitrogen

stream and this fraction was named F1A. The pellet was re-

extracted 3× with chloroform/methanol/water (1:2:0.8, v/

v/v) and the material was processed as described for F1A.

This fraction was named F2A. From F1A, we obtained 2

more fractions by Folch's partition [19]. The upper aque-

ous phase was named F3A and the lower phase F4A. F4A

was extracted with chloroform/methanol/water

(1:100:100, v/v/v) and centrifuged in glass tubes for 30

minutes at 1,764 g and 4°C, generating two more frac-

tions, F5A (upper phase) and F6A (lower phase). All 6

fractions were solubilized in chloroform/methanol (1:1,

v/v) and desalted on C18 Sep-Pac Plus Columns (Waters

Corporation, Millford, MA), according to the manufac-

turer's instructions. All supernatants were dried under

nitrogen stream and stocked in a glass desiccator before

use (Fig. 1).

HPTLC resolution of fractions F3A and F4A

Fractions F3A and F4A were dissolved in chloroform/

methanol (1:1, v/v), sonicated on a water bath for 30 sec-

onds, and 1 mg/ml (dry weight) was applied on HPTLC

silica plates (Sigma). The mobile phase was chloroform/

methanol/water (60: 35: 8, v/v/v). Run HPTLC plates were

revealed with orcinol reagent (for hexose detection),

resorcinol-HCL reagent (for sialyl-containing carbohy-

drates) and iodine vapor (for total lipids). Ganglioside

GM3 and isogloboside iGb3 (5 μg/ml), used as standards,

were visualized with these reagents, and R

values deter-

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 4 of 14

(page number not for citation purposes)

mined. Tumor F3A and F4A fractions were chromato-

graphed and at the R

values corresponding to GM3 and

iGb3 the silica was scraped off and extracted with chloro-

form: methanol (1:1, v/v), then centrifuged for 30 min at

1,764 g. The supernatant was collected and dried under

nitrogen stream. Preparative fractions isolated from F3A

and F4A chromatographies were called iF3A and iF4A,

respectively. The iF3A and iF4A fractions were dissolved in

chloroform: methanol (1:1, v/v), sonicated for 30 sec-

onds, resolved on silica gel 60 Å TLC plates (10 × 10 cm,

0.25 mm, Merck) and compared with GM3 and iGb3

standards.

In vitro stimulation of NKT DN32D3 hybridoma cells with

-GalCer, iGb3 and fractions of tumor B16F10-Nex2

On the 6

day of ex-vivo culture, BMDCs were stimulated

with α-GalCer (0.01-10 ng/ml) in complete medium

(RPMI 1640 supplemented with 10% FCS, 50 μM 2-mer-

captoethanol, 2 mM glutamine, gentamycin 40 mg/ml,

penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml, and 10 mM

HEPES) for 24 h. The NKT hybridoma DN32D3 (5 × 10

)

cells were co-cultured with 5 × 10

BMDC, stimulated or

not, in 96-well flat bottom microplates (TPP) in tripli-

cates, in a total volume of 200 μl/well. After 18 h at 37°C

and 5% CO

, supernatants were collected for IL-2 meas-

urement by ELISA. The same method was applied for

stimulation of BMDCs with iGb3 (0.5-100 μg/ml),

cytosolic fraction (0.008-3.41 mg protein/ml), membrane

fraction (0.007-1.1 mg protein/ml), F3A fraction (15-

1,000 μg/ml), iF3A fraction (1-100 μg/ml) and iF4A frac-

tion (5-50 μg/ml). A few experiments were also carried

out with CD1d-transfected fibroblasts as antigen-present-

ing cells, stimulated as described for BMDCs.

Measurement of IL-2 by ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plates were

coated with 2 μg of murine anti-IL-2 monoclonal anti-

body in 50 μl binding buffer (0.1 M Na

HPO

, pH 9.0)

and incubated overnight at room temperature. After 3

rounds of washings (with PBS containing 0.05% Tween-

20), plates were blocked for 2 h at room temperature, with

PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.05%

Tween-20. After washing, 50 μl/well of murine recom-

binant IL-2 at 0.032-4 ng/ml diluted in PBS-1% BSA, or

100 μl/well of culture supernatant were added and incu-

bated overnight at 4°C. Plates were washed and biotin-

conjugated murine anti-IL-2 monoclonal antibody (50

ng/100 μl/well) was added, following incubation for 2 h

at room temperature, washing and further incubation for

1 h at room temperature with 50 μl/well of HRP-strepta-

vidin (1:1000, diluted in PBS - 1% BSA). Reaction was

revealed by addition of 50 μl/well of 5 ml citrate-phos-

phate buffer pH 5.5, 2 ml water, 2 mg OPD and 10 μl

. A solution of 4N H

(50 μl/well) was used to

terminate the reaction. Absorbance was measured at 490

nm. All reagents were purchased from Pharmingen, San

Diego, CA.

Separation of neutral and negatively charged

glycosphingolipids

Tumor lysate and F3A fraction were chromatographed in

a strong anion-exchange (SAX) resin (POROS 50 HQ,

Scheme for lipid extraction of B16F10-Nex2 murine melanomaFigure 1

Scheme for lipid extraction of B16F10-Nex2 murine melanoma. Six fractions (F1A to F6A) were obtained from

lyophilized subcutaneously grown tumors.

Pellet

Lyophilized

pellet

Pellet

FOLCH’S

partition

Supernatant

F1A

Upper phase

F3A

Lower phase

F4A

C-M-W

(1:100:100)

Upper phase

F5A F6A

Lower phase

C-M (2:1) 3X

C-M-W (1:2:0.8) 3X

F2A

F1A

FOLCH’S

partition

C-M-W

F5A F6A

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 5 of 14

(page number not for citation purposes)

Applied Biosystems, São Paulo, Brazil) for separation of

neutral and charged glycosphingolipids. The column was

previously washed with 4 ml methanol, 2 ml 80% ace-

tonitrile/0.05% trifluoroacetic acid, and finally equili-

brated with 10 ml methanol. Samples were diluted to a

final volume of 5 ml with 100% methanol and loaded

into the column. After washing with 6 ml methanol, elu-

tion was carried out with 6 ml of 250 mM ammonium

acetate in 100% methanol. Neutral glycolipids were

recovered in the unbound fraction, whereas the eluted

fraction was composed mainly of gangliosides. All sam-

ples were dried under highly pure N

stream. The eluted

fraction was desalted in a 3-ml reverse phase cartridge

(Discovery DSC-18, Supelco, Bellefonte, PA, USA). The

cartridge was washed with 4 ml methanol, equilibrated

with 5 ml deionized water, and the samples were loaded

in 5 ml 0.1 M KCl. After washing with 10 ml water, the

samples were eluted with 10 ml methanol and dried

under highly pure N

stream.

