RESUMO
Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são
importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de
crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa
cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a
esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares
permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de
microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca
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do
retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de
ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em
diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que
metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da
sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois
controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação
do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros
das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5’-nucleotidase em frações solúvel e
microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização
bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da
atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes
de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na
fração microssomal. Os valores de K
M
aparente calculados a partir do plot de Eadie-
Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 μM e de V
max
71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg
de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal,
os valores de K
M
calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 μM, e os valores de
V
max
foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente.
Considerando a atividade da ecto-5’-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os
resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade
máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo
para ambas frações foi 9,5. Os valores de K
M
foram 59,7 μM e 134,8 μM com um valor
de V
max
calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e
microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5’-
nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade
na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5’-timidina monofosfato (p-Nph-5’-TMP)
como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência
para cations divalentes. Os valores de K
M
corresponderam a 118,5 e 91,9 μM e os
valores do V
max
calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína
para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no
coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além
disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação
do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo
de Ca
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para o retículo sarcoplasmático.
Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das
ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a
administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a
cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles
receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento
crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e
os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o
tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise
dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar
relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração.
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