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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DÉBORA COMIN
AVALIAÇÃO DA ADMINISTRAÇÃO CRÔNICA DE
VITAMINA E SOBRE NEURÔNIOS PRODUTORES DE
ÓXIDO NÍTRICO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
DE RATOS DIABÉTICOS
MARINGÁ
2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DÉBORA COMIN
AVALIAÇÃO DA ADMINISTRAÇÃO CRÔNICA DE VITAMINA E
SOBRE NEURÔNIOS PRODUTORES DE ÓXIDO NÍTRICO NO
SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE RATOS DIABÉTICOS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
(área de concentração: Produtos naturais e
sintéticos biologicamente ativos), da
Universidade Estadual de Maringá, como
requisito à obtenção do título de mestre.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Rúbia Maria
Monteiro Weffort de Oliveira
MARINGÁ
2008
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SUMÁRIO
1. Introdução
13
2. Objetivo 22
3. Materiais e métodos 23
3.1Animais 23
3.2Tratamento 24
3.3 Avaliação comportamental 24
3.4Coleta e processamento do material 25
3.4.1Perfusão 25
3.4.2Histoquímica para NADPH-diaforase 25
3.4.3Imunohistoquímica para nNOS 26
3.4.4 Análise quantitativa de neurônios produtores de Óxido Nítrico 18
3.4.5 Análise morfométrica de neurônios produtores de Óxido Nítrico 20
4. Análise estatística 30
5. Resultados 31
5.1 O labirinto em Cruz elevado 31
5. 2 Análise quantitativa de neurônios NADPH-diaforase positivos 32
5. 3 Análise morfométrica de neurônios NADPH-diaforase positivos 32
6. Discussão 40
Referências 46
Anexo: Artigo 48
“Posso todas as coisas em Cristo que me fortalece.”
Filipenses 4:13
Agradeço a Deus, e a essa força misteriosa,
que possibilita a perseverança nos
momentos difíceis e pela vitória no final da caminhada.
“...Se um dia, já homem feito e respeitado sentires que a terra cede a teus pés, que
tuas obras se desmoronam, que não há ninguém a tua volta para te estender a mão
esquece a tua maturidade , passa pela tua mocidade, volta à tua infância e balbucia,
entre lágrimas e esperanças, as últimas palavras que restarão na alma: meu pai,
minha mãe...” (Rui Barbosa)
Aos meus pais, por toda a dedicação e compreensão
em todos esses anos. Agradeço pela confiança depositada e
por todo apoio mesmo pela distancia nunca foi negado.
“A arte de interrogar não é tão fácil como se pensa. É mais uma arte de mestres do
que de discípulos; é preciso ter aprendido muitas coisas para saber perguntar o que
não se sabe.” (Jean Jacques Rousseau)
A minha querida orientadora, Profª Drª Rúbia Maria Weffort de Oliveira,
pela dedicação, carinho, amizade, por compreender minhas limitações e por me
ensinar que o caminho certo é a rota mais rápida. Agradeço por me mostrar um
mundo apaixonante, e de como conseguir satisfação naquilo que se faz. Agradeço
por ter confiado em mim e me proporcionado a melhor experiência da minha vida.
“Não precisa ser homem, basta ser humano, basta ter sentimentos, basta ter
coração. Precisa saber falar e calar, sobretudo saber ouvir. Tem que gostar de
poesia, de madrugada, de pássaro, de sol, da lua, do canto, dos ventos e das
canções da brisa...
Deve amar o próximo e respeitar a dor que os passantes levam consigo. Deve
guardar segredo sem se sacrificar...
Procura-se um amigo para gostar dos mesmos gostos, que se comova, quando
chamado de amigo. Que saiba conversar de coisas simples, de orvalhos, de grandes
chuvas e das recordações de infância. Precisa-se de um amigo para não se
enlouquecer, para contar o que se viu de belo e triste durante o dia, dos anseios e
das realizações, dos sonhos e da realidade. Deve gostar de ruas desertas, de poças
de água e de caminhos molhados, de beira de estrada, de mato depois da chuva, de
se deitar no capim...
Precisa-se de um amigo que diga que vale a pena viver, não porque a vida é bela,
mas porque já se tem um amigo. Precisa-se de um amigo para se parar de chorar.
Para não se viver debruçado no passado em busca de memórias perdidas. Que nos
bata nos ombros sorrindo ou chorando, mas que nos chame de amigo, para ter-se a
consciência de que ainda se vive.” (Vinícius de Morais)
Ao meu amigo, Fábio, pelo incentivo, apoio, carinho,
amizade, e por me provar que sonhos se realizam.
“...Seja o que você quer ser,
porque você possui apenas uma vida e nela só se tem uma chance
de fazer aquilo que quer.
Tenha felicidade bastante para fazê-la doce.
Dificuldades para fazê-la forte.
Tristeza para fazê-la humana.
E esperança suficiente para fazê-la feliz.
As pessoas mais felizes não têm as melhores coisas.
Elas sabem fazer o melhor das oportunidades que aparecem em seus caminhos.
A felicidade aparece para aqueles que choram.
Para aqueles que se machucam.
Para aqueles que buscam e tentam sempre.
...e para aqueles que reconhecem a importância das pessoas que passam por suas
vidas...” (Clarisse Lispector)
.
Agradeço as minhas amigas,
Aline, Bruna e Francieli, que sempre estiveram ao meu lado
e me ensinaram que amizade verdadeira nem o tempo destrói.
“Se eu pudesse deixar algum presente a você, deixaria aceso o sentimento de
amor à vida dos seres humanos. A consciência de aprender tudo o que nos foi
ensinado pelo tempo afora. Lembraria os erros que foram cometidos como sinais
para que não mais se repetissem. A capacidade de escolher novos rumos.
Deixaria para você, se pudesse o respeito aquilo que é indispensável: Além do
trabalho, a ação. E quando tudo mais faltasse, um segredo:
“O de buscar no interior de si mesmo a resposta para encontrar a saída”.
(Mahatma Ghandi)
Agradecimentos
A Universidade Estadual de Maringá, pela oportunidade e espaço para a
concretização de mais um sonho.
Ao Prof° Dr° Humberto Milani, pelos ensinamentos e conhecimentos passados,
pelas explicações cedidas, compreensão nas dificuldades, e em especial pelo
carinho e companheirismo.
Aos amigos Lucas e Claudia, por me ajudarem na realização dos experimentos e
pela amizade e afinidade que descobrimos durante esta etapa.
Aos amigos e amigas de laboratório pelos bons momentos que passamos juntas e
pelo ótimo convívio durante este tempo. Angélica, Cássia, Carla, Juliana, Marco
Aurélio, Rogério.
Agradeço em especial ao amigo Ailton por me ensinar o funcionamento do
laboratório. E pela a amizade cedida neste tempo.
A Solidalva e ao Carlos Eduardo por toda a atenção, carinho, amizade e apoio
durante a realização dos experimentos.
Ao técnico, Marcos por toda ajuda e explicações necessárias para o
desenvolvimento da pesquisa.
A Profª Drª Jacqueline Nelises Zanoni, pela paciência e carinho cedido nas
explicações sobre este trabalho. E por fazer parte da banca de qualificação,
esclarecendo e melhorando a parte escrita do nosso trabalho.
A Profª Drª Marli Aparecida dos Santos Pereira, por aceitar participar da banca de
qualificação e defesa desta dissertação, contribuindo para o melhoramento deste
trabalho.
Ao Prof° Dr° Roberto Barbosa Bazotte, por ceder seu laboratório para parte dos
experimentos e por aceitar compor a banca da defesa, enriquecendo nosso trabalho
com suas gentis sugestões.
As secretárias, Helena e Erica, por toda atenção disponibilizada, pelo carinho
cedido, e amizade concretizada.
A amiga Ana Paula, que me acompanha por longa data de estudos. Agradeço pela
amizade sincera e por sua presença na minha vida.
Ao amigo Antônio, por estar todos esses anos ao meu lado me doando com infinita
bondade sua amizade, e me apoiando em todas minhas decisões.
As amizades feitas durante o mestrado, Renata e Silmara.
As amigas, Daniela e Claudiana, pelo apoio nos momentos difíceis em que me
deparei.
Ao meu irmão, pelos esforços cedidos durante esta etapa da minha vida
A minha prima Gracieli, por estar comigo me apoiando em todos os
momentos.
E todos que participaram direta ou indiretamente para a conclusão deste trabalho.
Resumo
O diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica caracterizada por
hiperglicemia resultante de um déficit na secreção e/ou ação da insulina, que está
associada com alteração, disfunção e/ou falência de vários órgãos, como coração,
olhos, rins e sistema nervoso central (SNC). Uma das complicações crônicas do
diabetes é a encefalopatia diabética que pode ser associada com alterações
estruturais do cérebro e déficits de aprendizagem e memória. Muitas evidências
mostram que o estresse oxidativo desempenha papel importante na encefalopatia
diabética. O óxido nítrico (NO) é reconhecido como uma substância transmissora
atípica do SNC, podendo desempenhar funções fisiológicas e/ou toxicológicas.
Durante o envelhecimento ou condições patológicas, tais como doenças
neurodegenerativas e injúria cerebral, ocorre um aumento nos níveis de NO, o que
resulta em efeitos deletérios na função neuronial. O NO é formado pela oxidação do
grupo guanidina da L-arginina por ação de enzimas denominadas sintases do óxido
nítrico (NOS). Em animais diabéticos, alterações na expressão da sintase do óxido
nítrico neuronal, ou nNOS, são descritas em várias estruturas cerebrais como,
núcleo paraventricular do hipotálamo (PVH), núcleo supra-óptico (SON) e substância
cinzenta periaquedutal dorsolateral (DLPAG). No hipocampo ou formação
hipocampal, déficits de aprendizagem estão correlacionados com uma expressão
diminuída da nNOS. Estudos em ratos diabéticos demonstram que o tratamento com
antioxidantes, como a vitamina E, pode melhorar parâmetros bioquímicos e prevenir
o desenvolvimento da encefalopatia diabética, através da proteção contra os efeitos
diretos e/ou indiretos da ação dos radicais livres sobre os neurônios. O objetivo
deste trabalho foi investigar o efeito do tratamento crônico com vitamina E sobre os
neurônios produtores de NO do SNC de ratos diabéticos. Utilizamos a histoquímica
para a NADPH-diaforase, para avaliar o número e a área de neurônios produtores de
NO nas seguintes estruturas cerebrais: estriado, PVH, SON e DLPAG. O teste do
labirinto em cruz elevado (LCE) Trial ½ foi utilizado para a avaliação da ansiedade e
memória. Cinqüenta ratos Wistar machos de 90 dias foram divididos nos grupos:
normoglicêmicos (N), normoglicêmicos tratados com vitamina E (NVE), diabéticos
tratados com veículo (DV), e diabético tratado com vitamina E (DVE). O DM foi
induzido nos animais dos grupos DV e DVE através da injeção endovenosa de
estreptozootocina (35 mg/Kg). Os animais receberam tratamento oral por gavagem
de veículo ou vitamina E 100 mg/Kg durante 7 semanas. Após esse período os
animais foram sacrificados e os cérebros foram retirados e submetidos às técnicas
de imunohistoquímica para detecção da nNOS e de histoquímica para NADPH-
diaforase, técnica esta que permite identificar neurônios produtores de NO em
tecidos fixados com formaldeído. A glicemia dos animais foi medida no início e ao
fim do experimento, e somente animais com glicemia superior a 500 mg/dl foram
considerados diabéticos. Animais do grupo NVE apresentaram ganho de peso na
sétima semana de tratamento com vitamina E. Animais diabéticos submetidos ao
LCE Trial 1/ 2 apresentaram significativa redução da atividade locomotora.e prejuízo
no desempenho cognitivo, sendo o último parâmetro melhorado com o tratamento
com vitamina E. A análise quantitativa dos neurônios NADPH-diaforase positivos
revelou um significativo aumento no número de neurônios no estriado e DLPAG de
ratos diabéticos. Já a análise morfométrica revelou um aumento na área do soma
neuronial de ratos diabéticos em todas as estruturas analisadas: estriado, PVH, SON
e DLPAG. O tratamento com vitamina E reverteu o aumento das áreas neuroniais
apenas no PVH e SON. É possível que as alterações celulares observadas no
presente experimento possam contribuir para déficits na atividade locomotora e na
cognição de ratos diabéticos.
Palavras-chave: óxido nítrico, diabetes, vitamina E, sistema nervoso central,
memória.
1. Introdução
O diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica caracterizada por
hiperglicemia, resultante de um déficit na secreção e/ou ação da insulina, e está
associada com alteração, disfunção e falência de vários órgãos, especialmente dos
rins, nervos, coração e vasos sanguíneos (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION,
1997).
O diabetes pode apresentar-se de duas formas: i) diabetes tipo 1, onde ocorre
uma deficiência absoluta na secreção de insulina e, ii) diabetes tipo 2, a forma mais
comum, onde ocorre uma combinação da resistência à ação da insulina e uma
inadequada reposta secretora de insulina (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION,
1997).
O DM é um importante problema de saúde pública que, devido à sua elevada
prevalência nos últimos anos vem sendo considerado como uma epidemia mundial.
Atinge não só países subdesenvolvidos, mas também Estados Unidos e Inglaterra,
além de países emergentes (MAINOUS III et al., 2006). Estimativas indicam que em
2010, cerca de 23 milhões de indivíduos do mundo todo terão diabetes tipo I e 216
milhões terão diabetes do tipo II (McCARTY & ZIMMET, 1994) Fatores de risco
como obesidade e sedentarismo têm aumentado na população e contribuído para o
aumento da incidência da doença (MAINOUS III et al., 2006). O DM esta relacionado
com morbidade, além de incapacitações e encurtamento da vida útil, mortalidade
prematura e altos custos para o paciente, incluindo custos psicológicos,profissionais,
sociais, familiares e financeiros.
Ambos os tipos de diabetes levam, à longo prazo, a ocorrência de
complicações graves tais como microangiopatia, retinopatia, nefropatia e neuropatia.
A maior parte das evidências experimentais e clínicas disponíveis, sugere que as
complicações do diabetes sejam decorrentes de distúrbios metabólicos,
principalmente da hiperglicemia (COTRAN et al., 1996; BERNSTEIN et al., 2002).
A encefalopatia diabética é reconhecida como uma complicação tardia do
diabetes tipo I e tipo II. Pacientes diabéticos apresentam moderados prejuízos de
cognição principalmente aqueles envolvidos com a memória verbal, processamento
de informações, nível de atenção, tempo de reação motora e memória de curta
duração. De forma complementar, estudos neuroradiológicos também demonstram
que o diabetes altera a visão, o sistema auditivo e somatosensorial, levando à
hipótese de que esta injúria causa distúrbios na condução do Sistema Nervoso
Central (SNC). Ainda, déficits de aprendizagem, memória e na resolução de
problemas são mais comuns em pacientes diabéticos do que na população geral
(SCHOENLE et al., 2002), e notavelmente, a doença de Alzheimer é duas vezes
mais prevalente na população diabética (OLT et al., 1999).
A patogênese do diabetes pode ser dividida em três componentes: (1) efeitos
neurotóxicos diretos causados pela hiperglicemia como: aumento da via do poliol,
acúmulo de sorbitol, aumento do estresse oxidativo, glicação de proteínas e
distúrbios de cálcio com conseqüente perturbação da homeostase; (2) alterações
vasculares como: angiopatia, redução no fluxo sanguíneo cerebral e prejuízo da
atividade vascular e, (3) alterações neurotróficas e neuromodulatórias como:
alterações tanto com a insulina quanto com seus receptores no cérebro (GISPEN &
BIESSELS, 2000).
