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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Farmacologia
Atividade e expressão da elastase-2, enzima formadora de
angiotensina II, em ratos normotensos e espontaneamente
hipertensos tratados com enalapril
Christiane Becari
Ribeirão Preto
2008
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Christiane Becari
Atividade e expressão da elastase-2, enzima formadora de
angiotensina II, em ratos normotensos e espontaneamente
hipertensos tratados com enalapril.
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor em
Ciências, área de concentração
Farmacologia.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Maria Cristina de Oliveira Salgado
Ribeirão Preto
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Becari, Christiane.
Atividade e expressão da elastase-2, enzima formadora de
angiotensina II, em ratos normotensos e espontaneamente hipertensos
tratados com enalapril/ Christiane Becari – Orientadora Maria Cristina de
Oliveira Salgado. Ribeirão Preto, 2008.
114 f. il. 30 cm.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo.
1. Sistema renina angiotensina. 2. Elastase-2. 3. Angiotensina II.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Christiane Becari
Atividade e expressão da elastase-2, enzima formadora de angiotensina II, em ratos
normotensos e espontaneamente hipertensos tratados com enalapril.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia.
Aprovada em: _____________
Banca Examinadora
Dra. Maria Cristina de Oliveira Salgado
Instituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP
Assinatura: ____________________________________
Prof. Dr. Eduardo Coelho Barbosa
Instituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP
Assinatura: ____________________________________
Profa. Dra. Lusiane Maria Bendhack
Instituição: Faculdade Ciências de Farmacêutica de Ribeirão Preto – FCFRP/USP
Assinatura: ____________________________________
Profa. Dra. Dulce Elena Casarini
Instituição: Escola Paulista de Medicina – UNIFESP
Assinatura: ____________________________________
Profa. Dra. Maria Helena Catelli de Carvalho
Instituição: Instituto de Ciências Biomédicas - USP
Assinatura: ____________________________________
EPÍGRAFE
Epígrafe
“Nada em biologia faz sentido a não ser sob a luz da evolução”
Theodosius Dobzhansky (1900-1975)
DEDICATÓRIA
Dedicatória
Dedico este trabalho
Aos meus pais Waldir e Heloisa
Pelo amor e apoio incondicional e por sempre estarem ao meu lado em todos os
momentos da minha vida.
A vocês Meu Muito Obrigada!
Dedicatória
Dedico este trabalho
Ao meu companheiro Maurício
Pelo inestimável apoio, companheirismo e amor que permitiu que a chegada até
aqui fosse muito mais fácil e agradável.
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
À Deus, meu guardião fiel que em todos os momentos da minha vida sempre
me acompanha e dá forças para superar obstáculos e me tornar uma pessoa
melhor.
À minha querida orientadora Profa Dra Maria Cristina de Oliveira Salgado,
exemplo de orientadora e mulher, deixo aqui minha imensa admiração e gratidão
pela orientação e amizade.
Ao Prof. Dr. Francisco Silveira Guimarães, ou melhor, ao querido mestre e
amigo Chico, obrigada pelo auxílio na realização das análises estatísticas, pelas
discussões científicas, dicas de viagens e principalmente pela amizade. Chico,
registro aqui minha admiração por você!
Ao Prof. Dr. Eduardo Brandt de Oliveira, docente do Departamento de
Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, exemplo de cientista, muito
obrigada pelos ensinamentos bioquímicos e imensa contribuição na minha formação
cientifica.
À Profa Dra Lusiane Maria Bendhack, da Faculdade de Ciências
Farmacêutica de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, pelo
assessoramento durante a realização deste trabalho e auxílio durante a realização
do programa de aperfeiçoamento ao ensino (PAE) e pela amizade.
Aos Professores Dr. Eduardo Coelho Barbosa, Dra. Lusiane Maria Bendhack,
Dra. Dulce Elena Casarini, Dra. Maria Helena Catelli de Carvalho pela
disponibilidade em fazer parte da comissão julgadora dessa tese de doutoramento.
Ao Prof. Dr. Claúdio, docente do Departamento de Bioquímica da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, pela colaboração e por disponibilizar seu laboratório
para a realização dos experimentos de biologia molecular.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos, docente da Faculdade de
Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo, pelo incentivo e a amizade.
Ao Prof. Dr. Marcelo, docente do Departamento de Bioquímica da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, por disponibilizar seu laboratório para a realização
dos experimentos de western blot.
Ao Felipe, doutorando do Departamento de Bioquímica da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, pelo inestimável auxílio e dedicação na realização dos
inúmeros experimentos para obtenção do anticorpo anti elastase-2, pelos
ensinamentos de bioquímica e pela amizade.
Aos técnicos do laboratório de farmacologia Osmar Vettore e Orlando
Mesquita pela amizade, paciência em ensinar técnicas e solucionar problemas e por
tornar o ambiente de trabalho do laboratório muito agradável. À vocês muito
obrigada.
A Lúcia e Odete, técnicas dos laboratórios da bioquímica do Departamento de
Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, pela grande auxílio na
realização dos experimentos e pela amizade.
Aos amigos do laboratório de farmacologia Dr. Disney, Dr. Luiz, Marcos
Caprio, Maria Lúcia (Malu) e Ms. Ricardo (Batata) pelas discussões científicas, pelo
bom convívio e claro pelas agradáveis conversas na hora do café.
Aos amigos dos diferentes laboratórios do Departamento de Bioquímica da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Ms. Marília, Dra. Rosana, Ms. Felipe,
Adriana, Ms. Sami, Dra. Laura e Dra. Milene pela amizade, convívio, discussões
científicas, conversas e risadas.
Agradecimentos
As amigas Raquel e Renata Grespan pela amizade e apoio em todos os
momentos.
Aos meus amigos Marília, Sâmia, Leonardo, Vanessa Soares, Claúdia,
Samira, Dorothy, Sandra Helena e Felipe, que de alguma forma contribuíram para
minha formação tanto científica quanto como pessoa.
Ao José Waldik Ramon, secretário do Departamento de Farmacologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, exemplo
de seriedade e profissionalismo, obrigada pelas valiosas dicas e auxílio ao
computador.
A Sônia Andrade e Fátima Petean, secretárias do Departamento de
Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo, pelo trabalho responsável e incansável, tão importante para o bom
funcionamento e sucesso da Pós-graduação.
A todos os docentes, funcionários e pós-graduandos do Departamento de
Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo, que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
A minha família, em especial aos meus irmãos Wesley, Willy e ao meu
sobrinho Leonardo. Pai, Mãe, Willy, Olívia, Wesley, Léo, Vó Luiza e Vô Mário (in
memória), obrigada pelo apoio e incentivo em todos os momentos e por tornar minha
vida mais feliz, Amo vocês.
À família do Maurício por me acolher com tanto carinho e pela torcida para
que tudo desse certo.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) pelo
auxílio financeiro para a realização deste trabalho.
RESUMO
Resumo
RESUMO
Vários trabalhos têm demonstrado a participação de vias alternativas à
enzima conversora de angiotensina (ECA) na geração de angiotensina (Ang) II, tais
como quimase de coração humano e elastase-2 de rato. O objetivo deste estudo foi
investigar a participação da(s) via(s) formadora(s) de Ang II em carótida isolada de
ratos normotensos (wistar) e com hipertensão espontânea (SHR) tratados com
inibidor da ECA (enalapril), verificando em particular a participação da elastase-2. Os
animais normotensos e SHR receberam tratamento com enalapril por 7 dias
(10mg/kg/dia, via oral por gavagem). A atividade da ECA tecidual (carótida e aorta)
em ratos hipertensos foi menor que em normotensos e o tratamento com enalapril foi
eficaz em inibir a atividade da ECA no plasma e no tecido vascular, além disso,
induziu significativa diminuição dos níveis pressóricos nos SHR. Foram realizadas
curvas cumulativa concentração-resposta para Ang II e Ang I em anéis de carótidas
de ratos normotensos e hipertensos controles e tratados cronicamente com enalapril
na ausência e presença dos diferentes inibidores. Em carótidas de animais
normotensos e hipertensos tratados com enalapril, as curvas concentração-resposta
para Ang I apresentaram-se deslocadas à direita, enquanto que as curvas para Ang
II não foram alteradas. Na presença de losartan, antagonista dos receptores AT1, a
resposta contrátil induzida pelos peptídeos Ang II e I foram completamente abolidas.
Considerando que o enalapril poderia ter se dissociado da ECA, in vitro, um outro
inibidor da ECA, captopril, foi adicionado à cuba para inibir totalmente a ECA. Nestas
condições, a resposta a Ang II não foi alterada, no entanto as curvas concentração-
efeito a Ang I apresentaram deslocamento significativo à direita em ratos
normotensos e em ratos hipertensos embora esse deslocamento tenha sido de
menor magnitude nas preparações de SHR em relação a de ratos normotensos. Na
Resumo
presença de quimostatina, inibidor seletivo de serino proteases como a elastase-2,
ocorreu um deslocamento à direita da curva concentração-resposta à Ang I tanto em
animais controles como nos tratados com enalapril (p<0,001), sendo o deslocamento
mais proeminente nos animais hipertensos tratados (p<0,0001). Para verificarmos se
o tratamento crônico com enalapril favoreceu uma maior contribuição da elastase-2
avaliamos a expressão do RNAm para elastase-2 por reação em cadeia de
polimerase em tempo real (PCR em tempo real). A expressão da elastase-2
encontrava-se aumentada no coração e carótida de ratos hipertensos tratados com
enalapril. Em conjunto, estes dados indicam a participação de vias sensíveis a
quimostatina, como a elastase-2, na conversão de Ang I em Ang II e que sua
atividade e/ou expressão está aumentada em carótida de ratos normotensos e de
forma mais proeminente em SHR na vigência da inibição da ECA.
ABSTRACT
Abstract
ABSTRACT
BECARI C. Activity and expression of rat elastase-2, an angiotensin II-
forming enzyme, in normotensive and hypertensive rats treated with enalapril.
2008. 114 f. Thesis (Doctoral)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Alternative pathways to angiotensin-converting enzyme (ACE) involved in
angiotensin (Ang) II generation have been extensively demonstrated and include
chymostatin-sensitive serine proteases such as human chymase and rat elastase-2.
We investigated the effect of chronic ACE inhibition on the activity and expression of
elastase-2, an alternative pathway for Ang II generation, in carotid of spontaneously
hypertensive rats (SHR) and Wistar (normotensive) rats. Rats received enalapril or
vehicle by gavage, during 7 days. After blood pressure measurements, carotid artery
was isolated and cumulative concentration-response curves to Ang I and Ang II were
obtained before and after the addition of inhibitors. ACE activity in plasma, aorta and
carotid homogenates of rats was determined using Hip-His-Leu as substrate. mRNA
expression for elastase-2 was determined by SYBR Green real time polymerase
chain reaction in heart and carotid artery tissue. Enalapril treatment did not change
blood pressure of normotensive rats but reduced blood pressure of SHR group from
178±4 to 129±4 mmHg (p<0.0001). Chronic treatment with enalapril did not affect the
responses induced by Ang II in both groups but induced a rightward shift of the
concentration-response curve to Ang I in carotid of normotensive rats (pD2 control
8.94±0.07 vs. pD2 treated 8.2±0.07; p<0.001) and SHR (pD2 control 8.25±0.08 vs.
pD2 treated 7.98±0.1; p<0.05). Ang I and II produced concentration-dependent
vasoconstrictor effects in carotid of normotensive rats and SHR that was abolished
Abstract
by losartan. Addition of captopril to the nutrient solution did not modify the contractile
responses to Ang II of control or enalapril treated groups, but induced a significantly
shift to the right in the concentration-response curve induced by Ang I in carotid of
normotensive rats (pD2control: 8.9±0.13 vs. pD2control+captopril: 6.8±0.1, p<0.001
and pD2treated: 8.2±0.11 vs. pD2 treated+captopril: 6±0.15, p<0.001) and SHR (pD2
control: 8.3±0.1 vs. pD2 control+captopril: 7.0±0.14, p<0.001 and pD2treated;
8.0±0.16 vs. pD2treated+captopril: 6.8±0.15, p<0.001). In the presence of
chymostatin, the responses to Ang II were not affected in carotid of normotensive
rats and SHR control and treated with enalapril. After chymostatin, concentration
response curve to Ang I was shifted to the right in carotid of control normotensive
rats (p<0.0001) and SHR (p<0.0001). While in carotid of enalapril treated SHR the
responses to Ang I were greatly depressed, in the treated normotensive group
concentration-response curve to Ang I was only shifted to the right (p<0,001). ACE
activity was decreased in aorta and carotid of SHR and enalapril treatment abolished
ACE activity in plasma, aorta and carotid of normotensive and SHR. mRNA
expression for elastase-2 was increased in carotid artery and heart of hypertensive
by enalapril treatment. This study showed that chronic ACE inhibition is associated
with increased angiotensin II-forming elastase-2 activity and mRNA expression in the
rat carotid artery and this effect seems to be more prominent in SHR arteries.
LISTA DE ABREVIATURAS
Lista de abreviaturas
LISTA DE ABREVIATURAS
Ac-AAPL-CK. Acetil-Ala-Ala-Pro-Leu-clorometicetona
Ang I Angiotensina I
Ang II Angiotensina II
cDNA DNA complementar
CH5450 Z-Ile-Glu-Pro-Phe-CO
2
Me
CT Ciclo limiar
DEPC Dietil Pirocarbonato
ECA Enzima conversora de angiotensina
Et al. E outros
PCR-tempo real Reação da polimerase em cadeia em tempo real
[Pro
11
-D-Ala
12
] AngI [Pro
11
-D-Ala
12
] Angiotensina I
RNAm RNA mensageiro
RT Transcrição reversa
SHR Ratos espontaneamente hipertensos
SRA Sistema renina angiotensina
TDP Substrato tetradecapeptídeo da renina
NO Óxido nítrico
PGI
2
Prostaciclina
LISTA DE FIGURAS
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Efeito do tratamento agudo com enalapril sobre a resposta de Ang II e Ang
I na pressão arterial de rato...................................................................................... 41
Figura 2. Efeito do tratamento crônico com enalapril sobre a pressão arterial em
ratos normotensos e hipertensos.............................................................................. 52
Figura 3. Atividade da ECA no plasma, carótida e aorta de ratos normotensos e
hipertensos tratados cronicamente com enalapril..................................................... 54
Figura 4. Efeito da Ang II e Ang I em anéis de carótidas de ratos............................ 55
Figura 5. Efeito da Ang II em anéis de carótidas de ratos normotensos e hipertensos
controles e tratados com enalapril............................................................................ 57
Figura 6. Efeito da Ang I em anéis de carótidas de ratos normotensos e hipertensos
controles e tratados com enalapril............................................................................ 58
Figura 7. Efeito da Ang II em anéis de carótidas de ratos normotensos e hipertensos
controles e tratados com enalapril na ausência e presença de losartan.................. 59
Figura 8. Efeito da Ang I em anéis de carótidas de ratos normotensos e hipertensos
controles e tratados com enalapril na ausência e presença de losartan.................. 60
Figura 9. Efeito da Ang II em anéis de carótidas de ratos normotensos e hipertensos
controles e tratados com enalapril na ausência e presença de captopril.................. 62
Figura 10. Efeito da Ang I em anéis de carótidas de ratos normotensos e hipertensos
controles e tratados com enalapril na ausência e presença de captopril................. 64
Figura 11. Efeito da Ang II em anéis de carótidas de ratos normotensos e
hipertensos controles e tratados com enalapril na ausência e presença de
quimostatina.............................................................................................................. 66
Lista de figuras
Figura 12. Efeito da Ang II em anéis de carótidas de ratos normotensos controles e
tratados com enalapril na ausência e presença de quimostatina............................. 67
Figura 13. Efeito da Ang II em anéis de carótidas de ratos hipertensos controles e
tratados com enalapril na ausência e presença de quimostatina............................. 69
Figura 14. Expressão de RNAm para elastase-2 realizada por PCR em tempo real
em carótidas de ratos normotensos e hipertensos controles e tratados cronicamente
com enalapril. ........................................................................................................... 71
Figura 15. Expressão de RNAm para elastase-2 realizada por PCR em tempo real
em corações de ratos normotensos e hipertensos controles e tratados cronicamente
com enalapril............................................................................................................. 72
SUMÁRIO
Sumário
SUMÁRIO
1-INTRODUÇÃO ...................................................................................................27
2- OBJETIVO ........................................................................................................38
3- MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................40
3.1- Animais .......................................................................................................40
3.2- Tratamento com inibidor da ECA..................................................................40
3.3- Determinação da pressão arterial.................................................................41
3.6- Expressão de RNAm....................................................................................45
3.7- Reação em cadeia da polimerase em tempo real..........................................46
3.8- Análise estatística........................................................................................48
4- RESULTADOS ..................................................................................................51
4.1- Efeito do tratamento crônico com enalapril sobre a pressão arterial em ratos
normotensos e hipertensos.................................................................................51
4.2- Atividade da ECA no plasma e em diferentes tecidos de ratos normotensos e
hipertensos.........................................................................................................53
4.3- Reatividade Vascular ...................................................................................55
4.3.1- Efeito da Ang II e Ang I em anéis de carótidas de ratos..............................55
4.3.2- Efeito da Ang II e Ang I em anéis de carótidas de ratos normotensos e
hipertensos controles e tratados com enalapril. ...................................................56
4.4- Expressão de RNAm para Elastase-2 em carótidas e corações de ratos
normotensos e hipertensos controles e tratados cronicamente com enalapril.......70
5- DISCUSSÃO .....................................................................................................74
6- CONCLUSÃO....................................................................................................86
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................88
8- ANEXO ...........................................................................................................106
1-INTRODUÇÃO
Introdução 27
1-INTRODUÇÃO
A primeira referência aos componentes do sistema renina-angiotensina (SRA)
data de 1898, quando Tigerstedt e Bergman mostraram que extrato de tecido renal,
quando injetado em coelhos, produzia elevação da pressão arterial; sendo
denominado de “renina” o componente ativo desse extrato. Em 1934, Goldblatt et al.
mostraram que era possível provocar hipertensão arterial em cães por meio da
constrição da artéria renal. Esse fato foi posteriormente confirmado por vários
pesquisadores, sendo detectada atividade pressora no sangue venoso renal,
conseqüente à constrição da artéria renal, atribuindo-se esse efeito à renina. Mais
tarde, em estudos realizados simultaneamente, Braun-Menendez et al. (1939) e
Page e Helmer (1939) mostraram que a renina não apresentava por si só atividade
pressora, mas sim uma atividade enzimática capaz de formar, a partir de substrato
protéico presente no plasma, um agente fisiologicamente ativo, denominado
“hipertensina” e “angiotonina” pelo primeiro e segundo grupo de pesquisadores,
respectivamente. Somente mais tarde foi adotado o termo “angiotensina” (Braun-
Menendez e Page, 1958). Skeggs et al. (1954) demonstraram que a angiotensina,
produto da incubação de renina com seu substrato (angiotensinogênio), era na
realidade uma mistura de dois peptídeos, que foram posteriormente denominados de
angiotensina I (Ang I) e angiotensina II (Ang II). Assim, o decapeptídeo denominado
Ang I (Asp
1
-Arg
2
-Val
3
-Tyr
4
-Ile
5
-His
6
-Pro
7
-Phe
8
-His
9
-Leu
10
), produto da ação da renina
(EC 3.4.23.15) sobre o angiotensinogênio plasmático, é clivado na região Phe8-His9
pela enzima conversora de angiotensina (ECA; EC 3.4.15.1) liberando o
octapeptídeo ativo Ang II (Asp
1
-Arg
2
-Val
3
-Tyr
4
-Ile
5
-His
6
-Pro
7
-Phe
8
). A ECA, descrita
inicialmente no plasma (Skeggs et al., 1956), está amplamente distribuída em
diferentes tecidos e leitos vasculares (Padmanabhan et al., 1999). Vários trabalhos
Introdução 28
publicados na década de 70 (Yang et al., 1970; Yang et al., 1971; Igic et al., 1972)
demonstraram que a ECA era idêntica à cininase II, enzima que degradava
bradicinina (Yang e Erdos, 1967), demonstrando uma relação entre a formação de
uma substância vasopressora (Ang II) e a degradação de uma substância
vasodilatadora (bradicinina).
