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MICHELLE CHRISTIANE DA SILVA RABELLO
Estudo do mecanismo de transferência horizontal da sequência de
inserção IS1245, específica de Mycobacterium avium, para
Mycobacterium kansasii
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo para obtenção do Título de
Doutor em Ciências.
São Paulo
2009
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
MICHELLE CHRISTIANE DA SILVA RABELLO
Estudo do mecanismo de transferência horizontal da sequência de
inserção IS1245, específica de Mycobacterium avium, para
Mycobacterium kansasii
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo para obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
Orientador: Profa. Dra. Sylvia Cardoso Leão
Co-Orientador: Profa. Dra. Rosa Maria Silva
São Paulo
2009
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Rabello, Michelle Christiane da Silva
Estudo do mecanismo de transferência horizontal da sequência de
inserção IS1245, específica de Mycobacterium avium, para Mycobacterium
kansasii. Michelle Christiane da Silva Rabello – São Paulo, 2009.
XVII, 84f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós – graduação em Microbiologia e Imunologia.
Título em inglês: Study of the mechanism of horizontal transfer of insertion
sequence IS1245, specific of Mycobacterium avium, to Mycobacterium
kansasii
1. Mycobacterium avium. 2. Sequência de inserção. 3. IS1245.
4. Plasmídeo. 5. Transferência horizontal.
MICHELLE CHRISTIANE DA SILVA RABELLO
Estudo do mecanismo de transferência horizontal da sequência de
inserção IS1245, específica de Mycobacterium avium, para
Mycobacterium kansasii
PRESIDENTE DA BANCA:
Profa. Dra. Sylvia Cardoso Leão
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Mário Hiroyuki Hirata
Profa. Dra. Marillis do Valle Marques
Prof. Dr. Marcelo de Carvalho Ramos
Profa. Dra. Rosana Puccia
SUPLENTES:
Dra. Rosângela Siqueira de Oliveira
Profa. Dra. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E
PARASITOLOGIA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Clara Lúcia Barbieri Mestriner
Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara
AGRADECIMENTOS ACADÊMICOS
À Profa. Dra. Sylvia Cardoso Leão, meu sincero agradecimento pela brilhante
orientação, que foi fundamental para meu amadurecimento científico, e pela
oportunidade e apoio em todos os momentos.
À Profa. Dra. Rosa Maria Silva por ter acreditado no meu potencial desde início e pela
co-orientação, incentivo e valiosas discussões científicas nos corredores da
Microbiologia, na hora do café e nos seminários.
À Profa. Dra. Maria Jesus Garcia da Universidad Autónoma de Madrid pela
oportunidade, colaboração e aprendizado durante minha estância em seu laboratório.
À Rosângela Siqueira pelas descobertas iniciais deste estudo e pelo carinho, amizade e
companheirismo.
À Mônica Vieira pelo auxílio nos experimentos com radioativo, amizade e apoio em
todos os momentos.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Pignatari e ao Prof. Dr. José Franco Silveira Filho por
terem disponibilizado o aparelho CHEF-DRIII.
À equipe do laboratório da Dra. Sylvia: Cris Viana, Jéssica e Cristianne, e as meninas
da Imunologia: Janaína, Carol e a Profa. Dra. Célia Carneiro pelas reuniões científicas,
convivência e ajuda em todos os momentos.
Às secretárias Magda e Paola, a todos os funcionários, docentes e alunos da Disciplina
de Microbiologia pela convivência durante este período, dedicação em ajudar e
amizade.
Ao CNPq pelo apoio financeiro no Brasil, à CAPES pelo apoio financeiro durante o
doutorado sanduíche na Espanha.
AGRADECIMENTOS PESSOAIS
À Deus pela vida, saúde e a força que fez vencer todas as dificuldades.
Aos meus pais Cláudio e Maria, a minha avó Juvita; meus irmãos Ítalo e Cláudia e aos
meus padrinhos Luís Carlos (in memoriam) e Maria pelo carinho, incentivo aos estudos,
apoio e compreensão pela minha ausência durante esta trajetória na minha vida.
Também, a minha sobrinha Biaquinha que me proporcionou muitas alegrias nos poucos
momentos que passamos juntas.
À Cristina Viana - Niero pela amizade verdadeira, companheirismo, ensinamentos no
laboratório, força e apoio em todos os momentos que precisei, seja pessoal ou científico.
À Profa. Dra. Eulália Ximenes e a Profa. Kêsia Xisto da Universidade Federal de
Pernambuco pelo incentivo a carreira acadêmica e por acreditarem no meu potencial
científico.
Aos meus queridos amigos: Denise Yamamoto, Jéssica Moreno, Erick Ramos e Kléber
Galvão pela amizade, incentivo, risos e apoio em todos os momentos.
Aos amigos da república: Daniel, Fabrício e Sérgio, pela compreensão e ajuda no
período final deste trabalho.
Aos amigos de Recife e aos conquistados em São Paulo, que mesmo distantes, sempre
torceram pelo meu sucesso e me apoiaram.
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS XI
LISTA DE TABELAS XIII
LISTA DE FIGURAS XIV
RESUMO XVII
SUMMARY XVIII
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Micobactérias 2
1.2. O complexo Mycobacterium avium 4
1.3. Mycobacterium kansasii 6
1.4. Sequências de inserção 7
1.5. Aquisição de DNA por transferência horizontal em bactérias 12
1.5.1. Transferência horizontal de genes (THG) 12
1.5.2. Mecanismos de transferência de DNA 13
1.5.3. HGT em micobactérias 15
1.6. Plasmídeos 18
1.7. Plasmídeos em micobactérias 20
1.8. Antecedentes do projeto 22
2. OBJETIVOS 23
2.1. Objetivos geral 24
2.2. Objetivos específicos 24
3. MATERIAL E MÉTODOS 25
3.1. Cepas bacterianas estudadas 26
3.2. Cultivo e manutenção das bactérias 26
3.3. Isolamento das colônias de M. avium e M. kansasii 27
3.4. Extração de DNA 27
3.5. Identificação das colônias de M. avium e M. kansasii pelo método 28
molecular PRA – ITS
3.6. Detecção de IS1245 e IS1311 por Polymerase Chain Reaction (PCR) 29
3.7. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)-IS1245 30
3.8. Pesquisa de plasmídeos por PFGE 31
3.9. Localização da IS1245 por hibridação com sonda radioativa 32
3.9.1. Marcação radioativa da sonda 32
3.9.2. Hibridação das membranas com sonda radioativa 33
3.10. Caracterização do elemento de DNA portador de IS1245 em 34
M. avium
3.10.1. Análise da mobilidade de moléculas de DNA circular e 34
linear por PFGE
3.10.2. PFGE em condições de corrida distintas 34
3.10.3. Efeito do tratamento com exonucleases e com topoisomerase I 35
3.10.4. Efeito do tratamento com proteinase K 35
3.11. Testes de transferência horizontal do elemento IS1245 por
36
conjugação
3.11.1. Amostras selecionadas para os testes de conjugação 36
3.11.2. Teste de conjugação em meio líquido sob agitação 36
3.11.3. Teste de conjugação em meio líquido sem agitação 36
3.11.4. Teste de conjugação em meio sólido 37
3.11.5. Seleção de colônias transconjugantes de M. kansasii 37
3.12. Tipificação das colônias de M. avium e M. kansasii por PFGE 38
3.13. Teste de estabilidade da sequência de inserção IS1245 em 38
M. kansasii após cultivos in vitro
4.0. RESULTADOS 39
4.1. Identificação das colônias isoladas do cultivo 88 40
4.2. Confirmação da presença da IS1245 em M. kansasii por PCR 41
4.3. Confirmação da presença da IS1245 em M. kansasii por RFLP 43
4.4. Pesquisa de plasmídeos 44
4.4.1. Detecção da IS1245 na banda de DNA identificada em M. avium 45
e M. kansasii IS1245 +
4.4.2. Caracterização da banda de DNA de 100 kb portadora de IS1245 47
4.4.2.1. Comparação da migração de moléculas de DNA linear e 47
circular por PFGE
4.4.2.2. Efeito do tratamento com exonucleases e topoisomerase I 49
4.4.2.3. Detecção de proteínas ligadas covalentemente à banda 50
MA100
4.5. Testes de conjugação 51
4.5.1. Testes de conjugação de M. avium com M. kansasii (isolados 52
do cultivo misto 88)
4.5.2. Testes de conjugação de M. avium com outras cepas de 54
M. kansasii
4.6. PFGE após digestão com a enzima de restrição Dra I das cepas 56
analisadas neste estudo
4.7. Análise da estabilidade da sequência de inserção IS1245 após cultivos 58
consecutivos in vitro de M. kansasii
5. DISCUSSÃO 59
6. CONCLUSÕES 70
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72
LISTA DE ABREVIATURAS
aids Acquired Immunodeficiency Syndrome
ATCC American Type Culture Collection
BSA Albumina sérica bovina
CCC covalently closed circular
CTAB Brometo de N-cetyl-N,N,N,-trimetil amônio
dCTP Deoxicitidina trifosfato
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Deoxinucleotídeos trifosfato
DR Direct Repeats
EDTA Ácido etileno-diamino tetracético
GPL Glicopeptideolipídeo
Hfr high frequency recombination
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
Inc Incompatibilidade
IAL Instituto Adolfo Lutz
IEC Instituto Evandro Chagas
IR Inverted repeats
IS Insertion sequence
ITS Internal Transcribed Spacer
LB Meio de cultura Luria Bertani
MAC complexo Mycobacterium avium
MNT Micobactérias não tuberculosas
OADC Catalase, dextrose, albumina, ácido oléico
ORF open reading frame
XI
PCR Polymerase Chain Reaction
PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis
ph Potencial hidrogeniônico
PRA PCR Restriction Enzyme Analysis
PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS Dodecil sulfato de sódio
SSC Solução salina citrato
TE Tris-EDTA
THG Transferência horizontal de genes
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação das micobactérias de acordo com o tempo de 3
crescimento e produção de pigmento.
Tabela 2: Plasmídeos de micobactérias sequenciados. 21
Tabela 3: Dados das cepas com plasmídeos utilizadas. 26
Tabela 4: Oligonucleotídeos utilizados para PCR-IS1245 e PCR-IS1311. 30
Tabela 5: Resultados de PRA-ITS, PCR-IS1245 e PCR-IS1311 obtidos 42
com DNA das colônias de M. avium e M. kansasii isoladas do
cultivo 88.
Tabela 6: Análise por PCR IS1245 das colônias de M. kansasii isoladas após 52
experimentos de conjugação de M. avium com M. kansasii IS1245 –.
Tabela 7: Análise por PCR IS1245 das colônias de M. kansasii isoladas após 55
testes de conjugação de M. avium com outras cepas de M. kansasii.
XIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mecanismo de inserção de IS no genoma do hospedeiro. 8
Figura 2: Transposição conservativa e replicativa de sequência de inserção. 9
Figura 3: Mecanismos de transferência horizontal de DNA entre células. 13
Figura 4: Sequência de inserção IS1245. 29
Figura 5: Sequência de inserção IS1311. 29
Figura 6: Identificação das quinze colônias isoladas do cultivo misto 40
de M. avium / M. kansasii (cultivo 88).
Figura 7: PCR-IS1245 das quinze colônias isoladas do cultivo misto de 41
M. avium/M. kansasii (cultivo 88).
Figura 8: PCR-IS1311 das quinze colônias isoladas do cultivo misto de 42
M. avium / M. kansasii (cultivo 88).
Figura 9: RFLP-IS1245 das colônias isoladas do cultivo misto de 44
M. avium/M. kansasii (cultivo 88).
Figura 10: Identificação de uma banda de DNA de ≅ 100 kb nas colônias de 46
M. avium e de M. kansasii IS1245 +.
Figura 11: Padrão de migração das moléculas de DNA lineares e circulares 48
por PFGE.
Figura 12: Comparação da migração da banda MA100 submetida a PFGE em 49
diferentes intervalos de tempo de alternância dos pulsos de campo
elétrico.
Figura 13: Caracterização da banda de DNA de 100 kb de M. avium (MA100) 50
Figura 14: Caracterização da banda de DNA MA100 de M. avium. 51
XIV
Figura 15: Análise das colônias de M. kansasii obtidas após testes de 54
conjugação de M. avium com M. kansasii IS1245 -.
Figura 16: Análise dos transconjugantes de M. kansasii isoladas após testes 55
de conjugação de M. avium com outras cepas de M. kansasii IS1245 -.
Figura 17: PFGE-Dra I das colônias isoladas do cultivo 88 e das outras cepas 57
de M. kansasii analisadas neste estudo.
Figura 18: RFLP-IS1245 das colônias de M. kansasii 88.11 e 88.12 isoladas após 58
dez cultivos sequenciais in vitro.
XV
RESUMO
Mycobacterium avium e Mycobacterium kansasii são micobactérias não
tuberculosas frequentemente isoladas em infecções em pacientes HIV positivos. Em um
projeto anterior do laboratório foi estudado um cultivo misto de M. avium e M. kansasii
isolado da medula óssea de um paciente HIV positivo. Estudando colônias isoladas
deste cultivo, foi possível observar que a cepa de M. kansasii possuía a sequência de
inserção IS1245, que é especifica de M. avium. A presença deste elemento de inserção
em M. kansasii foi confirmada por PCR-IS1245, RFLP-IS1245 e sequenciamento. Este
estudo teve como objetivo investigar o mecanismo de transferência da IS1245 para M.
kansasii. Uma banda de aproximadamente 100 kb foi detectada por PFGE em colônias
de M. avium e de M. kansasii deste cultivo misto. Testes de mobilidade desta banda de
DNA em géis de PFGE, em diferentes condições de corrida, e testes com exonucleases e
com topoisomerase I comprovaram que esta banda era um plasmídeo linear (pMA100),
que continha proteínas covalentemente ligada nos seus terminais 5’. Estes achados
levaram à hipótese de que o plasmídeo pMA100 seria responsável pela transferência
natural do elemento IS1245 de M. avium para M. kansasii por conjugação.
Experimentos in vitro reproduziram o evento de conjugação, tanto com a cepa de M.
kansasii isolada do cultivo misto, como com outras duas cepas de M. kansasii não
relacionadas. A sequência de inserção se manteve estável no genoma de M. kansasii
após 10 subcultivos e foi observada a ocorrência de transposição de modo replicativo
em M. kansasii. Pela primeira vez está sendo demonstrada a transferência horizontal de
genes natural entre espécies diferentes de micobactérias.