Do ponto de vista experimental, ratos com diabetes do tipo I (BB/Wor rat),
apresentam déficits de memória quando expostos ao labirinto radial de oito braços
(MORRIS, 1984), e este efeito está associado com uma diminuição na secreção de
insulina e apoptose neuronal no hipocampo e córtex frontal destes animais (LI et al.,
2002). No entanto, outros estudos em roedores têm apresentado diferentes
resultados, possivelmente por causa de diferenças nos modelos animais
empregados e na duração do diabetes. Um fator chave parece ser a natureza do
estímulo usado nos diferentes paradigmas comportamentais. Existem indicações
claras que estímulos estressantes, os quais normalmente fazem parte dos
paradigmas de aprendizado, resultam em boas respostas em ratos diabéticos
(ROWLAND et al., 1989). Um aumento no comportamento de esquiva passiva em
ratos diabéticos (BELLUSH et al., 1989) tem sido referido como uma sensibilidade
aumentada ao choque nas patas, por exemplo, assim embora ratos diabéticos
aprendam tarefas de natureza mais simples, seus desempenhos em tarefas mais
complexas, como por exemplo, a esquiva ativa ou o labirinto em T elevado (LTE), é
claramente prejudicado (FLOOD, 1990).
1.1 Estreptozootocina e diabetes
Por muitas décadas, toxinas específicas para célula pancreáticas, têm sido
utilizadas para promover modelos animais de diabetes, apesar de uma incompleta
compreensão de como realmente causam a morte das células. A indução
experimental de diabetes em ratos utilizando agentes químicos destrói as células
β
pancreáticas. Um agente diabétogênico muito utilizado é a estreptozootocina (STZ)
(KONRAD, 2001).
A STZ (2-deoxi-2-(3-(metil-3-nitrosoureido)-D-glicopiranose), é um antibiótico
sintetizado através do fungo Streptomycetes achromogenes. Este agente apresenta
atividade carcinogênica e antitumoral e também pode ser utilizado para a indução do
diabetes mellitus do tipo I e II em roedores (KRÖNCHE, 1995).
Em modelos animais, a STZ pode ser administrada por via intraperitoneal ou
por via endovenosa. As doses são flexíveis, podendo-se utilizar dose única ou
múltiplas doses, dependendo do tipo de via escolhida para indução do diabetes
(SZKUDELSKI, 2001).
A administração de STZ causa hiperglicemia com significativo aumento da
osmolaridade sanguínea, hipoinsulimenia, hiperfagia e polidipsia. Em adição, a
deficiência de insulina causa alterações na transmissão hipotalâmica e na expressão
gênica de neuropepítideos. Alterações nas monoaminas, como dopamina e
serotonina e neuropepitideos, como vasopressina e ocitocina, no hipotálamo podem
ter papel fundamental no comportamento e anormalidades hormonais e metabólicos
observados em ratos diabéticos (SERINO, 1998; ROWLAND, 1989).
1.2 O estresse oxidativo e o diabetes
Muitas evidências mostram que o estresse oxidativo desempenha papel
importante na etiologia e patogênese das complicações crônicas do diabetes (ATES
et al., 2006).
O estresse oxidativo ocorre quando há uma sobrecarga relativa de moléculas
reativas ao oxigênio ou radicais livres dentro das células, seja pela produção
excessiva destes e/ou um decréscimo nos sistemas antioxidantes (ATES et al.,
2006).
Os radicais livres são espécies oxidativas altamente reativas que causam
danos irreversíveis às células, inclusive neurônios, tais como perda das funções
celulares e morte por necrose ou apoptose (IMAI & NAKAGAWA, 2002; YOSHIDA et
al., 2005). Dentre os radicais mais importantes, estão os radicais superóxido,
hidroxila, peroxila e peróxido de hidrogênio (KUYVENHOVEN & MEINDERS, 1999).
A produção aumentada de radicais livres exerce efeitos citotóxicos nos
fosfolipídeos da membrana celular, resultando na formação de produtos tóxicos, tais
como o radical superóxido (ATES et al., 2006). Os radicais livres podem difundir-se
intracelularmente e modificar carboidratos e proteínas além de causar danos nas
enzimas mitocondriais e DNA, alterando assim a função celular (SLATTER et al.,
2000).
Um outro fator relacionado ao aumento do estresse oxidativo no diabetes, é a
elevada atividade na via dos polióis, via esta que leva a produção de sorbitol. O
sorbitol é produzido pela redução de glicose na reação catalisada pela enzima
aldose redutase (VINSON et al., 1989). A elevação da sua concentração acarreta em
aumento da osmolaridade intracelular, com formação de edema, lesão neuronal e
conseqüente redução da velocidade da condução nervosa, este último efeito
relacionado diretamente com redução da atividade Na
+
/K
+
ATPase (HOSKING et al.,
1978), além de provocar alterações nas subunidades da proteína quinase C (PKC) .
A grande atividade da via dos polióis provoca ainda uma redução dos níveis de
glutationa, pois a glutationa redutase compete com a enzima aldose redutase pelo
NADPH para regenerar a glutationa (CAMERON et al.,1993; PARTHIBAN, et al.,
1995). Em adição a este fato, o estresse oxidativo no diabetes é intensificado, pois
os níveis da enzima superóxido dismutase (SOD) também é reduzida nesta
patologia (PARTHIBAN, et al., 1995).
Dois mecanismos celulares podem combater os radicais livres: i) os
antioxidantes não enzimáticos, como as vitaminas provenientes da alimentação, C e
E, o ácido úrico e a bilirrubina) e, ii) os mecanismos enzimáticos neutralizadores, tais
como as enzimas SOD, catalase e glutationa peroxidase (BONNEFONT-
ROUSSELOT et al., 2000).
1.3 O óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é reconhecido como um regulador endócrino, que
desempenha diferentes funções em todo o organismo, tais como: vasodilatação,
mediação da resposta imune e neurotransmissão (WANG, 2006). A característica
distribuição de neurônios produtores de NO em áreas específicas do SNC, sugere os
prováveis papéis funcionais para este neurotransmissor como, por exemplo, o
envolvimento em processos neuronais, plasticidade neuronal, aprendizagem e
memória, fenômenos de neurotoxicidade, neuroproteção e desenvolvimento neural
(BREDT & SNYDER, 1994; DAWSON & DAWSON, 1998).
No SNC, o NO é reconhecido como uma substância transmissora atípica,
podendo desempenhar funções fisiológicas bem como toxicológicas
(OVTSCHAROFF et al., 2002). Por exemplo, durante o envelhecimento ou
condições patológicas, tais como doenças neurodegenerativas e injúria cerebral,
ocorre um aumento nos níveis de NO, e este pode se apresentar como um radical
livre, podendo resultar em efeitos deletérios na função neuronal decorrente do
aumento do estresse oxidativo (REVSIN et al., 2005).
O NO é formado pela oxidação do grupo guanidina da L-arginina por ação de
enzimas denominadas sintases do óxido nítrico (NOS). Até o momento foram
identificadas e classificadas três isoformas das NOSs, considerando seu local de
expressão: NOS neuronal (nNOS); NOS endotelial (eNOS) e NOS derivada de
macrófagos (mNOS) (BREDT et al., 1991).
A isoforma nNOS foi descrita em alta quantidade nos córtices piriforme e
cingulado, núcleos hipotalâmicos, incuindo o núcleo paraventricular do hipotálamo
(PVH), núcleo supra-ótico (SON), substância cinzenta mesencefálica, núcleo dorsal
da rafe (NDR), núcleos amigdalóides e hipocampo de ratos (BREDT et al., 1991;
VINCENT & KIMURA, 1992).
A maioria dos estudos descritos em relação à transmissão do NO no SNC
estão baseados na localização e na expressão da nNOS. Três são as principais
técnicas utilizadas para localizar a nNOS no SNC: histoquímica para a atividade
NADPH-diaforase, a imunohistoquímica e a hibridização in situ.
A histoquímica para detecção da atividade NADPH-diaforase tem a
propriedade de reduzir certos corantes, entre eles o nitroblue tetrazolium, quando um
elétron é doado pelo NADPH. Este processo resulta na formação de um precipitado
púrpura de fácil identificação histológica. Em 1991, Hope et al. e Bredt et al.
demonstraram que a reação da NADPH-diaforase no SNC constituía um fiel
marcador para a NOS, uma vez que a NOS é capaz de catalisar seletivamente a
reação NADPH-diaforase em tecidos fixados em aldeído, numa proporção molecular
de 1:1.
1.4 Diabetes, óxido nítrico e o sistema nervoso central (SNC)
Análises bioquímicas realizadas em ratos diabéticos mostram um aumento da
produção de NO no hipocampo, córtex, cerebelo e medula espinhal quando
comparadas as mesmas analises de animais controle (ATES et al. 2006).
Alteração na expressão da nNOS também tem sido relatada em outras
regiões cerebrais de ratos diabéticos. No eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), a
presença da nNOS é particularmente evidenciada no PVH, SON e hipófise,
sugerindo um papel neuromodulatório do NO no consumo alimentar, balanço
energético e alterações neuroendócrinas, como por exemplo secreção de oxitocina e
vasopressina. Neste sentido, ratos e camundongos com diabetes nefrogênica
hereditária apresentam cerca de 50% mais neurônios nNOS positivos no PVH
quando comparados a animais normais (WANG & MORRIS, 1996). Uma
aumentada expressão de neurônios positivos para NADPH-diaforase foi descrita no
PVH, núcleo hipotalâmico lateral e núcleo hipotalâmico ventromedial em ratos onde
o diabetes foi induzido por STZ (JANG et al., 2002).
No entanto, em 2002, Reagan & McEwen correlacionaram déficits de
aprendizado com uma expressão diminuída da nNOS em hipocampo de ratos
diabéticos, sugerindo que esta diminuição poderia contribuir para os déficits
cognitivos observados.
1.5 Vitamina E e neuroproteção
Estudos em ratos diabéticos demonstram que o tratamento com antioxidantes
pode prevenir o desenvolvimento da neuropatia diabética (VAN DAM &
BRAVENBOER, 1997), uma vez que ocorre proteção contra os efeitos diretos e/ou
indiretos da ação dos radicais livres sobre os neurônios e células de Schwann.
Assim, drogas que reduzem o estresse oxidativo poderiam ter um papel relevante no
tratamento das complicações neurológicas do diabetes (CAMERON et al.,
1993; SAGARA et al., 1996).
A vitamina E ocorre na natureza em oito formas diferentes que variam quanto
suas atividades biológicas e também no grau de eficácia como antioxidante. O α-
tocoferol é a forma que apresenta maior atividade biológica (TRABER & ARAI,
1999). A vitamina E é uma substância altamente lipofílica que é transportada na
circulação sanguínea em associação com lipoproteínas do plasma. Devido ao seu
caráter lipofílico, a vitamina E parece ser efetiva na neuroproteção, pois encontra-se
presente em elevadas concentrações nas membranas celulares que estão sofrendo
a ação dos radicais livres (COTTER et al.,1995). Neste sentido, o α- tocoferol é um
potente inibidor da peroxidação lipídica, pois capta o radical peroxil de um ácido
graxo insaturado e o reduz a um hidroxiperóxido.
O radical toxoferoxil também
formado na reação é menos reativo (KUYVENHOVEN & MEINDERS, 1999). O
radical tocoferoxil pode ser novamente convertido para α-tocoferol pela ação do
ácido ascórbico (COTTER et al.,1995; KUYVENHOVEN & MEINDERS, 1999).
A função antioxidante da vitamina E esta localizada no anel cromanol, ou
seja, o grupamento hidroxila (OH) ligado ao anel fenólico da molécula, é responsável
por doar seu átomo de hidrogênio para os radicais livres. A presença de pelo menos
um grupo metil ligado ao anel aromático também é essencial para a atividade
antioxidante (DERBIER & LARONDELLE) (Figura 1).
Figura 1: estrutura química da Vitamina E. Fonte: (modificado de: DERBIER &
LARONDELLE, 2005)
Devido à atividade da vitamina E sobre os radicais livres, estudos indicam que
a mesma é fundamental na prevenção ou no retardo da patogênese de várias
doenças degenerativas, como câncer, catarata, doenças cardiovasculares e
inflamatórias, degeneração celular relacionada com o processo de envelhecimento e
desordens neurológicas (PACKER, 1991; BRAMLEY et al., 2000).
Evidências experimentais e clínicas demonstraram que a vitamina E pode
atuar beneficamente no diabetes. Ratos diabéticos apresentaram uma redução de
80% na velocidade de condução nervosa do nervo ciático (COTTER et al.,1995),
efeito este revertido pela vitamina E (1g/kg/dia) (COTTER et al.,1995,TUTUNCU et
al., 1998). Em adição, pacientes com diabetes mellitus tipo 2, cuja dieta foi
suplementada com vitamina E, apresentaram uma melhora na ação da insulina
(PAOLISSO et al., 1993). Também foi relatado que a suplementação alimentar diária
com vitamina E (600 e 1200 mg /Kg/dia) durante dois meses, reduz a glicação não
enzimática protéica em pacientes com diabetes tipo I (CERIELLO et al.,1991) e
aumenta a glutationa dos glóbulos vermelhos (COSTAGLIOLA et al., 1985).
Em 2002, Zanoni et al., mostraram que ratos diabéticos apresentaram um
aumento relativo do número de neurônios NADPH-diaforase positivos do plexo
mioentérico do íleo, quando comparados aos controles normoglicêmicos. Da mesma
forma, a análise morfométrica revelou um aumento na área destes neurônios nos
animais diabéticos. Neste sentido, o tratamento crônico com vitamina C foi capaz de
reduzir a área neuronal dos animais diabéticos quando comparado com animais
diabéticos que receberam veículo.
Considerando os processos de aprendizagem e memória, recentemente
Tuzcu & Baydas (2006) demonstraram que o tratamento com vitamina E por 7
semanas, melhora significantemente o desempenho de ratos no labirinto aquático
de Morris. Estes autores atribuíram este efeito a reversão da peroxidação lipídica e o
retorno dos níveis de glutationa a seus valores controles.
Estas evidências indicam que a vitamina E poderia ser um coadjuvante no
tratamento das complicações crônicas do diabetes. Assim, em virtude do que foi
relatado é provável que o tratamento com vitamina E tenha um efeito neuroprotetor
sobre os neurônios produtores de óxido nítrico de animais diabéticos.
2. Objetivo
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da administração crônica
de vitamina E sobre neurônios produtores de NO em estruturas do SNC de ratos
diabéticos como o estriado, PVH, SON e DLPAG, utilizando a histoquímica para a
NADPH-diaforase. Foram avaliados o número e da área do soma de neurônios
NADPH-diaforase positivos. O teste do labirinto em cruz elevado Trial 1/2 foi também
utilizado para avaliar o efeito da vitamina E sobre parâmetros comportamentais,
como ansiedade e memória dos ratos diabéticos.
3. Materiais e métodos
3.1 Animais
Os procedimentos descritos no presente trabalho estão de acordo com os
princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA) e foram previamente submetidos à análise pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Universidade Estadual de Maringá (UEM), parecer n°
22/2007.
Foram utilizados 50 ratos albinos machos da linhagem Wistar (Rattus
novergicus) provenientes do Biotério Central da UEM. Aos 88 dias de vida (± 297 g),
os ratos foram mantidos em caixas plásticas (n=5), em biotério setorial com foto-
período de 12 horas (7:00 – 19:00 h) e temperatura controlada (23±1°C), recebendo
água e alimento ad libitum.
Inicialmente, os animais foram divididos em dois grupos: normoglicêmicos (N)
e diabéticos (D). No 90° dia de vida o DM foi induz ido nos animais do grupo D, após
jejum prévio de 14 horas, através de uma injeção endovenosa de estreptozootocina
(Sigma, Chemical Co, St. Louis, MO, EUA), na dose de 35 mg/Kg (REAGAN &
McEwen, 2002), dissolvida em uma solução de tampão citrato pH 4,5 (10 mM). Após
7 dias da indução do DM, foi retirado 20 µl de sangue da cauda dos animais para
verificação da glicemia. Esta, foi determinada pelo método da glicose oxidase (Kit
Gold Analisa, Biosystems, AS., Barcelona-Espanha). Aos 49 dias da administração
de STZ, foi realizado uma repetição do teste para confirmar se houve manutenção
do estado hiperglicêmico. Os animais que apresentaram reversão foram descartados
do experimento. Foram aceitos animais com glicemia superior a 500 mg/dl.
