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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Avaliação da apoptose de neutrófilos do sangue periférico de pacientes
com Artrite Reumatóide em diferentes estágios da doença
DAIANI CRISTINI OLIVEIRA ANDRADE
Ribeirão Preto
2007
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DAIANI CRISTINI OLIVEIRA ANDRADE
Avaliação da apoptose de neutrófilos do sangue periférico de pacientes
com Artrite Reumatóide em diferentes estágios da doença
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Imunologia Básica e
Aplicada para obtenção do título de
mestre em Imunologia.
Área: Imunologia básica e aplicada.
Orientadora: Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim
Ribeirão Preto
2007
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Andrade, Daiani Cristini Oliveira
Avaliação da apoptose de neutrófilos do sangue periférico de pacientes com
Artrite Reumatóide em diferentes estágios da doença. Ribeirão Preto, 2007.
83p. il., 30cm
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e
Aplicada para obtenção do título de Mestre em Imunologia da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
Orientadora: Lucisano- Valim, Yara Maria
1. Artrite Reumatóide. 2. Neutrófilo. 3. Imunidade Intata.
4. Apoptose
5 Quimiocinas
FOLHA DE APROVAÇÃO
Autora: Daiani Cristini Oliveira Andrade
Tìtulo: Avaliação da Apoptose de Neutrófilos do Sangue Periférico de Pacientes com Artrite
Reumatóide em Diferentes Estágios Da Doença
Banca Examinadora
Prof (a). Dr(a). ______________________________________________________________
Instituição____________________________Assinatura_____________________________
Prof (a). Dr(a). ______________________________________________________________
Instituição____________________________Assinatura_____________________________
Prof (a). Dr(a). ______________________________________________________________
Instituição____________________________Assinatura_____________________________
Aprovada pela comissão julgadora em ____/____/____.
Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em
Imunologia Básica e Aplicada para obtenção do
título de mestre em Imunologia.
Área: Imunologia básica e aplicada.
Agradecimentos
“... Longe se vai, sonhando demais
Mas onde se chega assim
Vou descobrir o que me faz sentir
Eu, caçador de mim...”
(Milton Nascimento)
À Antônia Júlia Oliveira Andrade e Valdemar de Paula Andrade,
Anjos meus aqui na Terra! Pessoas que dão à minha vida o verdadeiro e único sentido, o
sentido do amor e da lealdade.
Pelo exemplo de determinação, coragem e superação, honestidade, humildade e fé, sou grata
ao Ser Supremo por poder chamá-los de PAIS!
Sem o amor imensurável, carinho e compreensão de vocês não haveriam conquistas!! Sem a
ajuda de vocês nada seria possível!! Sem este exemplo a ser seguido, eu não teria chegado!!
Não existem palavras capazes para descrever minha imensa gratidão, amor e carinho!
Amo vocês! Muito obrigada!
Ao meu irmão Fábio Adriano Oliveira Andrade,
Pelo imenso carinho, amor, cumplicidade!
E, sem dúvida alguma,
pela maior e mais incondicional amizade da minha vida!
Obrigada por ser sempre presente!
Pelo aprendizado, pelas trocas tão preciosas do dia-a-dia...
Orgulho-me de você!!!
Obrigada pelo grande amor que compartilhamos!
Obrigada por me ensinarem todos os dias o verdadeiro significado da palavra FAMÍLIA!
Ao meu querido amado Jairson Vinícius de Carvalho,
Pelo seu carinho, cuidado, companheirismo e amor sempre dedicados. Por ser tão presente na
minha vida e por dividir comigo as alegrias e tristezas, me ajudando a chegar! Obrigada pela
compreensão dos momentos ausentes... pela paciência e principalmente por respeitar e
acreditar sempre no meu trabalho!
Obrigada por me deixar fazer parte da sua vida... E ser esse alguém tão especial e importante
para mim!
Simplesmente... Te amo! Sempre!
À minha tão querida Orientadora Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim
Pela oportunidade de conviver com alguém cujos ensinamentos ultrapassam os limites
acadêmicos. Pelo exemplo de bondade, amizade, ética e muita dedicação.
Com certeza os caminhos seriam mais árduos sem a sua tranqüilidade, equilíbrio e paz...
Obrigada por confiar em mim e no meu trabalho, por me ensinar a fazer pesquisa!
E principalmente, pelo exemplo profissional e humano a ser seguido, por ser acima de tudo,
uma formadora de pessoas...
“ Na vida não basta saber. É imprescindível compreender “
Hoje sou alguém melhor!
“ Amizade só faz sentido se traz o céu para mais perto da gente e se inaugura aqui mesmo o
seu começo.”
(Chico Xavier)
Agradeço às minhas grandes amigas, Juliana Marques Arena, Vandreza L. Pantoni
da. Freiria, Tatiana Arrisse E Dias, Carla Fernanda R. Tostes que sempre estiverem
presentes em todos os momentos, cada qual contribuindo à sua maneira. Obrigada pelos
longos anos de amizade, convivência e confiança mútua! Sem dúvida alguma há algo mais
forte do que a distância nos unindo agora! Obrigada pelo carinho imensurável e por
compreenderem os meus momentos de ausência...
Aos meus familiares, principalmente às minhas Tias Marta e Maria, obrigada pelo
prazeroso convívio, sempre com muito carinho, dedicação, preocupação e constante apoio!
À minha segunda família, Maria Aparecida, Keli, Gislene, Luís Carlos e Jurema que
sempre me acolhem com tanto carinho. Obrigada pela alegria do dia-a dia, pela harmoniosa e
prazerosa convivência!
Aos meus queridos amigos e colegas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto – USP:
Cláudia da Silva. Bitencourt
Pela confiança, pelo carinho, pela compreensão. Por dividir comigo os momentos de profunda
alegria e descontração e também os mais difíceis e dolorosos. Pelo companheirismo, pela
amizade. Pela garra. Pelo exemplo de força de vontade e determinação. Obrigada! “ À cada
dia a vida me mostra que nossos caminhos não convergiram por um mero acaso. “
Anaisa Fernandes Calgaro Helena
Pelo apoio sempre certo nas horas incertas. Pela cumplicidade e lealdade. Por tanto carinho e
afeto com que sempre me acolheu. Pelas inseguranças partilhadas e superadas! Por tantos
momentos de descontração que tornaram a jornada mais amena. Por tudo que dividimos
nestes anos. Obrigada pela amizade sincera que hoje nos une acima de tudo!
Adriana Balbina Paoliello Paschoalato
Por tudo que vivemos juntas ao longo destes anos... Pela pronta amizade com que me
acolheu. Pela confiança em mim e no meu trabalho. Pelo apoio e incentivo constantes. Por
dividir comigo a dureza da batalha e por me fazer acreditar que seria possível (e foi
possível!). Por me encorajar nos momentos difíceis. Pelo exemplo de superação. Obrigada por
tantos momentos de intensa alegria!
Wagner Rodrigo de Sousa
Pela alegria do dia-a-dia! Por me fazer sorrir sempre e muito fácil. Pelo exemplo de garra.
Pela oportunidade de conviver e aprender com alguém tão especial. Por saber ser amigo de
um jeito único... Obrigada pelo carinho e confiança sempre demonstrados!
Daniel Junqueira Dorta
Pelo exemplo de simplicidade! Pela admirável tranqüilidade, paciência e disponibilidade em
ensinar. Pelas inúmeras ajudas e trocas de conhecimentos. Pelos momentos de alegre
convívio. Obrigada pela amizade tão enriquecedora!
Danielle Palma de Oliveira
Pelos inúmeros momentos de descontração. Pelas longas e agradáveis conversas e conselhos.
Pelo apoio. Por ser sempre presente. Pela disponibilidade em ajudar. Obrigada pela recente,
porém verdadeira amizade!
Mirian Ribeiro Moreira
Pela solidariedade! Pelo exemplo de dedicação. Pelos ensinamentos compartilhados. Pela
grande e valiosa ajuda no desenvolvimento deste trabalho. Pelos momentos de muita alegria
e descontração. Obrigada pela amizade e carinho!
Alexandre Kanashiro
Pelo admirável exemplo de humildade. Pela solidariedade. Pela valiosa ajuda na conclusão
deste trabalho e na superação dos momentos difíceis. Pelos inúmeros momentos de intenso
aprendizado profissional e pessoal. Por me fazer acreditar na pesquisa e pela rica
convivência ao longo destes anos. Obrigada pelo exemplo de pesquisador e amigo.
Gustavo Martelli
Pela ajuda, apoio e incentivo constantes. Pela garra empregada na conclusão deste trabalho.
Pelas discussões científicas enriquecedoras. Pelos tantos momentos de risos que tornaram o
trabalho menos pesado. Obrigada por se demonstrar sempre amigo!
Joel Gonçalves de Souza
Pelo exemplo de garra, determinação e humildade. Pela convivência tão harmoniosa.
Fabiana Silva Paula
Pelos momentos de descontração importantes dentro do nosso grupo de pesquisa. Pelo
aprendizado de cada dia.
Luciana Mariko Kabeya
Pela oportunidade de aprendizado. Pelo exemplo de dedicação. Pelos anos de agradável
convivência.
Ana Paula Landi Librandi
Pela amizade sincera. Pela bondade e humildade sempre demonstradas. Pelo incentivo
constante e agradável convívio.
Livia M. C. Simões Ambrosio
Pela preciosa amizade. Pela alegria e convivência harmoniosa.
Denise P.S. Leitão, Elisa M.S. Russo-Carbolante, Andrea S.G. Figueiredo, Amarildo
Aparecido Cavenaghi, Juliana da Silva Oliveira, Fernando A.M. Souza, Mateus F. Leite,
Laura M. Valdevite, Cezar R. Pestana, Fábio E. Mingato, obrigada pelo agradável
convívio ao longo destes anos!
E aos mais novos integrantes do grupo de pesquisa Everton e Carolina... Boa sorte!
Aos funcionários e professores do laboratório de Bioquímica da FCFRP – USP:
Ana Elisa C. Seixas Azzolini
Pela valorosa contribuição no desenvolvimento e conclusão deste trabalho. Pela
disponibilidade e garra sempre demonstradas. Pelo exemplo de dedicação e profissionalismo
admirável. Pela paciência e constante oportunidade de aprendizado. Obrigada pela amizade
e convivência durante estes anos!
Ana Cristina M. Polizelo
Pelo auxílio precioso. Pela bondade e disponibilidade em ensinar sempre. Pelos momentos de
agradável convivência e simpatia. Obrigada pela amizade!
Ieda M.R. Prado, Maria Regina de P. Raphaloski, Nadir Mazzucato, Alcides S. Pereira
Pelo convívio sempre agradável. Pelo carinho, apoio e incentivo constantes. Pelos momentos
enriquecedores de aprendizado e respeito. Obrigada por fazerem parte deste trabalho!
Professora Dra. Ana Isabel de Assis Pandochi, Dra. Carem Gledes Vargas Recchia, Dr.
Carlos Curti e Dr. Augusto César Cropanese Sapdaro, Prof. Dr. Sérgio A. Uyemura
Pelos momentos de agradável convivência. Obrigada pelo rico aprendizado indispensável
para minha formação. Agradeço a todos a oportunidade de aprender sempre.
Agradeço a todos aqueles que contribuíram de maneira indispensável para realização
deste trabalho:
Prof Dra Cleni M.Marzocchi-Machado
Pela atenção, amizade, carinho. Pelos momentos de convivência tão sempre agradáveis, além
de aprendizado constante.
Prof. Dr. Marcelo Dias Baruffi, do laboratório de Glicoimunologia da FCFRP-USP
Pela intensa cooperação e incentivo. Pela disponibilidade em ensinar e pelos inúmeros
esclarecimentos prestados para o desenvolvimento e conclusão deste trabalho. Pelo exemplo
de professor e entusiasta. Pela amizade e apoio sempre demonstrados.
Walter Miguel Turato, funcionário da FMRP - USP
Pela realização das análises em citometria de fluxo. Pelo profissionalismo admirável e todo
conhecimento compartilhado. Pela atenção e solidariedade sempre demonstrados. Obrigada
pela amizade!
Ao Dr. Flávio Calil Petean e à Dra. Fabíola Reis
Pelo auxílio valioso na seleção e atendimento dos pacientes envolvidos neste trabalho.
Aos médicos residentes da Clínica Médica, Imunologia, do HCFMRP-USP, especialmente
Dra. Ana Paula e Dr. Felipe, pela colaboração na seleção dos pacientes.
Fabiana Rosseto de Morais, da FCFRP-USP
Pela realização de alguns experimentos de citometria de fluxo.
Ana Cristine, secretária do departamento de Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto - USP
Obrigada pelo auxílio constante, pelos esclarecimentos prestados, pela sua dedicação, carinho
e amizade!
Lista de abreviaturas
AIC Artrite induzida por colágeno
APO 2-L Ligante do antígeno de apoptose 2
APO 3-L Ligante de antígeno de apoptose 3
Bid Proteína pró-apoptótica
C2 – C5a Componentes do complemento
CCL Família das quimiocinas CC (possuem resíduos de
cisteína adjacentes)
CCR
CD
CEUA
Receptor de quimiocina da família CC
Cluster of differentiation
Comitê de ética no uso de animais do campus de
Ribeirão Preto
CPH Complexo principal de histocompatibilidade
CR1 Receptor tipo 1 do complemento
CR3
CXCL
Receptor tipo 3 do complemento
Família das quimiocinas CXC (possuem resíduos de
cisteína separados por um aminoácido)
CXCR Receptor de quimiocina da família CXC
DISC Complexos sinalizadores de indução da morte
DR 3 Receptor de morte 3
EDTA Ácido etileno dietiltetracético
EROs Espécies reativas de oxigênio
FADD Domínio de morte associado ao Fas
Fas Nome oficial tnfrsf6
FasL Ligante de fas
Fc Fragmento Cristalizável da molécula de imunoglobulina
FcγR
Receptor gama para porção fc
FITC Fluorocromo isotiocionato de fluoresceína
FMLP N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
FS Fosfaditilserina
G-CSF
GM-CSF
Fator estimulador de colônia de granulócitos
Fator estimulador de colônia de granulócitos e
magrófagos
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
IFN-γ
Interferon-gama
Ig Imunoglobulina
IgG Imunoglobulina da classe G
IL Interleucina
IP Iodeto de Propídeo
IP-10 Proteína de 10 kd interferon induzido
LPS Lipopolissacarídeo
MCP-1 Proteína quimioatraente de monócito
Mig
Monocina induzida pelo IFN-γ
MIP-1α
Proteína inflamatória de macrófago -alfa
MIP-1β
Proteína inflamatória de macrófago-beta
MXT Metotrexato
NADPH-oxidase Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase
NH
4
Cl Cloreto de amônio
O
2
Oxigênio molecular
O
2
Oxigênio molecular
O
2
-•
Ânion superóxido
O
2
-•
Ânion superóxido
p Probabilidade
PBS Solução salina tamponada com fosfato
PE Fluorocromo ficoeritrina
PMNs Polimorfonucleares
RANTES
Regulated upon activation, normal T cell expresseda and
secreted
TCD8 e TCD4 Fenótipos dos linfócitos T
TGF-β Fator β transformador de crescimento
Th1 Fenótipo de linfócito T auxiliar (“
Helper”
)
TNF Fator de necrose tumoral
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TNFR1 Receptor 1 do fator de necrose tumoral
TRADD Domínio de morte associado ao receptor TNF
TRAIL
APO 2-L
Ligantes indutores de apoptose relacionado ao TNF
Ligante do antígeno de apoptose 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
Resumo
Andrade, D.C. O. Avaliação da apoptose de neutrófilos do sangue periférico de
pacientes com Artrite Reumatóide em diferentes estágios da doença. 2007. 83p. Tese
de Mestrado – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto, 2007.
