ads:
Londrina
2008
AVA
L
IAÇÃO
DA
AT
I
V
I
DADE
ANTIBIÓT
I
CA
DE
COMPOSTOS EXTRACE
L
ULARES
BACTERIANO
NO
CONTROLE
DE
XANTHOMONAS AXONOPODIS
PV
.
CITR
I
CEPA
306
ADMILTON GONÇALVES DE OLIVEIRA JÚNIOR
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ADMILTON GONÇALVES DE OLIVEIRA JÚNIOR
AVA
L
IAÇÃO
DA
AT
I
V
I
DADE
ANTIBIÓT
I
CA
DE
COMPOSTOS EXTRACE
L
ULARES
BACTERIANO
NO
CONTROLE
DE
XANTHOMONAS AXONOPODIS
PV
.
CITR
I
CEP
A
306
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia da
Universidade Estadual de Londrina como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Microbiologia
Orientador: Prof.Dr. Galdino Andrade
Londrina
2008
ads:
BANCA E
X
A
MIN
A
DOR
A
Prof. D
r
.JoãoCa
r
los Palazzo de Mello
Prof. D
r
. Galdino
A
nd
r
ade
Prof. D
r
.Ma
r
tin Homechin
Lond
r
ina, 28 de feve
r
ei
r
o de 2008
DEDIC
A
T
Ó
RI
A
A Deus, pela luz que me ilumina, À minha
família; a equipe do Laboratório de Ecologia
Microbiana e a todos aqueles que de alguma
forma me acompanharam no desenvolvimento
deste trabalho.
AGR
A
DECIMENTOS
A
Deus, pela luz que me guia.
A
os meus pais
A
dmilton e Te
r
eza pelo incentivo e apoio financei
r
o pa
r
a a
r
ealização
do cu
r
so.
A
meu i
r
mão William, minha cunhada
K
átia e minha namorada, pela confiança,
companhei
r
ismo, motivação ao longo de todo mest
r
ado.
A
os meus familia
r
es pelo apoio, em especial pa
r
a o Tio João e Tia Ve
r
a, Tio Paulo e
Tia Lucia, Tia Leidi.
A
o Prof. D
r
. Galdino
A
ndrade pela o
r
ientação, amizade, incentivo ao longo des
t
e
t
r
abalho e pelo e
x
emplo de profissionalismo.
A
o Prof. D
r
. Ma
r
co
A
ntônio Noguei
r
a pela amizade, b
r
ilhantismo estat
í
stico e
valiosas info
r
mações pa
r
a o desenvolvimento des
t
et
r
abalho.
A
o Prof. D
r
. João Ca
r
los Palazzo de Mello pela amizade, a
j
uda constante na
.
condução dos e
x
pe
r
imentos e por pe
r
mitir a utilização de equipamen
t
os de seu
labo
r
a
t
ó
r
io.
A
o Prof. D
r
. Ma
r
tin Homechin pelas valiosas suges
t
ões, as quais fo
r
am muito
impo
r
t
an
t
es nos
r
esul
t
ados dos e
x
pe
r
imentos.
A
o Prof. D
r
. Ma
r
celo Dubuc pela g
r
ande amizade, ensinamentos g
r
andiosos,
confiança, con
t
udo, por sua pessoa.
À
Coo
r
denação do Mest
r
ado em Mic
r
obiologia, por fornecer condições pa
r
a a
r
ealização des
t
e cu
r
so.
A
o técnico do labo
r
a
t
ó
r
io, Má
r
cio por estar semp
r
e dispos
t
oaa
j
uda
r
.
A
os companhei
r
os de labo
r
ató
r
io Ivana, Ma
r
ina, Dáfila, C
í
ce
r
a, C
r
istiane, Lu
í
s
Edua
r
do, Daniel, Lau
r
a, Kellen, B
r
asil, e em especial a Let
í
cia pela a
j
uda nos
e
x
pe
r
imen
t
os e o Eik pelas fo
t
os, e
t
ambém po
r
faze
r
em com que o mest
r
ado fosse
não somen
t
e um pe
r
í
odo de ap
r
imoramento profissional, mas também de
c
r
escimento pessoal.
A
os meus g
r
andes amigos Gus
t
avo, Ped
r
o, Helbe
r
, Valdemir pelo incentivo e
confiança desde a graduação.
A
todos que, di
r
eta ou indi
r
etamente, colabo
r
a
r
am pa
r
aa
r
ealização des
t
e t
r
abalho.
OLIVEI
R
A
J
Ú
NIO
R
,
A
dmil
t
on Gonçal
v
es.
A
v
aliação da ati
v
idade antibiótica de
compostos extracelulares bacteriano no controle de
X
anthomonas a
x
onopod
i
s
p
v
.
c
i
tri cepa 306. Lond
r
ina, 2008. Disse
r
tação (Mestrado em Mic
r
obiologia)
Unive
r
sidade Estadual de Lond
r
ina
–
UEL.
R
ESUMO
O Canc
r
o c
í
t
rico causado pela Xantho
m
onas a
x
ono
po
d
i
s
p
v
.
c
i
tr
i
(Xa
c
) é conside
r
ado
um dos maio
r
es p
r
oblemas fi
t
ossani
t
á
r
ios e econômicos pa
r
a ci
t
r
icul
t
u
r
a mundial.
A
t
ualmen
t
e, a fo
r
ma mais utilizada de con
t
r
oleéae
r
r
adicação das plan
t
as doentes
e/ou pul
v
erização com p
r
odu
t
os a base de cob
r
e.
A
ob
t
enção de no
v
os p
r
odu
t
os pa
r
a
con
t
r
ole do canc
r
o c
í
t
r
ico é necessá
r
ia, uma
v
ez que as fo
r
mas atuais de con
t
r
ole não
a
t
uam efe
t
i
v
amen
t
e na doença e podem contaminar o ambien
t
e pelo uso de me
t
al
pesado.
A
bac
t
éria cepa LV (P
s
eudo
m
onas sp) foi cul
t
i
v
ada em caldo nu
t
r
ien
t
e +
CuCl2 . 2H2O (100 mg L-1) po
r
15 dias (28 °C, 100
r
pm) em seguida cen
t
r
ifugada
(9.000
r
pm, 20 min, 4°C), sendo o sob
r
enadan
t
e
t
r
atado com diclo
r
ometano po
r
pa
r
t
ição líquido-líquido, concen
t
r
ado em
r
o
t
a
v
apor a 45°C, congelado em ni
t
r
ogênio
líquido e liofilizado.
A
fase diclo
r
ome
t
ano (FD) ob
t
ida, foi f
r
acionada po
r
c
r
oma
t
og
r
afia
líquida a
v
ácuo (CLV) u
t
ilizando seis sol
v
en
t
es com pola
r
idade c
r
escen
t
e. Foi
t
estada a
ação antibió
t
ica da FD e das f
r
ações ob
t
idas na CLV con
t
r
aaXa
c
cepa 306 a
t
r
a
v
és da
t
écnica de difusão em ága
r
, e de
t
e
r
minada à concen
t
r
ação inibitó
r
ia m
í
nima em placas
de cul
t
u
r
a de 24 poços onde a FD e a f
r
ação F3
t
i
v
e
r
am maio
r
efei
t
o an
t
ibió
t
ico.
A
s
plan
t
as fo
r
am
t
r
atadas com a FD e com a f
r
ação F3 que ap
r
esen
t
ou maio
r
ação
i
n
v
i
tro.
Os
r
esul
t
ados mos
t
r
a
r
am que oco
r
r
euadiminuiçãodap
r
esença de lesão em ce
r
ca de
80% e 94% nas plan
t
as
t
r
a
t
adas com FD e F3
r
espec
t
i
v
amen
t
e. Es
t
es
r
esul
t
ados
indicam que o uso de subs
t
âncias com ação an
t
ibió
t
ica pode ser uma e
x
celen
t
e
fe
r
r
amen
t
a pa
r
a o con
t
r
ole da Xa
c
.
Pala
v
ras-cha
v
e: Ci
t
r
icul
t
u
r
a. Fi
t
opa
t
ógeno. Canc
r
oc
í
t
rico. Con
t
r
ole biológico.
A
n
t
ibiose. Xantho
m
o
na
s
a
x
o
nopod
i
s
p
v
.
c
i
tr
i
OLIVEI
R
A
J
Ú
NIO
R
,
A
dmil
t
on Gonçal
v
es. E
v
aluation of the antibiotic acti
v
ity o
f
extracellular bacterial compounds in the control o
f
X
anthomonas a
x
onopod
i
s
p
v
.
c
i
tri strain 306. Lond
r
ina, 2008. Disse
r
tação (Mestrado em Mic
r
obiologia)
Unive
r
sidade Estadual de Lond
r
ina
–
UEL.
A
BSTR
A
CT
The disease caused by Xantho
m
ona
s
a
x
on
o
p
o
d
i
s
p
v
.
c
i
tr
i
(Xa
c
) is a big p
r
oblem fo
r
ci
t
ricul
t
u
r
e. Usually
t
he con
t
r
ol is ma
k
ebycu
t
t
ed sick plan
t
sand
/
o
r
t
r
ea
t
ed with cuppe
r
p
r
oduc
t
. The challenge
t
oday is find
t
he new p
r
oduct which is mo
r
e effec
t
i
v
e
t
o con
t
r
ol
can
k
er ci
t
r
us. The bac
t
e
r
ia s
t
r
ain LV (P
s
eudo
m
onas sp.) was cul
t
u
r
a
t
ed in nu
t
rient
b
r
o
t
h plus CuCl2 . 2H2O (100 mg L-1) for 15 da
y
s (28 °C, 100
r
pm) followed o
f
cen
t
r
ifugation (9,000
r
pm ; 20 min ; 4°C),
t
he supe
r
na
t
ant was
t
r
ea
t
ed wi
t
h
dichlo
r
ome
t
hane in a liquid-liquid e
x
t
r
ac
t
ion, and concen
t
r
a
t
ed wi
t
h
r
o
t
a
t
o
r
e
v
apo
r
a
t
o
r
at
45°C, f
r
eezed in a liquid ni
t
r
ogen and l
y
ophilized. The phase of dichlo
r
omethane (PD)
was f
r
ac
t
iona
t
ed by
v
acuum liquid ch
r
oma
t
og
r
aphy (VLC) using six o
r
ganic sol
v
en
t
s
wi
t
h c
r
escent pola
r
i
t
y
. The antibio
t
ic ac
t
i
v
i
t
yofFDand
t
he f
r
ac
t
ion ob
t
ained f
r
om VLC
was
t
es
t
ed against Xa
c
s
t
r
ain 306 using agar diffusion
t
echnique in a Pe
t
r
i dishes.
A
lso
t
he inhibito
r
y minimum concen
t
r
a
t
ion was es
t
ima
t
ed in a cell cul
t
u
r
e pla
t
es wi
t
h 24
wells. The
r
esul
t
s showed
t
he FD and
t
he f
r
ac
t
ionF3we
r
emo
r
eeffec
t
i
v
e
t
o con
t
r
ol the
Xa
c
306 g
r
ow
t
h. In a g
r
eenhouse e
x
periment plant was
t
r
ea
t
ed wi
t
h FD and F3 f
r
ac
t
ion
(high effec
t
i
v
e
i
n
v
i
tro e
x
pe
r
iment). The
r
esul
t
s showed that
t
he lesions forma
t
ion was
inhibited a
r
ound 80% and 94% in plan
t
s
t
r
eated wi
t
hFDandF3
r
espec
t
i
v
el
y
. The da
t
a
suggested
t
hat
t
he use of an
t
ibio
t
ic compounds p
r
oduced by bac
t
eria should be an
e
x
cellent tool
t
o con
t
r
ol plant disease in
t
his case
t
he can
k
e
r
ci
t
r
us.
K
e
y
words: Ci
t
ricul
t
u
r
e. Ph
y
t
opa
t
hogen. Ci
t
r
us can
k
e
r
. Biological con
t
r
ol.
A
ntibiosis.
Xantho
m
ona
s
a
x
ono
po
d
i
s
p
v
.
c
i
tr
i
LISTA DE TABELA
S
Tabela 1: Teste de sensibilidade da Xa
c
306 ao clo
r
e
t
odecob
r
e
Tabela 2:
A
valiação da ação antibiótica po
r
difusão em ága
r
da fase diclo
r
ometano
(FD), fração hexano (F1), fração diclorometano (F2), fração acetato de etila (F3),
fração metanol (F4), fração metanol e água (F5) e fração água (F6), frente à Xac
306.
Tabela 3: De
t
e
r
minação da concent
r
ação inibitó
r
ia m
í
nima da fase diclo
r
ometano
(FD), fase diclorometano autoclavada a 121°C 20min-1 (FDT), fração hexano (F1),
fração diclorometano (F2), fração acetato de etila (F3), fração metanol (F4), fração
metanol e água (F5) e fração água (F6), frente à Xac 306.
LEGENDA DE FIGURAS
Figu
r
a 1: Reg
r
essão (p < 0.05, n = 40) dose-efeito da aplicação de t
r
ês doses da
fase diclorometano (D0 = água destilada, D1 = 10.000 µg mL-1, D2 = 1.000 µg mL-1,
D3 = 100 µg mL-1) sobre o número de lesões foliares de cancro cítrico causado pela
Xac 306 em plantas de C. sinensis cv. Valência após 21 dias da aplicação. (A) Pré-
tratamento. (B) Pós-tratamento.
Figu
r
a 2: Reg
r
essão (p < 0.05, n = 50) dose-efeito da aplicação de quat
r
o doses da
fração F3 obtida a partir do tratamento da fase FD com acetato de etila (D0=água
destilada, D1=10.000 µg mL-1, D2=1.000 µg mL-1, D3=100 µg mL-1, D4=10 µg mL-
1) sobre o número de lesões foliares de cancro cítrico causado pela Xac 306 em
plantas de C. sinensis cv. Valência após 21 dias de aplicação. (A) Pré-tratamento,
(B) Pós-tratamento.
SUM
Á
RIO
1 INTRODUÇÃO
1
2
2
2
2 OBJETI
V
OS
2.1 Geral
2.2 Específicos
3
3
5
7
7
8
9
10
11
11
12
13
3
R
E
V
ISÃO BIBLIOGR
Á
FICA
3.1 Cancro Cítrico: Histórico e Importância
3.2 Etiologia
3.3 Ciclo da Doença
3.3.1 Disseminação
3.3.2 Infecção
3.3.3 Colonização
3.3.4 Sobrevivência
3.4 Controle do Cancro Cítrico
3.4.1 Erradicação e Exclusão
3.4.2 Controle Químico
3.4.3 Controle Biológico
4. REFER
Ê
NCIAS BIBLIOGR
Á
FIC
A
S 16
ARTIGO: A
V
ALIAÇ
Ã
O DA ATI
V
ID
A
DE
A
NTIBI
Ó
TIC
A
DE COMPOSTOS
EXTRACELULARES BACTERIANO NO CONTROLE DE XANTHOMONAS
AXONOPODIS PV. CITRI CEPA 306
25
R
ESUMO 26
1 INT
R
ODUÇÃO 27
28
28
28
29
29
29
2 MATE
R
IAL E M
É
TODOS
2.1 Cepas de bactérias
2.2 Produção e extração das substâncias antibióticas
2.3 Teste de sensibilidade da Xac 306 ao cloreto de cobre
2.4 Quantificação do resíduo de cobre remanescente na fase diclorometano
2.5 Purificação das substâncias antibióticas por cromatografia líquida a
vácuo (CLV)
2.6 Avaliação da ação antibiótica por difusão em ágar
2.7 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e
termoestabilidade da fase diclorometano
2.8 Avaliação da ação das substâncias antibióticas FD e F3 sobre a
formação de lesão em folha
2.9 Efeito citotóxico das substâncias antibióticas FD e F3
30
30
31
32
3 RESULTADOS 32
x
3.1
S
ens
i
bil
i
dade da
X
ac 306 a di
f
erente
s
c
on
c
entra
ç
õe
s
de
c
l
oreto de
cobre
3.2 Análise de resíduo de cobre na fase diclorometano
3.3 Avaliação da ação antibiótica in vitro pelo método de difusão em ágar
3.4 Determinação da concentração inibitória mínima e termoestabilidade da
fase diclorometano
3.5 Avaliação da ação das substâncias antibióticas FD e F3 sobre a
formação de lesão em folha
3.6 Efeito citotóxico das substâncias antibióticas FD e F3
32
33
33
33
34
34
4 DISCUSSÃO 35
5 CONCLUSÃO 37
5 REFER
Ê
NCIAS BIBLIOGR
Á
FIC
A
S 37
Legenda das
f
iguras 45
1
1 INT
R
ODUÇÃO
O Canc
r
o c
í
t
rico é conside
r
ado um dos maio
r
es p
r
oblemas fi
t
ossani
t
ário pa
r
aa
ci
t
ricul
t
u
r
a em di
v
e
r
sas pa
r
t
es do mundo. De um modo ge
r
al ela acor
r
e mais
se
v
e
r
amen
t
e em pa
í
ses ou
r
egiões com clima mais quen
t
e e úmido. O mais an
t
igo
r
ela
t
o da
t
a de 1827 e 1831 com Fawce
t
teJen
k
ins, (1933) em folhas de C
i
tru
s
m
ed
i
c
a
p
r
o
v
enien
t
es da
Í
ndia, sendo desc
r
i
t
ap
r
imei
r
amen
t
epo
r
Hasse em 1915 nos EU
A
,Já
no B
r
asil, os p
r
imei
r
os
r
ela
t
os ocor
r
e
r
am na década de 50.
