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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM AGRONOMIIA
GERMINAÇÃO, VIABILIDADE E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES
DE Cattleya (ORCHIDACEAE)
SILVÉRIO TAKAO HOSOMI
Presidente Prudente – SP
2009
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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM AGRONOMIIA
GERMINAÇÃO, VIABILIDADE E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES
DE Cattleya (ORCHIDACEAE)
SILVÉRIO TAKAO HOSOMI
Dissertação apresentada à Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade
do Oeste Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Agronomia
Área de Concentração: Produção Vegetal
Orientadora:
Prof
a.
Dr
a.
Ceci Castilho Custódio
Presidente Prudente – SP
2009
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FICHA CATALOGRÁFICA
631.521 Hosomi, Silvério Takao.
H827g Germinação, Viabilidade e Armazenamento de
Sementes de Cattleya (Ochidaceae) / Silvério
Takao Hosomi. – Presidente Prudente: [s.n.],
2009.
57 : il.
Dissertação (Mestrado em Agronomia) –
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE:
Presidente Prudente – SP, 2009.
Bibliografia
1. Germinação -- Testes. 2. Tetrazólio –
Testes. 3. Sementes -- Conservação. I. Título.
SILVÉRIO TAKAO HOSOMI
Germinação, Viabilidade e Armazenamento de Sementes de
Cattleya (ORCHIDACEAE)
Dissertação apresentada à Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade
do Oeste Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Agronomia
Presidente Prudente, 23 de junho 2009.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Prof
a.
Dr
a.
Ceci Castilho Custódio
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,
Presidente Prudente - SP.
____________________________________
Prof
a.
Dr
a.
Ana Claudia Pacheco Santos
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,
Presidente Prudente - SP.
____________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Maria Auxiliadora M.Gutierre
Universidade Estadual de Maringá – UEM
Maringá – PR.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Prof
a
. Dra. Ceci Castilho Custódio, que esteve
presente desde meu primeiro contato com o curso até a apresentação da
dissertação, mostrando-se sempre atenciosa e competente.
Ao Prof. Dr. Nelson Barbosa Machado, pela amizade e grande
conhecimento, que muito contribuíram para a realização deste trabalho.
Ao professor e colega de trabalho Prof. Dr. Gustavo Maia Souza, pelo
incentivo e por me apresentar ao curso de Pós-Graduação em Agronomia.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Agronomia da
Unoeste, pelo conhecimento e disponibilidade.
À Keid Ribeiro Kruger, que estando à frente da secretaria tornou a
burocracia menos burocrática.
Aos funcionários dos laboratórios: Sementes, Cultura de Tecidos
Vegetais e Genética Molecular da UNOESTE.
Aos colegas de curso: Paulo, Miléia, Dani, Daniela, Júlio, Fábio, Diego,
Luciana, Maura, Gabriel, Miriam, Luiz Guilherme, Edson, Keila, Sato e Gilson pela
companhia nas aulas e distração nos horários de cafezinho.
À aluna de graduação do curso de Agronomia da Unoeste, Renata
Batista dos Santos, por ter auxiliado nas contagens de sementes dos experimentos
iniciais.
Aos alunos dos cursos de Agronomia e Ciências Biológicas da Unoeste
(Ricardo, Natália, Massako, Toddy, Érica), pela companhia e disposição em aplicar
os conhecimentos que adquiri nos experimentos realizados no Laboratório de
Cultura de Tecidos.
À Direção da Faclepp - Faculdade de Ciências Letras e Educação de
Presidente Prudente e, em especial, à Coordenadora do Curso de Ciências
Biológicas da UNOESTE, Profa. Aparecida Carmen Terazaki, por incentivar a
qualificação do corpo docente.
À Darwin Initiative - Orchid Seed Storage Sustainable Use (OSSSU
Project), uma parceria entre o Royal Botanic Gardens – Kew e a UNOESTE, que
permitiu a execução deste trabalho.
Ao pesquisador do Royal Botanic Gardens - Kew, Phillip Seaton, por ter
me ajudado a entender melhor a importância das pesquisas na área da conservação
de orquídeas.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao casal de professores e pesquisadores Nelson
Barbosa Machado Neto e Ceci Castilho Custódio que são os verdadeiros
idealizadores deste trabalho e por isso merecem receber todos os frutos e sementes
(méritos) desta obra.
À minha família (Glenda, Bia, Shindi e Dani) que entendeu minha
ausência na correria do dia-a-dia. E se eu sempre estive com disposição e humor
para o trabalho no laboratório é porque alguém, em casa, teve que conviver com o
outro lado.
“Qualquer fenômeno biológico só tem sentido quando interpretado sob a
perspectiva evolucionista da seleção natural, caso contrário não terá sentido
nenhum.”
Theodosius Dobzanski
RESUMO
Germinação, Viabilidade e Armazenamento de Sementes de Cattleya
(Ochidaceae)
Sementes extremamente pequenas, associação obrigatória com micorrizas para
germinação natural e processos de polinização especializados são algumas
características comuns entre as orquídeas, grupo morfologicamente heterogêneo
que constitui a maior família de plantas entre as Angiospermas. A degradação de
ambientes naturais pela ação humana tem levado um grande número de espécies
deste grupo à extinção; o que torna a formação de um banco de sementes uma
estratégia de preservação interessante. Desta forma, estudos para entender o
comportamento das sementes quanto à perda da viabilidade durante o
armazenamento e o uso de testes rápidos para a avaliação da viabilidade das
mesmas acabam tornando-se ferramentas importantes. A popularização dos
equipamentos de informática e softwares possibilita o uso de análises de imagens
através da digitalização dos testes de germinação e tetrazólio, uma alternativa
interessante que permite que pequenos produtores auxiliem no processo de
conservação das espécies de orquídeas. Na primeira parte deste trabalho realizou-
se a análise das sementes de Cattleya pré-condicionadas em solução de sacarose e
posteriormente submetidas a concentrações distintas de sais tetrazólio, em
diferentes tempos de exposição, para avaliar a qualidade fisiológica das sementes.
Na segunda parte, dez lotes de sementes foram armazenados em baixa temperatura
e suas viabilidades foram avaliadas pelos testes de germinação e tetrazólio. A
análise da viabilidade das sementes submetidas ao testes de tetrazólio e
germinação através da digitalização de imagens mostrou-se eficiente tanto pela
praticidade como pela possibilidade de controle das contagens. O pré-
condicionamento em solução de sacarose 10% apresentou melhores resultados,
facilitando a identificação das sementes viáveis e soluções de tetrazólio com
concentrações acima de 0,25% e períodos de exposição ao tetrazólio superiores à 6
horas seriam as mais recomendadas. Os resultados demonstraram não haver perda
na viabilidade das sementes armazenadas e em cinco lotes houve diminuição do
IVG e foi alta a correlação entre os testes de tetrazólio com pré-condicionamento em
solução de sacarose e a germinação.
Palavras chave: Germinação -- Testes. Tetrazólio – Testes. Sementes --
Conservação. Análise de imagens
ABSTRACT
Germination, viability and storage of Cattleya seeds (Orchidaceae)
Seeds with extremely reduced size, obligatory association with micorrhyzal fungi for
natural germination and specialized pollination procedures are similar characteristics
among orchids, a morphologic heterogeneous group that constitutes the biggest
family of plants. The natural environment destruction by men action has pushed a
great number of species near to extinction, which makes the stablishment of seed
banks an interesting preservation strategy. Therefore, studies for understanding seed
behavior and viability loss during storage and the use of quick tests for the evaluation
of seed viability had become important tools. The popularization of info equipment
and software would permit the use of image analysis through digitalization of
germination and tetrazolium tests, an interesting alternative that will allows small
producers to contribute to orchid species conservation. In the first part of this work,
an analysis of sucrose pre conditioned Cattleya seeds submitted to different
tetrazolium concentration were done, in distinct periods of exposure. In the second
part, ten batches of seed were stored at low temperatures, and their viability were
evaluated by germination and tetrazolium tests.
keywords: Germination test. Tetrazolium test. Seed conservation. Image analysis
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL 11
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 13
2 ARTIGO I: TESTE DE TETRAZÓLIO PARA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE
FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE Cattleya (ORCHIDACEAE) 14
RESUMO 14
ABSTRACT 15
2.1 Introdução 15
2.2 Material e Método 17
2.3 Resultados e Discussão 19
2.4 Conclusões 28
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 29
3 ARTIGO II: VIABILIDADE E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES DE
Cattleya (ORCHIDACEAE) 32
RESUMO 32
ABSTRACT 33
3.1 Introdução 33
3.2 Material e Método 36
3.3 Resultados e Discussão 40
3.4 Conclusões 53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
11
1 INTRODUÇÃO GERAL
As orquídeas (Família Orchidaceae) representam o maior grupo de
plantas entre as Angiospermas, com cerca de 850 gêneros e mais de 20.000
espécies; excluindo o número de híbridos artificiais, no Brasil ocorrem 200 gêneros e
2.500 espécies. São utilizadas principalmente para ornamentação e por esse motivo
vêm sendo intensamente exploradas, o que, juntamente com a intensa degradação
de seus habitats, têm resultado na extinção localizada de populações nativas.
O comércio de orquídeas, como planta de vaso ou flor de corte, é
bastante significativo, tendo sido a segunda planta ornamental de vaso mais vendida
nos Estados Unidos no ano de 2002. A venda de 12,7 milhões de plantas (US$
106.000.000,00) ficou atrás apenas do bico-de-papagaio (Poinsettia) (US$
247.000.000,00) e acima dos Crisanthemuns (US$ 77.000.000,00) (American Orchid
Society, 2003).
O cultivo de orquídeas como plantas ornamentais se iniciou na Europa
por volta do século XIX, sendo as plantas oriundas majoritariamente de coletas nas
Américas e Ásia Tropical. Os espécimes sobreviventes eram multiplicados por
divisões ou por semeaduras, e geravam poucos descendentes (KNUDSON, 1922).
Em 1943, as soluções nutritivas para a cultura de plantas foram estabelecidas
(KNUDSON, 1943), porém apenas em 1946 foi descrito um meio eficiente para a
germinação in vitro de Cattleya e alguns gêneros aparentados. Após esse evento, a
propagação em larga escala, via sementes, levou a um grande aumento na
multiplicação destas plantas e conseqüentemente no melhoramento das mesmas,
seja por hibridação ou por seleção dentro das espécies.