A Artrite Reumatóide (AR) acomete 1% da população mundial, surgindo com
maior incidência em indivíduos com idade entre 30 e 50 anos, sendo mais comum
em mulheres. É uma doença autoimune degenerativa de etiologia ainda
desconhecida, caracterizada principalmente por inflamações articulares persistentes
que afetam as juntas, levando a uma conseqüente destruição da cartilagem,
causando edema, dor e dificultando ou impossibilitando as funções habituais da
articulação e do tecido ósseo. Manifestações sistêmicas contribuem para a morbidade
e mortalidade em estágios mais avançados da doença. Durante o processo
inflamatório ocorre influxo predominante e contínuo de polimorfonucleares
neutrófilos (PMNs), os quais se acumulam na cavidade sinovial, fazendo da artrite
reumatóide um protótipo de doença caracterizada pela inflamação neutrofílica. Sendo
este tipo celular importante para o início, progressão e manutenção da doença. E sua
presença prolongada em estado de ativação no sítio inflamatório contribui para a
lesão tecidual, com a liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e potentes
enzimas de ação proteolítica para o meio extracelular. Desta maneira, a apoptose
celular doa neutrófilos é considerada o mecanismo chave para o controle do
processo inflamatório, colaborando para a homeostasia do sistema imunológico. No
entanto, trabalhos anteriores mostraram que este mecanismo está alterado em
neutrófilos presentes na sinóvia de pacientes de AR e que talvez a presença de
citocinas no local estivessem conferindo a essas células resistência a este processo e
morte celular, permitindo a permanência destas células no local de inflamação por
um período prolongado, colaborando com a patogenia da doença. Este presente
trabalho tem como objetivo esclarecer se esse “atraso” no processo de apoptose
também é observado em neutrófilos da circulação de pacientes e se diferentes
estágios da doença poderia contribuir para tanto. Através do monitoramento da
exposição de fosfatidilserina pela marcação com Anexina-V, observamos que no
sangue periférico de pacientes com AR, a população de neutrófilos que expõe o
fosfolípide é menor que a observada nos indivíduos saudáveis. Tal fato parece
depender do estágio da doença, uma vez que na população pacientes com AR em
atividade foi observada uma porcentagem ainda menor destas células marcadas
quando comparada com a dos outros grupos.
Pacientes com a doença ativa também apresentaram Elevadas concentrações
de IL-8 e IL-12p70 no soro de pacientes com AR ativa (p< 0.05) quando comparados
aos pacientes com a doença contralada
Níveis mais altos de IL-8 e IL-12 também foram observados no soro de
pacientes com AR ativa quando comparados aos observados em pacientes com a
doença controlada e em indivíduos saudáveis (p<0.05).
Palavras-chave : Artrite Reumatóide, neutrófilo, imunidade inata, apoptose,
quimiocinas.
Abstract
Andrade, D.C. O. Evaluation of apoptosis neutrophils of the peripheral blood from
patients with Rheumatoid Arthritis in differents phases of the desease. 2007. 83p.
Master’s Degree – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto.
Rheumatoid arthritis (RA) occurs in about 1% of the population, betweem
ages 30 and 50 years and the women nearly twice as likely to develop the disease. It
is a systemic autoimmune disease of unknown etiology. Clinically manifests as a
symmetric polyarthritis associated with swelling and pain in multiple joints, being
able cause significant joint deformity and disability. Systemic manifestations
contribute for the morbidade and mortality in more advanced periods of training of
desease. Neutrophils have also been detected in synovial membrane at sites of
erosion, where they release potent effectors of cartilage destruction such reactive
oxygen species generated by oxidative burst and release of potents proteolytics
enzymes. Thus, the RA can be considered a prototype for diseases characterized by
neutrophilic inflammation. Being thus, the apoptosis of neutrophils is a key
mechanism to control the excessive tissue damage. However, previous works had
shown that these cells seem to be capable to remain in the inflammation site for a
drawn out time, seeming to be resistant apoptosis mechanisms and that perhaps the
presence of proinflammatory cytokines in the place was conferring to these cells such
resistance, collaborating with the patogenesis of the desease. The aim of this work
was to clarify if this “delay” in the apoptosis process also is observed in circulating
neutrophils from the patients and if differents periods of training of the desease
could contribute for in such a way. Through the evaluation of the phosfatidil serin
(PS) exposition, a reduction in spontaneous apoptosis was verified in peripheral
neutrophils from RA in activity patients.
Alterations in the concentrations of different proinflammatory cytokines had
been found in the serum of these patients
Icresead levels of IL-8 and IL-12 had been also observed in the serum of
patients with active AR when compared with the observed in patients with the AR
controlled and healthful individuals (p<0.05).
Key words : Reumatoid Arthritis, neutrophil, innate immunology, apoptosis,
chemokines.
Índice
1 – INTRODUÇÃO
1.1– Neutrófilos 02
1.2– Citocinas 06
1.3- Artrite Reumatóide 08
1.4 – Apoptose Celular 15
2– OBJETIVOS 23
3- CASUÍSTICA E MÉTODOS
Parte A
– Experimentos realizados com neutrófilos humanos
26
3.1- Pacientes 26
3.1.1- Colheita de sangue 27
3.1.2- Obtenção do soro 27
3.1.3- Marcação das células com o conjunto reativo Anexina-V-
FITC e Iodeto de propídeo
28
3.1.4- Análise por citometria de fluxo 29
3.1.5- Preparo das amostras de soro para dosagem de citocinas 30
3.1.6- Preparo das
beads
utilizadas nas dosagens de citocinas 31
3.1.7- Preparo do fluorocromo PE (BD Biosciences) 31
3.1.8- Preparo das amostras para dosagens de citocinas 32
3.1.9- Dosagem de citocina por citometria de fluxo
32
Parte B
– Experimentos realizados com neutrófilos de ratos
Modelo experimental de Artrite Reumatóide
33
3.2 – Animais 33
3.2.1 - Indução de Artrite Reumatóide pelo uso de adjuvante
(CFA) em ratos
33
3.2.2 - Obtenção das amostras de sangue dos animais 34
3.2.3- Marcação das células com o conjunto reativo Anexina-V-
FITC e Iodeto de propídeo
34
3.2.4 - Análise por citometria de fluxo 35
3.3- Análises Estatísticas 35
4 – RESULTADOS
Parte A
– Experimentos realizados com neutrófilos humanos
4.1- Avaliação da viabilidade de neutrófilos em pacientes com AR
em diferentes estágios da doença
38
4.1.1 – Determinação da população de neutrófilos apoptóticos 38
4.1.2 – Determinação da população de neutrófilos inviáveis 42
4.1.3 – Determinação da população de neutrófilos viáveis 45
4.2 – Avaliação das concentrações de citocinas e quimiocinas em
soro de pacientes com AR em diferentes estágios da doença
47
Parte B
– Experimentos realizados com neutrófilos obtidos de
ratos (Modelo experimental de Artrite Reumatóide induzida por
adjuvante)
4.3 - Parâmetros para avaliação da indução da Artrite
Reumatóide em fêmeas de ratos
Wistar
51
4.4 – Avaliação da viabilidade de neutrófilos de ratos com AR
induzida por adjuvante
53
4.4.1- Determinação da população de neutrófilos apoptóticos 52
4.4.2 – Determinação da população de neutrófilos inviáveis 55
4.4.3 – Determinação da população de neutrófilos viáveis 57
5 – DISCUSSÃO
6 – CONCLUSÕES
7. REFERÊNCIAS
59
71
74
Introdução
Introdução
2
1 – INTRODUÇÃO
1.1– Neutrófilos
Os neutrófilos representam cerca de 50 a 70% do total de leucócitos no
sangue. São células formadas na medula óssea e em seu processo de maturação
passam por diferentes estágios até chegar à forma celular de núcleo segmentado,
com 3 a 5 lóbulos interligados, quando são liberados para o sangue periférico. Uma
vez liberados da medula óssea para a circulação, apresentam uma meia vida curta,
de apenas 6 - 7 horas (RAVEL 1997).
Durante o processo de maturação ocorre formação dos seus grânulos
intracelulares que são classificados em primários (ou azurófilos), secundários (ou
específicos), terciários (com alta concentração de gelatinase) e vesículas secretoras,
cujos componentes estão relacionados à fagocitose e à morte intracelular de
microrganismos (ELGHETANY, 2002).
Os neutrófilos são considerados fagócitos profissionais e desempenham um
importante papel na primeira linha de defesa do organismo no combate a agentes
invasores como fungos e bactérias (Van-EEDEN
et al
., 1999). Através de um
processo chamado de quimiotaxia estas células são capazes de migrar para os sítios
inflamatórios e lá exercerem sua atividade efetora. Este processo migratório dos
neutrófilos, é dependente de um gradiente de concentração de substâncias atraentes
(quimiotáticas), como por exemplo, a interleucina 8 (IL-8), além da participação de
moléculas aderentes de baixa e alta afinidade (LEY, 2002).
Introdução
3
O
rolling
do neutrófilo circulante ocorre através de interações entre moléculas
de P-selectina, presentes na membrana das células endoteliais de um capilar e
ligantes glicoproteicos na superfície desta célula (ligação de baixa afinidade).
Próximo ao sítio de inflamação ocorre a participação de moléculas de integrinas
presentes na superfície do capilar, que interage com alta afinidade com ligantes de
superfície dos neutrófilos (CD11 e CD18), promovendo a adesão celular. Sobre
influência de sinais enviados do sítio inflamatório, inicia o processo de transmigração
dos neutrófilos através das células endoteliais. Este processo, chamado de diapedese
é mediado por moléculas de adesão endotélio-plaquetário do tipo-1 (LIU
et al
.,
2004).
Já no sítio inflamatório, estas células são ativadas e em resposta ao complexo
processo da fagocitose, se tornam capazes de liberar enzimas proteolíticas, espécies
reativas de oxigênio (EROs), mediadores anti- e pró-inflamatórios, como
eicosanóides e algumas citocinas e quimiocinas (RICEVUTI, 1997), além de
apresentarem sinais de ativação para apoptose celular (exposição do fosfolipídeo
fosfaditilserina -FS- na superfície celular) (ARROYO
et al
., 2002). Desta maneira,
além de participarem da eliminação do patógeno através da fagocitose, os
neutrófilos também têm como função recrutar outras células para o local de
inflamação através da produção de mediadores pró-inflamatórios e auxiliar na
remoção de células mortas, de corpos celulares, e remoção de tecidos (LÖFGREN
et
al
., 1999).
A figura 1 mostra o processo de fagocitose que é acompanhado por um
aumento do consumo de oxigênio, também chamado de
burst
oxidativo ou explosão
respiratória e está relacionado à produção de ânion superóxido (O
2
-•
) a partir do
Introdução
4
oxigênio molecular (O
2
) pelo complexo multi-enzimático NADPH-oxidase. Este
complexo, normalmente associado às membranas dos grânulos e também à
membrana celular, em condições normais se encontra em repouso e pode ser
rapidamente ativado quando exposto a estímulos específicos (BABIOR, 2000). O
superóxido gerado é transformado por dismutação espontânea ou por ação da
enzima superóxido dismutase, em peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). A enzima
mieloperoxidase, presente no interior de grânulos, catalisa então a oxidação de íons
cloreto pelo H
2
O
2
a ácido hipocloroso, um potente agente bactericida.
Figura 1 – Processo de fagocitose de microorganismos pelos neutrófilos e
conseqüente
burst
oxidativo com produção de espécies reativas de oxigênio (EROs).
Fonte: ALLEN, LEE – ANN H, 2003.
Introdução
5
No entanto, em determinadas condições, as EROs podem extravasar para o
meio extracelular e destruir células do próprio hospedeiro (BABIOR, 2000), como é
observado nos processos inflamatórios ou nas doenças por imunocomplexos, em que
há liberação maciça dessas espécies reativas sobre os tecidos, em função da
chamada "fagocitose frustrada".
A liberação em excesso da elastase de neutrófilos humanos (enzima
proteolítica presente nos grânulos azurófilos) também é responsável pela destruição
tecidual durante uma doença inflamatória crônica como o efizema hepático, a
glomerulonefrite, a fibrose cística e a artrite reumatóide. A liberação da elastase
pode ser estimulada por várias citocinas, por quimioatraentes (como LPS e C5a) e
pelo tripeptídeo derivado da parede de bactérias (N-formil-metionil-leucil-
fenilalanina; fMLP) (LEE, 2001).
A produção de EROs em neutrófilos ativados também pode provocar a
exposição de fosfatidilserina (FS) em sua superfície celular. Os mononucleares
possuem receptores que reconhecem este fosfolipídeo e através de fagocitose,
eliminam estes neutrófilos dos tecidos. (ARROYO et al., 2002). No entanto, FADDEL
et al. 1998, demonstraram a existência de dois mecanismos responsáveis pela
indução de FS na superfície celular, um dependente da produção de EROs e outro
não.
No ano de 2005, KASAMA
et al.
mostraram que os neutrófilos podem sintetizar
citocinas em resposta a uma variedade de estímulos inflamatórios e durante
determinadas condições patológicas. Assim como os macrófagos, os neutrófilos
também são capazes de produzir e liberar citocinas pró-inflamatórias como TNF-α
Introdução
6
(Fator de necrose tumoral) e IL-1β (Interleucina-1 beta), fatores angiogênicos como
o VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular), bem como quimiocinas, tais quais
a IP-10 (Proteína 10 interferon induzido); MIP-1α (Proteína inflamatória de
macrófago-alfa); IL-8, (Interleucina 8) e que esta liberação pode ser regulada por
algumas outras citocinas, as quais são chamadas de imunorregulatórias, como IFN-γ
(Interferon gama), IL-4 (Interleucina 4), IL-10 (Interleucina 10) e pela IL-13
(Interleucina 13).
Além das respostas inflamatórias agudas, os neutrófilos e as citocinas dele
derivadas parecem estar envolvidos na patogênese de doenças inflamatórias crônicas
como a artrite reumatóide, doenças inflamatórias no intestino e outras.
Desta forma, os neutrófilos passam a ocupar uma posição de destaque, onde
regulam e orquestram não somente respostas as inflamatórias agudas, mas também
as crônicas e a regulação imune (KASAMA
et al
., 2005).
1.2– Citocinas
Citocina é o termo genérico empregado para designar um grupo muito
extenso de moléculas envolvidas na emissão de sinais entre as células durante o
desencadeamento das respostas imunes inflamatórias, tendo um papel muito
importante na modulação desta resposta, seja ela local ou sistêmica.
(JANEWAY,2003).
São moléculas peptídicas (proteínas de baixo peso molecular), geralmente
glicosiladas (glicoproteínas), sintetizadas por células da imunidade inata, adaptativa
ou outras (células endoteliais, por exemplo) em resposta a patógenos, seus produtos
Introdução
7
ou a outros sinais associados. São produzidas durante a fase de ativação e fase
efetora da resposta imune e têm uma vida média curta, porém, as citocinas possuem
uma potente ação. São capazes de interagir com as células-alvo através de
receptores específicos expressos na membrana destas células. A ligação de alta
afinidade dos respectivos receptores aos seus ligantes permite que uma pequena
quantidade de citocina seja capaz de desencadear efeitos biológicos. Dessa forma,
exercem suas funções, tais como, regular a duração e intensidade das respostas
específicas; induzir a geração e maturação de novas células a partir de seus
precursores; ativar células efetoras e recrutá-las para os sítios de inflamação e
induzir a troca de isotipo do anticorpo nas células B (ABBAS, 2005).
A maioria das citocinas é de ação autócrina quando age na mesma célula que
a secretou ou de ação parácrina, agindo em células da proximidade. Quando
produzidas em grandes quantidades, entram na circulação e passam a ter ação
endócrina por serem capazes de atuar em células distantes do seu local de produção
(ABBAS, 2005). As ações das citocinas são freqüentemente pleiotrópicas (podem
atuar sobre muitos tipos celulares diferentes) e redundantes (várias citocinas podem
efetuar as mesmas ações), o que dificulta seu uso terapêutico, embora muitos
estudos estejam em andamento neste sentido (KASAMA et al ; 2005; JOOSTEN et
al., 1999).
Além disso, podem induzir efeitos diferentes sobre as mesmas células-alvo em
tempos diferentes ou simultaneamente. Podem também influir na ação de outras
citocinas de forma antagônica ou sinérgica.
Dentre as diversas citocinas produzidas durante o processo inflamatório estão
os membros da família das citocinas quimioatraentes, conhecidas por quimiocinas.
Introdução
8
Estas são capazes de induzir resposta celular através da interação com receptores
acoplados à proteína G. Tais moléculas induzem quimiotaxia de células-alvo,
recrutando diversos tipos celulares para o sítio inflamatório (WILLIAMS
et al
.,2005).
Essa migração leucocitária é regulada em parte por quimiocinas, tais como RANTES
(CCL5), a Mip-1α e β - (CCL3 e 4 respectivamente), Eotaxina (CCL11), Monocina
induzida pelo IFN-γ - Mig – (CXCL9) e Proteína IFN-γ induzível – IP-10- (CXCL10) que
são altamente expressas em tecidos inflamados (PATEL; ZACHARIAH; WHICHARD,
2001).
