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FÁBIO REIS DALLE MOLLE
Atividade de enzimas do catabolismo de sacarose em
plântulas de Hymenaea courbaril L. (Hayne) Lee &
Lang. durante a mobilização do xiloglucano de reserva
Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica
da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL
E MEIO AMBIENTE, na área de Concentração
de Plantas Vasculares em Análises Ambientais.
São Paulo
2007
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II
FÁBIO REIS DALLE MOLLE
Atividade de enzimas do catabolismo de sacarose em
plântulas de Hymenaea courbaril L. (Hayne) Lee &
Lang. durante a mobilização do xiloglucano de reserva
Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica
da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL
E MEIO AMBIENTE, na área de Concentração
de Plantas Vasculares em Análises Ambientais.
ORIENTADOR: DR. MARCO AURÉLIO SILVA TINÉ
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III
Faça tudo, busque o impossível,
Mas meu amigo,
Respeite o mar.
O sábio marinheiro sabe que
Ele jamais venceu uma tormenta,
Apenas e tão-somente apenas,
Foi o mar que deixou
Ele passar.
Trecho de carta de Hélio ao amigo Amir Klink
IV
Agradecimentos
À Rita e ao Bruno, meus amores.
Aos meus amados pais, Romualdo e Walkíria, pela minha vida e pelo suporte por
todos esses anos.
Aos meus irmãos, Gustavo e Diogo, pela convivência, amizade e apoio.
Ao meu orientador Dr. Marco Aurélio Silva Tiné, pela amizade, paciência e
aprendizado.
Ao Prof. Dr. Marcos Silveira Buckeridge, do departamento de Botânica (USP) pelo
apoio, incentivo e ensinamentos.
A Profa. Dra. Sônia M. C. Dietrich, pelo apoio, simpatia e energia.
A Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, pela oportunidade de desenvolver
os experimentos.
As pesquisadoras Dra. Marília Gaspar Mais, Dra. Maria Ângela Machado de
Carvalho, Dra. Lílian Penteado Zaidan, Dra. Rita de Cássia Leone Figueiredo Ribeiro pela
atenção e amizade.
Aos pesquisadores Dr. Marcos Pereira Marinho Aidar e Dr. Emerson Alves da
Silva pela convivência e ajudas.
Aos professores e coordenadores do curso de pós-graduação do Instituto de
Botânica, pela construção de conhecimento e oportunidade.
Aos professores do Departamento de Fisiologia Vegetal (Unicamp), pela
oportunidade e pelos ensinamentos.
Aos amigos Amanda Asega, Amanda “Top”, Amanda S., Claudinha, Cynthia,
Denise, Elaine, Fabiano, Fê K., Ju. Iura, Kelly, Ludmila, Marcelino, Paty Pinho, Paola,
Roberta, Rosana, Simone, Sabrina, Tati, Vanessa Rebouças, João, Maraba, Marina,
Vanessa Oliveira.
V
À Mary Monteiro, técnica do laboratório, pelos auxílios.
A todos os que direta ou indiretamente contribuiram para que este trabalho fosse
concluído.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio
financeiro
VI
Índice
Introdução............................................................................................................................ 1
1. Hymenaea courbaril (jatobá).............................................................................................1
2. Tipos de reserva em sementes.......................................................................................... 2
3. Xiloglucano de reserva......................................................................................................5
4. Relações fonte-dreno de sacarose......................................................................................6
5. Enzimas do metabolismo de sacarose................................................................................9
Objetivo.............................................................................................................................. 12
Material e métodos............................................................................................................ 13
1. Sacarose sintase.............................................................................................................. 14
2. Invertase......................................................................................................................... 17
3. Análise dos carboidratos................................................................................................ 22
Resultados......................................................................................................................... 24
1. Sacarose sintase............................................................................................................. 24
2. Invertase........................................................................................................................ 26
3. Análise de carboidratos................................................................................................. 33
Discussão.......................................................................................................................... 35
1. Sacarose sintase............................................................................................................. 35
2.Invertases........................................................................................................................ 38
2.1. Invertase insolúvel...................................................................................................... 38
2.2. Invertase solúvel ácida............................................................................................... 39
2.3. Invertase solúvel neutra.............................................................................................. 41
3. Análise de carboidratos................................................................................................. 43
Conclusões.........................................................................................................................45
Referências bibliográficas............................................................................................... 46
VII
Resumo
Quase todas as sementes acumulam carboidratos que são utilizados pela plântula
como fonte de carbono durante o seu estabelecimento. No caso de Hymenaea courbaril L.,
uma das reservas da semente é o xiloglucano, um polissacarídeo depositado nas paredes
das células cotiledonares. Após a germinação da semente, este polissacarídeo é convertido
em sacarose e transportado para outras partes da plântula. A compreensão do metabolismo
da sacarose, portanto, é essencial para a compreensão das relações de fonte e dreno entre as
partes da plântula em crescimento. As enzimas chave do metabolismo da sacarose são:
sacarose fosfato sintase, que catalisa a síntese reversível de sacarose a partir de frutose-6-P
e NDP-glucose, a sacarose sintase que catalisa a degradação reversível da sacarose gerando
NDP-glucose e frutose e as invertases que catalisam a hidrólise irreversível da sacarose
gerando glucose e frutose. Neste trabalho, foi feito um mapeamento espacial da sacarose
sintase e espaço-temporal das invertases nos diferentes órgãos de plântulas de H. courbaril
ao longo de um dia. As sementes foram escarificadas manualmente, embebidas em uma
bandeja com vermiculita a 25
0
C. Após a germinação, as sementes foram transferidas para
vasos com vermiculita e areia (1:2), cultivadas em casa de vegetação até que os cotilédones
mostrassem sinais de murchamento, sinal que está ocorrendo a mobilização do
polissacarídeo de reserva. As plântulas foram coletadas em intervalos de 6 horas a partir da
0 hora por 24 horas, com uma coleta intermediária às 2 horas, imediatamente congeladas e
armazenadas a -80
0
C até a dosagem de atividade enzimática. Uma amostra dos diferentes
órgãos foi coletada nos diferentes horários para a análise dos carboidratos solúveis por
HPAEC-PAD. As maiores atividades de sacarose sintase por massa fresca ocorreram em
cotilédone e hipocótilo e as menores em metáfilo e eófilo. Os órgãos que apresentaram as
maiores atividades específicas foram epicótilo, hipocótilo e metáfilo, enquanto que os
cotilédones apresentaram a menor atividade. As três isoformas de invertase estudadas
tiveram variação na atividade ao longo do dia nos diferentes órgãos da plântula, com
VIII
destaque para o horário das 6 horas para a invertase de parede celular, quando há queda de
atividade desta enzima nos cotilédones e eófilos, enquanto que nos demais órgãos há um
aumento de atividade nesse horário. Às 12 horas há um pico de atividade específica de
invertase solúvel neutra em todos os órgãos, exceto raiz. Às 6 horas há um enorme pico de
atividade específica de invertase ácida no eófilo. O mapeamento temporal mostrou que o
metabolismo de sacarose parece variar ao longo do dia, coordenando as diferentes fontes
de carbono da plântula: o xiloglucano de reserva e a fotossíntese. A análise dos
carboidratos solúveis mostrou baixas concentrações destes em cotilédones, diminuição da
concentração de sacarose durante o dia no eófilo e altas concentrações de monossacarídeos
livres em metáfilo e epicótilo. A alta correlação encontrada entre a capacidade de dreno
dos órgãos e a atividade de sacarose sintase sugere que o catabolismo de sacarose por essa
enzima é um importante elemento no estabelecimento de drenos de carboidratos dentro da
plântula e pode ser usado como um marcador das relações fonte-dreno entre os diferentes
órgãos da plântula.