As orquídeas apresentam sementes muito numerosas, com tamanho e
peso reduzidos, o que torna o estabelecimento de um banco genético através do
armazenamento de sementes bastante indicado, tanto para espécies silvestres,
quanto para espécies já melhoradas. Para tanto a avaliação da qualidade fisiológica
das sementes é importante para auxiliar em uma rápida tomada de decisão quanto
ao uso ou descarte de lotes destinados ao armazenamento. Embora o teste padrão
de germinação seja o parâmetro oficial mais utilizado para avaliar a qualidade
fisiológica de lotes de sementes (VIEIRA; CARVALHO, 1994), em orquídeas, o
12
diminuto tamanho e a germinação lenta e espaçada dificultam a execução de testes
para a determinação do vigor e da germinação das sementes.
Dentre os testes considerados rápidos para avaliação da qualidade das
sementes, destaca-se o teste de tetrazólio, que possibilita a avaliação da viabilidade
e do vigor, além de fornecer informações valiosas sobre o potencial fisiológico das
sementes, para fins de semeadura. O teste permite a identificação dos fatores que
influenciam a qualidade das sementes de grandes culturas, como danos mecânicos,
danos ocasionados por secagem, insetos e deterioração por umidade
(KRZYZANOWSKI et al., 1999).
De modo geral as sementes que são conduzidas ao teste de tetrazólio
devem ser pré-condicionadas, procedimento que, além de provocar o amolecimento
da semente e facilitar a penetração de solução de tetrazólio, também ativa o sistema
enzimático que resulta numa coloração mais nítida.
O presente trabalho foi dividido em duas partes; no primeiro capítulo foi
avaliada a eficiência dos métodos de pré-condicionamento em água e em solução
de sacarose, tendo como variáveis adicionais o tempo de exposição das sementes
ao tetrazólio e as concentrações da solução de tetrazólio utilizada na avaliação da
qualidade de lotes de sementes de orquídeas tropicais. Os resultados foram
comparados aos do teste de germinação assimbiótica.
Já no segundo capítulo foram avaliados o comportamento de nove
espécies de orquídeas armazenadas a baixa temperatura por um período de três
meses. A qualidade fisiológica das sementes armazenadas também foi avaliada
pelos dois testes, germinação e tetrazólio. Neste último foi utilizado somente o pré-
condicionamento em solução de sacarose, pois foi o que apresentou melhores
resultados durante as avaliações realizadas na primeira parte do trabalho.
A análise da viabilidade das sementes submetidas aos testes de
tetrazólio e germinação foi realizada através da digitalização de imagens, que
mostrou-se eficiente pela praticidade e controle das contagens.
A análise da eficiência de procedimentos mais simples para avaliar a
qualidade fisiológica das sementes realizada neste trabalho pode permitir que eles
sejam utilizados na análise de sementes de orquídeas armazenadas por pequenos
produtores, o que constituiria uma ferramenta adicional para a preservação da
biodiversidade.
13
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMERICAN ORCHID SOCIETY. Business is Booming, Orchids, v. 72, p. 567, 2003.
KNUDSON, L. Non-symbiotic germination of orchid seeds. Botanical Gazette, v.
73, p. 1-25, 1922.
KNUDSON, L. Nutrient solutions for orchid seed germination. American Orchid
Society Bulletin, v. 12, p. 77-79, 1943.
KRZYZANOWISKI, F.C.; VIEIRA, R. D.; FRANÇA NETO, J. B. Vigor de Sementes:
Conceitos e Testes. Associação Brasileira de tecnologia de sementes. Londrina:
ABRATES, 1999. 218 p.
VIEIRA, R. D.; CARVALHO, N. M. Testes de vigor de sementes. Jaboticabal:
FUNEP, 1994. 164 p.
14
2 ARTIGO I: TESTE DE TETRAZÓLIO PARA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE
FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE Cattleya (ORCHIDACEAE)
RESUMO
As orquídeas apresentam sementes reduzidas, cuja germinação é
demorada e, muitas vezes, depende do estabelecimento de uma relação simbiótica
com fungos micorrízicos. O teste de tetrazólio é um dos métodos mais promissores
para estimar, de forma rápida, a viabilidade e o vigor das sementes. Sua utilização
em sementes de orquídeas torna-se importante para avaliação de lotes de sementes
destinados para conservação e/ou propagação. O presente trabalho teve por
objetivo analisar a aplicabilidade do teste de tetrazólio para orquídeas, verificando a
eficiência de métodos de pré-condicionamento, tempo de exposição das sementes
ao tetrazólio e concentrações da solução de tetrazólio na avaliação da qualidade de
lotes de sementes de Cattleya. As sementes foram submetidas aos métodos de pré-
condicionamento em solução de sacarose a 10% em temperatura ambiente, por 24
horas. Após o pré-condicionamento, as sementes foram imersas em soluções de
tetrazólio a 0,1; 0,25; 0,5 e 1,0% por períodos que variaram entre 3, 6, 12 e 24
horas, a 40º C, em banho-maria no escuro. Para comparação dos resultados obtidos
no teste de tetrazólio, foram realizados os testes de germinação assimbiótica em
meio Knudson C. As avaliações dos testes de tetrazólio e de germinação foram
realizadas com o auxílio da digitalização de imagens através de scanner de mesa e
câmeras digitais comerciais (5MPixel). A análise da viabilidade das sementes
submetidas ao testes de tetrazólio e germinação através da digitalização de imagens
mostrou-se eficiente tanto pela praticidade como pela possibilidade de controle das
contagens. O pré-condicionamento em solução de sacarose 10% apresentou
melhores resultados, facilitando a identificação das sementes viáveis e soluções de
tetrazólio com concentrações acima de 0,25% e períodos de exposição ao tetrazólio
superiores à 6 horas seriam as mais recomendadas. Os resultados das sementes
pré-condicionadas ficaram mais próximos dos valores da germinação.
Palavras chave: Viabilidade. Pré-condicionamento. Análise de imagens.
15
ABSTRACT
Orchids exhibited tiny seeds, with delayed germination due to the need
of symbiotic relationship with some fungi. Tetrazolium test is one of the most
promising methods to estimate, fastly, seed viability and vigour. Its utilization in
orchid seeds became important to evaluate seed batches to propagation and
conservation efforts. The aim of this work was to study the tetrazolium test for
orchids, to verify the pre conditioning efficiency, time of exposure and the
concentration of the tetrazolium solutions in the evaluation of tropical seed orchids.
Seeds were pre conditioned in 10% sucrose solution, at room temperature, for 24h.
After that they were immersed in 0.1, 0.25, 0.5 and 1% tetrazolium solutions during 3,
6, 12 and 24h at 40ºC, in water bath in the dark. The results obtained in the
tetrazolium test were compared with seed germination, carried out in Knudson C
media. Evaluation of tetrazolium test was done by table scanner at 3600dpi with
three replicates. Germination was track by digital photograpy (5MPixel) made with a
common camera. The viability analysis using digital images was efficient due to the
facilities of digitalization and to the counting control. Pre conditioning in 10% sucrose
improved the seeds coloration, turning easy the seed differentiation. The results of
pre conditioned seeds and assymbiotic germination was highly correlated. However,
it was not possible to stablish the better concentration of tetrazolium salt.
Key words: Orchidaceae. Viability. Pre conditioning. Image analysis.
2.1 Introdução
O emprego de testes rápidos em programas de controle de qualidade
de sementes é uma ferramenta imprescindível para a avaliação de sua qualidade
fisiológica, e por isso têm merecido permanente atenção dos tecnologistas,
produtores e pesquisadores. Isso reflete o refinamento da demanda de materiais que
proporcionem maior segurança para fins de semeadura e/ou armazenamento,
principalmente das espécies que requerem um longo período para completar o teste
de germinação (MARCOS FILHO, 1994; McDONALD, 1998).
16
Para analisar a qualidade de um lote de sementes pode-se utilizar o
teste de germinação, que consiste em determinar o potencial germinativo das
sementes para fins de semeadura e produção de mudas (CARVALHO; NAKAGAWA,
2000). Entretanto, tal procedimento apresenta limitações quanto à diferenciação de
lotes, demora na obtenção dos resultados (CUSTÓDIO, 2005) e, particularmente
para orquídeas, demanda um longo período de duração, técnicas especializadas e
custo elevado de implementação, pois suas sementes necessitam estabelecer uma
relação com fungos micorrízicos e/ou a utilização de meios de cultura adequados
para germinar (WRIGHT; GUEST, 2005; ALVAREZ-PARDO; FERREIRA, 2006). O
tempo necessário para obter a germinação simbiótica pode variar entre um e alguns
meses, ou mesmo um ano, dependendo da espécie e do lote de sementes
(RASMUSSEN, 1995; ZETTLER, 1997), bem como da capacidade de um
determinado fungo isolado de induzir a germinação (HADLEY, 1982). As orquídeas
apresentam sementes muito numerosas, com tamanhos e pesos peculiarmente
reduzidos – variando entre 0,05 e 6,0 milímetros – havendo a possibilidade de cada
fruto conter milhares de sementes (ARDITTI; GHANI, 2000). A maioria das sementes
de orquídea não possui endosperma, e seus embriões constituem-se de pequenos
corpos elipsoidais formados por relativamente poucas células, que acumulam
reservas predominantemente lipídicas (ARDITTI, 1992).
A avaliação da qualidade fisiológica das sementes pode auxiliar na
rápida tomada de decisões quanto ao uso ou descarte de lotes de sementes
destinados ao armazenamento no banco de sementes. Neste sentido a utilização de
um teste rápido e de baixo custo constitui uma alternativa vantajosa.
O teste bioquímico de tetrazólio, que reflete a atividade das enzimas
desidrogenases envolvidas no processo de respiração celular, é um dos mais
tradicionais na avaliação da qualidade e do vigor de sementes. A hidrogenação do
2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio produz nas células vivas do embrião uma
substância vermelha, estável e não difusível, o trifenil formazan (PIÑA-RODRIGUES
et al., 2004), o que torna possível distinguir as partes vivas, coloridas de vermelho,
daquelas mortas, que mantêm a sua cor original. O referido teste tem sido aceito,
segundo Deswal e Chand (1997), não somente como uma técnica para estimar a
viabilidade, mas também o vigor das sementes.
Na realização do teste de tetrazólio são indicados procedimentos,
chamados de pré-condicionamento, que visam a penetração da solução nos tecidos
17
de interesse a serem avaliados. Para espécies florestais, há descrição de
tratamentos de pré-condicionamento diversos, como corte, escarificação e
embebição em água (DAVIDE et al., 1995; MALAVASI et al., 1996; SANTOS et al.,
1998; FERREIRA et al., 2001; MENDONÇA et al., 2001; OLIVEIRA, 2004).
