( PDF ) Estudos de otimização do protótipo antiinflamatório LASSBio-259

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências Matemáticas e da Natureza

Instituto de Química

Departamento de Química Orgânica

Rio de Janeiro

Agosto, 2006

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ESTUDOS DE OTIMIZAÇÃO DO PROTÓTIPO

ANTIINFLAMATÓRIO LASSBio-259

Débora Faoro

TESE DE DOUTORADO REALIZADA NO LABORATÓRIO DE AVALIAÇÃO E

SÍNTESE DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS (LASSBio) – FACULDADE DE

FARMÁCIA – UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO, SOB A

ORIENTAÇÃO DE:

PROF. DR. ELIEZER J. BARREIRO

PROF. DR. CARLOS ALBERTO MANSSOUR FRAGA

Rio de Janeiro

Agosto, 2006

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ESTUDOS DE OTIMIZAÇÃO DO -PROTÓTIPO

AINTIINFLAMATÓRIO LASSBio-259

Débora Faoro

Tese submetida ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências.

Aprovada por:

Eliezer J. Barreiro (LASSBio – FF – UFRJ) – Presidente

Carlos Alberto Manssour Fraga (LASSBio – FF – UFRJ)

Hugo Cerecetto (Universidad de la Republica - Uruguai)

Nilo Zanatta (DQ - UFSM)

Vitor Francisco Ferreira (IQ - UFF)

Lídia Moreira Lima (LASSBio – FF – UFRJ)

Ângelo da Cunha Pinto (DQO – IQ - UFRJ)

Carlos R. Kaiser (DQO - IQ - UFRJ)

iii

Tese apresentada como um dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor

em Ciências, junto ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de

Janeiro

FICHA CATALOGRÁFICA

FAORO, Débora.

Estudos de Otimização do Protótipo Antiinflamatório

LASSBio-259/

Débora Faoro. Rio de Janeiro: UFRJ/

Instituto de Química, 2006.

xxxi, 149 p.; ANEXO, 114 p.

(Tese) - Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Química, 2006.

1. Benzofenonas. 2. Antiinflamatórios.

3. Analgésicos. 4. Otimização estrutural.

5. Tese (Dout. – IQ-UFRJ).

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro

II. Título.

AGRADECIMENTOS

• Aos Professores Doutores Eliezer J. Barreiro e Carlos Alberto Manssour

Fraga, pelas discussões científicas e pela oportunidade de realizar o

trabalho no Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas

(LASSBio), Faculdade de Farmácia, UFRJ.

• À Profª. Dra. Ana Luísa Palhares de Miranda e seus orientados de inicição

cinetífica Cléverton Kleiton Freitas de Lima, Daniel F. Schulz e Milla Fumian

do LASSBio, Faculdade de Farmácia, UFRJ, pelo trabalho em colaboração

referente aos ensaios farmacológicos in vivo e in vitro, pelas discussões,

pela convivência diária no laboratório e pela amizade.

• Aos colegas e amigos Alexandra B. Lopes, Aline Fraga, Ana Paula

Rodrigues, André de Paula, Angélica Lima, Anna Benite, Arthur Kümmerle,

Bruno Andrade, Carolina de Mattos Duarte, Célia Correa, Cínthia Luna

Torreão, Cléverton Kleiton Freitas de Lima, Daniel Schulz, Danilo

Sant’anna, Débora Faoro, Fernanda Brito, Fernanda Oliveira, Fernando

Rodrigues, Gilberto Silva, Heleno Bezerra-Netto, Ibelza Melo, Jean Santos,

Leandro Silva, Luiz Romeiro, Mariana Duarte, Mariana Vilella, Márcia

Veloso, Milla Fumian, Monique Brito, Nelilma Romeiro, Ramon Leite,

Renata Lacerda, Ricardo Menegatti, Rodrigo Peres, Vagner Pinho, Valter

Gonçalves, do LASSBio, com os quais convivi durante a realização deste

trabalho.

• Ao grande amigo Jorge L. M. Tributino, pela amizade, convivência e apoio.

• Aos meus familiares Anete Terezinha Faoro, José Adilir Faoro, Gisele Faoro

e Leandro Faoro pelo total e incondicional apoio.

• Aos velhos e novos amigos gaúchos, mineiros e cariocas Ana Paula

Queiroz, Danilo, Edinéia Franz, Eduardo Costa Pinto, Evandro Goulart,

Fernanda Grave, Joel Franz, Maíra Refatti, Majulaine Copetti, Roberto

Queiroz, Rodrigo Rigon, Rodrigo Peres, Rogério Lourega, Simone Silva,

Shan Santo, Thiago, Wilson Cúnico, pela amizade e pelo suporte.

• À Rodrigo Correa, por todos os ótimos momentos e pelo grande incentivo

na etapa de redação da tese.

• À Central Analítica do IQ-UFRJ pelos espectros de ressonância magnética

nuclear e de infravermelho.

• Aos órgãos CNPq, CAPES, FUJB, FAPERJ e ao programa PRONEX, pelo

apoio financeiro.

• Antecipadamente, aos membros da banca examinadora pelo aceite do

convite.

vii

SUMÁRIO

RESUMO xi

ABSTRACT xiii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS xiv

ÍNDICE DE FIGURAS xvi

ÍNDICE DE ESQUEMAS xx

ÍNDICE DE TABELAS xxi

ÍNDICE DE GRÁFICOS xxiv

LISTA DE ESPECTROS xxvi

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. COMPOSTO-PROTÓTIPO 1

1.2. OTIMIZAÇÃO DO COMPOSTO-PROTÓTIPO 9

1.2.1 SIMPLIFICAÇÃO MOLECULAR 11

1.2.2 RESTRIÇÃO CONFORMACIONAL 15

1.2.3 BIOISOSTERISMO 19

1.2.4 ESTRATÉGIAS DE OTIMIZAÇÃO UTILIZANDO MODELAGEM

MOLECULAR

1.3 A DESCOBERTA DE NOVO CANDIDATO A PROTÓTIPO DE

FÁRMACO ANTIINFLAMATÓRIO (LASSBio-259)

2. OBJETIVOS E PLANEJAMENTO ESTRUTURAL 45

2.1 PLANEJAMENTO ESTRUTURAL DOS NOVOS COMPOSTOS 91-

95 A PARTIR DO COMPOSTO-PROTÓTIPO ANTIINFLAMATÓRIO E

ANALGÉSICO LASSBio-259

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 48

viii

3.1. SÍNTESE DOS NOVOS COMPOSTOS PLANEJADOS 48

3.1.1 SÍNTESE DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES 91 E 92,

PLANEJADOS ESTRUTURALMENTE A PARTIR DO COMPOSTO-

PROTÓTIPO ANTIINFLAMATÓRIO E ANALGÉSICO LASSBio-259

(85a)

3.1.2 SÍNTESE DOS NOVOS DERIVADOS DAS SÉRIES 93, 94 E 92,

PLANEJADOS ESTRUTURALMENTE A PARTIR DO COMPOSTO-

PROTÓTIPO ANTIINFLAMATÓRIO E ANALGÉSICO LASSBio-259

(85a)

3.2. AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS NOVOS COMPOSTOS

SINTETIZADOS

3.2.1. AVALIAÇÃO DO PERFIL ANTIINFLAMATÓRIO, ANALGÉSICO E

ANTIAGREGANTE PLAQUETÁRIO DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES

91 E 92

3.2.2. AVALIAÇÃO DO PERFIL ANTIINFLAMATÓRIO, ANALGÉSICO E

ANTIAGREGANTE PLAQUETÁRIO DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES

93, 94 E 95

4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 88

5. PARTE EXPERIMENTAL 90

5.1. SÍNTESE DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES (91-95) 90

5.1.1 OBTENÇÃO DO DERIVADO (1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANOL (97) (LAGES et al, 1998)

5.1.2 OBTENÇÃO DO DERIVADO 5-BENZIL-1,3-BENZODIOXOLA (99)

(LAGES et al, 1998)

5.1.3 OBTENÇÃO DO DERIVADO 5-BENZIL-6-NITRO-1,3- 95

BENZODIOXOLA (LASSBio-1067) (91a)

5.1.4 OBTENÇÃO DO DERIVADO 6-AMINO-5-BENZIL-1,3-

BENZODIOXOLA (LASSBio-1068) (91b) (LAGES et al, 1998)

5.1.5 OBTENÇÃO DO DERIVADO N-(6-BENZIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)ACETAMIDA (LASSBIO-1069) (91c) (LAGES et al, 1998)

5.1.6 OBTENÇÃO DO DERIVADO (1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANONA (100) (QUICI e REGEN, 1979)

101

5.1.7 OBTENÇÃO DO DERIVADO (6-NITRO-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANONA (LASSBiO-1045) (92a)

103

5.1.8 OBTENÇÃO DO DERIVADO (6-AMINO-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANONA (LASSBio-1046) (92b) (LAGES et al., 1998)

105

5.1.9 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS N-(6-BENZOIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)METANOSULFONAMIDA (LASSBio-1065) (92c) e

N-(6-BENZOIL-1,3-BENZODIOXOL-5-IL)ACETAMIDA(LASSBio-1066)

(92d) (LAGES et al., 1998)

107

5.1.10 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS 6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL(FENIL)METANONA SUBSTITUÍDAS (93a-c e 93h) (GRASSO et al.,

2000)

110

5.1.11 OBTENÇÃO DO DERIVADO (4-AMINOFENIL)(6-METIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)METANONA (LASSBio-976) (93d )(LAGES et al.,

1998)

114

5.1.12 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS N-{4-[(6-METIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)CARBONIL]FENIL}METANOSULFONAMIDA

(93e), N-{4-[(6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)CARBONIL]FENIL}ACETAMIDA (93f) e N-{4-[(6-METIL-1,3-

116

BENZODIOXOL-5-IL)CARBONIL]FENIL}BENZAMIDA (93g) (LAGES et

al., 1998)

5.1.13 OBTENÇÃO DO DERIVADO ÁCIDO 4-[(6-METIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)CARBONIL]BENZOICO (LASSBio-1042) (93i)

119

5.1.14 OBTENÇÃO DO DERIVADO 4-[(6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)CARBONIL]BENZOIDRAZIDA (LASSBio-1043) (93j)

121

5.1.15 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS (6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)[4-(METILSULFONIL)FENIL]METANOL (LASSBio-974) (94a) e (6-

METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-IL)(4-NITROFENIL)METANOL (LASSBio-

1040) (94b) (BARREIRO, et al., 1985)

123

5.1.16 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS 5-METIL-6-[4-

METILSULFONIL)BENZIL]-1,3-BENZODIOXOLA (LASSBio-975) (95a)

E 5-METIL-6-(4-NITROFENIL)-1,3-BENZODIOXOLA (LASSBio-1041)

(95b) (LAGES et al., 1998)

126

5.2 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS COMPOSTOS (91-95) 129

5.2.1 ENSAIO DE EDEMA DE PATA DE RATO INDUZIDO POR

CARRAGENINA (FERREIRA,1979)

129

5.2.2 POTENCIAL ULCEROGÊNICO (CHAN et al., 1995)

130

5.2.3 ENSAIO DE CONTORÇÃO ABDOMINAL INDUZIDA POR ÁCIDO

ACÉTICO (WHITTLE, 1964; COOLIER et al., 1968)

131

5.2.4 ENSAIO DA PLACA QUENTE EM CAMUNDONGOS (KURAISHI

et.al., 1983)

132

5.2.5 ENSAIO DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA INDUZIDA POR

ÁCIDO ARAQUIDÔNICO, COLÁGENO E ADP (BORN & CROSS, 1968)

133

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 134

RESUMO

O presente trabalho descreve o planejamento, a síntese e a

avaliação das propriedades farmacológicas de novos derivados 1,3-

benzodioxólicos funcionalizados (91 - 95), planejados estruturalmente como

análogos otimizados do protótipo LASSBio-259 (85a), candidatos a protótipos

de fármacos analgésicos e antiinflamatórios.

Os novos derivados sintetizados (91 - 95) foram submetidos a

ensaios in vivo em protocolos clássicos de inflamação e analgesia,

identificando-se os derivados N-(6-benzoil-1,3-benzodioxol-5-

il)metanosulfonamida (LASSBio-1065) (92c), (6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)(4-

nitrofenil)metanona (LASSBio-973) e N-{4-[(6-metil-1,3-benzodioxol-5-

il)carbonil]fenil}acetamida (LASSBio-986) (93f) como candidatos mais

promissores.

O derivado LASSBio-1065 (92c) foi capaz de inibir o edema de pata

de rato induzido por carragenina em 32,5% (100 µmol/kg, p.o.) e as contorções

abdominais induzidas pro ácido acético em camundongos em 36,7% (100

µmol/kg, p.o.). Em contraste, os derivados da série 93 apresentaram um perfil

analgésico predominante. Os compostos LASSBio (973) (93c) e LASSBio-986

(93f) apresentaram importantes efeitos analgésicos centrais e periféricos (ED

= 20,54 µmol/kg e 54,94 µmol/kg, respectivamente).

Desta forma, constatou-se que os estudos de otimização estrutural

do composto-protótipo antiinflamatório e analgésico LASSBio-259 (85a)

resultou na obtenção de novos compostos-protótipos, i.e. LASSBio-1065 (92c),

LASSBio-973 (93c) e LASSBio-986 (93f), demonstrando a importância das

xii

estratégias de modificação molecular da Química Medicinal para o

planejamento racional de novos candidatos a fármacos.

xiii

ABSTRACT

We describe herein the design, synthesis and pharmacological

evaluation of new functionalized 1,3-benzodioxole derivatives (91 - 95),

structurally designed as novel optimized analogs of lead LASSBio-259 (85a),

candidates to anti-inflammatory and analgesic lead-compounds.

The new synthesized derivatives (91 - 95) were submitted to in vivo

classical inflammation and analgesic assays, in which N-(6-benzoyl-1,3-

benzodioxol-5-yl)methanesulfonamide (LASSBio-1065) (92c), (6-methyl-1,3-

benzodioxol-5-yl)(4-nitrophenyl)methanone (LASSBio-973) (93c) and N-{4-[(6-

methyl-1,3-benzodioxol-5-yl)carbonyl]phenyl}acetamide (LASSBio-986) (93f)

derivatives as the most promising candidates.

LASSBio-1065 (92c) was able to reduce the carragenaan-induced rat

paw edema in 32.5% (100 µmol/kg, p.o.) and the acetic acid solution-induced

constrictions in mouse in 36.7% (100 µmol/kg, p.o.). While the new derivatives

93 presented very important analgesic activity profile. LASSBio-973 (93c) and

LASSBio-986 (93f) have presented important central and peripheral (ED

20.54 µmol/kg and 54.94 µmol/kg, respectively).analgesics profiles.

Finally, the rational basis adopted for the optimization of anti-

inflammatory and analgesic properties of the lead-compound LASSBio-259

(85a) was successful, resulting in the identification of novel lead-compounds,

i.e. LASSBio-1065 (92c), LASSBio-973 (93c) and LASSBio-986 (93f), showing

the importance of molecular modification strategies of Medicinal Chemistry for

rational design of new candidates of drugs.

xiv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

δ - deslocamento químico

AA - ácido araquidônico

ADME – absorção, distribuição, metabolização e excreção

ADMET – absorção, distribuição, metabolização, excreção e propriedades

toxicológicas

ADP – dofsfato de adenosina

AINEs – antiinlamatórios não-esteroidais

Cat-G – catepsina-G

CCF - cromatografia em camada fina

CoMFA – Comparative Molecular Field Analysis

CoMSIA - Comparative Molecular Similarity Indices Analysis

COX -ciclooxigenase

- dose efetiva para alcançar 50% do efeito máximo

GPVI – glicoproteína VI

Hz - Hertz

- concentração inibitória de 50% da atividade máxima

IGF – interconversão de grupos funcionais

IV - infravermelho

J - constante de acoplamento

ligação-H - ligação de hidrogênio

PD – fase farmacodinâmica

PDB – Protein Data Bank

PRP – plasma rico em plaquetas

ppm - partes por milhão

RMN - ressonância magnética nuclear

QSAR – relação quantitativa entre a estrutura química e a atividade

SAR – relação estrutura química e atividade

SNC - sistema nervoso central

TNFα – fator de necrose tumoral alfa

TXA

- tromboxana A

TXS – tromboxana sintase

UV - ultravioleta

xvi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Exemplos de interações fármacos-biorreceptores (adaptado de

SILVERMAN, 2004).............................................................................................9

Figura 2 – Estudos de relação entre a estrutura-química e a atividade biológica

(SAR) de derivados da morfina (15) (adaptado de MCCURDY, 2006).............11

Figura 3 - Simplificações moleculares sucessivas (representadas em vermelho)

do protótipo natural morfina (15)........................................................................13

Figura 4 – Simplificação molecular da quinina (31)..........................................14

Figura 5 – Simplificação molecular da guanosina (36), originando o fámaco

aciclovir (37) (ELION, 1977)..............................................................................15

Figura 6 – Restrição conformacional na gênese do remoxiprida (42) a partir

das benzamidas (adaptado de BARREIRO e FRAGA, 2001)...........................17

Figura 7 – Restrição conformacional da morfina (15).......................................18

Figura 8 – Gênese dos fármacos frovatriptano (47) e naratriptano (48) por

anelação da triptamida (45) e sumatriptano (46), respectivamente (adaptado de

BARREIRO e FRAGA, 2001; SANDERS-BUSH e MAYER, 2003)...................19

Figura 9 – Bioisosterismo entre hidroxila fenólica em (50) pela subunidade

metilsulfonilamino em (51), antagonistas de receptores GNRh (LIN et al.,

2001)..................................................................................................................22

Figura 10 – Troca isostérica da hidroxila fenólica em (52) pela subunidade

metilsulfonilamino em (53) resultando num decréscimo de afinidade..............22

Figura 11 - Utilização do bioisosterismo clássico de átomos divalentes na

otimização do protótipo talidomida (54) (adaptado de ZHU et al., 2003)..........23

xvii

Figura 12 – Bioisosterismo clássico de anéis na gênese de antiinflamatórios

não-esteroidais de segunda geração.................................................................24

Figura 13 – Gênese de novos derivados ativadores de canais de K

ATP

(64) e

(65) pela troca bioisostérica da subunidade N-cianoguanidina presente no

pinavidil (63) (adaptado de BUTERA et al., 2000; LIMA e BARREIRO,

2005)..................................................................................................................25

Figura 14 – (A) Representação do composto (66) no sítio ativo da catepsina G;

(B) Interações de ligação de hidrogênio do composto (66) no sítio ativo

representadas pelas linhas pontilhadas vermelhas; (C) Representação

esquemática das interações do composto (66) no sítio ativo da catepsina G

(adaptado de GRECO et al, 2002; MARYANOFF, 2004)..................................27

Figura 15 – Estrutura e atividade dos novos derivados obtidos de inibidores de

catepsina-G e a representação do composto mais potente (72) no sítio ativo da

enzima obtida através de estudos de docking (adaptado GRECO et al, 2002;

MARYANOFF, 2004).........................................................................................29

Figura 16 – Banco de dados utilizado para os estudos de QSAR 3D e docking

flexível (SHENG et al., 2006).............................................................................30

Figura 17 – (A) Mapa de contorno do campo eletrostático do CoMFA – áreas

favoráveis a substituintes positivamente carregados em vermelho; (B) Mapa de

contorno do campo estérico do CoMFA - áreas estericamente favorecidas em

verde; (C) Mapa de contorno do campo hidrofóbico do CoMSIA – regiões

favorecidas com substituintes hidrofóbicos em verde; (D) Resultado do docking

flexível do composto (72) no sítio ativo da CACYP51 (adaptado de SHENG et

al., 2006)............................................................................................................31

xviii

Figura 18 - Modelo farmacofórico baseado no biorreceptor-alvo e gênese das

novas séries de agentes antifúngicos planejadas racionalmente (adaptado

SHENG et al., 2006)..........................................................................................34

Figura 19 – Índice de seletividade (IS = IC

COX-1/IC

COX-2) dos AINESs:

indometacina (79), celecoxib (60) e etoricoxib (62) no modelo de sangue total

(RIENDEAU et al.,2001)....................................................................................35

Figura 20 – Índice de seletividade (IS = IC

COX-1/IC

COX-2) dos sulidos:

nimesulido (80), NS-398 (81), flosulido (82) e L-745,337 (83). (A) Inibição de

COX-1 e COX-2 no modelo de sangue total (DANNHARDT e KIEFER, 2001;

RIENDEAU et al.,2001); (B) Inibição da produção de PGE

em células CHO

trasfectadas com COX-1 e COX-2 humanas (LI et al., 1995; RIENDEAU et

al.,1997).............................................................................................................36

Figura 21 – Planejamento estrutural dos safrosulidos 85 a partir do flosulido

(82) (LAGES et al., 1998)..................................................................................37

Figura 22 – Estudos de dinâmica molecular dos derivados (85). (A)

Sobreposição dos complexos entre os retroisósteros (85a, LASSBio-259) e

(85c) e os resíduos do sítio ativo da COX-2; (B) Representação do complexo

entre (85d) e os resíduos do sítio ativo da COX-2 (RODRIGUES et al.,

1998)..................................................................................................................40

Figura 23 – Planejamento estrutural das novas séries de derivados 91 - 95 a

partir do composto-protótipo antiinflamatório e analgésico LASSBio-259

(85a)...................................................................................................................47

Figura 24 – Espectro de ultra-violeta da benzofenona (100)............................53

xix

Figura 25 – Principais bandas de absorção nos espectros de IV dos compostos

(100), (91c), (92c) e (92d) caracterizando a participação de ligação-H

intramolecular em (92c) e (92d)........................................................................55

ÍNDICE DE ESQUEMAS

Esquema 1 – Análise retrossintética dos novos compostos das séries 91 e 92

planejados estruturalmente a partir do composto-protótipo antiinflamatório e

analgésico LASSBIO-259 (85a).........................................................................49

Esquema 2 – Rota sintética para a obtenção dos derivados das séries 91 e 92

a partir do safrol (84)..........................................................................................52

Esquema 3 – Análise retrossintética dos compostos das séries 94, 95 e 96

planejados estruturalmente a partir do composto-protótipo antiinflamatório e

analgésico LASSBio-259 (85a)..........................................................................56

Esquema 4 – Rota sintética para a obtenção dos compostos da série 93 a

partir do safrol (84).............................................................................................58

Esquema 5 – Rota sintética para a obtenção dos compostos das séries 94 e 95

a partir das benzofenonas 93, correspondentes................................................60

xxi

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 - Processo de otimização de compostos-protótipos a fármacos, com

aumento do peso molecular e da lipofilicidade(TEAGUE, et al., 1999)...............5

Tabela 2 - Comparação estatística das propriedades moleculares* de fármacos

de diferentes bancos de dados com biodisponibilidade oral versus paclitaxel

(18).......................................................................................................................7

Tabela 3 - Ensaio de pleurisia induzido por carragenina em camundongos dos

derivados (85a-d) e nimesulido (80) (LAGES et al., 1998)...............................38

Tabela 4 – IC

COX-1 e COX-2 dos derivados benzofenônicos (87) (adaptado

de DANHARDT et al., 2002)..............................................................................42

Tabela 5 – Inibição da COX-1 e COX-2 dos derivados 88 e 89 no ensaio de

sangue total humano (HWB) (KHANAPURE et al., 2003).................................44

Tabela 6 – Fórmula molecular, peso molecular, ponto de fusão, aspecto físico e

rendimento global da síntese dos compostos (91a-c) e (91a-

d)........................................................................................................................55

Tabela 7 – Fórmula molecular, peso molecular, ponto de fusão, aspecto físico e

rendimento global da síntese dos novos compostos da série

93.......................................................................................................................59

Tabela 8 – Fórmula molecular, peso molecular, ponto de fusão, aspecto físico e

rendimento global da síntese dos compostos (94a), (94b) (95a) e

(95b)..................................................................................................................61

Tabela 9 – Efeitos antiedematogênicos dos derivados (91a-c) e (92a-d) no

ensaio de edema de pata de rato induzido por carragenina..............................63

xxii

Tabela 10 – Efeitos antinociceptivos dos novos derivados (91a-c) e (92a-d) no

ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético.........................67

Tabela 11 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos

LASSBio-1069 (91c), LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) em plasma

rico em plaquetas (PRP) de coelho induzido por ácido araquidônico (AA).......70

Tabela 12 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos

LASSBio-1069 (91c), LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) em plasma

rico em plaquetas (PRP) de coelho induzido por colágeno...............................70

Tabela 13 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos

LASSBio-1069 (91c), LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) em plasma

rico em plaquetas (PRP) de coelho induzido por ADP......................................71

Tabela 14 – Efeitos antiedematogênicos dos derivados (93a-j), (94a-b) e (95a-

b) no ensaio de edema de pata de rato induzido por carragenina....................73

Tabela 15 – Efeitos antiedematogênicos do derivado LASSBio-973 (93c) no

ensaio de edema de pata de rato induzido por carragenina nas doses de 10 –

600 µmol/kg.......................................................................................................75

Tabela 16 – Efeitos antinociceptivos dos derivados (93a-j), (94a-b) e (95a-b)

no ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético em

camundongos....................................................................................................77

Tabela 17 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos

LASSBio-971 (93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93d) e LASSBio-986

(93f) em plasma rico em plaquetas (PRP) de coelho induzido por ácido

araquidônico (AA)..............................................................................................85

xxiii

Tabela 18 Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos LASSBio-

971 (93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93d) e LASSBio-986 (93f) em

plasma rico em plaquetas (PRP) de coelho induzido por colágeno..................86

Tabela 19 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos

LASSBio-971 (93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93d) e LASSBio-986

(93f) em plasma rico em plaquetas (PRP) de coelho induzido por ADP..........86

xxiv

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Atividade antiinflamatória no modelo de edema de pata de rato

induzido por carragenina dos compostos (91a e c) e (92a-d), administrados por

via oral na dose de 100 µmol/kg........................................................................64

Gráfico 2 - Atividade antiinflamatória no modelo de edema de pata de rato

induzido por carragenina do composto (91b), administrado por via oral na dose

de 100 µmol/kg..................................................................................................65

Gráfico 3 - Atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais

induzidas por ácido acético em camundongos dos compostos (91a e c) e (92a-

d), administrados por via oral na dose de 100 µmol/kg.....................................68

Gráfico 4- Atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais

induzidas por ácido acético em camundongos do composto (91b), administrado

por via oral na dose de 100 µmol/kg..................................................................68

Gráfico 5- Atividade antiinflamatória no modelo de edema de pata de rato

induzido por carragenina dos compostos das séries 93, 94 e 95, administrados

por via oral na dose de 100 µmol/kg..................................................................72

Gráfico 6 - Atividade antiedematogênica no modelo d edema de pata de rato

induzido por carragenina do composto LASSBio-973 (93c), administrado via

oral e via intraperitoneal (IP) na dose de 300 µmol/kg......................................76

Gráfico 7 - Atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais

induzidas por ácido acético em camundongos dos compostos das séries 93, 94

e 95, administrados por via oral na dose de 100 µmol/kg.................................78

xxv

Gráfico 8 – Curva dose-resposta no modelo de contorções abdominais

induzidas por ácido acético em camundongos do derivado LASSBio-973

(93c)...................................................................................................................80

Gráfico 9 – Curva dose-resposta no modelo de contorções abdominais

induzidas por ácido acético em camundongos do derivado LASSBio-986

(93f)...................................................................................................................81

Gráfico 10– Efeito analgésico dos derivados LASSBio-971 (93a) e LASSBio-

976 (93d) (100 µmol/kg) e acetaminofeno (90) (300 µmol/kg) no ensaio da

placa quente, doses administradas por via oral.................................................83

Gráfico 11 – Efeito analgésico do derivado LASSBio-973 (93c) (100 µmol/kg e

300 µmol/kg) e acetaminofeno (90) (300 µmol/kg) no ensaio da placa quente,

doses administradas por via oral.......................................................................83

Gráfico 12– Efeito analgésico do derivado LASSBio-986 (93f) (100 µmol/kg e

300 µmol/kg) e acetaminofeno (90) (300 µmol/kg) no ensaio da placa quente,

doses administradas por via oral.......................................................................84

xxvi

LISTA DE ESPECTROS

Espectro 1 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (97).

Espectro 2 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (97).

Espectro 3 – Experimento de DEPT-135 do derivado (97).

Espectro 4 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (99).

Espectro 5 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (99).

Espectro 6 – Experimento de DEPT-135 do derivado (99).

Espectro 7 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (91a).

Espectro 8 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (91a).