XVI
SUMMARY
Mycobacterium avium and Mycobacterium kansasii are non-tuberculous
mycobacteria frequently isolated in infections from HIV positive patients. In a previous
study from our laboratory, a mixed culture of M. avium and M. kansasii from a bone
marrow isolate of an HIV positive patient was studied. The analysis of isolated colonies
allowed the detection of the insertion sequence IS1245, specific from M. avium, in M.
kansasii. The presence of this element in M. kansasii was confirmed by PCR-IS1245,
RFLP-IS1245 and sequencing. The objective of this study was to investigate the
mechanism of transference of the IS1245 to M. kansasii. A band of approximately 100
kb was detected by PFGE in colonies of M. avium and M. kansasii from this mixed
culture. Tests of mobility of this DNA band in PFGE gels, in different running
conditions, and tests with exonucleases and topoisomerase I demonstrated that this band
was a linear plasmid (pMA100) with proteins covalently linked to the 5’ ends. These
findings led to the hypothesis that the pMA100 plasmid was responsible for the natural
transference of the IS1245 element from M. avium to M. kansasii by conjugation.
Experiments performed in vitro reproduced the conjugation event, not only with the M.
kansasii strain from the mixed culture, but also with other two unrelated M. kansasii
strains. The insertion sequence was stably maintained in the M. kansasii genome after
10 subcultures and its replicative transposition in M. kansasii was also observed. For the
first time the natural horizontal gene transfer between different species of mycobacteria
has been demonstrated.
XVII
1. INTRODUÇÃO
2
1.1. Micobactérias
O gênero Mycobacterium, único da família Mycobacteriaceae, é constituído de
142 espécies e 11 subespécies (J.P. Euzéby, List of Prokaryotic Names with Standing in
Nomeclature [http://www.bacterio.citc.fr]). Essas bactérias são bacilos retos ou
ligeiramente curvos, imóveis, aeróbios e não esporulados (Holt et al., 1994). A
definição deste gênero baseia-se em três critérios principais: resistência à descoloração
por álcool-ácido (princípio da técnica de Ziehl-Neelsen), conteúdo de Guanina-Citosina
(61 a 71%) e síntese de ácidos micólicos.
A parede celular destes microrganismos possui um alto teor de lipídeos
complexos (60%), como ácidos micólicos, lipoarabinomanano, peptidioglicolipídios e
glicolipídios fenólicos. Essa característica explica as propriedades tintoriais e a
resistência a diversos agentes químicos e físicos (Levy-Frebault & Portaels, 1992).
As micobactérias podem ser classificadas, segundo o tempo de geração (varia de
2 a 18 h), em micobactérias de crescimento rápido ou lento. Micobactérias de
crescimento rápido formam colônias visíveis em menos de sete dias e as de crescimento
lento requerem mais de sete dias para produzir colônias visíveis. Em relação à produção
de pigmentação, essas bactérias podem ser divididas em três grupos: acromógenas,
fotocromógenas e escotocromogénas. Estas características associadas possibilitam a
classificação das micobactérias em quatro grupos, chamados grupos de Runyon: I, II, III
e IV (Tabela 1).
3
Tabela 1: Classificação das micobactérias de acordo com o tempo de crescimento e produção
de pigmento (Runyon, 1965)
Grupos Pigmentação
Tempo de
crescimento
Grupo I Fotocromógenas (colônias adquirem pigmentação quando
expostas à luz)
Lento
Grupo II Escotocromógenas (colônias produzem pigmentação
mesmo quando crescem na ausência de luz)
Lento
Grupo III Acromógenas (não apresentam pigmentação) Lento
Grupo IV Produtoras ou não de pigmento Rápido
As micobactérias também podem ser classificadas de acordo com critérios
clínicos como: 1) micobactérias estritamente patogênicas para o homem e animais
(como por exemplo, os membros do complexo Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leprae e Mycobacterium lepraemurium), que geralmente não são
encontradas no ambiente; 2) micobactérias potencialmente patogênicas para o homem
ou animais e 3) micobactérias saprófitas não patogênicas ou só excepcionalmente
patogênicas. As espécies saprófitas e as potencialmente patogênicas são comumente
denominadas micobactérias não tuberculosas (MNT), MOTT (Mycobacteria Other
Than Tuberculosis), ou atípicas. A denominação micobactérias não tuberculosas (MNT)
tem sido frequentemente adotada, embora ainda não haja um consenso sobre a
denominação mais adequada (Falkinham, 2002).
MNT são ubíquas no ambiente. As infecções por MNT são comumente
adquiridas de fontes ambientais, incluindo água e solo (Primm et al., 2004). O aumento
na prevalência da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired
Immunodeficiency Syndrome - aids) e de pacientes com várias condições
imunossupressivas (ex: transplantes cardíacos ou renais, uso crônico de corticosteróides
4
e leucemias) também tem contribuído para elevar a incidência de infecções por MNT,
especialmente naqueles pacientes com imunossupressão severa.
O encontro de MNTs em isolados humanos pode significar que a bactéria é
patogênica e responsável pela ocorrência de uma micobacteriose, ou é um contaminante
ou colonizador e a separação entre estas três possibilidades se baseia em dados clínicos
e na detecção da mesma espécie em vários isolamentos consecutivos do mesmo
paciente, no caso de espécimes obtidos de sítios não estéreis, ou em um único
isolamento de sítio estéril. O diagnóstico correto e rápido dessas infecções é muito
importante na decisão de qual estratégia deve ser utilizada no tratamento, que pode
variar de acordo com a espécie (Griffith et al., 2007; Katoch, 2004).
As MNTs mais frequentemente isoladas em pacientes portadores do Vírus da
Imunodeficiência Humana (Human Immunodefficiency Vírus - HIV) pertencem às
espécies Mycobacterium avium e Mycobacterium kansasii (Katoch, 2004). Infecções
mistas com essas duas espécies também têm sido documentadas, especialmente em
pacientes HIV positivos (Massenkeil et al., 1992; Oliveira et al., 2000; Sasaki et al.,
1997).
1.2. O complexo Mycobacterium avium
O complexo M. avium (Mycobacterium avium Complex - MAC) compreende um
grupo de patógenos oportunistas que podem ser isolados de uma ampla variedade de
fontes, incluíndo solo, água e aerossóis. As micobactérias deste complexo são de
crescimento lento e apresentam colônias lisas ou rugosas, não pigmentadas ou com
coloração creme-amarelada. Causam infecções em diferentes hospedeiros, tais como:
pássaros, diversos mamíferos e humanos.
5
Características fenotípicas, testes bioquímicos e, mais recentemente,
características genéticas tem sido usadas para identificar e classificar estas
micobactérias (Turenne et al., 2007). Inicialmente, MAC era constituído de duas
espécies, M. avium e Mycobacterium intracellulare, classificadas sorologicamente em
28 sorovares. Essa classificação é baseada na diferença na composição dos resíduos de
açúcares da superfície dos glicopeptideolipídeos (GPL). Os sorovares 1 a 6, 8 a 11 e 21
foram atribuídos às bactérias da espécie M. avium e os sorovares 7, 12 a 20 e 25, às
bactérias da espécie M. intracellulare. Os sorovares 22 a 28 (exceto o sorovar 25) foram
considerados heterogêneos e não puderam ser atribuídos a nenhuma destas espécies
(Saito et al., 1990). Recentemente, duas novas espécies foram descritas e incluídas no
MAC: Mycobacterium chimaera (Tortoli et al., 2004) e Mycobacterium colombiense
(Murcia et al., 2006).
Em 1990, M. avium foi subdividida em três subespécies: M. avium subsp. avium,
M. avium subsp. paratuberculosis e M. avium subsp. silvaticum (Thorel et al., 1990).
Em 2002, mais uma subespécie de M. avium foi descrita, M. avium subsp. hominissuis,
para distinguir os isolados de humanos e suínos das cepas isoladas de pássaros (Mijs et
al., 2002). M. avium subsp. silvaticum geralmente é isolada de pombos e pingüins e M.
avium subsp. avium é o agente etiológico da tuberculose aviária. M. avium subsp.
paratuberculosis é isolada de animais ruminantes, causa a doença de Johne
(Paratuberculose), uma doença intestinal granulomatosa crônica e também tem sido
associada à doença de Crohn em humanos.
Bactérias pertencentes ao MAC são as MNT mais frequentemente isoladas na
América Latina (Barrera et al., 1985; Barreto & Campos, 2000; Crespo et al., 1999;
Ramos et al., 2000). A maioria das infecções em pacientes HIV positivos é causada por
6
M. avium, especialmente nos países desenvolvidos. Em contraste, M. intracellulare tem
sido descrito mais frequentemente em pacientes HIV negativos. M. avium e M.
intracellulare também causam doenças pulmonares e linfadenite em crianças. Além das
infecções pulmonares, infecções disseminadas por M. avium tem sido frequentemente
relatadas nos pacientes na fase final da aids (Hazra et al., 2000; Inderlied et al., 1993;
Leao et al., 2004).
1.3. Mycobacterium kansasii
M. kansasii é uma micobactéria fotocromogênica de crescimento de lento. A
identificação bioquímica desta espécie é baseada na sua capacidade de produzir
catalase, urease e pirazinamidase, reduzir nitrato e hidrolisar tween 80 (Leao et al.,
2004). Esta micobactéria tem sido isolada de água tratada, ocasionalmente, de fontes de
águas naturais (McSwiggan & Collins, 1974; Steadham, 1980) e, raramente, de solo e
de animais (Alcaide et al., 1997; Falkinham, 2002; Picardeau et al., 1997).
Análises filogenéticas e moleculares têm demonstrado que M. kansasii é uma
espécie heterogênea constituída de cinco subtipos: I, II, III, IV e V. O subtipo I é o mais
frequentemente identificado entre os isolados clínicos (Alcaide et al., 1997; Chimara et
al., 2004; Picardeau et al., 1997).
Depois de MAC, M. kansasii é considerada a segunda MTN mais
frequentemente isolada em várias regiões no mundo (Zhang et al., 2004), inclusive no
Estado de São Paulo, Brasil (Chimara et al., 2004; da Silva Telles et al., 2005). Essa
bactéria causa infecções pulmonares com sintomas parecidos aos da tuberculose e
infecções extrapulmonares, como linfadenites cervicais, dermatites, artrites e
7
osteomielites. Infecções disseminadas têm sido relatadas em pacientes
imunocomprometidos (Griffith et al., 2007; Sherer et al., 1986; Taillard et al., 2003).
1.4. Sequências de inserção
Sequências de inserção (Insertion Sequence - IS) também denominadas
transposons simples, são elementos móveis de DNA capazes de se inserir em diferentes
localizações no genoma. Estes elementos contêm no máximo 2,5 kb e carregam uma a
duas fases abertas de leitura (Open Reading Frame - ORF), que codificam a enzima
transposase, que permite a sua mobilidade. A maioria das ISs descritas apresenta uma
estrutura característica, na qual as suas extremidades possuem sequências terminais
repetidas e invertidas (Inverted Repeats - IR) de 10 a 40 pb, enquanto as extremidades
adjacentes do DNA hospedeiro são constituídas de repetições diretas curtas (Direct
Repeats - DR) (Mahillon & Chandler, 1998).
Os elementos de inserção são classificados em famílias de acordo com a
similaridade nas sequências das transposases e sua organização genética. Isto inclui a
disposição das ORFs, o comprimento e a similaridade das IRs e das DRs (Mahillon &
Chandler, 1998).
Quando a IS é transposta, uma sequência de DNA do hospedeiro é duplicada no
sítio de inserção. A duplicação é revelada pela comparação da sequência do sítio-alvo
antes e depois da ocorrência de uma inserção. A Figura 1 mostra que, no sítio de
inserção, o DNA da IS é flanqueado por sequências idênticas. Porém, no gene original,
o sítio-alvo possui apenas uma destas sequências. A maioria das ISs insere-se em sítios
aleatórios no DNA hospedeiro, mas algumas mostram preferência por determinados
sítios (hotspots).
8
Figura 1: Mecanismo de inserção de IS no genoma do hospedeiro
(http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/Transposons.html)
A transposição desses elementos no genoma pode ocorrer de modo não
replicativo (conservativo) ou replicativo (Figura 2). Na transposição não replicativa, a
sequência de inserção move-se como uma entidade física diretamente de um sítio para
outro, mantendo o número de cópias já existentes, ou seja, ocorre a inserção do
elemento no sítio alvo e a sua perda no sítio doador. No caso da transposição
replicativa, o elemento de inserção é duplicado, sendo que uma cópia permanece no
sítio original, enquanto que a outra cópia, idêntica ao elemento original, é inserida em
um novo sítio, aumentando o número de cópias deste transposon (Lewin, 2000).
9
Figura 2: Transposição conservativa e replicativa de sequência de inserção.
Vários tipos de rearranjos no genoma, como deleções, inversões e fusões de
replicons, são ocasionados por eventos de transposição desses elementos de inserção e
recombinação genética entre eles, como foi mostrado em M. tuberculosis em projetos
anterior realizado no nosso laboratório (Viana-Niero et al., 2004). Além disso, a
transposição desses elementos pode causar a ativação ou inativação da expressão gênica
(Mahillon & Chandler, 1998).
Esses elementos móveis também são capazes de transmitir genes de resistência a
drogas ou genes de virulência quando formam um transposon composto, o qual é
constituído de uma região, contendo um ou mais genes que codificam características
fenotípicas, flanqueada por sequências de inserção. Consequentemente, quando as ISs
flanqueadoras são transpostas, podem promover o deslocamento do segmento de DNA
central para outro sítio (Zaneveld et al., 2008).
Sequências de inserção têm sido usadas em estudos de epidemiologia molecular
de micobactérias. Mais de 37 elementos móveis já foram descritos no gênero
Mycobacterium e muitos destes pertencem a uma das três grandes famílias de
10
sequências de inserção: IS3, IS110 e IS256 (Guilhot et al., 1999). As sequências de
inserção IS900, IS901, IS1245 e a IS1311 têm sido utilizadas como alvos em PCR para
a identificação das espécies do complexo M. avium e também como sondas em
experimentos de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) para
diferenciação de cepas de M. avium (Collins et al., 1997; Green et al., 1989; Guerrero et
al., 1995; Kunze et al., 1991; Oliveira et al., 2003; Panunto et al., 2003; Roiz et al.,
1995).
A IS900 é considerada específica de M. avium subsp. paratuberculosis e tem
sido utilizada como alvo para a detecção molecular desta subespécie de M. avium
(Green et al., 1989). Já a IS901, que apresenta 60% de similaridade com IS900, é um
elemento de inserção frequentemente detectado em isolados de M. avium de pássaros e
acredita-se que esteja envolvida em virulência (Collins et al., 1997; Kunze et al., 1991;
Pavlik et al., 2000). Cepas de M. avium que contém este elemento mostraram-se mais
virulentas em camundongos BALB/c do que as cepas sem IS901 (Kunze et al., 1991).
Além disso, geralmente M. avium isolados de pássaros e animais com lesões
macroscópicas são IS901
+
, enquanto que os isolados de humanos, suínos e de outros
animais sem lesões são IS901
-
(Collins et al., 1997; Pavlik et al., 2000).