Além do pré-condicionamento, são parâmetros fundamentais para a
obtenção de resultados confiáveis sobre a qualidade das sementes: a concentração
da solução de tetrazólio, o tempo de exposição ao teste, temperatura de
condicionamento e avaliação adequada da coloração das sementes. O uso da
digitalização das imagens das sementes pode levar à diminuição dos custos e maior
agilidade dos testes, o que constitui uma alternativa tanto para laboratórios, quanto
para pequenos produtores.
A metodologia para a realização do teste de tetrazólio em sementes de
orquídeas tropicais ainda não foi completamente estabelecida; desta forma o
presente trabalho objetivou verificar a eficiência de diferentes métodos de pré-
condicionamento, concentrações e tempos de exposição à solução de tetrazólio na
avaliação da qualidade de lotes de sementes de orquídeas através da utilização de
técnicas de captura e ampliação de imagens digitais.
2.2 Material e Métodos
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos da
Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE –
Presidente Prudente – SP).
Frutos com sementes de Cattleya leopoldii Verschaff. ex Lem e
Cattleya walkeriana Gardn provenientes do Orquidário Aurora em Taciba- SP foram
coletados nos meses de abril e julho de 2008, respectivamente. Após a coleta, os
frutos foram colocados em envelope de papel e mantidos em temperatura ambiente
até a deiscência. As sementes obtidas foram armazenadas sobre sílica gel a 4ºC,
com 6,5% de grau de umidade (BRASIL, 1992) até o início dos testes.
Os tratamentos foram arranjados no esquema fatorial 2x4x4 para cada
lote de sementes, amostras com e sem pré-condicionamento em solução de
sacarose a 10%, quatro períodos de exposição das sementes à solução de tetrazólio
18
(3, 6, 12 e 24horas) e em quatro concentrações de sais de tetrazólio (0,1; 0,25; 0,5 e
1,0%).
As sementes foram aliquotadas em frações de 10mg em microtubos
para serem submetidas aos tratamentos específicos. O pré-condicionamento das
sementes foi realizado adicionando-se 1,5mL da solução de sacarose a 10% nos
microtubos por 24 horas a temperatura ambiente. Após este período, a solução de
sacarose foi retirada com auxílio de uma pipeta Pasteur e as sementes foram
lavadas duas vezes com a adição de 1,5mL de água destilada. Foram adicionados
1,5mL das soluções de tetrazólio nas diferentes concentrações e os microtubos
foram acondicionados em banho-maria, no escuro, a 40ºC pelo de 3, 6, 12 e 24
horas (modificado de JORDÃO et al., 1988).
A avaliação da viabilidade das sementes baseou-se na captura e
ampliação de imagens digitalizadas. Após o período de incubação de cada amostra,
descartou-se 1,0 ml da solução de tetrazólio e o restante foi gotejado em cima de
uma placa de vidro, sendo as imagens digitalizadas capturadas em scanner de mesa
HP G2710 com resolução de 3600 dpi. Para maior contraste entre as sementes
coradas, foram testados fundos de colorações diferentes (preto, marrom, amarelo e
branco) obtidos através de plástico aderido internamente à tampa do scanner. As
contagens das sementes foram realizadas na tela do computador e as imagens
foram modificadas, quando necessário, com o uso do software Adobe Photoshop®
CS3, através de ferramentas de ampliação de imagem, definição de contraste e
brilho. Foram consideradas viáveis as sementes portadoras de embriões coloridos
de vermelho.
O teste de germinação foi realizado em meio Knudson C. (KNUDSON,
1946) adicionado de sacarose (20g.L
-1
) e ágar (6g.L
-1
). O pH foi acertado com NaOH
para 5,6, o meio foi autoclavado e posteriormente distribuído em placas de Petri de
60mm. Previamente à semeadura, 10mg de cada lote de sementes foram
desinfetados com DCCA – Dicloroisocianurato de sódio (5g.L
-1
), adicionado de
algumas gotas de Tween 80. O procedimento se deu dentro de seringas, por 10
minutos, em câmara de fluxo laminar (MACHADO NETO; CUSTÓDIO, 2005), e após
sua realização as sementes foram lavadas duas vezes com água destilada
autoclavada. Em seguida gotejou-se 1,0 mL das soluções de sementes em placas
de Petri, que foram envoltas com filme plástico e transferidas para sala de
19
crescimento à temperatura de 25±3º C com fotoperíodo de 16 horas por
aproximadamente 60 dias.
Para a contagem da germinação das sementes foram marcados três
campos em cada placa, os quais foram fotografados com câmera digital Sony DSC-
P10 acoplada manualmente na lente ocular do estereoscópio. Todos os campos das
placas foram fotografados com intervalo de sete dias, orientados sempre na mesma
posição. As imagens foram analisadas no computador e modificadas, quando
necessário, com o uso do software Adobe Photoshop® CS3, através das
ferramentas de ampliação de imagem, definição de contraste e brilho. As sementes
que apresentavam embriões expandidos e massa celular de coloração verde
(estágio 1) foram consideradas germinadas, segundo as definições de Seaton e
Hailes, 1989. Para cada lote de sementes foram semeadas três placas de Petri com
três campos de contagem em cada placa. Os dados foram expressos em
porcentagem e analisados por estatística descritiva com cálculo do desvio padrão.
A viabilidade das sementes das orquídeas avaliadas pelos testes de
tetrazólio foi expressa em porcentagem; os resultados obtidos foram, então,
submetidos à análise estatística descritiva. O delineamento utilizado foi inteiramente
casualizado e a comparação das médias foi feita pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade. A análise dos dados foi realizada pelo programa SISVAR
®
(FERREIRA, 2000).
2.3 Resultados e Discussão
As sementes de orquídeas apresentam tamanho reduzido e
necessitam de equipamentos de microscopia para a sua visualização. Os
instrumentos óticos utilizados para esse fim são caros e de difícil acesso para
orquidários e laboratórios pequenos. Uma alternativa utilizada neste trabalho foi a
digitalização de imagens das sementes utilizadas nos testes de tetrazólio e
germinação, já que nos últimos anos, a popularização da tecnologia de imagem
tornou scanners e câmeras digitais acessíveis a população em geral.
A análise das sementes submetidas aos testes de tetrazólio e de
germinação através da digitalização de imagens mostrou-se eficiente, permitindo
20
diferenciar com clareza as sementes viáveis, coradas de vermelho, das sementes
inviáveis, com coloração branca, sendo possível também a identificação de palhas -
sementes sem embrião (Figura 1). Foram testadas diferentes colorações de fundo
para a obtenção das imagens, tendo o fundo azul mostrado maior contraste em
relação as sementes. A análise de imagens digitalizadas permite o uso do teste de
tetrazólio por pequenos produtores, pois além de dispensar equipamentos de
laboratório de alto custo como o microscópio estereoscópio, permite ao analista
realizar a contagem das sementes em diferentes horários e rever as contagens
realizadas, já que uma vez digitalizada, a imagem permanece armazenada no
computador. Além disso, a contagem pode ser feita com a ajuda de softwares que
permitem marcar as sementes viáveis na imagem, como Paintbrush®, Adobe
Photoshop® CS3 ou outros softwares de imagens.
A
B
C
I II
FIGURA 1 - Imagens digitalizadas de sementes de Cattleya walkeriana sem pré-
condicionamento e submetidas ao teste do tetrazólio. Os traços da
imagem I representam a régua digitalizada e no detalhe a direita
(imagem II) uma ampliação das sementes. A- sementes viáveis
(coloração vermelha), B- sementes não viáveis (coloração branca) e C-
palha (sementes sem embrião)
A análise de imagens digitais também foi utilizada no teste de
germinação, através do uso de câmeras digitais comuns. Sua utilização no
laboratório é possível, desde que se mantenha permanente a posição dos campos
21
de contagem e o cuidado no momento de acoplar a lente ocular do microscópio
estereoscópio à lente da máquina fotográfica, de modo a evitar a diminuição do
campo visual do microscópio esteroscópio. A utilização da digitalização de imagens
no teste de germinação (Figura 2) mostrou-se importante também, pois permitiu: a
revisão de contagens de todos os períodos de avaliação, as leituras das placas em
períodos diferentes e a avaliação da qualidade dos protocórmios após o aumento
das imagens no computador. Segundo Arditti (1992) protocórmios são estruturas
embrionárias tuberiformes, geralmente clorofiladas, formadas a partir da proliferação
celular do embrião que promove o rompimento do tegumento seminal. Sob
condições naturais, o protocórmio permanece como tal até que seja infectado por
um fungo micorrízico apropriado, para provimento inicial de nutrientes por meio da
degradação de reservas acumuladas ou síntese de novas substâncias; somente
após esse evento tem início a formação da gema vegetativa e seus primórdios
foliares.
A utilização de softwares populares possibilitou a realização de
pequenos tratamentos nas imagens, como ampliações e definição de maior
contraste e brilho, o que facilitou a distinção entre sementes germinadas e não
germinadas. Além disso, permitiu a marcação das sementes germinadas e a
comparação de seu desenvolvimento em diferentes períodos de contagem.
22
7dias 21dias
14dias
28dias 35dias 42 dias
49 dias 56 dias 63 dias
FIGURA 2 - Fotografias digitais das avaliações semanais da germinação
assimbiótica de Cattleya leopoldii semeadas em meio Knudson C.
Os testes de germinação foram conduzidos até o 63º dia após a
semeadura, pois os valores de germinação não aumentaram a partir do 35º dia e
após o 49º dia foi possível observar a degradação do protocórmio (Figura 2). Na
Tabela 1 encontram-se a viabilidade de orquídeas avaliadas pelo teste de
germinação assimbiótica realizada em meio Knudson C.