IX
Abstract
Almost all seeds accumulate carbohydrates, which are used by the plantlet as
carbon source during its establishment. In the case of Hymenaea courbaril L., one of the
reserves of the seed is the reserve xyloglucan, a polysaccharyde deposited in the walls of
cotyledons cells. After the germination of the seed, this polysaccharyde is converted into
sucrose and carried to other parts of the plantlet. The understanding of the metabolism of
sucrose, therefore, is essential for the understanding of the source-sink relations among
parts of the growing plantlet. The key enzymes in the sucrose metabolism are sucrose
phosphate synthase, that catalyzes the reversible synthesis of sucrose from fructose-6-P
and NDP-glucose, sucrose synthase that catalyzes the reversible degradation of sucrose
generating NDP-glucose and fructose and invertases that catalyzes irreversible hydrolysis
of sucrose generating glucose and fructose. In this work, a mapping of sucrose synthase
and invertases activities in the different organs of H. courbaril was performed throughout
one day. The seeds were abranded manually, and imbibed in a tray with vermiculite at
25
0
C. After the germination, the seeds were transferred to vases with vermiculite and sand
(1:2) and cultivated in greenhouse until the cotyledons showed wiltting signals, inicating
the mobilization of the reserve polysaccharyde. Plantlets were collected in intervals of 6
hours from the 0:00 during 24 hours, with an intermediate harvest at 2:00 and frozen in
liquid N
2
and stored at -80
0
C until use. The highest sucrose synthase activities for fresh
mass had occurred in cotyledon and hypocotyl and the lowest in metaphyll and eophyll.
The organs that presented the highest specific activities were epicotyl, hypocotyl and
metaphyll and the lowest was in cotyledons. The three isoforms of invertase varied their
activities along the day in the different plantlet organs, specially at dawn (6:00 am), when
the activity of cell wall invertase drops in the cotyledons and eophylls, while rises in the
rest of the plantlet. At 12:00 am there is a peak of neutral invertase specific activity in all
X
organs, except roots. At 6:00 am there is a huge peak of in the acid soluble invertase
specific activity in eophyll. The mapping showed that the metabolism of sucrose varies
along the day, co-ordinating the different carbon sources of plantlet: the reserve xyloglucan
and the photosynthesis. The high correlation found between the organ sink capacity and the
sucrose synthase activity suggests that the catabolism of sucrose by this enzyme is an
important element in the establishment of carbohydrate sinks inside of plantlet and can be
used as a marker of source-sink relations among the different organs of the plantlet.
INTRODUÇÃO
1. Hymenaea courbaril L. (Hayne) Lee & Lang. (jatobá)
O gênero Hymenaea surgiu na África a cerca de 65 milhões de anos, espalhou-se
e adaptou-se muito bem nas regiões neotropicais gerando muitas espécies. Hymenaea
courbaril é considerada uma das mais bem-sucedidas espécies deste gênero, com 17
variedades diferentes em florestas tropicais do México até os países tropicais da
América do Sul. Hymenaea courbaril L. (Hayne) Lee & Lang. é uma árvore de 20-30
m, com tronco de até 200 cm de diâmetro, ocorre em Floresta Estacional Semi Decidual
e Floresta Ombrófila Densa até zonas subtropicais secas e úmidas, tolerando
precipitação entre 600 e 4200 mm, temperatura média anual entre 22 e 28
o
C e solos
com pH entre 4 e 7,5. É típica de floresta madura e primária, sendo considerada espécie
secundária tardia (ou clímax) na sucessão florestal (Lee & Langenheim, 1975). Possui
sementes grandes com cotilédones globóides não-fotossintetizantes ricos em reservas
(Buckeridge & Dietrich, 1990). Tais reservas são importantes na estratégia da espécie
para o estabelecimento das plântulas.
As plântulas de H. courbaril são consideradas, em relação aos cotilédones de
reserva, como fanerocotiledonar, epígea e globóide (Santos & Buckeridge, 2004). Os
cotilédones são compostos por 46% de carbono, 9% de proteína e 3,5% de lipídeos. As
sementes germinam em sub-bosque da floresta madura, sendo as plântulas tolerantes a
sombra. H. courbaril é nativa ao longo dos rios em florestas relativamente secas do
estado de São Paulo e de partes adjacentes do Rio de Janeiro e Minas Gerais. Floresce
de janeiro a novembro e os frutos estão geralmente maduros em setembro (Lee &
Langenheim, 1975).
1
O estabelecimento das plântulas durante o crescimento heterotrófico envolve o
uso metabolicamente controlado das reservas (mobilização e partição dos produtos) até
que estas plantas sejam capazes de extrair do ambiente os recursos necessários ao seu
crescimento. Esta transição heterotrofia-autotrofia é considerada uma etapa crítica no
ciclo de vida das plantas por ser a etapa de maior mortalidade. A compreensão do
controle do metabolismo das reservas, portanto, é essencial para entender a estratégia de
uso dos recursos disponíveis para as plântulas.
2. Tipos de reserva em sementes
As angiospermas apresentam diferentes estratégias de adaptação aos seus
respectivos ambientes, entre as quais encontra-se o acúmulo de certos compostos de
reserva em suas sementes. Estas substâncias são mobilizadas após a germinação,
durante o desenvolvimento das plântulas, e seus produtos de degradação são usados
para diferentes propósitos tais como a geração de energia e a produção de matéria prima
(proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídeos) para a construção de novos tecidos
e células (Mayer & Poljakoff-Mayber, 1975). Dentre as principais substâncias
armazenadas pelas plantas, muitos polímeros de carboidratos foram selecionados
durante a evolução. O polissacarídeo de reserva mais abundante, o amido possui a
vantagem de ser formado por glucose. Este açúcar é prontamente utilizado pelo
metabolismo de geração de energia e também fornece carbono para a biossíntese da
maioria das biomoléculas presentes em células vegetais (Buckeridge et al., 2000).
Além dos polímeros de carboidratos, as sementes podem acumular sacarose e
oligossacarídeos da série rafinósica para degradação durante a germinação. A principal
função da sacarose tem sido atribuída à propriedade das sementes ortodoxas de
estabilizarem suas membranas e poderem permanecer secas por um longo período, após
2
o qual germinam normalmente. Tais sementes podem se manter viáveis por um longo
período com um baixo teor de água até que a embebição dispare várias respostas
fisiológicas que irão levar à germinação e à mobilização das reservas. Uma parte da
sacarose que chega à semente em formação pode ser utilizada para a síntese dos
oligossacarídeos da família rafinósica, cuja biossíntese ocorre no vacúolo e leva à
adição de uma unidade de galactose ao carbono 6 da molécula de glucose da sacarose na
forma de ligação alfa (Buckeridge et al., 2004).