O SRA é considerado classicamente como um sistema humoral, cujo produto
final, a Ang II formada na circulação, tem um papel fundamental na regulação da
homeostase cardiovascular, atuando tanto sobre a regulação do volume sangüíneo
como da resistência vascular periférica. Entretanto, na última década, novas
evidências demonstram que Ang II atua não somente como um hormônio circulante,
mas também pode ser formada localmente em vários tecidos, atuando como um
hormônio autócrino ou parácrino induzindo um amplo espectro de efeitos sobre o
sistema cardio-circulatório (De Gasparo et al., 2002; Catelli et al., 2005). Nos últimos
anos, vários trabalhos mostraram que o SRA apresenta uma complexidade muito
maior do que se imaginava. Atualmente, peptídeos que eram considerados apenas
como metabólitos inativos têm sua atividade biológica reconhecida. Além da Ang II
outros peptídeos podem apresentar atividade biológica como: a Ang III, que é
formada a partir da Ang II por ação de aminopeptidases e está relacionada à
liberação de aldosterona (Zager e Luetscher, 1982); a Ang IV, formada a partir da
Ang III por aminopeptidase N, apresenta um importante papel no sistema nervoso
central, em especial relacionado à memória, e pode também induzir efeitos
proliferativos; o fragmento Ang 1-7 parece apresentar efeitos opostos àqueles
mediados pela Ang II, o que decorre da ativação do receptor MAS. Outra
carboxipeptidase homologa a ECA, denominada ECA-2 foi identificada por dois
grupos simultaneamente (Tipnis et al., 2000 e Donoghue et al., 2000), é capaz de
Introdução 29
clivar Ang I e formar Ang 1-9, bem como gerar Ang 1-7 a partir de Ang II. É
importante ressaltar que até o momento nenhuma atividade biológica direta do
fragmento Ang 1-9 foi descrito, sendo sugerido que esse peptídeo possa competir
com a Ang I pela ligação no sítio ativo da ECA, a qual pode gerar Ang 1-7 a partir de
Ang 1-9 (Esquema 1).
Os efeitos das angiotensinas são exercidos, em sua maioria, por sua ligação a
receptores acoplados à proteína G (GPCR), os quais possuem sete domínios
transmembranais. Os primeiros receptores foram identificados por Whitebread et
al.(1989) e por Chiu et al. (1989) e foram denominados AT1 (atualmente
subdivididos em AT1a, AT1b e AT1c) e AT2. Esses receptores são ativados pela
Ang II, mas também podem ser estimulados por outros mediadores do SRA com
menor afinidade de ligação, como a Ang III, a Ang IV e a Ang 1-7. Outros receptores
também foram identificados, como o receptor AT4 para Ang IV (Swanson et al.,
1992) e o receptor Mas para Ang 1-7 (Santos et al., 2003) (Esquema 1). A variedade
dos efeitos cardiovasculares do SRA está associada à distribuição difusa dos
receptores para a Ang II, especialmente do receptor AT1, já que este parece mediar
a grande maioria dos efeitos da Ang II. Assim, os receptores AT1 são expressos no
pulmão, no fígado, nos rins, no coração, nos vasos sanguíneos, no cérebro, nas
adrenais e várias glândulas endócrinas (Chiu et al., 1989; Ardaillou, 1999). Os
receptores AT2 são predominantemente expressos em tecidos fetais (situação
revertida após o nascimento), embora possam ser expressos em situações de
injúria. Os receptores AT2 parecem antagonizar alguns efeitos renais mediados por
receptores AT1 tendo papel contra-regulador sobre os efeitos pressores e anti-
natriuréticos (Carey et al., 2000). O receptor AT4 encontra-se localizado no cérebro,
Introdução 30
coração, pulmões, fígado e rins, sendo relacionado a funções cognitivas, embora
este último possa ainda exercer efeitos proliferativos (Unger et al. 1996).
Esquema 1: Desenho representativo dos peptídeos, enzimas e receptores do SRA componentes do
SRA e suas respectivas vias de formação e atuação nos receptores. (ver revisões Weber, 1999;
Carey e Siragy, 2003; Catelli et al., 2005; Schmieder et al., 2007).
Os inibidores da ECA são amplamente utilizados não apenas no tratamento da
hipertensão arterial, mas também em inúmeras outras doenças cardiovasculares (ou
a elas associadas) como: insuficiência cardíaca; infarto do miocárdio; diabetes tipo
2; falência renal e nefropatia diabética (Dzau et al., 2002). Resultados de numerosos
estudos clínicos (Pfeffer et al., 1992; The SOLVD, 1991; The Acute Infraction
Ramipril Efficacy Study Investigators, 1993; TRACE, 1999) estabeleceram que
bloqueio do SRA com inibidores da ECA resulta em significativa redução da
mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca ou pós-infarto do miocárdio.
ANGIOTENSINOGÊNIO
ANGIOTENSINA I (1-10)
ANGIOTENSINA II (1-8)
RENINA
ECA
Quimase
Elastase-2
ANGIOTENSINA 1-9
ECA- 2
ANGIOTENSINA 1-7
ECA- 2
ECA
Receptor MAS
ANGIOTENSINA III (2-8)
ANGIOTENSINA IV (3-8)
Receptor AT4
Receptor AT1 Receptor AT2
APA
APN
Introdução 31
Como os benefícios sobre a sobrevida foram demonstrados com diferentes
inibidores da ECA e todos têm mecanismo de ação comum, esse importante efeito é
atribuído a todos os inibidores da ECA. Estudos farmacológicos mostram que os
inibidores da ECA podem diferir quanto a sua afinidade pela ECA tecidual, embora o
significado clínico permanece a ser determinado (Dzau et al., 2002).
Os primeiros estudos “in vitro” e “in vivo” demonstraram que o captopril era
capaz de inibir a atividade da ECA, bem como os efeitos hipertensor e constritor da
Ang I (Ondetti et al., 1977; Rubin et al., 1978; Cushman e Ondetti, 1980) e ainda,
reduzir a pressão arterial, de maneira mais efetiva, em animais hipertensos nos
quais a atividade da renina plasmática encontra-se aumentada (Sweet & Blaine,
1984). Esses resultados levaram a sugestão inicial de que o efeito antihipertensivo
dos inibidores da ECA estivesse primariamente relacionado à inibição da conversão
de Ang I em Ang II. Entretanto, essa ação não explica, por exemplo, por que o
captopril é capaz de diminuir a pressão arterial de ratos espontaneamente
hipertensos (SHR), os quais possuem atividade da renina e ECA plasmática normal
(Polsky-Cynkin et al, 1980; Jandeleit et al.,1992). E mais, tem sido demonstrado o
retorno da concentração plasmática de Ang II a níveis equivalentes aos indivíduos
não tratado durante o tratamento crônico com inibidores da ECA, embora a eficácia
terapêutica em diminuir o valor da pressão arterial nesses indivíduos ocorra (Mento
et al., 1987; Juillerat et al., 1990, Abe et al., 1999), indicando um possível
envolvimento de vias alternativas à ECA na geração de Ang II.
Vários estudos têm mostrado a participação de outras enzimas, além da ECA,
na geração de Ang II (Campbell et al., 1987; Balcells et al., 1997; Takai et al., 2001).
As primeiras descrições de uma via alternativa de formação da Ang II foram
descritas por Cornish et al. (1979) na bochecha de hamster, e por Trachte e Lefer
Introdução 32
(1979) no músculo papilar cardíaco de gato. Cornish et al. (1979) também
observaram a formação de Ang II de forma independente da ECA na artéria
coronária de hamster. Okunishi et al. (1984) identificaram uma enzima geradora de
Ang II sensível à quimostatina na artéria mesentérica de cão, a qual também é
insensível a inibidores da ECA. Urata et al. (1990a) demonstraram in vitro uma dupla
via para a formação de Ang II em homogenato de coração humano. Esses autores
observaram que aproximadamente 80% da formação total de Ang II associava-se à
presença de uma serino-protease até então desconhecida, enquanto a atividade
formadora de Ang II dependente da ação da ECA era responsável somente por
aproximadamente 11% da formação total de Ang II. Esta serino-protease cardíaca
foi posteriormente purificada e identificada como um novo membro da família
quimase e, desde então, denominada de quimase do coração humano (Urata et al.,
1990b).
Embora várias enzimas, incluindo a tripsina (EC 3.421.4), quimotripsina (EC
3.4.21.1), tonina, catepsina G (EC 3.4.21.20), e calicreína (3.4.21.34) possam
produzir Ang II in vitro, por meio da clivagem da ligação Phe
8
-His
9
da Ang I (Urata et
al., 1995; Hollenberg et al., 1998), a atividade das mesmas no sistema
cardiovascular in vivo não está esclarecida. Além disso, algumas destas enzimas,
como tripsina e quimiotripsina, também degradam a Ang II (Le Trong et al., 1987),
deixando em dúvida a função destas enzimas na formação deste peptídeo.
Interessante notar que, enquanto as quimases humana e de hamster clivam
eficientemente Ang I, formando Ang II (Urata et al., 1990b; Takai et al., 1996), a
quimase I (EC 3.4.21.39) de rato apresenta atividade de degradação da Ang II (Le
Trong et al., 1987). Dados gerados a partir da sensibilidade dessas diferentes
enzimas a inibidores de proteases permitiram a classificação das enzimas
Introdução 33
formadoras de Ang II em três categorias (Arakawa, 1996). A primeira categoria
corresponde à metalodipeptil carboxipeptidase conhecida como ECA. A segunda
categoria inclui um grupo de serino-proteases sensíveis à quimostatina, tais como a
enzima geradora de Ang II sensível à quimostatina da artéria mesentérica de cão
(Okunishi et al., 1987), quimase humana (Urata et al., 1990b; Takai et al., 1996),
catepsina G (Tonnesen et al., 1982) e a elastase-2 de rato (Santos et al., 2002). A
terceira categoria agrupa as serino-proteases sensíveis a aprotinina, destacando-se
a calicreína (Maruta e Arakawa, 1983), tripsina (Arakawa, 1996) e tonina (Boucher et
al., 1977).
A despeito das diferenças de características entre quimases de diferentes
espécies, essas enzimas têm participação em vias funcionalmente relevantes de
formação de Ang II independente da ECA (Okunishi et al., 1987; Urata et al., 1996;
Waldeck et al., 1997). A determinação de atividades funcionais distintas para ECA e
quimases tem sido possível, em alguns casos, pela utilização de inibidores
(Cushman et al., 1977; Bastos et al., 1995) e substratos (Hoit et al., 1995) seletivos.
O desenvolvimento do composto Z-Ile-Glu-Pro-Phe-CO2Me (CH5450), um inibidor
peptídico da quimase do coração humano (Bastos et al., 1995), forneceu uma
ferramenta farmacológica importante para a investigação das enzimas responsáveis
pela formação tecidual de Ang II (Waldeck et al., 1997), principalmente por ser um
inibidor seletivo de quimases em concentrações nanomolares. Evidências de que
vias enzimáticas independentes da ECA sejam funcionais na conversão de
precursores circulantes de Ang II foram fornecidas por experimentos in vivo
(Mangiapane et al., 1994; Hoit et al., 1995; Garrison et al., 1997; Nishimura et al.,
1998; Inoue et al., 1999) utilizando o peptídeo sintético [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I, um
precursor biologicamente inativo que seletivamente libera Ang II após incubação
Introdução 34
com quimase humana, mas não com ECA ou carboxipeptidases (Hoit et al., 1995).
Esse substrato tem sido utilizado como ferramenta para demonstrar a participação
de quimases na formação de Ang II em preparações derivadas de tecidos de
humanos (Waldeck et al., 1997; Wolny et al., 1997), primatas (Mangiapane et al.,
1994; Hoit et al., 1995), hamster (Nishimura et al., 1998), cães (Murakami et al.,
1997), gatos (Garrison et al., 1997), e mesmo em ratos (Inoue et al., 1999), espécie
que não apresenta quimase com atividade formadora de Ang II.
Nosso grupo de pesquisa (Oliveira et al., 1991) demonstrou a existência de
algumas peptidases no perfusato do leito mesentérico isolado de rato. Observou-se
que a solução de perfusão recirculante acumulava endo-e exo-peptidases solúveis,
entre as quais foi identificada uma serino-protease insensível ao captopril capaz de
formar Ang II a partir de Ang I. Posteriormente, essa serino-protease formadora de
Ang II do perfusato do leito arterial mesentérico de rato foi isolada e purificada, a
qual foi obtida numa forma altamente purificada por uma combinação de
cromatografias de filtração e afinidade (Paula et al., 1998). A enzima mostrou-se
sensível a quimostatina e foi identificada como uma glicoproteína de massa
molecular igual a 28.5 kDa. A seqüência amino-terminal dos dez primeiros resíduos
desta enzima mostrou-se idêntica à da elastase-2 pancreática de rato (EC
3.4.21.71), sendo a enzima denominada elastase-2 formadora de Ang II do perfusato
do leito arterial mesentérico isolado de rato. O seqüenciamento dos cDNAs para as
elastases-2 do pâncreas e do leito arterial mesentérico de rato forneceu seqüências
idênticas (Santos et al., 2002b). As seqüências também foram idênticas àquela
previamente publicada por MacDonald et al. (1982) para a elastase-2 do pâncreas
de rato. Ao que sabemos, a elastase-2 é o único representante dessa família de
proteases secretada fora do trato digestivo e implicada na geração de Ang II. O
Introdução 35
RNAm para a elastase-2 também foi encontrado em outros tecidos além de
pâncreas e leito mesentérico; a expressão foi encontrada em pulmão, coração, rim,
fígado, baço e artéria carótida. O fato de termos encontrado o RNAm para a
elastase-2 no coração (Santos et al., 2003) tem respaldo de achados do nosso
laboratório, uma vez que a elastase-2 foi identificada no perfusato de coração
isolado de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos (Stuckert-
Seixas, 2001). Esses resultados sugerem que elastase-2 tenha uma participação
funcional na geração local de Ang II em vários órgãos importantes no sistema
cardiovascular.
As propriedades enzimáticas da elastase-2 de rato claramente indicam
diferenças entre esta peptidase e a ECA em vários aspectos, porém mostra
similaridades com a enzima sensível a quimostatina da artéria renal isolada do cão
(Okamura et al., 1990) e quimase do coração humano (Arakawa, 1996). Uma
característica notável da elastase-2 como uma enzima conversora de angiotensina é
que ela não destrói o produto Ang II (Paula et al., 1998). Essa característica é
compartilhada com algumas quimases, tais como humana, de babuíno e de cão,
mas não com a maioria das quimases de roedores, como a do rato. Além disso, a
interação até então desconhecida da elastase-2 com [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I e CH5450
(Santos et al., 2002a), ambos considerados como reagentes seletivos para
quimases, sugere que as evidências para a formação de Ang II in vivo por quimases,
particularmente no rato, podem ter sido superestimadas em investigações prévias
sobre vias geradoras de Ang II.
Uma atividade funcional para uma via alternativa de geração de Ang II, como a
elastase-2, foi sugerida em estudos realizados em nosso laboratório, em leito arterial
mesentérico isolado de rato (Santos et al., 2003; Leite e Salgado, 1992; Leite et al,
Introdução 36
1997), em coração isolado de ratos normotensos e SHR (Stuckert-Seixas 2001) e
vasos de condutância como a artéria carótida de ratos (Becari et al., 2005), os quais
indicam a possível participação de uma via independente da ECA responsável pelos
efeitos farmacológicos de Ang I nessas preparações.
Estudos realizados em vaso de condutância (carótida) demonstram que tanto a
ECA quanto a elastase-2 participam sinergicamente na geração de Ang II a partir de
Ang I em condições fisiológicas (Becari et al., 2005). Em conjunto, estes dados
indicam a importância da via alternativa à ECA, possivelmente elastase-2, geradora
de Ang II no tecido vascular que poderia ter importante função de gerar Ang II na
vigência da inibição da ECA.
A hipótese deste trabalho é que o tratamento crônico com inibidor da ECA
favoreceria a contribuição de via(s) independentes da enzima conversora de
angiotensina na formadora(s) de Ang II, mais especificamente favorecendo a maior
expressão e/ou atividade da elastase-2 em artérias carótidas de ratos normotensos
e hipertensos.
2-OBJETIVO
Objetivo 38
2- OBJETIVO
Com base no exposto, este trabalho foi realizado com os seguintes objetivos:
1) investigar se o tratamento crônico com inibidor da ECA modifica a
contribuição relativa das vias formadoras de Ang II em carótida isolada de ratos
normotensos e com hipertensão espontânea (SHR).
2) verificar se ocorre alteração da expressão da elastase-2 de RNAm em
carótida de ratos normotensos e SHR não tratados e tratados com inibidor da ECA.
3- MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos 40
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Animais
Foram utilizados ratos machos Wistar (normotensos) e ratos espontaneamente
hipertensos (SHR), com 8 a 12 semanas de idade, provenientes do Biotério Central
do Campus da USP de Ribeirão Preto e do biotério do Departamento de Neurologia
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, respectivamente, sendo a
cepa do SHR provenientes da cepa original da Taconics Pharm. Inc., Germantown,
NY). Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (21°C) e
iluminação, com livre acesso à água e alimentação.
Os animais foram divididos em 4 grupos: ratos normotensos controles, ratos
normotensos tratados com enalapril por 7 dias, ratos hipertensos controles e ratos
hipertensos tratados com enalapril por 7 dias.
3.2- Tratamento com inibidor da ECA
Os ratos normotensos e SHR foram tratados com enalapril (inibidor da ECA,
10mg/kg/dia) ou veiculo (água) por via oral (gavagem) durante sete dias. A solução
contendo enalapril foi preparada diariamente e a concentração da droga foi ajustada
ao peso dos animais para atingir a dose de 10 mg/Kg/dia. O grupo controle recebeu
igual volume de veículo. Os experimentos realizados neste trabalho foram realizados
no 7º dia de tratamento dos ratos e sempre após pelo menos 3 horas após
administração do enalapril ou do veículo (água).