Em seguida ao teste de glicemia, os ratos foram divididos em quatro grupos
experimentais: normoglicêmico tratado com veículo (NV), normoglicêmico tratado
com vitamina E (NVE), diabético tratado com veículo (DV) e diabético tratado com
vitamina E (DVE).
3.2 Tratamento
Os animais do grupo N e D receberam veículo, azeite de oliva (Galo),
enquanto os ratos pertencentes aos grupos NVE e DVE receberam vitamina E,
(EPHINAL®, Bayer, São Paulo, SP, Brasil) por via oral (gavagem), na dose de 100
mg/kg, diluída em veículo, durante 7 semanas (TUZCU & BAYDAS, 2006). Os
animais foram pesados semanalmente. No final do tratamento os animais foram
conduzidos à avaliação comportamental e, posteriormente foram sacrificados para
obtenção do tecido nervoso.
3.3 Avaliação comportamental
Os experimentos comportamentais foram realizados em sala com iluminação
(luz vermelha, 40 watts) e temperatura controladas (23±1°C), equipadas com câmera
de vídeo. No 50° dia, no período das 13:00 e 17:00 h, os animais foram submetidos
ao LCE, conforme descrito abaixo. Os experimentos foram filmados para posterior
análise.
Labirinto em Cruz elevado (LCE) Trial 1/2
O LCE é um equipamento feito de madeira, elevado 55 cm do solo, que
consiste em dois braços abertos (50 cm X 10 cm) que partem de uma plataforma
central (10 cm X 10 cm), dispostos de forma perpendicular a dois braços fechados
por paredes laterais (50 cm X 10 cm X 40 cm). Os braços abertos são rodeados
por uma parede de acrílico de 1 cm de altura, utilizada para prevenir queda dos
animais.
No primeiro dia de teste, cada animal foi colocado no fim de um dos dois
braços fechados do LCE para que o mesmo pudesse explorar/percorrer o labirinto
em um tempo de 300 segundos Trial 1. O mesmo procedimento foi repetido 24 horas
após Trial 2. Neste teste foi avaliado o número de vezes em que o animal entrava
nos braços fechados ou abertos, bem como e o tempo em que permanecia nos
mesmos. Estes valores foram posteriormente transformados nos índices
porcentagem de entradas nos braços abertos (% EBA= entradas nos braços abertos/
entrada nos braços fechados + entrada nos braços abertos) e porcentagem de
tempo nos braços abertos (%TBA= tempo nos braços abertos/ tempo nos braços
fechados + tempo nos braços abertos). Além disto, foi também avaliado o número de
movimentos de se “esticar” ou avaliação do risco, risk assessment (RA) do braço
fechado para um dos braços abertos, com uma, duas ou até três patas (DE-MELLO
& CAROBREZ, 2006).
3.4 Coleta e processamento do material
3.4.1 Perfusão
Os animais foram previamente pesados e anestesiados com uma dose de 40
mg/kg de tiopental (Thiopentax®, Itapira, SP, Brasil) por via intraperitoneal.
Em seguida, os animais foram transcardialmente perfundidos com solução
salina 0,9% gelada, seguida de solução fixadora de paraformaldeido 4% em tampão
fosfato sódio (PBS) 0,01 mM com pH 7,4. Os cérebros foram cuidadosamente
retirados, pós-fixados durante 2 horas no mesmo fixador e em seguida, transferidos
para uma solução de sacarose 30% para crioproteção. Após este processo, os
cérebros foram rapidamente congelados em isopentano com auxílio de nitrogênio
líquido, e armazenados em freezer à temperatura -20°C, até o momento dos
ensaios.
3.4.2 Histoquímica para NADPH-diaforase: identificação de células produtoras
de óxido nítrico
Foram obtidas secções coronais de 40 µm com o auxílio de um micrótomo
criostato de chão (Leica CM 1850) à temperatura de -22
o
C±2
o
C. As secções foram
coletadas em quadruplicata, sendo espaçadas em 160 µm, acondicionadas em
placas de 24 furos contendo PBS 0,1 M com azido sódico 1%, e mantidas em
geladeira à 4°C.
As secções foram incubadas sobre proteção da luz à 42
o
C por 2 h em um
meio solução contendo solução tampão fosfato (PB) 0,2 M,Triton-X 100%, nitroblue
tretrazolium 0,5 mM e β-NADPH 1 mM (modificado de VINCENT & KIMURA,1992).
Em seguida os cortes foram lavados em solução salina tamponada com fosfato
(PBS) 0,1 M e montados em lâminas gelatinizadas. Após 48 horas, para secagem
das lâminas, seguiu-se à desidratação de acordo com o esquema: 1-água; 2- álcool
70%; álcool 80%, álcool 90%; álcool 90%, álcool 100%, e clareamento no xilol.
Posteriormente, para confecção das lâminas permanentes foi utilizado Permont® e
lamínula.
3.4.3 Imunohistoquímica para nNOS
Secções adjacentes de 40 µm foram utilizadas para a detecção
imunohistoquímica da nNOS. Estas secções foram inicialmente pré-tratadas com
H
2
O
2
1% em PBS 0,1M durante 10 minutos, para redução da atividade da
peroxidase endógena. Após 3 lavagens de 5 minutos cada, em PBS 0,1M (pH 7,4)
as secções foram incubadas com soro albumina bovina (BSA) 1% em PBS 0,1M ,
durante 1 hora, para bloqueio dos sítios de ligações inespecíficas. Em seguida, as
secções foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-nNOS (1:500,
Santa Cruz Biotechnology). Após 40 hs de incubação à temperatura ambiente, as
secções foram novamente lavadas em PBS 0,1M (3 x 5 minutos) antes de serem
incubadas com o anticorpo secundário biotinilado (1:1000) por mais 1 horas. Os
anticorpos foram diluídos em Triton-X 3% (PBS-T) + BSA 1%. Uma vez removido o
anticorpo secundário, através das lavagens em PBS 0.1M (3 x 10 minutos), as
secções foram incubadas com o complexo ABC avidina-biotina-peroxidase (1:500,
Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories), por 1 hora. A atividade da peroxidase foi
revelada usando o tetracloreto de 3’3’-diaminobenzidina (DAB) contendo H
2
O
2
0,02%. Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente sobre
agitação constante. Finalmente, após adequadamente lavadas, as secções foram
montadas em lâminas gelatinizadas, depois de secas, as quais foram desidratadas e
diafanizadas como descrito acima.
3.4.4 Análise quantitativa de neurônios produtores de óxido nítrico
A quantificação dos neurônios positivos para NADPH-diaforase foi realizada
em 2-3 secções por animal (n=5), em ambos os hemisférios cerebrais, nas seguintes
estruturas: Estriado (Bregma: -6.72 a -7.04 mm), PVN (Bregma:-1.40 a -1.80 mm),
SON (Bregma: -1.40 a -1.80 mm), substância cinzenta periaquedutal (PAG)
(Bregma: 1.60-1.00 mm) de acordo com o atlas de Paxinos e Watson (1997).
As lâminas foram analisadas na objetiva de 20X de um microscópio de luz
Axiokop Plus (Zeiss, Jena, Alemanha), acoplado a uma câmera de alta resolução
AxioCam (Zeiss, Jena, Alemanha). As imagens foram capturadas e então
transferidas para um microcomputador por meio do programa Axio Vision 4 versão
4.1, e gravadas em compact disc.
Para realizar a quantificação foi utilizado o software de análise de imagens
Image-Pro Plus versão 4.50.29 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA).
O número de neurônios foi determinado em áreas fixas, de forma que
abrangessem todo o núcleo. O estriado e PAG foram analisados em uma área de
0,06 mm
2
enquanto os núcleos PVN e SON foram analisados em áreas de 0,02 mm
2
(conforme figura 2 abaixo). Os resultados obtidos foram expressos como a média do
número de neurônios, nos dois hemisférios, por área de interesse.
Figura 2: Diagramas representativos de planos estereotáxicos referentes ao A) estriado (Bregma: -
6.72 a -7.04 mm), B) PVN (Bregma:-1.40 a -1.80 mm), C) SON (Bregma: -1.40 a -1.80 mm), D)
substância cinzenta periaquedutal (PAG) (Bregma: 1.60-1.00 mm) de acordo com o atlas de Paxinos
e Watson (1997). Os retângulos representam a área (mm
2
) analisada.
A
B
C
D
3.4.5 Análise Morfométrica dos neurônios produtores de óxido nítrico
Neurônios NADPH-diaforase positivos foram manualmente delineados com a
ajuda do mouse do computador e, a área individual foi mensurada em µm
2
através
do programa Image-Pro Plus. Esta análise foi realizada em 10 a 20
neurônios/estrutura em ambos hemisférios cerebrais em 2-3 secções para cada
animal. Aproximadamente foram analisados 400 neurônios para cada estrutura
(estriado, PVN, SON e PAG).
4. Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio do software Statistica (Stat Soft
Inc., Tulsa, OK, USA), onde os resultados foram apresentados como média ± erro
padrão da média (EPM).
Para análise comportamental e do peso dos animais, foi utilizada a análise de
variância (ANOVA) de medidas repetidas.
Para o peso, os fatores independentes foram “estado” (normoglicêmico e
diabético) e “tratamento” (veículo e vitamina E), e o fator “semanas” (1 a 7 semana)
foi considerado a medida repetida.
No comportamento os fatores independentes foram “estado” (normoglicêmico
e diabético) e “tratamento” (veículo e vitamina E), e o fator, “dia” (trial 1 e trial 2) foi
considerado a medida repetida. Quando as variâncias entre os grupos não foram
homogêneas, detectadas pelo teste de Levene, os valores brutos foram
matematicamente transformados em [log10(variável+1)].
Análises post-hoc para o comportamento foi realizada pelo teste de Tukey e
peso pelo teste de Duncan.
Os dados relativos à glicemia, contagem de neurônios e área neuronal foram
submetidos ao teste t ou ANOVA de uma via.
5. Resultados
A estreptozootocina promoveu a síndrome diabética nos animais dos grupos
DV e DVE, os quais apresentaram o quadro clínico característico da doença ao
longo de todo o experimento: poliúria, polidipsia e polifagia. Aos 97 dias, o DM foi
confirmado através da dosagem da glicose sanguínea. Animais com glicose acima
de 500 mg/dl foram considerados diabéticos (teste t, p<0,001, Tabela 1). Ao fim do
experimento, a manutenção do estado diabético foi confirmada, sendo os valores de
glicemia dos animais DV e DVE significativamente maiores quando comparados aos
seus controles (ANOVA, F
3,40
=522,3, p<0.001, Tabela 1).
Quanto ao peso dos animais, a ANOVA mostrou efeito do “estado”
(F
3,40
=96,1, p<0.001) e “semanas” (F
3,40
=48,2, p<0.001) bem como interação entre
os fatores “semanas e estado” (F
3,40
=193,7, p<0.001) e “tratamento e semanas”
(F
3,40
=4,17, p<0.001). Os animais dos grupos DV e DVE apresentaram significativa
redução do peso corporal quando comparados aos animais dos grupos NV e NVE, a
partir da segunda semana de experimento (Figura 3). A administração crônica de
vitamina E aumentou significativamente o peso dos animais normoglicêmicos (NVE)
em relação ao grupo NV, apenas na sétima semana (p<0.05).
5.1 O Labirinto em cruz elevado
A Figura 4 ilustra o desempenho dos animais submetidos ao LCE.
A ANOVA geral mostrou efeito do fator “dia” tanto para a %EBA quanto para a
%TBA (F=17,4; p<0.001 e F=19,1; p<0.001, respectivamente). A análise post-hoc
pelo teste de Duncan mostrou que a experiência prévia ao LCE (Trial 1) reduziu
significativamente a %EBA e a %TBA na Trial 2 (p<0,05), para os grupos NV e
DVE. No entanto, a experiência prévia ao LCE não alterou o desempenho dos
animais dos grupos NVE e DV na Trial 2.
Considerando o número de EBF e RAs, a ANOVA geral mostrou um
significante efeito do fator “estado” (F=9,8; p<0,05 e F=31,7; p<0,0001,
repectivamente). Comparações posteriores evidenciaram que os grupos D e DVE
apresentaram uma significativa redução dos parâmetros EBFs e RAs quando
comparados aos grupos N e NVE tanto no Trial 1 quanto no Trial 2 (p<0,05). A
experiência prévia ao LCE (Trial 1 ) não alterou o desempenho de nenhum dos
grupos no Trial 2.
5.2 Análise quantitativa de neurônios NADPH-diaforase positivos
Conforme Figuras 5 e 6, houve um significativo aumento no número de
neurônios NADPH-diaforase positivos dos grupos DV e DVE em relação aos grupos
NV e NVE, em duas estruturas analisadas: no estriado e PAG (F
3,17
=15,0; p<0,001 e
F
3,17
=8,2; p<0,05, respectivamente).
O tratamento crônico com vitamina E diminuiu significativamente o número de
neurônios no grupo NVE em relação ao grupo NV no estriado (p<0,05).
5.3 Análise morfométrica de neurônios NADPH-diaforase positivos
Houve aumento significativo na área dos neurônios NADPH-diaforase
positivos dos grupos DV e DVE em relação aos grupos NV e NVE, nas 4 estruturas
analisadas: estriado (F
3,17
=23,8; p< 0,001), PVH (F
3,19
= 17,6; p < 0,001) e SON
(F
3,19
= 83,3: p< 0,001), PAG (F
3,18
=13,0 p<0,001) (Figuras 7 e 8).
O tratamento crônico com vitamina E diminuiu significativamente a área de
neurônios do grupo NVE em relação ao grupo NV no PVH (p<0,05) e SON
(p<0,001). No SON também foi observado uma diminuição significativa nos grupos
DVE em relação ao seu controle DV (p<0,001) NO PVH foi observada uma
tendência de redução na área neuronal do grupo DVE em relação ao seu controle
DV (p<0,1).
TRATAMENTO
GLICOSE (mg/dl)
Inicial Final
N
139.3±2.9
a
NV
144.3±6.6
a
NVE
138.8±4.2
a
D
555.5±6.9
b
DV
571.8±12.2
b
DV
553.2±18.9
b
Tabela 1: Glicemia dos animais dos grupos normoglicêmicos (N), normoglicêmicos tratados com
veículo (NV), normoglicêmicos tratados com vitamina E (NVE), diabéticos (D), diabéticos tratados
com veículo (DV) e diabéticos tratados com vitamina E (DVE) no início e fim do experimento. A
vitamina E ou veículo foram administrados por gavagem durante 7 semanas. Médias ± EPMs
seguidos por letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes de acordo com o
test t de Student para a glicemia inicial e ANOVA para a glicemia final. Nível de significância,
p<0,001.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
200
250
300
350
400
450
500
NVE
NV
DVE
DV
*
semanas
Peso (g)
Figura 3: Média ± EPMs dos pesos dos animais dos grupos normoglicêmico tratado com veículo
(NV), normoglicêmico tratado com vitamina E 100 mg/Kg (NVE), diabético tratado com veículo (DV)
e diabético tratado com vitamina E 100 mg/Kg (DVE) durante 7 semanas. *p<0,05 comparado ao
grupo NVE. Mais informações na legenda da tabela 1.
Figura 4: Efeito do tratamento crônico com vitamina E em animais normoglicêmicos e diabéticos,
submetidos ao Labirinto em Cruz Elevado Trial 1/2 por 5 minutos. Foram analisados os parâmetros:
porcentagem de entradas nos braços abertos (%EBA), porcentagem de tempo nos braços abertos
(%TBA), número de entradas nos braços fechados (EBF) e número de risk assessment (RA). #p<0,05
comparado com a performance no Trial 1; *p<0,05 comparado com os grupos controles (NV e NVE)
no Trial 1 e Trial 2. Normoglicêmico tratado com veículo (NV), normoglicêmico tratado com vitamina E
(NVE), diabético tratado com veículo (DV) e diabético tratado com vitamina E (DVE).
