ads:
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Doutorado em Biologia Celular e Molecular
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIALÉRGICA DA ESPÉCIE
Syzygium cumini (L.) Skeels
Fabíola de Almeida Brito
Rio de Janeiro
2008
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
FABÍOLA DE ALMEIDA BRITO
Avaliação da atividade antialérgica de Syzygium cumini (L.) Skeels
Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em
Biologia Celular e Molecular do Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
Orientadora: Dra Maria das Graças Muller de Oliveira Henriques
RIO DE JANEIRO
2008
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTORA: FABÍOLA DE ALMEIDA BRITO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIALÉRGICA DE Syzygium cumini (L.) SKEELS
ORIENTADORA: Dr. Maria das Graças Müller de Oliveira Henriques
Aprovada em: 27/06/2008
EXAMINADORES:
Dra Carmen Penido - (Presidente).
Dra Maria Auxiliadora Coelho Kaplan.
Dr Emiliano de Oliveira Barreto.
Dra Mônica Freiman de Souza Ramos (Suplente).
Dra Sandra Aurora Chaves Perez Rodrigues (Revisora e suplente).
Rio de Janeiro, 27 de junho de 2008.
iii
ads:
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus maiores incentivadores:
Maria Cândida (mãe), Brito (pai), e aos meus amados
irmãos Camila, Luiz Felipe e Matheus.
iv
AGRADECIMENTOS
☺ Neste espaço de gratidão elevo meus olhos para o alto e agradeço Aquele que detém nas
mãos a ciência mais profunda, mais rica e certamente inalcançável até para o mais excelente
Doutor. Que é o conhecimento da mente e da alma humana. Que o louvor e a gratidão a Deus
estejam sempre presentes nos meus lábios.
☺ À Dra. Maria das Graças pela orientação, confiança e pelas oportunidades. E sem dúvida
pelo amadurecimento pessoal e profissional que nestes anos convividos no departamento me
levaram a obter. Obrigada por tudo
!
☺ À amiga Elaine pelo apoio nunca negado, pela orientação extra-oficial e pelo incentivo
gratuito, que com certeza foram essenciais para a conclusão deste trabalho.
☺ Aos grandes amigos de longa data, aos companheiros do dia-a-dia que dividiram comigo
nestes anos as boas e as “nem tão boas” fases da vida. Márcia, André, Socorro, Conte,
Mariana, Carlos, Fausto, Maria Fernanda, Bárbara, Simone, Carmen, Sejane, Daniela, Fátima,
Octávio, Jun, Marcelo, Kátia, Mônica, Ricardo, Patrícia, Vitor, Raquel. Muito obrigada pelo
respeito, pelo carinho e por tornarem os dias de trabalho mais prazerosos.
☺ A turma do biotério e afins: Sr. Betinho, Jurema, Antônio, Jorge, Alexandre, Paulinho e
Daniel. A colaboração de vocês é sempre valiosa.
☺ À minha família linda, tão presente e essencial para esta conquista. Essa vitória é nossa.
Coisa boa é ter vocês, obrigada por tudo.
☺
À Dra. Sandra Aurora e a Patrícia Lamour pela revisão e pelos comentários ao trabalho.
☺Aos membros da banca examinadora e aos suplentes, que tão prontamente aceitaram o
convite.
☺À coordenação do Curso de pós-graduação de Biologia Celular e Molecular/IOC
☺ Ao Instituto de Tecnologia em Fármacos - Farmanguinhos
☺ Às instituições CAPES, FAPERJ (Programa Nota 10).
v
O presente trabalho foi realizado no Laboratório
de Farmacologia Aplicada do Instituto de
Tecnologia em Fármacos – Farmanguinhos –
Fiocruz, sob a orientação da Dra Maria das
Graças Muller de Oliveira Henriques. Na vigência
de auxílios concedidos pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e Fundação Carlos Chagas Filho de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ).
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Avaliação da atividade antialérgica da espécie de Syzyium cumini (L.) Skeels
TESE DE DOUTORADO
Fabíola de Almeida Brito
RESUMO
Espécies vegetais são reconhecidas fontes de substâncias com atividade terapêutica. Plantas da família
Myrtaceae são amplamente usadas na medicina popular e os gêneros Eugenia e Syzygium estão entre
os mais importantes. Porém, existem poucos trabalhos que abordem a atividade antiinflamatória e/ou
antialérgica de extratos e frações obtidos de espécies da família Myrtaceae. Neste estudo, nós
demonstramos que o extrato aquoso bruto das folhas da espécie de Syzygium cumini (L.) Skeels (S-C),
inibe importantes parâmetros da alergia. Nós demonstramos que a administração oral de S-C inibe o
edema de pata induzido por diferentes estímulos como, composto 48/80 (C48/80), ovoalbumina (Ova) em
camundongos previamente sensibilizados, histamina, serotonina, mas falhou em inibir o edema induzido
por PAF. Foi demonstrado ainda, que o pré-tratamento com o extrato S-C inibe a liberação de histamina
por mastócitos estimulados pelo C48/80 e a eosinofilia alérgica em camundongos, este último dado que
pode estar relacionado à inibição dos níveis de CCL11/eotaxina e de IL-5. A partir da análise por
cromatografia líquida de alta performance (HPLC), nós demonstramos que os componentes majoritários
no extrato bruto de S-C são substâncias fenólicas, dentre eles os taninos hidrolisáveis e os flavonóides.
Identificamos neste estudo que o período entre os meses de novembro a janeiro, representa a época
sazonal que o conteúdo fenólico apresenta melhor efeito biológico. Com o objetivo de tentar esclarecer
os mecanismos celulares e/ou moleculares pelos quais esta substância de origem vegetal e seus
derivados atuam na reação inflamatória de origem alérgica. Nós investigamos o potencial efeito
antialérgico e/ou imunomodulador do tratamento com a fração acetato de etila obtida do extrato aquoso
bruto de S-C, sobre diferentes parâmetros da resposta alérgica in vivo, como a formação de edema
induzido por diferentes estímulos, o recrutamento e o perfil de diferentes tipos celulares no sítio alérgico,
e in vitro, como a quimiotaxia celular, a liberação de mediadores inflamatórios e a ativação de fator de
transcrição nuclear. Com o objetivo de identificar as substâncias responsáveis por estas atividades foi
identificado o perfil químico da fração acetato de etila de S-C, a identificação e quantificação de dois dos
seus constituintes. Foi identificado que os flavonóides representam 9,53% dos constituintes da fração
acetato de etila obtida de S.cumini. Dentro deste conteúdo flavonoídico a miricetina representa 1,96% da
fração e a quercetina representa 0,31%. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com a fração
acetato de etila do extrato aquoso de S-C, possui relevantes efeitos antialérgicos, pois inibem
importantes parâmetros característicos da resposta alérgica, fato que pode ser atribuído em parte aos
seus constituintes miricetina e/ou quercetina.
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Avaliação da atividade antialérgica da espécie de Syzyium cumini (L.) Skeels
TESE DE DOUTORADO
Fabíola de Almeida Brito
A
BSTRACT
Vegetal species are known sources of therapeutical actives compounds. Plants of Myrtaceae family are
widely used in folk medicine and the genera Eugenia and Syzygium are among the most important.
However, there are few studies that reported the anti-inflammatory or antiallergic activity of extracts
obtained from vegetal species of the Myrtaceae family. In this study we demonstrated that aqueous crude
extract of Syzygium cumini (L.) Skeels leaves (S-C), inhibited important allergic parameters. We
demonstrated that oral administration of S-C inhibit paw oedema induced by different stimulus such as
compound 48/80 (C48/80), ovalbumin (Ova) in previously sensitized mice, histamine and serotonin, but
failure in inhibit PAF-induced paw oedema. It was also demonstrated that pre treatment with S-C inhibits
histamine release by mast cells stimulated with C48/80 and allergic eosinophilia in mice, this last data can
be related with CCL11/eotaxin and IL-5 inhibition. We demonstrated by liquid chromatograph high
performance analysis (HPLC), that major compounds in aqueous extract of S-C are phenolic compounds
among these hydrolysable tannin and flavonoids. We identified that the period between November to
January, represent the best seasonal period that phenolic content posses major biologic effects. To try
clarifies the cellular and molecular mechanisms by this vegetal substance act in inflammatory allergic
reaction. We investigated the potential antiallergic or immunomodulatory effect of treatment with acetate
fraction from aqueous extract of S-C on different allergic response parameters in vivo, such as paw
oedema formation induced by different stimulus, different phenotype and cellular recruitment in allergic
sites, and in vitro, such as cellular chemotaxis, inflammatory mediators releasing and nuclear factor
transcription activation. To identify the active substances responsible by this activity, was performed the
chemical profile of the acetate fraction, its identification and measurement of the two of its constituents.
We identified that flavonoids represent 9.53% in acetate fraction obtained from S. cumini. Among this
flavonoids contend myricetin represent 1.96% of the acetate fraction and quercetin represent 0.31%. Ours
results demonstrated the acetate fraction obtained from aqueous extract S-C, posses relevant antiallergic
effects, because inhibit important allergic response parameters, fact that can be in part attributed to its
constituents myricetin or quercetin.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
-APC “antigen-presenting cells” – células apresentadora de antígeno
-5-HT serotonina
-C 48/80 Composto 48/80
-ECP “eosinophil cationic protein” - Proteína catiônica do eosinófilo
-EDN “eosinophil-derived neurotoxin” - Neurotoxina derivada do
eosinófilo
-EDTA ácido etilenodiaminatetraacético
-ELISA Ensaio enzimático de imunoaderência ligado à enzima
-EPM erro padrão da média
-FcεRI receptor de alta afinidade para IgE
-GM-CSF “granulocyte-macrophage-colony stimulating factor” – fator
estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
-IFN-γ interferon gama
-IL- ( ) interleucina - ( )
-ICAM “intercellular adhesion molecule” – Molécula de adesão intercelular
-Ig imunoglobulina
-i.p intraperitoneal
-i.t intratrorácica
-kg kilograma
-LT ( ) leucotrienos
-μg micrograma
-μL microlitro
-MAC-1 “macrophage-associated antigen –1” – antígeno 1 associado ao
macrófago
-MBP “major basic protein” - proteína básica principal
-MCP “monocyte chemotatic protein” – proteína quimiotática de
monócitos
-min minutos
-NFкB “nuclear factor кappa B” – fator nuclear кappa B
-Ova ovoalbumina
-PAF “platelet-activating factor” - fator de ativação plaquetária
-PDTC “pyrrolidine dithiocarbamate” – ditiocarbamato de pirrolidina
-PG ( ) prostaglandina
-rpm rotações por minuto
-p.o por via oral
ix
-S-C Syzygium cumini (L.) Skeels
-Th “T helper” – linfócito T auxiliar
-TNF “tumor necrosis factor” - fator de necrose tumoral
-UI unidade internacional
-VCAM “vascular cell adhesion molecule” - molécula de adesão celular vascular
x
ÍNDICE
R
ESUMO vi
A
BSTRACT vii
1.0- I
NTRODUÇÃO 1
1.1- Reações Inflamatórias de Origem Alérgica 2
1.2- M
ASTÓCITOS 4
1.3- Células T e a Patogênese de Inflamações Alérgicas 7
1.4-A
CÚMULO TECIDUAL E ATIVAÇÃO DE EOSINÓFILOS 11
1.5-
USO DE PRODUTOS NATURAIS COM POTENCIAL ATIVIDADE TERAPÊUTICA 15
1.6-A
ESPÉCIE SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS 18
1.7- Flavonóides 20
2.0- O
BJETIVO 23
2.1- Objetivo geral 24
2.2- Objetivos específicos 24
3.0- A
RTIGO PUBLICADO 1: 25
3.1- Pharmacological study of anti-allergic activity of Syzygium cumini (L.) Skeels 26
3.2-
ARTIGO PUBLICADO 2: 28
3.3- Correlation of anti-inflammatory activity with phenolic content in the leaves of
Syzygium cumini (L.) Skeels (MYRTACEAE) 28
4.0-
ARTIGO SUBMETIDO: 30
4.1- Artigo submetido: “Antiallergic effects of the acetate fraction of Syzygium cumini (L.) Skeels
on allergen-induced edema and mast cell degranulation” 30
4.2-
ARTIGO EM PREPARAÇÃO: 54
Artigo em preparação: “Avaliação da atividade antialérgica da fração acetato de etila e de
flavonóides presentes no extrato aquoso de Syzygium cumini (L.) Skeels” 54
5.0-
DISCUSSÃO 93
6.0-
CONCLUSÕES 109
7.0-
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 110
xi
1.0 – Introdução
1
1.0 - Introdução
Alergia é um termo usado para definir a resposta imune exacerbada do organismo a
substâncias que seriam normalmente inertes aos indivíduos não predispostos, mas que possui
um importante aspecto inflamatório em indivíduos predispostos geneticamente ou atópicos. Nas
últimas décadas, a incidência de doenças alérgicas em países industrializados praticamente
dobrou. Cerca de 25-30% da população mundial (aproximadamente 1,8 bilhão de pessoas) tem
algum tipo de alergia como asma, dermatite, rinite e alergias alimentares e são usuários em
potencial de medicamentos antialérgicos (http://www.aaaai.org). Em 2006, o estudo
internacional da asma e das doenças alérgicas na infância mostrou dados epidemiológicos
dessas doenças em diferentes partes do mundo. O Brasil encontra-se entre os países que
estão no topo da lista de prevalência de asma ativa, e dos sintomas de rinites e eczemas em
crianças na idade escolar e nos adolescentes (Solé et al., 2006). Mesmo que, atualmente,
diferentes estratégias terapêuticas estejam disponíveis, a asma, principalmente, e algumas
doenças alérgicas, somente podem ser controladas, mas não curadas (Barnes, 1999). Por esta
razão, a sua prevenção é uma forma de controle primário. Para um tratamento eficaz é
necessário entender as causas e o curso da doença e, para isso se requer um cuidadoso
conhecimento dos mecanismos que precipitam um ou uma série de eventos que desencadeiam
um episódio alérgico. Durante o processo alérgico ocorre a liberação de aminas vasoativas, das
quais se destaca a histamina por ser um dos alvos terapêuticos dos medicamentos antialérgicos
mais utilizados. Esses medicamentos são, em grande maioria, antagonistas de receptores H1
da histamina, capazes de inibir seus efeitos e de prevenir os sintomas agudos da resposta
alérgica. No entanto, nos casos crônicos e/ou mais graves a principal ferramenta terapêutica
disponível ainda é o uso de corticosteróides
(http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.htm).
1.1 - Reações Inflamatórias de Origem Alérgica
2
A reação inflamatória envolve uma longa cadeia de reações e de eventos celulares e
vasculares que ocorrem em resposta a diferentes estímulos; e que levam ao aumento de
permeabilidade vascular, a formação de edema e ao acúmulo de leucócitos. A inflamação
aguda é a primeira resposta do organismo na tentativa de restringir o dano tecidual ou o sítio de
infecção, e, em geral, exibe um rápido desenvolvimento e uma curta duração. No entanto, em
algumas doenças de origem alérgica como rinite, dermatite e asma, a ativação persistente do
sistema imune pode resultar na cronificação da inflamação e do quadro clínico dessas doenças
(revisto por Schmid-Schönbein, 2006; Cohn et al, 2004). Somam-se evidências demonstrando
que diversas citocinas, mediadores inflamatórios e alguns tipos celulares, principalmente
mastócitos, eosinófilos e linfócitos possuem um papel crítico no desenvolvimento dessas
reações que acabam por causar dano no epitélio brônquico, levando a um quadro de
hiperresponsividade das vias aéreas (revisto por Lukacs, 2001; Bochner et al, 2004).
Já está bem estabelecida a participação de linfócitos T αβ CD4+ em reações alérgicas,
secretando preferencialmente citocinas como IL-2, IL-4, IL-5 e IL-13, demonstrando um perfil
Th2. Essas citocinas possuem um papel imprescindível para o desenvolvimento e manutenção
do quadro asmático, regulando a síntese de IgE, a produção de mediadores, a maturação e
ativação de mastócitos e basófilos, e promove o recrutamento de outros tipos celulares (revisto
Herrick & Bottomly, 2003). De fato, experimentos de depleção de linfócitos T αβ CD4
+
demonstram que esses linfócitos são essenciais para a eosinofilia e hiperresponsividade das
vias aéreas. Além disso, camundongos transgênicos, que expressam níveis exacerbados de
citocinas do perfil Th2 (como IL-4 e IL-5) no epitélio pulmonar, apresentam aumento na
eosinofilia e na hiperresponsividade durante a reação alérgica das vias aéreas (Rankin et al.,
1996; Lee et al.,1997; revisto por Romagnani, 2002; Martin et al., 2004). A IL-4 e a IL-13, entre
outras funções, são responsáveis pela mudança de isotipo de imunoglobulina para IgE,
contribuindo para o estabelecimento do quadro atópico (altos níveis de IgE circulante) e
amplificação da reação anafilática. A IgE secretada por linfócitos B liga-se aos receptores FcεRI
de alta afinidade expressos na membrana de mastócitos presentes nos tecidos, e quando há
3
ligação cruzada do antígeno com anticorpos adjacentes esses mastócitos desgranulam
liberando mediadores como histamina, serotonina, mediadores lipídicos e citocinas, como IL-4,
IL-5 e IL-13 (revisto por Larché et al., 2003; Cookson, 2004; Shakoory et al., 2004).
Associado a fenômenos como a síntese de IgE e ao aumento no número de linfócitos T
αβ, o recrutamento de eosinófilos para o sítio inflamatório no curso de respostas alérgicas é
bem característico. Dentre os fatores que coordenam a mobilização de eosinófilos, podemos
citar a IL-5, que induz diferenciação, maturação dessas células na medula óssea, e favorece a
atividade efetora e sobrevida dos eosinófilos (revisto por Ferreira, 2003; Rothenberg & Hogan,
2006). Juntamente com a IL-5, os agentes quimiotáticos CCL11 e CCL5, atraem os eosinófilos
para o tecido inflamado (Palframan et al., 1998; Das et al., 1999). A ativação dos eosinófilos
leva à secreção de proteína básica maior, proteína catiônica eosinofílica, peroxidase
eosinofílica, diversos mediadores inflamatórios (PAF, LTC
4
, etc.) e de citocinas (GM-CSF, TNF-
α, IL-3, IL-5, IL-8, entre outras), favorece a amplificação da resposta imune local, e podendo
levar a importante dano tecidual (revisto por Lampinen et al, 2004; Rothenberg & Hogan, 2006).
1.2-
MASTÓCITOS
Os mastócitos são células tipicamente teciduais, e foram primeiramente descritos por
Paul Ehrlich (1878) que salientou a propriedade metacromática de seus numerosos e
proeminentes grânulos citoplasmáticos (Riley, 1954; Shakoory et al., 2004; Vyas e
Krishnaswamy, 2006). Os mastócitos têm papel fundamental em reações alérgicas, e participam
de outras condições fisiopatológicas tais como cicatrização, doenças auto-imunes (Benoist e
Mathis, 2002), doenças parasitárias e infecciosas (Marshall, 2004), e estão envolvidos na
imunidade inata e adquirida (Stelekati et al., 2007).
Os mastócitos estão amplamente distribuídos pelo corpo, principalmente em tecidos
conjuntivo e sobre a superfície das mucosas, onde eles estão freqüentemente localizados
próximos aos vasos sangüíneos e aos nervos periféricos. Embora os mastócitos sejam células
derivadas de precursores hematopoiéticos da medula óssea, progenitores celulares
4
comprometidos com sua diferenciação circulam em pequenos números no sangue. Esses
migram para tecidos vascularizados e/ou mucosas, onde são submetidos aos estágios finais de
diferenciação e de maturação (revisto por Galli et al., 2005). A população dos mastócitos nos
tecidos é regulada pela combinação: do recrutamento de seus progenitores celulares, da
maturação dos precursores residentes e sobrevida local; e os principais fatores de crescimento
in vivo dessas células em roedores são IL-3 e stem-cell factor (SCF) também conhecido como
KIT ligante (Okayama & Kawakami, 2006). Defeito no SCF ou em seu receptor, conhecido como
KIT, induz profundas conseqüências na população de mastócitos in vivo (Kitamura et al.,1978;
Kitamura & Go, 1979). Deficiência na IL-3 limita o aumento do número de mastócitos durante
infecções por helmintos (Madden et al., 1991) em humanos, SCF em combinação com outras
citocinas como a IL-6 mantêm o crescimento dos mastócitos in vitro (Saito et al., 1996).
