( PDF ) Identicação de RNAs não-codicantes em vibrios

Download PDF

ads:

Laborat´orio Nacional de Computa¸c˜ao Cient´ıﬁca

Programa de P´os Gradua¸c˜ao em Modelagem Computacional

Identiﬁca¸c˜ao de RNAs n˜ao-codiﬁcantes em vibrios

Por

Ana Cristina Gomes Silveira

PETR

OPOLIS, RJ - BRASIL

MAIO DE 2010

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

IDENTIFICA¸C

AO DE RNAS N

AO-CODIFICANTES EM VIBRIOS

Ana Cristina Gomes Silveira

DISSERTA¸C

AO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO LABORAT

ORIO

NACIONAL DE COMPUTA¸C

AO CIENT

IFICA COMO PARTE DOS REQUI-

SITOS NECESS

ARIOS PARA A OBTEN ¸C

AO DO GRAU DE MESTRE EM

ENCIAS EM MODELAGEM COMPUTACIONAL

Aprovada por:

Prof. Fabiano L Thompson, D.Sc

(Presidente)

Prof. Ana Tereza R Vasconselos, D.Sc.

Prof. Marcio Alves-Ferreira, D.Sc.

Prof. Ana Carolina Vicente, D.Sc.

Prof. Marisa Fabiana Nicol´as, D.Sc.

Prof. Maur´ıcio Cant˜ao, D.Sc.

PETR

OPOLIS, RJ - BRASIL

MAIO DE 2010

ads:

Silveira, Ana Cristina Gomes

XXXX identiﬁca¸c˜ao de rnas n˜ao-codiﬁcantes em vibrios / Ana Cristina Gomes

Silveira. Petrop´olis, RJ. : Laborat´orio Nacional de Computa¸c˜ao Cient´ıﬁca,

2010.

xx, yy p. : il.; 29 cm

Orientadore(s): Fabiano L Thompson e Ana Tereza R Vasconselos

Disserta¸c˜ao (M.Sc.) – Laborat´orio Nacional de Computa¸c˜ao Cient´ıﬁca,

2010.

1. bioinform´atica. 2. ncRNA. 3. vibrio. 4. regula¸c˜ao gˆenica. I.

Thompson, Fabiano L. II. LNCC/MCT. III. T´ıtulo.

CDD XXX.XXX

e.p´ı.gra.fe

s. f. 1. Senten¸ca ou divisa posta no

frontisp´ıcio de um livro ou cap´ıtulo, no

come¸co de um discurso ou de uma

composi¸c˜ao po´etica. 2.Inscri¸c˜ao posta em

lugar vis´ıvel de um edif´ıcio.

(Fonte: Dic. Aur´elio.)

Dedicat´oria

Men¸c˜ao que o autor faz (homenagem) em

folha distinta.

Agradecimentos

O autor manifesta reconhecimentos `as pessoas e institui¸c˜oes que colaboraram

para a execu¸c˜ao de seu trabalho.

Resumo da Disserta¸c˜ao apresentada ao LNCC/MCT como parte dos requisitos

necess´arios para a obten¸c˜ao do grau de Mestre em Ciˆencias (M.Sc.)

IDENTIFICA¸C

AO DE RNAS N

AO-CODIFICANTES EM VIBRIOS

Ana Cristina Gomes Silveira

Maio , 2010

Orientador: Fabiano L Thompson, D.Sc

Co-orientador: Ana Tereza R Vasconselos, D.Sc.

A descoberta de RNA n˜ao-codiﬁcante (ncRNA) tem focado principalmente

nos genomas de eucariontes e de bact´erias patogˆenicas. Em vibrios, o que se co-

nhece at´e o momento sobre ncRNAs envolve V. cholerae N16961 e V. campbellii

ATCC BAA-1116. Neste estudo, s˜ao identiﬁcados genes candidatos de ncRNAs

no genoma de V. campbellii ATCC BAA-1116, V. alginolyticus 40B, V. communis

1DA3 e V. mimicus VM573. V. alginolyticus 40B e V. campbellii ATCC BAA-

1116 s˜ao abundantes em corais brasileiros, enquanto que V. mimicus VM573 ´e uma

linhagem toxigˆenica (CT e TCP positiva) at´ıpica desta esp´ecie. Para identiﬁcar

os ncRNAs atrav´es de an´alise in silico foram utilizadas ferramentas j´a dispon´ıveis

(Infernal e a base de dados Rfam) e programas em Perl desenvolvidos no presente

trabalho. A ferramenta Infernal e a base de dados Rfam s˜ao baseados em mo-

delo de covariˆancia (CM), um caso especial de gram´aticas estoc´asticas livres de

contexto (SCFG). Foram identiﬁcados at´e 38 ncRNAs por esp´ecie, os quais foram

classiﬁcados em sete classes de acordo com sua fun¸c˜ao regulat´oria e /ou estrutu-

ral (riboswitches, moduladores da atividade de prote´ınas, RNAs antisenso de a¸c˜ao

trans, RNAs antisenso de a¸c˜ao cis, ribonucleoproteinas, regula¸c˜ao por t´ermino de

transcri¸c˜ao e classiﬁca¸c˜ao desconhecida). O grupo mais abundante foi o riboswitch,

enquanto que o grupo menos abundante foi o ribonucleoproteina. Este trabalho

demonstrou que os ncRNAs apresentam uma ampla diversidade de classes funci-

vii

onais, estando possivelmente associados com a regula¸c˜ao de diferentes processos

celulares.

viii

Abstract of Dissertation presented to LNCC/MCT as a partial fulﬁllment of the

requirements for the degree of Master of Sciences (M.Sc.)

IDENTIFICATION OF NON-CODING RNAS IN VIBRIOS

Ana Cristina Gomes Silveira

May, 2010

Advisor: Fabiano L Thompson, D.Sc

Co-advisor: Ana Tereza R Vasconselos, D.Sc.

The discovery of the non-coding RNA (ncRNA) has been primarily focu-

sed on the genomes of eukaryotes and pathogenic bacteria. In vibrios, all that is

known up to now regarding ncRNAs involves V. cholerae N16961 e V. campbellii

ATCC BAA-1116. In this study, ncRNA candidate genes were identiﬁed in the

genomes of V. campbellii ATCC BAA-1116, V. alginolyticus 40B, V. communis

1DA3 e V. mimicus VM573. V. alginolyticus 40B and V. campbellii ATCC BAA-

1116 are abundant in brazilian corals, whereas V. mimicus VM573 is a toxic strain

(carrying the cholera toxin and the TCP genes) atypical to this species. In order

to identify the ncRNAs in silico, the tools Infernal and Rfam database were used.

Perl programs were developed in the present work. The Infernal tool and the Rfam

database are based on the Covariance Model (CM), a special case of Stochastic

Context Free Grammars (SCFG). Up to 38 ncRNAs were identiﬁed per species.

They were classiﬁed into seven classes according to their regulatory function and/or

structural (1. riboswitches, 2. modulators of protein activity, 3. RNA’s antisen-

sus of trans action, 4. RNA’s antisensus of cis action, 5. ribonucleoproteins, 6.

regulation by transcription termination and 7. unknown classiﬁcation). The most

abundant group was the riboswitch, whereas the less abundant group was the ri-

bonucleoprotein. This work demonstrated that the ncRNAs show a great diversity

in functional classes, possibly associated with the regulation of diﬀerent cellular

processes.

Sum´ario

1 Introdu¸c˜ao 1

1.1 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1 Objetivo Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.2 Objetivos Espec´ıﬁcos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Organiza¸c˜ao da Disserta¸c˜ao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2 Fundamentos e Conceitos de Biologia 3

2.1 Vibrios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1.1 Classiﬁca¸c˜ao, Caracter´ısticas e Ocorrˆencia . . . . . . . . . . 4

2.1.2 Bioﬁlmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.3 Ciclagem de Nutrientes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.1.4 Pat´ogenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.2 Regula¸c˜ao Gˆenica em Bact´erias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.2.1 Controle Transcricional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.3 RNAs n˜ao-codiﬁcantes e a Regula¸c˜ao Gˆenica . . . . . . . . . . . . . 16

2.3.1 ncRNAs participam de cascatas de regula¸c˜ao global . . . . . 21

2.3.2 ncRNAs participam de Quorum Sensing . . . . . . . . . . . 23

3 Ferramentas computacionais para detec¸c˜ao de ncRNAs 25

3.1 QRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2 RNAz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.3 Rsearch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.4 Infernal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.5 Rfam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.6 Escolha das Ferramentas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.7 Gram´atica Estoc´astica Livre de Contexto e Modelo de Covariˆancia . 33

4 Materiais e M´etodos 43

4.1 Dados de entrada originados do genoma V. campbellii ATCC BAA-

1116 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.2 Dados de entrada originados dos genomas de V. mimicus VM573,

V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.2.1 Sequenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.2.2 Anota¸c˜ao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.3 An´alise Computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.3.1 Identiﬁca¸c˜ao de Regi˜oes Intergˆenica em V. mimicus VM573,

V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 . . . . . . . . . . . 47

4.3.2 Identiﬁca¸c˜ao de Regi˜oes Intergˆenica em V. campbellii ATCC

BAA-1116 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.3.3 Preprocessamento da base de dados do Rfam . . . . . . . . . 49

4.3.4 Busca utilizando o infernal e a base de dados do Rfam . . . 49

4.3.5 Formata¸c˜ao dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.4 An´alise de desempenho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.5 Valida¸c˜ao experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

5 Resultados e Discuss˜ao 54

5.1 Identiﬁca¸c˜ao das Regi˜oes intergˆenicas em V. mimicus VM573, V.

alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 e V. campbellii ATCC BAA-

1116 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

5.2 Desempenho do programa de busca utilizando a base de dados pre-

processada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

5.3 Busca utilizando Infernal / Rfam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

xii

5.4 Formata¸c˜ao dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

5.5 Diversidade de ncRNAs nos genomas de vibrio . . . . . . . . . . . . 59

5.6 Express˜ao dos candidatos de ncRNAs em V. campbellii BAA-1116 . 68

6 Conclus˜oes e Trabalhos Futuros 72

Referˆencias Bibliogr´aﬁcas 74

Apˆendice

A Tabela resumida dos ncRNAs 92

B Tabela completa dos ncRNAs 96

C Artigo cient´ıﬁco 105

xiii

Lista de Figuras

Figura

2.1 Estrutura de um operon (adaptado de Snustad e Simmons, 2008). . 10

2.2 Regula¸c˜ao negativa de um operon. No primeiro momento mostra

o repressor ativo ligando-se ao operador e impedindo a transcri-

¸c˜ao. No segundo momento mostra o repressor inativo (pelo indutor)

deixando o operador livre e permitindo a transcri¸c˜ao dos genes es-

truturais (adaptado de Snustad e Simmons, 2008). . . . . . . . . . . 11

2.3 Regula¸c˜ao positiva de um operon (adaptado de Snustad e Simmons,

2008). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.4 Organiza¸c˜ao do operon lac em E. coli (adaptado de Stryer, 1992). . 13

2.5 Regula¸c˜ao da express˜ao do operon lac. (A) Ausˆencia de lactose: re-

pressor lac (gene i) se liga ao operador reprimindo a transcri¸c˜ao.(B)

Presen¸ca de lactose: a lactose inativa o repressor lac, viabilizando a

transcri¸c˜ao (adaptado de Stryer, 1992). . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.6 Regula¸c˜ao positiva da express˜ao do operon lac devido a forma¸c˜ao

do complexo AMPc-CAP (De Oliveira, 2005). . . . . . . . . . . . . 15

2.7 Diagrama do operon trp, mostrando o promotor (p), operador (o),

atenuador (a), gene para a sequˆencia leader (L) e os genes das enzi-

mas da via do trp (E, D, C, B e A) (adaptado de Stryer, 1992). . . 15

xiv

2.8 Modelo de atenua¸c˜ao do openor trp. (A) Alto n´ıvel de trp, o seg-

mento 3 e 4 se pareiam e formam a al¸ca de t´ermino de transcri¸c˜ao.

(B) Baixo n´ıvel de trp, o ribossomo p´ara no c´odon do trp no seg-

mento 1, formando uma nova al¸ca com os segmentos 2 e 3, que por

n˜ao ser t´emino de transcri¸c˜ao, ocorre a express˜ao dos genes subse-

quentes a este sitio de atenua¸c˜ao (Adaptado de Stryer, 1992). . . . 17

2.9 Exemplos de mecanismos de controle da express˜ao gˆenica mediada

por riboswitch (adaptado de Waters e Storz, 2009). . . . . . . . . . 20

2.10 Mecanismos de controle negativo da express˜ao gˆenica mediada por

RNAs antisenso de a¸c˜ao trans (adaptado de Waters e Storz, 2009). . 22

2.11 Mecanismos de controle positivo da express˜ao gˆenica mediada por

RNAs antisenso de a¸c˜ao trans (adaptado de Waters e Storz, 2009). . 22

2.12 Alguns exemplos da participa¸c˜ao de ncRNAs em cascatas de regu-

la¸c˜ao gobal (adaptado de Gottesman, 2005). . . . . . . . . . . . . . 23

3.1 Base dos modelos usados na ferramenta QRNA (Adaptado de Rivas

e Eddy, 2001). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.2 Hierarquia de Chomsky (adaptado da Wikipedia) . . . . . . . . . . 37

3.3 Exemplo de uma dada fam´ılia de RNA: A esquerda ´e representado o

alinhamento m´ultiplo de 3 sequˆencias, sendo que a linha [estrutura]

representa a estrutura secund´aria consenso. A direita ´e mostrada

a estrutura secund´aria da sequˆencia do RNA de humano, gerada a

partir da estrutura consenso (adaptado de Eddy, 2007). . . . . . . . 42

3.4 Alinhamento estrutural ´e convertido em ´arvore bin´aria. A esquerda

´e representado a estrutura secund´aria consenso derivada do alinha-

mento da ﬁgura anterior. A direita ´e representada a ´arvore CM

correspondente a estrutura consenso (adaptado de Eddy, 2007). . . 42

4.1 Fluxograma do preprocessamento da base Rfam. . . . . . . . . . . . 50

4.2 Fluxograma das etapas da an´alise computacional. . . . . . . . . . . 52

5.1 Express˜ao de ncRNAs ao longo do tempo, utilizando PCR de trans-

cri¸c˜ao reversa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

xvi

Lista de Tabelas

Tabela

2.1 Exemplos de fatores σ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.1 Estados do CM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.2 Os tipos de n´os usados na constru¸c˜ao da ´arvore bin´aria. . . . . . . . 41

4.1 Quantidade de ORFs por genoma gerada pelo programa de anota¸c˜ao

SABIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.2 Quantidade de contigs por cromossomo. Em alguns contigs n˜ao foi

poss´ıvel determinar o cromossomo de origem, sendo assim denomi-

nados de contigs sem identiﬁca¸c˜ao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.3 Quantidades de contigs sem ORFs e com ORFs (contigs ´uteis para

an´alise) em cada genoma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5.1 Quantidade de IGRs (total, menores do que 50 nt e maiores do que

50 nt) encontradas nos genomas de V. mimicus VM573, V. alginoly-

ticus 40B, V. communis 1DA3 e V. campbellii ATCC BAA-1116,

separadas por cromossomo: cromossomo I (Crom I), cromossomo II

(Crom II). As IGRs provenientes de contigs que n˜ao foram poss´ıveis

detectar o cromossomo que as originou, fazem parte da estat´ıstica

de cromossomo indeﬁnido (Crom -). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

5.2 Tamanhos das IGRs dos genomas de vibrio. . . . . . . . . . . . . . 55

5.3 Compara¸c˜ao dos tempos de execu¸c˜ao. . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

xvii

5.4 Quantidades de ncRNAs encontradas nos genomas de V. mimicus

VM573, V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 e V. campbellii

ATCC BAA-1116, separadas por cromossomo: cromossomo I (Crom

I), cromossomo II (Crom II) ou cromossomo indeﬁnido (Crom -). . . 57

5.5 Tabela de express˜ao dos ncRNAs em V. campbellii BAA-1116 (cro-

mossomo I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

5.6 Tabela de express˜ao dos ncRNAs em V. campbellii BAA-1116 (cro-

mossomo II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

xviii

Lista de Siglas e Abreviaturas

A: Adenina

AC: Adenilato Ciclase

AMP: Adenosina Monofosfato

ATP: Adenosina Trifosfato

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

BLOSUM: Blocks of Amino Acid Substitution Matrix

C: Citosina

cAMP (ou AMPc): AMP c´ıclico

CAP: Catabolite Activator Protein

c-di-GMP: diguanilato c´ıclico

CFG: Context Free Grammars

CM: Covariance Model

CPU (ou UCP): Unidade Central de Processamento

Crom (ou Cr): cromossomo

CRP: cAMPreceptor protein

CT: Toxina da C´olera

DNA (ou ADN):

Acido Desoxirribonucl´eico

E-value: Expect value

Fe: Ferro

FMN: Flavina Mononucleot´ıdeo

FTP: File Transfer Protocol

G: Guanina

xix

Gal: Galactose

GB: Giga Byte

Gly: Glicina

HAP: Hidrocarboneto Arom´atico Polic´ıclico

His: Histidina

H-NS: Histone-like nucleoid protein

IGR: Intergenic Region

Infernal: Inference of RNA Alignment

Lac: Lactose

Log: logar´ıtmo

MFE: Minimun Free Energy

Ion Magn´esio

miRNA: micro RNA

mRNA (ou RNAm): RNA mensageiro

NCBI: National Center for Biotechnology Information

ncRNA: RNA n˜ao-codiﬁcante

nt: nucleotideo

ORF: Open Reading Frame

p: signiﬁcˆancia estat´ıstica

pb: pares de base

PCR: Polimerase Chain Reaction

pH: potencial hidrogeniˆonico

RBS: Ribosome Binding Site

RIBOSUM: Ribosomal RNA Substitution Matrix

RNA (ou ARN):

Acido Ribonucleico

RNase: Ribonuclease

rRNA (ou RNAr): RNA ribossomal

RT-PCR: reverse transcriptase PCR

SABIA: System for Automated Bacterial Integrated Annotation

SCFG: Stochastic Context Free Grammars

SGE: Sun Grid Engine

snoRNA: small nucleolar RNA

snRNA: small nuclear RNA

sRNA: small RNA

SVM: Support Vector Machine

T: Timina

TCBS: Tiosulfato-Citrato-Bile-Sacarose

TCP: pilus co-regulado com a toxina

Thi: Tiamina

Thr: Treonina

TIR: Translation Initiation Region

TPP: Tiamina Pirofosfato

tRNA (ou RNAt): RNA transportador

Trp: Triptofano

U: Uracila

URL: Uniform Resource Locator

UTR: Untranslated Region

V. alginolyticus: Vibrio alginolyticus

V. campbellii: Vibrio campbellii

V. cholerae: Vibrio cholerae

V. communis: Vibrio communis

V. mimicus: Vibrio mimicus

∪: Uni˜ao

∩: Interse¸c˜ao

⊆: Contido ou igual

⊂: Contido

xxi

∈: Pertence

|: Tal que

→: Produ¸c˜ao

⇒: Deriva¸c˜ao

xxii

Cap´ıtulo 1

Introdu¸c˜ao

A bioinform´atica utiliza o conhecimento da ciˆencia da computa¸c˜ao com o

intuito de estudar temas biol´ogicos complexos. Neste estudo, o desaﬁo foi a identi-

ﬁca¸c˜ao de genes de ncRNAs do genoma de quatro esp´ecies de vibrios. Este estudo

foi realizado a artir dos genomas de V. mimicus VM573, V. alginolyticus 40B, V.

communis 1DA3 e V. campbellii ATCC BAA-1116. Os ncRNAs j´a descritos e com-

provados em outras esp´ecies de bact´erias foram identiﬁcados nestes trˆes genomas.

Para alcan¸car tais resultados seria muito demorado e pouco eﬁcaz utilizar uma

abordagem unicamente experimental, uma vez que um genoma bacteriano tem em

m´edia 4.000.000 pares de base. Portanto, a abordagem computacional torna-se

imprescind´ıvel neste contexto e ideal quando aliada a experimentos laboratoriais

subsequentes, para a valida¸c˜ao dos resultados gerados in silico. O presente tra-

balho resultou em um artigo cuja submiss˜ao foi aceita na revista internacional

Microbiology-UK. Este artigo encontra-se no apˆendice C.

1.1 Objetivos

1.1.1 Objetivo Geral

Realizar um estudo abrangente sobre as regi˜oes intergˆenicas por meio da bi-

oinform´atica para identiﬁcar genes de ncRNAs nos genomas de V. mimicus VM573,

V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 e V. campbellii ATCC BAA-1116.

1.1.2 Objetivos Espec´ıﬁcos

Identiﬁcar genes de ncRNAs nos genomas dos vibrios atrav´es de compara-

¸c˜oes com os dados conhecidos e conﬁrmados em outros genomas bacteria-

nos.

Identiﬁcar as ORFs que ladeiam os genes dos ncRNAs candidatos e a ﬁta

que as transcreve.

Veriﬁcar a eﬁciˆencia do m´etodo estabelecido neste trabalho para a identi-

ﬁca¸c˜ao dos ncRNAs candidatos.

1.2 Organiza¸c˜ao da Disserta¸c˜ao

Esta disserta¸c˜ao est´a organizada em 6 cap´ıtulos:

No cap´ıtulo 2 est˜ao fundamentados os conhecimentos de biologia necess´arios

para o entendimento do trabalho. Para tal ﬁnalidade, s˜ao apresentadas as princi-

pais caracter´ısticas dos organismos que pertencem ao grupo vibrio, s˜ao descritas as

formas mais conhecidas de regula¸c˜ao gˆenica em bact´erias e ﬁnalmente s˜ao descritos

os RNAs n˜ao-codiﬁcantes (ncRNAs) e algumas de suas fun¸c˜oes regulat´orias. No

cap´ıtulo 3 est˜ao descritos os desaﬁos encontrados na detec¸c˜ao de ncRNAs, s˜ao dis-

cutidos alguns trabalhos que descrevem t´ecnicas computacionais para identiﬁca¸c˜ao

de ncRNAs e detalhadas algumas t´ecnicas e modelos pertinentes ao entendimento

deste trabalho. No cap´ıtulo 4 s˜ao apresentados os m´etodos utilizados neste traba-

lho, incluindo os procedimentos de cada etapa do processo de busca e identiﬁca¸c˜ao

dos ncRNAs. No cap´ıtulo 5 s˜ao apresentados os resultados e discuss˜oes do modelo

de busca, bem como uma avalia¸c˜ao do desempenho computacional. Finalmente,

no cap´ıtulo 6 s˜ao apresentadas as conclus˜oes deste trabalho, destacando suas con-

tribui¸c˜oes, al´em de propostas de trabalhos futuros.

Cap´ıtulo 2

Fundamentos e Conceitos de Biologia

2.1 Vibrios

Em 1854, o m´edico italiano Filippo Pacini, ao estudar os surtos da c´olera

em Floren¸ca, descobriu a primeira esp´ecie de vibrio, V. cholerae. Esta descoberta

ocorreu ao examinar, com seu microsc´opio, a mucosa intestinal de v´ıtimas fatais

da doen¸ca e V. cholerae foi encontrada em todas as amostras (conforme o site de

referˆencia da UCLA

). No mesmo ano, John Snow, m´edico inglˆes e um dos mais

inﬂuentes sanitaristas de sua ´epoca, demonstrou que a contamina¸c˜ao da c´olera n˜ao

se dava pelo ar, como acreditava-se at´e ent˜ao, e sim atrav´es de ´agua contaminada

por fezes de doentes. Esta doen¸ca, que havia matado dezenas de milhares de pes-

soas na Inglaterra entre 1830 e 1850, foi eliminada das comunidades inglesas com a

aprova¸c˜ao das recomenda¸c˜oes sanit´arias preventivas propostas por Snow (segundo

o site de referˆencia da UCLA). Ap´os 30 anos, o m´edico alem˜ao Robert Koch, assim

como a maioria da comunidade cient´ıﬁca, n˜ao tinha conhecimento do trabalho de

Pacini na Universidade de Floren¸ca e no entanto, ambos de forma independente

chegaram a conclus˜ao que o V. cholerae era o agente etiol´ogico da c´olera. A desco-

berta de Koch tornou-se aceita pela comunidade cient´ıﬁca, tendo sido amplamente

divulgada na imprensa popular, tornando-se reconhecido como o descobridor do

organismo da c´olera, al´em de ter sido o primeiro a isolar V. cholerae em meio de

cultura (UCLA). Ap´os a descoberta do V. cholerae outras esp´ecies do grupo vibrio

UCLA, Department of Epidemiology. Who ﬁrst discovered vibrio cholerae

[http://www.ph.ucla.edu/epi/snow/ﬁrstdiscoveredcholera.html]

tem sido descoberta, com aproximadamente 115 esp´ecies conhecidas hoje.