23
TABELA 1 - Valores em porcentagem de sementes de orquídeas germinadas em
condições assimbióticas em meio Knudson C
Germinação (%)
Períodos de avaliação
Amostras
7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias 49 dias
Cattleya leopoldii
81±5,7
1
97±0,9 99±0,3 100±0,5 100±0,5 100±0,5 100±0,5
Cattleya walkeriana
54±9,5 79±5,6 85±8,1 91±5,9 94±2,7 94±2,7 94±2,7
1
Médias ± desvio padrão
Quanto à necessidade de pré-condicionamento, a viabilidade das
sementes das duas espécies de orquídeas pré-condicionadas expostas a solução de
tetrazólio por períodos de 3 e 6 horas apresentou diferenças significativas quando
comparada com sementes não condicionadas e mantidas pelo mesmo período na
solução de tetrazólio. No entanto, nos períodos de 12 e 24 horas de exposição à
solução de tetrazólio, os valores da viabilidade para C. leopoldii não apresentaram
diferenças significativas para sementes pré-condicionadas e não-condicionadas. Em
C. walkeriana os resultados referentes ao período de 12 horas de exposição à
solução de tetrazólio mantiveram-se semelhantes para sementes pré-condicionadas
e não-condicionadas. Já no período de 24 horas as sementes pré-condicionadas
apresentaram valores de viabilidade maiores (Tabela 2). Sendo assim, de maneira
geral, para a maioria dos tempos de exposição à solução de tetrazólio, o pré-
condicionamento mostrou-se vantajoso, permitindo a maior detecção de sementes
viáveis nos menores tempos de exposição para as duas espécies de orquídeas.
TABELA 2 - Viabilidade de sementes de orquídeas em porcentagem, avaliadas pelo
teste de tetrazólio sem e com pré-condicionamento em solução de
sacarose 10% por 24horas, em diferentes intervalos de tempo
C. leopoldii
C. walkeriana
Tempo
Sem sacarose Com sacarose Sem sacarose Com sacarose
3 horas 81
b*
96
a
85
b
98
a
6 horas 68
b
90
a
84
b
97
a
12 horas 91
a
94
a
92
a
98
a
24 horas 93
a
97
a
85
b
99
a
* Médias seguidas pela mesma letra, na horizontal, dentro de cada espécie, não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
24
Em relação à concentração da solução de tetrazólio, as sementes de
C.leopoldii pré-condicionadas em solução de sacarose apresentaram uma
viabilidade significativamente maior que as sementes não-condicionadas para todas
as concentrações de sais de tetrazólio. Em C. walkeriana as sementes pré-
condicionadas apresentaram viabilidades maiores apenas nas soluções de 0,1% e
1,0% quando comparadas com sementes não-condicionadas (Tabela 3).
TABELA 3 - Viabilidade de sementes de orquídeas em porcentagem, avaliadas pelo
teste de tetrazólio sem e com pré-condicionamento em solução de
sacarose 10%, por 24 horas, submetidas a diferentes concentrações
da solução de tetrazólio
C. leopoldii
C. walkeriana
Concentração
de tetrazólio
Sem sacarose Com sacarose Sem sacarose Com sacarose
0,10% 78
b*
87
a
84
b
97
a
0,25% 89
b
97
a
96
a
98
a
0,50% 84
b
97
a
84
a
99
a
1,00% 81
b
97
a
82
b
98
a
* Médias seguidas pela mesma letra, na horizontal dentro de cada espécie, não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
Na Tabela 4, os dados da viabilidade das sementes de C. leopoldii pré-
condicionadas apresentaram diferenças significativas quando comparadas a
sementes não-condicionadas, no período de 3 horas de exposição aos sais de
tetrazólio e em três concentrações: (0,1%, 0,5% e 1,0%). No período de 6 horas as
diferenças ocorreram nas concentrações de 0,25%, 0,5% e 1,0%. Nos demais
períodos de exposição e concentração de sais de tetrazólio não houve diferenças
significativas entre os tratamentos de sementes pré-condicionadas e não
condicionadas.
25
TABELA 4 - Viabilidade de sementes de C. leopoldii, avaliadas pelo teste de
tetrazólio sem e com pré-condicionamento em solução de sacarose
10%, por 24horas, em diferentes intervalos de concentração da
solução de tetrazólio e tempo de exposição
Tempo
3 horas 6 horas 12 horas 24 horas
Concentração
de tetrazólio
sem com sem com sem com sem com
0,10% 61
b*
89
a
72
a
73
a
86
a
86
a
94
a
99
a
0,25% 97
a
99
a
73
b
94
a
91
a
97
a
97
a
98
a
0,50% 88
b
99
a
71
b
96
a
89
a
97
a
97
a
98
a
1,00% 80
b
98
a
57
b
98
a
97
a
97
a
92
a
95
a
* Médias seguidas pela mesma letra, na horizontal, dentro de cada período de exposição, não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
Em C. walkeriana (Tabela 5) a viabilidade das sementes pré-
condicionadas apresentou diferenças significativas quando comparada à das
sementes não-condicionadas, nos períodos de 3 horas de exposição aos sais de
tetrazólio nas concentrações de 0,1% e 0,5%. No período de 6 horas as diferenças
ocorreram nas concentrações de 0,1% e 1,0%. No período de 12 horas a diferença
ocorreu na concentração de 1,0% e no período de 24 horas as diferenças ocorreram
nas concentrações de 0,5% e 1,0%.
TABELA 5 - Viabilidade de sementes de C. walkeriana, avaliadas pelo teste de
tetrazólio sem e com pré-condicionamento em solução de sacarose
10%, por 24horas, em diferentes intervalos de concentração da
solução de tetrazólio e tempo de exposição
Tempo
3 horas 6 horas 12 horas 24 horas
Concentração
de tetrazólio
Sem com sem com sem com sem com
0,10% 62
b*
98
a
80
b
95
a
98
a
98
a
97
a
97
a
0,25% 98
a
98
a
95
a
98
a
94
a
98
a
97
a
99
a
0,50% 82
b
99
a
87
a
97
a
99
a
100
a
69
b
100
a
1,00% 98
a
99
a
74
b
97
a
77
b
97
a
76
b
99
a
* Médias seguidas pela mesma letra, na horizontal entre os tratamentos e dentro de cada
período de exposição, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
O pré-condicionamento das sementes de orquídeas em solução de
sacarose a 10% foi importante para homogeneizar os resultados da avaliação de
viabilidade pelo teste de tetrazólio (Tabelas 2, 3, 4 e 5). Para as sementes pré-
condicionadas foi possível detectar diferenças significativas para a concentração de
26
0,1% da solução de tetrazólio para os períodos de 3, 6 e 12 horas para C. leopoldii.
E em C. walkeriana a diferença ocorreu para o tratamento de 0,1% da solução de
tetrazólio, no período de 24 horas (Tabela 6).
Analisando-se a viabilidade dentro de cada período de exposição à
solução de tetrazólio, mas em diferentes concentrações, houve diferenças para as
concentrações de 0,1% no período de 6 horas, para C. leopoldii, e em C. walkeriana
as diferenças ocorreram somente nas concentrações 0,1% e 0,5% dentro do período
de 6 horas de exposição (Tabela 6). O período de tempo necessário para o
desenvolvimento de coloração das sementes varia bastante entre as espécies.
Delouche et al. (1976) afirmaram que sementes de uma mesma espécie ou até de
um mesmo lote podem apresentar velocidade de coloração diferente. Geralmente,
sementes velhas e deterioradas colorem mais rapidamente e desenvolvem
coloração vermelho carmim. Um período muito longo de contato das sementes com
a solução poderia acarretar no desenvolvimento de coloração muito intensa,
prejudicando a interpretação do teste. Neste trabalho as sementes expostas a
solução com maior concentração de tetrazólio permitiram uma melhor identificação
das sementes viáveis (Figura 3), pois em baixas concentrações as sementes ficaram
apenas levemente coradas, o que aumenta a chance de erro na avaliação da
viabilidade das sementes. Sendo assim, a solução de tetrazólio a 1% pode ser
recomendável tendo em vista a rapidez de seus resultados, entretanto a utilização
de concentrações a partir de 0,25% são mais vantajosas sob o aspecto econômico.
Já em relação ao melhor período de exposição (Tabela 6), a indicação
de um período de 6 horas ou 24 horas seria mais adequada para um laboratório com
rotina. No período de 6 horas haveria a possibilidade dos resultados saírem no dia:
sendo as sementes colocadas na solução de tetrazólio de manhã, o resultado sairia
no final da tarde. Para um período de 24 horas o resultado sairia no dia seguinte. O
período de 3 horas avaliado para C. leopoldii e C. walkeriana resultou em dificuldade
na identificação das sementes, que adquiriram coloração fraca devido ao baixo
tempo de exposição à solução de tetrazólio. O período 12 horas traria dificuldade
pois os resultados sairiam fora do horário de rotina.
27
TABELA 6 - Viabilidade de sementes de orquídeas, avaliadas pelo teste de
tetrazólio com pré-condicionamento em solução de sacarose 10%, por
24horas, em diferentes períodos de exposição aos sais de tetrazólio
dentro de quatro concentrações da solução de tetrazólio
Tempo
C. leopoldii
C. walkeriana
Concentração de tetrazólio Concentração de tetrazólio
0,10% 0,25% 0,50% 1,00% 0,10% 0,25% 0,50% 1,00%
3 89
A b
99
A a
99
A a
98
A a
98
A a
98
A a
99
A a
99
A a
6 73
A b
94
A a
96
A a
98
A a
95
B a
98
A a
97
B b
97
A a
12 86
A b
97
A a
97
A a
97
A a
98
A a
98
A a
100
A a
97
A a
24 99
A a
98
A a
98
A a
95
A a
97
A b
99
A a
100
A a
99
A a
* Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na vertical e minúscula na horizontal dentro de
cada espécie, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
Na figura 3 as sementes pré-condicionadas apresentam-se coradas de
forma homogênea, enquanto nas amostras sem pré-condicionamento foi mais difícil
a determinação das sementes coradas das não coradas. Para Gratapaglia e
Machado (1998) o tipo e a concentração dos açúcares são importantes para
promover a germinação e o crescimento de plântulas in vitro, assim como para a
própria manutenção de crescimento da raiz. Isso indica que a presença da solução
de sacarose foi importante para ativar o metabolismo dos embriões permitindo uma
melhor coloração das sementes viáveis.
O uso da sacarose torna-se importante também pela dificuldade de
manipulação das sementes de orquídea, dado seu tamanho, que inviabiliza a
utilização de rolos de papel, como acontece para sementes de grandes culturas
como soja e feijão (BRASIL, 1992; KRZYZANOWSKI, et al., 1999). Isto ocorre
porque a solução de sacarose mantém um maior equilíbrio osmótico entre a
semente e o meio externo, impedindo que a embebição em água direta cause
injúrias ao seu tegumento.
Outro aspecto importante em relação ao uso da sacarose está
relacionado ao fato da solução servir como um colchão para separar as sementes de
maior densidade, as quais “conteriam“ embriões com maior viabilidade (JORDÃO, et
al., 1998; PICOLO, et al., 2007), excluindo desta forma as sementes inviáveis.