Outra forma de armazenamento de carboidratos é através dos polissacarídeos de
reserva de parede celular de sementes, como o galactomanano, o galactano e o
xiloglucano, que são reservas para a plântula em desenvolvimento, sendo degradados
após a germinação (Buckeridge & Reid, 1996).
Cada um dos principais polissacarídeos de reserva (de parede celular e amido)
apresenta características que fazem com que eles sejam mais convenientes para o
metabolismo celular em situações específicas. Uma dessas características é o fato de
que nenhum deles possui a carbonila do aldeído livre. Esta é uma vantagem quando
comparada ao acúmulo de monossacarídeos, uma vez que tais compostos poderiam
levar à glicosilação inespecífica de elementos celulares. Outra vantagem é a relativa
inatividade osmótica dos polímeros, uma vez que o amido é insolúvel e altamente
compactado em organelas celulares específicas (amiloplastos). Por outro lado, os
estados de baixa compactação e alta solubilidade dos oligossacarídeos (sacarose e
rafinose) estão possivelmente relacionados com uma segunda função desses compostos:
controlar o potencial osmótico das células.
Os polissacarídeos de reserva de parede celular são relativamente inertes no que
concerne à sua reatividade química e apresentam diferentes graus de solubilidade em
água. Essas características conferem vantagens que são similares às do amido (alta
3
compactação e baixa reatividade) e tornam possível a existência de um “compartimento
celular” (a parede celular) que permite o fluxo de água com um grau de liberdade
considerável. Por outro lado, o custo para produzir tais polímeros é alto, pois tais
compostos necessitam de um complexo sistema de biossíntese (que requer nucleotídeos
açúcares como doadores de monossacarídeos), secreção e montagem no meio
extracelular (Buckeridge et al., 2000). Outra vantagem potencial destes polímeros é que
eles requerem um arsenal específico de enzimas para sua degradação, o que limita o
número de predadores capazes de se alimentar das sementes. Portanto, os
polissacarídeos de reserva de parede celular têm função principal como reserva (fonte
de carbono) para utilização durante o desenvolvimento da plântula e possuem funções
secundárias como controle de embebição e propriedades mecânicas dos cotilédones. São
classificados em 3 grupos distintos: os mananos, os (arabino)galactanos e os
xiloglucanos. Esta classificação é baseada essencialmente na estrutura química desses
polímeros (Buckeridge et al., 2000).
Em cotilédones de jatobá, a reserva do polissacarídeo de parede celular é o
xiloglucano, que corresponde a 40% da massa seca do órgão. Este polissacarídeo é
mobilizado após a germinação e possui concomitância com o desenvolvimento da
plântula, configurando uma reserva pós-germinativa (Tiné et al., 2000). A mobilização
do xiloglucano é sincronizada com a expansão dos eófilos e primeiros metáfilos da
plântula, sendo responsável pelo suporte energético para o início do processo
fotossintético e a transição dreno-fonte nestes tecidos (Santos & Buckeridge, 2004).
4
3. Xiloglucano de reserva
Xiloglucanos são polissacarídeos de parede celular formados por uma cadeia
principal de β-D-(1→4)-glucano ramificada com ligações α-(1→6) por unidades de D-
xilopiranosídeos ou Β-D-galactopiranosídeo-(1→2)-D-xilopiranosídeos. Exceto pela
ausência de terminais fucosil ligados [α-L-(1→2)] aos grupos β-D-galactosídeos, existe
uma grande semelhança entre xiloglucanos de reservas de sementes e xiloglucanos de
paredes primárias, em tecidos vegetativos de dicotiledôneas (Hayashi, 1989).
A função de reserva dos xiloglucanos foi demonstrada em cotilédones de
sementes de Tropaeolum majus (Edwards et al., 1985), Tamarindus indica (Reis et al.,
1987), Copaifera langsdorffii (Buckeridge et al., 1992) e Hymenaea courbaril (Tiné et
al., 2000, Santos & Buckeridge, 2004), nas quais a mobilização deste polímero foi
acompanhada in vivo pelo incremento e queda da atividade de quatro hidrolases: β-
galactosidase, xiloglucano-endo-β-(1→4)-glucanase (XET), α-xilosidade e β-
glucosidase.
Embora o mecanismo bioquímico do desmonte do xiloglucano já tenha sido
estudado, sabe-se pouco sobre o transporte de carbono entre as partes da planta. A
ausência de outros oligossacarídeos, além da sacarose, nos cotilédones de H. courbaril,
sugere que este dissacarídeo seja a forma de transporte de carbono predominante entre o
órgão fonte (cotilédone) e os drenos (plântula em desenvolvimento).
Trabalhos anteriores com H. courbaril (Santos, 2002; Amaral, 2005) mostraram
que os resultados estão fortemente associados ao horário das coletas devido ao ritmo
circadiano, já que o metabolismo de carboidratos de reserva durante a noite está
intimamente associado ao metabolismo fotossintético durante o dia. No caso de H.
5
courbaril, como a mobilização ocorre em um momento em que algumas folhas já
apresentam atividade fotossintética, a mobilização parece ocorrer durante a noite,
quando o fluxo de carbono a partir dos órgãos fotossintéticos cessa (Barriga, 2003).
4. Relações fonte-dreno de sacarose
Em H. courbaril, a degradação do xiloglucano de reserva ocorre ao mesmo
tempo em que a fotossíntese é iniciada nos eófilos, primeiros pares de folhas que
emergem da abertura dos cotilédones. Neste caso, a plântula em desenvolvimento
possui duas possíveis fontes de carbono simultaneamente: a reserva dos cotilédones e a
fotossíntese. No caso da fotossíntese, existe um ritmo circadiano associado à
disponibilidade de luz. Por outro lado, foi verificado que a degradação do xiloglucano
de reserva ocorre durante a noite (Amaral, 2005). Nos dois casos, a sacarose parece ser
a forma de transporte do carbono ao longo da planta. As duas fontes de carbono,
portanto, parecem estar finamente sincronizadas de modo que durante o dia, a
fotossíntese nas folhas maduras produz a sacarose exportada para o resto da planta.
Durante a noite, as reservas de xiloglucano são mobilizadas, o que mantém a
disponibilidade de carbono para os tecidos em crescimento durante todo o dia (figura 1).
A própria disponibilidade de sacarose nos tecidos poderia funcionar como um
sinalizador no processo, uma vez que além de fonte de energia, a própria sacarose pode
atuar como um regulador direto ou indireto da expressão gênica (Winter & Huber,
2000).
Santos & Buckeridge (2004) indicaram que o controle da degradação de
xiloglucano em H. courbaril parece ser exercido pela auxina, devido aos picos de
atividade das hidrolases responsáveis pela mobilização deste polímero, que ocorrem
paralelamente aos maiores teores de auxina endógena.