Devido a sua localização estratégica, os mastócitos são expostos a estímulos presentes
no ambiente tais como microorganismos e alérgenos com os quais eles reagem, tanto em
minutos como após algumas horas, levando à secreção regulada de mediadores pré-formados
e neo-sintetizados (Puxeddu et al, 2003).
Nas respostas alérgicas, ao entrar em contato com antígenos multivalentes (alérgenos),
ocorre uma agregação das imunoglobulinas E (IgE) aos seus receptores alta afinidade FcεRI
sobre a superfície dos mastócitos, levando a uma exocitose regulada. Isso descreve o
mecanismo pelo qual os mastócitos secretam imediatamente mediadores granulares pré-
formados como histamina, triptase e quimases ou aqueles contidos nas suas vesículas ligadas
a membrana (Brown et al., 2008).
A ativação de mastócitos também leva à síntese e à liberação de mediadores lipídicos
que variavelmente incluem, dependendo das circunstâncias, os metabólitos do ácido
araquidônico, tais como Fator ativador de plaquetas (PAF), prostaglandinas (PG) D2,
tromboxano e leucotrienos (Theoharides et al., 2007). Os mastócitos são importantes fontes de
citocinas tais como a IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 dentre outras, fatores de crescimento como SCF,
GM-CSF e quimiocinas como MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 (Mekori & Metcalfe, 2000). Por essas
5
razões os mastócitos são importantes células associadas às reações de hipersensibilidade
imediata, uma resposta imune que resulta em intensa liberação de mediadores químicos devido
a ativação via interação IgE/FcεRI (Brown et al., 2008). Mastócitos podem ser ativados por
diferentes agentes a partir de vias não imunológicas, como composto 48/80, substância P,
anafilotoxina C5a, C3a etc. Morfologicamente, a desgranulação produzida através das vias
imunológicas e não imunológicas parecem ser similares. Contudo, o processo bioquímico que
leva a liberação dos mediadores, bem como a natureza e quantidade dos mediadores liberados
podem diferir (Puxeddu et al, 2003).
Os mastócitos têm contribuído cada vez mais para o entendimento de alguns efeitos dos
mecanismos de ação de seus mediadores liberados nas inflamações alérgicas. A histamina, um
dos principais conteúdos dos grânulos dos mastócitos, exerce muitos efeitos relacionados à fase
imediata da alergia, incluindo vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, edema
tecidual, contração de músculo liso e aumento da produção de muco (White, 1999). A
importância dos mastócitos nos estágios mais tardios da inflamação alérgica já tem sido descrita
(Willians & Galli, 2000, Liu et al., 2005; Bloemen K, et al., 2007). Nesses estágios, os mastócitos
podem liberar triptases e citocinas como TNF-α que induzem o desenvolvimento de múltiplas
características observadas na asma crônica em camundongos (Nakae et al., 2007, Yu et al.,
2007), como hiperreatividade e remodelamento das vias aéreas, inflamação e produção de
citocinas Th2 (Kariyawasam et al., 2007). Os mastócitos podem interagir e serem ativados pelo
infiltrado de células inflamatórias como eosinófilos e linfócitos, pelas células musculares lisas e
fibroblastos. Os mastócitos também estimulam macrófagos e células epiteliais a gerarem
substâncias que promova o desenvolvimento do perfil Th-2 de citocinas. Na asma tem sido
observado, recentemente, que os mastócitos infiltrados nas vias aéreas e na musculatura lisa
estão correlacionados ao grau de hiper-responsividade das vias aéreas, um fenômeno no
passado atribuído aos eosinófilos exclusivamente (Brightling et al, 2002).
6
Esquema 1: Interação dos mastócitos com outras
células durante a inflamação alérgica. (retirado de
Puxeddu, 2003)
1.3-
CÉLULAS T E A PATOGÊNESE DE INFLAMAÇÕES ALÉRGICAS
De acordo com Romagnani (2000), podemos considerar que existem duas principais
fases no histórico das descobertas sobre a patogênese da alergia. A primeira fase iniciada em
1879, quando Ehrlich descreveu pela primeira vez os mastócitos e eosinófilos; e inclui a
descoberta das reaginas por Prausnitz e Kustner, em 1921, terminando em 1967 com a
identificação da natureza da IgE de anticorpos reagínicos, descritos independentemente por
Ishizaka & Ishizaka e Johansson. O conceito de reação alérgica que emergia do final dessa fase
era que um processo inflamatório era sustentado pela interação entre alergenos ambientais
comuns e anticorpos específicos (IgE) ligados a receptores de IgE sobre mastócitos que
liberavam mediadores. A segunda fase iniciou em 1986 com a descoberta das citocinas
derivadas de células T que regulam a produção de IgE pelas células B, descrito em
camundongos (Coffman e Carty, 1986) e em humanos (Del Prete et al., 1988; Pène et al., 1988),
e inclui a descrição do tipo I (Th1) e do tipo 2 (Th2) de células T “helper” (Th) em camundongos
(Mosmann et al., 1986) e em humanos (Del Prete et al., 1991), e essa fase continua até hoje.
7
Atualmente, por causa de muitas outras descobertas que não têm sido mencionadas aqui,
a reação alérgica parece ser a resposta das células T com perfil de citocinas Th2 a um ou mais
antígenos específicos. (Romagnani, 2000). Embora as manifestações clínicas da resposta
alérgica possam variar, dependendo do local e do antígeno envolvido, é bem estabelecido que a
resposta alérgica consista de uma fase aguda ou inicial envolvendo a desgranulação de
mastócitos acompanhada principalmente, da liberação de histamina, e de outros mediadores
como as citocinas; e a fase mais tardia, é caracterizada pela migração de células inflamatórias
para o sítio alérgico (White, 1999).
Os linfócitos têm importante papel no orquestramento da resposta imune tardio-específica
contra os alérgenos na asma e em outras inflamações alérgicas. É bem caracterizado que em
reações alérgicas há o envolvimento predominante da subpopulação de linfócitos TCD4
+
. Esses
reconhecem antígenos de origem protéica e representam uma das principais fontes de citocinas
para o recrutamento de outros tipos celulares, principalmente eosinófilos. Os linfócitos são
responsáveis pela síntese e liberação de uma variedade de outros fatores solúveis, e pela
expressão de moléculas de adesão que exercem diversas funções na complexa cascata de
eventos que acontece no estabelecimento da resposta alérgica específica (Romagnani, 2000). As
análises do sangue, do lavado broncoalveolar e de biópsias da mucosa brônquica de pacientes
asmáticos revelam uma predominante ativação e participação de linfócitos T CD4
+
que secretam
preferencialmente citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13, demonstrando, assim, um perfil Th-2 de
citocinas (Walker & Amorim, 2001). Essas citocinas possuem um papel imprescindível para o
desenvolvimento e manutenção do quadro asmático, pois ativam vias efetoras inflamatórias
direta ou indiretamente (revisto por Romagnani, 2002)
Em particular, a IL-4 é fundamental para a patogênese das inflamações alérgicas. Ela é
requerida para o desenvolvimento das células Th-2 e, juntamente com a IL-13, regula a síntese
de imunoglobulinas E (IgE) pelos linfócitos B, o que pode contribuir para o estabelecimento do
quadro atópico (altos níveis de IgE circulante), e amplificar a reação anafilática (Metcalfe et al.,
1997; Kay, 1996).
8
A IL-5 é uma das principais citocinas produzidas pelos linfócitos Th-2 envolvida no
acúmulo de eosinófilos nos quadros alérgicos. Essa citocina estimula a produção de eosinófilos
na medula óssea, induz sua migração para o pulmão e aumenta sua atividade e sobrevida no
sítio inflamatório (Ferreira, 2004; Rothenberg & Hogan, 2006). Embora a infiltração de
eosinófilos não seja essencial para o desenvolvimento da resposta imune tardia, se este fato
ocorre, pode contribuir para o dano tecidual, devido à liberação de proteínas catiônicas
(Haselden et al, 2001). Outro grupo celular recrutado para o pulmão durante a resposta imune
tardia, como resultado da atividade dos linfócitos T, são os neutrófilos e os basófilos. Por
conseguinte, essas células podem amplificar a resposta inflamatória através da liberação de
mediadores, porém, seus papéis na asma e em outras doenças alérgicas ainda são incertos
(Macfarlane et al, 2000; Woodruff et al., 2002).
Como observado em modelos experimentais, em condições normais a função
respiratória é normalmente restaurada em 1-3 h após uma exposição ao alérgeno. Contudo, nas
reações alérgicas o sistema imune monta uma complexa e específica resposta que causará
uma recaída da função pulmonar tipicamente entre 6-12 h após uma segunda exposição, mas
que poderá persistir por mais de 24h (Ferreira, 2004). Essa resposta imune é iniciada pelas
células conhecidas como apresentadoras de antígenos profissionais (APCs), preferencialmente
pelas células dendríticas que têm importante ação fagocítica. Essas APCs ativam os linfócitos T
CD4
+
presentes na mucosa pulmonar e nos órgãos linfóides periféricos. Seguindo a ativação
nos linfonodos, as células T adquirem o perfil Th-2 de citocinas, entram na corrente sangüínea
onde circulam até receberem sinais químicos como os de quimiocinas semelhantes a
CCL5/RANTES e CCL3/MIP-1α que podem controlar sua migração (Von et al, 2000). Estas
quimiocinas aumentam avidez de ligação entre as células T e as moléculas de adesão
expressadas na superfície do endotélio. Dessa maneira, os linfócitos T CD4
+
ficam ancorados
no endotélio facilitando sua migração da circulação para o tecido injuriado e com isso parece ter
efeito contraditório, pois indiretamente contribuem para a deleção do antígeno na mucosa; por
9
outro lado, podem mediar e diretamente amplificar a inflamação durante a resposta alérgica
(Haselden, et al, 2001).
+
Enquanto o papel central dos linfócitos T CD4
no desenvolvimento das respostas
alérgicas tem sido demonstrado em vários modelos experimentais, o exato papel das células T
CD8
+
na indução e regulação da resposta mediada por alérgeno permanece ainda incerto. A
presença das células T CD8
+
nas vias aéreas tem sido associada à mortalidade por asma
severa (Magnan et al., 2000; O’Sullivan et al., 2001). Em roedores, as células T CD8
+
podem
apresentar efeitos supressores da resposta alérgica após o desafio antigênico nas vias aéreas
(Allakhverdi et al., 2000). Contudo, algumas evidências contraditórias têm sido observadas em
modelos murinos, mostrando que as células T CD8
+
são essenciais para a hiper-responsividade
das vias aéreas induzida por alérgenos (Schwarze et al., 1999; Hamelmann et al., 1996).
Inicialmente, a produção de IFN-γ pelas células TCD8
+
era definida como supressora de células
T que contra ataca o início da resposta alérgica inibindo a produção de IgE (MacMenamin e
Holt, 1993; Renz et al., 1994). Contudo, tem sido demonstrado que IFN-γ pode contribuir para a
severidade das doenças alérgicas (Corrigan & Kay, 1990; Cembrzynska et al., 1993). As células
com fenótipo de citocinas Th1, quando tranferidas adotivamente juntas com células Th2, podem
exarcebar a inflamação pulmonar mais do que contrabalancear os efeitos das células Th2
(Hansen et al., 1999). Recentemente, foi demonstrado que a diminuição da expressão
intracelular de IL-4 pelas células TCD8
+
, tem papel modulador na terapia de pacientes com
rinite alérgica (Glück et al., 2007).
Outra subpopulação de linfócitos que tem sido descrita e estaá envolvida nas reações
alérgicas são os linfócitos Tγδ. Esses compreendem aproximadamente de 1 a 5% da população
de linfócitos T totais em órgãos linfóides e no sangue periférico de camundongos e de humanos
(Groh et al., 1989, Pawankar et al., 2000). Diferentemente dos linfócitos T αβ, os linfócitos T γδ
estão preferencialmente localizados em tecidos epiteliais e mucosas e são capazes de
reconhecer diretamente antígeno, independente de complexo principal de histocompatibilidade
(Janeway Jr et al., 1988, Spinozzi & Porcelli, 2007), sugerindo um papel particular dessas
10
células na primeira linha de defesa (Williams, 1998; Hayday, 2000, Moser & Brandes, 2006). Os
números de linfócitos T γδ encontram-se aumentados no foco inflamatório durante reações
alérgicas, como na mucosa nasal de pacientes com rinite alérgica, na cavidade pleural,
linfonodo torácico e no sangue de camundongos após desafio antigênico (Spinozzi e Porcelli,
2007, Penido et al., 2008). No entanto, o papel dessas células na patogênese de doenças
alérgicas não está totalmente esclarecido e é controverso, uma vez que autores demonstram
papéis tanto pró quanto antiinflamatório, regulando fenômenos como hiper-responsividade das
vias aéreas e eosinofilia (Zuany-Amorim et al., 1998; Schramm et al., 2000; Lahn et al., 2004).
Esses papéis efetores controversos parecem estar relacionados ao envolvimento dos diferentes
subtipos de linfócitos T γδ em momentos distintos da reposta (Hahn et al., 2003; Hahn et al.,
2004).
1.4-
ACÚMULO TECIDUAL E ATIVAÇÃO DE EOSINÓFILOS
Os eosinófilos são granulócitos produzidos na medula óssea onde se desenvolvem e se
diferenciam de células precursoras primitivas até adquirirem características de células maduras.
Possuem núcleos bilobados e distintos grânulos de diferentes tamanhos e conteúdos.
Provavelmente, uma das principais funções do eosinófilo seja a destruição de parasitas e
bactérias através da liberação de proteínas tóxicas de seus grânulos, como a proteína básica
principal (MBP), a neurotoxina derivada do eosinófilo (EDN), a proteína catiônica do eosinófilo
(ECP) e a peroxidase do eosinófilo (EPO), além de citocinas como TNF-α. Porém, na ausência
de parasitas, os eosinófilos ativados podem causar destruição tissular e inflamação. (Willians,
2004). Essas células são consideradas primariamente teciduais e, em condições normais,
constituem cerca de 1-3% do total de leucócitos circulantes no sangue periférico (Lampinen et
al., 2004).
O acúmulo de eosinófilos no tecido bem como no sangue periférico tem sido
considerado como uma das características centrais e mais marcantes na patogênese das
doenças alérgicas, como a asma, rinite, dermatites, eczemas e etc. O número dessas células
11
encontra-se muito aumentado nos sítios inflamatórios alérgicos e no sangue de indivíduos
atópicos (com altos níveis de IgE circulantes), quando comparados aos indivíduos normais ou
não atópicos (Wardlaw, 2004).
Os mecanismos que controlam a mobilização e o recrutamento dos eosinófilos envolvem
uma combinação da eosinofilopoiese dependente de interleucina 5 (IL-5), da regulação da
adesão ao endotélio vascular e de substâncias quimiotáticas (ver esquema 2; Wardlaw, 2004).
Inicialmente a IL-5 foi descrita como um fator que induzia diferenciação e proliferação de
eosinófilos na medula óssea (Sanderson et al., 1885; Clutterbuck e Sanderson, 1888,
Yamaguchi et al., 1988). Em seguida, foi observado que essa citocina, possuía outras
propriedades, incluindo a habilidade de ativar ou primar eosinófilos (Sehmi et al., 1992;
Warringa et al., 1992; Coeffier et al., 1991) e de prolongar a sua sobrevida in vitro (Tai e Spry,
1991), comprovando um papel crucial da IL-5 na regulação seletiva do crescimento,
diferenciação, ativação e sobrevida dos eosinófilos. Foi demonstrado ainda que, juntamente
com agentes quimiotáticos específicos como a CCL11/eotaxina, a IL-5 pode causar a saída de
eosinófilos da medula óssea sem afetar outros leucócitos (Collins et al., 1995; Palframan et al.,
1998). O atual conhecimento dos mecanismos de recrutamento de eosinófilos é baseado
principalmente no estudo de doenças alérgicas. Estudos em animais têm detalhado as vias
pelas quais esses leucócitos são mobilizados da medula óssea e recrutados para o tecido
inflamado (Rothenberg & Hogan, 2006, Lampinen et al., 2004).
O endotélio venular é um importante ponto de controle para a migração de leucócitos
envolvendo uma série de eventos obrigatórios, sendo cada um controlado por distintas famílias
de receptores de moléculas de adesão e substâncias quimiotáticas (Butcher et al., 1991). O
processo de recrutamento de eosinófilos para o foco inflamatório pode ser dividido nos
seguintes eventos: a) “priming” dos eosinófilos na circulação; b) rolamento ao longo das células
endoteliais; c) adesão firme ao endotélio; d) diapedese transendotelial e quimiotaxia para o sítio
inflamatório (ver esquema 2). Em resumo, eosinófilos “primed” na circulação tendem a
aproximar-se das paredes dos vasos, e devido à interação reversível entre as selectinas dos
12
eosinófilos (L-selectina) e seus ligantes faz com que esse leucócito mova-se lentamente sobre o
endotélio vascular. A expressão de E - e P-selectinas pode ser regulada positivamente por
citocinas como IL-1 e TNF-α, enquanto que a L-selectina é constantemente expressada sobre
os eosinófilos (revisto por Lampinen et al., 2004). As moléculas mais importantes envolvidas
nesta etapa são: o complexo CD11b/CD18 e VLA-4 sobre os eosinófilos e seus ligantes ICAM-1
e VCAM-1 expressados pelas células endoteliais. (Resnick et al., 1993, Sriramarao et al., 1994).
Eosinófilos provenientes de indivíduos não atópicos podem aderir às células endoteliais
ativadas por citocinas como IL-1 e TNF-α, mas esses são incapazes de migrar através do
endotélio. Em contraste, eosinófilos provenientes de indivíduos alérgicos não somente aderem
às células endoteliais como também são capazes de transmigrarem por elas (Bianchi et al.,
1997). O Fator de agregação plaquetária (PAF), leucotrieno (LT) B
4
, fator do complemento C5a
e f-Met-Leu-Phe (fMLP) foram uns dos primeiros fatores quimiotáticos descritos para os
eosinófilos (Resnick et al., 1993). Contudo, todos esses mediadores atuam tanto sobre os
eosinófilos quanto sobre neutrófilos. Quimiocinas da família C-C, como CCL5/RANTES,
CCL3/MIP-1α, dentre outras, e citocinas como IL-3, IL-5, IL-13 e GM-CSF têm sido
reconhecidas com ativadores de eosinófilos (Horie et al., 1997; revisto por Lampinen et al.,
2004). Contudo, nenhum desses mediadores promove um seletivo e específico recrutamento de
eosinófilos. A CCL11/eotaxina ao contrário desses mediadores é um importante agente
eosinofilotático que poussui atividade mínima sobre outros leucócitos (Collins et al., 1995;
Rothenberg, 1999).
Trabalhos têm sugerido que o papel dos eosinófilos na manuntenção e progressão nas
doenças alérgicas das vias aéreas como a asma, pode estar relacionado: (a) ao aumento da
inflamação através da produção de citocinas, incluindo a IL-13, (Mattes et al, 2002;
Zimmermann et al., 2003) e à apresentação do antígeno e ativação das células T CD4
+
(Shi et
al, 2000); e pela (b) remodelação das vias aéreas devido ao aumento da fibrose subendotelial
(Blyth et al, 2000). As citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 produzidas por eosinófilos mantêm o
recrutamento desse leucócito para o tecido injuriado das vias aéreas. A IL-5, GM-CSF e IL-13
13
podem aumentar a sua sobrevida, favorecendo o aumento de proteínas anti-apoptóticas Bcl
(bcl-2 e bcl-xL). Neste sentido, tem sido atribuído aos eosinófilos muito mais que uma ação
efetora relacionada à sua capacidade de induzir dano tecidual e fibrose pela liberação de suas
proteínas tóxicas granulares. Atualmente, têm sido considerados pelo menos dois aspectos
inicialmente responsáveis por esta mudança de paradigma. O primeiro aspecto mostra estudos
em camundongos têm mostrado a ausência de uma desgranulação expressiva dos eosinófilos
em modelos inflamatórios com perfil de resposta Th2, como também uma fraca contribuição das
proteínas granulares dos eosinófilos nos camundongos com alergia pulmonar (Denzler et al.,
2000; Denzler et al., 2001). Associado a isso, em camundongos deficientes em eosinófilos,
observa-se uma diminuição da resposta Th2 tanto em modelo agudo como crônico de alergia
(Lee et al., 2004). O segundo aspecto tem apresentado estudos sobre a resposta imune
associada à alergia pulmonar ou à infecção por parasitas em camundongos. Esses estudos
mostram os eosinófilos como importantes células reguladoras do sistema imune, capazes de
modular a resposta de células T e, também, a inflamação tecidual local (Jacobsen et al., 2008).