Figura 5: Efeito da administração crônica de vitamina E sobre número de neurônios NADPH-
diaforase positivos: (A) Estriado (Bregma: -6.72 a -7.04 mm), (B) Núcleo paraventricular do
hipotálamo (Bregma:-1.40 a -1.80 mm), (C) Núcleo supra-óptico (Bregma: -1.40 a -1.80 mm), (D)
Substância cinzenta periaquedutal (Bregma: 1.60-1.00 mm), de acordo com o atlas de Paxinos e
Watson (1997). **p<0,001 em relação aos grupos controle (NV e NVE); *p< 0,05 em relação aos
grupos controle (NV e NVE);
a
p<0,05 em relação ao grupo NV.
A
B
C
D
Figura 6: Fotomicrografias representativas do número de neurônios NADPH-diaforase positivos no
estriado (A e B); PVH (C e D); SON (E e F) e DLPAG (G e H) de animais normoglicêmicos (coluna à
direita) e diabéticos (coluna à esquerda). A1 e B1 representam fotomicrografias de secções
adjacentes à A e B, respctivamente, ensaiadas para a imunohistoquímica para detecção da nNOS.
Escala da barra = 200 µm. 3V= terceiro ventrículo; QO=quiasma óptico; AS= Aqueduto de Sylvius.
3V
QO
AS
AS
Normoglicêmicos Diabéticos
3V
QO
A
B
A.1
B.1
C D
E
F
G
H
Figura 7: Efeito da administração crônica de vitamina E sobre a área (µm
2
) de neurônios NADPH-
diaforase positivos: (A) Estriado, (B) PVN, (C) NSO, (D) PAG. **p<0,001 em relação aos grupos
controle (NV e NVE);
a
p<0,05 em relação ao grupo NV;
b
p< 0,001 em relação ao grupo NV;
c
p< 0,1
em relação ao grupo DV.
A
B
C
D
Figura 8: Fotomicrografias representativas das áreas do somas de neurônios NADPH-diaforase
positivos no estriado (A e B); PVH (C e D); SON (E e F) e DLPAG (G e H) de ratos normoglicêmicos
(coluna à direita e diabéticos (coluna à esquerda). Escala da barra = 100 µm.
Normoglicêmicos Diabéticos
A B
C D
E F
G
H
6. Discussão
O presente trabalho avaliou o efeito do tratamento crônico com vitamina E
(100 mg/Kg), sobre o desempenho de ratos diabéticos na ansiedade e memória,
usando como modelo o LCE Trial 1/2. Nós também avaliamos a expressão de
neurônios produtores de NO no estriado, PVH, SON e DLPAG, utilizando a
histoquímica para NADPH-diaforase. Ratos diabéticos apresentaram prejuízos
cognitivos e diminuição da atividade locomotora quando comparados aos seus
controles normoglicêmicos. Paralelo a estes efeitos, foi detectado um significativo
aumento na área do soma dos neurônios NADPH-diaforase positivos nas estruturas
cerebrais analisadas: estriado, PVH, SON e DLPAG. No entanto, somente no
estriado e DLPAG de ratos diabéticos foi observado um aumento no número destes
neurônios. O tratamento crônico com vitamina E (100 mg/Kg) melhorou os déficits
cognitivos e diminuiu a área do soma de neurônios NADPH-diaforase positivos do
PVH e SON de ratos diabéticos.
O teste do LCE Trial 1/2 tem sido reconhecido como um modelo animal
adequado para avaliar respostas comportamentais de ansiedade e memória em
roedores (BERTOGLIO & CAROBREZ, 2000). No Trial 1 é possível avaliar o efeitos
ansiolíticos/ansiogênicos de diferentes tratamentos (entrada nos braços abertos)
bem como a atividade locomotora dos animais (número de entradas nos braços
fechados e risk assessment). Após a exposição inicial no Trial 1, os animais
mostram uma redução significativa na exploração dos braços abertos no Trial 2.
Acredita-se que este comportamento reflete a aquisição da memória espacial, que
estaria relacionada com a exploração das regiões aversivas do LCE, como os braços
abertos (BERTOGLIO & CAROBREZ, 2000).
Através dos parâmetros avaliados no LCE Trial 1, os animais diabéticos não
apresentaram alteração na ansiedade quando comparados com os animais
normoglicêmicos. No entanto, uma significativa redução da atividade locomotora foi
detectada, visto que ocorreu diminuição no número de entradas dos braços
fechados e no número dos risk assessment. Estes resultados estão de acordo com
estudos realizados por HILAKIVI-CLARKE et al., (1990) e KHANAM & PILLAI (2007)
que relatam não haver alteração significativa da ansiedade em roedores tornados
diabéticos. Em contraste, outros estudos demonstram que ratos diabéticos
apresentam-se mais ansiosos em comparação a ratos não diabéticos no teste do
campo aberto, LCE, labirinto em zero elevado e testes de interação social
(RAMANATHAN et al., 1998; GRZEDA et al., 2007).
Déficits cognitivos têm sido descritos em animais diabéticos submetidos a
tarefas como o labirinto aquático de Morris (BIESSELES, 1998) e esquiva
passiva/ativa no labirinto em T (BIESSELES, 1998; GISPEN, 2005). Desta forma,
nossos resultados mostraram que ratos normoglicêmicos apresentam uma redução
significativa na exploração dos braços abertos sem alteração nas entradas nos
braços fechados e risk assessment, no LCE Trial 2. Este comportamento está de
acordo com o fato de a experiência anterior/prévia no LCE Trial 1, modifica o
desempenho na Trial 2. OS resultados da Trial 2 comparados a Trial 1, evidenciam
que ocorre uma diminuição na saída dos braços abertos, indicando a aquisição da
memória. Inversamente, ratos diabéticos não apresentaram qualquer alteração na
exploração dos braços abertos (%EBA) no Trial 2. Isto pode ser interpretado como
uma possível interrupção na aprendizagem das informações relativas ao ambiente
espacial do LCE.
No presente estudo, o tratamento crônico com vitamina E melhorou o
desempenho cognitivo dos ratos diabéticos no LCE Trial 1/2, uma vez que reduções
significativas na exploração do braço aberto foram observadas no LCE Trial 2. Estes
resultados confirmam estudos anteriores de que a vitamina E previne déficits de
aprendizagem e memória em ratos diabéticos submetidos a uma versão espacial do
labirinto aquático de Morris (TUZCU & BAYDAS, 2006).
Os mecanismos pela qual a vitamina E atua na prevenção dos déficits
cognitivos ainda não estão totalmente esclarecidos. TUZCU & BAYDAS (2006),
sugeriram que o estresse oxidativo poderia possuir papel central, já que a vitamina E
reduz a peroxidação lipídica e poupa a depleção de glutationa no hipocampo e
córtex frontal de ratos diabéticos. Além disso, os déficits observados no aprendizado
e memória de ratos diabéticos têm sido associados com a plasticidade sináptica,
envolvendo receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) e as respectivas alterações na
potenciação à longo prazo (GRZEDA et al., 2003).
No presente estudo, animais diabéticos apresentaram uma diminuição da
atividade locomotora no LCE. Em paralelo, um aumento do número de neurônios
NADPH-diaforase positivos foi observado no estriado destes animais quando
comparados aos seus controles normoglicêmicos. Uma diminuição da atividade
locomotora em animais diabéticos tem sido relacionada com a baixa liberação de
dopamina no sistema estriatal dopaminérgico (MURZI et al.,1996; MARDON et al.,
1999). Neste sentido, o NO tem sido demonstrado como um modulador do
comportamento motor, provavelmente interferindo com a neurotransmissão
dopaminérgica no estriado (DEL BEL et al., 2002). Muitos estudos sugerem que, sob
condições fisiológicas, o NO aumenta a dopamina no estriado, facilitando sua
liberação (STEWART et al., 1996; WEST & GALLOWAY, 1998) e/ou diminuindo sua
recapatação (GUEVARA-GUZMAN et al., 1994; KISS & VIZI, 2001). Portanto, o
aumento no número de neurônios NADPH-diaforase positivos observados no
estriado de ratos diabéticos observado no presente trabalho, poderia resultar de um
aumento compensatório na atividade da neurotransmissão nitrérgica no estriado
para contrapor a redução de dopamina já descrita no diabetes. No entanto,
alterações na expressão da NOS podem resultar em alterações nos níveis de outras
monoaminas, pois o NO tem a habilidade de modular a função sináptica no cérebro
(DAWSON & DAWSON , 1998).
A atividade da NOS tem sido amplamente localizada no hipotálamo, em
especial no PVH e SON. Esta localização evidencia um papel neuromodulatório do
NO na homeostase de eletrólitos e regulação da água do organismo (WANG &
MORRIS, 1996). Tem sido relatado que a expressão do gene nNOS no PVH e SON
está aumentada em resposta à estímulos osmóticos como, desidratação e
sobrecarga de sal (KADOWAKI et al., 1994; UETA et al., 1995). No diabetes
experimental, diferentes alterações na expressão de nNOS foram descritas no PVH
e SON. Alguns autores demonstraram aumento na expressão do RNAm da nNOS
como também no número de neurônios NADPH-diaforase positivos no PVH e SON
(WANG & MORRIS, 1996; SERINO et al.,1998). Já, outros pesquisadores
mostraram uma diminuição na atividade neuronal basal da NOS no PVH e SON de
animais diabéticos (ZHENG et al., 2005). No presente experimento, nós observamos
que não ocorreram alterações no número de neurônios NADPH-diaforase positivos
no PVH e SON de ratos, após 7 semanas da indução do diabetes experimental. A
razão possível para esta variação nos resultados apresentados e os obtidos por nós,
ainda não esta totalmente esclarecida. No entanto, as diferenças no modelo
experimental utilizado, o tempo de duração do diabetes e a gravidade da
hiperglicemia, dentre outros fatores, podem ser pensados como fatores
relacionados.
Acredita-se que a DLPAG seja um importante componente no sistema de dor
endógena (LOVICK & KEY, 1996). Estudos mostram que o aumento da expressão
da nNOS foi observado na DLPAG após estimulação de receptores nociceptivos
viscerais (RODELLA et al.,1998), e a administração de 7-nitroindazole, um inibidor
da nNOS, resulta em efeitos anti-nociceptivos em ratos (MOORE et al., 1998).
Recentemente, JANG et al., (2003), demonstraram uma expressão aumentada da
nNOS na DLPAG de ratos diabéticos. Os autores sugeriram que o aumento da
atividade da nNOS na DLPAG poderia estar relacionado com a alodinia e a
hiperalgesia observadas na neuropatia diabética. Nossos resultados confirmam que
a expressão de NOS esta aumentada na DLPAG de ratos diabéticos, expressa pelo
aumento do número de neurônios NADPH-diaforase positivos e, reforça o papel do
NO na modulação da dor na DLPAG de ratos diabéticos.
Análises morfométricas como a determinação da área do soma neuronal
podem fornecer informações sobre a atividade funcional das células (BESTETTI et
al., 1987). Por exemplo, o aumento da atividade de neurônios noradrenérgicos
conseqüente ao aumento da transcrição do gene de tirosina hidroxilase, resulta na
produção e acúmulo de noradrenalina dentro desses neurônios (KANDEL et al.,
2000). Por outro lado, o aumento de íons Na
+
e metabólitos dentro da célula, podem
causar aumento do influxo de água devido a fenômenos osmóticos, levando a
formação de edema e conseqüente aumento do tamanho celular (GLYN, 1985). No
presente estudo, animais diabéticos apresentaram aumento significativo na área do
soma de neurônios NADPH-diaforase positivos no estriado, PVH, SON e DLPAG.
Curiosamente, resultados semelhantes foram obtidos por ZANONI et al., (2003),
após investigarem neurônios produtores de NO do plexo mioentérico de ratos
diabéticos. Embora o diabetes não tenha aumentado a população dos neurônios
NADPH-diaforase positivos do plexo mioentérico, a área desses neurônios foi
significativamente maior quando comparadas a ratos normoglicêmicos. Desta forma,
como observado no plexo mientérico, o diabetes poderia promover um aumento na
expressão da NOS no cérebro de ratos diabéticos, resultando numa maior produção
de NO, com conseqüente aumento na área dos neurônios NADPH-diaforase
positivos. Assim, as distintas características morfométricas dos neurônios NADPH-
diaforase nos grupos de ratos diabéticos e normoglicêmicos poderia implicar uma
maior atividade metabólica do NO no diabetes.
A vitamina E mostrou-se eficiente em reduzir a degeneração das células
hipocampais após a isquemia cerebral (HARA et al., 1990) e também na
recuperação da função motora após lesão medular (ANDERSON et al., 1988). A
vitamina E, também pode melhorar os déficits de aprendizagem e memória em
roedores (FUKUI et al., 2001; TUZCU & BAYDAS, 2006). No presente estudo,
animais diabéticos apresentaram um aumento da área do soma de neurônios
NADPH-diaforase positivos no estriado, PVH, SON e DLPAG. Provavelmente, estes
efeitos foram, pelo menos em parte, mediados pelo estresse oxidativo. Com o
tratamento crônico com vitamina E, ocorreu diminuição significativa da área do soma
de neurônios NADPH-diaforase positivos no PVH e SON de ratos diabéticos. No
entanto, este efeito não pode ser específico para a condição de diabetes, uma vez
que uma redução similar na área do soma de neurônios NADPH-diaforase positivos
também foi observada no PVH e SON de ratos normoglicêmicos tratados com
vitamina E.
Em conclusão, o presente estudo confirma e estende as evidências de que o
tratamento crônico com vitamina E melhora a aquisição e a recuperação da memória
em ratos diabéticos. Os presentes resultados mostram ainda um aumento no
número de neurônios no estriado e na DLPAG e um aumento da área do soma
neuronial no estriado, PVH, SON e DLPAG. O tratamento com vitamina E reverteu o
aumento do soma neuronial no PVH e SON. É possível que as alterações celulares
observadas possam contribuir para os déficits da atividade locomotora e de cognição
observado em ratos diabéticos.
Referências
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Report of the expert committee on the
diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care, V. 20, n. 7, p. 1183-
1197, 1997.
ANDERSON, D.K.; WATERS, T.R.; MEANS, E.D. Pretreatment with alpha-
tocopherol enhances neurologic recovery after experimental spinal cord compression
injury. Journal of Neurotrauma, V. 5, p. 61-67, 1988.
ATES, O.; CAYLI, S. R.; ALTINOZ, E.; YUCEL, N.; KOCAK, A.; TARIM, O.; DURAK,
A.; TURKOZ, Y.; YOLOGLU, S. Neuroprotective effect of mexiletine in the central
nervous system of diabetic rats. Journal of Clinical Neuroscience, V. 14, n. 7, p. 658-
665, 2006.
BELLUSH, L. L.;ROWLAND, N. E. Stress and behavior in streptozotocin diabetic
rats: biochemical correlates of passive avoidance learning. Behavioural
Neuroscience, V. 103, n. 1, p. 144–150, 1989.
BERNSTEIN, R. R.; BUSIK, V. J.; HENRY, N. D. Are diabetic neuropathy,
retinopathy and neuphropathy caused by hyperglycemic exclusion of
dehydroascorbate uptake by glucose transporters? Journal of Theoretical Biology. V.
216, p. 345-359, 2002.
BERTOGLIO, L. J.; CAROBREZ, A. P., Previous maze experience required to
increase open arms avoidance in rats submitted to the elevated plus-maze model of
anxiety, Behavioural. Brain Research, V. 108, p.197-203, 2000.
BESTETTI, G.; HOFER, R.; ROSSI, G. L., The preoptic-suprachiasmatic nuclei
though morphologically heterogeneous are equally affected by streptozotocin
diabetes. Experimental Brain Research, V. 66, p. 74-82, 1987.