6
Nas plantas, portanto, existem órgãos que atuam como fontes de carboidratos e
outros que atuam como drenos. Tais relações fonte-dreno são dinâmicas e variam não
apenas ao longo do desenvolvimento da planta como também ao longo de um dia.
Órgãos de reserva, por exemplo, atuam como potentes drenos durante o acúmulo das
reservas e passam a atuar como fontes quando da mobilização destas reservas. No caso
das plântulas de H. courbaril, durante a mobilização do xiloglucano de reserva, o
modelo atual propõe que as folhas maduras atuariam como fonte durante o período
luminoso do dia e à noite, com a redução da capacidade de exportação das folhas, a
mobilização do xiloglucano de reserva seria estimulada, aumentando a capacidade de
exportação dos cotilédones. Entender o metabolismo e o transporte de sacarose na
plântula durante a degradação do polissacarídeo de reserva é, portanto, essencial para a
compreensão do uso e da partição dos carboidratos na plântula. Para a melhor
compreensão do metabolismo de carboidratos, devem-se direcionar os estudos para os
diferentes órgãos da planta durante seu crescimento inicial: raiz, hipocótilo (caule
abaixo da inserção cotiledonar), cotilédones, eófilos, epicótilo (caule acima da inserção
cotiledonar) e metáfilos (figura 1).
Os órgãos-fonte de sacarose seriam aqueles com função de reserva (como os
cotilédones) ou folhas maduras (como os eófilos), capazes de produzir fotossintatos em
excesso além de sua própria necessidade. Os órgãos-dreno de sacarose seriam aqueles
não fotossintetizantes ou incapazes de produzir fotossintatos em quantidade suficiente
para sustentar o próprio crescimento ou necessidade de armazenamento (Taiz & Zeiger,
1998).
7
Xiloglucan
Gal, Glc, Xil
SPS
Sacarose
Amido
↔
Glc↔
Sac
?
Amido
Sacarose
Glc
Fru
?
SS
Inv
Figura 1. Esquema geral de degradação do xiloglucano de reserva nos cotilédones e o
transporte de sacarose para os diferentes órgãos-dreno durante o crescimento inicial de
plantas de Hymenaea courbaril (jatobá). Em negrito estão mostrados os possíveis locais
de atividade das enzimas do metabolismo da sacarose – SPS (sacarose fosfato sintase),
SS (sacarose sintase) e Inv (invertase). Os pontos de interrogação indicam que nenhum
estudo neste sentido foi realizado, portanto, a detecção destas enzimas nesta espécie
deve ser a primeira etapa a ser cumprida (adaptado de Tiné, 1997).
Santos & Buckeridge (2004) injetaram sacarose marcada radioativamente (
14
C-
sacarose) em um dos cotilédones de plântulas de Hymenaea courbaril e acompanharam
a distribuição da marcação radioativa após 72 horas (tabela 1). O eófilo neste ponto do
desenvolvimento já se encontra fotossinteticamente ativo e já não representa um dreno
importante. Embora no cotilédone no qual a radioatividade foi injetada (tratado) a
contagem tenha sido alta, a contagem no cotilédone não tratado foi zero, o que mostrou
que não houve importação nenhuma de sacarose para aquele órgão. Os órgãos que
8
apresentaram as maiores contagens por tecido foram metáfilo e epicótilo. A maior parte
do carbono exportado do cotilédone teve como destino a parte aérea em expansão.
Tabela 1. Distribuição relativa de [
14
C]sacarose entre diferentes tecidos de plântulas de
35 dias de idade de H. courbaril (adaptado de Santos et al., 2004).
Radioatividade relativa (%)*
Tecido Contagens por tecido Força de dreno**
Epicótilo***
15±2,9 41±7,3
Metáfilo
24±6,8 22±8,7
Eófilo
6±2,9 2±1,3
Hipocótilo
14±4,5 7±3,7
Cotilédone não tratado
0±0,0 0±0,0
Cotilédone tratado
30±8,3 20±5,1
Raiz
10±6,2 8±4,2
A sacarose radioativa foi injetada (5µL, 18520 Bq) em um cotilédone (tratado) e a
[
14
C]cintilação foi lida depois de 72 h.
*Os números representam a média de 9 replicatas (plântulas) ± desvio padrão.
**Porcentagem de contagens por g de massa seca.
*** Região do caule superior à inserção dos cotilédones.
5. Enzimas do metabolismo de sacarose
Os estudos de metabolismo de carboidratos devem ser realizados através da
análise de enzimas relacionadas ao metabolismo da sacarose, que regulam a entrada
deste dissacarídeo dentro das diferentes rotas bioquímicas, como respiração, biossíntese
de parede celular e produção de reservas temporárias (Sturm & Tang, 1999), permitindo
o entendimento da partição e utilização dos carboidratos.
A síntese de sacarose é realizada principalmente pela sacarose fosfato sintase
(SPS) (EC 2.4.1.14), uma enzima alostérica ativada pela glucose-6-fosfato e inibida
9
pelo ortofosfato (Taiz & Zeiger, 1998). A fosforilação da enzima está sendo considerada
como um importante mecanismo de controle da atividade de SPS em resposta a vários
sinais endógenos e do ambiente (Winter & Huber, 2000). A degradação da sacarose, e
consequentemente, o estabelecimento do dreno, podem ser realizados tanto pela
invertase (INV) (EC 3.2.1.26) quanto pela sacarose sintase (Sus) (EC 2.4.1.13):
NDP+sacarose
NDP-glucose + frutose
SuS
NDP-glucose + frutose
SuS
NDP+sacarose
SP
S
NDP-glucose + frutose-6P
sacarosesacarose glucose + frutose
INVERTASE
Segundo Magel et al. (2000), o estado de ativação da sacarose fosfato sintase
pode ser usado como um indicador da taxa de síntese de sacarose e, indiretamente, para
a atividade “fonte” de um dado órgão. Ao contrário, a atividade das enzimas que
catalizam a quebra da sacarose, invertases e sacarose sintase, servem como indicador do
aumento da atividade de “dreno”. Nos drenos, é necessário que a sacarose seja
hidrolisada em hexoses. A invertase é uma hidrolase que catalisa a hidrólise irreversível
da sacarose até suas hexoses livres (glucose + frutose), e sua atividade tem sido
associada à expansão celular (Winter & Huber, 2000). A sacarose sintase (SS) é uma
glicosil transferase, que, na presença de uridina difosfato (UDP), converte sacarose em
UDP-glucose e frutose (Sturm & Tang, 1999), sendo uma reação reversível que retém
energia no nucleotídeo-açúcar produzido e sua atividade tem sido associada à
biossíntese de parede celular ou produtos de reserva (Winter & Huber, 2000).
Existem pelo menos 2 isoformas de sacarose sintase. São citoplasmáticas,
solúveis ou podem apresentar-se fortemente aderidas
ao complexo de celulose sintase
10
na membrana plasmática ou no cito-esqueleto, dependendo do estado de fosforilação
(Sturm & Tang, 1999), sendo a forma não fosforilada solúvel.