Espectro 9 – Experimento de DEPT-135 do derivado (91a).

Espectro 10 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(91a).

Espectro 11 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (91b).

Espectro 12 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (91b).

Espectro 13 – Experimento de DEPT-135 do derivado (91b).

Espectro 14 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (91c).

Espectro 15 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (91c).

Espectro 16 – Experimento de DEPT-135 do derivado (91c).

Espectro 17 – Experimento de HMBC para o derivado (91c).

Espectro 18 – Experimento de HMBC para o derivado (91c).

Espectro 19 – Experimento de HMBC para o derivado (91c).

Espectro 20 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(91c).

Espectro 21 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (100).

xxvii

Espectro 21 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (100).

Espectro 23 – Experimento de DEPT-135do derivado (100).

Espectro 24 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(100).

Espectro 25 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92a).

Espectro 26 – Expansão do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de

1H do derivado (92a).

Espectro 27 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (92a).

Espectro 28 – Experimento de DEPT-135 do derivado (92a).

Espectro 29 – Experimento de HMBC para o derivado (92a).

Espectro 30 – Experimento de HMBC para o derivado (92a).

Espectro 31 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr para o

derivado (92a).

Espectro 32 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92b).

Espectro 33 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (92b).

Espectro 34 – Experimento de DEPT-135 para o derivado (92b).

Espectro 35 – Experimento de HMBC para o derivado (92b).

Espectro 36 – Experimento de HMBC para o derivado (92b).

Espectro 37 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr para o

derivado (92b).

Espectro 38 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (92c).

Espectro 39 – Expansão do espectro Ressonância Magnética Nuclear de 1H

do derivado (92c).

Espectro 40 - Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (92c).

Espectro 41 – Experimento de DEPT-135 do derivado (92c).

xxviii

Espectro 42 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr para o

derivado (92c).

Espectro 43 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92d).

Espectro 44 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (92d).

Espectro 45 – Experimento de DEPT-135 do derivado (92d).

Espectro 46 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(92d).

Espectro 47 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93a).

Espectro 48 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93a).

Espectro 49 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93a).

Espectro 50 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93a).

Espectro 51 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93b).

Espectro 52 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93b).

Espectro 53 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93b).

Espectro 54 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93c).

Espectro 55 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93c).

Espectro 56 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93c).

Espectro 57 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

Espectro 58 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

Espectro 59 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

Espectro 60 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

Espectro 61 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93c).

xxix

Espectro 62 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93d).

Espectro 63 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93d).

Espectro 64 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93d).

Espectro 65 – Experimento de HMBC para o derivado (93d).

Espectro 66 – Experimento de HMBC para o derivado (93d).

Espectro 67 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93d).

Espectro 68 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93e).

Espectro 69 – Expansão do espectro Ressonância Magnética Nuclear de 1H

do derivado (93e).

Espectro 70 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93e).

Espectro 71 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93e).

Espectro 72 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93e).

Espectro 73 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (94f).

Espectro 74 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (94f).

Espectro 75 – Experimento de DEPT-135 do derivado (94f).

Espectro 76 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(94f).

Espectro 77 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (93g).

Espectro 78 – Expansão do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de

1H do derivado (93g).

Espectro 79 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (93g).

Espectro 80 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado

(93g).

xxx

Espectro 81 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93g).

Espectro 82 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (93h).

Espectro 83 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (93h).

Espectro 84 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93h).

Espectro 85 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93h).

Espectro 86 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (93i).

Espectro 87 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (93i).

Espectro 88 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (93i).

Espectro 89 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado

(93i).

Espectro 90 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93i).

Espectro 91 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (93j).

Espectro 92 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (93j).

Espectro 93 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado

(93j).

Espectro 94 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(93j).

Espectro 95 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (94a).

Espectro 96 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (94a).

Espectro 97 – Experimento de DEPT-135 do derivado (94a).

Espectro 98 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(94a).

xxxi

Espectro 99 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (94b).

Espectro 100 – Expansão do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de

1H do derivado (94b).

Espectro 101 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (94b).

Espectro 102 – Experimento de DEPT-135 para o derivado (94b).

Espectro 103 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(94b).

Espectro 104 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (95a).

Espectro 105 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (95a).

Espectro 106 – Experimento de DEPT-135 do derivado (95a).

Espectro 107 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(95a).

Espectro 108 – Ressonância Magnética Nuclear de 1H do derivado (95b).

Espectro 109 – Ressonância Magnética Nuclear de 13C do derivado (95b).

Espectro 110 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

Espectro 111 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

Espectro 112 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

Espectro 113 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

Espectro 114 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado

(95b).

1.1 COMPOSTO-PROTÓTIPO:

A Química Medicinal se dedica a estudar as razões moleculares da

ação dos fármacos, a relação entre a estrutura química e a atividade

farmacológica, incluindo o planejamento e o desenho estrutural de novas

substâncias, sua síntese e a otimização de seu perfil farmacoterapêutico

(BUSSE et al., 1996; WERMUTH et al., 1998). É uma tarefa complexa que

envolve uma multiplicidade de fatores responsáveis pela resposta biológica de

um fármaco que precisa apresentar elevada eficácia, reflexo das propriedades

farmacodinâmicas e farmacocinéticas, além de possuir reduzida toxicidade

(BARREIRO e FRAGA, 2001; BARREIRO e FRAGA, 2005).

Dentre as diversas estratégias modernas de planejamento racional

de novos fármacos disponíveis, a principal se baseia no mecanismo de ação

farmacológico pretendido e se denomina abordagem fisiológica (GANELLIN,

1993). Esta estratégia fundamenta-se no prévio conhecimento do processo

fisiopatológico, com a conseqüente eleição do alvo-terapêutico mais adequado

para seu tratamento e a partir deste, o planejamento de novos padrões

estruturais bioativos in vivo, que correspondem a novos candidatos a

compostos-protótipos de fármacos (LINDSAY, 2003; BARREIRO e FRAGA,

2005).

Muitos esforços têm sido feitos para definir as propriedades que

melhor caracterizam um composto-protótipo. Primeiramente, o composto-

protótipo deve apresentar alguma atividade farmacológica, podendo ser baixa

ou não-seletiva, mas detectada em modelos in vivo. Deve ser parte de uma

série congênere, de modo a permitir identificar-se quais modificações

estruturais irão modular a atividade farmacológica (SAR – Structure-Activity

Relationships). O prévio conhecimento das distintas contribuições

farmacofóricas de diferentes subunidades estruturais da molécula do

composto-protótipo é extremamente importante, uma vez que as modificações

moleculares devem ser introduzidas de maneira a preservá-las, assegurando,

assim, seu reconhecimento molecular pelo biorreceptor e em conseqüência seu

perfil de atividade farmacológica.

O composto-protótipo não deve apresentar características

extremamente polares ou lipofílicas, as quais podem representar limitações em

termos de biodisponibilidade e, certamente, não deve conter grupamentos

toxicofóricos ou capazes de produzir metabólitos reativos. Não é desejável,

também, que o farmacóforo interaja irreversivelmente com a biomacromolécula

alvo, apesar da existência de fármacos de reconhecido sucesso terapêutico,

tais como, o ácido acetilsalicílico (1) (AMANN e PESKAR, 2002), a penicilina

(2) (BULYCHEV et al., 1997) e o omeprazol (3) (SHAMBUREK e SHUBERT,

1993) que atuam como inibidores enzimáticos pseudo-irreversíveis e

irreversíveis, respectivamente, i.e., ligando-se ao sítio receptor através de

ligações covalentes.

OCH

COOH

(1)

Ácido acetilsalicílico

(2)

Penicilina G

(3)

Omeprazol

Uma vez descoberto o novo composto-protótipo, a etapa seguinte

consiste em sua otimização estrutural. Esta etapa se caracteriza por uma

seqüência hierárquica de decisões, onde o aprimoramento de certas

propriedades do protótipo, leva a novo análogo, que por sua vez, é otimizado

seqüencialmente até que o candidato final com todas as propriedades

farmacocinéticas e farmacodinâmicas desejadas seja eleito para o início das

investigações clínicas (SILVERMAN, 2004).

O processo de otimização estrutural de compostos-protótipos gera

novos derivados, geralmente, de peso molecular superior e mais lipofílicos que

o original, como ilustrado na Tabela 1 (TEAGUE et al., 1999; OPREA et al.,

2001; HANN et al., 2001; CARR e HANN, 2002; OPREA, 2002; PROUDFOOT,

2002; RISHTON, 2003). Observa-se, pela Tabela 1, alguns exemplos de

compostos-protótipos de origem endógena ou sintética que apresentam pesos

moleculares inferiores a 350 unidades de massa atômica (u.m.a) e lipofilicidade

expressa pelo log P (P = coeficiente de partição n-octanol / água), inferior a 3 e

os fármacos originados através de sua otimização estrutural, apresentando um

aumento nestas propriedades (TEAGUE et al., 1999).

Por outro lado, a “regra dos cinco”, postulada por Lipinski (LIPINSKI

et al., 1997; LIPINSKI, 2004), demanda que os compostos candidatos a

fármacos devam ter o peso molecular ca. 500 u.m.a e lipofilicidade <5, com no

máximo 5 pontos doadores de ligação de hidrogênio (ligação-H) e não mais

que 10 aceptores de ligação-H em sua estrutura, sendo que, a violação de dois

ou mais desses ítens aumenta, significativamente, segundo o autor, o risco dos

compostos-protótipos apresentarem baixa biodisponibilidade oral.

Tabela 1 - Processo de otimização de compostos-protótipos a fármacos, com aumento

do peso molecular e da lipofilicidade (adaptado de TEAGUE, et al., 1999).

PM = 103

log P = -0,64

PM = 213

log P = 1,56

PM = 103

log P = -0,64

PM = 213

log P = 1,56

PM = 111

log P = -0,84

PM = 274

log P = 3,39

PM = 111

log P = -0,84

PM = 274

log P = 3,39

(4)

Histamina

(5)

Clorfeniramina

PM = 111

log P = -0,84

PM =252

log P = 0,36

(4)

Histamina

PM = 111

log P = -0,84

PM =252

log P = 0,36

PM = 111

log P = -0,84

PM =252

log P = 0,36

(4)

Histamina

N N

(6)

Cimetidina

(7)

GABA

(8)

Baclofeno

(9)

Sulfanilamida

PM = 172

log P = -0,72

PM = 295

log P = -0,03

PM = 172

log P = -0,72

PM = 295

log P = -0,03

Canais de Cl

(10)

Clorotiazida

(11)

Clorotiazida

PM = 295

log P = -0,03

PM = 330

log P = 2,92

PM = 295

log P = -0,03

PM = 330

log P = 2,92

Canais de Cl

(12)

Furosemida

PM = 351

log P = 3,18

PM = 422

log P = 3,5

PM = 351

log P = 3,18

PM = 422

log P = 3,5

Ang II

(13)

S-8307

(14)

Losartano

Composto-

protótipo*

protótipo* Fármaco

Antialérgico

Anti-úlcera

Antiespasmódico

Diurético

Anti-hipertensivo

Alvo terapêutico

Composto-protótipo de origem endógena ou sintética.

Em contraste, variações estruturais de produtos naturais complexos,

tais como a morfina (15), quinina (16) ou tubocurarina (17), permitiram a

obtenção de análogos mais simples que apresentaram potentes propriedades

farmacológicas, comparáveis ao composto-protótipo natural (BARREIRO, 1990;

BARREIRO, 2002).

OCH

OHHO

(15)

Morfina

(16)

Quinina

(17)

Tubocurarina

Alguns grupos de pesquisa têm relacionado a área de superfície

polar de substâncias bioativas (KELDER et al,. 1999; BERGSTRÖM et al.,

2003), bem como sua flexibilidade (VEBER et al., 2002), avaliada em função do

número de graus de liberdade torsional, como os principais fatores

determinantes à sua biodisponibilidade.

As propriedades moleculares de alguns fármacos e de protótipos

candidatos a fármacos têm sido investigadas por diversos grupos de pesquisa

(OPREA, 2002; WENLOCK et al., 2003; BLAKE, 2003; LEESON e DAVIS,

2004; VIETH et al., 2004; PROUDFOOT, 2005; PROUDFOOT, 2006). A Tabela

2 ilustra o resultado obtido nestas análises, utilizando-se diferentes bancos de

dados de fármacos, com o perfil de biodisponibilidade por via oral, para alguns

parâmetros moleculares contidos na “regra dos cinco”, como peso molecular,

log P, número de pontos doadores e aceptores de ligação-H. Os valores

obtidos foram comparados com correspondentes obtidos para o paclitaxel (18)

(Taxol), fármaco antineoplásico administrado na forma de infusão venosa.

AcO

(18)

Paclitaxel

Tabela 2 - Comparação estatística das propriedades moleculares* de fármacos de

diferentes bancos de dados com biodisponibilidade oral versus paclitaxel (18):

Parâmetros Lipinski

Wenlock

Vieth

Proudfoot

Paclitaxel (18)

Número de fármacos orais 2245 594 1193 1791 -

PM 500 473 475 469 839,96

Log P 5 5,5 5,2 4,8 6,93

Sítio doador de H 5 4 3 3 4

Sítio aceptor de H 10 7 9 9 14

* As propriedades se referem a uma distribuição de 90% do espaço molecular analisado.

(a) LIPINSKI et al., 1997; (b) WENLOCK et al., 2003; (c) VIETH et al., 2004; (d) PROUDFOOT,

2005; (e) ISLAM et al., 2003

Estima-se que, em média, 25% dos candidatos a fármacos em fase

clínica não entram no mercado devido a limitações quanto às propriedades

farmacocinéticos, i.e., relacionados aos processos de absorção, distribuição,

metabolização e excreção (ADME) (BUGRIM, 2004), além disso, ca. 50% dos

fármacos que estão no mercado apresentam alguma limitação em termos de

suas propriedades ADME e toxicológicas (ADMET) (HODGSON, 2001). A

investigação precoce das propriedades ADMET, já nas fases iniciais do

processo da descoberta de fármacos, representa ponto muito importante para a

redução dos riscos de insucesso em termos de otimização dos compostos-

protótipos. A determinação das propriedades físico-químicas dos novos

compostos-protótipos, tais como, constante de ionização (pKa), lipofilicidade

(log P) e estudos metabólicos in vitro e in silico, utilizando-se enzimas CYPs

clonadas ou aplicando-se programas computacionais capazes de preverem as

propriedades ADMET, são recursos importantes e amplamente empregados na

previsão do comportamento farmacocinético dos novos protótipos candidatos a

fármacos (HODGSON, 2001).

A Química Medicinal oferece diversos métodos de modificação

estrutural para a otimização de potência e seletividade de um composto-

protótipo, que compreendem aproximações racionais e intuitivas (WERMUTH,

1996) ou aquelas baseadas no mecanismo de ação e identificação do

farmacóforo, empregando ferramentas da modelagem molecular (computer

assisted drug design, CADD, computer assisted molecular design, CAMD,

computer-aided ligand design, CALD) (COHEN et al., 1990; WONG e

McCAMMON, 2003; KITCHEN et al, 2004; LEWIS, 2005).

1.2 OTIMIZAÇÃO DO COMPOSTO-PROTÓTIPO:

As interações envolvidas no complexo fármaco-biorreceptor são da

mesma natureza que as interações usuais entre moléculas orgânicas e podem

incluir ligações covalentes, interações iônicas (eletrostáticas), íon-dipolo e

dipolo-dipolo, além de ligações de hidrogênio e interações por transferência de

carga, hidrofóbicas ou de van der Waals (SILVERMAN, 2004). A Figura 1

ilustra exemplos dessas interações fármaco-biorreceptor envolvendo os

fármacos ácido acetilsalicílico (1), omeprazol (3), pivagabina (21), zaleplon (22)

e butamben (23).

(22)

Zaleplon

δδ

(22)

Zaleplon

δδ

(22)

Zaleplon

δδ

Interação íon-dipolo e

dipolo-dipolo

1 a 7 kcal/mol

(21)

Pivagabina

Interação iônica

5 a 10 kcal/mol

(1)

Ácido acetilsalicílico

O CH

Ligação de hidrogênio

1 a 7 kcal/mol

Hidrofóbica

1 kcal/mol

(23)

Butamben

OCH

+ H

,- H

OCH

(3)

Omeprazol

(19)

(20)

Ligação covalente

40 a 100 kcal/mol

(S-S = 50 kcal/mol)

OCH

NHN

OCH

= Superfície do biorreceptor

Figura 1 - Exemplos de interações fármacos-biorreceptores (adaptado de

SILVERMAN, 2004).

As interações dos fármacos com seus biorreceptores, característica

da fase farmacodinâmica (PD), podem ser específicas, como exemplificadas na

Figura 1, dependendo das subunidades estruturais presentes. Os grupamentos

relevantes para o reconhecimento molecular primário do fármaco pelo sítio

receptor e principais responsáveis pela energia de interação favorável à

atividade biológica, são denominados como grupamentos farmacofóricos

(SILVERMAN, 2004). Estas subunidades podem ser representadas por

grupamento(s) funcional(is) ou um arranjo estrutural que modificado reduz, se

não elimina a atividade observada (BARREIRO e FRAGA, 2001).

As demais subunidades presentes no composto-protótipo,

conhecidas como grupos auxofóricos, podem ser excluídas ou modificadas

sem redução de potência, quando não essenciais para manter a integridade da

molécula e do grupo farmacofórico em conformação adequada à interação com

o biorreceptor (SILVERMAN, 2004).

Para a completa identificação dos grupos farmacofóricos e

auxofóricos de um composto-protótipo, é necessária a obtenção de análogos

estruturalmente modificados que componham uma série congênere e sua

caracterização farmacológica, de modo a obterem-se as relações entre sua

estrutura-química e a atividade biológica (SAR). A Figura 2 ilustra o estudo de

modificações estruturais da morfina (15), potente hipnoanalgésico, onde as

subunidades em destaque (azul) ilustram o principal grupo farmacofórico.

4 5

N-CH

Ph aumenta a atividade;

N-CH

CH=CH

é antagonista;

A introdução de

uma OH aumenta

a atividade;

A redução

aumenta a

atividade;

A remoção da OH ou sua acetilação

aumenta a atividade;

A oxidação à cetona reduz a atividade;

A oxidação em C-6 acoplada com

redução em C-7,C-8 aumenta a

atividade;

A remoção

aumenta a

atividade;

A remoção da OH ou

troca isostérica reduz a

atividade;

Metilação ou acetilação

reduz a atividade;

(15)

Morfina

Figura 2 – Estudos de relação entre a estrutura-química e a atividade biológica (SAR)

de derivados da morfina (15) (adaptado de MCCURDY, 2006).

Com o conhecimento prévio das subunidades estruturais importantes

para atividade identificadas no composto-protótipo (SAR), várias estratégias de

modificações estruturais têm sido empregadas para melhorar o perfil

terapêutico de um candidato a fármaco (SILVERMAN, 2004). A seguir,

ilustram-se, sumariamente, algumas destas estratégias de modificação

molecular.

1.2.1 SIMPLIFICAÇÃO MOLECULAR:

A simplificação molecular foi originalmente empregada na obtenção

de compostos estruturalmente mais simples, a partir de protótipos naturais

ativos, estruturalmente mais complexos. Inúmeros alcalóides originaram

fármacos importantes, de diferentes categorias terapêuticas, através do uso

desta importante ferramenta empregada de forma empírica nos primórdios da

Química Medicinal (PATRICK, 2001; BARREIRO, 2002).

Um exemplo clássico é a morfina (15), alcalóide isolado, em 1803,

pelo farmacêutico alemão Friedrich W. A. Setürner de Papaver somniferum,

(BARREIRO, 1990). A Figura 3 ilustra a gênese da classe de fármacos

hipnoanalgésicos, importantes ligantes de receptores opióides centrais, como a

meperidina (28), pertencente à classe das 4-fenilpiperidinas e da metadona

(30), ilustrando o sucesso da estratégia de simplificação molecular, sucessiva,

de protótipos naturais.

Primeiramente, a retirada do átomo de oxigênio do anel

diidrofurânico (A, Figura 3), levou ao levorfanol (25), análogo hidroxilado com

propriedades analgésicas quatro vezes mais potentes que a morfina (15), mas

que reteve o potencial de dependência química indesejado desta classe.

Possivelmente, o aumento da liberdade conformacional introduzida em (25),

resultante desta simplificação, permitiu à molécula uma melhor aproximação à

conformação bioativa, àquela responsável pelo reconhecimento do

biorreceptor-alvo. A posterior remoção da metade do anel cicloexênico (B,

Figura 3), permanecendo, assim, somente as subunidades metilas como

substituintes, levou a metazocina (26a, R = CH

) que começou a apresentar

uma separação entre os efeitos analgésicos e causadores de dependência. A

pentazocina (26b, R = CH

CH=C(CH

)

) foi o fármaco oriundo desta

simplificação que mostrou-se menos potente que a morfina, mas com

significativa redução do potencial indutor de dependência. A remoção do grupo

metilênico (C, Figura 3), que liga os dois anéis cicloexânicos fundidos do

levorfanol (25), levou ao composto (27), que manteve o efeito nociceptivo em

modelos in vivo. A retirada de todos os anéis fundidos (D, Figura 3), levou a

obtenção de análogos estruturalmente muito mais simples e menos rígidos, as

4-fenilpiperidinas, representadas na Figura 3 pela meperidina (28), classe

terapêutica que é amplamente empregada. Os fármacos propoxifeno (29) e

metadona (30), análogos acíclicos de (15), são potentes analgésicos,

empregados também no tratamento da síndrome de abstinência em

dependentes de heroína (GUDSTEIN e AKIL, 2003; SILVERMAN, 2004).

OCH

≡

≡≡

≡

Simplificação Molecular

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

(15) Morfina (R = H)

(24) Heroína (R = COCH

)

≡

≡≡

≡

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

(25)

Levorfanol

(26a) Metazocina R = CH

(26b) Pentazocina R = CH

CH=(CH

)

(27)

(28)

Meperidina

(29)

Propoxifeno

(30)

Metadona

(26)

OCH

≡

≡≡

≡

Simplificação Molecular

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

(15) Morfina (R = H)

(24) Heroína (R = COCH

)

≡

≡≡

≡

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

(25)

Levorfanol

(26a) Metazocina R = CH

(26b) Pentazocina R = CH

CH=(CH

)

(27)

(28)

Meperidina

(29)

Propoxifeno

(30)

Metadona

(26)

Figura 3 - Simplificações moleculares sucessivas (representadas em vermelho) do

protótipo natural morfina (15).

A quinina (31), um dos principais componentes químicos da casca

de Cinchona officialis, contitui-se de outro exemplo clássico. Este alcalóide

pode ser considerado como responsável pelo desenvolvimento dos

antimalários sintéticos da classe das hidroximetilquinolínicas, 9-

aminoacridinas e 4- e 8-aminoquinolinas, representados na Figura 4 pela

mefloquina (32), mepacrina (33), cloroquina (34) e primacrina (35),

respectivamente (BARREIRO, 1990).

O processo de simplificação molecular que originou a mefloquina

(32), compreende, basicamente, a modificação do anel rubânico da quinina

(31) para o sistema piperidínico, correspondente. A simplificação molecular

da mepraquina (33) resultou na obtenção da cloroquina (34), que através da

estratégia de transposição de grupo farmacofórico gerou a primaquina (35)

(BARREIRO, 2002).

OCH

(31)

Quinina

(32)

Mefloquina

(33)

Mepracrina

(34)

Cloroquina

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

(35)

Primaquina

Transposição de

Grupo

Farmacofórico

9 4

Figura 4 – Simplificação molecular da quinina (31).

Outro exemplo importante da aplicação desta estratégia está

relacionado à gênese do aciclovir (37), descoberto em 1977, por Gertrude

Elion e colaboradores nos laboratórios da Welcome, EUA (ELION, 1977).

Este fármaco é um derivado purínico sintético, obtido por simplificação

molecular do anel ribosídico da guanosina (36) (Figura 5) e empregado no

tratamento do Herpes sp.

Simplificação

Molecular

Simplificação

Molecular

(36)

Guanosina

(37)

Aciclovir

Figura 5 – Simplificação molecular da guanosina (36), originando o fámaco

aciclovir (37) (ELION, 1977).

Atualmente, os avanços observados em técnicas associadas aos

estudos de SAR permitiram que a estratégia de simplificação molecular

passasse a ser empregada de forma racional, com a preservação das

subunidades farmacofóricas, previamente identificadas no composto-

protótipo eleito, natural ou sintético (SETTI e MICETICH, 1996).

1.2.2 RESTRIÇÃO CONFORMACIONAL:

Entre as estratégias de modificação molecular do composto-

protótipo, visando sua otimização, a restrição conformacional tem sido

amplamente empregada, visando o aumento de afinidade e ou seletividade de

um determinado ligante por uma enzima / receptor (BARREIRO & FRAGA,

2001).

A restrição conformacional de moléculas bioativas flexíveis pode ser

conseguida de maneiras diversas: a) introdução de um grupamento alquila

capaz de restringir a rotação de determinada ligação; b) introdução de

grupamentos funcionais que promovam a formação de ligações-H

intramoleculares; c) introdução de insaturação, capaz de fixar a posição relativa

de substituintes terminais ou geminais; d) construção de um ciclo, processo

denominado de anelação molecular, que provoca rigidez conformacional em

determinado arranjo molecular (BARREIRO e FRAGA, 2001).

Modificações estruturais deste tipo foram introduzidas na

procainamida (38) (Figura 6), representante dos anestésicos benzamídicos, de

forma a induzir modificações conformacionais na cadeia lateral

dietilaminoetilamida e investigar sua eventual contribuição farmacofórica. A

introdução de um grupamento orto-metoxila em C-6 do anel fenílico de (38),

conduziu à obtenção do fármaco antiemético triaprida (39), com sua

conformação restrita devido à possibilidade de formação de ligações-H

envolvendo o átomo de oxigênio do orto-substituinte e o NH amídico da cadeia

lateral. Este novo fármaco foi posteriormente modificado estruturalmente pelo

aumento da restrição conformacional da cadeia lateral amídica de (39) por

anelação, envolvendo a construção do ciclo pirrolidínico terminal, o que levou

ao primeiro derivado antiemético com a subunidade N-etilpirrolidinilmetila,

denominado sultoprida (40). Modificações moleculares subseqüentes puderam

ser realizadas sobre (40), com o objetivo de otimizar seu padrão hidrofóbico e,

conseqüentemente, seu perfil farmacológico (JENNER et al., 1980). A

modificação estrutural posterior de (40) levou à descoberta de sulpirida (41) e

remoxiprida (42), o qual foi caracterizado como o derivado antiemético mais

potente desta classe atuando seletivamente nos receptores dopaminérgicos D

Cabe registrar que a introdução do padrão 2,6-dimetoxibenzamida em (42)

provocou maior restrição conformacional devido ao efeito orto cumulativo

(JENNER et al., 1980).

A importância da ligação-H, restringindo a flexibilidade

conformacional da cadeia lateral do fármaco remoxiprida (42), foi

posteriormente evidenciada pela segunda anelação, feita pela introdução do

anel indanonamídico, mimetizando o efeito da ligação-H. O novo análogo

cíclico (43) apresentou a mesma potência do fármaco protótipo remoxiprida

(42) nos receptores dopaminérgicos D

, confirmando a relevância da parcial

restrição conformacional da cadeia alquilamídica lateral na atividade

farmacológica para esta classe de agentes antieméticos (Figura 6) (NORMAN

et al., 1993).

OCH

(38)

Procainamida

(39)

Triaprida

(41)

Sulpirida

(40)

Sultoprida

(42)

Remoxiprida

(43)

Indanonamida

Restrição

Conformacional

Restrição

Conformacional

(anelação)

Restrição

Conformacional

(anelação)

Figura 6 – Restrição conformacional na gênese do remoxiprida (42) a partir das

benzamidas (adaptado de BARREIRO e FRAGA, 2001).

Recentemente, novos análogos mais rígidos da morfina (15) foram

planejados estruturalmente utilizando-se a estratégia de anelação

(SILVERMAN, 2004). A Figura 7 ilustra o planejamento estrutural da

buprenorfina (44), fármaco mais lipofílico que o composto-protótipo natural

(15), 25-50 vezes mais potente e empregado como analgésico de eficácia

comprovada no tratamento dos pacientes dependentes de opióides

(GUDSTEIN e AKIL, 2003).

Restrição

Conformacional

(anelação)

(15)

Morfina

(44)

Buprenorfina

OHHO

OCH

Figura 7 – Restrição conformacional da morfina (15).