Inicialmente acreditava-se que as quimiocinas apenas atuavam no
recrutamento de leucócitos, hoje em dia seu envolvimento na angiogênese,
hematopoiese, desenvolvimento embrionário e metástase vem sendo muito estudado
(LUSTER
et al
., 2005; STRIETER
et al
., 2004). Outros trabalhos evidenciam o
envolvimento de algumas quimiocinas como RANTES (CCL5), IL-8 (CXCL8), CCL3,
CCL4 e CXCL10 em processos de inflamação e autoimunidade como artrite
reumatóide, por exemplo (LUSTER
et al
.,2005; QUIN, S.
et al
., 1998; SUZUKI, N.
et
al
., 1999).
1.3- Artrite Reumatóide
A artrite reumatóide é uma doença autoimune crônica e sistêmica que
acomete cerca de 1% da população, atingindo no Brasil, aproximadamente de 1,8
milhões de brasileiros. Surge com maior predominância em indivíduos com idades
entre 30 e 55 anos, sendo mais comum em mulheres (FIRESTEIN & ZAVAIFLER,
1990).
Introdução
9
O ponto de partida da doença é conduzido por uma resposta imune que leva à
inflamação da parede interna da junta, chamada membrana sinovial (SWEENEY &
FIRESTEIN, 2004). A membrana sinovial é uma estrutura que reveste a parede
interna da cápsula fibrosa que envolve a articulação e cuja função é produzir o
líquido sinovial que nutre a cartilagem e lubrifica a sua superfície, permitindo o
movimento normal da articulação. Quando, porém, a membrana inflama torna-se
mais espessa, aumenta de volume e deixa de produzir o líquido sinovial normal para
produzir um líquido inflamatório que destrói progressivamente os ossos e as
cartilagens que revestem as articulações (LOPES VAZ, 2000). Assim, a doença atinge
seu ponto crucial. Tal evento resulta num inchaço que prejudica a sua função, limita
os movimentos articulares e causa dor em múltiplas juntas (FIRESTEIN &
ZAVAIFLER, 1990). Embora seja uma doença com expressão articular pode ocorrer
envolvimento extra-articular, afetando múltiplos órgãos.
As manifestações sistêmicas, as quais contribuem para a morbidade e
mortalidade dos pacientes, ocorrem freqüentemente numa fase evoluída da afecção,
causando, por exemplo, nódulos subcutâneos, pleurite, pericardite, vasculite, nefrite
e outras (glanglionares, hepáticas e musculares) (PALEOLOG, 2003; GOLDRING,
2003; SWEENEY et al, 2004).
Os nódulos subcutâneos ocorrem em cerca de 20% dos pacientes com testes
positivos para o fator reumatóide e raramente, nos pacientes soro-negativos (LOPES
VAZ, 2000). São constituídos, histopatologicamente, por um centro necrótico
fibrinóide, envolvido por uma estrutura de fibroblastos. Perifericamente e rodeando
as zonas anteriores, existe uma área infiltrada por células mononucleares.
Desenvolvem-se preferencialmente em áreas que sofrem pressão, incluindo os
Introdução
10
cotovelos, as articulações dos dedos, as proeminências isquial e sacral, o escalpo
occipital e o tendão de Aquiles.
Já a pleurite ocorre em cerca de 5% dos casos desta doença. Correlaciona-se
positivamente com o sexo masculino e com a presença de fator reumatóide, de
nódulos e outras manifestações extra-articulares (LOPES VAZ, 2000).
Dentro das manifestações cardíacas, a pericardite assume relevância particular. Há
também de se fazer referência à coronarite, uma vez que pode constituir risco de
enfarte do miocárdio, risco que está acrescido pelo tratamento sistêmico com uso
corticóides que se faz necessário na grande maioria destes doentes.
A Artrite Reumatóide ainda é uma patologia de etiologia desconhecida.
Acredita-se na existência de diferentes estímulos que, quando presentes em
indivíduos com predisposição genética desencadeiam uma resposta inflamatória. A
persistência desses estímulos e/ou a incapacidade do sistema imunológico em
controlar a inflamação levam à cronicidade da doença. Dessa maneira, acredita-se
que alguns mecanismos, tais como os imunogenéticos, imunológicos e os fatores
ambientais (que implicam na participação de algumas bactérias ou vírus) podem
desencadear a doença.(SILVERMAN et al., 1981; HAJEER et al., 1994; EBRINGER et
al., 1989; ALBANI et al., 1995).
A relação de fatores genéticos com esta doença é sugerida pelo aumento da
freqüência desta entre indivíduos com parentesco de primeiro grau e uma alta taxa
de concordância em gêmeos monozigóticos. (SILMAN et al., 1993; SELDIN et al.,
1999).
É notória em diversos estudos a existência de genes que predispõem ao
aparecimento das doenças reumáticas, estando também associados a graus
Introdução
11
diferentes de gravidade da doença e a determinado tipo de manifestações da
mesma. A inflamação das articulações é mediada imunologicamente. No entanto, o
agente causador e a relação exata entre os fatores genéticos e os ambientais não
são ainda completamente conhecidos.
Ainda se tratando de fatores imunogenéticos, os genes do complexo principal
de histocompatibilidade (CPH) são considerados responsáveis por cerca de 50% da
susceptibilidade à doença. Esses genes estão reunidos em três grupos: classes I e II
(que codificam moléculas clássicas de histocompatibilidade que apresentam
antígenos peptídicos para linfócitos TCD8 e TCD4, respectivamente.) e classe III
(genes que são responsáveis pela síntese de outras moléculas importantes do
sistema imune, incluindo os fatores do complemento C
2,
C
4
e fator B, além dos
fatores de necrose tumoral -TNF). (BODMER et al., 1997; NEPOM et al., 1994).
Porém, também é considerado o envolvimento de outros genes que estão fora do
CPH (REVEILLE, 1998; SELDIN et al., 1999). Trabalhos sugerem que o gene do TNF-
α é forte candidato a conferir suscetibilidade à doença (FELDMANN et al., 1996-b,
ABE et al., 2001).
Polimorfismos no gene do TNF-α parecem alterar seqüências regulatórias da
região do promotor ou dos microsatélites, levando à síntese elevada, intermediária
ou baixa da citocina. A produção não balanceada do TNF-α implicaria, portanto, na
presença de diferentes níveis da citocina nos tecidos afetados e, conseqüentemente,
produzindo diferentes níveis de gravidade da doença (UDALOVA et al., 1993;
VINASCO et al., 1997).
No caso da inflamação crônica vista na artrite reumatóide o TNFα, juntamente
com outros fatores quimiotáticos (POBER
et al
., 1990; OPPENHEIM
et al
.,1991),
Introdução
12
podem recrutar além dos neutrófilos, variados tipos celulares como as células
mononucleares incluindo macrófagos, linfócitos B e T, sendo a maioria linfócitos T
CD4, da circulação para a sinóvia. No entanto, a presença de diferentes mediadores
na membrana e fluido sinovial, resulta no influxo predominante e contínuo de PMNs
(polimorfonucleares) que migram e se acumulam na cavidade sinovial (JASIN, 2001),
fazendo com que a artrite reumatóide seja considerada um protótipo de doença
caracterizada pela inflamação neutrofílica (Harris, 1990).
Estudos demonstram o papel central dos PMN na patogênese da artrite. Em
trabalho utilizando um modelo animal bem estabelecido da doença (AIC ou artrite
induzida por colágeno tipo II), os autores observaram inicialmente, que animais
tratados com TNF desenvolveram artrite rapidamente, com cinética correspondente
ao recrutamento de PMN. No entanto, a depleção de neutrófilos nesses animais, foi
capaz de abolir a capacidade do TNF para induzir artrite clínica (FAVA
et al
., 1993).
Os neutrófilos são considerados os principais responsáveis pela destruição do
tecido sinovial, uma vez que, quando presentes no sítio de inflamação, apresentam
ativação e desgranulação resultando na conseqüente liberação de potentes enzimas
proteolíticas, que degradam a superfície da cartilagem articular (JASIN, 1991),
aumentando a exposição de epítopos sobre o colágeno tipo II, favorecendo a ligação
de IgG específica e contribuindo para a inflamação. No caso de artrite reumatóide, a
formação de imunocomplexos por auto-anticorpos que reconhecem Ig, bem como a
sua deposição nas articulações, tem sido considerado o maior determinante para a
lesão do tecido articular mediada por neutrófilos (OTTONELLO
et al
., 2002), já que a
desgranulação é proveniente da ação fagocítica desempenhada pela célula, a qual é
ativada pelos receptores presentes na sua superfície, que reconhecem proteínas do
Introdução
13
sistema complemento (CR1 e CR3) e porção Fc de imunoglobulina (FcγRII e FcγRIII).
Além desses processos, paralelamente ocorre a ativação da enzima NADPH-oxidase,
estimulando o metabolismo oxidativo, que culmina na geração de espécies reativas
de oxigênio, que também contribuem para a lesão do tecido. (WEISS, 1989).
Entre os mediadores que ativam neutrófilos, várias citocinas podem influenciar
na modulação das funções dessas células em pacientes com artrite. O TNF-α ativa o
"
burst
" oxidativo em neutrófilos, promovendo a geração de EROs, que, juntamente
com as enzimas proteolíticas, podem estar envolvidos no início e na perpetuação da
lesão articular na artrite reumatóide (DINARELLO; MOLDAWER, 2000).
Num trabalho realizado pelos pesquisadores WIPKE & ALLEN em 2001,
utilizando um modelo murino de artrite reumatóide demonstraram a importância dos
neutrófilos na iniciação, progressão e manutenção da doença articular. Os autores
observaram que o uso do anticorpo monoclonal para depletar neutrófilos nos
animais, bloqueou completamente a resposta inflamatória articular. O tratamento
com anticorpo causou rápida e profunda reversão da doença, protegendo os animais
da inflamação por períodos de no mínimo 7 dias.
Estudos prévios demonstram que os neutrófilos presentes na sinóvia
reumatóide parecem permanecer ativados no local de inflamação por um período de
tempo prolongado, apresentando um aumento no tempo de vida. O que dificultaria o
processo de homeostase do sistema imunológico, aumentando assim ainda mais a
lesão tecidual (CHANG
et al
., 2003).
Além da importante e bem conhecida participação do TNF-α na patogênese da
artrite, existem outras citocinas que também atuam de maneira considerável na
perpetuação desta doença. Podem ser citadas a Interleucina 2 (IL-2) que permite a
Introdução
14
proliferação dos linfócitos de padrão Th1 e estimula a diferenciação dos linfócitos B,
bem como a produção de anticorpos; a INF-γ que promove a ativação dos fagócitos
mononucleares levando ao aumento de secreção de citocinas de caráter pró-
inflamatório e metaloproteinases com grande potencial destrutivo dos tecidos
articulares. Ambas citocinas são produzidas principalmente pelos linfócitos TCD4
(auxiliares) (PANAYI
et al.
, 1997). A IL-1 que é uma proteína produzida durante a
apresentação do antígeno e está freqüentemente associada ao TNF-α por possuir
atividade similar nas células sinoviais, participam da ativação das células T durante a
apresentação antigênica. Ainda, a IL-1 estimula a reabsorção óssea peri-articular,
ativa a proliferação dos linfócitos B e inibe a síntese de proteoglicanos entre outros,
é indicada como responsável primariamente pela fase destrutiva da doença
(WOOLEY,
et al
. 1996 ; JOOSTEN
et al
., 1999).
Há que se destacar a participação da Interleucina 6 (IL-6) que está presente
no líquido sinovial reumatóide colaborando para a lesão óssea (KOTAKE, S.,
et al
.,
1996). A IL-6 estimula as células B, contribuindo assim para a produção local de
anticorpos e fator reumatóide.
O GM-CSF (fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos) é um
potente ativador de macrófagos, induz a atividade anti-tumoral, morte intracelular de
parasitas e secreção de IL-1. Ativa também as células dendríticas e aumenta as
funções efetoras dos neutrófilos, como a fagocitose (PANAYI
et al.
, 1997).
Trabalhos anteriores descrevem um acúmulo no líquido sinovial reumatóide de
células expressando CXCR3 e CCR5, receptores que interagem com algumas
quimiocinas, mostrando um papel importante destas citocinas nessa patogenia
(QUIN
et at
., 1998 ; SUZUKI
et al
., 1999). Quimiocinas como IP-10 (CXCL-10),
Introdução
15
RANTES (CCL5), MIP-1α e β (CCL3 e CCL4) que podem ser produzidas também pelos
neutrófilos, interagem com os receptores CXR3 e CCR5 e desta forma atuam
recrutando leucócitos (preferencialmente células de padrão Th1) para o local de
inflamação, no caso de artrite reumatóide, para a sinóvia (PATEL,
et al
., 2001).
Quanto às moléculas de caráter antinflamatório, devem ser destacadas
principalmente duas citocinas, a IL-10 e o IFN-
γ
. Ambas são secretadas pelos
linfócitos Th2 e possuem uma ação protetora no processo patogênico. A IFN-γ com
origem na população de magrófagos tem ação autócrina e inibe a ativação deste tipo
celular. Já a IL-10 inibe a ação dos linfócitos de padrão Th1 e a produção de
citocinas pró-inflamatórias IL-1 e TNF-α (PANAYI, 1997).
1.4 – Apoptose Celular
A apoptose é uma forma de morte celular programada. É o mecanismo pelo
qual a célula promove a sua autodestruição de modo programado. Esse fenômeno já
foi observado, dentre outros processos, durante a embriogênese (principalmente nas
fases de organogênese e de involução), durante os processos de metamorfose
(relacionados principalmente a metaplasias), em quadros de alteração hormonal,
como a menopausa (envolvendo as células endometriais), em tumores com fases de
regressão ou de intensa proliferação e em algumas doenças virais (como a hepatite
viral) (BOWEN, 1990).
Embora pareça contraditório, é importante encarar a morte celular
programada como um mecanismo de sobrevivência ao invés de destruição, já que
Introdução
16
ela está intimamente envolvida em todo o processo de desenvolvimento embrionário
e na fase adulta de um organismo (BOWEN
et al
., 1998).
No início das pesquisas sobre morte celular a apoptose era considerada um
processo patológico, ocorrendo em circunstâncias anormais como em doenças, por
exemplo. Em meados da década de 50 o fenômeno de morte celular programada
começou a ser considerada como um fenômeno fisiológico, necessário para o
desenvolvimento e manutenção dos tecidos. Na década de 70, através de pesquisas
realizadas em tumores, a morte celular programada foi então relacionada à
homeostase e estaria regulando o número de células, afim de promover um
equilíbrio entre perda e ganho celular.
Ultimamente vem sendo muito estudado o papel dominante da apoptose no
balanço de organismos multicelulares e seu papel na modulação da inflamação. É de
extrema importância em sistemas celulares no quais uma rápida divisão celular se faz
necessária em determinadas situações, porém esse crescimento celular deve ser
limitado e finalizado a fim de prevenir que se torne uma proliferação desregulada,
podendo gerar como conseqüência, tumores (WILLIAMS et al, 1992; KING et al,
1995; JACOBSON, 1997).
No sistema imunológico durante um processo infeccioso, os linfócitos
antígeno-específicos precisam proliferar rapidamente para exercerem suas funções
efetoras e controlar a infecção. Com a eliminação do patógeno, essas células imunes
também precisam ser eliminadas para impedir dessa maneira, que este processo de
proliferação celular torne-se então, desregulado e/ou exacerbado, evitando uma
conseqüente leucemia ou linfoma. Desta forma a apoptose celular tem um papel
crítico na homeostase do sistema imunológico, balanceando a taxa de divisão e
Introdução
17
morte das células imunes (LORENZ, H-M.
et al
., 2000), limitando a duração da
resposta inflamatória, evitando que ocorra dano tecidual provocado pelas próprias
células do sistema imunológico (neutrófilos, por exemplo) e permitindo que ocorra o
reparo do local inflamado (van den BERG, J. M.,
et al
., 2001).
O mecanismo de apoptose ou morte celular programada diverge de uma
outra via de morte celular, a necrose, em inúmeros aspectos. A necrose é
caracterizada pelo inchaço da célula, ruptura da membrana celular e conseqüente
liberação do conteúdo intracelular para o meio extracelular, o que resulta numa
reação inflamatória intensa (MANJO, G., JORIS, I., 1995) Em contrapartida, como
características morfológicas de células apoptóticas estão incluídas o encolhimento
celular, a condensação do citoplasma, a segregação e condensação da cromatina,
evaginações de membrana, porém ela se mantém intacta e a formação de corpos
apoptóticos. Como característica bioquímica é apontada a fragmentação do DNA
celular (LOO, D.T.;RILLEMA, J.R., 1998). Devido ao fato de o material celular ser
freqüentemente preservado, resulta em resposta inflamatória e dano tecidual local
menos intensos em relação aos observados na necrose (SCHWARTZMAN, 1993).
