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Comissão Nacional de Energia Nuclear
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR
Programa de Pós-Graduação EM CIÊNCIA e Tecnologia das
Radiações, Minerais e Materiais
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DA
CROTOXINA EM TUMORES MAMÁRIOS E
AVALIAÇÃO DO SEU POTENCIAL
RADIOFARMACÊUTICO
Marina Bicalho Silveira
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para
obtenção do Grau de Mestre em Ciência e Tecnologia das
Radiações, Minerais e Materiais.
2010
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Comissão Nacional de Energia Nuclear
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR
Programa de Pós-Graduação EM CIÊNCIA e Tecnologia das
Radiações, Minerais e Materiais
MARINA BICALHO SILVEIRA
“ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DA
CROTOXINA EM TUMORES MAMÁRIOS E
AVALIAÇÃO DO SEU POTENCIAL
RADIOFARMACÊUTICO”
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das
Radiações, Minerais e Materiais como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre.
Orientadora: Dra. Raquel Gouvêa dos Santos
Belo Horizonte
2010
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iv
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
Defesa e aprovação
Dedicatória iv
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
DEDICO ESTE TRABALHO...
... aos meus pais, José Carlos e Maristela, e à
minha irmã Letícia, por estarem sempre ao
meu lado com muito amor e paciência, e por
serem os maiores incentivadores dos meus
projetos de vida.
Agradecimentos vii
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
AGRADEÇO A/AO (AOS) ...
Deus, por me dar sabedoria para seguir minha caminhada.
Dra. Raquel Gouvêa, pela orientação, ensinamentos, preocupações e pela grande
oportunidade. Obrigada por incentivar minhas idéias, pelos, por insistir com o livro
sobre binding, por cada reunião de sexta a tarde (brincadeira), por me fazer pensar, por
me ligar da Finlândia.
Meu pai, minha mãe e minha irmã, por serem meu alicerce, por estarem presentes
sempre com muita compreensão e amor e por lutarem junto comigo. Graças a vocês eu
pude me tornar Mestre.
Tiago por estar comigo e crescer comigo. Obrigada também por me ouvir, dividir cada
alegria e angústia, por ser um amor e por me dar broncas, e tornar os dias ainda mais
brilhantes.
Toda minha família, pela participação e carinho.
Marcella, pela enorme contribuição relacionada a cada trabalho realizado nestes dois
anos e pela participação que vai além dos trabalhos.
Paulo (Baiano), pelos treinamentos, carinho e amizade. Sem esquecer as longas horas
no Hospital das Clínicas realizando imagens.
Lucilene, pela compania, pela colaboração ao longo de todo o mestrado e ajuda com os
experimentos.
Dr. Carlos Simal e a equipe do hospital Felício Rocho, em especial, meu colega
Raphael Ligório, pela contribuição com a realização das imagens, com as doses de
131
I
e com uma dose de paciência.
Prof. Geovanni e sua aluna Cristina pelo fornecimento das células de Ehrlich.
Dra. Consuelo Fortes Dias pelo fornecimento da Crotoxina, “personagem” principal
desta história.
Márcio Tadeu e Roberto di Lorenzo, pela oportunidade de entrar no CDTN e mudar a
direção do meu caminho a partir de fevereiro de 2007.
Carlos Malamut pelo apoio e pelos direcionamentos, pelas conversas sérias e pelas
descontraídas.
Celeyda, minha professora, colega, chefe e amiga. Obrigada por tudo mesmo.
Thessa pelo suporte no final do mestrado e retorno à UPPR.
Amigos do Laboratório de Radiobiologia, Lú, Fred, Bárbara, Dani, Marcella, Paulo,
Luiza, Lucilene, Fabrício, Pryscila, Thaíssa, Camila, Estefânia, Izabela, Vitor, Nino e
Agradecimentos vii
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
Rodrigo. Obrigada pelos ensinamentos, risadas, conversas, orientações, dicas, músicas;
por dividir equipamentos, bancadas, vidrarias, luvas, pantufas, espaço e... emoções.
Camila, Priscila, Lucília, Tati, Adriana e toda a turma “dos jibóias” incluindo Jiji,
Nelson, Paulinho, Soninha, Ana e todos os outros, pela amizade e por muitas festas!
Fausto Maretti, Paulinho, Rocha, Amaral e Sr. Zé Augusto e toda equipe do reator,
pela partipação em momentos importantes e essenciais para meu trabalho.
Colegas do IPEN e do IEN, por toda contribuição antes, durante e depois do mestrado.
A todos da Faculdade de Farmácia que fizeram parte da minha iniciação científica.
Amigos da Pós-graduação da turma de 2008, por dividirem comigo toda essa
experiência do mestrado.
Priscilla Pujatti, pela ajuda e pelos bons momentos juntas em Tiradentes, e por me
receber com tanto carinho em sua casa.
Samira e Soraya, por serem minhas colegas, companheiras e amigas.
Amigos da UPPR: Juliana, Eduardo, Ferracini, Marco, Sérgio, Zacarias, Leo, Moreira,
Russo, Adilson, Zé Carlos, Wagna e Fatinha.
Amigos do LIG: Perpétua, Fausto, Pablo, Lili, Timóteo, Márcio.
Time feminino de futebol do CDTN pelos bons momentos de comemoração depois
dos jogos. E pelos jogos também.
Tio Tunico, Juninho, Júnia e Alessandra, que sempre me receberam com todo
carinho para o almoço.
Prof. Edgar pelas aulas de espanhol e pela compreensão.
Prof. Téogenes, Maria José, Antero, Max, Estér, pelos relevantes ensinamentos.
Patrícia, Teresinha, Dovenir e Euzébio, pelo apoio técnico.
Toda a equipe da Radioproteção pelas instruções.
Lenira, Virgínia e Nívea, pelo apoio na biblioteca.
Pessoal do transporte, almoxarifado e gráfica, pela prestatividade e serviços.
Roseli, Cerisa, Fulgêncio e ao professor Rubens, pelos relevantes auxílios nas
questões pessoais e acadêmicas.
Minhas amigas Nanda, Tuli, Belinha, Amanda, Roberta e Mari, por sempre serem
minhas amigas.
Minha afilhada Celina, pela diversão durante todo esse tempo.
CDTN e CNEN pelas instalações e apoio financeiro.
Simplesmente, muito obrigada!
Epígrafe
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
“Um dos motivos mais poderosos que conduziram
o homen em direção a arte e a ciência foi
o de escapar do cotidiano”.
Albert Einstein
Resumo
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DA CROTOXINA EM TUMORES
MAMÁRIOS E AVALIAÇÃO DO SEU POTENCIAL RADIOFARMACÊUTICO
Marina Bicalho Silveira
RESUMO
A Crotoxina, o principal componente do veneno de Crotalus durissus terrificus, vem
sendo estudada desde 1938. É um complexo polipeptídico natural com grande potencial
farmacológico especialmente por seu efeito antitumoral, propriedade que tem despertado
o interesse para o diagnóstico e o tratamento do câncer. Entretanto, pouco se sabe sobre
seu mecanismo de ação e os sítios com os quais interage em células tumorais. O câncer
de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais comum entre as
mulheres. Cerca de 30 a 60% dos tumores mamários apresentam expressão aumentada
de receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR), uma proteína transmembrana
que desencadeia a proliferação celular. A partir de dados da literatura mostrando que o
efeito antitumoral da Crotoxina é mais potente em células que superexpressam EGFR,
estabeleceu-se o objetivo deste trabalho: avaliar os efeitos citotóxicos desse polipeptídeo
sobre os tumores de origem mamária MCF-7 (carcinoma humano) e Ehrlich (carcinoma
murino ascítico) e realizar um estudo de interação molecular da Crotoxina com células
de tumor de Ehrlich. Inicialmente, a Crotoxina foi radiomarcada com iodo-125 (
125
I-
Crotoxina) e iodo-131 (
131
I-Crotoxina). Ensaios de saturação e competição foram
realizados para caracterizar a interação da Crotoxina in vitro, enquanto que a interação in
vivo foi avaliada através da biodistribuição e obtenção de imagens em tomografia por
emissão de fóton único (SPECT) do composto radiomarcado em camundongos
portadores de tumor de Ehrlich. Os resultados evidenciaram que o polipeptídeo
apresentou um potente efeito citotóxico sobre as células de tumor de Ehrlich, com valor
de DL
50
in vitro (concentração do composto que produziu 50% de morte celular)
próximo de 1 micromolar, mas não apresentou efeito significativo sobre a linhagem
MCF-7. Alterações morfológicas nas células de tumor de Ehrlich tratadas com Crotoxina
sugerem indução de morte celular programada. A interação da
125
I-Crotoxina com as
células de Ehrlich foi saturável com cerca de 70% de especificidade, com K
d
= 24,98
nmol/L e B
max
= 16570 sítios/célula para sítios de baixa afinidade e com K
d
= 0,06
nmol/L e B
max
=210 sítios/célula para sítios de alta afinidade. O polipeptídeo
radiomarcado apresentou menor especificidade (cerca de 37%) para a linhagem MCF-7.
Resumo
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
O EGF competiu com 20% dos sítios específicos da
125
I-Crotoxina indicando que
Crotoxina e EGF compartilham parcialmente sítios específicos em células de Ehrlich.
Através do estudo de biodistribuição, observou-se que houve captação significativa de
125
I-Crotoxina no tumor (razão tumor/músculo esquelético de 18,55) no período de 3
horas após administração deste composto. As imagens SPECT também evidenciaram
captação diferenciada pelo tumor, mostrando interação in vivo da
131
I-Crotoxina com
células de tumor de Ehrlich. O conjunto dos resultados sugere que Crotoxina apresenta
potente efeito antitumoral sobre células de Ehrlich e que este efeito é devido pelo menos
parcialmente à interação específica com sítios de alta e baixa afinidade. Os sítios de
baixa afinidade se correlacionam com o EGFR e os de alta afinidade ainda necessitam de
mais investigação para melhor caracterização. Estes resultados corroboram o potencial
da Crotoxina como ferramenta para radiodiagnóstico capaz de diferenciar células
tumorais.
Abstract
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
STUDY OF CROTOXIN MECHANISM OF ACTION TO MAMMARY
CARCINOMAS AND EVALUATION OF ITS POTENTIAL AS A
RADIOPHARMACEUTICAL
Marina Bicalho Silveira
ABSTRACT
Crotoxin, the main component of Crotalus durissus terrificus snake venom, has been
studied since 1938. It is a natural polypeptidic complex with pharmacological potential
because of its antitumoral properties wich has attracted great interest for diagnosis and
therapy of oncological deseases. However, Crotoxin mechanism of action and sites of
specific interaction on tumor cells are still misunderstood. Breast cancer is the second
most frequent type in the world and the most common cancer in women. About 30 to
60% of mammary tumors overexpress epidermal growth factor receptor (EGFR), a
transmembrane protein related to cell proliferation. Since literature has reported that
Crotoxin antitumoral effect is more potent on cells with EGFR overexpression the
objectives of this work were to evaluate Crotoxin cytotoxic effects on mammary tumor
cells human breast carcinoma (MCF-7) and Ehrlich tumor cells (murine ascitics
carcinoma), and to investigate the specific molecular interaction of Crotoxin on Ehrlich
tumor cells. Inititally, Crotoxin was radiolabelled with iodine-125 (
125
I-Crotoxin) and
iodine-131 (
131
I-Crotoxin). Saturation and competition assay were carried out to
characterize Crotoxin in vitro interaction; Crotoxin biodistribution studies and single-
photon emission computed tomography (SPECT) of mice bearing Ehrlich tumor have
been evaluated to describe in vivo interaction. Our results showed that Crotoxin
presented cytotoxic effect against Ehrlich with DL
50
in vitro (concentration of compound
which is lethal for 50% of cells) of about one micromolar, but did not present
significative effect against MCF-7. Morphological alterations characteristic of apoptosis
suggests programmed cell death.
125
I-Crotoxin interaction with Ehrlich tumor cells was
saturable with approximately 70% specificity, and presented K
d
=24.98 nmol/L and
B
max
=16,570 sites/cell for low affinity binding sites and K
d
=0.06 nmol/L e B
max
=210
sites/cell high affinity binding sites; moreover, the radiolabeled polypeptide interaction
showed low specificity toward to MCF-7 (37%). EGF reduced 20% of
125
I-Crotoxin
specific binding, so specific binding sites of Crotoxin on Ehrlich tumor cells partially
overlap to EGFR. Crotoxin biodistribution studies showed significant uptake in the
tumor paw (tumor/skeletal muscle ratio= 18.55), three hours after administration.
Abstract
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
SPECT imaging also showed tumor uptake confirming in vivo interaction with Ehrlich
tumor cells. Crotoxin had an antitumoral effect on Ehrlich tumor cells and this action is
due, at least partially, to the specific interaction with low and high affinity binding sites.
Low affinity binding sites correlate EGFR and high affinity binding sites still need
identification. These results confirm Crotoxin as a template for radiopharmaceutical
design for cancer diagnosis and as a tool for cancer studies, increasing its
biotechnological potential.
Lista de Figuras
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação espacial das taxas brutas de incidência de câncer de
mama por 100.000 mulheres estimadas para o ano 2008 no Brasil. ......................... 23
FIGURA 2: Quadro com a classificação clínica do câncer de mama pelo sistema
TNM. ............................................................................................................................... 24
FIGURA 3: Desenho estrutural da mama, com destaque para as células dos ductos
e dos lóbulos, que dão origem a tumores mamários em humanos. ........................... 25
FIGURA 4: Tomografia por emissão de fóton único (SPECT) e tomografia por
emissão de pósitrons (PET).. ......................................................................................... 31
FIGURA 5: Imagem obtida a partir de tomografia por emissão de fóton único
(SPECT) de um paciente com câncer de mama por diferentes ângulos de aquisição..
......................................................................................................................................... 31
FIGURA 6: Imagem obtida através de tomografia por emissão de pósitrons
acoplada a tomografia computadorizada (PET/CT), mostrando a detecção de
tumores mamários conforme indicado. ....................................................................... 32
FIGURA 7: Desenho esquemático da estrutura geral de um radiofármaco. ........... 33
FIGURA 8: Serpente da espécie Crotalus durissus terrificus, cujo veneno apresenta
como principal componete a Crotoxina. ...................................................................... 36
FIGURA 9: Modelagem molecular da Crotoxina, um polipeptídeo de 24 KDa e 122
aminoácidos.. .................................................................................................................. 37
FIGURA 10: Família de receptores tirosina-quinase e seus respectivos ligantes
específicos. ...................................................................................................................... 41
FIGURA 11: (A) Desenho esquemático do receptror de fator de crescimento
epidérmico (EGFR). (B) Modelagem molecular representando o mesmo receptor de
fator de crescimento epidérmico (EGFR) mostrado em (A)...................................... 42
FIGURA 12: Diagrama esquemático da via de sinalização desencadeada a partir da
ativação do receptor de fator do crescimento epidérmico (EGFR). ......................... 43
FIGURA 13: Câmara de Neubauer. ............................................................................ 49
FIGURA 14: Desenho esquemático do MTT sendo reduzido por enzimas
desidrogenases de células metabolicamente viáveis e dando origem ao Formazan. 52
FIGURA 15: Representação esquemática do sistema cromatográfico para
verificação da eficiência da reação de marcação da Crotoxina com
125
I ou
131
I.. .... 54
Lista de Figuras
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
FIGURA 16: Representação esquemática da interação das moléculas de
125
I-
Crotoxina com as células de carcinoma ascítico de Ehrlich. ..................................... 56
FIGURA 17: Tomógrafo do tipo SPECT (tomografia por emissão de um único
fóton).. ............................................................................................................................. 60
FIGURA 18: Fotomicrografias ópticas das células controle (não tratadas) de
carcinoma ascítico de Ehrlich.. ..................................................................................... 63
FIGURA 19: Fotomicrografias ópticas das células de carcinoma ascítico de Ehrlich
após tratamento com Crotoxina. .................................................................................. 63
FIGURA 20: Fotomicrografias ópticas das células controle de MCF-7. .................. 64
FIGURA 21: Fotomicrografias ópticas das células MCF-7 após tratamento com
Crotoxina.. ...................................................................................................................... 64
FIGURA 23: Efeito citotóxico da Crotoxina sobre células MCF-7 após 72hs de
tratamento.. .................................................................................................................... 66
FIGURA 22: Efeito citotóxico da Crotoxina sobre células de carcinoma ascítico de
Ehrlich após 72 hs de tratamento.. ............................................................................... 66
FIGURA 24: Estudo de estabilidade em soro fetal bovino (37 ºC) da
125
I-Crotoxina
após a radiomarcação.. .................................................................................................. 68
FIGURA 25: Especificidade de ligação da
125
I-Crotoxina em cada linhagem de
células tumorais estudada.. ........................................................................................... 69
FIGURA 26: Perfil da ligação da
125
I-Crotoxina pelas células de tumor de Ehrlich..
......................................................................................................................................... 70
FIGURA 27: Propriedade de ligação da
125
I-Crotoxina às células de tumor de
Ehrlich.. .......................................................................................................................... 71
FIGURA 28: Curva de saturação da ligação de
125
I-Crotoxina às células tumorais
de Ehrlich construída a partir da análise de interação com apenas um sítio
específico.. ....................................................................................................................... 72
FIGURA 29: Transformação linear Scatchard dos dados da curva de saturação.. 73
FIGURA 30: Curva de saturação da ligação específica da
125
I-Crotoxina às células
de tumor de Ehrlich construída a partir da análise de interação com dois sítios
específicos. ...................................................................................................................... 74
FIGURA 31: Transformação linear Scatchard dos dados da curva de saturação.. 74
Lista de Figuras
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
FIGURA 32: Curva de competição Crotoxina/
125
I-Crotoxina pelo receptor
específico em células de tumor de Ehrlich considerando interação com apenas um
sítio de ligação. ............................................................................................................... 76
FIGURA 33: Curva de competição Crotoxina/
125
I-Crotoxina pelo receptor
específico em células de tumor de Ehrlich considerando interação com dois sítios de
ligação.. ........................................................................................................................... 77
FIGURA 34: Curva de competição da
125
I-Crotoxina com o fator de crescimento
epidérmico (EGF) em células de tumor de Ehrlich.. .................................................. 78
FIGURA 35: Comparação entre as curvas de competição demonstrando diferenças
no perfil de interação específica da
125
I-Crotoxina com células de tumor de Ehrlich
na presença de competidores.. ...................................................................................... 79
FIGURA 36: Perfil de biodistribuição da
125
I-Crotoxina injetada via endovenosa
para avaliação da interação in vivo do polipeptídeo com células de tumor de
Ehrlich. ........................................................................................................................... 80
FIGURA 37: Perfil de biodistribuição da
125
I-Crotoxina injetada via intratumoral
para avaliação da interação in vivo do polipeptídeo com células de tumor de
Ehrlich. ........................................................................................................................... 81
FIGURA 38: Captação de
125
I-Crotoxina pelo tumor quando na presença ou
ausência de Crotoxina não marcada, ambas administradas via endovenosa em
camundongos com tumor de Ehrlich em tempos diferentes.. .................................... 83
FIGURA 39: Imagem planar de corpo inteiro de camundongos com tumor de
Ehrlich na pata 30 minutos após administração de 7,4 x 10
6
Bq de
131
I-Crotoxina
(A) via endovenosa e de 1,85 x 10
6
Bq de
131
I-Crotoxina (B) via intratumoral. ....... 84
FIGURA 40: Imagem planar de corpo inteiro de camundongos com tumor de
Ehrlich na pata 72 horas administração via (A) endovenosa e (B) intratumoral do
radiotraçador
131
I-Crotoxina. ....................................................................................... 84
FIGURA 41: Imagem SPECT 72 horas após a injeção de do iodo-131 puro (7,4 x
10
6
Bq), admnistrado via endovenosa (A) e via intratumoral (B), como imagem
controle. .......................................................................................................................... 85
FIGURA 42: Modelos de curvas obtidas a partir de um ensaio de saturação.. ..... 105
FIGURA 43: Modelo de curva de competição mostrando o IC
50
, a concentração do
competidor que inibe 50% da interação do ligante. ................................................. 106
Lista de Tabelas
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Classificação histológica para tumores mamários definida pela
Organização Mundial de Saúde (OMS). .................................................................... 26
TABELA 2: Peptídeos de grande interesse no diagnóstico e terapia de tumores,
com seu respectivo receptor, função e célula ou doença alvo. .................................. 35
TABELA 3: Expressão de EGFR em tumores sólidos. ............................................. 44
TABELA 4: Propriedades de ligação de fator de crescimento epidérmico (EGF)
radiomarcado em linhagens de tumores mamários humanos, caraterizando a
expressão do receptor específico, EGFR. ................................................................... 46
TABELA 5: Parâmetros da ligação do EGF ao seu receptor específico (EGFR) em
células de tumor de Ehrlich, de acordo com Elexpuru et al, 2004. .......................... 47
TABELA 6: Principais propriedades dos radionuclídeos utilizados,
125
I e
131
I, e
suas respectivas aplicações. .......................................................................................... 53
TABELA 7: Parâmetros observados após síntese de radiotraçadores a partir da
Crotoxina utilizando-se dois radioisótopos distintos: iodo-125 e iodo-131. ............ 67
TABELA 8: Parâmetros de interação da
125
I-Crotoxina às células de tumor de
Ehrlich. .......................................................................................................................... 75
TABELA 9: Valores do IC
50
calculados para a Crotoxina radiomarcada. ............. 77
TABELA 10: Razão da captação de
125
I-Crotoxina calculada entre o tumor e
diferentes órgãos/tecidos, a partir dos dados de %ID/g em cada tempo avaliado
após a administração endovenosa. .............................................................................. 82
TABELA 11: Comparação entre os parâmetros definidos para os receptores de
EGF e para os receptores específicos de Crotoxina em células de tumor de
Ehrlich.. ......................................................................................................................... 90
Lista de Abreviaturas e Siglas
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC – American Type Cell Collection.
B
max
– número total de sítios de interação determinados em um tecido ou célula.
BSA – albumina de soro bovino.
CDTN – Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear.
CEBIO – Centro de Biotetrismo.
CNEN – Comissão Nacional de Energia Nuclear.
CETEA – Comitê de Ética em Experimentação Animal.
CT – tomografia computadorizada.
DAPI - 4´,6- diamidina- 2´- fenindole dihidroclorido.
DL
50
– dose que provoca a morte de 50% das células.
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s.
DMSO – dimetilsulfóxido.
EGF – fator de crescimento epidérmico (epidermal growth factor).
EGFR – receptor de fator de crescimento epidérmico (epidermal growth factor
receptor).
EPI – equipamento de proteção individual.
18
FDG – (18F) 2-flúor-2-desoxi-D-glicose.
Fiocruz – Fundação Oswaldo Cruz.
FUNED – Fundação Ezequiel Dias.
IC
50
– concentração que provoca 50% do efeito observado.
ID/g – dose injetada do material radioativo por grama de tecido (injected
dose/g).
INCA – Instituto Nacional do Câncer.