BIESSELS, G. J.; KAPELLE, B.; BRAVENBOER, B.; ERKELEUS, D. W.; GISPEN,
W. H. Cerebral function in diabetes mellitus. Diabetologia, V. 37, p. 643-650, 1994.
BIESSELS, G. J.; KAMAL, A.; URBAN, I. J.; SPRUIJT, B. M.; ERKELENS, D. W.;
GISPEN, W. H., Water maze learning and hippocampal synaptic plasticity in
streptozotocin-diabetic rats: effects of insulin treatment. Brain Research, V. 800, n. 1,
p. 125-135, 1998.
BONNEFONT-ROUSSELOT D.; BASTARD, J. P.; JAUDON, M. C.; DELATTRE, J.
Consequences of the diabetic status on the oxidant/antioxidant balance. Diabetes
and Metabolism, V. 26, p. 163-176, 2000.
BRAMLEY, P. M.; ELMADFA, I.; KAFATOS, A.; KELLY, F. J.; MANIOS, Y.;
ROXBOROUGH, H. E.; SCHUCH, W.; SHEEHY, P. J. A.; WAGNER, K. H. Vitamin
E. Journal of the science of Food and Agriculture, V. 80, n. 77, p. 913-938, 2000.
BREDT, D. S.; SNYDER, S. H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule.
Annual Reviews of Biochemistry, V. 63, p. 175-195, 1994.
BREDT, D. S.; GLATT, C. E.; HWANG, P. M.; FOTUHI, M.; DAWSON, T. M.;
SNYDER, S. H. Nitric oxide synthase protein and mRNA are discretely localized in
neuronal populations of the mammalian CNS together with NADPH diaphorase.
Neuron, V. 7, n. 4, p. 615-624, 1991.
CAMERON, N. E.; COTTER, M. A.; MAXFIELD, E. K. Anti-oxidant treatment
prevents the development of peripherical nerve disfunction in streptozotocin-diabetic
rats. Diabetologia, V. 36, p. 299-304, 1993.
CERIELLO, A.; GIUGLIANO, D.; QUATRARO, A.; DONZELLA, C.; DIPALO, G.;
LEFEBVRE, P. J. Vitamin E reduction of protein glycosylation in diabetes. New
prospect for prevention of diabetic complications? Diabetes Care, V. 14, n. 1, p. 68-
72, 1991.
COSTAGLIOLA, C.; LIBONDI, T.; MENZIONE, M.; RINALDI, E.; AURICCHIO, G.
Vitamin E and red blood cell glutathione. Metabolism: Clinical and Experimental, V.
34, n. 8, p. 712-714, 1985.
COTRAN, N. S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S. L. Robbins patologia estrutural e
funcional. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.
COTTER, M. A.; LOVE, A.; WATT, M. J.; CAMERON, N. E.; DINES, K. C. Effects of
natural free radical scavengers on peripheral nerve and neurovascular function in
diabetic rats. Diabetologia, V. 38, n. 11, p. 1285-1294, 1995.
DAWSON, V. L.; DAWSON, T. M. Nitric oxide in neurodegeneration. Progress in
Brain Research, V. 118, p. 215-229, 1998.
DEL BEL, E. A.; SOUZA, A. S.; GUIMARAES, F. S.; DA SILVA, C. A.; Nucci-Da-
Silva,L.P. Motor effects of acute and chronic inhibition of nitric oxide synthesis in
mice. Psychopharmacologia, V. 161, p. 32-37, 2002.
DE-MELLO, N.; CAROBREZ, A. P. Elevated T-maze as an animal model of memory:
effects of scopolamine. Behavioural Phamacology, V. 13, n. 2, p. 139-148, 2002.
DERBIER, C.; LARONDELLE, Y. Vitamins A and E: metabolism, roles and transfer to
offspring. British Journal of Nutrition, V. 93, n. 2, p. 153-174, 2005.
FLOOD, J. F. Characteristics of learning and memory in streptozocin-induced
diabetic mice. Diabetes, V.39, p.1391–1398, 1989.
FUKUI, K.; ONODERA, K.; SHINKAI, T.; SUZUKI, S.; URANO, S. Impairment of
learning and moemory in rats caused by oxidative stress and aging and its prevention
by vitamin E. Annals of the New York Academy Sciences, V. 949, p. 275-284, 2001.
GISPEN, W. H.; BIESSELS, G. J. Cognition and synaptic plasticity in diabetes
mellitus. Trends in Neurosciences, V. 23, p. 542–549, 2000.
GUEVARA-GUZMAN, R.; EMSON, P. C.; KENDRICK, K. M., Modulation of in vivo
striatal transmitter release by nitric oxide and cyclic GMP. Journal Neurochemistry, V.
62, p. 807-810, 1994.
GZREDA, E.; WISNIEWSKA, R. J.; WISNIEWSKI, K. Effect of an NMDA receptor
agonist on T-maze and passive avoidance test in 12-week streptozotocin-induced
diabetic rats. Pharmacological Reports: PR, V. 59, n. 6, p. 656-663, 2007.
GLYN, I. M. The Na/K cotrasnporting adenosine triphosphate. In: The enzymes of
biological membranes (Martonosi A, ed.), p. 34-114. New York: Plenum Press, 1985.
HARA, H.; KATO, H.; KOGURE, K. Protective effect of alpha-tocopherol on ischemic
neuronal damage in the gerbil hippocampus. Brain Research, V. 510, p. 335-338,
1990.
HILAKIVI-CLARKE, K. M.; WOZNIAK, M. J.; DURACAN M..; LINNOILA M. Behavior
of streptozotocin-diabetic mice in tests of exploration, locomotion, anxiety, depression
and aggression. Physiology & Behavior, V. 48, p. 429–433, 1990.
HOPE B. T.; MICHAEL G. J.; KNIGGE K. M.; VINCENT S. R. Neuronal NADPH
diaforase is a nitric oxid synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, V. 88, n. 7, p. 2811-2814, 1991.
HOSKING, D. J.; BENNET, T.; HAMPTON, J. R. Diabetic autonomic neuropath.
Diabetes, V. 27, p. 1043-1055, 1978.
IMAI, H.; NAKAGAWA, Y. Biological significance of phospholipid hydroperoxide
glutathione peroxidase (PHGPx, GPx4) in mammalian cells. Free Radical and
Medicine, V. 34, n. 2, p. 145-169, 2002.
JANG, M.; KIM, H.; SHIN, M.; LIM, B.; LEE, T.; JUNG, S.; KIM, C.; KIM, E.
Administration of Folium mori extract decreases nitric oxide synthase expression in
the hypothalamus of streptozotocin-induced diabetic rats. Japanese Journal of
Pharmacology, V. 90, n. 2, p. 189-192, 2002.
JANG, M. H.; SHIN, M. C.; KOO, G. S.; LEE, C. Y.; KIM, E. H.; KIM, C. J.,
Acupuncture decreases nitric oxide synthase expression in periaqueductal gray area
of rats with streptozotocin-induced diabetes. Neuroscience Letters, V. 337, p. 155-
158, 2003.
KADOWAKI, K.; KISHIMOTO, J.; LENG, G.; EMSON, P.C., Up-regulation of nitric
oxide synthase (NOS) gene expression together with NOS activity in the rat
hypothalamo-hypophysial system after chronic salt loading: evidence of a
neuromodulatory role of nitric oxide in arginine vasopressin and oxytocin secretion.
Endocrinology, V. 134, p. 1011-1017, 1994.
KAMAL, A.; BIESSELS, G. J.; DUIS, S. E.; GISPEN, W. H. Learning and
hippocampal plasticity in streptozotocin-diabetic rats: interaction of diabetes and
aging. Diabetologia, V. 43, p. 500-506, 2000.
KANDEL, E. R.; SCHWARTZ, J.H.; JESSELS, T.H. Neurotransmitters. In: Principles
of neural science, p. 284. 4th edition, New York: McGraw-Hill, 2000.
KISS J.; VIZI E. S., Nitric oxide: a novel link between synaptic and nonsynaptic
transmission. Trends in Neuroscience, V. 24, n. 4, p. 211–215, 2001.
KHANAM, R.; PILLAI, K. K. Effect of chronic chromium picolinate in animal models of
anxiety and memory. Fundamental Clinical Pharmacology, V. 21, p. 531-534, 2007.
KONRAD, R. J.; MIKOLAENKO I.; TOLAR, J. F.; LIU K.; KUDLON J. E. The
potencial mechanism of the diabetogenic action of streptozotocin: inhibition of
pancreatic β-cell O-GIcNAc-selective N-acetyl- β-D-glucosaminidase. Biochemical
Society, V. 356, p. 31-41, 2001.
KRÖNCHE, K. D.; FEHSEL K.; SOMMER A.; RODRIGUEZ, M. L..; KOLB-
BACHOFEN, V. Nitric oxide generation during cellular metabolization of the
diabetogênic N-methyl-N-nitoso-urea streptozotocin contributes to islet cell DNA
damage. Biological Chemistry Hopper-Seyler, V. 376, n. 3, p. 179-185, 1995.
KUYVENHOVEN, J. P.; MEINDERS, A. E. Oxidative stress and diabetes mellitus
pathogenesis of long-term complications. European Journal of Internal Medicine, V.
10, p. 9-19, 1999.
LI, Z.; ZHANG, W.; GRUNBERGER, G.; SIMA, A. A. Hippocampal neuronal
apoptosis in type 1 diabetes. Brain Research, V. 946, n. 2, p. 221-231, 2002.
LOVICK, T. A.; KEY, B. J. Inhibitory effect of nitric oxide on neuronal activity in the
periaqueductal grey matter of the rat. Experimental Brain Research, V. 108, p. 382-
388, 1996.
McCARTY, D.; ZIMMET, P. Z. Diabetes 1994 to 2010: global estimates and projects.
Melbourne: International Diabetes Intitute, 1994.
MAGARIÑOS, A. M.; MCEWEN, B. S. Experimental diabetes in rats causes
hippocampal dendritic and synaptic reorganization and increased glucocorticoid
reactivity to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, V. 97, p. 11056–11061, 2000.
MAINOUS III, A. G.; BACKER, R.; KOOPMAN, R. J.; SAXENA, S.; DIAZ, V. A.;
EVERETT, C. J.; MEJEED, A. Impact of the population at risk of diabetes on
projections of diabetes burden in the United State: an epidemic on the way.
Diabetologia, V. 50, n. 5, p. 934-940, 2006.
MOORE, P. K.; BABBEDGE, R. C.; WALLACE, P.; GAFFEN, Z. A.; HART, S. L. 7-
Nitro indazole, an inhibitor of nitric oxide synthase, exhibits anti-nociceptive activity in
the mouse without increasing blood pressure. British Journal Pharmacology, V. 108,
p. 296-297, 1993.
MORRIS, R. Development of a water maze procedure for studying spatial learning in
the rat. Journal of Neuroscience, V. 11, p. 47-60, 1984.
OLT, A.; STALK, R. P.; VON HARSKAMP, F.; POLS, H. A. P.; HOFMAN, A.;
BRETELER, M. M. B. Diabetes mellitus and the risk of dementia: Rotterdam Study.
Neurology, V. 53, p. 1937–1942, 1999.
OVTSCHAROFF, W.; BOZHILOVA-PASTIROVA, A.; CHRISTOVA, T. Postnatal
development of neurons expressing NADPH-diaphorase and parvalbumin in the
parietal cortex of male and female rats. Acta of Histochemica, V. 104, n. 1, p. 23-28,
2002.
PACKER, L. Protective role of vitamin E in biological systems. The American Journal
of Clinical Nutrition, V. 53, n. 4, p. 1050S-1055S, 1991.
PAOLISSO, G.; D'AMORE, A.; GIUGLIANO, D.; CERIELLO, A.; VARRICCHIO, M.;
D'ONOFRIO, F. Pharmacologic doses of vitamin E improve insulin action in healthy
subjects and non-insulin-dependent diabetic patients. American Journal of Clinical
Nutrition, V. 57, n. 5, p. 650-656, 1993.
PARTHIBAN, A.; VIJAYALINGAM, S.; SHANMUGASUNDARAM, K. R.; MOHAN, R.
Oxidative stress and the development of diabetic complications - antioxidants and
lipid peroxidation in erythrocytes and cell membrane. Cell Biology International, V.
19, p. 987-993, 1995.
PAXINOS, G.; WATSON, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 3nd. Academic
Press, San Diego, CA, 1997.
RAMANATHAN, M.; JAISWAL, A. K.; BHATTACHARYA, S. K. Differential effects of
diazepam on anxiety in streptozotocin induced diabetic and non-diabetic rats.
Psychopharmacology, V. 135, p. 361-367, 1998.
REAGAN, L. P.; McEwen, B. S. Diabetes, but not stress, reduces neuronal nitric
oxide synthase expression in rat hippocampus: implications for hippocampal synaptic
plasticity. Neuroreport, V. 13, n. 14, p. 1801-1804, 2002.
REVSIN, Y.; SARAVIA, F.; ROIG, P.; LIMA, A.; KLOET, E. R.; HOMO-DELARCHE,
F.; DE NICOLA, A. F. Neuronal and astroglial alterations in the hippocampus of a
mouse model for type 1 diabetes. Brain Research, V. 1038, n. 1, p. 22-31, 2005.
RODELLA, L.; REZZANI, R.; AGOSTINI, C.; BIANCHI, R., Expression of NADPH-
diaphorase and colocalization with Fos in the brain neurons of the rat following
visceral noxious stimulation. Brain Research, V. 834, p. 173-177, 1999.
ROWLAND, N. E.; BELLUSH, L. L. Diabetes mellitus: stress, neurochemistry and
behavior. Neuroscience Biobehavavioral Reviews, V. 13, n. 4, p. 199–206, 1989.
ROYCE J. R. On the construct vality of open-field measures, Psychological Bulletin,
V. 84, p. 1098-1106, 1977.
SAGARA, M.; SATOH, J.; WADA, R.; YAGIHASHI, S.; TAKAHASHI, K.;
FUKUZAWA, M.; MUTO, G.; MUTO, Y.; TOYOTA, T. Inhibition of development of
peripheral neuropathy in streptozootocin-induced diabetic rats with N-acetylcysteine.
Diabetologia, V. 39, n. 3, p. 263-269, 1996.
SERINO, R.; UETA Y.; TOKUNAGA M.; HARA Y.; NOMURA M.; KABASHIMA N.;
SHIBUYA I.; HATTORRI Y.; YAMASHITA H. Upregulation of hypothalamic nitric
oxide synthase gene expression in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetologia,
V. 41, p. 640-648, 1998.
SCHOENLE, E. J.; SCHOENLE, D.; MOLINARI, L.; LARGO, R. H. Impaired
intellectual development in children with type 1 diabetes: association with HbA(1c),
age at diagnosis and sex. Diabetologia, V. 45, p. 108-114, 2002.
SIMA, A. A. F.; KAMIYA, H.; LI, Z. G. Insulin, C-peptide, hyperglycemia and central
nervous system complications in diabetes. European Journal of Pharmacology, V.
490, p. 187-197, 2004.
SLATTER, D. A.; BOLTON, C. H.; BAILEY, A. J. The importance of lipid-derived
malondialdehyde in diabetes mellitus. Diabetologia, V. 43, p. 550–557, 2000.
STEWART, T. L.; STEWART, A. D.; MICHEL, M. D.; BLACK AND P. P. A.
HUMPHREY. Evidence that nitric oxide causes calcium-independent release of [3H]
dopamine from rat striatum in vitro. Journal of Neurochemistry, V. 66, p. 131–137,
1996.
SZKUDELSKI T. the mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the
rat pancreas. Physiological Research, V. 50, p. 536-546, 2001.
THIEL, C. M.; HUSTON, J. P.; SCHWARTING, R. K. Hippocampal acetylcholine and
habituation learning. Neuroscience, V.85, n. 4, p.1253-1262, 1998.
THIEL, C. M.; MULLER, C. P.; HUSTON, J. P.; SCHWARTING, R. K. High versus
low reactivity to a novel environment: behavioural, pharmacological and
neurochemical assessments. Neuroscience, V. 93, n. 1, p. 243-251, 1999.