Permethylation of glycosphingolipids

All permethylation reagents were purchased from Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO. Permethylation of glycosphingoli-

pids was carried out as described [20]. Briefly, the samples

were dissolved in 150 μL dimethylsulfoxide (DMSO), a

few milligrams of powdered NaOH were added, and the

mixture was vortexed vigorously. Then, 80 μL of

iodomethane was added and the reaction was carried out

for 1 h at room temperature in an orbital shaker. The reac-

tion was then quenched with 2 ml water and 2 ml dichlo-

romethane was added before the mixture was vortexed.

After brief centrifugation, the aqueous phase was removed

and the organic phase was washed twice with water. The

final organic phase was dried under N

and suspended in

200 μl pure methanol for MS as follows.

Electrospray ionization-linear ion trap-mass spectrometry

(ESI-LIT-MS) analysis

Permethylated glycosphingolipids were analyzed by electro-

spray ionization-linear ion trap-mass spectrometry (ESI-LIT-

MS) as described by Li et al. [14,21]. Briefly, permethylated

samples were loaded in static nanospray tips (New Objec-

tive) and analyzed in a linear ion-trap mass spectrometer

(LTQ XL with ETD, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA).

The spray voltage was set from 0.7 to 1.5 kV, varying accord-

ing to the tip. After detecting the intact permethylated glycol-

ipids by MS

, tandem fragmentation (MS

-MS

) of

individual glycolipid species was carried out manually, or by

total-ion mapping (TIM) of m/z 667 (marker of Gb3 and

iGb3) or m/z 912 (marker of Gb4 and iGb4) [14,21]. The

isolation window was set at 3 atomic mass units (a.m.u.) for

manual fragmentation and 1 a.m.u., for TIM. The collision

energy was set to 60% for either manual or TIM analysis. The

spectra were annotated manually. To calculate

the amount of iGb3 in fraction F3A we used the following

equation: A(iGb3)

sample

= (A(iGb3)

211corr

+ A(iGb3)

371

[A(iGb3)

211corr

+ A(iGb3)

371

+ (2× A(Gb3)

329

, where

A(iGb3)

211corr

= A(iGb3)

predicted

/A(iGb3)

max using iGb3 standard

where A(iGb3)

211

and A(iGb3)

371

are the abundance (A) of

iGb3 markers m/z 211 and m/z 371, and A(Gb3)

329

that of

Gb3 marker m/z 329 [21].

In vitro cytotoxicity assay

The cytotoxic effect by activated NKT DN32D3 hybrid-

oma cells on B16F10-Nex2 tumor cells was evaluated as

described [22]. B16F10-Nex2 cells (2 × 10

) were incu-

bated in 25 cm

flasks with 0.5 μCi of [

H] thymidine

(NEN, Boston, MA) for 24 h. NKT hybridoma DN32D3

cells were activated by previous incubation with DC

primed with iGb3 (20 μg/ml) or unprimed DC for 4-6 h.

Activated NKT cells and [

H] B16F10-Nex2 cells were co-

cultured for 4 h on 96-well flat-bottom microtiter plates at

target/effector cell ratios of 1/12 to 1/400, in triplicates.

All cells were collected in a Cell Harvester and radioactiv-

ity was measured with a β-counter. The specific cytotoxic-

ity (% lysis) was calculated using the formula: (E-C)/E ×

100, where E is the radioactivity (cpm) in the glycolipid-

primed DC system and C the control radioactivity value in

the unprimed DC system. Values were subtracted from the

maximum radioactivity value of unchallenged labeled

melanoma cells.

In vivo experiments

WT and CD1d-KO animals (5 per group) were inoculated

subcutaneously with 5 × 10

B16F10-Nex2 tumor cells, on

the right flank, and tumor development was observed

every 2 days for 67 days. Animals were sacrificed at maxi-

mal tumor volumes of 3 cm

. To verify the protective

effect of activated BMDCs on the pulmonary metastatic

melanoma model, WT animals were injected intrave-

nously with 5 × 10

murine melanoma cells on day 0, and

on days 2 and 4 with 5 × 10

BMDCs (from WT mice) acti-

vated in vitro for 24 h with 200 ng/ml α-GalCer, or 20 μg/

ml iGb3. A group of WT animals was treated with BMDCs

obtained from CD1d-knockout mice stimulated with 20

μg/ml iGb3. Animals were sacrificed on day 14 and the

number of lung nodules was quantified using a stereomi-

croscope. Experiments were repeated twice.

Statistical analysis

Experiments in vitro and in vivo were analyzed using the

Student's t-test. The animal survival experiment in CD1d-

KO and WT animals, was analyzed by Kaplan-Meier and

logrank test. Values of p ≤ 0.05 were considered statisti-

cally significant.

Results

Survival of C57Bl/6 WT and CD1d-KO mice upon

challenge with melanoma cells

Mice aged 6-8 weeks were injected subcutaneously with 5

× 10

B16F10-Nex2 melanoma cells and tumor growth

was recorded every 2 days during 70 days. All CD1d-KO

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 6 of 14

(page number not for citation purposes)

mice were dead or were sacrificed with tumors at the max-

imum size allowed after 32 days. In the WT mice, tumor

development was significantly slower with 20% of mice

still alive after 70 days (Fig. 2). This result suggests that

CD1d-dependent effector cells (e.g. NKT cells) play an

important role in anti-tumor progression in this syngeneic

model.

Activation of DN32D3 hybridoma cells

We have used NK1.1

DN32D3 cells (Vα14-Jα18/Vβ8

NKT mouse hybridoma) for stimulation in vitro. CD1d-

transfected fibroblasts, 5 × 10

, plated on 96-well plate,

were pulsed with different concentrations of α-galactosyl-

ceramide (α-GalCer), a classical activator of NKT cells, for

24 h. DN32D3 cells (5 × 10

cells/well) were added to a

final volume of 200 μl in RPMI 1640 and co-cultured with

the fibroblasts for 18 h. The culture supernatant was then

collected and production of IL-2 was quantified. Alterna-

tively, we used BMDCs for antigen presentation. BMDCs

are the most efficient cell type able to present the endog-

enous ligand iGb3 that stimulates NKT cells (Zhou et al.,

2004). These cells were cultivated with 30 ng/ml GM-CSF

and 10 ng/ml IL-4 for 6 days. Half of these cells double

stained for CD11c-PE and CD1d-FITC and this frequency

further increased after stimulation with LPS and IFN-γ.

Incubation with the glycolipid also succeeded in activat-

ing NKT cells to produce IL-2 (not shown).

Stimulation of DN32D3 cells by cytosolic and membrane

fractions of B16F10-Nex2 cells

B16F10-Nex2 cells (5 × 10

) were injected subcutaneously

in C57Bl/6 mice and the tumor was excised when its vol-

ume reached 1,500 mm

. The tumor cells were lysed by

freezing/thawing, centrifuged at low speed and the super-

natant ultracentrifuged at 100,000 g to yield cytosolic and

membrane fractions that were tested for stimulation of

NKT cells. Both fractions were added to BMDC for 24 h

and co-cultured with NKT cells.