K
d
– constante de afinidade.
MCF-7 – células de carcinoma mamário humano.
MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio.
OMS – Organização Mundial de Saúde.
PBS – solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4.
PLA
2
– fosfolipase A
2
.
PET – Tomografia por Emissão de Pósitrons (Positron Emission Tomography).
pH – potencial de hidrogênio.
Lista de Abreviaturas e Siglas
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
rpm – rotações por minuto.
SBCAL – Sociedade Brasileira em Ciência de Animais de Laboratório.
SFB – soro fetal bovino.
SNC – sistema nervoso central.
SPECT – Tomografia por Emissão de Fóton Único (Single Photon Emission
Tomography).
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais.
UICC – União Internacional Contra o Câncer
Sumário
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
16
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 19
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 21
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 21
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 21
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 21
3.1 Câncer de mama ............................................................................................... 22
3.1.1 Definição e estatística ............................................................................... 22
3.1.2 Origem e classificação .............................................................................. 23
3.1.3 Tumor de Ehrlich, um carcinoma murino ascítico ................................... 26
3.2 Diagnóstico e tratamento do câncer de mama .................................................. 27
3.3 Medicina Nuclear ............................................................................................. 29
3.4 Radiofármacos .................................................................................................. 33
3.4.1 Conceito e exemplos ................................................................................. 33
3.4.2 A necessidade da busca de novos compostos para diagnóstico................ 34
3.5 Toxinas animais ................................................................................................ 36
3.5.1 Crotoxina, principal toxina da peçonha da serpente Crotalus durissus
terrificus ................................................................................................................. 36
3.5.2 Propriedades de interação da Crotoxina ................................................... 39
3.6 Receptores celulares como alvos ...................................................................... 40
3.6.1 Expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico - EGFR ........ 42
3.6.2 EGFR em tumores de mamários humanos ............................................... 45
3.6.3 EGFR em células de tumor de Ehrlich ..................................................... 46
3.7 Estudos de interação com receptores – Binding ............................................... 47
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 48
4.1 Crotoxina .......................................................................................................... 48
4.2 Cultivo celular .................................................................................................. 48
4.2.1 Células de tumor de Ehrlich ..................................................................... 49
4.3 Animais ............................................................................................................ 50
4.3.1 Modelo animal tumoral ............................................................................ 50
4.4 Estudo do efeito citotóxico da Crotoxina sobre células tumorais .................... 51
Sumário
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
17
4.5 Reação de marcação da Crotoxina – Síntese de um radiotraçador utilizando
125
I
e
131
I .................................................................................................................. 52
4.6 Estabilidade da molécula de Crotoxina marcada com
125
I em soro fetal bovino
...........................................................................................................................54
4.7 Ensaios in vitro de interação molecular da Crotoxina – Binding ..................... 55
4.7.1 Determinação da ligação específica em células MCF-7 e de tumor de
Ehrlich ...................................................................................................................55
4.7.2 Saturação da ligação ................................................................................. 56
4.7.3 Determinação do IC
50
e avaliação da afinidade de
125
I-Crotoxina ........... 57
4.7.4 Caracterização da interação in vitro e in vivo da Crotoxina com EGFR .. 58
4.8 Estudo do perfil de biodistribuição da
125
I-Crotoxina ...................................... 58
4.9 Imagem SPECT in vivo .................................................................................... 59
4.10 Manipulação de radioisótopos .......................................................................... 61
4.11 Análise estatística ............................................................................................. 61
5 RESULTADOS ..................................................................................................... 62
5.1 Avaliação do efeito antitumoral a partir de análises morfológicas .................. 62
5.2 Avaliação do efeito citotóxico in vitro da Crotoxina sobre células de tumores
mamários .......................................................................................................... 65
5.3 Síntese da Crotoxina radiomarcada .................................................................. 67
5.4 Estudos in vitro de interação molecular da Crotoxina – Binding ..................... 68
5.4.1 Determinação da ligação específica em células MCF-7 e de tumor de
Ehrlich.....................................................................................................................68
5.4.2 Identificação e caracterização da interação da
125
I-Crotoxina com alvos
presentes em células de tumor de Ehrlich .............................................................. 69
5.4.3 Ensaios de competição para caracterização do sítio de ação específico da
Crotoxina e seu provável mecanismo de ação. ....................................................... 77
5.5 Avaliação da interação in vivo da
125
I-Crotoxina com células de tumor de
Ehrlich .............................................................................................................. 79
5.5.1 Biodistribuição da
125
I-Crotoxina – administração via intratumoral e via
endovenosa ............................................................................................................. 79
5.5.2 Biodistribuição após competição in vivo entre a
125
I-Crotoxina e a
Crotoxina não marcada ........................................................................................... 82
5.6 Imagem SPECT in vivo da
131
I-Crotoxina ........................................................ 83
Sumário
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
18
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 86
7 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 93
8 PERSPECTIVAS .................................................................................................. 94
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 95
APÊNDICE A - Princípios dos ensaios de interação Ligante-Receptor –
Binding..........................................................................................................................102
APÊNDICE B - Obtenção de (
18
F) fluoreto com qualidade garantida para
marcação da Crotoxina...........................................................................................107
ANEXO 1 – Resumo - VI Congresso da Sociedade Brasileira de Biociências
Nucleares (2008)...........................................................................................................108
ANEXO 2 – Resumo - VI Congresso da Sociedade Brasileira de Biociências
Nucleares (2008)...........................................................................................................109
ANEXO 3 – Resumo - XVI Congress of the International Society on Toxinology e X
Congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia (2009)......................................110
ANEXO 4 – Certificado de Premiação - Prêmio pela apresentação do trabalho
“Crotoxin as a radiopharmaceutical for breast tumour diagnosis” no XVI Congress
of the International Society on Toxinology e X Congresso da Sociedade Brasileira
de Toxinologia (2009)..................................................................................................111
ANEXO 5 – Trabalho completo - INAC - International Nuclear Atlantic Conference
(2009).............................................................................................................................112
ANEXO 6 – Certificado - Ética em experimentação animal...................................113
Introdução
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
19
1 INTRODUÇÃO
O câncer, uma das maiores causas de mortes no mundo, foi responsável por cerca de 7,6
milhões de óbitos em 2007. Estima-se que em 2050 esse número atingirá 17,5 milhões
de pessoas (American Cancer Society, 2008). Entre os diversos tipos de neoplasias, o
câncer de mama é o segundo mais freqüente no mundo e o mais comum entre as
mulheres. Uma das esperanças na busca por diagnósticos mais precisos e precoces e por
tratamentos efetivos de tumores é o desenvolvimento de novos radiofármacos,
ferramentas aplicadas pela medicina nuclear no diagnóstico e tratamento de diversos
distúrbios fisiológicos ou metabólicos, incluindo o câncer. Embora não sejam técnicas
usuais na detecção de tumores de mama, as tomografias PET (Tomografia por Emissão
de Pósitrons) e SPECT (Tomografia por Emissão de Fóton Único) têm sido muito
apropriadas para determinados pacientes que já realizaram exames convencionais ou no
acompanhamento de terapias de tumores de origem mamária (BOSSCHE & WIELE,
2004; BARTELLA et al, 2007). Técnicas diagnósticas como ressonância magnética e
mamografia, permitem a obtenção de imagens que auxiliam no diagnóstico do câncer;
porém não fornecem informações funcionais como as tomografias PET e SPECT,
apenas morfológicas (OLIVEIRA et al, 2006).
O desenvolvimento de novos radiofármacos é baseado na busca por marcadores
tumorais cada vez mais específicos que permitam visualizar metabolismo alterado ou
receptores superexpressos, exemplos de propriedades comuns entre células tumorais. Há
um grande interesse em receptores com expressão aumentada em células tumorais
humanas e murinas, alvos potenciais para diagnóstico por imagem e terapia de câncer
(OKARVI, 2008). O receptor de fator de crescimento epidérmico EGFR (epidermal
growth factor receptor) quando ativado, desencadeia processos responsáveis pelo
crescimento e progressão de tumores (ROCHA-LIMA et al, 2007). A expressão
aumentada do EGFR em células tumorais de diversos tipos, incluindo aqueles de origem
mamária, o torna objeto de grande interesse neste trabalho como sendo um potencial
alvo de interação específica que pode permitir avanços quanto a diversos radiofármacos
em estudo.
A Crotoxina é um complexo polipeptídico, isolado do veneno da serpente da espécie
Crotalus durissus terrificus que apresenta atividade citotóxica in vitro contra diversas
Introdução
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
20
linhagens tumorais humanas e murinas (RUDD et al, 1994; CURA, 2002; YAN et al,
2006). Embora a Crotoxina já tenha sido patenteada por apresentar efeito citotóxico
(PLATA et al, 1992), seu mecanismo de ação em nível molecular como agente
antineoplásico ainda não está completamente desvendado. É notável que durante anos
de pesquisa a versatilidade farmacológica da Crotoxina a mantenha como potencial
precursor para desenvolvimento de novos radiofármacos para diagnóstico e terapia do
câncer (EYRE, SMITH and METTLIN, 2000).
A busca por novos radiofármacos cada vez mais específicos e eficientes é o maior
desafio dos pesquisadores da área nuclear voltada para a saúde. Este trabalho foi
desenvolvido para tentar elucidar o mecanismo de ação da Crotoxina, um potencial
radiofármaco, além de esclarecer o seu efeito citotóxico sobre tumores de origem
mamária e avaliar sua interação com receptores específicos. A resposta terapêutica
obtida em estudos prévios é um fator estimulante para darmos continuidade na
elucidação das interações em nível molecular, podendo futuramente, manipular a
estrutura química e alterar a especificidade e sensibilidade da Crotoxina.
Objetivos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito antitumoral da Crotoxina sobre linhagens de tumores de origem mamária e
investigar o seu mecanismo de ação antitumoral a partir de ensaios de interação com
receptores específicos em células de Ehrlich, estudando sua relação com o receptor do fator de
crescimento epidérmico.
2.2 Objetivos Específicos
Identificar o efeito antitumoral da Crotoxina sobre as linhagens de MCF-7
(adenocarcinoma mamário humano) e tumor de Ehrlich (carcinoma ascítico murino),
avaliando o poder citotóxico em cada uma.
Avaliar a especificidade da Crotoxina sobre cada uma das duas linhagens tumorais
estudadas.
Sintetizar radiotraçadores a partir da Crotoxina usando
125
I e
131
I.
Realizar o controle de qualidade radioquímico dos produtos radiomarcados.
Identificar a interação específica in vitro da Crotoxina às células de tumor de Ehrlich
através de ensaios de competição.
Averiguar a qualidade da
125
I-Crotoxina como radiotraçador para estudos de
caracterização da própria molécula.
Caracterizar a interação in vitro da
125
I-Crotoxina com células de tumor de Ehrlich
através de ensaios de saturação em condições de equilíbrio.
Avaliar a interação in vivo de
125
I-Crotoxina com tumor de Ehrlich implantado em
camundongos através de estudos de biodistribuição.
Identificar a interação da Crotoxina com o receptor de fator do crescimento
epidérmico.
Avaliar o potencial de
131
I-Crotoxina como ferramenta para detecção de tumor de
Ehrlich através da formação de imagens tomográficas SPECT.
Identificar a interação específica de
131
I-Crotoxina com tumores de Ehrlich através de
estudos de competição in vivo.
Revisão Bibliográfica
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
22
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Câncer de mama
3.1.1 Definição e estatística
O câncer é a designação dada ao conjunto de manifestações patológicas que se caracterizam
pela perda de controle da proliferação celular, ganho de capacidade de invadir tecidos
adjacentes ou de sofrer metástases para tecidos distantes (MONTESANO et al, 2001). É uma
doença que afeta cerca de 1.500.000 pessoas anualmente apenas nos Estados Unidos.
Atualmente, é uma das maiores causas de mortes no mundo, sendo responsável por cerca de
7,6 milhões de óbitos em 2007, com estimativa de 17,5 milhões de óbitos em 2050 (American
Cancer Society, 2008).
No Brasil, dados estatísticos do ano de 2008, previstos também para o ano de 2009, apontam
que ocorreram cerca de 460 mil novos casos de câncer no país. Os tipos mais incidentes, à
exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e de pulmão,
no sexo masculino, e os cânceres de mama e de colo do útero, no sexo feminino,
acompanhando o mesmo perfil de magnitude observada no mundo (INCA, 2007).
O câncer de mama é um tipo de neoplasia maligna que se inicia a partir de tecidos mamários.
Com exceção do câncer de pele, é o tipo mais comum observado entre as mulheres. Apesar do
baixo risco de desenvolver um câncer de mama, os homens também devem ficar atentos a
fatores como histórico familiar, uma vez que a doença acomete ambos os sexos. As taxas de
incidência de câncer de mama e de mortalidade de pacientes acometidos por esse tipo de
neoplasia aumentam com a idade, e isso pode ser comprovado através de dados estatísticos
que mostram que entre os anos 1998 e 2002, 97 % das mortes ocasionadas por esse tipo de
tumor acometeram mulheres com 40 anos ou mais (American Cancer Society, 2008).
Dados do Instituto Nacional de Câncer (INCA) mostram a representação espacial das taxas de
incidência de câncer de mama estimadas para o ano de 2008 em seis regiões do Brasil
(FIG.1).
Revisão Bibliográfica
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
23
A cada ano, cerca de 22% dos novos casos de câncer em mulheres são tumores de origem
mamária. O número de casos novos de câncer de mama esperados para o Brasil em 2010 será
de 49.240, com um risco estimado de 49 casos a cada 100 mil mulheres, estimativa que se
mantém para 2011. Apesar de ser considerado um câncer de relativamente bom prognóstico
quando diagnosticado e tratado oportunamente, as taxas de mortalidade por câncer de mama
continuam elevadas no Brasil. Isso provavelmente se deve ao fato da doença ainda ser
diagnosticada em estágios avançados (INCA, 2009).
FIGURA 1: Representação espacial das taxas brutas de incidência de câncer de mama por
100.000 mulheres estimadas para o ano 2010 no Brasil (Fonte: INCA, 2009).
3.1.2 Origem e classificação
O câncer pode ser classificado de acordo com vários critérios: pela origem da neoplasia
(critério histogenético); pelo comportamento (critério clínico) ou pelo aspecto microscópico
(critério histomorfológico). Quanto à origem, há três formas principais de classificação das
neoplasias: sarcomas, nos quais o tumor originou-se do tecido mesenquimal; carcinomas, que
se originam no tecido epitelial; e neoplasias hematopoéticas e linfóides, como leucemias e
linfomas. E ainda, em relação ao comportamento e evolução clínica, as neoplasias são
divididas em duas grandes categorias: benignas e malignas (FILHO et al, 2000).
Revisão Bibliográfica
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
24
O sistema TNM - Classification of Malignant Tumours (FIG.2) é o mais usado para a
classificação de tumores malignos e a descrição de sua extensão anatômica, desenvolvido e
publicado pela União Internacional contra o Câncer - UICC. A classificação se baseia na
avaliação de três componentes: extensão do tumor primário (T), a ausência ou presença e a
extensão de metástase em linfonodos regionais (N) e a ausência ou presença de metástase à
distância (M). A informação da extensão da doença para cada localização anatômica, a
descrição clínica precisa e a classificação histopatológica (quando possível) das neoplasias
malignas são de extrema relevância no planejamento do tratamento, na indicação do
prognóstico, na avaliação da terapia e na pesquisa contínua sobre o câncer (INCA).
FIGURA 2: Quadro com a classificação clínica do câncer de mama pelo sistema TNM.
Revisão Bibliográfica
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
25
A mama é constituída por pele, músculo, glândulas, ductos, vasos linfáticos, além de tecido
adiposo e conjuntivo. As estruturas de maior interesse na oncologia são as glândulas,
chamadas lóbulos, que realizam a produção de leite, e os ductos, que permitem a passagem do
leite (FIG.3). Os cânceres de mama se iniciam no tecido mamário e são, na maioria das vezes,
tumores epiteliais que se desenvolveram a partir de células que revestem ductos e lóbulos,
devendo, portanto, ser classificados como carcinomas e adenocarcinomas.
FIGURA 3: Desenho estrutural da mama, com destaque para as células dos ductos e dos lóbulos,
que dão origem a tumores mamários em humanos.
Embora o câncer da mama seja considerado uma doença única, na realidade é uma doença
com muitas variações ou tipos histológicos, diferindo na sua história natural, no
comportamento clínico e no prognóstico. Os tumores de melhor prognóstico são,
naturalmente, os carcinomas não-invasivos (in situ). Tipos histológicos mistos podem ocorrer
em cerca de 28% dos casos de carcinoma da mama de diferentes origens ou poder invasivo. O
tipo histológico mais comum de câncer de mama é o carcinoma ductal invasivo, com uma
incidência de 80 a 85% ente os casos registrados (ALVARENGA, 1980). A classificação
histológica para tumores mamários definida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) está
representada na TAB.1.
Revisão Bibliográfica
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26
TABELA 1: Classificação histológica para tumores mamários definida pela Organização
Mundial de Saúde (OMS).
Tumores Malignos
Epiteliais (Carcinomas):
Não-invasivos (in situ)
Carcinoma intraductal (Ca ductal in situ)
Carcinoma lobular in situ
Invasivos
Carcinoma ductal invasivo; carcinoma ductal invasivo com componente
intraductal predominante; carcinoma lobular invasivo; carcinoma mucinoso
(colóide); carcinoma medular; carcinoma papilifero; carcinoma tubular;
carcinoma adenocístico; carcinoma secretor (juvenil); carcinoma apócrino;
carcinoma metaplásico (do tipo epidermóide, do tipo de células fusiformes, dos
tipos condróide e ósseo e do tipo misto); outros tipos: carcinoma rico em lipidios,
carcinoma de células pequenas, carcinoma de células em anel de sinete e
carcinoma inflamatório
Carcinoma de Paget do mamilo
Tumores Mistos
Epiteliais e
Mesenquimais
Tumor filóide maligno
Carcinossarcoma
Tumores Malignos
Diversos
Tumores de tecidos moles; sarcoma do estroma e angiossarcoma
Tumores de tecidos hematopoiéticos e linfóides: linfomas malignos e
Iasmocitoma (mieloma)
Tumores cutaneos malignos: carcinoma epidermóide, melanoma
maligno etc.
(tumores que não podem ser classificados em qualquer das categorias acima)
Tumores Malignos Não
Classificados
3.1.3 Tumor de Ehrlich, um carcinoma murino ascítico
O tumor de Ehrlich é um tipo de carcinoma murino espontâneo, originalmente mamário,
adaptado para a forma ascítica e cultivado no peritôneo de camundongos através de repique
intraperitoneal em prazos definidos (DAGLI, GUERRA & SALDIVA, 1992). É um tumor
maligno pouco diferenciado e transplantável que surgiu originariamente como um carcinoma
mamário espontâneo em um camundongo. Tumores de Ehrlich crescem tanto na forma sólida
quanto ascítica e podem ser descritos como neoplasia mamária experimentalmente induzida
em animais para estabelecer um modelo de estudo das neoplasias mamárias em humanos
(Biblioteca Virtual em Saúde, 2009).
Revisão Bibliográfica
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
27
Este tipo de carcinoma é primariamente classificado como mamário e, mesmo que seja
indiferenciado, é possível que sofra as influências dos hormônios incriminados na gênese do
câncer de mama, como estrógeno, prolactina, andrógenos e até mesmo dos hormônios
tireoidianos (SILVA et al, 2004). Células de tumor de Ehrlich têm sido utilizadas como
modelo no estudo da ação de componentes físicos, químicos e biológicos sobre o crescimento,
patogênese, cinética, imunologia, bioquímica e terapêutica dos tumores (YONEDA et al,
1999; MADY, 2002; PALERMO-NETO et al, 2003).
Diversas substâncias naturais apresentaram efeito citotóxico sobre a linhagem de tumor de
Ehrlich após ensaios in vitro (AHMED et al, 1988; HAZRA et al, 2002; GUPTA et al, 2004).
Nascimento e colaboradores (2006) comprovaram o efeito antitumoral de uma planta (mastruz
ou Chenopodium ambrosioides L.) sobre células tumorais de Ehrlich.
Como justificativa do uso das células de tumor de Ehrlich neste trabalho e baseando no
trabalho de Silva e colaboradores (2004), pode-se dizer que é válida a utilização dessa
linhagem tumoral como modelo para o estudo do câncer de mama humano. Partindo da
premissa de que se trata de um adenocarcinoma de origem mamária, ainda serão necessários
mais estudos relacionando a ação de hormônios envolvidos na carcinogênese mamária e
comparando os resultados com os do câncer de mama em mulheres, particularmente daqueles
indiferenciados e semelhantes ao tumor de Ehrlich (SILVA et al, 2004).
3.2 Diagnóstico e tratamento do câncer de mama
É estabelecido que quando o câncer é detectado ainda em sua fase localizada (estágios
iniciais), o prognóstico é melhor e o tratamento é mais efetivo. O diagnóstico precoce permite
intervenções locais, detecção de focos potencialmente invasivos, alteração do curso natural da
doença através do bloqueio do crescimento maligno e maior qualidade de vida para o paciente
(EYRE et al, 2000).
No caso do câncer de mama, a prevenção primária ainda não é totalmente possível devido à
variação dos fatores de risco e às características genéticas que estão envolvidas na sua
etiologia. É por isso que se recomenda a realização da mamografia a cada dois anos para
mulheres de 50 a 69 anos e o exame clínico anual das mamas para mulheres de 40 a 49 anos.
Revisão Bibliográfica
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28
Estes ainda são os métodos diagnósticos mais eficazes para detecção precoce de tumores
mamários (INCA, 2009).
Essencialmente, três tipos de investigações podem ser aplicados para se chegar a um
dignóstico após a realização do exame clínico: radiologia, patologia e endoscopia. A
radiologia engloba uso de raios-X, tomografia computadorizada, ressonância magnética,
ultrassom e obtenção de imagens pela medicina nuclear. A imagem molecular gerada por cada
um dessas modalidades carateriza in vivo processos biológicos em nível celular e molecular,
permitindo estudo de diversas doenças. A aplicação dessa técnica para o diagnóstico do
câncer de mama permite aperfeiçoar a detecção e localização de tumores e ainda avaliar a
terapia, auxiliando no combate à doença. Modalidades clínicas de diagnóstico já padronizadas
como a mamografia e a ressonância magnética são extremamente úteis para avaliação da
resposta do paciente ao tratamento. Entretanto, são técnicas que permitem detectar alterações
de forma e tamanho, estágio no qual os tumores já apresentam grandes alterações fisiológicas
e dificultam o tratamento e recuperação do paciente (ROUSSEAU, 2006), e ainda funcionam
como uma forma de diagnóstico não invasivo extremamente precisa (OLIVEIRA et al, 2006).
A mamografia é uma técnica muito sensível usada para diagnóstico de possíveis tumores de
mama em mulheres que apresentam sinais ou sintomas característicos. Na última década tem-
se observado o desenvolvimento e aperfeiçoamento da mamografia digital, tecnologia na qual
o filme usado para gravar e revelar a imagem obtida foi substituído pro um detector digital.