Material e Métodos 41
Para testarmos à qualidade do lote de enalapril utilizado, um rato normotenso
foi anestesiado e artéria e veia femoral foram canuladas. Após a recuperação da
anestesia e registro da pressão arterial basal, verificamos o efeito pressor da
administração intravenosa de Ang II (10 ng) e Ang I (10 ng); em seguida
administramos enalapril (10 mg/kg, via oral por gavagem) e esperamos 3 horas,
tempo necessário para observarmos 100% da inibição da ECA plasmática (Lees e
Reid, 1987a) e novamente avaliamos a resposta pressórica à administração
intravenosa das mesmas doses de Ang II e I. Observamos que a pressão arterial
basal não foi alterada; entretanto, após enalapril, a resposta à Ang I foi abolida
enquanto que à Ang II foi mantida (Figura 1), indicando que o tratamento com
enalapril foi efetivo em inibir a ECA.
Figura 1. Registro da pressão arterial de rato normotenso acordado. Ang I (10 ng) e Ang II
(10 ng) foram injetadas diretamente na veia femoral e administração de enalapril foi feita por
gavagem (10 mg/kg).
3.3- Determinação da pressão arterial
As verificações dos níveis pressóricos dos animais foram feitas por medida
indireta da pressão arterial, pelo método pletismográfico de cauda, antes (dia 0) e no
dia anterior aos experimentos (6
o
dia de tratamento). Para tanto, os animais (ratos
normotensos e SHR) foram aquecidos previamente e, após contenção, um sensor
foi colocado junto à cauda e o sinal da pulsação arterial amplificado (transdutor e
pré-amplificador MK II- E & M Instrument Co.- Texas – USA) e visualizado na tela de
Enala
p
ril Ang I
Ang II
Ang I Ang II
3 Horas
mmHg
0
200
2min
Material e Métodos 42
um osciloscópio (Pantec 5210 – 15 MHz- Brasil). Um manguito, colocado na cauda,
foi insuflado até desaparecimento do sinal oscilatório. A pressão indicada em uma
coluna de mercúrio acoplado ao manguito foi anotada assim que o sinal oscilatório
foi novamente visualizado na tela do osciloscópio. Foram realizadas três medidas de
pressão para cada animal e a média destas três aferições foi utilizada.
3.4- Determinação da atividade da ECA
Ratos normotensos e hipertensos controles e tratados com enalapril por sete dias
foram anestesiados com tribromoetanol (250 mg/Kg, i.p.). Para a determinação da
atividade da ECA plasmática foi coletado, em seringa contendo heparina,
aproximadamente 1 mL de sangue através de punção cardíaca. O sangue foi
centrifugado a 2000 rpm durante 5 min para a obtenção do plasma. Para a
determinação da atividade da ECA no tecido vascular, as carótidas comuns foram
removidas e lavadas com solução salina gelada em seguida, foi realizada a remoção da
aorta. A aorta foi dissecada e seccionada logo acima da bifurcação das artérias ilíacas e
após sua emergência do coração. Em seguida, a aorta foi mergulhada em solução
fisiológica gelada e dissecada em uma placa de Petri mantida em gelo para remoção de
resquícios de sangue e tecidos conjuntivo adjacente. As carótidas e aortas foram
pesadas, cortadas em pequenos pedaços, e armazenadas a -18ºC até serem
processadas para a medida da atividade da ECA. Posteriormente, as carótidas e aortas
foram descongeladas e homogeneizadas (Potter S, B. Braun Biotech Intern.), a 2500
rpm, por 5 ciclos de 15 segundos e intervalos de 30 segundos entre os ciclos, utilizando
solução tampão borato de sódio 0,05 M, pH 7,4 (ajustado com NaOH 0,5 M), contendo
0,32 M de sacarose, na proporção de 1:10 (peso:volume), no preparo do homogenato.
Em seguida, o material foi centrifugado durante 10 minutos a 4ºC (Sorvall Legend RT) a
Material e Métodos 43
1000 rpm, e o sobrenadante retirado com pipeta Pasteur e conservado a –18ºC até o
momento da sua utilização para dosagem da atividade da ECA.
A atividade da ECA foi determinada utilizando Hip-His-Leu como substrato e
medida pela análise fluorimétrica para o dipeptídeo His-Leu formado (Yang e Neff,
1972). O volume de 20 µL de homogenato de aorta ou plasma e 100 µL de
homogenato de carótida foi incubado a 37ºC com 200 µL de solução de Hip-His-Leu
(5 mM, Sigma) em água destilada. Após incubação por 15 minutos do plasma e do
homogenato de aorta e de 60 minutos do homogenato de carótida, foi adicionado 1
mL de NaOH 0,5 M para interromper a atividade enzimática. O dipeptídeo His-Leu
foi detectado pela adição de 0,1 mL de ο-ftaldialdeído 1% (massa/volume, em
etanol), seguido da adição de 0,2 mL de HCl 6 M após 4 minutos. A fluorescência foi
medida em espectrofluorímetro (Shimadzu RF-535) com comprimento de onda de
excitação de 365 nm e de emissão de 495 nm. Foi construída uma curva padrão
para o dipeptídeo His-Leu (0-20 nmol, Sigma) com a finalidade de estabelecer os
parâmetros da relação entre concentração de His-Leu e fluorescência medida pelo
espectrofluorímetro. Os brancos para cada ensaio foram preparados adicionando-se
o plasma ou tecidos na mesma proporção da utilizada no ensaio após a adição de
NaOH 0,34 M ao substrato (Hip-His-Leu), mantendo-se inalteradas as demais
etapas de ensaio enzimático. Atividade da ECA foi expressa em nmol de His-Leu/
min/g de tecido (carótidas e aorta) ou em nmol de His-Leu/min/mL de plasma.
3.5 - Reatividade vascular
Ratos normotensos e hipertensos controles e tratados com enalapril por 7 dias
foram anestesiados com tribromoetanol (250 mg/Kg, i.p.), e sacrificados por
Material e Métodos 44
exsangüinação. Através de uma incisão na linha média do pescoço, as carótidas
foram expostas, nervos e tecidos conjuntivo e adiposo foram removidos, as artérias
isoladas e retiradas do animal. Para o estudo de reatividade vascular foram
utilizados anéis de carótida de aproximadamente 3 mm de comprimento. Dois
ganchos de metal foram inseridos no lúmem da artéria, com cuidado para não
danificar o endotélio. Um dos ganchos foi conectado a um suporte fixo na base da
cuba para órgão isolado (13 mL) e o outro foi conectado a um transdutor (Statham,
USA) para registro isométrico de tensão em polígrafo Hewlett-Packard 7758B. Os
anéis das artérias carótidas foram mantidos em cuba contendo solução de Krebs
(em mM: NaCl 118; KCl 4,7; CaCl
2
+2H
2
O 2,5; MgSO
4
+6H
2
O 1,64; KH
2
PO
4
1,18;
NaHCO
3
24,9; glicose 11,1; todos os sais utilizados foram obtidos da Merck Co.,
EUA), pH 7,4. Os anéis foram mantidos em temperatura constante de 37°C e
aerados com mistura carbogênica (95% O
2
e 5% CO
2
). Todos os protocolos
experimentais foram realizados após estabilização das preparações pelo período de
30 min, sob tensão basal de 1,0 g. Inicialmente, a resposta ao vasoconstritor
fenilefrina (10-
7
M) foi testada repetidas vezes para verificarmos a estabilidade da
preparação para a realização do experimento. Em seguida, acetilcolina (10-
3
M) foi
adicionada à preparação pré-contraída com fenilefrina para averiguar a integridade
do endotélio; somente preparações que apresentaram o endotélio íntegro, isto é,
apresentaram relaxamento total em resposta à acetilcolina foram utilizadas.
Em anéis de carótidas isoladas de ratos normotensos e hipertensos controles
ou tratados com enalapril por sete dias foram construídas curvas concentração-
efeito de forma cumulativa para o peptídeo Ang II e Ang I (substrato para ECA e
elastase-2) na ausência e presença de diferentes inibidores como captopril (inibidor
da ECA, 10 µM), losartan (antagonista seletivo de receptor AT1, 1 µM) e
Material e Métodos 45
quimostatina (inibidor de serino protease como a elastase, 100 µM). Cada
preparação foi utilizada para testar um único peptídeo na ausência e presença de
inibidor; desta forma, todo experimento tinha seu próprio controle. Um intervalo de
50 minutos entre uma curva cumulativa e outra sendo que inibidores eram colocados
nos últimos trinta minutos.
Esse período entre as curvas concentração-efeito consecutivas, de 50 min
entre elas, foi definido anteriormente (Becari et al., 2005) verificando se a resposta
contrátil induzida pelos peptídeos Ang II e Ang I era influenciada pela administração
prévia do mesmo. Observamos que a administração dos diferentes peptídeos com
intervalos de 50 minutos não apresentaram diferenças na resposta contrátil
induzidas pelo peptídeo numa mesma preparação.
Para todos os peptídeos (Sigma, EUA) utilizados no decorrer deste trabalho
foram realizadas análises de aminoácidos para determinação de suas
concentrações. As análises dos peptídeos foram realizadas pelo Prof. Dr. Eduardo
Brandt de Oliveira, Departamento de Bioquímica, Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. A quimostatina foi obtida da Sigma (St.
Louis, Mo, EUA) e o losartan, enalapril e captopril da Galena (Campinas, SP, Brasil).
3.6- Expressão de RNAm
As amostras obtidas de ratos normotensos e hipertensos controles e tratados
com enalapril foram coletadas e imersas no reagente trizol (Gibco, BRL, Life
Techonologies, Rockville, MD) e armazenadas a -70°C até a sua utilização. Para
expressão RNAm nos corações e carótidas foi utilizada a extração de RNA total pelo
Material e Métodos 46
método guanidino-isotiacianato-fenol-clorofórmio modificado, conforme estabelecido
anteriormente no laboratório (Becari et al., 2005).
A concentração de RNA total nas amostras foi determinada por diluição do
RNA (fator de diluição conhecido) e leitura em cubetas de quartzo em
espectrofotômetro (DU 640 Beckamn, EUA) no comprimento de onda de 260 nm. A
qualidade do RNA total nas amostras foi determinada pela verificação de possível
degradação em gel de agarose 1%, com observação da integridade das
subunidades 28S e 18S. Só foram utilizadas as amostras de RNA que não
apresentavam qualquer sinal de degradação. Todas as amostras de RNA foram
tratadas com DNAse para evitar possível contaminação por DNA genômico.
Utilizando o “First-strand cDNA síntese” foi realizada a síntese de cDNA por
transcrição reversa (RT). A síntese do cDNA foi feita usando 2 µg (2 µL) de RNA
total e volume final de 19 µL usando 1 µL (500 µg/mL) Oligo(dT), 1 µL (10 mmol/L)
dNTPs, 10 µL água estéril, 4 µL Tampão de RT (250 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3, 375
mmol/L KCl, 15 mM MgCl
2
), 2 µL (0.1 mol/L) DTT, 1 µL (200 units) transcriptase
reversa de “murine leukemia” vírus. O cDNA foi sintetizado durante um período de
60 min de incubação a 37
o
C e a reação foi paralisada pelo aquecimento a 90
o
C por
5 min. Os produtos da transcrição reversa (1 µL) serviram de molde para a
amplificação por PCR em tempo real.
3.7- Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Foi utilizado o kit “Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with ROX”
(Invitrogen, EUA) para a reação de PCR em tempo real. A reação foi realizada com
volume final de 25 µL consistindo de 12,5 µL de SYBR Green master-mix (contendo
polimerase hot-start Platinum Taq DNA, SYBR Green I dye, Tris-HCl, KCl, 6 mM
Material e Métodos 47
MgCl2, 400 µM dGTP, 400 µM dATP, 400 µM dCTP, 800µM dUTP, uracil DNA
glycosylase (UDG), 1 µM ROX marcador de referência e estabilizadores), 5 µL de
cDNA (diluído 1/5 v/v com água estéril), 1 µL de primer 5´3´ (1 µM de concentração
final na reação), 1 µL de primer 3´5´(1 µM de concentração final na reação) e 5 µL
de água estéril tratada com Dietil Pirocarbonato (DEPC). O processo de ciclagem
térmica consiste de 2 min a 50
°
C, em seguida 10 min a 95°C e 40 ciclos a 95°C por
15 s seguido de 60°C a 1 min e 72°C a 1 min. As reações de PCR em tempo real
foram feitas utilizando o aparelho “Applied Biosystems 7500 Fast Real time PCR
System”. Os genes β-actina e ciclofilina foram utilizados como controles internos. Em
todos os experimentos foram feitos controles negativos para excluir possibilidades
de contaminação por RNA ou DNA genômico. As seqüências dos “primers” utilizadas
neste estudo foram desenhados usando o software Primer-Express (Applied
Biosystems) baseado na seqüência de nucleotídeos presentes na base de dados
GenBank (http//:www.ncbi.nlm.nih.gov, código de acesso para elastase-2
NM_012553) e sintetizados pela Invitrogen (Brasil). As seqüências dos primers e o
tamanho do “amplicons” usados estão demonstrados na tabela 1. Os níveis relativos
da expressão dos genes foram calculados de acordo com as instruções da Applied
Biosystems, usando o método de ciclo limiar (Ct) e o grupo normotenso utilizado
como normalizador e tendo a β-actina ou ciclofilina como “housekeeping” (controle
interno) de amostra.
Material e Métodos 48
TABELA 1 – “Primers” utilizados na “PCR em tempo real” para os diferentes alvos e
tamanhos antecipados dos produtos de amplificação.
3.8- Análise estatística
Para a análise dos fatores entre as linhagens, tratamento com enalapril,
diferentes concentrações dos peptídeos, efeitos dos inibidores e antagonistas,
utilizamos análise de variância multivariada de medidas repetidas (MANOVA). Para
a análise dos efeitos dos inibidores de proteases sobre as respostas dos peptídeos,
as curvas concentração-efeito na ausência e presença dos inibidores foram
comparadas utilizando análise de variância de dois fatores (Two Way-ANOVA).
Foram realizadas três medidas de pressão para cada animal e a média destas três
aferições foi utilizada e o teste estatístico aplicado foi teste t pareado. A análise
estatística utilizada para comparar a atividade da ECA entre as linhagens foi por
teste t. Foi adotado nível de significância de 5% (p<0,05) para que as diferenças
fossem consideradas estatisticamente significativas. A análise estatística foi
realizada utilizando o programa SPSS13 e para a confecção dos gráficos foi utilizado
o programa GraphPad Prism 4.0.
A análise da quantificação relativa da expressão do RNAm foi realizada
utilizada o método delta Ct, com ajuste para a eficiência de amplificação (Livak &
Schmittgen, 2001). O programa GraphPad Prism 4.0 foi utilizado para as análises
Alvo Tamanho
antecipado
Sense (5’-3’) Anti-sense (5’-3’)
Ciclofilina 90 pb
AAG GAC TTC ATG ATC CAG GG TGA CAT CCT TCA GTG GCT TG
β-actina
210 pb
AGAAGATGACCCAGATCATGTTT AGCAGCCGTGGCCATCTCTTGCTC
Elastase-2 250 pb
GCCTCTCCACCTCGGAAT GTGCGTTCCCAAGGTGAC
Material e Métodos 49
estatísticas da expressão de cada gene. A média do delta CT do grupo normotenso
foi utilizado como normalizador em relação à média do delta Ct dos outros grupos.
Os dados foram apresentados em logaritmo (log)10 para uma maior homogeneidade
da variância entre os grupos. Os dados da expressão de mRNA foram normalizados
e apresentaram uma distribuição normal e foram comparados pela análise de
variância de um fator (Anova), seguido do pós-teste de Bonferroni. Foram
consideradas diferenças significativas para p< 0,05.
4- RESULTADOS
Resultados 51
4- RESULTADOS
4.1- Efeito do tratamento crônico com enalapril sobre a pressão arterial em
ratos normotensos e hipertensos
O tratamento com inibidor da ECA não alterou a pressão arterial dos ratos
normotensos (130±2 mmHg, antes do inicio do tratamento, para 129±3 mmHg, no 6º
dia de tratamento), conforme mostrado na figura 2A. Entretanto, em ratos
hipertensos o tratamento com enalapril reduziu significativamente a pressão arterial
(de 178±4 mmHg, antes do inicio do tratamento, para 129±4 mmHg, no 6º dia de
tratamento, P<0,0001), trazendo-a próxima à verificada nos animais normotensos
(figura 2B). Os animais que receberam somente veículo (controle) não apresentaram
modificações nos níveis pressóricos neste período (figura 2).
Resultados 52
Figura 2. Efeito do tratamento com inibidor da enzima conversora sobre pressão arterial
determinada por pletismografia. Pressão sistólica de ratos normotensos (A, n=10) e
hipertensos (B, n=13-15) antes (dia 0) e no 6º dia de tratamento com veículo (Controle) ou
enalapril (10 mg/kg/dia, gavagem). (Teste t pareado, *p<0,0001).
C
on
t
rol
e
dia
0
C
ontrole di
a
6
En
a
lapr
i
l d
i
a 0
E
na
l
ap
r
il
dia
6
0
40
80
120
160
200
A
Pressão Sistólica
(mmHg)
Controle di
a
0
Controle di
a
6
E
nalapril di
a
0
Enalapril dia 6
0
40
80
120
160
200
*
B
Pressão Sistólica
(mmHg)
Resultados 53
4.2- Atividade da ECA no plasma e em diferentes tecidos de ratos normotensos
e hipertensos.
A atividade da ECA plasmática e tecidual (carótida e aorta) foi determinada em
ratos normotensos e hipertensos controles e tratados com enalapril por 7 dias. A
atividade da ECA encontrava-se significativamente diminuída em carótida e aorta de
ratos hipertensos em relação à de normotensos (figura 3A e B, respectivamente)
Porém, a atividade plasmática da ECA não apresentou diferença significativa entre
ratos normotensos e hipertensos (figura 3C). Em ratos normotensos e hipertensos
tratados cronicamente com enalapril por 7 dias a atividade da ECA plasmática e
tecidual foi completamente inibida.
Resultados 54
Figura 3: Atividade da ECA em homogenato de carótida (A), aorta (B) e plasma (C) de ratos
normotensos e hipertensos no 7º dia de tratamento com veiculo (Controle) ou enalapril (10
mg/kg/dia, gavagem), (n=3-4). Os valores são expressos como a média±EPM. (teste t, *
p<0,0001 e **p<0,07 comparação entre normotenso e hipertensos controles).
Normotenso Hipertenso
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Controle
Enalapril
*
Atividade da ECA
(nmol/g/min)
Normotenso Hipertenso
0
2
4
6
8
10
**
Atividade da ECA
(nmol/g/min)
Normotenso Hipertenso
0
1
2
3
4
Atividade da ECA
(nmol/mL/min)
A
B
C
Resultados 55
4.3- Reatividade Vascular
4.3.1- Efeito da Ang II e Ang I em anéis de carótidas de ratos.
Foram construídas curvas concentração–efeito para os peptídeos Ang II e Ang
I em anéis de carótidas isolados de ratos normotensos e hipertensos controles e
tratados com enalapril. As curvas concentração-efeito produzidas por estes
peptídeos têm como característica a forma de sino, isto é, apresentam um efeito
contrátil em concentrações menores de forma concentração dependente (10
-10
a
3x10
-7
para Ang II e 10
-10
a 10
-7
para Ang I), seguido por relaxamento a
concentrações maiores. Na figura 4 mostramos este comportamento para Ang I e
Ang II em anéis de carótida de ratos hipertensos. Diante do exposto, todos os
resultados a seguir (ratos hipertensos e normotensos) foram apresentados utilizando
somente a faixa de concentração de cada peptídeo que induz efeito contrátil. Não foi
observada nenhuma alteração nas curvas concentração-resposta a Ang II e Ang I
quando realizadas de forma consecutivas, com intervalos de 50 min entre elas,
numa mesma preparação.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Ang II
Ang I
Peptídeo Log [M]
Tensão (mg)
Figura 4. Curvas concentração-efeito obtidas pela administração de forma cumulativa de Ang II (10
-10
a 10
-7
M) e Ang I (10
-10
a 10
-6
M), mostrando efeito contrátil inicial, seguido de relaxamento em
carótidas de ratos SHR (n=5). Os valores são expressos como a média±EPM.