Como exemplo dessa função reguladora está o fato dos eosinófilos secretarem mediadores
chaves tanto para a inibição como para a ativação e polarização de linfócitos T, como IL-2, IL-4,
TGF-β e IL-10 (Jacobsen et al., 2007). Juntos, esses estudos mostram que os eosinófilos
possuem papel crítico na regulação da resposta imune Th2, se assemelhando ao dos linfócitos
T (para revisão ver Lee et al., 2001).
14
Esquema 2: Representação esquemática da migração de eosinófilos da medula óssea regulada primariamente
pela IL-5 para o pulmão. Fatores que controlam o processo de rolamento, adesão e diapedese deste leucócito e
ativação das células T. (retirado de Rothenberg, 1999)
1.5-
USO DOS PRODUTOS NATURAIS COM POTENCIAL ATIVIDADE TERAPÊUTICA
A utilização de espécies vegetais, assim como de outros agentes naturais são
considerados os primeiros recursos terapêuticos conhecidos pela humanidade. É de supor que,
no passado, o homem quando acometido de seus males, recorria a alguma fonte que tivesse
poder curativo. O homem intuitivamente buscava descobrir soluções para suas necessidades
básicas, como nutrição e proteção humana. Nesta perspectiva da procura natural, o homem
encontrou nas plantas medicinais, propriedades cujo valor tornou-se reconhecido, e, por tantas
vezes, foi considerado como mágico e até alquimista, sendo transmitido de geração em geração
(Viegas-Jr, et al., 2006). A história mostra que estudos realizados na Tanzânia com chimpanzés
verificaram que esses ingeriam em jejum, folhas de certas plantas que os livravam de vermes
intestinais. (Otte, 1994).
Os primeiros tratados do uso de plantas medicinais datam de cerca de 3000 A.C,
encontrando-se registros na Índia em Hinos religiosos, na China, no Livro de Medicina Interna
do Imperador Amarelo e na Mesopotânia em tábuas suméricas mencionando 1000 plantas com
15
atividades medicinais (Teske, 1997). A medicina tradicional chinesa desenvolveu-se com tal
grandiosidade e eficiência que até hoje muitas espécies e preparados vegetais medicinais são
estudados na busca pelo entendimento de seu mecanismo de ação e no isolamento dos
princípios ativos.
O profundo conhecimento do arsenal químico da natureza, pelos povos primitivos e
pelos indígenas, pode ser considerado fator fundamental para descobrimento de substâncias
tóxicas e medicamentosas, ao longo do tempo. A convivência e o aprendizado com os mais
diferentes grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições para o desenvolvimento da pesquisa
em produtos naturais, do conhecimento da relação íntima entre a estrutura química de um
determinado composto e suas propriedades biológicas. Neste sentido, a natureza forneceu
muitas possibilidades de substâncias que fundamentaram estudos de relação estrutura-
atividade, e inspiraram o desenvolvimento da síntese orgânica clássica (Viegas-Jr et al., 2006).
Ainda hoje vários medicamentos industrializados têm sido desenvolvidos a partir de
plantas medicinais, a noção da ação terapêutica e/ou tóxica das plantas passou a ser objeto de
interesse. Aproximadamente 60% da população mundial se tratam, quase exclusivamente,
através do uso de plantas medicinais e os produtos naturais vêm sendo reconhecidos como
importantes fontes de compostos efetivos terapeuticamente. Vários medicamentos
industrializados foram desenvolvidos a partir de plantas medicinais, com base nas indicações
populares. Muitas plantas estudadas cientificamente e com efeitos farmacológicos já
comprovados, marcam importante contribuição no uso cotidiano. Talvez o marco mais
importante para o desenvolvimento dos fármacos a partir de plantas, tenha sido o
descobrimento dos salicilatos obtidos das cascas de Salix alba (Salgueiro) em 1757, quando
Edward Stone fez as primeiras observações analgésicas e antipiréticas do extrato dessa planta.
No entanto, em 1828 foi feito o isolamento da salicilina, componente do ácido acetil salicílico e
princípio ativo da Aspirina (Peruzzo et al, 1999, Yunes et al., 2001, Weissmann, 1991). Dentre
outros exemplos podem ser citados: digoxina e a digitoxina, dois glicosídeos cardioativos
provenientes da Digitalis lanata, utilizados no tratamento de algumas desordens
16
cardiovasculares (Hollman A, 1996); a morfina, um opióide proveniente da Papaver somniferum,
muito útil na clínica como potente analgésico (Benyhe, 1994); a vincristina e a vimblastina, dois
alcalóides isolados de Cataranthus roseus que funcionam como tratamentos eficazes contra
determinadas neoplasias (Corrêa, 1974). Mais recentemente a artemisinina, importante
antimalárico natural isolado de Artemisia annua, planta muito conhecida e utilizada na medicina
chinesa, que apresenta originalidade e complexidade estruturais capazes de inspirar novos
fármacos úteis para tratamento da malária (Veiga Jr., et al., 2005).
De modo geral, a natureza é a responsável pela produção da maioria das substâncias
orgânicas conhecidas; entretanto, o reino vegetal é responsável pela maior parcela da
diversidade química conhecida e registrada na literatura. A variedade e a complexidade das
micromoléculas que constituem os metabólitos secundários de plantas ainda são inalcançáveis
por métodos laboratoriais (Montanari & Bolzani, 2001).
O Brasil, graças a sua enorme biodiversidade, pode contribuir para o desenvolvimento
de novos medicamentos produzidos a partir de plantas, uma vez que há um estímulo
continuado no estudo de propriedades farmacológicas, na sua maioria tentando comprovar a
validade do uso popular de plantas medicinais. A idéia contida nesses estudos é utilizar os
produtos naturais como tratamento alternativo à terapia convencional. Embora muitas plantas
estejam sendo utilizadas com fins terapêuticos, a maioria ainda não possui dados científicos
que comprovem a sua eficácia e ausência de efeito tóxico no homem, assim como garantia da
qualidade do produto ou de sua produção (Ferreira, 1998). Inicialmente dados sobre o uso de
plantas medicinais no Brasil foram obtidos a partir dos conhecimentos indígenas, dos escravos
e imigrantes, restringindo-se principalmente ao campo (Corrêa, 1998). Em muitos países,
independente de seu nível de desenvolvimento, se têm utilizado as plantas com fim terapêutico
sob diferentes formas de preparo. É utilizado o consumo in natura de plantas frescas até
produtos mais elaborados, de diferentes famílias vegetais como tratamento alternativo à terapia
convencional. Na Europa, a fitoterapia já é parte da medicina tradicional, sendo que extratos de
plantas e componentes ativos, além de produtos medicinais acabados, estão descritos em
17
muitas farmacopéias (Veiga Jr., et al., 2005). A importância dos produtos naturais no
desenvolvimento da indústria farmacêutica mundial fica clara observando-se os dados entre o
período de 1983 a 1994, quando foram aprovados 520 novos fármacos nos EUA e destes 39%
eram produtos naturais ou derivados de substâncias extraídas de plantas (Harvey, 2000). Além
disso, dentre os novos antibióticos e drogas anti-neoplásicas, entre 60 a 80% eram derivadas
de produtos naturais (Strohl, 2000).
1.6- A espécie Syzygium cumini (L.) Skeels
A espécie Syzygium cumini (L.) Skeels, comumente conhecida no Brasil como jambolão,
jamelão, ou jalão, na Índia como gulabjaman, jamun e jabul e nos EUA, como rose apple, black
plum e black berry, inicialmente foi nomeada como Eugenia jambolana Lam (Bhatia, et al.,
1971), e tem como sinonímia os nomes, Syzygium jambolanum (Lam.) DC e Eugenia cumini
Druce (Marchiori & Sobral, 1997). O jambolão (Syzygium cumini (L.) Skeels) é uma planta da
família Myrtaceae, oriunda da Ásia. Essa família possui cerca de 140 gêneros, mais de 3000
espécies e seus dois principais centros de dispersão são América e Austrália (Joly, 1993;
Ribeiro,1999). Existem registros científicos da ocorrência de Syzygium cumini em várias regiões
do Brasil, nos estados de São Paulo, Porto Alegre, Paraná, Florianópolis, Ceará e Rio de
Janeiro (Alberton et al, 2001). Várias espécies dessa família, principalmente as nativas do
Brasil, têm frutos comestíveis, tais como goiaba, araçá, jabuticaba, cabeludinha, guabiroba e
cambuci, entre outras (Joly, 1993). Syzygium cumini é uma árvore que pode chegar a até 10
metros de altura, com copa ampla e muito ramificada. Possui flores creme ou brancas, com
pétalas arrendodadas e caracteristicamente em forma de capuz. Seus frutos são pequenos e
arroxeados quando maduros. O fruto possui uma semente única e grande, quando comparada
com o tamanho do fruto, envolta por uma polpa carnosa semelhante ao fruto da oliveira em
peso e tamanho (ver Fotos I) e tem sabor agradável ao paladar (Craveiro et al, 1983). Para
reconhecer essa família, e até mesmo alguns dos seus gêneros, basta friccionar uma folha, e
18
sentir o aroma característico proveniente da grande quantidade de óleos essenciais ali
presentes (Henriques et al, 1993).
Os gêneros Eugenia e Syzygium figuram entre os mais importantes na família Myrtaceae
com espécies de valores comerciais, nutritivos e com potencial de aproveitamento na obtenção
de fármacos (Donadio, 1997). Além do valor comercial, os extratos obtidos de espécies de
Myrtaceae já foram descritos na literatura por apresentarem várias atividades biológicas, e seu
uso popular tem aumentado cada vez mais.
De acordo com alguns costumes regionais, são relatados na literatura inúmeros efeitos
das espécies de Syzygium. Destaca-se o seu efeito hipoglicemiantes (Petenusci et al., 1986,
Prince et al., 1998, Teixeira & Fuchs, 2006), antiinflamatório (Chaudhuri et al., 1990,
Muruganandan et al, 2001, Muruganandan et al, 2002), antialérgico (Kim et al., 1998) e
antimicrobiano (Mukherjee et al., 1998, Loguercio et al., 2005). Em contrapartida, nesses
estudos, a ausência de uma carcterização química associada à obtenção do extrato e à sua
atividade biológica dificulta a elucidadção das substâncias ativas. A forma de administração dos
chás e extratos também é bastante variável, de acordo com os princípios etnobotânicos. Assim,
a literatura relata extratos aquosos, hidro-alcoólicos e alcoólicos em diversas proporções, feitos
a partir de folhas verdes ou secas, de casca, de frutos, de sementes e, até mesmo, de botões
florais. O presente estudo acerca da utilização de extrato aquoso bruto das folhas de Syzygium
cumini (L.) Skeels ganha relevância dentre outros aspectos, na facilidade de mauseio e de
preparo do extrato e, na proximidade ao uso etnobotânico. Em adição, a caracterização química
realizada a partir do extrato aquoso proveniente das folhas frescas de S. cumini, juntamente
com a comprovação de seus efeitos antialérgicos em modelos de alergia em camundongos,
(Brito et al., 2007) valida cientificamente o seu uso popular.
Em relação às substâncias responsáveis pela atividade antiinflamatória do genêro
Syzygium, há trabalhos relacionando este efeito à presença de flavonóides (Slowing et al, 1996;
Bhatia et al, 1975) e de taninos (Yang et al, 2000). Porém, a identificação da substância isolada
responsável por tal atividade ainda precisa ser descrita.
19
Folhas Frutos (Jamelão) Flor
Fotos I: Espécie Syzygium cumini (L.) Skeels
1.7 FLAVONÓIDES
Os flavonóides foram descobertos em 1930 pelo prêmio Nobel Szent-György que extraiu
a citrina da casca do limão e demonstrou a capacidade dessa substância na regulação da
permeabilidade dos capilares, diferente da vitamina C. Assim, essa classe de produtos naturais
foi inicialmente denominada como vitamina P (de permeabilidade) e também por vitamina C2.
Visto que algumas substâncias pertecentes a esta classe apresentavam propriedades
semelhantes às da vitamina C. Entretanto, a diversidade química encontrada para os
flavonóides impediu a classificação desses compostos como uma única vitamina. Dada a não
confirmação destas substâncias como vitamina, essa classificação foi abandonada em 1950
(Martinez-Flores et al., 2002).
Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados
entre os produtos de origem natural. Essa classe de compostos é amplamente distribuída no
reino vegetal. Têm sido identificadas mais de 4000 estruturas de flavonóides nas plantas
(Harbone et al., 1975; Harbone, 1986). Os flavonóides são encontrados em frutas, vegetais,
sementes, flores e etc. Porém, os flavonóides encontrados nas folhas podem ser diferentes
daqueles presentes nas flores, galhos, raízes ou frutos. O mesmo composto ainda pode
apresentar diferentes concentrações dependendo do órgão vegetal em que se encontra. Eles
são um dos principais componentes das frutas cítricas e de outras fontes vegetais (Herrmann,
1976).
20
Os flavonóides podem ser encontrados em diversas formas estruturais, a maioria dos
seus representantes possui 15 átomos de carbono em seu núcleo fundamental, constituído de
duas fenilas ligadas por uma cadeia de três carbonos entre elas. Nos compostos tricíclicos as
unidades são chamadas de núcleos ou anéis A, B e C (Figura 1a). Eles são usualmente
subdivididos de acordo com os seus substituintes dentro dos flavonóis (b), antocianidinas (c) e
flavonas, flavanonas e chalconas (c).
Figura 1: Núcleo fundamental dos flavonóides (a). Estrutura química das mais comuns tipos dos flavonóides, (b)
flavonóis, (c) antocianidinas, (d) flavonas, (e) flavanonas e (f) chalconas.
(a)
Flavonóide (b) Flavanol (c) Antocinidina
(d) Flavonas (e) Flavanonas (f) Chalconas
Essa subdivisão é primeiramente baseada na presença ou ausência da ligação dupla na
posição 4 do anel C, a presença ou ausência de ligação dupla entre os átomos de Carbono 2 e
3 do anel B, e a presença do grupamento hidroxila no anel B.
Diversas funções atribuídas aos flavonóides presentes nas plantas estão relacionadas
ao metabolismo primário delas. Entre elas podemos citar: (a) proteção dos vegetais contra a
incidência de raios ultravioleta e visível, proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias; (b)
atração para animais polinizadores; (c) possui importantes efeitos nos processos fisiológicos e
bioquímicos da planta com ação antioxidante, controlando a ação dos hormônios vegetais,
21
inibindo enzimas, etc (Middleton et al., 2000). Os flavonóides podem ser utilizados como
marcadores taxonômicos. E isso é devido à sua relativa abundância em quase todo reino
vegetal, especificidade em algumas espécies, relativa facilidade de identificação, etc. As frutas,
principalmente as cítricas e determinadas legumimosas, são as principais fontes desses
compostos reconhecidos como potentes agentes antioxidantes (Lako et al., 2004). Esses
compostos existem a bilhões de anos, podendo ser encontrados em uma grande variedade de
vegetais e são os responsáveis pelo aspecto colorido das folhas e flores. Essa ampla classe de
substâncias de origem natural, cuja síntese não ocorre na espécie humana, possui importantes
propriedades farmacológicas que atuam sobre sistemas biológicos dentre algumas, atividade
antioxidantes (Lako et al., 2004), antialérgica, (Miller, 2001; Hirano et al., 2004), antiinflamatória,
anticarcinogênica (Middleton et al., 2000).
22
2.0 – Objetivos
23
2.1- OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antialérgica e imunomoduladora do extrato aquoso de Syzygium cumini
(S-C), caracterizar quimicamente e identificar as substâncias químicas responsáveis por tal
atividade. Esclarecer os mecanismos celulares e moleculares pelos quais estas substâncias
atuam na reação inflamatória de origem alérgica.
2.2-
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1- Investigar a atividade antialérgica do extrato aquoso bruto de S-C, nos modelos de edema e
pleurisia alérgica.
2- Em parceria com o grupo de química de Produtos Naturais-4 de FarManguinhos, realizar
estudo químico, farmacológico e sazonal do extrato S-C, quantificando os principais
grupamentos químicos e correlacionar com a atividade biológica.
3- Identificar e quantificar o(s) princípio(s) ativo(s) presente(s) na fração acetato de etila de
Syzigium cumini (AC-Sc).
4- Avaliar atividade da fração acetato de Syzigium cumini (AC-Sc) e/ou de seus constituintes:
A) Em modelos in vitro:
i) Desgranulação de mastócitos. Para tal, será quantificada a liberação de histamina e de TNF-
α.
ii) Ativação de eosinófilos e de linfócitos avaliados através da liberação de citocinas e
quimiocinas e para os eosinófilos a análise da quimiotaxia. Além disto, na população de
linfócitos será analisada a expressão de fator de translocação nuclear.
B) Em modelos in vivo:
i) Indução de edema de pata por diferentes mediadores.
ii) Indução da pleurisia alérgica, avaliando-se os seguintes parâmetros: extravasamento
protéico, migração de células inflamatórias, produção de citocinas e quimiocinas.
24
3.0 - Artigo publicado 1
25
3.1- Artigo 1:
Pharmacological study of anti-allergic activity of Syzygium cumini (L.) Skeels
Brito FA, Lima LA. Ramos MFS, Nakamura MJ, Cavalher-Machado SC, Siani AC, Henriques
MGMO, Sampaio ALF.
Revista: Brazilian Journal of Medical Biological Research 40 (1) 2007; 110-115.
Espécies vegetais da família Myrtaceae são amplamente usadas na medicina popular e
os gêneros Syzygium e Eugenia figuram entre os mais importantes na família Myrtaceae, com
espécies de valor comercial, nutritivo e com potencial de aproveitamento na obtenção de
fármacos (Donadio, 1997). A espécie Syzygium cumini (L.) Skeels é comumente conhecida no
Brasil como jambolão ou jamelão. Diferentes partes da planta têm sido descritas por possuirem
propriedades medicinais, dentre as quais as mais conhecidas são as antidiabética e anti-
diarreica de suas sementes (Prince, et al, 1998, Chopra et al,1958; Ratsimamanga, 1973;
Petenusci, 1986). Foi descrita a atividade antiinflamatória do extrato etanólico de Syzygium
cumini, inibindo o edema de pata induzido por carragenina e histamina (Muruganadan et al.,
2001; Muruganadan et al., 2002), entretanto a ausência de caracterização química deste extrato
dificulta a elucidação de suas substâncias biologicamente ativas.
Neste trabalho tivemos como objetivo caracterizar quimicamente e avaliar a atividade
antialérgica do extrato aquoso bruto das folhas de Syzygium cumini (L.) Skeels (S-C). A análise
por cromatografia de alta eficiência (CLAE) revelou que os taninos hidrolisáveis e os flavonóides
são as substâncias majoritárias do extrato aquoso bruto das folhas de S-C. Para a avaliação da
atividade antialégica foram utilizados modelos experimentais murinos que retratam eventos
iniciais da resposta alérgica, como a formação de edema de pata, induzido pelo composto 48/80
ou pelo estímulo antigênico com ovoalbumina, analisando os mediadores envolvidos nestes
processos. O modelo de pleurisia alérgica em camundongos foi utilizado para avaliar a
capacidade do extrato S-C em alterar o acúmulo de leucócitos e produção de citocinas, eventos
estes que retratam aspectos mais tardios da resposta alérgica. A partir deste estudo,
concluímos que o pré-tratamento oral com o extrato S-C, é capaz de inibir a formação de
26
edema de pata alérgico, basicamente pela ação do extrato em impedir o processo de
desgranulação mastocitária e conseqüente liberação de histamina. Foi demonstrado ainda que
o tratamento com o extrato aquoso S-C, inibiu o acúmulo de eosinófilos na cavidade pleural,
que é uma das características mais marcantes da resposta alérgica pulmonar, via a inibição dos
mediadores eosinolilotáticos CCL11/eotaxina e IL-5.