Apesar do elevado custo da nova técnica, foi um avanço que possibilitou a obtenção de
imagens de maior resolução, arquivamento de imagens em sistemas computacionais,
manipulação das imagens para facilitar o diagnóstico e agilidade nos processos (BARTELLA
et al, 2007).
Entre as técnicas avançadas de obtenção de imagens diagnósticas estão aquelas utilizadas pela
medicina nuclear. As duas principais técnicas de imagem molecular baseadas em
radioisótopos são a tomografia por emissão de fóton único (SPECT, single photon emission
tomography) e a tomografia por emissão de pósitrons (PET, positron emission tomography).
Não são ferramentas usuais na detecção de tumores de mama, mas são apropriadas para
determinados pacientes, geralmente após a realização dos exames convencionais.
Uma vez detectado o tumor, é necessário estabelecer uma forma de combatê-lo e melhorar a
qualidade de vida do paciente. Novas modalidades terapêuticas em pacientes com tumor de
Revisão Bibliográfica
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29
mama têm sido investigadas, tais como hipertermia, excisão percutânea, radioterapia
intersticial e crioterapia, mas estas ainda são consideradas experimentais. A cirurgia da mama
está muito bem estabelecida na clínica e é o tratamento mais aplicado a pacientes com
tumores mamários localizados (HALL-CRAGGS & VAIIDYA, 2002). Geralmente, o
processo cirúrgico é combinado com outra técnica de tratamento como radioterapia,
quimioterapia, terapia com hormônios ou com anticorpos monoclonais. Uma cirurgia pode ser
classificada como lumpectomia, quando apenas parte de tecido tumoral é retirado, ou
mastectomia, remoção total da mama; ambas podem inlcuir ou não a retirada dos linfonodos
dependendo do caso (American Cancer Society, 2005-2006).
As falhas observadas em casos de terapia convencional indicam que estudos de investigação
acerca da prevenção e da cura do câncer são cruciais. No caso específico do câncer de mama,
é importante que as mulheres fiquem atentas aos seguintes sinais: nódulos ou espessamento
na mama ou região das axilas; alterações na pele nessas áreas, como manchas vermelhas;
alterações no mamilo; mudanças na forma e tamanho dos seios ou dor e desconfortos não
usuais (Cancer Research UK, 2002). Sintomas e sinais como estes podem ou não estar
relacionados ao câncer de mama e, portanto, a mulher deve procurar um especialista para
avaliação e diagnóstico.
3.3 Medicina Nuclear
A medicina nuclear é uma especialidade médica que utiliza as propriedades nucleares de
compostos radioativos para realização de exames diagnósticos e avaliação das condições
anatômicas e fisiológicas, além de terapia de desordens diversas. O destaque e a importância
dessa modalidade médica são devidos à grande eficiência dos radiofármacos na detecção de
alterações de função ou morfologia de um órgão (GRANIER, 1990).
Após realização de exames físicos e avaliações convencionais, a imagem molecular fornecida
pela medicina nuclear apresenta-se como técnica complementar para confirmar um
diagnóstico, analisar efetivadade de terapias ou ainda, traçar planos de ação como biópsia ou
cirurgia. Em casos de câncer de mama, técnicas de imagem molecular utilizadas pela
medicina nuclear são muito apropriadas para pacientes com peculiaridades como: mama com
tecido muito denso, anormalidades não detectáveis por técnicas como mamografia e
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30
ultrassom, implantantes mamários e suspeita de múltiplos tumores, inclusive no sistema
linfático (BOMBARDIERI et al, 1997).
As duas principais técnicas de imagem molecular, SPECT e PET, possibilitam a monitoração
em função do tempo da concentração do radiotraçador no tecido regional após administração
de molécula marcada com radionuclídeo emissor de fóton ou de pósitron, respectivamente.
Cada tipo de tomografia apresenta um sistema de detecção diferente: as imagens SPECT são
adquiridas pela rotação da câmera ao redor do paciente, enquanto que o tomógrafo PET capta
dois fótons simultâneos resultantes de um evento de aniquilação (FIG.4). Apesar de ambas as
técnicas fornecerem informação funcional, elas apresentam propriedades bem distintas.
Atualmente, as câmeras SPECT e PET encontram-se associadas à tomografia
computadorizada (CT) ou à ressonância magnética, que complementam o diagnóstico com
informações anatômicas (VALLABHAJOSULA, 2007).
A tecnologia SPECT apresenta sensibilidade e resolução menores, quando comparados com
PET; entretanto, a simplicidade relativa e o baixo custo dos radioligantes e dos equipamentos
geradores de imagem tornam a tomografia por emissão de fóton único uma ferramenta de
elevada aplicabilidade clínica na medicina nuclear. Além disso, desenvolvimentos recentes na
área de instrumentação resultaram em aumento significativo da qualidade das imagens
geradas por SPECT (GROCH & ERWIN, 2001).
Baseado em uma tecnologia precisa e sofisticada, o tomógrafo PET possui um conjunto de
detetores que registram a chegada simultânea de pares de fótons em sentidos opostos, após a
interação dos pósitrons emitidos pelo radioligante com elétrons do tecido. São adquiridas
imagens tridimensionais de alta resolução e precisão. Contudo, a complexidade da tecnologia
e a necessidade de um cíclotron local para produzir os radioligantes emissores de pósitron
com tempo de meia-vida físico curto tornam a técnica um recurso dispendioso (JACOBUS et
al, 2002). A tecnologia PET permite vizualizar o tumor após seções de quimioterapia para
avaliação da resposta ao tratamento em um estágio menos evoluído do que a detecção através
de técnicas convencionais.
Revisão Bibliográfica
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31
FIGURA 4: Tomografia por emissão de fóton único (SPECT) e tomografia por emissão de
pósitrons (PET). Técnicas diagnósticas utilizadas pela medicina nuclear. Radioisótopos ou
radiofármacos são administrados para obtenção de imagens moleculares que revelam características
funcionais de desordens metabólicas como, por exemplo, o câncer.
É crescente a aplicação das técnicas SPECT (FIG.5) e PET (FIG.6) na obtenção de imagem
em casos câncer de mama, tanto na área de pesquisa e desenvolvimento, quanto no
diagnóstico precoce e direcionamento para um tratamento efetivo desse tipo de tumor. Além
disso, as tomografias também auxiliam na detecção de metástases na região dos nódulos
linfáticos, estadiamento de metástases distantes e acompanhamento da resposta terapêutica
para casos de tumores primários e metástases (BOSSCHE & WIELE, 2004; MANKOFF,
2005).
FIGURA 5: Imagem obtida a partir de tomografia por emissão de fóton único (SPECT) de um
paciente com câncer de mama por diferentes ângulos de aquisição. Captação de
123
I-iodometil-
N,N-dietiltamoxifeno por tumor primário localizado em paciente com carcinoma mamário (Fonte:
BOSSCHE & WIELE, 2004).
Revisão Bibliográfica
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32
Observa-se um aumento no número de tomografias PET realizadas com a (
18
F) 2-flúor-2-
desoxi-D-glicose (
18
FDG) (FIG.6) para avaliar estadiamento avançado ou recorrente de câncer
de mama e também para monitorar resposta a terapia. O radiofármaco
18
FDG está sendo
usado rotineiramente no acompanhamento de pacientes com câncer de mama (MANKOFF,
2005; BARTELLA et al, 2007).
FIGURA 6: Imagem obtida através de tomografia por emissão de pósitrons acoplada a
tomografia computadorizada (PET/CT), mostrando a detecção de tumores mamários conforme
indicado. Em (A) um corte coronal, em (B) um corte axial da imagem PET, (C) representa um corte
axial de CT e em (D) tem-se a fusão das imagens morfológica e funcional, PET/CT. O radiofármaco
utilizado foi
18
FDG (Fonte: BARTELLA et al, 2007).
Radiofármacos diagnósticos são utilizados para obtenção de imagens SPECT ou PET com o
objetivo de examinar fluxo sanguíneo, metabolismo celular, perfusão cardíaca, entre outros. A
aplicação dessas técnicas altamente modernas e especializadas está intimamente ligada e
totalmente dependente de moléculas associadas a radionuclídeos, os radiofármacos, sejam
eles de uso consagrado pela medicina ou em desenvolvimento científico e tecnológico por
grupos de pesquisa de diversas áreas.
Revisão Bibliográfica
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33
3.4 Radiofármacos
3.4.1 Conceito e exemplos
De acordo com a Consulta Pública nº 94, de 19 de outubro de 2007 da Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), os radiofármacos podem ser definidos como “medicamentos
com finalidade diagnóstica ou terapêutica que, quando prontos para o uso, contêm um ou mais
radionuclídeos”. Os radiofármacos incluem compostos inorgânicos, compostos orgânicos,
peptídeos, proteínas, anticorpos monoclonais e oligonucleotídeos marcados com
radionuclídeos com tempos de meia-vida física que variam de poucos segundos a vários dias
(ANVISA, 2007).
A estrutura geral de um radiofármaco cujo alvo é um receptor específico pode ser
representada conforme esquema da FIG.7. O ligante pode ser um peptídeo, uma proteína, um
hormônio ou uma molécula orgânica específicos para o alvo a ser definido. Caso o
radionuclídeo não se ligue diretamente à molécula de interesse, é necessário utilizar um
ligante intermediário ou linker. Além disso, para aplicação na aquisição de imagens é
desejável que o radiofármaco obtido apresente alta atividade específica (radioatividade por
unidade de massa do fármaco, maior que 1 Ci/mmol), elevada afinidade pelo receptor com
baixa ligação não-específica e características metabólicas e de depuração favoráveis
(BOSSCHE & WIELE, 2004).
FIGURA 7: Desenho esquemático da estrutura geral de um radiofármaco. Sua estrutura e suas
propriedades são essenciais para interação com receptores alvos e formação da imagem molecular. O
radionuclídeo pode estar diretamente ou indiretamente (presença do intermediário ou linker) ligado à
molécula de interesse representada por um peptídeo nesta figura.
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34
Radiofármacos são aplicados para vizualizar ou tratar determinados tipos de câncer,
especialmente quando agem de forma mais significativa e intensa sobre a superfície de células
tumorais com características peculiares, como a presença de receptores com expressão
aumentada. Uma classe de peptídeos muito estudada a ser descrita no item 3.5, é a das toxinas
animais. Polipeptídeos naturais cujo efeito citotóxico favorável contra células tumorais podem
levar ao desenvolvimento de novos radiofármacos, principalmente quando se conhece o
mecanismo de ação molecular. Diversos produtos naturais podem ser acoplados a
radionuclídeos dando origem a radiofármacos ou traçadores radioativos com potencial
aplicação no diagnóstico ou tratamento do câncer (SOROCEANU et al, 1998; SHEN et al,
2005; SOPRANI, 2008). A Crotoxina, principal componente do veneno de Crotalus durissus
terrificus, parece adequada e é promissora para aplicação como radiofármaco.
Radiofármacos aplicados para diagnóstico podem ser classificados como sendo de perfusão
ou específicos. Os radiofármacos de perfusão, por exemplo,
99m
Tc-Sestamibi e
99m
Tc-ECD,
são transportados no sangue e atingem o órgão alvo na proporção do fluxo sanguíneo.
Enquanto que radiofármacos específicos como o
123
I-MIBG (metaiodo-benzilquanidina iodo-
123) são direcionados por moléculas biologicamente ativas, podendo ser anticorpos,
peptídeos, que se ligam a receptores celulares ou são internalizados (OLIVEIRA et al, 2006).
Para detecção do câncer de mama, seja em PET ou SPECT, alguns radiofármacos vêm sendo
estudados e aplicados até o momento.
18
FDG é o principal agente PET usado para detecção de
diversos tipos de tumores, entre eles os de origem mamária, detectados pela captação
diferencial devido ao metabolismo celular aumentado (BARTELLA, et al. 2007; MANKOFF
2005). Os traçadores mais utilizados na obtenção de imagem SPECT de mama são
99m
Tc-
Sestamibi, o primeiro radiofármaco registrado nos Estados Unidos para este propósito, e
99m
Tc-Tetrofosmin. Outros radiofármacos, incluindo
201
Tl-chloride and
99m
Tc-MDP, também
estão sendo aplicados no estudo do câncer de mama (BOMBARDIERI, 1997).
3.4.2 A necessidade da busca de novos compostos para diagnóstico
A detecção precoce do câncer é um passo chave no processo de cura dos pacientes, pois
permite intervenções rápidas que podem bloquear o crescimento maligno, evitar metástases e
a prevenir a morte do paciente (EYRE et al, 2000).
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35
Alguns fatores devem ser levados em consideração quando o assunto é o desenvolvimento de
novos radiofármacos, incluindo: o elemento radioativo, a molécula ou substrato que será
radiomarcado, o método de síntese que será aplicado, entre outros. É necessário observar
parâmetros de qualidade química, radioquímica, radionuclídica e biológica, apresentados pelo
radiofármaco desenvolvido (SAHA, 2003). Nos últimos anos, vários peptídeos vêm sendo
objeto de estudo como potencias radiofármacos, pois apresentam elevada afinidade por
receptores superexpressos em uma grande variedade de linhagens de células tumorais. A
TAB. 2 traz alguns exemplos de peptídeos, com suas respectivas funções e os receptores
alvos. Essas moléculas quando radiomarcadas oferecem a possibilidade de aplicação em
diagnóstico e terapia na medicina nuclear (WEINER & THAKUR, 2005).
TABELA 2: Peptídeos de grande interesse no diagnóstico e terapia de tumores, com seu
respectivo receptor, função e célula ou doença alvo (adaptada de WEINER & THAKUR, 2005).
Peptídeo
Receptor
Função
Alvo
Somatostatina e
análogos
Somatostatina 1–5
Inibe o crescimento e a
liberação de hormônio
Tumores neuroendócrinos, SCLC,
câncer de mama, monócitos e
linfócitos
EGF
EGFR
Promove o crescimento
Câncer de mama
e de colon
Bombesina
GRP
Atividade do SNC e trato
GI
Glioblastomas, SCLC,
próstata, mama, gástrico,
colon e de pâncreas
CCK/gastrina
CCK 1–2
Contração da bexiga e
secreção ácida
SCLC, tumores GI, câncer de
pâncreas e tiróide, adenomas
Peptídeo de
liberação gastrina
GRP
Promove secreção de
gastrina
Glioblastomas, SCLC, câncer
de próstata, mama, gástrico,
colon e pâncreas
α-MSH
Melanocortina 1–5
Regula a pigmentação da
pele
Melanoma
Neurotensina
Neurotensina 1–3
Neuromodulador do trato
GI e atividade cardíaca
Câncer de próstata e
pâncreas
VIP
VIP 1–2
Vasodilador, promoce
crescimento,
immunomodulador
NSCLC, câncer de próstata, mama,
colon, pâncreas,
bexiga e ovário
Análogos RGD
αvβ3 integrina
Molécula de adesão
endotelial
Tumores angiogenéticos
SNC=sistema nervosa central; GI=gastrointestinal, SCLC=câncer de pulmão de pequenas células; NSCLC= câncer de pulmão de não
pequenas células; CCK=colecistoquinina, GRP=peptídeo de liberação gátrica; VIP=peptídeo vasoativo intestinal; RGD=sequência arginina-
glycina-aspartato.
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36
Peptídeos sintéticos pequenos apresentam mais vantagens do que macromoléculas como
proteínas e anticorpos para aplicações em imagem molecular. Eles podem ser facilmente
sintetizados e a sua radiomarcação é mais favorável. Outra vantagem é que podem penetrar
em células tumorais com maior facilidade e é menos provável que induzam uma resposta
imune no organismo (FICHNA et al, 2005). Além disso, modicações químicas como a
incorporação de aminoácidos, alteração da sequência terminal ou a redução de ligações de
amidas em peptídeos têm sido estratégias adotadas para, por exemplo, reduzir a degradação in
vivo por diversas proteínas endopeptidases e exopeptidases (WEINER & THAKUR, 2005).
3.5 Toxinas animais
3.5.1 Crotoxina, principal toxina da peçonha da serpente Crotalus durissus
terrificus
A Crotoxina é um complexo polipeptídico de 24 KDa isolado do veneno da espécie de
serpente Crotalus durissus terrificus (FIG.8). Foi primeiramente purificada e cristalizada por
Slotta e Fraenkel-Conrat em 1938, e desde então vem sendo investigada por pesquisadores de
diversas áreas (VITAL-BRAZIL, 1972; MARLAS & BON, 1982; CORIN et al, 1993;
DELOT & BON, 1993; ZHANG et al, 2006). A Crotoxina é o principal componente tóxico
da peçonha e representa cerca de 70% da sua massa total (DA SILVA et al, 1981 - citado por:
DOS SANTOS et al, 1992).
FIGURA 8: Serpente da espécie Crotalus durissus terrificus, cujo veneno apresenta como
principal componete a Crotoxina.
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37
FIGURA 9: Modelagem molecular da Crotoxina, um polipeptídeo de 24 KDa e 122 aminoácidos.
Modelo construído a partir do programa Swiss-Model (Swiss Institute of Bioinformatics). Disponível
em: http://swissmodel.expasy.org/).
O polipeptídeo (FIG.9) constitui um complexo não-convalente formado por duas
subunidades: CA ou crotapotina (~9,5 kDa), unidade ácida e não-enzimática; e CB (~14,5
kDa), uma fosfolipase A
2
de caráter básico (HABERMANN & BREITHAUPT, 1978). Sabe-
se que nenhuma atividade citotóxica está associada à subunidade A isolada, função exercida
pela fosfolipase A
2
, e que sua ação neurotóxica deve-se a um bloqueio da transmissão
neuromuscular (VITAL-BRAZIL, 1972). A subunidade A funciona como uma chaperona
prevenindo a ligação não específica da subunidade B às membranas, além de estar
diretamente envolvida com o reconhecimento do alvo (DELOT & BON, 1993).
A interação da Crotoxina ocorre quando o complexo polipeptídico (subunidades A+B)
reconhece um sítio de ligação específico nas membranas alvo. A subunidade B permanece
ligada enquanto a A se desprende no meio. Alguns dos sítios de ligação da Crotoxina foram
identificados, mas apenas para células cerebrais e musculares (LAMBEAU et al, 1989;
LAMBEAU et al, 1990). Resultados obtidos por Marlas & Bon (1982) sugerem que a
atividade fosfolipásica da Crotoxina é um requisito necessário para que ela apresente algum
efeito farmacológico. Entretanto, essa atividade não explica o mecanismo de ação da
Crotoxina, que pode ser melhor entendido a partir de sua ligação aos sítios específicos
(MARLAS & BON, 1982).
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38
Além da neurotoxicidade, a Crotoxina apresenta também outras atividades biológicas já
conhecidas incluindo miotoxicidade local e sistêmica (GOPALAKRISHNAKONE &
HAWGOOD, 1984), efeito inibitório sobre processos inflamatórios (RANGEL-SANTOS et
al, 2004), desencadeamento de agregação plaquetária (LANDUCCI, et al. 1994), ação
analgésica (ZHANG, et al. 2006) e inibição de macrófagos (SAMPAIO et al, 2006).
O grande interesse pela Crotoxina deve-se à sua atividade citotóxica sobre várias linhagens
tumorais humanas e murinas (CURA et al, 2002; YAN et al, 2006; SOARES, 2007). Brigatte
demonstrou em 2005 que a Crotoxina promoveu inibição do crescimento em células de
carcinossarcoma mamário in vivo, sem causar alterações histopatológicas nos animais
analisados. O efeito citotóxico da Crotoxina foi ainda demonstrado in vitro em linhagens
humanas tais como HS87T, carcinoma ductal mamário e Lu-1, adecarcinoma pulmonar
(RUDD et al, 1994). Yan e colaboradores (2006) comprovaram que a Crotoxina é capaz de
inibir a viabilidade de células K562 (células de leucemia crônica), de maneira tempo/dose
dependente, em mais de 85% quando incubada por 72 horas com doses de 50µg/mL por 72
horas. Vários estudos já compravaram a ação antitumoral desse polipeptídeo também sobre
células murinas; entre elas, eritroleucêmicas (CORIN et al, 1993).
O interesse pela Crotoxina como agente antitumoral levou ao ensaio da Crotoxina em
pacientes com câncer avançado no ano de 2002. Neste ensaio, o polipeptídeo foi administrado
via intramuscular por 30 dias consecutivoss em 23 pacientes com diferentes tipos de tumor.
Os resultados revelaram inibição do crescimento tumoral em carcinoma pulmonar (83%),
carcinoma mamário humano (69%) e uma pequena ação sobre leucemia (44%). Os autores
sugeriram que a Crotoxina apresenta a especificidade para tumores sólidos. Alguns efeitos
colaterais resultantes do caráter neurotóxico da Crotoxina foram observados (CURA et al,
2002). É possível minimizar a toxicidade ao organismo apresentada por moléculas Crotoxina,
para que esta seja adequadamente aplicada na oncologia. Por meio de biomateriais
poliméricos, por exemplo, obtém-se um sistema de liberação com poucos efeitos adversos a
nível sistêmico (FERGUSON & DUNCAN, 2009). Uma observação relevante é que a
Crotoxina foi muito menos tóxica para células normais em um teste realizado com células do
endotélio umbilical (YAN et al, 2006).
A eficácia da Crotoxina vem sendo demonstrada através de estudos in vitro e in vivo em
diferentes tipos de tumores, apesar de seu mecanismo de ação ainda não ter sido bem
esclarecido (NEWMAN et al, 1993). Embora o complexo polipeptídico da Crotoxina já tenha
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39
sido patenteado por apresentar efeito citotóxico (PLATA et al, 1992) e efeito analgésico
(REID & QIN, 2007), a interação a nível molecular deste polipeptídeo com receptores
específicos não está completamente desvendada.
Quanto ao tipo de morte celular desencadeada, sabe-se que a Crotoxina pode levar a indução
de autofagia e apoptose sobre um mesmo tipo de célula tumoral (YAN et al, 2006). A
apoptose em tumores cerebrais desencadeada pela Crotoxina foi apresentada por Soares
(2007) e pôde ser demonstrada através de estudos de citometria de fluxo e uso de
radiotraçadores de Crotoxina utilizando o radioisótopo iodo-125.
3.5.2 Propriedades de interação da Crotoxina
As propriedades de interação da Crotoxina têm sido analisadas utilizando-se membranas
biológicas de diversos tecidos. Entre eles, vesículas fosfolipídicas carregadas negativamente,
sugerindo que esta estrutura seja um constituinte dos sítios aceptores da Crotoxina em
membranas plasmáticas pré-sinápticas (RADVANYI et al, 1989).
De acordo com Donato e colaboradores (1996) a Crotoxina é mais citotóxica sobre linhagens
tumorais que expressam níveis elevados de receptor do fator de crescimento epidérmico
(EGFR). A capacidade de interação do polipeptídeo foi avaliada a partir da inibição da ligação
do EGF em células A431 (carcinoma epitelial humano) e não houve evidência de ligação
direta da toxina ao receptor. O papel desses receptores na citotoxicidade da Crotoxina ainda é
muito pouco conhecido.