A sequência de inserção IS1245, estudada neste trabalho, contém 1.414 pb e
pertence à família IS256 de Staphylococcus aureus sendo considerada específica das
subespécies de M. avium (Guerrero et al., 1995). Vários estudos mostraram que cepas
de M. avium isoladas de humanos e de suínos continham um elevado número de cópias
desta IS, enquanto que cepas obtidas de pássaros apresentavam um padrão de RFLP de
apenas três bandas. Essa variabilidade no número de cópias da IS1245 nos isolados
clínicos de M. avium permitiu que este elemento fosse utilizado em estudos
11
epidemiológicos (Guerrero et al., 1995; Oliveira et al., 2003; Pestel-Caron & Arbeit,
1998; Ritacco et al., 1998; van Soolingen et al., 1998).
IS1311 é outra sequência de inserção usada como sonda para RFLP em estudos
epidemiológicos de M. avium. Esta sequência está presente nas subespécies de M. avium
e ausente em M. intracellulare (Roiz et al., 1995). No entanto, este elemento tem 85%
de homologia com IS1245 e gera hibridação cruzada com a sonda IS1245 convencional
usada em RFLP. Em 2005, Jonhansen et al. mostraram que esta sequência não estava
presente em M. avium subsp. paratuberculosis e que o padrão de RFLP-IS1245 de três
bandas das cepas de pássaros, na realidade, consistia de somente uma cópia da IS1245 e
duas cópias de IS1311 (Johansen et al., 2005).
Além dessas sequências de inserção, MAC contém outras IS, como por exemplo,
IS1110, ISMav1, IS666 e IS1601. Porém, sua distribuição entre as cepas é desconhecida
ou pouco conhecida (Turenne et al., 2007).
Ao contrário de MAC, que contém uma variedade de elementos de inserção,
somente uma sequência de inserção foi descrita em M. kansasii, IS1652. Esta IS, de 947
pb, está presente em dois dos cinco subtipos de M. kansasii de isolados obtidos tanto do
ambiente como de humanos (Picardeau et al., 1997; Yang et al., 1993). Isolados do
subtipo II apresentam um padrão polimórfico com quatro a seis cópias da IS1652 e
isolados do subtipo III têm apenas uma cópia da IS1652. Sabendo que outras espécies
de micobactérias não contêm IS1652, os autores sugeriram que esta sequência de
inserção poderia ser útil para estudos epidemiológicos de M. kansasii (Picardeau et al.,
1997).
12
1.5. Aquisição de DNA por transferência horizontal em bactérias
1.5.1. Transferência horizontal de genes (THG)
A transferência horizontal de genes (THG) é um processo em que um organismo
doador transfere seu material genético para um organismo receptor, que não seja seu
descendente. A THG começou a ser reconhecida como um evento de grande
importância em bactérias desde os anos 50, com a rápida disseminação de genes de
resistência a antibióticos. Além disso, o impacto da THG na evolução de procariotos
tem sido confirmado a partir do sequenciamento completo de vários genomas
bacterianos e das análises filogenéticas desses microrganismos. A maioria desses
estudos sugere que a capacidade das bactérias e das archaeas de se adaptarem a um
novo ambiente resulta mais da aquisição de novos genes por transferência horizontal, do
que da alteração de funções de genes causadas por mutações pontuais (Ochman et al.,
2000).
A aquisição de material genético através de THG é um importante mecanismo
pelo qual microrganismos adquirem novas características fenotípicas. Em bactérias
patogênicas, casos bem conhecidos de transferência incluem a difusão de genes que
codificam resistência a antibióticos e determinantes de virulência (Ochman et al., 2000).
Ilhas de patogenicidade adquiridas horizontalmente têm sido descritas em bactérias
Gram-negativas (Yersinia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Escherichia, Neisseria,
etc.) e Gram-positivas (Staphylococcus, Listeria, Clostridium, etc.). Tipicamente, essas
ilhas contêm um conjunto de genes de virulência que são inseridos dentro ou próximos
a genes de tRNA e são flanqueados por repetições diretas curtas, semelhante ao que
ocorre com a integração de fagos (Gal-Mor & Finlay, 2006; Hacker & Kaper, 2000).
13
THG pode transferir não somente novas sequências, mas também sequências
homólogas de genes já existentes, o que pode levar à substituição de sequências
autóctones por cópias adquiridas, por meio de recombinação homóloga (Krzywinska et
al., 2004; Ochman et al., 2000).
1.5.2. Mecanismos de transferência de DNA
Conjugação, transdução e transformação são formas de transferência horizontal
de DNA que ocorrem naturalmente entre as bactérias (Figura 3).
A transformação foi o primeiro mecanismo de troca genética descrito na
literatura. Este processo foi inicialmente evidenciado por Griffith (Griffith, 1928)
durante um estudo com Streptococcus pneumoniae.
Figura 3: Mecanismos de transferência horizontal de DNA entre células (Zaneveld et al.,
2008).
A transformação é um mecanismo pelo qual a célula receptora capta DNA linear
ou circular livre no ambiente. Porém, geralmente somente fragmentos pequenos de
14
DNA são incorporados (Day, 2004). Este processo é mediado por proteínas codificadas
cromossomicamente e que são encontradas em algumas bactérias naturalmente
transformáveis (células competentes). A competência resulta de alterações na parede
celular, tornando-a permeável a moléculas de DNA. Certas espécies bacterianas, como
Neisseria gonorrhoeae e Haemophilus influenzae, são permanentemente competentes
para captar DNA, enquanto outras, como Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae,
tornam-se competentes somente durante alguns estágios fisiológicos do seu ciclo celular
(Ochman et al., 2000; Zaneveld et al., 2008).
Transdução é um mecanismo de transferência de DNA mediado por vírus
bacterianos que se replicam independentemente, chamados bacteriófagos (ou fagos).
Esse mecanismo foi primeiramente descrito em Salmonella enterica Typhimurium por
Zinder & Lederberg (Zinder & Lederberg, 1952). Para este processo ocorrer é
necessário que a célula doadora e a receptora contenham o mesmo receptor na sua
superfície para ligação do fago. Portanto, a transdução geralmente acontece entre
bactérias proximamente relacionadas e o tamanho do DNA transferido é limitado pelo
tamanho do capsídeo do fago. Mesmo ocorrendo com baixa frequência, bacteriófagos
podem acidentalmente empacotar segmentos de DNA do hospedeiro em seu capsídeo e
injetar este DNA dentro do novo hospedeiro, no qual ele deverá se integrar no
cromossomo celular para poder ser herdado (Ochman et al., 2000; Zaneveld et al.,
2008)
Semelhante à transformação, a transdução não requer que células doadoras e
receptoras estejam em contato. As proteínas codificadas pelos fagos medeiam a entrega
da dupla fita de DNA no citoplasma da receptora e também podem promover a
integração do DNA no cromossomo e proteger as sequências transferidas da degradação
por endonucleases de restrição do hospedeiro.
15
Ao contrário do mecanismo de transformação, a conjugação é geralmente
mediada por plasmídeos. Estes elementos contêm os genes tra necessários para a sua
transferência de uma célula para outra. O mecanismo de conjugação requer contato
físico entre a célula doadora e a receptora, e pode ocorrer entre bactérias próximas ou
distantemente relacionadas ou, ainda, entre bactérias e células eucarióticas (plantas e
leveduras).
O mecanismo de conjugação dos plasmídeos evidenciado em bactérias Gram-
negativas, como E. coli utiliza o sistema de secreção do tipo IV para produzir um pilus
sexual (estrutura que medeia o contato célula-célula). Já as bactérias Gram-positivas
parecem possuir um limitado mecanismo de conjugação, que inclui o sistema de
conjugação dependente de ferormônios de Enterococcus e outros sistemas
independentes de ferormônios, todos envolvendo proteínas aderentes na superfície das
células, que permitem contato direto de umas com as outras. A maior diferença entre o
sistema de conjugação de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas está na formação
do contato direto entre as células (mating-pair), que parece ser mais simplificado nas
bactérias Gram-positivas (Chandler & Dunny, 2004; Sorensen et al., 2005).
A conjugação também pode mediar a transferência de sequências cromossomais
por plasmídeos que se integram no cromossomo e também por transposons
conjugativos, que codificam proteínas requeridas para sua excisão do doador, formação
de um contato direto entre as células e transposição para células receptoras (Ochman et
al., 2000).
1.5.3. THG em micobactérias
A ocorrência de THG em micobactérias tem sido sugerida por alguns autores
devido à identificação de genes (Gamieldien et al., 2002; Kinsella et al., 2003; Le
16
Dantec et al., 2001; Poelarends et al., 2000) e elementos genéticos móveis, como
plasmídeos, tranposons e sequências de inserção (Le Dantec et al., 2001; Mariani et al.,
1993; Martin et al., 1990; Picardeau & Vincent, 1997; Stinear et al., 2005; Yip et al.,
2007) presentes tanto em micobactérias como em outros microrganismos. A maioria
desses estudos se baseia em evidência circunstancial envolvendo similaridade de
sequências encontradas em espécies bacterianas distantemente relacionadas, ou ainda
eucariotos.
Outros estudos também relatam a importância da THG na evolução das
micobactérias, principalmente os membros do complexo M. tuberculosis (Becq et al.,
2007; Gutierrez et al., 2005; Kinsella et al., 2003; Rosas-Magallanes et al., 2006;
Stinear et al., 2008).
Alguns estudos experimentais já demonstraram THG por conjugação e por
transformação em micobactérias, porém estes eventos foram induzidos artificialmente
no laboratório. Gormley e Davies comprovaram a transferência conjugativa de um
plasmídeo mobilizável de E. coli para Mycobacterium smegmatis (Gormley & Davies,
1991).
Um mecanismo particular de transferência do DNA cromossomal, distinto
daquele observado em cepas Hfr (high frequency recombination) em E. coli e não
mediado por plasmídeos, foi descrito em M. smegmatis. Nesse caso, o cromossomo da
cepa doadora de M. smegmatis contém múltiplas regiões de iniciadores que atuam na
transferência de regiões cromossômicas ou plasmidiais e, como resultado, múltiplos
segmentos de DNA podem ser herdados (Parsons et al., 1998; Wang et al., 2003; Wang
et al., 2005).
Bhatt et al. mostraram em experimentos in vitro utilizando M. smegmatis, a
transformação espontânea de um plasmídeo híbrido composto do plasmídeo conjugativo
17
SCP2* de Streptomyces coelicolor e do plasmídeo pAL5000 de Mycobacterium
fortuitum. Esta transferência foi sensível a DNAse I e envolveu a liberação do DNA de
Streptomyces. Além disso, foi visto que M. smegmatis foi capaz de captar o plasmídeo
híbrido livre da célula hospedeira por transformação tanto na sua forma molecular CCC
como na sua forma linear (Bhatt et al., 2002). Além destes mecanismos de transferência
evidenciados em M. smegmatis, a competência natural para transformação por DNA
cromossomal foi reportada em M. avium (Tsukamura et al., 1960).
Um extenso mosaicismo de genes, combinando genes bacterianos e virais, tem
sido identificado nos micobacteriófagos. A homologia de genes descritos em
micobacteriófagos com genes do cromossomo de micobactérias indica que a
transferência horizontal por transdução pode ocorrer entre micobactérias. Mais de 250
micobacteriófagos foram descritos em micobactérias e, aproximadamente, 30 foram
sequenciados (Hatfull et al., 2008; Pedulla et al., 2003; Ripoll et al., 2009). Alguns
foram usados para desenvolver sistemas de transferência de genes em micobactérias
(Bardarov et al., 1997).
Mycobacterium ulcerans proporcionou a primeira evidência direta da
importância da THG na evolução da patogênese micobacteriana. M. ulcerans é um
patógeno humano que causa a doença de Buruli, caracterizada por ulcerações crônicas
na pele e extensa necrose subcutânea. A análise comparativa dos genomas de M.
ulcerans e Mycobacterium marinum mostrou que estas espécies são filogeneticamente
relacionadas (M. ulcerans apresenta > 97% de identidade nucleotídica com M.
marinum) e que M. ulcerans divergiu de um progenitor comum de M. marinum pela
aquisição do plasmídeo de virulência pMUM001, que codifica a toxina micolactona,
causadora da doença de Buruli. M. marinum não possui este plasmídeo e não produz a
18
toxina micolactona, mas causa doença em peixes e sapos e, ocasionalmente, uma
infecção cutânea limitada em humanos (Stinear et al., 2000).
Em 2004, Krzywinska et al. sugeriram a ocorrência de THG e de recombinação
homóloga em cepas de M. avium. A análise genômica comparativa do cluster GPL
(genes gtfB e rtfA-mtfC, que codificam elementos da biossíntese do
glicopeptideolipideo) em diferentes cepas de M. avium mostrou que a sequência da cepa
2145 era um mosaico das respectivas sequências de duas outras cepas de M. avium, 724
e 104 (Krzywinska et al., 2004).
1.6. Plasmídeos
Plasmídeos são moléculas de DNA extracromossomal de replicação autônoma,
encontrados em uma grande variedade de bactérias. No entanto, ao contrário do
cromossomo, os plasmídeos não são essenciais para a sobrevivência do hospedeiro.
Podem conter genes que codificam características especiais, como resistência a
antimicrobianos, capacidade de fixação de nitrogênio, utilização de fontes não usuais de
carbono, síntese de bacteriocinas e de fatores de virulência, tais como fímbrias e
toxinas, que permitem a seu hospedeiro sobreviver em ambientes adversos ou competir
com outros microrganismos, ocupando o mesmo nicho ecológico.
Esses elementos extracromossomais podem ser classificados de acordo com o
seu número de cópias (como plasmídeos de baixo ou de alto número cópias), seu
tamanho, estrutura do DNA (circular ou linear) e grupo de incompatibilidade (Inc).
Plasmídeos com o mesmo mecanismo de replicação (mesmo grupo Inc) não convivem
na mesma célula.
19
Normalmente, os plasmídeos são estáveis nas células hospedeiras, mas podem
ser perdidos (curados). Os mecanismos que estão relacionados com a sua manutenção
geralmente são codificados nos grandes plasmídeos conjugativos e incluem genes de
proteínas envolvidas na morte pós - segregação das células livres de plasmídeo - sistema
toxina antitoxina (psk), partição estável desses elementos dentro das células filhas (par)
e sistema de resolução de multímeros (mrs). Mecanismos similares também estão
presentes em cromossomos bacterianos, assegurando que cada célula filha tenha uma
cópia do genoma durante a divisão celular (Sorensen et al., 2005).