Outra aplicação importante da restrição conformacional como

estratégia de modificação molecular do composto-protótipo, visando o

aumento da afinidade em agonistas do subtipo 1D de receptor

serotoninérgicos centrais, foi realizada no desenho estrutural de análogos

dos compostos triptamida (45) e sumatriptano (47), fármacos recomendados

para o tratamento da enxaqueca, resultando na obtenção de frovatriptano

(47) e naratriptano (48), respectivamente, que apresentaram, de fato, maior

afinidade pelo receptor-alvo (Figura 8) (KING et al., 1993; BARREIRO e

FRAGA, 2001; SANDERS-BUSH e MAYER, 2003).

N(CH

)

O O

NHCH

Restrição

Conformacional

(anelação)

Restrição

Conformacional

(anelação)

(45)

(46)

Sumatriptano

(47)

Frovatriptano

(48)

Naratriptano

Figura 8 – Gênese dos fármacos frovatriptano (47) e naratriptano (48) por anelação da

triptamida (45) e sumatriptano (46), respectivamente (adaptado de BARREIRO e

FRAGA, 2001; SANDERS-BUSH e MAYER, 2003).

1.2.3 BIOISOSTERISMO:

Dentre as estratégias conhecidas para se introduzir modificações

moleculares em um composto-protótipo, objetivando a otimização, seja por

razões farmacocinéticas ou farmacodinâmicas, aquela fundamentada no

bioisosterismo tem permitido a identificação de inúmeros derivados

terapeuticamente úteis, de distintas classes terapêuticas. Esta estratégia é

amplamente utilizada nos laboratórios de pesquisa da indústria farmacêutica na

descoberta de novos fármacos análogos de compostos que representem

inovações terapêuticas recentes e comercialmente atrativas (me-too) (LIMA e

BARREIRO, 2005).

O bioisosterismo, termo introduzido por Friedman em 1951, resultou da

aplicação do princípio de isosterismo, desenvolvido por Langmuir em 1919, em

moléculas bioativas (BARREIRO e FRAGA, 2001). Em 1970, Alfred Burger

classificou e subdividiu os bioisósteros em duas grandes categorias (LIMA e

BARREIRO, 2005):

a) Bioisósteros clássicos:

 Átomos e grupos monovalentes;

 Átomos e grupos divalentes;

 Átomos e grupos trivalentes;

 Átomos tetravalentes;

 Anéis equivalentes;

b) Bioisósteros não clássicos:

 Grupos funcionais;

 Ciclos versus não-cíclicos;

 Retroisósteros;

O emprego adequado do bioisosterismo exige que parâmetros

estruturais relativos às propriedades físico-químicas, eletrônicas, reatividade

química e aspectos conformacionais envolvidos, sejam considerados na

substituição bioisostérica planejada, de maneira a antecipar, ainda que

teoricamente, as eventuais e possíveis alterações em termos das propriedades

terapêuticas que a nova substância bioisostérica apresentará (BARREIRO e

FRAGA, 2001; LIMA e BARREIRO, 2005).

Os principais fatores a serem considerados para uma proposta de

substituição bioisostérica são:

a) tamanho, volume e distribuição eletrônica dos átomos ou as considerações

sobre o grau de hibridização, polarizabilidade, ângulos de ligação e efeitos

indutivos e mesoméricos, quando couberem;

b) grau de solubilidade lipídica e aquosa, de maneira a permitir a previsão da

alteração dos propriedades físico-químicas, tais como pKa e log P.

c) reatividade química dos grupos funcionais ou subunidades estruturais

bioisostéricas, objetivando, principalmente, antecipar as principais alterações

nos processos de biotransformação, e inclusive quanto à eventual alteração do

perfil de toxicidade relativa dos principais metabólitos.

d) fatores conformacionais, incluindo a capacidade diferencial de formação de

ligação de hidrogênio inter e intramoleculares (BARREIRO e FRAGA, 2001;

LIMA e BARREIRO, 2005).

É importante ressaltar, que uma substituição bioisostérica quando

efetuada com sucesso em compostos que atuam em determinado tipo de

biorreceptor, não obrigatoriamente, terá o mesmo êxito quando empregada

em compostos planejados como moduladores de outra biomacromolécula

(Figura 9) (BARREIRO e FRAGA, 2001; LIMA e BARREIRO, 2005).

A otimização do composto-protótipo (50), um antagonista do

receptor de hormônio de liberação das gonadotropinas (GnRH), foi realizada

através da substituição bioisostérica da hidroxila fenólica pela subunidade

metilsulfonilamino, grupamentos funcionais com pKa semelhante, levando a

gênese do composto (51), o qual apresentou maior afinidade pelo receptor-

alvo (IC

= 50 e 7 nM, respectivamente) (Figura 9) (LIN et al., 2001, CHU et

al., 2001).

Bioisosterismo

(50)

(51)

= 50 nM

(GnRH)

= 7 nM

(GnRH)

Figura 9 – Bioisosterismo entre hidroxila fenólica em (50) pela subunidade

metilsulfonilamino em (51), antagonistas de receptores GNRh (LIN et al., 2001).

Em contraste, esta mesma substituição isostérica realizada na

naltrexona (52), resultou no composto (53), sem afinidade pelo receptor

opióide (MCCURDY et al, 2000, CHEN e WANG, 2003).

(52)

Naltrexona

(53)

= 0,74 nM

(Opióide µ)

> 1 µM

(Opióide µ)

Isosterismo

Figura 10 – Troca isostérica da hidroxila fenólica em (52) pela subunidade

metilsulfonil amino em (53) resultando num decréscimo de afinidade.

Existem muitos exemplos na literatura sobre a utilização do

bioisosterismo para a otimização de um composto-protótipo. A Figura 11 ilustra

a utilização desta ferramenta por Zhu e colaboradores (ZHU et al., 2003) na

otimização estrutural do protótipo talidomida (54), quanto à atividade inibitória

dos efeitos do TNFα (fator de necrose tumoral alfa), utilizando o bioisosterismo

clássico de átomos divalentes. O TNFα tem um papel importante numa

variedade de processos fisiológicos e patológicos, que incluem proliferação e

diferenciação celular, apoptose, modulação da resposta imune e indução da

inflamação (ZHU et al., 2003).

(µ

µµ

µM)*

(54) O O O ~ 200

(55) O O S ~30

(56) S O O ~30

(57) O S S 20

(58) S O O 11

(59) S S S 6

Bioisosterismo

(54)

Talidomida

(55-59)

* Inibição da produção de TNFα induzido por LPS

(µ

µµ

µM)*

(54) O O O ~ 200

(55) O O S ~30

(56) S O O ~30

(57) O S S 20

(58) S O O 11

(59) S S S 6

Bioisosterismo

(54)

Talidomida

(55-59)

* Inibição da produção de TNFα induzido por LPS

Figura 11 - Utilização do bioisosterismo clássico de átomos divalentes na

otimização do protótipo talidomida (54) (adaptado de ZHU et al., 2003).

O bioisosterismo de anel pode ser considerado como o tipo mais

utilizado na busca de novos compostos bioativos (LIMA e BARREIRO,

2005). Esta estratégia foi aplicada com sucesso na descoberta de novos

fármacos me-too da classe dos antiinflamatórios não esteroidais de

segunda geração (NSAIDs). Conforme descrito na Figura 12, o anel

pirazólico (A) do celecoxib (60) foi isostericamente substituído pelo anel

isoxazólico no valdecoxib (61) e pelo anel piridínico no etoricoxib (62). Por

outro lado, o anel fenílico (B, Figura 12) presente no celecoxib (60) e no

valdecoxib (61) foi modificado pelo bioisóstero piridínico (B, Figura 12)

presente no etoricoxib (62) (LIMA e BARREIRO, 2005).

C S

S N

(60)

Celecoxib

(61)

Valdecoxib

(62)

Etoricoxib

B B

Figura 12 – Bioisosterismo clássico de anéis na gênese de antiinflamatórios não-

esteroidais de segunda geração.

A Figura 13 representa o bioisosterismo não-clássico utilizado por

Butera e colaboradores (BUTERA et al., 2000) para modificação estrutural do

anti-hipertensivo pinacidil (63), ativador de canais de potássio. Os autores

descrevem a troca do grupamento N-cianoguanidina de (63) pela subunidade

1,2-diaminociclobuten-3,4-diona, gerando uma nova série de potentes

ativadores de canais de K

ATP

, exemplificados, na Figura 13, pelos compostos

(64) e (65), sendo este um novo candidato a fármaco para o tratamento da

incontinência urinária (BUTERA et al., 2000; CHEN e WANG, 2003; LIMA e

BARREIRO, 2005).

N CH

Bioisosterismo

(63)

Pinacidil

(64)

(65)

= 0,63 µM

= 1,3 µM

= 0,09 µM

= 0,13 mg/kg (incontinência urinária)

= 17,7 mg/kg (efeito hipotensor)

Figura 13 – Gênese de novos derivados ativadores de canais de K

ATP

(64) e (65) pela

troca bioisostérica da subunidade N-cianoguanidina presente no pinavidil (63)

(adaptado de BUTERA et al., 2000; LIMA e BARREIRO, 2005).

Vários métodos computacionais têm sido descritos para identificar

relações bioisostéricas in silico (WAGENER e LOMMERSE, 2005). O banco de

dados BIOSTER desenvolvido por István Ujváry (Hungarian Academy of

Sciences) contém 10957 pares de bioisósteros com 29443 exemplos de

moléculas bioativas extraídas de 17557 referências publicadas até 2002

(http://www.accelrys.com/reference/cases/studies/bioster.html acessada em 10/10/2006)

1.2.4 ESTRATÉGIAS DE OTIMIZAÇÃO UTILIZANDO MODELAGEM

MOLECULAR:

A modelagem molecular é uma ferramenta muito importante para a

Química Medicinal não só no planejamento de novos candidatos a protótipos

de fármacos, como também na sua otimização estrutural. Podem ser usadas

abordagens “estáticas”, centradas principalmente nos “ligantes” (fármacos e

compostos-protótipos), onde os exemplos clássicos são as metodologias de

SAR e QSAR (relação quantitativa entre a estrutura química e a atividade

biológica). Estas estratégias de construção de modelos em química

computacional, sem a consideração direta dos sítios receptores foram

delimitadas, tanto pela pequena disponibilidade de estruturas tridimensionais

dos biorreceptores, quanto pelo elevado custo computacional necessário para

se gerar relações quantitativas entre a estrutura química e a atividade

biológica, utilizando-se modelos dinâmicos. Entretanto, este quadro vem se

modificando com uso de metodologias capazes de produzirem estes modelos

como QSAR-4D, docking flexível, dinâmica molecular e o método de Monte

Carlo (VERLI e BARREIRO, 2005).

Maryanoff e colaboradores (GRECO et al, 2002; MARYANOFF,

2004) descreveram a otimização do composto (66) (Figura 14), identificado

como inibidor da catepsina-G (Cat-G), serina-protease envolvida em processos

inflamatórios associados a diversas patologias, como asma, psoríase, enfisema

e artrite reumatóide. Através da cristalografia de raios-X do complexo entre a

Cat-G e (66), os autores puderam identificar que o eutômero apresenta a

configuração absoluta R, onde o grupamento 2-naftila do composto encontra-se

numa região hidrofóbica S1 do sítio ativo da enzima e a subunidade 1-naftila

está envolvida numa interação do tipo empilhamento π-π com o anel

imidazólico da His-57 na região S2 (A e B. Figura 14). Os átomos de oxigênio

da subunidade ácido fosfórico e da carbonila cetônica participam em interações

de ligação-H com His-57, Gly-193 e Lys-192 (B e C, Figura 14). Os autores

identificaram, ainda, duas regiões não ocupadas no sítio ativo, as regiões S3 e

S4, as quais poderiam ser exploradas através de pequenas modificações na

estrutura do composto (66), que levariam a novos compostos com interações

complementares e um provável aumento na afinidade.

(66)

(A)

(B) (C)

Figura 14 – (A) Representação do composto (66) no sítio ativo da catepsina G; (B)

Interações de ligação de hidrogênio do composto (66) no sítio ativo representadas

pelas linhas pontilhadas vermelhas; (C) Representação esquemática das interações

do composto (66) no sítio ativo da catepsina G (adaptado de GRECO et al, 2002;

MARYANOFF, 2004).

Através do uso de modelagem molecular, empregando a metodologia

de docking flexível (ROSENFELD et al., 1995), os autores identificaram que

substituições na posição 3 da subunidade 2-naftila, assegurariam um acesso

ao sítio S3. Vários compostos congêneres foram sintetizados e bioensaiados

(Figura 15). Os compostos (67) e (68) exibiram uma afinidade três vezes maior

pelo receptor que o protótipo (66), enquanto (69) oito vezes maior, indicando

que a adição de substituintes hidrofóbicos pode aumentar a afinidade. O

composto (70), que possuiu o substituinte aromático ligado através de um anel

piperidínico como espaçador, exibiu uma afinidade 80 vezes maior que (66).

Provavelmente, a restrição conformacional gerada pelo espaçador piperidinila

orienta favoravelmente a subunidade fenila no sítio ativo da Cat-G. Suposição

esta comprovada pela diminuição da afinidade quando o espaçador piperidinila

foi substituído pelo grupo propilamino em (71) (Figura 15) (GRECO et al, 2002;

MARYANOFF, 2004). As interações de (70) no sítio ativo da Cat-G, obtidas

através de estudos de docking flexível, foram as mesmas de (66) nas regiões

S1 e S2, porém, com interações adicionais hidrofóbicas em S3 com Phe-172,

Tyr-215 e Ile-99 (Figura 15) (GRECO et al, 2002; MARYANOFF, 2004).

O composto (70) mostrou-se ativo em modelos de inflamação in vivo,

o que validou a utilização da modelagem molecular na otimização de um

bioligante à composto-protótipo (MARYANOFF, 2004).

0,80 ±

±±

± 0,20

-(CH

)

NHC(O)Ph71

0,053 ±

±±

± 0,012

0,50 ±

±±

± 0,10

-CH

C(O)NHCH

CHPh

1,3 ±

±±

± 0,2

-CH

C(O)NHCH

Ph68

1,0 ±

±±

± 0,2

-CH

Ph67

4,1 ±

±±

± 0,3

±±

± SEM (µM)

0,80 ±

±±

± 0,20

-(CH

)

NHC(O)Ph71

0,053 ±

±±

± 0,012

0,50 ±

±±

± 0,10

-CH

C(O)NHCH

CHPh

1,3 ±

±±

± 0,2

-CH

C(O)NHCH

Ph68

1,0 ±

±±

± 0,2

-CH

Ph67

4,1 ±

±±

± 0,3

±±

± SEM (µM)

NC(O)Ph

(67-68)

(70)

Figura 15 – Estrutura e atividade dos novos derivados obtidos de inibidores de

catepsina-G e a representação do composto mais potente (72) no sítio ativo da enzima

obtida através de estudos de docking (adaptado GRECO et al, 2002; MARYANOFF,

2004).

Sheng e colaboradores (SHENG et al., 2006), com o objetivo de

aumentar a afinidade de agentes antifúngicos azólicos, utilizaram as

metodologias de QSAR-3D (relação quantitativa entre a estrutura química e a

atividade tridimensional), CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis)

(CRAMER et al., 1988) e CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices

Analysis) (KLEBE et al., 1994), utilizando uma série de 40 compostos

congêneres (72-75) previamente sintetizados e avaliados biologicamente como

banco de dados (Figura 16) (SHENG et al., 2003; SHENG, et al., 2004) e

estudaram o modo de ligação dos mesmos, através da metodologia de docking

flexível (ROSENFELD et al., 1995).

N N N

(72)

R = 4-COCH

, 4-CHO,

4-CN, 3-CF

, 4-C(CH

)

(73)

R = 4-piridina, 2-piridina,

4-CF

-6-Cl-2-piridina

R = H, 4-F, 4-Cl, 2-Cl, 4-NO

, 3-

, 4 -CH

, 3-CH

, 2-CH

, 4-

OCH

, 2-OCH

, 4-NH

4-C(CH

)

(74)

R = 4-F, 2-F, 4-Cl, 3-Cl, 2-Cl, 4-Br, 4-

I, 3-I, 2,4-Cl, 2-F-4-Br, 2-Br-4-F, 2-Br-

5-F, 2-Cl-5-NO

, 2-NO

, 4 –CH

, 3-

, 4 –CH

, 4-CN, 4-C(CH

)

(75)

Figura 16 – Banco de dados utilizado para os estudos de QSAR 3D e docking

flexível (SHENG et al., 2006).

A Figura 17 (A, B, e C) ilustra os resultados dos mapas de contorno

eletrostático (A), estérico (B) e hidrofóbico (C) dos modelos tridimensionais

gerados nestes estudos e os resultados do docking de (75) no sítio ativo da

enzima lanosterol 14-α-desmetilase (P450

14DM

, CYP51) (D, Figura 17), obtida

por homologia a partir da esterol 14-α-desmetilase de Mycobacterium

tuberculosis (MTCYP51), que é o único cristal da família CYP51 conhecido

(SHENG et al., 2002). Antifúngicos azólicos agem por inibição competitiva da

enzima lanosterol 14-α-desmetilase (P450

14DM

, CYP51), enzima que catalisa a

remoção oxidativa do grupo 14α-metila do lanosterol. Sua inibição leva a um

acúmulo de lonasterol e outros esteróis 14-metilados promovendo a redução do

crescimento dos fungos (SHENG et al., 2006).

(A) (B) (C)

(D)

(74)

(74)(74)

(75)

Heme

Ligação-H

ππ

π- π

ππ

Hidrofóbicas

Figura 17 – (A) Mapa de contorno do campo eletrostático do CoMFA – áreas

favoráveis a substituintes positivamente carregados em vermelho; (B) Mapa de

contorno do campo estérico do CoMFA - áreas estericamente favorecidas em verde;

substituintes hidrofóbicos em verde; (D) Resultado do docking flexível do composto

(72) no sítio ativo da CACYP51 (adaptado de SHENG et al., 2006).

A partir dos resultados mostrados na Figura 17, os autores

construíram um modelo farmacofórico baseado no biorreceptor, para orientar

a etapa de otimização dos agentes antifúngicos azólicos, de modo racional

(Figura 18). Neste modelo, primeiramente, foi estudado a substituição do

espaçador, de modo a restringir a cadeia lateral numa conformação ideal

para maior interação ligante-biorreceptor. Ligado a este espaçador foi

incluído um grupamento fenila capaz de formar interações do tipo

empilhamento π - π com a Tyr 118, presente no sítio ativo da CACYP51. Na

posição para deste anel fenílico foi incluído um grupamento aceptor de

ligação-H, capaz de formar interações adicionais deste tipo com a Ser 378.

Finalmente, com o intuito de formar interações de van der Waals e

hidrofóbicas com os resíduos presentes na região S2 da enzima (Figura 17,

Leu 87, Leu 88, Leu 121, Pro230, Ile 231, Phe 233, Val 234 e Met 508),

foram introduzidos grupamentos hidrofóbicos e volumosos ligados ao

grupamento aceptor de ligações-H (SHENG et al., 2006).

Com base no modelo farmacofórico descrito na Figura 18, os

autores trocaram o espaçador piperazinila da série protótipo (72-75) pelo

grupo N-CH

, modificação que, de acordo com os estudos de docking

flexível realizados concomitantemente, permitiu ao grupamento fenila ligado,

fazer interações do tipo empilhamento π - π com Tyr 118, levando aos

compostos da série A (76) (Figura 18). Esta nova série foi avaliada in vitro

quanto a sua atividade antifúngica e se mostrou mais potente e de mais

amplo espectro (SHENG et al., 2006).

A série B (77) (Figura 18) foi planejada e sintetizada introduzindo

um grupamento amídico (aceptor de ligação-H) na posição para do

grupamento fenila, de forma a viabilizar a interação com a Ser 378 do

biorreceptor-alvo. Da mesma maneira que na série anterior, grupamentos

hidrofóbicos e volumosos foram introduzidos produzindo uma série mais

ativa que a série inicial (SHENG et al., 2006).

Finalmente, os autores trocaram o grupamento amida da série (B)

(77) pela subunidade triazolona na série C (78) (Figura 18), considerando

que esta subunidade além de poder participar das interações do tipo de

ligações-H com a Ser 378, pode também, ajustar as propriedades físico-

químicas das substâncias, adequando seu perfil de lipossolubilidade. Os

derivados desta série se mostraram os mais ativos quanto ao seu perfil

antifúngico in vitro e estão sendo avaliados quanto aos seus perfis

farmacológicos e toxicológicos, exemplificando a utilização da modelagem

molecular na otimização de bioligantes (SHENG et al., 2006).

N CH

N X

N CH

NHCO

(75)

Série protótipo

(76)

Série A

(77)

Série B

Coordenação com

heme

Espaçador

Aceptor de

ligação H

Grupos hidrofóbicos

e volumosos

S1 - Interação hidrofóbica

Ala 114, Phe 126, Leu 139, Met 140,

Phe 145, Ile 304 E Met 306

Ligação-H

Ser 378

Tyr 118

Interação π

ππ

π - π

ππ

Interação hidrofóbica e Van der Waals

Leu 87, Leu 88, Leu 121, Pro230, Ile 231,

Phe 233, Val 234 e Met 508

(78)

Série C

Figura 18 - Modelo farmacofórico baseado no biorreceptor-alvo e gênese das novas

séries de agentes antifúngicos planejadas racionalmente (adaptado SHENG et al.,

2006).

1.3 A DESCOBERTA DE NOVO CANDIDATO A PROTÓTIPO DE FÁRMACO

ANTIINFLAMATÓRIO (LASSBio-259):

O emprego dos antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) de segunda

geração (Figura 19) visa a inibição seletiva da isoenzima ciclooxigenase-2

(COX-2) em relação a COX-1, com o objetivo de reduzir os efeitos

gastroirritantes causados pelos AINEs clássicos, não-seletivos, como por

exemplo a indometacina (79) (SCHWAB, et al., 2003).

(79)

Indometacina

NHCH

(60)

Celecoxib

(62)

Etoricoxib

COX-1 = 0,19 µM

COX-2 = 0,44 µM

IS= 0,4

COX-1 = 6,7 µM

COX-2 = 0,87 µM

IS = 7,6

COX-1 = 116 µM

COX-2 = 1,1 µM

IS = 106

Figura 19 – Índice de seletividade (IS = IC

COX-1/IC

COX-2) dos AINEs:

indometacina (79), celecoxib (60) e etoricoxib (62) no modelo de sangue total

(RIENDEAU et al.,2001)

O nimesulido (80) (SWINGLE et al., 1976) é empregado como agente

antiinflamatório desde 1985, i.e. antes da descoberta da COX-2, ocorrida em

1991 (XIE et al., 1991), e por não apresentar a função ácido carboxílico, típica

dos derivados AINEs clássicos, seus efeitos antiinflamatórios foram

inicialmente atribuídos às propriedades antioxidantes, decorrentes da presença

em sua estrutura da subunidade para-nitrofenila acoplada à função

sulfonilamina (RABASSEDA, 1996; BARREIRO e FRAGA, 2001).

A identificação do nimesulido (80) como inibidor seletivo da COX-2,

levou à busca de novos análogos possuindo em suas estruturas a subunidade

metilsulfonilamino, grupo farmacofórico que caracteriza a classe dos sulidos

exemplificada por NS-398 (81) (FUTAKI et al., 1993), flosulido (82) (KLEIN et

al., 1994; KLEIN, et al., 1995) e L-745,337 (83) (LI et al., 1995) (Figura 20).

NHSO

(80)

Nimesulido

COX-1 = 4,1 µM

COX-2 = 0,56 µM

IS= 7,3

(83)

L-745,337

(81)

NS-398

(82)

Flosulido

COX-1 = 4,81 µM

COX-2 = 0,47 µM

IS= 10,2

COX-1 = >100 µM

COX-2 = 9,67 µM

IS >10,3

COX-1 = 780 nM

COX-2 = 9 nM

IS= 90

COX-1 = 1900 nM

COX-2 = 9 nM

IS= 300

COX-1 = >50000 nM

COX-2 = 9 nM

IS >300

COX-1 = >50000 nM

COX-2 = 21 nM

IS >200

(A)

(B)

Figura 20 – Índice de seletividade (IS = IC

COX-1/IC

COX-2) dos sulidos:

nimesulido (80), NS-398 (81), flosulido (82) e L-745,337 (83). (A) Inibição de COX-1 e

COX-2 no modelo de sangue total (DANNHARDT e KIEFER, 2001; RIENDEAU et

al.,2001); (B) Inibição da produção de PGE

em células CHO trasfectadas com COX-1

e COX-2 humanas (LI et al., 1995; RIENDEAU et al.,1997).

Na busca de novos candidatos a protótipos de fármacos

antiinflamatórios, explorando as ferramentas da Química Medicinal, Barreiro e

colaboradores (LAGES et al., 1998) descreveram o planejamento, a síntese e a

avaliação farmacológica de novos análogos do flosulido (82) desenhados a

partir do safrol (84), produto natural brasileiro abundante (Figura 21).

Admitindo que, a exemplo da carbonila do sistema indanônico

presente no protótipo flosulido (82), um dos átomos de oxigênio do sistema 1,3-

benzodioxola, mantido em posição para ao grupamento farmacofórico

metilsulfonilamino, poderia interagir com o sítio enzimático da enzima COX-2

como um aceptor de ligação-H, os autores desenharam os novos candidatos à

agentes antiinflamatórios apresentando a estrutura geral 85, explorando esta

nova relação bioisostérica (LAGES et al., 1998; BARREIRO e FRAGA, 2001;

LIMA e BARREIRO, 2005). Adicionalmente, a partir do bioisosterismo clássico

entre -O- e -CH

-, os autores planejaram a substituição da subunidade

difeniléter de (82) pela unidade difenilmetano nos novos derivados 1,3-

benzodioxólicos 85 (Figura 21) (LAGES et al., 1998; BARREIRO e FRAGA,

2001).

NHSO

⇒

(82)

Flosulido

(84)

Safrol

(85)

(85a) W = H, R = -NHSO

(85b) W = CF

, R = -NHSO

(85c) W = H, R = -SO

NHCH

(85d) W = H, R = -SO

NHPh

Bioisosterismo

clássico

Bioisosterismo

de anéis

Retroisósteros

Figura 21 – Planejamento estrutural dos safrosulidos 85 a partir do flosulido (82)

(LAGES et al., 1998)

A atividade antiinflamatória dos novos compostos 85 foi determinada

in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzido por carragenina em

camundongos (OTTERNESS e BLIVEN, 1985) (Tabela 3). Os compostos foram

testados por via oral na dose de 100 µmol/kg, empregando o nimesulido (80),

como substância de referência na mesma dose (LAGES et al., 1998).

Tabela 3 - Ensaio de pleurisia induzido por carragenina em camundongos

dos derivados (85a-d) e nimesulido (80) (LAGES et al., 1998).

Composto

Dose

(µ

µµ

µmol/kg)

Número de células

(1 x 10

células / cavidade)

Inibição

(%)

Goma 5% - 16 34,1 ± 1,6 -

Salina - 5 10,6 ± 1,4 -

(80)

Nimesulido

100 10 23,9 ± 1,5 29,9*

85a

100 8 19,4 ± 2,4 43,1*

85b

100 5 24,7 ± 1,2 24,6*

85c

100 5 18,4 ± 3,2 46,0*

85d

100 5 25,7 ± 2,9 24,6*

Todos os compostos foram administrados por via oral; * p<5 (teste t de Student); Resultados expressos

expressa em média ± erro padrão da média.

Os retroisósteros (85a) e (85c) foram capazes de promover

significativa redução do número de células por cavidade, 43,1% e 46,0 %,

respectivamente, atividade superior ao nimesulido (80). Ao contrário de (85c),

(85a), denominado LASSBio-259, foi capaz de inibir significativamente o edema

de pata de rato induzido por carragenina na quarta hora (LAGES et al., 1998).

Os compostos testados não provocaram lesões na mucosa gástrica dos

animais estudados, quando administrados por via oral em doses seis vezes

superiores àquelas utilizadas nos ensaios de inflamação (BARREIRO e

FRAGA, 2001).

Visando a racionalização estrutural da diferença de atividade

observada entre os derivados (85a-d) e com o objetivo de otimizar esta

atividade dos novos candidatos de fármacos antiinflamatórios, Barreiro e

colaboradores, a partir da disponibilidade da estrutura cristalográfica da COX-2

(1CX2) no Protein Data Bank (PDB), criaram um modelo preditivo do sítio ativo

da COX-2 e estudaram o provável modo de ligação destes derivados

empregando dinâmica molecular (RODRIGUES et al., 2002). A Figura 22

evidencia que a presença do anel fenila na subunidade farmacofórica de (85d)

provoca interações desfavoráveis no sítio ativo da COX-2, afastando o

grupamento farmacofórico dos principais sítios de interação (B, Figura 22), o

que não ocorre com os derivados metilados (85a

e 85c) (A, Figura 22)

(BARREIRO e FRAGA, 2001; RODRIGUES et al., 2002).