A indução e execução da apoptose se dá por meio de vias sinalizadoras que
ativam um conjunto de proteases intracelulares, chamadas caspases que leva à essa
série de mudanças morfológicas e bioquímicas sofridas pelas células (LEIST, 2001).
Os sinais para ativação dessas caspases podem ser de origem intrínseca ou ainda, de
origem extrínseca.
A ativação da apoptose através de um sinal extrínseco, ocorre pela formação
de um complexo de membrana, conseqüência da ligação de moléculas indutoras de
apoptose aos receptores expostos pelas células, tais como: ligante Fas (FasL) ao
Introdução
18
receptor Fas (CD95) (SCAFFIDI et al.,1998); ligante TNF-α ao receptor 1 do fator de
necrose tumoral (TNFR1) (MAGNUSSON & VAUX, 1999); ligantes TRAIL/APO 2-L
(ligantes indutores de apoptose relacionado ao TNF) aos receptores TRAIL/R dos
tipos 1 e 2 (WILEY et al., 1995); ligante APO 3-L ao receptor DR 3 (SAIKUMAR et al.,
1999).
Após a ligação das moléculas protéicas sinalizadoras FasL e TNF-α aos seus
respectivos receptores Fas e TNFR1 (via extrínsica), proteínas associadas à
membrana conhecidas como “domínios de morte”, então são clivadas pela ação de
metaloproteases (McGEEHAN et al., 1994; HSU et al., 1995; TANAKA et al.,1996). A
ativação destes domínios de morte promove o recrutamento das proteínas
adaptadoras FADD/Mort-1(domínio de morte associado ao Fas) (SALMENA et al.,
2003) e TRADD (domínio de morte associado ao receptor TNF) respectivamente,
para formar complexos sinalizadores de indução da morte (DISC) (LI et al., 1998;
LUO et al., 1998; KRAMMER, 2000).
Como conseqüência do recrutamento dos domínios de morte FADD e TRADD,
inicia-se a ativação em cascata das caspases (cisteíno proteases). As caspases, uma
vez ativadas catalisam a clivagem de outras caspases, que por sua vez, ativam
diversas proteases e endonucleases celulares promotoras da apoptose. Neste caso,
quando o sinal é de origem extrínseco, a primeira caspase a ser ativada é a 8
(também chamada de iniciadora) (SALVESEN, 1999). Após a sua ativação, torna-se
capaz de ativar a caspase 3, chamada efetora (BUDIHARDJO et al.,1999), cuja
atividade tem como conseqüencia a degradação de proteínas nucleares e celulares
bem como decomposição de DNA (LOO et al., 1998).
Introdução
19
A clivagem da proteína Bid promove sua translocação para a superfície da
mitocôndria. Como conseqüência tem-se a formação de poros na membrana
mitocondrial, o que permite a liberação de citocromo C, considerado sinal intrínseco
para apoptose celular. A liberação do citocromo C leva a ativação da caspase 9
(iniciadora) que, assim como a caspase 8 também promove a ativação da caspase 3
(efetora) (SAIKUMAR et al., 1999).
Nos estágios iniciais da apoptose verifica-se a translocação de resíduos de
fosfatidilserina à face externa da membrana plasmática, que fisiologicamente se
encontram confinados na face interna da bicamada lipídica das células. (SAVILL,
1997).
Finalmente células apoptóticas perdem a sua função (SARASTE, 2000), a
superfície celular forma vesículas que resultam na formação dos corpos apoptóticos.
Os corpos apoptóticos, por sua vez, são reconhecidos através de receptores (CD36)
existentes nas células fagocíticas vizinhas e assim são fagocitados e eliminados dos
tecidos (VAUX & STRASSER, 1996; VanENGELAND et al., 1997).
Como já citado previamente, no sistema imunológico, a apoptose dos
neutrófilos é principal mecanismo de controle da intensidade da resposta
inflamatória bem como da lesão tecidual que pode ser causada pela permanência
prolongada de neutrófilos ativados no local de inflamação. Além disso, a
fagocitose de neutrófilos apoptóticos acontece sem promover a liberação de
mediadores pró-inflamatórios característicos da ativação celular dos macrófagos
(KIM, S.
et al
., 2004). No entanto, a células apoptóticas induzem a produção de
TGF-β (fator β transformador de crescimento) e IL-10, citocinas que podem
Introdução
20
promover resolução da inflamação e conseqüente reparo do tecido lesionado
(BYME, A & REEN, D. J., 2002).
WAHL
et al
., através de trabalho publicado no ano de 2004, fazendo uso de
um modelo animal demonstrou que o TGF-β produzido em resposta à células
apoptóticas é capaz de suprimir não só a inflamação, como também uma doença
autoimune.
Um trabalho publicado na Nature Immunoly no ano de 2006 (ARIEL,
et al
.,
2006) chama atenção para uma outra função de células apoptóticas (principalmente
neutrófilos e linfócitos) na resolução da inflamação. Este estudo mostra que há um
aumento, dependente de caspase, na expressão do receptor CCR5 na superfície de
neutrófilos apoptóticos e que este receptor atua seqüestrando seus ligantes (função
scavenger
), no caso, quimiocinas como a CCL5 e CCL3 (RANTES e MIP-1α,
respectivamente). Deste modo, os leucócitos em apoptose participam ativamente da
eliminação dos sinais promovidos pelas quimiocinas, por reduzir as quantidades
destes mediadores no local de inflamação durante sua resolução.
Porém, já foi descrito que os neutrófilos da sinóvia de pacientes com artrite
reumatóide parecem adquirir uma certa resistência à apoptose, inclusive a induzida
pelo TNF (ZVAIFLER NJ
et al
.,1991).
Com base na participação de células apoptóticas na resolução da inflamação, no
papel dos neutrófilos na patogenia da artrite reumatóide, a apoptose deste tipo
celular tem sido alvo de diversos estudos por ser essencial na prevenção da
excessiva destruição do tecido sinovial.
Introdução
21
Comparado com outros tipos celulares a apoptose de neutrófilos, suas vias e
mediadores pró e anti-apoptóticos têm sido bastante estudados nos últimos anos,
mas resultados controversos ainda são bastante encontrados.
Objetivos
Objetivos
23
2– OBJETIVOS
Uma vez que a artrite reumatóide é considerada um protótipo de doença
caracterizada pela inflamação neutrofílica, mediada por muitas citocinas e que o
processo de apoptose celular participa na resolução da inflamação, previnindo a
excessiva destruição tissular, o objetivo geral deste trabalho foi: avaliar a apoptose
dos neutrófilos do sangue periférico de pacientes com AR em diferentes estágios da
doença, bem como sua relação com o perfil de produção de determinadas citocinas.
Com o propósito de atingir este objetivo, foram utilizadas as seguintes
estratégias experimentais:
1. Avaliação da população de neutrófilos apoptóticos do sangue periférico de
pacientes de Artrite Reumatóide com a doença controlada e em atividade,
através de análise em citometria de fluxo pela da marcação com Anexina V/
Iodeto de propídio;
2. Avaliação das concentrações de determinadas citocinas no soro de pacientes
de Artrite Reumatóide apresentando a doença em sua fase controlada e em
atividade, através de análises realizadas por citometria de fluxo;
3. Avaliação da população de neutrófilos apoptóticos do sangue periférico de
ratos que desenvolveram a Artrite Reumatóide induzida por adjuvante
Objetivos
24
completo de Freund (CFA), através de análise em citometria de fluxo pela da
marcação com Anexina V/ Iodeto de propídio.
Casuística e Métodos
Casuística e Métodos
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3- CASUÍSTICA E MÉTODOS
Parte A
– Experimentos realizados com neutrófilos humanos
3.1- Pacientes
Os pacientes envolvidos neste trabalho foram diagnosticados segundo os
critérios do Colégio Americano de Reumatologia (ARNETT et al., 1988) e são
atendidos pelos médicos e residentes do Ambulatório de Doenças Reumáticas do
Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – USP.
Foram avaliados pacientes com Artrite Reumatóide que estavam ou não na
fase controlada da doença.
O grupo foi composto de 25 pacientes do sexo feminino, que apresentavam
Artrite Reumatóide na fase controlada (ausência de sinais e sintomas e exames sem
alterações) ou ativa da doença, com idade entre 20 e 50 anos, pré-menopausadas,
fazendo uso do mesmo medicamento (Metotrexato- MXT) em doses baixas. Esses
pacientes selecionados foram pareados com 25 indivíduos saudáveis em termos de
idade e sexo.
O grupo de pacientes foi estadiado em dois novos grupos:
• AR controlada ou inativa – constituído por 15 pacientes.
• AR em atividade – constituído por 10 pacientes.
O protocolo experimental deste trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP
Casuística e Métodos
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(Processo HCRP n° 10097/2002). Todos os procedimentos obedeceram
rigorosamente às recomendações de ética médica.
3.1.1- Colheita de sangue
A colheita das amostras foi realizada após o consentimento prévio verbal de
todos os indivíduos, seguindo as recomendações de ética médica (Termo de
consentimento livre esclarecido).
As amostras de sangue venoso dos pacientes foram obtidas por punção
anterocubital, utilizando-se sistema a vácuo. Foram colhidos 10 mL de
sangue em tubo contendo EDTA (ácido etileno diaminotetracético) a 15% (Vacuum
II, Labnew, Becton & Dickinson, EUA) para avaliação da população de neutrófilos
apoptóticos.
3.1.2- Obtenção do soro
O soro foi obtido a partir da colheita sem uso de anticoagulante de 10 mL de
sangue total de pacientes de Artrite Reumatóide, bem como de doadores voluntários
saudáveis. O sangue foi mantido em repouso à temperatura ambiente para que
houvesse a retração do coágulo por aproximadamente uma hora e, em seguida
centrifugado a 480 g por dez minutos. Este procedimento permitiu que o coágulo
formado fosse removido e uma segunda centrifugação sob refrigeração foi realizada
a 480 g. Nesta etapa foram eliminadas células remanescentes que, eventualmente
não foram retidas no coágulo formado. Após esta segunda centrifugação o soro foi
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fracionado em pequenas alíquotas de 200 e 500 µl em tubos Eppendorf® e em
seguida estocado em freezer a -70
o
C para análises posteriores.
3.1.3- Marcação das células com o conjunto reativo Anexina-V-FITC
e Iodeto de propídeo
O kit da R&D Systems, EUA, contendo Anexina-V conjugada com FITC
(fluorocromo isotiocionato de fluoresceína) e Iodeto de Propídeo (IP) foi utilizado
para detectar populações de neutrófilos viáveis, em apoptose e inviáveis (necrose e
apoptose tardia) (HODGE and HAN, 1999).
Uma solução para a lise das hemácias foi preparada com o uso de cloreto de
amônia (NH
4
Cl) 1,7 mol/L com pH 7,3, diluída dez vezes usando como diluente um
tampão Tris 0,17 mol/L.
2,0 mL desta solução de lise foi adicionada a uma alíquota de 100 µL de
sangue total (de pacientes e indivíduos saudáveis) que previamente foi distribuída
em tubos de polipropileno com volume máximo de 1,0 mL.
Após um período de incubação em banho-maria à 37
o
C por 10 minutos, esses
tubos foram centrifugados a 300 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Ao
final dessa centrifugação o sobrenadante foi descartado por inversão e o pellet
contendo as células foi lavado duas vezes com solução salina tamponada com fosfato
(PBS) gelado, pH= 7,4 , mais uma vez centrifugado nas mesmas condições da etapa
anterior.
O botão de células obtido foi ressuspenso em 400 µL do tampão de ligação
(“binding buffer” - R&D Systems, EUA), diluído dez vezes em água destilada. Em
Casuística e Métodos
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seguida, foram acrescentados 100 µL de uma solução contendo Anexina V- FITC
(25µg/mL) e Iodeto de propídeo (50 µg/ mL) a qual foi preparada da seguinte
maneira:
Anexina -V FITC (25µg/mL) 1,0 µL
Iodeto de propídeo (50 µg/ mL) 10 µL
Tampão de ligação sem diluir
10 µL
Água destilada
79 µl
As amostras foram incubadas por um período de 15 minutos ao abrigo da luz
e à temperatura ambiente.
3.1.4- Análise por citometria de fluxo
A análise foi realizada no citômetro de fluxo (FACScan, Becton & Dickinson,
USA) do Departamento de Bioquímica e Imunologia da FMRP-USP, com o auxílio do
software CellQuest
®
.
Posteriormente à aquisição das células em citômetro de fluxo, através do
programa CellQuest
®
, os neutrófilos foram selecionados através do seu típico
espalhamento, a partir do seu tamanho (dispersão vertical de luz) e granulosidade
celular (dispersão lateral de luz) e outros tipos celulares, como os mononucleares e
eritrócitos, por exemplo, bem como células “debris” e agregados foram excluídos da
análise, posto não fazem parte dos objetivos deste projeto. Dados de 10.000 eventos
foram coletados dos tubos e analisados com o software Cell Quest
®
(Becton &
Dickinson, USA).
Casuística e Métodos
30
Células que se encontravam nos estágios inicias de apoptose foram marcadas
intensamente por Anexina V-FITC, que emite fluorescência verde como resultado de
sua ligação preferencial aos resíduos de fosfatidilserina (FS), que são externalizados
no início do processo apoptótico. Já as células inviáveis foram marcadas pelo iodeto
de propídeo (IP), que possui afinidade pela dupla fita de DNA celular, o qual emite
fluorescência vermelha. As células em processo de necrose ou apoptose tardia foram
marcadas intensamente por iodeto de propídeo, e menos intensamente por Anexina
V-FITC. As células viáveis, por sua vez, não foram marcadas nem por Anexina V-
FITC, nem por iodeto de propídeo.
Anexina V-FITC foi determinada utilizando o detector de sinal para FITC (FL1)
enquanto que o iodeto de propídeo foi determinado através do detector de emissão
de sinais para PE (FL2).
3.1.5- Preparo das amostras de soro para dosagem de citocinas
As alíquotas de soro que foram estocadas no freezer de temperatura -70°C
foram retiradas e degeladas à temperatura ambiente.
Estas amostras foram submetidas a uma breve centrifugação de
aproximadamente 3 minutos a 200 g e à temperatura ambiente para eliminar
qualquer sedimento formado por hemáceas remanescentes.
Realizada esta etapa de centrifugação, as amostras de soro foram mantidas
em geladeira até que fossem utilizadas.
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31
3.1.6- Preparo das
beads
utilizadas nas dosagens de citocinas
Para este experimento, foi necessário previamente diluir as
beads
de captura.
Para tanto, um volume pequeno 100 µL de cada citocina a ser avaliada foi distribuído
em tubos diferentes.
Estas alíquotas de 100 µL foram diluídas cinco vezes em tampão para lavagem
(BD Biosciences). Após as amostras serem centrifugadas a 200 g por 5 minutos, o
sobrenadante foi cuidadosamente descartado e as
beads
foram ressuspensas em
diluente para soro ou plasma em um volume final de 50 µL (para cada amostra de
soro a ser testada).
As suspensões de
beads
preparadas foram mantidas em repouso, ao abrigo
da luz e à temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Após este
período as amostras foram vigorosamente agitas e alíquotas de 32 µL (de cada
citocina a ser dosada) foram distribuídas em tubos previamente identificados.
3.1.7- Preparo do fluorocromo PE (BD Biosciences)
Foram colocados em um tubo 100 µL do fluorocromo (
PE detection
) de cada
uma das citocinas. Em seguida foi realizada uma suspensão utilizando o reagente de
detecção (BD Biosciences) na proporção de 1:1.
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32
3.1.8- Preparo das amostras para dosagens de citocinas
À cada um dos tubos foram adicionados 50 µL de cada uma das amostras de
soro obtidas de pacientes de artrite reumatóide ou indivíduos saudáveis. Seguiu-se
após esta etapa um período de incubação de 1 hora em temperatura ambiente e ao
abrigo da luz.
Em seguida, 33 µL da suspensão preparada contendo o fluorocromo e o
reagente de detecção foram adicionados nos tubos que já estavam incubados há 1
hora, contendo as amostras de soro e as
beads
. Mais uma vez os tubos foram
incubados por 2 horas nas mesmas condições da incubação realizada anteriormente.
Após este período as amostras foram submetidas à centrifugação a 200 g por 5
minutos. Em seguida foram lavadas 1 vez com 1 mL de tampão de lavagem. O
sobrenadante foi descartado cuidadosamente e o
pellet
foi ressuspenso em 300 µL
do mesmo tampão usado para lavagem.