Resultados 56
4.3.2- Efeito da Ang II e Ang I em anéis de carótidas de ratos normotensos e
hipertensos controles e tratados com enalapril.
O tratamento crônico com enalapril não alterou as respostas induzidas por Ang
II em carótida de ratos normotensos e hipertensos (figura 5). Além disso, a resposta
contrátil induzida por Ang II em carótidas de ratos normotensos controles não difere
estatisticamente da resposta em ratos hipertensos controles.
Como esperado, o tratamento com enalapril induziu um deslocamento à direita
da curva concentração-resposta à Ang I, embora de pequena magnitude, tanto em
preparações de ratos normotensos (pD2 controle 8,94±0,07 vs. pD2 tratado
8,28±0,07; p<0,001) como de ratos hipertensos (8,25±0,08 vs. pD2 tratado 7,98 ±
0,1; p<0,05), conforme mostrado na figura 6. Nas figuras 5 e 6 agrupamos os valores
individuais dos grupos normotensos e hipertensos controles e tratados com enalapril
na ausência dos inibidores para uma melhor visualização das diferenças entre as
linhagens (Wistar e SHR) e a alterações induzidas pelo tratamento crônico com
enalapril.
Resultados 57
Figura 5: Curvas concentração-resposta a Ang II (10
-10
a 3x10
-7
M) em carótidas de ratos
normotensos e hipertensos controles (símbolos abertos) e tratados (símbolos fechados) com
enalapril, (n= 11). Os valores são expressos como a média±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Normotenso Controle
Normotenso Tratado
SHR Controle
SHR Tratado
Log [M] Ang II
Tensão (mg)
Resultados 58
Figura 6: Curvas concentração-resposta a Ang I (10
-10
a 10
-7
M) em carótidas de ratos
normotensos e hipertensos controles (símbolos abertos) e tratados (símbolos fechados) com
enalapril. Os valores são expressos como a média±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Normotenso Controle (n=10)
Normotenso Tratado (n=11)
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
SHR Controle (n=19)
SHR Tratado (n=20)
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
Resultados 59
As respostas contráteis induzidas pela Ang II e Ang I em carótidas de ratos
normotensos e hipertensos controles e tratados cronicamente com enalapril foram
abolidas na presença de losartan (figuras 7 e 8, respectivamente), mostrando que o
efeito induzido pela Ang II é devido à ativação do receptor AT
1
de angiotensina.
Figura 7: Curvas concentração-resposta a Ang II (10
-10
a 3x10
-7
M) em carótidas de ratos
normotensos (A) e hipertensos (B) controles e tratados (n=3-4) com enalapril na ausência
(símbolos abertos) e presença (símbolos fechados) de losartan (1µM). Os valores são
expressos como a média±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Controle
Controle +losartan
Tratado
Tratado+losartan
Log [M] Ang II
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Log [M] Ang II
Tensão (mg)
A
B
Resultados 60
Figura 8: Curva concentração-resposta a Ang I (10
-10
a 3x10
-7
M) em carótidas de ratos
normotensos (A) e) em carótidas de ratos hipertensos (B;10
-10
a 10
-7
M) controles e tratados
(n=4) com enalapril, na ausência (símbolos abertos) e presença (símbolos fechados) de
losartan (1 µM). p<0,001 entre as curvas controle e tratado, Two-Way ANOVA. Os valores
são expressos como a média±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Controle
Tratado
Controle + Losartan
Tratado +Losartan
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
A
B
Resultados 61
Durante a remoção e montagem dos anéis de carótida in vitro, que foram
mantidos em solução nutriente freqüentemente renovada na cuba de órgão isolado,
possivelmente ocorre dissociação do inibidor da ECA administrado in vivo ao animal.
Assim, foram realizadas curvas concentrações-efeito de forma cumulativa para Ang
II e Ang I em carótidas de ratos normotensos e hipertensos controles e tratados com
enalapril na presença do captopril.
A adição de captopril à solução nutriente que banha a preparação não
modificou as respostas contráteis induzida pela Ang II em carótidas de ratos
normotensos (figura 9A) e hipertensos (figura 9B) controles e tratados com enalapril.
Resultados 62
Figura 9.
Curva concentração-resposta a Ang II (10
-10
a 3x10
-7
M) em carótidas de ratos
normotensos (A) e hipertensos (B) controles e tratados (n=5-6) com enalapril na ausência
(símbolos abertos) e presença (símbolos fechados) de captopril (10
µM). Os valores são
expressos como a média
±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Controle
Controle+Captopril
Tratado
Tratado+Captopril
A
Log [M] Ang II
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
B
Log [M] Ang II
Tensão (mg)
Resultados 63
Na presença de captopril, adicionado à solução nutriente que banha a
preparação na cuba, observamos um deslocamento significativo da curva
concentração-resposta a Ang I à direita nas preparações obtidas de ratos
normotensos controles (pD
2
controle: 8,9±0,13 vs, pD
2
controle+captopril: 6,8±0,1,
p<0,001; figura 10A) e nos tratados com enalapril (pD
2
tratados: 8,2±0,11 vs. pD
2
tratado+captopril: 6±0,15, p<0,001; figura 10A).
Na figura 10B também verificamos um deslocamento significativo à direita da
curva concentração-resposta a Ang I em anéis de carótidas isoladas dos animais
hipertensos controles (pD
2
controle: 8,3±0,1 para pD
2
controle+captopril: 7,0±0,14,
p<0,001) e hipertensos tratados com enalapril por 7 dias (pD
2
tratado:
8,0±0,16 vs.
pD
2
tratado+captopril: 6,8±0,15, p<0,001). É interessante notar que o deslocamento
observado à direita da curva concentração-resposta a Ang I na presença de captopril
é proporcional (mesmo número de casas log de deslocamento) para os controles e
tratados dentro do grupo de animais normotensos; quando comparamos esse
deslocamento à direita entre os animais normotensos e hipertensos observamos um
deslocamento de menor magnitude nas artérias carótidas de ratos hipertensos
quando comparado com o verificado nas artérias de ratos normotensos, sugerindo
que a participação da ECA na formação de Ang II seja menos proeminente em
carotidas de ratos hipertensos.
Resultados 64
Figura 10: Curva concentração-resposta para Ang I (10
-10
a 10
-6
M) em carótidas de ratos
normotensos (A, n=4-5) e hipertensos (B, n=5-7) controles e tratados com enalapril na
ausência (símbolos abertos) e presença (símbolos fechados) de captopril (10
µM). Os
valores são expressos como a média
±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Controle
Controle+Captopril
Tratado
Tratado+ Captopril
A
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
B
Log [M] An
I
Tensão (mg)
Resultados 65
Para verificar a participação de vias alternativas, como a elastase-2, na
formação de Ang II em carótidas de ratos normotensos e hipertensos controles e
tratados com enalapril, foram realizadas curvas concentrações efeito de forma
cumulativa a Ang II e Ang I na ausência e presença da quimostatina (inibidor de
serino proteases como a elastase-2). A adição de quimostatina na cuba não alterou
a resposta vasoconstritora produzida pela Ang II em animais normotensos (figura
11A) e hipertensos (figura 11B) controles e tratados cronicamente com enalapril,
sugerindo que a quimostatina não altera a resposta contrátil induzida pelo peptídeo
biologicamente ativo Ang II.
Resultados 66
Figura 11:
Curva concentração-resposta a Ang II (10
-10
a 3x10
-7
M) em carótidas de ratos
normotensos (A, n=4-5) e (10
-10
a 10
-7
M) em carótidas de ratos hipertensos (B, n=4-5)
controles e tratados com enalapril na ausência (símbolos abertos) e presença (símbolos
fechados) de quimostatina (100
µM). Os valores são expressos como a média±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Controle
Controle+ Quimostatina
Tratado
Tratado + Quimostatina
A
Log [M] Ang II
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
B
Log [M] Ang II
Tensão (mg)
Resultados 67
Em anéis de carótidas de animais normotensos controles (figura 12A) e
tratados com enalapril (figura 12B) a adição da quimostatina à cuba deslocou à
direita (p<0,001) a curva cumulativa concentração-resposta produzida pela Ang I,
indicando a presença de vias alternativas de formação de Ang II independente da
ECA tanto em carótidas de ratos normotensos controle quanto em ratos
normotensos tratados com enalapril.
Figura 12: Curva concentração-resposta à administração de forma cumulativa de Ang II (10
-
10
a 10
-7
M) em carótidas de ratos normotensos controles (A) e tratados com enalapril (B) na
ausência (símbolos abertos) e presença (símbolos fechados) de quimostatina (100
µM).
(n=3). Os valores são expressos como a média
±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Controle
Controle+Quimostatina
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
Tratado
Tratado +Quimostatina
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
A
B
Resultados 68
Na presença de quimostatina, adicionado à solução nutriente na cuba,
observamos um deslocamento da curva concentração-resposta a Ang I à direita em
ratos hipertensos controles (figura 13 A; p=0,002, entre as curvas controle vs.
controle+quimostatina), sugerindo a presença de vias alternativas de formação de
Ang II independente da ECA em carótidas de ratos hipertensos.
Interessantemente, em animais hipertensos tratados com enalapril (figura 13 B)
a resposta à Ang I foi praticamente abolida na presença da quimostatina (p<0,0001,
entre as curvas tratado vs. tratado+quimostatina), indicando que o tratamento com
enalapril favorece a uma maior contribuição das vias alternativas na formação de
Ang II independente da ECA em animais hipertensos.
Resultados 69
Figura 13:
Curva concentração-resposta a administração de forma cumulativa de Ang II (10
-
10
a 3x10
-6
M) em carótidas de ratos hipertensos controle (A) e hipertensos tratados com
enalapril (B) na ausência (símbolos abertos) e presença (símbolos fechados) de
quimostatina (100
µM). (n=9). Os valores são expressos como a média±EPM.
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
A
Controle+Quimostatina
Controle
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
-10 -9 -8 -7 -6
0
100
200
300
400
500
B
Tratado
Tratado +Quimostatina
Log [M] Ang I
Tensão (mg)
Resultados 70
4.4- Expressão de RNAm para Elastase-2 em carótidas e corações de ratos
normotensos e hipertensos controles e tratados cronicamente com enalapril.
Os resultados encontrados na reatividade vascular de anéis de carótidas de
ratos hipertensos sugerem que o tratamento crônico com enalapril favoreça a uma
maior contribuição das vias alternativas para a formação de Ang II independente da
ECA, o que nos levou a investigar a expressão de RNAm para a elastase-2, enzima
formadora de Ang II.
O tratamento com enalapril por 7 dias aumentou significativamente a expressão
de RNAm para elastase-2 em carótidas de ratos hipertensos (p<0,0001) conforme
mostrado na figura 14, sugerindo que a elastase-2 possa ser a enzima responsável
pela conversão de Ang I em Ang II nos animais hipertensos tratados com enalapril.
Em carótidas de ratos normotensos tratados com enalapril embora ocorra tendência
em aumentar a expressão do RNAm para a elastase-2, esta não apresentou
diferença estatística significativa (figura 14).
Em corações de ratos hipertensos tratados cronicamente com enalapril (figura
15) a expressão do RNAm para elastase-2 também encontra-se aumentada
(p<0,0001), mostrando que esse efeito de aumento da expressão para elastase-2
ocorre em outros territórios e não é restrito a artéria carótida .
É interessante notar que a expressão de RNAm para elastase-2 em carótidas
de ratos hipertensos é 343 vezes maior em relação aos animais normotensos. Além
disso, observamos que expressão de RNAm para elastase-2 também encontra-se
aumentada em corações de ratos hipertensos, onde encontramos a expressão da
elastase-2 é 27 vezes maior em corações de ratos hipertensos em relação a
corações de ratos normotensos.
Resultados 71
Figura 14: Expressão de RNAm foi realizada por PCR em tempo real para elastase-2 em
carótidas (n=2-4) de ratos normotensos e hipertensos controles e tratados com enalapril. β-
actina foi utilizado como controle interno. Os valores da expressão relativa foram calculados
pelo método 2
-∆∆
CT e apresentados na forma logarítmica. A média do grupo normotenso foi
utilizado como normalizador em relação aos outros grupos. Os valores foram comparados
por ANOVA seguida do pós-teste Bonferroni´s. ** p<0,001 normotensive vs. SHR,
***p<0,001 SHR vs SHR enalapril.
Normotenso Controle
Nor
mot
e
nso
Trat
a
do
S
HR
Con
t
r
ol
e
S
HR T
r
atado
0
1
2
3
4
5
Carótida
mRNA
Elastase-2
Log
10
(Expressão relativa)
***
**
Resultados 72
Figura 15:
Expressão de RNAm foi realizada por PCR em tempo real para elastase-2 em
corações de ratos normotensos e hipertensos controles e tratados com enalapril. Os valores
da expressão relativa foram calculados pelo método 2
-∆∆
CT e apresentados na forma
logarítmica. β-actina foi utilizado como controle interno. A média do grupo normotenso foi
utilizado como normalizador em relação aos outros grupos. Os valores foram comparados
por ANOVA seguida do pós-teste Bonferroni´s. ** p<0,001 normotensive vs. SHR, ***p<0,01
SHR vs SHR enalapril.
Normo
te
nso Controle
Normotenso Tratado
SHR Controle
SHR Tratado
0
1
2
3
4
Coração
mRNA
Elastase-2
Log
10
(Expressão Relativa
)
***
**
5- DISCUSSÃO
Discussão 74
5- DISCUSSÃO
Vários estudos clínicos têm demonstrado os efeitos benéficos da utilização dos
inibidores da ECA no tratamento de inúmeras patologias como hipertensão
essencial, hipertensão renovascular, insuficiência cardíaca congestiva, nefropatia
diabética, disfunção ventricular esquerda, pós-infarto do miocárdio. Além disso, o
tratamento com inibidores da ECA apresenta significativa redução da mortalidade,
infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca e nos números de internações de
pacientes em hospitais por problemas cardíacos. (CONSESUS, 1987; Garg e Yusuf,
1995; Yusuf et al., 2000; Sleight, 2002; Dzau et al., 2002).
O rato espontaneamente hipertenso (SHR), que apresenta hipertensão de
forma espontânea e de origem genética (Okamoto e Aoki, 1963; Trippodo e Frohlich,
1981; Pinto et al., 1998, revisão), é reconhecido como um excelente modelo de
hipertensão experimental. A aumentada pressão arterial observada em SHR está
associada a níveis normais de atividade de renina plasmática e inalteração ou
modesto aumento da concentração de Ang II circulante (Bolterman et al., 2005). A
despeito disso, inibidores da ECA causam proeminente queda da pressão arterial
nos SHR, de fato, em nosso estudo, o tratamento com o anti-hipertensivo enalapril
em SHR reduziu significativamente os valores da pressão arterial, trazendo-a
próxima à verificada nos animais normotensos, enquanto não alterou a pressão
arterial dos normotensos. Estes achados estão de acordo com estudos realizados
em humanos e animais com diversos tipos de hipertensão (Sassano et al, 1984;
Otsuka et al., 1998; Aihara et al., 1999; Fogari et al., 2004) bem como em animais
normotensos (Stanziola et al., 1999).
Discussão 75
A atividade plasmática e tecidual da ECA em ratos normotensos e hipertensos
foi completamente suprimida com o tratamento crônico com enalapril por 7 dias, e
estes achados também foram demonstrados por outros autores (Otsuka et al., 1998;
Stanziola et al., 1999). De fato, o enalapril é um pró-farmaco, que é convertido no
fígado por esterases no produto ativo denominado enalaprilato, que inibe totalmente
a atividade da ECA plasmática cerca de 3 horas após sua administração (Lees e
Reid, 1987; MacFadyen et al., 1993). Em ratos hipertensos a atividade da ECA
tecidual (aorta e carótida) encontrava-se diminuída em relação aos ratos
normotensos, enquanto a atividade da ECA plasmática não apresenta diferença
entre animais hipertensos e normotensos, sugerindo que em animais hipertensos a
ECA tecidual contribua de forma menos proeminente que em animais normotensos.
Alguns trabalhos têm mostrado que a atividade plasmática da ECA (Jandeleit et al.,
1992) e os níveis plasmáticos de Ang II (Morishita et al., 1995) não apresentam
diferença significativa entre animais normotensos e SHR, bem como no modelo de
hipertensão tipo um rim-um clip (Salgado et al., 1991). Em contrapartida, Trippodo e
Frohlich (1981) mostraram que a atividade da ECA plasmática encontra-se
diminuída no SHR enquanto Otsuka et al. (1998) e Kirimura et al. (2005) mostraram
que a atividade da ECA no plasma e em aortas de ratos hipertensos encontrava-se
aumentada em relação aos normotensos, porém, esses autores utilizaram animais
com mais de 16-20 semanas de idade, o que poderia explicar a diferença em
relação aos nossos achados.
É intrigante o fato de que o tratamento com inibidor da ECA é capaz de diminuir
a pressão arterial de SHR que possuem atividade da renina normal e atividade da
ECA tecidual e plasmática diminuída ou inalterada, respectivamente, ou em
pacientes hipertensos não-dependentes de renina, o que indicaria que os efeitos dos
Discussão 76
inibidores da ECA não são somente devido à inibição da ECA e, por conseguinte, a
diminuição da formação de Ang II. Cabe salientar que muitos dos efeitos teciduais
dos inibidores da ECA (fibrose, hipertrofia vascular e cardíaca, proliferação de
capilares sangüíneos) não estão relacionados à capacidade que estas drogas
possuem de diminuir a pressão arterial. Assim, fica claro que, a inibição da
conversão de Ang I em Ang II não explica satisfatoriamente todos os efeitos anti-
hipertensivos e teciduais dos inibidores da ECA. Além de converter Ang I em Ang II,
a ECA degrada BK (Yang et al., 1971). Assim, poder-se-ia esperar que os efeitos
dos inibidores dessa enzima estivessem relacionados, ao menos em parte, a um
aumento nas concentrações plasmáticas e/ou teciduais desse peptídeo. De fato,
inúmeros estudos têm sugerido a participação das cininas nos efeitos hipotensor,
anti-hipertróficos (hipertrofia cardíaca e vascular), antiisquêmicos, bem como na
inibição do remodelamento cardíaco, produzidos pelos inibidores da ECA (Linz et al.,
1995). A BK desencadeia seus efeitos biológicos por atuar em dois subtipos de
receptores, B1 e B2. A estimulação dos receptores B2 nas células endoteliais leva à
liberação de óxido nítrico (NO) e prostaciclina (PGI2) (Wiemer et al., 1991 e 1994;
Busse et al., 1993), os quais são capazes de produzir vasodilatação. Por sua vez,
inibidores da ECA aumentam a liberação de NO e PGI2, efeito que tem sido
relacionado à estimulação de receptores B2. Entretanto, potencialização dos efeitos
da BK, produzida pelos inibidores da ECA, tem sido relatada em condições
experimentais nas quais não se observa um aumento nas concentrações desse
peptídeo (Auch-Schwelk et al., 1993), sugerindo que os efeitos dessas drogas não
estejam totalmente relacionados a um menor metabolismo da BK e, portanto, uma
maior biodisponibilidade. Mais recentemente, vários estudos têm demonstrado a
existência de uma interação entre o receptor de BK e ECA; a inibição da ECA levaria
Discussão 77
ao aumento da atividade espontânea do receptor B2 e estabilização/re-
sensibilização desses receptores em um estado de alta afinidade, potencializando o
efeito da BK (Erdos et al., 1999).