Quando submete-se as sementes diretamente na solução de tetrazólio, boa parte
delas flutuam ou aderem às paredes dos microtubos, diminuindo a área de contato
com a solução de tetrazólio pois, dependendo da espécie, as sementes de orquídea
apresentam um espaço de ar (ARDITTI, 1992).
28
I-1 I-2 I-3 I-4
II-1 II-2 II-3 II-4
FIGURA 3 - Imagens digitalizadas em scaner de mesa de sementes de Cattleya
leopoldii submetidas ao teste de tetrazólio expostas por um período de
6 horas à solução. I- Sementes pré-condicionadas em solução de
sacarose a 10% e II- sementes sem pré-condicionamento.
Concentrações de 1- 0,1%; 2- 0,25%; 3- 0,5% e 4- 1% do sal de
tetrazólio
2.4 Conclusões
A análise da viabilidade das sementes submetidas ao teste de
tetrazólio e germinação através da digitalização de imagens mostrou-se eficiente
tanto pela praticidade como pela possibilidade de controle das contagens.
O pré-condicionamento em solução de sacarose 10% melhorou a
coloração das sementes, facilitando a identificação das sementes viáveis. Os
resultados das sementes pré-condicionadas ficaram mais próximos dos valores da
germinação assimbiótica.
É possível sugerir o uso de soluções de tetrazólio acima de 0,25% de
concentração quando o objetivo for economia e um período de exposição das
sementes ao sal, acima de 6 horas, quando o objetivo for rapidez.
29
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32
3 ARTIGO II: VIABILIDADE E ARMAZENAMENTO DE SEMENTES DE Cattleya
(ORCHIDACEAE)
RESUMO
As orquídeas (Família Orchidaceae) representam o maior grupo de
plantas entre as Angiospermas, porém a extinção localizada de populações nativas
tem ocorrido como resultado de sua utilização para ornamentação e da degradação
de seus habitats. Sendo assim a conservação de sementes – tanto para espécies
silvestres que carregam características próprias, quanto para espécies já
melhoradas – faz-se necessária e torna-se bastante interessante, já que seu
tamanho é bastante reduzido. A avaliação da qualidade fisiológica das sementes
pode auxiliar na rápida tomada de decisão quanto ao uso ou descarte de lotes
destinados a conservação. Para analisar a qualidade das sementes utilizou-se o
teste de germinação em meio Knudson C e o teste de tetrazólio com pré-
condicionamento em solução de sacarose 10%, em dois períodos de
armazenamento, durante três meses à -18º C. Foram testados dez lotes de
sementes de nove espécies (Cattleya granulosa, Cattleya hegeriana, Cattleya
intermedia, Cattleya leopoldii, Cattleya mossiae, Cattleya purpurata, Cattleya
sanguiloba, Cattleya tenuis e Cattleya walkeriana) e as leituras dos testes foram
realizadas pela digitalização de imagens. Foram avaliados: a porcentagem de
sementes viáveis pelo teste de tetrazólio com e sem pré-condicionamento, a
porcentagem de germinação e curvas de germinação, o Índice de Velocidade de
Germinação (IVG) e a correlação entre os testes de tetrazólio e germinação. Os
resultados demonstraram não haver perda na viabilidade das sementes
armazenadas analisadas pelos testes de tetrazólio e germinação. Em cinco lotes
houve diminuição do IVG e foi alta a correlação entre os testes de tetrazólio com
pré-condicionamento e a germinação. O uso da digitalização de imagens mostrou-se
eficiente, permitindo a utilização da técnica por pequenos produtores, o que pode
auxiliar na conservação de orquídeas.
Palavras chave: Orchidaceae. Tetrazólio. Germinação. Análise de imagens.
33
ABSTRACT
Orchids are the biggest group of Angiosperms. However, there are
localized extinction of some species as a result of ornamentation and habitat
degradation. So, seed storage, either for bred or for non bred species, is a need and
it is very interesting, because a large amount of seeds could be stored in a small
flask. Evaluation of seed physiological quality can aid in the decision of use or
discard of batches to conservation. To score seed quality, seeds were germinated in
Kundson c medium and analyzed by the tetrazolium test with pre conditioning in 10%
sucrose solution and stored at -18ºC during three months. Ten seed batches were
tested from nine species (Cattleya intermedia, Cattleya tenuis, Cattleya hegeriana,
Cattleya sanguiloba, Cattleya granulosa, Cattleya leopoldii, Cattleya walkeriana,
Cattleya purpurata e Cattleya mossiae). The tetrazolium test counting was made with
digitalized images at 3600dpi. Seed viability (with or without pre conditioning in 10%
sucrose), Germination, Germination Velocity Index (IVG) and the correlation between
then were evaluated. Results showed there was no loss of viability in the stored
seeds, either by tetrazolium test or by the germination. In five lots there were a decay
in the IVG. The correlation between pre conditioned seeds in the Tetrazolium test
and germination was high. Digitalization of images was efficient, what could allow the
use of the techniques by small growers improving orchid conservation.
Key words: Orchidaceae. Tetrazolium. Germination. Image analysis.
3.1 Introdução
As orquídeas (Família Orchidaceae) representam o maior grupo de
plantas entre as Angiospermas, com cerca de 850 gêneros e mais de 20.000
espécies; excluindo o número de híbridos artificiais, no Brasil ocorrem 200 gêneros e
2.500 espécies (SOUZA; LORENZI, 2008). São utilizadas principalmente para
ornamentação e por esse motivo vêm sendo intensamente exploradas, o que,
juntamente com a degradação de seus habitats, tem resultado na extinção
localizada de populações nativas.
34
Existem vários sistemas comerciais de propagação de orquídeas,
sendo os mais simples, variações de algum processo de propagação assexuada
como: divisão de touceiras, divisão de pseudobulbos, divisão de bulbos velhos e
indução de brotamento a partir de hastes florais. Entretanto tais processos, embora
triviais e com resultados seguros, têm uma capacidade reprodutiva limitada, pois
sempre dependem de algum indivíduo adulto a ser utilizado para formar uma nova
planta, que demora de 2 a 8 anos para chegar à idade adulta. Já a reprodução
sexuada das orquídeas não é comumente realizada por pequenos produtores,
apesar de um único fruto poder conter mais de 800.000 sementes. Assim, os
métodos in vitro para reprodução sexuada têm sido preferidos por estabelecimentos
comerciais de grande porte, pois apesar do custo elevado, oferecem capacidade
produtiva elevadíssima e apresentam resultados mais seguros.
As diminutas sementes de orquídea são destituídas de endosperma,
sendo os embriões constituídos de pequenos corpos elipsoidais formados por
relativamente poucas células, que acumulam reservas predominantemente lipídicas.
As sementes de orquídeas apresentam, em geral, um padrão bastante uniforme de
germinação e desenvolvimento, iniciando-se pela embebição da semente, que
acarreta o rompimento do tegumento seminal e a liberação do embrião, uma
estrutura tuberiforme, geralmente clorofilada, chamada de protocórmio. Sob
condições naturais, o protocórmio permanece como tal até que seja infectado por
um fungo micorrízico apropriado, para provimento inicial de nutrientes por meio da
degradação de reservas acumuladas ou síntese de novas substâncias; somente
após esse evento tem início a formação da gema caulinar e seus primórdios foliares.
A formação da raiz ocorre mais tarde, após o surgimento de várias folhas (ARDITTI,
1992).
Segundo Machado Neto e Custódio (2005b), os parâmetros para a
estocagem de sementes de orquídeas não foram muito estudados e existem
problemas em relação a sua metodologia. Tais problemas envolvem temperatura,
umidade da semente e sobrevivência do embrião em cada tipo de estocagem. As
sementes têm sido divididas em duas categorias: sementes ortodoxas, que toleram
dessecação e baixas temperaturas durante a estocagem, apresentando longevidade
variável dependendo da espécie; e sementes recalcitrantes ou não ortodoxas, que
não toleram perda de água e/ou baixas temperaturas de estocagem. Uma terceira
categoria, sementes intermediárias, foi definida por Ellis et al. (1990), inclui
35
sementes que toleram alguma perda de água e frio na estocagem, mas não
permanecem viáveis por longos períodos.
Pritchard e Seaton (1993) sugeriram uma classificação de sementes
em duas categorias: ortodoxas e intermediárias (ou recalcitrantes). As sementes
ortodoxas toleram dessecação e umidade de cerca de 30% ou até menos;
entretanto, há dois sub-grupos reconhecidos em relação ao comportamento de
estocagem para as espécies de sementes ortodoxas: as verdadeiramente ortodoxas
e as essencialmente ortodoxas. As espécies verdadeiramente ortodoxas podem ser
preservadas a longo prazo sob condições convencionais e por esta razão são
adotadas pela maioria dos bancos de sementes. Em contraste, sementes
essencialmente ortodoxas apresentam longevidade reduzida em baixas
temperaturas ou temperaturas negativas com sementes mais secas.
A conservação de sementes de orquídeas torna-se bastante
interessante já que cada fruto pode conter milhares de sementes, as quais são
bastante pequenas, variando de 0,05 a 6,0 milímetros cada (ARDITTI; GHANI,
2000). Entretanto, é comum a formação de cápsulas contendo sementes sem
embriões e por isso é interessante que se teste a qualidade fisiológica das sementes
antes de sua conservação.
Para analisar a qualidade das sementes pode-se utilizar o teste de
germinação, que consiste em determinar o potencial germinativo das sementes para
fins de semeadura e produção de mudas (CARVALHO; NAKAGAWA, 2000); no
entanto tal procedimento apresenta limitações quanto à diferenciação de lotes,
demora na obtenção dos resultados (CUSTÓDIO, 2005) e, no caso das orquídeas,
custo elevado, pois é necessário que suas sementes estabeleçam uma relação com
fungos micorrízicos e/ou a utilização de meios de culturas para a sua germinação
(ALVAREZ-PARDO et al., 2006).
Outra forma de analisar a viabilidade das sementes são os testes
bioquímicos como o de tetrazólio, que é um dos mais tradicionais na avaliação da
qualidade e do vigor de sementes. O teste de tetrazólio reflete a atividade das
enzimas desidrogenases, envolvidas no processo de respiração celular. A
hidrogenação do 2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio produz nas células vivas uma
substância vermelha, estável e não difusível, o trifenil formazan (PIÑA-RODRIGUES
et al., 2004), o que torna possível distinguir as partes vivas, coloridas de vermelho,
daquelas mortas, que mantêm a sua cor original.