3.1.9- Dosagem de citocina por citometria de fluxo
As dosagens de citocinas foram realizadas por citometria de fluxo através de
um imunoensaio baseado em
beads
de captura, realizado com uso do Kit CBA
Human basic Flex Set (BD Biosciences), que permite dosagem de até 24 citocinas
diferentes em uma mesma amostra de soro.
Após a aquisição dos dados no citômetro foi feita a análise através do uso do
software FCAP Array. As concentrações das citocinas presentes nos soros de
pacientes e de indivíduos saudáveis foram expressas em pg/mL.
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Parte B
– Experimentos realizados com neutrófilos de ratos
Modelo experimental de Artrite Reumatóide:
Este modelo experimental foi desenvolvido pelo Dr. Alexandre Kanashiro, em
seu trabalho de pós-doutorado no laboratório de Farmacologia da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto –USP, sob supervisão da Profa. Dra. Glória
E. Petto de Souza.
3.2 - Animais
Foram utilizadas 16 ratas Wistar, com variações baixas de peso (entre 140 e
150 gramas), originárias do Biotério Central do campus da USP-RP.
Os animais foram mantidos em caixas de polietileno (de aproximadamente
20 cm x 40 cm x 60 cm) no Biotério do Laboratório de Farmacologia da FCFRP -USP
sob condições ambientais controladas e de acordo os preceitos éticos estabelecidos
pela Comissão de Ética de Uso de Animais (CEUA) do Campus de Ribeirão Preto –
USP, de acordo com o Protocolo número : 06. 1. 1353.53.2
3.2.1 - Indução de Artrite Reumatóide pelo uso de adjuvante (CFA)
em ratos
Após os animais terem sido levemente anestesiados com éter, utilizando uma
seringa de vidro foram injetados na base da cauda de cada animal 500 mg de
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Mycobacterium butyricum em 200 µL de emulsão formada por óleo mineral e água
(na proporção de 9:1). Um outro grupo de animais, considerado grupo controle foi
formado por animais que receberam apenas 200 µL de emulsão de óleo mineral e
água (na proporção de 9:1).
Durante 24 dias os animais foram pesados (gramas) e o volume da pata
traseira direita (mL) foi determinado em Pletismógrafo (Ugo Basile).
O desenvolvimento da artrite teve inicio entre os 10 e 12
o
dias.
3.2.2 - Obtenção das amostras de sangue dos animais
No 24
o
dia, os animais foram anestesiados (xilasina e ketamina) e o sangue
(5mL) foi obtido por punção da aorta abdominal utilizando EDTA- 15% como
anticoagulante; (Poggi, J.C. et al, 2004).
3.2.3- Marcação das células com o conjunto reativo Anexina-V-FITC
e Iodeto de propídeo:
Assim como já descrito acima nos experimentos realizados com células
humanas, uma solução de NH
4
Cl 1,7 mol/L pH 7,3, diluída em 1:10 em tampão Tris
0,17 mol/L, foi utilizada para a lise das hemácias.
Seguidamente, adicionou-se 2 mL da solução de lise a um volume de 100 µL
da amostra de sangue total de cada um dos animais (grupo controle e grupo que
recebeu injeção de adjuvante). Após serem gentilmente misturadas, foram incubadas
por 10 minutos à 37
o
C. A suspensão foi centrifugada a 300 g durante 10 minutos à
Casuística e Métodos
35
temperatura ambiente. O sedimento foi então ressuspenso em 1 ml de HBSS e
centrifugado novamente sob as mesmas condições anteriores. Após o descarte do
sobrenadante por inversão, os leucócitos foram ressuspendidos em tampão de
ligação (
binding buffer
), e posteriormente adicionou-se Anexina V-FITC e Iodeto de
propídio em cada um dos tubos, os quais foram então incubados no escuro durante o
período de 15 minutos à temperatura ambiente.
3.2.4 - Análise por citometria de fluxo
A população de neutrófilos foi identificada através da análise citométrica, com
base no seu típico espalhamento a partir do seu tamanho (dispersão vertical de luz)
e granulosidade celular (dispersão lateral de luz) e selecionados a partir da exclusão
de outros tipos celulares. Assim como realizado em experimentos com neutrófilos
humanos, a análise seguiu-se no citômetro de fluxo (FACScan, Becton & Dickinson,
USA) do Departamento de Bioquímica e Imunologia da FMRP-USP. Dados de 10.000
eventos foram coletados dos tubos e analisados com o software Cell Quest
®
(Becton
& Dickinson, USA).
3.3- Análises Estatísticas
Os resultados foram analisados através do software GraphPad Prism,
GraphPad Software, San Diego, EUA.
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se os testes não
paramétricos de Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis.
Casuística e Métodos
36
Quando foram realizadas comparações entre os três grupos (pacientes com a
doença ativa, inativa e indivíduos saudáveis) foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis,
considerando serem significativos os valores de p < 0,05.
Para as comparações realizadas entre dois grupos apenas, foi utilizado o teste
de Mann-Whitney U, sendo considerado valores significativos quando p < 0,05.
Resultados
Resultados
38
4 – RESULTADOS
Parte A
– Experimentos realizados com neutrófilos humanos
4.1- Avaliação da viabilidade de neutrófilos em pacientes com AR em
diferentes estágios da doença
4.1.1 – Determinação da população de neutrófilos apoptóticos
A população de neutrófilos a partir do sangue total dos diferentes grupos
estudados foi identificada utilizando-se um gráfico de dispersão luminosa frontal
(tamanho celular) versus dispersão luminosa lateral (granulosidade celular) por
análise citométrica (BROWN et al., 1993) (figura.4.1). Como observado nesta figura,
averiguou-se morfologicamente que, em decorrência de sua típica localização a
população isolada de neutrófilos é facilmente distinguida de outros tipos celulares
(R1).
A partir da população celular selecionada com base em indicadores
morfométricos (R1), um novo gráfico é construído para avaliarmos a emissão de
fluorescência destas células. Para tanto, selecionou-se 10.000 eventos sendo
considerado cada evento uma célula. O número de células em estágio inicial de
apoptose nesta população foi avaliado através de marcação realizada com Anexina V-
FITC, rotineiramente utilizada na investigação citométrica de células que expõem
fosfatidilserina (FS), considerado um indicativo de apoptose celular. Com o uso de
outro marcador, o Iodeto de propídeo (IP) foi possível diferenciar células em
Resultados
39
processo de morte celular por necrose, bem como células em estágio de apoptose
tardia (apresentando dupla marcação), como mostra a figura 4.2.
Figura 4.1- Estratégia de análise de neutrófilos em sangue total humano, obtidos
após lise das hemácias. A população de células foi caracterizada de acordo com a
sua forma (deslocamento vertical, eixo y) e granulosidade (dispersão lateral, eixo x).
A região 1 (R1) é correspondente à população de neutrófilos.
R1
dodododododododododododdododododododododododododododododod
Dispersão luminosa vertical
(tamanho celular)
Dispersão luminosa lateral
(granulosidade)
R1
Neutrófilos
R1
dodododododododododododdododododododododododododododododod
Dispersão luminosa vertical
(tamanho celular)
Dispersão luminosa lateral
(granulosidade)
R1
Neutrófilos
R1
dodododododododododododdododododododododododododododododod
R1R1
dodododododododododododdododododododododododododododododod
Dispersão luminosa vertical
(tamanho celular)
Dispersão luminosa lateral
(granulosidade)
Dispersão luminosa vertical
(tamanho celular)
Dispersão luminosa lateral
(granulosidade)
R1
Neutrófilos
R1
NeutrófilosNeutrófilos
Resultados
40
Figura 4.2 - Análise representativa da marcação de neutrófilos humanos com
Anexina V-FITC e Iodeto de propídeo (IP). As células consideradas em estágio inicial
de apoptose estão apresentadas no quadrante direito inferior.
gugughuguguguggugugugugugugugughhihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihih
Anexina
Anexina
–
–
V (FITC)
V (FITC)
Iodeto de Propídeo
Iodeto de Propídeo
(IP)
(IP)
Anexina-V (+) / IP (-)
(células em apoptose inicial)
Anexina-V (-) / IP (+)
(células em necrose)
Anexina-V (-) / IP (-)
(células viáveis)
Anexina-V (+) / IP (+)
(células em apoptose tardia)
gugughuguguguggugugugugugugugughhihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihih
Anexina
Anexina
–
–
V (FITC)
V (FITC)
Iodeto de Propídeo
Iodeto de Propídeo
(IP)
(IP)
gugughuguguguggugugugugugugugughhihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihgugughuguguguggugugugugugugugughhihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihihih
Anexina
Anexina
–
–
V (FITC)
V (FITC)
Iodeto de Propídeo
Iodeto de Propídeo
(IP)
(IP)
Anexina-V (+) / IP (-)
(células em apoptose inicial)
Anexina-V (-) / IP (+)
(células em necrose)
Anexina-V (-) / IP (-)
(células viáveis)
Anexina-V (+) / IP (+)
(células em apoptose tardia)
Anexina-V (+) / IP (-)
(células em apoptose inicial)
Anexina-V (-) / IP (+)
(células em necrose)
Anexina-V (-) / IP (-)
(células viáveis)
Anexina-V (+) / IP (+)
(células em apoptose tardia)
Resultados
41
A figura 4.3 mostra o gráfico referente às comparações da porcentagem de
neutrófilos apoptóticos do sangue periférico de pacientes (em estágios diferentes da
doença) e de indivíduos saudáveis (grupo controle). Observa-se que a população de
neutrófilos marcados com Anexina-V é menor em pacientes com AR ativa, tanto em
comparação com a população celular de indivíduos saudáveis quanto em comparação
com a população de pacientes apresentando AR controlada. Embora, de acordo com
os testes aplicados essa diferença não seja estatisticamente significativa (p>0,05).
Figura 4.3 - Avaliação da população de neutrófilos apoptóticos presentes em
amostras de sangue total obtidas de pacientes com Artrite Reumatóide controlada
(n=15) e Ativa (n=10), bem como em indivíduos saudáveis (controles) (n=25). Os
resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos em porcentagem. Dados
analisados utilizando-se os testes não paramétricos de Mann Whitney e Kruskal-
Wallis, considerando como significante apenas valores de p< 0.05.
0
15
30
45
60
75
Porcentagem de
neutrófilos Anexina-V(+)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
15
30
45
60
75
Porcentagem de
neutrófilos Anexina-V(+)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
Resultados
42
4.1.2 – Determinação da população de neutrófilos inviáveis
Os neutrófilos marcados apenas com IP correspondem à população de
neutrófilos necróticos. Já os duplamente marcados com Anexian-V e IP referem-se às
células que estão em processo de apoptose tardia.
Com a análise dos dados, verificou-se que não houve diferença significativa na
porcentagem de neutrófilos marcados com IP quando comparados os grupos de
pacientes entre si (p>0,05) ou mesmo quando estes foram comparados ao grupo
controle (p>0,05), como mostra a figura 4.4.
Do mesmo modo, as populações de neutrófilos em apoptose tardia também
não apresentaram diferenças estatisticamente relevantes quando os três grupos
foram comparados ou quando os grupos de pacientes foram comparados entre si
(p>0,05). Porém, nota-se uma discreta diminuição na porcentagem de neutrófilos de
pacientes com AR ativa duplamente marcados quando comparada aos demais
grupos, como mostra a figura 4.5.
Resultados
43
Figura 4.3 - Avaliação da população de neutrófilos necróticos presentes em
amostras de sangue total obtidas de pacientes com Artrite Reumatóide Controlada
(n=15), e Ativa (n=10), bem como em indivíduos saudáveis (controles) (n=25). Os
resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos em porcentagem. Dados
analisados utilizando-se os testes não paramétricos de Mann Whitney e Kruskal-
Wallis, considerando como significante apenas valores de p< 0.05.
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
Porcentagem de
neutrófilos IP(+)
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
Porcentagem de
neutrófilos IP(+)
Resultados
44
Figura 4.4 - Avaliação da população de neutrófilos em apoptose tardia presentes
em amostras de sangue total obtidas de pacientes com Artrite Reumatóide
Controlada (n=15) e Ativa (n=10), bem como de indivíduos saudáveis (controles)
(n=25). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos em
porcentagem. Dados analisados utilizando-se os testes não paramétricos de Mann
Whitney e Kruskal-Wallis, considerando como significante apenas valores de p< 0.05.
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
Porcentagem de
neutrófilos Anexina-V (+) /
IP (+)
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
Porcentagem de
neutrófilos Anexina-V (+) /
IP (+)
Resultados
45
4.1.3 – Determinação da população de neutrófilos viáveis
Os neutrófilos que não apresentam marcação para Anexina-V e IP são
considerados viáveis, pois não expuseram o fosfolipídeo FS em sua superfície e
apresentam membrana plasmática íntegra, uma vez que o IP não conseguiu
incorporar a essas células.
Como apresentado na figura 4.5, a análise dos dados mostra que população
de neutrófilos de pacientes com AR ativa apresenta uma pequena variação na
porcentagem de células viáveis em comparação a população de neutrófilos de
pacientes com AR controlada e também de indivíduos saudáveis, embora estas
diferenças sejam muito pequenas e sem significância estatística. Ainda, a população
de células viáveis dos indivíduos saudáveis foi menor quando comparada com a
população de ambos os grupos de pacientes. Porém, esta diferença observada
também não apresenta relevância estatística.
Resultados
46
Figura 4.5 - Avaliação da população de neutrófilos viáveis, sem qualquer marcação,
presentes em amostras de sangue total obtidas de pacientes com Artrite Reumatóide
controlada (n= 15) e Ativa (n=10), bem como de indivíduos saudáveis (controles)
(n= 25). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos em
porcentagem. Dados analisados utilizando-se os testes não paramétricos de Mann
Whitney e Kruskal-Wallis, considerando como significante apenas valores de p< 0.05.
0
15
30
45
60
75
90
Porcentagem de
neutrófilos viáveis
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
Resultados
47
4.2 – Avaliação das concentrações de citocinas e quimiocinas em
soro de pacientes com AR em diferentes estágios da doença
Uma menor expressão de FS na superfície de neutrófilos de pacientes de AR
ativa sugere que estas células se mantêm funcionais por um período de tempo maior
do que os neutrófilos provenientes dos outros grupos estudados. Desta maneira,
foram realizadas dosagens de diferentes quimiocinas que podem ser produzidas e
liberadas por estas células, como MIP-1α (CCL3), MIP-1β (CCL4), IP-10 (CXCL10)
além da IL-8 que também é capaz de promover a quimiotaxia deste tipo celular
(KASAMA
et al
.,2005).
Nos gráficos apresentados na figura 4.6, observa-se maiores concentrações
destas quimiocinas no soro de pacientes de ambos os grupos em comparação ao
grupo controle. Sendo as concentrações encontradas no soro do grupo de pacientes
com AR ativa mais elevadas quando comparadas com os demais grupos. A única
exceção é notada para MIP-1α que apresenta uma sutil alteração no soro de
pacientes com AR controlada. Apesar dos aumentos detectados, somente o aumento
de IL-8 é estatisticamente significante.
Além das quimiocinas mencionadas, também foram realizadas análises de
outras citocinas como G-CSF, que também possui ação sobre neutrófilos e outros
granulócitos, estimulando a hematopoiese destas células e IL-12p70 (IL-12
funcional), uma citocina pró-inflamatória de padrão Th1 (STARK
et al
.,2005). De
acordo com dados demonstrados no gráfico da figura 4.7, não houve diferença
estatística nas concentrações destas citocinas nos diferentes soros analisados.
Resultados
48
Porém, nota-se uma tendência para um aumento da concentração de G-CSF no soro
de pacientes com a doença ativa.
Quando a citocina analisada foi a IL-12p70, também verificou-se tendência
para um aumento, porém, no soro de pacientes com a doença controlada. Nos dois
casos este aumento talvez não tenha se confirmado em virtude do número de
pacientes analisados ser relativamente baixo.
Resultados
49
Figura 4.6
– Comparação dos níveis de quimiocinas no soro de pacientes com AR
controlada (n=11), AR ativa (n=8) e indivíduos saudáveis (n=8). Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Dados analisados utilizando-
se os testes não paramétricos de Mann Whitney e Kruskal-Wallis, considerando como
significante apenas valores de p< 0.05.