Outras ações que poderiam explicar os efeitos dos inibidores da ECA estão
relacionadas ao metabolismo da Ang I por vias independentes da ECA, bem como a
ações intracelulares mediadas por essa enzima. Assim, a inibição da ECA causa
aumento nos níveis de Ang I tecidual que pode ser hidrolisada por outras enzimas, o
que levaria à formação dos peptídeos Ang 1-9 e Ang 1-7, dentre outros fragmentos.
Estes fragmentos da Ang I também são capazes de potencializar os efeitos da BK
(Maia et al., 2004). Por outro lado, também tem sido descrito que os inibidores da
ECA aumentam a fosforilação do resíduo de serina, presente na cadeia
citoplasmática da ECA, o que desencadeia uma série de reações intracelulares que
resultam na fosforilação da proteína c-Jun (um dos componentes do complexo AP-1,
importante regulador da expressão gênica) e sua posterior translocação para o
núcleo da célula, sugerindo uma via de sinalização celular mediada pela própria
ECA, a qual pode afetar a expressão gênica de outras proteínas. Nesse sentido, os
inibidores da ECA são capazes de causar aumento na expressão da ciclooxigenase-
2 em células endoteliais, o qual é acompanhado de um incremento na síntese e
liberação de PGI2 (Kohlstedt et al.,2005), potente agente vasodilatador. Esses
resultados explicariam como o tratamento crônico com inibidores da ECA induz
aumento na produção de PGI2 em humanos e sugerem novo mecanismo de ação
para os inibidores da ECA.
Outro achado relacionado à utilização dos inibidores da ECA é que pacientes
hipertensos tratados cronicamente com estas drogas apresentam retorno da
concentração plasmática de Ang II a níveis comparáveis aos de pacientes
Discussão 78
hipertensos não tratados (Biollaz et al., 1980; Juillerat et al., 1990, Abe et al., 1999).
Este dado intrigante tem dado margem a uma série de considerações sobre o
envolvimento de outros sistemas geradores de Ang II nos tecidos, cuja importância
em processos fisiológicos ou patológicos ou implicação nos efeitos dos inibidores da
ECA ainda não estão esclarecidas. Assim várias enzimas, além da renina e da ECA,
são capazes de gerar Ang I e/ou Ang II a partir de precursores diversos tais como
angiotensinogênio, Ang I, TDP e [Pro
11
-D-Ala
12
] Ang I, sendo descritas como vias
alternativas de geração de angiotensina II (Mangiapane et al., 1994; Hoit et al., 1995;
Garrison et al., 1997; Murakami et al., 1997; Waldeck et al., 1997; Wolny et al., 1997;
Nishimura et al., 1998; Inoue et al., 1999; Santos et al., 2003; Becari et al., 2005).
Para o estudo da funcionalidade das vias de geração de Ang II, as repostas à
Ang I na presença de inibidores seletivos de proteases que possam estar implicadas
na conversão de Ang I em Ang II têm sido comumente utilizadas. Em nosso estudo,
verificamos inicialmente que Ang II e Ang I apresentam resposta em forma de sino,
isto é, apresenta um efeito contrátil inicial, concentração dependente, seguido por
relaxamento, em anéis de carótida isolados de ratos normotensos e hipertensos.
Esse é um fenômeno conhecido em relação aos efeitos induzidos por Ang II em
preparações isoladas de músculo liso e parece estar relacionado à dessensibilização
(“down regulation”) ou internalização de receptores (Hunyady, 1999). Os
mecanismos envolvidos no processo de dessensibilização de receptores do tipo AT1
podem incluir: mudança para um estado de baixa afinidade ou internalização. Além
disso, o efeito de relaxamento observado em altas concentrações de Ang II e seus
precursores pode estar ocorrendo pela ativação de receptores AT2 (Widdop et al.,
2002), que induz relaxamento da musculatura lisa vascular (Dimitropoulou et al.,
2001). Em animais com deleção de receptores AT2 observa-se um aumento da
Discussão 79
resposta vasoconstritora a Ang II (Hein et al., 1995). Em nosso estudo, no entanto,
não verificamos a participação dos receptores AT2, já que a resposta induzida pela
Ang I em carótidas de ratos normotensos não foi alterada na presença do
antagonista de receptor AT2 PD123319 (Becari et al., 2005). Em nosso protocolo
experimental, esperávamos um intervalo de 50 minutos entre as curva
concentração-efeito induzidas por Ang I e II, para evitar a ocorrência de taquifilaxia,
como já demonstrado anteriormente em nosso laboratório (Becari et al., 2005).
As respostas contráteis induzidas por Ang II em anéis de artérias carótidas de
ratos normotensos e hipertensos não apresentaram diferença significativa entre si,
indicando que a responsividade à Ang II nesta preparação vascular não foi alterada
pelo estado hipertensivo. O tratamento crônico com enalapril também não alterou a
resposta contrátil induzida pela Ang II em ambos os grupos. O fato da inibição
crônica da ECA pelo enalapril não alterar a resposta à Ang II em animais
normotensos e hipertensos indica que este tratamento não modificou a interação da
Ang II ao receptor de AT1 ou mesmo a quantidade de receptores AT1 nas carótidas
dos ratos.
A comparação da resposta à Ang I entre os animais normotensos e hipertensos
mostra que a curva concentração-resposta à Ang I em carótidas de ratos
hipertensos apresentou-se deslocada à direita em relação à curva concentração-
resposta dos animais normotensos, indicando que a conversão Ang I em Ang II no
tecido vascular apresentava-se diminuída nos animais hipertensos. Corroborando
com esta hipótese, está o fato da resposta contrátil induzida pela Ang II não
apresentar diferença entre as linhagens e a atividade da ECA tecidual apresentar-se
diminuída em carótidas de hipertensos. Kirimura et al. (2005) mostraram que a
resposta contrátil induzida pela Ang I em carótidas de animais hipertensos
Discussão 80
apresentou uma tendência a ser menor que a observada em carótidas de ratos
normotensos; no entanto, o fato desses autores não observarem diferença
estatística significativa entre os grupos poderia ser explicada pelo fato de utilizarem
somente uma dose de Ang I para a indução da resposta contrátil.
A realização de curvas concentração-resposta a Ang II e Ang I na presença e
ausência de inibidores e antagonistas é uma prática comum em farmacologia para
mostrar a participação de enzimas na clivagem dos peptídeos bem como a interação
dos peptídeos com seus receptores. As respostas contráteis induzidas pela Ang II e
Ang I em anéis isolados de carótida de ratos normotensos e hipertensos controles e
tratados com enalapril foram abolidas na presença de losartan, antagonista seletivo
do receptor AT
1
, evidenciando que a resposta contrátil induzida pelo substrato Ang I
são precedidas pela conversão em Ang II e subseqüente ativação dos receptores
AT
1
.
As respostas contráteis produzidas pela Ang II em carótidas de ratos
normotensos e hipertensos controles e tratados com enalapril não apresentaram
diferenças estatísticas na presença de captopril (inibidor da ECA) ou quimostatina
(inibidor de serino protease, como elastase-2), indicando que, nas condições
utilizadas em nossos experimentos, esses inibidores não alteraram a resposta do
peptídeo biologicamente ativo Ang II em anéis de carótidas de ratos normotensos e
hipertensos.
Vários trabalhos têm mostrado que a formação da Ang II não é completamente
bloqueada na presença de captopril “in vitro” em diferentes órgãos e espécies
(Akasu et al., 1998; Inoue et al., 1999; McDonald et al., 2001; Richard et al., 2001;
Santos et al., 2002, Becari et al., 2005), indicando a presença de vias de formação
da Ang II independente da ECA. Na presença de captopril, adicionado “in vitro” à
Discussão 81
solução nutriente na cuba, observamos um significativo deslocamento da curva
concentração-resposta a Ang I à direita tanto nas preparações obtidas de ratos
normotensos e hipertensos controles como nos tratados, indicando que ao lavarmos
a preparação na cuba de ensaio de reatividade vascular com a solução nutriente
removemos parcialmente a inibição da ECA pelo enalaprilato induzida durante o
tratamento crônico com enalapril “in vivo” por 7 dias. Nota-se, no entanto, que o
deslocamento observado à direita da curva concentração-resposta a Ang I na
presença de captopril é proporcional (mesmo número de casas logarítmicas de
deslocamento) para os controles e tratados dentro de cada grupo de animal. No
entanto, quando comparamos esse deslocamento à direita entre os animais
normotensos e hipertensos observamos um deslocamento de menor magnitude nas
artérias carótidas de ratos hipertensos quando comparado com o verificado nas
artérias de ratos normotensos, sugerindo que a participação da ECA na formação de
Ang II seja menos proeminente em carótidas de ratos hipertensos. Este achado
indica uma menor contribuição da ECA na conversão de Ang I em Ang II em
carótidas de ratos hipertensos e está de acordo com o achado de menor atividade
da ECA neste tecido quando comparada com o de ratos normotensos.
Uma ferramenta farmacológica muito utilizada para caracterizar vias de
formação de Ang II independente da ECA é a quimostatina, um inibidor de serino
proteases como quimase humana ou elastase-2 de ratos. Com o uso da
quimostatina foi caracterizada a existência de vias alternativas de formação de Ang
II em diferentes espécies e órgãos (Ideishi et al., 1990; Mangiapane et al., 1994;
Leite et al., 1997; Akasu et al., 1998; Inoue et al. 1999; Richard et al., 2001; Santos
et al., 2002; Becari et al., 2005). A adição de quimostatina na solução nutriente que
banha a preparação deslocou à direita a curva concentração-resposta induzida pela
Discussão 82
Ang I nos ratos normotensos e hipertensos controles. Esses resultados sugerem a
existência de via independente da ECA para geração de Ang II a partir da Ang I em
carótida de ratos normotensos e hipertensos que envolve serino proteases sensíveis
à quimostatina. Várias enzimas, incluindo a tripsina, quimotripsina, quimases
humana e elastase- 2 de rato produzem Ang II in vitro, por meio da clivagem da
ligação Phe
8
-His
9
da Ang I (Urata et al., 1995; Hollenberg et al., 1998; Santos et al.,
2003). Porém, algumas destas enzimas, como tripsina e quimiotripsina, degradam a
Ang II (Le Trong et al., 1987). As quimases são descritas como via alternativa à ECA
para geração de Ang II, porém dependendo da espécie estudada a quimase pode
ser geradora ou degradadora de Ang II. Kunori et al. (2005) mostraram que a
cinética de formação de Ang II pelas quimases de diferentes espécies segue a
seguinte ordem cão>humana>hamster>camundongo>rato (Kcat/Km: 18, 11, 0,69,
0,059, 0,0030 µM
-1
min
-1
, respectivamente), enquanto a atividade degradadora de
Ang II das quimases é: hamster>rato>mouse>cão (Kcat/Km: 5,4, 4,8, 0.39, 0,29 µM
-
1
min
-1
, respectivamente), indicando que a quimase humana apresenta somente
atividade geradora de Ang II enquanto a quimase de rato apresenta atividade
degradadora de Ang II. A elastase-2 de rato somente apresenta atividade formadora
de Ang II, com alta atividade catalítica na conversão de Ang I em Ang II; a elastase-2
é secretada no perfusato de leito arterial mesentérico e coronariano e apresenta
atividade funcional em carótidas, aortas, mesentérios e coração; além disso, a
expressão de RNAm para a elastase-2 é encontrada em diferentes órgãos de ratos
normotensos e hipertensos (Oliveira et al., 1991; Paula et al.,1998; Santos et
al.,2002; Santos et al.,2003, Becari et al., 2005), inclusive no hipocampo de cérebros
de ratos Wistar (dados não publicados), sugerindo que a enzima responsável pela
formadora de Ang II independente da ECA em ratos seja a elastase-2. É
Discussão 83
interessante citar que o papel das quimases na formação de Ang II em ratos, com os
uso de quimostatina, tem sido superestimada na literatura.
Na presença de quimostatina a curva concentração-resposta induzida pela Ang
I em carótidas de ratos normotensos tratados com enalapril por 7 dias foi deslocada
à direita de forma significativa e em ratos hipertensos tratados cronicamente com
enalapril a resposta a Ang I foi praticamente abolida, sugerindo que ao inibir
cronicamente a ECA com enalapril ocorre um favorecimento da participação da(s)
via(s) alternativa(s) de geração de Ang II em ratos normotensos e a participação
desta(s) via(s) é mais proeminente em ratos hipertensos. Tsunemi et al. (2002)
estudando aneurisma de aorta abdominal em humanos encontraram que ambas as
vias dependentes da ECA e de quimase estão aumentadas em extrato de aorta com
aneurisma abdominal e em um grupo de pacientes tratados com inibidores da ECA a
atividade da ECA apresentou tendência em diminuir enquanto a atividade da
quimase tendeu em aumentar na aorta com aneurisma, porém o tratamento com
inibidor da ECA não altera a atividade da ECA e da quimase em aortas normais,
indicando o favorecimento de vias alternativas de formação de Ang II na inibição
crônica da ECA parece ser importante em determinadas patologias.
Em conjunto, os resultados obtidos com os inibidores de proteases na resposta
induzida pela Ang I sugerem que a inibição crônica da ECA com enalapril favoreceu
uma maior participação de serino proteases, possivelmente a elastase-2, na
formação de Ang II a partir da Ang I. Esta via sensível à quimostatina e capaz de
gerar Ang II parece ter sua atividade aumentada de forma marcante em carótida de
ratos hipertensos. A análise da expressão de RNAm para a elastase-2 no tecido
carotídeos confirma esta possibilidade, já que a mesma se encontrava aumentada
em carótidas de animais hipertensos em relação aos normotensos. É interessante
Discussão 84
observar que esse aumento da expressão da elastase-2 associada à inibição crônica
da ECA não se restringe somente à artéria carótida, pois o mesmo foi verificado em
coração de ratos hipertensos, indicando que o aumento da expressão de RNAm
para elastase-2 ocorra de modo geral no organismo quando a ECA encontre-se
inibida. Além disso, a atividade da ECA em carótidas de hipertensos é menor que
dos normotensos, o que poderia explicar porque a elastase-2 contribui de forma
predominante para a geração de Ang II nos animais hipertensos quando a ECA
encontra-se inibida.
O presente trabalho mostrou que em carótidas de animais hipertensos a via
alternativa para formação de Ang II apresenta-se aumentada em relação à de ratos
normotensos e que o tratamento crônico com inibidor da ECA favoreceu uma maior
participação da elastase-2, uma via alternativa a ECA, na formação de Ang II. A
cada nova descoberta de enzimas, peptídeos e vias formadoras do SRA fica nítida a
complexidade deste sistema, bem como sua importância fisiológica e seu papel em
determinadas patologias. Os inibidores da ECA são utilizados como
antihipertensivos há cerca de 30 anos e apresentam alta eficácia terapêutica; porém,
o(s) mecanismo(s) de ação desta droga ainda não são completamente entendidos.
Ainda há muito o quê se entender do papel de proteases que podem gerar Ang II em
condições normais ou patológicas e o efeito de seus inibidores nestas situações.
6- CONCLUSÃO
Conclusão 86
6- CONCLUSÃO
Em conjunto, estes resultados indicam que a elastase-2 participa da conversão
de Ang I em Ang II na carótida e que sua atividade e/ou expressão encontra-se
aumentada na vigência da inibição da ECA em carótidas de ratos normotensos e de
forma mais proeminente em hipertensos.
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências bibliográficas 88
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Abe F, Omata K, Yamada M, Tsunoda K, Sato T, Shimizu T, Ito S, Abe K,
Nakazima M, Morimoto T, Takanashi N. Specific direct radioimmunoassay of
angiotensin II (AT II) in human plasma and the effect of angiotensin converting
enzyme (ACE) inhibitor. Immunopharmacol 1999; (44): 199-204.
- Aihara H, Ogawa H, Kasuya A, Yoshida M, Suzuki-Kusaba M, Hisa H, Satoh S.
Intrarenal angiotensin converting enzyme inhibition in spontaneously hypertensive
rats. Eur J Pharmacol 1999; (373): 35-40.
- Akasu M, Urata H, Kinoshita A, Sasaguri M, Ideishi M, Arakawa K. Differences in
tissue angiotensin II-forming pathways by species and organs in vitro.
Hypertension 1998; 32(3):514-20.
- Arakawa K, Serine protease angiotensin II systems. J Hypertens Suppl 1996;
14(S):3-7.
- Ardaillou R. Angiotensin II receptors. J Am Soc Nephrol 1999;10:S30-S39
- Auch-Schwelk W, Kuchenbuch C, Claus M, Walther B, Bossaller C, Friedel N,
Graf K, Gräfe M, Fleck E. Local regulation of vascular tone by bradykinin and
angiotensin converting enzyme inhibitors.Eur Heart J. 1993; 14 (Suppl I):154-160.
- Balcells E, Meng QC, Johnson WH Jr, Oparil S, Dell'Italia LJ. Angiotensin II
formation from ACE and chymase in human and animal hearts: methods and
species considerations. Am J Physiol 1997; (273): H 1769-H1774.
- Bastos M, Maeji NJ, Abeles RH. Inhibitors of human heart chymase based on a
peptide library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92(15):6738-6742.
Referências bibliográficas 89
- Becari C, Sivieri DO Jr, Santos CF, Moyses MK, Oliveira EB, Salgado MC. Role
of elastase-2 as an angiotensin II-forming enzyme in rat carotid artery. J
Cardiovasc Pharmacol 2005; (46):498-504.
- Biollaz J, Brunner HR, Gavras I, Waeber B, Gavras H. Antihypertensive therapy
with MK 421: angiotensin II--renin relationships to evaluate efficacy of converting
enzyme blockade. J Cardiovasc Pharmacol. 1982;4(6):966-972.
- Bolterman RJ, Manriquez MC, Ortiz Ruiz MC, Juncos LA, Romero JC. Effects of
captopril on the renin angiotensin system, oxidative stress, and endothelin in
normal and hypertensive rats. Hypertension. 2005;46(4):943-947.
- Boucher R, Demassieux S, Garcia R, Genest J. Tonin, angiotensin II system.
Circ Res. 1977;41(4 Suppl 2):26-29.
- Braun-Menéndez E, Fasciolo JC. Acción vasoconstrictora e hipertensora de la
sangre venosa del riñón en isquemia incomple ta aguda. Rev Soc Arg Biol 1939;
(15): 61–172.
- Braun-Menendez E, Page IH. Suggested Revision of Nomenclature--
Angiotensin. Science 1958; 127 (3292):242.