2.1.1 Classiﬁca¸c˜ao, Caracter´ısticas e Ocorrˆencia

Os vibrios s˜ao integrantes da fam´ılia Vibrionaceae e pertencentes `a classe

Gammaproteobacteria. Este grupo est´a distribu´ıdo entre 6 gˆeneros distintos, ou

seja, Aliivibrio, Enterovibrio, Grimontia, Photobacterium, Salinivibrio e Vibrio. O

grupo dos vibrios (todas as esp´ecies da fam´ılia Vibrionaceae) compreendem 115

esp´ecies, sendo que somente o gˆenero Vibrio cont´em atualmente 73 esp´ecies. O

site de referˆencia de Euz´eby (LBSN

) apresenta a lista completa de esp´ecies.

Os vibrios s˜ao bact´erias Gram-negativas, em forma de bastonetes curvos, ge-

ralmente m´oveis, apresentam ﬂagelo polar, s˜ao mesof´ılicos e quimioorganotr´oﬁcos,

tˆem metabolismo fermentativo facultativo, s˜ao oxidase positivo, capazes de crescer

Agar Tiosulfato-Citrato-Bile-Sacarose (TCBS) e s˜ao encontrados em ambientes

aqu´aticos e em associa¸c˜ao com eucariontes. Os vibrios s˜ao ub´ıquos e abundantes no

ambiente aqu´atico. A elevada abundˆancia destes organismos tamb´em ´e detectada

em tecidos e/ou ´org˜aos de algas marinhas e de diversos animais como por exemplo,

corais, peixes, camar˜oes, esponjas, moluscos e zooplˆancton. Nos ´org˜aos luminosos

da lula Sepiolla spp. a popula¸c˜ao de v´ıbrios pode chegar a 10

c´elulas (Fido-

piastis et al., 1998; Nishiguchi, 2000). J´a na superf´ıcie externa de zooplˆancton,

os vibrios podem chegar a 4,3x10

c´elulas/mm

(Heidelberg et al., 2002) e em co-

p´epodos o V. cholerae pode chegar a 1,55x10

c´elulas/mm

(Rawlings et al., 2007).

2.1.2 Bioﬁlmes

Os vibrios podem formar bioﬁlmes. Bioﬁlmes s˜ao comunidades biol´ogicas

com um elevado grau de organiza¸c˜ao, onde as bact´erias formam comunidades es-

LBSN Formerly List of Bacterial names with Standing in Nomenclature

[http://www.bacterio.cict.fr/]

truturadas, coordenadas e funcionais imersas em matrizes polim´ericas produzidas

por elas pr´oprias (Davey e O’toole, 2000). Os bioﬁlmes s˜ao formados em qualquer

superf´ıcie e em qualquer ambiente e apresentam v´arias fun¸c˜oes que ser˜ao descritas

a seguir. O bioﬁlme favorece rela¸c˜oes simbi´oticas, sendo o exemplo t´ıpico em vibrio

a simbiose das V. logei, A. ﬁscheri com lula. Estas duas bact´erias colonizam os

´org˜aos luminosos do hospedeiro e atrav´es da emiss˜ao de luz desempenham pap´eis

na comunica¸c˜ao, atra¸c˜ao de presas e repuls˜ao de predadores, favorecendo assim seu

hospedeiro (Ruby, 1996).

Os bioﬁlmes proporcionam benef´ıcios aos organismos a eles associados. No

caso de vibrio, sua associa¸c˜ao aos bioﬁlmes constitui uma forma de prote¸c˜ao ao

seu desenvolvimento, como por exemplo em V. cholerae, V. parahaemolyticus, V.

harveyi, A. ﬁscheri e V.vulniﬁcus. O bioﬁlme confere a estas esp´ecies a habilidade

de alternar seu crescimento no ambiente aqu´atico e no interior de seus hospedeiros

(Yildiz e Visick, 2009). Outro benef´ıcio do bioﬁlme ´e o de permitir a sobrevivˆencia

dos vibrios em ambientes hostis, por exemplo em V. cholerae que pode formar o

bioﬁlme para protegˆe-lo contra o pH ´acido do estˆomago humano (Zhu e Mekala-

nos, 2003). Outras fun¸c˜oes do bioﬁlme que podem ser destacadas s˜ao: permitir a

utiliza¸c˜ao de nutrientes contidos no pr´oprio bioﬁlme, prote¸c˜ao contra predadores e

compostos antimicrobianos e possibilitar o estabelecimento de rela¸c˜oes favor´aveis

com outras bact´erias ou hospedeiros.

A forma¸c˜ao de bioﬁlme em vibrios ´e regulada pelo mecanismo de quorum

sensing, o qual ser´a explicado na sess˜ao 2.3.

2.1.3 Ciclagem de Nutrientes

Os vibrios tˆem um papel importante na ciclagem de nutrientes no meio aqu´a-

tico, atrav´es do consumo de mat´eria orgˆanica (Sherr e Sherr, 2002). Os vibrios

podem prover ´acidos graxos polinsaturados para a cadeia alimentar aqu´atica, su-

prindo organismos marinhos que n˜ao podem produz´ı-los de novo (Cottrell e Kir-

chman, 2003; Nichols, 2003). Vibrios s˜ao capazes de degradar quitina, um dos

polissacar´ıdeos mais abundantes nos oceanos, que serve de fonte de carbono e

nitrogˆenio para o crescimento (Riemann e Azam, 2002). V. harveyi secreta no m´ı-

nimo dez enzimas diferentes que degradam quitina (Suginta et al., 2004). Algumas

esp´ecies de vibrios s˜ao capazes de degradar hidrocarbonetos arom´aticos polic´ıclicos

(HAPs) presentes em sedimentos marinhos polu´ıdos (Hedlund e Staley, 2001).

2.1.4 Pat´ogenos

Os principais pat´ogenos humanos s˜ao V. cholerae, V. mimicus, V. parahae-

molyticus e V. vulniﬁcus. Apenas V. cholerae causa epidemias e pandemias. O V.

cholerae ´e o agente etiol´ogico da c´olera, que ´e uma infec¸c˜ao intestinal aguda, sendo

na maioria das vezes assintom´atica (em 90% das pessoas) ou produzindo diarr´eia

de pequena intensidade. Em menos de 10% dos infectados pode ocorrer diarr´eia

aquosa profunda, com r´apida evolu¸c˜ao para desidrata¸c˜ao grave e alta diminui¸c˜ao

da press˜ao sangu´ınea, podendo levar `a morte (os dados acima descritos foram ob-

tidos da CIVES

). Esta infec¸c˜ao ´e resultante da ingest˜ao de ´agua ou alimentos

contaminados com V. cholerae toxigˆenico. Existem mais de 200 sorogrupos e des-

tes apenas dois s˜ao toxigˆenicos, isto ´e, produzem a enterotoxina col´erica (CT) e o

pilis co-regulados com a toxina (TCP). Estas linhagens patogˆenicas tˆem causado

a morte de milhares de pessoas em todo o mundo, principalmente em pa´ıses sub-

desenvolvidos, onde o saneamento b´asico ainda ´e prec´ario (dado obtido da WHO

). Origin´aria da

Asia, mais precisamente da

India e de Bangladesh, a c´olera se

espalhou para outros continentes a partir de 1817. Chegou ao Brasil em 1885, in-

vadindo os estados do Amazonas, Bahia, Par´a e Rio de Janeiro, chegando em S˜ao

Cives Centro de Informa¸c˜ao em Sa´ude para Viajantes

[http://www.cives.ufrj.br/informacao/colera/col-iv.html]

WHO World Health Organization [www.who.int]

Paulo em 1893. No ﬁnal do s´eculo XIX, o governo brasileiro declarou que a doen¸ca

tinha sido erradicada do pa´ıs. Cerca de um s´eculo depois, em 1991, a c´olera chegou

novamente ao Brasil vinda do Peru. Dados recentes mostram que no Zimb´abue o

n´umero de casos suspeitos de c´olera foi de 98.424 com 4.276 ´obitos, de agosto de

2008 a maio de 2009 (dados obtidos da WHO). Na Guin´e-Bissau, foi reportado no

per´ıodo de maio at´e setembro de 2008 um total de 7166 casos de c´olera com 133

´obitos (dados obtidos da WHO).

O V. mimicus ´e outra esp´ecie importante dentro do genˆero Vibrio, pois tam-

b´em est´a associada a surtos de diarr´eia em humanos (Takahashi et al., 2007; Mizuno

et al., 2009). O V. mimicus ´e a esp´ecie ﬁlogeneticamente mais pr´oxima de V. cho-

lerae, tendo sido primeiramente identiﬁcada como uma linhagem de V. cholerae

bioquimicamente at´ıpica, incapaz de utilizar sacarose (DAVIS et al., 1981) e pos-

teriormente descrita como uma nova esp´ecie que mimetizava V. cholerae.

O V. parahaemolyticus causa gastroenterite em humanos, principalmente,

atrav´es de consumo de frutos do mar contaminados (DePaola et al., 2003; Drake

et al., 2007; Cho et al., 2008). Linhagens de V. parahaemolyticus de sorogrupos

O3:K6, O4:68 e O1:K tˆem sido respons´aveis por epidemias (Okuda et al., 1997;

Gonzalez-Escalona et al., 2005; Ansaruzzaman et al., 2008). Outras esp´ecies de

vibrios, por exemplo, Grimontia hollisae, Photobacterium damselae, V. alginoly-

ticus, V. cincinnatiensis, V. ﬂuvialis, V. furnisii, V. harveyi e V. metschnikovii

tˆem sido encontradas em infec¸c˜oes espor´adicas em humanos (Farmer J.J. III, 2005;

BRENNER et al., 1983; CARNAHAN et al., 1994; Yamane et al., 2004).

Al´em dos vibrios que afetam humanos, tamb´em s˜ao encontradas muitas esp´e-

cies de vibrios patogˆenicas para animais aqu´aticos (Austin e Zhang, 2006; Austin,

2010), entre elas est˜ao os V. anguillarum, A. salmonicida, V. vulniﬁcus, V. algi-

nolyticus, V. harveyi e V. campbellii, que s˜ao os principais pat´ogenos para v´arias

esp´ecies de peixes e camar˜oes. Por exemplo, V. alginolyticus pode causar septice-

mia, exoftalmia e ´ulceras em diferentes esp´ecies de peixes; V. harveyi pode causar

gastroenterite e ´ulceras em peixes al´em de vibriose luminosa em camar˜oes. V.

shilonii e V. coralliilyticus s˜ao os agentes causadores do branqueamento em corais

e a patogenicidade destes vibrios est´a relacionada ao aumento da temperatura da

´agua do mar (Ben-Haim et al., 2003; Rosenberg e Falkovitz, 2004). Estudos re-

centes mostram que h´a uma rela¸c˜ao direta entre o aumento de vibrios no muco de

corais e o aparecimento de doen¸cas nestes organismos (Bourne et al., 2008; Allers

et al., 2008; Dinsdale et al., 2008).

2.2 Regula¸c˜ao Gˆenica em Bact´erias

As bact´erias est˜ao expostas a altera¸c˜oes nas condi¸c˜oes ambientais tais como,

temperatura, pH, concentra¸c˜ao de oxigˆenio, disponibilidade de nutrientes e com-

postos t´oxicos. Essas altera¸c˜oes exigem pronta adapta¸c˜ao para garantir a sobre-

vivˆencia da popula¸c˜ao. A adaptabilidade das bact´erias depende em parte de sua

regula¸c˜ao gˆenica, ou seja, de sua capacidade de ligar e desligar a express˜ao de

conjuntos espec´ıﬁcos de genes em resposta a mudan¸cas ambientais. A express˜ao

de determinados genes ´e ligada quando os produtos destes genes s˜ao necess´arios

em um dado momento, quando eles n˜ao s˜ao mais necess´arios sua express˜ao ´e ent˜ao

desligada.

Alguns genes s˜ao ditos constitutivos, ou seja, s˜ao expressos de forma cons-

tante independente das varia¸c˜oes ambientais uma vez que seus produtos s˜ao essen-

ciais para a sobrevivˆencia do organismo, s˜ao exemplos de tais produtos as mol´eculas

de tRNA, rRNA, prote´ınas ribossomais, subunidades de RNA polimerase e as de-

mais enzimas que catalisam processos metab´olicos cuja fun¸c˜ao ´e a manuten¸c˜ao

celular. Estes genes, por conseguinte, n˜ao est˜ao sujeitos a regula¸c˜ao. Entretanto

existe uma gama de produtos gˆenicos que s˜ao necess´arios para o crescimento celu-

lar em apenas determinadas condi¸c˜oes ambientais, sendo neste caso um desperd´ıcio

de energia se sua s´ıntese fosse constitutiva. Estes genes est˜ao sujeitos a regula¸c˜ao

da express˜ao, permitindo que seus produtos aumentem ou diminuam em respos-

tas a sinais moleculares. Quando uma bact´eria encontra-se em um meio contendo

mol´eculas orgˆanicas essenciais para seu crescimento, esta bact´eria n˜ao sintetizar´a

tais mol´eculas a partir de precursores tamb´em presentes no meio, atendendo as-

sim ao princ´ıpio da economia de energia da c´elula. Do ponto de vista energ´etico,

a s´ıntese de compostos orgˆanicos requer processos altamente dispendiosos para a

c´elula, portanto regular os tipos e quantidades de compostos que ser˜ao sintetiza-

dos ´e muito efetivo para a otimiza¸c˜ao do crescimento de uma popula¸c˜ao bacteriana.

A express˜ao gˆenica pode ser regulada em diferentes n´ıveis do processo de

s´ıntese de prote´ına, tais como: transcri¸c˜ao, processamento de mRNA, renova¸c˜ao

de mRNA, tradu¸c˜ao e p´os-tradu¸c˜ao (Snustad D.P, 2008). Uma das mais estuda-

das ´e a regula¸c˜ao a n´ıvel transcricional, a qual requer intera¸c˜ao DNA-prote´ına. O

controle da express˜ao gˆenica ´e realizado por mecanismos reguladores positivos e

negativos. O mecanismo de controle positivo necessita de um ativador para ligar a

express˜ao de um ou mais genes estruturais. J´a no mecanismo de controle negativo

´e necess´ario um repressor para desligar a express˜ao de genes estruturais. Tanto

ativadores quanto repressores s˜ao produtos de genes reguladores que tem como

fun¸c˜ao, no caso da regula¸c˜ao a n´ıvel transcricional, controlar a express˜ao gˆenica

ligando-se a s´ıtios adjacentes aos promotores de genes estruturais.

2.2.1 Controle Transcricional

Em bact´erias, o principal mecanismo de controle da express˜ao gˆenica ´e a

regula¸c˜ao da quantidade de mRNA produzido a partir de um certo gene. As

principais prote´ınas que regulam o in´ıcio da transcri¸c˜ao atrav´es da RNA polimerase

s˜ao:

Repressores: impedem o acesso da RNA polimerase ao promotor.

Ativadores: potencializam a intera¸c˜ao entre a RNA polimerase e o promo-

tor.

Fatores de especiﬁcidade: altera a especiﬁcidade da RNA polimerase pelo

promotor (fatores σ).

2.2.1.1 Repressores e Ativadores

Em bact´erias, genes que est˜ao envolvidos num mesmo processo metab´olico

freq

uentemente comp˜oem uma unidade gen´etica de express˜ao coordenada chamada

operon. Cada operon cont´em um conjunto de genes estruturais cont´ıguos, um

promotor (o s´ıtio de liga¸c˜ao para a RNA polimerase) e um operador (o s´ıtio de

liga¸c˜ao para uma prote´ına reguladora, ou repressor) (ﬁgura 2.1). Um operon pode

sofrer, principalmente, regula¸c˜ao negativa e/ou regula¸c˜ao positiva.

Figura 2.1: Estrutura de um operon (adaptado de Snustad e Simmons, 2008).

A regula¸c˜ao negativa ocorre quando um repressor est´a ligado ao operador,

assim a RNA polimerase n˜ao pode transcrever os genes estruturais do operon. No

entanto, quando o operador encontra-se livre de repressor, a RNA polimerase pode

transcrever o operon (ﬁgura 2.2). Entretanto, a regula¸c˜ao positiva ocorre quando

uma prote´ına ativadora liga-se a uma regi˜ao espec´ıﬁca do promotor potencializando

a intera¸c˜ao entre RNA polimerase e promotor, e portanto a transcri¸c˜ao do operon ´e

intensiﬁcada (ﬁgura 2.3). Existem casos em que uma cole¸c˜ao de genes (que podem

estar organizados v´arios operons) ´e regulada por uma mesma mol´ecula. Nesse caso

´e dito que tais genes pertencem a um mesmo regulon. Os sistemas que regulam

simultaneamente v´arios operons, ou seja regulon, s˜ao chamados de mecanismo re-

gulat´orio global. Em vibrios, existem regulons associados com absor¸c˜ao de ferro,

Lux e patogenicidade (Antunes et al., 2007; Childers e Klose, 2007; Ahmad et al.,

2009)

Figura 2.2: Regula¸c˜ao negativa de um operon. No primeiro momento mostra o

repressor ativo ligando-se ao operador e impedindo a transcri¸c˜ao. No segundo

momento mostra o repressor inativo (pelo indutor) deixando o operador livre e

permitindo a transcri¸c˜ao dos genes estruturais (adaptado de Snustad e Simmons,

2008).

Figura 2.3: Regula¸c˜ao positiva de um operon (adaptado de Snustad e Simmons,

2008).

2.2.1.2 Fatores σ

A express˜ao gˆenica come¸ca com a liga¸c˜ao da RNA polimerase ao promotor

para iniciar a transcri¸c˜ao dos mais de 1000 operons e genes isolados de bact´erias.

Fator σ ´e uma subunidade da RNA polimerase de procariontes. Esta su-

bunidade est´a envolvida apenas no in´ıcio da transcri¸c˜ao e sua fun¸c˜ao ´e permitir

que a RNA polimerase reconhe¸ca especiﬁcamente as duas seq

uˆencias consenso na

regi˜ao promotora, -35 e -10, e assim dar in´ıcio `a transcri¸c˜ao. Pode-se dizer en-

t˜ao que os fatores σ determinam a especiﬁcidade da RNA polimerase, uma vez

que diferentes fatores σ conduzem esta enzima para promotores distintos (Snus-

tad D.P, 2008). A maioria das esp´ecies bacterianas tem diferentes fatores σ, sendo

o mais importante e principal deles o σ

, os demais s˜ao conhecidos como fatores

σ alternativos. O fator σ

permite o reconhecimento de promotores respons´a-

veis pela transcri¸c˜ao da maioria dos genes necess´arios ao crescimento exponencial

das c´elulas. A substitui¸c˜ao do fator σ principal por um outro alternativo, muda

radicalmente o reconhecimento de seq

uˆencias do promotor pela RNA polimerase.

Estes fatores σ alternativos permitem que a bact´eria promova mudan¸cas globais na

express˜ao gˆenica em resposta a determinados estresses ambientais. Por exemplo,

um aumento abrupto de temperatura provoca a express˜ao de prote´ınas de choque

t´ermico para contrapor os efeitos negativos do aquecimento elevado, os promotores

dos genes que expressam tais prote´ınas s˜ao reconhecidos apenas pela RNA poli-

merase quando esta encontra-se associada ao fator σ

ou fator σ

(Snustad D.P,

2008). Na tabela 2.1, est˜ao descritos alguns fatores σ, seus genes e suas especiﬁci-

dades (Snustad e Simmons, 2008).

Tabela 2.1: Exemplos de fatores σ.

Fator Gene Fun¸c˜ao e caracter´ısticas relevantes

rpoD Reconhecimento de promotores canˆonicos de express˜ao regular.

rpoH Reconhecimento de promotores de genes ligados ao choque t´ermico.

rpoF Reconhecimento de promotores de genes ﬂagelares e de quimiotaxia.

rpoN Reconhecimento de promotores de genes ligados ao metabolismo de nitrogˆenio.

rpoE Reconhecimento de promotores de genes ligados ao choque t´ermico extremo.

rpoS Reconhecimento de promotores de genes ligados a fase estacion´aria.

2.2.1.3 Operon de Lactose

O atual modelo de operon foi proposto por Jacob e Monod com base nos

estudos do operon de lactose em E. coli, tamb´em chamado de operon lac (JA-

COB e MONOD, 1961). Este operon ´e requerido para o transporte e metabo-

lismo da lactose. O operon lac cont´em um promotor (P), um operador (O) e 3

genes estruturais, lacZ, lacY e lacA, que codiﬁcam as enzimas β-galactosidase,β-

galactos´ıdeo-permease, β-galactos´ıdeo-transacetilase, respectivamente (ﬁgura 2.4).

A β-galactos´ıdeo-permease transporta lactose para o interior da c´elula, onde a β-

galactosidase a quebra em glicose e galactose (Stryer, 1992).

Figura 2.4: Organiza¸c˜ao do operon lac em E. coli (adaptado de Stryer, 1992).

O operon lac apresenta dois mecanismos de regula¸c˜ao. No primeiro, a re-

gula¸c˜ao ´e negativa e a prote´ına repressora, codiﬁcada pelo gene i , ´e expressa na

ausˆencia ou presen¸ca de lactose, ou seja, ´e uma prote´ına constitutiva. Na ausˆencia

de lactose, a prote´ına repressora se liga ao s´ıtio operador bloqueando a liga¸c˜ao da

RNA polimerase no promotor do operon, impedindo assim a transcri¸c˜ao de seus

genes estruturais. J´a na presen¸ca de lactose, esta se liga ao repressor liberando-o

da regi˜ao operadora subsequentemente os genes estruturais do operon s˜ao expres-

sos. Portanto, a presen¸ca da lactose induz a produ¸c˜ao das trˆes prote´ınas requeridas

para o metabolismo deste a¸c´ucar (ﬁgura 2.5).

Figura 2.5: Regula¸c˜ao da express˜ao do operon lac. (A) Ausˆencia de lactose: re-

pressor lac (gene i) se liga ao operador reprimindo a transcri¸c˜ao.(B) Presen¸ca de

lactose: a lactose inativa o repressor lac, viabilizando a transcri¸c˜ao (adaptado de

Stryer, 1992).

O segundo sistema de regula¸c˜ao ocorre quando a bact´eria E. coli ´e cultivada

em presen¸ca de glicose e lactose, a express˜ao do operon lac permanece inibida

at´e que a glicose seja exaurida. A repress˜ao do operon lac pela glicose ´e denomi-

nada repress˜ao catab´olica, e ´e o resultado dos baixos n´ıveis de monofosfato c´ıclico

de adenosina (AMPc) intracelular, caracter´ıstico de c´elulas crescendo com supri-

mento adequado de glicose. Quando o n´ıvel de glicose cai, h´a o aumento do n´ıvel

de AMPc na c´elula, que por sua vez interage com a prote´ına CRP (cAMPrecep-

tor protein), tamb´em denominada CAP (catabolite activator protein), formando o

complexo AMPc-CAP. Este complexo tem aﬁnidade por uma sequˆencia pr´oxima

ao promotor. O AMPc-CAP ao ligar-se pr´oximo ao promotor potencializa a inte-

ra¸c˜ao entre RNA polimerase e promotor, por consequˆencia a transcri¸c˜ao dos genes

do operon lac ´e intensiﬁcada (Snustad D.P, 2008) (Figura 2.6).

Figura 2.6: Regula¸c˜ao positiva da express˜ao do operon lac devido a forma¸c˜ao do

complexo AMPc-CAP (De Oliveira, 2005).

2.2.1.4 Operon de Triptofano

Operon triptofano (trp) codiﬁca enzimas utilizadas na s´ıntese de triptofano

(ﬁgura 2.7). Este operon apresenta regula¸c˜ao negativa e regula¸c˜ao por atenua¸c˜ao.

Figura 2.7: Diagrama do operon trp, mostrando o promotor (p), operador (o),

atenuador (a), gene para a sequˆencia leader (L) e os genes das enzimas da via do

trp (E, D, C, B e A) (adaptado de Stryer, 1992).