TRABER, M. G.; ARAI, H. Molecular mechanisms of vitamin E transport. Annual
Reviews of Nutrition. V. 19, p. 343-355, 1999.
TUTUNCU, N. B.; BAYRAKTAR, M.; VARLI, K. Reversal of defective nerve
conduction with vitamin E supplementation in type 2 diabetes: a preliminary study.
Diabetes Care, V. 21, n. 11, p. 1915-1918, 1998.
TUZCU, M.; BAYDAS, G. Effects of melatonin and vitamin E on diabetes-induced
learning and memory impairment in rats. European Journal of Pharmacology, V. 537,
p. 106-110, 2006.
UETA, Y.; LEVY, A.; CHOWDREY, H. S.; LIGHTMAN, S. L., Water deprivation in the
rat induces nitric oxide synthase (NOS) gene expression in the hypothalamic
paraventricular and supraoptic nuclei. Neuroscience Research, V. 23, p. 317-319,
1995.
VAN DAM, P. S.; VAN ASBECK, B. S.; BRAVENBOER, B.; VAN OIRSCHOT, J. F. L.
M.; GISPEN, W. H.; MARX, J. J. M. Nerve Function and Oxidative Stress in Diabetic
and Vitamin E-Deficient Rats. Free Radical Biology and Medicine, V. 24, n. 1, p. 18-
26, 1997.
VIANNA, M. R.; IZQUIERDO, L. A.; BARROS, D. M.; DE SOUZA, M. M.;
RODRIGUES, C.; SANT'ANNA, M. K.; MEDINA, J. H.; IZQUIERDO, I.
Pharmacological differences between memory consolidation of habituation to an
open field and inhibitory avoidance learning. Brazilian Journal Medical Biological
Research, V. 342, n. 2, p. 233-240, 2001.
VINCENT, S. R. & KIMURA H. Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the
rat brain. Neuroscience, V. 46, p. 755-784, 1992.
VINSON, J. A.; STARETZ, M. A.; BOSE, P.; KASSM, H. M. In vitro and in vivo
reduction of erytrocyto sorbitol by ascorbic acid. Diabetes, V. 38, p. 136-141, 1989.
WANG H.; MORRIS J. F. Constitutive nitric oxide synthase in hypothalamus of
normal and hereditary diabetes insipidus rats and mice: role of nitric oxide in osmotic
regulation and its mechanism. Endocrinology, V. 135, n. 5, p. 1745-1751, 1996.
WEST, A. R.; GALLOWAY, M. P., Endogenous nitric oxide facilitates striatal
dopamine and glutamate efflux in vivo: role of ionotropic glutamate receptor-
dependent mechanisms. Neuropharmacology, V. 36, p. 1571-1581, 1997.
YOSHIDA, M.; KIMURA, H.; KYUKI, K; ITO, M. Effect of combined vitamin E and
insulin administration on renal damage in diabetic rats fed a high cholesterol diet.
Biological and Pharmaceutical Bulletin, V. 28, n. 11, p. 2080-2086, 2005.
ZANONI J. N.; BUTTOW N. C.; BAZZOTTE R. B.; MIRANDA NETO M. H. Evaluation
of the population of NADPH-diaforase-stained and myosin-V myenteric neurons in
the ileum of chronically streptozotocin-diabetic rats treated with ascorbic acid.
Autonomic Neuroscience : Basic & Clinical, V. 104, n. 1, p. 32-38, 2003.
ZHENG, H.; MAYHAN, W. G.; BIDASEE, K. R.; PATEL, K. P. Blunted nitric oxide-
mediated inhibition of sympathetic nerve activity within the paraventricular nucleus in
diabetic rats, American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and
Comparative Physiology, V. 290, n. 4, p. R992-R1002, 2006.
Anexo
Effects of vitamin E chronic administration on memory and NOS-
producing neurons in the brain of streptozotocin-induced diabetic rats.
D. Comin
1
; L. Gazarini
1
; J.N. Zanoni
2
, H. Milani
1
; R.M.W. Oliveira
1*
.
State University of Maringá,
1
Department of Pharmacology,
2
Department of
Mophophysiological Sciences, Maringá, Brazil
*corresponding author: rmmwolive[email protected]
State University of Maringá, Department of Pharmacology
Av. Colombo 5790, CEP 87020-900
Maringá, Paraná, Brazil
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Abstract
In the present study, we investigated the effect of chronic vitamin E
administration on nitric oxide (NO)-producing neurons in the brain of streptozotocin
(STZ)-induced diabetic rats. We further evaluated the effect of diabetes and vitamin E
treatment on experimentally anxiety and memory processes using the elevated plus
maze (EPM) Trial 1/2 protocol. Fifty adult Wistar rats were divided into four groups:
normoglycemics (N), normoglycemics treated with vitamin E (NVE), diabetics (D) and
diabetics treated with vitamin E (DVE). Diabetes mellitus was induced by a single
intravenous injection of STZ (35 mg/kg). VE (100 mg/Kg) or vehicle, were
administered by oral route (gavage, 1 ml/Kg) everyday during 7 weeks. After
behavioral testing, the brains of the animals were removed and the striatum,
paraventricular nucleus of hypothalamus (PVN), supraoptic nucleus (SON) and
dorsolateral periaqueductal grey matter (DLPAG) were analysed for NADPH-
diaphorase histochemistry. STZ-diabetic rats presented a decreased locomotor
activity and cognitive impairments when compared to its normoglycemic controls in
the EPM Trial 1/2 test. A significant increase in the soma area of NADPH-d positive
neurons was detected in the striatum, PVN, SON and DLPAG while the number of
NADPH-d positive neurons was increased only in the striatum and PAG of STZ-
diabetic rats. Vitamin E chronic treatment decreased the soma area of NADPH-d
neurons in the PVN and SON. It also improved the cognitive deficits observed in
STZ-diabetic rats.
Keywords: diabetes, streptozotocin, elevated plus maze trial 1/2, NADPH-
diaphorase, vitamin E
Introduction
Diabetes mellitus, a common metabolic disorder, is characterized by
hyperglycemia as a result of deficient production or action of insulin. Diabetes has
been associated with metabolic, microvascular and neuronal tissue damage, causing
profound changes in the peripheral and central nervous system (CNS) (Gispen and
Biessels, 2000; Sima, 2004). Furthermore, impaired cognitive functions and,
neurochemical and brain structural abnormalities are reported to occur both in
diabetic patients and streptozotocin(STZ)-induced diabetic rodents (Allen et al., 2004;
Sima, 2004). In diabetic rats, behavioral changes such as increased anxiety,
reduced ambulation and low locomotor activity have also been described
(Ramanathan et al., 1998).
The pathogenesis of the CNS changes observed in diabetes is multifactorial
and may involve microvascular dysfunction and oxidative stress (Patil et al., 2006).
Persistent hyperglycemia may cause high production of free radical and reactive
oxygen species (ROS) (Al-Shamsi et al., 2004; Mastrocola et al., 2005). ROS are
formed as a consequence of the incomplete conversion of oxygen to water during
respiration in aerobic organisms. Because the instability of ROS, they can react with
any cellular component, contributing to increased neuronal death through protein
oxidation, DNA damage, and peroxidation of membrane lipids (Hawkins and Davies,
2001). Elevated levels of lipidic peroxidation and glycoxidation products confirm the
induction and/or the increase of oxidative stress observed in diabetes (Baynes,
1991).
There are two common mechanisms that lead to increased oxidative stress in
diabetes: one of them is increased free radical production during autoxidation of
glucose and the other is the hyperglycemia-induced reduction in the levels of
protective endogenous antioxidants such as vitamins A, E, C and gluthation and,
decrease in the activity of antioxidant enzymes such as glutathione peroxidase (Al-
Shamsi et al., 2004). Therefore, an increased free radical production and a reduced
activity of antioxidant defense system occur in diabetes and hence tissue damage is
facilitated (Hawkins and Davies, 2001). The oxidative damage to various brain
regions is believed to contribute to morphological abnormalities and memory
impairments observed in diabetic animals (Fukui et al., 2001).
Nitric oxide (NO), a free radical gas, is a highly reactive molecule (Dawson et
al., 1994). It is produced by nitric oxide synthase (NOS) during the conversion of L-
arginine to citrulline and it acts as a neurotransmitter and a biological messenger in
the body (Moncada and Higgs, 1993; Dawson et al. 1994). Three isoforms of NOS
exist and include neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) and inducible
NOS (iNOS) (Bredt et al., 1991). Of these, nNOS is the main isoform expressed in
the brain (Moreno-López et al., 2000). Neuronal NOS is localized in the cerebral
cortex, striatum, hippocampus, hypothalamic nuclei and midbrain periaqueductal gray
matter (PAG) among other brain structures (Vincent and Kimura, 1992). Because of
its wide distribution in the CNS, NO has been implicated in several brain functions,
such as neural signaling, analgesia, regulation of autonomic and osmotic functions,
learning and memory. However, in pathological conditions, NO acts as a major toxic
mediator when overproduced (Dawson and Dawson, 1998). Sustained
overproduction of NO, and the consequent increase of its metabolite, the oxygen free
radical peroxynitrite, have been implicated in neural damage occurring in acute and
chronic brain pathologies including Alzheimer disease (Heneka et al., 2001),
epilepsia (Gonzalez-Hernadez et al., 2000) and ischemia (Murphy and Gibson,
2007).
Several works emphasized a potential role for NOS in diabetes. Shankar et al.,
(1998) have demonstrated that acute inhibition of CNS NOS induces hyperglycemia,
insulin resistance and defective insulin secretion, recapitulating the cardinal features
of diabetes. In addition, changes in nNOS expression have been demonstrated in
various studies. For example, an increased mRNA nNOS expression and NOS
activity have been described in the hypothalamic paraventricular (PVN) and
supraoptic (SON) nuclei (Wang and Morris, 1996; Serino et al., 1998) as well as in
the dorsolateral PAG (DLPAG) (Jang et al., 2003) of STZ-diabetic animals.
Otherwise, a decreased nNOS mRNA and protein levels have been observed in the
cortex and hippocampus of STZ-diabetic rats (Yu et al., 2000; Reagan and McEwen,
2002).
Studies in animals revealed that some of diabetes-related functional and
morphological abnormalities could be prevented by antioxidants. In this way, it has
been shown that vitamin E, a chain-breaking antioxidant, prevented lipid peroxidation
in sciatic nerve (Scholz et al., 1997) and improved some metabolic and biochemical
parameters in STZ-diabetic rats (Baydas et al., 2002; Al-Shamsi et al., 2006).
Recently, Tuzcu and Baydas (2006) have demonstrated that vitamin E revert the
decrease on brain glutathione, reduced lipidic peroxidation in the hippocampus and
frontal cortex and, ameliorated learning and memory performance of rats submitted
to Morris water maze model.
Based on above findings, the present study was aimed to evaluate the effect
of vitamin E on nNOS-producing neurons on STZ-diabetic rats. Nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate-diaphorase (NADPH-d) histochemistry was used to localize
nNOS, since NADPH-d positive neurons are the same as those containing NOS
(Hope et al., 1991). In addition, the elevated plus maze (EPM) Trial 1/2 protocol was
used to evaluate the effects of experimental diabetes on anxiety and memory
processes in the animals.
Material and Methods
Animals
Fifty male Wistar rats (Rattus norvegicus), 90 days old (290-300 gr) were
housed five per cage and maintained on a 12-12 h light-dark cycle in a controlled
temperature (23±1ºC) room, with free access to food and water.
All procedures were conducted in accordance with the Brazilian Society of
Neuroscience and Behavior Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals
which comply with international laws. All efforts were made to minimize animal
suffering (protocol number CEEA 22/2007).
Treatment
In the beginning of the study, the animals were randomly divided in two
groups: normoglycemics and diabetics.
Diabetes was induced in the animals after 14 h fast through an intravenous
injection of STZ (Sigma, St. Louis, MO, USA) 35 mg/kg, dissolved in citrate buffer pH
4.5 (10 mM). Control animals received saline injection. Two days after STZ
administration, blood glucose concentrations were determined by the glucose
oxidative method (Kit Gold Analisa, Biosystems, Barcelona, Spain). Rats with
glycaemia above 477 mg/dl were declared diabetic.
At this point, the animals were then randomly divided in four groups:
normoglycemics (N), normoglycemics treated with vitamin E (NVE), diabetics (D) and
diabetics treated with vitamin E (DVE).
Rats received daily vitamin E 100 mg/Kg or vehicle (olive oil) 0.1 ml/Kg, by
oral route (gavage) during 7 weeks. The dose of vitamin E was based on previously
published data (Görgun et al., 2002; Baydas et al., 2002; Tuzcu and Baydas, 2006).
Animal’s body weight was assessed weekly and diabetic state was
reassessed after 7 weeks just prior to sacrificing the animals.
Behavioral Procedure – The Elevated Plus Maze Trial 1/2 protocol
Behavioral tests were performed in a room illuminated with a dimly red light
(40 W), during diurnal phase between 1:00 p.m. and 6:00 p.m. All procedures were
recorded by a video camera connect to both monitor and video recording system
installed in an adjacent room. Each experimental group compraised 9-11 rats.
The EPM was made of wood and consisted of two opposite open-arms, 50 cm
x 10 cm (surrounded by a 1 cm high Plexiglas edge) and two enclosed-arms (50 cm x
10 cm x 40 cm), set up 50 cm above the floor. The junction area of the four arms
(central plataform) measured 10 cm x 10 cm. In the EPM Trial 1/2 protocol, after the
initial exploration of the whole apparatus (Trial 1), rodents express increased
inhibitory avoidance response during retesting 24 h later (Trial 2). While the animal
exploration in Trial 1 is related to anxiety levels, the performance in Trial 2 is thought
to reflect the acquisition of spatial memory (Bertoglio and Carobrez, 2005).
For Trial 1, rats were placed at the end of the enclosed arm and left to explore
the maze for 5 min. Twenty four hours later, the animals were retested in the EPM
(Trial 2). A trained observer scored the following behavioral parameters from Trial 1
and Trial 2: the number of the open arm and enclosed entries and the time spent in
the open and enclosed arms. These measures were used to calculate the
percentage of open arm entries (%OAE= 100×open/total entries) and the percentage
of time (%OAT= 100xopen/total time) spent in the open arms, for each animal. The
number of stretched attend postures (SAPs) in which the rats stretches forward and
the then retracts to its original position before reaching the open arms, performed by
rats from the central platform or enclosed arms towards open arms, was also
recorded.
NADPH-diaphorase histochemistry
Immediately after behavioral testing the animals were anesthetized with an
overdose of pentobarbital (Thiopentax, Cristália, SP, Brazil) and perfused
transcardially with saline, followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M saline
phosphate buffer (PBS, pH 7.4). Brains were removed and postfixed over 2 h in 4%
paraformaldehyde and stored for at least 48 h in 30% sucrose for cryoprotection. The
brains were sectioned serially into 40 µm coronal sections with a freezing microtome
(Criocut, Leica CM 1850) and collected in quadruplicate in vials containing cold 0.1 M
PBS.
For NADPH-d staining, the free floating sections were incubated in 0.1 M PBS
containing 0.5% Triton X-100, 1 mg/ml
β-NADPH and 0.25 mg/ml nitro blue
tetrazolium (NBT) at 37ºC, for 60 min. All reagents were obtained from Sigma (St
Louis, MO). After successively washes with 0.1 M PBS, the sections were mounted
onto gelatinized glass slides, air-dried, cleared with xylene and cover-slipped with
Permount.
Cell counting and neuronal area analysis
For each experimental group, 2-3 sections from 4-5 animals, containing the
striatum (Bregma -6.72 to -7.04 mm), PVN and SON (Bregma -1.40 to -1.80 mm)
and, DLPAG (Bregma -1.60 to -1.00 mm) were chosen for analysis, accordingly to
the stereotaxic atlas of Paxinos and Watson (1997).