(85a)

(85c)

(85d)

Figura 22 – Estudos de dinâmica molecular dos derivados (85). (A) Sobreposição dos

complexos entre os retroisósteros (85a, LASSBio-259) e (85c) e os resíduos do sítio

ativo da COX-2; (B) Representação do complexo entre (85d) e os resíduos do sítio

ativo da COX-2 (RODRIGUES et al., 1998).

Estudos posteriores de dinâmica molecular indicaram a presença do

resíduo Tyr-385 no sítio ativo da enzima COX-2, distante ca. 4,3 Å dos

grupamentos fenilas de LASSBio-259 (85a) e de (85c), capaz de interagir por

empilhamento π - π (VERLI, 2002; BARREIRO e FRAGA, 2001). Estas

observações anteciparam a possibilidade da introdução de novas modificações

estruturais nos compostos-protótipos, visando maximizar estas novas

interações. Com base nestas observações, os derivados 86, oxa-homólogos,

foram estruturalmente planejados visando a otimização estrutural de 85.

Entretanto, os novos derivados 86 não apresentaram atividade nos modelos de

edema de pata de rato e pleurisia em camundongos induzidos por carragenina

nas doses de 100 µmol/kg e 300 µmol/kg por via oral (SILVA et al., 2000),

sugerindo que o aumento do grau de liberdade conformacional introduzido em

86, em relação à 85, pode ter sido deletério à atividade pretendida.

(86a) W = H, R = -NHSO

(86c) W = H, R = -SO

NHCH

(86)

Estes resultados, inesperados, poderão ser úteis no planejamento

estrutural de novas séries congêneres de 85, capazes de representarem nova

tentativa de otimização.

Recentemente, Danhardt e colaboradores (DANHARDT et al., 2002)

estudaram a importância da presença da função carbonila como espaçador em

classe de compostos estruturalmente relacionados ao derivado LASSBio-259

(85a) e investigaram, ainda, a contribuição dos grupamentos sulfonilamina e

acetilamina em diferentes posições do anel fenila de 87 em relação à

seletividade in vitro entre as enzimas COX-1 e COX-2 (Tabela 4). De modo

geral, os compostos obtidos pelos autores apresentaram uma maior

seletividade pela COX-1, tendo os derivados amídicos (87f-h) maior afinidade

por ambas isoenzimas do que os derivados sulfonilamínicos correspondentes

(87a-d) (DANHARDT et al., 2002). Os autores evidenciaram, ainda, maior

afinidade para os compostos contendo como grupamento espaçador a função

carbonila (87a-j) em relação aos derivados mais flexíveis (87l e 87m) e mesmo

aqueles mais rígidos (87n) (DANHARDT et al., 2002).

Tabela 4 – IC

COX-1

e COX-2

dos derivados benzofenônicos (87) (adaptado de

DANHARDT et al., 2002).

R''

(87)

RR’ = O;

R = OH, R’ = H;

RR’ = H

R’’ = arila, CH

;

X = SO

, CO;

Posição R

’

COX-1

(µ

µµ

µM)

COX-2

(µ

µµ

µM)

Indometacina

(79)

- - - - 0,0005 0,0043

87a

2 O CH

1,12 13,7

87b

2 O Ph SO

0,40 -

87c

2 O

4-CH

-Ph

0,35 -

87d

2 O

4-Cl-Ph

0,58 9%

87e

2 O

CO >10 -

87f

2 O Ph CO 2,09 2,55

87g

2 O 4-CH

-Ph CO 0,32 0,61

87h

2 O 4-Cl-Ph CO 0,18 0,24

87i

3 O CH

0,25 -

87j

4 O CH

4,11 -

87l

2 OH H CH

>10 -

87m

2 H H CH

>10 -

87n

NHSO

>10 -

a) ensaio de inibição da COX-2 em células intactas (DANHARDT et al., 1998) b) Inibição da

COX-2 induzida por LPS em monócitos (Fiebich et al., 1996) c)% de inibição na concentração

de 10µM.

Em trabalho posterior, Khanapure e colaboradores (KHANAPURE et

al., 2003) descreveram a síntese e avaliação famacológica de derivados 1,3-

benzodioxólicos (88), inibidores seletivos da COX-2, estruturalmente

relacionados ao LASSBio-259 (85a) (Tabela 5). Os autores estudaram

compostos com o grupo farmacofórico separado por um anel fenílico na

posição 6 do anel 1,3-benzodioxólico (anel central) e obtiveram uma série de

compostos alquílicos (88a-b) e arílicos (88c-f) com espaçadores do anel central

representados pelos grupos metilideno (88a), metileno (88b-d) e carbonila

(88e-f) (Tabela 5) (KHANAPURE et al., 2003). Entre os derivados alquílicos

(88a-b), a introdução da dupla ligação em (88a) entre o substituinte cicloalquila

e o anel central melhorou o perfil de inibição da COX-2, enquanto que dentre

os derivados arílicos (88c-f), os compostos substituídos com o grupamento

flúor em meta (88d e 88f) apresentaram maior inibição da COX-2. Os autores

evidenciaram que o anel 1,3-dioxolano contribuiu significativamente para

inibição da COX-2, como pode ser evidenciado pela comparação com o perfil

de atividade dos derivados 89, sem o anel (Tabela 5) (KHANAPURE et al.,

2003).

Tabela 5 – Inibição da COX-1 e COX-2 dos derivados 88 e 89 no ensaio de sangue

total humano (HWB) (KHANAPURE et al., 2003).

(88) (89)

COX-1

(100µ

µµ

µM)

COX-2

(10µ

µµ

µM)

COX-2

(1µ

µµ

µM)

88ª

50%

90% 40%

88b

50%

75% 20%

88c

65% 50% 10%

88d

25% 90% 40%

88e

75% 65% 25%

88f

50% 95% 50%

89a

60% 90% 50%

89b

35% 10% 0

89c

45% 40% 10%

Celecoxib

(60)

- - 100 75%

No âmbito de um programa de pesquisas que visa o planejamento

estrutural, a síntese e a avaliação das propriedades farmacológicas de novos

candidatos a protótipos de fármacos, este trabalho visa a otimização do perfil

antiinflamatório e analgésico do derivado LASSBio-259 (85a)(LAGES et al.,

1998). Neste contexto, tem-se por objetivo a construção de nova série

congênere de derivados 1,3-benzodioxólicos funcionalizados, planejados

através de modificações moleculares utilizando as ferramentas da Química

Medicinal e a sua avaliação farmacológica (Figura 23).

2.1 PLANEJAMENTO ESTRUTURAL DOS NOVOS COMPOSTOS 91 - 95 A

PARTIR DO COMPOSTO-PROTÓTIPO ANTIINFLAMATÓRIO E

ANALGÉSICO LASSBio-259 (85a):

Aplicando-se a estratégia do bioisosterismo (BARREIRO e FRAGA,

2001), o desenho estrutural do novo composto N-(6-(fenilmetil)-1,3-

benzodioxol-5il)acetamida (91, LASSBio-1069) da série proposta inspirou-se na

troca isostérica do grupamento N-mesila de (85a) pela subunidade N-acetila

presente no fármaco analgésico e antipirético acetaminofeno (90) (Figura 23).

A série dos compostos 92, por sua vez, foi planejada a partir da restrição

conformacional (BARREIRO e FRAGA, 2001) promovida pela troca do grupo

metileno, presente no protótipo (85a), por uma carbonila cetônica, capaz de

promover, através de ligação-H intramolecular com os substituintes orto, a

restrição conformacional desejada envolvendo o oxigênio carbonílico e o NH do

grupo farmacofórico presente na posição 6. Aplicando-se a estratégia de

transposição de grupo farmacofórico, planejou-se a série dos compostos 93

pela troca do grupamento R (grupo farmacofórico) da posição 6 do anel A de

(92) para a posição 4 do anel B, adicionando-se na posição 6 o substituinte

metila, que visa manter a restrição estérica da série anterior (92) (Figura 23).

Os grupamentos R eleitos na série 93 são grupamentos farmacofóricos

característicos da classe dos antiinflamatórios não esteroidais clássicos e de

segunda geração ou seus isósteros, isto é, ácido carboxílico e seu isóstero

nitro, metilsulfona, metilsulfonilamino e acetilamino e hidrazida, este último

identificado no LASSBio como um novo ponto farmacofórico relevante para

compostos aniinflamatórios não-esteroidais de segunda geração

. Com o

objetivo de se verificar a importância da carbonila cetônica na série dos

compostos 93, os derivados hidroxilados 94 e metilênico 95 correspondentes,

foram preparados e avaliados farmacologicamente (Figura 23). Ademais, os

novos derivados planejados 91 - 95 contemplam o perfil farmacocinético

preconizado por Lipinski no que se refere à regra dos cinco (LIPINSKI et al.,

1997; LIPINSKI, 2004).

LIMA, L. M., resultados não publicados.

NHSO

R = -NHSO

(92c)

-NHCOCH

(92d)

NHCOCH

Bioisosterismo

Restrição

Conformacional

Transposição de

Grupo

Farmacofórico

R = -SO

(93b)

-NO

(93c)

-NHSO

(93e)

-NHCOCH

(93f)

-CO

H (93i)

-CONHNH

(93j)

Antinociceptivo e

antiinflamatório

(LAGES et al., 1998)

(82)

Flosulido

(85a)

LASSBio-259

(91)

LASSBio-1069

(92)

(93)(94)

(95)

(84)

Safrol

(84)

Safrol

NHCOCH

(90)

Acetaminofeno

NHCOCH

⇒

Figura 23 – Planejamento estrutural das novas séries de derivados 91 - 95 a partir do

composto-protótipo antiinflamatório e analgésico LASSBio-259 (85a).

3.1 SÍNTESE DOS NOVOS COMPOSTOS PLANEJADOS:

3.1.1 SÍNTESE DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES 91 E 92 PLANEJADOS

ESTRUTURALMENTE A PARTIR DO COMPOSTO-PROTÓTIPO

ANTIINFLAMATÓRIO E ANALGÉSICO LASSBio-259 (85a):

A síntese dos novos compostos das séries 91 e 92 foi baseada na

análise retrossintética ilustrada no Esquema 1.

O composto (97) foi identificado como intermediário-chave das séries

91 e 92 e pode ser obtido a partir do piperonal (96), através da construção de

ligação C-C, explorando reação de adição à carbonila do reagente de Grignard

correspondente. O piperonal (96) pode ser obtido a partir do safrol (84), através

de uma desconexão C-C e interconverção de grupos funcionais (IGF),

explorando a isomerização da dupla ligação e cisão oxidativa, conforme

descrito por Barreiro e colaboradores em 1985 (BARREIRO et al., 1985)

(Esquema 1).

O derivado difenil-metano (99), precursor da série 91, pode ser

obtido a partir do intermediário-chave (97), por interconversão clássica de

grupos funcionais envolvendo etapa de redução do álcool secundário a

metileno.

Por desconexão da ligação N-C (etapa a, Equema 1) do derivado

acetilamino (91c), pode-se identificar o composto 6-amino correspondente

(91b) como seu precursor, através de uma reação de N-acilação. O derivado 6-

amino (91b) pode ser obtido a partir do derivado 6-nitro (91a), através da

interconversão de grupos funcionais (redução) e finalmente, o derivado 6-nitro

(91a) pode ser obtido a partir do derivado difenil-metano (99), explorando uma

reação de substituição eletrofílica aromática da posição 6 do anel 1,3-

benzodioxola (Esquema 1).

IGF

C-C

⇐

(92b) R = -H

(92c) R = -SO

(92d) R = -COCH

IGF

N-C ou N-S

⇐

IGF

⇐

(84)

Safrol

(96)

Piperonal

(97)

(91)

(92)

⇐

IGF

⇐

IGF

(99)

(100)

⇐

C-N

⇐

C-N

⇐

C-C

⇐

C-C

⇐

IGF

N-C

(91a)

(92a)

NHR

(91b) R = -H

(91c) R = -COCH

Intermediário

chave

etapa a

etapa b’

etapa a’

Esquema 1 – Análise retrossintética dos novos compostos das séries 91 e 92

planejados estruturalmente a partir do composto-protótipo antiinflamatório e analgésico

LASSBIO-259 (85a).

O derivado benzofenônico (100), precursor da série 92, pode ser

obtido a partir do intermediário-chave (97), através da interconversão de grupos

funcionais (oxidação). Por desconexões da ligação N-C (etapa a’, Esquema 1)

do derivado acetilamino (92d) e da ligação N-S (etapa b’, Esquema 1) do

derivado metilsulfonilamino (92c), pode-se identificar o composto 6-amino

correspondente (92b) como seu precursor, explorando reações de N-acilação.

O derivado 6-amino (92b) pode ser obtido a partir do derivado 6-nitro (92a),

através da interconversão de grupos funcionais (redução) e finalmente, o

derivado 6-nitro (92a) pode ser obtido a partir do derivado benzofenônico (100),

explorando uma reação de substituição eletrofílica aromática na posição 6 do

anel 1,3-benzodioxola (Esquema 1).

A metodologia sintética empregada na obtenção dos compostos das

séries 91 e 92 partiu do piperonal (96), que pode ser obtido a partir clivagem

oxidativa do isosafrol (98), por sua vez obtido a partir da isomerização do safrol

(84), em três etapas, com 75% de rendimento (Esquema 2) (BARREIRO et al.,

1985; BARREIRO e FRAGA, 1999). O piperonal (96) foi submetido às

condições da reação de Grignard, utilizando-se bromobenzeno, magnésio

metálico e iodo em THF, levando ao composto (97) com 80% de rendimento,

intermediário-chave de ambas as séries (Esquema 2) (FURNISS et al., 1991;

LAGES et al. , 1998).

Uma vez obtido e caracterizado estruturalmente, o composto (97),

previamente descrito por Barreiro e colaboradores (LAGES et al., 1998), foi

reduzido ao derivado difenil-metano (99) com 90% de rendimento, utilizando-se

borohidreto de sódio, ácido trifluoracético em diclorometano à temperatura

ambiente e foi subseqüentemente submetido à funcionalização regiosseletiva

da posição 6 do anel 1,3-benzodioxólico, através da reação de nitração,

empregando-se ácido nítrico concentrado em ácido acético glacial à

temperatura ambiente, levando ao composto LASSBio-1067 (91a) em 90% de

rendimento (Esquema 2) (LAGES et al., 1998). A análise do espectro de

infravermelho (IV) de LASSBio-1067 (91a) revelou a presença do grupamento

nitro, pela presença das bandas de absorção em 1520 e 1319 cm

-1

adicionalmente, a presença de dois singletes em 7,46 e 6,60 ppm na região de

hidrogênios aromáticos do espectro de RMN

H deste composto, confirmou a

presença do padrão AB deste anel 1,2,4,5-tetrassubstituído.

Uma vez caracterizado estruturalmente, o composto LASSBio-1067

(91a) foi submetido à redução do grupamento nitro, empregando-se ferro

metálico em meio ácido (LAGES et al., 1998), o que forneceu a anilina

correspondente (91b) em 73% de rendimento. Em seguida, a acetilação de

LASSBio-1068 (91b) (LAGES et al., 1998) forneceu o derivado N-acetilado

LASSBio-1069 (91c) em 80% de rendimento (Esquema 2). As bandas de

absorção em 3293 e 3026 cm

-1

observadas no espectro de IV de LASSBio-

1069 (91c), referem-se à deformação axial do grupo N-H, enquanto a banda

em 1653 cm

-1

caracteriza a deformação da carbonila.

(96)

Piperonal

(99)

(91)

(84)

Safrol

(98)

(84)

Safrol

(98)

(97)

(90) R = H

(91a) LASSBio-1067 R = -NO

(91b) LASSBio-1068 R = -NH

(91c) LASSBio-1069 R = -NHCOCH

(90) R = H

(91a) LASSBio-1067 R = -NO

(91b) LASSBio-1068 R = -NH

(91c) LASSBio-1069 R = -NHCOCH

(100)

(92)

(91) R = H

(92a) LASSBio-1045 R = -NO

(92b) LASSBio-1046 R = -NH

(92c) LASSBio-1065 R = -NHSO

(92d) LASSBio-1066 R = -NHCOCH

(91) R = H

(92a) LASSBio-1045 R = -NO

(92b) LASSBio-1046 R = -NH

(92c) LASSBio-1065 R = -NHSO

(92d) LASSBio-1066 R = -NHCOCH

b, cb, c

a) KOH aq. 3 N, n-BuOH, t.a., 3 h; b) O

, AcOH, 0 °C, 1 h; c) Znº, AcOH (75%, 3 etapas) (BARREIRO

et al., 1985); d) Mg

, I

, THF, PhBr (80%) (LAGES et al. , 1998); e) NaBH

, CF

H, CH

, 0

C. (90%)

(LAGES et al. , 1998); f) KMnO

, Al

, CH

, t.a.

(80%) (QUICI e REGEN , 1969); g) HNO

65%,

AcOH, t.a. (70% - 90%); h) Fe

, NH

Cl, EtOH:H

O(1:1), refluxo, 5h. (73-81%) (LAGES et al., 1998); i) AcCl

ou MsCl, Py, CH

, t.a. (80-86%) (LAGES et al., 1998);

Esquema 2 – Rota sintética para a obtenção dos derivados das séries 91 e 92 a partir

do safrol (84).

Para a obtenção dos derivados da série 92, o intermediário-chave

(97) foi oxidado ao derivado benzofenônico (100) em 80% de rendimento,

utilizando-se permanganato de potássio, alumina em diclorometano (QUICI e

REGEN, 1979). A análise do espectro de infravermelho (IV) de (91) apresentou

uma banda de deformação axial da carbonila em 1643 cm

-1

, característica de

cetonas conjugadas com sistemas aromáticos (SILVERSTEIN et al., 1994). A

conjugação da carbonila com o sistema aromático pôde ser confirmada através

do espectro de ultravioleta (UV), onde se observou a banda de transição

eletrônica π-π* em sistemas conjugados do tipo benzofenona λ

máx

= 238 nm e

de ε

máx

= 18007 (SILVERSTEIN et al., 1994). Além disso, a presença da banda

n-π*em λ = 316 nm, característica da função cetona, foi observada (Figura 24).

Figura 24 – Espectro de ultra-violeta da benzofenona (100).

Uma vez caracterizada estruturalmente, a benzofenona (100) foi

submetida à funcionalização regiosseletiva da posição 6 do anel 1,3-

benzodioxólico, através da reação de nitração, empregando-se ácido nítrico

concentrado em ácido acético glacial à temperatura ambiente, levando ao

composto LASSBio-1045 (92a) em 70% de rendimento. A análise do espectro

de infravermelho (IV) de LASSBio-1045 (92a) revelou a presença do

grupamento nitro, pela presença das bandas de absorção em 1516 e 1329 cm

-1

e adicionalmente, a presença de dois singletes em 7,66 e 6,82 ppm na região

dos hidrogênios aromáticos do espectro de RMN

H deste composto, confirmou

a presença do padrão AB deste anel aromático 1,2,4,5-tetrassubstituído.

O composto LASSBio-1045 (92a) foi submetido à redução

quimiosseletiva do grupamento nitro, empregando-se ferro metálico em meio

ácido (LAGES et al., 1998), o que forneceu a anilina correspondente LASSBio-

1046 (92b), em 81% de rendimento. Em seguida, a mesilação e a acetilação de

LASSBio-1046 (92b) (LAGES et al., 1998) forneceram os derivados N-mesilado

LASSBio-1065 (92c) e N-acetilado LASSBio-1066 (92d) em 84% e 86% de

rendimento, respectivamente (Esquema 2). A presença de uma ligação-H

intramolecular nos compostos LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d)

pôde ser evidenciada pela análise dos espectros de infravermelho devido ao

alargamento das bandas correspondentes à deformação axial do grupo N-H e a

diminuição da sua frequência (3015 cm

-1

) quando comparadas ao composto

(91c) (3293 cm

-1

), derivado não benzofenônico (Figura 25) (SILVERSTEIN et

al., 1994). A diminuição da freqüência das bandas que caracterizam a

deformação axial da carbonila benzofenônica nos espectros dos compostos

LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) (1627 cm

-1

), em relação ao

composto não substituído (100) (1643 cm

-1

) e o aumento da freqüência da

banda que caracteriza a deformação axial da carbonila do grupamento amida

de LASSBio-1066 (92d) (1691 cm

-1

), comparada com LASSBio-1069 (91c)

(1653 cm

-1

), indicaram a formação de ligação-H intramolecular entre o oxigênio

da carbonila cetônica e o hidrogênio amídico dos substituintes em orto dos

compostos LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) (Figura 25)

(SILVERSTEIN et al., 1994).

(100)

(92c)

LASSBio-1065

(92d)

LASSBio-1066

(91c)

LASSBio-1069

1643 cm

-1

1653 cm

-1

3293 cm

-1

3026 cm

-1

1627 cm

-1

1627 cm

-1

3015 cm

-1

3116 cm

-1

3060 cm

-1

1691cm

-1

Figura 25 – Principais bandas de absorção nos espectros de IV dos compostos (100),

(91c), (92c) e (92d) caracterizando a participação de ligação-H intramolecular em

(92c) e (92d).

A Tabela 6 apresenta a fórmula molecular, peso molecular, o ponto

de fusão, aspecto físico e o rendimento global da síntese dos novos derivados

das séries 91 e 92.

Tabela 6 – Fórmula molecular, peso molecular, ponto de fusão, aspecto físico e

rendimento global da síntese dos compostos (91a-c) e (91a-d):

Composto X

Fórmula

molecular

Peso

molecular

Rendimento

global

(%)

Ponto de

Fusão (°C)

Aspecto

físico

91a

LASSBio-1067

-CH

- -NO

257,25 64

61-63

Sólido

amarelo

91b

LASSBio-1068

-CH

- -NH

227,26 47

Óleo

marrom

91c

LASSBio-1069

-CH

- -NHCOCH

269,39 38 177-179

Sólido

branco

92a

LASSBio-1045

C=O -NO

271,23 56 152-155

Sólido

amarelo-

claro

92b

LASSBio-1046

C=O -NH

241,25 39 163-166

Sólido

amarelo

92c

LASSBio-1065

C=O -NHSO

319,33 33 173-176

Sólido

amarelo-

claro

92d

LASSBio-1066

C=O -NHCOCH

283,28 39 160-163

Sólido

branco

(a) Calculado a partir do piperonal (96); (b) Compostos descritos por LAGES et al., 1998;

3.1.2 SÍNTESE DOS NOVOS DERIVADOS DAS SÉRIES 93, 94 E 95

PLANEJADOS ESTRUTURALMENTE A PARTIR DO COMPOSTO-

PROTÓTIPO ANTIINFLAMATÓRIO E ANALGÉSICO LASSBio-259 (85a):

A síntese dos novos compostos das séries 93, 94 e 95 foi baseada

na análise retrossintética ilustrada no Esquema 3.

O composto 3,4-metilenodioxitolueno (101) foi identificado como

precursor das séries 93, 94 e 95 e pode ser obtido a partir safrol (84), através

de uma desconexão C-C e interconversão de grupos funcionais (IGF), usando

o piperonal (96) como intermediário (Esquema 3) (Lima et al., 1999).

A série 93 pode ser obtida a partir do precursor 3,4-

metilenodioxitolueno (101), pela construção de ligação C-C, explorando reação

de Friedel-Crafts. A série 93, por sua vez, foi identificada como precursora das

séries de compostos 94 e 95, através de interconversão de grupos funcionais

(IGF), utilizando-se reações de redução da carbonila cetônica ao álcool e

metileno, correspondentes (Esquema 3).

C-C

IGF

⇐

(84)

Safrol

(96)

Piperonal

IGF

⇐

(101)

(93)

C-C

IGF

⇒

IGF

⇒

(94)(95)

Esquema 3 – Análise retrossintética dos compostos das séries 94, 95 e 96 planejados

estruturalmente a partir do composto-protótipo antiinflamatório e analgésico LASSBio-

259 (85a).

A metodologia sintética empregada na obtenção dos compostos das

séries 93, 94 e 95 explorou o piperonal (96), preparado a partir do safrol (84),

conforme descrito por Barreiro e colaboradores (BARREIRO et al., 1985), como

precursor do 3,4-metilenodioxitolueno (101), obtido pela metodologia de Wolff-

Kishner em 55% de rendimento (4 etapas) (Esquema 4) (LIMA, et al., 1999;

BARREIRO e FRAGA, 1999). O derivado (101), também disponível

comercialmente, foi submetido às condições de reação de Friedel-Crafts,

utilizando-se como agente acilante uma mistura do ácido carboxílico

correspondente (para-RPhCO

H, sendo R = H, -SO

, CO

e –NO

pentóxido de fósforo em 1,2-dicloro-etano, durante 16 horas à temperatura

ambiente (Esquema 4) (GRASSO et al., 2000). Esta reação ocorreu de forma

regiosseletiva na posição 6 da subunidade 3,4-metilenodioxitolueno (101),

como pôde ser evidenciado através da análise dos espectros de RMN

destes compostos que indicaram a presença de dois singletes, correspondendo

aos hidrogênios do padrão AB do sistema 1,2,4,5-tetrassubstituído deste anel

aromático.

Uma vez caracterizado estruturalmente, o composto LASSBio-973

(93c) foi submetido à redução quimiosseletiva do grupamento nitro,

empregando-se ferro metálico em meio ácido (LAGES et al., 1998), o que

forneceu a anilina correspondente LASSBio-976 (93d), em 95% de rendimento

(Esquema 4). Em seguida, reações de acilação de LASSBio-976 (93d),

empregando-se cloreto de mesila, cloreto de acetila ou cloreto de benzoíla na

presença de piridina em diclorometano (LAGES et al., 1998), forneceram os

derivado N-mesilado LASSBio-977 (93e), N-acetilado LASSBio-986 (93f) e N-

benzoíla LASSBio-1044 (93g) em 82%, 87% e 83% de rendimento,

respectivamente (Esquema 4). A banda de absorção em 3242 cm

-1

identificada

no espectro de IV do composto LASSBio-977 (93e) refere-se à deformação

axial do grupo N-H, enquanto as bandas em 1640 cm

-1

, 1340 cm

-1

e 1159 cm

-1

caracterizam a deformação da carbonila e as deformações assimétrica e

simétrica do grupo -SO

, respectivamente.

(84)

Safrol

(96)

Piperonal

a, b, c d

(101)

(93)

(93a) LASSBio-971 R = H

(93b) LASSBio-944 R = -SO

(93c) LASSBio-973 R = -NO

(93d) LASSBio-976 R = -NH

(93e) LASSBio-977 R = -NHSO

(93f) LASSBio-986 R = -NHCOCH

(93g) LASSBio-1044 R = -NHCOPh

(93h) LASSBio-972 R = -CO

(93i) LASSBio-1042 R = -CO

(93j) LASSBio-1043 R = -CONHNH

(93a) LASSBio-971 R = H

(93b) LASSBio-944 R = -SO

(93c) LASSBio-973 R = -NO

(93d) LASSBio-976 R = -NH

(93e) LASSBio-977 R = -NHSO

(93f) LASSBio-986 R = -NHCOCH

(93g) LASSBio-1044 R = -NHCOPh

(93h) LASSBio-972 R = -CO

(93i) LASSBio-1042 R = -CO

(93j) LASSBio-1043 R = -CONHNH

a) KOH aq. 3 N, n-BuOH, t.a., 3 h; b) O

, AcOH, 0 °C, 1 h; c) Znº, AcOH; d) KOH, N

O 80%,

etilenoglicol, refluxo, 4h. (55%, 4 etapas) (LIMA et al., 1999); e) 4-RPhCO

H, P

, Cl

(CH

)

, t.a, 16h.

(65-85%) (GRASSO et al., 2000); f) Fe

, NH

Cl, EtOH:H

O(1:1), refluxo, 5h. (95%) (LAGES et al. , 1998);

g) ou MsCl ou BzCl, Py, CH

, t.a. (82-87%) (LAGES et al. , 1998); h) NaOH, H

O, EtOH, refluxo (97%);

i) NH

O, EtOH, 1h, t.a (70%);

Esquema 4 – Rota sintética para a obtenção dos compostos da série 93 a partir do

safrol (84).