A maioria dos plasmídeos descritos em bactérias são moléculas circulares,
entretanto plasmídeos lineares têm sido descritos em um amplo espectro de gêneros
bacterianos como Streptomyces, Agrobacterium, Borrelia, Nocardia, Rhodococcus e
Mycobacterium. Dois tipos de plasmídeos lineares têm sido caracterizados em
procariotos: um contendo a presença de alças hairpin em cada extremidade, como os
descritos em Borrelia spp. (Barbour & Garon, 1987) e outro, que possui proteínas
covalentemente ligadas em cada extremidade 5’, como ocorre em Streptomyces
(Hinnebusch & Tilly, 1993; Picardeau & Vincent, 1998; Sakaguchi, 1990).
A caracterização desses elementos como lineares ou circulares pode ser
evidenciada a partir de três condições: a mobilidade dessas moléculas quando
submetidas a eletroforese de campo pulsado, a digestão com exonucleases e
relaxamento com topoisomerase. Moléculas circulares são resistentes a ação de
exonucleases, sensíveis à ação de topoisomerase e sua mobilidade eletroforética varia de
acordo com a alternância dos campos elétricos, enquanto que as moléculas lineares são
digeridas com exonucleases, resistentes à ação de topoisomerase e sua migração
eletroforética não é alterada quando são submetidas a diferentes tempos de alternância
20
dos campos elétricos (Beverley, 1988; Konig et al., 2004; Overhage et al., 2005;
Picardeau & Vincent, 1997).
1.7. Plasmídeos em micobactérias
Em 1979, Crawford e Bates demonstraram pela primeira vez a presença de
plasmídeos em cepas de M. avium (Crawford & Bates, 1979). Plasmídeos circulares
(variando de 13 a 174 kb) foram subsequentemente descritos em M. avium e M.
intracellulare (Crawford et al., 1981b; Crawford & Bates, 1986; Franzblau et al., 1986;
Jensen et al., 1989; Masaki et al., 1989), Mycobacterium scrofulaceum (Meissner &
Falkinham, 1984), M. ulcerans (Stinear et al., 2004), M. marinum (Stinear et al., 2008) e
em espécies de crescimento rápido como Mycobacterium fortuitum (Hull et al., 1984;
Labidi et al., 1984; Wallace et al., 1985; Yew et al., 1993), Mycobacterium peregrinum
(Labidi et al., 1984), Mycobacterium abscessus (Ripoll et al., 2009) e Mycobacterium
chelonae (Labidi et al., 1984; Wallace et al., 1985; Zhibang et al., 2002). Plasmídeos
lineares (variando de 20
a 320 kb) foram detectados em Mycobacterium xenopi,
Mycobacterium branderi e Mycobacterium celatum (Picardeau & Vincent, 1997) e
também em M. avium (Picardeau & Vincent, 1998). No entanto, somente alguns desses
plasmídeos foram caracterizados e têm sua sequência de DNA disponível (Tabela 2).
21
Tabela 2: Plasmídeos de micobactérias sequenciados.
Plasmídeo
Tamanho
(Kb)
Estrutura Espécie
Número
de acesso
Referência
pAL5000 4,8 Circular M. fortuitum
NC001381
(Rauzier et al., 1988)
pVT2 12,9 Circular M. avium NC005016 (Kirby et al., 2002)
pCLP 23 Linear M. celatum NC004963 (Le Dantec et al., 2001)
pMUM001 174 Circular M. ulcerans NC005916 (Stinear et al., 2005)
pMM23 23 Circular
M. abscessus
M. marinum
NC010604
(Ripoll et al., 2009;
Stinear et al., 2008)
pMFLV01 321 Linear Mycobacterium gilvum NC00939 -
pMFLV02 25,3 Circular M. gilvum NC009340 -
pMFLV03 16,3 Circular M gilvum NC009341 -
pMKMS01 302 Circular Mycobacterium sp. KMS CP000519 -
pMKMS02 216 Circular Mycobacterium sp. KMS CP000520 -
Plasmid1 215 Linear Mycobacterium sp. MCS NC008146 -
- não foram encontradas publicações sobre esses plasmídeos
A região de replicação dos plasmídeos circulares de M. avium, M. fortuitum, M.
scrofulaceum e M. ulcerans e do plasmídeo linear de M. celatum já foram utilizadas
para a construção de vetores capazes de se replicar em diferentes espécies de
micobactéria e na construção de vetores shuttle E. coli-micobactéria (Bachrach et al.,
2000; Beggs et al., 1995; Gavigan et al., 1997; Kirby et al., 2002; Picardeau et al.,
2000; Qin et al., 1994; Ranes et al., 1990; Stinear et al., 2005). Entretanto, alguns
desses vetores não conseguem se replicar em M. smegmatis mc
2
155, hospedeiro
comumente utilizado para clonagem e estudos de genética micobacteriana (Beggs et al.,
1995; Qin et al., 1994; Stinear et al., 2005).
Pouco se conhece sobre a função desses plasmídeos, os genes que albergam ou
seu papel na virulência de micobactérias. A dificuldade de curar plasmídeos, ou seja,
fazer com que a célula hospedeira os perca, bem como a falta de marcadores seletivos,
têm dificultado sua análise. Propriedades fenotípicas já foram atribuídas a plasmídeos
descritos em M. scrofulaceum, M. avium, M. abscessus, M. marinum e M. ulcerans,
22
como por exemplo: a resistência a mercúrio (Meissner & Falkinham, 1984; Ripoll et al.,
2009; Stinear et al., 2008) e a cobre (Erardi et al., 1987), modificação do sistema de
restrição (Crawford et al., 1981a) e síntese de enzimas metabólicas, como catalase
(Pethel & Falkinham, 1989), e a toxina lipídica micolactona (Stinear et al., 2004).
1.8. Antecedentes deste projeto
No projeto de mestrado de Rosângela Siqueira de Oliveira, realizado no
Laboratório de Micobactérias do Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia da UNIFESP, foram estudados 25 isolados de MAC obtidos de amostras
clínicas (Oliveira, 2001). Uma dessas amostras, o isolado IAL-81590, era um cultivo
misto de M. avium e M. kansasii. Estas espécies foram identificadas por métodos
fenotípicos no Instituto Adolfo Lutz de São Paulo (IAL-SP) e pelo método molecular
PRA-hsp65 na UNIFESP. Estudando colônias isoladas deste cultivo foi possível
observar que a cepa de M. kansasii possuía a sequência de inserção IS1245. Uma vez
que IS1245 é considerada especifica de M. avium, estes resultados sugeriram que essa
sequência de inserção fora transferida da cepa de M. avium para a de M. kansasii.
Colônias de M. kansasii isoladas de outros cinco cultivos mistos de M. avium/M.
kansasii (cedidos pelo IAL-SP) também foram analisadas quanto à presença da IS1245,
porém em nenhum destes novos isolados foi evidenciada a presença desta sequência de
inserção em M. kansasii.
2. OBJETIVOS
24
2.1. Objetivo geral
Estudar o mecanismo de transferência da sequência de inserção IS1245 de
M. avium para M. kansasii.
2.2. Objetivos especificos
- Confirmar a presença da IS1245 em M. kansasii.
- Identificar e caracterizar o possível elemento extracromossômico responsável
pela transferência desta sequência de inserção.
- Comprovar in vitro o mecanismo de transferência da IS1245 entre essas duas
espécies.
- Verificar se outras cepas de M. kansasii são capazes de adquirir a IS1245 pelo
mesmo mecanismo de transferência.
- Analisar a estabilidade desta sequência de inserção em M. kansasii.
3. MATERIAL E MÉTODOS
26
3.1. Cepas bacterianas estudadas
As cepas de M. avium e M. kansasii foram isoladas de um cultivo misto oriundo
de medula óssea de um paciente HIV positivo (isolado IAL-81590), obtido no IAL-SP.
Este cultivo recebeu o número 88 na coleção do Laboratório de Micobactérias da
UNIFESP e esta denominação será usada neste estudo. Outros dois isolados clínicos de
M. kansasii também fizeram parte deste estudo, o isolado 413 e o isolado 6805,
gentilmente cedidos por Erica Chimara (IAL-SP) e por Karla Valéria Batista Lima
(Instituto Evandro Chagas-IEC), respectivamente. Cepas de E. coli portando plasmídeos
foram usadas para cálculo de tamanho plasmidial em experimentos de PFGE (Tabela 3).
Tabela 3: Dados das cepas com plasmídeos utilizadas.
Cepa Plasmídeos Tamanho (kb)
Marca de
resistência
Referência
E. coli 39 R861
NTP168, Sa,
X e RA1-1
6,9; 35,8; 63; 147
------- *NCTC
E. coli JM101 pUS933 11,9 Kanamicina
(Dellagostin et al., 1995)
E. coli DH5α pBR322 4,4 Ampicilina (Bolivar et al., 1977)
*NCTC: National Collection of Type Cultures, PHLS Central Public Health Laboratory, Londres, UK.
3.2. Cultivo e manutenção das bactérias
M. kansasii e M. avium foram cultivadas em meio líquido Middlebrook 7H9
(Difco) suplementado com ADC (catalase, dextrose e albumina) (7H9-ADC) e em
placas de meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado com OADC (catalase,
dextrose, albumina e ácido oléico) (7H10-OADC). Micobactérias foram cultivadas a
37ºC e foram mantidas em estoque, congeladas a -70°C em meio 7H9-ADC/glicerol
15% e em miçangas.
27
As cepas de E. coli foram cultivadas em meio líquido Luria Bertani - LB
(triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%) e em placas de LB Agar (triptona
1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, agar 1,5%). Quando necessário, foi adicionado
antibiótico apropriado.
3.3. Isolamento de colônias de M. avium e M. kansasii
O cultivo misto M. avium-M. kansasii (cultivo 88) foi semeado por esgotamento,
em meio sólido, para obtenção de colônias isoladas. Colônias de M. kansasii
(fotocromógenas) foram distinguidas de colônias de M. avium (acromógenas) por
exposição da placa de cultivo à luz, após crescimento das colônias isoladas. Deste
modo, foram selecionadas quatro colônias de M. avium (88.1 a 88.4) e onze colônias de
M. kansasii (88.5 a 88.15) para este estudo.
3.4. Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada como descrito por van Soolingen et al. (van
Soolingen et al., 1998). Bactérias recuperadas diretamente do cultivo em meio sólido,
com auxílio de uma alça bacteriológica de 10 µL, foram suspensas em 400 µL de TE 1X
(Tris-HCl 10 pH 8, EDTA 1 mM pH 8,0) e inativadas a 80°C durante 20 min. As
células foram lisadas com 50 µL de lisozima (10 mg/mL) durante 18 h a 37°C. Após
lise, adicionou-se, então, 75 µL de uma solução de SDS (dodecil sulfato de
sódio)/Proteinase K (70 µL de SDS 10% e 5 µL de proteinase K 10 mg/mL), e a mistura
foi incubada a 65°C por 10 min. Em seguida, adicionou-se 100 µL de NaCl 5 M e 100
µL de solução CTAB/NaCl, (brometo de N-cetyl-N,N,N,-trimetil amônio 0,1 M, NaCl
28
1,7 M). Essa mistura foi incubada a 65°C por 10 min. Após a incubação, o DNA foi
extraído com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e precipitado por 18 h com
isopropanol a –20°C. Após lavagem do DNA com 1 mL de etanol 70%, o precipitado
foi ressuspendido em 25 µL de TE/RNAse 0,4 mg/mL. Todos os DNAs extraídos por
essa técnica foram quantificados no espectrofotômetro GeneQuant (Pharmacia Biotech)
e analisados em gel de agarose 0,8% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo.
3.5. Identificação das colônias de M. avium e M. kansasii pelo método
molecular PRA-ITS
A região ITS (região espaçadora entre os genes de DNA ribossomal 16S e 23S)
foi amplificada com os oligonucleotídeos Sp1 (5` ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC) e
Sp2 (5` GATGCTCGCAACCACTATCCA) (Roth et al., 2000) em reações contendo
0,4 mM de cada oligonucleotídeo, 1,5 mM de MgCl
2
, 200 µM de dNTPs e 0,5 U de Taq
DNA polimerase em tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM. A reação foi
submetida à desnaturação por 5 min a 94ºC, e a 45 ciclos de amplificação (1 min a
94ºC, 1 min a 60ºC, 1 min a 72ºC), seguido de 10 min de extensão a 72ºC, em
termociclador Perkin Elmer (Applied Biosystems). O produto amplificado foi digerido
com a enzima de restrição Hae III (Invitrogen) e aplicado em gel de agarose Seakem LE
4% em TBE 0,5X (TBE 5X = trizma base 445 mM, ácido bórico 445 mM, EDTA 10
mM pH 8,2). Na primeira e na última canaleta foi aplicado o padrão molecular de 50 pb
(50 bp DNA Ladder - Invitrogen). Após eletroforese, o gel foi corado com brometo de
etídeo (0,5 µg/mL) e em seguida, o DNA foi visualizado em transiluminador com luz
ultravioleta e fotografado. Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando-se o
29
programa BioNumerics v. 5.1 (Applied-Maths, Sint-Marten Laten, Bélgica), e
comparados àqueles publicados por Roth et al. (Roth et al., 2000).
3.6. Detecção de IS1245 e IS1311 por Polymerase Chain Reaction (PCR)
Os oligonucleotídeos utilizados para amplificar as sequências de inserção
IS1245 e IS1311 estão descritos na Tabela 4. As regiões amplificadas por estes
oligonucleotídeos estão ilustradas nas Figuras 4 (para IS1245) e 5 (para IS1311). As
reações de PCR foram preparadas exatamente como descritos no item 3.5. A reação
com P1/P2 foi submetida à desnaturação por 5 min a 94ºC, 30 ciclos de amplificação (1
min a 94ºC, 1 min a 65ºC, 1 min a 72ºC) e extensão final a 72ºC por 7 min.
IR1 IR1
IR2 IR2P1-P2
IS1245
1414 bp
Figura 4: Sequência de inserção IS1245. Região da IS1245 amplificada pelos
oligonucleotídeos P1/P2 (retângulo azul).
A reação de PCR utilizada para amplificar IS1311 com os oligonucleotídeos
P37/P38 foi submetida à desnaturação por 5 min a 94ºC, 30 ciclos de amplificação (30 s
a 94ºC, 30 s a 56ºC, 30 s a 72ºC) e extensão final a 72ºC por 7 min.
IR IR
P37-P38
IS1311
1317 bp
Figura 5: Sequência de inserção IS1311. Região da IS1311 amplificada pelos
oligonucleotídeos P37/P38 (retângulo roxo).
30
Os fragmentos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
1,5% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo (Sigma) em tampão TBE 0,5X. Após a
eletroforese, os amplicons foram visualizados em transiluminador com luz ultravioleta e
fotografados.
Tabela 4: Oligonucleotídeos utilizados para PCR-IS1245 e PCR-IS1311.