- Busse R, Fleming I, Hecker M. Endothelium-derived bradykinin: implications for
angiotensin-converting enzyme-inhibitor therapy. J Cardiovasc Pharmacol. 1993;
22 (Suppl 5):S31-S36.
- Campbell DJ, Circulating and tissue angiotensin systems. J Clin Invest 1987;
(79):1-6.
Referências bibliográficas 90
- Carey RM, Siragy HM. Newly recognized components of the renin-angiotensin
system: potential roles in cardiovascular and renal regulation.Endocr Rev. 2003;
24(3):261-271
- Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM. Role of the angiotensin type 2 receptor in the
regulation of blood pressure and renal function. Hypertension 2000; (35):55-163.
- Carvalho, Maria Helena C ; Colaço, Andre Luiz ; Silva, Luiz Borges Bispo da ;
Salgado, M. C. O. . Aspectos farmacologicos dos inibidores da ECA e dos
receptores de angiotensina II. Revista brasileira de hipertensão, Brasil, v. 12, n. 2,
p. 97-102, 2005.
- Chiu At, Herblin Wf, Ardecky Rj, et al. Identification of angiotensin II receptor
subtypes. Biochem Biophys Res Commun 1989;165:196-203.
- Cornish KG, Joyner WL, Gilmore JP. Evidence for the conversion of angiotensin I
to angiotensin II by the coronary microcirculation. Blood Vessels 1979;(16):241-
246.
- Cushman DW, Cheung HS, Sabo EF, Ondetti MA. Design of potent competitive
inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Carboxyalkanoyl and
mercaptoalkanoyl amino acids. Biochemistry 1977; 16(25):5484-5491.
- Cushman DW, Ondetti MA. Inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Prog Med
Chem. 1980; (17): 41-104.
- De Gasparo M, Catt KJ, Inagami T, Wright JW, Unger T. International Union of
Pharmacology. XXIII. The Angiotensin II Receptors. Pharmacol Rev 2000;
(52):415–472.
Referências bibliográficas 91
- Dimitropoulou C, White RE, Fuchs L, Zhang H, Catravas JD, Carrier GO.
Angiotensin II relaxes microvessels via the AT(2) receptor and Ca(2+)-activated
K(+) (BK(Ca)) channels. Hypertension 2001; (37):301-307.
- Dzau VJ, Bernstein K, Celermajer D, Cohen J, Dahlöf B, Deanfield J, Diez
J,Drexler H, Ferrari R, Van Gilst W, Hansson L, Hornig B, Husain A, Johnston
C,Lazar H, Lonn E, Lüscher T, Mancini J, Mimran A, Pepine C, Rabelink T,
Remme W,Ruilope L, Ruzicka M, Schunkert H, Swedberg K, Unger T, Vaughan D,
Weber M. Pathophysiologic and therapeutic importance of tissue ACE: a
consensus report. Cardiovasc Drugs Ther. 2002; (16):149-160.
- Erdös EG, Deddish PA, Marcic BM. Potentiation of Bradykinin Actions by ACE
Inhibitors. Trends Endocrinol Metab. 1999;10(6):223-229.
- Fogari R, Mugellini A, Zoppi A, Marasi G, Pasotti C, Poletti L, Rinaldi A, Preti P.
Effects of valsartan compared with enalapril on blood pressure and cognitive
function in elderly patients with essential hypertension. Eur J Clin Pharmacol.
2004; 59(12):863-868.
- Garg R, Yusuf S. Overview of randomized trials of angiotensin-converting
enzyme inhibitors on mortality and morbidity in patients with heart failure.
Collaborative Group on ACE Inhibitor Trials. JAMA 1995; 10;273(18):1450-1456.
- Garrison EA, Champion HC, Kadowitz PJ. [Pro
11
,D-Ala
12
]angiotensin I has rapid
onset vasoconstritor activity in the cat. Am J Physiol 1997; (273):E1059-E1064.
- Goldblatt H, Lynch J, Hanzal RF, Summerville WW. Studies on experimental
hypertension, I: the production of persistent elevation of systolic blood pressure by
means of renal ischemia. J Exp Med 1934; (59):347–379.
Referências bibliográficas 92
- Hein L, Barsh GS, Pratt RE, Dzau VJ, Kobilka BK. Behavioural and
cardiovascular effects of disrupting the angiotensin II type-2 receptor in mice.
Nature 1995; 377(6551):744-747.
- Hoit BD, Shao Y, Kinoshita A, Gabel M, Husain A, Walsh RA. Effects of
angiotensin II generated by an angiotensin converting enzyme-independent
pathway on left ventricular performace in the conscious baboon. J Clin Invest 1995;
(95):1519-1527.
- Hollenberg NK, Fisher ND, Price DA. Pathways for angiotensin II generation in
intact human tissue: evidence from comparative pharmacological interruption of
renin system. Hypertension 1998; (32):387-392.
- Hunyady L. Molecular mechanisms of angiotensin II receptor internalization. J
Am Soc Nephrol. 1999; (peripheral circulation. Life Sci. 1990; (46):335-341.
- Ideishi M, Sasaguri M, Ikeda M, Arakawa K. Substrate-dependent angiotensin II
formation in the T. Angiotensin I converting enzyme of the lung. Circ Res 1972;
31(Suppl 2):51-61.
- Ideishi M, Sasaguri M, Ikeda M, Arakawa K. Substrate-dependent angiotensin II
formation in the peripheral circulation. Life Sci. 1990;46(5):335-341.
- Igic R, Erdös EG, Yeh HS, Sorrells K, Nakajima T. Angiotensin I converting
enzyme of the lung. Circ Res. 1972 ; 31(9):Suppl 2:51-61.
- Inoue K, Nishimura H, Kubota J, Kawamura K. Alternative angiotensin II
formation in rat arteries occurs only at very high concentration of angiotensin I.
Hypertension 1999; (34):525-530.
Referências bibliográficas 93
- Jandeleit K, Perich R, Jackson B, Johnston CI. Mesenteric resistance and brain
microvascular angiotensin-converting enzyme in the spontaneously hypertensive
rat. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1992; 19(5):348-352.
- Jorde UP, Ennezat PV, Lisker J, Suryadevara V, Infeld J, Cukon S, Hammer A,
Sonnenblick EH, Le Jemtel TH. Maximally recommended doses of angiotensin-
converting enzyme (ACE) inhibitors do not completely prevent ACE-mediated
formation of angiotensin II in chronic heart failure. Circulation 2000; 101(8):844-
846.
- Juillerat L, Nussberger J, Menard J, Mooser V, Christen Y, Waeber B, Graf P,
Brunner HR. Determinants of angiotensin II generation during converting enzyme
inhibition. Hypertension 1990; (16):564-572.
- Kirimura K, Takai S, Jin D, Muramatsu M, Kishi K, Yoshikawa K, Nakabayashi M,
Mino Y, Miyazaki M. Role of chymase-dependent angiotensin II formation in
regulating blood pressure in spontaneously hypertensive rats. Hypertens Res.
2005; (28):457-464.
- Kohlstedt K, Busse R, Fleming I. Signaling via the angiotensin-converting
enzyme enhances the expression of cyclooxygenase-2 in endothelial cells.
Hypertension. 2005;45(1):126-132.
- Kunori Y, Muroga Y, Iidaka M, Mitsuhashi H, Kamimura T, Fukamizu A. Species
differences in angiotensin II generation and degradation by mast cell chymases.J
Recept Signal Transduct Res. 2005;25(1):35-44.
Referências bibliográficas 94
- Le Trong H, Neurath H, Woodbury RG. Substrate specificity of the chymotrypsin-
like protease in secretory granules isolated from rat mast cells. Proc Natl Acad Sci
U S A 1987; (84):364-367.
- Lees KR, Reid JL. Age and the pharmacokinetics and pharmacodynamics of
chronic enalapril treatment. Clin Pharmacol Ther. 1987a; 41(6):597-602.
- Lees KR, Reid JL. Haemodynamic and humoral effects of oral perindopril, an
angiotensin converting enzyme inhibitor, in man.Br J Clin Pharmacol. 1987b;
23(2):159-164.
- Leite R, Estevao R, Resende AC, Salgado MCO. Role of endothelium in
angiotensin II formation by the rat aorta and mesenteric arterial bed. Braz J Med
Biol Res 1997; (30):649-656.
- Leite R, Salgado MCO. Increased vascular formation of angiotensin II in one-
Kidney, one clip hypertension. Hypertension 1992; (19):575-581.
- Linz W, Wiemer G, Gohlke P, Unger T, Schölkens BA. Contribution of kinins to
the cardiovascular actions of angiotensin-converting enzyme inhibitors. Pharmacol
Rev. 1995 Mar;47(1):25-49.
- Linz W, Scholkens BA, Ganten D. Converting enzyme inhibition specifically
prevents the development and induces regression of cardiac hypertrophy in rats.
Clin Exp Hypertens A 1989; A(11):1325-1350.
- Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;
25(4):402-408.
Referências bibliográficas 95
- Mac Donald RJ, Swift GH, Quinto C, Swain W, Pictet RL, Nikovits W, Rutter WJ.
Primary structure of two distinct rat pancreatic preproelastases determined by
sequence analysis of the complete cloned messenger ribonucleic acid sequences.
Biochemistry 1982; (21):1453-1463.
- MacFadyen RJ, Meredith PA, Elliott HL. Differential effects of ACE inhibiting
drugs: evidence for concentration-, dose-, and agent-dependent responses. Clin
Pharmacol Ther. 1993; 53(6):622-629.
- Maia LG, Ramos MC, Fernandes L, de Carvalho MH, Campagnole-Santos MJ,
Souza dos Santos RA. Angiotensin-(1-7) antagonist A-779 attenuates the
potentiation of bradykinin by captopril in rats. J Cardiovasc Pharmacol. 2004;
43(5):685-691.
- Mangiapane ML, Rauch Al, MacAndrew JT, Ellery SS, Hoover KW, Knight FR,
Jonhnson HÁ, Magee WP, Cushing DJ, Buchholz RA. Vasoconstrictor action of
angiotensin I-convertase and the synthetic substrate [Pro
11
,D-Ala
12
]angiotensin I.
Hypertension 1994; (23):857-860.
- Maruta H, Arakawa K. Confirmation of direct angiotensin formation by Kalikrein.
Biochem J 1983; (213):193-200.
- McDonald JE, Padmanabhan N, Petrie MC, Hillier C, Connell JM, McMurray JJ.
Vasoconstrictor effect of the angiotensin-converting enzyme-resistant, chymase-
specific substrate [Pro
11
-D-Ala
12
] angiotensin I in human dorsal hand veins: in vivo
demonstration of non-ace production of angiotensin II in humans. Circulation 2001;
104(15):1805-1808.
Referências bibliográficas 96
- Mento PF, Wilkes BM. Plasma angiotensins and blood pressure during
converting enzyme inhibition. Hypertension 1987;9(6 Pt 2):III42-III48.
- Morishita R, Higaki J, Nakamura Y, Aoki M, Yamada K, Moriguchi A, Rakugi H,
Tomita N, Tomita S, Yu H, et al. Effect of an antihypertensive drug on brain
angiotensin II levels in renal and spontaneously hypertensive rats. Clin Exp
Pharmacol Physiol. 1995; 22(9):665-669.
- Morishita R, Higaki J, Okunishi H, Kawamoto T, Ishii K, Nakamura F, Katahira K,
Nagano M, Mikami H, Miyazaki M, et al. Effect of long-term treatment with an
angiotensin-converting enzyme inhibitor on the renin-angiotensin system in
spontaneously hypertensive rats. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1991; 18(10):685-
690.
- Murakami M, Matsuda H, Kubota E, Wakino S, Honda M, Hayashi K, Saruta T.
Role of angiotensin II generated by angiotensin converting enzyme-independent
pathways in canine kidney. Kidney Int Suppl 1997; (63):S132-S135.
- Nishimura H, Buikema H, Baltatu O, Ganten D, Urata H. Funcional evidence for
alternative AngII-forming pathways in hamster cardiovascular system. Am J Physiol
1998; (275):H1307-H1312.
- Okamoto K, Aoki K. Development of a strain of spontaneously hypertensive rats.
Jpn Circ J. 1963; (27):282-293.
- Okamura T, Okunishi H , Ayajiki K, Toda N. Conversion of angiotensin I to
angiotensin II in dog isolated renal artery: role of two differente angiotensin II-
generanting enzymes. J Cardiovasc Pharmacol 1990; (15):353-359.
Referências bibliográficas 97
- Okunishi H, Miyazaki M, Okamura T, Toda N. Different distribution of two types
of angiotensin II-generating enzymes in the aortic wall. Biochem Biophys Res
Commun 1987; (149):1186-1192.
- Okunishi H, Miyazaki M, Toda N. Evidence for a putatively new angiotensin II-
generating enzyme in the vascular wall. J Hypertens 1984; (2):277-284.
- Oliveira EB, Salgado MC, Turner AJ. A survey of vasoactive peptide
metabolizing enzymes in the rat mesenteric arterial bed perfusate. Biochem
Pharmacol 1991; (42):1897-1904.
- Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. Design of specific inhibitors of angiotensin-
converting enzyme: new class of orally active antihypertensive agents. Science
1977; 196(4288):441-444.
- Otsuka S, Sugano M, Makino N, Sawada S, Hata T, Niho Y. Interaction of
mRNAs for angiotensin II type 1 and type 2 receptors to vascular remodeling in
spontaneously hypertensive rats. Hypertension 1998; (32):467-472.
- Padmanabhan N, Jardine AG, McGrath JC, Connell JM. Angiotensin-converting
enzyme-independent contraction to angiotensin I in human resistance arteries.
Circulation 1999; (99):2914-2920.
- Page IH, Helmer OM. A crystalline pressor substance: angiotonin. Proc Center
Soc Clin Invest 1939; 12:17.
- Paula CA, Sousa MV, Salgado MC, Oliveira EB. Purification and substrate
specificity of an angiotensin converting elastase-2 from the rat mesenteric arterial
bed perfusate. Biochim Biophys Acta 1998; (1388):227-238.
Referências bibliográficas 98
- Pfeffer MA, Braunwald E, Moye LA, et al. Effect of captopril on mortality and
morbidity in patients with left ventricular dysfunction after myocardial infarction.
Results of the survival and ventricular enlargement trial. The SAVE Investigators. N
Engl J Med 1992; (327):669-677.
- Pinto YM, Paul M, Ganten D. Lessons from rat models of hypertension: from
Goldblatt to genetic engineering. Cardiovasc Res. 1998; (39):77-88.
- Polsky-Cynkin R, Reichlin S, Fanburg BL. Angiotensin-1-converting enzyme
activity in the spontaneously hypertensive rat. Proc Soc Exp Biol Med.;164(3):242-
247.
- Richard V, Hurel-Merle S, Scalbert E, Ferry G, Lallemand F, Bessou JP, Thuillez
C. Functional evidence for a role of vascular chymase in the production of
angiotensin II in isolated human arteries. Circulation 2001; 104(7):750-752.
- Rubin B, Laffan RJ, Kotler DG, O'Keefe EH, Demaio DA, Goldberg ME. SQ 14,225
(D-3-mercapto-2-methylpropanoyl-l-proline), a novel orally active inhibitor of
angiotensin I-converting enzyme. J Pharmacol Exp Ther. 1978; 204(2):271-280.
- Salgado MC, Caldo H, Pinheiro MA. Discrepancy between plasma angiotensin
converting enzyme activity and in vivo extent of angiotensin I conversion in
hypertensive rats. Braz J Med Biol Res. 1991;24(3):311-318.
- Santos CF, Caprio MA, Oliveira EB, Salgado MC, Schippers DN, Munzenmaier
DH, Greene AS. Functional role, cellular source, and tissue distribution of rat
elastase-2, an angiotensin II-forming enzyme. Am J Physiol Heart Circ Physio.
2003; (285):H775-H783.
Referências bibliográficas 99
- Santos CF, Greene AS, Salgado MC, Oliveira EB. Conversion of renin substrate
tetradecapeptide to angiotensin II by rat MAB elastase-2. Can J Physiol Pharmacol
2004; (82):1000-1005.
- Santos CF, Oliveira EB, Salgado MC, Greene AS. Molecular cloning and
sequencing of the cDNA for rat mesenteric arterial bed elastase-2, an angiotensin
II-forming enzyme. J Cardiovasc Pharmacol 2002; (39):628-635.
- Santos CF, Paula CA, Salgado MC, Oliveira EB. Kinetic characterization and
inhibition of the rat MAB elastase-2, an angiotensin I-converting serine protease.
Can J Physiol Pharmacol 2002; (80):42-47.
- Santos RA, Simoes e Silva AC, Maric C, Silva DM, Machado RP, de Buhr
I,Heringer-Walther S, Pinheiro SV, Lopes MT, Bader M, Mendes EP, Lemos
VS,Campagnole-Santos MJ, Schultheiss HP, Speth R, Walther T. Angiotensin-(1-
7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas.Proc Natl Acad
Sci U S A. 2003;100(14):8258-8263.
- Sassano P, Chatellier G, Amiot AM, Alhenc-Gelas F, Corvol P, Menard J. A
double-blind randomized evaluation of converting enzyme inhibition as the first-
step treatment of mild to moderate hypertension. J Hypertens Suppl 1984; (2):S75-
S80.
- Schmieder RE, Hilgers KF, Schlaich MP, Schmidt BM. Renin-angiotensin system
and cardiovascular risk. Lancet. 2007;369(9568):1208-1219.
- Skeggs LT Jr, Kahn JR, Shumway NP. The preparation and function of the
hypertensin-converting enzyme. J Exp Med 1956; (103):295-299.
Referências bibliográficas 100
- Skeggs LT Jr, Marsh WH, Kahn JR, Shumway NP. The existence of two forms of
hypertensin. J Exp Med 1954; (99):275-282.
- Sleight P. The HOPE Study (Heart Outcomes Prevention Evaluation).J Renin
Angiotensin Aldosterone Syst. 2000; 1(1):18-20.
- Song JC, White CM. Clinical pharmacokinetics and selective pharmacodynamics
of new angiotensin converting enzyme inhibitors: an update.Clin Pharmacokinet
2002; 41(3):207-224.
- Stanziola L, Greene LJ, Santos RA. Effect of chronic angiotensin converting
enzyme inhibition on angiotensin I and bradykinin metabolism in rats. Am J
Hypertens. 1999; (12):1021-1029.
- Stuckert-Seixas SR. Identificação e purificação de uma enzima formadora de
angiotensina II no perfusato cardíaco de ratos normotensos e hipertensos. Tese
de doutorado. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo. Ribeirão Preto, 2001.
- Swanson GN, Hanesworth JM, Sardinia MF, Coleman JK, Wright JW, Hall KL,
Miller-Wing AV, Stobb JW, Cook VI, Harding EC, et al. Discovery of a distinct
binding site for angiotensin II (3-8), a putative angiotensin IV receptor. Regul Pept.
1992; 40(3):409-419.
- Sweet CS, Blaine EW. Angiotensin-converting enzyme and renin inhibitors. In_
Cardiovascular Pharmacology, 2nd edition, Ed. Antonaccio MJ. Raven Press, New
York. 1984.
Referências bibliográficas 101
- Takai S, Sakaguchi M, Jin D, Yamada M, Kirimura K, Miyazaki M. Different
angiotensin II-forming pathways in human and rat vascular tissues. Clin Chim Acta
2001; (305):191-195.