For each region, the number of NADPH-d positive neurons was counted in
areas of fixed size, using the computerized image analysis system Image-Pro
Plus
5.0 (Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD). The size of the unit areas in which
cells were counted was chosen according to the extension of the region under
analysis, in order to examine the whole area and to avoid repeated measurements.
For the striatum and PAG, neurons were counted in areas of 0.06 mm
2
, while for
PVN and SON, an area of 0.02 mm
2
was used.
The total number of NADPH-d positive neurons was counted bilaterally under
a light microscope (Olympus BX41) coupled to a digital camera. To avoid bias during
counting and measurements, the slides were coded. The results were expressed as
the mean number of NADPH-d cells/mm
2
of the area of the specific region.
In addition, the areas of individual soma of NADPH-d positive neurons
localized within the anatomic boundaries of striatum, PVN, SON and DLPAG were
manually outlined with the help of the computer mouse and estimated (Murata and
Masuko, 2003). Estimations were carried out on 10 to 20 neurons bilaterally, in 2-3
sections for each animal. Thus, on average 400 neurons were studied from each
anatomic brain area in experimental groups.
Statistical analysis
Data were expressed as mean±S.E.M. Between group differences in body
weight, blood glucose, cell counting and soma area were analyzed by the Student t
test or oneway analysis of variance (ANOVA). For behavioral analysis data were
compared by a repeated measure ANOVA, with “state” (normoglycemics and
diabetics) and “treatment” (vehicle and vitamin E) as the independent factors and
“day” (Trial 1 and Trial 2) as the repeated measure. When variances among groups
were not homogeneous, the raw data were log (data+1) transformed.
The statistical approaches were followed by the Duncan test (P<0.05) and
were performed using the Statistica
software (StatSoft Inc., Tulsa, Oklahoma,
USA).
Results
Blood glucose levels and body weight
Table 1 summarizes the characteristics of control and diabetic rats used in the
present study. Streptozotocin injection resulted in the diabetic syndrome verified by
the presence of polydypsia, polyuria (data not shown), hyperglycemia and weight
loss in the diabetic animals from groups DV and DVE compared to normoglycemics
(N and NVE). At the beginning, the mean blood glucose level for the normoglycemic
group was significantly lower than the blood glucose level of the diabetic group
(P<0.001). By the end of 7 weeks, blood glucose levels of DV and DVE groups
remained significantly elevated compared to control groups (ANOVA, F
3,40
=522.3,
P<0.001).
There was a significant weight loss in streptozocin-induced diabetic rats
compared to control groups (F
7,81
= 38,41). Nomoglycemic rats that received vitamin
E gained weight compared to NV group.
Vitamin E 7 weeks treatment did not change the final blood glucose levels or
body weight of the animals throughout the experiment period (P<0.05).
The elevated plus maze (EPM) Trial 1/2
Figure 1 illustrates the behavioral performance of rats submitted to EPM Trial
1 and Trial 2.
The overall ANOVA comparisons showed significant “day” effect for %OAE
and %OAT (F
1,37
=17.4, p<0.001 and F
1,37
=19.1, p<0.001, respectively). Further post-
hoc comparisons showed a decrease in both %OAE and %OAT on the EPM Trial 2
exposure for N and DVE groups (P<0.05) when compared to Trial 1. There was no
significant differences among the groups considering the behaviors scored in Trial 1.
ANOVA also showed a significant “state” effect on the enclosed arm entries
(EAE; F
1,37
=9.8, p=0.002). However, only a marginally significant (F
1,37
=2.33, P<0.1)
“day” effect was observed. Furthermore, diabetic rats treated (DVE) or not (D) with
vitamin E presented a significant decrease in the number of EAE both in Trial 1 and
Trial 2 exposures (P<0.05) compared to control groups.
Regarding SAPs, similar to EAE parameter, a significant “state” effect was
revealed by ANOVA (F
1,37
=31.7, P<0.001). In addition, there was an interaction
between “day” and “state” (F
1,37
=4.57, P=0.04). Further pairwise comparison showed
a decrease in the SAPs in Trial 1 and Trial 2 for D and DVE groups compared to
controls (P<0.05).
NADPH-diaphorase neurons
The distribution and staining patterns of NADPH-d positive cells in striatum,
PVN, SON and DLPAG were in accordance with previous works (Vincent and
Kimura, 1992; Rodella et al., 1999).
The number of NADPH-d positive cells in the striatum and DLPAG of diabetic
rats were significantly higher (F
3,17
=15.0, P<0.001 and F
3,17
=8.2, P<0.05, respectively)
than that found in controls groups (N and NVE) . No significant difference in the
number of NADPH-d positive neurons was found in the PVN and SON of diabetic rats
(D and DVE) compare to its controls (Figure 2). Chronic treatment with vitamin E
resulted in a significant decrease in the number of NADPH-positive neurons in the
striatum of normoglycemic rats (NVE) compared to its vehicle-treated group (N,
P<0.05).
As seen in figure 3, ANOVA showed a significant increase of the soma areas
of NADPH-d neurons in diabetic groups (D and DVE) for all of analyzed structures:
striatum (F
3,17
=23.8, P<0.001), PVN (F
3,19
=17.6, P<0.001), SON F
3,19
=83.3, P<0.001)
and DLPAG (F
3,18
=13.0, P<0.001). Chronic treatment with vitamin E decreased the
neuronal area in PVN and SON (P<0.05) of normoglycemic rats when compared to
its vehicle-treated controls. Similar results were obtained with diabetic animals;
vitamin E reduced significantly the soma area of NADPH-d neurons in the SON
(P<0.001) while in the PVN ANOVA showed only a marginal significant effect
(P<0.1).
Discussion
The present study evaluated the effects of chronic vitamin E treatment on the
anxiety and memory performance on STZ-diabetic rats using EPM Trial 1/2 protocol.
We further examined the expression of NOS in some brain areas including the
striatum, PVN, SON and DLPAG, using NADPH-d histochemistry. STZ-diabetic rats
presented a decreased locomotor activity and cognitive impairments when compared
to its normoglycemic controls in the EPM Trial 1/2 test. A significant increase in the
soma area of NADPH-d positive neurons was detected in the striatum, PVN, SON
and DLPAG while the number of NADPH-d positive neurons was increased only in
the striatum and PAG of STZ-diabetic rats. Vitamin E chronic treatment not only
decreased the mean soma area of NADPH-d neurons of diabetic rats in PVN and
SON but also it improved the cognitive deficits observed in STZ-diabetic rats.
The EPM Trial 1/2 model has been recognized as an animal model suitable to
evaluate either anxiety- and memory-related behavioral responses (Bertoglio and
Carobrez, 2000). In Trial 1, it is possible to evaluate anxiolytic or anxiogenic effect of
treatments (open arm exploration), as well as the general locomotor activity of the
animals (enclosed arm exploration and SAPs). It has been well established that after
initial exposition (Trial 1), rodents show a significant reduction in open arm
exploration during retesting (Trial 2). This latter finding is thought to reflect the
acquisition of spatial memory related to exploration of potentially dangerous areas of
the maze–the open arms (Bertoglio and Carobrez, 2000). In the present study, STZ-
diabetic animals presented no change in the anxiety parameters evaluated in the
EPM in Trial 1. Our results are in accordance with Hilakivi-Clarke et al. (1990) and
Khanam and Pillai (2007) that reported no significant alteration in anxiety levels in
diabetic mice or rats, respectively. In contrast, other studies have demonstrated that
diabetic rats presented significantly more anxiogenic activity in comparison to non-
diabetic in the open-field, EPM, zero maze and social interaction tests (Ramanathan
et al., 1998; Grzeda et al., 2007). These altered behaviors were attributed to the
changes in brain monoamines and correlated with the intensity of hyperglycemia
(Ramanathan et al., 1998). Indeed, in diabetic rats altered central catecholaminergic
and serotonergic system in different brain regions were reported (Ramanathan et al.
1997), which are mostly involved in anxiety state. However, the available literature
focusing on the behavioral changes related to anxiety or/emotional responsiveness in
experimental diabetic condition is still scarce. Further studies using other behavioral
models for anxiety using diabetic animals may clear the presented inconsistencies.
Deficits in cognitive tasks such as performance in the Morris water maze
(Biessels et al., 1998) and active and passive avoidance in T-maze (Biessels and
Gispen, 2005) have been demonstrated in STZ-diabetic rats. Our results showed that
normoglycemic rats presented a significant reduction in open-arm exploration with no
changes in EAEs or SAPs in the EPM in Trial 2. This effect is in agreement with the
suggestion that previous EPM experience modifies EPM Trial 2 performance and
shows that although rats were not exiting to open arms, there were as many
movements toward open arms as in Trial 1. Conversely, STZ-diabetic animals
showed no change in the open arm indexes (%OAE and %OAT) in Trial 2 compared
to Trial 1, reflecting a possible disruption in learning of information concerning the
spatial environment in the EPM. It was also found in the present study that vitamin E
treatment ameliorated cognitive performance of STZ-diabetic rats, since significant
reductions in the open arm exploration were observed in Trial 2. These results
confirm previous reports that vitamin E prevented the learning and memory deficits of
STZ-diabetic rats submitted to a spatial version of Morris water maze (Tuzcu and
Baydas, 2006).
The mechanisms of vitamin E in preventing cognitive deficits are not still clear.
Tuzcu and Baydas (2006) have suggested that the oxidative stress has a central role,
since vitamin E reduced lipid peroxidation and spared glutathione depletion in the
hippocampus and frontal cortex of STZ-diabetic rats. In addition, the observed
deficits in learning and memory in diabetic rats have been associated with
hippocampal synaptic plasticity involving long term potentiation (LTP) and N-methyl-
D-aspartic acid (NMDA) receptors (Reagan and McEwen, 2002; Grzeda et al., 2003).
In the present study, STZ-diabetic animals presented a decreased locomotor
activity in the EPM, seen as a decrease in the EPM number of EAEs and SAPs. In
parallel, an increased number of NADPH-d neurons was observed within distinct
brain areas, striatum and DLPAG, of diabetic animals when compared to the
correspondent areas in normoglycemics. In the striatum, NO has been shown to
modulate motor behavior, probably by interfering with dopaminergic
neurotransmission (Del Bel et al., 2002). In this way, decreased locomotor activity in
diabetic animals has been thought to be related to low dopamine release in the
striatal dopaminergic system (Murzi et al., 1996; Mardon et al., 1999). Many studies
suggest that, under physiological conditions, NO increases striatal dopamine by
facilitating its release (Stewart et al., 1996; West and Galloway, 1998) and/or by
decreasing its reuptake (Guevara-Guzman et al., 1994; Kiss and Vizi, 2001).
Therefore, the increased number of NADPH-d neurons observed in the striatum of
STZ-diabetic rats in the present work may represent a compensatory mechanism
necessary to balance the decreased dopaminergic neurotransmission. However,
changes in NOS expression may result in changes in other monoamine levels, since
NO has the ability to modulate synaptic function and influence the release of various
other neurotransmitters in the brain (Dawson and Dawson, 1994).
The activity of NOS has been widely localized in the hypothalamus,
particularly in the PVN and SON supporting a neuromodulatory role of NO in
regulation of body water and electrolyte homeostasis (Wang and Morris, 1996). Along
with the above, it has been reported that expression of nNOS gene in the
hypothalamic PVN and SON is increased under osmotic stimuli such as dehydration
and salt loading (Kadowaki et al., 1994; Ueta et al., 1995). Peripheral administration
of STZ is known to cause marked hyperglycemia and plasma hyperosmolality.
Accordingly, altered NOS expression has been described in the PVN and SON of
STZ-diabetic animals. However, while some authors have shown increased nNOS
gene expression and NADPH-d positive neurons number (Wang and Morris, 1996;
Serino et al., 1998), others demonstrated a decreased basal neuronal activity in the
PVN and SON of diabetic animals (Zheng et al., 2005). The altered expression of
NOS in the PVN and SON is believed to be involved in the production and/or
secretion of vasopressin and oxytocin (Luo et al., 2002). Despite functional evidence
of a neuromodulatory role of NO in osmotic regulation, in the present work, we
observed no changes in the number of NADPH-d positive neurons in PVN and SON
of STZ-diabetic rats. These findings, however, not preclude a role of NOS in
hypothalamic modulation in diabetes; the reason for the variance in the results from
our group and from other studies probably reflects differences in the model used,
duration of diabetes and severity of hyperglycemia or other factors. It is also plausible
to argument that the NOS regulatory hypothalamic system may adapted to the
continuously raised osmotic pressure observed in diabetes.
The DLPAG is believed to be an important component in the endogenous pain
control system (Lovick and Key, 1996). Enhanced expression of nNOS has been
demonstrated in DLPAG after nociceptive visceral stimulation (Rodella et al., 1998)
and administration of 7-nitroindazole, a nNOS inhibitor, was shown to have anti-
nociceptive effects in mice (Moore et al., 1993). Recently, Jang et al. (2003) have
demonstrated an enhanced expression of nNOS in the DLPAG of STZ-induced
diabetes rats. The authors suggested that the increased NOS activity in the DLAPG
might be related to allodynia and hyperalgesia observed in diabetic neuropathy. Our
results confirm that NOS expression is increased in the DLPAG of STZ-diabetic rats,
expressed by the increased number and area of NADPH-d positive neurons and, and
support the role for NO in modulation of pain in the DLPAG.
Morphometrical measurements such as soma neuronal area may furnish
information on the functional activity of the cells (Bestetti et al., 1987). For example,
increased activity of noradrenergic neurons results in increased transcription of
tyrosine hydroxilase gene resulting in production and accumulation of noradrenaline
within such neurons (Kandel et al., 2000). The increased Na
+
ions and metabolites
inside a cell would therefore, causes increased water intake due to osmosis resulting
in swelling and increased cell sizes (Glyn, 1985). The NADPH-d diaphorase reaction
has proven a useful histochemical tool to explore activity-dependent changes in NO-
producing neurons of specific brain areas (Morris et al., 1997). Herein, STZ-diabetic
animals presented significant larger soma areas of NADPH-d neurons in the striatum,
PVN, SON and DLPAG. Curiously, similar results were obtained by Zanoni et al.
(2003) after investigating NADPH-d neurons in the myenterius from chronically STZ-
diabetic rats. Although, diabetes did not increase the population of NOS myenteric
neurons, the area of NADPH-d positive neurons was greatly increased when
compared to nondiabetic rats. As observed in the myenterius, diabetes could
promote an increase in the NOS expression in the brain of STZ-diabetic rats and a
larger production of NO, with consequent increase in the NADPH-d positive neurons
profile. Therefore, the distinct morphometrical characteristics of NADPH-d neurons
between diabetic and controls may imply a more active metabolism of NO in
diabetes.
Vitamin E has been shown to reduce the degeneration of hippocampal cells
after brain ischemia (Hara et al., 1990) and enhanced the recovery of motor function
after spinal cord injury (Anderson et al., 1988). Vitamin E can also ameliorate deficits
in learning and memory in rodents (Fukui et al., 2001; Tuzcu and Baydas, 2006). In
the present study, STZ-diabetic animals showed a poor cognitive performance in
EPM Trial 2. Furthermore, these animals presented an increase in the soma area of
NADPH-d neurons in striatum, PVN, SON and DLPAG. We believe that these effects
are, at least in part, mediated by oxidative stress since chronic treatment with vitamin
E ameliorates the cognitive deficits observed and significantly decreased the soma
area of NADPH-d neurons in the PVN and SON of diabetic rats. However, the later
result must be interpreted with prudence because it is not be specific to diabetes
condition, since a similar reduction in the soma area of NADPH-d neurons was also
observed in the same brain areas of normoglycemic rats treated with vitamin E.
In conclusion, the present findings extend previous studies that have
demonstrated that chronic administration of vitamin E ameliorates memory
acquisition and retrieval in STZ-diabetic rats. Our results further revel cellular
alterations in NADPH-d positive neurons in the striatum, PVN, SON and DLPAG,
which may contribute to locomotor and cognitive deficits observed in diabetic rats.