27
3.2 – Artigo publicado 2
28
2.3- Artigo 2:
Correlation of anti-inflammatory activity with phenolic content in the leaves of Syzygium
cumini (L.) Skeels (MYRTACEAE)
Lima LA, Brito FA, Henriques MGMO, Sampaio ALF. Siani AC, Riehl CAS
Revista: Química Nova, Vol. 30, No. 4, 860-864, 2007
No trabalho anterior demonstramos a atividade antialérgica do extrato aquoso bruto de
Syzygium cumini (L.) Skeels (S-C) sobre importantes parâmetros da alergia. Demonstramos
que o pré-tratamento com o extrato S-C inibe a formação do edema de pata induzido pelo
potente desgranulador de mastócito, o composto 48/80, apresentando significativa ação anti-
histamínica também comprovada em ensaios in vitro.
O estudo das propriedades biológicas de produtos de origem vegetal está intimamente
relacionado com a escolha da planta sobre diferentes aspectos, como ambiental, climático,
físico dentre outros. Desta forma, a época em que uma planta é coletada é um dos fatores de
maior importância. Visto que a quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza dos constituintes
ativos não é constante durante o ano. Neste trabalho foi feito uma avaliação das alterações
sazonais da atividade apresentada pelo extrato aquoso S-C. Folhas da espécie Syzygium
cumini (L.) Skeels, foram coletadas mensalmente durante o período de um ano, e foram
avaliadas a atividade antiedematogênica e o conteúdo fenólico, principalmente de flavonóides e
de taninos das folhas, durante este período. Para isto, foi utilizado como solvente o acetato de
etila que favorece a obtenção destas substâncias. Identificamos neste trabalho que o período
entre os meses de novembro a janeiro, é a melhor época sazonal para a coleta e obtenção dos
extratos. Demonstramos ainda que a atividade inibitória contra o edema de pata causado pelo
composto 48/80, é mantida na partição em acetato de etila do extrato, que foi ativa até a dose
de 0,01μg/kg.
29
4.0 - Artigo submetido
30
4.1 – Artigo submetido
Antiallergic effects of the acetate fraction of Syzygium cumini (L.) Skeels on allergen-
induced edema and mast cell degranulation
Brito FA, Tappin MR, Carvalher MS, Siani AC, Henriques MGMO.
Revista Planta Médica (submetido)
Os trabalhos anteriores demonstraram uma relevante atividade antialérgica do extrato
aquoso bruto das folhas da espécie de Syzygium cumini (L.) Skeels (S-C), pertencente à família
Myrtaceae. Foi observado que o tratamento oral com o extrato aquoso bruto de S-C apresenta
uma significativa ação antiedematogênica. Tanto sobre o edema induzido por estímulo não
imunológico, como o composto 48/80 (C48/80), quanto por estímulo imunológico, como a
ovoalbumina (OVA) em camundongos sensibilizados, ou ainda induzidos por histamina ou
serotonina. O tratamento com a partição acetato de etila do extrato aquoso, que é enriquecida
de componentes fenólicos, manteve a atividade edematogênica apresentada pelo extrato bruto,
e foi efetiva em doses bem menores. Os flavonóides são grupos polifenólicos que possuem
muitas atividades biológicas, dentre elas a atividade antioxidante (Lako et al., 2004),
antialérgica, (Miller, 2001; Hirano et al., 2004), antiinflamatória, anticarcinogênica (Middleton et
al., 2000), e são encontrados naturalmente em frutas, vegetais, folhas, sementes etc.
Neste trabalho tivemos como objetivo investigar o potencial antialérgico e/ou
imunomodulador da fração acetato de etila do extrato aquoso de S-C sobre o modelo de edema
de pata induzido por diferentes estímulos, além de caracterizar, identificar e quantificar
quimicamente alguns de seus constituintes. Além disto, foram realizados estudos na tentativa
de esclarecer os possíveis mecanismos pelos quais estas substâncias atuam na fase inicial
reação inflamatória de origem alérgica.
31
4.1 – Artigo submetido
Antiallergic effects of the acetate fraction of Syzygium cumini (L.) Skeels on allergen-
induced edema and mast cell degranulation
Brito FA, Tappin MR, Carvalher MS, Siani AC, Henriques MGMO.
Abstract
Myrtaceae is a plant family widely used in folk medicine. Syzygium cumini (L.) Skeels
belongs to this family and aqueous leaf extract of presents an anti-allergic property. In this study
we investigated the anti-allergic activity of the acetate fraction of Syzygium cumini (L.) Skeels
(SC fraction). Chemical analysis reveled that the flavonoids contents from SC fraction were
9.53% and among then, myricetin was 1.96% and quercetin 0.31%. Oral pre-treatment with the
SC fraction (0.01-100 μg/kg) significantly inhibited paw edema induced by compound 48/80 (100
ng/paw; 60% at higher dose) and the allergic paw edema (OVA, 3 μg/paw; 50% at higher dose)
but was less effective to inhibit edema induced by histamine (30% of inhibition; 100 μg/kg). Pre-
treatment with SC fraction (0.1-100 μg/mL) prevented mast cell degranulation and,
consequently, histamine release in Wistar rat peritoneal mast cells induced by C 48/80 (5
μg/mL). This histamine inhibition was also observed after mast cell pre-treatment with both
myricetin or quercetin (1-100 μg/mL), the identified flavonoids from the SC fraction. Moreover,
pre-treatment with the SC fraction (1-100 μg/mL) and with myricetin or quercetin almost
abolished the TNF-α level in supernatant of sensitized mast cells challenged in vitro with
DNP/BSA (1µg/mL). These findings demonstrate the anti-allergic effect of the SC fraction, which
includes the inhibition of edema formation and histamine and TNF- α release caused by mast
cell degranulation.
32
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36
INTRODUCTION
Syzygium cumini (L.) Skeels (syn., Eugenia jambolana Lamk) is an evergreen tree from the
Myrtaceae family, native to southern Asia and Australia that now can be found growing
throughout tropical regions [1, 2]. Popularly has several common names, including jamun, jabul,
gulabjaman, jambolão, jamelão, jalão, rose apple, and black plum and is widely used in folk
medicine. The fruit and seeds are used in traditional medicine to treat diarrhea, dysentery and to
control diabetes [3, 4, 5, 6]. Pharmacological studies have showed hypoglycemic, bactericidal
and gastroprotective effects of different extracts of S cumini [7, 8, 9]. The anti-inflammatory
activity of the ethanolic bark extract has been reported in carrageenan and formaldehyde paw
oedema [10]. The same extract was also showed to inhibit histamine; 5-HT and PGE2-induced
paw oedema [11]. Beside these effects, our group has recently demonstrated that aqueous leaf
extract of S cumini inhibited edema formation induced by compound 48/80 and in less intensity
the allergic paw edema in sensitized animals. This property was shown to be mediated by the
inhibition of mast cell degranulation and the consequent release of histamine, an inflammatory
mediator involved in vascular permeability. We have also, demonstrated that aqueous leaf
extract of S cumini inhibit eosinophil influx into the allergic site via the inhibition of IL-5 and
eotaxin generation [12]. Moreover we described that hydrolysable tannins and flavonoids are the
major components of the aqueous leaf extract of S cumini and that this components are
concentrated in the partition with ethyl acetate [12, 13].
Flavonoids are low molecular weight coumpounds composed of a three-ring structure with
various substitutions. They are found in fruits, vegetables, nuts, seed herbs, spices, stems,
flowers, as well as tea and red wine. Certain plants and spices containing flavonoids have been
used for thousands of years in traditional Eastern medicine and have been demonstrated that
flavonoids possess vasoprotective, anti-inflammatory, anti-allergic, antimicrobial,
antihepatotoxic, anti-osteoporotic and anti-neoplastic action [14]. In the current study we have
characterized and quantified the flavonoids contents of S cumini acetate fraction and
37
investigated the anti-allergic activity of acetate fraction and two flavonoids and their ability to
inhibit mast cell degranulaton.
38
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Animals
Male BALB/c mice (18-20 g), Swiss Webster mice (20-25 g) and Wistar rats (180-200 )
provided by Oswaldo Cruz Foundation breeding unit (CECAL-FIOCRUZ) were used. The
animals were allowed a standard pellet diet and tap water ad libitum in a room with temperature
ranging from 22 to 24
o
C under a cycle of 12 h light/darkness. All experiments were performed in
accordance with Committee on Ethical Use of Laboratory Animals of Fundação Oswaldo Cruz
and to the ethical guidelines of International Association for the Study of Pain [15].
2.2. Plant material and fraction preparation
Entire branches of Syzygium cumini (L.) Skeels (Myrtaceae) were collected in Rio de
Janeiro, Brazil. The plant material was identified by Dr. Graziela M. Barrozo (in memoriam) from
the Botanic Garden of Rio de Janeiro, and a voucher was deposited in the Herbarium of the
Botanic Garden of Rio de Janeiro under the number HB-83016. Aqueous extract of S. cumini
was obtained by decoction of fresh leaves in distilled water (100 g/L) during 3 to 5 minutes as
described in [12]. The extract was filtered, lyophilized and stored at room temperature. This
extract was partioned in ethyl acetate and total tannins contents were removed by encubating
this fraction with polimere polyvinylpolypyrrolidone (1/1) as described in [13].
2.3. Chemical analysis of the SC fraction
The SC fraction was analyzed by High Performance Liquid Chromatography, on a Shimadzu
Prominence equipment (Kyoto, Japan) with the following modules: Communications Bus Module
CBM-20A, Liquid Chromatograph pump LC-20AT equipped with a gradient valve, Diode Array
Detector SPD-M20A and Auto Sampler SIL-20A. Column used was a Kromasil C18 (250 mm x
4.6 mm, 5 μm particle size). Method consisted in a linear gradient, mobile phase consisted of
Solvent A (ammonium acetate buffer 5mM adjusted to pH 4.5:acetonitrile 90:10 v/v), Solvent B
(acetonitrile), the gradient program was: at 0 min. 100% of solvent A; at 60 min. 76% of solvent
39
A; at 61 min. 100% of solvent A, kept constant to 76 min. Flavonoids were monitored at 350 nm.
Flavonoid portion of the sample were determined by the examination of the UV spectrum of each
peak, Miricetin and Quercetin were identified by coinjection. Flavonoids quantitation:
flavonoids were determined using Quercetin (99% dihydrate, Acros organics, New Jersey USA)
as reference. A calibration curve was established with six concentrations that ranged from 0.7 to
90.2 μg/ml, and the reference solutions and the sample ware all analyzed with three replicates.
2.4. Treatments
Animals fasted overnight received either the antihistamine agent, the H
1-
receptor antagonist
promethazine (10 mg/kg, p.o) or ethyl acetate SC fraction (0,1-100 μg/kg p.o.) in a final volume
of 200 μl, 1 h prior stimulation. The control groups were similarly treated with the corresponding
vehicle alone.
For in vitro assays, mast cells were incubated, with the ethyl acetate SC fraction,
flavonoids (0.01-100 μg/mL) or with disodium cromoglycate, a classic membrane stabilizer of
mast cells (DSCG; 10.2μg/well) 1 h prior stimulation 1 h prior stimulation.
2.5. Induction of Paw oedema
Paw oedema was induced as previously described [12]. In briefly, Swiss mice received an
intraplantar (i.pl.) injection of compound 48/80 (C48/80; 100 ng/paw), histamine (HIS; 100
μg/paw), or serotonin (5-HT; 100 μg/paw) into one hind paw. The final volume was 50 μL and
the contralateral paw received the same volume of sterile saline and served as control. The
volumes of each hind paw were measured by using a plethysmograph (Ugo Basile, Italy), 30 min
after stimulation.
Animal sensitisation and allergic paw oedema were performed as described (12). Briefly,
animals were sensitized with subcutaneous (s.c). Injection of 100 μl. of a mixture of ovalbumin
(OVA, 50 μg) and aluminun hydroxide (Al (OH)
5 mg). Fourteen days later, animals were
3,
40
challenged by an i.pl. injection of OVA (3 μg/paw) and induction of paw oedema evaluated 30
min after stimulation.
2.6. Mast cell purification and histamine quantification
Mast cells were purified under continuous Percoll gradient as previously reported [16].
Briefly, cells were recovered from the peritoneal cavity of normal Wistar rats after rinsing with 20
mL of heparinized (10 IU/mL) calcium and magnesium- free Hank`s solution (HBSS
-
). After
centrifugation of the cells at 150 g for 10 min, the supernatant was discarded and the pellet
resuspended in HBSS
-
containing 0.1 % bovine serum albumin (BSA). Cells were pooled and
mixed with isotonic Percoll (72 %), overlaid with 1 mL of HBSS
-
. Purified mast cells were
resuspended in Hank`s solution containing Ca
2+ 2+ +
and Mg (HBSS ). Purity (95 %) and viability
(98 %) were evaluated by Toluidine blue and Trypan blue exclusion staining, respectively. The
cells were added to a 24-well plate (10
5
cells/well) and preincubated for 1 h with dried SC
fraction dissolved in HBSS
+
, flavonoids (0,01-100 µg/mL), or with disodium cromoglycate
(DSCG; 10.2 μg/mL) in a 5 % CO
2
atmosphere, at 37
o
C. After this period, cells were incubated
for 30 min with 5 µg/mL C48/80 and the reaction was stopped in ice. Histamine was quantified in
the supernatant by a fluorimetric assay as previously described [17]. The fluorescence intensity
was measured at 450 nm (excitation at 360 nm) with a Spectra Max Gemini EM
spectroflurometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). The inhibition percentage of
histamine release was calculated using the following equation: % Inhibition =100 − {(histamine
release with S-C x 100) / histamine release without S-C}.
2.7. TNF-α Quantification
Levels of TNF-α - were evaluated in the supernatant of mast cell sensitized in vitro with IgE.
Purified mast cell from peritoneal cavity of mice were added to a 96 well plate (10
5
cells/well) and
incubated with anti-DNP IgE at 1 µg/mL overnight at 5% CO
2
atmosphere, 37°C. After this
period, sensitized mast cells were incubated with DSCG (10,2 µg/mL), SC fraction, myricetin or
41
quercetin (100 µg/mL. After 1 hour, cells were challenged with DNP-BSA (1 µg/mL) and the
supernatants were collected 4 h later and stored (-20°C). Levels of TNF-α were evaluated by
sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using matched antibody pairs from
PharMingen (San Diego, CA), according to the manufacturer’s instructions. Results are
expressed as pg per cavity and values were obtained by comparison with a standard curves
3.0. Statistical Analysis
Data are reported as the mean ± SEM and were analyzed statistically by means of
analysis of variance (ANOVA) followed by Newman-Keuls-Student test or Student t test. Values
of p< 0.05 were regarded as significant.
42
RESULTS
Quantification of flavonoids in acetate fraction from aqueous leaf extract of S cumini by
chromatography
Chromatograms were recorded and flavonoids portion of the sample were determined by the
examination of the UV spectrum of each peak, figure 1C. Total flavonoids contents were
determined using quercetin as reference. Myricetin (4) and quercetin (5) peaks were identified
by the comparison of their spectra with those of pure standards co-injected. The identity of the
compounds was confirmed by comparing the spectroscopic data with that of references [19].
The flavonoids contents from acetate fraction were 9.53% and among then, myricetin was1.96%
and quercetin 0.31%.
Effect of S. cumini acetate fraction on paw oedema triggered by compound 48/80 or
ovoalbumin
To assess the effect of S-C in allergic reactions, we first used the model of anaphylaxis oedema
caused either by the mast-cell degranulator, compound 48/80 or by OVA in sensitized animals.
The i.pl. administration of C48/80 into mice hind paw triggered a significant oedema 30 min after
the injection as shown in figure 2A. Oral pre-treatment with acetate fraction of S-C inhibited the
oedema formation at doses of 1, 10 and 100 μg/kg (maximal inhibition of 60% at 100 μg/kg).
Conversely, the pre-treatment with promethazine was able to inhibit the oedema in 72%. Figure
2B shows that OVA (3 μg/paw) triggered a paw swelling within 30 min in sensitized mice. The
oral pre-treatment with acetate fraction of S-C (0.01-100 μg/kg) leads to a significant (41%)
inhibition of allergic paw oedema with no differences observed between the doses tested. It is
noteworthy that the acetate fraction was able to inhibit allergic oedema to almost the same
extent as promethazine, an anti-histaminic compound (50% of inhibition at the dose of 10
mg/Kg)
43
Effect of acetate fraction of S. cumini extract on histamine release from rat peritoneal
mast cells and on histamine induced paw oedema
To investigate a possible directly anti-histaminic effect of SC fraction we used the paw
edema model induced by histamine. As observed in Figure 3B the i.pl. administration of
histamine (100 μg/paw) into the hind paw of naive mice induced a significant paw edema 30 min
after the injection which was inhibited by promethazine administration (10 mg/kg, p.o., 46.4 %
inhibition). The oral treatment with SC acetate fraction was able to inhibited the edema only at
the higher dose utilized (100μg/kg) from 67 ± 4.2 to 48.7 ± 3.8 μL of oedema (≈30% of inhibition;
p<0.05).
Mast cell degranulation followed by the release of vasodilators mediators (mainly
histamine) is the major event of allergic oedema. In this set of experiments we investigated the
effect of SC acetate fraction on mast cells degranulation by means of histamine release. As
shown in Figure 3A, stimulation with C48/80 (5μg/ml) induced a release of 5.86ng/mL of
histamine on RPMC that was inhibited with disodium cromoglycate treatment, a classic
membrane stabilizer of mast cells (66% of inhibition). Pre-treatment with SC (10 and 100 μg/mL,
1 h before C48/80) were able to inhibit significantly the histamine released from mast cells (50
and 70% respectively) suggesting that SC acetate fraction acts directly on mast cell.
In order to evaluate the bioactive substances present in the SC acetate fraction, we
analyzed the effect of myricetin and quercetin on histamine release from mast cells. As observed
in Figure 4 the in vitro pre-treatment with the flavonoids, myricetin (1- 100 μg/mL Fig 4A), or
quercetin (0,1- 100 μg/mL Fig 4B) were able to inhibit significantly the histamine release from
mast cell stimulated with C48/80 achieving the maximal inhibition of 73% e 67% respectively.
Effect of S. cumini acetate fraction and flavonoids on TNF-α released from mast cells
The cytokine TNF- α is one of the important mediators released from mast cells and is
involved in the establishment and maintenance of an allergic reaction. Here we investigated the
44
effect of S. cumini acetate fraction and the flavonoids, myricetin and quercetin on the in vitro
production of this cytokine. Fig. 5 A demonstrates increased levels of TNF-α in supernatant of
sensitized mast cells challenged in vitro with DNP/BSA (1µg/mL; from 2,897 ± 0,006 to 8,975 ±
0,346ng/mL). The in vitro pre-treatment with S-C fraction (1-100 µg/mL) induced a significant
inhibition of the production of this cytokine (40% of inhibition by cromoglicate and 84% of
inhibition by SC fraction; Fig. 6A). It is noteworthy that pre-treatment of mast cell with quercetin
or myricetin (1-100 µg/mL) almost abolished the TNF-α production (Figs 5B and 5C). This effect
was confirmed by means of microscopic analysis of mast cells stained with toluidine blue. We
observed a predominance of degranulated cells in IgE sensitized mast cells challenged with
DNP. Conversely most of the mast cells observed in groups treated with disodium cromoglycate
or S-C acetate fraction are preserved (Fig 6).
45
(A) (B)
QUERCETINA MIRICETINA
(C)
(4)
(5)
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(1)
(2)
(3)
Figure 1: Chemical structure of quercetin (A) or myricetin (B) and HPLC chromatogram of the
SC fraction showing typical patterns of flavonoids (C) in the UV-Visible absorption (350nm)
spectra. Total flavonoids (9.53%) contents were determined using quercetin as reference.