0
15
30
45
60
75
IP-10 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
MIP-1 alfa
(pg/mL)
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
25
50
75
MIP-1 beta
(pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
IL-8 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
10
20
30
40
*
p = 0.0289
0
15
30
45
60
75
IP-10 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
MIP-1 alfa
(pg/mL)
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
25
50
75
MIP-1 beta
(pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
15
30
45
60
75
IP-10 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
MIP-1 alfa
(pg/mL)
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
15
30
45
60
75
IP-10 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
15
30
45
60
75
IP-10 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
MIP-1 alfa
(pg/mL)
0
2
4
6
8
10
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
25
50
75
MIP-1 beta
(pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
IL-8 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
10
20
30
40
*
p = 0.0289
IL-8 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
10
20
30
40
IL-8 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
IL-8 (pg/mL)
AR Controlada AR Ativa Controles
(saudáveis)
0
10
20
30
40
*
p = 0.0289
Resultados
50
Figura 4.7
– Comparação dos níveis de citocinas no soro de pacientes com AR
controlada (n=11), AR ativa (n=8) e indivíduos saudáveis (n=8). Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Dados analisados utilizando-
se os testes não paramétricos de Mann Whitney e Kruskal-Wallis, considerando como
significante apenas valores de p< 0.05.
0
1
2
3
4
G-CSF (pg/mL)
AR Controlada
AR Ativa
Controles
(saudáveis)
0
1
2
3
4
G-CSF (pg/mL)
AR Controlada
AR Ativa
Controles
(saudáveis)
0
1
2
3
4
5
AR Controlada
AR Ativa
Controles
(saudáveis)
IL-12 p70 (pg/mL)
0
1
2
3
4
5
AR Controlada
AR Ativa
Controles
(saudáveis)
IL-12 p70 (pg/mL)
**
p = 0.0068
*
p = 0.0229
Resultados
51
Parte B
– Experimentos realizados com neutrófilos obtidos de ratos
(Modelo experimental de Artrite Reumatóide induzida por adjuvante)
4.3 - Parâmetros para avaliação da indução da Artrite Reumatóide em
fêmeas de ratos
Wistar
Devido ao fato dos pacientes incluídos neste estudo fazerem uso de
medicamentos que podem alterar o sistema imunológico e uma vez que o objetivo
deste trabalho é analisar alguns aspectos funcionais deste sistema, um modelo
experimental de Artrite Reumatóide induzido por adjuvante foi desenvolvido usando
ratos Wistar fêmeas. Deste modo, procederam-se experimentos a partir de
neutrófilos do sangue periférico destes animais, os quais não receberam nenhum tipo
de medicamento antinflamatório para posterior comparação com os resultados
obtidos nos experimentos realizados com neutrófilos de pacientes.
O peso dos animais e o volume da pata traseira direita (mL) foram avaliados
durante 24 dias, partindo do dia da inoculação do
Mycobacterium butyricum
até o dia
da obtenção das amostras, mostrando o desenvolvimento e a progressão da doença
(Fig 4.8).
Com base nos dados obtidos e analisados, observa-se o início da doença no
12° dia. A partir deste dia os animais que receberam o adjuvante começaram a
apresentar inchaço da pata e perda de peso, quando comparados aos animais do
grupo controle. (Figura 4.8)
Resultados
52
0 5 10 15 20 25
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
controle
artrite
tempo (dias)
volume das patas (mL)
A
0 5 10 15 20 25
100
150
200
250
300
controle
artrite
B
tempo (dias)
peso (gramas)
Figura 4.8
Desenvolvimento da artrite-induzida por adjuvante em ratos Wistar
fêmea. A: Progressão do edema de pata (mL). B: Progressão do peso corporal
(gramas). Dados estão representados como como média ± erro padrão da média
(SEM) (n=8).
Resultados
53
4.4 – Avaliação da viabilidade de neutrófilos de ratos com AR induzida por
adjuvante
4.4.1- Determinação da população de neutrófilos apoptóticos
Nos experimentos realizados a partir do sangue periférico dos animais
pertencentes aos dois grupos (os que desenvolveram AR e o grupo controle), com a
finalidade de se avaliar a população de neutrófilos apoptóticos, mostram que a
porcentagem destas células apoptóticas encontrada em ambos os grupos não
apresenta diferença significativa (p>0,05), embora os dados revelem uma população
Anexina-V positiva maior nos animais do grupo controle (Fig.4.9).
Resultados
54
Figura 4.9
- Avaliação da população de neutrófilos apoptóticos presentes em
amostras de sangue total obtidas ratos Wistar fêmeas que desenvolveram Artrite
Reumatóide induzida por adjuvante completo de Freud. (n = 8) e animais saudáveis
(controles) (n= 8). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos
em porcentagem. Dados analisados utilizando-se o teste não paramétrico de Mann
Whitney, considerando como significante apenas valores de p < 0.05.
0
1
2
3
4
5
Porcentagem de
neutrófilos Anexina-V(+)
Animais AR Controles
0
1
2
3
4
5
Porcentagem de
neutrófilos Anexina-V(+)
Animais AR Controles
Resultados
55
4.4.2 – Determinação da população de neutrófilos inviáveis
Os gráficos apresentados na figura 4.10 referem-se à população de neutrófilos
inviáveis que estão necróticos ou em processo de apoptose tardia (A e B,
respectivamente).
Assim como observado nos experimentos realizados com neutrófilos de
pacientes, também não houve diferença estatisticamente significativa. Porém, a
população de neutrófilos necróticos (marcação positiva apenas para IP) apresenta
um aumento sutil nos animais controles em comparação aos animais que
desenvolveram artrite (figura 4.10-A).
Em contrapartida e também divergente dos resultados obtidos a partir dos
neutrófilos humanos, verificou-se um aumento na porcentagem de neutrófilos em
processo de apoptose tardia (marcação positiva para Anexina-V e IP) nos animais
controles quando comparados aos animais com artrite. Este dado, segundo o teste
estatístico aplicado, não possui relevância estatística (p>0,05).
Resultados
56
Figura 4.10
–Avaliação da população de neutrófilos inviáveis presentes em amostras
de sangue total obtidas ratos Wistar fêmeas que desenvolveram Artrite Reumatóide
induzida por adjuvante completo de Freud. (n = 8) e animais saudáveis (controles)
(n= 8).
A. Porcentagem de neutrófilos necróticos (marcados apenas com IP).
B. Porcentagem de neutrófilos em apoptose tardia (marcação positiva para
Anexina-V e IP).
Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos em porcentagem.
Dados analisados utilizando-se o teste não paramétrico de Mann Whitney,
considerando como significante apenas valores de p < 0.05.
0
10
20
30
40
50
Porcentagem de
neutrófilos IP(+)
A
0
3
6
9
12
15
Porcentagem de
neutrófilos
Anexina-V (+) /
IP (+)
Animais AR
Controles
B
0
10
20
30
40
50
Porcentagem de
neutrófilos IP(+)
A
0
10
20
30
40
50
Porcentagem de
neutrófilos IP(+)
A
0
3
6
9
12
15
Porcentagem de
neutrófilos
Anexina-V (+) /
IP (+)
Animais AR
Controles
B
0
3
6
9
12
15
Porcentagem de
neutrófilos
Anexina-V (+) /
IP (+)
Animais AR
Controles
B
Resultados
57
4.4.3 – Determinação da população de neutrófilos viáveis
Verificou-se que as populações de neutrófilos vivos (marcação negativa tanto
para Anexina-V quanto para IP) são semelhantes nos dois grupos de animais
analisados (figura 4.11).
Figura 4.11
–Avaliação da população de neutrófilos viáveis presentes em amostras
de sangue total obtidas ratos Wistar fêmeas que desenvolveram Artrite Reumatóide
induzida por adjuvante (n = 8) e animais saudáveis (controles) (n= 8). Os resultados
(média ± erro padrão da média) estão expressos em porcentagem. Dados analisados
utilizando-se o teste não paramétrico de Mann Whitney, considerando como
significante apenas valores de p < 0.05.
0
20
40
60
80
100
Porcentagem de
neutrófilos viáveis
Animais AR Controles
Discussão
Discussão
59
5 – DISCUSSÃO
Os neutrófilos representam um papel crucial na defesa do hospedeiro por
fagocitar e matar microorganismos invasores. São gerados diariamente pela medula
óssea cerca de 10
11
PMNs em um indivíduo adulto saudável, fazendo deste tipo
celular o mais abundante presente na circulação sanguínea. Em contrapartida, os
neutrófilos possuem uma meia-vida muito curta, permanecendo apenas algumas
horas (cerca de 8 horas) na circulação antes de migrarem para os tecidos. A
eliminação dos neutrófilos da corrente sanguínea se dá pelo processo de morte
celular programada, a apoptose, e sua subseqüente remoção através do mecanismo
de fagocitose realizado por macrófagos, monócitos e células dendríticas
(MOLLINEDO, F.; BORREGAARD, N. ; BOXER, L.A. , 1999).
A apoptose não somente regula a meia-vida de PMNs, mas também contribui
com a resolução da inflamação por regular a remoção destas células do sítio
inflamatório (SAVILL, J., 1997). O primeiro evento da apoptose é a exposição de
fosfatidilserina na superfície celular. Essa mudança na composição da membrana
plasmática marca os neutrófilos para serem reconhecidos e removidos pelos
macrófagos. Também é evidenciado que neutrófilos apoptóticos perdem suas
funções como adesão celular, quimiotaxia, fagocitose e
burst
oxidativo. No entanto,
ainda não está esclarecido se essa perda de função acontece antes ou depois da
exposição do fosfolípide (HENDEY, B.
et al
., 2002).
Um descontrole neste mecanismo de morte celular pode estar associado a
autoimunidade (LORENZ, H-M.
et al
., 2000). No caso da artrite reumatóide, o papel
dos neutrófilos na instalação e progressão da doença já foi bem evidenciado em
Discussão
60
estudos prévios (CHATHAM, WW.,
et al
., 1993). Dados da literatura também
demonstram que os PMNs da sinóvia inflamada apresentam um atraso na apoptose.
Como conseqüência, permanecem ativados no sítio inflamatório, promovendo a lesão
tecidual, colaborando com a cronicidade da doença (BORREGAARD, N., COWNLAND,
J. B., 1997).
Outros trabalhos demonstraram que neutrófilos circulantes de pacientes com
AR e de indivíduos saudáveis também sofrem atraso no processo de apoptose celular
assim como os da sinóvia, quando cultivados com amostras do liquido sinovial
reumatóide. Indicando que algum componente do líquido sinovial é responsável pela
permanência exacerbada dos PMNs no sítio inflamatório (OTTONELLO,
et al
., 2.002).
Estes dados da literatura nos levaram ao questionamento que deu origem a este
trabalho: “ Os neutrófilos de pacientes com AR adquirem característica de resistência
a apoptose somente no local de inflamação? ”
Este estudo objetivou a investigação de importante aspecto funcional dos
neutrófilos circulantes de pacientes com artrite reumatóide em diferentes estágios da
doença. Deste modo, a apoptose espontânea desta população celular, bem como a
concentração de algumas citocinas relacionadas à potogenia da artrite foram
averiguadas. Os neutrófilos obtidos a partir do sangue periférico de pacientes e
indivíduos sadios foram marcados com Anexina-V / IP permitindo a avaliação de
neutrófilos viáveis, em apoptose e inviáveis (necrose ou apoptose tardia) (HODGE,
1999) através de análises citométricas.
A avaliação e quantificação das populações celulares por citometria de fluxo
forneceram análises precisas e reprodutivas do processo de morte celular por
apoptose.
Discussão
61
Trabalhos publicados desde 1994 mostram que a Anexina-V é útil na detecção
de células apoptóticas em decorrência de sua ligação preferencial a fosfolipídeos de
membrana, como a fosfatidilserina exposta no início do processo apoptótico
(KOOPMAN et al.,1994; LEE et al., 2004). A Anexina-V conjugada ao corante
Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), nos permitiu identificar e quantificar as células
apoptóticas através da citometria de fluxo. Com a utilização concomitante do
marcador nuclear fluorescente iodeto de propídeo (IP), foi possível a identificação de
características dos estágios tardios da apoptose, bem como a distinção de células
necróticas de células apoptóticas, como descrito por WILLINGHAM, 1999.
Marcadores de DNA de elevado peso molecular como o IP, não são capazes
de penetrar na célula intacta em decorrência do seu tamanho, bem como não
marcam células apoptóticas sem que estas estejam já apresentando alterações na
permeabilidade da membrana plasmática, como ocorre nos processos de morte
celular por necrose e nos estágios finais da apoptose. Desse modo, utilizando
citômetro de fluxo, o marcador Anexina V-FITC nos permitiu detectar neutrófilos em
estágios iniciais da apoptose, enquanto o iodeto de propídeo nos permitiu detectar
neutrófilos nos momentos finais deste processo de morte celular.
A maioria dos estudos sobre apoptose de neutrófilos, no entanto, tem sido
conduzida com células purificadas do sangue total. Porém, quando estas células
permanecem em contato com todos os componentes presentes no sangue total, o
efeito de citocinas pró-inflamatórias na apoptose dos leucócitos podem ser
modulados pela presença de eritrócitos, plaquetas e até mesmo por outros sub-tipos
leucocitários, mimetizando de maneira mais fiel ao que acontece de fato
in vivo
(SIMON, 2003). Além do que, o sub-tipo celular mais suscetível a essas alterações é
Discussão
62
o neutrófilo, como demonstrou McNAMEE e colaboradores num trabalho publicado no
ano de 2005.
Neste trabalho, apoptose espontânea de neutrófilos foi avaliada em citometria
de fluxo a partir de amostras de sangue total, uma vez que as dispersões frontal e
lateral de luz detectam, sem auxílio de fluorescência, tamanho e complexidade
celular (granulosidade), respectivamente e através do seu típico espalhamento a
população de neutrófilos foi facilmente identificada.
No monitoramento da exposição de FS em neutrófilos de pacientes com AR
comparados aos dos indivíduos sadios, verificamos que os neutrófilos dos pacientes
já apresentam uma tendência no atraso da apoptose espontânea quando ainda estão
circulantes. Sendo que os PMNs do grupo de pacientes com AR ativa parecem ter
uma meia-vida prolongada quando comparado aos demais grupos, uma vez que a
população de neutrófilos destes pacientes apresentou a porcentagem mais baixa de
células marcadas com Anexina-V. Em comparação com a população de neutrófilos
dos indivíduos saudáveis, o grupo de pacientes com AR controlada também
apresentou uma porcentagem mais baixa de PMNs marcados com Anexina-V.
Podemos inferir que neutrófilos de pacientes com AR são de maneira geral mais
resistentes à morte celular quando comparados aos de indivíduos saudáveis. E que
essa resistência é aumentada quando a doença se manifesta de maneira mais
agressiva (em atividade).
Porém, nossa investigação teve como base a apoptose espontânea dessas
células, uma vez que em nossas condições experimentais não era viável
averiguarmos se o mesmo aconteceria caso induzíssemos este processo nessas
células. Dados não mostrados indicam que talvez diferenças mais significativas
Discussão
63
fossem encontradas caso a apoptose fosse induzida. Um teste realizado com
neutrófilos do sangue periférico de pacientes com AR em atividade demonstrou que
essas células demoraram mais tempo para entrar neste processo de morte celular
programada, quando comparado com neutrófilos de indivíduo saudável, submetidos
às mesmas condições.
Em relação a porcentagem de células viáveis (sem nenhuma marcação para
Anexina-V e ou IP) nos três grupos avaliados (AR ativa, controlada e indivíduos
sadios), um aumento, embora pequeno, na população de neutrófilos viáveis em
pacientes com a doença em atividade indica mais uma vez que estas células são
capazes de permanecerem viáveis por um período de tempo maior.
Os neutrófilos que apresentam marcação positiva para Anexina-V, pela
exposição de fosfatidilserina, e também positiva para iodeto de propídeo são
considerados inviáveis. A marcação com IP indica perda da integridade da membrana
plasmática. Isso é possível porque neutrófilos apoptóticos se não são removidos pela
fagocitose realizada pelos macrófagos, perdem a integridade da membrana e assim
como ocorre na necrose, liberam seus conteúdos celulares num processo de “necrose
secundária” (MELLEY, 2005). Isto significa que a apoptose pode terminar como
necrose e desta feita, ao invés de promover a resolução, promove a inflamação. A
população duplamente marcada com Anexina-V e IP refere-se às células que
entraram em apoptose, porém não foram eliminadas, levando conseqüentemente à
necrose.
Tanto num quadro de inflamação crônica e sistêmica como no caso da artrite
reumatóide, quanto em situações normais, para garantir a homeostase do sistema
imunológico, não só a apoptose celular dos neutrófilos, mas também a remoção
Discussão
64
destas células através da fagocitose é extremamente essencial para não causar
inflamação ou um aumento dela. Caso contrário, estando a apoptose inalterada,
porém, se os fagócitos falharem no reconhecimento dos corpos apoptóticos, a morte
celular programada passa de “mocinho a vilão”.