36
Na realização do teste de tetrazólio são indicados procedimentos,
chamados de pré-condicionamento, que visam à penetração da solução nos tecidos
de interesse a serem avaliados. Para espécies florestais, há descrição de
tratamentos de pré-condicionamento diversos, como corte, escarificação e
embebição em água (DAVIDE et al., 1995; MALAVASI et al., 1996; SANTOS et al.,
1998; FERREIRA et al., 2001; MENDONÇA et al., 2001; OLIVEIRA, 2004).
No caso das orquídeas se faz necessário o uso de um instrumento de
ampliação para a diferenciação das sementes, devido ao seu tamanho diminuto. O
uso da digitalização das imagens das sementes pode levar à diminuição dos custos
e maior agilidade dos testes, o que constitui uma alternativa tanto para laboratórios,
quanto para pequenos produtores.
O estabelecimento de um banco genético através do armazenamento
de sementes seria de extrema importância, tanto para espécies silvestres que
carregam características próprias, quanto para espécies já melhoradas (ALVAREZ-
PARDO; FERREIRA, 2006). O sucesso nos resultados pode permitir a utilização de
procedimentos mais simples de conservação de sementes de orquídeas por
pequenos produtores.
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo comparar os
testes de germinação e modificações do teste de tetrazólio com o pré-
condicionamento para avaliar a qualidade fisiológica das sementes de Cattleya
armazenadas em baixa temperatura.
3.2 Material e Métodos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de
Células e Tecidos Vegetais da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade do
Oeste Paulista (UNOESTE – Presidente Prudente – SP).
Sementes de orquídeas foram coletadas de frutos de nove espécies
diferentes: Cattleya granulosa (2 lotes), Cattleya hegeriana, Cattleya intermedia,
Cattleya leopoldii, Cattleya mossiae, Cattleya purpurata, Cattleya sanguiloba,
Cattleya tenuis e Cattleya walkeriana, provenientes do Orquidário Aurora (Taciba-
SP). A coleta das cápsulas ocorreu em diferentes épocas (Tabela 1), quando foram
37
colocadas em envelope de papel, tendo sido mantidas em temperatura ambiente até
a deiscência dos frutos. As sementes de cada planta foram armazenadas em
envelope de papel sobre sílica gel a 4ºC, com 6,5% de grau de umidade (BRASIL,
1992) até o início dos testes.
TABELA 1 - Relação dos lotes de sementes de orquídeas avaliadas, risco de
extinção, períodos de polinização e coleta dos frutos, identificação dos
biomas e distribuição geográfica das espécies
Amostra Risco Data de
polinização
Data de
coleta
Bioma Distribuição
Cattleya walkeriana Gardn. 2,5 21/11/2007 08-07-2008 Cerrado SP, MG,
MS,GO, MT
Cattleya tenuis M.A. Campacci
& P.L. Vedovello
1 20/09/2006 15/03/2007 Cerrado BA
Cattleya hegeriana
(Campacci) Van den Berg**
- 18/11/2007 15/08/2008 Campo
Rupestre
RJ
Cattleya sanguiloba (Withner)
Van den Berg & M.W.Chase*
- 31/12/2007 03/08/2008 Campo
Rupestre
MG
Cattleya granulosa Lindl. 1 27/11/2007 15/06/2008
Mata
Atlântica
AL, BA, ES,
PB, PE, RN
Cattleya leopoldii Verschaff. ex
Lem.
- 27/11/2007 03/04/2008 Mata
Atlântica
RS
Cattleya. intermedia Graham
ex Hook.
3 27/11/2007 05/02/2008 Mata
Atlântica
RS, SC, SP
e RJ
Cattleya purpurata (Lindl. &
Paxton) Van
den Berg & M.W.Chase*
3,4 27/11/2007 26-08-08 Mata
Atlântica
RS, SC, SP
Cattleya granulosa Lindl. 1 11/2006 06/2007
Mata
Atlântica
AL, BA, ES,
PB, PE, RN
Cattleya mossiae Parker ex
Hooker
- 06/10/2006 10/08/2007 Floresta
Amazônica
(Venezuela)
-
*VAN DEN BERG, C.& CHASE,2000.; **VAN DEN BERG, C., 2008.
1-
Lista Oficial de Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção. (BRASIL, Ministério do Meio
Ambiente, 2008)
2-
Lista Oficial de Espécies da Flora Brasileira com Deficiências de Dados. (BRASIL, Ministério do
Meio Ambiente, 2008)
3-
Lista da Flora Ameaçada de Extinção do Rio Grande do Sul (Secretaria do Meio Ambiente do
Estado do Rio Grande do Sul, 2002)
4-
Lista Oficial das Espécies da Flora do Estado de São Paulo Ameaçadas de Extinção. (2004)
5-
Lista das Espécies Presumivelmente Ameaçadas de Extinção da Flora do Estado de Minas
Gerais.(1997)
38
Para a avaliação da viabilidade das sementes pelo teste de tetrazólio
foram aliquotados 10 miligramas de sementes de cada lote em dois microtubos.
O primeiro tubo de cada lote de sementes (Tratamento A) recebeu
1,5mL de solução de tetrazólio (Cloreto de 2,3,5-Trifenil-Tetrazólio) a 1%, e foi
submetido a 24 horas de banho-maria à temperatura de 40º C, em ambiente escuro
(modificado de JORDÃO et al., 1988).
No segundo tubo (Tratamento B) foi realizado o pré-condicionamento
das sementes através da adição de 1,5mL de solução de sacarose a 10%, por 24
horas. Após este período as sementes foram lavadas duas vezes em água destilada
e procedeu-se ao teste de tetrazólio como descrito anteriormente para o tratamento
A.
A metodologia empregada na determinação da viabilidade das
sementes baseou-se na utilização de imagens digitalizadas por computador em
lugar do microscópio estereoscópico, que é normalmente utilizado. Após o período
de incubação de cada amostra, descartou-se 1,0 mL da solução de tetrazólio e o
restante foi gotejado em cima de uma placa de vidro, posicionada ao lado de uma
régua de plástico. As imagens foram digitalizadas em resolução de 3600 dpi com a
utilização de um scanner de mesa HP Scanjet G2710. Para maior contraste entre as
sementes coradas, foram testados fundos de colorações diferentes (preto, marrom,
amarelo e branco) obtidos por um plástico aderido internamente à tampa do
scanner. As contagens das sementes foram realizadas na tela do computador e as
imagens foram modificadas, quando necessário, com o uso do software Adobe
Photoshop® CS3, através de ferramentas de ampliação de imagem, definição de
contraste e brilho. Foram consideradas viáveis as sementes portadoras de embriões
coloridos de vermelho, sendo as sementes com coloração branca, consideradas
inviáveis.
O teste de germinação foi realizado em meio Knudson C (KNUDSON,
1946) adicionado de sacarose (20g.L
-1
) e ágar (6g.L
-1
). O pH foi acertado com NaOH
para 5,6 e o meio de cultura foi autoclavado e posteriormente distribuído em placas
de Petri de 60 mm. Previamente à semeadura, 20 mg de cada lote de sementes
foram desinfetadas por 10 minutos com DCCA – Dicloroisocianurato de sódio
(5g.L
-1
), com adição de algumas gotas de Tween 80, dentro de seringas em câmara
de fluxo laminar (MACHADO NETO; CUSTÓDIO, 2005a). Após esse procedimento,
as sementes foram lavadas duas vezes com água destilada autoclavada e em
39
seguida 1,0 mL das soluções de sementes foram gotejadas dentro de cada placa de
Petri. Logo após as placas foram envoltas com filme plástico e transferidas para sala
de crescimento à temperatura de 25±3º C com fotoperíodo de 16 horas por
aproximadamente 60 dias.
Para a contagem da germinação das sementes foram marcados três
campos em cada placa, os quais foram fotografados com câmera digital Sony DSC-
P10 acoplada manualmente na lente ocular. Todos os campos das placas foram
fotografados a cada sete dias, mantidos sempre na mesma posição. As imagens
foram analisadas no computador e modificadas, quando necessário, com o uso do
software Adobe Photoshop® CS3, através de ferramentas de ampliação de imagem,
definição de contraste e brilho. As sementes que apresentavam embriões
expandidos e massa celular de coloração verde (estágio 1) foram consideradas
germinadas, segundo as definições de Seaton e Hailes (1989). Para cada lote de
sementes foram semeadas três placas de Petri com três campos de contagem em
cada placa.
As sementes dos 10 lotes de orquídeas foram armazenadas a -18º C
por 90 dias em microtubos, acondicionados em frascos de vidro hermeticamente
fechados contendo sílica gel.
A viabilidade das sementes de orquídea, verificada pelo teste de
Tetrazólio (Tratamentos A e B) e a taxa germinação foram expressas em
porcentagem. O Índice de Velocidade de Germinação para cada lote de sementes
foi calculado conforme Maguire (1962), tendo as avaliações ocorrido no início do
armazenamento e após três meses de armazenamento. Foram calculados os
coeficientes de correlação linear pelo teste t, ao nível de 5% de probabilidade, entre
os testes de germinação e de Tetrazólio (Tratamentos A e B) e as comparações de
médias foram feitas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Também foram
realizados ajustes das equações de regressão, com análise de significância. A
análise dos dados foi realizada pelo programa SISVAR
®
(FERREIRA, 2000).
40
3.3 Resultados e Discussão
Foram analisados dez lotes de sementes de nove espécies, sendo
duas delas (Cattleya tenuis e Cattleya granulosa) integrantes da Lista Oficial de
Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção (BRASIL, 2008). Já a espécie
Cattleya walkeriana está inclusa na Lista Oficial de Espécies da Flora Brasileira com
Deficiências de Dados (BRASIL, 2008) e na Lista das Espécies Presumivelmente
Ameaçadas de Extinção do Estado de Minas Gerais; Cattleya purpurata figura nas
Listas Oficiais da Flora Ameaçada de Extinção dos Estados do Rio Grande do Sul
(Secretaria do Meio Ambiente do Estado do Rio Grande do Sul, 2008) e São Paulo e
Cattleya intermedia que aparece na Lista da Flora Ameaçada de Extinção do Rio
Grande do Sul. Cattleya mossiae tem origem na Venezuela (Tabela 1).