- Takai S, Shoita N, Yamamoto D, Okunishi H, Miyazaki M. Purification and
characterization of angiotensin II generating chymase from hamster cheek pouch.
Life Sci 1996; (58):591-597.
- The Acute Infraction Ramipril Efficacy Study Investigators. Effect of ramipril on
mortality and morbidity of survivors of acute myocardial infarction with clinical
evidence of heart failure. Lancet 1993; (342):821-828.
- The CONSENSUS Trial Study Group. Effects of enalapril on mortality in severe
congestive heart failure. Results of the Cooperative North Scandinavian Enalapril
Survival Study (CONSESUS). N Engl J Med 1987; (316):1429-1435.
- The SOLVD Investigators. Effect of enalapril on survival in patients with reduced
left ventricular ejection fractions and congestive heart failure. N Engl J Med
1991;(325):293-302.
- Tigerstedt R, Bergman PG. Niere und Kreislauf. Skand Arch Physiol 1898;
(8):223–271.
- Tipnis SR, Hooper NM, Hyde R, Karran E, Christie G, Turner AJ. A human
homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloning and functional expression as a
captopril-insensitive carboxypeptidase.J Biol Chem. 2000; 275(43):33238-33243.
Referências bibliográficas 102
- Tonnesen MG, Klempner MS, Austen KF, Wintroub BU. Identification of a human
neutrophil angiotension II-generating protease as cathepsin G. J Clin Invest. 1982;
(69):25-30.
- Torp-Pedersen C, Kober L. Effect of ACE inhibitor trandolapril on life expectancy
of patients with reduced leftventricular function after acute myocardial infarction.
TRACE Study Group. Trandolapril Cardiac Evaluation. Lancet 1999;(354):9-12
- Trachte Lefer GJ, Lefer AM. Inotropic and vasoactive effects of the naturally
occurring angiotensins in isolated cat cardiac muscle and coronary arteries. Res
Commun Chem Pathol Pharmacol 1979; (25):419-427.
- Trippodo NC, Frohlich ED. Similarities of genetic (spontaneous) hypertension.
Man and rat. Circ Res. 1981; (3):309-319.
- Tsunemi K, Takai S, Nishimoto M, Yuda A, Hasegawa S, Sawada Y, Fukumoto H,
Sasaki S, Miyazaki M. Possible roles of angiotensin II-forming enzymes,
angiotensin converting enzyme and chymase-like enzyme, in the human
aneurysmal aorta. Hypertens Res. 2002;25(6):817-822.
- Unger T, Chung O, Csikos T, Culman J, Gallinat S, Gohlke P, Höhle S, Meffert S,
Stoll M, Stroth U, Zhu YZ. Angiotensin receptors. J Hypertens Suppl. 1996;1
4(5):S95-S103.
- Urata H, Healy B, Stewart RW, Bupus FM, Husain. Angiotensin II-forming
pathways in normal and failing human hearts. Circ Res 1990a; (66):883-890.
Referências bibliográficas 103
- Urata H, Kinoshita A, Misono KS, Bumpus FM, Husain A. Identification of a higly
specific chymase as the major angiotensin II-forming enzyme in the human heart. J
Biol Chem 1990b; (265):22348-22357.
- Urata H, Nishimura H, Ganten D, Arakawa K. Angiotensin-converting enzyme-
independent pathways of angiotensin II formation in human tissues and
cardiovascular diseases. Blood Press Suppl 1996; (2):22-28.
- Urata H, Nishimura H, Ganten D. Mechanisms of angiotensin II formation in
humans. Eur Heart J 1995; (16):79-85.
- Waldeck k, Lindberg BF, Persson K, Andersson KE. Characterization of
angiotensin II formation in human isolated bladder by selective inhibitors of ACE
and human chymase: a funcional and biochemical study. Br J Pharmacol 1997;
(121):1081-1086.
- Weber MA. Interrupting the renin-angiotensin system: the role of angiotensin-
converting enzyme inhibitors and angiotensin II receptor antagonists in the
treatment of hypertension. Am J Hypertens. 1999; 12(12):189S-194S.
- Whitebread S, Mele M, Kamber B, De Gasparo. Preliminary biochemical
characterization of two angiotensin II receptor subtypes. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1989;(163): 284-291.
- Widdop RE, Matrougui K, Levy BI, Henrion D. AT2 receptor-mediated relaxation
is preserved after long-term AT1 receptor blockade. Hypertension 2002; (40):516-
520.
Referências bibliográficas 104
- Wiemer G, Schölkens BA, Becker RH, Busse R. Ramiprilat enhances endothelial
autacoid formation by inhibiting breakdown of endothelium-derived bradykinin.
Hypertension 1991; (18):558-563.
- Wiemer G, Schölkens BA, Linz W. Endothelial protection by converting enzyme
inhibitors. Cardiovasc Res. 1994; 28(2):166-172.
- Wolny A, Clozel JP, Rein J, Mory P, Vogt P, Turino M, Kiowski W, Fischli W.
Functional and biochemical analysis of angiotensin II-forming pathways in the
human heart. Circ Res 1997; (80):219-227.
- Yang HY, Erdos EG, Levin Y. A dipeptidyl carboxypeptidase that converts
angiotensin I and inactivates bradykinin. Biochim Biophys Acta 1970; (214):374-
376.
- Yang HY, Erdos EG, Levin Y. Characterization of a dipeptide hydrolase (kininase
II: angiotensin I converting enzyme). J Pharmacol Exp Ther 1971; (177): 291-300.
- Yang HY, Erdos EG. Second kininase in human blood plasma. Nature 1967;
(215):1402-1403.
- Yang HY, Neff NH. Distribution and properties of angiotensin converting enzyme
of rat brain.J Neurochem. 1972; 19(10):2443-2450.
- Yang HY, Neff NH. Distribution and properties of angiotensin converting enzyme
of rat brain. J Neurochem. 1972; (19):2443-2450.
- Yusuf S, Sleight P, Pogue J, Bosch J, Davies R, Dagenais G. Effects of an
angiotensin-converting-enzyme inhibitor, ramipril, on cardiovascular events in high-
Referências bibliográficas 105
risk patients. The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. N
Engl J Med. 2000; 342(3):145-153.
- Zager PG, Luetscher JA. Effects of angiotensin III and ACTH on aldosterone
secretion. Clin Exp Hypertens A. 1982; 4(9-10):1481-1504.
8- ANEXO
TRABALHO PUBLICADO
ORIGINAL ARTICLE
Role of Elastase-2 as an Angiotensin II–Forming Enzyme
in Rat Carotid Artery
Christiane Becari, MS,* Disney O. Sivieri, Jr., MS,* Carlos F. Santos, PhD,* Milene K. Moyse´s, PhD,†
Eduardo B. Oliveira, PhD,† and Maria Cristina O. Salgado, PhD*
Abstract: We have described the biochemical, enzymatic, and
structural properties of a chymostatin-sensitive angiotensin (Ang)
I-converting elastase-2 found in the rat mesenteric arterial bed
perfusate. We determined the mRNA for elastase-2 and its relative
role in generating Ang II in the rat isolated aorta and carotid artery
rings. In carotid rings, the Ang I–induced vasoconstrictor effect was
only partially inhibited by captopril or chymostatin, whereas that
of tetradecapeptide renin substrate (TDP) was greatly inhibited by
chymostatin but unaffected by captopril; however, Ang I- and TDP-
induced effects were abolished by the combination of both inhibitors.
Effects of [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I (PDA), an Ang I–converting enzyme
(ACE)-resistant biologically inactive precursor of Ang II were blocked
by chymostatin or N-acetyl-Ala-Ala-Pro-Leu-chloromethylketone
(elastase-2 inhibitor) in carotid artery. PDA failed to induce an effect
in aortic rings, and Ang I-induced contractions were completely in-
hibited by captopril. The mRNA for rat elastase-2 was detected in
aorta, carotid, and mesenteric arteries, although its expression was found
to be less important in aorta. These findings indicate the presence of
a functional alternative pathway to ACE for Ang II generation in rat
carotid artery and represent strong evidence of a physiological role for
elastase-2; however, its functional contribution to Ang II formation in
aorta appears to be negligible.
Key Words: elastase-2, angiotensin-converting enzyme, chymostatin,
[Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I
(J Cardiovasc Pharmacol
TM
2005;46:498–504)
T
here is substantial evidence for the presence of essential
components of the renin–angiotensin system in a variety of
tissues, suggesting the existence of local renin–angiotensin
systems.
1,2
In addition, the existence of alternative pathways to
angiotensin-converting enzyme (ACE) for angiotensin (Ang) II
generation in different tissues is based on evidence derived
from experiments carried out with a combination of protease
inhibitors and Ang II receptor antagonists. Partial or total
blockade of Ang II formation by different combinations of
ACE inhibitors with chymostatin or other protease inhibitors
has provided clues to the nature of the enzymes involved in
Ang I conversion in particular tissues.
3
Since the advent of
[Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I (PDA), a biologically inactive precursor
that selectively yields Ang II on incubation with chymases
but not with ACE or carboxypeptidases,
4
several reports have
described the relative contribution of chymases in Ang II
formation in isolated preparations derived from various
species.
5–11
We have recently described the biochemical and enzymatic
properties of a chymostatin-sensitive Ang II-forming elastase-2
found in the perfusate of the isolated rat mesenteric arterial
bed.
12–15
One of the most interesting findings was that purified
elastase-2 from rat mesenteric bed perfusate was also capable
of efficiently forming Ang II from PDA, suggesting that
formation of Ang II ascribed to chymases may have been
overestimated in previous investigations of Ang II–forming
pathways. It was also demonstrated that N-acetyl-Ala-Ala-
Pro-Leu-chloromethylketone (Ac-AAPL-CK), an active site-
directed inhibitor of human pancreatic elastase-2,
16
efficiently
blocked the Ang II-generating activity of the rat elastase-2.
14
A remarkable feature of rat elastase-2 as an Ang I–converting
protease is that it does not destroy the product Ang II
12,13,17
despite its broad proteolytic specificity.
12,18
This property is
shared with some chymases such as human,
19
baboon,
5
and dog
20
but not rodent chymases. In fact, rat chymases split Ang I and
Ang II at its two potential chymotryptic cleavage sites, Tyr
4
-
Ile
5
and Phe
8
-His
9
,
4,21,22
acting as a true angiotensinase.
The cloned and sequenced cDNA for Ang II–generating
elastase-2 was found to be identical to that for rat pancreatic
elastase-2,
23
whose corresponding mRNA was shown to be
expressed in different rat tissues.
14,24
We also demonstrated
that cultured endothelial cells from rat mesenteric arteries are
capable of producing and secreting elastase-2.
24
A functional
role for this elastase-2 has been proposed by studies carried
out on the isolated rat mesenteric arterial bed, indicating its
participation in an ACE-independent pathway responsible for
the pharmacological effects of both Ang I and renin substrate
tetradecapeptide (TDP) in this preparation.
24
Because the func-
tional role of rat elastase-2 was determined in only 1 vascular
bed, the objective of this work was to verify the contribution of
this enzyme for Ang II generation in other rat vascular tissues.
Thus, we assessed mRNA expression for elastase-2 and
Received for publication May 11, 2005; accepted June 27, 2005.
From the *Department of Pharmacology, University of Sa˜o Paulo, School
of Medicine of Ribeira˜o Preto, Ribeira˜o Preto, Brazil 14049-900; and
†Department of Biochemistry and Immunology, University of Sa˜o Paulo,
School of Medicine of Ribeira˜o Preto, Ribeira˜o Preto, Brazil 14049-900.
This work was supported by a grant from Fundacxa˜o de Amparo a
`
Pesquisa
do Estado de Sa˜o Paulo (FAPESP).
Reprints: Maria Cristina O. Salgado, Departamento de Farmacologia,
Faculdade de Medicina de Ribeira˜o Preto, 14049-900 Ribeira˜o Preto,
SP, Brazil (e-mail: mcdosalg@fmrp.usp.br).
Copyright Ó 2005 by Lippincott Williams & Wilkins
498 J Cardiovasc Pharmacol
ä
Volume 46, Number 4, October 2005
investigated the relative role of elastase-2 in Ang II generation
in the rat aorta and carotid artery, with the aid of different Ang
II precursors and protease inhibitors.
METHODS
The experiments were conducted employing male
Wistar rats (250–300 g) maintained in a controlled environ-
ment with a constant 12:12-hour light-dark cycle and provided
food and water ad libitum. All surgical procedures were in
accordance with our institutional guidelines for use and
experiments in animals. The rats were exsanguinated by
section of the cervical vessels under ether anesthesia. The
aorta or carotid arteries were rapidly removed and handled as
described below.
Isolated Arterial Rings
The arteries of rats were rapidly removed and carefully
cleaned of adhering connective tissue and cut into 3-mm-long
rings. The rings were suspended with 2 L-shaped stainless
steel hooks under an initial tension of 1.0 g in a 13-mL
jacketed tissue bath filled with Krebs solution (in mmol/L:
NaCl 118, KCl 4.7, CaCl
2
Á2H
2
O 2.5, MgSO
4
Á6H
2
O 1.64,
KH
2
PO
4
1.18, NaHCO
3
24.9, glucose 11.1). The solution in
the baths was constantly aerated with 95% O
2
and 5% CO
2
,pH
7.4, and kept at 37°C. The changes in tension were recorded
with an isometric strain gauge (model UC2, Gould Statham,
Valley View, OH) coupled to a recording system (Hewlett-
Packard 7758B, Palo Alto, CA). After a 30-minute equilibra-
tion period with buffer replaced every 10-minutes, the isolated
arteries were contracted with phenylephrine (10
27
mol/L), and
acetylcholine (10
23
mol/L) was added to confirm the integrity
of the endothelium. Only preparations that presented
endothelium-dependent vasodilatation to acetylcholine were
used.
The effects of Ang II or its precursor peptides, Ang I, TDP,
and PDA (an ACE-resistant substrate), were studied by adding
the peptides in a cumulative fashion. Only 1 peptide was
tested in each ring. In a pilot experiment we determined that
a 50-minute resting period between 2 full concentration–
response curves for all the peptides studied was sufficient to
avoid tachyphylaxis, a commonly observed phenomenon at
higher concentrations of Ang II in vitro.
25,26
Thus, concen-
tration–response curves to Ang II, Ang I, TDP, or PDA were
obtained in control conditions and after a 50-minute period in
the presence of the different protease inhibitors in the same prep-
aration. Captopril (10 mmol/L; ACE inhibitor), chymostatin
(100 mmol/L, elastase-2 and chymase inhibitor), or the combi-
nation of both inhibitors was added to the bath 30 minutes
before the second curve.
In a separate set of experiments, the effect of the
elastase-2 inhibitor Ac-AAPL-CK (200 mmol/L) on the
contractile response to a single concentration of Ang II
(10
27
mol/L) and PDA (10
26
mol/L) was investigated in
carotid artery rings. Also, the effect of the AT
1
receptor
antagonist losartan (1 mmol/L) on the response to Ang II and
its related peptides (at concentrations that induced maximal
contraction of the carotid artery) was investigated.
Isolation of RNA
Total RNA from mesenteric arterial bed (positive
control), carotid artery, and aorta was isolated as previously
described.
14
RNA was treated with DNase (Amersham
Pharmacia; Piscataway, NJ) for 15 minutes at room temper-
ature to remove any potential genomic DNA contamination.
RNA concentration was measured spectrophotometrically at
260 nm.
Detection of Rat Elastase-2 mRNA Using
Reverse Transcription Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR)
First-strand cDNA synthesis was performed in a 19-mL
reaction volume using 2 mg total RNA, 1 mL (500 mg/mL)
oligo(dT), 1 mL (10 mmol/L) dNTPs, 8 mL sterile water, 4 mL
RT buffer (250 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3, 375 mmol/L KCl,
15 mM MgCl
2
), 2 mL (0.1 mol/L) DTT, 1 mL (200 units) of
murine leukemia virus reverse transcriptase, as provided in
the first-strand cDNA synthesis kit (SuperScript II RT) from
Invitrogen (Carlsbad, CA). cDNA was synthesized during
a 50-minute incubation at 37°C, and the reaction was termi-
nated by heating at 72°C for 15 minutes. RT products (2 mL)
served as the template for PCR amplification using the
following primers synthesized by Invitrogen: (1) sense 5#-
GGG GAT CCATGG TAG TTG GGG GTC AAG AG-3# and
antisense 5#-GGG AAT TCT TAG TTC TTT GCA ATC AC-3#
(rat elastase-2; final PCR product 721 bp) and (2) sense 5#-
CTA AGG CAA ACC GTG AAA AGA-3# and antisense 5#-
ATT GCC GAT AGT GAT GAC CTG-3# (b-actin; final PCR
product 420 bp). All PCR reactions were performed in a total
volume of 50 mL that was composed of 10 mmol/L of each
primer, PCR buffer [200 mmol/L Tris HCl (pH 8.4), 500
mmol/L KCl, 50 mmol/L MgCl
2
], 10 mmol/L dNTP mix, and
2.5 units recombinant Taq DNA polymerase (Invitrogen).
Temperature cycling consisted of an initial denaturation step
for 2 minutes at 94°C, followed by 45 cycles of amplification.
Each round consisted of denaturation for 1 minute at 94°C,
annealing for 1 minute at 53°C, and extension for 1 minute at
72°C. Samples were incubated for additional 30 minutes at
72°C (terminal elongation) after the completion of the final
cycle. For each set of primers, RT-PCR was performed on
sterile water to check for any contamination (negative control),
and, for each tissue, PCR was conducted on RNA to check for
genomic DNA contamination. A 9-mL aliquot of each sample
was electrophoretically size fractionated on a 1.0% agarose
gel containing ethidium bromide (0.64 mg/mL). DNA was
visualized under ultraviolet light to detect the presence of PCR
amplification products at the anticipated sizes. The size of the
PCR products was determined by comparison with the 1-kb
plus ladder (Invitrogen).
Statistical Analysis
Responses to Ang II and related peptides were measured
as increases in tension (mg). Log concentration–response
curves from individual experiments were grouped to generate
mean curves to angiotensin peptides. Curves obtained in the
absence and presence of the given inhibitor were analyzed
using nonlinear regression (Graphpad Prism 3.0, Graphpad
q 2005 Lippincott Williams & Wilkins 499
J Cardiovasc Pharmacol
ä
Volume 46, Number 4, October 2005 Angiotensin-Converting Elastase-2
Software, San Diego, CA), and pD
2
values and maximum
contractile responses were obtained. The pD
2
value was
defined as the negative logarithm of agonist concentration
required to produce 50% of the maximum response (2log
EC
50
). At least 2 preparations were obtained from each rat, and
1 vessel from each rat received a particular treatment (n =
number of artery rings). When either pD
2
values or maximum
contractile responses were compared, statistical significance
was determined using either Student paired or unpaired t test
or, where more than 2 groups were being compared, a 1-way
analysis of variance with a post hoc Bonferroni multiple
comparison test was employed. Concentration–response curves
were compared using 2-way analysis of variance with a post
hoc Bonferroni test. Values shown are expressed as mean 6
SEM. The statistical analysis was performed using the
Graphpad Software, and, in all cases, statistical significance
was accepted where P , 0.05.