Myricetin (4) and quercetin (5) were identified by the comparison of their spectra with those of
pure standards co-injected and represent 1.96% and 0.31%, repectively
46
Sal Pro 0.01 0.1 1 10 100
0
25
50
75
***
***
*
***
C48/80 + + + + + + +
Acetate fraction (μg/kg)
A
Sal - saline
Pro - promethazine
Acetate fraction
Paw oedema (
μ
L)
Sal Pro 0.01 0.1 1 10 100
0
25
50
75
100
***
***
***
***
***
Ovalbumin + + + + + + +
Acetate fraction (μg/kg)
B
Paw oedema (
μ
L)
Figure 2: Effect of acetate fraction oral pretreatment in different doses on paw oedema induced
by C48/80, 100ng/paw (A), or OVA, 3 μg/paw (B). Promethazine (10mg/kg, p.o.) was used as
reference inhibitor. Results were expressed as the mean ± S.E.M. from at least seven animals
per group.* represents statistically significant difference (p≤ 0.05) between treated and untreated
groups.
47
Sal Pro 0.1 1 10 100
0
25
50
75
100
Acetate fraction (μg/kg)
***
*
Histamine + + + + + +
A
Sal - saline
Pro - promethazine
Acetate fraction
Paw oedema (
μ
L)
Medium C48/80 DSCG 0.1 1 10 100
0.0
2.5
5.0
7.5
C48/48 - + + + + + +
Acetate fraction (μg/mL)
**
***
*
+++
B
Histamine (ng/mL)
Figure 3: Effect of acetate fraction oral pretreatment in different doses or promethazine
(10mg/kg, p.o.) on paw oedema induced by histamine (A). In (B) effect of in vitro treatment with
acetate fraction on histamine release by RPMC induced by (C48/80; 5µg/mL). DSCG
(10.2μg/well) was used as reference inhibitor. Histamine measurement from supernatant was
performed by fluorimetric assay. Results were expressed as the mean ± S.E.M. from at least five
animals per group.* represents statistically significant difference (p≤ 0.05) between treated and
untreated groups.
48
Medium C48/80 DSCG 0.1 1 10 100
0.0
2.5
5.0
7.5
C48/48 - + + + + + +
Myricetin (μg/mL)
+++
***
***
**
*
A
Histamine (ng/mL)
Medium C48/80 DSCG 0.1 1 10 100
0.0
2.5
5.0
7.5
C48/48 - + + + + + +
Quercetin (μg/mL)
+++
***
**
**
**
***
B
Histamine (ng/mL)
Figure 4: Effect of myricetin (A) or quercetin (B) in vitro treatment at different doses (0.1-
100µg/mL) on histamine release by RPMC induced by (C48/80; 5µg/mL). DSCG (10.2μg/well)
was used as reference inhibitor. Histamine measurement from supernatant was performed by
fluorimetric assay. Results were expressed as the mean ± SEM from 2 triplicates experiments. +
represents statistically differences (p≤ 0.05) between stimulated and non-stimulated groups and
* represents differences between treated and untreated groups.
49
Medium IgE CG M 1 M10 M100
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
+++
**
***
***
***
α DNP/IgE + + + + + +
My ric etin ( μg/mL)
DNP/BSA - + + + + +
B
TNF-
α
(ng/mL)
Medium IgE CG F 1 F10 F100
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
+++
**
***
***
***
α DNP/IgE + + + + + +
Acetate fraction (μg/mL)
DNP/BSA - + + + + +
A
Figure 5: In vitro effect of acetate fraction (A), myricetin (B) or quercetin (C) treatment at 1, 10
and 10µg/mL on TNF-α synthesis by sensitized mice mast cells induced with anti DNP/IgE
(1µg/mL) and challended in vitro with DNP/BSA (1µg/mL). The culture supernatant was collected
4h after DNP/BSA-stimuli. TNF-α measurement were performed by ELISA. Results were
expressed as the mean ± SEM from one triplicate experiment. + represents statistically
significance differences (p≤ 0.05) between stimulated and non-stimulated groups and *
represents differences between treated and untreated groups.
Medium IgE CG Q 1 Q10 Q100
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
+++
**
α DNP/IgE + + + + + +
Quercetin (μg/mL)
DNP/BSA - + + + + +
***
***
***
C
TNF-
α
(ng/mL)
TNF-
α
(ng/mL)
50
D
B
C
A
400 x
400 x
400 x
400 x
Figure 6: Photomicroscopy of sensitized mast cells challenged in vitro with DNP/BSA (1µg/mL).
(A) represent medium group, (B) untreated group. (C) and (D) represent treated groups with
DSCG or SC fraction respectively.
51
Discussion
The present study demonstrates that the S-C acetate fraction and the flavonoids
quercetin and myricetin present in the
fraction exhibit important anti-allergic properties, which are
marked by inhibition of edema formation, mast cell degranulation, and consequently inhibition of
histamine and TNF-α released. Treatment with the SC fraction inhibited the paw edema
triggered by C48/80, a potent mast cell degranulator, to the same extent as promethazine, the
reference antihistaminic compound tested. This treatment also inhibited the paw edema
triggered by antigen-challenge, although this effect was not similar to that observed on C48/80-
induced edema. It is well established that mast cell activation may be initiated upon interaction of
an allergen with its specific IgE antibody attached to the cell membrane through high-affinity
receptor FcεRI;
[19] this causes the release, in the tissues, of several inflammatory mediators
such as histamine, 5-HT, PAF and several cytokines including IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α [19,
20].
Once produced and stored, histamine is liberated in large quantities during the immediate
phase of allergic reactions, evoking features such as plasma leakage and edema [12, 21, 22].
The involvement of this mediator has been suggested to be not only an early-phase mediator
producing clinical allergic symptoms through binding specific cell receptors, H1 to H4 [23], but
also a participant during the late-phase allergic response, activating neutrophils and eosinophils
and being a chemoattractant for these cells [24]. Moreover, histamine increases IL-8 levels and
evokes leukocyte rolling in endothelial cells [23, 25]. The anti-histaminic effect of the SC acetate
fraction was evaluated against histamine-induced hind paw edema in mice. It is noteworthy that
the treatment with the SC acetate fraction was not markedly significantly against histamine-
induced paw edema been far less effective than that obtained with promethazine, the reference
anti-histaminic compound tested. Nonetheless, the mechanisms by which the SC fraction inhibits
allergic-induced edema might differ from those underlying the actions of promethazine (i.e.,
histamine H
1
receptor blockade [26]. The SC acetate fraction effectively inhibited in vitro
52
histamine released from mast cell degranulation that was induced by C48/80 as well as
degranulation after antigen challenge with DNP-BSA.
The potential importance of TNF-α in asthma, and in mouse models of allergic airway
inflammation, is a topic of considerable interest [27]. TNF contributes to the ability of mouse
mast cells to recruit neutrophils to sites of IgE [28] and TNF can induce lung neutrophil infiltration
and airway hyperreactivity [29, 30]. In addition, TNF immunoreactive cells, most of which were
mast cells, were increased ~6-fold in airway submucosa biopsies of patients with asthma
compared with normal controls [31] and anti-TNF therapy reduced signs and symptoms of
asthma in some subjects with severe asthma [32, 33]. The SC acetate fraction effectively
inhibited in vitro TNF-α released from mast cell degranulation that was induced by antigen
challenge with DNP-BSA. In addition, flavonoids quercetin and myricetin present in the
fraction
was much more efficient than the reference compound DSCG at inhibiting TNF-α production
caused by antigen challenge in mast cell and seems to be one of the major components
responsible for this effect.
In light of such considerations, it appears that the anti-allergic properties of the SC-fraction can
be ascribed to the inhibition of pro-inflammatory mechanisms triggered by a direct action on
mast cell membrane inhibiting the relase of inflammatory mediators.
Acknowledgements
This work was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq, Brazil). F.A. Brito is a post-graduated fellow of FAPERJ (Brazil).
53
4.2 - Artigo em preparação
54
4.2 – Artigo em preparação
“Avaliação da atividade antialérgica da fração acetato e de flavonóides presentes no
extrato aquoso de Syzygium cumini (L.) Skeels”
Brito FA, Rosas EC, Henriques MGMO.
Artigo em preparação.
Os trabalhos anteriores demonstraram a atividade antialérgica do extrato aquoso
bruto de Syzygium cumini (L.) Skeels, inibindo dentre outros aspectos o recrutamento de
eosinófilos para a cavidade pleural de camundongos alérgico, via inibição de mediadores
eosinofilotáticos. Demonstramos que a fração acetato de etila obtida do extrato bruto S-C
manteve a atividade antiedematogênica ativa em doses bem menores do que o tratamento com
o extrato bruto. Identificamos que entre os flavonóides majoritários quantificados a miricetina
representa 1,96% e a quercetina 0,31% dos flavonóides presentes na fração. E que estas
substâncias possuem ações diretas sobre mastócitos, que estão estreitamente relacionados
aos estágios iniciais da alergia e, conseqüentemente podem estar modulando respostas mais
tardias (Puxeddu et al., 2003).
Neste trabalho tivemos como objetivo avaliar a ação da fração acetato de etila e dos
flavonóides miricetina e quercetina sobre modelos experimentais que estão associados aos
aspectos mais tardios da resposta alérgica, como recrutamento celular, produção de citocinas,
ativação de fatores de transcrição, dentre outros. E desta forma tentar identificar alguns dos
mecanismos de ação que estas substâncias de origem vegetal possam estar modulando ou
inibindo a resposta alérgica em camundongos.
55
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1321.
58
com a inibição da síntese de CCL11/eotaxina, CCL5/RANTES, e também de IL-2 e IL-4 através
da redução da translocação NFкB por esplênócitos de camundongos.
57
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63
Introdução
O acúmulo tecidual de eosinófilos tem sido considerado como característica central e
mais marcante na patogênese das doenças alérgicas, como a asma, rinite, dermatites e etc. O
aumento do número de eosinófilos pode chegar até 100 vezes mais nos sítios inflamatórios, do
que em situações normais (Wardlaw, 2004). Ainda não é estabelecido o papel preciso dos
eosinófilos no desenvolvimento e na persistência dessas doenças. Contudo, especula-se que
tal papel pode estar relacionado ao aumento da inflamação através da produção de citocinas, à
apresentação do antígeno e ativação das células T CD4
+
(Shi et al, 2000; Mattes et al, 2002);
pela remodelação das vias aéreas e fibrose subendotelial (Blyth et al, 2000). As citocinas IL-4,
IL-5 e IL-13 produzidas por eosinófilos e linfócitos mantêm o recrutamento deste leucócito para
o tecido injuriado das vias aéreas. Neste sentido, tem sido atribuído aos eosinófilos, muito mais
do que uma ação efetora relacionada à sua capacidade de induzir dano tecidual e fibrose pela
liberação de suas proteínas tóxicas granulares (Denzler et al., 2000). Estudos mostram os
eosinófilos como importantes células reguladoras do sistema imune, capazes de modular a
resposta de células T, e também a inflamação tecidual local (Jacobsen et al., 2008). Como
exemplo desta função reguladora está o fato dos eosinófilos secretam mediadores chaves tanto
para a inibição, como para a ativação e polarização de linfócitos T, como IL-2, IL-4, TGF-β e IL-
10 (Jacobsen et al., 2007).
Os mecanismos que controlam a mobilização e o recrutamento dos eosinófilos envolvem
uma combinação da eosinofilopoiese dependente de interleucina 5 (IL-5), da regulação da
adesão, e das interações com o endotélio vascular dependentes de substâncias quimiotáticas
(Wardlaw, 2004). A IL-5 é crucialmente importante como um fator de crescimento seletivo, e
juntamente com agentes quimiotáticos específicos como a CCL/eotaxina pode causar a saída
de eosinófilos da medula óssea sem afetar outros leucócitos (Williams, 2004, Collins et al,
1995).
Recentemente, nosso grupo demonstrou que o extrato aquoso das folhas da espécie de
Syzygium cumini (L.) Skeels (S-C) apresentou propriedades antialérgicas (Brito et al, 2007). O
64
água. O extrato bruto (S-C) depois de devidamente filtrado e liofilizado foi fracionado por
partição água:acetato de etila na proporção (1:1), respectivamente conforme descrito por Lima
et al., 2007. O conteúdo de taninos condensados presente na fração acetato de etila, foi
removido com a utilização de polímero de polivinilpolipirrolidona (PVPP), os taninos se
complexam ao PVPP, que é insolúvel em água, e posteriormente o conteúdo de substâncias
fenólicas simples foi quantificado pelo método de Folin - Ciocauteult (Lima et al., 2007). O
extrato bruto bem como a fração acetato de etila da espécie de (S-C), foram fornecidos pela
equipe chefiada pelo Dr. Antônio Carlos Siani do Laboratório de Química de Produtos Naturais
4, Far-Manguinhos FIOCRUZ, responsável pela coleta, extração e identificação e
caracterização química da fração.
Tratamentos
A fração acetato e os flavonóides foram administrados por via oral (200 μL) nas doses
0,1; 1; 10 e 100 μg/kg, 1 h antes do estímulo. Foram utilizados como inibidores de referência a
dexametasona (10 mg/kg, i.p.) ou prometazina (30 mg/kg; p.o) 1 h antes do estímulo. Para os
ensaios in vitro as células foram incubadas com as amostras na dose de 100 μg/mL ou
dexametasona 10 μg/mL ou PDTC 1 μM, 1h antes do estímulo com Ova (10μg/mL).
Indução da Pleurisia Alérgica
Os camundongos Balb/c foram sensibilizados por uma injeção subcutânea na região do
dorso com uma suspensão de hidróxido de alumínio [Al (OH)
3
; 5mg] e Ovoalbumina (Ova, 50
μg/animal) diluída em salina (200 μL/animal). Quatorze dias após a sensibilização, os animais
foram desafiados com o antígeno pela injeção intratorácica (i.t) de uma solução de Ova (12,5
μg/cavidade) em um volume final de 100 μL. Os animais controles receberam igual volume de
salina estéril. Em específicos intervalos de tempo após o desafio, os camundongos eutanizados
com CO
tiveram suas cavidades torácicas expostas e lavadas com 1 mL de PBS/EDTA (1
2,
66
mg/mL; pH=7,4). O lavado pleural foi recolhido para avaliação do acúmulo de leucócitos totais e
diferenciais no sítio inflamatório.
Contagem de leucócitos
A avaliação da contagem total do número de leucócitos no lavado pleural foi feita em um
contador automático de partículas (Counter – Coulter), a partir de uma alíquota retirada do
lavado pleural, diluída 200 vezes em solução de Isoton
®
(Coulter) acrescida de uma gota de
Zap-ogolbin
®
(Coulter) para a lise de hemácias. A contagem diferencial foi realizada através de
citoesfregaços (Citocentrífuga Shandon, USA), corada pelo método de May-Grünwald-Giemsa,
com auxílio de microscópio óptico sob objetiva de imersão (100x; Olympus, Japão). Os
leucócitos foram identificados em células mononucleares, neutrófilos e eosinófilos. Os
resultados foram expressos como milhões de células por mL.
Citometria de fluxo
6
Células provenientes da cavidade pleural (10
/100 μL) foram imunomarcadas com
específicos anticorpos monoclonais conjugados com FITC ou PE para as moléculas: CD3, CD4,
CD8, TCRγδ, CD25 por 30 min a 4°C, após a incubação com soro de rato inativado para
bloquear os sítios inespecíficos. As células foram lavadas com PBS/azida 0,1%, e a análise dos
marcadores de superfície foram realizadas pelo programa Cell Quest no citomêtro de fluxo
FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Aproximadamente 10
4
linfócitos foram
adquiridos por amostra. Para determinação dos percentuais das subpopulações dos linfócitos,
foi feito um gate específico na região dos linfócitos T CD3. Os dados foram representados como
números de células por cavidade, após a multiplicação do percentual dos subtipos de células T
pelo número total de leucócitos na cavidade pleural.
Dosagem de citocinas por método imunoenzimático (ELISA)
67
Foi utilizado o método de ELISA utilizando anticorpos específicos para cada mediador
investigado, seguindo a metodologia descrita pelo fabricante Pharmingen (San Diego, CA). Os
níveis de IL-2, IL-4, IL-5, CCL11/eotaxina e CCL5/RANTES foram invstigados no lavado pleural
de camundongos alérgicos, recolhido 24 horas após o desafio antigênico, e no sobrenadante da
cultura de esplênócitos de camundongos estimulados in vitro com OVA. Os resultados foram
expressos em picogramas por mL, e os valores foram obtidos por comparação usando
respectivas curvas padrão de cada citocina.
Obtenção e purificação de eosinófilos
Os eosinófilos foram obtidos a partir da cavidade peritoneal de ratos Wistar normais.
Para tanto, os animais foram eutanizados em câmara de CO
2
, e sua cavidade peritoneal foi
lavada com 20 mL de meio RPMI / EDTA 10 mM. Em seguida, as células foram sedimentadas
através da centrifugação a 2000 rpm por 10 min a 20
o
C.
Para a etapa de purificação dos eosinófilos, utilizou-se gradiente descontínuo de Percoll
(56% e 72%). O gradiente é centrifugado a 2500 RPM por 30 min a 20
o
C, sem aceleração ou
desaceleração. Recolhe-se a fração formada entre as bandas de Percoll. As células coletadas
foram lavadas com RPMI-1640 e submetidas a posteriores centrifugações a 1500 rpm por 10
min, para retirada de resíduos do Percoll. O pellet celular obtido foi, então, ressuspendido em 1
depositados os eosinófilos num total de 2 x 10
5
células/ 50 µl. No processo de montagem da
câmara, no compartimento inferior foi colocado uma membrana de nitrocelulose com poro de 3
µm (Toyo), previamente umedecido em RPMI-1640, e sobre esta uma membrana de silicone. A
câmara foi assim posteriormente incubada, a 37
o
C por 2 h, em estufa contendo atmosfera de
5% CO
2
.
4
Os eosinófilos foram plaqueados na densidade celular de 10
células/poço e incubados
com fração acetato ou flavonóides (100 µg/mL) ou dexametasona (0,005 μM) por 1 hora. Após
esse período, as células foram estimuladas com IL-5 (10 ng/mL) por 15 minutos e
posteriormente adicionados aos poços da câmara de Boyden frente ao estímulo quimiotático de
eotaxina (10ng/mL ou 1mM). Após este período a membrana foi corada utilizando o kit panótico
deixando-a por 5 min em cada passo, lavada com PBS e com auxílio de microscópio de luz foi
feito à contagem das células que migraram para a membrana. Os dados foram expressos como
média do número de células contadas em três diferentes campos.
Preparo de células para análise de NFkB
A translocação de NFkB foi analisada in vitro a partir de esplênócitos provenientes de
camundongos Balb/c sensibilizados previamente (50mg Ova/5mg AL(OH), s.c.). As células
foram adicionadas a placas de 24 poços (5x10
5
células/mL) em meio RPMI 1640 suplementado
com 10% de soro fetal e gentamicina (25 μg/mL), incubadas com a fração acetato ou
flavonóides (100 μg/mL) ou com PDTC (1 μM) for 1 h a 37°C com 5% CO
2
, e estimulados com
Ova (10 μg/mL) por 6 h. Após este período a placa foi centrifugada (500 x g, 10 min) e as
células foram ressuspendidas em tampão A de lise gelado [10 M HEPES (pH=7,9), 10 mM KCL,
0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1mM DTT, 0,5 mM PMSF] e transferidas para microtubos, 15 min
após incubação em gelo foi adicionado Nonidet P-40 numa concentração final de 5% (v/v). Os
tubos foram centrifugados (14000 x g; 5 min à 4ºC). O pellet nuclear foi ressuspendido em
tampão gelado C [20 mM HEPES (pH = 7,9), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM
DTT, 1 mM PMSF, 1mg/mL pepstatina, 1mg/mL leupeptina, e 20% glicerol] e incubados por 30
69
min. As proteínas nucleares foram coletadas do sobrenadante após centrifugação (14000 x g
por 10 mim, 4/C). O conteúdo total de proteína presente no extrato celular foi quantificado
segundo método descrito por Bradford, 1976.