Embora a exposição de fosfatidilserina seja um indicativo de apoptose celular,
alguns trabalhos revelam que a sua exposição na membrana de neutrófilos pode
acontecer após contato com galectina-1 (proteína da família das lectinas ligantes de
β-galactosídeos) expressa em células endoteliais ativadas durante o processo de
migração do neutrófilo para o local de inflamação. Neste caso, a exposição de FS
acontece sem elicitar a fragmentação do material genético ou outros sinais de morte
celular programada e, embora não estejam em apoptose, os neutrófilos são
eliminados do sítio inflamatório pela ação fagocítica dos macrófagos que reconhecem
o fosfolípide exposto na superfície celular. (DIAS-BARUFFI, M.
et al
., 2003). Este
mecanismo assegura a regulação da homeostase do sistema imunológico
(KARMAKAR,
et al
., 2005).
A marcação feita com o iodeto de propídio se mostra de extrema importância
neste ponto, pois assim podemos monitorar a exposição de FS pelos neutrófilos, bem
como detectar uma possível falha na remoção destas células realizada pelos
fagócitos. Neste caso, teríamos nos grupos de pacientes uma porcentagem de
células duplamente marcadas superior a porcentagem encontrada nos indivíduos
saudáveis. No entanto, isso não foi observado nas condições experimentais
empregadas neste estudo.
De acordo com estes estudos, os resultados apresentados neste trabalho
podem inferir que em pacientes com AR ativa a eliminação dos neutrófilos pode estar
Discussão
65
deficiente por estas células falharem na exposição de fosfatidilserina, dificultando o
seu reconhecimento pelos macrófagos.
Durante a realização deste trabalho, foi de nosso interesse avaliar os mesmos
parâmetros estudados em pacientes sem tratamento, recém diagnosticado, sem uso
de medicamento, já que todos os pacientes envolvidos neste estudo fazem uso de
medicação, no caso, Metotrexato®. Como o acesso a esses pacientes recém
diagnosticados não foi possível, optamos por desenvolver um modelo experimental
em parceria com outros pesquisadores da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto. Desta forma poderíamos confirmar os resultados encontrados.
Os experimentos realizados com ratos
Wistar
fêmeas, pôde nos esclarecer
essa questão, já que nenhuma droga foi usada nos animais quer desenvolveram AR
e os experimentos procederam durante a fase ativa da doença. A exemplo do que foi
observado nos pacientes, os neutrófilos dos animais com AR, em comparação aos
dos animais do grupo controle, também apresentaram uma menor exposição do
fosfolípide e conseqüentemente, um número menor de células marcadas com
Anexina-V.
Em coerência com os resultados aqui apresentados, um outro trabalho
realizado pelo nosso grupo de pesquisa constatou que, os neutrófilos isolados do
sangue periférico de pacientes com AR ativa têm um aumento na expressão basal de
CR1 e frente ao estímulo de imunocomplexos também tem um aumento na produção
de EROs quando comparados aos neutrófilos de indivíduos sadios ou com AR
controlada. Juntos, os resultados obtidos nos dois trabalhos podem inferir que a
população de PMNs de pacientes com AR ativa apresenta um número menor de
neutrófilos expondo FS por possivelmente estarem pré-ativados na circulação.
Discussão
66
Outros experimentos realizados pelo grupo, onde se avaliou a quimiotaxia de
neutrófilos de voluntários saudáveis usando soro coletado dos dois grupos de
pacientes, mostraram também que a atividade quimiotática sobre os neutrófilos foi
maior quando usado o soro de pacientes com Ar ativa.
A ativação e a migração dos neutrófilos para o local de inflamação estão
diretamente relacionadas com doenças inflamatórias, como a artrite reumatóide.
Uma vez no sítio inflamatório estas células colaboram para o aumento e perpetuação
da doença pela sua capacidade de lesar o tecido (NIGGLI, 2003). Dados da
literatura mostram que, em modelos humanos de doença inflamatória, a migração de
neutrófilos é induzida por quimiocinas via receptores CXCRI e CXCR2. Relatos mais
recentes mostram que estas células, via interação com o receptor CCR1 migram em
resposta a MIP-1α e β e, como conseqüência induz a síntese de outros mediadores
quimiotáticos, incluindo outras quimiocinas que agem sinergicamente (RAMOS
et
al
.,2005).
TNF-α e IL-1β, citocinas de papel relevante na artrite reumatóide (HATA
et
al
., 2004) aumentam a síntese de quimiocinas (CC e CXC), dentre elas, IL-8, MIP-1α
e β (CCL3 e 4, respectivamente) e IP-10 (CXCL10). Atualmente tem sido
demonstrado que os neutrófilos são capazes de sintetizar todas essas quimiocinas
(KASAMA, 2005) além de expressar seus respectivos receptores.
O aumento significativo na concentração da IL-8 no soro dos pacientes com
AR ativa em relação aos demais grupos é coerente com os demais resultados obtidos
neste trabalho e em outros trabalhos do grupo, indicando que os neutrófilos de
pacientes com AR em atividade podem estar primados na circulação, o que diminui a
exposição de FS e aumenta a produção de EROs frente a estímulos, posto que
Discussão
67
muitos trabalhos encontrados na literatura descrevem a ação desta citocina nas
respostas de PMNs, como quimiotaxia, desgranulação e aumento na expressão de
moléculas de adesão na superfície celular (IMAIZUMI et al., 1997; BAGGIOLINI, et
al., 1994; DANG et al., 2002.).
As dosagens das concentrações das demais quimiocinas, não mostraram
alterações com relevância estatística quando realizadas as comparações entre os
grupos estudados, porém estão coerentes com os dados da literatura. Os neutrófilos
sintetizam MIP-1 α e β, IP-10 e receptores que interagem com estas quimiocinas.
Porém as células de padrão Th1 são mais responsivas às estas quimiocinas e
também são capazes de sintetizá-las quando ativadas. PETEL et al. em 2001,
demonstraram a migração de mononucleares para a sinóvia reumatóide (padrão de
resposta Th1) obedecendo a um gradiente quimioatraente proporcionado por essas
quimiocinas. Através das dosagens realizadas no soro e no fluido sinovial destes
pacientes o autor concluiu que células de padrão Th1 migraram para a sinóvia e lá
ativadas produziam e liberavam estas quimiocinas para recrutar mais células. Deste
modo, as concentrações destes quimioatraentes estão mais elevadas no fluido
sinovial do que no soro.
ARIEL et al., 2006 demonstraram a relação existente entre quimiocinas e
células apoptóticas. De acordo com o autor, neutrófilos e linfócitos T apoptóticos
expressam CCR5 que é um dos receptores que reconhecem MIP-1α, β e RANTES.
Porém esse receptor expresso em células apoptóticas não é funcional, ou seja, não
provoca sinais intracelulares, tendo como função apenas ligar-se a essas quimiocinas
que são mediadores anti-inflamatórios, afim de seqüestrá-las do meio, diminuindo a
ação pró-inflamatória e colaborando com a resolução da inflamação.
Discussão
68
Altos níveis de IL12p-70 (heterodímero formado pelas sub-unidades p40 e
p35) foram detectados no soro de pacientes com artrite em atividade e esta citocina
na sua forma funcional é fundamental para a polarização de respostas de células T
ao perfil Th1 (MAGRAM, 1996). A IL-12 induz a produção de IFN-γ, citocina pró-
inflamatória que age sobre células mononucleares. No quadro de artrite reumatóide,
esta citocina em excesso promove a diferenciação de linfócitos T em Th1 alto
produtores de INF-γ que ativa mononucleares e estes em resposta a esta ativação
produzem TNF-α, citocina considerada o grande vilão desta patogenia, colaborando
com a cronicidade da inflamação.
Os níveis de aumentados de G-CSF no soro de pacientes com AR podem ser
explicados pela relação existente entre esta citocina e neutrófilos apoptóticos, posto
que a diminuição destas células apoptóticas aumentaria os níveis da citocina e esta,
por sua vez, induziria uma maior produção de neutrófilos pela medula óssea.
Com base nos nossos resultados e na literatura, podemos inferir que os
neutrófilos dos pacientes com a doença em atividade, apresentam aumento em sua
meia-vida. Como conseqüência, diminui a exposição de FS na membrana celular, já
que estas se mantêm funcionais. Sem expor fosfatidilserina os PMNs não são
removidos pelas células fagocíticas. Esta fagocitose inibiria a liberação pelas células
dendríticas, de IL-12 funcional (IL-12p70), já que somente estas células
apresentadoras de antígeno produzem a sub-unidade p40 (OPMANN, 2000; STUART,
et al.
, 2002). Com a continuada produção de IL-12 altos níveis de p40 são
produzidos e estas sub-unidades podem se associar as sub-unidades recentemente
descritas p19, gerando a IL-23 (OPPMANN, 2000; BROMBACHER,
et al
., 2003). A IL-
23, por sua vez, direciona a produção da IL-17, que está relacionada com a
Discussão
69
autoimunidade (AGGARWAL,
et al
, 2003). Além disso, IL-17 é capaz de induzir o
aumento de G-CSF (ZCHWARZENBERGER,
et al
, 2000) citocina direcionada para
diferenciação e proliferação de precursores de neutrófilos na medula óssea (FORLOW
et al
., 2001). Desta feita, ocorre aumento do número de neutrófilos na circulação e
estes podem ser pré-ativados pela IL-8 e recrutados para a sinóvia, contribuindo com
a perpetuação da doença (IMAIZUMI,
et al
., 1997).
Conclusões
Conclusões
71
6 – Conclusões
Este trabalho nos permite fazer as seguintes conclusões:
1) A exposição de fosfatidilserina está alterada em neutrófilos do sangue
periférico de pacientes com artrite reumatóide quando comparada àquela dos
neutrófilos circulantes de indivíduos sadios e tal alteração se mostra dependente do
estágio da doença, estando mais acentuada em pacientes com AR ativa.
2) Resultados semelhantes foram observados em neutrófilos de ratos
Wistar
que desenvolveram artrite pela injeção de CFA e que não receberam nenhum
tratamento.
3) Pacientes com AR ativa apresentam maiores níveis de algumas
quimiocinas no soro, sendo a concentração de IL-8, que é um potente
quimioatraente de neutrófilos, a mais exacerbada. Do mesmo modo, uma tendência
para uma maior produção de G-CSF também foi encontrada no soro destes
pacientes, o que pode acarretar num aumento da produção e da liberação de PMNs
pela medula óssea, perpetuando o estado inflamatório.
4) Pacientes com AR ativa apresentam uma maior produção de IL-12
funcional, indicando que a fagocitose de células apoptóticas está diminuída. Esses
altos níveis de IL-12 funcional podem indicar que há uma produção exacerbada da
sub-unidade p40 pelas células dendríticas, posto que são as únicas fontes desta sub-
unidade. Este fato pode estar relacionado com a síntese de IL-23 e
conseqüentemente da IL-17, que recentemente foi descrita estar envolvida nos
Conclusões
72
processos de autoimunidade, bem como no aumento da produção de novos PMNs
pela medula óssea.
5) Este estudo pode contribuir para um melhor entendimento dos
mecanismos moleculares envolvidos na patogênese da AR e também para o
desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, uma vez que os tratamentos
disponíveis apresentam inúmeras reações adversas para os pacientes.
Referências
Referências
74
7. REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K. ; LICHTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular. 5. ed. c. 11. p.
11: 251-11:254, 2005.
ABE, T. et al. Rheumatoid arthritis and tumor necrosis factor alpha. Autoimmunity,
London, v.34, n.4, p.291-303, 2001.
AGGARWAL, S., et al., Interleukin-23 promotes a distintic CD4 T cell activation state
characterized by the production of interleukin-17. J. Biol. Chem., Baltimore, v. 278,
p. 1910-14, 2003.
ALBANI, S. et al. Positive selection in autoimmunity: abnormal immune responses to
a bacterial DNAJ antigenic determinant in pacients with early rheumatoid arthritis.
Nat. Med., New York, v.1, p.448-52, 1995.
ALLEN, LEE – ANN H. Mechanisms of pathogenesis: evasion of killing by
polymorfhonuclear leukocytes. Microbes and Infection, Paris ; New York , v. 5, p.
1329-35, 2003.
ARNETT, F.C. et al. The American Rheumatism Association, revised criteria for the
classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., New York, v.31, n.3, p.315-
24, 1988.
ARIEL, A. et al., Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during
immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature
Immunol., New York, v.7, p. 1209-16.
ARROYO A, et al.. NADPH oxidase-dependent oxidation and externalization of
phosphatidylserine during apoptosis in Me2SO-differentiated HL-60 cells. Role in
phagocytic clearance.The Journal of biological chemistry, Baltimore, v. 20, p.
277, n. 51, p. 65-75, 2002.
BABIOR BM. Phagocytes and oxidative stress. American journal of medical
genetics, New York, v. 109, n. 1, p. 33-44, 2000.
BAGGIOLINI, M.; DEWALD, B.; MOSER, B. Interleukin-8 and related chemotatic
cytokines: CXC an CC chemokines. Adv Immunol, New York., v.55, p.179-97, 1994
BODMER, J.G. et al. Nomenclature for factors of the HLA system. Tissue
Antigens, Copenhagen, v.19, p.1-18, 1997.
BRENNAN, F.M
. et al
,. Inhinitory effect of TNF -α antibodies on synovial cell
interleukin-1 production in the rheumatoid arthritis. Lancet ,v.2, p. 244-247, 1.989.
Referências
75
BORREGAARD, N., COWNLAND, J. B. Granules of the human neutrophilic
polimorphonuclear leukocyte. BLOOD, New York, v. 89, p. 3503-21, 1.997.
BOWEN, I.D., BOWEN, S.M. Programmed cell death in tumours and tissues. London:
Chapman and Hall, 268p., 1990.
BOWEN, I.D., BOWEN, S.M., JONES, A.H. Mitosis and Apopotosis: matters of life and
death. London: Chapman and Hall, 1998.
BROMBACHER, F.; KASTELEIN, R.A.; ALBER, G. Novel IL-12 family members shed
light on the orchestration of Th1 responses. Trends Immunol., Oxford, v. 24, p.
207-12, 2003.
BROWN, D.G., SUN, X.M., COHEN, G.M. Dexamethasone-induced apoptosis
involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation.
J. Biochem. Chem., Baltimore, v.268, p.3037-3039, 1993.
BUDIHARDJO, I., et al. Biochemical pathways of caspase activation during
apoptosis. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., Palo Alto, v.15, p.269-90, 1999.
BYME, A. & REEN, D.J. LPS induces rapid production of IL-10 by monocytes in the
presence of apoptotic neutrophils. J. Immnol, Baltimore, v. 168, p. 1968-77, 2002.
CHATHAM, W.W., et al., Degradation of human articular cartilage by neutrophils in
synovial fluid. Arthritis Rheum., New York, v. 36, n. 1, p.51-8, 1993.
DANG, P.M.; CROSS, A.R.; QUINN, M.T.; BABIOR, B.M. Assembly of the neutrophil
respiratory burst oxidase: a direct interaction between p67PHOX and cytochrome
b558 II. Proc Natl Acad Sci U S A, Washington, v. 2, p.97, v. 7, p.4262-5, 2002.
DIAS-BARUFFI, M. et al.. Dimeric galectin-1 induces surface exposure of
phosphatidylserine and phagocytic recognition of leukocytes without inducing
apoptosis. The Journal of Biological Chemestry, Baltimore, v. 278, 41282-93,
2003.
DINARELLO, C.A.; MOLDAWER, L.L. Proinflammatory and Anti-inflammatory
Cytokines in Rheumatoid Arthritis. 2 ed., Amgen, 2000. 85 p.
EBRINGER, A et al. Rheumatoid arthritis and
Proteus
: a possible aetiological
association. Rheum. Int., New York, v.9, p.223-28, 1989.
ELGHETANY MT. Surface antigen changes during normal neutrophilic development: a
critical review. Blood Cells Mol Dis, Orlando, v. 28, p. 260-74, 2002.
Referências
76
Fava R. A; Gates C.; Townes A. S. Critical role of peripheral blood phagocytes and
the involvement of complement in tumour necrosis factor enhancement of passive
collagen-arthritis. Clin Exp Immunol.,Oxford, v. 94 (2), p. 261-6, 1993.
FADEEL, B. et al. Involvement of caspases in neutrophil apoptosis: regulation by
reactive oxygen species. Animal blood groups and biochemical genetics, New
York, v. 92, p. 4808–18, 1998.