Quando o n´ıvel de triptofano (trp) est´a baixo na c´elula, os genes do operon

de trp s˜ao transcritos normalmente. Quando a quantidade de triptofano ´e elevada,

o triptofano exerce um controle negativo no operon trp, impedindo a transcri¸c˜ao

de seus genes estruturais (Stryer, 1992). J´a no segundo mecanismo regulat´orio,

o mecanismo de atenua¸c˜ao ´e uma forma de regula¸c˜ao de t´ermino de transcri¸c˜ao.

Baseia-se no controle da RNA polimerase em continuar ou n˜ao a transcri¸c˜ao al´em

de determinado s´ıtio, conhecido como atenuador, devido a forma¸c˜ao de estruturas

terci´arias, que podem caracterizar ou n˜ao o t´ermino de transcri¸c˜ao. Este meca-

nismo depende do fato de que a transcri¸c˜ao est´a acoplada `a tradu¸c˜ao, em proca-

riontes. Os ribossomos iniciam a tradu¸c˜ao no terminal 5´mRNA enquanto que o

mRNA ainda est´a sendo sintetizado. Quando o trp ´e suﬁciente, a tradu¸c˜ao ocorre

normalmente, de forma que o grampo formado no s´ıtio de atenua¸c˜ao caracterize o

t´ermino de transcri¸c˜ao, sendo assim, n˜ao haver´a a transcri¸c˜ao dos genes do operon

trp a partir deste ponto (ﬁgura 2.8-A). Entretanto, quando o trp n˜ao est´a dispo-

n´ıvel, o ribossomo para nos c´odons UGG devido a escassez de triptofanil tRNA.

O ribossomo parado altera de algum modo a estrutura do mRNA, formando no

s´ıtio de atenua¸c˜ao um novo grampo, que desta vez, n˜ao caracteriza o t´ermino de

transcri¸c˜ao. Desta forma, os genes do operon trp ser˜ao expressos (Stryer, 1992)

(ﬁgura 2.8-B).

2.3 RNAs n˜ao-codiﬁcantes e a Regula¸c˜ao Gˆenica

Os RNAs n˜ao-codiﬁcantes (sRNAs ou ncRNAs) s˜ao pequenas mol´eculas fun-

cionais de RNA que n˜ao s˜ao traduzidas em prote´ınas. Estas mol´eculas apresentam

um tamanho t´ıpico de 50 a 250 nt, podendo ter em poucos casos mais do que 300

nt (Vogel e Papenfort, 2006).

O dogma central da biologia molecular, aﬁrma que o DNA ´e transcrito em

RNA, que por sua vez ´e traduzido em prote´ınas. O RNA ´e um produto interme-

di´ario e n˜ao exerce fun¸c˜oes independentes. As exce¸c˜oes a esta regra apareceram

primeiramente para duas classes de ncRNAs que realizam fun¸c˜ao na s´ıntese de

prote´ınas, os RNAs transportadores (tRNAs) e os RNAs ribossomais (rRNAs).

Posteriormente tornou-se claro que ncRNAs tˆem diferentes fun¸c˜oes e s˜ao encon-

Figura 2.8: Modelo de atenua¸c˜ao do openor trp. (A) Alto n´ıvel de trp, o segmento

3 e 4 se pareiam e formam a al¸ca de t´ermino de transcri¸c˜ao. (B) Baixo n´ıvel de

trp, o ribossomo p´ara no c´odon do trp no segmento 1, formando uma nova al¸ca

com os segmentos 2 e 3, que por n˜ao ser t´emino de transcri¸c˜ao, ocorre a express˜ao

dos genes subsequentes a este sitio de atenua¸c˜ao (Adaptado de Stryer, 1992).

trados em todos os reinos da vida, apresentando fun¸c˜oes estruturais e regulat´orias.

Em bact´erias, os ncRNAs s˜ao conhecidos h´a mais de uma d´ecada como regula-

dores de replica¸c˜ao e manuten¸c˜ao de elementos extracromossomais (WAGNER e

SIMONS, 1994). Recentemente os ncRNAs foram identiﬁcados como reguladores

de express˜ao gˆenica em bact´erias (Gottesman, 2005). Muitos deles s˜ao considera-

dos reguladores cruciais na resposta ao estresse e na express˜ao de genes envolvidos

na patogenicidade, como alguns encontrados em Vibrio. Um ´unico ncRNA pode

regular m´ultiplos genes e exercer profundo efeito na ﬁsiologia celular (Gottesman,

2005).

Os primeiros estudos sobre estes RNAs estavam restritos a E. coli (Wassar-

man et al., 1999; Vogel et al., 2003; Kawano et al., 2005; Zhang et al., 2003), em

seguida, as diferentes esp´ecies de bact´erias come¸caram a ser estudadas. Em vibrio,

o que se conhece at´e o momento sobre ncRNAs regulat´orios envolve basicamente V.

cholerae N16961, A. ﬁscheri ES114 e V. campbellii ATCC BAA-1116 (Lenz et al.,

2004; Davis et al., 2005; Kulkarni et al., 2006; Livny et al., 2005; Song et al., 2008).

Em 2001, eram conhecidos somente 10 genes de ncRNA em E. coli (Wassarman

et al., 1999), 6 destes 10 com fun¸c˜oes regulat´orias: DsrA que ativa a express˜ao do

fator σ

(ou RpoS) e reduz a express˜ao de H-NS (Majdalani et al., 1998); MicF

que inibe a express˜ao do canal OmpF (MIZUNO et al., 1984); DicF que inibe a

express˜ao do gene da divis˜ao celular ftsZ (TETART e BOUCHE, 1992); CsrB que

inibe a atividade da prote´ına regulat´oria CsrA (Romeo, 1998), Spot 42 que regula

a express˜ao do operon galactose em E. coli (Moller et al., 2002) e a OxyS que regula

a resposta ao estresse de per´oxido de hidrogˆenio (Argaman e Altuvia, 2000). Hoje

existem mais de 80 ncRNAs conhecidos em E. coli e cerca de 140 em bact´erias

(Altuvia, 2007).

Os ncRNAs regulat´orios s˜ao classiﬁcados em diversos tipos, entre eles est˜ao:

(i) riboswitches, (ii) ncRNAs que se ligam a prote´ınas , e (iii) duas classes de RNAs

antisenso que modulam a tradu¸c˜ao e a estabilidade de mRNAs. A primeira engloba

os RNAs antisenso de a¸c˜ao cis e a segunda classe engloba os RNAs antisenso de

a¸c˜ao trans (Waters e Storz, 2009).

Riboswitch - Talvez seja o mais simples elemento regulat´orio em bact´erias.

O riboswitch ´e transcrito juntamente com seu gene alvo, estando localizado na

por¸c˜ao 5’-UTR do mRNA. O riboswitch pode mudar sua conforma¸c˜ao espacial

ao ligar-se a pequenas mol´eculas, podendo adotar assim diferentes conforma¸c˜oes

em resposta a sinais ambientais tais como, elevada temperatura, pequenos ligantes

e ribossomos estagnados (Waters e Storz, 2009). Este elemento ´e composto por

dois dom´ınios funcionais, um dom´ınio aptˆamero e a plataforma de express˜ao. O

dom´ınio aptˆamero funciona como um sensor que reconhece o metab´olito espec´ıﬁco

para aquele tipo de riboswitch e ao ligar-se com o metab´olito provoca altera¸c˜ao

estrutural na plataforma de express˜ao, permitindo, desta forma, o controle da tra-

du¸c˜ao do mRNA. A plataforma de express˜ao varia substancialmente at´e mesmo

em organismo bastante pr´oximos evolutivamente, o que reﬂete sua diversidade de

fun¸c˜oes. Os riboswitches podem modular a express˜ao gˆenica no in´ıcio da tradu¸c˜ao,

no alongamento da transcri¸c˜ao do mRNA e at´e mesmo na estabilidade dos mR-

NAs. Riboswitches regulam v´arios caminhos metab´olicos, incluindo a bioss´ıntese

de vitaminas (como por exemplo: riboﬂavina, tiamina e cobalamina) e o metabo-

lismo de metionina, lisina e purinas.

Na ﬁgura 2.9 est´a exempliﬁcado os mecanismos de controle da express˜ao

gˆenica mediada por riboswitch: (A) Regula¸c˜ao da transcri¸c˜ao: Na ausˆencia de

metab´olito (ligante), ocorre a transcri¸c˜ao do gene downstream devido a forma¸c˜ao

do grampo anti-terminador. Entretanto, na presen¸ca do metab´olito, este se liga

ao aptˆamero impedindo a forma¸c˜ao do anti-terminador e favorecendo a forma¸c˜ao

do grampo terminador de transcri¸c˜ao. (B) Regula¸c˜ao da tradu¸c˜ao: Na ausˆencia

do ligante, o ribossoma se liga ao RBS (sitio de liga¸c˜ao de ribossomo) no mRNA

e inicia a tradu¸c˜ao. Na presen¸ca de ligante, o RBS torna-se indispon´ıvel para os

ribossomos, n˜ao ocorrendo a tradu¸c˜ao.

ncRNAs que modulam atividade de prote´ınas - Tem sido detectados

diferentes RNAs bacterianos envolvidos na regula¸c˜ao transcricional, cuja fun¸c˜ao

´e modular a atividade de prote´ınas que tˆem impacto sobre a transcri¸c˜ao. Cu-

riosamente, v´arios destes RNAs reguladores s˜ao muito abundantes e, portanto,

foram um dos primeiros ncRNAs descobertos. Entretanto, suas fun¸c˜oes s´o foram

elucidadas recentemente. Embora, em muitos casos, os mecanismos precisos de

a¸c˜ao destes RNAs sejam ainda nebulosos, tem sido postulado que pelo menos um

subconjunto desses RNAs atua mimetizando intera¸c˜oes de ´acidos nucl´eicos nor-

malmente feitas pela prote´ına alvo. Podemos tomar como exemplo o RNA 6S que

associa-se especialmente a holoenzima RNA polimerase contendo o σ

como fator

Figura 2.9: Exemplos de mecanismos de controle da express˜ao gˆenica mediada por

riboswitch (adaptado de Waters e Storz, 2009).

espec´ıﬁco. Esta intera¸c˜ao impede que a holoenzima ligue-se aos promotores (que

possuem s´ıtio para o fator σ

) durante a fase estacion´aria, inibindo desta forma

a participa¸c˜ao da holoenzima (RNA polimerase + σ

) na transcri¸c˜ao de certos

genes (Barrick et al., 2005). O fator σ

´e usado para a grande maioria das fun¸c˜oes

de crescimento exponencial.

Outros ncRNAs podem estar envolvidos em regula¸c˜ao p´os-transcricional (ou

seja, traducional), como ´e o caso dos RNAs antisenso. As atividades destes ncR-

NAs dependem das intera¸c˜oes dos pares de bases complementares com seus mRNAs

alvos, podendo apresentar atividades cis ou trans, descritas a seguir.

RNAs antisenso de a¸c˜ao cis - Neste caso a localiza¸c˜ao de seus genes ´e

na mesma localiza¸c˜ao de seu alvo, mas na ﬁta oposta, possuindo uma regi˜ao de

perfeita complementaridade com seu alvo (frequentemente de 75nt ou mais), que

normalmente ´e s´o um (Waters e Storz, 2009). Em bact´eria, este RNA antisenso

foi primeiramente encontrado em plasm´ıdeos.

E muito dif´ıcil de ser encontrado em

cromossomos de bact´erias e suas fun¸c˜oes s˜ao muito pouco conhecidas.

RNA antisenso de a¸c˜ao trans - Nesta classe de RNAs antisenso, a regi˜ao

cromossˆomica que codiﬁca os n˜ao sobrep˜oe os genes de seus mRNAs alvos, podendo

at´e estar distantes entre si no cromossomo, as regi˜oes de complementaridade com

seus alvos s˜ao curtas e dispersas no RNA. Devido a sua curta intera¸c˜ao, um RNA

antisenso de a¸c˜ao trans pode ter mais de um mRNA alvo. Tamb´em estes ncRNAs

necessitam da prote´ına Hfq (chaperona de RNAs) para auxiliar no pareamento

com seus alvos. S˜ao exemplos de RNA antisenso de a¸c˜ao trans os DsrA, MicF e

Ryh, os quais regulam rpoS, ompF e os genes de prote´ınas dependentes de ferro,

respectivamente.

De uma forma geral, os RNAs antisenso podem regular a express˜ao gˆenica

de diversas formas ao ligarem-se a seus RNAs alvos. Por exemplo, podem inibir a

tradu¸c˜ao ao se ligarem perto do RBS de um mRNA, bloqueando o acesso dos ribos-

somos ao RBS (´e o caso do Spot 42), ou ligando-se ao mRNA proporcionando sua

degrada¸c˜ao por RNase (como ´e o caso do RyhB) (ﬁgura 2.10). Alternativamente,

ncRNAs podem estimular a tradu¸c˜ao promovendo a estabilidade dos mRNAs alvos

(como o GadY) ou ligando-se perto do RBS de seu mRNA alvo, de forma a des-

fazer sua estrutura secund´aria, expondo o RBS para intera¸c˜ao com os ribossomos

(como o caso dos DsrA e RprA) (ﬁgura 2.11). O RNA antisenso pode inibir ou

estimular a tradu¸c˜ao dependendo de como ele se liga e afeta as diferentes regi˜oes

de seus mRNAs alvos (Waters e Storz, 2009).

2.3.1 ncRNAs participam de cascatas de regula¸c˜ao global

V´arias condi¸c˜oes de estresse induzem uma resposta global, geralmente, por

afetar a atividade e ou s´ıntese de um regulador transcricional. Alguns exemplos

de ncRNA que participam de cascatas de regula¸c˜ao global s˜ao descritos a seguir.

O ncRNA RyhB ´e transcrito em resposta `a limita¸c˜ao de ferro, como resultado de

Figura 2.10: Mecanismos de controle negativo da express˜ao gˆenica mediada por

RNAs antisenso de a¸c˜ao trans (adaptado de Waters e Storz, 2009).

Figura 2.11: Mecanismos de controle positivo da express˜ao gˆenica mediada por

RNAs antisenso de a¸c˜ao trans (adaptado de Waters e Storz, 2009).

uma eleva¸c˜ao da repress˜ao pela prote´ına Fur. RyhB causa a r´apida degrada¸c˜ao

de v´arios alvos mRNAs, os quais codiﬁcam para prote´ınas n˜ao-essenciais que se

ligam a ferro (Fe-binding), reduzindo a requisi¸c˜ao intracelular de ferro, reservando,

assim, ferro somente para prote´ınas essenciais (ﬁgura 2.12-a). O estresse oxidativo

leva a ativa¸c˜ao do regulador transcricional OxyR, resultando na s´ıntese do ncRNA

OxyS, que regula negativamente a s´ıntese de dois reguladores transcricionais, RpoS

e FhIA, al´em de reduzir mutagˆenese, com isso contribuindo para a prote¸c˜ao celu-

lar dependente de OxyR (ﬁgura 2.12-b). Como exemplo de regula¸c˜ao positiva, sob

baixa temperatura, o promotor do ncRNA DsrA ´e ativado aparentemente sem a

ajuda dos fatores de transcri¸c˜ao auxiliares, e sendo um regulador positivo da RpoS,

torna-se respons´avel pelo aumento do n´ıvel de tradu¸c˜ao do RpoS e, assim, aumen-

tando a express˜ao de genes RpoS-dependentes, importantes para a sobrevivˆencia

da c´elula a baixa temperatura (RpoS ´e um fator σ alternativo) (ﬁgura 2.12-c).

Figura 2.12: Alguns exemplos da participa¸c˜ao de ncRNAs em cascatas de regula¸c˜ao

gobal (adaptado de Gottesman, 2005).

2.3.2 ncRNAs participam de Quorum Sensing

O quorum sensing (sensor de quorum) ´e um mecanismo de regula¸c˜ao gˆenica

em bact´erias que coordena a express˜ao de determinados genes em resposta `a pre-

sen¸ca ou ausˆencia de mol´eculas pequenas. Este mescanismo foi descoberto pela

primeira vez na bact´eria marinha A. ﬁscheri (NEALSON et al., 1970). O quorum

sensing ´e um processo de comunica¸c˜ao intercelular, que se manifesta quando as

bact´erias da mesma esp´ecie encontram-se em alta densidade populacional, promo-

vendo altera¸c˜oes fenot´ıpicas nesta popula¸c˜ao (Miller e Bassler, 2001). Atualmente

est´a bem deﬁnido que este sensoriamento populacional ´e realizado por meio de pe-

quenas mol´eculas denominadas autoindutores (como por exemplo as homoserinas

lactonas). Estas mol´eculas se difundem livremente para fora das c´elulas e ligam-se,

quando alcan¸cam uma certa concentra¸c˜ao, a prote´ınas receptoras em uma c´elula

vizinha gerando um sinal intracelular que promove a regula¸c˜ao da express˜ao de

certos genes envolvidos na luminescˆencia, forma¸c˜ao de bioﬁlme e patogenicidade

(Taga e Bassler, 2003).

Alguns estudos tˆem sugerido que ncRNAs est˜ao envolvidos no processo de

quorum sensing (Lenz et al., 2004; Defoirdt et al., 2008). Pode-se tomar como

exemplo o mecanismo de quorum sensing em Vibrio harveyi, uma bact´eria marinha

bioluminescente. Quando Vibrio harveyi encontra-se na ausˆencia de autoindutores

devido ao baixo agrupamento destas bact´erias, os receptores celulares fosforilam

indiretamente a prote´ına LuxO. A prote´ına LuxO ativada induz a express˜ao de

cinco ncRNAs regulat´orios (Qrr 1-5). Estes ncRNAs juntamente com a chape-

rona Hfq desestabilizam o mRNA de LuxR (prote´ına reguladora de transcri¸c˜ao)

impedindo sua tradu¸c˜ao. J´a na presen¸ca de altas concentra¸c˜oes de autoindutores

devido a alta densidade populacional, os receptores indiretamente defosforilam o

LuxO, inativando-o. Com a prote´ına LuxO inativa n˜ao h´a express˜ao dos ncRNAs

reguladores e a prote´ına LuxR ´e produzida, sendo assim ligado o mecanismo de

bioluminescˆencia (Defoirdt et al., 2008).

Na maioria das esp´ecies de vibrios, o quorum sensing induz a forma¸c˜ao de

bioﬁlme e de fatores de virulˆencia, como por exemplo, V. anguillarum (Milton

et al., 1997), V.cholerae (Camara et al., 2002; Hammer e Bassler, 2003; Zhu e

Mekalanos, 2003), V. harveyi (Lilley e Bassler, 2000; Maneﬁeld et al., 2000), V.

parahaemolyticus (Henke e Bassler, 2004) e V. vulniﬁcus (McDougald et al., 2000).

A ocorrˆencia de quorum sensing nestes casos deﬂagra a libera¸c˜ao de toxinas, sendo

que cada esp´ecie de bact´eria tem seu pr´oprio autoindutor usado na comunica¸c˜ao

entre seus pares.

Cap´ıtulo 3

Ferramentas computacionais para

detec¸c˜ao de ncRNAs

A detec¸c˜ao de genes de ncRNAs ´e um desaﬁo para a bioinform´atica. Isto

deve-se principalmente ao fato de que as ferramentas que vˆem sendo desenvolvidas

s˜ao espec´ıﬁcas para identiﬁcar genes que codiﬁcam prote´ınas e como os genes de

ncRNAs possuem caracter´ısticas pr´oprias, estes n˜ao s˜ao detectados por estas fer-

ramentas. V´arias t´ecnicas vˆem sendo desenvolvidas e aprimoradas com o intuito

de encontrar genes de ncRNAs. Diversas abordagens baseiam-se em uma ou mais

caracter´ısticas encontradas em alguns genes de ncRNAs: (i) a localiza¸c˜ao dentro

de regi˜oes intergˆenicas (IGRs), (ii) sequˆencias prim´arias conservadas entre esp´ecies

intimamente relacionadas, (iii) localiza¸c˜ao abaixo de sequˆencias consenso espec´ı-

ﬁcas encontradas em promotores, (iv) estar acima da estrutura terminadora de

transcri¸c˜ao independente de rho, (v) apresentar certa porcentagem de G-C e (vi)

apresentar estrutura secund´aria conservada.

Muitas destas abordagens limitam a t´ecnica de detec¸c˜ao de ncRNAs, uma

vez que estes possuem caracter´ısticas e fun¸c˜oes heterogˆenicas. Por exemplo, muitos

dos genes de ncRNAs que constituem um operon n˜ao s˜ao ladeados por terminador

de transcri¸c˜ao e/ou promotor, n˜ao sendo assim detectados pelas t´ecnicas basea-

das na presen¸ca de sequˆencias de promotores e terminadores. J´a as t´ecnicas que

baseiam-se em sequˆencias consenso de promotores, como o s´ıtio de liga¸c˜ao do σ

est˜ao restritas a procura de genes de ncRNAs transcritos pela holoenzima σ

-RNA

polimerase. Dentre as diversas abordagens, a que confere maior conﬁabilidade ´e a

que utiliza a conserva¸c˜ao de estrutura secund´aria, uma vez que a grande maioria

dos ncRNAs conhecidos apresentam esta caracter´ıstica. A maioria dos estudos

mais recentes tem sido baseada em sinais de conserva¸c˜ao de estrutura secund´aria e

modelos estat´ısticos. Muitas destas ferramentas utilizam como entrada os alinha-

mentos m´ultiplos.

Finalmente existe uma abordagem que utiliza base de dados de ncRNAs j´a

caracterizados e conﬁrmados. Esta abordagem se restringe na busca e compara¸c˜ao

de ncRNAs j´a conhecidos e n˜ao na busca por novos ncRNAs, como nas abordagens

descritas anteriormente. A maioria dessas bases de dados ´e espec´ıﬁca para um

grupo de organismos. Por exemplo, RNAdb

´e uma base de dados de ncRNAs

de mam´ıferos, ASRP

´e uma base de dados de ncRNAs de Arabidopsis thaliana.

A NONCODE (Liu et al., 2005) ´e uma base de dados que cont´em todos ncRNAs

(exceto tRNAs e rRNAs) da literatura e do GenBank

e que s˜ao manualmente

tratados, sendo que aproximadamente 80% de seu reposit´orio ´e baseado em dados

experimentais. Outra base de dados de ncRNAs de procariontes e eucariontes ´e

o Rfam

, que ´e um conjunto de alinhamentos m´ultiplos e modelos de covariˆancia

que representam as fam´ılias de ncRNAs conhecidas (Griﬃths-Jones et al., 2003).

Abaixo ser˜ao descritos algumas ferramentas e base de dados mais usadas na detec-

¸c˜ao de ncRNAs em bact´erias.

3.1 QRNA

Sua abordagem ´e detectar genes de ncRNAs usando como base a estrutura

secund´aria conservada. Para este ﬁm s˜ao testados os padr˜oes de substitui¸c˜ao obser-

RNAdb [http://research.imb.uq.edu.au/rnadb]

ASRP [http://asrp.cgrb.oregonstate.edu]

GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank]

Rfam database [http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam]

vados em um alinhamento de duas sequˆencias hom´ologas. A id´eia chave ´e produzir

trˆes modelos probabil´ısticos (RNA, COD e OTH) que descrevem trˆes padr˜oes de

muta¸c˜ao observados nos pares de sequˆencias alinhadas. O modelo OTH assume

muta¸c˜oes pontuais em posi¸c˜oes independentes e representa a hip´otese nula. O mo-

delo COD assume que as sequˆencias alinhadas codiﬁcam prote´ınas hom´ologas, isto

porque, nas regi˜oes codiﬁcantes espera-se encontrar muta¸c˜oes que substituam ami-

no´acidos por outros que tenham as mesmas propriedades. O modelo RNA assume

que o padr˜ao de muta¸c˜ao conserva uma estrutura secund´aria em RNAs hom´ologos

(Rivas e Eddy, 2001). Os modelos OTH e COD foram constru´ıdos com base em

modelos ocultos de Markov e j´a o modelo RNA foi constru´ıdo usando gram´atica

livre de contexto (Rivas e Eddy, 2001). Ent˜ao, dado um alinhamento de sequˆencias

como entrada, a ferramenta QRNA classiﬁca estas sequˆencias em OTH, COD ou

RNA de acordo com a probabilidade de cada classe (Rivas e Eddy, 2001). Na ﬁ-

gura 3.1 s˜ao mostrados alinhamentos contendo trˆes diferentes padr˜oes de muta¸c˜ao

que representam a hip´otese nula (no topo), uma regi˜ao codiﬁcante (no meio) e um

RNA estrutural (em baixo).