Preparo e análise de imumo blot
O lisado celular foi desnaturado em tampão Laemmli (50 mM Tris-HCl, pH=6,8; 1% SDS;
5% 2-mercaptoetanol; 10% glicerol; 0,001% de azul de bromofenol) e aquecido em banho de
água fervente por 3 min. Amostras com 10 μg de proteína foram colocadas em gel SDS-PAGE
12%, e as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Hybond-C Purê,
Amersham Pharmacia biotech, San Francisco, CA). As membranas foram bloqueadas com
PBS-Tween (0,5% Twee-20) contendo 2% de soro de albumina bovina e marcado com
específico anticorpo monoclonal anti NFkB/p65 (1:500, Santa Cruz, CA). Após extensivas
lavagens em PBS-Tween, a membrana de nitrocelulose foi incubada com anticorpo biotinilado
anti-rabbit IgG (1:1000 Sigma) por 1h e então incubado com estreptoavidina/HSP (1:1000)
(Catalg Laboratories, Burlingame, CA). As proteínas imunoreativas foram reveladas por 3,3´-
diaminobenzidina (DAB, Sigma). As bandas foram quantificadas por densitometria, usando o
software Image-Pro Plus (Media Cyberneties, Silver Spring, MD, USA).
Análise Estatística
Os resultados serão expressos como média ± erro padrão da média (EPM), sendo
avaliados estatisticamente pela análise de variância seguida pelo Newman-keuls test. A
significância estatística será considerada para valores de p ≤ 0,05.
70
RESULTADOS OBTIDOS
1- Efeito do pré-tratamento com a fração acetato obtida do extrato aquoso bruto de
S.cumini sobre a pleurisia alérgica
Vinte e quatro horas após a injeção intratorácica (i.t.) de ovoalbumina (OVA 12,5
μg/cavidade), ocorre um intenso acúmulo de leucócitos totais, células mononucleares e
eosinófilos na cavidade torácica, que são tipos celulares que caracterizam bem a resposta
alérgica induzida neste tempo. Foi observado ainda um pequeno número de neutrófilos na
cavidade pleural de camundongos Balb/c. Como o esperado, o pré-tratamento com o fármaco
de referência dexametasona (10 mg/kg, i.p.), inibiu significativamente (p≤ 0,001) o influxo
desses leucócitos para cavidade pleural. O pré-tratamento oral com a fração acetato reduziu o
número total de leucócitos (Figura 1A) e de neutrófilos (Figura 1C) acumulados na cavidade
pleural também maneira significativa (p≤ 0,05), porém não foi capaz de alterar os números de
células mononucleares (Figura 1B). A Figura 1D mostra que tratamento com a fração acetato,
em todas as doses testadas, inibiu de maneira significativa (p≤ 0,001) o acúmulo pleural de
eosinófilos, em torno de 61%, sem diferença estatística entre elas. O tratamento com a maior
dose apresentou valores de inibição de 1,88 ± 0,63 para 0,30 ± 0,50 x10
6
células/cavidade.
2- Efeito do pré-tratamento com a fração acetato obtida do extrato aquoso bruto de
S.cumini sobre a produção de CCL11/Eotaxina, CCL5/RANTES e Interleucina-5 na
pleurisia alérgica
Com o objetivo de melhor entender o efeito da fração acetato sobre a mobilização de
eosinófilos durante a pleurisia alérgica, nós investigamos o efeito in vivo do pré-tratamento oral
da fração em suas diferentes doses sobre os níveis de CCL11/Eotaxina, CCL5/RANTES e de
interleucina-5 no lavado pleural de camundongos previamente sensibilizados. Como mostrado
na Figura 2, a injeção (i.t.) com OVA, foi capaz de aumentar significativamente os níveis das
quimiocinas eosinofilotáticas CCL11/Eotaxina, CCL5/RANTES e também os níveis de IL-5
presentes no lavado pleural destes animais. Na figura 2A observa-se que o pré-tratamento oral
71
com todas as doses usadas da fração (0,1; 1; 10 e 100μg/kg), foi capaz de reduzir de maneira
muito significativa (p≤0,001) os níveis de CCL11/eotaxina no lavado pleural. O tratamento com a
dose de 100
≤μg/kg), foi capaz de reduzir de maneira
muito significativa (p≤0,001) os níveis de CCL11/eotaxina no lavado pleural. O tratamento com a
dose de 100
pleurisia alérgica. Na figura 4, observa-se que a injeção (i.t.) com OVA eleva significativamente
os níveis destes mediadores no lavado pleural de camundongos previamente sensibilizados.
Como mostra a figura 4A, os tratamentos com a miricetina ou quercetina na dose de 100μg/kg,
(p.o.), 1 h antes, reduziram significativamente (p≤0,001) os níveis de CCL11/eotaxina no lavado
pleural, em 23% e 28% de inibição, respectivamente. A figura 4B mostra o efeito inibitório do
tratamento com os flavonóides sobre os níveis de CCL5/RANTES no lavado pleural. O tratamento
com miricetina ou quercetina apresentou uma inibição em torno de 20%. Na figura 4C, observa-se
que o tratamento com os dois flavonóides também reduzem de maneira significativa (p≤0,001) os
níveis de IL-5 no lavado pleural de camundongos alérgicos, em torno de 23%.
5- Efeito do pré-tratamento com a fração acetato obtida do extrato aquoso bruto de
S.cumini, Miricetina ou Quercetina sobre a quimiotaxia de eosinófilos em Câmara de
Boyden
CCL11/eotaxina é uma importante quimiocina responsável pela migração de eosinófilos
no processo inflamatório alérgico. Para avaliar esse fenômeno, foi feito o ensaio de quimiotaxia
de eosinófilos através da câmara de Boyden. A figura 5A mostra que na presença de
CCL11/eotaxina ocorre um aumento significativo na quimiotaxia de eosinófilos, e o pré-
tratamento (1h) in vitro com a fração acetato (F), miricetina (M) ou quercetina (Q), inibe de
forma significativa (p≤0,001) o processo quimiotático deste leucócito diante ao estímulo in vitro
com CCL11/eotaxina (10ng/mL), em torno de 75% de inibição para F; 56% para M e 50% para
Q. Na figura 5B observa-se que quando os eosinófilos são incubados na presença dos lavados
pleurais provenientes de animais alérgicos e tratados in vivo com a fração acetato ou com os
flavonóides, a quimiotaxia destas células na câmara também é inibida (p≤0,001) apresentando
percentual de inibição de 64% para F, 73% para M e 77% para Q, isto é, valores comparáveis
ao observado no grupo tratado com o fármaco dexametasona que apresentou 62% de inibição,
(de 226,7 ± 8,6 para 85,70 ± 3,380 células. Confirmando que o tratamento com as amostras
73
reduz os níveis de eotaxina no lavado pleural de camundongos alérgicos e conseqüentemente
a migração de eosinófilos in vivo e in vitro.
6- Efeito do tratamento com a fração acetato obtida do extrato aquoso bruto de S.cumini
sobre o acúmulo de linfócitos na pleurisia alérgica
A análise por citometria de fluxo representada na figura 6 mostrou o acúmulo dos
subtipos de linfócitos T na cavidade pleural de camundongos alérgicos 24 e 48 horas após
desafio antigênico com ova. As figuras A e B respectivamente mostram que em 24 h já ocorre
um aumento significativo (p≤0,001) do influxo dos subtipos T CD3
+
/CD4
+
(de 0,02 ± 0,01 para
0,07 ± 0,007 x 10
6 + +
células/cavidade) e de T CD3 /CD8 (de 0,009 ± 0,004 para 0,024 ± 0,004 x
10
6
células/cavidade) para a cavidade pleural e que tende à um discreto aumento em 48 h. As
figuras C, D e E representam respectivamente o acúmulo total bastante significativo em 48 h, de
0,01 ± 0,002 para 0,026 ± 0,003 para T CD3
+ +
/CD25 , de 0,0010 ±. 0,002 para o subtipo T
CD4
+ + 6
/CD25 e de 0,003 ± 0,001 para 0,009 ± 0,001 x 10 células/cavidade para o subtipo T
CD3
+
/γδ
+
. O pré-tratamento com dexametasona foi capaz de inibir o influxo de todos os
subtipos, enquanto que o tratamento com a fração acetato não reduziu a migração de linfócitos
para a cavidade pleural de animais desafiados antigenicamente com ova nos tempos
estudados.
7- Efeito do pré-tratamento in vitro com a fração acetato obtida do extrato aquoso bruto
de S.cumini ou com os flavonóides sobre a produção de CCL11/Eotaxina por
esplênócitos tratados e estimulados in vitro
Vinte e quatro horas após o desafio antigênico in vitro com OVA (10 μg/mL) ocorre um
aumento significativo dos níveis de CCL11/eotaxina no sobrenadante de esplênócitos
provenientes de animais sensibilizados, e o tratamento com dexametasona, reduz em 78% a
produção do mediador. A figura 7A, mostra que o tratamento com a fração acetato (0,1, 1, 10 e
74
100μg/mL) inibe os níveis de CCL11/eotaxina de maneira dose dependente, em torno de 34%,
51%, 90% e 100% de inibição respectivamente, praticamente abolindo os níveis da quimiocina
ocorre um aumento significativo dos níveis de IL-2 e IL-4 no sobrenadante de esplênócitos
provenientes de animais sensibilizados, e o tratamento com dexametasona, reduziu em 99% a
produção dos mediadores. A figura (A) mostra que tanto o tratamento com a fração acetato
quanto com miricetina ou quercetina (100 μg/mL) reduzem os níveis de interleucina 2 em torno
de 73%, 100% e 93% respectivamente. A figura (B) mostra uma significativa redução dos níveis
de interleucina 4, com o tratamento com a fração acetato, miricetina ou quercetina (100μg/mL )
em 84, 70 e 53%, respectivamente.
10- Expressão de NFк-B/p65 em esplênócitos estimulados in vitro com ovoalbumina e
tratados com a fração acetato e flavonóides
Nas respostas alérgicas a síntese de diversas citocinas e quimiocinas são reguladas a
partir da translocação de fatores nucleares como o NFкB. A figura 10 mostra que seis horas
após o estímulo in vitro com ova (10 μg/mL), esplênócitos provenientes de animais previamente
sensibilizados têm os índices de translocação nuclear da subunidade p65 de NFкB aumentados
no núcleo de 2,86 (banda A – translocação basal) para 10,13 de expressão (banda B), o pré-
tratamento in vitro com o inibidor de referência PDTC (1 μM) reduz estes índices para 6,66
(banda C) de expressão. O tratamento in vitro com a fração acetato (100μg/mL) reduz a
expressão de NFкB (5,50; banda D) com valores inferiores ao observado no grupo controle. O
tratamento com miricetina e quercetina (100μg/mL) também levam a uma redução das
subunidades p65 de NFкB, para 8,82 e 9,06, bandas E e F, respectivamente. E
conseqüentemente pode impedir a síntese de alguns mediadores inflamatórios.
76
0.0
2.5
5.0
7.5
++
***
Sal - salina
Ova - ovoalbumina
Dexa - dexametasona
M - mir ac etina
Q - quercetina
B
Células mononucleares
(x10
6
células/cavidade)
0
4
8
12
***
+++
A
Total de Leucócitos
(x 10
6
células/cavidade)
Sal Ova Dexa M Q
0.0
2.5
5.0
***
(100μg/kg)
***
***
+++
D
Eosinófilos
(x10
6
células/cavidade)
Ova (i.t.) - + + + +
Sal Ova Dexa M Q
0
1
2
3
**
+++
C
(100μg/kg)
Ova (i.t.) - + + + +
Neutrófilos
(x10
6
células/cavidade)
Figura 3: Efeito do pré-tratamento oral (200μL) com os flavonóides miracetina (M) e quercetina (Q)
(100μg/kg, p.o) sobre a pleurisia alérgica. A pleurisia alérgica foi induzida 24 h após o desafio antigênico
com (OVA: 12,5 μg/cavidade) em camundongos previamente sensibilizados. A contagem total e
diferencial de leucócitos foi realizada 24 h após o desafio. Os resultados foram expressos como média ±
SEM de pelo menos 7 animais. * Indica diferença de significância estatística (p≤ 0.05) entre o grupo
estimulado e não tratado com os grupos tratados.
+
indica valores de p≤ 0,05 quando comparado ao
grupo salina.
79
Sal Ova Dexa M Q
0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
***
***
***
(100μg/kg)
++
B)
CCL5/RANTES (ng/mL)
Sal Ova Dexa M Q
0.000
0.025
0.050
0.075
***
***
***
+
(100μg/kg)
Sal - salina
Ova - ovoalbumina
Dexa - dexametasona
M - mir ac etina
Q - quercetina
A)
CCL11/eotaxina (ng/mL)
Sal Ova Dexa M Q
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
***
***
***
(100 μg/kg)
++
C)
Interleucina - 5 (ng/mL)
Figura 4: Efeito do pré-tratamento oral com miricetina (M) ou quercetina (Q) (100 μg/kg, p.o.), sobre os
níveis de CCL11/Eotaxina em (A), CCL5/RANTES em (B) e interleucina-5 em (C), presente no lavado
pleural de camundongos alérgicos. Os sobrenadantes foram coletados 24 h após o estímulo com
salina ou OVA (12,5 μg/cavidade) * Indica diferença de significância estatística (p≤ 0,05) entre o grupo
estimulado e os grupos tratados.
+
indica valores de p≤ 0,05 quando comparado ao grupo salina.
80
Meio Eotaxina Dexa F M Q
0
50
100
150
+++
***
***
***
***
Tratamento:
CCL11/Eotaxina:
- + + + + +
(100μg/mL)
A)
Número de eosinófilos
(média)
Sal Ova Dexa F M Q
0
100
200
300
***
***
***
***
++
Lavado peural:
(100μg/kg)
B)
Número de eosinófilos
(média)
0
100
200
300
+
CCL11/eotaxina: - +
Número de osinófilos
Figura 5: Quimiotaxia de eosinófilos em Câmara de Boyden. Em (A) eosinófilos de rato Wistar foram
isolados em gradiente de Percol e encubados com a fração acetato ou com os flavonóides isolados
(100μg/mL) durante 1h. Todas as amostras foram previamente sensibilizadas com IL-5 (3μM) e
encubadas para migração durante 2h sob o estímulo de eotaxina (1nM) em estufa de CO
2
a 37°C. Em (B)
os lavados pleurais são provenientes de animais alérgicos e tratados in vivo com as amostras (100μg/kg)
e colocados em contato com eosinófilos de ratos para análise de migração. O Insert representa os
valores de migração diante do estímulo com eotaxina (1nM).O valor de P mostrado é referente a
comparação com eotaxina. Os resultados foram expressos como média
+ SEM,
+
indica valores de p≤
0,05 quando comparado ao grupo salina ou meio.
81
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
Salina
Ovoalbumina
Dexametasona
Fração acetato
24
48
horas
0.00
0.05
0.10
0.15
24
48
horas
Figura 6: Acúmulo de linfócitos T e de seus subtipos CD3
+
/CD4
+
em (A), CD3
+
/CD8
+
em (B),
CD3
+
/CD25
+
em(C), CD4
+
/CD25
+
em (D), CD3
+
/γδ
+
em (E), na cavidade pleural de camundongos
sensibilizados e pré-tratados com a fração acetato (100μg/kg), 24 e 48 horas após o estímulo com
OVA (12,5 μg/cavidade). Os resultados foram expressos como média ± SEM de pelo menos 5
animais. * Indica diferença de significância estatística (p≤ 0.05) entre o grupo estimulado e não tratado
e os grupos tratados.
+
indica valores de p≤ 0,05 quando comparado ao grupo salina.
+++
+++
*
***
***
A)
Linfócitos
4
+
(x10
6
/caviCD3
+
/CD dade)
++
+
*
*
B)
Linfócitos
CD3
+
/CD8
+
(x10
6
/cavidade)
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
24
48
horas
+
+++
**
***
*
C)
Linfócitos
CD3
+
/CD25
+
(x10
6
/cavidade
0.00
0.01
0.02
0.03
)
+
+++
**
*
***
24
48
horas
Linfócitos
CD4
+
/CD25
+
(x10
6
/cavidade)
D)
0.000
0.005
0.010
0.015
24
48
horas
++
++
Linfócitos
CD3
+
/
γδ
+(x10
6
/cavidade)
E)
82
Meio Ova Dexa 0,1 1 10 100
0.0
0.1
0.2
++
***
***
***
***
***
Fração acetato (μg/mL)
A)
CCL11/Eotaxina (ng/mL)
Meio Ova Dexa 0,1 1 10 100
0.0
0.1
0.2
++
***
***
***
***
***
Miracetina (μg/mL)
B)
CCL11/Eotaxina (ng/mL)
Meio Ova Dexa 0,1 1 10 100
0.0
0.1
0.2
++
***
**
**
***
Quercetina (μg/mL)
C)
CCL11/Eotaxina (ng/mL)
Figura 7: Efeito do pré-tratamento com a fração acetato em (A) ou com os flavonóides miracetina (B),
quercetina (C) em diferentes doses (0,1 - 100 μg/mL.), sobre os níveis de CCL11/Eotaxina, presentes
no sobrenadante de esplênócitos provenientes de animais sensibilizado e estimulados in vitro com ova
(10μg/mL). Os sobrenadantes foram coletados 24 h após o estímulo * Indica diferença de significância
estatística (p≤ 0.05) entre o grupo estimulado e não tratados e os grupos tratados.
+
indica valores de
p≤ 0,05 quando comparado ao grupo meio.
83
Meio Ova Dexa 0,1 1 10 100
0.0
0.1
0.2
0.3
++
**
**
**
***
Fração acetato (μg/mL)
A)
Meio Ova Dexa 0,1 1 10 100
0.0
0.1
0.2
+++
****
**
***
Miracetina (μg/mL)
**
CCL5/RANTES (ng/mL)
B)
Figura 8: Efeito do pré-tratamento com a fração acetato em (A) ou com os flavonóides miracetina (B),
quercetina (C) em diferentes doses (0,1 - 100 μg/mL.), sobre os níveis de CCL5/RANTES, presentes
no sobrenadante de esplênócitos provenientes de animais sensibilizado e estimulados in vitro com ova
(10μg/mL). Os sobrenadantes foram coletados 24 h após o estímulo * Indica diferença de significância
estatística (p≤ 0.05) entre o grupo estimulado e não tratados com os grupos tratados.
+
indica valores
de p≤ 0,05 quando comparado ao grupo meio.
CCL5/R E g/mL)S (nANT
Meio Ova Dexa 0,1 1 10 100
0.0
0.1
0.2
+++
**
**
**
***
Quercetina (μg/mL)
**
CCL5/RANTES (ng/mL)
C)
84
Meio Ova Dexa F M Q
0.0
0.1
0.2
100μg/mL
***
***
**
++
***
A)
Meio
Ova - ovoalbumina
Dexa - dexametasona
F - Fração acetato
M - Miricetina
Q - Quercetina
Interleucina - 2 (ng/mL)
Meio Ova Dexa F M Q
0
1
2
100μg/mL
**
**
**
Interleucina - 4 (ng/mL)
++
***
B)
Figura 9: Efeito do pré-tratamento oral com a fração acetato em ou com os flavonóides miracetina ou
quercetina na dose de 100 μg/mL, sobre os níveis de IL-2 em (A) e IL-4 em (B), presentes no
sobrenadante de esplênócitos provenientes de animais sensibilizado e estimulados in vitro com ova
(10μg/mL). Os sobrenadantes foram coletados 24h após o estímulo * Indica diferença de significância
estatística (p≤ 0.05) entre o grupo estimulado e não tratados com os grupos tratados.
+
indica valores
de p≤ 0,05 quando comparado ao grupo meio.
85
A B C D E F
NFкB (p65)
Histona H3
Meio OVA FPDTC
QM
A)
NFкB (p65)
Histona H3
Meio OVA FPDTC
QM
A)
Meio Ova PDTC F M Q
0
5
10
15
B)
Translocação de NF-kB
(unidades densitométricas)
Figura 10: Analise por Western blot de NFκB (α-p65 MAb, Santa Cruz). Os níveis de proteína foram
determinados a partir do extrato nuclear de esplênócitos provenientes de camundongos alérgicos e
estimulados in vitro com OVA (10μg/mL) e pré tratados ou não com (PDTC;1nM) ou fração acetato ou
os flavonóides (100 μg/mL) por 1h. O extrato nuclear foi coletado 6h após o desafio antigênico. Um
total de 10μg de proteína foram aplicados por lane (A). Os valores foram expressos por análise
densitométrica (B).