O uso de imagens digitalizadas já foi descrito para análise de plântulas
de milho, soja (TEIXEIRA, 2004), eucalipto e tomate (DORNELAS et al., 2005). Essa
ferramenta torna possível que pequenos produtores testem, in loco, a viabilidade das
sementes, o que auxilia na conservação das espécies de orquídeas, dispensando a
aquisição e utilização de equipamentos sofisticados de laboratório e treinamento
específico para realizar o teste de germinação das sementes.
A análise das sementes submetidas ao teste de tetrazólio através da
digitalização de imagens mostrou-se eficiente, permitindo diferenciar as sementes
viáveis, coradas de vermelho, das sementes inviáveis, com coloração branca, além
de possibilitar também a identificação de palhas, sementes sem embrião (Figura 1).
Foram testadas diferentes colorações de fundo para a captura de imagens, tendo o
fundo azul oferecido maior contraste com as imagens das sementes. A análise de
imagens digitalizadas possibilita o uso do teste de tetrazólio por pequenos
produtores, pois não há necessidade de utilização de equipamentos de laboratório
de alto custo, como o microscópio estereoscópico. A técnica também permite ao
analista realizar a contagem das sementes em diferentes horários, além da revisão
das contagens realizadas, pois uma vez digitalizada, a imagem fica disponível no
computador. A marcação das sementes viáveis na imagem pode ser feita com a
utilização de softwares como o Paintbrush
®
, Adobe Photoshop
®
CS3 ou outros
programas de imagens.
41
C
B
A
FIGURA 1 - Sementes de Cattleya granulosa pré-condicionadas em solução de
sacarose 10% e submetidas ao teste do tetrazólio (Tratamento B). Os
traços da imagem maior estão divididos em milímetros e no detalhe a
direita uma ampliação das sementes. A- sementes viáveis (coloração
vermelha), B- sementes não viáveis (coloração branca) e C- palha
(sementes sem embrião)
O pré-condicionamento em solução de sacarose 10% permitiu uma
coloração mais evidente entre as sementes viáveis (Figura 2), facilitando a
contagem das mesmas. O uso da solução de sacarose 10% no pré-condicionamento
torna-se importante para manter um maior equilíbrio osmótico entre a semente e o
meio externo, impedindo que a embebição em água direta cause injúrias ao seu
tegumento. Segundo Arditti, 1992, a presença da sacarose na germinação in vitro
acaba sendo responsável pela ativação do embrião, já que as sementes são
pequenas, não apresentam reservas em abundância e na natureza dependem da
associação com micorrizas para o fornecimento de nutrientes ao embrião.
42
1 2
FIGURA 2 - Imagens digitalizadas em scanner de mesa do teste de tetrazólio em
sementes de Cattleya sanguiloba antes do armazenamento. 1- amostra
sem pré-condicionamento (Tratamento A) e 2- com pré-condicionamento
em solução de sacarose 10% (Tratamento B)
O resultado obtido no teste de germinação mostrou a possibilidade de
utilização de máquinas digitais comuns no laboratório, desde que se mantenha a
padronização dos campos de contagem e cuidado no procedimento ao acoplar a
lente ocular do microscópio estereoscópico à lente da câmera fotográfica, de modo a
evitar a diminuição no campo visual do microscópio estereoscópico. A utilização da
digitalização de imagens no teste de germinação (Figuras 3 e 4 ) mostrou-se
importante, pois permitiu a revisão de contagens de todos os períodos de avaliação,
a leitura das placas em períodos diferentes e a avaliação da qualidade dos
protocórmios pelo aumento das imagens no computador (Figura 4). Com a
utilização de softwares populares foi possível realizar pequenos tratamentos, como
ampliações, alterações no contraste e no brilho das imagens, os quais facilitaram a
distinção entre sementes germinadas e não germinadas, além de permitir a
marcação das sementes que germinaram e a comparação do seu desenvolvimento
em diferentes períodos de contagem (Figura 5).
43
7dias 14dias 21dias
42 dias
28dias 35dias
49 dias 56 dias 63 dias
FIGURA 3 - Fotografias digitais das avaliações semanais da germinação de
sementes de Cattleya sanguiloba antes do armazenamento a -18º C
44
7dias 14dias 21dias
28dias 35dias 42dias
49dias 56dias 63dias
70dias 77dias 77dias
FIGURA 4 - Fotografias digitais das avaliações semanais da germinação de
sementes de Cattleya purpurata antes do armazenamento a -18º C. No
último quadro a direita, detalhe de um protocórmio debilitado no 77º dia
de germinação
45
1 2
FIGURA 5 - Fotografias digitais da germinação de sementes de Cattleya intermedia
(1) e Cattleya hegeriana (2) antes do armazenamento, no 21º dia após
a semeadura. Imagens trabalhadas no software Adobe Photoshop®
CS3, pontos vermelhos utilizados para marcar sementes germinadas e
pontos azuis para marcar sementes não germinadas
Os testes de germinação foram conduzidos até o 56º dia após a
semeadura, pois os valores de germinação não aumentaram a partir do 49º dia e
após o 63º dia foi possível observar degradação do protocórmio. Isso está
evidenciado na Figura 4, onde está detalhado um protocórmio de Cattleya purpurata
bastante debilitado, mostrando a alteração de cor de verde para marrom,
desidratação e formação de camadas escuras ao seu redor. Como o experimento
envolveu a utilização de muitas espécies raras na natureza, houve interesse em
utilizar as plântulas em outros projetos, principalmente de reintrodução, e dessa
forma fizeram-se necessários os repiques destas plântulas para um novo meio.
Na Tabela 2 é possível observar que não houve perda da viabilidade
nas sementes armazenadas durante três meses a -18º C de acordo com os valores
de germinação total. Pelo contrário, em C. tenuis, C. mossiae, C. granulosa-I e C.
granulosa-II, foi possível observar um aumento significativo na germinação final após
o armazenamento, comparado com os dados iniciais. Este fato pode estar
relacionado a uma alteração da membrana após o processo de congelamento e
também a uma quebra de dormência (BEWLEY; BLACK, 1994). Em C. intermedia,
C. hegeriana, C. sanguiloba, C. leopoldii, C. walkeriana e C. purpurata houve uma
diminuição significativa nas germinações avaliadas ao 7º dia, porém ao 14º dia,
cinco dos seis lotes já apresentavam valores semelhantes de germinação antes e
46
após o armazenamento. Analisando as curvas de germinação, nas Figuras 6 e 7,
verifica-se que na porcentagem de germinação total não houve perda de viabilidade
para os dez lotes analisados. Em C. hegeriana, C. sanguiloba, C.leopoldii,
C.walkeriana e C. purpurata apresentaram uma germinação inicial menor após o
armazenamento das sementes em -18º C, porém no 28º dia ocorreu uma
sobreposição das curvas de germinação, igualando os valores de germinação total
para as sementes armazenadas e não armazenadas. Já as espécies C. tenuis, C.
granulosa (lote I), C. granulosa (lote II) e C. mossiae mantiveram as suas duas
curvas de germinação distintas (antes e após o armazenamento), sendo que os
valores de germinação após o armazenamento foram maiores para estes quatro
lotes.
TABELA 2 - Valores em porcentagem de sementes de orquídeas germinadas in vitro
antes e após três meses de armazenamento a -18
o
C avaliadas em
três períodos distintos
Germinação
7 dias 14 dias Total
Amostras
Início Após 3
meses
Início Após 3
meses
Início Após 3
meses
C. intermedia
84
a*
43
b
93
a
94
a
100
a
99
a
C. tenuis
16
a
17
a
21
b
49
a
59
b
73
a
C. hegeriana
87
a
53
b
97
a
98
a
98
a
99
a
C. sanguiloba
64
a
43
b
85
a
93
a
98
a
99
a
C. granulosa-I
63
a
65
a
80
b
96
a
91
b
99
a
C. leopoldii
81
a
50
b
97
a
97
a
100
a
99
a
C. walkeriana
54
a
43
b
79
a
67
b
94
a
96
a
C.purpurata
77
a
43
b
85
a
94
a
95
a
97
a
C. granulosa- II
44
a
44
a
64
b
96
a
86
b
99
a
C. mossiae
5
b
23
a
9
b
59
a
48
b
68
a
* Médias seguidas pela mesma letra, na horizontal dentro de cada período de avaliação da
germinação, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Comparando os valores dos Índices de Velocidade de Germinação
(IVG) antes e após o armazenamento a -18º C (Tabela 3), observou-se que em cinco
lotes (C. intermedia, C. hegeriana, C. sanguiloba, C. leopoldii e C. purpurata) houve
diminuição no potencial germinativo, pois ocorreu uma diminuição significativa dos
valores de IVG após os três meses de armazenamento. Em C. granulosa-I e C.
walkeriana mantiveram-se os valores, e em C. tenuis, C. granulosa-II e C. mossiae
47
ocorreu um aumento significativo nos valores de IVG após três meses de
armazenamento.
TABELA 3 - Valores de IVG (Índice de Velocidade de Germinação) de sementes de
orquídeas germinadas in vitro no início e após três meses de
armazenamento a -18
o
C
Amostras IVG
Início Após 3 meses
C. intermédia
12,9365
a*
10,0514
b
C. tenuis
4,0108
b
5,6468
a
C. hegeriana
13,2103
a
10,8609
b
C. sanguiloba
11,2383
a
9,9858
b
C. granulosa-I
10,6127
a
11,6524
a
C. leopoldii
12,8795
a
10,6131
b
C. walkeriana
10,1264
a
9,1256
a
C. purpurata
11,9678
a
9,8773
b
C. granulosa-II
8,5179
b
10,1599
a
C. mossiae
2,6129
b
6,1986
a
* Médias seguidas pela mesma letra, na horizontal, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a
5% de probabilidade.