Produto de
amplificação
Oligonucleotídeo (sequência)
Posição na sequência
(número de acesso)
Referência
IS1245
(427 pb)
P1 (GCCGCCGAAACGATCTAC)
P2 (AGGTGGCGTCGAGGAAGAC)
197-623
(GenBank, L33879)
(Guerrero et al.,
1995)
IS1311
(198 pb)
P37 (GCTGGACGCATTACGCAATG)
P38 (CGCAACTCCAAATCGCCAG)
89-286
(GenBank, U16276)
(Johansen et al.,
2005)
3.7. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)-IS1245
A técnica de RFLP-IS1245 foi realizada como descrito por van Soolingen et al.
(van Soolingen et al., 1998). Cinco microgramas de DNA genômico de cada amostra
foram submetidos à digestão com a enzima de restrição Pvu II (Invitrogen). Os
fragmentos digeridos foram separados em gel de agarose a 0,8% contendo 0,5 µg/mL de
brometo de etídeo em tampão TBE 0,5X. Após 24 h de eletroforese, o DNA foi
depurinado, submergindo-se o gel em solução de HCl 0,25 M durante 10 min, e
desnaturado em solução de NaOH 0,4 M durante 20 min (2x), com lavagens com água
destilada entre cada etapa. Em seguida, o DNA foi transferido para uma membrana de
nylon Hybond N
+
(Amersham), a vácuo, usando o aparelho Vacuum Blotter (Bio-Rad).
A sonda utilizada para esta técnica foi obtida por amplificação do fragmento de
427 pb interno à sequência de inserção IS1245, a partir do DNA da cepa de M. avium
ATCC 25291
T
, usando os oligonucleotídeos P1 e P2 (Guerrero et al., 1995) e
purificação com QIAquick PCR Purification kit (Qiagen). A sonda foi marcada com
31
peroxidase de acordo com as recomendações do fabricante do kit empregado (ECL
TM
RPN 3000, Amersham). A membrana foi pré-hibridada a 42°C por 1 h com tampão de
hibridação e hibridada com a sonda marcada, a 42°C, durante 15 h. Em seguida, a
membrana foi lavada duas vezes por 10 min a 55°C em solução SSC 0,5X/SDS 0,4%
(SSC 20X = NaCl 3 M, citrato de sódio 0,3 M pH 7) e duas vezes com SSC 2X por 5
min a temperatura ambiente. A revelação foi feita com os reagentes do kit ECL
TM
RPN
3000 por 1 min. A membrana foi colocada em um cassete de autoradiografia com um
filme Biomax ML (Kodak). Após a exposição de 1 min, o filme foi revelado e o
resultado obtido serviu de base para ajustar o tempo de exposição ideal. As imagens
obtidas foram analisadas utilizando-se o programa BioNumerics v.5.1.
3.8. Pesquisa de plasmídeos por PFGE
A técnica de eletroforese de campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis -
PFGE) foi realizada como descrito por Colemann et al. (Coleman & Spain, 2003) com
algumas modificações. Colônias isoladas foram cultivadas em 40 mL de meio líquido a
37ºC sob agitação até D.O.
650nm
≅ 1,0. As bactérias foram centrifugadas a 10.000 x g
durante 20 min a 4°C e, em seguida, o precipitado bacteriano foi incubado a -70ºC por 1
h. Após descongelamento, as bactérias foram ressuspensas em 400 µL de tampão STE
(NaCl 100 mM, Tris 10 mM pH 8,0 e EDTA 50 mM) - Tween 80 0,1%. Esta suspensão
bacteriana foi misturada v/v com agarose low-melt a 1% (Bio-Rad) e distribuída em
moldes apropriados. Os blocos de agarose solidificados foram tratados com solução
STE/lisozima (10 mg/mL) a 37ºC por 18 h. Após a lise bacteriana, os blocos foram
desproteinizados com Sarkosyl (N-sodium lauryl sarcosine) 1%/EDTA 0,5 M/
proteinase K (1 mg/mL) a 55°C por 18 h. Para inativar a proteinase K, os blocos foram
32
incubados com fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) 0,12 mg/mL em TE 1X a 55°C
durante 1 h e, depois, lavados com TE 1X. Os blocos assim preparados foram mantidos
em solução de EDTA 0,5 M a 4°C até o momento do uso.
Os blocos de agarose com DNA foram aplicados em gel de agarose 1% (Pulsed-
Field Certified Agarose - Bio-Rad) em tampão TBE 0,5X e submetidos à eletroforese
em aparelho CHEF-DR III system (Bio-Rad) a 14ºC por 21 h a 6V/cm, com alternância
de campos elétricos de 1,6 a 21,3s. Lambda Ladder PFG Marker (New England
BioLabs) foi usado como padrão de massa molecular.
3.9. Localização da IS1245 por hibridação com sonda radioativa
Após a eletroforese, o DNA contido no gel de PFGE foi depurinado,
desnaturado e transferido para membrana de nylon N
+
como descrito no item 3.7 e a
membrana foi hibridada com a sonda IS1245 radioativa.
3.9.1. Marcação radioativa da sonda
A sonda marcada foi a mesma utilizada para o experimento de RFLP-IS1245
(item 3.7). A sonda IS1245 (100 ng) foi marcada com 50 µCi de [α
32
P] dCTP
(Amersham), com atividade específica de 3.000 Ci/mmol, pelo método de random-
primer extension, utilizando-se o kit Ready-To-Go DNA labelling Beads (-dCTP)
(Amersham), segundo especificações do fabricante. A sonda foi desnaturada por
incubação em água fervente e imediatamente imersa em banho de gelo. A solução foi
transferida para os microtubos contendo a mistura de marcação, e delicadamente
homogeneizada. Em seguida, 5 µL de [α
32
P] dCTP foram adicionados e o tubo foi
incubado a 37°C por 30 min. A purificação dos nucleotídeos marcados não
33
incorporados foi realizada em microcolunas de Sepharose G-50 (Amersham), de acordo
com recomendações do fabricante. A sonda marcada foi mantida a 4°C até o momento
do uso.
3.9.2. Hibridação das membranas com sonda radioativa
As membranas foram pré-hibridadas durante 1 h, a 65ºC, em solução de
hibridação [SSC 5X/SDS 0,1%/Denhardt’s 2X (Denhardt’s 50X = Ficoll 400 1%,
polivinilpirrolidona 1% e BSA 1%), sob agitação lenta. Em seguida, as membranas
foram transferidas para sacos plásticos contendo 15 mL de solução de hibridação
acrescida de 100 µg/mL de DNA desnaturado de esperma de salmão e de,
aproximadamente, 10
5
cpm/mL da sonda radioativa, previamente desnaturada a 100ºC
por 5 min. Os sacos de hibridação foram selados e incubados por 18 h, a 65ºC, sob
agitação lenta. Então, a solução de hibridação foi retirada e as membranas foram
lavadas duas vezes durante 20 min, a 65ºC, sob agitação lenta, em solução SSC
0,1X/SDS 0,1% e mais duas vezes em solução SSC 0,1X/SDS 0,05% por 20 min a
65ºC. Após este período, as membranas foram secas à temperatura ambiente e
autoradiografadas por exposição a filmes de raio X-Omat-R (Kodak), contendo tela
intensificadora por, no mínimo, 24 h, a –70°C. Por fim, o filme foi revelado utilizando-
se um revelador automatizado de filmes raio X (FPM 2100 X-Ray Processor -Fuji), em
câmara escura. O tempo de exposição dos filmes seguintes foi modulado de acordo com
o resultado do primeiro.
34
3.10. Caracterização do elemento de DNA portador de IS1245 em M. avium
3.10.1. Análise da mobilidade de moléculas de DNA circular e linear por
PFGE
Os plasmídeos circulares pBR322, pUS933 e os quatro plasmídeos da cepa 39
R861, foram extraídos a partir de 1 mL de cultivo das suas células hospedeiras crescidas
em meio LB acrescido de antibióticos correspondentes para cada plasmídeo, de acordo
com o protocolo de lise alcalina descrito por Birnboin & Doly (Birnboim & Doly,
1979), modificado por Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989). Os plasmídeos pBR322
e pUS933 foram linearizados e sua migração no gel de PFGE foi comparada com a
migração da sua forma circular. Para isso, pBR322 foi digerido com a enzima de
restrição Eco RI e pUS933 com Hind III. Vinte microlitros de cada plasmídeo, digerido
e não digerido, foram aplicados em gel de agarose 1% (Pulsed-Field Certified Agarose -
Bio-Rad) e submetidos a PFGE a 14ºC por 15 h a 6V/cm, com alternância de campos
elétricos de 5s a 50s ou de 1s a 18s. Lambda Ladder PFG Marker (New England
BioLabs) e 1 kb DNA Ladder (Invitrogen) foram usados como padrões de massa
molecular.
3.10.2. PFGE em condições de corrida distintas
Os blocos de agarose contendo DNA das colônias de M. avium e M. kansasii
isoladas do cultivo 88 foram aplicados em gel de agarose 1% (Pulsed-Field Certified
Agarose - Bio-Rad) em tampão TBE 0,5X e submetidos a três condições de PFGE,
variando somente o intervalo de tempo da alternância dos campos elétricos (1,6s a
21,3s; 1s a 30s; 5s a 50s). A migração do DNA foi comparada à migração do marcador
molecular Lambda Ladder PFG Marker nas diferentes condições de corrida do gel.
35
3.10.3. Efeito do tratamento com exonucleases e com topoisomerase I
Blocos de agarose contendo DNA da cepa M. avium foram submetidos a PFGE
por 21 h. Após a eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídeo (1 µg/mL) e em
seguida, as bandas de ≅ 100 kb visualizadas foram cortadas do gel e submetidas
isoladamente a digestão enzimática com 30U de exonuclease lambda (Biolabs), 30U de
exonuclease III (Biolabs) ou 30U de topoisomersase I (Biolabs), segundo as instruções
do fabricante. Cada reação foi incubada a 37°C por 3 h e depois inibida com EDTA
0,05 M a 4°C por 15 minutos. Após esta etapa, os blocos de agarose contendo o
plasmídeo não submetido à ação de enzimas e os plasmídeo digeridos foram aplicados
em gel de agarose 1% (Pulsed-Field Certified Agarose - Bio-Rad) e submetidos a PFGE
conforme o item 3.8. Após a eletroforese, o gel foi corado com solução de brometo de
etídeo (1 µg/mL) e a banda de 100 kb foi analisada para observar a presença ou não de
digestão.
3.10.4. Efeito do tratamento com proteinase K
Durante a preparação das amostras de M. avium para PFGE, os blocos de
agarose foram tratados ou não com proteinase K. Ambos os blocos foram submetidos à
PFGE por 21 h. De acordo com a migração das moléculas de DNA no gel de agarose é
possível identificar se uma molécula linear possui proteínas nas suas extremidades.
Também, com esses blocos de DNA, o PFGE foi realizado na presença de SDS 0,2% no
gel de agarose 1% e no tampão de corrida TBE 0,5X.
36
3.11 Testes de transferência horizontal do elemento IS1245 por conjugação
3.11.1. Amostras selecionadas para os testes de conjugação
Para todos os testes de conjugação, a colônia 88.3 de M. avium foi utilizada
como doadora do elemento extracromossomal. Como receptoras foram utilizadas três
cepas de M. kansasii: a colônia 88.6 (isolada do cultivo 88), a cepa 6805 e a cepa 413. A
ausência da IS1245 nestas cepas foi confirmada por PCR-IS1245 e por RFLP-IS1245.
3.11.2. Teste de conjugação em meio líquido sob agitação
Colônias isoladas tanto da cepa doadora (M. avium) e da cepa receptora (M.
kansasii) foram cultivadas em meio líquido a 37ºC sob agitação até atingirem DO
600nm
≅
0,6 a 0,8. Um volume de 1 mL da doadora foi misturado a 100 µL da receptora. Essa
mistura foi adicionada em 9 mL de meio líquido fresco e incubada sob agitação (150
rpm) a 37ºC até D.O.
600nm
≅ 0,6 a 0,8. Em seguida, 1 mL desse cultivo misto foi
repicado na proporção de 1:10 em meio 7H9-ADC e incubado nas mesmas condições
até atingir a D.O.
600nm
≅ 0,6 a 0,8. Deste mesmo modo, foram realizados oito repiques
sequenciais. Diluições seriadas (1:100) do último subcultivo foram semeadas em meio
de cultura sólido e incubadas a 37ºC até o aparecimento de colônias isoladas.
3.11.3. Teste de conjugação em meio líquido sem agitação
Colônias isoladas da doadora como da receptora foram cultivadas
separadamente em meio 7H9-ADC e incubadas a 37ºC sob agitação até D.O.
600nm
≅ 1,2.
Alíquotas de 500 µL de cada cultivo foram centrifugadas por 1 min em microcentrífuga
e o sedimento foi ressuspendido em 500 µL de meio de cultura líquido fresco. Após
homogeneização, as alíquotas da cepa receptora e da cepa doadora foram misturadas. As
37
misturas de conjugação foram incubadas por diferentes tempos (durante quatro ou dez
dias) e em diferentes temperaturas (30ºC ou 37ºC). Após o período de incubação, 10 µl
de cada suspensão bacteriana foram diluídos seriadamente (1:100). Em seguida, estas
diluições foram semeadas em meio de cultura sólido e incubadas a 37ºC até o
aparecimento de colônias isoladas.
3.11.4. Teste de conjugação em meio sólido
Cultivos da amostra doadora e receptora foram preparados como descrito no
item 3.11.3. Em seguida, essas bactérias foram misturadas e filtradas em membranas
estéreis com poros de 0,45 µm (Millipore). Essas membranas foram colocadas sobre
placas de 7H10-OADC e incubadas por diferentes tempos (durante quatro ou dez dias) e
em diferentes temperaturas (30ºC ou 37ºC). Após o período de incubação, as
membranas de cada experimento foram transferidas para uma placa de Petri estéril e as
bactérias foram lavadas com 1 mL de meio líquido. Diluições seriadas (1:100) foram
preparadas a partir dessa suspensão micobacteriana e, em seguida, as diluições foram
semeadas em meio de cultura sólido e incubadas a 37ºC até o aparecimento de colônias
isoladas.
3.11.5. Seleção de colônias transconjugantes de M. kansasii
Como M. kansasii é uma bactéria fotocromógena que produz pigmentação
amarela quando incubada na presença de luz, essas colônias puderam ser distinguidas
das colônias não pigmentadas de M. avium nas placas de cultura. Assim, colônias
isoladas de M. kansasii obtidas das placas de 7H10-OADC semeadas com as misturas
de conjugação foram analisadas em relação à presença de IS1245 por PCR (técnica
descrita no item 3.6). As colônias de M. kansasii que apresentaram resultado positivo de
38
amplificação do fragmento de IS1245 foram selecionadas e analisadas por RFLP-
IS1245 e PFGE (técnicas descritas no item 3.7 e 3.8) seguido de hibridação com a sonda
IS1245-P
32
(técnica descrita no item 3.9), para comprovar a transferência da IS1245.