FELDMANN, M. et al. Rheumatoid arthritis. Cell, Cambridge, v.85, n.3, p.307-10,
1996, (b)
FIRESTIEN, G. S., & ZVAIFLER, N.J. How importance are T-cells in chronic
rheumatoid synovitis? Arthritis and Rheumatism, New York, v.33, p.768-73, 1990
FORLOW, S. B. et al., Increase granulopoiesis through interleukin-17 and G-CSF in
leukocyte adhesion molecule-deficient mice. Blood, New York, v. 98, p. 3309-14,
2001.
GOLDRING, S.R.. Pathogenesis of bone and cartilage destruction in rheumatoid
arthritis. Rheumatology, Oxford, v. 42 Suppl 2, p. ii 1-6, 2003.
HAJEER, A. H. et al. Influence of previous exposure to human parvovirus B19 in
explaining susceptibility to rheumatoid arthritis: an analysis of disease discordant
twin pairs. Ann. Rheum. Dis., London, v.53, p.137-39, 1994.
HENDEY, B.; ZHU, C. L.; GREENSTEIN, S. Faz activation opposes PMA-stimulated
changes in the localization of PKC: a mechanism for reducing neutrophil adhesion to
endothelial cells. J. Of Leukoc Biol, New York, v. 71, p. 863-70, 2002.
HOMBURG, C. H., et al. Human neutrophils lose their surface FCgRIII and acquire
annexin V binding sites during apoptosis in vitro. Blood
,
New York, v. 85, p. 532-
540, 1995.
HODGE, G. L.; FLOWER, R.; HAN, P. Optimal storage conditions for preserving
granulocyte viability as monitored by annexin V binding in whole blood. Journal of
Immunological Methods, Amsterdam, v. 255, p. 27-38, 1999.
HSU, H., et al. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and
NF-κB activation. Cell, Cambridge, v.81, p.495-504, 1995.
IAMAIZUMI, A. T. et al., Human endotelial cells synthesize ENA-78: relashionship to
IL-8 and to signaling of PMN adhesion. Am J Respir Cell Mol Biol, New York v. 17,
p. 181-92, 1997.
ISOMAKI, P. et al. Pro- and anti-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis. Ann.
Med., Stockholm, v.29, p.499-507, 1997.
Referências
77
JACOBSON, M.D. Programmed cell death: a missing link is found. Trends in Cell
Biology, Cambridge, v.7, p.467-9, 1997.
JANEWAY, C. A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M.; SHLOMCHIK, M. Imunobiologia: o
sistema imune na saúde e na doença. 5. ed. c.2. p. 8:91-8:93, 2003.
JASIN, H. E..
Arthritis and Allied Conditions. Lippincott Williams & Wilkins 2001,
1132 p.
JASIN, H. E. Mechanisms of Disruption of the Articular Cartilage Surface in
Inflamation. J. Clin. Invest., New Haven, v. 87, p. 1531-36, 1991.
JOOSTEN, L. A. B.; Helsen, M. M. A., et al. IL-1ab Blockade Prevents Cartilage and
Bone Destruction in Murine Type II Collagen-Induced Arthritis, Whereas TNF-α
Blockade Only Ameliorates Joint Inflammation. J. Immunol., Baltimore, v. 163, p.
5049–55, 1999.
JOOSTEN LAB, LUBBERTS E, HELSEN MMA, et al. Protection against cartilage and
bone destruction by systemic interleukin-4 treatment in established murine type II
collagen-induced arthritis. [peer-reviewed primary
research].http://arthritisresearch.com/26oct99/ar0101p03
KARMAKAR, S.; CUMMINGS, R. D.; McEVER, P. R. Contributionsof Ca
2+
to galectin-1-
induced exposure of phosphatidylserine on activated neutrophils. The Journal of
Biological Chemestry, Baltimore, v. 280. n. 31, p. 28623-31, 2005.
KASSAMA, T et al. Neutrophil-derive cytokines: potencial therapeutic targets in
inflammation. Curr Drug Targets Inflammation Allergy, San Francisco, v. 4, p.
273-279, 2005.
KIN, S.; ELKON, K. B.; Ma, X. Transcriptional supression of interleukinin-12 gene
expression following phagocytosis of apoptotic cells. Immunity,Cambridge, v.21, p.
643-53, 2004.
KING, K.L., SQUIER, M.K.T., SELLINS, K.S. Cell death comes to life in purgatory: a
Keystone meeting on apoptosis. Trends in Cell Biology, Cambridge, v.5, p. 287-91,
1995.
KLEBANOFF, S.J. Myeloperoxidase: friend and foe. J. Leukoc. Biol, New York, v.
77, p. 598-625, 2005.
KOOPMAN G., et al. Annexin V for flow cytometic detection of phosphatidylserine
expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, New York, v. 84, p. 1415-
1420,1994.
KRAMMER, P.H. CD95’s deadly mission in the immune system. Nature, London,
v.407, p.789-95, 2000.
Referências
78
KOTAKE, S., K. SATO, et al., Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the
synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteclast-like cell
formation. J. Bone Miner Res., New York, v. 11, p. 88, 1996.
LEE, W.D., et al. Tilmicosin-induced bovine neutrophil apoptosis is cell-specific and
downregulates spontaneous LIB4 synthesis without increasing Fas expression. Vet.
Res., Paris, v.35, n.2, p.213-24, 2004.
LEIST, M. and Jäättelä, M. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative
mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol., New York, v. 2, p. 589-98, 2001.
Li, H., et al. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the
Fas pathway of apoptosis. Cell, Cambridge, v.94, n.4, p.491-501, 1998.
LIU FT., Regulatory roles of galectins in the immune response. Allergy
Immunology, v. 136, p. 385-400, 2004.
LOFGREN, R. et al.. CR3, FcgammaRIIA and FcgammaRIIIB induce activation of the
respiratory burst in human neutrophils: the role of intracellular Ca(2+),
phospholipase D and tyrosine phosphorylation. Biochim Biophys Acta, Amsterdam.
v. 13, p. 1452, n. 1, p .46-59, 1999.
LORENZ, H-M, HERRMANN, M., WINKLER, T., GAIPL, U. Role of apoptosis in
autoimmunity. Apoptosis, Boston, v. 5, n. 5, p. 443-49, 2000.
LOO, D.T., RILLEMA, J.R., Measurement of cell death. Methods Cell Biol., New
York, v. 57, p. 251-64, 1998.
Lopes Vaz, A., Artrite Reumatóide, Lidel, 2000.
LUSTER, A. D., ALON, R. & von ADRIAN, U. H. Immunce cell migration in
inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol., New York, v.
6, p. 1182-1190, 2005.
MAGNUSSON, C., VAUX, D.L. Signalling by CD95 and TNF receptors: not only life
and death. Immunol. Cell. Biol
.,
Adelaide, v.77, n.1, p.41-46, 1999.
MAGRAM, J. et al. IL-12-deficient mice are defective in IFN gamma production and
type 1 cytokine responses. Immunity, Cambridge, v. 4, p. 471-81, 1996.
MANJO, G; JORIS, I., Apoptosis, oncosis and necrosis. An overview of the cell death.
Am. J. Pathol., Bethesda , v. 146, p. 3-15, 1995.
McGEEHAN, G. M., et al. Regulation of tumor necrosis factor: a processing by a
metalloproteinase inhibitor. Nature, London, v. 370, p. 558-561, 1994.
Referências
79
McNAMEE, J. P. et al.. Effect of pro-inflammatory cytokines on spontaneous
apoptosis in leucocyte sub-sets within a whole blood culture. Cytokine, San Diego,
v. 31, p. 161-67, 2005.
MELLEY, D. D.; EVANS, T. W.; QUINLAN, G. J. Redox regulation of neutrphils
apoptosis and the systemic inflammatory response syndrome. Clinical Science,
London, v. 108, p. 413-24, 2005.
MOLLINEDO, F.; BORREGAARD, N. ; BOXER, L.A. Novel trends in neutrophil
structure, function and development. Trends Immunology today, Oxford , v. 20,
n. 12, p. 535- 37, 1999.
NEPOM, G. T.; NEPOM, B. S. (Ed.). The major histocompatibility complex. St.
Louis: Mosby, c. 12., p.12:1-12:12, 1994.
NICOLETTI, I., et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis
by propidium iodide staining and flow cytometry. J. Immunol. Methods
,
Amsterdan, v.139, p.271-279, 1991.
NIGGLI, V. Signaling to migation in neutrophils: importance of localized parthways.
Inst J Biochem, Oxford, v.35, p.1619-38, 2003.
OHTSU, S. et al. Enhanced neutrophilic granulopoiesis in rheumatoid arthritis.
Involvement of neutrophils in disease progression. Journal Rheumatology,
Toronto, v.27, n.6, p.1341-51, 2000.
OPPENHEIM, J. J. et al. Properties of the novel proinflammatory supergene
“intercine” cytokine family. Ann. Rev. Immunol., Palo Alto, v.9, p.617-48, 1991.
OPPMANN, B. et al., Novel p19 protein engages IL-12p40 to form cytokine, IL-23,
with biological activities similar as well as distinct from IL-12, Immunity, Cambridge,
v.13, p. 715-25, 2000.
OTTONELLO, L. et al. Synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis inhibits
neutrophil apoptosis: role of adenosine and proinflammatory cytokines.
Rheumatology, Oxford, v. 41, n.11, p.1249-60, 2002.
PALEOLOG, E.. The therapeutic potential of TNF-alpha blockade in rheumatoid
arthritis. Expert Opin. Investig. Drugs, London, v. 12(7), p 1087-1095, 2003.
PATEL, D. D., ZACHARIAH, P. J., WHICHARD. CXCR3 and CXR5 ligands in
Rheumatoid Arthritis synovium. Clinical Imunnology, Karger, v. 98, n.8, p. 39-45,
2001.
Panayi, G. S. T cell-dependent pathways in rheumatoid arthritis. Curr Opin
Rheumatol, Philadelphia, v.9, n. 3, p.236-40, 1997.
Referências
80
POBER, J. S. et al. Cytokines and endotelial cell biology. Physiol. Rev., Washington,
v.70, p.427-52, 1990.
QUIN, S., ROTTMAN, J. B. et al. The chemokine receptors CXCR3 and CCR5 mark
subsets of T cells associated with certain inflammatory reactions. J. Clin. Invest.,
Ann Arbor, v. 101, p. 746-54, 1998.
RAMOS, C. D. L. et al.. MIP-1α[CCL3] acting on the CCR1 receptor mediates
neutrophil migration in immune inflammation via sequential release of TNF-α and
LTB4. Journal of Leukocyte Biology, New York, v. 78, p. 167-77, 2005.
RAVEL, R. Laboratório clínico: aplicações clínicas dos dados laboratoriais.
Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. cap.23, p.323-342, 6ªedição, 1997
RICEVUTI, G. Host tissue damage by phagocytes. Ann N Y Acad Sci., New York, v.
15, p.426-48, 1997.
REVEILLE, J. D.. The genetic contribution to the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
Curr. Opin. Rheumatol., Philadelphia, v.10, p. 187-200, 1998.
SAIKUMAR, P., et al. Apoptosis: definition, mechanisms, and relevance to disease.
Am. J. Med., New York, v.107, n.5, p.489-506, 1999.
SALVESEN, G.S. Caspase 8: Igniting the death machine. Structure. Fold. Des.,
London, v.7, p.R225-R229, 1999.
SALVESEN, G. S.. Caspases and apoptosis. Essays Biochem., London, v. 38, p.
9-19, 2002.
SARASTE, A.; PULKKI, K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis.
Cardiovasc Res., London, v. 3 p. 528-37, 2000.
SARTORIUS, U. et al. Molecular mechanisms of death-receptor-mediated apoptosis.
Chembiochem., Weinheim, v. 1, p. 20-9, 2001.
SAVILL, J. Apoptosis in resolution of inflammation. J. Leukocyte Biology, New
York, v. 61, p. 375-80, 1997.
SCAFFIDI, C., et al. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. EMBO J., Oxford,
v. 17, p. 1675-1687, 1998.
SCHWARTZMAN, R. A., CIDLOWSKI, J.A., Apoptosis: the biochemistry and molecular
biology of programmed cell death. Endocr Rev.,Baltimore, v.14, n. 2, p. 133-51.
1993.
Referências
81
SELDIN, M. F. et al. The genetics revolution and the assault on rheumatoid arthritis.
Arthritis Rheum., New York, v.42, p.1071-1079, 1999.
SILMAN, A. J. et al. Twin concordance rates for rheumatoid arthritis: results from a
nationwide study. Br. J. Rheum., London, v.32, p.903-07, 1993.
SILVERMAN, S. L. et al. Antibodies to Epstein-Barr viral antigens in early rheumatoid
arthritis. Arthritis Rheum., New York, v.24, p.1465-68, 1981.
SIMON, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation.
Immunol Rev., London, v. 193, p. 101-10, 2003.
STARK, A. MATTHEW
et al
., Phagocytosis of apoptotic neutrophils regulates
granulopoiesis via IL-23 and IL-17. Immunity, Cambridge, v. 22, p. 285-94, 2005.
STRIETER, R. M., BELPERIO, J. A., PHILLIPS, R. J. & KEANE, M. P.. CXC chemokines
in angiosenisis of cancer. Semin. Cancer Biol. v.14, p. 195-200, 2004.
STUART, L.M., et al., Inhibitory effects of apoptotic cells ingestion upon endotoxin-
driven myeloid dendritic cell maturation, J. Immunol., Baltimore, v. 168, p. 1627-
35, 2002.
SUZUKI, N. NAKAJIMA, A. et al. Selective acummulation of CCR5+ T linphocytes into
inflammed joints of rheumatoid artritis. Int. Immunol., Oxford, v. 11, p. 553-59,
1999.
SWEENEY, E. S. et al. Rheumatoid arthritis: regulation of synovial inflammation. Int.
J. Biochem. Cell Biol., Exeter, v.36, p.372-78, 2004.
TANAKA, M., et al. Fas ligand in human serum. Nat. Med., New York, v. 2, p. 317-
22, 1996.
UDALOVA, I. A. et al. Highly informative typing of the human TNF locus using six
adjacent polymorphic markers. Genomics, San Diego, v.16, p.180-6, 1993.
van den BERG, J. M., et al. Divergent effects of tumor necrosis factor α on apoptosis
of human neutrophils. Journal of Leukocyte Biology, New York, v. 69, p. 467-73,
2001.
VAN EEDEN S.F.; KLUT M. E. ; WALKER B.A.; HOGG J.C. The use of flow cytometry
to measure neutrophil function. J Immunol Methods, Amsterdam, v.17, p. 23-43,
1999.
VanENGELAND, M., et al. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis
detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry, New York,
v.31,p.1-9, 1998.
VanENGELAND, M., et al. Plasma membrane alterations and cytoskeletal changes
Referências
82
in apoptosis
.
Exp. Cell. Res
.,
New York, v. 235, p. 421-430, 1997.
VAUX, D., L., STRASSER, A,. The molecular biology of apoptosis. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA
,
Washington, v 93, p.2239-2244, 1996.
VINASCO, J. et al. Polymorphism at the TNF loci in. Tissue Antigens, Copenhagen,
v.49, p.74-8, 1997.
WAHL, S. M. et al., TGF-β: the perpetrator of immune supresion by regulatory T cells
and suicidal T cells. J. Leukoc. Biol., New York, v. 76, p. 15-24, 2004.
WEISS, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med., Boston, v.320,
p.365-76, 1989.
WIPKE, B. T. et al. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of
murine model of rheumatoid arthritis. Journal of Immunology, Baltimore, v.167,
n.3, p.1601-8, 2001.
WILEY, S. R., et al. Identification and characterization of a new member of the TNF
family that induces apoptosis. Immunity
,
Massachusetts, v.3, p.673-682, 1995.
WILLIAMS, G.T., et al. A. Apoptosis: final control point in cell biology. Trends in
Cell Biology, Cambridge, v.2, p. 263-7, 1992.
WILLIAMS, M. A. et al.. Interleukin 8 dimerization as a mechanism for regulation of
neutrophil adherence-dependent oxidant production.. Shock, Augusta, v. 23, n.4, p.
371-76, 2005.
WILLINGHAM, M.C. Cytochemical methods for the detection of apoptosis. J.
Histochem. Cytochem.,
Baltimore, v.47, n.9, p.1101-1109, 1999.
WOOLEY, P. H., J. D. WHALEN et al. The effect of interleukin-1 receptor antagonist
protein on collagen-induced and antigen-induced arthritis in mice. Arthritis
Rheum., New York, v. 36, p. 1305, 1996.
ZCHWARZENBERGER, P., et al., Requirement of interleukin 17 receptor signaling for
lung CXC chemokine and granulocyte colony-stimulating factor expression, neutrophil
recruitment, and host defense. J Exp Med. v. 20, p.519-27, 2001
83
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