Para a obtenção dos derivados LASSBio-1042 (93i) e LASSBio-1043

(93j), o composto LASSBio-972 (93h) foi submetido às condições de hidrólise

básica e hidrazinólise quimiosseletiva fornecendo-os em 97% e 70% de

rendimento, respectivamente. A quimiosseletividade da etapa da hidrazinólise

pôde ser evidenciada pela presença do carbono da carbonila cetônica em 196

ppm no espectro de RMN

C, enquanto que a eventual hidrazona

correspondente apresentaria este carbono deslocado para campo mais alto

(ca.150 ppm) (SILVERSTEIN et al., 1994).

A Tabela 7 apresenta a fórmula molecular, peso molecular, o ponto

de fusão, o aspecto físico e o rendimento global da síntese dos novos

derivados das séries 93.

Tabela 7 – Fórmula molecular, peso molecular, ponto de fusão, aspecto físico e

rendimento global da síntese dos novos compostos da série 93.

Composto R

Fórmula

molecular

Peso

molecular

Rendimento

global

(%)

Ponto de

Fusão (°C)

Aspecto

físico

93a

LASSBio-971

240,26 85

58-60

Sólido

branco

93b

LASSBio-944

-SO

S 318,54 65 138-140

Sólido

branco

93c

LASSBio-973

-NO

285,26 75

121-124

Sólido

amarelo

93d

LASSBio-976

-NH

255,28 71

182-185

Sólido

branco

93e

LASSBio-977

-NHSO

S 333,37 58 174-177

Sólido

amarelo-

claro

93f

LASSBio-986

-NHCOCH

297,31 62 157-160 Sólido bege

93g

LASSBio-1044

-NHCOPh C

359,38 59 189-190 Sólido bege

93h

LASSBio-972

-CO

298,30 80 134-136

Sólido

amarelo-

claro

93i

LASSBio-1042

-CO

H C

284,27 77 200-202 Sólido bege

93j

LASSBio-1043

-CONHNH

298,30 56 204-206

Sólido

amarelo

(a) Rendimento glopal calculado a partir do 3,4-metilenodioxitolueno (101); (b) Compostos descritos por

Grasso et al., 2000; (c) Composto descrito por Micale et al., 2002;

Para obtenção da série 94, os compostos LASSBio-944 (93b) e

LASSBio-973 (93c) foram submetidos à reação de redução da carbonila,

utilizando-se borohidreto de sódio em metanol a 0

C, o que forneceu os álcoois

correspondentes em rendimentos de 95% e 85%, respectivamente (Esquema

5) (BARREIRO, et al., 1985). A análise dos espectros de infravermelho (IV) dos

compostos LASSBio-975 (94a) e LASSBio-1040 (94b) revelou a presença da

hidroxila pela presença das bandas de absorção em 3500 e 3517 cm

-1

adicionalmente, a presença dos sinais em 69,5 ppm e 72,1 ppm referentes ao

carbono ligado à hidroxila nos espectros de RMN

C de LASSBio-975 (94a) e

LASSBio-1040 (94b), respectivamente.

(93)

(94)

(95)

(94a e 95a) LASSBio-974 e LASSBio-975 R = -SO

(94b e 95b) LASSBio-1040 e LASSBio-1041 R = -NO

a) NaBH

, MeOH, 0

C, 30 min. (85-95%) (BARREIRO, et al., 1985); b) NaBH

, CF

H, CH

, 0

(72-75%) (LAGES et al., 1998);

Esquema 5 – Rota sintética para a obtenção dos compostos das séries 94 e 95 a

partir das benzofenonas 93, correspondentes.

Para obtenção da série 95, os compostos LASSBio-975 (94a) e

LASSBio-1040 (94b) foram submetidos à reação de redução ao metileno

correspondente, utilizando-se borohidreto de sódio, ácido trifluoracético em

diclorometano a 0

C com rendimentos de 72% e 75%, respectivamente

(Esquema 5) (LAGES et al., 1998). A análise dos espectros de RMN

H dos

compostos LASSBio-975 (95a) e LASSBio-1041 (95b) revelou a presença dos

singletes correspondentes aos metilenos em 3,89 ppm e 3,98 ppm,

respectivamente.

A Tabela 8 apresenta a fórmula molecular, peso molecular, o ponto

de fusão, o aspecto físico e rendimento global da síntese dos novos derivados

das séries 94 e 95.

Tabela 8 – Fórmula molecular, peso molecular, ponto de fusão e rendimento global da

síntese dos compostos (94a), (94b) (95a) e (95b):

Composto

Fórmula

molecular

Peso

molecular

Rendimento

global

(%)

Ponto de

Fusão (°C)

Aspecto

físico

94a

LASSBio-974

CHOH

-SO

320,37 62 146-148

Sólido

branco

94b

LASSBio-1040

CHOH

-NO

287,27 64 115-118

Sólido

amarelo

95a

LASSBio-975

-CH

- -SO

304,37 44 125-127

Sólido

branco

95b

LASSBio-1041

-CH

- -NO

271,27 48 84-85

Sólido

amarelo

(a) Rendimento calculado a partir do 3,4-metilenodioxitolueno(101)

3.2. AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS NOVOS COMPOSTOS

SINTETIZADOS:

3.2.1. AVALIAÇÃO DO PERFIL ANTIINFLAMATÓRIO, ANALGÉSICO E

ANTIAGREGANTE PLAQUETÁRIO DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES 91 E

92:

O processo inflamatório envolve uma série de eventos que podem

ser desencadeados por numerosos estímulos, isto é, agentes infecciosos,

isquemia, interações antígeno-anticorpo e lesões térmicas ou físicas. Em nível

macroscópico, a resposta é habitualmente acompanhada dos sinais clínicos

bem conhecidos de eritema, edema, hipersensibilidade e dor. A capacidade de

desencadear uma resposta inflamatória é essencial para a sobrevida em vista

de patógenos e das lesões ambientais, embora em algumas situações e

doenças, a resposta inflamatória possa ser exagerada e duradoura, sem

qualquer razão benéfica aparente, o que caracteriza o estado crônico do

processo fisiopatológico (ROBERTS II e MORROW, 2003).

Primeiramente, o perfil antiinflamatório in vivo dos compostos das

séries 91 e 92 foi investigado no modelo de edema de pata de rato induzido por

carragenina (WINTER et al., 1962; FERREIRA, 1979), com o intuito de avaliar

os derivados com melhor perfil de bioatividade.

O processo inflamatório induzido por carragenina apresenta duas

fases: a fase inicial que tem duração de 60 minutos após a injeção do agente

flogístico e está associada com a liberação da histamina, serotonina e

bradicinina (VINEGER et al.,1969; SÜLEYMAN et al., 2004) e a fase tardia que

Estudo realizado pelos alunos de iniciação científica Cléverton Kleiton Freitas de Lima, Daniel

Filisberto Schulz e Milla Fumian do LASSBio / Departamento de Farmacologia Básica e Clínica – ICB –

UFRJ.

ocorre depois dos 60 minutos com duração de 3 horas e está associada com a

produção de radicais livres a partir dos neutrófilos (peróxido de hidrogênio,

superóxido e radicais hidroxilas) e, também, depende da produção de

prostaglandinas nos tecidos (DI ROSA et al., 1971; MAZZON, et al., 2001;

SÜLEYMAN et al., 2004). Resultados previamente descritos na literatura

indicam que os inibidores seletivos de COX-2 atuam neste modelo na fase

tardia, reduzindo a formação de edema, sem provocar irritação gástrica

(SIEBERT et al., 1994; CHAN et al., 1995; ZHANG et al., 1997).

Os novos compostos (91a-c) e (92a-d), além do nimesulido (80) e do

LASSBio-259 (85a), utilizados como referência, foram administrados em ratos

por via oral na dose de 100 µmol/kg. Os resultados obtidos estão apresentados

na Tabela 9 e nos Gráficos 1 e 2.

Tabela 9 – Efeitos antiedematogênicos dos derivados (91a-c) e (92a-d) no ensaio de

edema de pata de rato induzido por carragenina.

Composto n

Variação de volume

(µ

µµ

µL)

% de inibição

Controle

Goma 5%

520,8 ± 17,8

---

Nimesulido

268,4 ± 42,6

49,7*

85a

LASSBio-259

279,6 ± 33,29

46,3*

91a

LASSBio-1067

420,0 ± 30,3

19,3 n.s.

91c

LASSBio-1069

395,9 ± 50,0

24,0*

92a

LASSBio-1045

559,5 ± 16,9

-7,4 n.s.

92b

LASSBio-1046

571,7 ± 16,0

-9,7 n.s.

92c

LASSBio-1065

351,5 ± 37,8

32,5*

92d

LASSBio-1066

393,9 ± 50,0

24,4*

Controle

Tween+etanol+

água

541,8 ± 26,7

---

91b

LASSBio-1068

441,3 ± 77,1

18,5 n.s.

Variação de volume expressa em média ± erro padrão da média. *p<0,05, Teste t de Student.

a) Administração por via oral na dose de 100 µmol/kg.

Controle

Nimesulido

LASSBio-259

LASSBio-1045

LASSBio-1046

LASSBIO-1065

LASSBIO-1066

LASSBIO-1067

LASSBIO-1069

100

200

300

400

500

600

49,7%

32,5%

24,4%

24,0%

46,3%

Variação de volume (

100 µmol/kg v.o.; n=5-10 animais; *p<0,05 teste t de Student em relação ao controle de goma 5%.

Gráfico 1 - Atividade antiinflamatória no modelo de edema de pata de rato induzido

por carragenina dos compostos (91a e c) e (92a-d), administrados por via oral na dose

de 100 µmol/kg.

NHCOCH

NHSO

(92d)

LASSBio-1066

(91c)

LASSBio-1069

(92c)

LASSBio-1065

O composto LASSBio-1068 (91b) por ser oleoso foi administrado por

via oral utilizando-se como veículo uma mistura de tween, etanol e água para a

obtenção de uma mistura homogênea. O resultado está ilustrado na Tabela 9 e

no Gráfico 2.

Controle

LASSBio-1068

100

200

300

400

500

600

Variação de volume

(

100 µmol/kg v.o.; n=5-10 animais; *p<0,05 teste t de Student em relação ao controle de Tween, etanol e água.

Gráfico 2 - Atividade antiinflamatória no modelo de edema de pata de rato induzido

por carragenina do composto (91b), administrado por via oral na dose de 100 µmol/kg.

Os resultados obtidos indicaram que dentre os compostos testados

neste modelo, destacaram-se os derivados LASSBio-1069 (91c) (X = CH

, R =

NHCOCH

), LASSBio-1065 (92c) (X = C=O, R = NHSO

) e LASSBio-1066

(92d) (X = C=O, R = NHCOCH

), que foram capazes de inibir

significativamente o edema de pata na dose de 100 µmol/kg, quando

administrados por via oral em ratos, na ordem de 24,0%, 32,5% e 24,4%,

respectivamente, enquanto que os padrões nimesulido (80) e LASSBio-259

(85a) apresentaram efeitos na ordem de 49,7% e 46,3%, respectivamente, na

mesma dose e via de administração.

Os derivados das séries 91 e 92 e os padrões não provocaram

irritação na mucosa gástrica, na dose testada, conforme observou-se após

sacrifício, dissecação e avaliação macroscópica da mucosa gástrica dos

estômagos dos animais utilizados no ensaio, buscando a identificação de

lesões pontuais ou lesões hemorrágicas de maior tamanho (CHAN et al.,

1995).

A análise preliminar dos resultados obtidos neste bioensaio para os

derivados das séries 91 e 92, indicou que a presença do grupo

metilsulfonilamina em C-6 do sistema 1,3-benzodioxola destes compostos

parece favorecer a atividade antiinflamatória em relação ao grupamento

acetilamina na mesma posição, já que os compostos mesilados LASSBio-259

(85a) e LASSBio-1065 (92c) foram mais ativos, com 46,3% e 32,5% de

inibição, respectivamente, que os derivados acetilados correspondentes

LASSBio-1069 (91b) e LASSBio-1066 (92d), que apresentaram inibição de

24,0% e 24,4%, respectivamente.

Uma nova modificação estrutural introduzida foi planejada pela troca

do espaçador metilênico presente em 91 por uma carbonila cetônica, visando a

introdução de um certo grau de restrição conformacional e um novo sítio

aceptor de ligação-H, com a possibilidade de formação de ligações-H

intramoleculares entre os substituintes orto-orientados nos novos derivados

propostos 92, assim como o nimesulido (80). Nestes compostos, verificou-se

uma diminuição na atividade antiedematogênica observada, na dose de 100

µmol/kg, sugerindo que este novo ponto farmacofórico não estaria acessível à

uma possível interação devido a eventual efeito estérico ou, ainda, a

diminuição do grau de liberdade dos anéis devido a carbonila cetônica pode ter

sido deletéria à atividade pretendida.

A etapa seguinte da avaliação farmacológica dos novos derivados 91

e 92 foi realizada considerando que os NSAIs possuem atividade analgésica

intrínseca. Desta forma, decidiu-se avaliar os derivados das séries 91 e 92 e os

compostos de referência, quanto a atividade antinociceptiva periférica in vivo,

utilizando-se o ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético,

em camundongos (COOLIER et al., 1968), na dose de 100 µmol/kg,

administrada por via oral. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela

10 e nos Gráficos 3 e 4.

Tabela 10 – Efeitos antinociceptivos dos novos derivados (91a-c) e (92a-d) no ensaio

de contorções abdominais induzidas por ácido acético.

Composto

Dose

(µ

µµ

µmol/Kg)

n Número de contorções

% de

inibição

Controle

Goma 5%

--- 10

59,2 ± 1,33

---

Nimesulido

100 5

29,8 ± 4,52

58,2*

85a

LASSBio-259

100 8

31,2 ± 1,88

47,3*

91a

LASSBio-1067

100 8

49,0 ± 1,90

17,2 n.s.

91c

LASSBio-1069

100 8

53,3 ± 2,19

9,9 n.s.

92a

LASSBio-1045

100 7

59,4 ± 2,80

-0,3 n.s.

92b

LASSBio-1046

100 8

53,1 ± 3,08

10,3 n.s.

92c

LASSBio-1065

100 8

37,5 ± 1,77

36,7*

92d

LASSBio-1066

100 8

41,1 ± 2,64

30,6*

Controle

Tween+etanol+

água

--- 10

52,4 ± 1,72

---

91b

LASSBio-1068

100 5

44,7 ± 1,77

14,7 n.s.

Número de contorções abdominais em média ± erro padrão da média. *p<0,05, Teste t de Student.

a) Administração por via oral na dose de 100 µmol/Kg.

NHCOCH

NHSO

(92d)

LASSBio-1066

(92c)

LASSBio-1065

Controle

Nimesulido

LASSBio-259

LASSBio-1045

LASSBio-1046

LASSBio-1065

LASSBio-1066

LASSBio-1067

LASSBio-1069

58,2%

47,3%

36,7%

30,6%

Número de contorções

100 µmol/kg v.o.; n=7-10 animais; *p<0,05 teste t de Student em relação ao controle de Tween, etanol e água.

Gráfico 3 - Atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais induzidas

por ácido acético em camundongos dos compostos (91a e c) e (92a-d), administrados

por via oral na dose de 100 µmol/kg.

Controle

LASSBio-1068

Número de contorções

100 µmol/kg v.o.; n=8-10 animais; *p<0,05 teste t de Student em relação ao controle de Tween, etanol e água.

Gráfico 4- Atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais induzidas

por ácido acético em camundongos do composto (91b), administrado por via oral na

dose de 100 µmol/kg.

Os resultados obtidos indicaram que dentre os compostos testados

neste modelo, destacaram-se os derivados LASSBio-1065 (92c) (X = C=O, R =

NHSO

) e LASSBio-1066 (92d) (X = C=O, R = NHCOCH

), que foram

capazes de inibir significativamente na ordem de 36,7% e 30,6%,

respectivamente, as contorções abdominais induzidas por ácido acético na

dose de 100 µmol/Kg, quando administrados por via oral em camundongos,

enquanto que os padrões nimesulido (80) e LASSBio-259 (85a) apresentaram

efeitos na ordem de 58,2% e 47,3%, respectivamente, na mesma dose e via de

administração.

A etapa de avaliação farmacológica previa a análise do perfil

antiagregante plaquetário in vitro dos compostos LASSBio-1065 (92c),

LASSBio-1066 (92d) e LASSBio-1069 (91c), investigando-se no modelo

agregação plaquetária em plasma rico em plaquetas de coelho, utilizando-se os

agonistas: ácido araquidônico (AA), colágeno e difosfato de adenosina (ADP)

(BORN e CROSS, 1963), na concentração de 100 µM. Os resultados obtidos

estão ilustrados nas Tabelas 11, 12 e 13.

Fármacos antiagregantes plaquetários capazes de atuar na cascata

do ácido araquidônico (AA) por inibição da COX-1, ou por inibição da enzima

tromboxana sintase (TXS), são capazes de inibir significativamente a

agregação plaquetária induzida por colágeno e AA, sem, contudo,

apresentarem qualquer efeito sobre a via do ADP. A ausência de atividade no

ADP em plaquetas de coelho descarta a ação de uma substância sobre a via

de sinalização acoplada à ativação dos receptores purinérgicos de ADP.

O AA exógeno é capaz de penetrar livremente a membrana da

plaqueta, sendo metabolizado pela COX-1 e dando origem a TXA

, induzindo a

ativação plaquetária (SIESS, 1989). O colágeno, via ligação com receptores

específicos na superfície da plaqueta, muito provavelmente o receptor GP VI,

ativa vias de sinalização intracelulares que também promovem a mobilização

dos estoques intracelulares de Ca

e a liberação de AA, levando a uma

produção maciça de TXA

e à ativação plaquetária (SAVAGE, 2001,

CLEMETSON & CLEMETSON, 2001). O ADP em plaquetas de coelho induz

uma agregação monofásica reversível, independente da produção de TXA

(MIRANDA, 1988, COLMAN, 1994).

Tabela 11 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos LASSBio-1069

(91c), LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) em plasma rico em plaquetas

(PRP) de coelho induzido por ácido araquidônico (AA).

Composto

Concentração (µ

µµ

µM)

% de agregação % de inibição

Controle --- 86,1 ± 8,66 ---

DMSO --- 67,5 ± 0,50 ---

Nimesulido

0,0 ± 0,0

100*

Nimesulido

100

0,0 ± 0,0

100*

85a

LASSBio-259

100

0,0 ± 0,0

100*

91c

LASSBio-1069

100 15,0 ± 5,0 82,6*

92c

LASSBio-1065

100 0,0 ± 0,0 100*

92d

LASSBio-1066

100 0,0 ± 0,0 100*

* p<0,05 teste t de Student

Tabela 12 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos LASSBio-1069

(91c), LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) em plasma rico em plaquetas

(PRP) de coelho induzido por colágeno.

* p<0,05 teste t de Student

Composto

Concentração (µ

µµ

µM)

Inclinação (cm) % de inibição

Controle --- 13,3 ± 0,65 ---

DMSO --- 11,5 ± 1,05

---

85a

LASSBio-259

100

0,3 ± 0,33

97,7*

91c

LASSBio-1069

100 0,0 ± 0,0 100*

92c

LASSBio-1065

100 0,0 ± 0,0 100*

92d

LASSBio-1066

100 3,9 ± 0,27 70,7*

Tabela 13 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos LASSBio-1069

(91c), LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d) em plasma rico em plaquetas

(PRP) de coelho induzido por ADP.

Composto

Concentração (µ

µµ

µM)

% de agregação % de inibição

Controle --- 74,3 ± 9,67 ---

DMSO --- 53,0 ± 0,00

---

85a

LASSBio-259

100

57,5 ± 1,50

22,6 n.s

91c

LASSBio-1069

100 52,5 ± 0,50 29,3 n.s.

92c

LASSBio-1065

100 61,0 ± 1,00 17,9 n.s.

92d

LASSBio-1066

100 57,50 ± 4,50 22,6 n.s.

* p<0,05 teste t de Student

Os compostos LASSBio-1065 (92c), LASSBio-1066 (92d) e

LASSBio-1069 (91c), assim como o composto-protótipo LASSBio 259 (85a) e o

nimesulido (80), foram capazes de inibir a agregação plaquetária induzidas por

AA e colágeno na concentração de 100µM, sem, contudo, inibirem a agregação

plaquetária induzida por ADP, indicando que sua atuação se dá na cascata do

ácido araquidônico.

Os resultados farmacológicos descritos para as séries 91 e 92

sugerem que LASSBio-1069 (91c), LASSBio-1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d)

estão exercendo suas atividades analgésicas e antiinflamatórias in vivo através

da inibição das enzimas COX (1 e 2). Contudo, a despeito destes resultados

preliminares encorajadores, são necessários estudos quanto a potência

antiinflamatória e analgésica in vivo e o perfil de seletividade frente as

isoformas da COX (1 e 2) (PATRIGNANI et al., 1994) destes compostos.

Estudos em andamento no LASSBio / Departamento de Farmacologia Básica e Clínica – ICB – UFRJ.

3.2.1. AVALIAÇÃO DO PERFIL ANTIINFLAMATÓRIO, ANALGÉSICO E

ANTIAGREGANTE PLAQUETÁRIO DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES 93, 94 e

95:

O perfil antiinflamatório in vivo dos compostos das séries 93, 94 e 95

foi investigado no modelo de edema de pata de rato induzido por carragenina

(WINTER et al., 1962; FERREIRA, 1979), na dose de 100 µmol/kg

administrada por via oral, juntamente com os compostos de referência

LASSBio-259 (85a) e nimesulido (80). Os resultados obtidos estão

apresentados na Tabela 14 e no Gráfico 5.

Controle

Nimesulido

LASSBio-259

LASSBio-971

LASSBio -944

LASSBio-973

LASSBio-976

LASSBio-977

LASSBio-986

LASSBio-1044

LASSBio-972

LASSBio-1042

LASSBio-1043

LASSBio-974

LASSBio-1040

LASSBio-975

LASSBio-1041

100

200

300

400

500

600

700

26,1%

48,5%

46,3%

Variação de volume (

100 µmol/kg v.o.; n=5-10 animais; *p<0,05 teste t de Student em relação ao controle de goma 5%.

Gráfico 5- Atividade antiinflamatória no modelo de edema de pata de rato induzido por

carragenina dos compostos das séries 93, 94 e 95, administrados por via oral na dose

de 100 µmol/kg.

Estudo realizado pelos alunos de iniciação científica Cléverton Kleiton Freitas de Lima, Daniel

Filisberto Schulz e Milla Fumian do LASSBio / Departamento de Farmacologia Básica e Clínica – ICB –

UFRJ.

Tabela 14 – Efeitos antiedematogênicos dos derivados (93a-j), (94a-b) e (95a-b) no

ensaio de edema de pata de rato induzido por carragenina.

Composto n

Variação de volume

(µ

µµ

µL)

% de inibição

Controle

Goma 5%

10 533,6 ± 13,0 ---

Nimesulido

268,4 ± 42,6

49,7*

85a

LASSBio-259

279,6 ± 33,3

46,3*

93a

LASSBio 971

8 551,2 ± 45,6 -3,2 n.s.

93b

LASSBio 944

10 467,0 ± 33,9 12,5 n.s.

93c

LASSBio 973

10 394,3 ± 33,0 26,1*

93d

LASSBio 976

8 540,5 ± 19,0 -1,29 n.s.

93e

LASSBio 977

10 661,4 ± 51,3 -23,9 n.s.

93f

LASSBio 986

508,7 ± 30,0

4,7 n.s.

93g

LASSBio 1044

568,0 ± 39,3

-6,4 n.s.

93h

LASSBio 972

10 490,1 ± 67,7 8,1 n.s.

93i

LASSBio 1042

543,8 ± 29,7

-1,9 n.s.

93j

LASSBio 1043

539,1 ± 29,0

-1,0 n.s.

94a

LASSBio 974

8 561,8 ± 43,7 -5,2 n.s.

94b

LASSBio 1040

9 561,1 ± 29,2 -5,1 n.s.

95a

LASSBio 975

10 507,9 ± 55,5 4,8 n.s.

95b

LASSBio 1041

490,6 ± 47,0

8,5 n.s.

Variação de volume expressa em média ± Erro Padrão da Média. *p<0,05, Teste t de Student.

a) Administração por via oral na dose de 100 µmol/Kg.

Os resultados obtidos indicaram que dentre os compostos testados

neste modelo, destacou-se o derivado LASSBio-973 (93c) (R = NO

), que foi

capaz de inibir significativamente o edema de pata na dose de 100 µmol/kg,

administrada por via oral, em 26,1%, enquanto que os padrões nimesulido (80)

e LASSBio-259 (85a) apresentaram efeitos na ordem de 49,7% e 46,3%,

respectivamente, na mesma dose e via de administração.

Os derivados da série 93 e os padrões não foram capazes de induzir

ulcerações, na dose testada, conforme observou-se após sacrifício, dissecação

e avaliação macroscópica da mucosa gástrica dos estômagos dos animais

utilizados no ensaio, buscando a identificação de lesões pontuais ou lesões

hemorrágicas de maior tamanho (CHAN et al., 1995).

A análise preliminar dos resultados obtidos para os derivados das

séries 93, 94 e 95, indicou que a transposição do grupo farmacofórico de C-6

do anel 1,3-benzodioxola A das séries 91 e 92 para C-4 do anel fenila B,

parece reduzir significativamente a atividade antiinflamatória, já que o

composto C-6 substituido LASSBio-1065 (92c) (R = NHSO

) inibiu o edema

na ordem de 32,5%, na dose de 100 µmol/kg, administrada por via oral,

contrastando com o derivado C-4 substituido LASSBio-977 (93e) (R =

NHSO

), que não apresentou inibição significativa na mesma dose e via de

administração, sugerindo que o aumento do volume estérico da molécula pela

introdução de substituintes na posição para do anel fenila, pode ter sido

deletério à atividade pretendida.

A Tabela 15 ilustra os resultados obtidos nos estudos de

determinação da dose efetiva para alcançar 50% do efeito máximo (DE

) do

derivado LASSBio-973 (93c), no modelo de edema de pata de rato induzido por

carragenina. O efeito máximo alcançado foi de 26,1% de inibição, na dose de

100 µmol/kg, enquanto que, em doses de 300 µmol/kg foi observada inibição

na mesma ordem de grandeza (24,9%) e na dose de 600 µmol/kg a inibição

observada foi não significativa, sem provocar irritação gástrica nos animais

utilizados nestes ensaios, nestas doses.

Tabela 15 – Efeitos antiedematogênicos do derivado LASSBio-973 (93c) no ensaio de

edema de pata de rato induzido por carragenina nas doses de 10 – 600 µmol/kg.

Dose

(µ

µµ

µmol/Kg)

Variação de volume (µ

µµ

µL)

% de inibição

Goma 5% 10

533,6 ± 13,3

---

10 6 531,7 ± 3,83 0,3 n.s.

100 10

394,2 ± 42,5

26,1*

300 10

408,0 ± 27,4

24,9*

600 7 472,3 ± 28,2 11,5 n.s.

Variação de volume expressa em média ± erro padrão da média. *p<0,05, Teste t de Student.

(93c)

LASSBio-973

Estes resultados sugeriram que esta limitação pudesse resultar de

problemas de absorção desta substância. Desta forma, o composto LASSBio-

973 (93c) foi avaliado no modelo de edema de pata de rato induzido por

carragenina, na dose de 300 µmol/kg, adiministrada por via intraperitoneal. O

Gráfico 6 ilustra os resultados deste estudo, indicando significativa perda de

atividade antiedematogênica quando LASSBio-973 (93c) foi administrado via

oral (24,9%), em contraste com a administração pela via intraperitoneal

(37,9%). Estes resultados indicaram que, provavelmente, este derivado pode

apresentar limitações de caráter farmacocinético.

Controle

LASSBio 973

100

200

300

400

500

24,9%

37,9%

300 µmol/kg

Via oral

Via IP

Variação de volume (

Via oral

Via ip

n=8-10 animais; *p<0,05 teste t de Student em relação ao controle de goma 5%.

Gráfico 6 - Atividade antiedematogênica no modelo de edema de pata de rato

induzido por carragenina do composto LASSBio-973 (93c), administrado via oral e via

intraperitoneal (IP) na dose de 300 µmol/kg.

Considerando que os fármacos AINEs possuem atividade analgésica

intrínseca, decidiu-se avaliar os derivados das séries

93, 94

e os

compostos de referência quanto a atividade antinociceptiva periférica

in vivo,

utilizando-se o ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético,

em camundongos (COOLIER

et al.

, 1968) na dose de 100

mol/kg, por via oral.

Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 16 e no Gráfico 7.