86
Discussão
Baseados em recentes trabalhos do nosso grupo e associados aos trabalhos descritos na
literatura, a espécie Syzygium cumini (L.) Skeels pertencente da família Myrtaceae, apresenta-
se como uma importante fonte vegetal com substâncias biologicamente ativas presentes em
seus extratos e responsáveis por diversas atividades (Brito et al, 2007, Lima et al., 2007, Prince
et al., 1998, Chaudhuri et al.,1990). Neste presente estudo, nós demonstramos que a fração
acetato de etila obtida do extrato aquoso bruto das folhas de Syzygium cumini (L.) Skeels
apresenta importante propriedade antialérgica, marcada principalmente por sua capacidade de
inibir alguns dos principais parâmetros celulares envolvidos nas respostas alérgicas, como o
influxo de eosinófilos e a produção de mediadores eosinofilotáticos (Wardlaw, 2004, Wark e
Gibson, 2003).
Tem sido extensivamente descrito, que o desafio antigênico induzido por ovoalbumina
em camundongos previamente sensibilizados, induz aumento significativo do número de
leucócitos totais na cavidade pleural em 24 h, com um importante acúmulo de eosinófilos (Brito
et al., 2007, Sampaio et al., 2000). É estabelecido que o recrutamento de eosinófilos nas
reações alérgicas é em grande parte regulada por linfócitos T ativados nas vias aéreas, em
resposta ao grande número de alérgenos inalados, que na maioria das vezes, não são
reconhecidos por indivíduos não atópicos (revisto por Romagnani S., 2000). Vários trabalhos
demonstram que linfócitos T ativados possuem papel crucial no estabelecimento da eosinofilia
alérgica em diferentes modelos experimentais in vivo, via produção de mediadores
quimiotáticos (Bozza et al., 1994, Cohn et al., 1998, Shen et al., 2003). Essas células secretam
citocinas predominantemente do perfil Th2, como IL-4, IL-13, IL-5, GM-CSF (Romagnani, 2000).
Linfócitos T αβ compreendem cerca de 80 a 90 % do total de células T, esses consistem de
seus subtipos CD4 e CD8 (Spits, 1994). Tem sido demonstrado que camundongos deficientes
em células T CD4
+
têm uma diminuição da hiper responsividade das vias aéreas, bem como da
eosinofilia, devido ao comprometimento no mecanismo dependente de IL-4 e IL-5 que modulam
esses fenômenos (Hogan et al, 1998, Gavett et al,1994). O papel dos linfócitos T CD8
+
no
87
desenvolvimento e na regulação da alergia das vias aéreas é ainda controverso. Estudos
mostram um efeito protetor dessas células contra a indução da resposta imune e, ainda, uma
diversidade funcional de T CD8
+
em diferentes compartimentos de camundongos sensibilizados
(Stock et al, 2004). O outro subtipo dos linfócitos T são os T γδ que compreendem em torno de
10% do total de linfócitos. Zuany-Amorim et al, 1998 mostraram que camundongos deficientes
em células T γδ apresentam uma diminuição da liberação de IgE, IgG1 e de IL-5 em reações
alérgicas pulmonar, bem como uma diminuição do influxo de eosinófilos e células T quando
comparados aos animais selvagens. Baseado nesses dados, nós avaliamos o perfil fenotípico
dos linfócitos T na cavidade pleural de camundongos sensibilizados e estimulados com OVA em
diferentes tempos. Em concordância com dados de Sampaio et al., 2000 e Penido et al, 2006
que demonstraram um influxo de linfócitos T CD3
+
em sítios alérgicos, nós demonstramos que
24 e 48 h após o estímulo antigênico, ocorre um aumento dos números de linfócitos T, na
cavidade pleural de camundongos Balb/c, previamente sensibilizados, caracterizado mais
especificamente pelo influxo dos seus subtipos γδ, CD4 e CD8 (figura 6).
Interessantemente, o pré-tratamento oral com a fração acetato isolada do extrato bruto de
Syzygium cumini não foi capaz de inibir o influxo dos linfócitos nos tempos observados,
inclusive o tratamento com a fração induz um discreto aumento dos números dos subtipos T
CD4 e Tγδ. Porém, o tratamento com a fração acetato impediu de maneira significativa a
chegada de eosinófilos na cavidade pleural desses animais. Estudos têm mostrado que
linfócitos com perfil de citocinas Th2, os quais migram junto com os eosinófilos para os sítios de
reação alérgica, são importantes fontes de citocinas e substâncias quimioatraente e fatores de
crescimento que primam eosinófilos (Kay, 1996, Frew et al., 1988). Os mecanismos que
controlam essa mobilização e esse recrutamento dos eosinófilos envolvem uma combinação da
eosinofilopoiese dependente de interleucina 5 (IL-5), da regulação da adesão, e das interações
com o endotélio vascular dependentes de substâncias quimiotáticas (Collins et al., 1995,
Wardlaw, 2004). A IL-5 é uma das principais citocinas produzida pelos linfócitos Th2 que está
envolvida no acúmulo de eosinófilos nos quadros alérgicos. Ela estimula a produção de
88
eosinófilos na medula óssea, aumenta sua migração para o pulmão e sua atividade e sobrevida
nos sítios alérgicos (Rothenberg & Hogan, 2006). Já foi observado que nos processos de
eosinofilia durante reações alérgicas a expressão de mRNA de IL-5 é aumentada positivamente
em diferentes sítios, incluindo as vias aéreas (Hamid et al., 1991, Krishnaswamy et al., 1993).
Em adição, a IL-5 também é capaz de primar eosinófilos durante processos alérgicos,
facilitando sua ativação e migração pela quimiocina eotaxina (Collins et al., 1995). O acúmulo
de eosinófilos também é regulado por quimiocinas liberadas por células endoteliais, epiteliais e
outras presentes no microambiente local (Bianchi et al., 1997). Originalmente identificada em
lavado bronco alveolar em modelo animal de alergia (Jose, et al., 1994), a CCL11/eotaxina é
considerada uma das mais importantes quimiocinas com propriedade eosinofilótática observada
em diferentes modelos experimentais (Humbles et al., 1997, Menzies et al., 2002). Seu
mecanismo de ação é principalmente via o receptor de quimiocina 3 (CCR-3), presente em
elevados níveis sobre a superfície de eosinófilos (Ponath et al.,1996). Não somente a
CCL11/eotaxina, mas também a CCL5/RANTES tem sido considerada outra importante
quimiocina descrita com propriedade quimiotática para eosinófilos e possui papel importante em
várias reações imunes e alérgicas. Porém, esse mediador de 8 kD, pode se ligar a distintos
receptores como CCR-1, CCR-3 e CCR-5 expressados nas células, mostrando-se quimiotático
também para monócitos e linfócitos in vivo (Oyamanda et al. 2006, Kameyoshi et al, 1992).
Baseado nesses dados e para melhor entendermos o efeito inibitório da fração acetato
sobre o acúmulo de eosinófilos na pleurisia alérgica, nós investigamos os níveis de IL-5,
CCL11/eotaxina e de CCL5/RANTES, no lavado pleural recolhido de camundongos alérgicos.
Nossos resultados mostraram que o tratamento com a fração em acetato obtida do extrato
aquoso de Syzygium cumini leva a uma redução significativa dos níveis de CCL11/eotaxina e
de CCL5/RANTES, acompanhado da inibição do influxo de eosinófilos para a cavidade pleural.
Interessantemente, o tratamento com a fração não foi capaz de inibir a produção de IL-5. Esses
dados sugerem que o tratamento in vivo com a fração acetato l a produção de IL-5. Esses
dados sugerem que o tratamento in vivo com a fração acetato l a produção de IL-5. Esses
dados sugerem que o tratamento in vivo com a fração acetato l a produção de IL-5. Esses
dados sugerem que o tratamento in vivo com a fração acetato l a produção de IL-5. Esses
dados sugerem que o tratamento
sobre o recrutamento de eosinófilos, principalmente via inibição de mediadores eosinofilotáticos.
E os flavonóides estudados que constituem a fração podem ser, em parte, os responsáveis por
tal atividade. Suportando esses dados, a inibição do fator NFkB pode estar relacionada
diretamente ao efeito da fração acetato e/ou dos flavonóides sobre a inibição da síntese de
citocinas pelas células T. Deste modo, nós sugerimos que a fração acetato de Syzygium cumini,
bem como seus constituintes investigados são potenciais candidatos de origem vegetal para o
tratamento de alvos terapêuticos como regulação do gene de expressão NFkB/p65, inibindo a
síntese de citocinas e a eosinofilia alérgica.
92
explicado devido à presença de outras substâncias presentes na fração que atuam de maneira
sinérgica e potencializam o seu efeito inibitório. Deste modo, em parte, podemos atribuir a estes
flavonóides a efetiva atividade inibitória apresentada pela fração acetato nos modelos avaliados.
Reforçando essa hipótese, a partir de ensaios de quimiotaxia de eosinófilos em câmera de
Boyden, nós demonstramos que eosinófilos isolados, incubados com os lavados pleurais de
camundongos alérgicos que receberam o tratamento in vivo, com a fração acetato ou com os
flavonóides, são incapazes de migrar in vitro. O mesmo fenômeno foi observado com o
tratamento direto in vitro com a fração acetato e com os flavonóides sobre os eosinófilos
isolados. Juntos, esses dados mostram que tanto a fração acetato quanto a quercetina e
miricetina possui efeito direto e específico sobre os processos de migração e quimiotaxia da
população de eosinófilos in vivo e in vitro principalmente via CCL11/eotaxina.
Em humanos e em modelos animais tem sido demonstrado que as inflamações de
origem alérgica como a asma estão associadas a um aumento da atividade de fatores
nucleares, como o fator nuclear kappaB (NFкB) nas células do pulmão e das vias aéreas.
Conseqüentemente, com o aumento da expressão de proteínas inflamatórias que incluem
citocinas, enzimas e moléculas de adesão (Bureau et al., 2000, Hart et al., 1998, Yang et al
1998). Estudos em animais deficientes no fator revelaram que NFkB é essencial para a
diferenciação de linfócitos Th2 e indução da reação alérgica das vias aéreas. A ativação de
NFkB é essencial para a síntese de muitos mediadores inflamatórios como CCL11/eotaxina,
CCL5/RANTES e citocinas do perfil Th2, como IL-4, IL-5, IL-13, etc (Desmet et al., 2004, Yang
et al 1998). Nossos dados confirmaram a inibição da expressão do NFkB/p65 em extratos
nucleares de esplenócitos estimulados in vitro com OVA e tratados com a fração acetato ou
com os flavonóides isolados. Essa inibição foi acompanhada pela diminuição dos níveis de IL-2,
IL-4, CCL11/eotaxina, CCL5/RANTES nos sobrenadantes da cultura. Esse dado mostra um
efeito direto dos tratamentos sobre linfócitos e/ou macrófagos que são importantes fontes de
mediadores eosinofilotáticos durante a resposta alérgica. Juntos, nossos dados demonstraram
que a fração acetato obtida do extrato aquoso de Syzygium cumini possui uma ação direta
91
sobre o recrutamento de eosinófilos, principalmente via inibição de mediadores eosinofilotáticos.
E os flavonóides estudados que constituem a fração podem ser, em parte, os responsáveis por
tal atividade. Suportando esses dados, a inibição do fator NFkB pode estar relacionada
diretamente ao efeito da fração acetato e/ou dos flavonóides sobre a inibição da síntese de
citocinas pelas células T. Deste modo, nós sugerimos que a fração acetato de Syzygium cumini,
bem como seus constituintes investigados são potenciais candidatos de origem vegetal para o
tratamento de alvos terapêuticos como regulação do gene de expressão NFkB/p65, inibindo a
síntese de citocinas e a eosinofilia alérgica.
92
5.0 – Discussão Tese
93
5.0 – Discussão
O Brasil com sua enorme biodiversidade pode contribuir para a identificação e
desenvolvimento de novos medicamentos produzidos a partir de produtos naturais. Embora
muitas plantas já estejam sendo utilizadas com fins terapêuticos, muitas não possuem dados
científicos que comprovem a sua eficácia e ausência de efeito toxicológico no homem, assim
como garantia da qualidade do produto (fitomedicamento) ou de sua produção (Corrêa, 1974).
Atualmente, diversas agências governamentais têm estimulado o estudo de propriedades
farmacológicas, visando comprovar a validade do uso popular de plantas medicinais ou até
mesmo atribuir a elas novas atividades.
Plantas da família Myrtaceae são muito utilizadas na medicina popular e seus efeitos no
tratamento de distúrbios gastrointestinais de diversas espécies já foram confirmados
cientificamente (Cáceres et al, 1993, Chaturvedi et al., 2007). Também foi demonstrada a
atividade antimicrobiana (Schapoval et al, 1994, Chaieb et al., 2007, Rattanachaikunsopon et
al., 2007), antiinflamatória (Siani et al., 2000, Garcia et al., 2004, Ojewole, 2006), anti-
mutagênica (Jagetia & Baliga, 2002), dentre outras.
A espécie
Nosso grupo demostrou que o tratamento oral com extrato aquoso bruto obtido das folhas de
Syzygium cumini (S-C) foi capaz de inibir importantes eventos vasculares e celulares que
ocorrem durante a resposta alérgica (Brito et al., 2007). A formação do edema tecidual é
descrita como um dos eventos vasculares iniciais da resposta alérgica, que ocorre pela
liberação de mediadores inflamatórios por células teciduais, principalmente pelos mastócitos.
Os mastócitos são células teciduais caracterizadas pela presença de grânulos citoplasmáticos,
e têm um papel fundamental nas reações alérgicas (Marshall, 2004). Devido á sua localização
estratégica, eles são expostos a estímulos presentes no ambiente, tais como microorganismos
e alérgenos, com os quais eles reagem tanto em minutos como após algumas horas, levando a
secreção regulada de mediadores pré-formados como histamina, quimases, triptases, e neo-
sintetizados como prostaglandinas, leucotrienos e citocinas (Puxeddu et al, 2003; Marshall,
2004). Alguns desses mediadores estão associados aos grânulos dos mastócitos, tais como as
aminas vasoativas histamina e serotonina, além do fator de agregação plaquetária (PAF). Esses
possuem ação direta nos vasos e nas células endoteliais, promovendo a vasodilatação e
aumento da permeabilidade vascular (Barnes, 2001). Conseqüentemente, esses mediadores
apresentam implicações diretas em muitos sintomas das doenças alérgicas, inclusive na
formação de edema de pata alérgico em camundongos (Qu et al., 1991). Baseados nessas
observações, nós investigamos o efeito do extrato aquoso S-C sobre alguns desses
mediadores. Nós demonstramos que o tratamento oral com o extrato aquoso bruto de S-C,
apresentou efetivo efeito inibitório sobre os edemas induzidos por histamina e serotonina,
porém falhou em inibir o edema induzido por PAF. Ao investigar a ação do extrato sobre o
edema alérgico, nós observamos que o efeito antiedematogênico do extrato foi muito mais
discreto quando comparado ao seu efeito sobre o edema induzido pelo composto 48/80. Fato
que pode estar relacionado aos tipos de mediadores que estão envolvidos em cada reação. Na
formação do edema induzido pelo composto 48/80, ocorre uma liberação majoritária do
conteúdo pré-estocado de histamina. No edema alérgico há o envolvimento de muitos outros
mediadores além das aminas investigadas, como os metabólitos do ácido araquidônico, e as
95
citocinas, que possivelmente não foram inibidos pelo extrato. Em adição, estudos realizados in
vitro mostraram uma relevante ação inibitória do extrato sobre a desgranulação de mastócitos
peritoneias isolados. Juntos, nossos resultados sugerem que o extrato S-C possui uma ação
inibitória direta sobre histamina e serotonina; e é muito mais efetivo inibindo reações em que os
mecamismos de ação dependam do processo de desgranulação mastócitária e conseqüente
liberação de histamina (Brito et al., 2007)
Seguindo o curso do estabelecimento da resposta alérgica outras células comprometidas com o
orquestramento da resposta imune além dos mastócitos, começam a secretar uma variedade
de mediadores inflamatórios, induzindo a ativação e o recrutamento celular para o sítio alérgico.
O acúmulo de eosinófilos no sítio inflamatório é uma das carcterísticas mais marcantes da
resposta alérgica. Nós demonstramos que pré-tratamento oral com o extrato bruto de S-C foi
capaz de reduzir significativamente a eosinofilia pleural alérgica em camundongos. O acúmulo e
sobrevida desses leucócitos no sítio inflamatório são regulados principalmente por IL-5
secretada preferencialmente pelos linfócitos T, bem como por quimiocinas liberadas pelo
epitélio e pelas prórias células T. Nós demonstramos que o tratamento com o extrato S-C inibe
os níveis de IL-5 e CCL11/eotaxina na cavidade pleural de camundongos desafiados
antigenicamente. Esse fato explica a inibição do recrutamento de eosinófilos para a cavidade
pleural dos animais que foram tratados com o extrato. Juntos, esses resultados demonstraram
uma importante propriedade antialérgica do extrato aquoso bruto de Syzygium cumini (L.)
Skeels (Brito et al., 2007).
O estudo das propriedades biológicas de produtos de origem vegetal está intimamente
relacionado com a escolha da planta sobre diferentes aspectos. Embora uma planta possa
conter centenas de metabólitos secundários, apenas as substâncias presentes em maior
concentração são geralmente isoladas e estudadas pela fitoquímica clássica. A análise de
substâncias ativas pode ser muito mais complexa e longa quando os metabólitos presentes e
isolados na planta, em menor proporção, são àqueles que apresentam melhores efeitos
biológicos (Filho & Yunes, 1998). Por isto há necessidade de um trabalho em colaboração mais
96
ampla entre químicos e farmacólogos para a análise dos extratos, de onde se obtêm extratos,
frações e finalmente, as substâncias puras. Neste sentido, torna-se indispensável à análise da
potência das frações e das substâncias puras em relação à sua concentração. Esta avaliação
permite predizer se o principal componente químico responsável pela atividade biológica foi
realmente determinado (Filho & Yunes, 1998).
Para que se obtenha uma boa amostra vegetal com o mínino possível de perda de suas
substâncias ativas ou que se consiga obter a maior reserva de seus metabólitos ativos, vários
fatores devem ser levados em consideração tais como: variações temporais, espaciais, ciclo
circadiano, herbivoria, nutrientes, radiação ultravioleta, altitude, dentre outros. Apesar da
existência de um controle genético, esses e outros fatores podem influenciar no conteúdo total,
bem como as proporções relativas de metabólitos secundários nas plantas (Waterman, 1989).
De fato, os metabólitos secundários representam uma interface química entre as plantas e o
ambiente circundante, portanto, sua síntese é freqüentemente afetada por condições
ambientais (Kutchan, 2001).
A época em que uma planta é coletada é um dos fatores de maior importância, visto que a
quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza dos constituintes ativos não são constantes
durante o ano. São relatadas, por exemplo, variações sazonais no conteúdo de praticamente
todas as classes de metabólitos secundários, como óleos essenciais (Palá-Paúl et al., 2001),
sesquiterpenos
(Schmidt et al., 1998), ácidos fenólicos (Grace & Logan, 1996) flavonóides e
iridóides (Menković et al., 2000), saponinas (Kim et al., 1991), alcalóides (Elgorashi et al., 2002),
taninos (Salminen et al., 2001), glicosídeos cianogênicos (Kaplan et al., 1983) dentre outras. Os
casos mais freqüentemente relatados envolvem plantas e/ou metabólitos empregados na
terapêutica, podendo ser citados os seguintes exemplos: as folhas de Digitalis obscura
apresentam as menores concentrações de cardenolídeos na primavera e uma fase de rápido
acúmulo no verão, seguida por uma fase de decréscimo no outono (Roca-Pérez et al., 2004); as
concentrações de hipericina e pseudo-hipericina na erva de São João (Hypericum perforatum,
utilizada no tratamento de depressões leves a moderadas) aumentam de cerca de 100 ppm no
97
em água PVPP. A partir da obtenção da fração acetato de etila, que é enriquecida de
flavonóides, nós demonstramos que tanto o tratamento com o extrato aquoso bruto S-C como
com a fração apresentou atividade antiedematogênica similar, porém o tratamento com a fração
foi efetivo em doses bem menores. Este dado reforça a hipótese de serem os flavonóides os
constituintes químicos responsáveis pela atividade antiinflamatória apresentada pelo extrato
bruto de S. cumini e esses se mantêm em maiores quantidades na fração acetato de etila,
quando colhidas entre a primavera e o verão (Lima et al., 2007).