Um estudo recente identificou e caracterizou uma proteína específica presente em membranas
pré-sinápticas Torpedo com a qual a Crotoxina interage. Alguns parâmetros de cinética da
ligação foram calculados, sendo a constante de dissociação aparente igual a 3,4 nmol/L
(FAURE et al, 2003).
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40
3.6 Receptores celulares como alvos
A sinalização extracelular se baseia na ligação de uma molécula a seu receptor específico em
uma célula alvo. Essa interação induz a alteração na forma ou conformação do receptor,
produzindo a resposta celular, uma cadeia de eventos bioquímicos que levam aos efeitos
desencadeados pelo ligante. A comunicação intracelular ocorre de diversas maneiras, entre
elas, através da interação de hormônios endócrinos com células de todo o organismo. Uma
vez que células tumorais são caracterizadas pela proliferação e crescimento celular
descontralados, tem-se observado que a maioria dessas células superexpressam um ou mais
tipos de receptores (WEINER & THAKUR, 2005).
A interação com as células podem ocorrer através de estratégias que utilizam: receptores
intracelulares de ligantes lipossolúveis, enzimas transmembranas, receptores de citocinas,
canais regulados por ligantes ou proteína G e segundos mensageiros. Uma das maiores classes
de receptores de membrana é a dos receptores tirosina-quinase composta por ErbB-1 (EGFR),
ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4. (FIG.10), proteínas que estão diretamente envolvidas com o ciclo
celular, incluindo crescimento e mitogênese. Cada um dos receptores tirosina-quinase é
caracterizado pela especificidade da interação de um ligante particular (FIG.10), e o complexo
ligante-receptor apresenta especificidade efetora, sendo que os quatro membros da família
possuem funções intimamente relacionadas (ZAHNOW, 2006).
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41
FIGURA 10: Família de receptores tirosina-quinase e seus respectivos ligantes específicos. Em
destaque o ligante, fator de crescimento epidérmico (EGF) e seu receptor, o receptor de fator de
crescimento epidérmico (EGFR ou ErbB1 ou HER1), proteínas de interesse no desenvolvimento deste
trabalho. Outros receptores transmembrana da mesma família são: ErbB2, ErbB3 e ErbB4 (Fonte:
ZAHNOW, 2006).
Uma das esperanças na busca por um diagnóstico preciso e precoce e por um tratamento
efetivo do câncer é o desenvolvimento de novos radiofármacos baseados em peptídeos
específicos a tumores. A superexpressão de receptores em células tumorais humanas e
murinas os torna alvos potenciais para diagnóstico por imagem e terapia através de peptídeos
específicos radiomarcados (OKARVI, 2008). Embora diversos trabalhos descrevam o uso de
pequenos peptídeos, é importante ressaltar que a partir da sequência de aminoácidos de
polipeptídeos é possível sintetizar derivados ou análogos com apenas parte da sequência
original, desde que devidamente testados e que mostrem as propriedades e os efeitos
desejados.
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42
3.6.1 Expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico - EGFR
O receptor do fator de crescimento epidérmico, EGFR (epidermal growth factor receptor), é
uma glicoproteína transmembrana de 170 kDa que apresenta três domínios de interação do
ligante, sendo um extracelular, um transmembrana e um intracelular (FIG. 11). Este último
com atividade tirosina quinase intrínseca (GRUNWALD, 2002).
FIGURA 11: (A) Desenho esquemático do receptror de fator de crescimento epidérmico
(EGFR). Uma glicoproteína transmembrana com um domínio intracelular, um extracelular e um
transmembrana. (B) Modelagem molecular representando o mesmo receptor de fator de
crescimento epidérmico (EGFR) mostrado em (A). (Fonte: Kumar et al, 2008).
O principal ligante endógeno de EGFR é o fator de crescimento epidérmico (EGF), um
polipetídeo responsável por funções como mitogênese de fibroblastos, de células epiteliais e
de células endoteliais, promotor da malignização e da migração celular epitelial,
antiapoptóico, e pró-angiogênico de várias neoplasias (ROCHA-LIMA et al, 2007).
A ligação de um fator específico induz a dimerização do receptor, seguida pela ativação do
domínio citoplasmático tirosina-quinase. A ativação da proteína quinase do domínio
intracelular ocorre por fosforilação de resíduos de tirosina, que se tornam sítios de ligação
para proteínas específicas sinalizadoras de vias intracelulares. Os receptores tirosina-quinase
podem iniciar mais de uma via de sinalização intracelular, levando a diferentes respostas
celulares (FIG.12) (ZAHNOW, 2006; KUMAR et al, 2008).
B
A
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43
A ativação do EGFR desencadeia processos responsáveis pelo crescimento e progressão de
tumores, incluindo proliferação e maturação, angiogênese, invasão, metástase e inibição da
apoptose. Uma das rotas mais importantes ativadas através do EGFR é a via Ras/Raf, que
através de mudanças na conformação de outras moléculas intermediárias e reações químicas
terminam por fosforilar fatores de transcrição específicos envolvidos na proliferação celular
(ROCHA-LIMA et al, 2007).
FIGURA 12: Diagrama esquemático da via de sinalização desencadeada a partir da ativação do
receptor de fator do crescimento epidérmico (EGFR) (Fonte: ROCHA-LIMA et al, 2007).
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44
O EGFR é normalmente expresso em células saudáveis que se originam principalmente de
camadas epiteliais, assim como também é expresso em células tumorais. Entretanto, a
sinalização anormal a partir de um receptor devido à superexpressão deste está
frequentemente ligada a doenças hiperproliferativas como o câncer. A proliferação
descontralada de células tumorais envolvendo o EGFR pode ser devido a: superexpressão do
receptor e dos seus ligantes, modulação genética, mutação ou redução dos mecanismos de
regulação negativa. Muitos tipos de tumores superexpressam EGFR (TAB.3), incluindo
carcinomas mamário, pulmonar, gástrico, pancreático, de bexiga, ovariano, prostático e
gliomas (SALOMON et al, 1995).
TABELA 3: Expressão de EGFR em tumores sólidos (adaptada de SALOMON et al, 1995 ).
Tipo de tumor
Porcentagem de tumores
superexpressam EGFR
Tipo de tumor
Porcentagem de tumores
superexpressam EGFR
Cabeça e pescoço
80–100
Prostático
40–80
Coloretal
25–77
Bexiga
53–72
Pancreático
30–50
Cervical
54–74
Pulmão
40–80
Ovário
35–70
Esofageal
71–88
Mama
14–91
Renal
50–90
Glioblastoma
40–50
Donato e colaboradores (1996) mostraram que células de carcinoma retal com maior
expressão de EGFR (100 vezes maior) em relação a células adenocarcinoma de cólon
demostraram ser mais sensíveis à Crotoxina (20 vezes mais). Dessa forma, pode-se inferir que
a variação da intensidade do efeito citotóxico sobre cada linhagem avaliada pode estar
relacionada aos diferentes níveis de expressão de EGFR.
Atualmente, vários inibidores de EGFR já estão em fase clínica de estudo para tratamento de
câncer. Um exemplo é o Erlotinib (Tarceva®), indicado em casos de terapia avançada ou
metástase de câncer de pulmão (não-pequenas células), cujo mecanismo de ação se baseia na
inibição da fosforilação de EGFR de forma seletiva e reversível, sem induzir sua degradação.
A interação do Erlotinib com o EGFR leva ao bloqueio da sinalização celular, dando início ao
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45
seu mecanismo de ação antitumoral através da inibição da proliferação e da angiogênese do
tumor, com conseqüente indução de apoptose (ROCHA-LIMA, et al, 2007). Outro fármaco
com ação sobre EGFR é o Gefitinib (Iressa, ZD1839; AstraZeneca), que atua inibindo a
enzima tirosina-quinase envolvida na ativação do receptor (HERBST et al, 2004).
A pesquisa contínua sobre os receptores de fatores do crescimento com expressão aumentada
em neoplasias irá contribuir com o desenvolvimento de ligantes mais específicos a
determinados alvos.
3.6.2 EGFR em tumores de mamários humanos
O subgrupo de receptores ErbB é o mais estudado da família dos receptores tirosina-quinase;
não apenas por sua superexpressão em células epiteliais, neuronais e mesenquimais, mas por
estarem envolvidos na proliferação de tumores. Neste trabalho, selecionamos duas linhagens
de tumores mamários e, com isso, delimitamos o foco do estudo da Crotoxina sobre o câncer
de origem mamária, que assim como diversos tumores, também apresenta superexpressão de
EGFR.
Cerca de 30-60% dos tumores mamários apresentam níveis de EGFRs 100 vezes maior que
tecidos normais (menos que 1 x 10
4
/célula) e o número de receptores por célula pode variar de
1,5 x 10
4
(em MCF7) a 1,3 x 10
6
(em MDA-MB-468) (REILLY et al, 2000). A partir dos
parâmetros de interação determinados para a molécula de EGF, é possível avaliar a expressão
do seu receptor específico, EGFR, presente em cada linhagem estudada. O número de
moléculas de EGF que se ligam especificamente por célula varia entre diferentes linhagens
tumorais (TAB.4), apresentando valores que vão desde 200 para MDA-MB-436 a 700.000
para MDA-MB-231, adenocarcinomas mamários com características diferentes
(FITZPRATICK et al, 1984).
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46
TABELA 4: Propriedades de ligação de fator de crescimento epidérmico (EGF) radiomarcado
em linhagens de tumores mamários humanos, caraterizando a expressão do receptor específico,
EGFR (adaptada de FITZPRATICK et al, 1984).
Autores de um estudo envolvendo 780 pacientes com câncer de mama concluíram que a
expressão de EGF nos tumores avaliados não apresentava relação com o tamanho, nível ou
características do tumor (FERRERO et al, 2001). Dessa forma, a determinação de EGFR é de
valor limitado como indicador no prognóstico do câncer de mama, mas continua sendo um
alvo potencial em pesquisa ou um excelente marcador em diagnóstico por imagens (medicina
nuclear) além de auxiliar em avaliações terapêuticas.
3.6.3 EGFR em células de tumor de Ehrlich
A presença de EGFR em células de tumor de Ehrlich foi primeiramente descrita em 1985 por
Usui e colaboradores. Entretanto, suas propriedades foram estudadas com detalhes alguns
anos depois quando foi possível utilizar como ferramenta a fosforilação dependente de EGF
através de [γ-
32
P]ATP. A partir de estudos de interação, observou-se que
125
I-EGF se ligava a
um polipeptídeo de 170 KDa quando incubado com frações de membrana isoladas de células
de Ehrlich (ELEXPURU et al, 1994).
L
L
i
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a
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47
O trabalho de Elexpuru e colaboradores em 1994 teve como objetivo caracterizar os
receptores de EGFR presentes em células de tumor de Ehrlich. Através de ensaios de
interação, foram estabelecidos alguns parâmetros de ligação do EGF ao seu receptor
específico, EGFR (TAB.5).
TABELA 5: Parâmetros da ligação do EGF ao seu receptor específico (EGFR) em células de
tumor de Ehrlich, de acordo com Elexpuru et al, 2004.
Parâmetro
Resultados
K
d
(alta afinidade)
1,7 nmol/L
K
d
(baixa afinidade)
24 nmol/L
Número de receptores de alta afinidade
48000 sítios/ célula
Número de receptores de baixa afinidade
275000 sítios/ célula
3.7 Estudos de interação com receptores – Binding
Estudos in vitro de interação com receptores são ferramentas muito úteis para início da
caracterização de um novo radiofármaco durante seu desenvolvimento. Esses compostos são
designados para interagir e marcar um alvo específico, permitindo diagnóstico ou terapia de
um tumor, por exemplo.
Novas linhagens de células têm sido examinadas devido à presença de receptores de interesse
que devem ser identificados e caracterizados para que a linhagem possa ser usada como um
sistema modelo. Existem várias formas de aquisição de dados relacionados à interação com
receptores, além de muitas formas de se analisá-los. Todos eles fornecem informações sobre a
saturação dos receptores pelo ligante (KLOTZ, 1983).
A ligação não específica pode acontecer quando ocorre ligação do radioligante com lipídios e
outras proteínas (DAVENPORT & RUSSELL, 1996).
Materiais e Métodos
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48
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Crotoxina
A Crotoxina foi extraída do veneno da espécie Crotalus durissus terrificus e purificada
no laboratório de Bioquímica da Fundação Ezequiel Dias (FUNED). Amostras da
toxina foram gentilmente fornecidas ao Laboratório de Radiobiologia do Centro de
Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear (CDTN), no contexto de um convênio de
cooperação técnica firmado entre a FUNED e o CDTN. O material (10 mg) foi
transportado em criotubo na forma liofilizada e após solubilização em solução salina
tamponada com fosfato (PBS), os subestoques foram armazenados em freezer a -20ºC
na concentração de 2 mg/mL em alíquotas para posterior utilização.
4.2 Cultivo celular
A linhagem de células de carcinoma mamário humano (MCF-7), status p53 selvagem,
foi cedida pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). As células MCF7 foram
cultivadas em estufa de CO
2
(5% CO
2
-
Cole Parmer)
com atmosfera úmida à 37ºC, em
meio Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB) e 1% de penicilina/ estreptomicina (meio DMEM completo). Ao
atingirem 80% de confluência, as células foram repicadas utilizando-se PBS estéril para
lavar a placa e solução de Tripsina 1% estéril para desprender as células a serem
coletadas em tubo falcon. Em seguida a viabilidade celular foi avaliada através da
exclusão com azul de Tripan, teste no qual as células são incubadas na presença do
corante por 1 minuto e quantificadas com o auxílio de uma câmara de Neubauer (FIG.
13). O azul de Tripan é um corante de alto peso molecular capaz de penetrar apenas em
células mortas ou que possuam aumento na permeabilidade da membrana, tornando-as
azuis ao microscópico. Células vivas, em perfeito estado (membrana impermeável),
permanecem incolores e devem ser quantificadas para experimentos in vitro.
Materiais e Métodos
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49
FIGURA 13: Câmara de Neubauer. Detalhe para os campos definidos para contagem do
número de células viáveis e não viáveis.
A linhagem tumoral MCF-7 foi mantida através de congelamento (-197 ºC) de alíquotas
contendo 5 x 10
6
células em DMEM, acrescido de 50% de SFB, 1% de penicilina/
estreptomicina e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Os reagentes utilizados no cultivo
celular foram obtidos da Gibco e Cultilab.
4.2.1 Células de tumor de Ehrlich
A linhagem de células de carcinoma ascítico de Ehrlich foi cedida pelo Departamento
de Patologia Comparada do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG). Sua obtenção e manutenção diferem das demais uma vez que o
tumor é mantido na forma ascítica no peritôneo do camundongo, sendo posteriormente
retirado e processado para utilização imediata. Para realização dos testes in vitro, 1 mL
de fluido ascítico foi extraído de animais com tumor de Ehrlich (inoculados 7 dias
antes) e imediatamente transferida para tubo falcon e centrifugada por 5 minutos a 1000
rpm. Após centrifugação, as hemáceas e o fluido sobrenadante foram removidos,
enquanto as células de tumor de Ehrlich foram ressuspensas em 5 mL de PBS estéril e
novamente centrifugadas por 5 minutos a 1000 g. O sobrenadante foi descartado e o
pellet de células foi ressuspenso em 5 mL de PBS. Para avaliação da viabilidade celular
foi realizado o teste de exclusão do Azul de Tripan, conforme descrito no item 4.2.
Para manutenção do cultivo e posterior utilização das células, foram realizados repiques
consecutivos nos quais um volume de 200 µL de fluido contendo as células era
Materiais e Métodos
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50
transferido para outro animal utilizando agulhas (25 x 0,7 mm) e seringas estéreis. O
repique foi realizado através de injeções intraperitoneais de fluido ascítico recém
extraído do camundongo doador (inoculado anteriormente) para um camundongo
receptor. As células foram utilizadas nos experimentos de interação ou binding,
citotoxicidade in vitro e para o desenvolvimento do modelo animal tumoral.
4.3 Animais
Todos os experimentos com animais foram feitos de acordo com o Manual sobre os
cuidados no uso de animais de laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources –
Comission on Life Sciences – National Research Council – Washington D.C.), como
recomendado pela Sociedade Brasileira em Ciência de Animais de Laboratório
(SBCAL). O protocolo número 152/2007 foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal (CETEA) em 5 de dezembro de 2007. Foram utilizados
camundongos Swiss fêmeas, pesando cerca de 30 g, obtidos no Centro de bioterismo
(CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG). Os camundongos foram acondicionados em gaiolas pequenas (30x20x15 cm),
recebendo ração e água potável ad libitum, em ambiente com temperatura mantida à
25ºC e com ciclos dia-noite (12/12 horas) (estante ventilada Alesco). Ao final dos
experimentos os animais foram sacrificados pelo método da guilhotina.
4.3.1 Modelo animal tumoral
A capacidade de detecção de sítios tumorais in vivo utilizando-se a Crotoxina foi
avaliada em camundongos implantados com células de tumor de Ehrlich. Este tipo de
tumor possui alto índice mitótico e se caracteriza pela presença de poucas células
inflamatórias e estroma escasso. Além disso, é facilmente induzido em animais
saudáveis, que não sejam imunossurprimidos, através do transplante direto de células
tumorais retiradas de um animal que já possua a neoplasia desenvolvida. O tumor de
Ehrlich foi mantido através do transplante intraperitoneal seriado em camundongos
Swiss, fêmeas, realizado em intervalos de 7 dias.
Para obtenção do modelo animal com tumor de Ehrlich foi necessário retirar 3 mL do
fluido ascítico. Este fluido foi centrifugado (2500 rpm) e lavado 3 vezes em solução
Materiais e Métodos
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51
salina fisiológica para a obtenção de um líquido denso e claro, correspondente a uma
suspensão de células, com o mínimo de fibrina e hemáceas. Em seguida, as células de
tumor de Ehrlich foram contadas e analisadas quanto à viabilidade celular através da
exclusão pelo azul de Tripan. Células viáveis (2,5 10
6
células) foram implantadas
entre os coxins plantares do membro posterior esquerdo dos camundongos Swiss,
(fêmeas) possibilitando a obtenção do tumor na forma sólida (Soares,2007). Dez dias
após o implante do tumor, os animais foram divididos em grupos de acordo com cada
experimento.
4.4 Estudo do efeito citotóxico da Crotoxina sobre células tumorais
Análises morfológicas das linhagens de células tumorais MCF-7 e Ehrlich foram
realizadas em paralelo com os testes de citotoxicidade, utilizando-se Microscópio
Óptico Invertido com contraste de fases, Nikon®. As células em cultivo foram
fotografadas periodicamente para registros de possíveis alterações na morfologia
celular, sendo as imagens captadas com Câmera Digital Nikon® Coolpix 4500.
A atividade citotóxica da Crotoxina foi avaliada através do ensaio com o MTT, [3-(4,5-
dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)], um sal de coloração
amarela capaz de captar elétrons da cadeia transportadores de elétrons por uma reação
de oxi-redução. Ao ser reduzido por enzimas desidrogenases de células
metabolicamente viáveis, o MTT forma cristais de coloração roxa, o Formazan (FIG.
14). Esses cristais são insolúveis em água e apresentam pico de absorção em 570 nm.
Seguindo metodologia descrita por Plumb e colaboradores (1989), foi possível
determinar o efeito da Crotoxina sobre as linhagens testadas.
As células tumorais foram semeadas em placas de cultura de 96 poços, sendo 500
células MCF-7 por poço e 1500 células de tumor de Ehrlich por poço, e incubadas em
estufa a 37 ºC/ 5% CO
2
por 24 horas. Decorrido esse tempo, diferentes concentrações
de Crotoxina 4,17 x 10
-8
a 8,34 x 10
-6
mol/L foram adicionadas aos poços contendo as
células (presentes com 80% de confluência) que foram novamente incubadas por 72
horas. O grupo definido como controle não foi tratado com Crotoxina, recebeu apenas
meio completo e foi mantido nas mesmas condições que o grupo tratado. Após 72
horas, as células foram coradas com MTT (0,5 mg/mL) por 4 horas e mantidas ao
Materiais e Métodos
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52
abrigo da luz. O sobrenadante de cada poço foi descartado e 100 µL de DMSO foram
adicionados para solubilizar os cristais de Formazan. As amostras foram medidas por
espectrofotometria em um leitor de microplaca UV-visível (Molecular Devices) a 570
nm. A fração de sobrevivência foi calculada como porcentagem do controle
(Absorbância no controle =100% de sobrevivência). Os experimentos foram feitos em
quadruplicata. O valor da DL
50
(concentração do composto que produziu 50% de morte
celular) in vitro para cada linhagem foi determinado graficamente usando o programa
Graphpad Prism® 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).
FIGURA 14: Desenho esquemático do MTT sendo reduzido por enzimas desidrogenases
de células metabolicamente viáveis e dando origem ao Formazan.
4.5 Reação de marcação da Crotoxina – Síntese de um radiotraçador utilizando
125
I e
131
I
A reação de marcação com
125
I/
131
I foi realizada de acordo com o protocolo adaptado a
partir de Marchalonis (1969), seguida da execução dos testes de controle de qualidade
radioquímico e biológico. Cada radionuclídeo foi utilizado com objetivos distintos,
sendo geradas moléculas radiomarcadas quimicamente semelhantes mas com
propriedades radioativas diferentes para aplicações distintas (TAB. 5).
AMARELO
VIOLETA
N
N
N
+
N
C
S
N
CH
3
CH
3
N
N
H
N
N
C
S
N
CH
3
CH
3
NAD
+
NADH
FORMAZAM
MTT
Materiais e Métodos
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53
TABELA 6: Principais propriedades dos radionuclídeos utilizados,
125
I e
131
I, e suas
respectivas aplicações.
PROPRIEDADE
125
I
131
I
Energia gama
(principal)
35,5 KeV
364,5 KeV
Tempo de meia-vida
60 dias
8 dias
Aplicação desejada
Estudos de biodistribuição
Ensaios de interação
Imagem SPECT
Outras aplicações
Braquiterapia
Radioterapia
Produção
Radionuclídeo de reator
Radionuclídeo de reator
A síntese dos radiotraçadores ocorreu a partir de uma reação de substituição eletrofílica,
misturando-se 0,3 nmol (7,2 μg) de Crotoxina com 18,5 MBq de Na
125
I ou 37,0 MBq de
Na
131
I e quantidade adequada de lactoperoxidase. A reação foi iniciada pela adição de
solução de peróxido de hidrogênio, adicionados em três alíquotas de 5 μL a cada um
minuto. Finalmente, a reação foi interrompida com a adição de PBS contendo 0,1% de
albumina de soro bovino (BSA). Para separação do iodo livre (
125/131
I
-
) presente no meio
de reação, utilizou-se uma resina de troca aniônica (Dowex 1-X8), previamente saturada
com PBS 0,05 mol/L (pH= 7,4) e 1% de BSA. Alíquotas de 5,0 μL da amostra antes e
depois da purificação em Dowex foram retiradas e diluídas para análise cromatográfica.