3.2 RNAz

Esta ferramenta tem como abordagem a predi¸c˜ao de estrutura baseada na

energia m´ınima livre (MFE, Minimun Free Energy) (ZUKER e STIEGLER, 1981;

HOFACKER et al., 1994).

E levado em considera¸c˜ao o fato de que as estrutu-

ras dos ncRNAs apresentam duas caracter´ısticas, a estabilidade termodinˆamica

e conserva¸c˜ao da estrutura secund´aria (WASHIETL, 2006). Para o primeiro cri-

t´erio, o RNAz calcula uma medida normalizada da estabilidade termodinˆamica

e, a seguir, uma pontua¸c˜ao (z-score) ´e gerada. Uma pontua¸c˜ao negativa indica

que a sequˆencia ´e mais est´avel do que a esperada ao acaso (WASHIETL, 2006).

Para o segundo crit´erio, o RNAz prediz uma estrutura secund´aria consenso de um

alinhamento usando a abordagem RNAalifold (Hofacker et al., 2002). Muta¸c˜oes

Figura 3.1: Base dos modelos usados na ferramenta QRNA (Adaptado de Rivas e

Eddy, 2001).

compensat´orias, ou seja, muta¸c˜oes que preservam um par de bases certas (exem-

plo, substitui¸c˜ao do par CG pelo par UA) s˜ao pontuadas, enquanto que muta¸c˜oes

inconsistentes (exemplo, a substitui¸c˜ao do par CG por CA) adicionam penalidades.

No ﬁnal ´e calculado o ´ındice de conserva¸c˜ao da estrutura (SCI, structure conser-

vation index) (WASHIETL, 2006).

Finalmente, o RNAz utiliza um algoritmo de aprendizado com m´aquina de

vetor de suporte (SVM, support vector machine), que foi treinado utilizando um

vasto conjunto de ncRNAs conhecidos. Esta etapa utiliza os resultados dos dois

crit´erios (z-score e SCI) para classiﬁcar o alinhamento de entrada como “RNA es-

trutural” ou “outros” (WASHIETL, 2006).

3.3 Rsearch

O Rsearch ´e um programa baseado na ferramenta Infernal, que compara

sequˆencias de RNAs com um banco de sequˆencias conhecidadas de RNAs. Desta

forma, dado uma sequˆencia de RNA s˜ao feitas buscas em uma base de dados de

nucleot´ıdios por RNAs hom´ologos. Esta busca ´e baseada tanto na estrutura pri-

m´aria quanto na estrutura secund´aria (Klein e Eddy, 2003). Os algoritmos de

alinhamento desta ferramenta s˜ao baseados em gram´aticas estoc´asticas livres de

contexto (SCFG, Stochastic Context Free Grammars) (EDDY e DURBIN, 1994;

SAKAKIBARA et al., 1994). Incorporada aos algoritmos de alinhamento existe

uma matriz de substitui¸c˜ao apropriada para RNAs denominada RIBOSUM (Klein

e Eddy, 2003), similar `as matrizes usadas para prote´ınas, como por exemplo a

BLOSUM (HENIKOFF e HENIKOFF, 1992).

3.4 Infernal

O Infernal (INFERence of RNA Alignment) ´e uma aplica¸c˜ao que utiliza uma

abordagem baseada em Gram´atica Estoc´astica Livres de Contextos (SCFG, Sto-

chastic Context-Free Grammars) (EDDY e DURBIN, 1994; SAKAKIBARA et al.,

1994). Esta ferramenta constr´oi perﬁs de RNA consenso chamados de modelos

de covariˆancia (CM, Covariance Models), que ´e um caso especial de SCFG desig-

nado para modelar sequˆencias e estruturas de RNAs. O Infernal usa esses modelos

para procurar RNAs hom´ologos em base de dados de sequˆencias de DNA, sendo

que nestas buscas s˜ao levadas em considera¸c˜ao tanto as semelhan¸cas de sequˆencias

quanto a estrutura secund´aria dos RNAs.

Cada CM ´e constru´ıdo a partir do alinhamento de m´ultiplas sequˆencias (ou

uma sequˆencia ´unica de RNA) e de dados relacionados a estrutura secund´aria

consenso, como posi¸c˜oes em que o alinhamento ´e ´unico e posi¸c˜oes onde ocorrem

pareamentos de bases. Pontua¸c˜oes s˜ao atribu´ıdas para cada posi¸c˜ao espec´ıﬁca as-

sim como para quantidades de res´ıduos, pareamento de bases, inser¸c˜oes e dele¸c˜oes.

A ferramenta Infernal compreende os programas cmbuild , cmsearch e cma-

lign. A constru¸c˜ao do Modelo de Covariˆancia a partir de uma entrada utilizando

cmbuild requer como entrada um alinhamento estrutural de m´ultiplos RNAs no

formato estocolmo (Stockholm) (Figura 5.1) (Eddy, 2003), gerando um arquivo de

sa´ıda contendo o modelo de covariˆancia , o qual ser´a usado por outras fun¸c˜oes do

Infernal. A busca em bases de dados por poss´ıveis hom´ologos utilizando cmsearch

requer duas entradas, ou seja, um arquivo CM (contendo o modelo de covariˆancia

obtido com o cmbuild) e um arquivo contendo sequˆencias desejadas para an´alise. O

cmsearch busca as sequˆencias que geraram hits com alta pontua¸c˜ao para o modelo

de covariˆancia usado.

E gerada uma sa´ıda contendo os alinhamentos para cada

hit em um formato similar `a estrutura BLAST (Altschul et al., 1990). J´a o ali-

nhamento de poss´ıveis hom´ologos utilizando cmalign requer um arquivo de modelo

de covariˆancia e outro arquivo que contenha poss´ıveis hom´ologos. Este programa

alinha seq

uˆencias de acordo com o modelo, criando um alinhamento de m´ultiplas

estruturas no formato Estocolmo. Esse alinhamento poder´a ser utilizado como

entrada na constru¸c˜ao de um modelo de covariˆancia pelo cmbuild, como descrito

acima.

3.5 Rfam

Rfam ´e uma base de dados curada, ou seja revisada e supervisionada, con-

tendo informa¸c˜oes sobre as fam´ılias de ncRNAs. Esta base de dados consta de

duas classes distintas de dados: os perﬁs de modelos de covariˆancia (CMs) e ali-

nhamentos semente. Os CMs s˜ao modelos estat´ısticos resultantes da combina¸c˜ao de

informa¸c˜oes tais como: estrutura secund´aria e sequˆencias prim´arias, representadas

pelo alinhamento m´ultiplo de sequˆencias. Cada perﬁl de CM corresponde a uma

fam´ılia de ncRNA. J´a os alinhamentos semente (seed alignments) est˜ao contidos

dentro de um arquivo no formato estocolmo (Stockholm) e cont´em os membros re-

presentativos de cada fam´ılia de ncRNA gerados atrav´es de diversos alinhamentos

estruturais (Griﬃths-Jones et al., 2003). Os arquivos Rfam.seed.gz e Rfam.tar.gz

podem ser obtidos do site de FTP do Sanger

. Ao serem devidamente descompac-

tados, o primeiro gera um arquivo de alinhamentos semente anotados em formato

estocolmo (como descrito acima) e o segundo, gera uma grande quantidade de ar-

quivos de modelos de covariˆancia de ncRNAs.

Abaixo ´e exibido uma pequena parte do arquivo Rfam.seed (alinhamentos

semente) no formato estocolmo:

# STOCKHOLM 1.0

#=GF AC RF00378

#=GF ID Qrr

#=GF DE Qrr RNA

#=GF AU Moxon SJ

#=GF SE PMID:15242645

#=GF SS Published; PMID:15242645; Moxon SJ

#=GF GA 25.00

#=GF TC 25.79

#=GF NC 8.85

#=GF TP Gene; sRNA;

#=GF BM cmbuild CM SEED

#=GF BM cmsearch --toponly CM SEQDB

#=GF RN [1]

#=GF RM 15242645

#=GF RT The Small RNA Chaperone Hfq and Multiple Small RNAs Control Quorum

#=GF RT Sensing in Vibrio harveyi and Vibrio cholerae.

#=GF RA Lenz DH, Mok KC, Lilley BN, Kulkarni RV, Wingreen NS, Bassler BL;

#=GF RL Cell 2004;118:69-82.

#=GF CC This family represents a set of small RNAs (the Qrr RNAs) that are thought

#=GF CC to be involved in the regulation of quorum sensing in Vibrio species. It is

#=GF CC believed that these RNAs, guided by a protein, Hfq, can mediate the

#=GF CC destabilisation of the quorum-sensing master regulators LuxR/HapR mRNAs

#=GF CC [1].

#=GF SQ 31

AY525157.1/427-333 UGACCC.UU..A.G.......GGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

AAOU01000009.1/38611-38505 AUGACU.CU..U.AAGUUAAGAGUCAA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUUG

CR378666.1/200201-200099 UGACUC.UU..A.AUGUA...GAGUCAACCUAGCCAACUGACGUUGUUUG

AAKI02000122.1/2058-2167 UGACCC.UUAAU.UAAGCCGAGGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

AAWQ01000003.1/94089-93982 UGACCC.UU..UCUAAGCCGAGGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

AAWD01000001.1/11583-11476 UGACCC.UUG.U.UAAGCCGAGGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

AAUU01000009.1/33657-33752 UGACCC...........GCAAGGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

AAWQ01000017.1/35050-35158 UGACCC.UUA.U.UAAGCCGAGGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

AAND01000001.1/259885-259777 UGACCC.UUC.U.UAAGCCGAGGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

AAPS01000011.1/74129-74021 UGACCC.UU..UCUAAGCCGAGGGUCA.CCUAGCCAACUGACGUUGUUAG

#=GC SS_cons <<<<<<...............>>>>>>................<<<<..<

#=GC RF uGaCCC.UU..U.AAGccAAAGGGuCa.ccUAGccAAcUGAcGuuguUAG

Rfam database [ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/Rfam]

O formato estocolmo apresenta algumas linhas de marca¸c˜ao: #=GF, #=GC,

#=GS e #=GR. Estas marca¸c˜oes s˜ao encontradas no arquivo Rfam.seed. A linha

que come¸ca com #=GC SS cons indica a estrutura secund´aria consenso, onde

os gaps s˜ao indicados pelos caracteres ., , -, ou e os pares de base s˜ao indicados

por qualquer um dos seguintes pares: < >, ( ), ou [ ]. A linha #=GC RF ´e a

anota¸c˜ao de referˆencia, onde os res´ıduos em mai´usculo denotam forte conserva¸c˜ao

e os em min´usculo denotam fraca conserva¸c˜ao, o caracter usado para gap ´e o ponto

(.). A marca¸c˜ao #=GF ´e acompanhada por ﬂags. Veja abaixo o signiﬁcado dos

campos que cont´em as principais ﬂags.

Campos e suas flags:

------------------

AC N´umero de acesso: Este numero de acesso apresenta o formato Rfxxxxx (Rfam).

ID Identifica¸c~ao: Uma palavra para identificar a fam´ılia.

DE Descri¸c~ao: Pequena descri¸c~ao da fam´ılia.

AU Autor: Respons´avel pela entrada do dado.

SE Origem da semente: A origem sugere os membros da semente pertencente a uma fam´ılia.

SS Origem da estrutura: A origem da estrutura secund´aria do RNA consenso usado pelo Rfam.

BM M´etodo de montagem: Linha de comando usado para gerar o modelo.

SM M´etodo de busca: Linha de comando usada para gerar a busca.

TP Tipo: Tipo de fam´ılia do Rfam

SQ Seq¨u^encia: N´umero de seq¨u^encias em alinhamento.

Abaixo ´e exibido uma parte do arquivo RF00378.cm, um dos diversos arqui-

vos de modelo de covariˆancia do Rfam sendo que este em espec´ıﬁco ´e referente a

fam´ılia de Qrr RNA. Este CM foi gerado a partir da estrutura secund´aria consenso,

resultante do alinhamento m´ultiplo de sequˆencias desta fam´ılia.

INFERNAL-1 [0.72]

NAME SEED

STATES 338

NODES 93

W 129

el_selfsc -0.089267

NULL 0.000 0.000 0.000 0.000

MODEL:

[ ROOT 0 ]

S 0 -1 0 1 4 -6.565 -7.810 -0.100 -4.264

IL 1 1 2 1 4 -2.817 -4.319 -0.613 -2.698 0.660 -0.612 -0.293 -0.076

IR 2 2 3 2 3 -1.925 -0.554 -4.164 0.660 -0.612 -0.293 -0.076

[ MATR 1 ]

MR 3 2 3 5 3 -8.074 -0.023 -6.391 0.158 -0.792 -0.763 0.780

D 4 2 3 5 3 -6.390 -1.568 -0.620

IR 5 5 3 5 3 -1.925 -0.554 -4.164 0.660 -0.612 -0.293 -0.076

[ MATR 2 ]

MR 6 5 3 8 3 -8.074 -0.023 -6.391 -0.306 -0.878 -1.081 1.121

D 7 5 3 8 3 -6.390 -1.568 -0.620

IR 8 8 3 8 3 -1.925 -0.554 -4.164 0.660 -0.612 -0.293 -0.076

[ MATR 3 ]

MR 9 8 3 11 3 -8.074 -0.023 -6.391 -0.389 -0.804 -1.209 1.158

D 10 8 3 11 3 -6.390 -1.568 -0.620

IR 11 11 3 11 3 -1.925 -0.554 -4.164 0.660 -0.612 -0.293 -0.076

3.6 Escolha das Ferramentas

No presente trabalho, foi utilizado o programa cmsearch pertencente ao pa-

cote do infernal e a base de dados do Rfam. A escolha ´e justiﬁcada, primeiramente

porque neste estudo decidimos por identiﬁcar os ncRNAs j´a descritos e comprova-

dos em outras esp´ecies de bact´erias, sendo assim necess´ario utilizar uma ferramenta

de busca e uma base de dados curada e n˜ao uma ferramenta de predi¸c˜ao de novos

ncRNAs, como ´e o caso das ferramentas QRNA e RNAz. A escolha pelo Rfam e

n˜ao por outra base deve-se ao fato do Rfam ser uma base curada e bem conﬁ´avel

e por conter ncRNAs de bact´erias. Como a base de dados do Rfam foi gerada

a partir das ferramentas do Infernal (cmalign e cmbuild) nada mais coerente do

que utilizar o programa cmsearch ao inv´es de outro programa que faz buscas em

base de dados, uma vez que o formatos das bases s˜ao conhecidos pela ferramenta

escolhida e sobretudo por ser uma das ferramentas mais eﬁcientes e sens´ıveis para

a detec¸c˜ao de ncRNA em base de dados (Freyhult et al., 2007).

3.7 Gram´atica Estoc´astica Livre de Contexto e Modelo de Covari-

ˆancia

Para o melhor entendimento do modelo de covariˆancia e gram´aticas estoc´as-

ticas livres de contexto faz-se necess´ario a apresenta¸c˜ao de alguns conceitos dentro

da teoria das linguagens formais.

A teoria das linguagens formais ´e o estudo de modelos matem´aticos que pos-

sibilitam a especiﬁca¸c˜ao e o reconhecimento das linguagens, suas classiﬁca¸c˜oes,

estruturas, propriedades e caracter´ısticas.

A linguagem ´e um conjunto de s´ımbolos e um conjunto de regras que combi-

nam estes s´ımbolos, sendo usada e entendida por uma determinada comunidade.

Temos como exemplo de liguagem, os idiomas (linguagens naturais), linguagens de

programa¸c˜ao, protocolos de comunica¸c˜ao.

Formalizando as deﬁni¸c˜oes, segundo Salomaa (1987):

Alfabeto: ´e um conjunto ﬁnito e n˜ao vazio de s´ımbolos. Normalmente

denotado por Σ.

Senten¸ca ou palavra: ´e uma sequˆencia ﬁnita de s´ımbolos de um alfabeto.

Se Σ = {a, b}, ent˜ao ”a”, ”aa”, ”b”, ”ababbba” s˜ao exemplos de senten¸cas

de Σ. Denotamos por W (Σ) o conjunto inﬁnito de todas as palavras sobre

Σ.

Tamanho de uma senten¸ca: ´e a quantidade de s´ımbolos de uma senten¸ca.

Senten¸ca vazia:

E uma senten¸ca de tamanho zero, denotada por .

Conjunto potˆencia de um alfabeto Σ: ´e o conjunto de todas as senten¸cas de

tamanho n formadas pelos elementos de Σ, denotado por Σ

. Por exemplo,

se Σ = {a, b} ent˜ao Σ

= {a, b}. Da mesma forma, Σ

= {aa, ab, ba, bb},

= {aaa, aab, aba, abb, baa, bab, bba, bbb} e assim sucessivamente. O con-

junto de todas as senten¸cas, incluindo a nula , de um alfabeto Σ ´e repre-

sentado por Σ

∗

. Logo,

∗

= {} ∪ Σ

∪ Σ

∪ . . .

Tamb´em escrevemos Σ

= Σ

∗

− {}.

Linguagem formal: ´e um conjunto de senten¸cas formadas por um alfabeto,

isto ´e, L ⊆ Σ

∗

Gram´atica: ´e um conjunto ﬁnito de regras que especiﬁcam uma linguagem.

E representada por, G = {U, Σ, S, P } onde:

Σ ´e um alfabeto formado por s´ımbolos terminais;

U ´e um alfabeto formado por s´ımbolos n˜ao-terminais tal que

Σ ∩ U = ∅;

S representa o s´ımbolo inicial, onde S ∈ U;

P representa o conjunto ﬁnito de regras de produ¸c˜ao.

Terminais: s˜ao s´ımbolos que n˜ao podem ser substitu´ıdos.

N˜ao-terminais: s˜ao s´ımbolos que podem ser substitu´ıdos.

Regras de produ¸c˜ao: deﬁnem como podem ser geradas as senten¸cas. Uma

regra de produ¸c˜ao ´e representada por α → β, onde α ∈ W (Σ ∪ U )

β ∈ W (Σ ∪ U)

∗

Deriva¸c˜ao: A deriva¸c˜ao de uma gram´atica G = {U, Σ, S, P } ´e denotada

por α ⇒ β, onde α ∈ W (Σ ∪ U)

e β ∈ W (Σ ∪ U )

∗

, e signiﬁca que ´e

poss´ıvel derivar β a partir de α. Por exemplo, se z → w ´e uma regra de

produ¸c˜ao de G e xzy ∈ W (U ∪Σ)

∗

, ent˜ao xwz ´e dito diretamente deriv´avel

de xzy e se representa por xzy ⇒ xwz. Quando houver mais passos de

deriva¸c˜ao, estes s˜ao explicitados da seguinte forma:

⇒

∗

que signiﬁca zero ou mais passos de deriva¸c˜ao;

⇒

que signiﬁca um ou mais passos de deriva¸c˜ao.

Linguagem gerada: A linguagem gerada pela gram´atica G, denotada por

L(G), ´e composta por todas as senten¸cas deriv´aveis a partir do s´ımbolo

inicial S, isto ´e, L(G) = {w | w ∈ W (Σ

∗

), S ⇒

w}.

As gram´aticas formais podem ser classiﬁcadas, segundo a hierarquia de Chomsky,

em quatro tipos diferentes (Salomaa, 1987):

(0) Gram´aticas com Estrutura de Fase;

(1) Gram´aticas Sens´ıveis ao Contexto;

(2) Gram´aticas Livres de Contexto;

(3) Gram´aticas Regulares.

Segundo a deﬁni¸c˜ao, para i = 0, 1, 2, 3, a gram´atica G = {U, Σ, S, P } ´e do

tipo i se e somente se as restri¸c˜oes (i) sobre P s˜ao satisfeitas como mostrado abaixo.

(0) Sem restri¸c˜oes;

(1) Cada produ¸c˜ao em P ´e da forma Q

→ Q

Y Q

onde Q

e Q

s˜ao

palavras formadas pelo alfabeto V = Σ∪U, X ∈ U e Y ´e uma palavra n˜ao-

vazia formada pelo alfabeto V , com a poss´ıvel exce¸c˜ao de uma produ¸c˜ao

S → λ, cuja ocorrˆencia em P implica que S n˜ao ocorre no lado direito de

qualquer produ¸c˜ao em P .

(2) Cada produ¸c˜ao em P ´e da forma X → Y onde X ∈ U e Y ∈ W (V ).

(3) Cada produ¸c˜ao ´e de uma das duas formas X → ZY ou X → Y , onde

X, Z ∈ U e Y ∈ W (Σ).

A hierarquia de Chomsky consiste em, segundo Salomaa (1987):

tipo 3 ⊂ tipo 2 ⊂ tipo 1 ⊂ tipo 0,

indicando que as gram´aticas do tipo 0 cont´em todas as demais e as do tipo 3 s˜ao

as mais restritivas, como ilustrado na 3.2.

Nas gram´aticas do tipo 1, gram´aticas sens´ıveis ao contexto, o s´ımbolo n˜ao-

terminal X pode ser substitu´ıdo por Y , somente quando Q

estiver a esquerda de

X e Q

a sua direita (Salomaa, 1987).

Exemplo de uma gram´atica sens´ıvel ao contexto:

Figura 3.2: Hierarquia de Chomsky (adaptado da Wikipedia)

Sejam : Σ = {a, b, f, i, l, n, o}, U = {B, C, D, L} e as produ¸c˜oes:

(1) S → BLCDo (lˆe-se: S pode ser substitu´ıdo por BLCDo)

(2) Bi → labi

(3) CDo → nfo

(4) L → i

A deriva¸c˜ao da palavra labinfo ´e realizada por: S

⇒ BLCDo

⇒ BLnf o

⇒

Binf o

⇒ labinfo

Por conven¸c˜ao: os n˜ao-terminais est˜ao em letras mai´usculas e os terminais

em letras min´usculas.

Observa¸c˜ao:

→ : produ¸c˜ao (lˆe-se: pode ser substitu´ıdo por)

⇒ : deriva¸c˜ao (lˆe-se: pode ser transformado em).

J´a nas gram´aticas do tipo 2, gram´aticas livres de contexto, o s´ımbolo n˜ao-

terminal X pode ser substitu´ıdo por Y , n˜ao importando quais as letras que est˜ao

adjacentes a X, isto ´e, independe de contexto.

Exemplo de uma gram´atica livre de contexto:

Sejam : Σ = {a, b, c}, U = {S, A} e as produ¸c˜oes:

(1) S → aA

(2) A → bA

(3) A → c

A deriva¸c˜ao da palavra abbc ´e realizada por: S

⇒ aA

⇒ abA

⇒ abbA

⇒ abbc

OBS: as produ¸c˜oes acima podem ser escritas como:

S → aA

A → bA|c

Gram´atica Estoc´astica Livre de Contexto (SCFG):

Uma gram´atica estoc´astica livre de contexto (SCFG, Stochastic Context Free

Grammar) apresenta a mesma forma¸c˜ao da gram´atica livre de contexto (CFG,

Context Free Grammar) com um adicional, cada conjunto, ou regra, de produ¸c˜ao

est´a associado com uma probabilidade. Segundo Eddy (2007), uma SCFG consiste

em:

Diferentes s´ımbolos n˜ao-terminais M (aqui chamados de“estados”). Letras

mai´usculas V e Y s˜ao usadas para referenciar genericamente os s´ımbolos

n˜ao-terminais.

Diferentes s´ımbolos terminais K (exemplo de alfabeto observado para RNA,

a, c, g, u). Letras min´usculas a, b s˜ao usadas para referenciar genericamente

os s´ımbolos terminais.

Um n´umero de regras de produ¸c˜ao da forma: V → γ, onde γ pode ser

qualquer cadeia de caracteres formada por s´ımbolos terminais e/ou n˜ao

terminais, incluindo (em um caso espec´ıﬁco) o caracter vazio .

Cada regra de produ¸c˜ao ´e associada com um probabilidade de tal forma que

a soma das probabilidades de produ¸c˜ao para qualquer dado n˜ao-terminal

V ´e igual a 1.

Modelo de Covariˆancia:

A ferramenta utilizada no presente trabalho baseia-se em especial no modelo

de covariˆancia (CM, Covariance Model), que ´e um caso particular de SCFG. Os

CMs s˜ao modelos probabil´ısticos resultantes da combina¸c˜ao de informa¸c˜oes de es-

trutura secund´aria e sequˆencias prim´arias, a partir de um alinhamento m´ultiplo de

sequˆencias. Sendo assim, cada classe de ncRNA corresponder´a a um perﬁl de CM

(Eddy, 2007).