Legends for tables and figures
Table 1: Blood glucose levels and weight (means ± SEM) in rats at the onset and at
the end of the experiment. N=normoglycemics, NVE=normoglycemics treated with
vitamin E, D=diabetics and DVE= diabetics treated with vitamin E.
Means ± SEM followed by different letters in the same column are statistically
different (P<0.05) according to Student t test or ANOVA.
Figure 1: Effects on the open-arm exploration (A and B), enclosed arm entries (C)
and stretched attend postures (SAPs, D) of vehicle or vitamin E (100 mg/Kg) chronic
administration in STZ-diabetic rats tested in the elevated plus maze (EPM) Trial 1/2
protocol (n=8-11). N=normoglycemics, NVE=normoglycemics treated with vitamin E,
D=diabetics and DVE= diabetics treated with vitamin E. Data are presented as mean
± SEM. *P<0.05 compared to respective group in Trial 1 and
#
P<0.05 compared to
normoglycemic control groups (N and NVE).
Figure 2: Effects of vitamin E chronic administration in the number of NADPH-d
positive neurons in the striatum, paraventricular (PVN) and supraoptic (SON) nuclei
of hypothalamus and dorsolateral periaqueductal gray matter (DLPAG) of STZ-
diabetic rats. *P<0.05 and **P<0.001 compared to normoglycemic control group (N).
a
P<0,05 compared to normoglycemic control group (N). In the right column,
representative photomicrographs of NADPH-d positive neurons. Scale bar=100 µm
Figure 3: Effects of vitamin E chronic administration in the soma area of NADPH-d
neurons in the striatum, PVN, SON and DLPAG of STZ-diabetic rats. **P<0.001
compared to normoglycemic groups (N and NVE),
a
P<0.05 compared to
normoglycemic vehicle treated group (N),
b
P<0.001 and
c
P<0.1 compared to diabetic
vehicle group (D). Scale bar=200 µm
References
Al Shamsi, M.S.; Amin, A.; Adeghate, E., Beneficial effect of vitamin E on the
metabolic parameters of diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 261: 35-42; 2004.
Al-Shamsi, M.; Amin, A; Adeghate, E., Vitamin e ameliorates some biochemical
parameters in normal and diabetic rats. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1084: 411-31; 2006.
Allen, K.V.; Frier, B.M.; Strachan, M.W., The relationship between type 2 diabetes
and cognitive dysfunction: longitudinal studies and their methodological limitations.
Eur. J. Pharmacol. 490: 169-175; 2004.
Anderson, D.K.; Waters, T.R.; Means, E.D., Pretreatment with alpha-tocopherol
enhances neurologic recovery after experimental spinal cord compression injury. J.
Neurotrauma. 5: 61-67; 1988.
Baydas, G.; Canatan, H.; Turkoglu, A., Comparative analysis of the protective
effects of melatonin and vitamin E on streptozotocin-induced diabetes mellitus. J.
Pineal Res. 32: 225-230; 2002.
Baynes, J.W., Role of oxidative stress in development of complications in diabetes.
Diabetes. 40: 405-412; 1991.
Bertoglio, L.J.; Carobrez, A.P., Previous maze experience required to increase
open arms avoidance in rats submitted to the elevated plus-maze model of anxiety.
Behav. Brain Res. 108: 197-203; 2000.
Bestetti, G.; Hofer, R.; Rossi, G.L., The preoptic-suprachiasmatic nuclei though
morphologically heterogeneous are equally affected by streptozotocin diabetes.
Exp. Brain Res. 66: 74-82; 1987.
Biessels, G.J.; Kamal, A.; Urban, I.J.; Spruijt, B.M.; Erkelens, D.W.; Gispen, W.H.,
Water maze learning and hippocampal synaptic plasticity in streptozotocin-diabetic
rats: effects of insulin treatment. Brain Res. 800: 125-135; 1998.
Bredt, D.S.; Glatt, C.E.; Hwang, P.M.; Fotuhi, M.; Dawson, T.M.; Snyder, S.H.,
Nitric oxide synthase protein and mRNA are discretely localized in neuronal
populations of the mammalian CNS together with NADPH diaphorase. Neuron. 7:
615-624; 1991.
Dawson, T.M.; Dawson, V.L.; Snyder, S.H., Molecular mechanisms of nitric oxide
actions in the brain. Ann. N. Y. Acad. Sci. 738: 76-85; 1994.
Dawson, V.L.; Dawson, T.M., Nitric oxide in neurodegeneration. Prog. Brain Res.
118: 215-229; 1998.
Del Bel, E.A.; Souza, A.S.; Guimaraes, F.S.; da Silva, C.A.; Nucci-Da-Silva, L.P.,
Motor effects of acute and chronic inhibition of nitric oxide synthesis in mice.
Psychopharmacologia. 161: 32-37; 2002.
Fukui, K.; Onodera, K.; Shinkai, T.; Suzuki, S.; Urano, S., Impairment of learning
and memory in rats caused by oxidative stress and aging and its prevention by
vitamin E. Ann. N.Y. Acad. Sci. 949: 275-284; 2001.
Gispen, W.H.; Biessels, G.J., Cognition and synaptic plasticity in diabetes mellitus.
Trends Neurosci. 23: 542-549; 2000.
Glyn, I.M. The Na/K cotransporting adenosine triphosphate. In: The enzymes of
biological membranes (Martonosi A, ed.), pp 34-114. New York: Plenum Press;
1985.
Gonzalez-Hernandez, T.; Garcia-Marin, V.; Perez-Delgado, M.M.; Gonzalez-
Gonzalez, M.L.; Rancel-Torres, N.; Gonzalez-Feria, L., Nitric oxide synthase
expression in the cerebral cortex of patients with epilepsy. Epilepsia. 41: 1259-
1268; 2000.
Gorgun, F.M.; Gumustas, M.K.; Altug, T.; Kokoglu, E., Vitamin E supplementation
in streptozotocin-treated rats alters cerebellar and plasma nitric oxide metabolism.
J. Toxicol. Environ. Health A. 65: 631-637; 2002.
Guevara-Guzman, R.; Emson, P.C.; Kendrick, K.M., Modulation of in vivo striatal
transmitter release by nitric oxide and cyclic GMP. J. Neurochem. 62: 807-810;
1994.
Gzreda, E.; Wisniewska, R.J.; Wisniewski, K., Effect of an NMDA receptor agonist
on T-maze and passive avoidance test in 12-week streptozotocin-induced diabetic
rats. Pharmacol. Rep. 59: 656-663; 2007.
Hara, H.; Kato, H.; Kogure, K., Protective effect of alpha-tocopherol on ischemic
neuronal damage in the gerbil hippocampus. Brain Res. 510: 335-338; 1990.
Hawkins, C.L.; Davies, M.J. Generation and propagation of radical reactions on
proteins Biochim. Biophys. Acta. 1504: 196-219; 2001.
Heneka, M.T.; Wiesinger, H.; Dumitrescu-Ozimek, L.; Riederer, P.; Feinstein, D.L.;
Klockgether, T., Neuronal and glial coexpression of argininosuccinate synthetase
and inducible nitric oxide synthase in Alzheimer disease. J. Neuropathol. Exp.
Neurol. 60: 906-916; 2001.
Hilakivi-Clarke, L.A.; Wozniak, K.M.; Duracan, M.J.; Linnoila, M., Behavior of
streptozotocin-diabetic mice in tests of exploration, locomotion, anxiety, depression
and aggression. Physiol. Behav. 48: 429–433; 1990.
Hope, B.T.; Michael, G.J.; Knigge, K.M.; Vincent, S.R., Neuronal NADPH
diaphorase is a nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 2811-2814;
1991.
Jang, M.H.; Shin, M.C.; Koo, G.S.; Lee, C.Y.; Kim, E.H.; Kim, C.J., Acupuncture
decreases nitric oxide synthase expression in periaqueductal gray area of rats with
streptozotocin-induced diabetes. Neurosci. Lett. 337: 155-158; 2003.
Kadowaki, K.; Kishimoto, J.; Leng, G.; Emson, P.C., Up-regulation of nitric oxide
synthase (NOS) gene expression together with NOS activity in the rat
hypothalamo-hypophysial system after chronic salt loading: evidence of a
neuromodulatory role of nitric oxide in arginine vasopressin and oxytocin secretion.
Endocrinology. 134: 1011-1017; 1994.
Kandel, E.R.; Schwartz, J.H.; Jessels, T.H., Neurotransmitters. In: Principles of
neural science, p284. 4
th
edition. New York: McGraw-Hill; 2000
Khanam, R.; Pillai, K.K., Effect of chronic chromium picolinate in animal models of
anxiety and memory. Fundam. Clin. Pharmacol. 21: 531-534; 2007.
Kiss, J.P.; Vizi, E.S., Nitric oxide: a novel link between synaptic and nonsynaptic
transmission. Trends Neurosci. 24: 211–215; 2001.
Lovick, T.A.; Key, B.J., Inhibitory effect of nitric oxide on neuronal activity in the
periaqueductal grey matter of the rat. Exp. Brain Res. 108: 382-388; 1996.
Mardon, K.; Kassiou, M.; Donald, A., Effects of streptozotocin-induced diabetes on
neuronal sigma receptors in the rat brain. Life Sci. 65: 281-286; 1999.
Mastrocola, R.; Restivo, F.; Vercellinatto, I.; Danni, O.; Brignardello, E.; Aragno, M.;
Boccuzzi, G., Oxidative and nitrosative stress in brain mitochondria of diabetic rats.
J. Endocrinol. 187: 37-44; 2005.
Moncada, S.; Higgs, A., The L-arginine-nitric oxide pathway. N. Engl. J. Med. 329:
2002-2012; 1993.
Moore, P.K.; Babbedge, R.C.; Wallace, P.; Gaffen, Z.A.; Hart, S.L., 7-Nitro
indazole, an inhibitor of nitric oxide synthase, exhibits anti-nociceptive activity in the
mouse without increasing blood pressure. Br. J. Pharmacol. 108: 296-297; 1993.
Moreno-Lopez, B.; Noval, J.A.; Gonzalez-Bonet, L.G.; Estrada,C., Morphological
bases for a role of nitric oxide in adult neurogenesis. Brain Res. 869: 244-250;
2000.
Morris, B.J.; Simpson, C.S.; Mundell, S.; Maceachern, K.; Johnston, H.M.; Nolan,
A.M., Dynamic changes in NADPH-diaphorase staining reflect activity of nitric
oxide synthase: evidence for a dopaminergic regulation of striatal nitric oxide
release. Neuropharmacology. 36: 1589-1599; 1997.
Murata, Y.; Masuko, S., Developing patterns of nitric oxide synthesizing neurons in
the rat striatum: histochemical analysis. Brain Res. Dev. Brain Res. 141: 91-99;
2003.
Murphy, S.; Gibson, C.L., Nitric oxide, ischaemia and brain inflammation. Biochem.
Soc. Trans. 35: 1133-1137; 2007.
Murzi, E.; Contreras, Q.; Teneud, L.; Valecillos, B.; Parada, M.A.; De Parada, M.P.;
Hernandez, L., Diabetes decreases limbic extracellular dopamine in rats. Neurosci.
Lett. 202: 141-144; 1996.
Patil, C.S.; Singh, V.P.; Kulkarni, S.K., Modulatory effect of sildenafil in diabetes
and electroconvulsive shock-induced cognitive dysfunction in rats. Pharmacol.
Rep. 58: 373-380; 2006.
Paxinos, G.; Watson, C., The rat brain in stereotaxic coordinates. 3nd. Academic
Press, San Diego, CA; 1997.
Ramanathan, M.; Jaiswal, A.K.; Bhattacharya, S.K., Brain monoamines and
metabolites during early streptozotocininduced diabetes in rats. Biog. Amines. 13:
55-66; 2007.
Ramanathan, M.; Jaiswal, A.K.; Bhattacharya, S.K., Differential effects of diazepam
on anxiety in streptozotocin induced diabetic and non-diabetic rats.
Psychopharmacology (Berl). 135: 361-367; 1998.
Reagan, L.P.; McEwen, B.S., Diabetes, but not stress, reduces neuronal nitric
oxide synthase expression in rat hippocampus: implications for hippocampal
synaptic plasticity. Neuroreport. 13: 1801-1804; 2002.
Rodella, L.; Rezzani, R.; Agostini, C.; Bianchi, R., Expression of NADPH-
diaphorase and colocalization with Fos in the brain neurons of the rat following
visceral noxious stimulation. Brain Res. 834: 173-177; 1999.
Scholz, R.W.; Minicucci, L.A.; Reddy, C.C., Effects of vitamin E and selenium on
antioxidant defense in rat heart. Biochem. Mol. Biol. Int. 42: 997-1006; 1997.
Serino, R.; Ueta, Y.; Tokunaga, M.; Hara, Y.; Nomura, M.; Kabashima, N.; Shibuya,
I.; Hattori, Y.; Yamashita, H., Upregulation of hypothalamic nitric oxide synthase
gene expression in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetologia. 41: 640-648;
1998.
Shankar, R.; Zhu, J.S.; Ladd, B.; Henry, D.; Shen, H.Q.; Baron, A.D., Central
nervous system nitric oxide synthase activity regulates insulin secretion and insulin
action. J. Clin. Invest. 102: 1403-1412; 1998.
Silva, M.T.; Rose, S.; Hindmarsh, J.P.; Jenner, P., Inhibition of neuronal nitric oxide
synthase increases dopamine efflux from rat striatum. J. Neural Transm. 110: 353–
362; 2003.
Sima, A.A., Diabetes underlies common neurological disorders. Ann. Neurol. 56:
459-461; 2004.
Stewart, T.L.; Michel, A.D.; Black, M.D.; Humphrey, P.P., Evidence that nitric oxide
causes calcium-independent release of [3H]dopamine from rat striatum in vitro. J.
Neurochem. 66: 131–137; 1996.
Tuzcu, M.; Baydas, G., Effect of melatonin and vitamin E on diabetes-induced
learning and memory impairment in rats. Eur. J. Pharmacol. 537: 106-110; 2006.
Ueta, Y.; Levy, A.; Chowdrey, H.S.; Lightman, S.L., Water deprivation in the rat
induces nitric oxide synthase (NOS) gene expression in the hypothalamic
paraventricular and supraoptic nuclei. Neurosci. Res. 23: 317-319; 1995.
Vincent, S.R.; Kimura, H., Histochemical mapping of nitric oxide synthase in the rat
brain. Neuroscience. 46: 755-784; 1992.
Wang, H.; Morris, J.F., Constitutive nitric oxide synthase in hypothalamic of normal
and hereditary diabetes insipidus rats and mice: role of nitric oxide in osmotic
regulation and its mechanism. Endocrinology. 137: 1745-1751; 1996.
Wang, H.; Morris, J.F., Effects of oestrogen upon nitric oxide synthase NADPH-
diaphorase activity in the hypothalamo-neurohypophysial system of the rat.
Neuroscience. 88: 151-158; 1999.
West, A.R.; Galloway, M.P., Endogenous nitric oxide facilitates striatal dopamine
and glutamate efflux in vivo: role of ionotropic glutamate receptor-dependent
mechanisms. Neuropharmacology. 36: 1571-1581; 1997.
Yu, W.J.; Juang, S.W.; Chin, W.T.; Chi, T.C.; Chang, C.J.; Cheng, J.T., Insulin
restores neuronal nitric oxide synthase expression in streptozotocin-induced
diabetic rats. Life Sci. 68: 625-634; 2000.
Zanoni, J.N.; Buttow, N.C.; Bazotte, R.B.; Miranda Neto, M.H., Evaluation of the
population of NADPH-diaphorase-stained and myosin-V myenteric neurons in the
ileum of chronically streptozotocin-diabetic rats treated with ascorbic acid. Auton.
Neurosci. 104: 32-38; 2003.
Zheng, H.; Mayhan, W.G.; Bidasee, K.R.; Patel, K.P., Blunted nitric oxide-mediated
inhibition of sympathetic nerve activity within the paraventricular nucleus in diabetic
rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 290: R992-R1002; 2006.
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