Stimulation of NKT cells depended on the fraction con-

centration (measured as mg of protein) with rather

restricted amounts for optimal IL-2 production (Fig. 3).

CD1d-knockout mice allowed faster subcutaneous develop-ment of B16F10-Nex2 tumors than WT miceFigure 2

CD1d-knockout mice allowed faster subcutaneous

development of B16F10-Nex2 tumors than WT

mice. Wild type mice (--) and CD1d-knockout mice (----)

were injected subcutaneously with 5 × 10

viable B16F10-

Nex 2 cells. Animal survival was registered for 70 days. Mice

were sacrificed when tumors reached 3,000 mm

. Results are

representative of 4 independent experiments. p < 0.001.

Days after injection

20 30 40 50 60 70

Survival (%)

100

WT mice

CD1d -KO mice

Days after injection

Survival (%)

Days after injection

20 30 40 50 60 70

Survival (%)

100

WT mice

CD1d -KO mice

Days after injection

Survival (%)

Days after injection

20 30 40 50 60 70

Survival (%)

100

WT mice

CD1d -KO mice

Days after injection

Survival (%)

Stimulation of DN32D3 NKT cells by cytosolic and mem-brane fractions of murine melanoma B16F10-Nex2Figure 3

Stimulation of DN32D3 NKT cells by cytosolic and

membrane fractions of murine melanoma B16F10-

Nex2. BMDCs were pulsed with different concentrations of

(A) Cytosolic and (B) Membrane fractions, both extracted

from in vivo growing murine melanoma B16F10-Nex2.

Primed BMDCs were co-cultured with NKT hybridoma cells

as described in Material and Methods, and the IL-2 produc-

tion was measured in the supernatants by ELISA. Ctr,

DN32D3 cells stimulated with untreated BMDCs.

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

3.4 1.36 0.34 0.085 0.034 0.023 0.008 ctr

Cytosolic fraction (mg protein/ml)

IL-2 (ng/ml)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

1.1 0.44 0.11 0.03 0.01 0.007 ctr

Membrane fraction (mg protein/ml)

IL-2 (ng/ml)

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 7 of 14

(page number not for citation purposes)

Lipid extraction from B16F10-Nex2 tumor cells and their

ability to activate NKT cells

The lipid fractions were obtained from lyophilized subcu-

taneously grown melanoma cells as described in Fig. 1. All

fractions desalted in SepPak C18 were tested for stimula-

tion of DN32D3 NKT cells. At 250 μg/ml the F3A fraction

stimulated NKT cells to produce 1 ng/ml of IL-2. At lower

concentrations (15-30 μg/ml) 600 pg/ml of IL-2 was

secreted (not shown). It was hypothesized that both stim-

ulatory and inhibitory lipids could be present in this frac-

tion. As to fraction F4A, a restricted concentration, 28 μg/

ml, was stimulatory with low IL-2 production. The other

fractions did not give significant results and some of them

inhibited the background stimulation of NKT cells (not

shown).

Putative stimulatory and inhibitory components of

fractions F3A and F4A

HPTLC analysis of fractions F3A and F4A showed a major

component stained with orcinol (for sugars in general)

and resorcinol (for sialic acid) with R

similar to GM3.

Together with GM3, another component appeared which

showed a running R

similar to iGb3 already reported to

stimulate NKT cells [12,13]. To detect the latter, lipid frac-

tions were resolved by preparative HPTLC developed with

C-M-W (60:35:8, v/v/v), The TLC samples with R

corre-

sponding to Gb3/iGb3 were scrapped off and were iso-

lated by washing with C-M (2:1, v/v) and centrifugation,

further washing (3×) of pellet with C-M (1:1, v/v) and

finally 3 washes with C-M (1:2, v/v). All washes were dried

and plotted on a new HPTLC plate. On Fig. 4A, a single

band of R

similar to the iGb3 standard was stained with

orcinol (iF3A). The same procedure was used for fraction

F4A yielding iF4A (Fig. 4B). Fractions iF3A (5 μg/ml) and

iF4A (25 μg/ml) stimulated NKT cells to produce 60 pg/

ml and 150 pg/ml of IL-2, respectively. In contrast, GM3

markedly inhibited the basal production of IL-2 by

unstimulated NKT cells, even at 0.035 ng/ml (not shown).

ESI-LIT-MS analysis of fraction F3A lipid components

Fraction F3A was permethylated and examined by ESI-

LIT-MS. Several singly-charged ion species were observed

at the 1300-1600 m/z range (Fig. 5A). These ions were

compatible with GM3 species bearing N-acetyl- or N-glyc-

olylneuraminic acid (ΔN-Ac/Me-N-glycolyl = 30 m/z) and

different lipid moieties. To confirm this initial prediction,

the major peak at m/z 1372 (monoisotopic mass at m/z

1371.8) representing a singly-charged ion species with

sodium adduct ([M - H + 2 Na]

) was subjected to MS

and MS

fragmentation (Fig. 5B-C). The MS

spectrum

revealed a major daughter-ion at m/z 996.7, resulting from

the loss of N-acetylneuraminic acid (NANA). Also, two

other ions were observed at m/z 824.4 and 449.2, most

likely corresponding to sodiated NANA-Hex-Hex and

Hex-Hex fragments, respectively (Fig. 5B). To confirm the

GM3 nature of m/z 1372, the major daughter-ion species

observed at m/z 996.7 was subjected to MS

fragmentation

(Fig. 5C). Two daughter-ions observed at m/z 792.6 and

548.6, most likely corresponding to the sodiated Hex-Cer

and C34:1(OH)

-ceramide fragments, respectively, cor-

roborated the presence of a ceramide moiety, probably

containing sphingosine (d18:1) and palmitic acid

(C16:0) (Fig. 5C). Fig. 5D depicts the key fragments

observed in the MS

and MS

spectra of the major GM3

species of fraction F3A.

Due to the high amount of GM3 species, the original

(non-permethylated) fraction F3A was fractionated using

a SAX column to separate neutral and charged glycosphin-

golipids. The neutral glycosphingolipids (NGSLs) recov-

ered in the flow-through fraction were permethylated

(pMe) and analyzed by ESI-LIT-MS. Two major peaks at

m/z 1215 (pMe Galα1-3/4Galβ1-4Glcβ1-1Cer) (Fig. 6A)

and at m/z 1460 (pMe GalNacβ1-4Galα1-3/4Galβ1-

4Glcβ1-1Cer) (Fig. 6C) were detected by total-ion map-

ping (TIM) of m/z 667 (marker of Gb3 and iGb3) or m/z

912 (marker of Gb4 and iGb4). The fragmentation of m/z

1215 gave rise to m/z 667 (pMe Galα1-3/4Galβ1-4Glcβ1-

) with loss of ceramide, followed by loss of glucose (Glc)

corresponding to m/z 445 (pMe Galα1-3/4Gal-). The last

fragmentation gave rise to m/z 371 (1.3% relative abun-

dance) and m/z 211 (3.4% relative abundance), which are

markers characteristic of iGb3, as well as the predominant

peak at m/z 329 (100% of relative abundance), a marker

Identification and isolation of GM3 and iGb3 fromF3A and F4AFigure 4

Identification and isolation of GM3 and iGb3

fromF3A and F4A. A) Fractions 20 μg, GM3 5 μg and

iGb3 5 μg were chromatographed and stained with orcinol.