Cinco
t
ipos dife
r
en
t
es de canc
r
o c
í
t
rico fo
r
am ag
r
upados em função da
sintoma
t
ologia ap
r
esen
t
ada e os dife
r
en
t
es hospedei
r
os afe
t
ados:
A
, B, C, D e E. O
t
ipo
A
, ou canc
r
o c
í
t
r
ico asiático, é o principal e mais se
v
e
r
o
t
ipo p
r
esen
t
e nos
poma
r
es, sendo causado pela Xantho
m
onas a
x
o
n
o
p
o
d
i
s p
v
.
c
i
tri (Xa
c
), bas
t
one
t
e
ae
r
óbio, G
r
am nega
t
i
v
o, mono
t
r
íquio.
Os sin
t
omas cons
t
i
t
uem-se em lesões ci
r
cula
r
es, co
r
t
icosas, salien
t
es, de
colo
r
ação amar
r
onzada e aspec
t
o e
r
up
t
i
v
o ocor
r
endo em folhas, f
r
u
t
os e
r
amos.
A
infecção pode se
r
de fo
r
ma passi
v
a, ganhando o in
t
e
r
io
r
dos
t
ecidos de ci
t
r
os a
t
r
a
v
és
de abe
r
t
u
r
as na
t
u
r
ais, como os es
t
ôma
t
os, po
r
fe
r
imen
t
os causados mecanicamen
t
e
ou pela ati
v
idade de inse
t
os.
O es
t
udo do efei
t
o de di
v
e
r
sasmedidaspa
r
aocon
t
r
oleep
r
e
v
enção do canc
r
o
c
í
t
rico assume g
r
ande impo
r
t
ância,
t
an
t
o pa
r
a á
r
eas com cul
t
u
r
as de ci
t
r
os onde a
er
r
adicação de plan
t
as doen
t
es não é a p
r
incipalmedidadecon
t
r
ole, como no Es
t
ado
do Pa
r
aná, quan
t
o pa
r
a
r
egiões aonde a p
r
á
t
icadeer
r
adicação
v
em sendo adotada
como principal medida pa
r
a elimina
r
a doença, como no Estado de São Paulo.
Tendo em
v
is
t
a a g
r
ande impo
r
t
ância que o canc
r
o c
í
t
rico assume na
ci
t
ricul
t
u
r
a mundial e o p
r
oblema da
r
ápida disseminação da bac
t
é
r
ia nos poma
r
es, a
2
busca po
r
no
v
as medidas de con
t
r
ole é uma al
t
e
r
nati
v
a necessária, uma
v
ez que, as
fo
r
mas a
t
uais de con
t
r
ole não atuam efe
t
i
v
amen
t
e na doença e podem contamina
r
o
meio ambien
t
e pelo uso de me
t
al pesado. Medidas isoladas não
t
êm demons
t
r
ado
eficiência pa
r
a p
r
e
v
enir a in
t
r
odução e o es
t
abelecimen
t
odafitopa
t
ologia em no
v
as
á
r
eas a
t
é mesmo a sua er
r
adicação
t
o
t
al em
v
árias
r
egiões. No entan
t
o, an
t
es de es
t
as
medidas se
r
em efe
t
i
v
amen
t
e ado
t
adas, é fundamen
t
al que a eficácia no con
t
r
ole de
n
í
v
eis de infecção nos poma
r
es e o seu efei
t
o na p
r
odução das plan
t
as se
j
am
consistentemen
t
e estudados.
2 OBJETI
V
OS
2.1 Geral:
Obtenção de me
t
abóli
t
os secundá
r
ios com p
r
op
r
iedades antibióticas p
r
oduzidos pela
cepa LV (P
s
eudomonas sp) pa
r
a o cont
r
ole do canc
r
o c
í
t
r
ico causado pela
Xanthomona
s
a
x
ono
p
odi
s
pv. citri cepa 306.
2.2 Espec
í
f
icos:
a) P
r
oduzir substâncias e
x
t
r
acelula
r
es bac
t
e
r
ianas com ação an
t
ibiótica durante o
c
r
escimento da cepa LV;
b) F
r
acionar a fase orgânica em cromatografia l
í
quida a vácuo;
c)
A
valiar a te
r
moestabilidade da fase orgânica;
d)
A
valia
r
a ação antibiótica e de
t
e
r
mina
r
a concent
r
ação inibitó
r
ia m
í
nima in vitro da
fase orgânica e suas f
r
ações;
e) Dete
r
minar a ci
t
oto
x
icidade das subs
t
âncias com ação antibiótica;
3
f)
A
valiar a ação antibiótica da fase orgânica e a melhor f
r
ação na incidência de
lesões foliar do canc
r
o c
í
t
r
ico em condição de casa de vegetação.
3
R
E
V
ISÃO BIBLIOGR
Á
FICA
3.1 Cancro C
í
trico: Histórico e Importância
A
produção e e
x
po
r
tação de cit
r
os no B
r
asil ga
r
anti
r
am o p
r
imei
r
o luga
r
no
r
anking mundial, tendo como p
r
incipal concor
r
ente os EUA (F
A
O, 2006). O B
r
asil
p
r
oduz quase a metade do suco de la
r
an
j
a consumido no mundo, que
r
esponde
anualmente por mais de um bilhão de dóla
r
es nas e
x
po
r
tações b
r
asilei
r
as.
Ent
r
e
t
an
t
o, es
t
a posição vem sendo constantemen
t
e ameaçada pelo g
r
ave p
r
oblema
fi
t
ossani
t
á
r
io que
r
ep
r
esen
t
a o canc
r
oc
í
t
r
ico pa
r
a a produção nacional, aumen
t
ando
os custos, desestimulando o cit
r
iculto
r
ecausandop
r
oblemas na e
x
po
r
tação devido
a bar
r
ei
r
as fi
t
ossani
t
á
r
ias que muitas vezes são impos
t
as po
r
pa
í
ses concor
r
entes.
Ent
r
e 1997 e 2000, quase quat
r
o milhões de á
r
vo
r
es e mudas fo
r
am er
r
adicadas
devido ao canc
r
o c
í
t
r
ico, ge
r
ando um p
r
e
j
uízo acumulado de apro
x
imadamen
t
e
R
$
300 milhões (Berna
r
do Esteves, 2001).
O canc
r
o c
í
t
r
ico é o
r
iginá
r
io do sudoeste da
Á
sia, mesmo cent
r
o de o
r
igem
dos cit
r
os, as p
r
imeiras indicações de sua e
x
istência datam dos anos ent
r
e 1827 e
1831 em folhas herba
r
izadas de Citrus medica p
r
ovenien
t
es da
Í
ndia (Bitancou
r
t
,
1957).
A
pa
r
tir da
í
, esta doença tem se disseminado pelo mundo, p
r
incipalmen
t
e
pela impo
r
tação de ma
t
e
r
ial
v
egetativo contaminado, p
r
opagando-se pa
r
a vá
r
ias
r
egiões do planeta tais como Oceania,
Á
f
r
ica,
A
mé
r
icadoSuledo No
r
te (
K
oizumi,
1985; Lei
t
e Junio
r
e Moham; 1990; Feichtenberge
r
, 1997).
A
erradicação do canc
r
o
4
c
í
t
r
ico é mé
r
ito de poucos pa
í
ses tais como a
Á
f
r
ica do Sul e Nova Zelândia
(Koizumi, 1985).
Nos EU
A
, apesar do canc
r
o c
í
t
r
ico ter sido conside
r
ado er
r
adicado na
década de 40 (Dopson, 1964), por volta de 1984 novos focos fo
r
am encontrados,
levando à eliminação de milhões de plan
t
as o que
r
ep
r
esen
t
ou em um p
r
e
j
uízo
acumulado de ap
r
o
x
imadamente 100 milhões de dóla
r
es. Ho
j
e, apesa
r
dos esfo
r
ços,
a Fló
r
ida ainda possui focos da doença devido à disseminação da bac
t
é
r
ia,
p
r
incipalmen
t
e em poma
r
es
r
esidenciais. No B
r
asil, a doença foi
r
elatada pela
p
r
imei
r
a vez no munic
í
pio de P
r
esidente P
r
uden
t
e - SP em 1957 (Bitancou
r
t, 1957),
dando assim in
í
cio a vá
r
ias medidas de cont
r
ole com o ob
j
e
t
ivo de evitar a
disseminação da doença. No entanto, o agente causal do canc
r
o c
í
t
r
ico
(Xantho
m
onas a
x
ono
p
odis pv. citri (Xa
c
)) foi disseminada pa
r
a vá
r
ios estados
b
r
asilei
r
os, como Paraná, Santa Cata
r
ina, Rio Grande do Sul, Ma
t
o G
r
osso do Sul,
Mato G
r
osso, Minas Ge
r
ais e Ro
r
aima (Feichtenberge
r
et al., 1997; Leite Junio
r
e
Moham, 1990; Nascimento et al., 2003).
Com o ob
j
etivo de conte
r
e elimina
r
focos da doença em
t
er
r
itó
r
io b
r
asilei
r
o
foi c
r
iado a Campanha Nacional de Er
r
adicação do Canc
r
o C
í
t
r
ico (C
A
NECC),
confo
r
me Dec
r
e
t
o n° 70.601 de 09
/
12
/
1974. No in
í
cio, o p
r
ocesso de er
r
adicação
envolvia o mapeamento e avaliação de
t
odas as plan
t
as c
í
t
r
icas das zonas
r
u
r
al e
u
r
bana. Uma vez constatada a doença po
r
engenhei
r
os ag
r
ônomos da C
A
NECC, a
p
r
op
r
iedade podia sof
r
er inte
r
dição total.
A
er
r
adicação em si se dava at
r
avés da eliminação das plantas infec
t
adas e
as suspei
t
as em um
r
aio de 50 met
r
os a pa
r
tir do foco inicial. Pa
r
a vivei
r
os de
mudas,
t
odas as mudas deve
r
iam ser eliminadas incluindo as sadias além das
mudas de out
r
os vivei
r
os em um
r
aio de até 200 met
r
os.
A
eliminação podia se
r
5
at
r
avés do uso de he
r
bicidas, ou a fo
r
ma mais indicada, at
r
avés da queima das
plan
t
as depois de ar
r
ancadas in
l
oco (Roset
t
i, 1977; Leite Junio
r
e Monhan, 1990).
Com o passa
r
do tempo, discussão ent
r
e entidades gove
r
namen
t
ais, produ
t
o
r
es e
pesquisado
r
es fize
r
am com que limites impostos pela C
A
NECC fossem modificados.
A
pa
r
tir do ano de 1996, com a int
r
odução da laga
r
ta minado
r
a do cit
r
os,
Phyl
l
o
c
nisti
s
citrel
l
a, mudou as ca
r
ac
t
e
r
í
sticas epidemiológicas do patossis
t
ema em
vigência, cit
r
os-Xanthomona
s
pa
r
acit
r
os-Xanthomona
s
-Ph
y
l
l
o
c
nisti
s
(Bergamin Filho
et al., 2001), ocasionando um aumen
t
o na incidência do canc
r
o c
í
t
r
ico e novas
mudanças nas legislações, a fim de diminuir ou até mesmo eliminar os focos da
bacté
r
ia.
O
r
ecen
t
e seqüenciamento completo do genoma da bacté
r
ia Xa
c
cepa 306
pe
r
mitiu evidenciar a conside
r
ável ve
r
satilidade bioqu
í
mica e uma sé
r
ie de
mecanismos que esse organismo utiliza pa
r
aasuasob
r
evivência e pa
r
a a infecção
da planta hospedei
r
a (Da Silva et al., 2002).
A
spec
t
os como, p
r
odução de compostos
potencialmen
t
e capazes de aumenta
r
a capacidade da bacté
r
ia em causa
r
danos à
plan
t
a, prote
í
nas que atenuam o efei
t
o de antibióticos, p
r
ote
í
nas que dest
r
oem as
células do in
t
e
r
io
r
da folha, pe
r
miti
r
áab
r
i
r
novas linhas de pesquisa pa
r
a comba
t
e
r
o
canc
r
o c
í
t
r
ico.
3.2 Etiologia
A
ta
x
onomia do agen
t
e causal do canc
r
ocí
t
r
ico vem sendo constantemente
r
evisada, com isso, p
r
opostas de
r
eclassificação tem sido feitas por alguns
pesquisado
r
es (Shaad et al., 2000, 2005; B
r
unings e Gab
r
iel, 2003). Em vi
r
tude
disto, ado
t
amos no p
r
esen
t
e t
r
abalho a seguinte classificação aceita na literatu
r
a
6
mundial, Xanthomonas a
x
ono
p
odis pv. citri (
X
ac) (Vaute
r
in et al., 1995).
A
Xa
c
(Bacté
r
ia, P
r
oteobac
t
e
r
ia, Subdivisão Gamma,
X
anthomodales), é um bas
t
onete
est
r
itamen
t
e aeróbio ap
r
esentando reação G
r
am-negativa, motilidade por flagelo
polar (monot
r
í
quio), colônias com pigmen
t
ação ama
r
ela e um aspec
t
o viscoso
devido à p
r
odução de e
x
opolissaca
r
í
deos.
A
Xa
c
c
r
esce na maio
r
ia dos meios utilizados em labo
r
ató
r
io e é facilmente
isolada de tecido vegetal infectado. Colônias são visíveis após 24 e 72 ho
r
as de
incubação a uma
t
empe
r
atu
r
a de 28 °C (B
r
unnings e Gab
r
iel; 2003).
A
s condições
ideais pa
r
a o c
r
escimento da Xa
c
são umidade elevada e tempe
r
a
t
u
r
a ent
r
e 20 e 30
°C.
Cinco tipos ou pa
t
ova
r
es de canc
r
oc
í
t
r
ico fo
r
am ag
r
upados em
A
, B, C, D e
E, com base na sintoma
t
ologia ap
r
esentada e nos dife
r
entes hospedei
r
os afetados.
O canc
r
o c
í
t
r
ico asiático (canc
r
ose
A
), causado pela cepa asiática X. a
x
anopodi
s
pv.
citr
i
, é a fo
r
ma mais seve
r
a da doença.
A
fe
t
avá
r
ias espécies da fam
í
lia Rutácea e
encontram-se disseminado na
Á
sia,
Á
f
r
ica,
A
mé
r
ica e Oceania.
A
Canc
r
ose B,
causada pela cepa B de X. a
x
anopodis pv. aurant
i
f
oli
i
, com maio
r
impo
r
tância em
limões ve
r
dadei
r
os (Citrus l
i
mon) e lima ácida “Galego” (Citrus auranti
f
ol
i
a), sendo
encont
r
ada na
A
rgentina, Pa
r
aguai e U
r
uguai.