Para gerar um CM ´e utilizado como entrada o alinhamento m´ultiplo de

sequˆencias de RNA. Este alinhamento apresenta uma estrutura secund´aria con-

senso do RNA (ﬁgura 3.3). Um CM consiste de v´arios tipos de estados, que s˜ao

associados as bases de nucleot´ıdeos e suas posi¸c˜oes na estrutura secund´aria do

RNA consenso. Um CM tem sete tipos de estados e regras de produ¸c˜ao, conforme

a tabela 3.1, onde “forma¸c˜ao”´e a probabilidade da ocorrˆencia de um estado e“tran-

si¸c˜ao” ´e a probabilidade de um pr´oximo estado ocorrer a partir do atual (Eddy,

2007).

Por exemplo, um par particular v no estado P produz aY b, onde a e b apre-

sentam probabilidade de forma¸c˜ao e

(a, b) e sua transi¸c˜ao para v´arios novos estados

Y tem probabilidade t

(Y ) (probabilidade de transi¸c˜ao). Entretanto, um estado

de bifurca¸c˜ao B se bifurca em dois novos estados de in´ıcio S com probabilidade 1.

J´a o estado E ´e um caso especial  de produ¸c˜ao que termina uma deriva¸c˜ao (Eddy,

2007).

Tabela 3.1: Estados do CM.

Tipo de estado Descri¸c˜ao Produ¸c˜ao Forma¸c˜ao Transi¸c˜ao

P Par formado P → aY b e

(a, b) t

(Y )

L Esquerda formada L → aY e

(a) t

(Y )

R Direita formada R → Y a e

(a) t

(Y )

B Bifurca¸c˜ao B → SS 1 1

D Dele¸c˜ao D → Y 1 t

(Y )

S In´ıcio S → Y 1 t

(Y )

E Fim E → ε 1 1

Um CM consiste de v´arios estados dos sete tipos b´asicos, cada um com suas

distribui¸c˜oes de probabilidade de produ¸c˜ao (forma¸c˜ao) e probabilidade de transi-

¸c˜ao, al´em de seu estado que tamb´em pode sofrer transi¸c˜ao. Pares de base consenso

ser´a modelada pelo estado P , res´ıduos consenso que n˜ao se pareiam podem ser

modelados pelo estado L e R, insers˜oes consenso podem ser modeladas pelos esta-

dos L e R, dele¸c˜oes conseso pode ser modeladas pelo estado D, e a topologia de

ramiﬁca¸c˜ao da estrutura secund´ario de RNA pode ser modelada pelos estados B,

S e E (Eddy, 2007).

Finalmente, para cada CM ´e gerada a ´arvore bin´aria referente a estrutura

consenso do alinhamento m´ultiplo. Para a constru¸c˜ao da ´arvore s˜ao usados os oito

tipos de n´os relacionados na tabela 3.2. Por exemplo, um n´o MATP cont´em um

estado do tipo P para modelar um par de base consenso (Eddy, 2007).

Dada uma estrurura consenso, as bases pareadas s˜ao atribu´ıdas aos n´os

MATP e as n˜ao pareadas s˜ao atribu´ıdas ou aos n´os MATL ou aos n´os MATR.

Um n´o ROOT ´e usado no in´ıcio da ´arvore. As bifurca¸c˜oes em uma ´arvore s˜ao atri-

bu´ıdas aos n´os BIF e seus ramos, ou sub´arvores, s˜ao iniciados com os n´os BEGL

e BEGR, o primeiro para o ramo a esquerda e o segundo para o ramos a direita

(ﬁgura 3.4) (Eddy, 2007).

Tabela 3.2: Os tipos de n´os usados na constru¸c˜ao da ´arvore bin´aria.

N´o Descri¸c˜ao Principais Estados

MATP Pareamento P

MATL N˜ao pareado a esquerda L

MATR N˜ao pareado a direita R

BIF Bifurca¸c˜ao B

ROOT Raiz S

BEGL Come¸co a esquerda S

BEGR Come¸co a direita S

END Fim E

Figura 3.3: Exemplo de uma dada fam´ılia de RNA: A esquerda ´e representado

o alinhamento m´ultiplo de 3 sequˆencias, sendo que a linha [estrutura] representa

a estrutura secund´aria consenso. A direita ´e mostrada a estrutura secund´aria da

sequˆencia do RNA de humano, gerada a partir da estrutura consenso (adaptado

de Eddy, 2007).

Figura 3.4: Alinhamento estrutural ´e convertido em ´arvore bin´aria. A esquerda ´e

representado a estrutura secund´aria consenso derivada do alinhamento da ﬁgura

anterior. A direita ´e representada a ´arvore CM correspondente a estrutura consenso

(adaptado de Eddy, 2007).

Cap´ıtulo 4

Materiais e M´etodos

Foram utilizados neste estudo os cromossomos I e II dos genomas de V. mi-

micus VM573, V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 e V. campbellii ATCC

BAA-1116.

4.1 Dados de entrada originados do genoma V. campbellii ATCC

BAA-1116

Para a obten¸c˜ao do genoma completo de V. campbellii ATCC BAA-1116 fo-

ram importados do site de ftp do NCBI

os arquivos que cont´em as sequˆencias

de DNA (NC 004603.fna e NC 009784.fna, cromossomo I e II respectivamente),

os arquivos que cont´em as anota¸c˜oes das ORFs (NC 004603.ptt e NC 009784.ptt)

e os arquivos que cont´em as localiza¸c˜oes dos tRNAs e rRNAs (NC 004603.gbk e

NC 009784.gbk).

4.2 Dados de entrada originados dos genomas de V. mimicus

VM573, V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3

A linhagem V. mimicus VM573 foi isolada, na d´ecada de 90, de um paciente

norte-americano com diarr´eia. As linhagens V. alginolyticus 40B, V. communis

NCBI: National Center for Biotechnology Information

[ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria]

1DA3 foram isoladas respectivamente dos corais brasileiros Mussismilia hispida e

Phyllogorgia dilatada, em 2007. A linhagem 1DA3, conhecida como V. harveyi-like

1DA3, foi caracterizada em 2010 como uma nova esp´ecie chamada V. communis

(Chimetto et al., 2010). Estes trˆes genomas foram recentemente sequenciados e

posteriormente submetidos ao processo de anota¸c˜ao autom´atica, descrito a seguir,

de forma a obter as ORFs e tRNAs.

4.2.1 Sequenciamento

Os genomas de V. mimicus VM573, V. alginolyticus 40B e V. communis

1DA3 foram sequenciados atrav´es do m´etodo de pirosequenciamento pela equipe

do Professor Dr. David Ussery da Universidade da Dinamarca. O equipamento

utilizado foi o sequenciador 454 Life Sciences, modelo Gemone Sequencer FLX

System da Roche.

Atrav´es do m´etodo descrito acima, foram geradas 415.534, 376.865 e 554.651

leituras (reads) para os genomas de V. mimicus VM573, V. alginolyticus 40B e V.

communis 1DA3, respectivamente. Utilizando o programa NEWBLER, estas lei-

turas foram montadas em fragmentos maiores e cont´ınuos chamados contigs. Para

V. mimicus VM573 foram gerados 82 contigs, correspondendo a um tamanho total

de 4.373.300 nt e uma cobertura estimada de 24 vezes o tamanho do genoma. Para

o V. alginolyticus 40B e V. communis 1DA3 foram gerados respectivamente 290

e 229 contigs, correspondendo a um tamanho total de 5.234.286 e 5.989.648 nt, e

uma cobertura estimada de 18 e 22 vezes o tamanho do genoma.

4.2.2 Anota¸c˜ao

A anota¸c˜ao autom´atica destes trˆes genomas foi realizada utilizando o pro-

grama SABIA (System for Automated Bacterial Integrated Annotation) (Almeida

et al., 2004) pela equipe de bioinform´atica liderado pela Dra. Ana Tereza R. Vas-

concelos do Laborat´orio Nacional de Computa¸c˜ao Cient´ıﬁca (LNCC). O programa

de anota¸c˜ao SABIA possui interface com os principais bancos de dados utilizados

em anota¸c˜ao de genomas, al´em de possibilitar v´arias compara¸c˜oes entre genomas.

Os parˆametros utilizados para a anota¸c˜ao dos genomas foram: cobertura de 60%

e E-value m´aximo de 10

−5

O processo de anota¸c˜ao autom´atica gerou para cada genoma o mapa das

ORFs (ver na tabela 4.1 a quantidade de ORFs encontradas) e tRNAs. Cada

mapa mostra para cada ORF sua localiza¸c˜ao, dire¸c˜ao, nome do gene quando iden-

tiﬁcado, fun¸c˜ao da prote´ına quando identiﬁcada, entre outras caracter´ısticas.

Tabela 4.1: Quantidade de ORFs por genoma gerada pelo programa de anota¸c˜ao

SABIA.

Genoma V. mimicus VM573 V. alginolyticus 40B V. communis 1DA3

Total de ORFs 3744 4340 4954

Com os resultados obtidos pela anota¸c˜ao autom´atica, a equipe do labinfo

gerou para cada genoma de vibrio trˆes arquivos por contig: os fna, ptt e gbk.

O primeiro arquivo cont´em a sequˆencia de DNA referente ao contig, no formato

FASTA; o segundo cont´em as anota¸c˜oes das ORFs deste contig, ou seja as locali-

za¸c˜oes e os nomes dos genes assim como seu produto; j´a o terceiro arquivo al´em de

conter as anota¸c˜oes das ORFs, como no arquivo ptt, tamb´em cont´em a localiza¸c˜ao

dos tRNAs.

Para determinar a qual cromossomo cada contig pertence, foi utilizado, a

ferramenta Cross match para comparar as sequˆencias de DNA dos genomas aqui

estudados com genomas importados do NCBI, como segue: V. mimicus VM573

foi comparado com V. cholerae e V. cholerae 0395; V. alginolyticus 40B com V.

parahaemolyticus; V. harvey 1DA3 com V. campbellii ATCC BAA-1116. A tabela

4.2 mostra a quantidade de contigs por cromossomo.

Tabela 4.2: Quantidade de contigs por cromossomo. Em alguns contigs n˜ao foi

poss´ıvel determinar o cromossomo de origem, sendo assim denominados de contigs

sem identiﬁca¸c˜ao.

Genoma V. mimicus VM573 V. alginolyticus 40B V. communis 1DA3

Contigs do Cromossomo I 34 103 66

Contigs do Cromossomo II 25 59 45

Contigs sem identiﬁca¸c˜ao 11 14 17

4.3 An´alise Computacional

Nesta etapa, al´em de terem sido utilizados o programa cmsearch (pertencente

ao pacote Infernal

vers˜ao 0.81) e a base de dados do Rfam

9.0, foram desen-

volvidos programas em linguagem Perl. O Perl ´e uma linguagem de programa¸c˜ao

est´avel e multiplataforma, ou seja ´e suportada em ambientes UNIX, Windows, Ma-

cintosh, entre outros. Esta linguagem ´e muito utilizada na bioinform´atica devido a

sua alta eﬁciˆencia na manipula¸c˜ao de caracteres e por possuir m´odulos espec´ıﬁcos

para aplica¸c˜oes em bioinform´atica.

A an´alise computacional apresentada neste trabalho baseou-se nas regi˜oes

intergˆenicas (IGRs) para a procura dos ncRNAs. Sendo assim, foram identiﬁcadas

todas as IGRs dos genomas de V. mimicus VM573, V. alginolyticus 40B, V. com-

munis 1DA3 e V. campbellii ATCC BAA-1116. Na ﬁgura 4.2 est˜ao representadas,

atrav´es de ﬂuxograma, as etapas da an´alise computacional, as quais ser˜ao detalha-

das mais adiantes.

Infernal: inference of RNA alignments [http://infernal.janelia.org]

Rfam [http://rfam.janelia.org]

Em V. mimicus VM573, V. alginolyticus 40B e V. communis 1DA3 foram

usados, para a an´alise computacional, somente os contigs que continham pelo me-

nos uma ORF, os contigs sem ORFs foram descartados. A op¸c˜ao pelo descarte

destes contigs deve-se aos seus diminutos tamanhos (estando muito fragmentados)

e `a impossibilidade de mapear os ncRNAs que por ventura fossem encontrados,

ou seja entre quais genes est˜ao situados. Na tabela 4.3 mostra a quantidade de

contigs sem ORFs e com ORFs de cada genoma.

Tabela 4.3: Quantidades de contigs sem ORFs e com ORFs (contigs ´uteis para

an´alise) em cada genoma.

Genoma V. mimicus VM573 V. alginolyticus 40B V. communis 1DA3

Total de contigs 82 290 229

Contigs sem ORFs 12 114 101

Contigs ´uteis para an´alise 70 176 128

4.3.1 Identiﬁca¸c˜ao de Regi˜oes Intergˆenica em V. mimicus VM573,

V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3

Para a identiﬁca¸c˜ao das regi˜oes intergˆenicas (IGRs) foi desenvolvido um pro-

grama em Perl. O primeiro passo deste programa ´e a separa¸c˜ao dos contigs por

cromossomo. Posteriormente s˜ao gerados, para cada contig, arquivos no formato

FASTA contendo a localiza¸c˜ao e a sequˆencia das diversas IGRs. Estas IGRs s˜ao

calculadas utilizando o arquivo que cont´em a sequˆencia do contig (fna) e os ar-

quivos que cont´em as anota¸c˜oes das ORFs e de tRNAs (ptt e gbk) do contig em

quest˜ao. As regi˜oes que n˜ao estiverem anotadas nos arquitos ptt e gbk ser˜ao ma-

peadas e suas sequˆencias extra´ıdas do arquivo fna.

Por exemplo, no contig 56 do genoma de V. mimicus foram identiﬁcados,

por este programa, 5 IGRs e ao ﬁnal foram gerados 5 arquivos de sa´ıda, um para

cada IGR. Cada arquivo de sa´ıda cont´em a localiza¸c˜ao do IGR no contig e a sua

sequˆencia de nucleot´ıdeos. Abaixo s˜ao mostrados 3 destes arquivos de sa´ıda.

Nome do arquivo: Vibrio Mimicus Extragenic56 IGR 1.txt

Conte´udo:

>*IG* (1-229)

CCTCTAGTYGGCGCTTTTTTTTTGTACAACATTAATCTTTATCCAGCAATCAATTTCTCAACACTTTAT

CTAATAAAAATATAATTATTAAAAACCTTTCATTCGGTTCATTTCACGACTTAAGAAATTGGTACTCGT

AGCAACTCGCACTAAGTCTTCAAACCTCTTTTCATTACCAATGAGCTTCAATCTAATCTTGGTAATTAT

TTTTATAGAAGGTTAAAAAAAT

Nome do arquivo: Vibrio Mimicus Extragenic56 IGR 2.txt

Conte´udo:

>*IG* (1523-1559)

ACCTAAAAATCCCAGCCAAGTGCTGGGATTTTCTACA

Nome do arquivo: Vibrio Mimicus Extragenic56 IGR 3.txt

Conte´udo:

>*IG* (2616-2694)

GACTCATTTTCTCCTTTTTCGCCATCATAACAGCCAGAATGATGAGGAGCGAGTCGTACCCCAAATGAGTGT

GAGAAGC

4.3.2 Identiﬁca¸c˜ao de Regi˜oes Intergˆenica em V. campbellii ATCC

BAA-1116

Como o genoma de V. campbellii ATCC BAA-1116 ´e completo e seus 6 ar-

quivos (um arquivo fna, ptt e gbk, para cada cromossomo) foram importado do site

de ftp do NCBI, foi necess´ario adaptar o programa de extra¸c˜ao de IGR para este

genoma. Neste caso o programa gera para cada cromossomo, e n˜ao para cada con-

tig como nos demais genomas, arquivos no formato FASTA contendo a localiza¸c˜ao

e a sequˆencia das IGRs. Por exemplo, no cromossomo I do genoma de V. capbellii

foram gerados, atrav´es do programa, 2869 arquivos de sa´ıda que correspondem a

2869 IGRs. Pode-se observar abaixo trˆes destas sa´ıdas que correspondem ao IGR

2, 3 e 4:

Nome do arquivo: NC 009783 IGR 2.txt

Conte´udo:

>*IG* (6420-6515)

TGCGTGACGATAGATTAACCACTCTCTCTAATAACAAGAAAGAATAGAAGAGAATGTTTTATAACTTTTTGG

AAGTAAGAACGTTGGACCTAGTGC

Nome do arquivo: NC 009783 IGR 3.txt

Conte´udo:

>*IG* (6747-6895)

CGCAATCCCTGCTCCAACTTTTCTACATTGCTCTCAATAAGCATGGTCGAAGACTGAAACTTGGGCGAGAAAT

TCGATTTAATATAATGAAGTGATATAAAAAAACGCCGCTTATAAAGCGACGTTTTAAAGGAATGAATGCAGCG

TAC

Nome do arquivo: NC 009783 IGR 4.txt

Conte´udo:

>*IG* (7562-7661)

GTAATTTTTACTCCGAGATAGCTGATTTCAACATTAAGGGACATGTGAGAAATACTAACATACTCTCACAGCCC

GCCATCAACTAAATCTCTACAATCCG

4.3.3 Preprocessamento da base de dados do Rfam

A ferramenta Infernal apesar de ser considerada uma das ferramentas mais

eﬁcientes e sens´ıveis para a detec¸c˜ao de ncRNA em base de dados, consome muito

tempo de processamento quando o volume de informa¸c˜oes a ser processado ´e alto.

Com o intuito de diminuir o tempo computacional no processo de busca, a base

de dados do Rfam foi preprocessado de forma que fossem eliminados os modelos

de covariˆancia referentes `as classes de tRNAs e rRNAs assim como `as classes de

ncRNAs de eucariotos (snoRNA, miRNA, snRNA splicing).

Para atingir tal objetivo, foi desenvolvido um novo programa em Perl. Este

consulta o arquivo Rfam.seed, no formato STOCKHOLM, e procura nos cam-

pos #=GF TP as seguintes classes de ncRNA: snoRNA, miRNA, snRNA spli-

cing, rRNA e tRNA. Quando estas classes s˜ao encontradas, suas referˆencias (ex:

RF00007) contidas nos campos #=GF AC s˜ao armazenadas. Estas referˆencias

s˜ao usadas pelo programa para encontrar e eliminar os arquivos CM que cont´em

as classes indesejadas de ncRNAs. Veja ﬁgura 4.1.

4.3.4 Busca utilizando o infernal e a base de dados do Rfam

As IGRs geradas pelo programa descrito na sess˜ao 4.3.3, foram analisadas e

as que possu´ıam tamanhos menores do que 50 nt foram descartadas. Este procedi-

mento ´e necess´ario uma vez que os ncRNAs apresentam tamanhos a partir de 50 nt.

Figura 4.1: Fluxograma do preprocessamento da base Rfam.

Todas as sequˆencias das IGRs acima de 50 nt foram individualmente compa-

radas com a base de dados preprocessada do Rfam, utilizando para isto o programa

cmsearch do pacote Inferno. Cada sa´ıda pode apresentar pontua¸c˜oes permitindo

estimar a importˆancia de cada candidato. O score cutoﬀ utilizado foi 34, indicando

que os candidatos gerados s˜ao os de score acima de 34. Quanto maior a pontua¸c˜ao

dos candidatos maior a garantia do resultado. Pontua¸c˜oes maiores do que o log

do tamanho da sequˆencia de interesse (sequˆencia de IGR) s˜ao considerados signi-

ﬁcativos, segundo o guia de usu´ario do Infernal

. Por exemplo, caso a sequˆencias

de interesse tenha 600 nt (300 nt x 2 ﬁtas), pontua¸c˜oes acima de 9.23 s˜ao conside-

radas signiﬁcantes. Como o maior IGR encontrado neste estudo apresenta 9666 nt

(cromossomo II de V. communis), e log

(9666 x 2) ´e igual a 14.24, pode-se concluir

Infernal User’s guide: Sequence analysis using proﬁles of RNA secondary structure consensus,

2007 [http://infernal.janelia.org]

que qualquer pontua¸c˜ao acima de 14.24 para qualquer IGR j´a seria considerado

signiﬁcativo. Entretanto foi adotado o score cutoﬀ de 34, ou seja, selecionado ape-

nas os candidatos de pontua¸c˜ao acima de 34. Este valor foi adotado pois ´e bem

pr´oximo ao utilizado pelo Web Search Rfam

, al´em disso confere uma maior credi-

bilidade aos resultados, pois, como descrito acima, quanto maior a pontua¸c˜ao dos

candidatos maior a garantia do resultado.

Foi desenvolvido um programa em Perl que apresenta algumas fun¸c˜oes para

realizar as etapas acima descritas, de forma que todos os IGRs dos genomas aqui es-

tudados foram confrontado com todos os arquivos CM (ap´os o preprocessamento).

A ´ultima fun¸c˜ao desse programa ´e respons´avel pela formata¸c˜ao dos resultados e

gera para cada sa´ıda dois arquivos, um contendo maiores detalhes do ncRNA can-

didato e o outro contendo o tamanho e a sequˆencia de DNA do ncRNA candidato

(veja ﬁgura 4.2).

4.3.5 Formata¸c˜ao dos resultados

E a ´ultima fun¸c˜ao do programa de busca, descrito acima, com o objetivo de

incrementar alguns dados importantes `as sa´ıdas do programa cmsearch, de forma a

gerar para cada ncRNA cantidato sua identiﬁca¸c˜ao, fam´ılia pertencente, descri¸c˜ao,

seu tamanho, as sequˆencias de DNA do ncRNA candidato e da IGR que o pertence,

suas ORFs upstream e downstream, a ﬁta (strand), entre outras informa¸c˜oes. Para

gerar tais dados, esta parte do programa consulta os arquivos ptt e Rfam.seed,

al´em dos arquivos que cont´em as sequˆencias de DNA das IGRs.

Web Search Rfam [http://rfam.sanger.ac.uk/search]

Figura 4.2: Fluxograma das etapas da an´alise computacional.

4.4 An´alise de desempenho

O programa de busca foi executado em uma m´aquina do Laborat´orio de

Bioinform´atica (Labinfo/LNCC), sendo que 10 CPUs (Unidade Central de Proces-

samento) foram usados simultaneamente. A m´aquina apresenta a seguinte conﬁ-

gura¸c˜ao:

Processadores: 8 Dual Core AMD Opteron(tm) Processor 885. Totali-

zando 16 CPUs ou cores.

Mem´oria compartilhada: 64 GB.

Sistema Operacional: CentOS 5.2 kernel 2.6.18-92.el5.

Escalonador SGE (Sun Grid Engine). Software respons´avel por escalonar

(distribuir) as tarefas entre os diversos n´ucleos ou processadores.

Foram utilizados os IGRs acima de 50 nt do cromossomo I de V. mimicus

VM573 para realizar o teste de desempenho do programa de busca. Este teste

tem como objetivo comparar o desempenho de busca na base de dados Rfam pre-

processada com a busca na base de dados completa do Rfam. Ap´os a execu¸c˜ao

do programa de busca ora usando a base completa ora a base preprocessada, o

wallclock (tempo de rel´ogio, do momento que come¸ca a execu¸c˜ao at´e o t´ermino da

execu¸c˜ao do programa) foi recolhido e analisado, para cada um dos casos.

4.5 Valida¸c˜ao experimental

A valida¸c˜ao experimental foi realizada pela equipe do Laborat´orio de Pes-

quisa Naval do Centro de Ciˆencia Biomolecular e Engenharia (Marinha Americana,

Washington DC) liderada pelo Dr. Gary J. Vora. Esta an´alise foi realizada uti-

lizando culturas de V. campbelli BAA-1116. A an´alise experimental tem como

objetivo validar os resultados obtidos pela metodologia in silico. Foram utilizadas

as t´ecnicas de microarranjo e PCR de transcri¸c˜ao reversa (RT-PCR). Maiores de-

talhes sobre as t´ecnicas empregadas nesta valida¸c˜ao podem ser obtidos na se¸c˜ao

de materiais e m´etodos do artigo, no apˆendice C.