The region corresponding to Gb3/iGb3 in an F3A prepara-

tive HPTLC was scraped off and extracted with C-M (1:1).

The concentrated extract was examined by HPTLC and

revealed with orcinol (iF3A). B) The same procedure as in

(A) was used to examine F4A and generate iF4A. Arrows

indicate bands with R

corresponding to GM3 (double band)

in F3A and F4A; * the same for Gb3/iGb3.

F4A iF4A iGb3 GM3

F3A iF3A iGb3 GM3

F3A iF3A iGb3 GM3F3A iF3A iGb3 GM3

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 8 of 14

(page number not for citation purposes)

Electrospray ionization-linear ion trap-mass spectrometry (ESI-LIT-MS) of the major glycolipid species from F3A fractionFigure 5

Electrospray ionization-linear ion trap-mass spectrometry (ESI-LIT-MS) of the major glycolipid species from

F3A fraction. A) MS

spectrum of permethylated F3A. B) MS

spectrum of the singly-charged ion species ([M -H + 2 Na]

) at

m/z 1371.8 observed in A. C) MS

spectrum of the major daughter-ion species at m/z 996.7 observed in B. D) Summary of key

fragments observed in the MS

and MS

spectra of permethylated GM3 species at m/z 1372. For simplification, the proposed

GM3 structure is depicted without permethylation. m/z, mass to charge ratio.

GM3

species

1000 110 0 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

m/z

100

Relative Abundance (%)

1372

1402

1484

1456

1514

1358

ITMS + p NSI

Full ms

NL: 3.94e6

1428

996.7

824.4

449.2

1341.8

1371.8

[M – NANA + Na]

[M – H

COH + Na]

[NANA-Hex-Hex + Na]

[Hex-Hex + Na]

MS2: 1371.8@55%

NL: 7.60e5

[M + Na]

400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

m/z

100

Relative Abundance (%)

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

m/z

100

Relative Abundance (%)

449.2

966.7

996.7

792.6

548.6

[M – NANA + Na]

[M –NANA –H

COH + Na]

[C34:1(OH)

-Cer – H

O + H]

[Hex-Cer + Na]

[Hex-Hex + Na]

MS3: 1371.8@55% ĺ 996.7@55%

NL: 2.55e5

+ Na

1371.8 996.7

792.6

548.6

NANA

Gal

Glc

Cer

824.4

449.2

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 9 of 14

(page number not for citation purposes)

of Gb3 (Fig. 6B). These peaks and those at m/z 227, 259,

315, 413, and 415 are consistent with those found by Li et

al. (2008), who described the fragmentation of the nonre-

ducing terminal disaccharide-1-ene of iGb3 and Gb3. The

results showed, therefore, that F3A contains a mixture of

iGb3 and Gb3. The amount of iGb3 in the sample was cal-

culated (see equation below), corrected according to the

A(iGb3)

211

in iGb3 (expected/maximum = 100/79 = 1.27,

correction factor).

Fragmentation of m/z 1460 (Fig. 6D) involved primarily a

loss of ceramide giving rise to m/z 912 (pMe GalNacβ1-

4Galα1-3/4Galβ1-4Glcβ1-), followed by loss of glucose,

m/z 690 (pMe GalNacβ1-4Galα1-3/4Galβ1-), and finally

loss of N-acetyl-galactosamine, with remaining pMe dis-

accharide Galα1/4Gal and Galα1/3Gal (m/z 431). Frag-

mentation of these generated markers of

isoglobotetraosylceramide (iGb4), m/z 329 (2.5%), m/z

357 (1.4%) and m/z 369 (2.7%), and a major peak char-

acteristic of globotetraosylceramide (Gb4) at m/z 315. Dif-

fering from the MS analysis of iGb3/Gb3, that of iGb4/

Gb4 is not quantitative. A summary of the fragmentation

AiGb AiGb AiGb AiGb

sample corr cor

() (() ())/[()3333

211 371 211

AiGb x

AGb x

=+ ++ =

()

()](. .)/[. . ].

3 1 65 3 4 1 65 3 4 2 100 0

371

329

0025 2 5(.%).

ESI-LIT-MS analysis of GM3-depleted permethylated neutral glycolipids of F3A fractionFigure 6

ESI-LIT-MS analysis of GM3-depleted permethylated neutral glycolipids of F3A fraction. A) Total ion-mapping of

m/z 667, marker of Gb3 and iGb3. B) MS

spectrum of the daughter-ion m/z 445 obtained after MS

fragmentation (not shown)

of the parent-ion at m/z 1215 observed in A. The fragments at m/z 371 (3.4%) and m/z 211(1.3%) are typical of iGb3, whereas

the fragment at m/z 329 (100%) is a marker of Gb3. C) Total ion-mapping (TIM) of m/z 912, marker of Gb4 and iGb4. D) MS

spectrum of the daughter-ion m/z 431 obtained after MS

fragmentation (not shown) of the parent-ion at m/z 1460 observed in

B . The fragments at m/z 329 (2.5%), m/z 357 (1.4%), and m/z 369 (2.7%) are characteristic of iGb4, whereas the fragment at m/

z 315 (100%) is a marker of Gb4. m/z, mass to charge ratio.

iGb3

marker

(1.3%)

iGb3

marker

(3.4%)

x10

120 160 200 240 280 320 360 400 440 480

m/z

100

Relative Abundance (%)

329

413

259

227

315

371

211

ITMS + p NSI

Full MS4 m/z 445

NL: 1.00

Gb3

marker

(100%)

415

1215

m/z

Relative Abundance (%)

ITMS + p NSI

NL: 1.7e2

1011

1089

1071

1243

1325

100

1000 1100 1200 1300 1400

1216

1217

iGb4

marker

(2.7%)

x20

iGb4

marker

(2.5%)

iGb4

marker

(1.4%)

ITMS + p NSI

Full MS5 m/z 431

NL: 0.64

120 160 200 240 280 320 360 400 440 480

m/z

100

Relative Abundance (%)

315

399

245

227

401

209

171

301

431

283

181

195

369

329

357

Gb4

marker

(100%)

ITMS + p NSI

NL: 2.2e3

m/z

Relative Abundance (%)

1460

100

1488

1516

1544

1400 1450 1500 1550 1600

1570

1461

1462

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 10 of 14

(page number not for citation purposes)

sequences of permethylated NGSLs from fraction F3A is

shown on Fig. 7.