Tabela 16 – Efeitos antinociceptivos dos derivados (93a-j), (94a-b) e (95a-b) no

ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos.

Composto n Numero de contorções

% de

inibição

Goma 5% 10 71,4 ± 3,83 ---

Nimesulido

29,8 ± 4,52

58,2*

85ª

LASSBio-259

37,6 ± 1,88

47,3*

93ª

LASSBio 971

8 38,6 ± 3,72 45,9*

93b

LASSBio 944

10 48,5± 4,11 32,1*

93c

LASSBio 973

10 40,0 ± 2,95 43,9*

93d

LASSBio 976

8 42,4 ± 4,18 40,6*.

93e

LASSBio 977

7 52,7 ± 3,77 26,2*

93f

LASSBio 986

31,4 ± 3,23

56,0*.

93g

LASSBio 1044

71,0 ± 2,67

0,2 n.s.

93h

LASSBio 972

10 59,1 ± 5,97 17,2 n.s.

93i

LASSBio 1042

66,9 ± 2,37

6,2 n.s.

93j

LASSBio 1043

56,1 ± 1,71

21,4*

94ª

LASSBio 974

8 59,7 ± 2,53 16,4 n.s.

94b

LASSBio 1040

8 74,2 ± 1,46 -3,9 n.s.

95ª

LASSBio 975

8 66,4 ± 3,35 7,0 n.s.

95b

LASSBio 1041

75,1 ± 2,04

-5,1 n.s.

Número de contorções em média ± erro padrão da média. *p<0,05, Teste t de Student

a) Administração por via oral na dose de 100 µmol/Kg.

Controle

Nimesulido

LASSBio-259

LASSBio-971

LASSBio-944

LASSBio-973

LASSBio-976

LASSBio-977

LASSBio-986

LASSBio-1044

LASSBio-972

LASSBio-1042

LASSBio-1043

LASSBio-974

LASSBio-1040

LASSBio-975

LASSBio-1041

58,3%

47,3%

43,9%

45,9%

32,1%

40,6%

26,2%

56,0%

21,4%

Número de contorções

100 µmol/kg v.o.; n=7-10 animais; *p<0,05 teste t de Student em relação ao controle de goma 5%.

Gráfico 7 - Atividade antinociceptiva no modelo de contorções abdominais induzidas

por ácido acético em camundongos dos compostos das séries 93, 94 e 95,

administrados por via oral na dose de 100 µmol/kg.

Os resultados obtidos indicaram que dentre os compostos testados

neste modelo, os derivados benzofenônicos LASSBio-971 (

93a

) (R = H),

LASSBio-944 (

93b

) (R = SO

), LASSBio-973 (

93c

) (R = NO

), LASSBio-

976 (

93d

) (R = NH

), LASSBio-977 (

93e

) (R = NHSO

), LASSBio-986 (

93f

)

(R = NHCOCH

) e LASSBio-1043 (R = CONHNH

) (

93j

) foram capazes de

inibir significativamente as contorções abdominais induzidas por ácido acético

na dose de 100

mol/kg, quando administradas por via oral, com destaque para

os derivados LASSBio-971 (

93a

), LASSBio-973 (

93c

), LASSBio-976 (

93d

) e

LASSBio-986 (

93f

) que apresentaram inibições na ordem de 45,9%, 43,9%,

40,6% e 56,0%, respectivamente.

A análise preliminar dos resultados obtidos para os derivados da

série

neste bioensaio, indicou que a transposição do grupo farmacofórico de

C-6 do anel 1,3-benzodioxola A das séries

para C-4 do anel fenila B

parece aumentar significativamente a atividade analgésica, ao contrário

da atividade antiinflamatória, já que os compostos funcionalizados em C-4

LASSBio-973 (

93c

) (R = NO

), LASSBio-976 (

93d

) (R = NH

) e LASSBio-986

(

93f

) (NHCOCH

) apresentaram inibições na ordem de 43,9%, 40,6% e 56,0%,

respectivamente, enquanto que, dos derivados C-6 substituídos

correspondentes LASSBio-1045 (

92a

) (R = NO

), LASSBio-1046 (

92b

) (R =

) e LASSBio-1066 (

92d

) (NHCOCH

), somente o composto LASSBio-1066

(

92d

) apresentou inibição significativa de 30,6%.

A presença do grupo acetilamina em C-4 do anel fenila parece

favorecer a atividade analgésica em relação aos grupamentos

metilsulfonilamina e benzoilamina, como pôde ser evidenciado comparando-se

o derivado acetilado LASSBio-986 (

93f

) (R = NHCOCH

), que apresentou

56,0% de inibição neste modelo, com os derivados LASSBio-977 (

93e

) (R =

NHSO

), que apresentou 26,2% de inibição e LASSBio-1044 (

93g

) (R =

NHCOPh), que não apresentou inibição estatisticamente significativa.

Os derivados benzofenônicos LASSBio-944 (

93b

) (R = SO

, X =

C=O) e LASSBio-973 (

93c

) (R = NO

, X = C=O) apresentaram atividade na

ordem de 32,1% e 43,9%, respectivamente, contrastando com os derivados

hidroxilados LASSBio-974 (

94a

) (R = SO

, X = CHOH) e LASSBio-1040

(

94b

) (R = NO

, X = CHOH) e os derivados metilênicos LASSBio-975 (

95a

) (R

= SO

, X = CH

) e LASSBio-1041 (

95B

) (R = NO

, X = CH

)

correspondentes, que não apresentaram atividade estatisticamente

significativa, na dose de 100

mol/kg, p.o., sugerindo que, a subunidade

carbonila como espaçador entre os dois anéis fenilas permite uma orientação

ótima entre eles e em adição deve funcionar como aceptor de ligação-H, com

resíduos do biorreceptor alvo.

A determinação da dose efetiva para alcançar 50% do efeito máximo

(DE

) dos derivados LASSBio-973 (

93c

) (Gráfico 8) e LASSBio-986 (

93f

)

(Gráfico 9), neste modelo, foi de 20,54

mol/kg e 54,94

mol/kg,

respectivamente. Estes compostos mostraram-se mais potentes que a dipirona

e o acetaminofeno, que apresentaram DE

de 144

mol/kg e 506

mol/kg,

respectivamente. O derivado LASSBio-973 (

93c

) mostrou-se equipotente ao

nimesulido (

), que apresentaou DE

de 20,47

mol/kg.

-1 0 1 2 3

Log Dose (mmols/kg)

% de inibição

LASSBio-973

= 20,54 µ

µµ

µmol/kg

v.o.; n=7-10 animais;

Gráfico 8 – Curva dose-resposta no modelo de contorções abdominais induzidas por

ácido acético em camundongos do derivado LASSBio-973 (93c).

(93c)

LASSBio-973

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Dose (µ

µµ

µmol/kg)

% de inibição

LASSBio-986

= 54,94 µ

µµ

µmol/kg

v.o.; n=7-10 animais;

Gráfico 9 – Curva dose-resposta no modelo de contorções abdominais induzidas por

ácido acético em camundongos do derivado LASSBio-986 (93f).

NHCOCH

(93f)

LASSBio-986

De acordo com os resultados descritos, foi possível constatar um

perfil diferente de propriedades farmacológicas entre as séries de compostos

92 e 93. Os compostos da série 92, representados pelos derivados LASSBio-

1065 (92c) e LASSBio-1066 (92d), foram capazes de promover efeitos

antiinflamatórios no modelo de edema de pata de rato induzido por

carragenina, além dos efeitos analgésicos periféricos e antiagregantes

plaquetários, indicando uma ação na cascata do ácido araquidônico por

inibição da COX (1 e 2), contrastando com os derivados da série 93,

representados pelos derivados LASSBio-971 (93a), LASSBio-973 (93c),

LASSBio-976 (93d) e LASSBio-986 (93f), que apresentaram um perfil

analgésico mais acentuado do que antiinflamatório, com expressiva atividade

no modelo inespecífico de nocicepção periférica de contorções abdominais

induzidas por ácido acético em camundongos.

Recentemente, foi descrita uma terceira isoforma da enzima

ciclooxigenase, a COX-3, que é uma variante da COX-1, localizada

predominantemente no sistema nervoso central (SNC) e no coração

(CHANDRASEKARAN et al., 2002). Estudos demonstraram, que o

acetaminofeno, fármaco antipirético, analgésico, com fraca atividade

antiinflamatória e que penetra facilmente no SNC, exerce suas ações

farmacológicas inibindo a COX-3 (CHANDRASEKARAN et al., 2002; BOTTING

e AYOUB, 2005; AYOUB

et al.,

2006).

Com o intuito de se verificar uma eventual ação analgésica central,

os compostos LASSBio-971 (93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93d) e

LASSBio-986 (93f) foram submetidos ao ensaio da placa quente em

camundongos, juntamente com o padrão acetaminofeno (90) (KURAISHI

et al.

1983). Neste modelo, as substâncias com atividade analgésica central,

e.g.

morfina, são capazes de aumentar o tempo de latência do animal na placa

quente. Os resultados obtidos estão apresentados nos Gráficos 10, 11 e 12.

0 25 50 75 100 125 150

LASSBio-971 (100µmol/kg)

LASSBio-976 (100µmol/kg)

Morfina (5 mg/kg)

Controle

Acetaminofeno (300µmol/kg)

Tempo(min)

Tempo de Permanência (s)

v.o.; * p<0,05 teste t de Student. Cada ponto representa a média ± erro padrão da média de 7-10 animais por grupo.

Gráfico 10– Efeito analgésico dos derivados LASSBio-971 (93a) e

LASSBio-976 (93d) (100 µmol/kg) e acetaminofeno (90) (300 µmol/kg) no ensaio da

placa quente, doses administradas por via oral.

Os resultados ilustrados no Gráfico 10 demonstraram que os

compostos LASSBio-971 (93a) e LASSBio-976 (93f ) foram capazes de induzir

analgesia central neste modelo, na dose de 100 µmol/kg, indicando que apesar

das diferenças de lipofilicidade entre estes compostos, ambos conseguem

atravessar a barreira hematoencefálica e atuar ao nível do SNC.

0 25 50 75 100 125 150

LASSBio-973 (300 µmol/kg)

LASSBio-973(100 µmol/kg)

Controle

Morfina (5 mg/kg)

* *

Acetaminofeno (300µmol/kg)

Tempo (min)

Tempo de permanência (s)

v.o.; * p<0,05 teste t de Student. Cada ponto representa a média ± erro padrão da média de 7-10 animais por grupo

Gráfico 11 – Efeito analgésico do derivado LASSBio-973 (93c) (100 µmol/kg e 300

µmol/kg) e acetaminofeno (90) (300 µmol/kg) no ensaio da placa quente, doses

administradas por via oral.

Os resultados ilustrados no Gráfico-10 demonstraram que, assim

como LASSBio-971 (93a) e LASSBio-976 (93f ), o composto LASSBio-973

(93c) foi capaz de induzir analgesia central no modelo da placa quente em

camundongos, nas doses de 100 µmol/kg e 300 µmol/kg, nos tempos de 30

minutos e 1 hora. Observou-se sensível redução do efeito analgésico tempo-

dependente na dose de 300 µmol/kg, indicando, provavelmente, que este

derivado pode apresentar limitações de caráter farmacocinético.

0 25 50 75 100 125 150

Controle

Morfina (5 mg/kg)

LASSBio-986(300µmol/kg)

LASSBio-986(100 µmol/kg)

Acetaminofeno (300µmol/kg)

Tempo(min)

Tempo de Permanência (s)

v.o.; * p<0,05 teste t de Student. Cada ponto representa a média ± erro padrão da média de 7-10 animais por grupo.

Gráfico 12– Efeito analgésico do derivado LASSBio-986 (93f) (100 µmol/kg e 300

µmol/kg) e acetaminofeno (90) (300 µmol/kg) no ensaio da placa quente, doses

administradas por via oral.

Os resultados ilustrados no Gráfico 12 demonstraram que o

composto LASSBio-986 (93f) foi capaz de induzir analgesia central no modelo

da placa quente em camundongos, nas doses de 100 µmol/kg e 300 µmol/kg,

administradas por via oral, de maneira significativa e com um perfil muito

semelhante ao padrão acetaminofeno (90), quando administrado por via oral na

dose de 300 µmol/kg.

O perfil antiagregante plaquetário

in vitro

dos compostos LASSBio-

971 (93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93a) e LASSBio-986 (93f) foi

investigado no modelo agregação plaquetária em plasma rico em plaquetas de

coelho, utilizando-se os agonistas: ácido araquidônico (AA), colágeno e ADP

(BORN e CROSS, 1963), nas concentrações de 100 µM e 300 µM Os

resultados obtidos estão apresentados na Tabela 17, 18 e 19.

Tabela 17 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos LASSBio-971

(93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93d) e LASSBio-986 (93f) em plasma rico

em plaquetas (PRP) de coelho induzido por ácido araquidônico (AA).

Composto

Concentração

(µ

µµ

µM)

% de agregação % de inibição

Controle --- 65,7 ± 2,35 ---

DMSO --- 64,3 ± 1,20 ---

Nimesulido

0,0 ±0,0

100*

Nimesulido

100

0,0 ± 0,0

100*

85a

LASSBio-259

100

0,0 ± 0,0

100*

93a

LASSBio 971

100 0,0 ± 0,0 100*

93c

LASSBio 973

100 59,7± 2,03 9,1 n.s.

93c

LASSBio 973

300

0,0 ± 0,0

100*

93d

LASSBio 976

100 0,0 ± 0,0 100*

93f

LASSBio 986

100 52,7 ± 3,55 19,7 n.s.

93f

LASSBio 986

300 0,0 ± 0,0 100*

* p<0,05 teste t de Student

Tabela 18 Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos LASSBio-971

(93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93d) e LASSBio-986 (93f) em plasma rico

em plaquetas (PRP) de coelho induzido por colágeno.

Composto

Concentração

(µ

µµ

µM)

Slope (cm) % de inibição

Controle --- 11,5 ± 0,97 ---

DMSO --- 9,9,0 ± 0,56

85a

LASSBio-259

100

0,3 ± 0,33

99,8*

93a

LASSBio 971

100 0 ± 0 100*

93c

LASSBio 973

100 8,1 ± 1,44 29,5 n.s.

93d

LASSBio 976

100 4,2 ± 1,34 63,6*

93f

LASSBio 986

100 9,2 ± 1,27 20,0 n.s.

* p<0,05 teste t de Student

Tabela 19 – Propriedades antiagregantes plaquetárias dos compostos LASSBio-971

(93a), LASSBio-973 (93c), LASSBio-976 (93d) e LASSBio-986 (93f) em plasma rico

em plaquetas (PRP) de coelho induzido por ADP.

Composto

Concentração

(µ

µµ

µM)

% de agregação % de inibição

Controle --- 77,5 ± 4,65 ---

DMSO --- 53,0 ± 4,74 ---

85a

LASSBio-259

100

59,7 ± 1,50

22,9 n.s.

93a

LASSBio 971

100 58,4 ± 1,38 24,5 n.s.

93c

LASSBio 973

100 69,8 ± 1,61 9,9 n.s.

93d

LASSBio 976

100 64,8 ± 1,09 16,4 n.s.

93f

LASSBio 986

100 59,5 ± 1,50 22,9 n.s.

* p<0,05 teste t de Student

Os compostos LASSBio-971 (93a) e LASSBio-976 (93d), assim

como o composto-protótipo LASSBio-259 (85a) e o nimesulido (80), foram

capazes de inibir a agregação plaquetária induzidas por AA e colágeno na

concentração de 100 µM sem, contudo, inibirem a agregação plaquetária

induzida por ADP, indicando que a atuação destes compostos pode se dar na

cascata do ácido araquidônico. Os compostos LASSBio-973 (93c) e LASSBio-

986 (93f) inibiram a agregação plaquetária induzida por AA em 100% na

concentração de 300 µM e não inibiram significativamente a agregação

plaquetária induzida pelos agonistas colágeno e ADP na concentração de 100

µM, mostrando um perfil um distinto dos compostos LASSBio-971 (93a) e

LASSBio-976 (93d).

Os resultados farmacológicos descritos para a série 93, sugerem que

os derivados LASSBio-971 (93a) e LASSBio-976 (93d) podem estar exercendo

suas atividades analgésicas

in vivo

e antiagregantes plaquetárias

in vitro

através da inibição da enzima COX-1 e os derivados LASSBio-973 (93c) e

LASSBio-986 (93f) via inibição da COX-3. Contudo, a despeito destes

resultados preliminares encorajadores, são necessários estudos

farmacológicos mais apurados para a determinação do mecanismo de ação

destes compostos.

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir-se que a

estratégia adotada para o planejamento estrutural dos compostos 91 - 95 foi

exitosa, visto que logrou a descoberta de novos protótipos de fármacos

analgésicos e antiinflamatórios ativos em modelos

in vivo,

quando

administrados por via oral. A metodologia empregada na obtenção dos

compostos das séries de novos derivados 91 - 95 se mostrou adequada,

representando métodos clássicos, tendo sido os compostos desejados

sintetizados em rendimentos globais que variaram de 33 a 85%, a partir do

piperonal.

A avaliação farmacológica permitiu a descoberta de dois perfis

distintos entre as séries 92 e 93. Evidenciou-se que o derivado LASSBio-1065

(92c) apresentou importante efeito analgésico e antiinflamatório

in vivo

, com

perfil de ação semelhante àqueles de fármacos analgésicos e antiinflamatórios

que atuam inibindo seletivamente a COX-2. Estes resultados demonstraram a

importância da subunidade farmacofórica

-metilssulfonilamina na posição C-6

do anel 1,3-benzodioxola, presente em inibidores seletivos de COX-2, como

nimesulido (80), contudo, cabe ressaltar que o mecanismo de ação deste novo

composto-protótipo está sendo investigado no LASSBio

Os resultados obtidos para série de novos derivados 93

demonstraram que a transposição do grupamento farmacofórico da posição C-

6 do anel 1,3-benzodioxola (A) para a posição C-4 do anel fenila (B) levou a

Estudos em andamento no LASSBio / Departamento de Farmacologia Básica e Clínica – ICB – UFRJ

pelo aluno de iniciação científica Cléverton K. F de Lima.

compostos com predominantes efeitos analgésicos, onde destacaram-se os

derivados LASSBio-973 (93c) e LASSBio-986 (93f), que mostraram

importantes efeitos analgésicos centrais e periféricos, com DE

de 20,54

µmol/kg e 54,94 µmol/kg, respectivamente. Os mecanismos de ação destas

substâncias estão sendo investigados no LASSBio.

Finalmente, conclui-se que os estudos de otimização estrutural do

composto-protótipo antiinflamatório e analgésico LASSBio-259 (85a) resultou

na obtenção de novos compostos-protótipos originais,

i.e.

LASSBio-1065 (92c),

LASSBio-973 (93c) e LASSBio-986 (93f), demonstrando a importância das

estratégias de modificação molecular da Química Medicinal para o

planejamento racional de novos candidatos a fármacos.

Estudos em andamento no LASSBio / Departamento de Farmacologia Básica e Clínica – ICB – UFRJ

pelo aluno de iniciação científica Cléverton K. F de Lima.

5.1. SÍNTESE DOS COMPOSTOS DAS SÉRIES (91-95):

As reações foram rotineiramente monitoradas por cromatografia em

camada fina (CCF) em silica gel (placas F245 Merck) e os produtos

visualizados com iodo ou luz ultravioleta (254 and 365 nm). Espectros de

ressonância magnética nuclear (RMN) de

H e

C foram determinados em

soluções de DMSO-

ou CDCl

com um espectrômetro Bruker AC-200. Os

deslocamentos químicos (

) são dados em partes por milhão (ppm) a partir do

tetrametilsilano como padrão interno, e os valores de constante de

acoplamento (

)

são dados em Hz. Os espectros da região do infravermelho

(IV) foram obtidos em um espectrômetro Nicolet Magna IR 760, utilizando-se

pastilhas de brometo de potássio (KBr). As amostras foram examinadas sob a

forma de pastilhas de brometo de potássio. Os espectros na região do

ultravioleta (UV) foram obtidos em um espectrofotômetro Shimadzu UV-1601,

utilizando-se metanol (MeOH) como solvente. Os pontos de fusão foram

determinados em um aparelho Quimis e não estão corrigidos. As purificações

por cromatografia em coluna foram realizadas utilizando-se silica gel Merck

230–400 mesh. Todos os produtos descritos mostraram espectros de RMN de

H e

C de acordo com as estruturas assinaladas. As soluções orgânicas

foram secas sobre sulfato de sódio anidro e os solventes orgânicos foram

removidos sob pressão reduzida em evaporador rotatório.

5.1.1 OBTENÇÃO DO DERIVADO (1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANOL (97) (LAGES

et al,

1998):

, I

THF, PhBr

80%

(96)

Piperonal

(97)

Em um balão de 50 mL, acoplado a um condensador de refluxo e sob

atmosfera de N

, foram adicionados 6 mL de THF anidro, 0,97 g (0,04 mmol )

de Mg previamente ativado em estufa, 0,02 g de I

e 4,2 mL (0,04 mmol) de

bromobenzeno. Esta solução do reagente de Grignard foi mantida sob agitação

magnética e à temperatura ambiente até observar-se o consumo completo de

Mg. Resfriou-se a solução a 0

C e adicionou-se, lentamente, uma solução 2,0

g de piperonal (96) em 9 mL de THF anidro. Após 30 min, quando foi

observado o consumo total do aldeído de partida, neutralizou-se o meio com

solução saturada de cloreto de amônio e a solução foi extraída com acetato de

etila (3 x 30 mL). A fase orgânica foi seca com NaSO

anidro e evaporada sob

pressão reduzida. O produto final foi obtido em 80% de rendimento, como um

óleo amarelo claro, após purificação por cromatografia em coluna, utilizando-se

gradiente de acetato de etila:hexano como eluente.

(1,3-benzodioxol-5-il)(fenil)metanol (97). Óleo amarelo claro. RMN

H (200

MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 2,53 (s, 1H, OH); 5,67 (s, 1H, CHOH); 5,87 (s, 2H,

H2); 6,70-6,82 (m, 3H, H4, H6 e H7); 7,23-7,32 (m, 5H, Ph). RMN

C (50 MHz,

CDCl

, TMS)

(ppm): 75,8 (CHOH); 101,9 (C2); 107,1 (C7); 107,9 (C4); 119,9

(C6); 126,2 (CH, Ph); 127,4 (CH, Ph); 128,4 (CH, Ph); 137,9 (C5); 143,7(Ph);

146,8 (C1a); 147,7 (C3a).

5.1.2 OBTENÇÃO DO DERIVADO 5-BENZIL-1,3-BENZODIOXOLA (99)

(LAGES

et al,

1998):

NaBH

, CH

H, 0

90%

(97)

(99)

Em um balão de 50 mL, em banho de gelo, contendo 22 mL de ácido

trifluoracético, adicionou-se 0,88g (0,23 mmol) de NaBH

em pequenas

quantidades. Sobre esta mistura, sob agitação magnética, adicionou-se gota-a-

gota, por um período de 30 min, uma solução contendo 1g (4,38 mmol) do

álcool (97) em 11 mL de diclorometano. Observou-se o aparecimento de uma

coloração avermelhada quando cada gota atinge a mistura reacional com

rápido desaparecimento. Após o término da adição, neutralizou-se o meio com

solução aquosa de NaOH 50% (p/v), separou-se a fase orgânica e extraiu-se a

fase aquosa com diclorometano (4 x 30 mL). As fases orgânicas foram

reunidas e lavadas com solução saturada de NaCl (2 x 30 mL) e água (2 x 30

mL). Secou-se a fase orgânica com NaSO

, filtrou-se e destilou-se o solvente

em evaporador rotatório. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia em

coluna, utilizando-se gradiente de acetato de etila:hexano como eluente e o

produto foi obtido como um óleo incolor em 90 % de rendimento.

5-benzil-1,3-benzodioxola (99): Óleo incolor. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 3,87 (s, 2H, CH

); 5,878 (s, 2H, H2); 6,62-6,74 (m, 3H, H4, H6 e H7);

7,14-7,31 (m, 5H, Ph). RMN

C (50 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 41,6 (CH

);

100,7 (C2); 108,1 (C7); 109,4 (C4); 121,7 (C6); 126,0 (CH, Ph); 128,4 (CH, Ph);

128,7 (CH, Ph); 134,9 (C5); 141,2 (Ph); 145,8 (C1a); 147,7 (C3a).

5.1.3 OBTENÇÃO DO DERIVADO 5-BENZIL-6-NITRO-1,3-BENZODIOXOLA

(LASSBio-1067) (91a):

HNO

65%, AcOH

, t.a.

90%

(99)

(91a)

LASSBio-1067

A uma solução de 0,30 g (1,41 mmol) de (99) em 3 mL de ácido

acético glacial foi adicionado 0,4 mL de HNO

concentrado. A mistura foi

mantida sob agitação à temperatura ambiente por 30 minutos, quando foi

observado o consumo total do material de partida. Após o término da reação a

mistura foi resfriada em banho de gelo e adicionou-se 10 mL de água destilada

gelada, observando-se a intensa precipitação de um sólido amarelo-claro, que

foi filtrado sob vácuo e lavado com

ca.

20 mL de água destilada gelada. O

produto foi obtido em 90% de rendimento, após recristalização com

etanol/água.

5-benzil-6-nitro-1,3-benzodioxola (LASSBio-1067) (91a): Sólido amarelo; p.f.

61-63 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 4,24 (s, 2H, CH

); 6,01 (s,

2H, H2); 6,60 (s, 1H, H4); 7,11-7,30 (m, 5H, Ph); 7,46 (s, 1H, H7). RMN

C (50

MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 38,7 (CH

); 102,7 (C2); 105,5 (C7); 110,8 (C4);

126,5 (CH, Ph); 128,5 (CH, Ph); 128,8 (CH, Ph); 132,91 (C5); 138,7 (Ph); 142,7

(C6); 143,4 (C1a); 151,5 (C3a). IV (KBr, cm

-1

): 3126,9; 3060,0; 3035,0 (υ C-H

aromático); 2916,3 (υ C-H alifático); 1519,7; 1318, 7 (υ NO

5.1.4 OBTENÇÃO DO DERIVADO 6-AMINO-5-BENZIL-1,3-BENZODIOXOLA

(LASSBio-1068) (91b) (LAGES

et al,

1998):

(91a)

, NH

EtOH:H

O (1:1), refluxo

73%

(91b)

LASSBio-1068

Uma solução contendo 0,50 g (1,94 mmol) de (91a), 0,61 g (10,86

mmol) de ferro metálico e 0,06 g (1,16 mmol) de cloreto de amônio suspensos

em 65 mL de etanol:água (2:1) em um balão de 125 mL, foi refluxada por 5h,

quando foi detectado o consumo total do material de partida. Esta mistura foi

filtrada sobre celite, ainda quente, e o filtrado foi concentrado sob vácuo. O

resíduo foi diluído em água destilada e extraído com acetato de etila (3 x 30

mL). Secou-se a fase orgânica com NaSO

, filtrou-se e destilou-se o solvente

em evaporador rotatório. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia em

coluna, utilizando-se gradiente de acetato de etila:hexano como eluente e o

produto foi obtido como um óleo marrom em 73 % de rendimento.

6-amino-5-benzil-1,3-benzodioxola (LASSBio-1068) (91b): Óleo marrom.

RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 3,19 (s, 2H, NH

); 3,73 (s, 2H, CH

);

5,75 (s, 2H, H2); 6,19 (s, 1H, H4); 6,52 (s, 1H, H7); 7,10-7,28 (m, 5H, Ph). RMN

C (50 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 37,6 (CH

); 98,2 (C7); 100,4 (C2); 110,6

(C4); 117,1 (C6); 126,2 (CH, Ph); 128,3 (CH, Ph); 128,6 (CH, Ph); 139,0 (C5);

139,6 (Ph); 140,2 (C1a); 146,6 (C3a).

5.1.5 OBTENÇÃO DO DERIVADO

-(6-BENZIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)ACETAMIDA (LASSBIO-1069) (91c) (LAGES

et al,

1998):

(91b) AcCl, Py

, t.a.

80%

NHCOCH

(91c)

LASSBio-1069

Em um balão contendo 0,42 g (1,84 mmol) de (91b), foram

adicionados 15 mL de CH

, 0,6 mL de piridina e 0,6 mL de cloreto de acetila.

Após agitação por 1h à temperatura ambiente, detectou-se o consumo total do

material de partida. A mistura reacional foi lavada com HCl 10% (3 x 20 mL),

solução saturada de CuSO

(2 x 20 mL) e H

O (2 x 20 mL). A fase orgânica foi

evaporada, fornecendo um sólido branco em 80% de rendimento após

purificação por cromatografia em coluna, utilizando gradiente de acetato de

etila:hexano como eluente.