3.12. Tipificação das colônias de M. avium e M. kansasii por PFGE
Foi utilizado o mesmo protocolo descrito no item 3.9. Porém, para tipificação
molecular, os blocos de agarose de DNA foram digeridos com 10U de Dra I (Promega)
a 37ºC durante 18 h. Para parar a reação, os blocos foram lavados em EDTA 0,05 M
durante 15 min, e em seguida, aplicados em gel de agarose 1% (Pulsed-Field Certified
Agarose - Bio-Rad) em tampão TBE 0,5X e submetidos à eletroforese conforme já
descrito (item 3.9).
3.13. Teste de estabilidade da sequência de inserção IS1245 em M. kansasii
após cultivos in vitro
As colônias de M. kansasii 88.11 e 88.12 foram cultivadas em 10 mL de meio
líquido, sob agitação, a 37ºC, até atingirem D.O.
600nm
≅ 0,6 a 0,8. Em seguida, 1 mL de
cada cultivo foi diluído 1:10 em meio líquido e este cultivo foi incubado sob as mesmas
condições. Deste mesmo modo, foram realizados 10 subcultivos. Uma alíquota de 10
µL retirado do décimo repique foi diluída seriadamente em 7H9-ADC e as diluições
foram plaqueadas em meio sólido para obter colônias isoladas. Dez colônias aleatórias
de cada amostra foram analisadas por RFLP-IS1245 (técnica descrita no item 3.7).
4. RESULTADOS
40
4.1. Identificação das colônias isoladas do cultivo 88
Para este estudo foram selecionadas 15 colônias isoladas do cultivo 88 (88.1 a
88.15). Quatro eram colônias não pigmentadas, identificadas fenotipicamente como M.
avium e 11 eram pigmentadas (amarelas), identificadas presuntivamente como M.
kansasii. Todas as colônias isoladas foram identificadas pelo método molecular PRA-
ITS e analisadas por PCR-IS1245.
O perfil de restrição obtido por PRA-ITS com DNA das colônias não
pigmentadas mostrou três fragmentos (92 pb, 85 pb e 42 pb) após digestão do amplicon
com a enzima Hae III, enquanto que com DNA das colônias pigmentadas não houve
restrição com esta enzima (Figura 6). Estes resultados confirmaram a identificação das
colônias não pigmentadas como M. avium e das colônias pigmentadas como M. kansasii
(Roth et al., 2000).
Figura 6: Identificação das quinze colônias isoladas do cultivo misto de M. avium/M. kansasii
(cultivo 88). PRA-ITS (digestão com a enzima de restrição Hae III). 88.1 a 88.4 - M.
avium, 88.5 a 88.15 - M. kansasii.
35
50
70
100
140
200
300
400
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
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.
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.
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.
.
.
.
.
.
.
.
.
88.15
88.14
88.13
88.12
88.11
88.10
88.9
88.8
88.7
88.6
88.5
88.4
88.3
88.2
88.1
pb
35
50
70
100
140
200
300
400
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
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.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
88.15
88.14
88.13
88.12
88.11
88.10
88.9
88.8
88.7
88.6
88.5
88.4
88.3
88.2
88.1
pb
41
4.2. Confirmação da presença da IS1245 em M. kansasii por PCR
O resultado da PCR-IS1245 com DNA das quinze colônias isoladas, usando os
oligonucleotídos P1/P2 corroboraram os dados descritos nos antecedentes deste projeto.
As colônias de M. avium e oito das 11 colônias de M. kansasii geraram amplicons de
427 pb com os primers derivados da IS1245 (Figura 7 e Tabela 5).
Figura 7: PCR-IS1245 das quinze colônias isoladas do cultivo misto de M. avium/M. kansasii
(cultivo 88). 88.1 a 88.4 - M. avium, 88.5 a 88.15 - M. kansasii, – controle negativo da
PCR, + controle positivo da PCR, seta - amplicon de 427 pb.
A realização de PCR-IS1311 com o DNA extraído das colônias de M. avium e
das colônias de M. kansasii teve como objetivo excluir a presença da IS1311 nestas
colônias. Somente as colônias de M. avium geraram amplicons de 198 pb
correspondentes à sequência de inserção IS1311 (Figura 8 e Tabela 5).
42
Figura 8: PCR-IS1311 das quinze colônias isoladas do cultivo misto de M. avium/M. kansasii
(cultivo 88). 88.1 a 88.4 - M. avium, 88.5 a 88.15 - M. kansasii, – controle negativo da
PCR, + controle positivo da PCR, seta - amplicon de 198 pb.
A Tabela 5 representa o resumo dos resultados obtidos com cada colônia.
Tabela 5: Resultados de PRA-ITS, PCR-IS1245 e PCR-IS1311 obtidos com DNA das colônias
de M. avium e M. kansasii isoladas do cultivo 88.
Colônias isoladas do cultivo 88 PRA-ITS PCR-IS1245 PCR-IS1311
88.1 M. avium + +
88.2 M. avium + +
88.3 M. avium + +
88.4 M. avium + +
88.5 M. kansasii - -
88.6 M. kansasii - -
88.7 M. kansasii - -
88.8 M. kansasii + -
88.9 M. kansasii + -
88.10 M. kansasii + -
88.11 M. kansasii + -
88.12 M. kansasii + -
88.13 M. kansasii + -
88.14 M. kansasii + -
88.15 M. kansasii + -
43
Neste estudo, as colônias de M. kansasii que geraram amplicons por PCR-
IS1245 foram denominadas M. kansasii IS1245 +, e as que não geraram amplicons, M.
kansasii IS1245 –.
4.3. Confirmação da presença da IS1245 em M. kansasii por RFLP
Além da detecção da IS1245 por PCR, outra técnica molecular, RFLP-
IS1245, foi realizada para verificar a presença desta sequência de inserção em M.
kansasii. A figura 9 mostra os resultados obtidos com as quinze colônias isoladas do
cultivo 88. As colônias de M. avium apresentaram um perfil de múltiplas bandas de
hibridação com a sonda derivada da IS1245, enquanto que para as colônias M. kansasii
IS1245 + foi obtido o perfil de uma banda de hibridação de ≅ 4750 pb. Além disso, foi
detectada uma segunda banda de hibridação com a sonda IS1245 em duas das oito
colônias (colônia 88.11 e colônia 88.14) de M. kansasii IS1245 +. Os resultados de
RFLP-IS1245 estão de acordo com os dados obtidos por PCR, confirmando a presença
da IS1245 nas colônias de M. kansasii IS1245 + e a sua ausência nas colônias de M.
kansasii IS1245 – (88.5 a 88.7), nas quais nenhuma banda de hibridação foi visualizada.
44
Figura 9: RFLP-IS1245 das colônias isoladas do cultivo misto de M. avium/M. kansasii
(cultivo 88). 88.1 a 88.4 - M. avium, 88.5 a 88.15 - M. kansasii, A: autorradiografia,
B: bandas de hibridação específicas obtidas com a sonda derivada da IS1245.
4.4. Pesquisa de plasmídeos
Para verificar se as colônias de M. avium e M. kansasii isoladas do cultivo
misto continham banda de DNA em comum foi realizada eletroforese de campo pulsado
com o DNA dessas colônias, não submetido à digestão com endonucleases. Após
eletroforese e coloração com brometo de etídeo foi possível a identificação de uma
banda de DNA, migrando na altura da banda de, aproximadamente, 100 kb do marcador
linear usado (concatâmeros de lambda), em todas as colônias de M. avium e também nas
colônias de M. kansasii IS1245 +, mas não nas colônias de M. kansasii IS1245 - (Figura
10.A). A presença desta banda de DNA somente nas colônias de M. avium e M. kansasii
45
portadora da IS1245 sugeriu seu possível envolvimento com a presença da IS1245 nas
colônias de M. kansasii.
4.4.1. Detecção da IS1245 na banda de DNA identificada em M. avium e M.
kansasii IS1245 +
Para confirmar que a banda de DNA de ≅ 100 kb detectada por PFGE, tinha
relação com a presença da IS1245 nas colônias de M. kansasii, tornou-se necessário
demonstrar a presença desta IS na banda de 100 kb, tanto em M. avium como em M.
kansasii. Neste sentido, blocos de agarose contendo DNA extraído das 15 colônias de
M. avium e de M. kansasii foram submetidos a PFGE e o DNA foi transferido para uma
membrana de nylon e hibridado com a sonda IS1245 marcada radioativamente. A
sobreposição das imagens de autorradiografia e de PFGE revelou que a banda de DNA
visualizada no gel de PFGE, migrando na altura da banda de ≅ 100 kb, hibridou com a
sonda IS1245-P
32
(Figura 10.B), confirmando que a sequência de inserção está presente
nesta banda de DNA. Com este resultado foi levantanda a hipótese de que a banda de
DNA de 100 kb portadora de IS1245, presente em M. avium, foi transferida para
colônias de M. kansasii em um evento de transferência genética horizontal.
Uma segunda banda de hibridação com a sonda IS1245-P
32
, menor do que a
banda de ≅ 100 kb, foi observada em duas das colônias de M. kansasii IS1245 +
(colônia 88.14 e colônia 88.15), porém este elemento não foi visualizado nos géis de
PFGE após coloração com brometo de etídeo. Este experimento foi repetido e o
resultado obtido foi reproduzido. Nenhuma hibridação foi observada com o DNA das
colônias de M. kansasii IS1245 - (Figura 10.B).
46
Figura 10: Identificação de uma banda de DNA de ≅ 100 kb nas colônias de M. avium e de M.
kansasii IS1245 +. A: PFGE, B: detecção da IS1245 por hibridização com sonda
IS1245 marcada com P
32
. Ctl (controle +) - sonda IS1245 (427 pb); 88.1 a 88.4 - M.
avium; 88.5 a 88.7 - M. kansasii IS1245 - ; 88.8 a 88.15 - M. kansasii IS1245 +;
seta fechada - banda de DNA de ≅ 100 kb; setas abertas - bandas de hibridação com
a sonda IS1245.
47
4.4.2. Caracterização da banda de DNA de 100 kb portadora de IS1245
Os experimentos a seguir tiveram o objetivo de verificar se a banda de
DNA de 100 kb IS1245 +, denominada de MA100, era linear ou circular.
4.4.2.1. Comparação da migração de moléculas de DNA linear e circular
por PFGE.
Dois experimentos de PFGE em diferentes condições de corrida, variando
somente os intervalos de tempo de alternância dos pulsos de campo elétrico, foram
realizados com plasmídeos circulares e linearizados com a finalidade de saber como
essas moléculas se comportam no gel quando submetidas a diferentes condições de
PFGE. Como podemos visualizar na Figura 11, a migração relativa das moléculas
lineares por PFGE não variou quando o gel foi submetido a diferentes intervalos de
tempo de alternância de campo elétrico, enquanto que a migração das moléculas
circulares foi distinta, quando comparada à migração dos marcadores moleculares
lineares. Esta diferença de migração não se deveu à massa molecular da molécula de
DNA, uma vez que moléculas de mesma massa em diferentes formas migraram
diferentemente nos dois géis (ver na Figura 11, plasmídeos pBR322 e pUS933).
Portanto, observando-se a diferença na migração do DNA em experimentos de PFGE
realizados em diferentes condições de corrida é possível verificar se uma molécula de
DNA é linear ou circular.
48
Figura 11: Padrão de migração das moléculas de DNA lineares e circulares por PFGE.
Plasmídeos circulares e linearizados submetidos a PFGE em diferentes intervalos de
tempo de alternância dos pulsos de campo elétrico (1-18s e 5-50s).
A banda MA100 detectada nas amostras de M. avium e M. kansasii foi
submetida a três condições de PFGE, variando o intervalo de tempo de alternância dos
pulsos de campo elétrico. As imagens da Figura 12 mostram que não houve alteração
significativa na migração desta banda em comparação com a migração do marcador
molecular linear nas três condições de corrida avaliadas, sugerindo que MA100
corresponde a uma molécula de DNA é linear.
49
Figura 12: Comparação da migração da banda MA100 submetida a PFGE em diferentes
intervalos de tempo de alternância dos pulsos de campo elétrico. A: 5s - 50s; B: 1s -
30s e C: 1,6s - 21,3s. 1 - M. avium, 2 - M. kansasii IS1245 +, λ - MW concatâmeros
de lambda, seta - banda MA100.
4.4.2.2. Efeito do tratamento com exonucleases e topoisomerase I
Para caracterizar a banda MA100 portadora da IS1245, este elemento também
foi analisado por PFGE após digestão com exonucleases e com topoisomerase I. A
Figura 13.A mostra que esta banda foi resistente ao tratamento com exonuclease λ
(enzima que degrada as extremidades 5' livres), e foi totalmente degradada após
tratamento com exonuclease III (enzima que degrada as extremidades 3' livres). E
também, como pode ser observada na Figura 13.B, esta banda não sofreu alteração na
sua migração eletroforética quando tratada com a enzima topoisomerase I (enzima que
relaxa o DNA
ds
circular). A partir destes resultados, concluiu-se que a banda MA100 é
realmente linear e que possui suas extremidades 5’ protegidas da ação da exonucleases
λ, sugerindo ligação covalente com proteínas nestas extremidades.
50
Figura 13: Caracterização da banda de DNA de 100 kb de M. avium (MA100). A: Digestão de
MA100 com exonucleases, B: Digestão de MA100 com topoisomerase I. 1 -
MA100 digerida com exonuclease λ, 2 - MA100 digerida com exonuclease III, 3 -
MA100 sem digestão, 4 - MA100 tratada com topoisomerase I; MW - concatâmeros
de lamba, seta - MA100 de M. avium.
4.4.2.3. Detecção de proteínas ligadas covalentemente à banda MA100
Para investigar a hipótese sugerida de que a banda MA100 contém proteínas
covalentemente ligadas nos seus terminais 5’, proteinase K foi omitida da etapa de lise
das células durante a preparação dos blocos de agarose para PFGE. Como se pode
evidenciar na Figura 14.A, a banda MA100 sem tratamento com proteinase K não
conseguiu migrar no gel de agarose, indicando a presença de proteínas nos seus
terminais 5’. Durante PFGE em condições desnaturantes (SDS 0,2% foi adicionado ao
gel de agarose e ao tampão de corrida), observou-se que a banda MA100 linear não
tratada com proteinase K migrou no gel de agarose do mesmo modo que a banda
MA100 tratada com proteinase K, pois o SDS desnaturou as proteínas dos terminais da
banda MA100 linear, permitindo assim que ela migrasse no gel (Figura 14.B).