Existem pelo menos 3 isoformas de invertase nos tecidos que diferem entre si
pela localização celular e propriedades catalíticas. Uma das isoformas está localizada no
vacúolo, é solúvel em tampão e possui pH ótimo em torno de 4,6. Outra isoforma está
presente na parede celular, é insolúvel e também possui pH ótimo em torno de 4,6. A
terceira isoforma está localizada no citoplasma, é solúvel e possui pH ótimo em torno de
7,0. Aparentemente, as atividades dessas invertases são independentes e possuem
funções distintas, sendo que cada célula pode apresentar as diferentes isoformas em
diferentes proporções. Em estudos com plantas transgênicas de cenoura, as atividades
das diferentes enzimas do metabolismo de sacarose foram alteradas por expressão
antisense (Sturm & Tang, 1999). Tais mutações geraram redução do acúmulo de
carboidratos, redução do crescimento do órgão de reserva e alteração da razão raiz/parte
aérea, sugerindo profundas alterações nas relações de fonte e dreno da planta.
11
OBJETIVOS
Como contribuição ao estudo do metabolismo de carboidratos em Hymenaea
courbaril, o presente trabalho se propõe a:
1. mapear nos diferentes órgãos da plântula as atividades das enzimas de
degradação de sacarose durante a mobilização do xiloglucano de reserva;
2. mapear nos diferentes órgãos da plântula as atividades das isoformas de
invertase ao longo de um dia durante a mobilização do xiloglucano de reserva.
12
MATERIAL E MÉTODOS
Aproximadamente 1,0 kg de sementes de Hymenaea courbaril foram adquiridas
no Instituto Florestal. As sementes de Hymenaea courbaril foram escarificadas
mecanicamente e embebidas em bandejas com papel de filtro em câmaras de
crescimento a 30 °C com fotoperíodo de 12 horas. Após a germinação, as sementes
foram colocadas em vasos com mistura vermiculita-quartzo (1:2) e mantidas em casa de
vegetação por cerca de 40 dias até a coleta, quando a mobilização do polissacarídeo de
reserva atingiu sua taxa máxima, evidenciada pelo enrugamento dos cotilédones.
Para o mapeamento espaço-temporal das atividades das invertases e dos teores
de carboidratos solúveis foram utilizadas plântulas coletadas às 0:00, 2:00, 6:00, 12:00 e
18:00 horas. 3 plântulas foram coletadas por horário, levando-se em conta parâmetros
de semelhança entre elas como tamanho e estágio de desenvolvimento, imediatamente
congeladas e mantidas a -80
o
C. A coleta intermediária das 2:00 horas foi feita porque
dados de Amaral (2005) indicaram este como sendo o horário de máxima atividade das
enzimas de degradação e, portanto, o provável horário de máxima mobilização. As
diferentes partes das plântulas (raiz, hipocótilo, cotilédones, eófilo, metáfilo e epicótilo)
(figura 2) foram separadas e processadas de forma independente. As partes separadas
foram congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -80
o
C até o preparo dos extratos
enzimáticos.
13
Metáfilo
Eófilo
Epicótilo
Cotilédone
Hipocótilo
Raiz
Figura 2. Plântula de Hymenaea courbaril e seus diferentes órgãos.
1. Sacarose sintase (EC 2.4.1.13)
A quantificação da atividade de sacarose sintase foi feita no sentido de síntese de
sacarose. A literatura foi consultada para delinearmos uma estratégia de como seriam
efetuados a extração e o ensaio enzimático.
A metodologia utilizada para o ensaio consistiu de três etapas: I-síntese de
sacarose pela Sus; II- hidrólise da sacarose formada por invertase e; III- quantificação
da glucose livre pelo método da glucose oxidase-peroxidase (LabTest).
As partes da plântula foram homogeneizadas em gelo em tampão Tris HCl 100
mM pH 7,5 com 50mM NaCl, 0,2mM PMSF, 5mM oxalato de amônio
,
10 mM cloreto
de magnésio, na proporção de 5 mL por grama de matéria fresca. O extrato bruto foi
centrifugado a 10000g por 10 minutos a 4°C. A fração solúvel foi dialisada contra
tampão Tris HCl 25 mM pH 7,5 com 50mM NaCl, 2mM MgCl
2
. A diálise teve duração
14
de 2 horas com a troca da solução tampão de 30 em 30 minutos a 4°C. No final da
diálise foram medidos os volumes dos extratos enzimáticos dos diferentes órgãos da
plântula.
O ensaio de Sus foi constituído por 3 etapas descritas a seguir:
I – Ensaio de Sus: 300 µL de extrato enzimático, 300 µL de tampão de ensaio
contendo tampão Tris-HCl 25mM pH 7,5, MgCl
2
40mM, frutose 30 mM e UDP-glucose
20mM. Este sistema foi incubado a 30
0
C por 20 minutos.
II – Hidrólise da sacarose formada após a incubação anterior: foram adicionados
ao sistema de ensaio 50 µL de ácido acético 0,5 M e 150 µL invertase Sigma (1mg/mL).
O ácido acético foi adicionado nesta etapa para que houvesse o ajuste do pH para o
ótimo de atividade da invertase Sigma, que hidrolisa a sacarose formada na reação I.
Uma curva de tempo foi feita para esta etapa e verificou-se que o tempo suficiente de
incubação foi de 10 minutos, tempo utilizado para o ensaio (figura 3A).
III – Dosagem de glucose livre: após a incubação da invertase, a glucose livre
produzida pela ação da invertase foi quantificada pela adição de 100 µL de tampão Tris
HCl 1,0M pH 8,0, 600 µL de solução de dosagem de glicose (LabTest). Foi feita uma
curva de tempo (figura 3B) e verificou-se que o tempo ótimo de incubação foi de 10
minutos. A absorbância foi determinada a 505 nm e comparada com a de uma curva-
padrão de sacarose.
15
A
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
010203040
tempo (min)
abs 540 nm
50
B
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 10203040
tempo (min)
abs 540 nm
50
Figura 3. Otimização dos tempos de incubação de Invertase (A) e glucose oxidase (B)
no ensaio de sacarose sintase.
Para que a quantificação da atividade (etapa I) seja correta, portanto, é
necessário que as duas reações subseqüentes consumam totalmente o substrato
disponível, enquanto na primeira reação o limitante seja a disponibilidade de enzima e
não o substrato. Uma curva de concentração de sacarose (figura 4) feita a partir da etapa
“II”, ou seja, com incubação de sacarose com invertase e depois com o sistema GOD-
POD, mostrou uma relação linear entre concentração e absorbância. Esta relação valida
a metodologia usada mostrando que é possível quantificar a sacarose formada pelo
método proposto. O fato de a curva não passar pela origem do gráfico, sugere a
16
presença de glucose não ligada na solução de sacarose utilizada, algo que tem sido
repetidamente observado em nosso laboratório, principalmente quando as soluções
ficam estocadas muito tempo, mesmo que congeladas. Tal artefato poderia levar à
superestimação da atividade de Sus, mas isso pode ser facilmente compensado com o
uso de um controle com extrato enzimático fervido. As curvas de tempo feitas (figura 3)
mostram que nas condições utilizadas, 10 minutos de incubação são suficientes para as
etapas “II” e “III” do ensaio.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 102030405
µ
g de sac
abs 540 nm
0
Figura 4. Curva de concentração de sacarose (sac). A curva mostra a linearidade da
resposta do ensaio de sacarose sintase (Sus) a diferentes concentrações de sacarose
adicionadas na etapa I da dosagem de Sus, onde a sacarose é sintetizada.