Stimulation of DN32D3 cells with iGb3

Since iGb3 was identified in F3A fraction of melanoma

cells and since the fraction also contained GM3 which

exerted an inhibitory activity on NKT cell stimulation we

tested the effect in this system of purified iGb3. On Fig. 8A

it is shown that iGb3 was able to stimulate NKT cells in a

dose-dependent manner being presented by BMDCs.

When compared to α-GalCer, however, iGb3 was 100-

fold less potent in terms of NKT cell stimulation and IL-2

production, but could still be used in microgram quanti-

ties for in vivo tests.

DC cells incubated with 1 μg/ml of iGb3 and analyzed by

FACS showed increased expression (50%) of CD1d and

slight increase of CD80 and CD86 (data not shown).

In vitro iGb3 cytotoxicity assay in B16F10-Nex2 cells

B16F10-Nex2 cells were incubated with [

H] thymidine

for 24 h and co-cultured for 4 h with DN32D3 NKT cells

activated by BMDCs primed with iGb3 (20 μg/ml) or

unprimed. The NKT (effector) cells were added at rates of

12 to 400 cells per tumor cell (target). At 100-200 iGb3-

activated NKT effector cells to 1 target cell ratio there was

a net 40% lysis of the tumor cells (Fig. 8B) after subtrac-

tion of the control lysis with no exogenous activation of

NKT cells.

In vivo anti-tumor protection of BMDC primed with iGb3

and -GalCer

Effective treatment of mice challenged intravenously with

B16F10-Nex2 cells was investigated using BMDCs primed

with iGb3 (20 μg/ml) and α-GalCer (200 ng/ml). Mice

were injected with 5 × 10

melanoma cells/100 μl/animal

and treated on days 2 and 4 with BMDCs primed with gly-

colipids. On Fig. 9A we show that animals treated with α-

GalCer and iGb3-primed BMDCs had 4-fold fewer nod-

ules than animals treated with unprimed DC. Clearly on

Fig. 9B we show that lungs of animals treated with BMDC-

glycolipids have very few nodules when compared to the

control animals. These results show that iGb3 similarly

with α-GalCer can display anti-tumor activity when pre-

sented by BMDCs. That the anti-tumor effect depended on

cytotoxic NKT cells is inferred from the inability of iGb3-

treated BMDCs from CD1d-KO mice to show any protec-

tive activity (not shown).

Discussion

NKT cells are at the edge of innate and adaptive immunity,

and have important roles in infectious diseases, autoim-

munity and cancer modulating activity, either promoting

or inhibiting tumor development. Clearly different sub-

types, time of activation, soluble or cell-bound ligands are

involved in these contradictory effects. Generally, anti-

tumor activities are linked to direct cytotoxicity of type I

NKT cells expressing perforin, FasL, TRAIL, but mainly

IFN-γ that activates other immune cells such as DCs, NK

Summary of fragmentation products in positive-ion mode ion trap-mass spectrometry of permethylated neutral glycolipids of fraction F3AFigure 7

Summary of fragmentation products in positive-ion mode ion trap-mass spectrometry of permethylated neu-

tral glycolipids of fraction F3A. iGb3 and Gb3 as well as iGb4 and Gb4 are recognized by the fragmentation of the disac-

charide-1-ene ions (m/z 445 and m/z 431, respectively). F, fragment ions; FNa+, fragment with Na+ adduct.

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 11 of 14

(page number not for citation purposes)

cells and T cells [23]. These cells also produce IL-4 upon

activation with α-GalCer in the mouse, but after initial

stimulation, NKT cells are polarized for the production of

IL-4 with simultaneous increase in serum IgE levels, thus

modulating the immune response toward a Th2 pheno-

type [24]. Type II NKT cells are regulatory cells that sup-

press CD8

CTL-mediated antitumor activities. In a model

of tumor recurrence the CD8

T cell-mediated immuno-

surveillance was suppressed by IL-13 producing CD1d-

restricted CD4

T cells [25]. We also found evidence that

regulating NKT cells could be involved in the immune

response against B16F10-Nex2 melanoma in the mouse

by the protective effect exerted by the neutralization of IL-

13 using an IL-13Rα2-Fc chimera, enhanced by IL-12 [26].

In the present work, it is evident that type I NKT cells

(invariant or iNKT) play an important role in the protec-

tion against B16F10-Nex2 melanoma cells based on the

enhanced tumor progression in CD1d-KO animals. At a

limited density of tumor cells, WT mice showed increased

survival and after 70 days of tumor challenge, 20% of ani-

mals were still alive. IFN-γ-producing iNKT cells seem-

ingly play a role in anti-tumor protection by activating

other cytotoxic lymphocytes mainly through Th1 cytokine

cascades. Rejection of tumor was also observed when the

activation of iNKT cells by yet unidentified tumor-derived

ligands fostered a CD4

and CD8

adaptive immune

response [27].

iGb3-stimulated DN32D3 NKT cells are cytotoxic to B16F10-Nex2 melanoma cellsFigure 8

iGb3-stimulated DN32D3 NKT cells are cytotoxic to

B16F10-Nex2 melanoma cells. A) BMDCs were pulsed

with iGb3 for 24 h, co-cultured with DN32D3 NKT cells for

18 h, and IL-2 production was measured in the supernatant

by ELISA. The results are representative of three independ-

ent experiments. B) BMDCs were primed with 20 μg/ml

iGb3 for 24 h and co-cultured with NKT hybridoma cells for

4 h. B16F10-Nex2 cells were previously incubated with 5 μCi

of [

H] thymidine for 24 h. Melanoma and NKT cells were

co-cultured at the target/effector cell ratio indicated and the

cytotoxic (lytic) effect was measured as described in Material

and Methods.

0.5

1.5

2.5

3.5

100 12 3 1 ctr

iGb3 (ȝg/ml)

IL-2 (ng/ml)

1/12 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400

Target/Effector cells ratio

Lysis (%)

In vivo antitumor effects of α-GalCer and iGb3Figure 9

In vivo antitumor effects of α-GalCer and iGb3. A) In

vivo protection by α-GalCer (200 ng/mL) and iGb3 (20 μg/ml)

against lung colonization by B16F10-Nex2 melanoma cells (1

× 10

) injected i.v. in C57Bl/6 mice (5 animals/group). Glycol-

ipid-primed BMDCs or unprimed BMDCs were administered

on days 2 and 4 after challenge. Ctr, control, unprimed naïve

BMDCs; B) Lungs representative of animals treated with

unprimed and glycolipid-primed BMDCs after 13 days of

tumor challenge. The experiments are representative of at

least 2 independent experiments. *p < 0.05, compared to the

control.