Cap´ıtulo 5

Resultados e Discuss˜ao

5.1 Identiﬁca¸c˜ao das Regi˜oes intergˆenicas em V. mimicus VM573,

V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 e V. campbellii ATCC

BAA-1116

As quantidades de IGRs encontradas no genoma de V. mimicus VM573, V.

alginolyticus 40B e V. communis 1DA3 est˜ao listadas na tabela 5.1. As IGRs efeti-

vamente usadas nas an´alises foram as de tamanho acima de 50 nt. Por conseguinte,

foram usadas 2402 IGRs de V. mimicus, 3055 IGRs de V. alginolyticus, 3465 IGRs

de V. communis e 3663 IGRs de V. campbellii.

Tabela 5.1: Quantidade de IGRs (total, menores do que 50 nt e maiores do que

50 nt) encontradas nos genomas de V. mimicus VM573, V. alginolyticus 40B,

V. communis 1DA3 e V. campbellii ATCC BAA-1116, separadas por cromossomo:

cromossomo I (Crom I), cromossomo II (Crom II). As IGRs provenientes de contigs

que n˜ao foram poss´ıveis detectar o cromossomo que as originou, fazem parte da

estat´ıstica de cromossomo indeﬁnido (Crom -).

Organismo V. mimicus V. alginolyticus V. communis V. campbellii

IGRs Total <50nt >50nt Total <50nt >50nt Total <50nt >50nt Total <50nt >50nt

Crom I 1952 435 1517 2178 429 1749 2259 428 1831 2869 616 2253

Crom II 1038 183 855 1510 254 1256 1914 328 1586 1810 400 1410

Crom - 32 2 30 54 4 50 61 13 48 - - -

Total 3022 620 2402 3742 687 3055 4234 769 3465 4679 1016 3663

As maiores IGRs encontradas nos genomas dos vibrios, bem como o tamanho

m´edio das IGRs s˜ao mostrados na tabela 5.2.

Tabela 5.2: Tamanhos das IGRs dos genomas de vibrio.

Organismo Cromossomo

Maior IGR Tamanho m´edio

Tamanho (nt) Localiza¸c˜ao das IGRs (nt)

V. mimicus

Crom I 3431 contig4 IGR 59 179,54

Crom II 3453 contig18 IGR 9 237,88

V. alginolyticus

Crom I 9319 contig93 IGR 1 231,09

Crom II 7745 contig2 IGR 1 241,27

V. communis

Crom I 2915 contig19 IGR 1 208,08

Crom II 9666 contig17 IGR 1 227,08

V. campbellii

Crom I 2458 IGR 2563 179,45

Crom II 3922 IGR 1442 164,59

5.2 Desempenho do programa de busca utilizando a base de dados

preprocessada

A base preprocessada do Rfam reduziu o tempo de execu¸c˜ao da busca de

ncRNAs em 2.9 vezes quando comparado `a busca utilizando a base completa do

Rfam (5.3). Os testes consistiram em trˆes execu¸c˜oes na base completa e na base

preprocessada. A m´edia do tempo de execu¸c˜ao, utilizando a base completa, foi

de 21 horas 58 minutos e 19 segundos (desvio padr˜ao de 2 minutos e 5 segundos),

j´a utilizando a base preprocessada a m´edia do tempo de execu¸c˜ao foi de 7 horas

34 minutos e 22 segundos (desvio padr˜ao de 17 minutos e 6 segundos), conforme

tabela 5.3. Nestes testes de desempenho foram usados todos os IGRs acima de 50

nt do cromossomo I de V. mimicus VM573.

A busca na base de dados Rfam atrav´es da ferramenta Infernal ´e lenta, por

isso faz-se necess´aria uma pr´evia ﬁltragem (preprocessamento) da base de dados

eliminando as classes de ncRNAs que n˜ao condizem com o organismo estudado.

Vericou-se que o preprocessamento melhorou bastante o tempo de execu¸c˜ao do

programa de busca, sendo essencial para a obten¸c˜ao otimizada dos resultados.

Tabela 5.3: Compara¸c˜ao dos tempos de execu¸c˜ao.

Tempo de execu¸c˜ao

(hh:mm:ss)

Base Rfam completa Base Rfam preprocessada

Teste 1 21:57:28 07:14:41

Teste 2 22:00:41 07:42:56

Teste 3 21:56:47 07:34:22

M´edia 21:58:19 07:34:22

Devio Padr˜ao 00:02:05 00:17:06

5.3 Busca utilizando Infernal / Rfam

Abaixo ´e apresentado um exemplo de sa´ıda do comando cmsearch. Neste

exemplo o arquivo CM usado foi o RF00378.cm e o arquivo contendo a sequˆen-

cia desejada foi o Vibrio Mimicus Extragenic20 IGR 46.txt (IGR 46 do contig 20

pertencente ao cromossomo II de V. mimicus VM573). No arquivo de sa´ıda s˜ao

mostrados o alinhamento, a ﬁta (strand) e a pontua¸c˜ao (score). Neste exemplo este

ncRNA, que faz parte da fam´ılia do CM RF00378 (Qrr RNA) est´a na ﬁta positiva

e apresenta uma pontua¸c˜ao de 83,37.

CM 1: SEED

CM lambda and K undefined -- no statistics

Using CM score cutoff of 34.00

>*IG*

Plus strand results:

Query = 1 - 108, Target = 161 - 265

Score = 83.37, GC = 47

<<<<<<____________>>>>>>,,,,,,,,,,,,,,,<<<<--<<<<<<<____>>>>

1 uGaCCCUUauuAAgccgAGGGuCaCCUAGCCAACUGACGuuguUAGuGaAcauaAuugUu 60

:GACCCUU UAAGCCGAGGGUC:CCUAGCCAACUGACG U UUAGUGAACA AUUGUU

161 CGACCCUU-CUAAGCCGAGGGUCACCUAGCCAACUGACGUUGUUAGUGAACACCAUUGUU 219

>>>------->>>>--<<<<<<<<.______>>>>>>>>::::::::::

61 CaCAaaaAaaauaaaGCCAaccgc.aauaUUgcgguUGGcUuUUUUUUu 108

CACA A+A+ A A GCCAA:C:C ++U UUG:G:UUGGC UUUUUU

220 CACACAUAU-AGACGGCCAAUCACaCUUCUUGUGGUUGGCCUUUUUU-- 265

Fin

A an´alise in silico, utilizando o infernal e a base de dados preprocessada do

Rfam, identiﬁcou 140 ncRNAs candidatos nos quatro genomas, dos quais 31 em V.

alginolyticus 40B, 38 em V. campbellii ATCC BAA-1116, 38 em V. communis 1DA3

e 33 em V. mimicus VM573 (ver tabela 5.4). O tamanho dos ncRNAs encontrados

variaram entre 56 a 402 nt, sendo que 87%, ou seja 122 candidatos, apresentam

tamanhos que variam de 50 a 250 nt. O n´umero de ncRNAs encontrados no me-

nor cromossomo destes vibrios (variou de 9 a 12 candidatos), ´e signiﬁcativamente

menor (p<0.01) do que no maior cromossomo (variou de 20 a 27 candidatos). N˜ao

foram encontrados nenhum ncRNA nas IGRs de cromossomo indeﬁnido.

Tabela 5.4: Quantidades de ncRNAs encontradas nos genomas de V. mimicus

VM573, V. alginolyticus 40B, V. communis 1DA3 e V. campbellii ATCC BAA-

1116, separadas por cromossomo: cromossomo I (Crom I), cromossomo II (Crom

II) ou cromossomo indeﬁnido (Crom -).

Organismo V. mimicus V. alginolyticus V. communis V. campbellii

VM573 40B 1DA3 ATCC BAA-1116

Crom I 24 20 27 26

Crom II 9 11 11 12

Total 33 31 38 38

5.4 Formata¸c˜ao dos resultados

A ´ultima fun¸c˜ao do programa de busca desenvolvido em Perl, descrito nas

sess˜oes 4.3.4 e 4.3.5, gera dois arquivos para cada sa´ıda. Um dos arquivos cont´em

a sequˆencia de DNA do ncRNA candidato, seu tamanho e a ﬁta (strand), e o outro

arquivo cont´em, al´em dos dados obtidos pelo comando cmsearch, outras informa-

¸c˜oes importantes sobre o ncRNA candidato. Ou seja, as informa¸c˜oes obtidas pelo

cmsearch, tais como, a pontua¸c˜ao do ncRNA candidato e seu alinhamento com a

sequˆencia espec´ıﬁca da base de dados do Rfam recebem informa¸c˜oes adicionais,

incluindo a localiza¸c˜ao da IGR que cont´em o ncRNA candidato (em rela¸c˜ao ao

contig), a sequˆencia da IGR, identiﬁca¸c˜ao do ncRNA, tipo da fam´ılia na qual este

pertence, ORFs que ladeiam o ncRNA.

Um exemplo de sa´ıda do programa de formata¸c˜ao dos resultados ´e apresen-

tado no pr´oximo par´agrafo. Este programa gera dois arquivos por ncRNA candi-

dato. No exemplo escolhido, o candidato ´e o mesmo do subitem 5.3. Logo abaixo,

encontra-se o arquivo que cont´em uma nova formata¸c˜ao, esta al´em de oferecer in-

forma¸c˜oes originadas da sa´ıda do comando cmsearch (exemplo anterior), cont´em

importantes informa¸c˜oes adicionais.

Arq saida: Vibrio_Mimicus_Extragenic20_IGR_46.txt

>*IG* (62915-63179)

TTTTTTTGCATTTTGCAAATGTTAATTTGCAATTCGCAATCGCAATTGCATTTTGTTATTCACTTATGAG

TCAAGTTGTAATGAAACTGCCGATTATTTGTACGGTTTTCATGCAAAAGTACTTAATAAAAAGTTGGCAC

GTAATCTGCATTAATTAGATCGACCCTTCTAAGCCGAGGGTCACCTAGCCAACTGACGTTGTTAGTGAAC

ACCATTGTTCACACATATAGACGGCCAATCACACTTCTTGTGGTTGGCCTTTTTT

Score: 83.37

#=GF AC RF00378

#=GF ID Qrr

#=GF DE Qrr RNA

#=GF AU Moxon SJ

#=GF SE PMID:15242645

#=GF SS Published; PMID:15242645; Moxon SJ

#=GF GA 25.00

#=GF TC 25.79

#=GF NC 8.85

#=GF TP Gene; sRNA;

#=GF BM cmbuild CM SEED

#=GF BM cmsearch --toponly CM SEQDB

#=GF RN [1]

#=GF RM 15242645

#=GF RT The Small RNA Chaperone Hfq

#=GF RA Lenz DH, Mok KC, Lilley BN, Kulkarni RV, Wingreen NS, Bassler BL;

#=GF RL Cell 2004;118:69-82.

#=GF CC This family represents a set of small RNAs (the Qrr RNAs) that are thought

#=GF CC to be involved in the regulation of quorum sensing in Vibrio species. It is

#=GF CC believed that these RNAs, guided by a protein, Hfq, can mediate the

#=GF CC destabilisation of the quorum-sensing master regulators LuxR/HapR mRNAs

#=GF CC [1].

#=GF SQ 31

ORF Upstream: - | Strand: +| Produto: GGDEF family protein

ORF Downstream: - | Strand: -| Produto: conserved hypothetical protein

<<<<<<____________>>>>>>,,,,,,,,,,,,,,,<<<<--<<<<<<<____>>>>

1 uGaCCCUUauuAAgccgAGGGuCaCCUAGCCAACUGACGuuguUAGuGaAcauaAuugUu 60

:GACCCUU UAAGCCGAGGGUC:CCUAGCCAACUGACG U UUAGUGAACA AUUGUU

161 CGACCCUU-CUAAGCCGAGGGUCACCUAGCCAACUGACGUUGUUAGUGAACACCAUUGUU 219

>>>------->>>>--<<<<<<<<.______>>>>>>>>::::::::::

61 CaCAaaaAaaauaaaGCCAaccgc.aauaUUgcgguUGGcUuUUUUUUu 108

CACA A+A+ A A GCCAA:C:C ++U UUG:G:UUGGC UUUUUU

220 CACACAUAU-AGACGGCCAAUCACaCUUCUUGUGGUUGGCCUUUUUU-- 265

Abaixo ´e apresentado o exemplo do outro arquivo gerado, ou seja, o arquivo

contendo as sequˆencias dos genes do ncRNA, seu tamanho e a ﬁta (strand).

- Qrr (second) (105 nt | Strand +):

GACCCTTCTAAGCCGAGGGTCACCTAGCCAACTGACGTTGTTAGTGAACACCATTGTTC

ACACATATAGACGGCCAATCACACTTCTTGTGGTTGGCCTTTTTT

Para visualizar as sequˆencias dos ncRNAs candidatos geradas neste trabalho,

acessar a URL: http://www.lncc.br/∼tide

Gra¸cas a esta etapa da formata¸c˜ao dos resultados pˆode-se gerar uma tabela

completa de ncRNAs dos quatro genomas de vibrio, esta tabela encontra-se no

apˆendice B. Os ncRNAs detectados foram categorizados, segundo suas fun¸c˜oes e

caracter´ısticas. No total, 46 ncRNAs foram classiﬁcados como riboswitches, 30

como RNAs antisenso de a¸c˜ao trans, 22 como ncRNAs que modulam atividade

de prote´ınas, 9 RNAs antisenso de a¸c˜ao cis, 4 ribonucleoproteinas, 9 ncRNAs de

regula¸c˜ao por t´ermino de transcri¸c˜ao e 20 ncRNAs de classiﬁca¸c˜ao desconhecida.

A tabela contendo estes dados pode ser vizualizada no apˆendice A, onde cr I e cr

II s˜ao cromossomo I e cromossomo II. O ncRNA encontrado com maior frequˆen-

cia foi o Qrr, com at´e 5 copias por genoma (exceto o genoma de V. mimicus que

apresenta 4 copies). Estas repeti¸c˜oes podem sugerir um papel fundamental, desta

classe de ncRNAs, no funcionamento celular, como por exemplo na regula¸c˜ao de

quorum sensing e patogenicidade.

5.5 Diversidade de ncRNAs nos genomas de vibrio

Nesta se¸c˜ao s˜ao discutidos os ncRNAs encontrados nos genomas dos quatro

vibrios estudados.

Riboswitches:

Riboswitch de glicina: Possui normalmente dois dom´ınios aptˆameros para

liga¸c˜ao de metab´olitos. Os optˆameros ligam-se a glicina para regular a express˜ao

do gene subsequente. Este riboswitch ´e encontrado upstream do operon gcvt, em

Bacillus subtilis. O operon gcvt controla a degrada¸c˜ao da glicina, quando a glicina

est´a em excesso, ela se liga a ambos os aptˆameros ativando estes genes e facilitando

a degrada¸c˜ao da glicina. A glicina em uma c´elula bacteriana deve ser mantida a um

n´ıvel basal. Os dois optˆameros trabalhando em coopera¸c˜ao tornaria o processo de

degrada¸c˜ao mais eﬁciente, o que poderia conferir uma vantagem de crescimento sob

certas condi¸c˜oes nutricionais (Kwon e Strobel, 2008; Mandal et al., 2004). Esse

riboswitch quando encontrado em nosso genoma apresenta-se adjacente ao gene

da fam´ılia simporter s´odio/alanina e consequentemente regula a tradu¸c˜ao de seu

mRNA. A simporter s´odio/alanina ´e uma prote´ına de membrana respons´avel pelo

transporte de alanina e ou glicina em associa¸c˜ao com ´ıons sodio e ou ´ıons hidrogˆe-

nio.

Riboswitch de cobalamina: Tamb´em chamado de elemento-B12, liga-se a

adenosilcobalamina (uma coenzima formada pela vitamina B12) para regular a bi-

oss´ıntese e transporte de cobalamina e metab´olitos similares (Martens et al., 2002;

Vitreschak et al., 2003). Em V. mimicus o gene que codiﬁca para este riboswitch

´e ladeado pelo gene cujo produto ´e a prote´ına de membrana externa receptora de

cobalamina. Em V. alginolyticus e V. campbellii ATCC BAA-1116 ´e ladeado pelo

gene cujo produto ´e tRNA (uracil-5-)-metiltransferase (a vitamina B12 aumenta

a atividade da metiltransferase), indicando que estes s˜ao os genes regulados pelo

riboswitch de cobalamina.

Riboswitch de lisina: Serve como um sensor preciso para detectar a lisina.

E encontrado em genes envolvidos com o metabolismo da lisina, incluindo o gene

lysC (Mandal et al., 2003; Sudarsan et al., 2003). O gene deste riboswitch foi en-

contrado nos genomas aqui estudados, ora adjacente ao gene lysC, ora adjacente

ao gene vicH. O produto de vicH ´e o DNA-binding protein H-NS, indicando ser o

regulador da tradu¸c˜ao dos mRNAs destes genes.

Riboswitch de TPP: Tamb´em chamado de Thi-box riboswitch ou elemento

THI, ele liga-se diretamente a tiamina pirofosfato (TPP) para regular a express˜ao

gˆenica de v´arios mecanismos em archaea, bact´eria e eucariontes. TPP ´e uma forma

ativa de tiamina (vitamina B1), sendo assim este riboswitch ´e um elemento de re-

gula¸c˜ao de tiamina (Winkler et al., 2002). S˜ao encontrados em todos os genoma

de vibrio aqui estudados. Nestes genomas existem pelo menos dois riboswitches de

TPP, um no cromossomo II, que regula a express˜ao da fosfometilpirimidina quinase

cujo gene ´e thiD (participa do metabolismo da tiamina) e o outro, encontrado no

cromossomo I, que regula a express˜ao da prote´ına ThiC (participa na bioss´ıntese

de tiamina), cujo gene ´e thiC.

Riboswitch de FMN: Tamb´em chamado de elemento RFN, est´a envolvido

na regula¸c˜ao de genes que sintetizam riboﬂavina (vitamina B2). O termo FMN

signiﬁca “ﬂavina mononucleot´ıdeo” (sendo a riboﬂavina o componente central). O

elemento RFN ´e um dom´ınio encontrado frequentemente na regi˜ao 5’ n˜ao-traduzida

de mRNAs respons´aveis pela bioss´ıntese de FMN e transporte de prote´ınas. O ele-

mento RFN se liga a FMN na ausˆencia de prote´ınas (Gelfand et al., 1999). Em

todos os genomas aqui estudados, este riboswitch ´e encontrado junto ao gene ribB

regulando a tradu¸c˜ao do mRNA do RibB. O RibB codiﬁca 3,4-dihidroxi-2-butano

4-fosfato sintase, envolvida na biosintese de riboﬂavina.

Riboswitch de purina: Ligam-se a guanina e adenina regulando o mRNA

respons´avel pela bioss´ıntese e transporte de purinas (Serganov et al., 2004). En-

contrado no genoma de V. communis e V. campbellii, neste ´ultimo est´a associado

ao gene cujo produto ´e adenosina deaminase, esta enzima promove a deamina¸c˜ao

da adenosina para inosina (encontradas em tRNAs). A codiﬁca¸c˜ao desta enzima ´e

regulada pelo riboswitch de purina.

YkkC/YxkD: A fun¸c˜ao desta fam´ılia n˜ao ´e clara, embora tenha sido suge-

rido que ela possa ligar bombas de ﬂuxo (eﬄux pumps) e sistemas de desintoxica¸c˜ao

em resposta a mol´eculas ambientais nocivas (Barrick et al., 2004). S´o encontrado

no cromossomo II de V. communis.

ykoK: tamb´em chamado de M-box, ´e um RNA sens´ıvel a Mg

que controla

a express˜ao de prote´ınas de transporte de ´ıons de magn´esio em bact´erias (Barrick

et al., 2004). Encontrados, em nossos estudos, no genoma de V. mimicus upstream

ao gene que expressa prote´ına transportadora de magn´esio, sendo a express˜ao deste

gene regulada por tal riboswitch.

GEMM: Genes associados com di-GMP c´ıclico (GEMM) est˜ao envolvidos

em diversas fun¸c˜oes, como transdu¸c˜ao de sinal, secre¸c˜ao e uso de quitina (Sudar-

san et al., 2008; Weinberg et al., 2007). O GEMM foi encontrado upstream aos

genes que codiﬁcam prote´ınas reguladoras de transcri¸c˜ao (fam´ılia LacI) e prote´ınas

chitinase like, indicando o seu papel regulat´orio sobre estes genes em vibrio.

MOCO RNA motif: Seu optˆamero liga-se ao cofator molibdˆenio (MOCO)

ou ao cofator tungstˆenio com a ﬁnalidade de regular a concentra¸c˜ao de tais fatores

(Weinberg et al., 2007). Em E. coli existem cinco operons conhecidos envolvidos no

metabolismo do MOCO: moa, mob, mod, moe e mog (SHANMUGAM et al., 1992).

Em E. coli, o gene deste riboswitch foi localizado upstream ao operon moa, o qual

cont´em os genes moaA, moaB, moaC, moaD e moaE (Regulski et al., 2008). Em

nossos estudos, o gene deste riboswitch foi encontrado no cromossomo I de todos

os quatro vibrios ao lado do gene moaA (primeiro gene do operon moa), indicando

que esse riboswitch exerceria fun¸c˜ao regulat´oria neste operon.

ncRNAs que modula atividade de prote´ınas:

CsrB: Em E. coli, este ncRNA modula a atividade de CsrA, uma prote´ına

que se liga a RNA para regular o uso do carbono e motilidade bacteriana. O

CsrB, ao formar o complexo CsrA-CsrB, inibe a eﬁciente degrada¸c˜ao dos mRNA

respons´aveis pela bioss´ıntese de glicogˆenio mediada por CsrA (Liu et al., 1997).

CsrB participa de circuitos de regula¸c˜ao global que controlam o metabolismo do

carbono, a produ¸c˜ao de produtos extracelulares, motilidade da c´elula, forma¸c˜ao de

bioﬁlme, quorum sensing e/ou patogenicidade (Babitzke e Romeo, 2007). Foram

encontrados, pelo menos, dois destes ncRNA nos quatro genomas aqui estudados.

6S: Associa-se especialmente a holoenzima RNA polimerase contendo o σ

como fator espec´ıﬁco. Esta intera¸c˜ao reprime a express˜ao de genes cujos promoto-

res dependem do fator σ

, durante a fase estacion´aria inibindo a participa¸c˜ao do

complexo σ

-RNA polimerase na transcri¸c˜ao de certos genes (Barrick et al., 2005).

O fator σ

´e usado para a grande maioria das fun¸c˜oes de crescimento exponencial.

Foi encontrada, neste estudo, uma c´opia deste ncRNA em todos os genomas de

vibrio.

tmRNA: tamb´em conhecida como 10Sa RNA e o nome do gene ´e ssrA.

uma mol´ecula de RNA com propriedade dual, tRNA e mRNA. A tmRNA forma

um complexo ao se ligar com a prote´ına SmpB (Small Protein B - cujo gene ´e

smpB), com o EF-Tu e com a prote´ına ribossomal S1. Suas principais fun¸c˜oes s˜ao

reciclar os ribossomos paralisados e facilitar a degrada¸c˜ao de mRNAs anˆomalos

(Keiler, 2007; Moore e Sauer, 2007; Dulebohn et al., 2007). O gene deste ncRNA

foi encontrado em todos os genomas aqui estudados adjacente ao gene smpB.

RNaseP bact a: ´e uma ribozima (RNA com capacidade catal´ıtica) (Frank

e Pace, 1998; Brown, 1999). Nos genomas aqui estudados, o gene desta riboen-

zima est´a adjacente ao gene mraW cujo produto ´e a prote´ına MraW (S-adenosil-

metiltransferase).

RNAs antisenso de a¸c˜ao cis:

Yybp-ykoY: Tamb´em chamado de SraF, foi originalmente descoberto em

E. coli e posteriormente encontrado em muitas bact´erias. Sua fun¸c˜ao ainda ´e des-

conhecida (Barrick et al., 2004). Foi identiﬁcado em nossos genomas ﬂanqueados

pelo gene glyQ, cujo produto ´e a sub-unidade alfa da glicil-tRNA sintetase.

GcvB: Este ncRNA est´a envolvido na express˜ao de sistemas de transportes

de dipept´ıdeos e oligopeptideos em E. coli (Urbanowski et al., 2000). Foi demons-

trado ser um regulador de resistˆencia a ´acidos em E. coli, aumentando a capacidade

da bact´eria de sobreviver em pH baixo (Jin et al., 2009). A transcri¸c˜ao de seu gene

(gcvB) ´e ativada pela prote´ına GcvA (Urbanowski et al., 2000). O gene desse

ncRNA foi encontrado em todos os genomas aqui estudados, sendo que upstream a

ele encontra-se o gene cujo produto ´e um regulador transcricional da fam´ılia LysR

e Downstream encontra-se o gene thiI, cujo produto ´e a prote´ına ThiI (envolvida na

bioss´ıntese de tiamina). Em V. campbellii, o gene gcvB encontra-se adjacente ao

gene gcvA, cujo produto ´e a prote´ına GcvA (membro da fam´ılia LysR) (MingSheng

et al., 2009).