2. Invertase (EC 3.2.1.26)
Assim como ocorreu com a sacarose sintase, foi necessária uma otimização das
metodologias de extração e ensaio das isoformas de invertase. A escolha do tampão foi
feita levando em consideração um ensaio de interferência dos tampões no nosso ensaio
(tabela 2). Devido ao alto valor de absorbância do controle (branco) em alguns ensaios,
foram realizados testes para averiguação de possível interferência que alguns tampões
17
poderiam causar na leitura espectrofotométrica. Seria necessário comparar os valores de
absorbância dos tampões em diferentes concentrações, na ausência e presença de
glucose. Os tampões utilizados no teste foram: Fosfato, Hepes e Tris, nas concentrações
5 e 20 mM em pH 7,5, em virtude da boa capacidade tamponante de todos neste pH,
condição apropriada para o ensaio da glucose oxidase-peroxidase.
Os ensaios foram efetuados da seguinte maneira: em 200 µL dos tampões, tanto
naqueles em que a glucose (20µg) foi adicionada quanto naqueles sem glucose, foram
adicionados 500 µL de solução de dosagem de glicose (Labtest). Também foram feitos
ensaios com água no mesmo volume, também com glucose ausente e presente. Após o
tempo de incubação deste ensaio (10 min.), as absorbâncias foram determinadas a 505
nm e as leituras foram comparadas.
Tabela 2. Absorbância do ensaio de glucose oxidase-peroxidase na presença de
diferentes tampões. Duas concentrações de cada tampão foram utilizadas, sempre em
pH 7,5. s/= sem glicose (branco com tampão), c/= com 20 µg de glicose. n=3.
Água Fosfato Tris Hepes
10 mM 50 mM 5 mM 20 mM 5 mM 20mM
s/ c/ s/ c/ s/ c/ s/ c/ s/ c/ s/ c/ s/ c/
0 0.576 0 0.910 0.152 1.082 0 0.693 0 0.763 0 0.863 0 0.797
Todos os tampões ensaiados aumentaram a absorbância quando comparados
com o ensaio realizado apenas com água (OD=0,576). O tampão fosfato foi o que
causou maior interferência, aumentando a absorbância mesmo do branco, onde não foi
adicionada glucose (OD=0.152) e dobrando a absorbância do controle na maior
concentração (OD=1.082). A interferência foi dependente da concentração, pois para
18
todos os tampões a maior concentração causou a maior interferência. O tampão Tris foi
o que menos apresentou interferência no resultado final de leitura de glucose. A diálise
anteriormente feita contra tampão fosfato 50mM pH 7,5 passou a ser feita contra
tampão tris 10 mM pH 6,5.
Durante a etapa de otimização também foi feita uma curva de atividade em
diferentes temperaturas (figura 5). Para o ensaio foram preparados banhos com
temperaturas variando de 8 a 45
0
C onde os sistemas foram incubados por 20 minutos e
logo após fervido por 2 minutos. Foram adicionados 500 µL de solução de dosagem de
glucose (LabTest) e o sistema foi incubado por mais 10 minutos. As absorbâncias foram
determinadas a 505 nm e as leituras foram comparadas com uma curva padrão de
glicose. A curva mostrou um ótimo de atividade em 30
o
C. Embora a diferença em
relação à atividade feita a 40
o
C seja pequena, o desvio padrão foi maior, o que pode ser
efeito da desnaturação da enzima, que causa perda de atividade em algumas frações.
Para evitar este problema de perda de atividade, mantivemos a temperatura de ensaio a
30
o
C.
0,0
0,1
0,2
0,3
0 102030405
T(
o
C)
µ
g glc.min
-1
0
Figura 5. Curva de temperatura da invertase alcalina extraída de eófilo de Hymenaea
courbaril (n=3).
19
Devido à dificuldade de dosar a atividade específica das isoformas insolúveis,
foi feita uma tentativa de solubilizá-las, com lavagens sucessivas do precipitado com
NaCl 0,5M em tampão acetato 50mM pH 4,6. Não apenas as sucessivas solubilizações
não reduziram a atividade enzimática a zero (figura 6), como também uma grande parte
da atividade permaneceu insolúvel, associada ao sedimento após a centrifugação. Diante
disso, foi mantido o procedimento de lavar 3 vezes o sedimento com tampão NaAc 50
mM pH4,6 para remover o material solúvel, seguido de ensaio com o sedimento.
A
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
I II III IV V insolúvel
Lavagens em Tp NaAc 50 mM
µ
g glc.min
-1
c/ NaCl 0,5 M
s/ NaCl 0,5 M
B
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
I II III IV V insolúvel
Lavagens em Tp NaAc 50 mM
µ
g glc.min
-1
c/ NaCl 0,5 M
s/ NaCl 0,5 M
Figura 6. Atividade de invertase insolúvel em cotilédones (A) e eófilos (B) de plântula
de Hymenaea courbaril após 5 lavagens sucessivas em tampão NaAc 50 mM com e
sem NaCl 0,5 M. A última coluna refere-se à atividade que permaneceu insolúvel,
associada ao sedimento da centrifugação.
20
Após a etapa de otimização nas condições de extração e ensaio, a extração de
invertase foi feita com homogeneização dos tecidos em gelo com tampão tris-HCl 10
mM pH 6,5 na proporção de 5 mL por grama de matéria fresca. Após a
homogeneização, o extrato bruto foi centrifugado por 3 minutos a 13.000 rpm, para
separação da fração solúvel da insolúvel. O extrato bruto solúvel foi dialisado contra
tampão Tris 10 mM pH 6,5 durante 4 horas, com troca de tampão de hora em hora. No
final da diálise o volume dos extratos enzimáticos dos diferentes órgãos da plântula foi
medido. O sedimento insolúvel foi lavado 3 vezes com 500µL de tampão acetato de
sódio 50 mM pH 4,6 e o sedimento foi usado para determinação da atividade de
invertase insolúvel.
As condições de ensaio da invertase solúvel alcalina foram: 200 µL de extrato
enzimático, 80 µL sacarose 0,6M. Este sistema foi incubado a 30
0
C por 10 minutos e
logo após foi fervido por 2 minutos. Foram adicionados 500 µL de solução de dosagem
de glucose (LabTest) e o sistema foi incubado por mais 10 minutos. Depois a
absorbância foi determinada a 505nm e a quantidade de glicose liberada foi quantificada
por comparação com uma curva padrão de glucose.