O volume final obtido foi de 1,0 mL. A síntese do radiotraçador com
131
I foi realizada a
partir de uma maior quantidade do radioativo de maneira a aumentar a atividade
específica, propiciando uma imagem SPECT mais nítida.
O controle de qualidade foi realizado através de cromatografia ascendente em camada
delgada utilizando-se papel Whatman (2 x 25 cm) como fase estacionária e metanol
saturado com KI como fase móvel. Aplicou-se 5,0 μL da amostra de
125/131
I-Crotoxina
na fita de papel Whatman e após migração completa do eluente a fita foi cortada em
segmentos de 1 cm para medida da radioatividade em contador gama tipo poço,
automático, modelo 1480 Wizard 3 (janela de 511 keV, com eficiência de 82% para o
Materiais e Métodos
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54
iodo-125 e de 43% para iodo-131). Nesse sistema o iodo livre (
125/131
I
-
)
migra com a fase
móvel e a molécula radiomarcada,
125/131
I-Crotoxina, permanece na origem (FIG.15). A
eficiência de marcação, porcentagem de incorporação e a atividade específica foram
calculadas a partir dos resultados da cromatografia.
FIGURA 15: Representação esquemática do sistema cromatográfico para verificação da
eficiência da reação de marcação da Crotoxina com
125
I ou
131
I. Cromatografia em camada
delgada utilizando papel Whatman e metanol saturado com KI.
4.6 Estabilidade da molécula de Crotoxina marcada com
125
I em soro fetal
bovino
Neste estudo o objetivo foi avaliar a estabilidade in vitro da
125
I-Crotoxina após a
marcação, ou seja, verificar se a ligação entre a Crotoxina e o radionuclídeo
125
I era
mantida ao longo do tempo. Amostras do polipeptídeo radiomarcado
foram incubadas
em soro fetal bovino, pH 7,4 e temperatura igual a 37 ºC. Alíquotas de 5 µL foram
retiradas nos tempos de 1, 2, 3, 6 e 24 h após a incubação para determinação da
porcentagem de marcação diretamente relacionada ao efeito da radiólise e de enzimas
sobre a
125
I-Crotoxina .
A determinação da porcentagem de iodo livre e Crotoxina marcada foi possível após
realização de cromatografia em camada delgada, conforme detalhado no item 4.6. Os
cálculos foram feitos a partir da contagem da radioatividade dos segmentos das fitas
cromatográficas.
Materiais e Métodos
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55
4.7 Ensaios in vitro de interação molecular da Crotoxina – Binding
4.7.1 Determinação da ligação específica em células MCF-7 e de tumor de
Ehrlich
A ligação específica da Crotoxina com receptores das células de tumor de Ehrlich foi
avaliada através de estudos de interação in vitro. Após processamento adequado das
células descrito no item 4.3, elas foram ressuspensas na solução tampão para Binding
constituída de Tris-HCl (10 mmol/L), NaCl (150 mmol/L), EDTA (0,5 mmol/L) e BSA
(0,1% p/v). As células (1 x 10
6
células/ 200µL tampão) foram então incubadas por 1
hora com 25 µL de
125
I-Crotoxina (1 x 10
-10
mol/L) a 25 ºC em tubos eppendorf na
presença e na ausência de Crotoxina não radiomarcada (1 x 10
-7
mol/L). A ausência da
Crotoxina não marcada determinou a ligação total do radioligante, enquanto que a
presença de Crotoxina não marcada permitiu a definição da porcentagem de ligação não
específica da
125
I-Crotoxina com seus receptores. O excesso de 1000 vezes de Crotoxina
não marcada em relação à marcada foi adicionado para determinação da porcentagem
relativa à ligação não-específica, uma vez que os sítios específicos foram bloqueados.
Após o período de incubação, os tubos foram centrifugados (Centrífuga Biofuge 13,
Heraeus) a 13000 rpm por 5 minutos sob refrigeração. O sobrenadante foi descartado e
as células foram ressuspensas e lavadas com tampão de binding gelado contendo BSA
1,0% p/v. Esse procedimento de lavagem foi repetido três vezes. Finalmente, cada pellet
de células foi inserido em tubo de cintilografia para contagem da radioatividade no
contador gama previamente citado.
A ligação específica foi obtida a partir da subtração da ligação total menos a ligação
não-específica. A estabilidade da ligação específica foi acompanhada em intervalos de
tempos de 30, 45, 60, 120 e 180 minutos de incubação com as células.
De acordo com o modelo matemático adotado para análise dos resultados obtidos nos
ensaios de interação, estabeleceu-se que não haja efeito de depleção do ligante. Para
atender essa exigência, não mais que 10% da radioatividade total adicionada deve
permanecer associada às células, minimizando possíveis efeitos de depleção do ligante
ao longo do ensaio. Em condições de depleção, a concentração de radioligante é muito
Materiais e Métodos
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56
menor que a concentração de sítios receptores, o que prejudica a acurácia dos
parâmetros determinados (HULME & BIRDSALL, 1992).
Células em solução tampão foram incubadas com
125
I-Crotoxina e após diferentes
períodos de incubação (15, 30, 60 e 90 minutos) foram centrifugados. O sobrenadante e
o pellet foram coletados para contagem da radioatividade e determinação da
porcentagem de
125
I-Crotoxina livre e de
125
I-Crotoxina ligada, respectivamente,
calculadas em relação ao total de
125
I-Crotoxina adicionado inicialmente (FIG.16). A
verificação foi feita a partir de um experimento simples, mas os resultados são de
extrema impotância para continuidade do trabalho.
FIGURA 16: Representação esquemática da interação das moléculas de
125
I-Crotoxina
com as células de carcinoma ascítico de Ehrlich.
4.7.2 Saturação da ligação
Para obter a curva de saturação da ligação da Crotoxina aos receptores específicos
presentes nas células de Ehrlich. 25 µL de Crotoxina não-marcada (1 x 10
-10
mol/L)
foram incubados em tubos com 1 x 10
6
células em 200 µL de tampão 25 °C. Quando na
ausência de Crotoxina não radiomarcada, forneceu informações quanto à ligação total
da
125
I-Crotoxina. Para determinação da ligação não específica, concentrações
crescentes de
125
I-Crotoxina na faixa de 3 x 10
-12
a 2 x 10
-8
mol/L foram adicionadas e
mantidas em incubação por mais 60 minutos. A ligação total subtraída da ligação não
Materiais e Métodos
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57
específica permite definir a ligação específica do radioligante. Os tubos foram
centrifugados e as células foram lavadas para contagem da radioatividade do pellet
exatamente como descrito no item anterior. O ensaio foi realizado em tubos eppendorfs
de 1,5 mL com volume final de reação de 250 L.
Os valores de K
d
, constante de afinidade do ligante pelo receptor, e B
max
, número total
de sítios específicos, foram obtidos a partir da análise dos dados utilizando o programa
Graphpad Prism®5.0, através de regressão não-linear (Scatchard), considerando um e
dois sítios específicos de interação da Crotoxina.
4.7.3 Determinação do IC
50
e avaliação da afinidade de
125
I-Crotoxina
Neste ensaio, concentrações crescentes de Crotoxina não marcada (1x10
-12
mol/L a
1x10
-7
mol/L) foram pré-incubadas em tubos eppendorfs contendo células de tumor de
Ehrlich em tampão de binding por 15 minutos a 25 °C. Alíquotas de uma única
concentração de
125
I-Crotoxina (1x10
-10
mol/L) foram adicionadas ao tubos, que foram
incubados a 25 °C por 60 minutos. Após o período de incubação, o material foi
centrifugado a 13000 rpm por 5 minutos para separação da radioatividade ligada às
células (bound) e da radioatividade livre (free). As células formaram um pellet contendo
tecido e
125
I-Crotoxina ligada, enquanto o sobrenadante continha
125
I-Crotoxina que não
se ligou a receptores específicos. O sobrenadante foi descartado e as células foram
ressuspensas e lavadas com tampão 1% p/v BSA gelado. Esse procedimento foi repetido
três vezes e em seguida, o pellet foi colocado em tubos de cintilografia e para
determinação da radioatividade em contador gama.
Os dados obtidos foram avaliados utilizando-se o programa Graphpad Prism® 5.0,
através do qual foi possível determinar o valor de IC
50
para a Crotoxina. Foi muito
importante certificar que a Crotoxina radiomarcada mantinha uma afinidade de
interação pelo receptor, assim como a Crotoxina não marcada.
Materiais e Métodos
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58
4.7.4 Caracterização da interação in vitro e in vivo da Crotoxina com
EGFR
4.7.4.1 Estudos de competição in vitro com EGF/
125
I-Crotoxina
A interação da Crotoxina com EGFR foi avaliada a partir do experimento de
competição da molécula de interesse radiomarcada com um ligante específico do
receptor, o EGF. Células de tumor de Ehrlich foram incubadas (1 x 10
6
células/ 200 µL)
com concentrações crescentes (1 x 10
-7
mol/L a 1 x 10
-12
mol/L) de EGF a 37 °C por 2
horas. Após esse período, 25 µL
de
125
I-Crotoxina foram adicionados na concentração
de 1 x 10
-10
mol/L e os tubos foram mantidos a 25 °C por mais 1 hora. Assim como nos
outros ensaios de interação, tem-se a incubação de
125
I-Crotoxina na presença ou
ausência do competidor.
O mesmo procedimento descrito no em 4.7.1 foi adotado para lavagem das células e
separação da Crotoxina ligada e da não-ligada para contagem das emissões gama
associadas a cada fração.
4.8 Estudo do perfil de biodistribuição da
125
I-Crotoxina
A avaliação da interação da
125
I-Crotoxina com células tumorais in vivo foi realizada a
partir do estudo de biodistribuição em camundongos previamente preparados conforme
descrito no item 4.4.1. O objetivo foi avaliar o potencial da molécula marcada como
radiofármaco para detecção de tumores sólidos. Os camundongos foram divididos em
dois grupos, sendo que um recebeu injeção via intratumoral (i.t.) e outro, injeção via
endovenosa caudal (e.v.).
A biodistribuição via endovenosa foi realizada administrando-se 7,4 MBq (1x10
6
cpm)
de
125
I-Crotoxina diluída em 200 µL salina em cada animal. Através da via intratumoral
injetou-se 1x10
6
cpm de
125
I-Crotoxina diluída em 50 µL salina por animal. Diferentes
tempos após a administração do polipetídeo marcado (2, 10, 30, 60, 180, 360 e 1440
minutos), os animais foram sacrificados pelo método de guilhotinamento (guilhotina
Insight, modelo EB271) e coletaram-se amostras de sangue (50 µL) para análise.
Tiróide, coração, pulmões, fígado, baço, pâncreas, intestino, rins, músculo esquelético,
Materiais e Métodos
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59
cérebro, cerebelo, aparelho reprodutor e patas foram removidos para determinação do
peso e da radioatividade associada a cada um.
Com isso foi possível avaliar o perfil de biodistribuição in vivo, bem como a interação
da
125
I-Crotoxina com o tumor. A radioatividade (emissão gama) de cada órgão foi
determinada no contador gama. Os resultados foram expressos como percentual da dose
injetada por grama de cada órgão (%ID/g) e analisados através do programa Graphpad
Prism® 5.0.
4.9 Imagem SPECT in vivo
A tecnologia de imagem molecular através da tomografia por emissão de fóton único,
SPECT, permite o estudo de funções in vivo de forma pouco invasiva. O experimento
descrito a seguir foi realizado no Hospital Felício Rocho, em colaboração com o médico
nuclear Dr. Carlos Simal, utilizando-se um sistema SPECT (Gama Câmara G&E
Healthcare Millenium) com uma câmara de duas cabeças integrada a um sistema de
tomografia computadorizada (FIG. 17).
Para obtenção das imagens, a Crotoxina radiomarcada com iodo-131 foi utilizada
devido às características do radioisótopo, principalmente, à emissão de fótons com pico
de energia em 0,365 MeV, adequados para formação de imagem de boa qualidade em
tomógrafos tipo SPECT.
Materiais e Métodos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
60
FIGURA 17: Tomógrafo do tipo SPECT (tomografia por emissão de um único fóton).
Gama Câmara de duas cabeças modelo Millennium LG, G&E Healthcare, que permite obtenção
de imagens a partir da emissão de fótons por radiofármacos previamente administrados.
Apresenta um tomógrafo computadorizado convencional acoplado.
A
131
I-Crotoxina foi administrada via intratumoral (1,85 x 10
6
Bq) e via endovenosa
(7,4 x 10
6
Bq) em dois camundongos previamente preparados (modelo animal com
tumor de Ehrlich na pata esquerda). Em seguida, os animais foram anestesiados via
intraperitoneal com uma solução contendo 23,0 µL de Ketamina e 17,0 µL de Xylasina
para serem mantidos na posição adequada à realização do procedimento. O tempo de
aquisição das imagens foi de 10 minutos e elas foram obtidas em diferentes intervalos
de tempo: 15, 30, 60 minutos. Com o objetivo de avaliar a captação da
131
I-Crotoxina no
tumor e de iodo-131 livre na tireóide tardiamente, anestesiou-se novamente os mesmos
animais pra obtenção de imagem 72 horas após a injeção do composto radioativo. A
comparação entre as imagens foi feita para avaliar se a radioatividade observada no
tumor se deve ao acúmulo de
131
I-Crotoxina ou de
131
I, uma vez que moléculas
radioiodadas podem sofrer hidrólise liberando o iodo, o qual poderia ser captado pelos
seus órgãos alvo fisiológicos. As imagens foram reconstruídas, processadas e analisadas
através do programa Xeleris.
Materiais e Métodos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
61
4.10 Manipulação de radioisótopos
Todos os experimentos foram realizados de acordo com a norma CNEN-NE 3.01,
seguindo cuidados de radioproteção tais como: uso de blindagem de chumbo e acrílico
revestido com chumbo para
125
I e
131
I; bancadas devidamente forradas com plásticos e
papéis toalha; monitorações de superfícies com o detector Geiger-Müller e dosímetros
individuais; uso de equipamentos de proteção individual (EPI) como luvas cirúrgicas
descartáveis, óculos de segurança e jalecos.
Os rejeitos radioativos foram separados quanto ao tipo material (sólido ou líquido) e
acondicionados em sacos plásticos, lixeiras blindadas e bombonas de polipropileno até
o completo decaimento. Após o decaimento, foram recolhidos pelo setor de rejeitos do
CDTN.
Ao final dos experimentos com animais, as carcaças e órgãos foram embalados em
sacos plásticos (cor branca), identificados (data e tipo de isótopo) e acondicionados em
freezer -20ºC por um período suficiente para permitir o decaimento dos isótopos.
Posteriormente, foram monitorados com o detector de exposição de dose RADIATON
SURVEY METER PRM 301 e aqueles classificados como lixo não radioativo foram
descartados como resíduos de serviço de saúde.
4.11 Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em replicatas (2, 3 ou 4). Os resultados foram
expressos como a média e desvio padrão. Os dados foram analisados pelo teste t de
Student não pareado; foram considerados significativos aqueles dados com p<0,05.
Resultados
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62
5 RESULTADOS
5.1 Avaliação do efeito antitumoral a partir de análises morfológicas
As análises morfológicas foram realizadas a partir de fotografias obtidas com o auxílio
de uma câmera fotográfica digital acoplada ao microscópio óptico. As linhagens de
tumores de origem mamária, MCF-7 e de Ehrlich, foram submetidas ao tratamento com
diferentes concentrações de Crotoxina variando entre 4,17 x 10
-8
e 8,34 x 10
-6
mol/L e
após 72 horas foram visualizadas e fotografadas.
Em relação às células de tumor de Ehrlich foram observadas alterações morfológicas,
tais como: arredondamento celular, redução no número de células, redução do volume
citoplasmático, característicos do processo de morte celular programada (apoptose). As
alterações sofridas pelas células tumorais tratadas nas concentrações de 2,09 x 10
-6
e
8,34 x 10
-6
mol/L podem ser observadas nas FIG. 18-21. Não foram observadas
alterações celulares no grupo controle de nenhuma das linhagens observadas.
O polipeptídeo testado não demonstrou atividade citotóxica sobre a linhagem MCF-7.
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
63
Células de carcinoma ascítico de Ehrlich - TRATADAS
FIGURA 19: Fotomicrografias ópticas das células de carcinoma ascítico de Ehrlich após
tratamento com Crotoxina. Células de tumor de Ehrlich foram semeadas em placas de 96
poços e incubadas com diferentes concentrações de Crotoxina. Para efeito de comparação do
número de células e da morfologia, as fotos foram tiradas em (A) aumento de 100X e (B)
aumento de 400X. As concentrações de Crotoxina usadas foram significativamente citotóxicas.
FIGURA 18: Fotomicrografias ópticas das células controle (não tratadas) de carcinoma
ascítico de Ehrlich. Células de tumor de Ehrlich não tratadas para visualização do
comportamento característico da linhagem. Para efeito de comparação do número de células e
da morfologia, as fotos foram tiradas em (A) aumento de 100X e (B) aumento de 400X
(representação esquemática de aumento).
8,34 x 10
-6
mol/L
Células de carcinoma ascítico de Ehrlich - CONTROLE
8,34 x 10
-6
mol/L
2,09 x 10
-6
mol/L
2,09 x 10
-6
mol/L
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
64
Células de MCF-7 - TRATADAS
FIGURA 20: Fotomicrografias ópticas das células controle de MCF-7. Células MCF-7 não
tratadas para visualização do comportamento característico da linhagem. Para efeito de
comparação do número de células e da morfologia, as fotos foram tiradas em (A) aumento de
100X e (B) aumento de 400X (representação esquemática de aumento).
FIGURA 21: Fotomicrografias ópticas das células MCF-7 após tratamento com Crotoxina.
Células de foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas com diferentes concentrações de
Crotoxina. Para efeito de comparação do número de células e da morfologia, as fotos foram
tiradas em (A) aumento de 100X e (B) aumento de 400X.
Células de MCF-7 - CONTROLE
8,34 x 10
-6
mol/L
8,34 x 10
-6
mol/L
2,09 x 10
-6
mol/L
2,09 x 10
-6
mol/L
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
65
5.2 Avaliação do efeito citotóxico in vitro da Crotoxina sobre células de tumores
mamários
O efeito citotóxico da Crotoxina foi avaliado pela medida da taxa de sobrevivência das
células em relação ao controle, através do ensaio com sal tetrazólio MTT. As células
tumorais MCF-7 e de Ehrlich foram tratadas com concentrações crescentes de
Crotoxina e avaliadas após 72 horas de incubação.
A FIG. 22 mostra que a Crotoxina foi citotóxica para as células de tumor de Ehrlich e
que a curva apresentou um perfil dose-dependente. O valor da DL
50
in vitro,
concentração do composto que produziu 50% de morte celular, foi calculado plotando-
se a porcentagem de sobrevivência celular versus concentração do composto, através do
programa Graphpad Prism® 5.0. Células de tumor de Ehrlich foram incubadas com
Crotoxina nas concentrações de 4,17 x 10
-8
a 8,34 x 10
-6
mol/L e a DL
50
in vitro
calculada foi igual a 9,54 x 10
-7
mol/L. As maiores concentrações utilizadas, 4,17 x 10
-6
e 8,34 x 10
-6
mol/L, reduziram significativamente o número de células de tumor de
Ehrlich vivas que passou a ser cerca de 30% do número inicial após o tratamento.
Por outro lado, não foi possível observar um efeito dose-dependente para as células
MCF-7, uma vez que a taxa de sobrevivência manteve-se elevada. O mesmo tratamento
com a Crotoxina não alterou de forma significativa o número de células mortas
observadas, nem na concentração mais elevada de Crotoxina (8,34x10
-6
mol/L)
(FIG.23). O efeito citotóxico sobre a linhagem MCF-7 foi máximo (com redução do
número inicial de células em aproximadamente 20%) na concentração de Crotoxina
igual a 2,09 x 10
-6
mol/L.
A DL
50
in vitro da Crotoxina para as células MCF-7 não pôde ser calculada, pois não
houve morte de 50% das células com nenhuma das concentrações testadas. A linhagem
de tumor mamário humano demonstrou ser mais resistente ao efeito da Crotoxina do
que as células de tumor de Ehrlich (murinas).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
66
FIGURA 23: Efeito citotóxico da Crotoxina sobre células MCF-7 após 72hs de tratamento.
Células MCF-7 foram tratadas com diferentes concentrações de Crotoxina. A citotoxicidade foi
avaliada após 72 hs de tratamento pela medida da taxa de sobrevivência das células tratadas,
através do teste do MTT. Nem mesmo nas maiores concentrações de Crotoxina observou-se um
efeito citotóxico significativo sobre as células MCF-7, que mantiveram um nível de
sobrevivência de cerca de 90% ao longo de todo tratamento, independente da dose a que foram
submetidas.
-9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
120
log [Crtx] (mol/L)
Sobrevivência
(%controle)
FIGURA 22: Efeito citotóxico da Crotoxina sobre células de carcinoma ascítico de Ehrlich
após 72 hs de tratamento. Células de carcinoma ascítico de Ehrlich foram tratadas com
diferentes concentrações de Crotoxina. A citotoxicidade foi avaliada após 72 hs de tratamento
pela medida da taxa de sobrevivência das células tratadas, através do teste do MTT. As
concentrações de 4,17 x 10
-6
e 8,34 x 10
-6
mol/L foram letais para cerca de 70% das células. A
DL
50
in vitro encontrada foi igual a 9,54 x 10
-7
mol/L.
-9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
120
log [Crtx] (mol/L)
Sobrevivência
(%controle)
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
67
5.3 Síntese da Crotoxina radiomarcada
A partir de duas reações de radiomarcação, cada uma com um radionuclídeo diferente
(
125
I e
131
I), foram obtidos dois radiotraçadores com propriedades e finalidades distintas.
O processo de marcação permitiu a incorporação de pequenas quantidades dos
radionuclídeos à Crotoxina gerando sondas radioativas. Uma das aplicações do
radiotraçador marcado com
125
I é em estudos de identificação e caracterização do
mecanismo de ação da própria molécula (Crotoxina) que os compõem. O radiotraçador
ligado a
131
I foi utilizado para avaliação do potencial radiofarmacêutico através da
capacidade para detectar diferencialmente a região tumoral seja em estudos de
biodistribuição a partir de imagens SPECT.
Cada uma das moléculas radiomarcadas (
125
I-Crotoxina e
131
I-Crotoxina) foi avaliada
quanto a sua pureza radioquímica por cromatografia em papel Whatman nº1, mostrando
que a eficiência da reação de marcação e a porcentagem de recuperação após lavagem
em resina cromatográfica Dowex eram favoráveis à utlização nos ensaios in vitro e in
vivo. Os dados de atividade específica e eficiência de marcação relativos a cada
marcação estão apresentados na TAB.7.