100

150

200

250

ctr Į-GalCer iGb3

No. Lung metastases

100

150

200

250

ctr Į-GalCer iGb3

No. Lung metastases

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 12 of 14

(page number not for citation purposes)

For a CD1d-restricted protective response of iNKT cells in

the B16F10-Nex2 system, endogenous lipid components

of tumor cells should be recognized and we hypothesized

that they could be glycosphingolipids expressed on tumor

cells, particularly iGb3. Apparently, Vα14 TCR in iNKT

cells befits the foreign archetype ligand α-GalCer and the

recently described endogenous iGb3 [12,13] by adopting

two different conformations [28]. Although iGb3 has

been described as a candidate for the main endogenous

ligand of iNKT cells the biochemical fractionation of nat-

ural antigens is hampered by their low abundance in the

starting materials used. In fact, iGb3 was not found in

mouse or human thymus or DCs using a sensitive HPLC

assay [29]. Another report claimed that humans lack iGb3

due to the absence of a functional iGb3 synthase [30]. It

would seem, based on these reports, that iGb3 is unlikely

to be a physiologically relevant NKT cell-selecting ligand

in mouse and humans. In contrast to these reports, how-

ever, isoglobo and globo series tetraglycosylceramides

have recently been identified in human thymus, and iGb3

and iGb4 have been identified in the mouse thymus using

the more sensitive ESI-LIT-MS [14,15,21]. As pointed out

by Li et al. [21] in relation to the pseudogene hypothesis

of human iGb3 synthase, mRNA transcripts for iGb3 syn-

thase in human thymus have otherwise been recently

detected and a full-length cDNA has been cloned (unpub-

lished data).

In B16F10-Nex2 cells iNKT stimulating components were

present in the cytoplasm and cell membrane fractions.

Orcinol- and resorcinol-reacting glycolipids were

extracted from the subcutaneously grafted tumor with a

predominance of GM3 as expected for murine melanoma

cells. The fractions obtained after Folch's partition also

showed the presence of a glycolipid with the same R

iGb3 standard in HPTLC. The amount was quite small but

a preparative chromatography succeeded in the enrich-

ment of this species. Both GM3 and neutral glycolipids

had their presence confirmed in the permethylated form

by ESI-MS. Fragmentation of a predominant peak from

GM3 by MS

and MS

showed the presence of N-acetyl-

neuraminic acid and C34:1-(OH)

-ceramide, most likely

containing sphingosine (d18:1) and palmitic acid

(C16:0). Other species with different lipid moieties were

also shown in permethylated derivatives and are compat-

ible with the double band in HPTLC, a common charac-

teristic of GM3 [31]. The disproportionate amount of

GM3 in relation to iGb3 may explain the low NKT cell

stimulation of melanoma lipid fractions containing a

mixture of these glycolipids. Indeed, GM3 showed inhib-

itory activity of NKT cells [32] and it is generally accepted

that gangliosides are immunosuppressive cell surface

molecules often present in high concentrations in tumor

cells. These molecules may inhibit the immune response

that is implicated in tumor rejection. B16 murine

melanoma sublines with pharmacologically decreased

concentration of gangliosides produced fewer tumors in

mice than untreated cells [33]. Moreover, a GM3-conju-

gated vaccine induced anti-tumor activity against B16

melanoma in vitro and in vivo, and this effect was anti-

body-dependent [34]. Here, we observed that with

nonprimed BMDC, the background production of IL-2 by

NKT cells was completely inhibited by GM3.

Even considering the low amounts of isoglobotri- and iso-

tetrahexosyl ceramides (iGb3 and iGb4) in mammalian

cells they were identified in B16F10-Nex2 melanoma

along with predominant globotrihexosyl and globotetra-

hexosyl ceramide (Gb3 and Gb4) components by ion trap

mass spectrometry. Functionally, only iGb3 can stimulate

NKT cells [12] but iGb4 is converted to iGb3 in cells

expressing β-hexosaminidase B thus increasing the

amount of reactive ligands. Hexb

-/-

DCs fail to generate

iGb3 in the lysosome because they lack the β-hexosamin-

idase B required to remove the terminal GalNAc from

iGb4 [35].

In vitro, exogenous addition of iGb3 to BMDCs aiming at

iNKT cell activation was 100-fold less effective than α-Gal-

Cer as measured by IL-2 production. We found that iGb3

at 1 μg/ml or α-GalCer at 10 ng/ml activated NKT cells to

produce 1 ng/ml of IL-2. Why should then studies on

iGb3 be pursued on tumor cells apart from the fact that

these isoglobohexosylceramides be endogenous constitu-

ents of these cells possibly in higher amounts than in nor-

mal cells? In B16F10-Nex2 cells iGb3 and iGb4 (precursor

of iGb3) are natural effector molecules that may be shed

in the microenvironment and thus be processed and pre-

sented by DCs to iNKT cells able to lyse tumor cells and to

produce cytokines. This is an important component of the

immunosurveillance in C57Bl/6 mice since CD1d-KO

animals are significantly more susceptible to melanoma

growth than WT mice. This effect is regulated by GM3

which is abundantly expressed at the tumor cell surface. In

a melanoma metastatic model, however, we found that

iGb3 (20 μg/ml)-loaded CD11c

CD1d

BMDCs reduced

the number of lung nodules 4-fold, the same level of anti

tumor protection obtained with α-GalCer at 200 ng/ml.

Recognition that iGb3 can be protective against tumors

when presented by DCs, suggests that a Th-1 immune

response has been stimulated. Therefore iGb3 is an

important mediator of iNKT cell activation which may

contribute to host resistance to melanoma. To be used

pharmacologically modifications in iGb3 structure are

being investigated to improve its stimulatory activity. The

iGb3 analog 4"'-dh-iGb3 (nonreducing terminal Gal

deoxidized at 4-OH) and 4-OH-iGb3 (additional

hydroxyl group on C4 of phytosphingosine) promoted

significantly greater IFN-γ production [36]. Although 4"'-

dh-iGb3 is still less potent than α-GalCer, the latter exerts

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 13 of 14

(page number not for citation purposes)

such a strong activation of NKT cells with a single admin-

istration that they become anergic to α-GalCer restimula-

tion for at least 30 days [37,38]. Moreover, α-GalCer may

activate iNKT cells to produce both Th-1 and Th-2

cytokines thus limiting its therapeutic effectiveness.

Chemical derivatives of α-Gal Cer with modified cera-

mides are being tested aiming at immune responses spe-

cifically directed to a Th-1 or Th-2 type [39].

It is conceivable that other components in the lipid frac-

tions of B16F10-Nex2 melanoma may activate NKT cells.

Such activity would be difficult to detect in a complex

mixture containing inhibitory GM3 species. We looked at

the neutral glycolipid fraction after removal of acidic spe-

cies and besides the globo- and isoglobohexosides identi-

fied, we also detected several dihexosylceramide species

with different ceramide composition (data not shown).

Further fractionation and structural and functional analy-

sis of the neutral glycolipid fraction and other B16F10-

Nex2 melanoma-derived lipid fractions are necessary to

explore this issue.