51
Estes achados em conjunto corroboram a hipótese de que a banda MA100
constitui um plasmídeo linear. Este plasmídeo foi denominado de pMA100.
Figura 14: Caracterização da banda de DNA MA100 de M. avium. A: PFGE sem digestão
enzimática, B: PFGE sem digestão + SDS 0,2%. λ - MW concatâmeros de lamba; 1
- DNA tratado com proteinase K; 2- DNA não tratado com proteinase K; seta -
banda MA100 de M. avium.
4.5. Testes de conjugação
Os dados obtidos até aqui suportam a hipótese de que a sequência de inserção
IS1245 de M. avium está presente em um plasmídeo linear de 100 kb que foi transferido
para M. kansasii. Os testes de conjugação bacteriana descritos a seguir foram realizados
com o objetivo de determinar se o plasmídeo linear pMA100 presente em M. avium
poderia ser um plasmídeo conjugativo, que teria sido transferido para as colônias de M.
kansasii IS1245 + por meio de um evento de transferência horizontal de DNA mediado
por conjugação.
52
4.5.1. Testes de conjugação de M. avium com M. kansasii (isolados do cultivo
misto 88)
Vários testes de conjugação foram realizados em meio sólido e em meio líquido,
com ou sem agitação, em diferentes tempos e diferentes temperaturas de incubação. A
cepa de M. avium (colônia 88.3 = IS1245 +) contendo o plasmídeo pMA100 foi usada
como possível doadora e a cepa de M. kansasii (colônia 88.6 = IS1245 - e sem
plasmídeo), como receptora. A Tabela 6 resume os resultados de PCR-IS1245 obtidos
nesses experimentos e mostra que, de um total de 685 colônias de M. kansasii
analisadas após os testes de conjugação, foram obtidas cinco colônias que tiveram
resultado positivo na PCR-IS1245.
Tabela 6: Análise por PCR IS1245 das colônias de M. kansasii isoladas após experimentos de
conjugação de M. avium com M. kansasii IS1245 – .
Condições do experimento de
conjugação
Número de colônias
receptoras analisadas
Número de colônias positivas
(portadoras de-IS1245)
Meio sólido -30°C 4 dias
100 0
Meio sólido - 30°C 10 dias
126 1
Meio sólido - 37°C 4 dias
100 0
Meio sólido - 37°C 10 dias
180 3
Meio líquido sem agitação - 30°C 4 dias
50 0
Meio líquido sem agitação - 30°C 10 dias
16 0
Meio líquido sem agitação - 37°C 4 dias
99 0
Meio líquido sem agitação - 37°C 10 dias
04 0
Meio líquido com agitação - 37°C
(8 repiques)
10 1
Total 685 5
53
Para pesquisar se essas cinco colônias de M. kansasii eram transconjugantes,
realizou-se RFLP-IS1245, PFGE sem digestão enzimática e hibridação da membrana
correspondente ao gel de PFGE com a sonda IS1245-P
32
. A análise do RFLP-IS1245
das colônias de M. kansasii IS1245 + obtidas após os testes de conjugação mostrou a
banda de hibridação de 4750 pb, confirmando a presença deste elemento de inserção
nessas colônias (Figura 15.A). Novamente, experimentos de PFGE mostraram a banda
de DNA de 100 kb nestas colônias de M. kansasii IS1245 + (Figura 15.B).
A sobreposição das imagens obtidas do experimento de PFGE e da hibridação
da membrana correspondente ao gel de PFGE com a sonda IS1245-P
32
confirmou esta
hipótese, mostrando que o pMA100 portador da IS1245 de M. avium está presente
nessas colônias de M. kansasii IS1245 + obtidas após os testes de conjugação com M.
avium (Figura 15. B e 15. C). Ou seja, são transconjugantes que adquiriram o plasmídeo
linear pMA100 de M. avium.
Estes dados, aliados aos anteriormente relatados, confirmam que o plasmídeo
linear de 100 kb portador de IS1245, presente em M. avium, se constitui em um
plasmídeo linear conjugativo.
54
Figura 15: Análise das colônias de M. kansasii obtidas após testes de conjugação de
M. avium com M. kansasii IS1245 -. A: RFLP-IS1245, B: PFGE sem digestão
enzimática, C: hibridação da membrana correspondente ao gel de PFGE com a
sonda IS1245-P
32
de dois tranconjugantes de M. kansasii (colônias: 14 e 15) e
de dois não transconjugantes de M. kansasii (colônias: 2 e 3) obtidos após os
testes de conjugação. Seta aberta - fragmento de 4750 pb, seta com bola -
pMA100 e seta fechada - pMA100 após hibridação com sonda IS1245.
4.5.2. Testes de conjugação de M. avium com outras cepas de M. kansasii
Experimentos de conjugação foram também realizados com outras duas cepas de
M. kansasii, IAL 413 e IEC 6805 (ambas IS1245 -). Para isso, realizou-se somente teste
de conjugação em meio sólido a 37°C durante 10 dias e, como pode ser observado na
Tabela 7, entre 75 colônias de cepa IAL 413 analisadas, uma mostrou ser
transconjugante. Ainda, a análise de 150 colônias da cepa IEC 6805, detectou dois
transconjugantes. Estes transconjugantes também foram analisados por RFLP-IS1245
(dados não mostrados), PFGE e por hibridação com a sonda IS1245-P
32
(Figura 16), e
1000
1200
1400
2000
2500
3000
3500
5000
8000
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
pb
A
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
C
B
kb
40
200
250
350
1000
100
150
300
500
600
800
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
1000
1200
1400
2000
2500
3000
3500
5000
8000
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
pb
A
1000
1200
1400
2000
2500
3000
3500
5000
8000
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
pb
A
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
C
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
C
B
kb
40
200
250
350
1000
100
150
300
500
600
800
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
B
kb
40
200
250
350
1000
100
150
300
500
600
800
88.6 colônia 15
88.6 colônia 14
88.6 colônia 3
88.6 colônia 2
55
os resultados obtidos foram idênticos aos resultados obtidos com os transconjugantes
gerados a partir das cepas originais do cultivo misto (Figura 15).
Tabela 7: Análise por PCR IS1245 das colônias de M. kansasii isoladas após testes de
conjugação de M. avium com outras cepas de M. kansasii.
Experimento de conjugação
Número de colônias
receptoras analisadas
Número de colônias positivas
(portadoras de PCR-IS1245)
M. kansasii IAL 413) – 10 dias 75 1
M. kansasii (IEC 6805) – 10 dias 150 2
56
Figura 16: Análise dos transconjugantes de M. kansasii isolados após testes de conjugação de
M. avium com outras cepas de M. kansasii IS1245 -. A: PFGE sem digestão
enzimática, B: hibridação da membrana correspondente ao gel de PFGE com a
sonda IS1245-P
32
. Cepa doadora: M. avium 88.3; cepas receptoras: M. kansasii IEC
6805 e IAL 413; transconjugantes de M. kansasii: IAL 413 col 3, IEC 6805 col 8 e
IEC 6805 col 124; não transconjugantes de M. kansasii: IAL 413 col 9 e IEC 6805
col 29; setas - pMA100.
4.6. PFGE após digestão com a enzima de restrição Dra I das cepas
analisadas neste estudo
A tipificação molecular por PFGE após digestão com a enzima de restrição Dra I
do DNA das colônias de M. avium e de M. kansasii originais do cultivo misto 88 e das
outras duas cepas de M. kansasii selecionadas para os testes de conjugação com M.
avium mostrou quatro perfis distintos. O perfil obtido com as cepas de M. kansasii deste
estudo foram distintos entre si e também distintos do perfil da cepa de M. avium (Figura
17). Como se pode observar na Figura 17, diferentes colônias de cada uma das cepas de
M. kansasii apresentaram perfis indistinguíveis, exceto pela presença de uma banda
adicional de aproximadamente 100 kb, presente no perfil de todas as colônias de M.
kansasii transconjugantes e na cepa de M. avium.
Esses resultados confirmam a hipótese anterior, de que esta banda adicional é o
plasmídeo linear conjugativo identificado em M. avium (pMA100) e que foi transferido
de M. avium para as colônias de M. kansasii.
57
Figura 17: PFGE-Dra I das colônias isoladas do cultivo 88 e das outras cepas de M. kansasii
analisadas neste estudo. 88.2 - DNA de M. avium não digerido; 88.3 e 88.4 - DNA
de M. avium digerido com Dra I; 88.5 a 88.7 - DNA de M. kansasii IS1245 -
digerido com Dra I; 88.8 a 88.13 - DNA de M. kansasii IS1245 + digerido com Dra
I. Cepas originais - IAL 413 e IEC 6805; não transconjugantes - IAL 413 col 9 e
IEC 6805 col 29; transconjugantes - IAL 413 col 3, IEC 6805 col 8 e IEC 6805 col
124; seta - pMA100.
58
4.7. Análise da estabilidade da sequência de inserção IS1245 após
subcultivos consecutivos de M. kansasii
As colônias 88.11 e 88.12 (M. kansasii IS1245 +), contendo duas bandas e uma
banda de hibridação com a sonda IS1245, respectivamente, no experimento de RFLP-
IS1245 (Figura 8) foram submetidas a dez repiques consecutivos em meio líquido. Após
o décimo repique, o cultivo foi semeado em meio sólido e 19 colônias aleatórias foram
selecionadas para análise por RFLP-IS1245. As bandas de hibridação com a sonda
IS1245 que foram visualizadas nas colônias 88.11 e 88.12 originais, se mantiveram em
todas as colônias isoladas após a 10
a
passagem. Além disso, em 11 colônias foram
visualizadas bandas de hibridação adicionais (uma a três bandas extras), sugerindo a
ocorrência de transposição replicativa da IS1245 (Figura 18).
1,0
1,2
1,6
1,8
2,0
2,4
2,6
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
6,0
7,0
10,0
15,0
pb x 10
3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Figura 18: RFLP-IS1245 das colônias de M. kansasii 88.11 e 88.12 isoladas após dez cultivos
sequenciais in vitro. 1: colônia 88.11 original; 2-10: colônias isoladas após
subcultivos da colônia 88.11; 11: colônia 88.12 original; 12-21: colônias isoladas
após subcultivos da colônia 88.12. Setas - bandas de hibridação presentes nas
colônias 88.11 e 88.12 originais.
5. DISCUSSÃO
60
A sequência de inserção IS1245 é um elemento móvel altamente prevalente
entre as subespécies de M. avium isoladas de humanos e de animais. Múltiplas cópias
desta sequência de inserção estão geralmente presentes em isolados clínicos de M.
avium, e este elemento de inserção foi inicialmente considerado específico de M. avium.
Devido a esta especificidade, a IS1245 tem sido usada para identificação e diferenciação
de cepas de M. avium (Guerrero et al., 1995; Mijs et al., 2002; Oliveira et al., 2003;
Pestel-Caron & Arbeit, 1998; Ritacco et al., 1998; van Soolingen et al., 1998). Neste
estudo a presença de uma ou mais cópias da IS1245 em algumas colônias de M.
kansasii isoladas de um cultivo misto de M. avium/M. kansasii obtido da medula óssea
de um paciente HIV positivo foi confirmada por PCR-IS1245 e por RFLP-IS1245.
A identificação de M. avium e M. kansasii no cultivo misto havia sido realizada
por método fenotípico-bioquímico no IAL e pelo método molecular PRA-hsp65 na
UNIFESP (Oliveira, 2001). O gene hsp65 (que codifica a proteína de choque térmico de
65 kDa) é um alvo preferencial para identificação das MNT (Chimara et al., 2008;
Telenti et al., 1993). Entretanto, os perfis de PRA-hsp65 das cepas de M. avium [Bst
EII: 235 pb - 210 pb e Hae III: 130 pb e 105 pb] e M. kansasii [Bst EII: 235 pb, 210 pb
e Hae III: 130 pb, 105 pb, 80 pb] do cultivo misto objeto deste estudo foram muito
semelhantes, diferindo apenas pela presença de uma banda de 80 pb no perfil de
restrição com Hae III em M. kansasii. Para assegurar a correta identificação de ambas
espécies nas colônias isoladas, usamos o mesmo método PRA, mas com um alvo
distinto, ITS, que permitiu a diferenciação exata das espécies presentes neste cultivo
misto em todas as etapas deste projeto, como pode ser visto na Figura 6.
Devido à similaridade de 85% nas sequências dos elementos de inserção IS1245
e IS1311, foi necessário excluir que a IS detectada em M. kansasii fosse a IS1311 e não
a IS1245. Neste estudo, a presença da IS1311 nas colônias de M. kansasii foi
61
investigada por PCR-IS1311 usando os oligonucleotideos P37 e P38 descritos por
Johansen et al. (Johansen et al., 2005). O DNA das colônias de M. kansasii não gerou
amplicons com esses oligonucleotideos. Estes dados, aliados aos resultados de PCR-
IS1245 e de RFLP-IS1245, permitiram que afirmássemos que a IS presente nas colônias
de M. kansasii isoladas do cultivo misto é a IS1245. Além disso, a análise de sequências
de amplicons de 427 pb gerados com os oligonucleotideos P1/P2 do DNA das colônias
de M. kansasii IS1245 + mostrou 100% de identidade com a sequência da IS1245
depositada no GeneBank (número de acesso: L33879) (dados não mostrados).
Beggs et al. (Beggs et al., 2000), Mijs et al. (Mijs et al., 2002) e Keller et al.
(Keller et al., 2002) detectaram a presença da IS1245 em cepas de M. intracellulare por
PCR e/ou RFLP. Este elemento de inserção também foi detectado por PCR em outras
espécies não pertencentes ao MAC: M. malmoense, M. scrofulaceum e Mycobacterium
nonchromogenicum, mas a presença desta IS foi confirmada por hibridação e
sequenciamento somente em um dos isolados de M. malmoense (Keller et al., 2002).
Estes achados sugeriram que este elemento de inserção possa estar sendo disperso entre
as micobactérias, possivelmente por transferência horizontal. Porém, nenhum
mecanismo de transferência foi investigado.
Além da IS1245, outras sequências de inserção consideradas espécie-específicas
de micobactérias também foram detectadas em outras espécies, como por exemplo,
IS6110 e IS1110, e os autores sugeriram que estas ISs possivelmente foram adquiridas
por THG.
Coros et al. (Coros et al., 2008) identificaram uma cópia da IS6110, espécie-
específica do complexo M. tuberculosis, no genoma da cepa MKD8 de M. smegmatis.
Porém, este elemento de inserção em M. smegmatis não está completo, faltando uma
repetição invertida. Consequentemente, essa IS6110 não é capaz de se transpor nesse
62
genoma. Além disso, a partir de análises de bioinformática, o mesmo grupo identificou
um elemento semelhante à IS6110 em uma cepa de micobactéria ambiental
(Mycobacterium sp. JLS).