TABELA 7: Parâmetros observados após síntese de radiotraçadores a partir da Crotoxina
utilizando-se dois radioisótopos distintos: iodo-125 e iodo-131.
Radiotraçador
Atividade Específica
Eficiência da
marcação
125
I-Crotoxina
31,4 TBq/mmol (848,3 Ci/mmol)
91 ± 4 %
131
I-Crotoxina
109,9 TBq/mmol (2971,2 Ci/mmol)
85 ± 5 %
A estabilidade do polipeptídeo radiomarcado com iodo-125 foi examinada a 37 ºC em
soro fetal bovino. Análises quantitativas da porcentagem de Crotoxina que permanecia
ligada ao radioisótopo após incubação foram realizadas através de cromatografia em
camada delgada e revelaram que a
125
I-Crotoxina se manteve suficientemente estável
durante o período de incubação de 1 a 24 horas após a marcação (FIG.24).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
68
0 5 10 15 20 25
0
20
40
60
80
100
Tempo de incubação (horas)
Porcentagem
de
125
I-Crotoxina (%)
FIGURA 24: Estudo de estabilidade em soro fetal bovino (37 ºC) da
125
I-Crotoxina após a
radiomarcação. Alíquotas da amostra foram submetidas ao controle de qualidade para análise
radioquímica por cromatografia em camada delgada para avaliar se a
125
I-Crotoxina permanecia
radiomarcada com o decorrer do tempo.
5.4 Estudos in vitro de interação molecular da Crotoxina – Binding
5.4.1 Determinação da ligação específica em células MCF-7 e de tumor de
Ehrlich
A Crotoxina radiomarcada com iodo-125 foi utilizada para realização dos experimentos
de interação com as células tumorais MCF-7 e de Ehrlich. A ligação total foi
determinada após incubação de 1 x 10
6
células com 1 x 10
-10
mol/L de
125
I-Crotoxina. A
ligação não-específica foi medida na presença de 1 x 10
-7
mol/L de Crotoxina não
marcada, um excesso de 1000 vezes do ligante não-marcado adicionado para bloquear a
ligação da
125
I-Crotoxina a receptores específicos, e dessa forma determinar a
porcentagem de ligação não-específica. Idealmente, a ligação não-específica é
proporcional à concentração do ligante.
Os resultados obtidos sugerem que a
125
I-Crotoxina apresentou maior ligação a sítios
específicos das células tumorais mamárias murinas do que nas humanas, sendo
aproximadamente 70% de ligação específica em tumor de Ehrlich e 37% em MCF-7
(FIG. 25).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
69
5.4.2 Identificação e caracterização da interação da
125
I-Crotoxina com
alvos presentes em células de tumor de Ehrlich
As células de tumor de Ehrlich foram utilizadas nos estudos de interação da Crotoxina
devido a quatro fatores: propriedades similares aos tumores humanos de origem
mamária (SILVA et al, 2004), expressão conhecida e caracterizada de EGFR
(ELEXPURU, SORIANO & VILLALOBO, 1994), disponibilidade do modelo tumoral
in vivo no laboratório de Radiobiologia, além de um número favorável de células
viáveis para os ensaios in vitro. A interação do polipeptídeo marcado foi identificada e
caracterizada a partir dos ensaios de ligação em condições de equilíbrio: saturação e
competição (Apêndice A, pág. 101).
125
I-Crotoxina foi incubada com células de Ehrlich a 25 ºC. Ao longo de 90 minutos a
quantidade de radioatividade ligada foi quantificada e subtraindo esse valor do total
adicionado às células obtivemos a radioatividade livre (FIG.26). De acordo com o
modelo matemático adotado para análise não pode haver depleção do ligante (HULME
% BIRDSAL, 1992). Portanto, antes de iniciar os ensaios de interação a porcentagem de
125
I-Crotoxina ligada ao tecido foi determinada.
0
20
40
60
80
100
MCF7 EHRLICH
*
% Ligação Específica
FIGURA 25: Especificidade de ligação da
125
I-Crotoxina em cada linhagem de células
tumorais estudada. A ligação específica da Crotoxina radiomarcada foi maior em células de
tumor de Ehrlich (70 ± 2%) comparada à ligação em MCF-7 (37 ± 2 %), indicando maior
interação com sítios específicos da linhagem murina (n=3; *p<0,01).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
70
Apenas 3% do total de
125
I-Crotoxina adicionada permaneceu associada às células,
minimizando possíveis efeitos de depleção do ligante ao longo do ensaio. Ao
analisarmos apenas a captação da radioatividade pelas células de tumor de Ehrlich
observamos que o equilíbrio de ligação foi estabelecido rapidamente, mantendo valores
de contagem próximos de 600 cpm a partir de 30 minutos de incubação (FIG.27).
0 20 40 60 80 100
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
125
I-Crotoxina ligada
125
I-Crotoxina não ligada ou livre
Total de
125
I-Crotoxina adicionada
tempo (min)
125
I-Crotoxina (cpm)
FIGURA 26: Perfil da ligação da
125
I-Crotoxina pelas células de tumor de Ehrlich. Apenas
cerca de 3% da radioatividade total acrescentada à solução tampão de binding contendo as
células permanece ligada ao tecido, seguindo o modelo adotado de não depleção do ligante
(HULME & BIRDSALL, 1992).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
71
FIGURA 27: Propriedade de ligação da
125
I-Crotoxina às células de tumor de Ehrlich. O
equilíbrio de ligação é atingido a partir de cerca de 20 minutos após o início do período de
incubação do radioligante
125
I-Crotoxina com as células. Apenas 3% do total de 125I-Crotoxina
adicionado permance ligada ao tecido.
5.4.2.1 Estudos em condições de equilibiro: isoterma de saturação
Um estudo de saturação foi realizado através da incubação de um número fixo de
células de tumor de Ehrlich (1 x 10
6
células) com várias concentrações de
125
I-Crotoxina
(radioligante) por 1 hora até que o equilíbrio de ligação fosse estabelecido. A ligação
não-específica foi determinada com a adição de um excesso de Crotoxina não marcada
(1000 vezes) permitindo que a ligação específica fosse calculada para cada
concentração de
125
I-Crotoxina.
Utilizando o programa Graphpad Prism® 5.0, a curva de saturação foi obtida
representando a ligação da Crotoxina radiomarcada às células de tumor de Ehrlich. Dois
parâmetros foram calculados: K
d
, constante de afinidade do ligante pelo receptor, e
B
max
, número total de sítios específicos (Apêndice A, pág.101). Os resultados
permitiram ainda verificar a concentração de
125
I-Crotoxina capaz de saturar os sítios
específicos.
O parâmetro de caracterização da ligação B
max
saturação foram obtidos na unidade de
fmol/1 x 10
6
células e, a partir de regra de três simples, foi possível calcular o número
de sítios por cada célula.
0 20 40 60 80 100
0
2
4
6
8
10
tempo (min)
125
I-Crotoxina ligada (%)
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
72
Inicialmente, os resultados foram analisados considerando-se que o radioligante interage
com apenas um sítio de ligação (one binding site) (FIG.28). A ligação de
125
I-Crotoxina
às células de tumor de Ehrlich foi caracterizada como um processo saturável e
dependente da concentração do ligante, com um platô de ligação representando o K
d
com valor de foi igual a 19,7 x 10
-9
mol/L. O número total de sítios de ligação (B
max
) de
24,9 fmol/ 1 x 10
6
células (aproximadamente 15.000 sítios por célula) foi calculado a
partir do Scatchard plot. A análise Scatchard dos dados da FIG.28 permitiu a
construção da curva Ligado/Livre versus Ligado (FIG.29), sugerindo a interação com
apenas um sítio de ligação. A inclinação da curva é igual ao inverso de –K
d
(Apêndice
A, pág. 101) e a interseção da curva com o eixo das abscissas é igual ao B
max
(DAVENPORT & RUSSELL, 1996).
0 5 10 15 20 25
0
5
10
15
20
25
30
[
125
I-Crtx] nmol/L
Ligação Específica
(fmol/1x10
6
cél.)
FIGURA 28: Curva de saturação da ligação de
125
I-Crotoxina às células tumorais de
Ehrlich construída a partir da análise de interação com apenas um sítio específico. 1 x 10
6
células de tumor de Ehrlich foram incubadas com concentrações crescentes de
125
I-Crotoxina na
faixa de 3 x 10
-12
a 2 x 10
-8
mol/L a 25 °C por 1 hora. A ligação específica foi determinada pela
diferença entre a ligação total e a não-específica medida na presença de um excesso de 1000
vezes de Crotoxina não marcada.
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
73
0 10 20 30
0
2
4
6
8
10
Ligado (fmol/ 1x10
6
cels)
Ligado/ Livre
FIGURA 29: Transformação linear Scatchard dos dados da curva de saturação. A análise
através do programa GraphPad Prism® 5.0 dos dados da FIG.28 permitiu a construção da curva
Ligado/Livre versus Ligado, que mostra a interação com apenas um sítio de ligação. Os dois
parâmetros importantes determinados a partir desta curva foram a constante de afinidade do
ligante pelo receptor (K
d
) igual a 19,7 x 10
-9
mol/L e o número total de sítios de ligação (B
max
)
de 24,9 fmol/ 1 x 10
6
células (aproximadamente 15.000 sítios por célula).
Uma nova regressão linear foi executada usando o programa GraphPad Prism® 5.0 e a
curva de saturação foi traçada utilizando-se os mesmos valores de ligação específica
para as mesmas concentrações do radioligante. Entretanto, foram considerados dois
sítios de interação (two binding sites) para a
125
I-Crotoxina em células de tumor de
Ehrlich (FIG.30). Foi possível observar uma ligação saturável e específica da
125
I-
Crotoxina, com dois platôs de ligação com valores de K
d
de 24,98 x 10
-9
mol/L e 0,06 x
10
-9
mol/L para sítios de baixa e alta afinidade, respectivamente (TAB.8). A partir da
transformação linear Scatchard destes dados (FIG.31), verificou-se a presença de um
número muito maior de sítios de baixa afinidade para a
125
I-Crotoxina, (B
max
= 27,50
fmol/ 1 x 10
6
cél., aproximadamente 16570 sítios por célula) do que sítios de alta
afinidade (B
max
= 0,35 fmol/ 1 x 10
6
cél., aproximadamente 210 sítios por célula).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
74
0 5 10 15 20 25
0
5
10
15
20
25
30
[
125
I-Crtx] (nmol/L)
Ligação específica
(fmol/1x10
6
cél.)
FIGURA 30: Curva de saturação da ligação específica da
125
I-Crotoxina às células de
tumor de Ehrlich construída a partir da análise de interação com dois sítios específicos. 1
x 10
6
células de tumor de Ehrlich foram incubadas com concentrações crescentes de
125
I-
Crotoxina na faixa de 3 x 10
-12
a 2 x 10
-8
mol/L a 25 °C por 1 hora. A ligação específica foi
determinada pela diferença entre a ligação total e a não-específica medida na presença de um
excesso de 1000 vezes de Crotoxina não marcada.
0 10 20 30
0
2
4
6
8
10
Ligado (fmol/1x10
6
cél.)
Ligado/ Livre
FIGURA 31: Transformação linear Scatchard dos dados da curva de saturação. A análise
através do programa GraphPad Prism® 5.0 dos dados da FIG.30 permitiu a construção da curva
Ligado/Livre versus Ligado, que mostra a interação com dois sítios de ligação. Os valores de K
d
obtidos foram de 24,98 x 10
-9
mol/L e 0,06 x 10
-9
mol/L para sítios de baixa e alta afinidade,
respectivamente. O número de sítios de baixa afinidade para a
125
I-Crotoxina foi igual a 27,50
fmol/ 1 x 10
6
cél. (aproximadamente 16570 sítios por célula) e de alta afinidade foi igual a 0,35
fmol/ 1 x 10
6
cél. (aproximadamente 210 sítios por célula).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
75
TABELA 8: Parâmetros de interação da
125
I-Crotoxina às células de tumor de Ehrlich.
Sítio de ligação*
B
max
K
d
Baixa afinidade
27,50 fmol/ 1x10
6
cél.
(~ 16570 sítios por célula)
24,98 x 10
-9
mol/L
Alta afinidade
0,35 fmol/ 1x10
6
cél.
(~ 210 sítios por célula)
0,06 x 10
-9
mol/L
* considerando dois sítios de interação com o receptor.
5.4.2.2 Estudos de competição
Para evidenciar que a interação da
125
I-Crotoxina com as células de tumor de Ehrlich é
específica, estudos de competição foram conduzidos (Apêndice A, pág. 101). A
interação específica pressupõe um número finito de sítios receptores, portanto
saturáveis. Uma vez saturados, na presença de concentrações crescentes de competidor
os sítios inicialmente ocupados pelo radioligante (
125
I-Crotoxina) passam a ser ocupados
pelo competidor (não radiomarcado) e consequentemente se observa uma redução da
interação da
125
I-Crotoxina. Os resultados demonstraram que a Crotoxina não marcada
competiu com os sítios específicos de
125
I-Crotoxina de maneira dose dependente
(FIG.32). A partir do gráfico mostrado abaixo foi possível calcular a concentração de
Crotoxina necessária para inibir 50% da ligação específica da
125
I-Crotoxina às células
de tumor de Ehrlich, o IC
50
, com valor igual a 9,87 x 10
-12
mol/L. A curva de
competição foi analisada através do Graphpad Prism® 5.0 considerando, inicialmente,
apenas um sítio específico de ligação.
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
76
-18 -16 -14 -12 -10 -8 -6
0
20
40
60
80
100
Log [Crtx] (mol/L)
% Ligação Específica
da
125
I-Crotoxina
FIGURA 32: Curva de competição Crotoxina/
125
I-Crotoxina pelo receptor específico em
células de tumor de Ehrlich considerando interação com apenas um sítio de ligação. As
células foram incubadas com
125
I-Crotoxina (1 x 10
-10
mol/L) na presença ou ausência de
concentrações crescentes (1 x 10
-12
mol/L a 1 x 10
-7
mol/L) de Crotoxina não marcada. A ligação
específica foi determinada pela diferença entre a ligação total e a ligação não específica (cerca
de 70% de ligação específica). Realizou-se a separação da radioatividade ligada às células (B) e
da radioatividade livre (F). O IC
50
encontrado foi igual a 9,87 x 10
-12
mol/L.
Os mesmos resultados obtidos no experimento de competição entre a Crotoxina
radiomarcada e a não marcada foram analisados considerando-se, desta vez, a
possibilidade de interação do polipeptídeo com dois sítios de ligação, sendo um de alta
afinidade e outro de baixa afinidade (FIG.33). A partir do programa foram calculados
dois valores de IC
50
conforme mostrado na TAB.9.
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
77
-16 -14 -12 -10 -8 -6
0
20
40
60
80
100
log [Crtx] (mol/L)
% Ligação Específica
da
125
I-Crotoxina
FIGURA 33: Curva de competição Crotoxina/
125
I-Crotoxina pelo receptor específico em
células de tumor de Ehrlich considerando interação com dois sítios de ligação.
Concentrações crescentes de Crotoxina não marcada (1 x 10
-12
mol/L a 1 x 10
-7
mol/L) foram
pré-incubadas por 15 minutos a 25 °C. Alíquotas de
125
I-Crotoxina (1 x 10
-10
mol/L) foram
adicionadas e após o período de incubação, realizou-se a separação da radioatividade ligada às
células (B) e da radioatividade livre (F).
TABELA 9: Valores do IC
50
calculados para a Crotoxina radiomarcada.
Sítio de ligação*
IC
50
Baixa afinidade
5,33 x 10
-10
mol/L
Alta afinidade
7,44 x 10
-13
mol/L
*considerando dois sítios de interação.
5.4.3 Ensaios de competição para caracterização do sítio de ação específico
da Crotoxina e seu provável mecanismo de ação.
Concentrações crescentes de EGF não marcado foram incubadas com células de tumor
de Ehrlich com o acréscimo de Crotoxina radiomarcada. Não se observou competição
significativa entre a
125
I-Crotoxina e o EGF (FIG.34). Nem mesmo a concentração mais
alta do competidor conseguiu interferir sobre ligação específica da
125
I-Crotoxina, que
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
78
se manteve em torno de 64 ± 11%. O EGF competiu com 20% dos sítios específicos da
125
I-Crotoxina indicando que Crotoxina e EGF compartilham parcialmente sítios
específicos em células de Ehrlich.
Não foi possível calcular a concentração de EGF necessária para reduzir ou inibir em
50% a ligação específica da
125
I-Crotoxina às células de tumor de Ehrlich, o IC
50
. A
curva de competição foi analisada através do Graphpad Prism® 5.0 considerando um
sítio de ligação.
-16 -14 -12 -10 -8 -6
0
20
40
60
80
100
Log [EGF] (mol/L)
% Ligação Específica
da
125
I-Crotoxina
FIGURA 34: Curva de competição da
125
I-Crotoxina com o fator de crescimento
epidérmico (EGF) em células de tumor de Ehrlich. As células foram incubadas com
125
I-
Crotoxina na presença e ausência de concentrações crescentes do EGF. A ligação da
125
I-
Crotoxina na presença do competidor foi determinada em relação à ligação específica. Não foi
possível calcular o IC
50
.
Observando as duas curvas de competição em um mesmo gráfico (FIG.35), é possível
vizualizar que a porcentagem de ligação específica da
125
I-Crotoxina na presença de
diferentes concentrações do competidor EGF é superior àquela observada quando na
presença de Crotoxina não marcada e praticamente constante em torno de 70 ± 13 %.
Isso mostra que o sítio de interação da
125
I-Crotoxina não é o mesmo sítio do fator de
crescimento epidérmico.
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
79
-16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
0
20
40
60
80
100
Crotoxina não marcada
EGF
Log [competidor] mol/L
% Ligação Específica
da
125
I-Crotoxina
FIGURA 35: Comparação entre as curvas de competição demonstrando diferenças no
perfil de interação específica da
125
I-Crotoxina com células de tumor de Ehrlich na
presença de competidores. Concentrações crescentes de (■) Crotoxina não marcada e de (○)
EGF (fator de crescimento epidérmico) foram adicionadas ao tecido e incubadas.
5.5 Avaliação da interação in vivo da
125
I-Crotoxina com células de tumor de
Ehrlich
5.5.1 Biodistribuição da
125
I-Crotoxina – administração via intratumoral e
via endovenosa
Os perfis de biodistribuição da
125
I-Crotoxina administrada via e.v. e i.t. em
camundongos Swiss fêmeas implantados com tumor de Ehrlich são mostrados nas FIG.
36 e 37, respectivamente. Os animais foram sacrificados nos tempos de 2, 10, 30, 60,
180, 360 e 1440 minutos.
A captação pelo tumor da Crotoxina radiomarcada foi máxima no tempo de 30 minutos
após a injeção e.v., com 2,03 ± 0,23 %ID/g, mantendo-se em 1,25 ± 0,28 %ID/g 6 horas
após a injeção, o que indica a retenção do polipeptídeo no tumor.
Os resultados sugerem que a maior concentração de
125
I-Crotoxina no sangue quando
injetada via e.v. foi alcançada no tempo de 30 minutos (5,55 ± 0,31 %ID/g) e em
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
80
seguida foi reduzida gradativamente, tornando-se próxima de zero no tempo de 1440
minutos (0,62 ± 0,08 %ID/g). Já para a biodistribuição i.t., o perfil de biodistribuição foi
diferente, apresentando concentração máxima no sangue em 180 minutos (3,25 ± 0,69%
ID/g) com redução até 0,74 ± 0,27 %ID/g após 24 horas.
A administração intratumoral levou a uma menor captação no cérebro e cerebelo em
relação à endovenosa, sendo máxima 60 minutos após injeção intratumoral (0,18 ± 0,08
e 0,17 ± 0,03 %ID/g, no cérebro e cerebelo respectivamente) e máxima 2 minutos após
administração endovenosa (0,26 ± 0,05 e 0,29 ± 0,04 %ID/g, no cérebro e cerebelo
respectivamente). Apesar das baixas concentrações nesses órgãos, observa-se uma
captação relevante, pois se trata de uma neurotoxina. Uma vantagem apresentad é que a
depuração é rápida: em 60 minutos a concentração é aproximadamente 5 vezes menor
para ambos os casos estudados.
Sangue
Tireóide
Coração
Pulmões
Fígado
Baço
Pâncreas
Rins
Intestino
Músculo
Cérebro
Cerebelo
Ap. Rep.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
2 min.
10 min
30 min.
60 min.
180 min.
360 min.
1440 min.
% DI/g
FIGURA 36: Perfil de biodistribuição da
125
I-Crotoxina injetada via endovenosa para
avaliação da interação in vivo do polipeptídeo com células de tumor de Ehrlich.
Biodistribuição Endovenosa
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
81
Sangue
Tireóide
Coração
Pulmão
Fígado
Baço
Pâncreas
Rins
Intestino
Músculo
Cérebro
Cerebelo
Ap. rep.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
2 min.
10 min
30 min.
60 min.
180 min.
360 min.
1440 min.
% ID/g
FIGURA 37: Perfil de biodistribuição da
125
I-Crotoxina injetada via intratumoral para
avaliação da interação in vivo do polipeptídeo com células de tumor de Ehrlich.
Foi possível observar uma razão de captação tumor/sangue crescente até 6 horas após a
administração, sendo que 30 minutos após a injeção o valor da razão já era mais de 12
vezes maior que a captação em 2 minutos. Em relação à razão de captação
tumor/músculo, observa-se um valor crescente até 3 horas, seguido de uma redução
lenta que atinge um valor próximo de 11, 24 horas após injeção. Uma captação
diferenciada pelo tumor é constatada através da razão tumor/pata normal maior que 1
(um) em todos os tempos analizados. Além disso, uma razão de 11 vezes foi encontrada
para o tumor em relação ao osso no tempo de 3 horas após administração da
125
I-
Crotoxina. Todos os valores de razão da captação são apresentados na TAB. 10.
Biodistribuição Intratumoral
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
82
TABELA 10: Razão da captação de
125
I-Crotoxina calculada entre o tumor e diferentes
órgãos/tecidos, a partir dos dados de %ID/g em cada tempo avaliado após a administração
endovenosa.
Razão de captação
2 min
10 min
30 min
1 h
3 h
6 h
24 h
Tumor/ Músculo
3,14
6,45
7,1
12,77
18,55
13,59
10,95
Tumor/ Pata
normal
1,19
1,74
1,62
1,72
1,93
3,14
1,87
Tumor/ Osso
0,45
4,86
4,59
5,33
10,84
9,03
5,41
5.5.2 Biodistribuição após competição in vivo entre a
125
I-Crotoxina e a
Crotoxina não marcada
Para realização de estudos de competição in vivo, foram admnistrados (e.v.) 100 µL de
Crotoxina (em excesso) e após 30 minutos, 200 µL de
125
I-Crotoxina (2,03 x 10
4
Bq) via
e.v. em camundongos com tumor de Ehrlich na pata. Nesse estudo de competição foram
avaliados: sangue, urina, tireóide, rins, músculo, pata normal, pata com tumor. O tumor
apresentou captação reduzida em cerca de 50% (FIG.38).