A
Canc
r
ose C, causada pela cepa C
da X. a
x
ano
p
odi
s
pv. auranti
f
oli
i
, foi isolada em 1970 de lima me
x
icana no Estado de
São Paulo, mas é
r
a
r
amente encont
r
ada desde en
t
ão.
A
canc
r
ose D, causada pela
cepa D de X. a
x
ano
p
odi
s
pv. auranti
f
o
l
i
i
, o único hospedei
r
ona
t
ural conhecido dessa
bacté
r
ia é o limão Galego (Citru
s
auranti
f
ol
i
a) (Leite Junior e Moham, 1990).
Out
r
as formas da bacté
r
ia do canc
r
o c
í
t
r
ico têm sido
r
elatadas, como os
isolados descobe
r
tos em Omã,
A
r
ábia Saudita, I
r
ã e
Í
ndia que p
r
oduzem lesões
7
como a canc
r
ose
A
somente em lima me
x
icana, mas aparentam ser distin
t
as da
cepa
A
(Ve
r
niè
r
e et al., 1998; Mohammadi et al., 2001).
Os cultiva
r
es c
í
t
r
icos são classificados quanto à va
r
iabilidade nos níveis de
r
esistência ao canc
r
o c
í
t
r
ico, sendo conside
r
ado com
r
esistente a altamen
t
e
suscetíveis, como most
r
ado na Tabela 1.
*
A
daptado de Gottwald et al., (2002) e Shube
r
t e Sun, (2003).
C.
l
i
m
on
C.aurantifolia
C. reticulata
C. paradisi
A
ltamen
t
e suscetíveis
Mode
r
adamen
t
e
resistente
Moderadamente
suscetíveis
Suscetíveis
Resisten
t
es
Nome cient
í
fico
C. mitus
Fortunella spp
C. sinensis
C. reticulata
C. sinensis
C. reticulata
C. sinensis
C. reticulata
C. sinensis
Tabela 1: Exemplos de algumas culti
v
ares c
í
tricos quanto a n
í
v
eis de
resistência ao cancro cítrico
Cultivares cítricos
Nome popula
r
Calamondin
Laranjinha Kinkan
Laranja Doce, Moro
Tangerina Pokan, Tankan
Laranja Doce, Pêra, Valencia
Tangerina Dancy
Laranja Doce,Natal
Tangerina Cravo, King, Romana
Laranja Doce, Bahia, Ruby e
Hamlin
Limão verdadeiro
Lima ácida Galego
Tangerina Lee
Grapefruit
Nível de
r
esistência
A
ltamen
t
e Resistentes
3.3 Ciclo da Doença
3.3.1 Dis
s
em
i
na
ç
ão
A
disseminação da bacté
r
ia se da p
r
incipalmen
t
e at
r
avés de três fato
r
es
essenciais à dispe
r
são da doença: altas temperatu
r
as, umidade elevada
acompanhada de ven
t
os fo
r
tes e novas b
r
o
t
ações nos poma
r
es.
8
A
s p
r
ecipitações elevadas e aumento da tempe
r
atu
r
anoin
í
cio da estação de
maio
r
flu
x
o de c
r
escimento são fato
r
es fa
v
o
r
áveis ao desenvolvimento epidêmico de
canc
r
o c
í
t
r
ico. Isso provavelmen
t
ees
t
á
r
elacionado ao fato de que em condições de
alta umidade as lesões de canc
r
oe
x
sudam mais células bacte
r
ianas na supe
r
f
í
cie
afe
t
ada (Leite Junio
r
et al., 1987).
A
lém disso, as células bac
t
e
r
ianas são mantidas
ativas po
r
mais
t
empo quando a umidade do a
r
é elevada, aumentando com isso a
viabilidade e conseqüentemente a amplitude de dispe
r
são do inóculo (
K
oizumi et
al.,1996).
Em p
r
ecipitações acompanhadas de fo
r
tes ventos, um filme de água é
fo
r
mado desde o filoplano a
t
é as células do mesófilo, passando po
r
ent
r
e as células
estomáticas. Nes
t
a condição, lesões novas e
x
sudam células bac
t
e
r
ianas
imediatamente, chegando a liberar de 10
4
a 10
5
unidades formadoras de colônias
(UFC/mL). Em lesões mais velhas e sube
r
izadas, a libe
r
ação da Xac ocor
r
e mais
lentamente.
3.3.
2
In
f
ec
ç
ão
A
Xac
t
em capacidade de infec
t
ar folhas,
r
amos e f
r
u
t
os.
A
penet
r
ação e
infecção se dão at
r
avés de abe
r
t
u
r
as natu
r
ais (p
r
incipalmente estômatos), ou po
r
ação mecânica com fe
r
imentos causados po
r
espinhos, g
r
ão de a
r
eia, pelo homem
ou por insetos (Fundecit
r
us, 2006).
A
s faces aba
x
iais das folhas são mais
suscetíveis que as faces ada
x
iais, em
r
azão da maior densidade de estômatos
p
r
esen
t
es (G
r
ahm et al., 1992).
Fato
r
es climáticos como tempe
r
atu
r
aeumidadee
x
e
r
cem impo
r
t
ante papel
no sucesso da infecção.
A
du
r
ação do molhamento e o p
r
óp
r
io filme de água sob
r
ea
folha influenciam na capacidade da bacté
r
ia ganha
r
acâma
r
a sub-estomática ou um
9
fe
r
imento. Nas folhas, o pe
r
í
odo de e
x
pansão folia
r
é mais suscetível a infecção da
bacté
r
ia Xac do que aquele poste
r
ior à matu
r
ação. Já em frutos, o pe
r
í
odo de
suscetibilidade ocor
r
e ent
r
e 60 a 90 dias após a sua fo
r
mação.
3.3.
3
C
o
l
on
i
z
a
ç
ão
Uma vez no inte
r
io
r
do tecido de cit
r
os, a colonização po
r
Xa
c
rest
r
inge-se
ao s
í
tio de infecção. No in
í
cio da colonização, as células da Xa
c
multiplicam-se no
espaço inte
r
celular envolvidas por mat
r
iz de polissaca
r
í
deos e
x
t
r
acelula
r
.
A
s
p
r
imei
r
as lesões salientes começam apa
r
ecer após 7 a 10 dias, fo
r
madas po
r
hipe
r
trofia e hipe
r
plasia de células do mesofilo folia
r
.
A
s lesões ap
r
esen
t
am colo
r
ação ama
r
elada no in
í
ciodesua formaçãoevão
se to
r
nando de cor mar
r
om e co
r
ticosa ao longo do tempo, ao
r
edor das lesões
podem-se forma
r
halos clo
r
óticos e
/
ou halos aquosos. Quando ocor
r
e uma infecção
via estômato, a lesão se to
r
na mais
r
apidamente visível em ambas as faces da folha
(Figu
r
a 1A, B e C).
10
Figu
r
a 1. Lesões de cant
r
o c
í
t
r
ico causadas por Xac 306 em folhas de
C
.
s
i
nensis, aumento de 1X (
A
), 3X (B), 1X (C).
A
multiplicação da Xac no s
í
tio de colonização ocor
r
e somen
t
e du
r
ante a
fase de e
x
pansão da lesão, com isso, a população de bac
t
é
r
ia produzida po
r
lesão
esta fo
r
temente
r
elacionada ao tamanho da lesão (G
r
ahm et al., 1992).
3.3.4
S
obrevi
v
ên
c
i
a
A
sob
r
evivência de Xa
c
no ambiente pode chega
r
até seis meses em órgãos
infectados, mesmo após a queda dos mesmos. Em ambien
t
eabe
r
t
o, a sob
r
evivência
da bac
t
é
r
ia pode chega
r
po
r
volta de 15 dias em solo e po
r
volta de 62 dias
t
an
t
ono
filoplano quan
t
o em
r
izoplano de algumas gram
í
neas
A
p
r
odução de e
x
opolissaca
r
í
deo pelas bacté
r
ias e
x
sudadas na supe
r
f
í
cie
das lesões possui um impo
r
t
an
t
e papel na dispe
r
são e sob
r
evivência no ambien
t
e
(Goto e H
y
odo, 1985).
A
pe
r
sistência da Xac por
v
á
r
ias semanas em ma
t
e
r
ial de
plan
t
as não hospedei
r
as e na zona de
r
a
í
zes de algumas gram
í
neas embai
x
o de
á
r
vo
r
es doentes foi obse
r
vado no Japão e no B
r
asil (Go
t
o et al., 1975; Pe
r
ei
r
aetal.,
1978).
Em casos de folhas e frutos em decomposição ca
í
dos no chão, à população
de bac
t
é
r
ia declina pa
r
a um nível não detectável em 1-2 meses por sof
r
e
r
inte
r
ferência de bac
t
é
r
ias antagonis
t
as e competição com organismos saprof
í
ticos
(G
r
aham et al., 1989). Em mate
r
iais como metal, plástico, tecido ou madei
r
a, a Xa
c
possui um pe
r
í
odo de sob
r
evivência
r
elativamente cu
r
t
o, podendo chegar até 72
ho
r
as (G
r
aham et al., 2000).
11
3.4 Controle do Cancro C
í
trico
3.4.1
E
rradi
c
a
ç
ão e
E
x
c
l
u
s
ão
Dive
r
sas medidas de cont
r
ole vêm sendo utilizados a fim de
r
eduzir os
p
r
e
j
uízos causados pelo canc
r
o c
í
t
r
ico. Dent
r
e elas des
t
acamos medidas de caráte
r
cu
r
ativo como a er
r
adicação das plantas doentes que causa um g
r
ande p
r
e
j
u
í
zo ao
p
r
odu
t
o
r
(Leite Junio
r
e Moham, 1990) e o t
r
atamento qu
í
mico com pulve
r
ização das
plan
t
as infectadas com p
r
odutos a base de cob
r
e que pode con
t
amina
r
o ambien
t
e
po
r
se
r
um metal pesado (Koizumi, 1985; Leite Junio
r
e Mohan, 1990), e as medidas
de caráte
r
p
r
eventivo: (1) localização de vivei
r
os em locais liv
r
es de canc
r
o c
í
t
r
ico,
(2) poma
r
es mane
j
ados pa
r
a p
r
evenir ou
r
eduzir o
r
isco de epidemias de canc
r
o
c
í
t
r
ico at
r
avés do estabelecimen
t
odequeb
r
a-ventos, (3) const
r
ução de ce
r
cas pa
r
a
r
est
r
ingir o acesso aos poma
r
es; (4) pulve
r
ização de desinfetantes sob
r
e a
maquina
r
ia, equipamentos de colheita dos poma
r
es e t
r
abalhado
r
es, bem como a
desinfecção de suas
r
oupas e calçados; e (5) f
r
u
t
as f
r
escas pa
r
a comé
r
cio in
t
e
r
no e
e
x
po
r
tação são su
j
ei
t
as a uma inspeção
r
igo
r
osa pa
r
a ga
r
antir a isenção dos
sintomas do canc
r
o c
í
t
r
ico em f
r
utas em poma
r
es e tratamen
t
os sanitá
r
ios nas
câma
r
as de armazenagem de f
r
u
t
os.
Inicialmente, essas medidas foram conside
r
adas pa
r
a
t
odas as plantas
c
í
t
r
icas doentes ou não. Pos
t
e
r
io
r
mente, com o estabelecimento de modificações
dos c
r
ité
r
ios de er
r
adicação, somen
t
e as plantas doen
t
es e aquelas ad
j
acentes num
r
aio de até 30 met
r
os passaram a ser eliminadas.
A
utilização de queb
r
a-ventos é uma das p
r
áticas eficien
t
es pa
r
a a
p
r
evenção e cont
r
ole do canc
r
o c
í
t
r
ico. Esta medida cul
t
u
r
al de cont
r
ole promove a
r
edução da ação di
r
eta das cor
r
en
t
es de ar sob
r
e o poma
r
, p
r
opo
r
cionando
condições menos favo
r
áveis pa
r
a a disseminação e penet
r
ação da bactéria no
12
tecido hospedei
r
o. Po
r
conseqüência, promove a
r
edução de fe
r
imentos nos tecidos
da planta, causados pelo vento e ab
r
asão de ae
r
ossóis, que se
r
vem de po
r
ta de
ent
r
ada pa
r
a bacté
r
ias (Leite Junio
r
e Mohan, 1990).
A
lém disso, á
r
eas p
r
otegidas
por queb
r
a-ventos pe
r
dem menor quantidade de água, devido à
r
edução da
evapot
r
anspi
r
ação e, conseqüentemente, favo
r
ecer ao aumen
t
o da p
r
odutividade
dos poma
r
es.
O queb
r
a-vento arbó
r
eo nãodevese
r
uma bar
r
ei
r
a compac
t
a. Es
t
es devem
esta
r
dispostos perpendicularmen
t
eàdi
r
eção dominan
t
edoven
t
o ou em sis
t
emas
de compa
r
timentação, em á
r
eas onde não ocor
r
a di
r
eção p
r
edominante de
incidência do vento.
A
dis
t
ância ent
r
e as linhas de queb
r
a-ventos depende da
topografia do ter
r
eno e da espécie arbó
r
ea utilizada.
A
s espécies utilizadas como queb
r
a-ventos devem
t
e
r
como ca
r
acte
r
í
sticas,
menor competição com as plantas c
í
t
r
icas, c
r
escimento
r
ápido e uniforme, copa
densa,
r
esis
t
ência a p
r
agas e doenças e não serem hospedei
r
as de patógenos que
afe
t
am a cultu
r
a. Ent
r
e as espécies mais
r
ecomendadas estão: a casua
r
ina
(
C
a
s
uar
i
na equ
i
s
eti
f
o
l
i
a e C.
c
unn
i
ngham
i
ana), a g
r
evilha (Grevil
l
ea robu
s
ta), a
leucena (Leu
c
aena
l
eu
c
o
c
epha
l
a), o pinus (P
i
nus
s
p
p.), o sansão-do-campo
(M
i
m
osa
c
ae
s
a
l
p
i
nii
f
ol
i
a), o
j
ambolão (Eu
g
enia
s
p
p.) e o eucalipto (Eu
c
al
y
p
tu
s
s
p
p.)
(Leite Junior e Mohan, 1990).
3.4.
2
C
ontrole
Q
uí
m
i
co
O uso de p
r
odutos à base de cob
r
ecomofo
r
ma de cont
r
ole do canc
r
o é fei
t
o
em
t
odos os pa
í
ses p
r
odu
t
o
r
es de cit
r
os (Koizumi, 1985; Lei
t
e Junior e Mohan,
1990). O cob
r
e reduz a população bacte
r
iana na supe
r
f
í
cie das folhas e aplicações
múltiplas são necessá
r
ias pa
r
a alcançar um cont
r
ole adequado em hospedei
r
os
13
susceptíveis (Stall et al., 1980).
A
pulve
r
ização à base de cob
r
e é efetiva por um
pe
r
í
odo de duas a quat
r
o semanas quando as ta
x
as de formação e c
r
escimen
t
o das
folhas se igualam (G
r
aham et al., 1992; Stall et al., 1982). Os f
r
utos são susceptíveis
confo
r
me
v
ão c
r
escendo de 2-6 mm de diâmet
r
o por um pe
r
í
odo de 60-120 dias,
dependendo da espécie de cit
r
os.
A
eficiência das pulve
r
izações com cob
r
e
depende do seu con
t
ato com a bac
t
é
r
ia na supe
r
f
í
cie da folha. Po
r
isso a ocor
r
ência
de chuvas com ven
t
os pode comprome
t
er a eficiência desses p
r
og
r
amas de
cont
r
ole, visto que nesses casos as bac
t
é
r
ias são int
r
oduzidas di
r
etamente nos
estôma
t
os.
Devido ao uso cont
í
nuo de p
r
odutos à base de cob
r
e pode ocor
r
er o
apa
r
ecimento de cepas de Xac
r
esistentes ao p
r
oduto, o que compromete a
eficiência do cont
r
ole (Rinaldi e Leite Junio
r
, 2000).