As condições de ensaio da invertase solúvel ácida foram as seguintes: 200 µL de
extrato enzimático, 10 µL ácido acético 0,05 M, 80 µL sacarose 0,6M. O volume de
ácido acético a ser adicionado foi determinado previamente de modo a levar o pH do
ensaio a 4,5. Este sistema foi incubado a 30
o
C por 20 minutos e fervido por 2 minutos.
Foram adicionados 40 µL de tampão Tris 100 mM pH 8,0 e 500 µL de solução de
dosagem de glucose (LabTest). Novamente, a quantidade de tampão a ser adicionada foi
determinada em ensaios preliminares para que a condição de ensaio fosse apropriada
para a glucose oxidase-peroxidase (pH 7,5). O sistema foi incubado por mais 10
minutos. O procedimento de dosagem de glucose é o mesmo descrito acima.
21
As condições de ensaio da invertase insolúvel foram: 75 mg de sedimento
insolúvel, 250 µL tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,6, 80 µL sacarose 0,6M. O
sistema foi incubado a 30
0
C por 20 minutos. Após fervura por dois minutos, 250 µL do
sistema foram transferidos para um tubo contendo 625 µL de tampão tris 100 mM pH
8,0 e 500 µL de solução de dosagem de glucose (LabTest). O procedimento de dosagem
de glucose foi o mesmo descrito acima.
Os teores de proteína dos extratos de SS e invertase foram determinados usando
50 µL de extrato enzimático, 750 µL de água e 200 µL de solução de Bradford
(BioRad). A absorbância foi determinada a 595nm. A quantidade de proteína foi
determinada por comparação com uma curva padrão de albumina bovina sérica.
As análises estatísticas foram determinadas pela análise de variância (ANOVA)
utilizando o Winstat para Excel. O teste de diferença entre as médias foi o “least
significant diferences” (LSD) com p=0,05.
3. Análises de carboidratos
Para a análise de carboidratos, amostras das partes congeladas das plântulas
foram liofilizadas, maceradas, colocadas em eppendorf de 2,0 mL e pesadas. A extração
dos acúcares foi feita com 400 µL de etanol 80%, em banho a 80
0
C por 10 minutos,
seguida por centrifugação e retirada do sobrenadante. Este procedimento foi repetido 5
vezes, perfazendo 2,0 mL de sobrenadante submetido a posterior secagem em baixa
pressão com centrifugação (Hetovac). O material seco foi retomado em 1000 microlitros
de água e o teor de açúcares foi determinado pelo método fenol-sulfúrico (Dubois et al,
1956). Em um tubo de vidro foram acrescentados uma alíquota da amostra a ser dosada
e água para um volume final de 0,5mL, 0,5mL de fenol e 2,5 mL de ácido sulfúrico com
22
homogeneização vigorosa, para posterior leitura de absorbância a 490 nm. A
quantificação de açúcar foi feita por comparação com curva padrão de glucose.
Os monossacarídeos e oligossacarídeos presentes nas frações de material solúvel
em etanol foram analisados por cromatografia de troca aniônica de alta performance
associada à detecção por pulso amperométrico (HPAEC-PAD) com coluna Carbo-Pac
PA1 em eluição isocrática com NaOH 150mM por 20 minutos. Os carboidratos foram
identificados e quantificados por comparação com os perfis de eluição de padrões
comerciais.
23
RESULTADOS
1. Sacarose sintase (Sus) (EC 2.4.1.13)
A dosagem de sacarose sintase foi realizada em plântulas coletadas às duas da
manhã. Como este é o horário de maior atividade das enzimas de degradação do
xiloglucano, acredita-se que este seja o horário de maior mobilização do xiloglucano.
Como a atividade de praticamente todas as outras enzimas, os dados podem ser
apresentados como atividade por massa fresca (figura 7) ou como atividade específica
(figura 8). A expressão dos dados nas duas formas leva a interpretações distintas.
Quando expressos na forma de atividade por massa fresca, o órgão com maior atividade
é o cotilédone, embora este seja o órgão da plântula que possui maior massa. Como o
órgão possui uma grande quantidade de proteínas de reserva, porém, a atividade
específica é a mais baixa. O órgão que apresenta a maior atividade específica é o
epicótilo. O hipocótilo apresenta uma alta atividade nas duas formas de expressão dos
dados. Sendo que o metáfilo apresenta uma atividade muito semelhante a este último
órgão apenas em atividade específica. A raiz e o eófilo estão entre as atividades mais
baixas nas duas formas de expressão dos dados.
No presente trabalho os órgãos foram macerados inteiros e não foi feito nenhum
tipo de separação dos vários tecidos que compõem cada um dos órgãos. Em todas as
análises dos dados é importante lembrar que o resultado obtido é um resultado médio
dos diversos tecidos que compõem cada um dos órgãos: parênquima, xilema, floema,
epiderme, etc. Por se tratarem de tecidos distintos, é bem provável que cada um deles
tenha um metabolismo próprio e, portanto, tenham demandas de carboidrato e atividade
das enzimas distintas e nas discussões de resultados apresentadas será ignorado o
transporte de carbono dentro do órgão, ou seja, a relação entre os tecidos.
24
0
40
80
120
160
RAIZ EOF EPI COT MET HIP
suc.massa (
µ
g.min
-1
.g
-1
)
Figura 7. Atividade de sacarose sintase às 2h da manhã em órgãos de plântula de
Hymenaea courbaril (µg sacarose.min
-1
.g matéria fresca
-1
). EOF: eófilo, EPI: epicótilo,
COT: cotilédone, MET: metáfilo, HIP: hipocótilo. n=3. Barras verticais representam o
desvio padrão.
0
10
20
30
40
50
RAIZ EOF EPI COT MET HIP
ativ.específica (
µ
g suc.min
-1
.
µ
g
-1
)
Figura 8. Atividade específica de sacarose sintase as 2h da manhã em órgãos de plântula
de Hymenaea courbaril (µ g sacarose. min
-1
. µg proteína
-1
). EOF: eófilo, EPI: epicótilo,
COT: cotilédone, MET: metáfilo, HIP: hipocótilo. n=3. Barras verticais representam o
desvio padrão.
25
2. Invertase (EC 3.2.1.26)
Para as isoformas de invertase, foi feito o acompanhamento da atividade das 0 às
e invertase insolúvel mostrou variação da
atividade em alguns órgãos ao longo do dia (figura 9). Por ser uma enzima insolúvel,
não é possível determinar o teor de proteína solúvel, razão pela qual não é possível
expressar a atividade em atividade específica. O único órgão que não apresentou
variação significativa na atividade foi a raiz, embora haja uma queda na atividade às 6
horas. Em hipocótilo, epicótilo e metáfilo foi observado um pico de atividade às 6:00
horas, acompanhado de um decréscimo gradativo. Entre esses, o metáfilo apresentou a
maior atividade dessa enzima em toda a planta, enquanto o epicótilo apresentou a menor
atividade. Atividade igualmente baixa foi encontrada no eófilo, embora seu
comportamento tenha sido inverso, com uma queda na atividade às 6:00 horas. Também
em cotilédone ocorreu o mesmo padrão, com uma variação simetricamente inversa com
os outros órgãos: a atividade desta enzima diminui até os valores mais baixos às 6:00
horas. Após esse horário a atividade cresce gradativamente.