Já o elemento de inserção IS1110, foi inicialmente detectado na cepa de M.
avium LR541 (Hernandez Perez et al., 1994) e depois em isolados de M. avium de
humanos, animais e de ambiente (Hernandez Perez et al., 1996), sugerindo que a IS
seria específica de M. avium. Elementos similares a esta sequência foram
posteriormente descritos em outras espécies de micobactérias (Pagnout et al., 2006).
Um outro ponto avaliado neste estudo foi a estabilidade da IS1245 em M.
kansasii. Experimentos de RFLP-IS1245 realizados após dez cultivos consecutivos in
vitro confirmaram não só a estabilidade, mas também a ocorrência de transposição
replicativa em M. kansasii. Transposição da IS1245 também foi observada nas colônias
de M. avium do cultivo 88. Quatro colônias de M. avium analisadas por RFLP
apresentaram polimorfismos de duas a três bandas de hibridação (ver figura 9). Eventos
recentes de transposição da IS1245 em M. avium já foram observados em estudos
anteriores, em colônias individuais de M. avium isoladas do mesmo paciente ou em
isolados seriados coletados do mesmo paciente em diferentes épocas (Bauer et al.,
1999; Guerrero et al., 1995; Oliveira et al., 2003; Pestel-Caron & Arbeit, 1998). IS1245
é um elemento da classe das transposases DDE, as quais podem ser reguladas em várias
etapas do processo de transposição, por mecanismos intrínsecos ou mediados pelo
hospedeiro (Nagy & Chandler, 2004). O alto nível do polimorfismo da IS1245
encontrado neste estudo pode ser explicado pela inserção desta IS em um sítio
transcripcionalmente ativo, que consequentemente aumentaria a frequência da
transposição. Um evento similar foi demonstrado com IS6110 em Mycobacterium
tuberculosis (Wall et al., 1999).
63
A detecção da IS1245 em M. kansasii sugere que este elemento de inserção foi
adquirido de M. avium por THG. A ausência deste elemento em colônias de M. kansasii
isoladas de outros cinco cultivos mistos de M. avium-M. kansasii, como descrito nos
antecedentes deste estudo, concorda com a hipótese de que este evento de transferência
genética seja resultante de um episódio particular de THG.
Já foram descritos fagos e plasmídeos portadores de sequências de inserção ou
fragmentos de sequências de inserção como veículos de THG (Bruton & Chater, 1987;
Le Dantec et al., 2001; Leskiw et al., 1990; Mahillon & Chandler, 1998; Stinear et al.,
2005). Em micobactérias, o plasmídeo pCLP, detectado em M. celatum, contém
sequências similares às ORFs da resolvase e da transposase de IS1535 de M.
tuberculosis. O plasmídeo pMUM001 de M. ulcerans carrega 26 cópias de ISs ou
sequências semelhantes a ISs, 12 das quais também estão presentes no genoma de M.
ulcerans (4 cópias de IS2404 e 8 cópias de IS2606). As demais 14 sequências são
similares a ISs descritas em outras bactérias, como Streptomyces lividans, Gordonia
westfalica, Xanthomonas campestris, Magnetococcus SP MC-1 e Thermoanaerobacter
tengcongensis (Stinear et al., 2005).
No começo desse estudo, foi considerada a possibilidade de fagos ou plasmídeos
estarem atuando como veículos da THG da IS1245. Inicialmente, testes de indução de
fagos por UV foram realizados com as colônias isoladas de M. avium e de M. kansasii
obtidas do cultivo misto, porém nenhuma placa de lise foi observada (dados não
mostrados). Então, a técnica de PFGE sem digestão com endonuclease foi realizada com
o intuito de pesquisar a presença de plasmídeos nestas colônias isoladas do cultivo 88.
Com esta técnica, foi possível identificar uma banda de DNA de 100 kb, denominada
neste estudo de MA100, nas colônias de M. avium e de M. kansasii IS1245 + e os
64
experimentos de hibridação com a sonda IS1245 confirmaram que esta IS está presente
na banda MA100.
Em duas colônias de M. kansasii do cultivo misto observou-se a presença de
duas bandas adicionais de DNA, menores do que 100 kb, que também hibridavam com
a sonda derivada de IS1245 (ver Figura 10). Devido a este achado, e sabendo que o
mecanismo de transferência de DNA por transformação na natureza geralmente envolve
a transferência de segmentos de DNA de tamanhos variados, não foi possível descartar
totalmente este mecanismo de THG. Mas isso também pode acontecer na conjugação,
quando o plasmídeo conjugativo é quebrado durante a transferência, por dissociação do
mating pair antes da passagem do plasmídeo completo.
A análise em conjunto dos resultados dos testes de mobilidade de MA100 em
géis de PFGE, realizados em diferentes condições de corrida e dos testes com
exonucleases e com topoisomerase I comprovaram que esta banda de DNA MA100 era
um plasmídeo linear (pMA100) e que continha proteínas covalentemente ligada nos seu
terminais 5’.
pMA100 é semelhante a elementos lineares do tipo invertron descritos em
alguns actinomicetos, vírus e bacteriófagos, assim como em células eucarióticas
(Sakaguchi, 1990). Plasmídeos lineares já foram descritos em micobactérias, inclusive
em M. avium (Picardeau & Vincent, 1997; Picardeau & Vincent, 1998). Porém, somente
o plasmídeo pCLP de M. celatum foi caracterizado e sequenciado. Este plasmídeo, de
23 kb, possui proteínas ligadas covalentemente em seus telômeros e sua sequência é
similar à de plasmídeos lineares descritos nos actinomicetos, contendo repetições
terminais invertidas do tipo invertron. Porém, sua origem de replicação, os genes do
operon par, sequência iterons e uma região rica em AT são similares aos de muitos
plasmídeos circulares bacterianos (Picardeau et al., 2000). Regiões similares a
65
sequências do cromossomo de M. tuberculosis também foram evidenciadas neste
plasmídeo, sugerindo a ocorrência de transferência horizontal. Mas, nenhum gene
relacionado aos mecanismos de THG foi descrito em pCLP (Le Dantec et al., 2001).
Plasmídeos lineares conjugativos foram descritos em Streptomyces spp (Chen et al.,
1993; Hinnebusch & Tilly, 1993; Hosted et al., 2004). Devido a essa capacidade
conjugativa, esses elementos podem estar se disseminando entre outros actinomicetos,
incluindo micobactérias e organismos relacionados.
Por outro lado, vários plasmídeos circulares já foram encontrados em isolados
clínicos e ambientais de M avium, M. intracellulare e M. scrofulaceum (Jucker &
Falkinham, 1990), entre eles o plasmídeo pVT2 (12.9 Kb), sugerindo que estes
elementos são conjugativos e estão sendo dispersos nas micobactérias ambientais. A
sequência do pVT2 apresenta homologia com relaxases conjugativas de outros
plasmídeos bacterianos, aumentando ainda mais a possibilidade de transferência
conjugativa nessas bactérias (Kirby et al., 2002). Recentemente, Ripoll et al. também
mostraram que elementos extracromossomais estão sendo dispersos por THG entre
espécies micobacterianas distantemente relacionadas. O sequenciamento do genoma de
M. abscessus revelou que esta cepa contém o plasmídeo circular pMM23 de 23 kb
também evidenciado no genoma de M. marinum (Ripoll et al., 2009).
A identificação do plasmídeo linear pMA100 portando a IS1245 em M. avium
fortaleceu a nossa hipótese de que este elemento estaria envolvido no mecanismo de
transferência horizontal da IS1245 ocorrido entre M. avium e M. kansasii. Os resultados
obtidos neste estudo mostraram claramente que a transferência da sequência de inserção
IS1245 ocorreu por conjugação do plasmídeo linear de M. avium para a cepa de M.
kansasii. Todos os transconjugantes de M. kansasii obtidos adquiriram o elemento
extracromossomal de 100 kb que hibrida com a sonda IS1245. Uma banda DNA sempre
66
do mesmo tamanho era transferida das cepas de M. avium para M. kansasii, o que
reforça a hipótese da conjugação como o mecanismo de THG predominante neste caso.
Embora sem a intenção de comparar métodos, testes de conjugação foram
realizados sobre meio sólido tanto a 37°C como a 30°C e também, em meio líquido,
com e sem agitação, a 37°C. Além de reproduzir in vitro o mecanismo de transferência
da IS1245, foi possível comprovar a ocorrência de conjugação do plasmídeo pMA100
com diferentes protocolos. Nenhum transconjugante foi obtido nos experimentos em
meio sólido realizados com quatro dias, mas nos experimentos em meio sólido com 10
dias foram obtidos transconjugantes tanto após incubação a 30°C como a 37°C. A alta
frequência de transconjugantes obtidos com o experimento realizado em meio líquido
sob agitação (10%) não pode levar à conclusão de que este protocolo de conjugação seja
melhor. Neste protocolo, foram realizados oito repiques e as bactérias estiveram em
contato por um período de aproximadamente três meses, propiciando a proliferação de
alguns transcojugantes, enquanto que os experimentos realizados em meio sólido foram
avaliados após alguns dias de contato entre as cepas. Nenhum transconjugante foi
obtido em meio líquido sem agitação, o que também não pode ser considerado um
resultado absoluto. Como a conjugação requer contato célula-célula, geralmente os
testes de conjugação são mais eficazes quando realizados com as bactérias concentradas
e imobilizadas em superfície sólida, como nas membranas utilizadas nos testes de
conjugação. Porém, plasmídeos que contém pilus sexual longo e flexível são capazes de
serem transferidos quando as células são suspensas em meio líquido (Snyder &
Champness, 1997).
Ainda foi possível evidenciar neste estudo, que o plasmídeo linear conjugativo
de M. avium também foi capaz de ser transferido naturalmente para outras duas cepas de
M. kansasii distintas da cepa do cultivo misto. Experimentos de conjugação de cepa de
67
M. avium portando pMA100 também foram realizados com M. smegmatis mc
2
155
(micobactéria de crescimento rápido) para verificar se este elemento conjugativo
também era capaz de ser transferido para outra espécie, além de M. kansasii. Apesar de
nenhum transconjugante de M. smegmatis ter sido identificado entre as 1200 colônias
isoladas após os testes de conjugação (dados não mostrados), não se pode afirmar
definitivamente que esse plasmídeo não seja capaz de conjugar com M. smegmatis ou
com outras espécies de micobactérias de crescimento lento e de crescimento rápido.
Esses resultados em conjunto também mostraram que o elemento IS1245
presente em M. kansasii foi adquirido horizontalmente da cepa de M. avium em um
evento muito recente no paciente durante a infecção. Isto é reforçado pelo fato de que
ambas as espécies foram isoladas do mesmo paciente e também pela detecção de
colônias de M. kansasii no cultivo misto (88.5, 88.6 e 88.7) sem este elemento de
inserção. A tipificação molecular por PFGE-Dra I confirmou que as 11 colônias de M.
kansasii do cultivo 88, com e sem plasmídeo, são uma mesma cepa. Este dado afastou a
possibilidade de estarmos trabalhando com um contaminante.
A maioria dos trabalhos que abordam a THG em micobactérias, envolvendo
especificamente os genomas do complexo M. tuberculosis, M. avium subsp. avium e M.
avium subsp. paratuberculosis, foram baseados em análises de bioinformática e
mostraram similaridades entre sequências dos genomas de micobactérias e de
proteobactérias, sugerindo que a THG entre estas bactérias ocorreu durante a evolucão
destas espécies (Becq et al., 2007; Kinsella et al., 2003; Marri et al., 2006; Rosas-
Magallanes et al., 2006).
Os resultados obtidos neste estudo são inéditos. Pela primeira vez está sendo
demonstrada experimentalmente a transferência horizontal de genes entre espécies
diferentes de micobactérias. Neste trabalho, foi demonstrado que o elemento de inserção
68
IS1245 foi transferido naturalmente tanto in vitro como in vivo, por conjugação de um
plasmídeo linear identificado em M. avium, para a espécie M. kansasii. Além disso, os
resultados obtidos mostraram que a presença da IS1245 em um plasmídeo conjugativo é
uma das bases moleculares para explicar sua presença em outras espécies.
Entre as possíveis implicações deste trabalho, do ponto de vista clínico fica claro
que o uso da IS1245 para a identificação de M. avium em isolados clínicos deve ser
feito com cautela, de preferência em associação com algum outro alvo genético, para
evitar resultados falso positivos de identificação. Além disso, é importante considerar
que algumas cepas de M. avium não contêm este elemento de inserção (Inagaki et al.,
2009; Oliveira et al., 2003; Ritacco et al., 1998). Como ambas espécies produzem
doenças semelhantes, cujo tratamento envolve drogas distintas, a correta identificação
do agente é imprescindível.
Do ponto de vista de pesquisa básica em micobactérias, o sequenciamento
completo deste plasmídeo linear conjugativo de M. avium poderá gerar informações
importantes a respeito dos genes que estão envolvidos no mecanismo de conjugação
deste elemento. Além disso, tem o potencial de ampliar o entendimento de como essas
bactérias adquirem genes de outras espécies e também, de como esses genes adquiridos
podem influenciar a virulência, evolução ou diversidade genética das micobactérias. A
existência de variantes isogênicas de M. kansasii, portadoras ou não do plasmídeo
pMA100, abre de imediato a possibilidade de avaliar seu envolvimento em virulência
em modelos animais.
Futuramente, ferramentas de biologia molecular poderão ser desenvolvidas a
partir deste plasmídeo linear conjugativo, para estudos genéticos em micobactérias.
Vetores de clonagem e/ou vetores shuttle E. coli-micobactéria poderão ser construídos e
usados para a introdução e expressão de genes em micobactérias. Sistemas de
69
mutagênese por transposons poderão ser desenvolvidos, já que a frequência de
transposição do elemento IS1245 foi alta. Essas ferramentas poderão auxiliar no estudo
dos genes de virulência de M. tuberculosis e/ou em estudos genéticos de micobactérias.
6. CONCLUSÕES
71
A sequência de inserção IS1245, específica de M. avium, foi transferida
naturalmente entre as cepas de M. avium e M. kansasii isoladas do mesmo cultivo misto
pelo mecanismo de conjugação.
Este evento de transferência de DNA foi recente e mediado por um plasmídeo
linear de aproximadamente 100 kb portador da IS1245, identificado na cepa de M.
avium.
A transferência da IS1245 entre as duas espécies por conjugação mediada pelo
plasmídeo identificado foi comprovada in vitro.
Testes de conjugação in vitro de M. avium com outras cepas de M. kansasii
confirmaram que este elemento conjugativo pode ser transferido a outras cepas de M.
kansasii.
A IS1245 se manteve na cepa de M. kansasii e foi evidenciada a ocorrência de
transposição replicativa desta sequência de inserção em M. kansasii.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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