A
lém disso, o acúmulo do metal
no solo pode con
t
aminar as plantas, o solo e o meio ambien
t
e(
A
lva et al., 1995).
Í
ons cob
r
e são
r
eque
r
idos pa
r
a a s
í
ntese de me
t
alop
r
o
t
e
í
nas que são, na
sua g
r
ande maio
r
ia, o
x
igenases e p
r
o
t
e
í
nas t
r
anspo
r
t
ado
r
as de elét
r
ons.
A
o mesmo
tempo em que as bacté
r
ias utilizam cob
r
e em bai
x
as concent
r
ações, elas p
r
ecisam
desenvolve
r
um mecanismo de
r
egulação bem apu
r
ado, pois al
t
os níveis de cob
r
e
podem ser tó
x
icos pa
r
a as células.
3.4.
3
C
ontrole B
i
o
l
ó
g
i
c
o
A
s e
x
igências dos consumido
r
es por p
r
odutos ag
r
í
colas liv
r
es de
r
es
í
duos
tó
x
icos e po
r
uma ag
r
icultu
r
a mais cuidadosa como o meio ambiente, ao longo dos
anos,
t
em fei
t
o os ag
r
iculto
r
es buscaram
t
ecnologia cada dia mais limpa pa
r
a a
p
r
odução de alimen
t
os.
A
p
r
essão do me
r
cado
t
em fo
r
çado os go
v
e
r
nos a
estabelecerem novas pol
í
ticas públicas quan
t
o à utilização de ag
r
otó
x
icos no
14
cont
r
ole de fitopatologias (Gullino e Ku
j
ipe
r
s, 1994; Ragsdale e Sisle
r
, 1994). Des
t
a
fo
r
ma, todos os seguimentos envolvidos na cadeia produtiva de p
r
odu
t
os ag
r
í
colas
estão envolvidos na busca de p
r
odutos fitossanitá
r
ios menos tó
x
icos pa
r
a os
consumido
r
es e ao meio ambiente (Pun
j
a e Utkhede, 2003).
Mesmo sendo eficaz no cont
r
ole dos agentes causais, o cont
r
ole de
fi
t
opatógenos at
r
avés da utilização de p
r
odutos qu
í
micos pode ap
r
esen
t
ar efeitos
colate
r
ais ao hospedei
r
o ou níveis de contaminação na cadeia trófica nem semp
r
e
aceitáveis. Estas subs
t
âncias, em alguns casos, podem ap
r
esenta
r
níveis de to
x
idez
elevados, divido ao acúmulo na cadeia t
r
ófica causando doenças muitas vezes
g
r
aves como o cânce
r
(Lima et al. 2000).
A
p
r
ocu
r
a de mic
r
organismos com potencial de uso como agente de cont
r
ole
biológico, ou a ob
t
enção de moléculas com ação antimic
r
obiana produzidas po
r
estes mic
r
organismos, é uma das alternativas pa
r
aocont
r
ole de fi
t
opa
t
ógenos.
A
pós a descobe
r
ta inicial, o isolamento de agentes de cont
r
ole biológico da
fase labo
r
a
t
o
r
ial a
t
é a ob
t
enção do p
r
oduto come
r
cial é uma
t
arefa dif
í
cil. Sendo
necessá
r
io ob
t
er info
r
mações com
r
elação à eficácia, modo de ação do agente, a
sob
r
evivência, colonização e potencial de to
x
icidade pa
r
a espécies não alvo.
A
lém
disso, es
t
udo com
r
elação à fo
r
mulação, estabilidade e vida de p
r
atelei
r
a
t
ambém
são necessá
r
ios (Lumsden, 1996; Math
r
e et al., 1999; Harmam, 2000).
No B
r
asil, cent
r
os de pesquisas, unive
r
sidades e indúst
r
ias vêm
r
ealizando
estudos pa
r
a desenvolve
r
novos p
r
odutos biológicos que pode
r
iam se
r
utilizados no
cont
r
ole de doenças e p
r
agas. Nos p
r
og
r
amas de cont
r
ole biológico de
fi
t
opatógenos, está inclu
í
da a p
r
ática de mane
j
ofavo
r
ecendo antagonistas nativos e
adição de mic
r
organismos p
r
eviamente estudados (Melo, 1998).
15
O sucesso nos p
r
og
r
amas está
r
elacionado com as prop
r
iedades
antagônicas e mecanismo de ação do organismo como, po
r
e
x
emplo, a inibição de
fi
t
opatógenos po
r
meio da competição po
r
nut
r
ientes, o
x
igênio e espaço, pa
r
asitismo
di
r
eto ou p
r
odução de me
t
abóli
t
os secundá
r
ios que deg
r
adam a pa
r
ede celula
r
como
enzimas l
í
ticas e biosu
r
fac
t
an
t
es.
A
lém disso, vá
r
ias espécies de bacté
r
ias,
p
r
incipalmen
t
e P
s
eudomona
s
e
S
trepto
m
yc
e
s
,p
r
oduzem vá
r
ios tipos de antibióticos,
os quais podem ser utilizados também pela indúst
r
ia farmacêutica (Gomes et al.,
2000).
Muitos pesquisado
r
es vêm t
r
abalhando na á
r
ea de biocont
r
ole, ent
r
etanto,
poucos produtos biológicos foram int
r
oduzidos no me
r
cado. O sucesso do cont
r
ole
biológico em condições de campo está
r
elacionado ao melho
r
entendimen
t
o sob
r
ea
ecologia dos agen
t
es antagonis
t
as e do patógeno.
É
necessá
r
io o conhecimen
t
o
sob
r
e espect
r
o de ação, produção de antibióticos,
r
esistência a fato
r
es ambien
t
ais
est
r
essantes e ins
t
abilidade genética dos agentes de biocont
r
ole (Melo, 1998).
O cont
r
ole biológico possui dife
r
en
t
es mecanismos de inte
r
ação ent
r
e os
mic
r
organismos pa
t
ogênicos e an
t
agônicos: (1) antibiose: inte
r
ação onde um ou
mais metabólitos p
r
oduzidos por um organismo tem ação danosa sob
r
e outro; (2)
competição: ocor
r
e quando dois ou mais organismos concor
r
em ent
r
esi,
p
r
incipalmen
t
e por nut
r
ientes, o
x
igênio e espaço; (3) pa
r
asitismo: quando um
mic
r
oorganismo vive sob
r
e e/ou alimenta-se de out
r
o; (4) predação: situação onde
um mic
r
organismo ob
t
ém seus nut
r
ientes a pa
r
ti
r
do patógeno; (5) hipovi
r
ulência: diz
r
espeito à introdução de uma linhagem menos ag
r
essiva ou não pa
t
ogênica
compa
r
ada ao patógeno, a qual pode, ainda que
r
aramente, t
r
ansmitir es
t
a
ca
r
acte
r
í
stica às linhagens pa
t
ogênicas; (6) indução de defesa do hospedei
r
o: ação
16
di
r
ecionada ao hospedei
r
o por meio dos p
r
óp
r
ios organismos ou seus metabólitos
(Baker 1985; Bettiol e Ghini 1995).
A
s subs
t
âncias eliminadas pelas bac
t
é
r
ias na competição por um nicho
podem ser metabóli
t
os secundá
r
ios com ação antibiótica que em meio de
c
r
escimento, começam a se
r
produzidos no fim da fase de c
r
escimento e
x
ponencial.
Esses p
r
odutos não são essenciais pa
r
a o c
r
escimen
t
o e
r
ep
r
odução dos
mic
r
organismos que os p
r
oduzem. No entanto, em te
r
mos competitivos, os
mic
r
organismos produto
r
es de antibióticos são favo
r
ecidos em
r
elação aos não
p
r
odu
t
o
r
es. Esses tipos de subs
t
âncias químicas ma
t
am ou inibem o c
r
escimento de
out
r
as espécies microbianas, mesmo em pequenas quantidades.
3. REFER
Ê
NCIAS BIBLIOGR
Á
FIC
A
S
A
LVA,
A
. K., GR
A
H
A
M, J. H.,
A
NDERSON, C.
A
. 1995. Soil pH and coppe
r
effec
t
s
on
y
oung ‘Hamlin’ o
r
ange t
r
ees. Soil Sci. Soc.
A
m. J., 59, p. 481-487.
BAKER, C. J., ST
A
VELY, J. R., MOCK, N. 1985. Biocont
r
ol of bean
r
ust by Bacil
l
u
s
s
ubtili
s
unde
r
field conditions. Plant Disease, 69, p. 770-772.
BERG
A
MIN FILHO,
A
., GOTTW
A
LD, T. R., LAR
A
NJEIR
A
, F. F. 2001. Spatial
dist
r
ibution of cit
r
us canke
r
in São Paulo
–
B
r
azil. In: Inte
r
national Wo
r
kshop on
Plant Disease Epidemiolog
y
, 8, 2001, Ou
r
o P
r
e
t
o. Ou
r
o P
r
e
t
o: International
Society of Plant Pa
t
holog
y
, p. 28-29.
17
BETTIOL, W., GHINI, R. 1995. Cont
r
ole Biológico. In: Bergamin Filho,
A
., Kimati H. e
A
mo
r
in, L. eds. Manual de Fitopa
t
ologia. Volume 1: P
r
incipios e Concei
t
os. 3 ed.
São Paulo: Ag
r
onômica Ce
r
es, p. 717-728,
BITANCOURT,
A
.
A
. 1957. O canc
r
oc
í
t
r
ico. O Biológico 23: 101-111.
BR
A
ITHW
A
IT, M., LEITE J
r
, R. P. SMITH, J. J., BO
A
,E.,S
A
DDLER, G. S. 2002.
Fi
r
st
r
epo
r
t of cit
r
us canke
r
caused by Xanthomona
s
c
a
m
p
estri
s
pv. citr
i
on Citru
s
s
i
nensi
s
in Bolívia. Plant Patholog
y
, 51, p. 383.
BRUNINGS,
A
.M., and G
A
BRIEL, D.W. 2003. Xantho
m
onas citr
i
: b
r
eaking the
su
r
face. Molecular Plant Patholog
y
, 4: 141-157.
D
A
SILV
A
,
A
.C.R., FERRO, J.
A
., REIN
A
CH, F. C., F
A
R
A
H, C. S., FURLAN, L. R.,
QU
A
GGIO, R. B., MONTEIRO-VITORELLO, C. B., V
A
NSLUYS, M.
A
., ALMEID
A
,
N. F.,
A
LVES, L. M. C.,
A
M
A
R
A
L,
A
. M., BERTOLINI, M. C., C
A
M
A
RGO, L. E.
A
.,
C
A
M
A
ROTTE, G., C
A
NN
A
VAN, F., C
A
RDOZO, J., CH
A
MBERGO, F., CLAPIN
A
,
L.P., CIC
A
RELLI, R. M. B., COUTINHO, L.L., CURSINO-SANTOS, J. R., EL-
DORRY, H., F
A
RI
A
, J. B., FERREIR
A
,
A
.J.S.,FERRERI
A
, R. C. C., FERRO, M.
I. T., FORMIGHIERI, E. F., FR
A
NCO, M. C., GREGGIO, C. C., GRUBER,
A
.,
K
A
TSUY
A
M
A
,
A
. M., KISHI, L.T., LEITE R. P. JR., LEMOS, E. G. M., LEMOS,
M.V. F., LOC
A
LI, E. C., M
A
CH
A
DO, M.
A
., M
A
DEIR
A
,
A
. M. B. N., M
A
RTINEZ-
ROSSI, N. M., M
A
R
TINS, E. C., MEID
A
NIS, J., MENCK, C. F. M., MIY
A
KI, C. Y.,
MOON, D. H., MOREIR
A
, L. M., NOVO, M. T. M., O
K
UR
A
, V. K., OLIVEIR
A
,M.
C., OLIVEIR
A
, V. R., PEREIR
A
, H.
A
., ROSSI,
A
., SEN
A
, J.
A
. D., SILV
A
, C.,
18
SOUZA, R. F., SPINOLA, L.
A
.F.,T
A
KIT
A
,M.
A
., T
A
MUR
A
, R. E., TEI
X
EIR
A
,E.
C., TEZZ
A
, R. I. D., SANTOS, M. T., TRUFFI, D., TSAI, S. M., WHITE, F. F.,
SET
Ú
BAL, J. C.,
K
IT
A
JIM
A
, J. P. 2002. Compa
r
ison of the genomes of two
Xanthomona
s
pathogens with diffe
r
ent host specifics. Na
t
u
r
e 417, 459-463.
DOPSON, R. N. 1964. The e
r
adication of cit
r
us canke
r
. Plant Disease Repo
r
te
r
,v.
48, p.30-31.
ESTEVES, B. B
r
asil decif
r
a genoma de novo fi
t
opatógeno. Ciência Ho
j
e. 2001.
Disponível em:
http://cienciaho
j
e.uol.com.b
r
/
cont
r
olPanel
/
ma
t
e
r
ia/view/2697.
A
cesso em: 20/11
/
2007
F
A
O., 2006. Food and
A
g
r
icultu
r
e Organization of the United Nations.Cit
r
us:
statistics f
r
uit f
r
esh and p
r
ocessed annual. Capturado em 10 feve
r
ei
r
o 2008. on
line. Disponível em:
ht
t
p://www.fao.org.
F
A
WCETT, H. S.; JENKINS,
A
. E. 1933.
R
eco
r
ds of cit
r
us can
k
er from herba
r
ium
specimens of the genus cit
r
us in England and
t
he United S
t
ates. Ph
y
topa
t
holog
y
.
St. Paul, v. 23, p. 820-824.
FEICHTENBERGER, E. 1997. Mane
j
o ecológico das p
r
incipais doenças fúngicas e
bacte
r
ianas dos citros no B
r
asil.
A
nais do Quinto Seminá
r
io Inte
r
nacional de
Cit
r
os
–
T
r
atos Culturais. Bebedou
r
o: Fundação Cargil, p. 23-65.
19
FUNDECITRUS. Canc
r
o C
í
t
r
ico. http://www.fundecit
r
us.com.b
r
/
canc
r
o.h
t
ml (Janei
r
o.
2008).
GOMES, R. C., S
Ê
MEDO, L. T.
A
.S,SO
A
RES, R. M.
A
., LINH
A
R
ES, R. F., ULHO
A
,
C. J.,
A
LVI
A
NO, C. S., COELHO,.R. R. R. 2000. Pu
r
ification of themos
t
able
endochitinase f
r
om Strept
m
y
c
es RC 1071 isolated from a cer
r
ado soil and its
antagonism against ph
y
topathogenic fungi. Jou
r
nal of
A
pplied Mic
r
obiolog
y
, 90, p.
653-661.
GOTO, M., HYODO, H. 1985. Role of e
x
t
r
acelula
r
pol
y
saccha
r
ides of Xanthomona
s
c
a
m
p
estris pv. citr
i
in the ea
r
ly stage of infection.
A
nn. Ph
y
topathol. Soc. Japan,
51, p. 22-31.
GOTO, M., OHT
A
, K., O
K
A
BE, N. 1975. S
t
udies on saproph
y
tic su
r
vival of
Xanthomonas citri (Hasse) Dowson. 2. Longevity and su
r
vival density of
t
he
bacte
r
ium on a
r
tificially infested weeds, plant
r
eidues and soils.
A
nn. Ph
y
topathol.
Soc. Japan, 41, p. 141-147.
GOT
T
W
A
LD, T.R.; GR
A
H
A
M, J.H.; SHUBERT, T.S. 2002. Cit
r
us canke
r
: The
pathogen and its impact. Plant He
r
t
h P
r
og
r
ess, St. Paul. DOI: 10.1094/PHP
–
2002
–
0812-01-RV.
GR
A
H
A
M, J. H., GOTTW
A
LD, T. R., CIVEROLO, E. L., McGUIRE, R. G. 1989.