In conclusion, glycolipids iGb3, Gb3, iGb4 and Gb4 have

been identified in murine melanoma cells. Our results

demonstrate the important role of iNKT cells in the

immune cellular protection against susceptible animals

challenged with murine B16F10-Nex2 melanoma cells

and show the activation of these cells by iGb3 and nega-

tive modulation by GM3. BMDCs primed with iGb3 pro-

tected against tumor development and metastasis and this

effect depended on CD1d-restricted iNKTs. The present

study stimulates further investigation on the use of iGb3

and derivatives in the immunopharmacology of

melanoma and other tumors.

Abbreviations

BMDC: bone marrow dendritic cells; WT: wild type; KO:

knock-out; FBS: fetal bovine serum; Gb3 and iGb3: globo-

and isoglobotrihexosylceramide; Gb4 and iGb4: globo-

and isoglobotetrahexosylceramide; ESI-LIT-MS: electro-

spray ionization-linear ion trap-mass spectrometry; iNKT:

invariant natural killer T cells; TCR: T cell receptor;

HPTLC: high performance thin layer chromatography;

GM3: monosialylglycosphingolipid (NANA-Hex-Hex-

Cer); C-M-W: chloroform, methanol, water; GM-CSF:

granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Authors' contributions

BRD designed and performed all biochemical and cell

biological experiments, carried out data analysis and

drafted the manuscript. EGR assisted in cell biological and

immunological experiments, in vivo experiments and

their design. LN assisted in the early lipid extractions and

characterization as well as in the final draft of the manu-

script. ESN and ICA extracted and purified glycosphingol-

ipids, designed and carried out the ESI-LIT-MS

experiments, elaborated MS figures, and wrote part of the

manuscript (MS data). LRT, as Chairman of UNONEX

conceived the study, coordinated its execution and design,

and drafted and produced the final version of the manu-

script. All authors read and approved the present version

of the manuscript.

Acknowledgements

BRD was recipient of a Ph.D. fellowship from Fundação de Amparo a

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). EGR, LN and LRT are recipients

of Brazilian National Research Council (CNPq) fellowships. ESN was par-

tially supported by the George A. Krutilek memorial graduate scholarship

from Graduate School, UTEP. ICA was partially supported by the NIH

grant # 5G12RR008124. We thank the Biomolecule Analysis Core Analysis

at the Border Biomedical Research Center/Biology/UTEP (NIH grant #

5G12RR008124) for the access to the ESI-LIT-MS equipment.

References

1. Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ, McCabe D, Sun WH, Sondel PM,

Grota K, Yang NS: Gene gun-mediated skin transfection with

interleukin 12 gene results in regression of established pri-

mary and metastatic murine tumors. Proc Natl Acad Sci USA

1996, 93:6291-6296.

2. Park SH, Kyin T, Bendelac A, Carnaud C: The contribution of

NKT cells, NK cells and other gamma-chain-dependent non-

T non-B cells to IL-12 mediated rejection of tumors. J Immu-

nol 2003, 170:1197-1201.

3. Rodrigues EG, Garofalo AS, Travassos LR: Endogenous accumula-

tion of IFN-gamma in IFN-gamma-R(-/-) mice increases

resistance to B16F10-Nex2 murine melanoma: a model for

direct IFN-gamma anti-tumor cytotoxicity in vitro and in

vivo. Cytokines Cell Mol Ther 2002, 7:107-116.

4. Cui J, Shin T, Kawano T, Sato H, Kondo E, Toura I, Kaneko Y, Motoki

K, Ueno H, Nakagawa R, Sato H, Kondo E, Koseki H, Taniguchi M:

Requirement for Vα14 NKT cells in IL-12-mediated rejec-

tion of tumors. Science 1997, 278:1623-1626.

5. Bendelac A, Savage PB, Teyton L: The Biology of NKT Cells. Annu

Rev Immunology 2007, 25:297-336.

6. Seino K, Taniguchi M: Functionally distinct NKT cell subsets

and subtypes. J Exp Med 2005, 202:1623-1626.

7. Toura I, Kawano T, Akutsu Y, Nakayama T, Ochiai T, Taniguchi M:

Cutting edge: inhibition of experimental tumor metastasis

by dendritic cells pulsed with alpha-galactosylceramide. J

Immunol 1999, 163:2387-2391.

8. Sriram V, Du W, Gervay-Haque J, Brutkiewicz RR: Cell wall gly-

cosphingolipids of Sphingomonas paucimobilis are CD1d-spe-

cific ligands for NKT cells. Eur J Immunol 2005, 35:1692-1701.

9. Kinjo Y, Tupin E, Wu D, Fujio M, Garcia-Navarro R, Benhnia MR,

Zajonc DM, Ben-Menachem G, Ainge GD, Painter GF, Khurana A,

Hoebe K, Behar SM, Beutler B, Wilson IA, Tsuji M, Sellati TJ, Wong

CH, Kronenberg M: Natural killer T cells recognize diacylglyc-

erol antigens from pathogenic bacteria. Nat Immunol 2006,

7:978-986.

10. Amprey JL, Im JS, Turco SJ, Murray HW, Illarionov PA, Besra GS, Por-

celli SA, Späth GF: A subset of liver NK T cells is activated dur-

ing Leishmania donovani infection by CD1d-bound

lipophosphoglycan. J Exp Med 2004, 200:895-904.

11. Fischer K, Scotet E, Niemeyer M, Koebernick H, Zerrahn J, Maillet S,

Hurwitz R, Kursar M, Bonneville M, Kaufmann SH, Schaible UE:

Mycobacterial phosphatidylinositol mannoside is a natural

antigen for CD1d-restricted T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2004,

101:10685-10690.

12. Zhou D, Mattner J, Cantu C, Schrantz N, Yin N, Gao Y, Sagiv Y, Hud-

speth K, Wu YP, Yamashita T, Teneberg S, Wang D, Proia RL, Levery

Publish with BioMed Central and every

scientist can read your work free of charge

"BioMed Central will be the most significant development for

disseminating the results of biomedical research in our lifetime."

Sir Paul Nurse, Cancer Research UK

Your research papers will be:

available free of charge to the entire biomedical community

peer reviewed and published immediately upon acceptance

cited in PubMed and archived on PubMed Central

yours — you keep the copyright

Submit your manuscript here:

http://www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asp

BioMedcentral

Molecular Cancer 2009, 8:116 http://www.molecular-cancer.com/content/8/1/116

Page 14 of 14

(page number not for citation purposes)

SB, Savage PB, Teyton L, Bendelac A: Lysosomal glycosphingolipid

recognition by NKT cells. Science 2004, 306:1687-1689.

13. Zhou D: The immunological function of iGb3. Curr Protein Pept

Sci 2006, 7:325-333.