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
83
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
125
I-Crotoxina
125
I-Crotoxina + Crotoxina
% DI/g de tumor
FIGURA 38: Captação de
125
I-Crotoxina pelo tumor quando na presença ou ausência de
Crotoxina não marcada, ambas administradas via endovenosa em camundongos com
tumor de Ehrlich em tempos diferentes. 30 minutos após a injeção da Crotoxina não marcada
(em excesso), 2,03 x 10
4
Bq de
125
I-Crotoxina foram administrados via endovenosa. A
competição foi avaliada após 30 minutos de interação. Um bloqueio de cerca de 50% da ligação
da Crotoxina radiomarcada foi observado (n=3; *p< 0,01).
5.6 Imagem SPECT in vivo da
131
I-Crotoxina
Os resultados obtidos nos estudos de biodistribuição da
125
I-Crotoxina em animais com
tumor de Ehrlich, demonstraram o potencial da Crotoxina para detecção de sítios
tumorais in vivo, e permitiram a avaliação do melhor tempo para captação da molécula
radiomarcada pela região tumoral. A
131
I-Crotoxina foi administrada via intratumoral
(1,85 x 10
6
Bq) e via endovenosa (7,4 x 10
6
Bq) em camundongos com tumor de
Ehrlich para verificação da biodistribuição e captação no tumor. Após anestesia os
animais foram posicionados e fixados de forma a garantir a completa imobilização,
necessária para a perfeita aquisição da imagem SPECT. Imagens ventrais de corpo
inteiro foram adquiridas em Gama Câmara GE Healthcare Millenium. O tempo de
aquisição das imagens foi de 10 minutos e elas foram obtidas 30 minutos após a injeção
(por vias i.t. e e.v.) de
131
I-Crotoxina (FIG.39). Com o objetivo de avaliar a captação
tardia da
131
I-Crotoxina no tumor, anestesiaram-se novamente os mesmos animais pra
obtenção de imagem 72 horas após a injeção (FIG.40). As imagens foram reconstruídas,
processadas e analisadas através do programa Xeleris.
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
84
FIGURA 39: Imagem planar de corpo inteiro de camundongos com tumor de Ehrlich na
pata 30 minutos após administração de 7,4 x 10
6
Bq de
131
I-Crotoxina (A) via endovenosa e
de 1,85 x 10
6
Bq de
131
I-Crotoxina (B) via intratumoral. Em amarelo estão as regiões com
maior captação e em verde as regiões com captação inferior. Destaque para a pata com tumor
(circulada em A e em B), mostrando a captação específica no tumor após a injeção de
131
I-
Crotoxina.
FIGURA 40: Imagem planar de corpo inteiro de camundongos com tumor de
Ehrlich na pata 72 horas administração via (A) endovenosa e (B) intratumoral do
radiotraçador
131
I-Crotoxina. Em amarelo e roxo estão as regiões com maior captação e em
verde as regiões com captação inferior. Destaque para a pata com tumor (circulada em A e em
B), mostrando a captação específica no tumor após a injeção de
131
I-Crotoxina. As setas indicam
provável captação de
131
I na tireóide.
A
A
B
B
Resultados
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
85
Iodo-131 puro foi administrado via intratumoral e via endovenosa em camundongos
com tumor de Ehrlich para verificação da captação tardia para comparar com a imagem
da Crotoxina radiomarcada. A imagem obtida 72 horas após a injeção do iodo-131 livre
(FIG. 41) mostrou um pequeno acúmulo na tireóide, característico do elemento iodo, e
na bexiga, devido à eliminação renal do radioisótopo em solução salina. Observou-se
ainda uma pequena captação no tumor quando o radiotraçador foi administrado via
intratumoral.
FIGURA 41: Imagem SPECT 72 horas após a injeção de do iodo-131 puro (7,4 x 10
6
Bq),
admnistrado via endovenosa (A) e via intratumoral (B), como imagem controle. Houve
captação pela tireóide em (A) e (B), captação fisiológica por se tratar de iodo. Em (A), observa-
se um acúmulo na bexiga, mostrando a via de excreção. Em (B) a pata mostra captação residual
de
131
I pelo tumor.
A comparação entre as FIG.40 e FIG.41 permitiu avaliar o perfil de biodistribuição da
131
I-Crotoxina que se mostrou diferente do perfil observado para o iodo-131 puro.
Entretanto, após injeção intratumoral, houve captação no tumor em ambos os casos
sugerindo a presença de
131
I-Crotoxina e de
131
I livre, possível produto de degradação da
molécula marcada, sem proporções exatas definidas.
Discussão
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
86
6 DISCUSSÃO
O câncer é uma das maiores causas de mortes no mundo, sendo responsável por cerca
de 13% dos óbitos em 2007, e estima-se que em 2030 esse número será equivalente a 12
milhões (American Cancer Society, 2008). No Brasil, as estimativas de novos casos de
câncer também aumentam a cada ano e entre os tipos de tumores mais incidentes
destacam-se o câncer de mama e de colo do útero, no sexo feminino, acompanhando o
mesmo perfil da magnitude observada no mundo (INCA, 2009).
O diagnóstico precoce do câncer permite intervenções locais, detecção de focos
potencialmente invasivos, alteração do curso natural da doença através do bloqueio do
crescimento maligno, tratamento mais efetivo e maior qualidade de vida para o paciente
(EYRE et al, 2000). A mamografia é uma técnica muito sensível e de uso consagrado
para diagnóstico de possíveis tumores de mama. Entretanto, é essencial acrescentar na
rotina clínica técnicas avançadas de obtenção de imagens de elevada resolução como a
tomografia por emissão de fóton único (SPECT) e a tomografia por emissão de
pósitrons (PET). Estas não são ferramentas usuais na detecção de tumores de mama,
mas são apropriadas para determinados pacientes, geralmente após a realização dos
exames convencionais (BOSSCHE & WIELE, 2004; MANKOFF, 2005).
Assim como a Crotoxina, diversos produtos naturais com potencial antitumoral têm sido
explorados para utilização como agentes terapêuticos e de diagnóstico (SOROCEANU
et al, 1998; SHEN et al, 2005; SOPRANI, 2008). Radiofármacos são aplicados para
vizualizar ou tratar determinados tipos de câncer, especialmente aqueles que agem de
forma mais significativa e intensa sobre a superfície de células tumorais com
características peculiares, como a presença de receptores superexpressos. O
desenvolvimento de protótipos dessas moléculas permite avanços na medicina nuclear
no que diz respeito a imagem molecular e tratamento de tumores.
O tumor de Ehrlich é um tipo de carcinoma murino espontâneo, originalmente mamário,
adaptado para a forma ascítica (DAGLI, GUERRA & SALDIVA, 1992), que neste
trabalho serviu de modelo para estudos de interação in vitro e in vivo. Os experimentos
de citotoxicidade evidenciaram que a Crotoxina foi tóxica para as células tumorais de
Ehrlich. O valor da DL
50
in vitro, 9,54 x 10
-7
mol/L, obtido a partir da curva de
porcentagem de células sobreviventes em relação ao controle confirma o efeito da
Discussão
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
87
Crotoxina a medida que se aumenta a concentração do polipeptídeo. Por outro lado, não
foi observado efeito significativo sobre a linhagem de MCF-7.
Vários autores relataram que peptídeos de peçonhas animais têm demonstrado em
experimentos in vitro, que desempenham importantes papéis na regulação de diversos
tipos de câncer, sugerindo que o tratamento por períodos longos pode reduzir, ou
mesmo bloquear o crescimento tumoral (SOROCEANU et al, 1998; SHEN et al, 2005;
SOPRANI, 2008). Em um estudo recente observou-se a viabilidade celular de MCF-7 in
vitro na presença da fosfolipase A2 extraída do veneno de abelha. Entretanto, sobre essa
linhagem, o efeito anti-tumoral só foi significativo em altas concentrações da enzima
(IC
50
igual a 309 µg/mL), mantendo-se em aproximadamente 80% até 100 µg/mL
(FERGUSON & DUNCAN, 2009), assim como o observado neste trabalho para a
Crotoxina.
O acompanhamento das alterações morfológicas nas linhagens tumorais pelo tratamento
com Crotoxina evidenciou alterações no grupo de células de Ehrlich observadas pela
redução do número de células, arredondamento e mudança na forma original das
células. As células de MCF-7 foram resistentes ao tratamento, sem alterações
morfológicas visíveis ou redução do número de células. Outros testes devem ser
realizados para determinar com maior precisão o mecanismo pelo qual se dá o efeito
citotóxico da Crotoxina sobre as linhagens estudadas, tais como citometria de fluxo,
coloração com anexina/PI, testes para detecção de caspases, etc.
A atividade citotóxica da Crotoxina sobre diversas linhagens tumorais humanas e
murinas tem sido descrita por muitos autores (CURA et al, 2002; YAN et al, 2006;
SOARES, 2007). Brigatte demonstrou em 2005 que a Crotoxina promoveu inibição do
crescimento em células de carcinossarcoma mamário in vivo, sem causar alterações
histopatológicas nos animais analisados. Linhagens humanas tais como HS87T,
carcinoma ductal mamário e Lu-1, adenocarcinoma pulmonar foram sensíveis ao efeito
da Crotoxina (RUDD et al, 1994), que também inibiu a viabilidade de células K562
(células de leucemia crônica) quando incubadas em doses de 50µg/ml por 72 horas
(YAN et al, 2006). Alguns estudos comprovaram a ação antitumoral desse polipeptídeo
também sobre células murinas; entre elas, eritroleucêmicas (CORIN et al, 1993).
Discussão
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
88
A Crotoxina possui uma subunidade CA ou crotapotina (não-enzimática) e outra
subunidade, CB, uma fosfolipase A
2
(HABERMANN & BREITHAUPT, 1978). A
interação do polipeptídeo ocorre quando o complexo (subunidades A+B) reconhece um
sítio de ligação específico nas membranas alvo e a subunidade CB permanece ligada
enquanto CA se desprende no meio. O efeito farmacológico depende atividade
fosfolipásica da Crotoxina (MARLAS & BON, 1982); entretanto, essa atividade não
explica o mecanismo de ação antitumoral da Crotoxina que não é bem esclarecido
apesar da sua eficácia comprovada sobre tumores (MARLAS & BON, 1982;
NEWMAN et al, 1993).
Para entender melhor o mecanismo de ação de novos fármacos e estudo do seu potencial
uso para tratamento e diagnóstico dos mais diversos distúrbios é importante determinar
parâmetros de biodistribuição e de interação. A partir da Crotoxina, dois radiotraçadores
foram sintetizados com alta eficiência (80-95% de rendimento) e atividade específica
bastante satisfatória, 31 TBq/mmol (848,3 Ci/mmol) para
125
I-Crotoxina e 110
TBq/mmol (2971,2 Ci/mmol) para
131
I-Crotoxina. De acordo com Bossche & Wiele
(2004), para obtenção de imagens é desejável que o radiofármaco apresente alta
atividade específica. A partir dos resultados obtidos relativos quanto a este parâmetro,
podemos dizer que a
131
I-Crotoxina apresenta elevado potencial radiofarmacêutico.
Após a reação de marcação o polipeptídeo radiomarcado foi utilizado para ensaios de
interação e biodistribuição quando marcados com
125
I, e para aquisição de imagem
SPECT quando marcados com
131
I, dando continuidade ao seu estudo como
radiofármaco.
Os ensaios de interação levam ao conhecimento da comunicação intracelular que ocorre
entre ligantes e receptores celulares de todo o organismo. Uma vez que células tumorais
são caracterizadas pela proliferação e crescimento celular descontralados, é crescente o
interesse por peculiaridades como a presença de receptores com expressão aumentada
(WEINER & THAKUR, 2005). Neste trabalho atenção especial foi dada ao receptor do
fator de crescimento epidérmico (EGFR), uma glicoproteína transmembrana cuja
ativação desencadeia processos responsáveis pelo crescimento e progressão de tumores,
incluindo proliferação e maturação, angiogênese, invasão, metástase e inibição da
apoptose (ROCHA-LIMA et al, 2007). Muitos tipos de tumores superexpressam EGFR,
incluindo carcinomas mamário, pulmonar, gástrico, pancreático, de bexiga, ovariano,
prostático e gliomas (SALOMON et al, 1995). Utilizando as células de tumor de Ehrlich
Discussão
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
89
como modelo de estudo da interação da Crotoxina, direcionamos o foco do trabalho
para tumores de origem mamária.
Células de Ehrlich foram incubadas com
125
I-Crotoxina na presença ou ausência de um
excesso de 1000 vezes do ligante não-marcado. A
125
I-Crotoxina apresentou
aproximadamente 70% de ligação específica em tumor de Ehrlich e 37% em MCF-7,
dado que ajuda a entender o maior efeito citotóxico do polipeptídeo sobre a linhagem
murina de Ehrlich.
O acompanhamento da interação ao longo do tempo, considerando a ligação total,
específica e não específica, mostrou que não mais que 10% da radioatividade total
adicionada permanece associada às células, minimizando possíveis efeitos de depleção
do ligante ao longo dos ensaios de saturação e de competição, conforme tratado por
Hulme e Birdsall (1992).
125
I-Crotoxina competiu com a Crotoxina não marcada,
sugerindo manutenção das propriedades após radiomarcação. A caracterização da
interação revelou que deve haver dois sítios de interação para a Crotoxina em Ehrlich,
sendo um de baixa afinidade e outro de alta afinidade.
O EGF provocou efeito pouco significativo sobre a interação da
125
I-Crotoxina com
seus sítios específicos, inibindo a ligação em menos de 20%. O EGF competiu com
20% dos sítios específicos da
125
I-Crotoxina indicando que Crotoxina e EGF
compartilham parcialmente sítios específicos em células de Ehrlich, provavelmente sítio
de baixa afinidade conforme a constante de afinidade obtida para ensaios com EGF e
com a Crotoxina (TAB.11).
Discussão
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
90
TABELA 11: Comparação entre os parâmetros definidos para os receptores de EGF e
para os receptores específicos de Crotoxina em células de tumor de Ehrlich.
Parâmetro
Receptores de EGF*
Receptores de Crotoxina**
K
d
(alta afinidade)
1,7 nmol/L
0,06 nmol/L
K
d
(baixa afinidade)
24 nmol/L
24,98 nmol/L
Número de receptores
de alta afinidade
48000 sítios/ célula
210 sítios/ célula
Número de receptores
de baixa afinidade
275000 sítios/ célula
16570 sítios/ célula
* Dados (ELEXPURU et al, 2004) ** Dados do presente trabalho
O veneno de C. durissus terrificus e a sua principal toxina, a Crotoxina, provocam
reorganização da actina em macrófagos e inibem a fosforilação de proteínas tirosina
quinase (fosfotirosina) (SAMPAIO et al, 2006). Essa afirmação pode ajudar a esclarecer
porque a Crotoxina apresenta maior efeito antitumoral em células que superexpressam
EGFR, uma vez que a ligação direta do polipeptídeo a esse receptor é baixa. O receptor
de EGF é ativado através da fosforilação de resíduos de tirosina do domínio intracelular
pela proteína quinase desencadeando um processo de transdução de sinais para gerar o
efeito.
Para avaliar o perfil de biodistribuição e a capacidade de interação com tumores in vivo,
a
125
I-Crotoxina foi administrada via endovenosa e via intratumoral em diferentes
grupos de animais com tumor de Ehrlich. Este modelo animal é bastante utilizado na
oncologia experimental, pois permite o conhecimento prévio da quantidade e
características iniciais das células tumorais inoculadas, e possui um desenvolvimento
rápido, o que diminui os tempos de estudo (SILVA et al, 2004).
Através do experimento de biodistribuição é possível avaliar o potencial uso da
Crotoxina como radiofármaco para diagnóstico de tumores. A baixa captação da
125
I-
Crotoxina no cérebro e cerebelo é um ponto importante uma vez que a Crotoxina é
neurotóxica e seus efeitos já foram descritos e comprovados (CURA et al, 2002). Os
dados revelaram eliminação renal do polipeptídeo radiomarcado.
Discussão
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
91
No coração a maior captação foi observada 2 minutos após administração e.v. , sendo
igual a 2,50 ± 0,26 %ID/g, com depuração rápida atingindo 0,51 ± 0,03 %ID/g na
primeira hora de biodistribuição. Possíveis efeitos colaterais cardíacos podem estar
relacionados à alta concentração da droga no tecido no instante inicial. Estudos sugerem
que a Crotoxina provoca uma redução da força contrátil do coração devido,
provavelmente, à liberação de ácidos graxos e à danos celulares (SANTOS et al, 1990).
A maior concentração de
125
I-Crotoxina no sangue após injeção via e.v. atingiu níveis
próximos de zero no tempo de 1440 minutos (0,62 ± 0,08 %ID/g). Já para a
biodistribuição i.t., o perfil foi diferente, apresentando concentração máxima no sangue
em 180 minutos (3,25 ± 0,69 %ID/g) com redução até 0,74 ± 0,27 %ID/g após 24 horas.
A rápida depuração plasmática é uma característica favorável para aquisição de
imagem, uma vez que baixas concentrações sanguíneas da molécula reduzem o
background (radiação de fundo) nas imagens.
A estabilidade in vivo do polipeptídeo radiomarcado foi confirmada até 24 horas pelo
acompanhamento da captação pela tireóide. Os níveis de %ID/g na tireóide, principal
orgão captante de iodo, foram mantidos baixos sugerindo que a Crotoxina não se
desligou do iodo-125.
Uma desvantagem da Crotoxina como agente antitumoral para diagnóstico e terapia de
um câncer de mama, por exemplo, é o fato de ser um polipeptídeo e apresentar uma
longa sequência de aminoácidos que somam 24000 Da. Entretanto, seu potencial
radiofarmacêutico deve continuar sendo explorado devido às propriedades favoráveis
apresentadas neste trabalho. O estudo da sequência de aminoácidos e a síntese em
laboratório deste polipeptídeo ou parte dele é um passo seguinte à pesquisa de seus
efeitos in vitro e in vivo. Modificações químicas foram realizadas e demonstraram
resultados favoráveis à aplicação clínica da molécula, tais como a redução da
miotoxicidade, letalidade e redução das atividades anticoagulante e indutora de edema
(SOARES et al, 2001).
Utilizando um grande número de estratégias sintéticas é possível desenvolver análogos
radioativos de peptídeos naturais com propriedades nucleares adequadas para o uso
como radiofármacos. Além disso, é possível direcionar estudo para obtenção de
análogos com afinidade e especificidade consideradas ideais por receptores específicos
Discussão
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
92
e com efeitos biológicos alterados de forma a aperfeiçoar a biodistribuição destes
radiofármacos baseados em peptídeos. Um exemplo é um radiofármaco análogo da
somatostatina, o
111
In-DTPA octreotide (Octreoscan®) aplicado para descrição de
lesões presentes em estruturas contendo receptores de somatostatina (SHAPIRO, 1996).
Apesar das propriedades de biodistribuição e interação da Crotoxina com tumores serem
favoráveis, deve-se lembrar que esse polipeptídeo possui uma DL
50
in vivo igual a 0,13
mg/Kg (NOVAIS, 2006). Mesmo que em quantidades traços, é ideal que essa
toxicidade seja sempre a menor possível sem que a atividade antitumoral seja afetada.
Dessa forma, os resultados deste trabalho indicam o potencial radiofarmacêutico de
Crotoxina para o desenvolvimento. Sendo assim, em trabalho recente, Ferguson &
Duncan (2009) conseguiram através de um conjugado dextrina-PLA
2
reduzir a
toxicidade sistêmica de uma enzima fosfolipásica de veneno de abelha sem alterar
significativamente sua ação contra determinadas linhagens tumorais. Observou-se ainda
uma relação parcial do efeito do conjugado e do status de EGFR nas células testadas.
Todo o estudo foi realizado utilizando PLA
2
de veneno de abelha, mas fazendo um
paralelo com a subunidade fosfolipásica da Crotoxina.
O efeito citotóxico das fosfolipases A
2
a nível celular ocorre, teoricamente, de maneiras
diferentes: provocam danos diretos na membrana, inibem a ligação do EGF, modulam a
atividade de enzimas tirosina quinase e degradam a membrana de lisossomas e
endossomas (FERGUSON & DUNCAN, 2009).
Outro ponto importante é que as peçonhas de serpentes são constituídas por várias
substâncias biologicamente ativas (RANGEL-SANTOS et al, 2004) que podem
contribuir mais ou menos com o efeito citotóxico do veneno bruto. Soares em 2007
concluíram que a peçonha da serpente Crotalus durissus terrificus é um efetivo agente
antitumoral para determinadas linhagens. Como a Crotoxina representa cerca de 70% da
sua massa total (DA SILVA et al, 1981 - citado por: DOS SANTOS et al, 1992) é
possível supor que outro polipeptídeo constituinte do veneno apresenta maior efeito
antitumoral ou que a Crotoxina sozinha não atua de maneira muito efetiva.
Conclusões
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
93
7 CONCLUSÕES
A Crotoxina apresentou atividade antitumoral contra células de tumor de
Ehrlich, carcinoma murino de origem mamária, porém as células de tumor
mamário humano MCF-7 foram resistentes ao tratamento com as mesmas
quantidades de Crotoxina.
Radiotraçadores foram sintetizados com sucesso a partir da Crotoxina utilizando
os radionuclídeos
125
I e
131
I.
O processo de síntese foi de alta eficiência e os produtos,
125
I-Crotoxina e
131
I-
Crotoxina, apresentaram elevada atividade específica (31 TBq/mmol e 110
TBq/mmol, respectivamente).
A
125
I-Crotoxina se manteve estável por até 24 horas após marcação quando
incubada em soro bovino (pH 7,4) a 37 °C.
Observou-se capacidade de captação de Crotoxina de maneira diferencial entre
tumores e tecidos normais.
Existem sítios específicos para Crotoxina em células tumorais de Ehrlich e em
MCF-7; entretanto, a expressão de sítios específicos é maior em Ehrlich do que
em MCF-7, justificando o menor efeito sobre a linhagem humana.
A caracterização da interação revelou que deve haver dois sítios de interação
para a Crotoxina em Ehrlich, sendo um de baixa afinidade e outro de alta
afinidade.
Não houve interação direta da Crotoxina com o EGFR uma vez que quando na
presença do ligante específico, EGF, a ligação específica da Crotoxina às células
manteve-se praticamente estável.
Os resultados indicam que a Crotoxina é promissora na detecção de sítios
tumorais in vivo pela técnica SPECT e que pode ser um protótipo importante no
desenvolvimento de peptídeos pequenos com propriedades ainda mais
favoráveis.
Perspectivas
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
94
8 PERSPECTIVAS
Avaliar a competição da Crotoxina com outras moléculas específicas de
receptores envolvidos com a multiplicação celular.
Estudar a ligação utilizando um análogo da Crotoxina com fluoreto-18F para
realização de imagem PET em camundongos.