Population d
y
namics and su
r
vival of Xantho
m
onas
c
am
p
estris pv. citri in soil in
cit
r
us nu
r
se
r
ies in Ma
r
y
land and
A
rgentina. Plant Disease, 73, p. 423-427.
20
GR
A
H
A
M, J. H.; GOT
T
W
A
LD, T. R.; RILEY, T. D.;
A
CHOR, D. 1992. Penetration
th
r
ough leaf stoma
t
o and st
r
ains of Xanthomonas
c
am
p
estris in cit
r
us cultiva
r
s
va
r
y
ing in susceptibility to bacte
r
ial diseases. Ph
y
topatholog
y
, v. 82, n. 11, p.
1319-1325.
GR
A
H
A
M. J. H., GOT
T
W
A
LD, T. R., RILEY, T. D., CUBERO, J., DROUILLARD, D.
2000. L. Su
r
vival of Xanthomonas
c
a
m
p
estris pv.
c
itri on va
r
ious su
r
faces and
chemical cont
r
ol of
A
siatic cit
r
us canke
r
. P
r
oceedings of
t
he Inte
r
national Cit
r
us
Canker Resea
r
ch Wo
r
kshop, Ft. Pie
r
ce, Flo
r
ida. http://doacs.sta
t
e.fl.us/canke
r
.
GULLINO, M. L., KUIJPERS, L.
A
. M. 1994. Social and political implications o
f
managing plant diseases with
r
est
r
icted fungicides Eu
r
ope.
A
nnual Review o
f
Ph
y
topa
t
holog
y
, 32, p. 559-579.
H
A
RM
A
N, G. E. 2000. M
y
ths and dogmas of biocont
r
ol changes in pe
r
ceptions
de
r
ived from
r
esea
r
ch on Tri
c
hoder
m
a har
z
i
anum T-22. Plant Disease, 84, p. 377-
393.
H
A
SSE, C. H. 1915. Pseudomonas cit
r
i,thecauseof cit
r
us can
k
e
r
. Journal of the
A
g
r
icultu
r
al Resea
r
ch, 4: 96-100.
KOIZUMI, M. 1985. Cit
r
us canke
r
: The Wo
r
ld Si
t
uation. In: Cit
r
us Canke
r
: an
International Pe
r
spective, p. 2-7. Lake
A
lf
r
ed, Fl: Cit
r
us Resea
r
ch & Education
Cente
r
, Unive
r
sity of Flo
r
ida.
21
KOIZUMI, S., KIJIM
A
, E., TSUKAMOTO, T., TOG
A
W
A
, M., M
A
SUI, S. 1996.
Dispe
r
sal of cit
r
us canke
r
bacté
r
ia in droplets and p
r
evention with windb
r
eaks. In:
International Cit
r
us Cong
r
ess, 1996, Sun Cit
y
.Rive
r
side: Inte
r
national Society of
Cit
r
icultu
r
e, 1, p. 340-344.
LEITE J
r
., R. P., MOH
A
M, S. K., PEREI
R
A
,
A
. L. G., C
A
MP
A
CCI, C.
A
. 1987.
Cont
r
ole integ
r
ado do canc
r
o c
í
t
r
ico: efeito da
r
esistência genética e da aplicação
de bacte
r
icidas. Fitopatologia B
r
asilei
r
a, 12, p. 257-263.
LEITE JUNIOR., R. P e MOH
A
M, S. K. 1990. Integ
r
ated management of the cit
r
us
bacte
r
ial canke
r
disease caused by Xanthomona
s
c
am
p
estri
s
pv. citr
i
in the S
t
a
t
e
of Pa
r
aná. G
r
op P
r
o
t
ection, 9: 3-7.
LIM
A
, L. H. C., M
A
RCO, J. L., FELI
X
,C.R.,2000.Enzimashid
r
ol
í
ticas envolvidas no
cont
r
ole biológico po
r
micopa
r
asitismo. In: Melo I. S., Azevedo, J. L (Ed.). Cont
r
ole
Biológico. Jagua
r
iúna: EMBR
A
P
A
Meio
A
mbiente, 2, p. 263-304.
LUMSDEM, R. D. 1996. Development of Gliocladium vi
r
ens fo
r
damping-off disease
cont
r
ol. Canadian Jou
r
nal of Plant Pathology, 18, p. 463-468.
M
A
THRE, D. E., COOK, R. J., C
A
LLAN, N. W. 1999. F
r
om discove
r
y to use
–
t
r
ave
r
sing the wo
r
ld of comme
r
cializing biocont
r
ol agents fo
r
plant disease cont
r
ol.
Plant Disease, 83, p. 972-983.
22
MELO, I. S. 1998.
A
gentes mic
r
obianos de cont
r
ole de fungos fi
t
opa
t
ogênicos. In:
MELO I. S.,
A
ZEVEDO, J. L. Cont
r
ole Biológico. Jagua
r
iúna: EMBR
A
PA, p. 17-67.
MOH
A
MM
A
DI, M., MIRZ
A
EE, M. R., R
A
HIMI
A
N, H. 2001. Phisiological and
biological cha
r
ac
t
e
r
istics of I
r
anian st
r
ains of Xanthomonas a
x
ano
p
odis pv. citr
i
,
the causal agent of cit
r
us bacte
r
ial canker disease. J. Ph
y
topa
t
hol., 149, p. 65-75.
N
A
SCIMENTO, J. F.; RODRIGUES NETO, J.;
A
LVES, J. M.
A
.; R
Ê
GO, M. M.;
A
R
A
Ú
JO,
A
. E. S. 2003. Ocor
r
ência de canc
r
o c
í
t
r
ico no Estado de Ro
r
aima.
Summa Ph
y
topathologica. Bo
t
uca
t
u, v. 29, p. 81-82.
PEREIR
A
,
A
. L., W
A
T
A
N
A
BE, K., Z
A
G
A
TTO,
A
. G., CI
A
NCIULLI, P. L. 1978.
Su
r
vival of Xanthomona
s
citr
i
(Hasse) Dowson, the causal agent os cit
r
us canke
r
in the
r
izosphe
r
e of guineag
r
ass (Pani
c
um ma
xi
mum Jacq.) Biologico, 44, p. 135-
138.
PUNJ
A
, Z. K., UTKHEDE, R. S. 2003. Using fungi and
y
easts
t
o manage vegetable
c
r
op diseases. Trends in Biotechnolog
y
, 21, p. 400-407.
R
A
GSD
A
LE, N. N., SISLER, H. D. 1994. Social and political implications o
f
managing plant diseases with dec
r
eased availability of fungicides in the United
States.
A
nnual Review of Plant Ph
y
topatholog
y
, 32, p. 545-557.
ROSSETTI, V. 1977. Cit
r
us canke
r
in Latina
A
mé
r
ica:
A
r
eview. P
r
oceedings of
t
he
International Society of Cit
r
icultu
r
e, 3: 918-924.
23
RIN
A
LDI, D. A. M. F., LEITE JUNIOR., R. P. 2000. Xanthomona
s
a
x
ono
p
odi
s
pv. citr
i
population to
t
he p
r
esence of coppe
r
compounds in na
t
u
r
e. P
r
oc. Int. Soc. Cit
r
ic.,
2, p. 1064.
SCHUBERT, T.S., e SUN,
X
. 1996. (fifth
r
evision Janua
r
y 2003). Bacte
r
ial citrus
canke
r
. Plant Pa
t
hology Ci
r
cular 377. Flo
r
ida Depa
r
tment of
A
g
r
icultu
r
e &
Conse
r
vation Se
r
vices. Division of Plant Indust
r
y
.
SH
A
AD, N. W., POSTNIKOVA, E., L
A
CY, G. H., SECHLER,
A
.,
A
G
A
RKOVA, I.,
STROMBERG, P. E., STROMBERG, V. K., VID
A
VER,
A
. K. 2005.
Reclassifications of Xantho
m
ona
s
c
a
m
p
estri
s
pv citr
i
(ex Hasse 1915) D
y
e 1978
fo
r
ms
A
, B/C/D, and E as X.
s
mithii subsp. citri (ex Hasse) sp. nov. nom.
r
ev.
comb. nov., X.
f
us
c
ans subsp. aurant
i
f
olii (ex Gab
r
iel 1989) sp. nov. nom. ve
r
.
Comb. no
v
., and X. al
f
alfa subsp. citru
m
elo (ex Riker and Jones) Gab
r
iel et al.,
1989 sp. nov. nom.
r
ev. comb. nov., X.
c
am
p
estris pv.
m
al
v
a
c
earum (ex Smith
1901) D
y
e 1978 as X.
s
m
ithii subsp.
s
m
i
thii nov. comb. nov. nom. nov., X.
c
a
m
p
estris pv. al
f
alfa (ex Rike
r
and Jones, 1935) D
y
e 1978 as X. al
f
alfa subsp.
al
f
alfa (ex Riker at al., 1935) sp. nov. nom.
r
ev., and “va
r
.
f
us
c
an
s
” of X.
c
a
m
p
e
s
t
r
is pv.
p
ha
s
eol
i
(ex Smith, 1987) D
y
e 1978 as X.
f
us
c
an
s
subsp.
f
us
c
an
s
sp. nov. S
y
stematic and
A
pplied Mic
r
obiolog
y
, Stuttga
r
t, v. 28, p. 494-518.
SH
A
AD, N. W., VID
A
VER,
A
. K., LACY, G. H., RUDOLPH, K., JONES, J. B. 2000.
Evaluation of p
r
oposed amended names of seve
r
al P
s
eudomonad
s
an
24
Xanthomonad
s
and recommendations. Phytopatolog
y
, St. Paul, v. 90, n. 3, p. 208-
213.
ST
A
LL, R. E., MILLE
R
, J. W., M
A
RCO,G.M.eC
A
NTEROS de ECHENIQUE, B. I.
1982. Timing of sp
r
a
y
s to cont
r
ol canc
r
osis of g
r
apef
r
uit in
A
rgentina.
P
r
oceedingas of In
t
ernational Society of Cit
r
icultu
r
e, 1, p. 414-417.
ST
A
LL, R. E., MILLER, J. W., M
A
RCO, G. M., C
A
NTEROS de ECHENIQUE, B. I.
1980. Population d
y
namics of Xantho
m
onas citri causing canc
r
osis of cit
r
us in
A
rgentina. P
r
oc. Fl. S
t
ate Ho
r
t. Soc., 93, p. 10-14.
VAUTERIN, L., HOSTE, B.,
K
ERSTERS, K., SWINGS. J. 1995. Reclassification of
Xanthomonas. In
t
e
r
bational Journal of S
y
stematic Bacte
r
iolog
y
, Washington, v.
45, p. 472-489.
VERNI
È
RE, C. J., H
A
RTUNG, J. S., PRUVOST, O. P., CIVEROLO, E. L.,
A
LVAREZ,
A
. M., M
A
ESTRI, P. LUISETTI, J. 1998. Cha
r
acte
r
ization of phenot
y
pically distinct
st
r
ains of Xanthomonas a
x
anopodis pv. citri f
r
om Sou
t
hwest
A
sia. Eu
r
. J. Plant
Pathol., 104, p. 477-487.
25
A
valiação da ati
v
idade antibiótica de compostos ext
r
acelula
r
es bacteriano no cont
r
ole
de
X
anthomonas a
x
onopod
i
s p
v
.
c
i
tri cepa 306
Admilton Gonçalves de Oliveira Júnior
a
, Letícia Sayuri Murate
a
, Laura Priscila Toledo
Bernalª, Marcio Ferreira Cruz
a
, Marco Antonio Nogueira
a
, João Carlos Palazzo de Mello
b
,
Carlos Mitihiko Nozawa
c
, Galdino Andrade
a
.
a
Laboratório de Ecologia Microbiana, Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual
de Lond
r
ina, Cai
x
a Postal 6001, Lond
r
ina, PR, 86051-990. B
r
asil.
b
Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade
Estadual de Ma
r
ingá, PR. B
r
asil.
c
Laboratório de Virologia, Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de
Lond
r
ina, PR, B
r
asil.
26
R
esumo
O Canc
r
o c
í
t
r
ico causado pela Xanthomonas a
x
onopodis p
v
. citri (Xac) é conside
r
ado
um dos maio
r
es p
r
oblemas
f
itossanitá
r
ios e econômicos pa
r
aci
t
r
icultu
r
a mundial.
A
tualmente,
a
f
o
r
ma mais utilizada de cont
r
ole é a e
r
r
adicação das plantas doen
t
es e
/
ou pul
v
e
r
ização com
p
r
odutos a base de cob
r
e.
A
obtenção de no
v
os p
r
odutos pa
r
acon
t
r
ole do canc
r
o c
í
t
r
ico é
necessá
r
ia, uma
v
ez que as
f
o
r
mas atuais de cont
r
ole não atuam e
f
etivamente na doença e
podem con
t
amina
r
o ambiente pelo uso de metal pesado. Es
t
e
t
r
abalho te
v
e como ob
j
eti
v
o
a
v
alia
r
a ação antibiótica de composto p
r
oduzido po
r
um isolado de Pseudomonas sp (cepa
LV) no c
r
escimen
t
o da Xac 306 in
v
itro,ena
f
ormação de lesões de canc
r
o c
í
t
r
ico em
f
olha de
Citrus sinensis cv. Valência. A cepa LV foi cultivada em caldo nutriente + CuCl
2
. 2H
2
O (100
mg L
-1
) por 15 dias (28 °C, 100 rpm) em seguida centrifugada (9.000 rpm, 20 min, 4°C),
sendo o sob
r
enadante t
r
atado com diclo
r
ometano por pa
r
tição l
í
quido-l
í
quido, concent
r
ado
em
r
ota
v
apo
r
a 45°C, congelado em nit
r
ogênio l
í
quido e lio
f
ilizado.
A
f
ase diclo
r
ometano
(FD) obtida,
f
oi f
r
acionada por c
r
omatog
r
a
f
ia l
í
quida a
v
ácuo (CLV) utilizando seis sol
v
entes
com pola
r
idade c
r
escente. Foi testada a ação antibiótica da FD e das f
r
ações obtidas na
CLV cont
r
a a Xac cepa 306 at
r
a
v
és da técnica de di
f
usão em ága
r
,edete
r
minada à
concent
r
ação inibitó
r
ia m
í
nima em placas de cultu
r
a de 24 poços onde a FD e a f
r
ação F3
ti
v
e
r
am maio
r
e
f
eito antibiótico.
A
s plantas
f
o
r
am t
r
atadas com a FD e com a f
r
ação F3 que
ap
r
esentou maio
r
ação in
v
itro. Os
r
esultados most
r
a
r
am que oco
r
r
eu a diminuição da
p
r
esença de lesão em ce
r
ca de 80% e 94% nas plantas t
r
atadas com FD e F3
r
especti
v
amente. Estes
r
esultados indicam que o uso de substâncias com ação antibiótica
pode se
r
uma excelente
f
e
r
r
amenta pa
r
aocon
t
r
ole da Xac.
Pala
v
ras
-
cha
v
e: Ci
t
r
icultu
r
a, Fi
t
opatógeno, Canc
r
oc
í
t
r
ico; Con
t
r
ole biológico, antibiose,
Xanthomonas a
x
ono
p
odis p
v
. citri
27
1 Int
r
odução
O B
r
asil é o maior p
r
odutor mundial de cit
r
os, com uma p
r
odução de
ap
r
o
x
imadamente 19 milhões de toneladas de f
r
utas ano (F
A
O, 2006), sendo a cit
r
icultu
r
a
uma das ati
v
idades mais impo
r
tantes do ag
r
onegócio. Contudo, o canc
r
o c
í
t
r
ico é
conside
r
ado uma doença potencialmente g
r
a
v
epa
r
adi
v
e
r
sas
r
egiões p
r
oduto
r
as de cit
r
os
no mundo (Gottwald et al., 2002; Kimati e Be
r
gamin Filho, 1995; Leite Júnio
r
et al., 1988;
Stall e Ci
v
e
r
olo, 1991; Stall e Se
y
mou
r
, 1983) pois t
r
ata-se de uma doença sé
r
ia, que ataca
a maio
r
ia das culti
v
a
r
es come
r
ciais e o seu cont
r
ole é limitado.