14. Li Y, Teneberg S, Thapa P, Bendelac A, Levery SB, Zhou D: Sensitive

detection of isoglobo and globo series tetraglycosylcera-

mides in human thymus by ion trap mass spectrometry. Gly-

cobiology 2008, 18:158-165.

15. Li Y, Thapa P, Hawke D, Kondo Y, Furukawa K, Furukawa K, Hsu F-

F, Adlercreutz D, Weadge J, Palcic MM, Wang PG, Levery SB, Zhou

D: Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell devel-

opment in mouse thymus. J Proteome Res 2009, 8:2740-2751.

16. Park S-H, Roark JH, Bendelac A: Tissue-Specific Recognition of

Mouse CD1 Molecules. J Immunol 1998, 160:3128-3134.

17. Lantz O, Bendelac A: An invariant T cell receptor α chain is

used by a unique subset of MHC class I-specific CD4+ and

CD4

T cells in mice and humans. J Exp Med 1994,

180:1097-1106.

18. Paschoalin T, Carmona AK, Rodrigues EG, Oliveira V, Monteiro HP,

Juliano MA, Juliano L, Travassos LR: Characterization of thimet

oligopeptidase and neurolysin activities in B16F10-Nex2

tumor cells and their involvement in angiogenesis and tumor

growth. Mol Cancer 2007, 6:44-58.

19. Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH: A simple method for the iso-

lation and purification of total lipides from animal tissues. J

Biol Chem 1957, 226:497-509.

20. Ciucanu I, Kerek F: A simple and rapid method for the per-

methylation of carbohydrates. Carbohydrate Research 1984,

131:209-217.

21. Li Y, Zhou D, Xia C, Wang PG, Levery SB: Sensitive quantitation

of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric com-

ponents using electrospray ionization-ion trap mass spec-

trometry. Glycobiology 2008, 18:166-176.

22. Ananias RZ, Rodrigues EG, Braga EG, Squaiella CC, Mussalem JS,

Longhini ALF, Travassos LR, Longo-Maugéri IM: Modulatory effect

of killed Propionibacterium acnes and its purified soluble

polysaccharide on peritoneal exudate cells from C57Bl/6

mice: major NKT cell recruitment and increased cytotoxic-

ity. Scand J Immunol 2007, 65:538-548.

23. Taniguchi M, Seino K, Nakayama T: The NKT cell system: bridg-

ing innate and acquired immunity. Nat Immunol 2003,

4:1164-1165.

24. Singh N, Hong S, Scherer DC, Serizawa I, Burdin N, Kronenberg M,

Koezuka Y, Van Kaer L: Cutting edge: activation of NKT cells by

CD1d and alpha-galactosylceramine directs conventional T

cells to the acquisition of a Th2 phenotype. J Immunol 1999,

163:2373-2377.

25. Terabe M, Matsui S, Noben-Trauth N, Chen H, Watson C, Donaldson

DD, Carbone DP, Paul WE, Berzofsky JA: NKT cell-mediated

repression of tumor immunosurveillance by IL-13 and the IL-

4R-STAT6 pathway. Nat Immunol 2000, 1:515-520.

26. Hebeler-Barbosa F, Rodrigues EG, Puccia R, Caires ACF, Travassos

LR: Gene therapy against murine melanoma B16F10-Nex2

using IL-13Rα2-Fc chimera and interleukin 12 in association

with a cyclopalladated drug. Translational Oncology 2008,

1:110-120.

27. Smyth MJ, Thia KY, Street SE, Cretney E, Trapani JA, Taniguchi M,

Kawano T, Pelikan SB, Crowe NY, Godfrey DI: Differential tumor

surveillance by natural killer (NK) and NKT cells. J Exp Med

2000, 191:661-668.

28. Zajonc DM, Savage PB, Bendelac A, Ian A, Wilson IA, Teyton L: Crys-

tal structures of mouse CD1d-iGb3 complex and its cognate

Vα14 T Cell receptor suggest a model for dual recognition of

foreign and self glycolipids. J Mol Biol 2008, 377:1104-1116.

29. Speak AO, Salio M, Neville DCA, Fontaine J, Priestman DA, Platt N,

Heare T, Butters TD, Dwek RA, Trottein F, Exley MA, Cerundolo V,

Platt FM: Implications for invariant natural killer T cell ligands

due to the restricted presence of isoglobotrihexosylcera-

mide in mammals. Proc Nat Acad Sci USA 2007, 104:5971-5976.

30. Christiansen D, Milland J, Mouhtouris E, Vaughan H, Pellicci DG,

McConville MJ, Godfrey DI, Mauro S, Sandrin MS: Humans lack

iGb3 due to the absence of functional iGb3-synthase: Impli-

cations for NKT cell development and transplantation. PLoS

Biol 2008, 6:1527-1538.

31. Seyfried TN, Yu RK, Saito M, Albert M: Ganglioside composition

of an experimental mouse brain tumor. Cancer Res 1987,

47:3538-3542.

32. Park J-E, Wu DY, Prendes M, Lu SX, Ragupathi G, Schrantz N, Chap-

man PB: Fine specificity of natural killer T cells against GD3

ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural

killer T-cell ligand. Immunology 2008, 123:145-155.

33. Deng W, Li R, Ladisch S: Influence of cellular ganglioside deple-

tion on tumor formation. J Nat Cancer Inst 2000, 92:912-917.

34. Carr A, Mazorra Z, Alonso DF, Mesa C, Valiente O, Gomez DE,

Perez R, Fernandez LE: A purified GM3 ganglioside conjugated

vaccine induces specific, adjuvant-dependent and non-tran-

sient antitumour activity against B16 mouse melanoma in

vitro and in vivo. Melanoma Res 2001, 11:

219-227.

35. Mattner J, DeBord KL, Ismail N, Goff RD, Cantu C III, Zhou D, Saint-

Mezard P, Wang V, Gao Y, Yin N, Hoebe K, Schneewind O, Walker

D, Beutler B, Teyton L, Savage PB, Bendelac A: Exogenous and

endogenous glycolipid antigens activate NKT cells during

microbial infections. Nature 2005, 434:525-529.

36. Shang P, Zhang C, Xia C, Chen W, Han Q, Wang PG, Zhang J, Tian

Z: Chemical modification of iGb3 increases IFN-γ production

by hepatic NKT cells. Int Immunopharm 2008, 8:645-653.

37. Sullivan BA, Kronenberg M: Activation or anergy: NKT cells are

stunned by alpha-galactosylceramide. J Clin Invest 2005,

115:2328-2329.

38. Parekh VV, Wilson MT, Olivares-Villagómez D, Singh AK, Wu L,

Wang CR, Joyce S, Van Kaer L: Glycolipid antigen induces long-

term natural killer T cell anergy in mice. J Clin Invest 2005,

115:2572-2583.

39. Savage PB, Teyton L, Bendelac A: Glycolipids for natural killer T

cells. Chem Soc Rev 2006, 35:771-779.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 