NHCOCH

-(6-benzil-1,3-benzodioxol-5-il)acetamida (LASSBIO-1069) (91c): Sólido

branco; p.f. 177-179 °C. RMN

H (200 MHz, DMSO-

, TMS)

(ppm): 1,98 (s,

3H, CH

); 3,85 (s, 2H, CH

); 6,80 (s, 1H, NH); 5,98 (s, 2H, H2); 6,88 (s, 1H, H7);

7,14-7,34 (m, 6H, H4e Ph). RMN

C (50 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 23,8

100

(CH

); 38,3 (CH

); 101,4 (C2); 106,8 C7); 110,2 (C4); 126,6 (CH, Ph); 126,7

(C6); 128,3 (CH, Ph); 128,8 (CH, Ph); 129,2 (Ph); 139,5 (C5); 145,5 (C1a);

146,5 (C3a); 168,6 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3293,3 (υ N-H); 3026,5 (υ C-H

aromático); 2915,1 (υ C-H alifático); 1653,7 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 242

nm (ε

máx

= 6620).

101

5.1.6 OBTENÇÃO DO DERIVADO (1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANONA (100) (QUICI e REGEN, 1979):

KMnO

, CH

, t.a.

80%

(97)

(100)

Em um balão de 50 mL contendo 0,95 g (4,15 mmol) de (97), 1,06 g

(10,38 mmol) de alumina neutra em 25 mL de CH

foi adicionado 1,64 g

(10,38 mmol) de permanganato de potássio. Após agitação por 20h à

temperatura ambiente, detectou-se o consumo total do material de partida. O

dióxido de manganês formado foi retirado por filtração e o filtrado foi lavado

com solução saturada de NaCl (2 x 20 mL), água destilada (3 x 20 mL), seco

com Na

e evaporado, fornecendo um sólido branco em 80% de

rendimento.

(1,3-benzodioxol-5-il)(fenil)metanona (100): Sólido branco; p.f. 51-53 °C.

RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 6,06 (s, 2H, H2); 6,85 (d, 1H, H7,

= 10 Hz); 7,36-7,56 (m, 2H, H4, H6 e Ph); 7,74 (dd, 2H, Ph,

= 8 Hz,

= 1,5

Hz). RMN

C (50 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 101,9 (C2); 107,7 (C7); 109,1

(C4); 126,9 (C6); 128,2 (CH, Ph); 129,7 (CH, Ph); 131,4 (CH, Ph); 138,2 (Ph);

102

148,0 (C1a); 151,6 (C3a); 195,2 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3099; 3053; 3020 (υ C-H

aromático); 2921(υ C-H alifático); 1643 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 238 nm

(ε

máx

= 18007).

103

5.1.7 OBTENÇÃO DO DERIVADO (6-NITRO-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANONA (LASSBiO-1045) (92a):

HNO

65%, AcOH

, t.a.

70%

(92a)

LASSBio-1045

(100)

A uma solução de 0,80 g (1,41 mmol) de (100) em 10 mL de ácido

acético glacial foi adicionado 2,0 mL de HNO

concentrado. A mistura foi

mantida sob agitação à temperatura ambiente por 3 horas, quando foi

observado o consumo total do mateiral de partida. Após o término da reação a

mistura foi resfriada em banho de gelo e adicionou-se 30 mL de água destilada

gelada, observando-se a intensa precipitação de um sólido amarelo-claro, que

foi filtrado sob vácuo e lavado com

ca.

50 mL de água destilada gelada. O

produto foi obtido em 70% de rendimento, após recristalização com

etanol/água.

(6-nitro-1,3-benzodioxol-5-il)(fenil)metanona (LASSBiO-1045) (92a): Sólido

amarelo-claro; p.f. 152-155 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 6,20

(s, 2H, H2); 6,81 (s, 1H, H2); 7,39-7,60 (m, 3H, H4, Ph); 7,64 (s, 1H, H7); 7,73

104

(dd, 2H, Ph,

= 7,1 Hz,

= 1,6 Hz). RMN

C (50MHz, CDCl

, TMS)

(ppm):

103,6 (C2); 104,8 (C7); 107,6 (C4); 128,7(CH, Ph); 129,0 (CH, Ph); 132,8 (Ph);

133,6 (CH, Ph); 135,8 (C5); 141,1 (C6); 148,9 (C1a); 152,6 (C3a); 192,6 (C=O).

IV (KBr, cm

-1

): 3123; 3111; 3063 (υ C-H aromático); 2917 (υ C-H alifático); 1669

(υ C=O); 1516; 1329 (υ NO

). UV (MeOH): λ

máx

= 248 nm (ε

máx

= 25484).

105

5.1.8 OBTENÇÃO DO DERIVADO (6-AMINO-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)(FENIL)METANONA (LASSBio-1046) (92b) (LAGES

et al.,

1998):

(92b)

LASSBio-1046

, NH

EtOH:H

O (1:1), refluxo

81%

(92a)

Uma solução contendo 0,52 g (1,92 mmol) de (92a), 0,60 g (10,74

mmol) de ferro metálico e 0,06 g (1,16 mmol) de cloreto de amônio suspensos

em 65 ml de etanol:água (2:1) em um balão de 125 mL, foi refluxada por 5h,

quando foi detectado o consumo total do material de partida. Esta mistura foi

filtrada sobre celite, ainda quente, e o filtrado foi concentrado sob vácuo,

observando-se a precipitação de um sólido amarelo escuro, que após filtração

e recristalização em etanol/água forneceu o produto desejado em 81% de

rendimento.

(6-amino-1,3-benzodioxol-5-il)(fenil)metanona (LASSBio-1046) (92b): Sólido

amarelo; p.f. 163-166 °C. RMN

H (200 MHz, DMSO-

, TMS)

(ppm): 5,87 (s,

2H, H2); 6,22 (s, 1H, H7); 6,84 (s, 1H, H4); 7,41-7,58 (m, 5H, Ph). RMN

(50MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 96,8 (C7); 101,2 (C2); 110,4 (C6); 111,5 (C4);

106

128,0 (CH, Ph); 128,4 (CH, Ph); 130,3 (CH, Ph); 138,3 (C1a); 140,6 (C5); 150,1

(Ph); 153,0 (C3a); 196,9 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3432; 3297 (υ N-H); 3071; 3025;

2973 (υ C-H aromático); 2909 (υ C-H alifático); 1627 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 246 nm (ε

máx

= 19518).

107

5.1.9 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS

-(6-BENZOIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)METANOSULFONAMIDA (LASSBio-1065) (92c) e

-(6-BENZOIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)ACETAMIDA(LASSBio-1066) (92d) (LAGES

et al.,

1998):

AcCl ou MsCl, Py

, t.a.

84-86%

NHR

(92b)

R = Ms (92c) LASSBio-1065

R = Ac (92d) LASSBio-1066

Em um balão contendo 0,30 g (1,24 mmol) de (92b), 15 mL de

e 0,4 mL de piridina, foi adicionado 0,4 mL de cloreto de mesila ou 0,4

mL de cloreto de acetila. Após agitação por 1h à temperatura ambiente,

detectou-se o consumo total do material de partida. A mistura reacional foi

lavada com solução aquosa de HCl 10% (3 x 20 mL), solução saturada de

CuSO

(2 x 20 mL) e água destilada (2 x 20 mL). A fase orgânica foi

evaporada, fornecendo (92c) como um sólido amarelo-claro e (92d) como um

sólido branco após purificação por cromatografia em coluna, utilizando-se

gradiente de acetato de etila:hexano como eluente em 84% e 86% de

rendimento, respectivamente.

108

NHSO

-(6-benzoil-1,3-benzodioxol-5-il)metanosulfonamida (LASSBio-1065)

(92c): Sólido amarelo-claro; p.f. 173-176 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 3,02 (s, 3H, CH

); 6,06 (s, 2H, H2); 7,02 (s, 1H, H7); 7,37 (s, 1H, H4);

7,45-7,65 (m, 6H, H2 e Ph); 10,79 (s, 1H, NH).. RMN

C (50 MHz, CDCl

TMS)

(ppm): 39,8 (CH

); 101,4 (C7); 102,4 (C2); 112,4 (C4); 116,8 (C6);

128,3 (CH, Ph); 129,2 (Ph); 132,1 (CH, Ph); 137,9 (C5); 138,5 (C1a); 143,0

(Ph); 152,7 (C3a); 197,8(C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3105 (υ N-H); 2909 (υ C-H

alifático); 1627 (υ C=O); 1351; 1135 (υ SO

). UV (MeOH): λ

máx

= 247 nm (ε

máx

21400).

NHCOCH

-(6-benzoil-1,3-benzodioxol-5-il)acetamida (LASSBio-1046) (92d): Sólido

branco; p.f. 160-163 °C. RMN

H (200MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): . 2,22 (s, 3H,

); 6,02(s, 2H, H2); 6,97 (s, 1H, H7); 7,43-7,65 (m, 5H, Ph); 8,29 (s, 1H, H4);

11,44 (s, 1H, NH). RMN

C (50MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 25,4 (CH

); 102,1

(C2); 102,5 (C7); 112,2 (C4); 116,1 (C6); 128,4 (CH, Ph); 129,3 (CH, Ph); 132,0

(CH, Ph); 139,0 (C5); 139,3 (C1a); 142,1 (Ph); 152,6 (C3a); 169,3 (NHC=O);

109

198,5(C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3116; 3060 (υ N-H); 2921 (υ C-H alifático); 1691 (υ

C=O amida); 1629 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 251 nm (ε

máx

= 26720).

110

5.1.10 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS 6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL(FENIL)METANONA SUBSTITUÍDAS (93a-c e 93h) (GRASSO

et al

., 2000):

p-RPhCOOH, P

ClCH

Cl, t.a.

65-85%

(101)

R = -H (93a) LASSBio-971

R = -SO

(93b) LASSBio-944

R = -NO

(93c) LASSBio-973

R = -CO

(93h) LASSBio-972

Em um balão contendo 1,132 g (1 mL, 8,34 mmol) de 3,4-

metilenodioxi-tolueno (101) e 10,83 mmol do ácido carboxílico correspondente

(

para

-RPhCO

H, R = H, -SO

, -NO

e –CO

) solubilizados em 60 mL de

1,2-dicloroetano, foi adicionado 58,38 mmol de pentóxido de fósforo e a

solução foi mantida sob agitação à temperatura ambiente por 16h, quando

detectou-se o término da reação. O isolamento foi feito por adição de água

destilada vagarosamente à reação, separação da fase orgânica e extração com

acetato de etila (3 x de 30 mL). As fases orgânicas foram reunidas e lavadas

com uma solução de hidróxido de sódio 20% até pH ~13 e água destilada (3 x

30 mL). Secou-se a fase orgânica com NaSO

, filtrou-se e destilou-se o

solvente em evaporador rotatório. Os produtos (93a), (93b) e (93h) foram

obtidos após recristalização com etanol/água em rendimentos de 85%, 65% e

80%, respectivamente. O produto (93c) foi obtido após coluna cromatográfica

utilizando acetato de etila/hexano (05:95) como eluente e recristalização em

isopropanol/hexano, em 75% de rendimento.

111

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)(fenil)metanona (LASSBio-971) (93a). Sólido

branco; p.f. 58-60 °C. RMN

H (200MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 2,30 (s, 3H,

); 5,99 (s, 2H, H2); 6,76 (s, 1H, H4); 6,83 (s, 1H, H7); 7,42-7,81 (m, 5H,

Ph). RMN

C (50MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 20,4 (CH

); 101,6 (C2); 109,6

(C4); 111,3 (C7); 128,5 (C3’ e C5’); 129,0 (C6); 130,1 (C2’ e C6’); 130,7 (Ph);

132,9 (C4’); 138,4 (C5); 145,2 (C1a); 149,4 (C3a); 197,6 (C=O). IV (KBr, cm

-1

3045; 3003; 2975 (υ C-H aromático); 2890 (υ C-H alifático); 1656 (υ C=O). UV

(MeOH): λ

máx

= 246 nm (ε

máx

= 18680).

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)[4-(metilsulfonil)fenil]metanona (LASSBio-944)

(93b). Sólido branco; p.f. 138-140 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 2,35 (s, 3H, CH

); 3,10 (s, 3H, SO

); 6,02 (s, 2H, H2); 6,79 (s, 2H,

H4 e H7); 7,93 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,4 Hz); 8,04 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 8,4

Hz). RMN

C (50 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 20,8 (CH

); 44,4 (SO

);

101,9 (C2); 110,0 (C4); 111,8 (C7); 127,6 (C3’ e C5’); 129,9 (C6); 130,7 (C2’ e

C6’); 134,5 (C5); 143,2 (C4’); 143,8 (C1a); 145,4 (C1’); 150,4 (C3a); 195,7

112

(C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3075; 3055; 3020 (υ C-H aromático); 2921; 2911 (υ C-H

alifático); 1656 (υ C=O); 1369; 1153 (υ SO

). UV (MeOH): λ

máx

= 244 nm (ε

máx

21634).

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)(4-nitrofenil)metanona (LASSBio-973) (93c) -

Sólido amarelo ; p.f. 121-124 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm):

2,35 (s, 3H, CH

); 6,03 (s, 2H, H2); 6,79 (s, 2H, H4 e H7); 7,91 (d, 2H, H2’ e

H6’,

= 8,7 Hz); 8,30 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 8,7 Hz). RMN

C (50 MHz,

CDCl

, TMS)

(ppm): 20,7 (CH

); 101,7 (C2); 109,8 (C4); 111,6 (C7); 123,6

(C3’ e C5’); 129,7 (C6); 130,6 (C2’ e C6’); 134,4 (C5); 143,6 (C4’); 145,3 (C1a);

149,9 (C1’); 150,2 (C3a); 195,1 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3101; 3075 (υ C-H

aromático); 2918 (υ C-H alifático); 1651 (υ C=O); 1516; 1349 (υ NO

). UV

(MeOH): λ

máx

= 268 (ε

máx

= 18880).

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

113

4-[(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)carbonil)benzoato de metila (LASSBio-972)

(93h) - Sólido amarelo-claro; p.f. 134-136 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 2,29 (s, 3H, CH

); 3,93 (s, 3H, OCH

); 5,98 (s, 2H, H2); 6,74 (s, 1H,

H4); 6,78 (s, 1H, H7); 7,79 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,6 Hz); 8,08 (d, 2H, H3’ e

H5’,

= 8,6 Hz). RMN

C (50 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 20,5 (CH

); 52,4

(OCH

); 101,5 (C2); 109,7 (C4); 111,3 (C7); 129,5 (C3’ e C5’); 129,7 (C2’ e

C6’); 130,5 (C6); 133,4 (C5) 133,6 (C4’); 141,9 (C1a); 145,1 (C1’); 149,7 (C3a);

166,2 (C=O); 196,5 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 2955 (υ C-H aromático); 2920; 2901

(υ C-H alifático); 1712 ((υ C=O éster); 1652 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 254

nm (ε

máx

= 2297).

114

5.1.11 OBTENÇÃO DO DERIVADO (4-AMINOFENIL)(6-METIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)METANONA (LASSBio-976) (93d )(LAGES

et al

., 1998):

, NH

EtOH:H

O (1:1), refluxo

95%

(93c)

(93d) LASSBio-976

Uma mistura contendo 0,60 g (2,10 mmol) de (93c), 0,658 g (11,78

mmol) de ferro metálico e 0,067 g (1,26 mmol) de cloreto de amônio suspensos

em 45 mL de etanol:água (2:1) em um balão de 100 mL, foi refluxada por 5h,

quando foi detectado o consumo total do material de partida. Esta mistura foi

filtrada sobre celite, ainda quente, e o filtrado foi então evaporado, observando-

se a precipitação de um sólido rosado, que após filtração e recristalização em

etanol/água forneceu o produto desejado em 95% de rendimento.

1’

6’

2’

5’ 3’

4’

(4-aminofenil)(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)metanona (LASSBio-976) (93d) -

Sólido branco ; p.f. 182-185 °C. RMN

H (200 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm):

2,05 (s, 3H, CH

), 6,01 (s, 2H, H2); 6,16 (2H, NH

); 6,55 (d, 2H, H3’ e H5’,

8,6 Hz); 6,72 (s, 1H, H4); 6,85 (s, 1H, H7); 7,42 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,6 Hz).

RMN

C (50 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 19,2 (CH

); 101,2 (C2); 107,6 (C5);

115

110,5 (C7); 112,7 (C3’ e C5’); 124,6 (C4); 129,4 (C5); 132,3 (C2’ e C6’); 133,1

(C6); 144,7 (C1a); 147,8 (C3a); 154,1 (C1’); 194,4 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3456;

3352 (υ N-H); 2917; 2902 (υ C-H alifático); 1630 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

326 nm (ε

máx

= 24120).

116

5.1.12 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS

-{4-[(6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)CARBONIL]FENIL}METANOSULFONAMIDA (93e),

-{4-[(6-METIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)CARBONIL]FENIL}ACETAMIDA (93f) e

-{4-[(6-METIL-

1,3-BENZODIOXOL-5-IL)CARBONIL]FENIL}BENZAMIDA (93g) (LAGES

et al

1998):

AcCl ou MsCl ou BzCl, Py

, t.a.

82-87%

R = Ms (93e) LASSBio-977

R = Ac (93f) LASSBio-986

R = Bz (93g) LASSBio-1044

(93d)

NHR

Em um balão contendo 0,25 g (1,0 mmol) de (93d), 15 mL de CH

e 0,2 mL de piridina, foi adicionado 0,2 mL de cloreto de mesila ou 0,2 mL de

cloreto de acetila ou 0,2 mL de cloreto de benzoila. Após agitação por 1h à

temperatura ambiente, detectou-se o consumo total do material de partida. A

mistura reacional foi lavada com solução aquosa de HCl 10% (2 x 20 mL),

solução saturada de CuSO

(2 x 20 mL) e H

O (2 x 20 mL). A fase orgânica foi

evaporada, fornecendo (93e) como um sólido amarelo-claro, (93f) como um

sólido beje e (92g) como um sólido bege após purificação por cromatografia em

coluna, utilizando-se gradiente de acetato de etila:hexano como eluente em

82%, 87% e 83% de rendimento, respectivamente.

117

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

NHSO

-{4-[(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)carbonil]fenil}metanosulfonamida

(LASSBio-977) (93e) - Sólido amarelo-claro ; p.f. 174-177 °C. RMN

H (200

MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 2,13 (s, 3H, CH

); 3,11 (s, 3H, SO

); 6,05 (s,

2H, H2); 6,83 (s, 1H, H4); 6,90 (s, 1H, H7); 7,28 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 8,6 Hz);

7,66 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,6 Hz); 10,38 (s, 1H, NH). RMN

C (50 MHz,

DMSO

, TMS)

(ppm): 19,4 (CH

); 39,9 (SO

); 101,4 (C2); 108,3 (C4);

110,8 (C7); 117,5 (C3’ e C5’); 130,9 (C5); 131,4 (C2’ e C6’); 131,9 (C6);143,1

(C1a); 144,8 (C3a); 148,6 (C1’); 195,3 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3242 (υ N-H);

2925 (υ C-H alifático); 1640 (υ C=O); 1340; 1147 (υ SO

). UV (MeOH): λ

máx

285 nm (ε

máx

= 18060).

NHCOCH

6’

2’

5’

3’

4’

1’

-{4-[(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)carbonil]fenil}acetamida (LASSBio-986)

(93f) - Sólido bege ; p.f. 157-160 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm):

2,19 (s, 3H, CH

); 2,24 (s, 3H, COCH

); 5,98 (s, 2H, H2); 6,73 (s, 1H, H4); 6,78

(s, 1H, H7); 7,62 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 8,8 Hz); 7,74 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,8

118

Hz); 8,32 (s, 1H, NH). RMN

C (50 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 20,1 (CH

);

24,6 (COCH

); 101,4 (C2); 108,9 (C4); 111,0 (C7); 118,8 (C3’ e C5’); 131,4 (C2’

e C6’); 132,1 (C5); 133,3 (C6); 142,5 (C1a); 145,0 (C3a); 149,1 (C1’); 168,9

(C=O); 196,7 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3320 (υ N-H); 2909 (υ C-H alifático); 1667

(υ C=O amida); 1655 (C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 296 nm (ε

máx

= 21760).

6’

2’

5’

3’

4’

1’

NHCOPh

-{4-[(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)carbonil]fenil}benzamida (LASSBio-

1044) (93g) - Sólido bege ; p.f. 189-190 °C. RMN

H (200 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 2,13 (s, 3H, CH

); 6,06 (s, 2H, H2); 6,85 (s, 1H, H4); 6,91 (s, 1H, H7);

7,52-7,73 (m, 5H, Ph); 7,95 (d, 4H, Ph,

= 8,8 Hz); 10,59 (s, 1H, NH). RMN

C (50 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 19,4 (CH

); 101,4 (C2); 108,3 (C4); 110,8

(C7); 119,5 (CH, Ph); 127,8 (CH, Ph); 128,4 (CH, Ph); 130,7 (CH, Ph); 131,5

(Ph); 131,8 (CH, Ph); 132,4 (Ph); 134,5 (Ph); 143,7 (C1a); 144,8 (C3a); 148,6

(C1’); 165,9 (C=O); 195,4 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3346 (υ N-H); 2906 (υ C-H

alifático); 1658 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 303 nm (ε

máx

= 25540).

119

5.1.13 OBTENÇÃO DO DERIVADO ÁCIDO 4-[(6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-

5-IL)CARBONIL]BENZOICO (LASSBio-1042) (93i):

NaOH, EtOH

O, refluxo

97%

(93h)

(93i) LASSBio-1042

Uma mistura contendo 0,50 g (1,78 mmol) de (93h) e 0,34 g (8,40

mmol) de hidróxido de sódio suspensos em 30 mL de etanol:água (1:1) em um

balão de 50 mL, foi refluxada por 6h, quando foi detectado o consumo total do

material de partida. Após o término da reação a mistura foi resfriada em banho

de gelo e adicionou-se solução de ácido clorídrico 10% até pH 6, observando-

se a intensa precipitação de um sólido bege, que foi filtrado sob vácuo e lavado

com

ca.

50 mL de água destilada gelada. O produto foi obtido em 97% de

rendimento, após recristalização com etanol/água.

6’

2’

5’

3’

4’

1’

120

ácido 4-[(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)carbonil]benzoico (LASSBio-1042)

(93i) - Sólido bege ; p.f. 200-202 °C. RMN

H (200 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 2,17 (s, 3H, CH

); 6,07 (s, 2H, H2); 6,86 (s, 1H, H4); 6,93 (s, 1H, H7);

7,75 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,4 Hz); 8,05 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 8,4 Hz). RMN

C (50 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 19,8 (CH

); 101,7 (C2); 109,1 (C4); 111,1

(C7); 129,5 (C2’, C3’, C5’e C6’); 130,4 (C6); 132,3 (C5); 134,4 (C4’); 141,1

(C1a); 144,9 (C1’); 149,3 (C3a); 166,6 (C=O); 196,0 (C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3300

- 2500 (larga, υ O-H); 1692 (υ C=O, ácido carboxílico); 1660 (υ C=O).

121

5.1.14 OBTENÇÃO DO DERIVADO 4-[(6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-

IL)CARBONIL]BENZOIDRAZIDA (LASSBio-1043) (93j):

CONHNH

(93h)

(93j) LASSBio-1043

EtOH, t.a., 1h

70%

Em um balão de 25 ml contendo 0,36 g (1,21 mmol) de (93h)

suspensos em 10 mL de etanol, foi adicionado 1,2 mL de hidrato de hidrazina

100%. A mistura reacional permaneceu em refluxo, sob agitação durante 1h,

quando se observou o consumo total do éster de partida (93h). Após o término

da reação a mistura foi concentrada sob pressão reduzida, adicionou-se água

destilada gelada e observou-se a precipitação de um sólido amarelo, que foi

intensificada com um banho de gelo. O sólido foi filtrado, obtendo-se o produto

desejado em 70% de rendimento após recristalização em etanol/água.

6’

2’

5’

3’

4’

1’

CONHNH

122

4-[(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)carbonil]benzoidrazida (93j) - Sólido

amarelo ; p.f. 204-206 °C. RMN

H (200 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 2,17 (s,

3H, CH

); 4,58 (s, 2H, NH

); 6,07 (s, 2H, H2); 6,86 (s, 1H, H4); 6,94 (s, 1H, H7);

7,72 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 7,8 Hz); 7,93 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 7,8 Hz); 9,96 (s,

2H, NH). RMN

C (50 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 19,7 (CH

); 101,6 (C2);

108,9 (C4); 111,0 (C7); 127,2 (C3’ e C5’); 129,4 (C2’ e C6’); 130,6 (C6); 132,0

(C5); 137,0 (C4’); 139,6 (C1a); 144,8 (C1’); 149,1 (C3a); 164,9 (C=O); 196,0

(C=O). IV (KBr, cm

-1

): 3329; 3324 (υ N-H); 2913 (υ C-H alifático); 1883 (υ C=O,

hidrazida); 1627 (υ C=O). UV (MeOH): λ

máx

= 254 nm (ε

máx

= 19380).

123

5.1.15 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS (6-METIL-1,3-BENZODIOXOL-5-IL)[4-

(METILSULFONIL)FENIL]METANOL (LASSBio-974) (94a) e (6-METIL-1,3-

BENZODIOXOL-5-IL)(4-NITROFENIL)METANOL (LASSBio-1040) (94b)

(BARREIRO,

et al.,

1985):

NaBH

, MeOH,

30’, 0

85-95%

(93b ou 93c)

R = -SO

(94a) LASSBio-974

R = -NO

(94b) LASSBio-1040

Em um balão, mantido a 0

C, contendo 0,334 g (1,05 mmol) de

(93b) ou 0,30 g (1,05 mmol) de (93c) solubilizados em 10 mL de metanol, foi

adicionado, aos poucos, 0,080 g (2,10 mmol) de borohidreto de sódio. A

mistura foi mantida sob agitação em banho de gelo por 1h, quando se observou

o consumo total do material de partida. O isolamento foi feito por adição de 10

mL de diclorometano e 10 mL de solução de fosfato monobásico 10%,

separação da fase orgânica e extração com diclorometano (3 x de 10 mL). As

fases orgânicas foram reunidas e lavadas água destilada (3 x 10 mL). Secou-se

a fase orgânica com NaSO

, filtrou-se e destilou-se o solvente em evaporador

rotatório. Os produtos (94a) e (94b) foram obtidos após purificação por coluna

cromatográfica em sílica, utilizando-se gradiente de acetato de etila:hexano

como eluente e recristalizados em etanol/água com rendimentos de 95% e

85%, respectivamente.

124

6’

2’

5’

3’

4’

1’

(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)[4-(metilsulfonil)fenil]metanol (LASSBio-974)

(94a) - Sólido branco ; p.f. 146-148 °C. RMN

H (200 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 2,17 (s, 3H, CH

); 3,17 (s, 3H, SO

); 5,86-6,03 (m, 4H, H2 e CHOH);

6,72 (s, 1H, H7); 6,91 (s, 1H, H4); 7,55 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,0 Hz); 7,86 (d,

2H, H3’ e H5’,

= 8,0 Hz). RMN

C (50 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 18,9

(CH

); 43,6 (SO

); 70,4 (CHOH); 100,6 (C2); 106,9 (C4); 110,2 (C7); 126,8

(C3’ e C5’); 127,4 (C2’ e C6’); 128,0 (C5); 135,7 (C6); 139,1 (C4’); 145,3 (C1a);

145,9 (C3a); 150,5 (C1’). IV (KBr, cm

-1

): 3500 (υ O-H); 2926; 2892 (υ C-H

alifático); 1300; 1140 (υ SO

). UV (MeOH): λ

máx

= 292 nm (ε

máx

= 5240).

6’

2’

5’

3’

4’

1’

(6-metil-1,3-benzodioxol-5-il)(4-nitrofenil)metanol (LASSBio-1040) (94b) -

amarelo ; p.f. 115-118 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 2,25 (s,

3H, CH

); 2,51 (s, 1H, OH,

= 3,0 Hz); 5,89 e 5,90 (2d, 2H, H2,

= 1,35 Hz);

6,01 (d, 1H, CHOH,

= 2,2 Hz); 6,64 (s, 1H, H7); 6,75 (s, 1H, H4); 7,49 (d, 2H,

H2’ e H6’,

= 8,8 Hz); 8,15 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 8,8 Hz). RMN

C (50 MHz,

125

CDCl

, TMS)

(ppm): 19,2 (CH

); 71,9 (CHOH); 101,0 (C2); 107,2 (C4); 110,7

(C7); 123,6 (C3’ e C5’); 127,3 (C2’ e C6’); 129,0 (C5); 133,6 (C6); 146,2 (C4’);

147,1 (C1a); 147,2 (C3a); 150,3 (C1’). IV (KBr, cm

-1

): 3517 (υ O-H); 3104; 3075

(υ C-H aromático); 2876 (υ C-H alifático); 1510; 1343 (υ NO

). UV (MeOH): λ

máx

= 283 nm (ε

máx

= 21634).