O mais antigo
r
elato data de 1827 e 1831 (Fawcett e Jenkins, 1933) sendo
obse
r
v
ado em
f
olhas de Citrus medica p
r
o
v
enientes da
Í
ndia. Foi desc
r
ita p
r
imei
r
amente po
r
Hasse em 1915 nos EU
A
, e no B
r
asil na década de 50 (Bitancou
r
t, 1957).
Cinco tipos di
f
e
r
entes de canc
r
oc
í
t
r
ico
f
o
r
am ag
r
upados em
f
unção da
sintomatologia ap
r
esentada e os di
f
e
r
entes hospedei
r
os a
f
etados:
A
,B,C, D e E,
(Feichtenbe
r
ge
r
, 1997; Gab
r
iel et al., 1989). O tipo
A
,oucanc
r
oc
í
t
r
ico asiático, é o p
r
incipal
e mais se
v
e
r
o tipo p
r
esente nos poma
r
es, sendo causado pela Xanthomonas axonopodis
p
v
. citri (Xac), bastonete ae
r
óbio, G
r
am negati
v
o, monot
r
í
quio.
A
Xac pode in
f
ectar toda
parte aé
r
ea da planta, causando sintomas ca
r
acte
r
í
sticos podendo
v
a
r
ia
r
em
f
unção do tipo
e idade do ó
r
gão a
f
etado.
Di
v
e
r
sas medidas de cont
r
ole
v
êm sendo utilizados a
f
im de
r
eduzi
r
os p
r
e
j
uízos
causados pelo canc
r
oc
í
t
r
ico. Dent
r
e elas destacamos a e
r
r
adicação das plantas doentes
(Leite Junio
r
e Moham, 1990) e o t
r
atamento qu
í
mico com pul
v
e
r
ização das plantas
in
f
ectadas, com p
r
odutos a base de cob
r
e(
K
oizumi, 1985; Leite Junio
r
e Mohan, 1990).
Out
r
a est
r
atégia que pode ser utilizada no cont
r
ole do canc
r
oc
í
t
r
ico é o cont
r
ole
utilizando metabólitos bacte
r
ianos com ação antibiótica, p
r
oduzidos a pa
r
ti
r
de bacté
r
ias
antagonistas, p
r
odutos
j
á utilizados com sucesso em out
r
as cultu
r
as (Kloeppe
r
et al., 1999).
Estes mic
r
o
r
ganismos competem ent
r
esi inter eint
r
a-especi
f
icamente dent
r
o dos nichos
28
nos quais
v
i
v
em, sendo uma das
f
o
r
mas de adqui
r
i
r
em maior competiti
v
idade (
A
nd
r
ade,
2004).
Este t
r
abalho te
v
e como ob
j
eti
v
oa
v
alia
r
a ação antibiótica de composto p
r
oduzido
po
r
um isolado de Pseudomonas sp (cepa LV) no c
r
escimento da Xac 306 in
v
itro, e na
f
o
r
mação de lesões de canc
r
o c
í
t
r
ico em
f
olha de Citrus sinensis c
v
. Valência.
2 Mate
r
ial e Métodos
2
.1 Cepas de bactérias
A
cepa patogênica tipo utilizada
f
oi a Xac 306, a mesma que te
v
e o seu genoma
sequenciado (Da Sil
v
a et al., 2002), gentilmente cedida pelo D
r
. Rui Pe
r
ei
r
a Leite Junio
r
,
I
A
PAR, Lond
r
ina,PR.
A
cepa LV, (Pseudomonas sp) isolada a pa
r
ti
r
de lesão de canc
r
o
c
í
t
r
ico de f
r
uto p
r
o
v
eniente de um pomar com alto
í
ndice de ocor
r
ência da doença
(Rampazo, 2004). Pa
r
a a p
r
ese
r
v
ação das cepas, culti
v
ojo
v
ens
f
o
r
am c
r
iop
r
ese
r
v
ados em
solução de glice
r
ol 20% (
v
:
v
) a -20°C.
2
.
2
Produção e e
x
tração das substâncias antibióticas
O inóculo utilizado pa
r
a a p
r
odução de metabólitos
f
oi obtido a pa
r
ti
r
de cultu
r
ada
8
-1
cepa LV na
f
ase log com 10 UFC mL
(
D
.
O
.
=
0
.
9
,
λ
=
590
n
m
)
,
se
ndo
r
e
t
i
r
ada
u
m
a
a
l
í
quota
de 150 µL desta suspensão e inoculada em 1.5 L de caldo nutriente (CN) + 100 mg.L
-1
CuCl
2
. 2H
2
O, e incubada no escuro a 28ºC por 15 dias a 100 rpm em agitador horizontal. Após o
culti
v
o, as células
f
o
r
am peletizadas po
r
cent
r
i
f
ugação (9.000
r
pm 20 min, 4ºC). O
sob
r
enadante li
v
r
e de células
f
oi t
r
atado com diclo
r
ometano na
r
azão 1:1 (
v
:
v
) po
r
partição
l
í
quido-l
í
quido em
f
unil de sepa
r
ação de 2000 mL, em al
í
quotas de 500 mL do sob
r
enadante
e do sol
v
ente. Pa
r
a cada sepa
r
ação, este p
r
ocedimento
f
oi
r
epetido 15
v
ezes, dei
x
ando em
r
epouso po
r
15 min cada.
A
f
ase diclo
r
ometano (FD) obtida na partição
f
oi concent
r
ada em
29
r
ota
v
apo
r
de 10 L a 45°C, em seguida, congelada em nit
r
ogênio l
í
quido e lio
f
ilizada po
r
24 h,
sendo obtido ap
r
o
x
imadamente 0.5 g da FD pa
r
a cada 15 L de sob
r
enadante.
2
.3
T
este de sensibilidade da Xac 306 ao cloreto de cobre
De
v
ido à sensibilidade da Xac a determinadas concent
r
ações de cob
r
e (Ma
r
co e
Stall, 1983) e a utilização de clo
r
eto de cob
r
enomeiodecultu
r
a da cepa LV,
f
oi a
v
aliado a
sensibilidade da Xac 306 ao clo
r
eto de cob
r
e a partir de uma cu
r
v
adeconcent
r
ação (0, 5,
10, 25, 50 e 100 µg.mL
-1
) adicionadas em AN em placa de Petri com três repetições para
cada concent
r
ação (6 x 3, n=18) e a Xac 306 sem clo
r
eto de cob
r
e como cont
r
ole positi
v
o.
Foi utilizado como inóculo uma suspensão da Xac 306 de 10
12
UFC mL
-1
(
D
.
O
.
=
1
.
0
,
λ=
590
nm) em solução salina 0.85% esté
r
il.
A
splacasdePet
r
i
f
o
r
am inoculadas com uma
suspensão de 20 µL desta suspensão na superfície e incubadas a 28 ºC 48 h
-1
. Os
r
esultados
f
o
r
am conside
r
ados como sens
í
v
el (-) quando não hou
v
ec
r
escimento e
r
esistente (+) quando hou
v
e c
r
escimento.
2
.4 Quantificação do resíduo de cobre remanescente na fase diclorometano
O
r
es
í
duo
r
emanescente de cob
r
e
f
oi dete
r
minado a partir de dissolução de 2 g da
FD em água e leitu
r
a di
r
eta em espect
r
omet
r
ia de emissão atômica com
f
onte de plasma
induti
v
amente acoplado no Instituto
A
g
r
onômico de Campinas
–
CPD de Solos e Recu
r
sos
A
mbientais.
2
.5 Purificação das substâncias antibióticas
p
or cromatografia líquida a
v
ácuo (CL
V
)
A
FD
f
oi f
r
acionada at
r
a
v
és de CLV, em coluna de
v
id
r
o(20mm
Ф
x 350 mm
altu
r
a), acoplada a uma bomba de vácuo 51 kPa. Como
f
ase estacioná
r
ia
f
oi utilizada sílica
gel 60 (0.063
–
0.200 mm, Me
r
ck), e como
f
ases mó
v
eis sol
v
entes o
r
gânicos com pola
r
idade
c
r
escente: he
x
ano, diclo
r
ometano, acetato de etila, metanol, metanol e água destilada na
r
azão 1:1 (
v
:
v
) e água destilada.
A
coluna
f
oi montada com 30 g de s
í
lica gel; em seguida
uma mistu
r
a de 2 g da FD e 5 g de s
í
lica gel. Pa
r
a as passagens dos sol
v
entes o
r
gânicos
30
f
o
r
am utilizados al
í
quotas de 40 mL com 10
r
epetições pa
r
a cada sol
v
ente, obtendo-se 6
f
r
ações: (F1) he
x
ano; (F2) diclo
r
ometano; (F3) acetato de etila; (F4) metanol; (F5) metanol e
água destilada e (F6) água destilada.
A
sf
r
ações
f
o
r
am concent
r
adas em
r
ota
v
apo
r
a 45 ºC,
congeladas em nit
r
ogênio l
í
quido e lio
f
ilizadas po
r
24 h.
2
.6 Avaliação da ação antibiótica
p
or difusão em ágar
A
a
v
aliação da ação antibiótica da FD e das f
r
ações F
f
o
r
am pelo método de
di
f
usão em ága
r
com poços de 9 mm de diâmet
r
o
f
eito equidistantes no ága
r
. O desenho
e
x
pe
r
imental
f
oi conduzido com: 3 concent
r
ações da FD e das f
r
ações F, 4
r
epetições (3 x 4,
n=12) e como cont
r
ole negati
v
o
f
oi utilizado água destilada esté
r
il. O inóculo da Xac 306
f
oi
obtido a partir de cultura em fase exponencial a uma concentração de 10
12
UFC mL
-1
e
inoculado em placa de Pet
r
i com
A
N pela técnica de pou
r
-plate.
A
l
í
quotas de 150 µL da FD
e das f
r
ações F
f
o
r
am adicionadas nos poços com uma cu
r
v
a de concent
r
ação de 100, 1000
-1
e 10000 µg mL e água destilada estéril para controle negativo (solvente usado na
suspensão da FD e das frações F). As placas foram incubadas a 28 °C 48 h
-1
. A leitura foi
f
eita at
r
a
v
és da medida dos halos de inibição (mm).
2
.7 Determinação da concentração inibitória mínima (C
I
M) e termoestabilidade da fase
diclorometano
A
CIM
f
oi
f
eita em placas de cultu
r
a de células com 24 poços. O desenho
e
x
pe
r
imental utilizado
f
oi o seguinte: 10 concent
r
ações da FD e das f
r
ações F, 4
r
epetições
(10 x 4, n=40) e
f
oi conside
r
ado como cont
r
ole negati
v
o caldo nut
r
iente e como positi
v
ouma
suspensão de Xac 306. Fo
r
am adicionados em cada poço a seguinte sequência: 1.8 mL de
CN, 100 µL de uma suspensão da Xac 306 na mesma concent
r
ação desc
r
ita acima e 100
µL de uma cu
r
v
a de concent
r
ação (5000, 2500, 1250, 625, 312.5, 156.25, 78.12, 39,06,
19,53 e 9.76 µg mL
-1
) da FD, fase diclorometano autoclavada (120 ºC 20 min
-1
) (FDT) e das
f
r
ações F. Foi conside
r
ado como cont
r
ole positivo Xac 306 inoculada em CN e como
controle negativo água destilada estéril. As placas foram incubadas a 28 °C 48 h
-1
em
31
seguida
f
oi adicionado 20 µL de uma solução de clo
r
eto de 2, 3, 5-t
r
i
f
enil tet
r
azólio (TTC) a
1% e incubadas a 28 ºC 20 min
-1
. A leitura foi realizada através da mudança de cor através
da obse
r
v
ação da
v
iabilidade celula
r
,
f
oi conside
r
ado sens
í
v
el (-) na ausência de co
r
e
r
esistente (+) na p
r
esença de colo
r
ação
r
osa - a
v
ermelhada.
2
.8 Avaliação da ação das substâncias antibióticas
F
D e
F
3 sobre a formação de lesão em
folha
A
s plantas de C. sinensis c
v
. Valência
f
o
r
am culti
v
adas em vasos de 3 L com solo
não esté
r
il (Rhodic Fer
r
alsol) (FAO, 1994) mantidos em casa de
v
egetação (28 °C/22 °C e
10 h/14 h dia/noite, umidade
r
elati
v
ade80%).
A
cada 15 dias
f
o
r
am adicionados 150 mL de
solução nut
r
iti
v
a de Hewitt pa
r
a não leguminosas (Hewitt, 1966) e
r
egadas con
f
orme a
necessidade com água de to
r
nei
r
a.
Fo
r
am
r
ealizados dois e
x
pe
r
imentos. O p
r
imei
r
oe
x
pe
r
imento
f
oi em blocos
casualizados com o seguinte delineamento e
x
pe
r
imental: 2 tempos de aplicação (p
r
é e pós),
3 concent
r
ações da FD, 5
r
epetições (2 x 3 x 5, n = 40) e dois cont
r
oles positi
v
os com Xac
306 e água destilada pa
r
a o p
r
é e pós-t
r
atamento com 5 plantas cada. A aplicação da FD
f
oi
f
eita após 15 dias da poda e
f
o
r
am selecionadas 18 a 20
f
olhas
j
o
v
ens com
ap
r
o
x
imadamente o mesmo tamanho.
A
ntes da aplicação as plantas
f
o
r
am cobertas po
r
24
h com saco de polietileno p
r
eto pa
r
a
f
o
r
mar uma câma
r
aúmidaeescu
r
a, permanecendo
nestas condições por mais 48 h até o
f
inal das aplicações dos t
r
atamentos. No p
r
é-
t
r
atamento, os
v
asos
f
o
r
am abertos e as plantas pul
v
erizadas com 8 mL da FD por planta
nas concentrações de (10.000, 1.000, 100 µg mL
-1
) e 8 mL de água destilada no controle
(sol
v
ente utilizado pa
r
a dilui
r
a FD) e
f
echados, após 24 h, os
v
asos
f
o
r
am no
v
amente
abertos e pulverizados com uma suspensão de 8 mL de Xac 306 (10
8
UFC mL
-1
) por planta
e
f
echados.
A
pós 24 h
f
oi ti
r
ado à câma
r
a úmida e escu
r
ados
v
asos. No pós-t
r
atamento,
f
oi
adotado o mesmo p
r
ocedimento desc
r
ito ante
r
io
r
mente com e
x
ceção da o
r
dem das
pul
v
erizações que p
r
imei
r
amente
f
o
r
am inoculadas com Xac 306 e depois pul
v
erizadas com
as concent
r
ações da FD.
32
O segundo e
x
pe
r
imento também
f
oi em blocos casualizados e te
v
e o seguinte
desenho e
x
pe
r
imental 2 tempos de aplicação (p
r
é e pós), 4 concent
r
ações da F3, 5
r
epetições (2 x 4 x 5, n = 50), e dois cont
r
oles positi
v
os com Xac 306 e água destilada pa
r
a
o p
r
é e pós-t
r
atamento com 5 plantas cada. Pa
r
aop
r
éepós-t
r
atamento,
f
oi adotado o
mesmo p
r
ocedimento desc
r
ito acima, com e
x
ceção do composto antibiótico que
f
oi a F3
com as seguintes concentrações (10.000, 1.000, 100, 10 µg mL
-1
). O número de lesão dos
e
x
pe
r
imentos
f
oi dete
r
minado após 21 dias da aplicação. O núme
r
o de lesão po
r
f
olha
f
oi
a
v
aliada a pa
r
ti
r
da contagem das lesões em 18
f
olhas coletadas de cada
r
epetição po
r
t
r
atamento e os dados submetido à análise estat
í
stica por
r
eg
r
essão (p < 0.05).
2
.9
E
feito citotó
x
ico das substâncias antibióticas
F
D e
F
3
Pa
r
a o teste de citoto
x
icidade
f
oi utilizado células epiteliais de ca
r
cinoma de
f
a
r
inge
humana
A
TCCL CCL-23 (HEp-2) estocadas a -80%,
A
s células
f
o
r
am culti
v
adas em meio
DMEN (GiBco™), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 µg mL
-1
de
estreptomicina, 100 unidades mL
-1
de penicilina e 2.5 µg mL
-1
de fungizona.