RESULTS
In the rat isolated carotid artery, Ang II and Ang I, added
in a cumulative fashion (10
210
to 10
26
mol/L), induced bell-
shaped concentration–response curves (Fig. 1). Maximal con-
tractile response to Ang II was achieved at a concentration
between 50 and 100 nmol/L, followed by a decrease in tension
at higher concentrations. The same pattern of response was
observed for Ang I, which showed approximately 0.5 log unit
rightward shift of the Ang II concentration–response curve
(n = 3 each). In aortic rings Ang I and II also induced bell-
shaped concentration–response curves (data not shown). Thus,
to investigate the effect of the protease inhibitors on Ang
peptide-induced responses, only concentrations that induced
a concentration-dependent vasoconstrictor effect were employed.
Responses to increasing concentrations of angiotensin
peptides in carotid artery and aortic rings in the control con-
dition are shown in Figure 2. In carotid artery (n = 9 each),
although the maximal contractile responses induced by Ang II
(396.6 6 23.9 mg), Ang I (373.2 6 18.7 mg), TDP (373.6 6
14.1 mg), and PDA (379.7 6 13.6 mg) were similar, their
potencies differed significantly in carotid artery. The Ang I
concentration–response curve presented a rightward shift
compared with that of Ang II (pD
2
= 8.7 6 0.07 versus 9.0 6
0.09, P , 0.05). Vasoconstrictor responses induced by TDP
were obtained over a higher concentration range (pD
2
= 7.5 6
0.05, P , 0.001 than those of Ang II and Ang I). PDA was
approximately 100 times less potent than Ang II (P , 0.001)
with a pD
2
value of 7.1 6 0.04. In aortic rings (n = 4 each),
however, PDA did not induce any significant effect in the
FIGURE 1. Typical recording of the effect of angiotensin II (Ang
II) added in a cumulative fashion (10
210
to 10
26
mol/L) in
carotid artery showing the bell-shaped curve (top). Cumulative
concentration–response curves to Ang II and angiotensin I
(Ang I) in carotid arteries (bottom). Each point is represented as
mean 6 SEM, n = 3. *P , 0.01 compared with Ang I, ANOVA
followed by Bonferroni test.
FIGURE 2. Cumulative concentration–response curves to
angiotensin II (Ang II), angiotensin I (Ang I), tetradecapeptide
renin-substrate (TDP), and [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I (PDA) in
isolated rat carotid artery (top) and to Ang II, Ang I, PDA,
and Ang I in the presence of captopril (10 mmol/L, Ang I+C) on
aortic rings (bottom). Each point is represented as mean 6
SEM, n = 9.
500 q 2005 Lippincott Williams & Wilkins
Becari et al J Cardiovasc Pharmacol
ä
Volume 46, Number 4, October 2005
range of concentrations that induced a full concentration–
response curve to Ang I (pD
2
= 7.8 6 0.1) and Ang II (pD
2
=
8.2 6 0.1). The responses elicited by Ang I in aortic rings were
completely blocked in the presence of the ACE inhibitor
captopril, indicating the predominance of an ACE-dependent
mechanism in Ang II generation in the rat aorta.
In carotid artery rings, captopril (Fig. 3) induced
a rightward shift of the concentration–response curve to
Ang I (pD
2
= 6.8 6 0.1 versus 8.6 6 0.2, n = 6, P , 0.001) but
did not affect the contractile responses induced by either
Ang II (n = 7), TDP (n = 7), or PDA (n = 7). In the presence
of captopril, maximal contractile responses to all peptides did
not differ from their control values. Chymostatin (Fig. 4, n = 3,
each group) did not affect Ang II responses but completely
inhibited those induced by PDA and induced a marked in-
hibition of the contractile responses to TDP (which amounted
to an approximate 10-fold rightward shift of the TDP control
curve). Interestingly, chymostatin alone also inhibited Ang I–
induced responses (pD
2
= 7.9 6 0.04 versus 8.4 6 0.07 in
control period, P , 0.001). The combination of captopril and
chymostatin (Fig. 5, n = 3 each group) abolished the con-
tractile responses elicited by Ang I and TDP as well as those
elicited by PDA. It is noteworthy that this combination of
inhibitors did not result in any significant changes in the
responses induced by Ang II in the rat carotid artery.
The vasoconstrictor effect induced by PDA in carotid
artery was abolished by the elastase-2 inhibitor Ac-AAPL-CK,
whereas the constrictor response to Ang II was unaffected
(Fig. 6, n = 4 each).
Vasoconstriction induced by Ang II, Ang I, TDP, and
PDA, at concentrations that induced maximal effect, was
completely blocked by the selective AT
1
-receptor antagonist
losartan (1 mmol/L) (Fig. 7). Concentration–response curves
elicited by Ang II were not affected by the AT
2
-receptor
antagonist PD123319 (1 mmol/L, n = 3, data not shown).
Detection of Rat Elastase-2 mRNA in
Aorta and Carotid Artery
RT-PCR, performed on total RNA from rat carotid
artery, aorta, and mesenteric arterial bed with primers specific
for rat elastase-2, yielded a single band with the predicted size
of 721 bp (Fig. 8). Expression for elastase-2 mRNA was much
less in aortic tissue than in carotid and mesenteric arteries.
DISCUSSION
This study provides further evidence supporting
a functional role for elastase-2 in the generation of Ang II
in the rat arteries. The experiments carried out to demonstrate
the potential vasoconstrictor effect of Ang II, Ang I, TDP, and
the ACE-resistant substrate PDA on the isolated carotid artery
clearly showed the existence of an ACE-independent pathway
for Ang II generation that is sensitive to chymostatin or
Ac-AAPL-CK. Among the possible enzymes to be responsible
for this ACE-independent pathway is rat elastase-2, which
forms Ang II by cleaving the Phe
8
-His
9
bond from all the
precursors tested, is not inhibited by captopril, and is also
sensitive to chymostatin and Ac-AAPL-CK.
12,13,15,23
Chymos-
tatin inhibits both chymases
19,27
and elastase-2,
13,15,24
and the
FIGURE 3. Cumulative concentration–response curves to
angiotensin II (Ang II), angiotensin I (Ang I), tetradecapeptide
renin-substrate (TDP), and [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I (PDA) in
isolated rat carotid artery before (control) and after the
addition of captopril (10 mmol/L). Each point is represented
as mean 6 SEM, n = 6–7. *P , 0.001 compared with control,
ANOVA followed by Bonferroni test.
q 2005 Lippincott Williams & Wilkins
501
J Cardiovasc Pharmacol
ä
Volume 46, Number 4, October 2005 Angiotensin-Converting Elastase-2
FIGURE 4. Cumulative concentration–response curves to
angiotensin II (Ang II), angiotensin I (Ang I), tetradecapeptide
renin-substrate (TDP), and [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I (PDA) in
isolated rat carotid artery before (control) and after the
addition of chymostatin (100 mmol/L). Each point is repre-
sented as mean 6 SEM, n = 3. *P , 0.001 compared with
control, ANOVA followed by Bonferroni test.
FIGURE 5. Cumulative concentration–response curves to
angiotensin II (Ang II), angiotensin I (Ang I), tetradecapeptide
renin substrate (TDP), and [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I (PDA) in isolated
rat carotid artery before (control) and after the addition of
captopril (10 mmol/L) and chymostatin (100 mmol/L). Each
point is represented as mean 6 SEM, n = 3. *P , 0.001
compared with control, ANOVA followed by Bonferroni test.
502 q 2005 Lippincott Williams & Wilkins
Becari et al J Cardiovasc Pharmacol
ä
Volume 46, Number 4, October 2005
inhibitor Ac-AAPL-CK, an active site–directed inhibitor
originally described for human pancreatic elastase-2,
16
thus
far considered selective for this family of enzymes and
effective against rat elastase-2,
13
also can inhibit human
chymase.
15
Although the use of Ac-AAPL-CK and chymos-
tatin cannot unequivocally indicate the relative contributions
of different serine proteases in the generation of Ang II in the
isolated rat carotid artery, rat chymase is mainly an
angiotensinase,
4,21,22
which argues in favor of elastase-2 being
responsible for the ACE-independent pathway for Ang II
generation in the rat carotid artery because it does not degrade
Ang II.
12,13
To date, the enzymes known to be capable of
forming Ang II from PDA are homologous to either human
heart chymase
5,7–9,21
or rat elastase-2,
13,14
so that this latter
enzyme is the only known rat protease fitting the experimental
evidence described for the ACE-independent pathway for Ang
II generation in the rat.
The vasoconstrictor response elicited by PDA in the
isolated carotid artery rings was abolished by the Ang II
AT
1
-receptor antagonist losartan. These data indicate that the
biologically inactive peptide PDA has to be converted into
Ang II to produce vasoconstrictor responses in the isolated rat
carotid artery. The effects of protease inhibitors on the
contractile responses to these 3 Ang II precursors were studied
in an attempt to determine the relative importance of ACE and
non-ACE pathways for Ang II generation. Chymostatin alone,
which completely inhibited the effect of PDA, induced
a rightward shift of the vasoconstrictor effect of both Ang I
and TDP, thus indicating the participation of a non-ACE
pathway in the conversion of these peptides to Ang II. In
addition, the synergistic inhibitory effects of captopril and
chymostatin on the constrictor effects elicited by Ang I show
a marked participation of a non-ACE pathway for Ang II
production in the isolated rat carotid artery, even considering
the overcapacity of ACE revealed by the less intense effects of
chymostatin alone compared with captopril alone. The present
findings also indicate that ACE and non-ACE pathways are
equally important for converting TDP to Ang II in the isolated
carotid artery; this substrate can be converted to Ang II by the
successive removal of 3 dipeptides by the action of ACE
28
or endoproteolytically by rat elastase-2.
13,15
Additionally, the
substrate PDA is converted to Ang II only by non-ACE
pathways: whereas chymostatin alone or Ac-AAPL-CK alone
completely blocked the pressor response elicited by PDA ad-
ministration, captopril had no effect. Although this Ang II
precursor was designed based on key features of the human
chymase binding site,
5
it is also converted to Ang II by rat
elastase-2.
13
As a whole, the results point out to a substantial
role in an ACE-independent pathway for Ang II generation
from both Ang I and TDP in rat carotid artery and suggest that
the PDA is a suitable substrate for evaluating the role of non-
ACE pathways in Ang II-mediated responses in this isolated
artery as was shown in mesenteric arterial bed.
24
Confirming our previous data, rat elastase-2 mRNA
could be detected in mesenteric arterial bed.
14,24
The finding
FIGURE 6. Vasoconstrictor effect induced administration of
angiotensin II (Ang II; 10
27
mol/L) and [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I
(PDA; 10
26
mol/L) during a control period and in the presence
of 200 mmol/L N-acetyl-Ala-Ala-Pro-Leu-chloromethylketone
(Ac-AAPL-CK). Data are reported as mean 6 SEM, n = 4. *P ,
0.001 compared with the corresponding control value (paired
t test).
FIGURE 7. Typical recording of the effect of a single concen-
tration of angiotensin II (Ang II; 10
27
mol/L), angiotensin I
(Ang I; 10
27
mol/L), [Pro
11
-D-Ala
12
]-Ang I (PDA; 10
26
mol/L),
and tetradecapeptide renin substrate (TDP; 10
26
mol/L) during
a control period and in the presence of losartan (1 mmol/L) in
the rat carotid artery.
FIGURE 8. Ethidium bromide-stained agarose gels of reverse
transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) products
from mesenteric arterial bed (1), aorta (2), carotid arteries (3),
and water (4). The cDNAs were amplified by PCR with gene-
specific primers for rat elastase-2 (721 bp) as well as b-actin
(420 bp).
q 2005 Lippincott Williams & Wilkins
503
J Cardiovasc Pharmacol
ä
Volume 46, Number 4, October 2005 Angiotensin-Converting Elastase-2
that mRNA for rat elastase-2 was detected in the rat carotid
arteries makes this isolated vascular preparation suitable to
investigate the expression and function of this non-ACE
pathway for Ang II generation in different rat pathophysiological
conditions. In rat carotid artery, contractile responses elicited
by Ang II and related peptides were highly reproducible,
completely blocked by the AT
1
-receptor antagonist losartan,
and not affected by PD123319, a selective AT
2
-receptor
antagonist. These data indicate that AT
1
receptor-mediated
vasoconstriction is not opposed by activation of AT
2
-receptor
in the rat carotid artery, as was demonstrated in the rat isolated
uterine artery.
29
The same approach failed to reveal an important
functional role for elastase-2 in the rat aorta. In this artery
ACE seems to be the predominant pathway for Ang II
production from Ang I. In addition, the less intense expression
of elastase-2 mRNA in aortic tissue compared with carotid and
mesenteric tissues seems to corroborate this interpretation and
give an explanation for the lack of effect of PDA in aortic
rings.
CONCLUSION
In this study we demonstrated that mRNA for elastase-2
could be detected in the rat carotid artery tissue, and we also
provided pharmacological evidence that rat elastase-2 has an
important functional alternative pathway to ACE in Ang II
generation in this vascular tissue but not in aortic tissue.
ACKNOWLEDGMENT
The authors are grateful to Osmar Vettore for excellent
technical assistance.
REFERENCES
1. Campbell DJ. Tissue renin–angiotensin system: sites of angiotensin
formation. J Cardiovasc Pharmacol. 1987;10(Suppl 7):S1–S8.
2. Bader M, Peters J, Baltatu O, et al. Tissue renin–angiotensin systems: new
insights from experimental animal models in hypertension research. J Mol
Med. 2001;79:76–102.
3. Hollenberg NK, Fisher ND, Price DA. Pathways for angiotensin II generation
in intact human tissue: evidence from comparative pharmacological
interruption of the renin system. Hypertension. 1998;32:387–392.
4. Le Trong H, Neurath H, Woodbury RG. Substrate specificity of the
chymotrypsin-like protease in secretory granules isolated from rat mast
cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1987;84:364–367.
5. Hoit BD, Shao Y, Kinoshita A, et al. Effects of angiotensin II generated by
an angiotensin converting enzyme-independent pathway on left ventric-
ular performance in the conscious baboon. J Clin Invest. 1995;95:1519–
1527.
6. Garrison EA, Champion HC, Kadowitz PJ. [Pro
11
,D-Ala
12
]angiotensin I
has rapid onset vasoconstrictor activity in the cat. Am J Physiol
Endocrinol Metab. 1997;273:E1059–E1064.
7. Mangiapane ML, Rauch AL, MacAndrew JT, et al. Vasoconstrictor action
of angiotensin I-convertase and the synthetic substrate (Pro
11
,D-Ala
12
)-
angiotensin I. Hypertension. 1994;23:857–860.
8. Murakami M, Matsuda H, Kubota E, et al. Role of angiotensin II
generated by angiotensin converting enzyme-independent pathways in
canine kidney. Kidney Int. 1997;63:S132–S135.
9. Nishimura H, Buikema H, Baltatu O, et al. Functional evidence for
alternative ANG II-forming pathways in hamster cardiovascular system.
Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1998;275:H1307–H1312.
10. Waldeck K, Lindberg BF, Persson K, et al. Characterization of angiotensin
II formation in human isolated bladder by selective inhibitors of ACE and
human chymase: a functional and biochemical study. Br J Pharmacol.
1997;121:1081–1086.
11. Wolny A, Clozel JP, Rein J, et al. Functional and biochemical analysis of
angiotensin II-forming pathways in the human heart. Circ Res. 1997;80:
219–227.
12. Paula CA, Sousa MV, Salgado MCO, et al. Purification and substrate
specificity of an angiotensin converting elastase-2 from the rat mes-
enteric arterial bed perfusate. Biochim Biophys Acta. 1998;1388:227–
238.
13. Santos CF, Paula CA, Salgado MCO, et al. Kinetic characterization and
inhibition of the rat MAB elastase-2, an angiotensin I-converting serine
protease. Can J Physiol Pharmacol. 2002;80:42–47.
14. Santos CF, Oliveira EB, Salgado MCO, et al. Molecular cloning and
sequencing of the cDNA for rat mesenteric arterial bed elastase-2, an
angiotensin II-forming enzyme. J Cardiovasc Pharmacol. 2002;39:628–
635.
15. Santos CF, Greene AS, Salgado MCO, et al. Conversion of renin substrate
tetradecapeptide to angiotensin II by rat MAB elastase-2. Can J Physiol
Pharmacol. 2004;82:1000–1005.
16. Largman C, DelMar EG, Brodrick JW, et al. Inhibition of human
pancreatic elastase 2 by peptide chloromethyl ketones. Biochim Biophys
Acta. 1980;614:113–120.
17. Oliveira EB, Salgado MCO, Turner AJ. A survey of vasoactive peptide
metabolizing enzymes in the rat mesenteric arterial bed perfusate.
Biochem Pharmacol. 1991;42:1897–1904.
18. Szilagyi CM, Sarfati P, Pradayrol L, et al. Purification, characterization
and substrate specificity of rat pancreatic elastase II. Biochim Biophys
Acta. 1995;1251:55–65.
19. Urata H, Kinoshita A, Misono KS, et al. Identification of a highly specific
chymase as the major angiotensin II-forming enzyme in the human heart.
J Biol Chem. 1990;265:22348–22357.
20. Caughey GH, Raymond WW, Wolters PJ. Angiotensin II generation by
mast cell alpha- and beta-chymases. Biochim Biophys Acta. 2000;1480:
245–257.
21. Wintroub BU, Schechter NB, Lazarus GS, et al. Angiotensin I conversion
by human and rat chymotryptic proteinases. J Invest Dermatol. 1984;83:
336–339.
22. Chandrasekharan UM, Sanker S, Glynias MJ, et al. Angiotensin II-
forming activity in a reconstructed ancestral chymase. Science. 1996;271:
502–505.
23. MacDonald RJ, Swift GH, Quinto C, et al. Primary structure of two
distinct rat pancreatic preproelastases determined by sequence analysis of
the complete cloned messenger ribonucleic acid sequences. Biochemistry.
1982;21:1453–1463.
24. Santos CF, Caprio MA, Oliveira EB, et al. Functional role, cellular source,
and tissue distribution of rat elastase-2, an angiotensin II-forming enzyme.
Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;285:H775–H783.
25. Griendling KK, Ushio-Fukai M, Lasse
`
gue B, et al. Angiotensin II
signaling in vascular smooth muscle. New concepts. Hypertension. 1997;
29:366–373.
26. Thomas WG. Regulation of angiotensin II type 1 (AT
1
) receptor function.
Regul Pept. 1999;79:9–23.
27. Takai S, Shiota N, Yamamoto D, et al. Purification and characterization of
angiotensin II-generating chymase from hamster cheek pouch. Life Sci.
1996;58:591–597.
28. Dorer FE, Kahn JR, Lentz KE, et al. Formation of angiotensin II from
tetradecapeptide renin substrate by angiotensin-converting enzyme. Biochem
Pharmacol. 1975;24:1137–1139.
29. Hannan RE, Davis EA, Widdop RE. Functional role of angiotensin II AT
2
receptor in modulation of AT
1
receptor-mediated contraction in rat uterine
artery: involvement of bradykinin and nitric oxide. Br J Pharmacol. 2003;
140:9872995.
504 q 2005 Lippincott Williams & Wilkins
Becari et al J Cardiovasc Pharmacol
ä
Volume 46, Number 4, October 2005
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