48
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = 79,9786 + 12,0825 log (x) R
2
= 0,7167**
▲
y (A) = 30,0696 + 45,2077 log (x) R
2
= 0,6202**
Cattleya hegeriana
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = 36,7109 + 39,5702 log (x) R
2
= 0,8311**
▲
y (A) = 10,6209 + 57,4866 log (x) R
2
= 0,6931**
Cattleya sanguiloba
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = 70,3753 + 19,1459 log (x) R
2
= 0,7110**
▲
y (A) = 24,2847 + 48,9667 log (x) R
2
= 0,6405**
Cattleya leopoldii
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = 60,0311 + 21,7188 log (x) R
2
= 0,9480**
▲
y (A) = 12,3684 + 55,0995 log (x) R
2
= 0,6745**
Cattleya purpurata
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = -20,2118 + 46,9321 log (x) R
2
= 0,9442**
▲
y (A) = -7,3796 + 65,5349 log (x) R
2
= 0,9206**
Cattleya walkeriana
FIGURA 6 - Curvas de germinação dos cinco lotes de sementes de orquídeas
(Cattleya hegeriana, Cattleya sanguiloba, Cattleya walkeriana,
Cattleya leopoldii e Cattleya purpurata) avaliadas antes do
armazenamento (NA) e logo após três meses de armazenamento a
-18º C (A), realizadas em condições assimbióticas em meio de
cultura Knudson por um período de 49 dias. R
2
= coeficiente de
determinação. Equações ajustadas por regressão logarítmicas
significativas (P<0,05)
49
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = - 38,2570 + 57,009 log(x) R
2
=0,9206**
▲ y (A) = -31,5083 + 65,2965log (x) R
2
= 0,9406**
Cattleya tenuis
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = 46,5704 + 34,0148 log (x) R
2
= 0,6762**
▲
y (A) = 39,1677 + 32,6656 log (x) R
2
= 0,8982**
Cattleya granulosa (lote I)
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação( %) xx
Dias após a germinação
♦
y (NA) = 0,8657 + 53,0876 log (x) R
2
= 0,9652**
▲
y (A) = 14,3531 + 55,4692 log (x) R
2
= 0,6544**
Cattleya granulosa (lote II)
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após a semeadura
♦
y (NA) = -46,9055 + 57,3846 log (x) R
2
= 0,9323**
▲
y (A) = -7,5158 + 48,2993 log (x) R
2
= 0,8003**
Cattleya mossiae
0
20
40
60
80
100
120
7 142128354249
Germinação (%) xx
Dias após semeadura
♦
y (NA) = 30,9589 + 42,1918 log (x) R
2
= 0,8807**
▲
y (A) = 32,6113 + 42,7956 log (x) R
2
= 0,6464**
Cattleya intermedia
FIGURA 7 - Curvas de germinação dos cinco lotes de sementes de orquídeas
(Cattleya tenuis, Cattleya granulosa – lote I e II, Cattleya mossiae e
Cattleya intermedia) avaliadas antes do armazenamento (NA) e logo
após três meses de armazenamento a -18º C (A), realizadas em
condições assimbióticas em meio de cultura Knudson C por um
período de 49 dias. R
2
= coeficiente de determinação. Equações
ajustadas por regressão logarítmicas significativas (P<0,05)
50
Em relação ao teste de tetrazólio realizado com o pré-condicionamento
(Tratamento B) foi possível observar que não houve perda da viabilidade nas
sementes armazenadas durante três meses a -18º C. Pelo contrário em C.
intermedia, C. walkeriana e C. granulosa-II, observou-se aumento significativo na
viabilidade após o armazenamento comparado com a avaliação inicial. Para as
demais espécies a diminuição da viabilidade não foi significativa (Tabela 4). Este
fato pode estar relacionado a uma alteração da fluidez das membranas celulares do
embrião após o processo de congelamento, estimulando vias metabólicas para a
quebra de dormência (BEWLEY; BLACK, 1994). Resultados semelhantes foram
descritos para as espécies Angraecum magdalenae, Trichopilia tortilis, Calanthe
vestita e Calanthe gorey, submetidas ao armazenamento em nitrogênio líquido por
um período de trinta dias (NIKISHINA et al., 2001). Já para o teste de tetrazólio sem
pré-condicionamento, houve uma maior variação nos dados e C. sanguiloba
apresentou uma perda de viabilidade após o armazenamento. Em seis lotes de
sementes (C. intermedia, C. hegeriana, C. leopoldii, C. walkeriana, C. purpurata, C.
granulosa-II e C. mossiae) houve um aumento de viabilidade após o armazenamento
avaliadas pelo tratamento A, já no tratamento B apenas três lotes tiveram o mesmo
resultado (C. intermedia, C. walkeriana e C. granulosa-II).
TABELA 4 - Avaliação da qualidade fisiológica de sementes de orquídeas tropicais
pelo teste de tetrazólio. Tratamento A – amostras sem pré-
condicionamento e Tratamento B – amostras de sementes pré-
condicionadas em solução de sacarose 10%, por 24horas, no início e
após três meses do armazenamento a -18
o
C
Tratamento A
Tratamento B
Amostras Avaliação
inicial (%)
Avaliação após
3 meses (%)
Avaliação
inicial (%)
Avaliação após
3 meses (%)
C. intermedia
65
b*
92
a
94
b
97
a
C. tenuis
2
a
5
a
80
a
79
a
C. hegeriana
60
b
92
a
94
a
96
a
C. sanguiloba
63
a
53
b
96
a
98
a
C. granulosa-I
80
a
83
a
99
a
99
a
C. leopoldii
87
a
88
a
99
a
99
a
C. walkeriana
31
b
93
a
96
b
99
a
C. purpurata
75
b
81
a
95
a
98
a
C. granulosa-II
58
b
67
a
93
b
96
a
C. mossiae
8
b
34
a
67
a
70
a
* Médias seguidas pela mesma letra, na horizontal, dentro dos tratamentos, não diferem entre si
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
51
O uso da sacarose no pré-condicionamento melhorou a coloração das
sementes permitindo a melhor visualização das sementes viáveis (Figuras 1 e 2),
maior porcentagem de viabilidade (Tabela 4), além de apresentar uma maior
correlação com os testes de germinação realizados com sementes antes e após o
armazenamento a -18º C (Figuras 8 e 9). Para Gratapaglia e Machado (1998), o tipo
e a concentração dos açúcares são importantes para promover a germinação e o
crescimento de plântulas in vitro, assim como a própria manutenção de crescimento
da raiz. Isso pode ser indicativo de que a presença da solução de sacarose foi
importante para ativar o metabolismo dos embriões, aumentando a respiração
celular e, desta forma, permitindo uma melhor coloração das sementes viáveis.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20406080100120
Tetrazólio sem pré-condicionamento (%) xx
Germinação sementes não armazenadas (%)
y = -59,3273 + 1,2956 x R
2
= 0,6819**
Coeficiente de correlação linear = 0,8257
40
50
60
70
80
90
100
110
40 50 60 70 80 90 100 110
Tetrazólio com pré-condicionamento (%) xx
Germinação sementes não armazenadas (%)
Coeficientedecorrelaçãolinear=0,9218
y = 47,6043 + 0,5044 x R
2
= 0,8497**
A
B
FIGURA 8 - A - Correlação entre a viabilidade analisada pelo teste de tetrazólio
(Tratamento A) e o teste de germinação de sementes não
armazenadas; B - Correlação entre a viabilidade analisada pelo
teste de tetrazólio (Tratamento B) e o teste de germinação de
sementes não armazenadas. Coeficiente de correlação linear
significativo pelo teste t. R
2
= coeficiente de determinação
52
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
40 50 60 70 80 90 100 110
Tetrazólio sem pré-condicionamento (%) xx
Germinação sementes armazenadas (%)
y = -99,7159 + 1,8259 x R
2
= 0,5947**
Coeficientedecorrelaçãolinear=0,7712
100
40
50
60
70
80
90
100
110
40 50 60 70 80 90 100 110
Tetrazólio com pré-condicionamento (%) xx
Germinação sementes armazenadas (%)
y = 23,8080 + 0,7499 x R
2
= 0,9240**
Coeficientedecorrelaçãolinear=0,9240
A
B
FIGURA 9 - A - Correlação entre a viabilidade analisada pelo teste de tetrazólio
(Tratamento A) e o teste de germinação de sementes armazenadas por
um período de três meses a -18º C; B - Correlação entre a viabilidade
analisada pelo teste de tetrazólio (Tratamento B) e o teste de
germinação de sementes armazenadas por um período de três meses
a -18º C. Coeficiente de correlação linear significativo pelo teste t. R
2
=
coeficiente de determinação
No início do armazenamento o coeficiente de correlação linear entre os
testes de germinação e tetrazólio sem pré-condicionamento foi de 0,8257 e o
coeficiente de correlação linear com o pré-condicionamento em solução de sacarose
foi de 0,9218. Logo após o armazenamento a diferença entre os coeficientes de
correlação linear apresentou-se maior, entre os testes de germinação e tetrazólio
sem pré-condicionamento foi de 0,7712 e o coeficiente de correlação linear com o
pré-condicionamento em solução de sacarose foi de 0,9240.
Segundo Arditti (1992), quando a germinação das sementes ocorre sob
condições assimbióticas, o desenvolvimento do protocórmio se faz de forma similar,
desde que seja adicionada ao meio de cultura uma fonte adequada de carboidratos,
o que explica a ativação do embrião pela sacarose.
O uso da sacarose torna-se importante também pela dificuldade de
manipulação das sementes de orquídea, devido ao seu diminuto tamanho, que
inviabiliza a utilização de rolos de papel como acontece para sementes de grandes
culturas como soja e feijão (KRZYZANOWSKI, et al., 1999). Isto ocorre porque a
solução de sacarose mantém um maior equilíbrio osmótico entre a semente e o meio
externo, impedindo que a embebição em água direta cause injúrias ao seu
tegumento.
Outro aspecto importante em relação ao uso da sacarose está
relacionado ao fato da solução servir como um “colchão” para separar as sementes
53
de maior densidade, as quais contêm embriões com maior viabilidade (JORDÃO, et
al., 1998; PICOLO, et al., 2007), excluindo desta forma as sementes inviáveis
durante o processo de lavagem.
Quando submete-se as sementes diretamente à solução de tetrazólio,
sem pré-condicionamento, boa parte delas flutuam ou aderem às paredes dos
microtubos, diminuindo a área de contato com a solução de tetrazólio pois,
dependendo da espécie ocorre a presença de um espaço de ar interno (ARDITTI,
1992), desta forma as sementes colorem-se fracamente.
3.4 Conclusões
A análise da viabilidade das sementes submetidas aos testes de
tetrazólio e germinação através da digitalização de imagens mostrou-se eficiente
pela praticidade e controle das contagens.
Após três meses de armazenamento a -18º C não houve perda da
viabilidade das sementes de orquídeas, analisadas pelo teste de germinação e pelos
testes de tetrazólio, mas houve uma diminuição na velocidade de germinação de
cinco lotes (C. intermedia, C. hegeriana, C. sanguiloba, C. leopoldii e C. purpurata).
O teste de tetrazólio com pré-condicionamento em solução de sacarose
demonstrou maior correlação com o teste de germinação.
54
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