A
leitu
r
a da
v
iabilidade celular
f
oi
f
eita com MTT de aco
r
do com as inst
r
uções do
método (MTT-baseado no kit, Sigma Chem. Co.). O culti
v
o celular
f
oi
f
eito em mic
r
o placas
de 96 poços e incubadas a 37 ºC 48 h
-1
com 5% CO
2.
Após a formação do tapete celular o
sobrenadante foi descartado e transferido para cada poço 100 µL de meio DMEN contendo
diferentes concentrações da FD e da F3 (FD: 1000.000, 100.000, 10.000 e 1.000 µg mL
-1
;
F3: 2300, 230, 23 e 2,3 µg mL
-1
). As placas foram incubadas a 37 ºC 72 h
-1
com 5% CO
2
e a
leitura feita em leitor de ELISA com 490 e 630 nm. O experimento foi realizado em
quad
r
uplicata.
3
R
esultados
3.1 Sensibilidade da Xac 306 a diferentes concentrações de cloreto de cobre
33
A
Xac 306 ap
r
esentou
r
esistência a todas as concent
r
ações de clo
r
eto de cob
r
e
testadas (Tabela 1).
3.
2
Análise de resíduo de cobre na fase diclorometano
O clo
r
eto de cob
r
e que
f
oi adicionado no meio de cultu
r
a da cepa LV que pode
r
ia
ter ap
r
esentado e
f
eito bacte
r
icida na FD ou nas
f
r
ações F p
r
o
v
eniente do sob
r
enadante não
f
oi obse
r
v
ado. Pois na FD que
f
oi e
x
t
r
a
í
da di
r
etamente do sob
r
enadante e ap
r
esentou
g
r
ande e
f
eito antibiótico nos e
x
pe
r
imentos in
v
itro e in
v
ivo tinha uma quantidade de cob
r
e
de 1.7 mg kg
-1
. Considerando que a concentração mínima inibitória é de 3 g L
-1
e que a Xac
306 apresentou resistência em 100 mg mL
-1
, a concentração contida na FD é muito menor
do que a concent
r
ação inibitó
r
ia m
í
nima conside
r
ada.
3.3 Avaliação da ação antibiótica in
v
it
r
o
p
elo método de difusão em ágar
Na a
v
aliação da ação antibiótica por di
f
usão em ága
r
da FD e das f
r
ações F, a FD
ap
r
esentou halos inibitó
r
ios de c
r
escimento da Xac 306. No entanto somente a F3 most
r
ou
ter e
f
eito semelhante à FD
f
o
r
mando halos de inibição de c
r
escimento com diâmet
r
o
aproximados, 42 e 38.5 mm na concentração de 10.000 µg mL
-1
. As F1, F2 e F4
ap
r
esenta
r
am bai
x
a ação antibiótica com halos de inibição de 13, 12.5 e 10 mm
-1
respectivamente. Na F1, a concentração 1000 µg mL apresentou o mesmo efeito
encontrado na 10.000 µg mL
-
1 (Tabela 2).
3.4 Determinação da concentração inibitória mínima e termoestabilidade da fase
diclorometano
-1
A CIM, da FD foi de 78.12 µg mL , diferentemente da FDT, que apresentou inibição
pa
r
cial na mesma concent
r
ação. Nas f
r
ações, a F3 ap
r
esentou meno
r
CIM com inibição na
-1
concentração de 19.53 µg mL . Já as F1 e F2 tiveram como menor concentração inibitória
34
-1
-1
2500 µg mL e a F4 625 µg mL , as f
r
ações F5 e F6 não ti
v
e
r
am e
f
eito inibitó
r
io f
r
ente à Xac
306 (Tabela 3).
3.5 Avaliação da ação das substâncias antibióticas
F
D e
F
3 sobre a formação de lesão em
folha
Nos dois e
x
pe
r
imentos in
v
ivo
r
ealizados,
f
oi a
v
aliado o e
f
eito antibiótico na
f
o
r
mação de lesão de canc
r
o c
í
t
r
ico nas
f
olhas. No p
r
imei
r
oe
x
pe
r
imento onde
f
oi aplicado a
FD, no p
r
é-t
r
atamento, o e
f
eito inibitó
r
io
f
oi obser
v
ado a partir da D1 sendo maior na D2 e
na D3. Na regressão as diferenças entre dose-efeito foi significativa (r
2
= 0.9868, p < 0.01)
most
r
ando que a dose m
í
nima testada
f
oi a mais e
f
eti
v
anocont
r
ole da
f
o
r
mação de lesão.
A
s plantas t
r
atadas com a D3 ap
r
esenta
r
am 80% menos lesão nas
f
olhas quando
compa
r
adas com o cont
r
ole (Figu
r
a 1
A
). No pós-t
r
atamento as concent
r
ações maio
r
es D1 e
D2 estimula
r
am a
f
o
r
mação de lesão quando compa
r
adas com o cont
r
ole. Somente a D3
te
v
e e
f
eito inibitó
r
io na
f
ormação de lesão. Isto most
r
a um modelo di
f
e
r
ente na dose-e
f
eito
quando o p
r
oduto é aplicado após a in
f
ecção de Xac 306 tendo também di
f
e
r
enças
significativas no número de lesão formadas (r
2
= 0.9449, p < 0.01) (Figura 1 B).
No segundo e
x
pe
r
imento, onde
f
oi aplicado a F3 (obtida na CLV a parti
r
do
t
r
atamento da FD com acetato de etila), no p
r
é-t
r
atamento, todas as concent
r
ações
diminuíram o número de lesão e a dose-efeito na regressão foi significativa (r
2
= 0.8037, p <
0.01).
A
s plantas t
r
atadas com a D1, D2 e D3 diminu
í
r
am em ap
r
o
x
imadamente 65 % no
núme
r
o de lesão e as plantas t
r
atadas com a D4 o núme
r
o de lesão
f
oi
r
eduzido em 92 %,
quando compa
r
ado com as plantas cont
r
ole (Figu
r
a2
A
).
A
s plantas t
r
atadas com a F3 no
pós-tratamento a correlação dose-efeito também foi significativa (r
2
= 0.9938, p < 0.01), onde
todas as concent
r
ações diminu
í
r
am o núme
r
o de lesão, no entanto o e
f
eito na
f
o
r
mação de
lesão
f
oi di
f
e
r
ente, quando compa
r
ada ao cont
r
ole a D1 diminuiu em 42.4%, a D2 79,8%, a
D3 87.7% e a mais e
f
eti
v
a
f
oi a D4 com 93.5% (Figu
r
a2B).
3.6
E
feito citotó
x
ico das substâncias antibióticas
F
D e
F
3
35
No teste de citoto
x
icidade, a FD ap
r
esentou e
f
ei
t
ocitotó
x
ico somente nas duas
concentrações maiores (1.000.000 e 100.000 µg mL
-1
) o mesmo ocorreu com a F3 (2300 e
230 µg mL
-1
). Estes resultados demonstraram que as concentrações que foram utilizadas
nos e
x
pe
r
imentos in
v
i
v
o, e que ap
r
esenta
r
am melho
r
es e
f
eitos no cont
r
ole da
f
ormação de
lesão, são ambas 10
v
ezes meno
r
es do que as concent
r
ações m
í
nimas que ap
r
esenta
r
am
e
f
eito citotó
x
ico.
4 Discussão
A
pesa
r
do uso de pequenas concent
r
ações de cob
r
e no meio de cultu
r
a da cepa
LV, não
f
oi obse
r
v
ado nenhuma inte
r
f
e
r
ência na ação antibiótica das substâncias testadas,
j
á que o
r
esidual de cob
r
e encont
r
ado na FD
f
oi muitas
v
ezes meno
r
do que a concent
r
ação
inibitó
r
ia m
í
nima conside
r
ada pa
r
a diminuir a p
r
esença de lesões
f
olia
r
es at
r
a
v
és de
pul
v
erizações pe
r
iódicas nas
f
ases de b
r
otação das plantas c
í
t
r
icas (
K
olle
r
et al., 2006).
A
ação antibiótica do cob
r
e f
r
ente à patógenos depende di
r
etamente da concent
r
ação de
í
ons
li
v
r
es na solução (Lee et al., 1993).
Nos testes de antibiose in
v
itro, a F3 seguida pela FD
f
o
r
am as que ap
r
esenta
r
am
maio
r
e
f
eito inibitó
r
io e menor CIM
f
r
ente à Xac 306. Como a F3 é e
x
t
r
aída da FD po
r
f
r
acionamento na CLV, os
r
esultados indicam que as substâncias com ação antibióticas
solú
v
eis em acetato de et
í
la, p
r
esente na FD
f
o
r
am e
x
t
r
a
í
das na F3, com isso, as out
r
as
f
r
ações ap
r
esenta
r
am pouca ou nenhuma ação antibiótica.
Pa
r
a os e
x
pe
r
imentos in
v
ivo
f
oi utilizada a FD e a F3, por ap
r
esenta
r
em maio
r
ação
antibiótica nos e
x
pe
r
imentos in
v
itro e bai
x
a concent
r
ação inibitó
r
ia m
í
nima.
A
FD na
concent
r
ação D3 do p
r
é-t
r
atamento diminuiu ap
r
o
x
imadamente 80% no núme
r
o de lesões
f
olia
r
es, por out
r
o lado, no pós-t
r
atamento os e
f
eitos obse
r
v
ados
f
o
r
ma di
f
e
r
entes.
A
D1
estimulou o núme
r
o de lesões e a D2 não te
v
ee
f
eito tendo ap
r
o
x
imadamente o mesmo
núme
r
o de lesões do cont
r
ole. Mesmo a D3 que ap
r
esentou melho
r
cont
r
ole, a sua
36
e
f
iciência diminuiu bastante, pois a
r
edução no núme
r
o de lesões
f
oi somente de 30% em
r
elação ao cont
r
ole. Isto demonst
r
a que a
f
orma de t
r
atamento com a FD tem e
f
eitos
di
f
e
r
entes no cont
r
ole das lesões o que é
r
e
f
o
r
çado pelo
f
ato de ambos os modelos
apresentaram diferenças significativas na correlação dose-efeito e um alto valor de r
2
. Essas
di
f
e
r
enças no cont
r
ole de lesão do canc
r
oc
í
t
r
ico com
r
elação à época de t
r
atamento
também
f
o
r
am obse
r
v
adas nos e
x
pe
r
imentos de Cama
r
go (2006) que a
v
aliou o e
f
eito do
sob
r
enadante no cont
r
ole de lesão de canc
r
oc
í
t
r
ico.
Na F3 no p
r
é-t
r
atamento todas as doses ti
v
e
r
am um g
r
ande e
f
eito inibitó
r
io no
núme
r
o de lesão, sendo a mais e
f
eti
v
aameno
r
dose a D4 e no pós-t
r
atamento o e
f
eito
obse
r
v
ado
f
oi menor do que no p
r
é-t
r
atamento, suge
r
indo que apesar de não oco
r
r
er o
est
í
mulo na
f
ormação de lesão como na FD, o e
f
eito obse
r
v
ado
f
oi menor do que no p
r
é-
t
r
atamento. Isto signi
f
ica que o tempo de aplicação é um impo
r
tante
f
ato
r
na
r
elação dose-
e
f
eito. Di
f
e
r
enças no núme
r
o de lesões ent
r
eop
r
é e pós-t
r
atamento também
f
oi obse
r
v
ado
no t
r
abalho de Cama
r
go (2006), di
f
e
r
entemente de Mu
r
ati (2007) onde a diminuição do
nume
r
o de lesões
f
olia
r
es não ap
r
esentou di
f
e
r
ença nos tempos de aplicações.
A
s di
f
e
r
enças obse
r
v
adas no p
r
esente t
r
abalho ent
r
eost
r
atamentos FD e a F3
possi
v
elmente estão
r
elacionadas com o g
r
au de pu
r
eza das substâncias, demonst
r
ando
que quanto mais pu
r
o as substâncias, maior o e
f
eito obse
r
v
ado na
f
ormação de lesão.
Pa
r
a os testes de citoto
x
icidade a FD e a F3, substâncias com melhor ação
antibiótica in
v
itro e in
v
i
v
o não ap
r
esenta
r
am e
f
eito tó
x
ico nas concent
r
ações com maio
r
ação antibiótica, sendo 10
v
ezes meno
r
do que a concent
r
ação m
í
nima citotó
x
ica,
demonst
r
ando que a melho
r
concent
r
ação pode ser manipulada sem e
f
eito tó
x
ico pa
r
ao
aplicado
r
.
O
f
ato da FD e da f
r
ação F3 obtida at
r
a
v
és da CLV te
r
em ap
r
esentado e
f
eito
inibitó
r
io na
f
ormação de lesões, é um impo
r
tante ind
í
cio de que estas substâncias podem
a
j
udar no cont
r
ole do canc
r
o c
í
t
r
ico, podendo esta
r
associados a out
r
os p
r
odutos ou a
f
o
r
mas de mane
j
o pa
r
a o cont
r
ole da doença. No entanto, e
x
pe
r
imentos de campo de
v
em
ser
r
ealizados pa
r
a dete
r
minar qual se
r
á o comportamento destas substâncias nestas
37
condições.
A
s condições e
x
pe
r
imentais aqui utilizadas
f
acilita
r
am a
f
o
r
mação das lesões nas
f
olhas, uma
v
ez que, a cepa 306 é de alta
v
i
r
ulência, a concent
r
ação celula
r
de Xac 306
usada e
r
a muitas
v
ezes acima da encont
r
ada natu
r
almente e a câme
r
a úmida e escu
r
ate
v
e
f
unção impo
r
tante na abertu
r
a dos estômatos pa
r
a
f
acilitar a ent
r
ada da Xac 306 at
r
a
v
és dos
estômatos e in
f
ecta
r
as
f
olhas.
5 Conclusão
A
ação das substâncias antibióticas p
r
oduzida pela cepa LV tem e
f
eito inibitó
r
io na
f
o
r
mação de lesões
f
olia
r
es do canc
r
oc
í
t
r
ico. Es
t
ee
f
eito é um
r
esultado bastante p
r
omisso
r
na obtenção de no
v
os p
r
odutos pa
r
aocont
r
ole de doenças causadas por bacté
r
ias em
cit
r
os. No entanto este é o desa
f
io pa
r
aosp
r
ó
x
imos anos, busca
r
ocont
r
ole e
f
etivo das
bacté
r
ias
f
itopatogênicas e diminuir os p
r
e
j
uízos causados por estes mic
r
o
r
ganismos na
cit
r
icultu
r
a mundial.
5
R
e
f
e
r
ências Bibliog
r
áficas
A
nd
r
ade, G., 2004., Role of
f
unctional g
r
oups of mic
r
oo
r
ganisms on the
r
hizosphe
r
e
mic
r
ocosm d
y
namics. In: Va
r
ma,
A
.,
A
bbott, L., We
r
ne
r
, D., Hampp, R. (Eds.), Plant
Su
r
f
ace Mic
r
obiolog
y
, Sp
r
inge
r
-Ve
r
lag, pp. 51-69.
A
ssis, S.M.P., Ma
r
iano, R.L.R., Miche
r
eV, S.J., Rildo, S.B., 1996. Biological cont
r
ol o
f
Xanthomonas cam
p
estris p
v
.cam
p
estris on kale with Bacillus spp. and endoph
y
tic
bacte
r
ia. In: Tang, W., Cook, R.J., Ro
v
i
r
a,
A
. (Eds.),
A
d
v
ances in Biological Cont
r
ol o
f
Plant Disease.
A
g
r
icultu
r
al Uni
v
e
r
sity P
r
ess, Bei
j
ing, China, pp. 347
–
353.
38
Bo
r
a, L.C., Gangopadh
y
a
y
, S., Chand, J., 1993. Biological cont
r
ol o
f
bacte
r
ial lea
f
spot
(Xanthomonas cam
p
estris p
v
.
v
ignaeradiatae Dye) of mung bean with ph
y
lloplane
antagonists. Plant Patholog
y
. 23, 162
–
168.