Baseados nesses dados nós tentamos identificar e quantificar os flavonóides presentes na
fração acetato do extrato de S-C. Ensaios de cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
revelaram que os flavonóides correspondem a 9,53% do conteúdo fenólico total da fração
acetato de etila de S-C. A análise cromatográfica apresentada na figura 1 revelou que os picos
relacionados ao espectro U.V. mais representativos da amostra são compatíveis ao espectro
U.V. de isoflavonas (3,76%); e dentre os quatro picos compatíveis ao espectro U.V. de
flavonóides isolados, nós identificamos pelo menos dois desses. A miricetina, que representa o
terceiro maior constituinte com 1,96% e a quercetina que representa o menor composto com
0,31% da fração. Os outros dois flavonóides majoritários não foram identificados, mas
representam respectivamente 2,24% e 1,54% dos flavonóides totais presentes na fração
acetato obtidos do extrato aquoso e Syzygium cumini (L.) Skeels. Em seguida, foi analisado o
efeito do pré-tratamento oral com a fração acetato de etila sobre os modelos de edema de pata
em camundongos induzido por diferentes estímulos.
Como mencionado anteriormente, a formação de edema tecidual representa um dos eventos
vasculares iniciais de uma resposta alérgica, a exemplo dos casos de hipersensibilidade
imediata que, após a interação do complexo IgE/FcεR, em poucos minutos, ocorre a liberação
intensa de histamina por mastócitos, e, conseqüentemente, o aumento da permeabilidade
vascular, vasodilatação e a própria formação de edema tecidual (White, 1999). Mastócitos
podem ser ativados por diferentes agentes a partir de vias não imunológicas como composto
48/80, substância P, anafilotoxina C5a, C3a etc. Ou ainda pela via imunólogica que resulta de
99
uma resposta imune específica relacionada à ligação cruzada entre anticorpos adjacentes IgE e
FCεRI sobre os mastócitos. Morfologicamente, a desgranulação produzida através das vias
imunológicas e não imunológicas parecem ser similares. Contudo, o processo bioquímico que
leva a liberação dos mediadores, bem como sua natureza e quantidade liberadas podem diferir
(Puxeddu et al, 2003).
Nós observamos que o tratamento com a fração acetato é capaz de inibir significativamente a
formação do edema induzido por estímulo não imunológico como o composto 48/80, que induz
a rápida desgranulação e liberação do conteúdo granular dos mastócitos (Mousli et al., 1990,
Qu et al., 1991). O tratamento com a fração acetato inibe também o edema induzido por
antígeno específico, como a ovoalbumina sugerindo uma ação inibitória dos eventos iniciais de
uma resposta alérgica. Os mastócitos exercem papel primordial no desenvolvimento das
respostas alérgicas e quando ativados são fontes de um amplo espectro de mediadores
inflamatórios pré-formados e/ou “neo” sintetizados como PAF, leucotrienos, prostaglandinas e
citocinas, com múltiplas ações sobre diversas células, tecidos e vasos (Theoharides et al.,
2007). Histamina e serotonina são importantes aminas vaso ativas envolvidas principalmente
nas reações de hipersensibilidade imediata. Já foi descrito o papel da histamina em fases mais
tardias da inflamação estimulando células a secretarem novos mediadores (Chhabra et al.,
2007). Nós demostramos que o tratamento com a fração acetato apresentou atividade inibitória
sobre os efeitos das aminas vaso ativas histamina e serotonina, utilizando antagonista de
receptores específicos (prometazina ou metisegida) como controle da reação. Estes dados
sugerem um papel da fração acetato sobre os receptores anti histaminico H
1
e anti
serotoninérgicos 5HT
1
e 5HT
2
, respectivamente.
Em adição, demonstramos que os tratamentos in vitro com a fração acetato ou com os
flavonóides isoladamente apresentou uma potente atividade inibitória sobre a liberação de
histamina por mastócitos peritoneais de ratos estimulados com C48/80. Esse efeito foi
comparável ao grupo que recebeu o tratamento com o fármaco de referência, cromoglicato de
sódio (DSCG), um clássico estabilizador de membrana de mastócitos utilizado em episódios de
100
hipersensibilidade imediata (Shin et al., 2004) o qual inibe a liberação de mediadores pré-
formados e neo sintetizados de mastócitos. Shin e colaboradores (2004) mostraram que o pré-
tratamento com DSCG inibe a secreção de TNF-α por células RBL-2H3 induzida por anti
DNP/IgE, bem como a liberação de histamina por mastócitos peritoneias de ratos induzido pelo
C48/80. Tasaka e colaboradores (1986) demonstraram que o C48/80 aumenta a
permeabilidade vascular da bicamada lipídica da membrana celular devido a uma perturbação
na própria membrana. Em concordância com esses dados, nossos resultados demonstram que
o aumento da permeabilidade da membrana pode ser um gatilho essencial para a liberação de
medidores pelos mastócitos. Neste sentido, a identificação de substâncias com ação
estabilizadora da membrana de mastócitos, é um alvo de estudos para o desenvolvimento de
terapias que auxiliem em disordens nas quais ocorre a desgranulação de mastócitos. Essa ação
de estabilização da membrana de mastócitos pode ser atribuída à fração acetato e às suas
substâncias ativas pois impedem a perturbação da membrana causada pelo C48/80, e,
conseqüentemente, impedem a liberação de mediadores inflamatórios que contribuem para a
aéreas de ratos (Martin et al., 2002). Trabalhos in vitro mostram que PGE
2
pode induzir a
produção de IL-6, mas suprime a síntese de TNF-α por mastócitos peritoneias de ratos (Leal-
Berumen et al., 1995). Em seres humanos, tem sido demonstrado que PGE
2
inibe a resposta
alérgica aguda, reduzindo a liberação de PGD
2
e cisteinil-leucotrienos (Cys-Lts) do lavado
broncoalveolar de pacientes alérgicos, presumivelmente por sua ação sobre os mastócitos
(Hartet et al., 2001). Outro envolvimento da PGE
2
em respostas alérgicas é a sua capacidade
de inibir a produção de IgE pelos linfócitos B humanos (Pene et al., 1988) e de modular o perfil
da produção de citocinas pelos linfócitos T (Snijdewint et al., 1993). O tratamento com a fração
acetato de S-C bem como com os flavonóides, aparentemente falhou em inibir a produção de
LTB4 e PGE2 pelos mastócitos sensibilizados (dados não mostrados), porém novos
experimentos deverão ser realizados para confirmar esses resultados.
Os mastócitos são uma das principais fontes de TNF-α que pode estar pré-formado em seus
grânulos e também pode ser sintetizado. Foi observado que a produção de TNF-α é aumentada
pelos mastócitos ativados via receptores de IgE na pele e nos pulmões de pacientes alérgicos
(Ohkawara et al., 1992). Foi demonstrado, também, um aumento da expressão de mRNA de
TNF-α na pele de pacientes com dermatite, além de já ser descrito a capacidade dessa citocina
em estimular e ativar outras células a produzirem outros mediadores inflamatórios, que juntos
podem levar ao dano tecidual e regular o aumento da expressão de moléculas de adesão, além
de contribuir para a cronificação dos quadros das doenças alérgicas (Brown et al., 2008)
A partir do estudo desses mediadores, nós observamos que o tratamento com a fração acetato,
com a miricetina ou com a quercetina foi capaz de inibir significativamente a liberação de TNF-α
por mastócitos peritoneais de camundongos desafiados com antígeno. O entendimento de que
os mastócitos têm papel fundamental no estabelecimento das doenças alérgicas em seus
estágios iniciais é de suma importância e tem sido bem documentado. O fato de substâncias de
origem vegetal como a fração acetato de etila de S. cumini e seus constituintes que foram
quimicamente caracterizados, identificados e quantificados exercerem ação direta sobre estas
células, inibindo seus principais mediadores envolvidos nos estágios iniciais da resposta
102
alérgica, este fato dá ao trabalho relevância no contexto de investigar e de se obter fontes
alternativas de potenciais candidatos para o desenvolvimento de novos fármacos com atividade
antialérgica e/ou imunomoduladora.
Tem sido descrito que o desafio antigênico induzido por ovoalbumina em camundongos
previamente sensibilizados induz um aumento significativo do número de leucócitos totais na
cavidade pleural em 24 h, com um importante acúmulo de eosinófilos (Bozza et al., 1994;
Sampaio et al., 2000; Laranjeira et al., 2001). É bem estabelecido que o recrutamento de
eosinófilos nas reações alérgicas é em grande parte regulada por linfócitos T ativados nas vias
aéreas, em resposta ao grande número de alérgenos inalados que, na maioria das vezes, não
são reconhecidos por indivíduos não atópicos (revisto por Romagnani S., 2000). Trabalhos têm
demonstrado que linfócitos T ativados possuem papel crucial no estabelecimento da eosinofilia
alérgica em diferentes modelos experimentais in vivo, via produção de mediadores
quimiotáticos (Bozza et al., 1994, Cohn et al., 1998, Shen et al., 2003).
Os linfócitos T αβ compreendem cerca de 80 a 90 % do total de células T e compreendem os
subtipos CD4 e CD8 (Spits, 1994). Tem sido demonstrado que camundongos deficientes em
células T CD4+ têm uma diminuição da hiper-responsividade das vias aéreas, bem como da
eosinofilia, devido ao comprometimento no mecanismo dependente de IL-4 e IL-5 (Hogan et al,
1998, Gavett et al,1994). O papel dos linfócitos T CD8+ no desenvolvimento e na regulação da
alergia das vias aéreas é ainda controverso. Estudos mostram um efeito protetor dessas células
contra a indução da resposta imune e ainda uma diversidade funcional dos T CD8+ em
diferentes compartimentos de camundongos sensibilizados (Stock et al, 2004). Linfócitos T γδ
compreendem em torno de 10% do total de linfócitos. Zuany-Amorim e colaboradores (1998)
mostraram que camundongos deficientes em células T γδ, apresentam uma diminuição da
liberação de IgE, IgG1 e de IL-5 em reações alérgica pulmonar, bem como uma diminuição do
influxo de eosinófilos e células T quando comparados aos animais selvagens. Baseado nesses
dados nós avaliamos o perfil fenotípico dos linfócitos T na cavidade pleural de camundongos
sensibilizados e estimulados com OVA em diferentes tempos. Em concordância com dados de
103
Sampaio et al., 2000 e Penido et al, 2006, que demonstraram um influxo de linfócitos T CD3
+
na
pleurisia alérgica, nós demonstramos que 24 e 48 h após o estímulo antigênico, ocorre um
aumento dos números de linfócitos T na cavidade pleural de camundongos Balb/c previamente
sensibilizados; caracterizado mais especificamente pelo influxo dos seus subtipos γδ, CD4 e
CD8. Nós observamos que o pré-tratamento oral com a fração acetato S-C não foi capaz de
inibir o influxo de nenhum dos subtipos dos linfócitos T estudados, nos tempos observados.
Porém, o tratamento com a fração acetato, miracetina ou quercetina impediram de maneira
significativa a chegada de eosinófilos na cavidade pleural desses animais. Estudos têm
mostrado que linfócitos com perfil de citocinas Th2, como IL-4, IL-13, IL-5, GM-CSF
(Romagnani, 2000), os quais migram junto com os eosinófilos para aos sítios de reação
alérgica, são uma importante fonte de citocinas e substâncias quimioatraentes e fatores de
crescimento que primam eosinófilos (Kay, 1996, Frew et al., 1988). Os mecanismos que
controlam essa mobilização e esse recrutamento dos eosinófilos envolvem uma combinação da
eosinofilopoiese dependente de interleucina 5 (IL-5), da regulação da adesão, e das interações
com o endotélio vascular dependentes de substâncias quimiotáticas (Collins et al., 1995,
Wardlaw, 2004). A IL-5 é uma das principais citocinas produzida pelos linfócitos Th2 que está
envolvida no acúmulo de eosinófilos nos quadros alérgicos. Essa citocina estimula a produção
de eosinófilos na medula óssea, aumenta sua migração para o pulmão e sua atividade e
sobrevida nos sítios alérgicos (Rothenberg & Hogan, 2006). Já foi observado que nos
processos de eosinofilia durante reações alérgica, a expressão de mRNA de IL-5 é aumentada
em diferentes sítios, incluindo as vias aéreas (Hamid et al., 1991, Krishnaswamy et al., 1993). A
IL-5 também é capaz de primar eosinófilos durante processos alérgicos facilitando sua ativação
e migração pela quimiocina eotaxina (Collins et al., 1995). O acúmulo de eosinófilos também é
regulado por quimiocinas liberadas por células endoteliais, epiteliais e outras presentes no
microambiente local (Bianchi et al., 1997). Originalmente identificada em lavado bronco alveolar
em modelo animal de alergia (Jose, et al., 1994), a CCL11/eotaxina é considerada uma das
mais importantes quimiocinas com propriedade eosinofilótática observada em diferentes
104
modelos experimentais alérgicos (Humbles et al., 1997, Menzies et al., 2002). Seu mecanismo
de ação é principalmente via o receptor de quimiocina 3 (CCR-3) presente em elevados níveis
sobre a superfície de eosinófilos (Ponath et al.,1996). Não somente a CCL11/eotaxina, mas
também a CCL5/RANTES tem sido considerada outra importante quimiocina descrita com
propriedade quimiotática para eosinófilos, e possui importante papel em várias reações imunes
e alérgicas; porém esse mediador de 8 kD pode se ligar a receptores distintos, como CCR-1,
CCR-3 e CCR-5 expressados nas células, mostrando-se quimiotático também para monócitos e
linfócitos in vivo (Oyamanda et al. 2006, Kameyoshi et al, 1992).
Nossos resultados mostraram que o tratamento com a fração acetato S-C leva a redução
significativa dos níveis de CCL11/eotaxina e de CCL5/RANTES, acompanhado da inibição do
influxo de eosinófilos para a cavidade pleural. De forma interessante, o tratamento com a fração
S-C não foi capaz de inibir a produção de IL-5. Esses dados sugerem que o tratamento in vivo
com a fração acetato S-C não impede diretamente a diferenciação, proliferação e saída de
eosinófilos da medula, visto que esse processo é bem regulado pela IL-5, e, possivelmente, não
impede a sua sobrevida no sítio inflamatório. O tratamento com a fração acetato sugere, ainda,
uma ação muita mais direta sobre o processo de migração dos eosinófilos para a cavidade
pleural, visto que esse fenômeno é drasticamente comprometido, porém não abolido. Fato que
pode estar relacionado a ação mais seletiva da fração acetato sobre a produção dos agentes
eosinofilotáticos CCL11/eotaxina e de CCL5/RANTES pelas células comprometidas no
processo e presentes na cavidade pleural. Além do mais, a presença local de IL-5 pode, por si,
ser responsável pela remanescente mobilização de eosinófilos na cavidade pleural. Estudos
mostram que a dupla deleção dos genes eotaxina-1/IL-5 em camundongos induzem uma
grande supressão do recrutamento de eosinófilos para o pulmão (Mattes et al, 2002).
Nós observamos que o pré-tratamento oral com os flavonóides quercetina ou miricetina
adminstrados isoladamente, inibem o influxo de eosinófilos para a cavidade pleural, bem como
os níveis de IL-5, CCL11/eotaxina e CCL5/RANTES presentes no sobrenadante dos lavados
pleurais de camundongos estimulados com o antígeno. O efeito inibitório da fração acetato S-C
105
mostrou-se mais potente sobre o influxo de eosinófilos e sobre os níveis dos mediadores
eosinofilotáticos do que o tratamento com os flavonóides isoladamente, este fato pode ser
explicado devido à presença de outras substâncias presentes na fração acetato que atuam de
maneira sinérgica e potencializam o efeito inibitório da fração S-C sobre CCL11/eotaxina e
CCL5/RANTES. Deste modo, podemos atribuir, em parte, a estes flavonóides a atividade
inibitória apresentada pela fração acetato S-C nos modelos avaliados. Reforçando essa
hipótese, utilizamos ensaios de quimiotaxia de eosinófilos em câmera de Boyden e
demonstramos que eosinófilos isolados, tratados com os lavados pleurais provenientes de
camundongos alérgicos que receberam o tratamento in vivo com a fração acetato ou com os
flavonóides isoladamente, são incapazes de migrar in vitro. O mesmo fenômeno foi observado
quando eosinófilos isolados foram incubados in vitro com a fração acetato S-C ou com os
flavonóides. Juntos, esses dados demonstram que a fração acetato S-C, miricetina e quercetina
possuem efeito direto e específico sobre os processos de migração e quimiotaxia de eosinófilos
in vivo e in vitro, principalmente via CCL11/eotaxina.
Tem sido demonstrado em pacientes e em modelos animais que as inflamações de origem
alérgica como a asma estão associadas a um aumento da atividade de fatores nucleares, como
o fator nuclear (NF) kappa B nas células do pulmão e vias aéreas, e, conseqüentemente, a um
aumento da expressão de proteínas inflamatórias que incluem citocinas, enzimas e moléculas
de adesão (Bureau et al., 2000, Hart et al., 1998, Yang et al 1998). Dentre as proteínas
regulatórias transcripcionais descritas, o NFкB tem sido relatado ter particular importância na
modulação da expressão de relevantes genes imunomodulatórios em muitas doenças alérgicas.
Em particular, NFкB tem papel central na regulação transcripcional de citocinas, moléculas de
adesão e outros mediadores envolvidos em doenças como sepsis, inflamação. Esse fator
também regula a resposta inata e adaptativa do organismo, a proliferação celular, a apoptose e
o estresse celular (revisto por Hayden & Ghosh, 2004; Pasparakis et al., 1999; Bonizzi & Karin,
2004). O NFкB está presente no citoplasma da maioria das células como homo ou
heterodímeros de uma família de proteínas relacionadas entre si. Nas células de mamíferos têm
106
sido identificadas cinco proteínas pertencentes à família do NFkB, são elas: RelA , também
conhecida como p65, c-Bel, RelB, NFkB1 ou p50/p105 e NFkB2 ou (p52/p100). Em condições
normais o NFкB está retido no citoplasma através da sua associação com a sua molécula
inibidora conhecida com IкB. A fosforilação, ubiquitinização e proteólise de IкB, permite a
translocação do NFкB para o núcleo, induzindo a transcrição de vários genes. A atividade
transcripcional do NFкB pode ser regulada em distintos passos, incluindo a quantidade de IкB
presente, a composição das subunidades de NFкB e etc. (revisto por Sun & Anderson, 2002).
O NFkB é essencial para a diferenciação de linfócitos Th2 e, conseqüentemente, na indução da
reação alérgica das vias aéreas. Estudos em animais deficientes desse fator mostraram que
esses animais são incapazes de montar um quadro de eosinofilia alérgica das vias aéreas,
devido à inabilidade de seus linfócitos T se diferenciarem para o perfil Th2. A ativação de NFkB
é essencial para a síntese de muitos mediadores inflamatórios como CCL11/eotaxina,
CCL5/RANTES e citocinas do perfil Th2, como IL-4, IL-5, IL-13, etc (Desmet et al., 2004, Yang
et al 1998).
Nossos dados confirmaram a inibição da expressão do NFkB/p65 em extratos nucleares de
esplenócitos estimulados in vitro com OVA, e tratados com a fração acetato ou com os
flavonóides isolados. Essa inibição foi acompanhada pela diminuição dos níveis de IL-2, IL-4,
CCL11/eotaxina, CCL5/RANTES nos sobrenadantes da cultura. Esses dados demonstram um
efeito direto desses tratamentos sobre linfócitos e/ou macrófagos, que são importantes fontes
de mediadores eosinofilotáticos durante a resposta alérgica. Juntos, nossos dados
demonstraram que a fração acetato obtida do extrato bruto de Syzygium cumini possui uma
ação direta sobre o recrutamento de eosinófilos, e, somado a isto, atua também via inibição de
mediadores eosinofilotáticos. Os flavonóides estudados que constituem a fração parecem ser
em parte os responsáveis por tal atividade. Suportando esses dados, a inibição do fator NFkB
pode estar relacionado diretamente ao efeito da fração acetato e/ou dos flavonóides sobre a
inibição da síntese de citocinas pelas células T.
Deste modo, sugerimos que a fração acetato do extrato bruto de Syzygium cumini é um
107
potencial candidato de origem vegetal para o tratamento de doenças alérgicas, atuando em
alvos terapêuticos bem definidos nessas patologias.
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