RNAs antisenso de a¸c˜ao trans:

RyhB: Regula, em E. coli, a express˜ao de genes envolvidos no metabolismo

do ferro. RyhB causa a r´apida degrada¸c˜ao de v´arios mRNAs alvos, os quais co-

diﬁcam prote´ınas n˜ao-essenciais que se ligam a ferro. Sem a codiﬁca¸c˜ao destas

prote´ınas ´e reduzido a requisi¸c˜ao intracelular de ferro, reservando, assim, ferro so-

mente para prote´ınas essenciais (Masse e Gottesman, 2002). RyhB foi encontrado

em nossos estudos no cromossomo I de todos os quatro vibrios.

Spot 42: Este ncRNA parece ter um papel regulat´orio no operon galactose,

inibindo a tradu¸c˜ao de galK . A galK codiﬁca uma galactoquinase envolvida em

um caminho metab´olico da galactose (Moller et al., 2002). Foram observados que

mudan¸cas nos n´ıveis de Spot 42 afetam os n´ıveis de DNA polimerase I adjacente

(POLAYES et al., 1988). Neste estudo, o Spot 42 foi encontrado no cromossomo I

de todos os quatro vibrios, estando adjacente ao gene polI (cujo produto ´e a DNA

polimerase I).

Qrr: Est´a envolvido na regula¸c˜ao do quorum sensing em vibrios. Acredita-

se que estes RNAs, com o aux´ılio da prote´ına chaperona Hfq, podem mediar a

desestabiliza¸c˜ao do mRNAs LuxR/HapR respons´aveis pelo quorum-sensing (Zhu

et al., 2002; Lenz et al., 2004). Este ncRNA foi encontrado em muitas repeti¸c˜oes

principalmente no cromosomo II dos organismos estudados.

Ribonucleoproteina:

SRP bact: Envolvida na tradu¸c˜ao e liga¸c˜ao de prote´ınas na membrana ce-

lular (Regalia et al., 2002). Encontrado no cromossomo I dos quatro genomas de

vibrio aqui estudados.

Regulador por t´ermino de transcri¸c˜ao:

Estes ncRNAs s˜ao conhecidos como sequˆencia leader na regula¸c˜ao por atenu-

a¸c˜ao, como descrito na sess˜ao 2.2.1.4. Esta sequˆencia leader pode adquirir estrutura

secund´aria, em forma de grampo, que caracterize ou n˜ao o t´ermino de transcri¸c˜ao

dentro de um operon, podendo assim impedir ou permitir a transcri¸c˜ao dos genes

estruturais subsequentes (KOLTER e YANOFSKY, 1982).

His-leader:

E a sequˆencia leader do operon da histidina (FRUNZIO et al.,

1981; AMES et al., 1983). No presente trabalho, este ncRNA foi encontrado no

cromossomo I de V. mimicus, V. alginolyticus e V. communis.

Thr-leader:

E a sequˆencia leader do operon da treonina (KOLTER e YA-

NOFSKY, 1982). Neste estudo, o thr-leader foi encontrado no cromossomo I de

V. mimicus, V. communis e V. campbellii.

Trp-leader:

E a sequˆencia leader do operon do triptofano (KOLTER e YA-

NOFSKY, 1982). Encontrado nos gemomas de V. mimicus, V. alginolyticus e V.

communis deste estudo.

Classiﬁca¸c˜ao desconhecida:

P26: Este ncRNA foi primeiramente encontrado em Pseudomonas aerugi-

nosa (Livny et al., 2006).

E conservado em muitas esp´ecies da classe Gamma-

proteobacteria e em muitos casos aparece localizado entre os genes rpoB (codiﬁca

a subunidade beta da RNA polimerase) e rplL (codiﬁca a prote´ına ribossomal

L7/L12) (Livny et al., 2006). Neste estudo, o P26 foi encontrado nos genomas de

V. mimicus, V. communis e V. campbellii, localizados entre os genes rpoB e rplL,

como descrito acima.

S15-leader: Controla a express˜ao da prote´ına ribossomal S15. Em E. coli,

a regi˜ao leader do mRNA que codiﬁca a prote´ına ribossomal S15 pode formar es-

trutura secund´aria permitindo ou n˜ao a tradu¸c˜ao deste mRNA, regulando assim a

express˜ao da prote´ına ribossomal S15 (Benard et al., 1996). No presente estudo, o

S15-leader foi encontrado apenas no cromossomo I de V. campbellii.

Alfa RBS:

E uma regi˜ao de liga¸c˜ao de ribossomo do operon alfa. O operon

alfa de E. coli cont´em os genes para prote´ınas ribossomais S13, S11, S4, subuni-

dade alfa da RNA polimerase e prote´ına ribossomal L17, nesta ordem. A prote´ına

ribossomal S4 atua como repressor traducional deste operon ao ligar-se a regi˜ao

Alfa RBS (SPEDDING e DRAPER, 1993). No presente estudo, o Alfa RBS foi

encontrado apenas no cromossomo I de V. campbellii.

Intron-gpII:

E uma ribozima. Este parece codiﬁcar prote´ınas para proces-

sar certos mRNAs de bact´erias, ou seja n˜ao me parece ser um ncRNA!!!!!! (n˜ao

entendi) (Lehmann e Schmidt, 2003).

Este ´e o primeiro estudo sobre a diversidade de ncRNAs nos genomas de V.

alginolyticus 40B, V. campbellii ATCC BAA-1116, V. communis 1DA3 e V. mimi-

cus VM573. Fazendo uma an´alise global dos ncRNAs detectados em tais genomas,

podemos constatar que em muitos casos os genes adjacentes aos dos ncRNAs apre-

sentam algum padr˜ao de ocorrˆencia, que possivelmente justiﬁque alguma rela¸c˜ao

funcional entre eles. Em certos casos, como nos riboswitches e nos ncRNAs re-

guladores por t´ermino de transcri¸c˜ao, os genes downstream s˜ao os regulados pelo

ncRNA. Podemos observar tamb´em o caso de ncRNA que encontra-se adjacente ao

gene de seu ativador, como em GcvB. A an´alise realizada nesta sess˜ao demonstrou

que os ncRNAs detectados no presente trabalho apresentam uma ampla diversi-

dade de classes funcionais, estando possivelmente associados com a regula¸c˜ao ﬁna

de diferentes processos celulares e at´e participando de cascatas de regula¸c˜ao glo-

bal, como ´e o caso do ncRNA RyhB. O grupo mais abundante de ncRNA foi o

riboswitch, enquanto que o menos abundante foi o ribonucleoproteina.

5.6 Express˜ao dos candidatos de ncRNAs em V. campbellii BAA-

1116

Na an´alise in silico foram identiﬁcados 38 ncRNAs candidatos em V. camp-

bellii BAA-1116. Destes 38, oito foram identiﬁcados como intron gpII. Todos os

intron gpII foram representados por somente um ´unico grupo de sondas, sendo

assim poss´ıvel a detec¸c˜ao de apenas 31 ncRNAs usando o m´etodo de microarranjo

do genoma completo de V. campbellii BAA-1116. Cinco dos 31 ncRNAs foram pre-

viamente descritos como ncRNAs reguladores que participam no quorum sensing

(Qrr 1-5) Lenz et al. (2004) e (Tu e Bassler, 2007).

A an´alise experimental revelou que 21 dos 31 ncRNAs candidatos de V. camp-

bellii BAA-1116 foram expressos durante seu estado ﬁsiol´ogico. Foi demonstrado

um alto n´ıvel de express˜ao em cinco dos ncRNAs candidatos (6S, tmRNA, TPP-2,

S15 e Alpha RBS), sendo que 6S RNA apresentou o mais alto n´ıvel de express˜ao

(ﬁgura 5.1). As tabelas 5.5 e 5.6 ilustram a express˜ao dos ncRNAs em V. camp-

bellii, realizada por colaboradores. Detalhes dos resultados das an´alises realizadas

utilizando a t´ecnica de microarranjo e RT-PCR s˜ao encontrados nos resultados do

artigo, apˆendice C. Baseado nos resultados de valida¸c˜ao experimental, parece que a

ferramenta cmsearch (do pacote infernal), com o parˆametro score cutoﬀ de 34, foi

uma boa escolha na identiﬁca¸c˜ao de ncRNAs que j´a foram descritos e comprovados

em outros genomas.

Tabela 5.5: Tabela de express˜ao dos ncRNAs em V. campbellii BAA-1116 (cro-

mossomo I)

Cromossomo Tipo Subtipo Express˜ao

Cromossomo I

Riboswitches

Glicina -

Cobalamina +

Lisina-1 -

Lisina-2 -

TPP-1 +

TPP-2 +

GEMM RNA motif +

MOCO RNA motif -

CsrB-1 +

Moduladores da RNaseP bact a +

atividade de 6S +

prote´ına tmRNA +

Qrr-1 -

RNAs antisenso RyhB +

de a¸c˜ao Trans Spot 42 -

RNAs antisenso Yybp-ykoY -

de a¸c˜ao Cis GcvB +

Ribonucleoproteina SRP bact +

Regula¸c˜ao por

t´ermino de Thr leader +

transcri¸c˜ao

Desconhecido

S15 leader +

Alfa RBS +

P26 +

Intron gpII +

Tabela 5.6: Tabela de express˜ao dos ncRNAs em V. campbellii BAA-1116 (cro-

mossomo II)

Cromossomo Tipo Subtipo Express˜ao

Cromossomo II

Riboswitches

TPP +

FMN -

Purina +

Moduladores da atividade de prote´ına CsrB-2 +

Qrr-2 +

RNAs antisenso Qrr-3 -

de a¸c˜ao Trans Qrr-4 +

Qrr-5 -

Figura 5.1: Express˜ao de ncRNAs ao longo do tempo, utilizando PCR de transcri-

¸c˜ao reversa.

Cap´ıtulo 6

Conclus˜oes e Trabalhos Futuros

A ferramenta cmsearch (do pacote infernal), com o parˆametro score cutoﬀ de

34, utilizada neste trabalho pode ser considerada uma boa escolha para identiﬁcar,

em um dado genoma de bact´eria, ncRNAs anteriormente descritos e comprovados

em outros genomas; uma vez que dos 31 candidatos submetidos a valida¸c˜ao expe-

rimental em V. campbellii BAA-1116, 21 foram comprovados.

O preprocessamento na base de dados do Rfam tornou-se fundamental para

otimizar as buscas de ncRNAs nesta base com o uso da ferramenta cmsearch. Foi

estimado uma redu¸c˜ao no tempo de execu¸c˜ao em 2.9 vezes em rela¸c˜ao a base com-

pleta, aumentando consideravelmente o desempenho da busca.

A abundˆancia e a diversidade de ncRNAs nos genomas de vibrios sugerem

a importˆancia destas mol´eculas nas diversas vias metab´olicas e na resposta a est´ı-

mulos ambientais (Liu et al., 2009). O presente estudo demonstra que os vibrios

aqui estudados possuem v´arios tipos diferentes de ncRNAs e que muitos destes s˜ao

possivelmente respons´aveis pela regula¸c˜ao ﬁna da express˜ao gˆenica associadas a

diferentes respostas celulares e processos em vibrios.

Como trabalho futuro seria interessante validar experimentalmente os de-

mais ncRNAs candidatos encontrados nos genomas dos V. mimicus VM573, V.

alginolyticus 40B e V. communis 1DA3, gerados neste trabalho. Al´em disso, refa-

zer os experimentos in silico alterando os parˆametros do cmsearch com o intuito

de identiﬁcar o melhor parˆametro para esta an´alise.

Outro poss´ıvel trabalho futuro seria utilizar outras abordagens da bioinfor-

m´atica para identiﬁcar novos ncRNAs em vibrios que ainda n˜ao tenham sido des-

critos em nenhum outro genoma.

Referˆencias Bibliogr´aﬁcas

Raﬁ Ahmad, Erik Hjerde, Geir Asmund Hansen, Peik Haugen, e Nils-Peder Willas-

sen. Prediction and Experimental Testing of Ferric Uptake Regulator Regulons

in Vibrios. JOURNAL OF MOLECULAR MICROBIOLOGY AND

BIOTECHNOLOGY, 16(3-4):159–168, 2009. ISSN 1464-1801.

Elke Allers, Christina Niesner, Christian Wild, e Jakob Pernthaler. Microbes en-

riched in seawater after addition of coral mucus. APPLIED AND ENVI-

RONMENTAL MICROBIOLOGY, 74(10):3274–3278, MAY 2008. ISSN

0099-2240.

LGP Almeida, R Paixao, RC Souza, GC da Costa, FJA Barrientos, MT dos Santos,

DF de Almeida, e ATR Vasconcelos. A System for Automated Bacterial (ge-

nome) Integrated Annotation - SABIA. BIOINFORMATICS, 20(16):2832–

2833, NOV 1 2004. ISSN 1367-4803.

S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Meyers, e D. J. Lipman. Basic local

alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 215(3):403–410, 1990.

Shoshy Altuvia. Identiﬁcation of bacterial small non-coding RNAs: experimental

approaches. CURRENT OPINION IN MICROBIOLOGY, 10(3):257–

261, JUN 2007. ISSN 1369-5274.

BN AMES, TH TSANG, M BUCK, e MF CHRISTMAN. THE LEADER

MESSENGER-RNA OF THE HISTIDINE ATTENUATOR REGION RE-

SEMBLES TRANSFER RNAHIS - POSSIBLE GENERAL REGULATORY

IMPLICATIONS. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACA-

DEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA-

BIOLOGICAL SCIENCES, 80(17):5240–5242, 1983. ISSN 0027-8424.

M. Ansaruzzaman, Ashrafuzzaman Chowdhury, Nurul A. Bhuiyan, Marzia Sul-

tana, Ashrafus Safa, Marcelino Lucas, Lorenz von Seidlein, Avertino Barreto,

Claire-Lise Chaignat, David A. Sack, John D. Clemens, G. Balakrish Nair,

Seon Young Choi, Yoon Seong Jeon, Je Hee Lee, Hye Ri Lee, Jongsik Chun,

e Dong Wook Kim. Characteristics of a pandemic clone of O3: K6 and O4: K68

Vibrio parahaemolyticus isolated in Beira, Mozambique. JOURNAL OF ME-

DICAL MICROBIOLOGY, 57(12):1502–1507, DEC 2008. ISSN 0022-2615.

Luis Caetano M. Antunes, Amy L. Schaefer, Rosana B. R. Ferreira, Nan Qin,

Ann M. Stevens, Edward G. Ruby, e E. Peter Greenberg. Transcriptome analy-

sis of the Vibrio ﬁscheri LuxR-LuxI regulon. JOURNAL OF BACTERIO-

LOGY, 189(22):8387–8391, NOV 2007. ISSN 0021-9193.

L Argaman e S Altuvia. fhlA repression by OxyS RNA: Kissing complex formation

at two sites results in a stable antisense-target RNA complex. JOURNAL OF

MOLECULAR BIOLOGY, 300(5):1101–1112, JUL 28 2000. ISSN 0022-

2836.

B. Austin. Vibrios as causal agents of zoonoses. VETERINARY MICROBI-

OLOGY, 140(3-4, Sp. Iss. SI):310–317, JAN 27 2010. ISSN 0378-1135.

B. Austin e X-H. Zhang. Vibrio harveyi: a signiﬁcant pathogen of marine verte-

brates and invertebrates. LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY,

43(2):119–124, AUG 2006. ISSN 0266-8254.

Paul Babitzke e Tony Romeo. CsrB sRNA family: sequestration of RNA-binding

regulatory proteins. CURRENT OPINION IN MICROBIOLOGY, 10(2):

156–163, APR 2007. ISSN 1369-5274.

JE Barrick, KA Corbino, WC Winkler, A Nahvi, M Mandal, J Collins, M Lee,

A Roth, N Sudarsan, I Jona, JK Wickiser, e RR Breaker. New RNA motifs

suggest an expanded scope for riboswitches in bacterial genetic control. PRO-

CEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF

THE UNITED STATES OF AMERICA, 101(17):6421–6426, APR 27 2004.

ISSN 0027-8424.

JE Barrick, N Sudarsan, Z Weinberg, WL Ruzzo, e RR Breaker. 6S RNA is a

widespread regulator of eubacterial RNA polymerase that resembles an open

promoter. RNA-A PUBLICATION OF THE RNA SOCIETY, 11(5):

774–784, MAY 2005. ISSN 1355-8382.

Y Ben-Haim, FL Thompson, CC Thompson, MC Cnockaert, B Hoste, J Swings, e

E Rosenberg. Vibrio coralliilyticus sp nov., a temperature-dependent pathogen

of the coral Pocillopora damicornis. INTERNATIONAL JOURNAL OF

SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY, 53(Part

1):309–315, JAN 2003. ISSN 1466-5026.

L Benard, C Philippe, B Ehresmann, C Ehresmann, e C Portier. Pseudoknot and

translational control in the expression of the S15 ribosomal protein. BIOCHI-

MIE, 78(7):568–576, 1996. ISSN 0300-9084.

David Bourne, Yuki Iida, Sven Uthicke, e Carolyn Smith-Keune. Changes in coral-

associated microbial communities during a bleaching event. ISME JOURNAL,

2(4):350–363, APR 2008. ISSN 1751-7362.

DJ BRENNER, FW HICKMANBRENNER, JV LEE, AG STEIGERWALT,

GR FANNING, DG HOLLIS, JJ FARMER, RE WEAVER, SW JOSEPH, e RJF

SEIDLER. VIBRIO-FURNISSII (FORMERLY AEROGENIC BIOGROUP OF

VIBRIO-FLUVIALIS), A NEW SPECIES ISOLATED FROM HUMAN FECES

AND THE ENVIRONMENT. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIO-

LOGY, 18(4):816–824, 1983. ISSN 0095-1137.

JW Brown. The Ribonuclease P Database. NUCLEIC ACIDS RESEARCH,

27(1):314, JAN 1 1999. ISSN 0305-1048.

M Camara, A Hardman, P Williams, e D Milton. Quorum sensing in Vibrio

cholerae. NATURE GENETICS, 32(2):217–218, OCT 2002. ISSN 1061-4036.

AM CARNAHAN, J HARDING, D WATSKY, e S HANSMAN. IDENTIFICA-

TION OF VIBRIO-HOLLISAE ASSOCIATED WITH SEVERE GASTROEN-

TERITIS AFTER CONSUMPTION OF RAW OYSTERS. JOURNAL OF

CLINICAL MICROBIOLOGY, 32(7):1805–1806, JUL 1994. ISSN 0095-

1137.

Brandon M. Childers e Karl E. Klose. Regulation of virulence in Vibrio cholerae:

the ToxR regulon. FUTURE MICROBIOLOGY, 2(3):335–344, JUN 2007.

ISSN 1746-0913.

LA Chimetto, I Cleenwerck, N Jr Alves, BS Silva, M Brocchi, A Willems, P De Vos,

e FL Thompson. Vibrio communis sp. nov. isolated from marine animals (Mussis-

milia hispida, Phyllogorgia dilatata, Palythoa caribaeorum, Palythoa variabilis

and Litopenaeus vannamei). Int J Syst Evol Microbiol, 2010.

Seung-Hak Cho, Hyun-Ho Shin, Yeon-Hwa Choi, Mi-Sun Park, e Bok-Kwon Lee.

Enteric bacteria isolated from acute diarrheal patients in the Republic of Korea

between the year 2004 and 2006. JOURNAL OF MICROBIOLOGY, 46

(3):325–330, JUN 2008. ISSN 1225-8873.

MT Cottrell e DL Kirchman. Contribution of major bacterial groups to bacterial

biomass production (thymidine and leucine incorporation) in the Delaware estu-

ary. LIMNOLOGY AND OCEANOGRAPHY, 48(1):168–178, JAN 2003.

ISSN 0024-3590.

ME Davey e GA O’toole. Microbial bioﬁlms: from ecology to molecular genetics.

MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, 64(4):

847+, DEC 2000. ISSN 1092-2172.

BM Davis, M Quinones, J Pratt, YP Ding, e MK Waldor. Characterization of the

small untranslated RNA RyhB and its regulon in Vibrio cholerae. JOURNAL

OF BACTERIOLOGY, 187(12):4005–4014, JUN 2005. ISSN 0021-9193.

BR DAVIS, GR FANNING, JM MADDEN, AG STEIGERWALT, HB BRAD-

FORD, HL SMITH, e DJ BRENNER. CHARACTERIZATION OF BIOCHE-

MICALLY ATYPICAL VIBRIO-CHOLERAE STRAINS AND DESIGNATION

OF A NEW PATHOGENIC SPECIES, VIBRIO-MIMICUS. JOURNAL OF

CLINICAL MICROBIOLOGY, 14(6):631–639, 1981. ISSN 0095-1137.

CG De Oliveira. Regula¸c˜ao gˆenica da bioss´ıntese de violace´ına e quorum

sensing em Chromobacterium violaceum. Tese de Doutorado, Engenharia

Qu´ımica da UFSC, 2005.

Tom Defoirdt, Nico Boon, Patrick Sorgeloos, Willy Verstraete, e Peter Bossier.

Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: lessons learned from

in vivo work. ISME JOURNAL, 2(1):19–26, JAN 2008. ISSN 1751-7362.

A DePaola, J Ulaszek, CA Kaysner, BJ Tenge, JL Nordstrom, J Wells, N Puhr,

e SM Gendel. Molecular, serological, and virulence characteristics of Vibrio pa-

rahaemolyticus isolated from environmental, food, and clinical sources in north

America and Asia. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIO-

LOGY, 69(7):3999–4005, JUL 2003. ISSN 0099-2240.

Elizabeth A. Dinsdale, Olga Pantos, Steven Smriga, Robert A. Edwards, Florent

Angly, Linda Wegley, Mark Hatay, Dana Hall, Elysa Brown, Matthew Haynes,

Lutz Krause, Enric Sala, Stuart A. Sandin, Rebecca Vega Thurber, Bette L.

Willis, Farooq Azam, Nancy Knowlton, e Forest Rohwer. Microbial Ecology of

Four Coral Atolls in the Northern Line Islands. PLOS ONE, 3(2), FEB 27

2008. ISSN 1932-6203.

Stephenie L. Drake, Angelo DePaola, e Lee-Ann Jaykus. An overview of Vibrio

vulniﬁcus and Vibrio parahaemolyticus. COMPREHENSIVE REVIEWS

IN FOOD SCIENCE AND FOOD SAFETY, 6(4):120–144, OCT 2007.

ISSN 1541-4337.

Daniel Dulebohn, Jennifer Choy, Thomas Sundermeier, Nihal Okan, e A. Wali

Karzai. Trans-translation: The tmRNA-mediated surveillance mechanism for

ribosome rescue, directed protein degradation, and nonstop mRNA decay. BI-

OCHEMISTRY, 46(16):4681–4693, APR 24 2007. ISSN 0006-2960.

S Eddy. Infernal user’s guide: sequence analysis using proﬁles of rna secondary

structure consensus. http://infernal.janelia.org, 2007.

SR Eddy. The infernal users guide. http://infernal.janelia.org, 2003.

SR EDDY e R DURBIN. RNA SEQUENCE-ANALYSIS USING COVARIANCE-

MODELS. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 22(11):2079–2088, JUN 11

1994. ISSN 0305-1048.

Brenner F.W. Cameron D.N. Birkhead K.M. Farmer J.J. III, Janda M. Genus I.

Vibrio Pacini 1854. In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.

New York: Springer, 2005.

P M Fidopiastis, S von Boletzky, e E G Ruby. A new niche

for vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in

the genus sepiola. J Bacteriol, 180(1):59–64, 1998. ISSN 0021-

9193. URL http://www.biomedsearch.com/nih/new-niche-Vibrio-logei-

predominant/9422593.html.

DN Frank e NR Pace. Ribonuclease P: Unity and diversity in a tRNA processing

ribozyme. ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, 67:153–180, 1998.

ISSN 0066-4154.

Eva K. Freyhult, Jonathan P. Bollback, e Paul P. Gardner. Exploring genomic dark

matter: A critical assessment of the performance of homology search methods on

noncoding RNA. GENOME RESEARCH, 17(1):117–125, JAN 2007. ISSN

1088-9051.