Bitancou
r
t,
A
.
A
., 1957. O canc
r
o c
í
t
r
ico. O Biológico. 23, 101-111.
B
y
r
ne, J.M., Dianese,
A
.C., Jia, P., Campbell, H.L., Cuppels, D.
A
., Louws, F.J., Mille
r
, S.
A
.,
Jones, J.B., Wilson, M., 2005. Biological cont
r
ol o
f
bacte
r
ial spot of tomato unde
r
Weld
conditions at se
v
e
r
al locations in No
r
th
A
me
r
ica. Biological Cont
r
ol. 32, 408
–
418.
Cama
r
go, F.R.S., 2006.
A
v
aliação do potencial de agentes biológicos e seus p
r
odutos no
cont
r
ole do canc
r
oc
í
t
r
ico causado por Xanthomonas axonopodis p
v
. citri. Lond
r
ina,
Dissertação de Mest
r
ado em Mic
r
obiologia, Uni
v
e
r
sidade Estadual de Lond
r
ina, B
r
asil.
51.
Da Sil
v
a,
A
.C.R., Fe
r
r
o, J.
A
., Reinach, F.C., Fa
r
ah, C.S., Fu
r
lan, L.R., Quaggio, R.B.,
Montei
r
o-Vito
r
ello, C.B., Van Slu
y
s, M.
A
.,
A
lmeida, N.F.,
A
lves, L.M.C.,
A
ma
r
al,
A
.M.,
Bertolini, M.C., Cama
r
go, L.E.
A
., Cama
r
otte, G., Canna
v
an, F., Ca
r
dozo, J.,
Chambe
r
go, F., Clapina, L.P., Cica
r
elli, R.M.B., Coutinho, L.L., Cu
r
sino-Santos, J.R., El-
Dor
r
y
, H., Fa
r
ia, J.B., Fer
r
ei
r
a,
A
.J.S., Fe
r
r
e
r
ia, R.C.C., Fer
r
o, M.I.T., Fo
r
mighie
r
i, E.F.,
F
r
anco, M.C., G
r
eggio, C.C., G
r
ube
r
,
A
.,
K
atsu
y
ama,
A
.M., Kishi, L.T., Leite R.P.J
r
.,
Lemos, E.G.M., Lemos, M.V.F., Locali, E.C., Machado, M.
A
., Madei
r
a,
A
.M.B.N.,
Martinez-Rossi, N.M., Martins, E.C., Meidanis, J., Menck, C.F.M., Mi
y
aki, C.Y., Moon,
D.H., Mo
r
ei
r
a, L.M., Novo, M.T.M., Oku
r
a, V.K., Oli
v
ei
r
a, M.C., Oli
v
ei
r
a, V.R., Pe
r
ei
r
a,
H.
A
., Rossi,
A
., Sena, J.
A
.D., Sil
v
a, C., Souza, R.F., Spinola, L.
A
.F., Takita, M.
A
.,
Tamu
r
a, R.E., Tei
x
ei
r
a, E.C., Tezza, R.I.D., Santos, M.T., T
r
u
f
f
i, D., Tsai, S.M., White,
F.F., Setúbal, J.C., Kita
j
ima, J.P., 2002. Compa
r
ison o
f
the genomes of two
Xanthomonas pathogens with dif
f
e
r
ent host speci
f
ics. Natu
r
e. 417, 459-463.
F
A
O., 1994. Soil Map o
f
theWo
r
ld. Re
v
ised legend with cor
r
ections. F
A
O-UNESCO ISRIC,
Wageningen, Rome. 140.
39
F
A
O., 2006. Food and
A
g
r
icultu
r
e O
r
ganization of the United Nations.Cit
r
us: statistics f
r
uit
f
r
esh and p
r
ocessed annual. Captu
r
ado em 10
f
e
v
e
r
ei
r
o 2008. on line. Disponí
v
el em:
http://www.
f
ao.o
r
g.
Fawcett, H.S., Jenkins,
A
.E., 1933. Reco
r
ds o
f
cit
r
us canker f
r
om he
r
ba
r
ium specimens o
f
the genus Cit
r
us in England and the United States. Ph
y
topatholog
y
. 23, 820-824.
Feichtenbe
r
ge
r
, E., 1997. Mane
j
o ecológico das p
r
incipais doenças
f
úngicas e bacte
r
ianas
dos cit
r
os no B
r
asil.
A
nais do Quinto Seminá
r
io Inte
r
nacional de Cit
r
os
–
T
r
atos
Cultu
r
ais. 23-65.
Gab
r
iel, D.W., Kingsley, M.T., Hunte
r
, J.E., Gottwald, T.R., 1989. Reinstatement o
f
Xanthomonas citri (ex Hasse) and X. phaseoli (ex Smith) to species and
r
eclassi
f
ication
o
f
all Xanthomonas cam
p
estris p
v
. citri st
r
ains. Inte
r
national Jou
r
nal o
f
Systematic
Bacte
r
iolog
y
. 39, 14-22.
Gottwald, T.R., G
r
aham, J.H., Shube
r
t, T.S., 2002. Cit
r
us canke
r
: The pathogen and its
impact. Plant Health P
r
og
r
ess. doi: 10.1094
/
PHP
–
2002
–
0812-01-RV.
Hasse, C.H., 1915. Pseudomonas cit
r
i, the cause o
f
cit
r
us canke
r
. Jou
r
nal o
f
the
A
g
r
icultu
r
al
Resea
r
ch. 4, 96-100.
Hewitt, E. J., 1966. Sand and water cultu
r
e methods used in the study o
f
plant nut
r
ition. East
Maling: Commonwealth
A
g
r
icultu
r
al Bu
r
eau. 547.
Kloeppe
r
, J.W., Rod
r
í
guez-
K
ábana, R., Zehnde
r
, G.W., Mu
r
ph
y
,J.F.,Siko
r
a, E., Fe
r
nandez,
C., 1999. Plant
r
oot bac
t
e
r
ial inte
r
action in biological cont
r
ol o
f
soilbo
r
ne diseases end
potential e
x
tension to s
y
stemic and
f
olia
r
diseases.
A
ust
r
alasian Plant Patholog
y
. 28, 21-
26.
K
olle
r
, O.C., Oli
v
ei
r
a, R.B.L., Nunes, D.S., Dal Soglio, F., Panzenhagen, N.V., Sa
r
to
r
i, I.
A
.,
Manteze, F., 2006. Cont
r
ole qu
í
mico do canc
r
oc
í
t
r
ico em plantas
j
o
v
ens sob mane
j
o
con
v
encional e o
r
gânico. Ciência Ru
r
al. 36, 1043-1048.
Kimati, H., Be
r
gamin Filho,
A
., 1995. P
r
inc
í
pios ge
r
ais de cont
r
ole. In: Be
r
gamin Filho,
A
.,
Kimati, H.,
A
mo
r
im, L. (Eds.)., Manual de
f
itopatologia, Ce
r
es, São Paulo, pp. 692-709.
40
K
oizumi, M., 1985. Cit
r
us canke
r
: The wo
r
ld situation. In: Cit
r
us canke
r
: an Inte
r
national
pe
r
specti
v
e, Cit
r
us Resea
r
ch & Education Cente
r
,Uni
v
e
r
sity o
f
Flo
r
ida, pp. 2-7.
Lee, Y.
A
., Sch
r
oth, M.N., Hedson, M., Lindow, S.E., Wang, X.L., Onson, B., Buchne
r
, R.P.
Te
v
iotdale, B., 1993. Inc
r
eased to
x
icity o
f
i
r
on-emended coppe
r
-containing bacte
r
icides
to the walnut blight pathogen Xanthomonas cam
p
estris p
v
.
j
uglandis. Ph
y
topatholog
y
.
83,1460-1465.
Leite Junio
r
, R.P., Santos, S.D., 1988. Susceptibilidade do limão Siciliano (Citrus lemon),
en
x
ertado sob
r
e di
f
e
r
entes po
r
ta en
x
e
r
tos, ao canc
r
oc
í
t
r
ico causado por Xanthomonas
cam
p
estris p
v
. citri. Fitopatologia B
r
asilei
r
a. 13, 353- 358.
Leite Junio
r
, R.P. e Moham, S.K., 1990. Integ
r
ated Management of the cit
r
us bacte
r
ial
canke
r
disease caused by Xanthomonas cam
p
estris p
v
. citri in the State o
f
Pa
r
aná,
B
r
azil. C
r
op P
r
otection. 9, 3-7.
Ma
r
co, G.M., Stall, R.E., 1983. Cont
r
ol o
f
bacte
r
ial spot of pepper initiated by Xanthomonas
cam
p
estris p
v
. vesicatoria that dif
f
er in sensibility to coppe
r
. Plant Disease. 67, 779-781.
Mu
r
ate, L.S., 2007.
A
cti
v
ity o
f
bacte
r
ial seconda
r
y metabolites in the con
t
r
ol o
f
cit
r
us canke
r
.
Lond
r
ina, Disse
r
tação de Mest
r
ado em Mic
r
obiologia. Uni
v
e
r
sidade Estadual de
Lond
r
ina. 57.
Rampazo, L.G.L., 2004. E
v
aluation o
f
the ef
f
ect o
f
biological agents and thei
r
p
r
oducts into
the incidence of cit
r
us canke
r
lesions. Uni
v
e
r
sidade Estadual de Lond
r
ina. Dissertação
de Mest
r
ado. B
r
asil. 57.
Stall, R.E. e Ci
v
e
r
olo, E.L., 1991. Resea
r
ch
r
elating to the
r
ecent outb
r
eak o
f
cit
r
us canke
r
in
Flo
r
ida.
A
nnual Re
v
iew o
f
Ph
y
topathol. 29, 339-420.
Stall, R.E. e Seymou
r
, C.P., 1983. Canke
r
,ath
r
eat to cit
r
us in the gul
f
-cost states. Plant
Disease. 67,581-585.
St
r
ombe
r
g,
K
.D., Kinkel, L.L., Leona
r
d,
K
.J., 2000. Inte
r
actions between Xanthomonas
translucens p
v
. translucens, the causal agent o
f
bacte
r
ial lea
f
st
r
eak o
f
wheat, and
bacte
r
ial epiph
y
tes in the wheat phyllosphe
r
e. Biological Cont
r
ol.17, 61
–
72.
41
St
r
ombe
r
g,
K
. D., Kinkel, L. L., Leona
r
d,
K
. J., 2003. Quanti
f
y
ing the ef
f
ect o
f
bacte
r
ial
antagonists on the
r
elationship between ph
y
llosphe
r
e population sizes o
f
Xanthomonas
translucens p
v
. traslucens and subsequent bacte
r
ial lea
f
st
r
eak se
v
e
r
ity on wheat
seedlings. Biological Cont
r
ol. 29, 58-65.
Verma, J.P., Singh, R.P., 1987. Inte
r
action between Xanthomonas cam
p
estris p
v
.
malvaceaurum, ph
y
lloplane bacte
r
ia and Gossypium hirsutum. In: Focal Theme (Botan
y
)
ISC
A
Symposium. 163
–
178.
Zhang, L., Bi
r
ch, R.G., 1997. Mechanisms o
f
biocont
r
ol by Pantoea dispersa o
f
sugar cane
lea
f
scald disease caused by Xanthomonas albilineans.Jou
r
nal o
f
A
pplied Mic
r
obiolog
y
.
82, 448
–
454.
42
+ 100
(+)
r
esistência ao cob
r
e, (-) sens
í
v
el ao cob
r
e
+ 50
+ 25
Xac 306
+ 10
5+
0+
Tabela 1: Teste de sensibilidade da Xac 306 ao clo
r
eto de cob
r
e
Concent
r
ação de clo
r
eto de
Cepa
cobre (µg mL
-1
)
C
r
escimento bacte
r
iano
43
12.5
-
-
42.0
26.5
10.5
10.0
-
-
-
-
-
-
-
-
Tabela 2: Avaliação da ação antibiótica por difusão em ágar da fase diclorometano
(FD), fração hexano (F1), fração diclorometano (F2), fração acetato de etila (F3),
fração metanol (F4), fração metanol e água (F5) e fração água (F6), frente à Xac
306.
Diâmetro do halo (mm)
38.5
21.5
16.0
13.0
13.0
Concentração (µg mL
-1
)
10000
1000
100
10000
1000
100
10000
1000
100
10000
1000
100
10000
1000
100
10000
1000
100
100
1000
10000
(-) sem
f
o
r
mação de halos de inibição
F6
F5
F4
F3
F2
F1
FD
A
most
r
as
44
Tabela 3: Dete
r
minação da concent
r
ação inibitó
r
ia m
í
nima da
f
ase diclo
r
ometano (FD),
f
ase
diclorometano autoclavada a 121°C 20min
-1
(FDT), fração hexano (F1), fração diclorometano
(F2),
f
r
ação acetato de etila (F3), f
r
ação metanol (F4), f
r
ação metanol e água (F5) e f
r
ação
(-) sens
í
v
el, (+)
r
esistente, (+-) inibição pa
r
cial
+ + ++++9.76 + +
+ + +-++19.53 + +
+ + +-++39.06 + +
+ + +-++78.12 - -+
+ + +-+156.25 - - +
+ + +-+312.5 - - +
- + +-+625 - - +
- + +-+- - +1250
- + +--- - -2500
- + +--- - -5000
F6F4 F5 F3F2F1FD FDT
(µg mL
-1
)
Compostos antibióticos
água (F6), f
r
ente à Xac 306
Concent
r
ação
45
Legenda das Figu
r
as
Figu
r
a 1: Reg
r
essão (p < 0.05, n = 40) dose-e
f
eito da aplicação de t
r
ês doses da
f
ase
diclorometano (D0 = água destilada, D1 = 10.000 µg mL
-1
, D2 = 1.000 µg mL
-1
, D3 = 100 µg
mL
-1
) sobre o número de lesões foliares de cancro cítrico causado pela Xac 306 em plantas
de C. sinensis c
v
. Valência após 21 dias da aplicação. (
A
) P
r
é-t
r
atamento. (B) Pós-
t
r
atamento.
Figu
r
a 2: Reg
r
essão (p < 0.05, n = 50) dose-e
f
eito da aplicação de quat
r
o doses da f
r
ação
F3 obtida a pa
r
tir do t
r
atamento da
f
ase FD com acetato de etila (D0=água destilada,
D1=10.000 µg mL
-1
, D2=1.000 µg mL
-1
, D3=100 µg mL
-1
, D4=10 µg mL
-1
) sobre o número de
lesões
f
olia
r
es de canc
r
o c
í
t
r
ico causado pela Xac 306 em plantas de C. sinensis c
v
.
Valência após 21 dias de aplicação. (
A
) P
r
é-t
r
atamento, (B) Pós-t
r
atamento.
46
Figure
1
60
A
R
2
=
0
.
9868
p
<
0
.
01
50
40
Nº
LESIONS
LEAF
30
20
10
0
D0
D1
D2 D3
FD
DOSES
CONCENTRATION
100
B
R
2
=
0.9449
p
<
0.01
90
80
Nº
LESIONS
LEAF
70
60
50
40
30
20
D0
D1
D2 D3
FD
DOSES
CONCENTRATION
4747
Figure 2Figure 2
160
160
A
A
R
2
=
0.8037
R
2
=
0.8037
p
<
0.01
p
<
0.01
140
140
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
D0
D0
D1
D1
D2D2 D3D3 D4D4
F3
DOSES
CONCENTRATIONF3
DOSES
CONCENTRATION
160
160
140
140
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
D0
D0
D1
D1
D2D2 D3D3 D4D4
F3
DOSES
CONCENTRATION
F3
DOSES
CONCENTRATION
Nº
LESIONS
LEAF
Nº
LESIONS
LEAF
Nº
LESIONS
LEAF
Nº
LESIONS
LEAF
B
B
R
2
=
0.9938
R
2
=
0.9938
p
<
0.01
p
<
0.01
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