126

5.1.16 OBTENÇÃO DOS DERIVADOS 5-METIL-6-[4-

METILSULFONIL)BENZIL]-1,3-BENZODIOXOLA (LASSBio-975) (95a) E 5-

METIL-6-(4-NITROFENIL)-1,3-BENZODIOXOLA (LASSBio-1041) (95b)

(LAGES

et al

., 1998):

NaBH

, CF

, 0

72-75%

(94a ou 94b)

R = -SO

(95a) LASSBio-975

R = -NO

(95b) LASSBio-1041

Em um balão de 25 mL, em banho de gelo, contendo 5 mL de ácido

trifluoracético, adicionou-se 0,25 g (6,36 mmol) de NaBH

em pequenas

quantidades. Sobre esta mistura, sob agitação magnética, adicionou-se gota-a-

gota, por um período de 30 min, uma solução contendo 0,30 g (0,93 mmol) do

álcool (94a) ou 0,27 g (0,93 mmol) do álcool (94b) solubilizados em 4 mL de

diclorometano. Observou-se o aparecimento de coloração azulada para (94a) e

avermelhada para (94b) quando cada gota atinge a mistura reacional com

rápido desaparecimento. Após o término da adição, neutralizou-se o meio com

solução aquosa de NaOH 50% (p/v), separou-se a fase orgânica e extraiu-se a

fase aquosa com diclorometano (3 x 20 mL). As fases orgânicas foram

reunidas e lavadas com solução saturada de NaCl (2 x 20 mL) e água (2 x 20

mL). Secou-se a fase orgânica com NaSO

, filtrou-se e destilou-se o solvente

em evaporador rotatório Os produtos (95a) e (95b) foram recristalizados em

etanol/água. em rendimentos de 72% e 75%, respectivamente.,

127

6’

2’

5’

3’

4’

1’

5-metil-6-[4-metilsulfonil)benzil]-1,3-benzodioxola (LASSBio-975) (95a) -

Sólido branco ; p.f. 125-127 °C. RMN

H (200 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 2,05

(s, 3H, CH

); 2,95 (s, 3H, SO

); 3,89 (s, 2H, CH

); 5,83 (s, 2H, H2); 6,51 (s,

1H, H7); 6,60 (s, 1H, H4); 7,22 (d, 2H, H2’e H6’,

= 8,0 Hz); 7,75 (d, 2H, H3’ e

H5’,

= 8,0 Hz). RMN

C (50 MHz, DMSO

, TMS)

(ppm): 19,5 (CH

); 39,0

(CH

); 44,5 (SO

); 100,8 (C2); 110,1 (C4); 110,6 (C7); 127,5 (C3’ e C5’);

129,3 (C2’ e C6’); 129,5 (C5); 129,9 (C6); 138,2(C4’); 145,8 (C1a); 146,2 (C3a);

147,2 (C1’). IV: 3025; 3004 (υ C-H aromático); 2924 (υ C-H alifático); 1304;

1142 (υ SO

). UV (MeOH): λ

máx

= 293 nm (ε

máx

= 7460).

6’

2’

5’

3’

4’

1’

5-METIL-6-(4-NITROFENIL)-1,3-BENZODIOXOLA (LASSBio-1041) (95b) -

Sólido amarelo ; p.f. 84-85 °C. RMN

H (400 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 2,12

(s, 3H, CH

); 3,98 (s, 2H, CH

) 5,91 (s, 2H, H2); 6,59 (s, 1H, H7); 6,68 (s, 1H,

128

H4); 7,25 (d, 2H, H2’ e H6’,

= 8,8 Hz); 8,11 (d, 2H, H3’ e H5’,

= 8,8 Hz).

RMN

C (100 MHz, CDCl

, TMS)

(ppm): 19,4 (CH

); 39,9 (CH

); 100,8 (C2);

110,1 (C4); 110,6 (C7); 123,6 (C3’ e C5’); 129,1 (C2’ e C6’); 129,5(C5); 129,7

(C6); 145,8 (C1a); 146,3 (C3a); 148,4 (c1’). IV: 3103; 3076 (υ C-H aromático);

2903 (υ C-H alifático); 1510; 1342 (υ NO

129

5.2 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS COMPOSTOS (91-95):

5.2.1 ENSAIO DE EDEMA DE PATA DE RATO INDUZIDO POR

CARRAGENINA (FERREIRA,1979):

Os compostos testados foram administrados por via oral, na dose de

100 µmol/Kg, utilizando-se como veículo uma solução de goma arábica 5%.

Uma hora após a administração, foi realizada a indução do edema pela

administração subplantar de carragenina 1% (1000 µg/pata). Na pata

contralateral foi feita a administração de solução de NaCl 0,9% (0,1 mL/pata). A

leitura foi realizada 3 horas após a administração subplantar de carragenina,

utilizando-se um pletismógrafo acoplado a uma bomba peristáltica de fluxo

contínuo. O edema foi expresso pela variação de volume das patas, obtida pela

diferença entre as patas com carragenina e salina. Após o ensaio, os

estômagos foram retirados, abertos ao longo da curvatura maior e examinados

macroscopicamente para avaliar o índice de ulcerogeneicidade dos compostos

testados. AINES clássicos como a indometacina e a aspirina induzem

ulcerações difusas na mucosa dos animais, o que não é observado para os

inibidores seletivos de COX-2 (CHAN

et al.

, 1995).

130

5.2.2 POTENCIAL ULCEROGÊNICO (CHAN et al., 1995):

O potencial ulcerogênico dos compostos foi avaliado através da

dissecação dos estômagos dos animais utilizados no ensaio de edema de pata

de rato induzido por carragenina. Os estômagos foram abertos ao longo de sua

curvatura maior e após a sua lavagem com solução fisiológica, a mucosa

gástrica foi examinada macroscopicamente buscando a identificação de lesões

pontuais ou lesões hemorrágicas de maior tamanho. Às lesões pontuais foi

atribuído grau 2, e às de maior comprimento atribuiu-se grau 5. O grau de

ulcerogenicidade dos compostos foi então calculado multiplicando-se o número

de lesões observadas pelo valor do grau na qual essas lesões se

enquadravam dividido pelo número de estômagos observados (CHAN et al.,

1995).

131

5.2.3 ENSAIO DE CONTORÇÃO ABDOMINAL INDUZIDA POR ÁCIDO

ACÉTICO (WHITTLE, 1964, COOLIER et al., 1968):

A atividade analgésica periférica foi avaliada pelo ensaio de

contorção abdominal induzida pelo ácido acético 0,1N (WHITTLE, 1964,

COOLIER et al., 1968), utilizando-se camundongos suíços de ambos os sexos

pesando entre 18 e 25g e deixados em jejum com água a vontade por um

período de 8 horas.

As substâncias foram administradas por via oral na dose de 100

µmol/kg (0,1 mL/20g de peso do animal), utilizando-se como veículo goma

arábica 5%. Uma hora após a administração foi feita a indução do estímulo

algésico injetando ácido acético 0,1N na cavidade peritonial dos animais (0,1

ml/10 g de peso do animal). Dez minutos após a injeção iniciou-se a contagem

das contorções abdominais, que foi realizada durante os vinte minutos

subseqüentes. As contorções dolorosas foram definidas pela extensão de uma

ou ambas as patas posteriores com contorções intermitentes dos músculos

abdominais e arqueamento do dorso que tocava o fundo do recipiente onde se

encontrava o animal.

A contagem de contorções abdominais foi realizada em grupos de

animais tratados com as substâncias testes e em grupos de animais controle,

nos quais se administrou somente o veículo (goma 5%) ou as substâncias de

referência . A atividade analgésica foi determinada pela comparação com o

grupo controle.

132

5.2.4. ENSAIO DA PLACA QUENTE EM CAMUNDONGOS (KURAISHI

et.al.

1983):

A atividade analgésica central dos compostos foi avaliada através do

teste da placa quente (55 ± 0,1)°C, utilizando-se camundongos suíços de

ambos os sexos com pesos entre 18-25g e mantidos em jejum por um período

de 8 h.

Os animais foram colocados sobre a placa aquecida e suas

respostas ao estímulo térmico (retirada e lambida da pata) foram

cronometrados. Foi realizada uma primeira leitura para a adaptação dos

animais e subseqüentemente foi realizada a leitura controle. Os animais que

permaneceram por mais de 10 segundos na placa sem responder ao estímulo

térmico foram descartados. Os derivados foram administrados por via oral nas

doses de100 e 300 µmol/kg. Foram feitas quatro leituras em intervalos de trinta

minutos após a administração oral dos compostos.

133

5.2.5 ENSAIO DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA INDUZIDA POR ÁCIDO

ARAQUIDÔNICO, COLÁGENO E ADP (BORN & CROSS, 1968):

Para a obtenção do sangue utilizaram-se coelhos albinos de ambos

os sexos pesando entre 2,5 e 3,5, kg. Realizou-se a retirada do sangue através

de punção da artéria central da orelha. O sangue foi coletado em tubos de

polipropileno contendo solução de citrato trissódico 3,8% na proporção de 1

parte de citrato para cada 9 partes de sangue. Realizou-se uma centrifugação a

500 x

por 10 minutos e uma centrifugação do sedimento a 2000 x

, por 10

minutos, em temperatura ambiente, para a obtenção do PRP. O PRP foi

utilizado dentro de no máximo 3 horas, tendo em vista que após esse período

as plaquetas perdem gradativamente a sua capacidade de agregação

(CAZENAVE et. al, 1979). Os compostos foram testados veiculados em DMSO

e pré-incubados por 5 minutos com as plaquetas. Adicionaram-se os agonistas

(200 µM) e acompanhou-se o registro de agragação por 5 minutos.

134

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9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

5.17 3.07 2.00

0.00

2.53

5.67

5.87

6.70

6.74

6.78

6.80

6.82

7.23

7.25

7.27

7.30

7.32

(97)

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 1 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (97).

1.00

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

75.84

76.37

77.00

77.63

100.92

107.14

107.97

119.94

126.24

127.42

128.38

137.95

143.73

146.85

147.68

(97)

Espectro 2 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (97).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

75.84

100.92

107.14

107.97

119.94

126.24

127.42

128.38

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 3 – Experimento de DEPT-135 do derivado (97).

(97)

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

4.94 2.90 2.062.00

0.00

3.87

5.87

6.62

6.65

6.70

6.74

7.14

7.18

7.20

7.23

7.27

7.31

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 4 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (99).

(99)

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

41.58

76.37

77.00

77.63

100.77

108.11

109.37

121.67

126.06

128.42

128.74

134.95

141.23

145.82

147.67

Espectro 5 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (99)

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(99)

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

41.58

100.76

108.10

109.36

121.68

126.05

128.43

128.74

(99)

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 6 – Experimento de DEPT-135 do derivado (99).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

5.06 2.001.880.90

4.24

6.01

6.60

7.11

7.15

7.19

7.23

7.27

7.30

7.46

(91a)

LASSBio-1067

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 7 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (91a).

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

38.68

76.37

77.00

77.63

102.73

105.51

110.82

126.47

128.49

128.79

132.89

138.73

142.73

146.37

151.55

(91a)

LASSBio-1067

Espectro 8 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (91a).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

38.69

102.72

105.51

110.83

126.47

128.50

128.79

(91a)

LASSBio-1067

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 9 – Experimento de DEPT-135 para o derivado (91a).

(91a)

LASSBio-1067

Espectro 10 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (91a)

Wavenumbers (cm

-1

)

(91b)

LASSBio-1068

0.0038

7.1068

7.1469

3.1942

3.7343

5.7518

6.5240

6.1954

7.1809

7.2041

7.2244

7.2717

7.2808

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 11 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (91b).

(91b)

LASSBio-1068

137.580

176.470

177.107

177.744

198.223

100.430

110.578

117.152

126.252

128.319

128.584

139.028

139.578

140.238

146.662

Espectro 12 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (91b).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(91b)

LASSBio-1068

137.580

198.223

100.430

110.578

126.252

128.319

128.584

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 13 – Experimento de DEPT-135 para o derivado (91b).

(91c)

LASSBio-1069

NHCOCH

Espectro 14 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93d).

SOLVENT = DMSO-d

TD = 65536

SF = 400,15 MHz

SW = 8278.146 Hz

AQ = 3.948 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

(91c)

LASSBio-1069

NHCOCH

Espectro 15 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (91c).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 32768

SF = 100.627 MHz

SW = 23980.814 Hz

AQ = 0.683 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(91c)

LASSBio-1069

NHCOCH

136.340

101.045

107.322

109.211

125.821

128.202

128.579

122.926

Espectro 16 – Experimento de DEPT-135 do derivado (91c).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(91c)

LASSBio-1069

NHCOCH

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 4096

SW = 5995.204 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 400.15 MHz

NUC = 13C

SF = 100.62 MHz

Espectro 17 – Experimento de HMBC para o derivado (91c).

(91c)

LASSBio-1069

NHCOCH

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 4096

SW = 5995.204 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 400.15 MHz

NUC = 13C

SF = 100.62 MHz

Espectro 18 – Experimento de HMBC para o derivado (91c).

(91c)

LASSBio-1069

NHCOCH

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 4096

SW = 5995.204 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 400.15 MHz

NUC = 13C

SF = 100.62 MHz

Espectro 19 – Experimento de HMBC para o derivado (91c).

(91c)

LASSBio-1069

NHCOCH

Espectro 20 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (91c).

Wavenumbers (cm

-1

)

%Transmittance

(100)

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 21 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (100).

(100)

Espectro 22 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (100).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(100)

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 23 – Experimento de DEPT-135 do derivado (100).

(100)

Espectro 24 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (100).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

2.112.04 2.000.96

6.20

6.81

7.25

7.39

7.42

7.46

7.53

7.57

7.64

7.71

7.72

7.76

(92a)

LASSBio 1045

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 25 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92a).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

2.112.04 2.001.10 0.960.93

6.20

6.81

7.25

7.39

7.42

7.46

7.53

7.57

7.60

7.64

7.71

7.72

7.76

(92a)

LASSBio 1045

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 26 – Expansão do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92a).

200 150 100 50 0

76.36

77.00

77.63

103.65

104.85

107.60

128.71

129.01

132.83

133.68

135.81

148.94

152.66

192.63

Espectro 27 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (92a).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(92a)

LASSBio 1045

200 150 100 50 0

103.64

104.85

107.60

128.71

129.00

133.67

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 28 – Experimento de DEPT-135 do derivado (92a).

(92a)

LASSBio 1045

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 29 – Experimento de HMBC para o derivado (92a)

(92a)

LASSBio 1045

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 30 – Experimento de HMBC para o derivado (92a).

(92a)

LASSBio 1045

(92a)

LASSBio 1045

Espectro 31 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr para o derivado (92a).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

5.00 2.171.000.95

5.87

6.22

6.84

7.25

7.41

7.45

7.48

7.53

7.54

7.57

7.58

(92b)

LASSBio 1046

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 32 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92b).

200 150 100 50 0

76.37

77.00

77.63

96.83

101.27

110.46

111.58

128.05

128.47

130.38

138.39

140.67

150.13

153.09

196.96

Espectro 33 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (92b).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(92b)

LASSBio 1046

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 34 – Experimento de DEPT-135 do derivado (92b).

(92b)

LASSBio 1046

200 150 100 50 0

96.82

101.28

111.58

128.05

128.48

130.39

(92b)

LASSBio 1046

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 35 – Experimento de HMBC para o derivado (92b).

(92b)

LASSBio 1046

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 36 – Experimento de HMBC para o derivado (92b).

(92b)

LASSBio 1046

Espectro 37 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr para o derivado (92b)

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

4.98 3.082.000.890.78

0.00

3.02

6.06

7.02

7.37

7.45

7.48

7.52

7.56

7.59

7.62

7.65

10.79

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 38 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92c).

(92c)

LASSBio 1065

NHSO

7.5 7.0 6.5 6.0

4.98 2.000.890.87

6.06

7.02

7.37

7.45

7.48

7.52

7.56

7.59

7.62

7.65

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 39 – Expansão do espectro Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92c).

NHSO

(92c)

LASSBio 1065

200 150 100 50 0

39.88

76.37

77.00

77.63

101.41

102.43

112.47

116.82

128.37

129.25

132.17

137.90

138.51

143.01

152.78

197.87

(92c)

LASSBio 1065

Espectro 40– Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (92c).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

NHSO

200 150 100 50 0

39.88

101.40

102.42

112.46

128.37

129.24

132.16

(92c)

LASSBio 1065

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 41 – Experimento de DEPT-135 para o derivado (92c).

NHSO

(92c)

LASSBio 1065

NHSO

Espectro 42 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr para o derivado (92c).

Wavenumber (cm

-1

)

%Transmittance

(92d)

LASSBio 1066

NHCOCH

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 43 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (92d).

(92d)

LASSBio 1066

NHCOCH

Espectro 44 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (92d).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

(92d)

LASSBio 1066

NHCOCH

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 45 – Experimento de DEPT-135 do derivado (92d).

(92d)

LASSBio 1066

NHCOCH

Espectro 46 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (92d).

Wavenumbers (cm

-1

)

%Transmittance

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93a)

LASSBio 971

Espectro 47 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93a)

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93a)

LASSBio 971

Espectro 48 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93a).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93a)

LASSBio 971

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 49 – Experimento de DEPT-135 para o derivado (93a).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93a)

LASSBio 971

Espectro 50 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93a).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93b)

LASSBio 944

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 51 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93b)

LASSBio 944

Espectro 52 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93b).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93b)

LASSBio 944

Espectro 53 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93b).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

0.150.10 0.100.10 0.10

0.00

2.35

6.03

6.79

7.28

7.89

7.93

8.28

8.32

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 54 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93c).

200 150 100 50 0

20.65

76.37

77.00

77.63

101.72

109.80

111.61

123.56

129.65

130.64

134.40

143.58

145.30

149.93

150.25

195.13

Espectro 55 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93c).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 56 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93c).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 57 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 58 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 59 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 60 – Experimento de HMBC para o derivado (93c).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93c)

LASSBio 973

Espectro 61 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93c).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

2.822.001.971.95 0.95

2.05

2.49

3.47

6.01

6.16

6.53

6.58

6.72

6.84

7.39

7.43

Espectro 62 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93d).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93d)

LASSBio 976

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

200 150 100 50 0

19.19

38.24

38.66

39.08

39.50

39.91

40.33

40.74

101.24

107.66

110.53

112.71

124.59

129.41

132.34

133.10

144.75

147.82

154.12

194.39

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93d)

LASSBio 976

Espectro 63 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93d).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

150 100 50 0

19.19

101.23

107.65

110.52

112.70

132.33

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93d)

LASSBio 976

Espectro 64 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado (93d).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93d)

LASSBio 976

Espectro 65 – Experimento de HMBC para o derivado (93d).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 4096

SW = 5995.204 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 400.15 MHz

NUC = 13C

SF = 100.62 MHz

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93d)

LASSBio 976

Espectro 66 – Experimento de HMBC para o derivado (93d).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 4096

SW = 5995.204 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 400.15 MHz

NUC = 13C

SF = 100.62 MHz

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93d)

LASSBio 976

Espectro 67 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93d).

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

2.96 2.962.092.07 2.001.04 1.00

2.13

2.49

3.11

3.35

6.05

6.83

6.90

7.26

7.31

7.65

7.69

10.38

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93e)

LASSBio 977

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 68 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93e).

NHSO

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

2.092.07 2.001.000.98

6.05

6.83

6.90

7.26

7.31

7.65

7.69

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93e)

LASSBio 977

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 69 – Expansão do espectro Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93e).

NHSO

200 150 100 50 0

19.46

38.26

38.67

39.09

39.50

39.93

40.34

40.76

101.45

108.36

110.84

117.54

130.95

131.41

131.97

143.15

144.80

148.64

195.28

Espectro 70 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93e).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93e)

LASSBio 977

NHSO

Espectro 71 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado (93e).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93e)

LASSBio 977

NHSO

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

200 150 100 50 0

19.46

39.95

101.45

108.35

110.84

117.54

131.40

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93e)

LASSBio 977

NHSO

Espectro 72 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93e).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93f)

LASSBio 986

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 73 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93f).

NHCOCH

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

6.044.26 2.03 2.000.82

0.00

2.19

2.24

5.98

6.73

6.78

7.27

7.60

7.64

7.72

7.77

8.32

Espectro 74 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93f).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93f)

LASSBio 986

NHCOCH

200 150 100 50 0

20.06

24.57

76.36

77.00

77.63

101.38

108.98

111.04

118.86

131.41

132.11

133.36

142.50

145.06

149.17

168.98

196.67

200 150 100 50 0

20.06

24.57

101.37

108.98

111.04

118.85

131.40

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 75 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93f).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93f)

LASSBio 986

NHCOCH

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93f)

LASSBio 986

NHCOCH

Espectro 76 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93f).

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

4.213.31 3.022.472.051.991.00

2.13

3.34

6.06

6.85

6.91

7.52

7.56

7.60

7.68

7.73

7.93

7.98

10.59

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93g)

LASSBio 1044

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 77 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93g).

NHCOPh

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

4.21 3.312.10 2.051.99

6.06

6.85

6.91

7.52

7.56

7.60

7.68

7.73

7.93

7.98

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93g)

LASSBio 1044

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 78 – Expansão do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93g).

NHCOPh

200 150 100 50 0

19.45

38.24

38.66

39.08

39.50

39.91

40.33

40.74

101.41

108.31

110.78

119.51

127.78

128.39

130.71

131.53

131.85

132.37

134.50

143.73

144.80

148.59

165.98

195.39

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93g)

LASSBio 1044

NHCOPh

Espectro 79 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93g).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

200 150 100 50 0

19.45

101.41

108.32

110.79

119.52

127.78

128.39

130.72

131.86

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93g)

LASSBio 1044

NHCOPh

Espectro 80 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado (93g).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93g)

LASSBio 1044

NHCOPh

Espectro 81 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93g).

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

3.153.132.052.002.00 1.93

2.29

3.93

5.98

6.74

6.78

7.25

7.77

7.81

8.06

8.11

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93h)

LASSBio 972

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 82 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93h).

200 150 100 50 0

20.49

52.39

76.37

77.00

77.64

101.54

109.71

111.34

129.54

129.69

130.55

133.43

133.63

141.95

145.13

149.76

166.22

196.53

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93h)

LASSBio 972

Espectro 83 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93h).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

200 150 100 50 0

20.49

52.40

101.54

109.71

111.35

129.54

129.69

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93h)

LASSBio 972

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 84 – Experimento de DEPT-135 do derivado (93h).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93h)

LASSBio 972

Espectro 85 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93h).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

2.982.05 1.990.97

2.17

2.49

6.07

6.86

6.93

7.73

7.77

8.03

8.07

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93i)

LASSBio 1042

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 86– Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93i).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

2.05 2.00 1.990.97

6.07

6.86

6.93

7.73

7.77

8.03

8.07

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93i)

LASSBio 1042

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 87 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93i).

200 150 100 50 0

19.84

38.25

38.67

39.08

39.50

39.92

40.33

40.75

101.67

109.07

111.10

129.54

130.42

132.34

134.38

141.10

144.91

149.33

166.64

196.03

Espectro 88 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93i).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93i)

LASSBio 1042

200 150 100 50 0

19.84

101.67

109.08

111.11

129.56

Espectro 89 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado (93i).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93i)

LASSBio 1042

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93i)

LASSBio 1042

Espectro 90 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93i).

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

4.15 3.11 3.012.001.97 1.870.92

2.17

2.49

3.35

4.58

6.07

6.86

6.94

7.70

7.74

7.91

7.95

9.96

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 91 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (93j).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93j)

LASSBio 1043

CONHNH

200 150 100 50 0

19.73

38.26

38.67

39.09

39.50

39.92

40.34

40.75

101.61

108.90

111.02

127.26

129.42

130.61

132.01

137.06

139.58

144.86

149.17

164.91

196.02

Espectro 92 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (93j).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93j)

LASSBio 1043

CONHNH

200 150 100 50 0

19.73

101.60

108.89

111.03

127.26

129.42

Espectro 93 – Ressonância Magnética Nuclear de DEPT-135 do derivado (93j).

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93j)

LASSBio 1043

CONHNH

Espectro 94 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (93j).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(93j)

LASSBio 1043

CONHNH

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

4.39 3.47 3.472.162.08 1.00

2.17

2.49

3.17

3.38

5.86

5.88

5.92

5.96

6.00

6.03

6.72

6.90

7.53

7.57

7.84

7.88

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94a)

LASSBio 974

SOLVENT = DMSO-d

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 95 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (94a).

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

18.88

38.25

38.66

39.08

39.50

39.92

40.33

40.75

43.59

70.41

100.67

106.95

110.19

126.85

127.37

128.03

135.66

139.13

145.39

145.98

150.48

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94a)

LASSBio 974

SOLVENT = DMSO-d

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 96 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (94a).

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

18.88

43.59

70.40

100.67

106.94

110.20

114.11

126.87

127.38

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94a)

LASSBio 974

SOLVENT = DMSO-d

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 97 – Experimento de DEPT-135 do derivado (94a).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94a)

LASSBio 974

Espectro 98 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (94a).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

2.982.002.00 1.990.98

2.25

2.51

2.52

5.89

5.90

6.01

6.02

6.64

6.75

7.26

7.47

7.52

8.13

8.18

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94b)

LASSBio 1040

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 99 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (94b).

6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1 6.0 5.9 5.8 5.7

1.990.98 0.970.95

5.89

5.90

6.01

6.02

6.64

6.75

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94b)

LASSBio 1040

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 100 – Expansão do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (94b).

200 150 100 50 0

19.20

71.96

76.37

77.00

77.63

101.06

107.21

110.75

123.57

127.29

129.01

133.66

146.23

147.10

147.23

150.37

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94b)

LASSBio 1040

Espectro 101 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (94b).

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 14124.294 Hz

AQ = 2.320 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

19.20

71.94

101.05

107.20

110.74

123.56

127.29

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 102 – Experimento de DEPT-135 para o derivado (94b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94b)

LASSBio 1040

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(94b)

LASSBio 1040

Espectro 103 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (94b).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

3.07 3.062.34 2.132.10 2.102.02

0.00

2.05

2.95

3.89

5.83

6.51

6.60

7.20

7.24

7.74

7.77

Espectro 104 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (95a).

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 200,13 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95a)

LASSBio 975

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

19.49

39.01

44.51

76.58

77.00

77.43

100.82

110.16

110.65

127.48

129.33

129.53

129.96

138.17

145.83

146.28

147.27

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 75.468 MHz

SW = 19685.039 Hz

AQ = 1.665 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 105 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (95a).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95a)

LASSBio 975

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 50,323 MHz

SW = 15060.241 Hz

AQ = 2.176 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 106 – Experimento de DEPT-135 do derivado (95a).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95a)

LASSBio 975

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95a)

LASSBio 975

Espectro 107 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (95a).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95b)

LASSBio 1041

SOLVENT = CDCl

TD = 32768

SF = 400,15 MHz

SW = 5592.841 Hz

AQ = 2.929 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

Espectro 108 – Ressonância Magnética Nuclear de

H do derivado (95b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95b)

LASSBio 1041

SOLVENT = CDCl

TD = 65536

SF = 75.468 MHz

SW = 19685.039 Hz

AQ = 1.665 sec

TE = 300.0 K

NUC = 13C

Espectro 109 – Ressonância Magnética Nuclear de

C do derivado (95b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95b)

LASSBio 1041

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 110 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95b)

LASSBio 1041

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 111 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95b)

LASSBio 1041

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 112 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95b)

LASSBio 1041

SOLVENT = DMSO-d6

TD = 2048

SW = 3004.808 Hz

AQ = 0.341 sec

TE = 300.0 K

NUC = 1H

SF = 300.13 MHz

NUC = 13C

SF = 75.46 MHz

Espectro 113 – Experimento de HMBC para o derivado (95b).

Espectro 114 – Experimento de infravermelho em pastilha de KBr do derivado (95b).

6’

2’

5’ 3’

4’

1’

(95b)

LASSBio 1041

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