R FRUNZIO, CB BRUNI, e F BLASI. INVIVO AND INVITRO DETECTION

OF THE LEADER RNA OF THE HISTIDINE OPERON OF ESCHERICHIA-

COLI K-12. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY

OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA-

BIOLOGICAL SCIENCES, 78(5):2767–2771, 1981. ISSN 0027-8424.

MS Gelfand, AA Mironov, J Jomantas, YI Kozlov, e DA Perumov. A conserved

RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboﬂavin synthesis

genes. TRENDS IN GENETICS, 15(11):439–442, NOV 1999. ISSN 0168-

9525.

N Gonzalez-Escalona, V Cachicas, C Acevedo, ML Rioseco, JA Vergara, F Cabello,

J Romero, e RT Espejo. Vibrio parahaemolyticus diarrhea, Chile, 1998 and 2004.

EMERGING INFECTIOUS DISEASES, 11(1):129–131, JAN 2005. ISSN

1080-6040.

S Gottesman. Micros for microbes: non-coding regulatory RNAs in bacteria.

TRENDS IN GENETICS, 21(7):399–404, JUL 2005. ISSN 0168-9525.

S Griﬃths-Jones, A Bateman, M Marshall, A Khanna, e SR Eddy. Rfam: an RNA

family database. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 31(1):439–441, JAN 1

2003. ISSN 0305-1048.

BK Hammer e BL Bassler. Quorum sensing controls bioﬁlm formation in Vibrio

cholerae. MOLECULAR MICROBIOLOGY, 50(1):101–114, OCT 2003.

ISSN 0950-382X.

BP Hedlund e JT Staley. Vibrio cyclotrophicus sp nov., a polycyclic aroma-

tic hydrocarbon (PAH)-degrading marine bacterium. INTERNATIONAL

JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBI-

OLOGY, 51(Part 1):61–66, JAN 2001. ISSN 1466-5026.

JF Heidelberg, KB Heidelberg, e RR Colwell. Bacteria of the gamma-subclass

Proteobacteria associated with zooplankton in Chesapeake Bay. APPLIED

AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 68(11):5498–5507, NOV

2002. ISSN 0099-2240.

S HENIKOFF e JG HENIKOFF. AMINO-ACID SUBSTITUTION MATRICES

FROM PROTEIN BLOCKS. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL

ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AME-

RICA, 89(22):10915–10919, NOV 15 1992. ISSN 0027-8424.

JM Henke e BL Bassler. Quorum sensing regulates type III secretion in Vibrio

harveyi and Vibrio parahaemolyticus. JOURNAL OF BACTERIOLOGY,

186(12):3794–3805, JUN 2004. ISSN 0021-9193.

IL Hofacker, M Fekete, e PF Stadler. Secondary structure prediction for aligned

RNA sequences. JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 319(5):1059–

1066, JUN 21 2002. ISSN 0022-2836.

IL HOFACKER, W FONTANA, PF STADLER, LS BONHOEFFER, M TAC-

KER, e P SCHUSTER. FAST FOLDING AND COMPARISON OF RNA SE-

CONDARY STRUCTURES. MONATSHEFTE FUR CHEMIE, 125(2):

167–188, FEB 1994. ISSN 0026-9247.

F JACOB e J MONOD. GENETIC REGULATORY MECHANISMS IN

SYNTHESIS OF PROTEINS. JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY,

3(3):318–&, 1961. ISSN 0022-2836.

Ye Jin, Rory M. Watt, Antoine Danchin, e Jian-dong Huang. Small noncoding

RNA GcvB is a novel regulator of acid resistance in Escherichia coli. BMC

GENOMICS, 10, APR 20 2009. ISSN 1471-2164.

M Kawano, AA Reynolds, J Miranda-Rios, e G Storz. Detection of 5’- and 3’-

UTR-derived small RNAs and cis-encoded antisense RNAs in Escherichia coli.

NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 33(3):1040–1050, 2005. ISSN 0305-1048.

Kenneth C. Keiler. Physiology of tmRNA: what gets tagged and why? CUR-

RENT OPINION IN MICROBIOLOGY, 10(2):169–175, APR 2007. ISSN

1369-5274.

RJ Klein e SR Eddy. RSEARCH: Finding homologs of single structured RNA

sequences. BMC BIOINFORMATICS, 4, SEP 22 2003. ISSN 1471-2105.

R KOLTER e C YANOFSKY. ATTENUATION IN AMINO-ACID BIOSYNTHE-

TIC OPERONS. ANNUAL REVIEW OF GENETICS, 16:113–134, 1982.

ISSN 0066-4197.

Prajna R. Kulkarni, Xiaohui Cui, Joshua W. Williams, Ann M. Stevens, e Rahul V.

Kulkarni. Prediction of CsrA-regulating small RNAs in bacteria and their expe-

rimental veriﬁcation in Vibrio ﬁscheri. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 34

(11):3361–3369, 2006. ISSN 0305-1048.

Miyun Kwon e Scott A. Strobel. Chemical basis of glycine riboswitch cooperativity.

RNA-A PUBLICATION OF THE RNA SOCIETY, 14(1):25–34, JAN

2008. ISSN 1355-8382.

K Lehmann e U Schmidt. Group II introns: Structure and catalytic versatility of

large natural ribozymes. CRITICAL REVIEWS IN BIOCHEMISTRY

AND MOLECULAR BIOLOGY, 38(3):249–303, 2003. ISSN 1040-9238.

DH Lenz, KC Mok, BN Lilley, RV Kulkarni, NS Wingreen, e BL Bassler. The

small RNA chaperone Hfq and multiple small RNAs control quorum sensing in

Vibrio harveyi and Vibrio cholerae. CELL, 118(1):69–82, JUL 9 2004. ISSN

0092-8674.

BN Lilley e BL Bassler. Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO

and Sigma-54. MOLECULAR MICROBIOLOGY, 36(4):940–954, MAY

2000. ISSN 0950-382X.

CN Liu, BY Bai, G Skogerbo, L Cai, W Deng, Y Zhang, DB Bu, Y Zhao, e

RS Chen. NONCODE: an integrated knowledge database of non-coding RNAs.

NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 33(Sp. Iss. SI):D112–D115, JAN 1 2005.

ISSN 0305-1048.

Jane M. Liu, Jonathan Livny, Michael S. Lawrence, Marc D. Kimball, Matthew K.

Waldor, e Andrew Camilli. Experimental discovery of sRNAs in Vibrio cholerae

by direct cloning, 5S/tRNA depletion and parallel sequencing. NUCLEIC

ACIDS RESEARCH, 37(6), APR 2009. ISSN 0305-1048.

MY Liu, GJ Gui, BD Wei, JF Preston, L Oakford, U Yuksel, DP Giedroc, e T Ro-

meo. The RNA molecule CsrB binds to the global regulatory protein CsrA and

antagonizes its activity in Escherichia coli. JOURNAL OF BIOLOGICAL

CHEMISTRY, 272(28):17502–17510, JUL 11 1997. ISSN 0021-9258.

J Livny, MA Fogel, BM Davis, e MK Waldor. sRNAPredict: an integrative compu-

tational approach to identify sRNAs in bacterial genomes. NUCLEIC ACIDS

RESEARCH, 33(13):4096–4105, 2005. ISSN 0305-1048.

Jonathan Livny, Anja Brencic, Stephen Lory, e Matthew K. Waldor. Identiﬁcation

of 17 Pseudomonas aeruginosa sRNAs and prediction of sRNA-encoding genes

in 10 diverse pathogens using the bioinformatic tool sRNAPredict2. NUCLEIC

ACIDS RESEARCH, 34(12):3484–3493, 2006. ISSN 0305-1048.

N Majdalani, C Cunning, D Sledjeski, T Elliott, e S Gottesman. DsrA RNA regu-

lates translation of RpoS message by an anti-antisense mechanism, independent

of its action as an antisilencer of transcription. PROCEEDINGS OF THE

NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES

OF AMERICA, 95(21):12462–12467, OCT 13 1998. ISSN 0027-8424.

M Mandal, B Boese, JE Barrick, WC Winkler, e RR Breaker. Riboswitches con-

trol fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria.

CELL, 113(5):577–586, MAY 30 2003. ISSN 0092-8674.

M Mandal, M Lee, JE Barrick, Z Weinberg, GM Emilsson, WL Ruzzo, e RR Bre-

aker. A glycine-dependent riboswitch that uses cooperative binding to control

gene expression (vol 306, pg, 275, 2004). SCIENCE, 306(5701):1477, NOV 26

2004. ISSN 0036-8075.

M Maneﬁeld, L Harris, SA Rice, R De Nys, e S Kjelleberg. Inhibition of lu-

minescence and virulence in the black tiger prawn (Penaeus monodon) patho-

gen Vibrio harveyi by intercellular signal antagonists. APPLIED AND EN-

VIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 66(5):2079–2084, MAY 2000. ISSN

0099-2240.

JH Martens, H Barg, MJ Warren, e D Jahn. Microbial production of vitamin

B-12. APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 58(3):

275–285, MAR 2002. ISSN 0175-7598.

E Masse e S Gottesman. A small RNA regulates the expression of genes involved

in iron metabolism in Escherichia coli. PROCEEDINGS OF THE NATI-

ONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF

AMERICA, 99(7):4620–4625, APR 2 2002. ISSN 0027-8424.

D McDougald, SA Rice, e S Kjellberg. The marine pathogen Vibrio vulniﬁcus

encodes a putative homologue of the Vibrio harveyi regulatory gene, luxR: a

genetic and phylogenetic comparison. GENE, 248(1-2):213–221, MAY 2 2000.

ISSN 0378-1119.

MB Miller e BL Bassler. Quorum sensing in bacteria. ANNUAL REVIEW OF

MICROBIOLOGY, 55:165–199, 2001. ISSN 0066-4227.

DL Milton, A Hardman, M Camara, SR Chhabra, BW Bycroft, GSAB Stewart,

e P Williams. Quorum sensing in Vibrio anguillarum: Characterization of

the vanI/vanR locus and identiﬁcation of the autoinducer N-(3-oxodecanoyl)-L-

homoserine lactone. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 179(9):3004–3012,

MAY 1997. ISSN 0021-9193.

Qi MingSheng, Luo Li, Cheng HaiPing, Zhu Jiabi, e Yu GuanQiao. Identiﬁcation

and characterization of two gcvA genes in Sinorhizobium meliloti. CHINESE

SCIENCE BULLETIN, 54(3):405–411, FEB 2009. ISSN 1001-6538.

T MIZUNO, MY CHOU, e M INOUYE. A UNIQUE MECHANISM REGULA-

TING GENE-EXPRESSION - TRANSLATIONAL INHIBITION BY A COM-

PLEMENTARY RNA TRANSCRIPT (MICRNA). PROCEEDINGS OF

THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED

STATES OF AMERICA-BIOLOGICAL SCIENCES, 81(7):1966–1970,

1984. ISSN 0027-8424.

Tamaki Mizuno, Syed Z. Sultan, Yoshimi Kaneko, Tomonaga Yoshimura, Yoko Ma-

ehara, Hiroshi Nakao, Tomofusa Tsuchiya, Sumio Shinoda, e Shin-ichi Miyoshi.

Modulation of Vibrio mimicus hemolysin through limited proteolysis by an endo-

genous metalloprotease. FEBS JOURNAL, 276(3):825–834, FEB 2009. ISSN

1742-464X.

T Moller, T Franch, C Udesen, K Gerdes, e P Valentin-Hansen. Spot 42 RNA

mediates discoordinate expression of the E-coli galactose operon. GENES &

DEVELOPMENT, 16(13):1696–1706, JUL 1 2002. ISSN 0890-9369.

Sean D. Moore e Robert T. Sauer. The tmRNA system for translational surveil-

lance and ribosome rescue. ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY,

76:101–124, 2007. ISSN 0066-4154.

KH NEALSON, T PLATT, e JW HASTINGS. CELLULAR CONTROL OF

SYNTHESIS AND ACTIVITY OF BACTERIAL LUMINESCENT SYSTEM.

JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 104(1):313–&, 1970. ISSN 0021-9193.

DS Nichols. Prokaryotes and the input of polyunsaturated fatty acids to the marine

food web. FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, 219(1):1–7, FEB 14 2003.

ISSN 0378-1097.

Michele K. Nishiguchi. Temperature aﬀects species distribu-

tion in symbiotic populations of vibrio spp. 2000. URL

http://www.pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?artid=92184.

N Okuda, M Ishibashi, E Hayakawa, T Nishino, Y Takeda, AK Mukhopadhyay,

S Garg, SK Bhattacharya, GB Nair, e M Nishibuchi. Emergence of a unique

O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus in Calcutta, India, and isolation of

strains from the same clonal group from Southeast Asian travelers arriving in

Japan. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 35(12):3150–3155,

DEC 1997. ISSN 0095-1137.

DA POLAYES, PW RICE, e JE DAHLBERG. DNA-POLYMERASE-I ACTI-

VITY IN ESCHERICHIA-COLI IS INFLUENCED BY SPOT-42 RNA. JOUR-

NAL OF BACTERIOLOGY, 170(5):2083–2088, MAY 1988. ISSN 0021-

9193.

Tonya K. Rawlings, Gregory M. Ruiz, e Rita R. Colwell. Association of Vibrio cho-

lerae O1 El Tor and O139 Bengal with the copepods Acartia tonsa and Euryte-

mora aﬃnis. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,

73(24):7926–7933, DEC 2007. ISSN 0099-2240.

M Regalia, MA Rosenblad, e T Samuelsson. Prediction of signal recognition par-

ticle RNA genes. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 30(15):3368–3377, AUG

1 2002. ISSN 0305-1048.

Elizabeth E. Regulski, Ryan H. Moy, Zasha Weinberg, Jeﬀrey E. Barrick, Zizhen

Yao, Walter L. Ruzzo, e Ronald R. Breaker. A widespread riboswitch candidate

that controls bacterial genes involved in molybdenum cofactor and tungsten

cofactor metabolism. MOLECULAR MICROBIOLOGY, 68(4):918–932,

MAY 2008. ISSN 0950-382X.

L Riemann e F Azam. Widespread N-acetyl-D-glucosamine uptake among pela-

gic marine bacteria and its ecological implications. APPLIED AND ENVI-

RONMENTAL MICROBIOLOGY, 68(11):5554–5562, NOV 2002. ISSN

0099-2240.

E Rivas e SR Eddy. Noncoding rna gene detection using comparative sequence

analysis. BMC Bioinformatics, p´aginas 2–8, 2001.

T Romeo. Global regulation by the small RNA-binding protein CsrA and the

non-coding RNA molecule CsrB. MOLECULAR MICROBIOLOGY, 29

(6):1321–1330, SEP 1998. ISSN 0950-382X.

E Rosenberg e L Falkovitz. The Vibrio shiloi/Oculina patagonica model system of

coral bleaching. ANNUAL REVIEW OF MICROBIOLOGY, 58:143–159,

2004. ISSN 0066-4227.

EG Ruby. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: The Vibrio

ﬁscheri Euprymna scolopes light organ symbiosis. ANNUAL REVIEW OF

MICROBIOLOGY, 50:591–624, 1996. ISSN 0066-4227.

Y SAKAKIBARA, M BROWN, R HUGHEY, IS MIAN, K SJOLANDER, RC UN-

DERWOOD, e D HAUSSLER. STOCHASTIC CONTEXT-FREE GRAM-

MARS FOR TRANSFER-RNA MODELING. NUCLEIC ACIDS RESE-

ARCH, 22(23):5112–5120, NOV 25 1994. ISSN 0305-1048.

A Salomaa. Formal Languages. 1987.

A Serganov, YR Yuan, O Pikovskaya, A Polonskaia, L Malinina, AT Phan, C Ho-

bartner, R Micura, RR Breaker, e DJ Patel. Structural basis for discriminative

regulation of gene expression by adenine- and guanine-sensing mRNAs. CHE-

MISTRY & BIOLOGY, 11(12):1729–1741, DEC 2004. ISSN 1074-5521.

KT SHANMUGAM, V STEWART, RP GUNSALUS, DH BOXER, JA COLE,

M CHIPPAUX, JA DEMOSS, G GIORDANO, ECC LIN, e KV RAJA-

GOPALAN. PROPOSED NOMENCLATURE FOR THE GENES INVOL-

VED IN MOLYBDENUM METABOLISM IN ESCHERICHIA-COLI AND

SALMONELLA-TYPHIMURIUM. MOLECULAR MICROBIOLOGY, 6

(22):3452–3454, NOV 1992. ISSN 0950-382X.

EB Sherr e BF Sherr. Signiﬁcance of predation by protists in aquatic microbial

food webs. ANTONIE VAN LEEUWENHOEK INTERNATIONAL

JOURNAL OF GENERAL AND MOLECULAR MICROBIOLOGY,

81(1-4):293–308, 2002. ISSN 0003-6072.

Simmons MJ Snustad D.P. Fundamentos de Gen´etica (4 ed.). 2008.

Tianyan Song, Franziska Mika, Barbro Lindmark, Zhi Liu, Stefan Schild, Anne

Bishop, Jun Zhu, Andrew Camilli, Joergen Johansson, Joerg Vogel, e Sun Nyunt

Wai. A new Vibrio cholerae sRNA modulates colonization and aﬀects release

of outer membrane vesicles. MOLECULAR MICROBIOLOGY, 70(1):100–

111, OCT 2008. ISSN 0950-382X.

G SPEDDING e DE DRAPER. ALLOSTERIC MECHANISM FOR TRANS-

LATIONAL REPRESSION IN THE ESCHERICHIA-COLI ALPHA-OPERON.

PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES

OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 90(10):4399–4403, MAY 15

1993. ISSN 0027-8424.

L. Stryer. Bioquimica (3 ed.). 1992.

N. Sudarsan, E. R. Lee, Z. Weinberg, R. H. Moy, J. N. Kim, K. H. Link, e R. R.

Breaker. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.

SCIENCE, 321(5887):411–413, JUL 18 2008. ISSN 0036-8075.

N Sudarsan, JK Wickiser, S Nakamura, MS Ebert, e RR Breaker. An mRNA

structure in bacteria that controls gene expression by binding lysine. GENES

& DEVELOPMENT, 17(21):2688–2697, NOV 1 2003. ISSN 0890-9369.

W Suginta, A Vongsuwan, C Songsiriritthigul, H Prinz, P Estibeiro, RR Duncan,

J Svasti, e LA Fothergill-Gilmore. An endochitinase A from Vibrio carchariae:

cloning, expression, mass and sequence analyses, and chitin hydrolysis. AR-

CHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, 424(2):171–180,

APR 15 2004. ISSN 0003-9861.

ME Taga e BL Bassler. Chemical communication among bacteria. PROCEE-

DINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE

UNITED STATES OF AMERICA, 100(Suppl. 2):14549–14554, NOV 25

2003. ISSN 0027-8424.

Akira Takahashi, Shin-ichi Miyoshi, Noriko Takata, Masayuki Nakano, Akiko Ha-

mamoto, Kazuaki Mawatari, Nagakatsu Harada, Sumio Shinoda, e Yutaka Na-

kaya. Haemolysin produced by Vibrio mimicus activates two Cl- secretory

pathways in cultured intestinal-like Caco-2 cells. CELLULAR MICROBI-

OLOGY, 9(3):583–595, MAR 2007. ISSN 1462-5814.

F TETART e JP BOUCHE. REGULATION OF THE EXPRESSION OF THE

CELL-CYCLE GENE FTSZ BY DICF ANTISENSE RNA - DIVISION DOES

NOT REQUIRE A FIXED NUMBER OF FTSZ MOLECULES. MOLECU-

LAR MICROBIOLOGY, 6(5):615–620, MAR 1992. ISSN 0950-382X.

Kimberly C. Tu e Bonnie L. Bassler. Multiple small RNAs act additively to inte-

grate sensory information and control quorum sensing in Vibrio harveyi. GE-

NES & DEVELOPMENT, 21(2):221–233, JAN 15 2007. ISSN 0890-9369.

ML Urbanowski, LT Stauﬀer, e GV Stauﬀer. The gcvB gene encodes a small un-

translated RNA involved in expression of the dipeptide and oligopeptide trans-

port systems in Escherichia coli. MOLECULAR MICROBIOLOGY, 37(4):

856–868, AUG 2000. ISSN 0950-382X.

AG Vitreschak, DA Rodionov, AA Mironov, e MS Gelfand. Regulation of the

vitamin B-12 metabolism and transport in bacteria by a conserved RNA struc-

tural element. RNA-A PUBLICATION OF THE RNA SOCIETY, 9(9):

1084–1097, SEP 2003. ISSN 1355-8382.

J Vogel, V Bartels, TH Tang, G Churakov, JG Slagter-Jager, A Huttenhofer,

e EGH Wagner. RNomics in Escherichia coli detects new sRNA species and

indicates parallel transcriptional output in bacteria. NUCLEIC ACIDS RE-

SEARCH, 31(22):6435–6443, NOV 15 2003. ISSN 0305-1048.

Joerg Vogel e Kai Papenfort. Small non-coding RNAs and the bacterial outer

membrane. CURRENT OPINION IN MICROBIOLOGY, 9(6):605–611,

DEC 2006. ISSN 1369-5274.

EGH WAGNER e RW SIMONS. ANTISENSE RNA CONTROL IN BACTE-

RIA, PHAGES, AND PLASMIDS. ANNUAL REVIEW OF MICROBIO-

LOGY, 48:713–742, 1994. ISSN 0066-4227.

S. WASHIETL. Rnaz: Predicting structural noncoding rnas. Department for

Theoretical Chemistry/University Vienna, 2006.

KM Wassarman, AX Zhang, e G Storz. Small RNAs in Escherichia coli. TRENDS

IN MICROBIOLOGY, 7(1):37–45, JAN 1999. ISSN 0966-842X.

Lauren S. Waters e Gisela Storz. Regulatory RNAs in Bacteria. CELL, 136(4):

615–628, FEB 20 2009. ISSN 0092-8674.

Zasha Weinberg, Jeﬀrey E. Barrick, Zizhen Yao, Adam Roth, Jane N. Kim, Jeremy

Gore, Joy Xin Wang, Elaine R. Lee, Kirsten F. Block, Narasimhan Sudarsan,

Shane Neph, Martin Tompa, Walter L. Ruzzo, e Ronald R. Breaker. Identiﬁca-

tion of 22 candidate structured RNAs in bacteria using the CMﬁnder compara-

tive genomics pipeline. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 35(14):4809–4819,

JUL 2007. ISSN 0305-1048.

W Winkler, A Nahvi, e RR Breaker. Thiamine derivatives bind messenger RNAs

directly to regulate bacterial gene expression. NATURE, 419(6910):952–956,

OCT 31 2002. ISSN 0028-0836.

K Yamane, J Asato, N Kawade, H Takahashi, B Kimura, e Y Arakawa. Two

cases of fatal necrotizing fasciitis caused by Photobacterium damsela in Japan.

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 42(3):1370–1372, MAR

2004. ISSN 0095-1137.

Fitnat H. Yildiz e Karen L. Visick. Vibrio bioﬁlms: so much the same yet so dif-

ferent. TRENDS IN MICROBIOLOGY, 17(3):109–118, MAR 2009. ISSN

0966-842X.

AX Zhang, KM Wassarman, C Rosenow, BC Tjaden, G Storz, e S Gottesman.

Global analysis of small RNA and mRNA targets of Hfq. MOLECULAR

MICROBIOLOGY, 50(4):1111–1124, NOV 2003. ISSN 0950-382X.

J Zhu e JJ Mekalanos. Quorum sensing-dependent bioﬁlms enhance colonization

in Vibrid cholerae. DEVELOPMENTAL CELL, 5(4):647–656, OCT 2003.

ISSN 1534-5807.

J Zhu, MB Miller, RE Vance, M Dziejman, BL Bassler, e JJ Mekalanos. Quorum-

sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. PRO-

CEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF

THE UNITED STATES OF AMERICA, 99(5):3129–3134, MAR 5 2002.

ISSN 0027-8424.

M ZUKER e P STIEGLER. OPTIMAL COMPUTER FOLDING OF LARGE

RNA SEQUENCES USING THERMODYNAMICS AND AUXILIARY INFOR-

MATION. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 9(1):133–148, 1981. ISSN 0305-

1048.

Apˆendice A

Tabela resumida dos ncRNAs

Apˆendice B

Tabela completa dos ncRNAs

100

101

102

103

104

Apˆendice C

Artigo cient´ıﬁco

105

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 