Aprofundar os conhecimentos em relação ao tipo de interação da Crotoxina
com outros tipos de tumores.
Desenvolver novas formas farmacêuticas da
125
I-Crotoxina utilizando a
nanotecnologia para aprimorar a farmacocinética e farmacodinâmica do
produto radiomarcado.
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Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
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9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Apêndices
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
102
APÊNDICE A – Princípios dos ensaios de interação Ligante-Receptor – Binding
Um ensaio de interação permite a caracterização de novos ligantes radiomarcados
(radioligantes), de seus receptores presentes no tecido analisado e da ligação receptor-ligante.
Trata-se de um mecanismo de detectar e estudar receptores celulares, mesmo quando presentes
em concentrações muito baixas, utilizando-se moléculas radioativas de alta afinidade e elevado
grau de seletividade pelo alvo em estudo (HULME & BIRDSALL, 1992).
O efeito da radiomarcação sobre as propriedades de um ligante nem sempre é bem definido. A
seletividade e especificidade da nova molécula quando ligada um radionuclídeo é testada in
vitro utilizando ensaios de saturação e competição. Programas computacionais auxiliam na
seleção e análise de um modelo apropriado construído a partir dos dados obtidos
experimentalmente, gerando valores de parâmetros de ligação.
Idealmente, um ligante radiomarcado para ser aplicado em ensaios de interação deve apresentar
elevada atividade específica, baixa ligação não-específica e alta afinidade e especificidade pelo
receptor.
Geralmente, assume-se a lei de conservação de massa para a interação entre o ligante (L) e o
receptor (R) que está livre para formar um complexo receptor-ligante (RL), conforme
representado pelo esquema abaixo. A quantidade de complexos RL pode ser determinada pela
medida da radioatividade quando a molécula de interesse é um radioligante, como um
radiofármaco (HULME & BIRDSALL, 1992).
[L] + [R]
[RL]
[RL] RESPOSTA
O período de incubação é determinado por um tempo t necessário para permitir o equilíbrio
(completa ligação) alcançado entre o ligante e o receptor, quando mantidos a temperatura
constante. Teoricamente, o perfeito equilíbrio é atingido quando t é infinito, porém, um valor
finito suficiente para a formação do complexo RL deve ser estabelecido. O processo de
centrifugar as células e lavá-las com tampão após o período de incubação interrompe o
Apêndices
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
103
equilíbrio e separa o radioligante que permaneceu livre daquele que se ligou. O radioligante que
não interage com o receptor é denominado “livre” (F, free). Através da subtração do total de
radioligante adicionado pela quantidade de radioligante ligado (B, bound) tem-se o valor de F.
B + F = TOTAL
Radioligantes podem interagir com sítios específicos e não-específicos. A especificidade deve-
se ao fato de as superfícies do ligante e do receptor serem complementares. Para determinar a
porcentagem de ligação específica, utiliza-se a seguinte técnica: o ligante não marcado é
adicionado em excesso (100 a 1000 vezes) para ligação e saturação dos receptores específicos.
Em seguida, adiciona-se o radioligante que irá interagir com os sítios não específicos. Retira-se
todo droga livre e faz-se a leitura da radioatividade correspondente ao radioligante que, neste
caso, fornecerá a quantidade de ligação não-específica formada pela droga em estudo. Em
paralelo, deve-se determinar o total de ligações do radioligante com o receptor, sem adição de
droga não marcada. E finalmente, subtrair ligação total menos não-específica, para determinar
ligação específica (DAVENPORT & RUSSELL, 1996).
T – NE = E
A partir da determinação da ligação específica é possível estudar mais detalhadamente como
ocorre a interação do ligante em várias concentrações diferentes, na presença ou ausência de
competidores. Os dois principais métodos usados para caracterização da interação de um ligante
com o receptor são os ensaios in vitro de saturação e de competição.
Ensaio de Saturação
O objetivo de estudos de saturação é medir a captação do radioligante pelo receptor específico
no equilíbrio, determinando a afinidade e densidade do receptor. A partir de concentrações
crescentes do radioligante é possível definir a quantidade desta molécula necessária para saturar
os receptores. Podem ser calculados dois parâmetros importantes:
Apêndices
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
104
K
d
= constante de dissociação do radioligante no equilíbrio, que mede a força da
interação do ligante ao seu receptor. É a concentração do radioligante na qual 50% dos
receptores estão ocupados.
K
d
= - K
1
= [L] [R]
K
1
[LR]
B
max
= número total de receptores expressos nas células.
Baixos valores de K
d
indicam elevada afinidade in vitro do radioligante pelo receptor e sugerem
uma boa eficácia na utilização destes como traçadores in vivo. Valores de K
d
igual ou menor a 1
nmol/L geralmente sugerem uma interação de alta afinidade entre ligante e o receptor, enquanto
que K
d
igual a 1 µmol/L indica baixa afinidade pelo receptor (DAVENPORT & RUSSELL,
1996).
Em geral, estudos de saturação se baseiam na incubação de um número fixo de células que
expressam o receptor a ser estudado com várias concentrações do radioligante de interesse por
um período de tempo necessário para atingir o equilíbrio. Após processos de lavagem,
determina-se a radioatividade associada às células ao separar o radioligante livre (F) e o ligado
(B). Para determinação da ligação não-específica do radioligante com outras proteínas e
lipídeos, por exemplo, é realizada a incubação do radioligante com as células na presença de um
excesso (100 a 1000 vezes) do ligante não marcado para saturar o receptor (BIGGOT-
HENNKENS et al, 2008).
Uma curva de saturação é gerada a partir dos dados de ligação específica versus a concentração
do radioligante. A análise de regressão não-linear dos dados da curva de saturação permite obter
os valores de K
d
e B
max
(FIG.42).
Apêndices
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
105
FIGURA 42: Modelos de curvas obtidas a partir de um ensaio de saturação. (A) Exemplo de uma
isoterma de saturação da ligação de um radioligante ao seu receptor. (B) Efeito da concentração do
radioligante sobre a ligação não específica. (C) Análise Scatchard da curva de saturação para
determinação de K
d
e B
max
(Fonte: BIGGOT-HENNKENS et al, 2008).
Quatro exigências devem ser observadas para que se possa partir para a análise dos resultados:
A reação deve estar em equilíbrio, ou seja, as constantes de ligação e de dissociação
devem ser iguais.
Não deve haver depleção do ligante; menos que 10% da radioatividade total adicionada
deve permanecer associada ao tecido (GOLDSTEIN & BARRET, 1987; HULME &
BIRDSALL, 1992).
A ligação específica ao receptor na superfície das células deve ser significativamente
maior que a ligação não-específica a qualquer componente do sistema.
Para calcular-se o Bmax com confiança, a ligação específica deve ser medida quando o
ligante estiver em uma concentração tal que atinja o plateau de saturação.
O ligante pode se ligar a um ou mais sítios de interação com diferentes afinidades por cada um
ou com coperatividade negativa.
É possível adotar dois modelos matemáticos para análise dos resultados obtidos a partir dos
ensaios de interação considerando ou não o efeito de depleção do ligante. De acordo com este
último, não mais que 10% da radioatividade total adicionada deve permanecer associada às
células, minimizando possíveis efeitos de depleção do ligante ao longo do ensaio. A condição
de depleção é quando a concentração do radioligante é muito menor que a de sítios receptores, o
que prejudica a acurácia dos parâmetros determinados (HULME & BIRDSALL, 1992).
Tubos contendo células em solução tampão são incubados com o radioligante e após diferentes
períodos de incubação passam por processo de centrifugação. O sobrenadante e o pellet são
Apêndices
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
106
coletados para contagem da radioatividade e determinação da porcentagem de radioligante livre
e de radioligante ligado, respectivamente, calculadas em relação ao total de radioligante
adicionado inicialmente. A verificação é feita a partir de um experimento simples, mas os
resultados são de extrema impotância para continuidade do trabalho e análise dos resultados.
Ensaio de Competição
São ensaios baseados na competição entre um ligante marcado e um não marcado por um sítio
de ligação em um receptor específico. Primeiramente, o ligante não marcado é incubado com o
tecido até que o equilíbrio de ligação seja atingido. O objetivo é obter o valor de IC
50
, ou seja,
determinar a concentração do ligante de interesse necessário para reduzir a ligação específica do
radioligante em 50% (FIG.43). Quanto menor o IC
50
, maior a afinidade do ligante pelo receptor,
desde que uma baixa concentração desse ligante tenha sido utilizada para competir com o
radioligante.
As células são incubadas com concentrações crescentes do ligante não marcado para que o
equilíbrio de ligação seja atingido. Em seguida, ocorre a adição do uma concentração fixa do
radioligante e sua incubação até que haja um equilíbrio entre o próprio radioligante e os sítios
de ligação que permaneceram livres após o primeiro passo. Finalmente é feita a separação do
ligante que está livre do que permaneceu ligado. A equação usada para ensaio de competição
está relacionada à quantidade de radioligante ligado (B), do radioligante livre (F) e da
concentração total do ligante e do competidor.
FIGURA 43: Modelo de curva de competição mostrando o IC
50
, a concentração do competidor que
inibe 50% da interação do ligante.
Apêndices
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
107
APÊNDICE B - Obtenção de (
18
F) fluoreto com qualidade garantida para marcação da
Crotoxina
Uma das perspectivas deste trabalho era disponibilizar o radionuclídeo
18
F e utilizá-lo como
marcador da Crotoxina, uma vez que radiofármacos emissores de pósitrons são de grande
interesse devido à sensibilidade e maior resolução da técnica de obtenção de imagens PET e
para o diagnóstico de tumores.
Primeiramente, para alcançar o objetivo, o
18
F-fluoreto a ser produzido na Unidade de Produção
e Pesquisa de Radiofármacos do CDTN deveria ser disponibilizado para a síntese de novos
fármacos radiomarcados atendendo aos requisitos de qualidade, confirmados a partir de
metodologias de controle físico-químico, biológico e microbiológico. Em paralelo aos estudos
do mecanismo de ação da Crotoxina, algumas etapas para disponibilizar o fluoreto-18F foram
executadas.
O íon
18
F-fluoreto (
18
F
-
) foi produzido no Cíclotron PETtrace GE
®
de 16,5 MeV da UPPR do
CDTN e todo o controle de qualidade foi realizado garantindo a obtenção do radionuclídeo na
forma de fluoreto de sódio-18F (Na
18
F), ideal para reações de radiomarcação de diversas
moléculas. Entretanto, após estudos quanto aos métodos de fluorinação de peptídeos, concluiu-
se que as técnicas de marcação indireta utilizando diferentes grupos prostéticos têm sido
aplicadas com mais sucesso para reações com biomoléculas como proteínas e peptídeos. Pelo
contrário, a marcação direta destas moléculas complexas por métodos rápidos usando
18
F não
ocorrem com alta eficiência e é objeto de estudo em vários laboratórios.
A segunda etapa do projeto de mestrado, marcação da Crotoxina com o radioisótopo
18
F, não foi
finalizada, mas o grupo de pesquisa de desenvolvimento de novos radiofármacos do CDTN dará
continuidade ao trabalho atuando na síntese de um “braço de carbono” que servirá como
intermediário na ligação de peptídeos e outras moléculas ao (
18
F) fluoreto.
Em anexo estão, além de trabalhos relacionados à Crotoxina, os trabalhos gerados durante a
etapa de obtenção e disponibilização do (
18
F) fluoreto na forma de (Na
18
F) para reações de
radiomarcação de compostos, podendo ser aplicado também como radiofármaco para
cintilografia óssea.
Anexos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
108
ANEXO 1 – Resumo
VI Congresso da Sociedade Brasileira de Biociências Nucleares (2008)
SAFETY EVALUATION OF
18
F-NaF PRODUCED IN CDTN/CNEN FOR BONE
SCINTIGRAPHY: AN INTERNAL DOSIMETRY STUDY
Marina Bicalho Silveira
1,3
; Marcella Araugio Soares
1,3
; Thaíssa de Oliveira Bastos
1
; Andréa
Vidal
2
; Raquel Gouvêa dos Santos
1
1 Laboratório de Radiobiologia (CDTN/CNEN); 2 Serviço de reator e irradiações (CDTN/CNEN); 3
Unidade de Pesquisa e Produção de Radiofármacos (CDTN/CNEN).
mbs@cdtn.br
In the era of SPECT imaging, planar
18
F-fluoride ion scintigraphy was largely abandoned in
favor of
99m
Tc-MDP for metastatic evaluation of the skeleton because of its more favorable
photon energies for whole-body gamma camera imaging. Nowadays, the availability of PET
technology has refreshed the interest in this agent because of its increased spatial resolution and
increased sensitivity compared with planar imaging or SPECT with diphosphonates. In order to
attend the demand for a PET tracer for bone scintigraphy, the production and quality control of
18
F
-
has been standardized in the recent inaugurated UPPR (CDTN/CNEN). The current study
evaluated organ dosimetry determined from tissue distributions of
18
F
-
at various time points for
the purpose of radiation safety. The aim of this work was to evaluate the safety of
18
F-NaF
produced in UPPR for bone scintigraphy.
18
F-NaF was obtained in the UPPR and injected (i.v.)
in mice (70KBq/25g). Animals were euthanized at different times post-injection (0 - 60 min)
and the radioactivity present in each organ was measured in a gamma counter. The highest
absorbed doses were to bladder (11.5mGy/70KBq) and bone (7.1mGy/70KBq). Absorbed doses
for the other organs ranged from 120 to 833Gy/70KBq. Concentrations of
18
F
-
in mouse
tissues were extrapolated to patients using organ masses of MIRD reference man assuming a
similar concentration ratio among various tissues between mouse and patient. The extrapolated
radiation doses to patients were relatively low and concurred with the values established by
MIRD model. Radiation doses to bone and bladder were 0.026 and 0.016mGy/MBq,
respectively. These results are quite similar to those obtained using the phantoms Cristy and
Eckerman and show that
18
F-NaF produced in CDTN/CNEN can be safely used for bone
scintigraphy clinical use.
Financial support: CDTN/CNEN, CNPq.
Key words: Bone scintigraphy, quality control,
18
F-soduim fluoride.
Anexos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
109
ANEXO 2 - Resumo
VI Congresso da Sociedade Brasileira de Biociências Nucleares (2008)
PRODUCTION AND QUALITY CONTROL OF 18F-FLUORINE AT THE UNIT FOR
RESEARCH AND PRODUCTION OF RADIOPHARMACEUTICALS IN CDTN/CNEN
Marcella Araugio Soares
1,2
; Marina Bicalho Silveira
1,2
; Juliana Batista da Silva
2
; Samira Soares
Waquil
2
; Eduardo Valente Sarmento
2
; Raquel Gouvêa dos Santos
1
.
1 Laboratório de Radiobiologia - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear
(CDTN/CNEN); 2 Unidade de Pesquisa e Produção de Radiofármacos (UPPR/CDTN).
The PET radionuclide fluorine-
18
F (
18
F
-
) used for clinical applications is produced in a cyclotron
through the nuclear reaction
18
O (p,n)
18
F by the bombardment of enriched
18
O-water.
18
FDG is
the most widely used radiopharmaceutical in PET. The 110 min half-life of
18
F is long enough
to allow various synthesis, and the
18
F-radiopharmaceutical can be utilized at PET-imaging
centers located kilometers from the site of its production.
18
F labeling can be used for the
preparation of a variety of labeled biomolecules for use beyond the measurement of glucose
metabolism. In Belo Horizonte, the recent inaugurated UPPR has obtained the operation
approval of the VISA and the production of the main PET tracer,
18
FDG, is a routine procedure.
In order to attend the demand for new radiopharmaceuticals based on
18
F-labeling we are setting
up the production and quality control of
18
F
-
. The aim of this work was to obtain the ion fluorine
as
18
F-NaF solution in the UPPR and standardize the quality control protocols.
18
F
-
was
produced in the Cyclotron PetTrace GE of UPPR. In order to evaluate the quality control of the
product thin layer radiochromatography was performed for radiochemical assessment, HPGe
gamma spectrometry for radionuclide purity evaluation, NaI gamma counting for half-life
measurement, LAL experiment for determining endotoxins level, as well as, pH and sterility
estimation.
18
F
-
was obtained with a high specific radioactivity (185 GBq/mmol). The
18
F-NaF
showed pH=5.0, half-life of 107 minutes, a R
f
value of 0.02, radiochemical purity of 98.1% and
radionuclide purity of 98.9% with a major peak at 511keV on a γ-ray spectrum. The product
was sterile and presented no more than 10 EU/mL. The
18
F-NaF produced by UPPR presented
all the quality assurance requirements listed in the U.S.Pharmacopeia. Further developments are
going on in order to validate fluorine-
18
F quality control for application in the synthesis of new
PET radiopharmaceuticals non-FDG at UPPR in CDTN.
Financial support: CNPq and CDTN/CNEN.
Key words: Bone scintigraphy, quality control,
18
F-soduim fluoride.
Anexos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
110
ANEXO 3 - Resumo
XVI Congress of the International Society on Toxinology e X Congresso da Sociedade
Brasileira de Toxinologia (2009).
CROTOXIN AS A RADIOPHARMACEUTICAL FOR BREAST TUMOUR
DIAGNOSIS
Soares M.A.
1
, Silveira M.B.
1
, Simal C.
2
, Fortes Dias C.L.
3
, Santos, R.G.
1
1
Laboratório de Radiobiologia - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear (CDTN/CNEN),
2
Faculdade de Medicina – Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
3
Laboratório de Bioquímica da Fundação Ezequiel Dias (FUNED). Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil; Email:
marinabic@yahoo.com.br
Breast cancer is the most frequent cause of death from malignant disease among women
worldwide. The high mortality evoked by this pathology is related to the resistance of breast
tumour cells to conventional therapy and mainly to delayed diagnosis. For this reason, the
search of specific radiopharmaceuticals to be used in breast tumour diagnosis is relevant to
complement the techniques applied in conventional medicine. Crotalus durissus terrificus
venom (Cdt) is a natural source of several bioactive substances with therapeutical potential.
Crotoxin (Crotoxina) has been shown to have potent antitumoral activity against different
tumour cell lines and part of this effect seems to be related to the over expression of epidermal
growth factor receptor (EGFR) in cancer cells. Considering that 30 to 60% of breast tumour
cells present high levels of this receptor, it is important to evaluate the Crotoxina specificity on
breast tumours detection. The aim of this work was to evaluate the binding of Crotoxina with
tumour targets in vitro and in vivo, as well as, evaluate its applicability for breast tumours
diagnosis. Crotoxina was labelled with
125/131
I using lactoperoxidase method and radiochemical
analysis was performed by chromatography.
125
I-Crotoxina was used for biodistribution and
pharmacokinetics studies on swiss mice bearing Ehrlich solid tumour, while
131
I-Crotoxina was
used for single photon emission computed tomography (SPECT) imaging. Crotoxina presented
specific binding sites on Ehrlich tumour cells and had a rapid blood clearance (T
1/2
= 201.1
min.). Intratumoral administration increased significantly the activity delivered into the tumour
site (128-fold higher) and reduced the kidney burden (42-fold lower).
131
I-Crxt demonstrated to
interact with tumour cells for until 72 hours allowing good quality images of tumour. Our
results indicate the biotechnological potential of Crotoxina as template for radiopharmaceutical
design for cancer diagnosis.
Financial Support: CNPq, CDTN/CNEN.
Key words: Crotoxin, radiopharmaceuticals, breast tumour, diagnosis.
Anexos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
111
ANEXO 4 – Certificado de Premiação
Prêmio pela apresentação do trabalho “Crotoxin as a radiopharmaceutical for breast
tumour diagnosis” no XVI Congress of the International Society on Toxinology e X
Congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia (2009).
Anexos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
112
ANEXO 5 – Trabalho completo
INAC - International Nuclear Atlantic Conference (2009).
2009 International Nuclear Atlantic Conference - INAC 2009
Rio de Janeiro,RJ, Brazil, September27 to October 2, 2009
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE ENERGIA NUCLEAR - ABEN
ISBN: 978-85-99141-03-8
BINDING STUDIES OF THE ANTITUMORAL
RADIOPHARMACEUTICAL
125
I-CROTOXIN TO EHRLICH ASCITES TUMOR
CELLS
Marina B. Silveira
1
, Consuelo L. Fortes Dias
2
, Geovanni D. Cassali
3
and Raquel G. dos
Santos
1
1
Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, CDTN -
CNEN/MG
Avenida
Presidente Antônio Carlos,
6.627
31270-901 Belo Horizonte,
MG
marinabic@yahoo.com.br
santosr@cdtn.br
2
Fundação Ezequiel Dias,
FUNED
Rua
Conde Pereira Carneiro,
80
30510-010 Belo Horizonte,
MG
consuelo@pq.cnpq.br
3
Laboratório de Patologia Comparada, Universidade Federal de Minas Gerais,
UFMG
Avenida
Presidente Antônio Carlos,
6.627
31270-901 Belo Horizonte,
MG
cassalig@icb.ufmg.br
ABSTRACT
The development of tools for functional diagnostic imaging is mainly based on radiopharmaceuticals that specifically target
membrane receptors. Crotoxin (Crtx), a polypeptide isolated from Crotalus durissus terrificus venom, has been shown to
have an antitumoral activity and is a promising bioactive tracer for tumor detection. More specific radiopharmaceuticals are
being studied to complement the techniques applied in the conventional medicine against breast cancer, the most frequent
cause of death from malignant disease in women. Crtx’s effect has been shown to be related with the overexpression of
epidermal growth factor receptor (EGFR), present in high levels in 30 to 60% of breast tumor cells. Our objective was
to evaluate Crtx as a tracer for cancer diagnosis, investigating its properties as an EGFR-targeting agent. Ehrlich ascites
tumor cells (EAT cells) were used due to its origin and similar characteristics to breast tumor cells, specially the presence of
EGFR. Crtx was labeled with
125
I and binding experiments were performed. To evaluate the specific binding in vitro of Crtx,
competition binding assay was carried out in the presence of increasing concentrations of non-labelled crotoxin and
epidermal growth factor (EGF). Specific binding of
125
I-Crtx to EAT cells was determined and the binding was considered
saturable, with approximately 70% of specificity, high affinity (K
d
= 19.7 nM) and IC
50
= 1.6 x 10
-11
M. Our results indicate
that Crtx’s interaction with EAT cells is partially related with EGFR and
increases
the biotechnological potential of Crtx as a
template for radiopharmaceutical design for cancer diagnosis.
1. INTRODUCTION
Breast cancer remains the major cause of cancer morbidity and mortality in women throughout the world
[1]. There is an urgent need for early diagnosis and therapy for the patients, as this type of cancer may exist for
a long period as noninvasive or invasive disease. Through nuclear medicine is possible to attach radionuclides to
polypeptides, getting radiopharmaceuticals and, then, perform imaging diagnosis as the single photon emission
tomography (SPECT) or the positron emission tomography (PET).
(…)
Anexos
Marina Bicalho Silveira – CDTN/CNEN
113
ANEXO 6 – Certificado - Ética em experimentação animal
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