18 horas. A determinação da atividade d
26
ourbaril (em µg de glucose liberada.min
-1
.g massa fresca
-1
) ao longo do dia. Letras
o de
tividade às 2 horas em todos os órgãos (figura 10). Logo em seguida ao pico há uma
queda n
Raiz
0
10
20
30
40
50
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
a
a
aa
Hipocótilo
0
10
20
30
40
50
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
aa
bab
a
Cotilédone
0
10
20
30
40
50
061218
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
ab
b
ab
a
Eófilo
0
10
20
30
40
50
061218
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
b
c
aa
Epicótilo
0
10
20
30
40
50
0 6 12 18
horas
µ
c.m
.g M
ab
a
b
ab a
Metáfilo
0
10
20
30
40
50
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
a
b
a
a
F
-1
in
-1
g gl
Figura 9. Atividade de invertase insolúvel nos órgãos de plântulas de Hymenaea
c
diferentes correspondem a diferenças estatisticamente significativas (p=0,05) n=3.
A dosagem de invertase solúvel ácida ao longo do dia mostrou um pic
a
a atividade que permanece em um nível basal até a próxima madrugada. A única
27
exceção são os cotilédones, cuja atividade continuou crescendo ao longo do dia e não
baixou aos níveis do início do experimento.
Figura 10. Atividade de invertase solúvel ácida nos órgãos de plântulas de Hymenaea
courbaril (em µg de glucose liberada.min
-1
.g massa fresca
-1
) ao longo do dia. Letras
diferentes correspondem a diferenças significativas (p=0,05) n=3.
Quando a atividade é expressa na forma de atividade específica (Figura 11), o
padrão de atividade se torna menos claro. O perfil obtido nos cotilédones, por outro
Raiz
0
2
4
6
061218
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
b
a
ab
a
8
Hipocótilo
0
2
4
6
8
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
c
a
b
b
Cotilédone
0
2
4
6
8
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
ab
a
ab
b
Eófilo
0
2
4
6
8
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
c
a
ab
b
Epicótilo
0
2
4
6
8
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
b
a
a
a
Metáfilo
0
2
4
6
8
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
b
ab
aab
28
lado, se
rgãos de plântulas de H.courbaril ao longo do dia. Letras diferentes correspondem a
diferenças significativas (p=0,05) n=3.
aproxima padrão do observado anteriormente (um pico às 2 horas). Na raiz, no
hipocótilo e no epicótilo, a atividade varia ao longo do dia com um pico às 2 horas e
outro ao meio dia. No eófilo, há apenas um pico ao amanhecer (6 horas), enquanto no
metáfilo, não há uma variação significativa ao longo do dia, embora exista uma
tendência ao aumento da atividade durante a madrugada.
Raiz
1,50
ca
0,00
0,50
1,00
061218
horas
ativ. específi
a
bc ab
c
abc
Hipocótilo
1,50
ca
0,00
0,50
1,00
061218
horas
ativ. específi
a
a
a
aa
Eófilo
0,00
0,50
1,00
1,50
0 6 12 18
horas
ativ.específica
a
b
c
ab
ab
Cotilédone
0,00
0,50
1,00
1,50
0 6 12 18
horas
ativ. específica
a
b
aaa
Epicótilo
0,00
0,50
1,00
1,50
061218
horas
ativ. específica
a
c
aab bc
Metáfilo
0,00
0,50
1,00
1,50
0 6 12 18
horas
ativ. específica
a
a
a
a
a
Figura 11. Atividade específica (µg suc.min
-1
.µg ptn
-1
) de invertase solúvel ácida nos
ó
29
O perfil de atividade ao longo do dia da invertase solúvel neutra foi diferente das
demais enzimas (figuras 12 e 13). No geral, as maiores atividades foram observadas
durante o dia. Na raiz, tanto na atividade específica quanto na atividade por massa
fresca,
não houve variação significativa na atividade ao longo do dia, embora o gráfico
mostre uma tendência a uma queda no fim do dia, seguido de um aumento de
madrugada que se mantém durante o dia. O hipocótilo apresentou um pico de atividade
no fim da tarde, mas ao calcularmos a atividade específica, o pico de atividade aparece
claramente no fim do dia. O cotilédone apresentou um aumento gradual de atividade ao
longo do dia, mas o cálculo da atividade específica também mostrou um pico no fim da
tarde. Um pequeno pico de atividade específica aparece às duas horas. O eófilo
apresentou um grande pico de atividade ao meio dia. O epicótilo e o metáfilo
apresentaram um aumento gradual da atividade específica de invertase solúvel neutra
durante a manhã com um pico ao meio dia.
30
Figura 12. Atividade de invertase solúvel neutra (em µg de glucose liberada.min
-1
.g
assa fresca
-1
) nos órgãos de plântulas de Hymenaea courbaril ao longo do dia. Letras
iferentes correspondem a diferenças significativas (p=0,05) n=3.
Raiz
0
2
4
6
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
a
a
aa
Hipocótilo
0
2
4
6
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
aa
b
a
a
Cotilédone
0
2
4
6
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
a
ab
bc
c
d
Eófilo
0
2
4
6
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
aa a a
b
Epicótilo
0
2
4
6
061218
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
aab
b
Metáfilo
0
2
4
6
0 6 12 18
horas
µ
g glc.min
-1
.g MF
-1
aa
b
b
ab
aa
m
d
31
Raiz
0,0
0,1
0,20
0,30
061218
horas
ativ. específica
a
aa a
a
0
0
Hipocótilo
0,00
0,10
0,20
0,30
0 6 12 18
horas
ativ. específica
aa
a
a
b
Cotilédone
0,00
0,10
0,20
0,30
6 12 18
horas
ativ. específica
aa
a
b
c
0
Eófilo
0,00
0,10
0,20
0,30
0 6 12 18
horas
ativ. específica
aa
a
a
b
Epicótilo
0,00
0,10
0,20
0,30
0 6 12 18
horas
ativ. específica
aa
ab
b
a
Metáfilo
0,00
0,10
0,20
0,30
0 6 12 18
horas
ativ. específica
a
a
a
a
a
Figura 13. Atividade específica (µg suc.min
-1
.µg ptn
-1
) de invertase solúvel neutra nos
órgãos de plântulas de H.courbaril ao longo do dia. Letras diferentes correspondem a
diferenças significativas (p=0,05) n=3.
32
3. Análise dos carboidratos
Na raiz, as concentrações de monossacarídeos permaneceram constantes. A
oncentração de sacarose foi constante durante a madrugada, mas caiu às 12:00 horas,
de um aumento significativo. As concentrações de
rgãos de plântulas de H. courbaril ao longo do dia. Colunas hachuradas = sacarose,
olunas pretas = glucose, colunas brancas = frutose. Letras diferentes correspondem a
diferenças significativas entre os horários de cada carboidrato (p=0,05) n=3.
c
queda que foi seguida
monossacarídeos também não variaram no hipocótilo mas ao amanhecer, houve uma
queda na concentração de sacarose, seguida por um aumento ao longo do dia com um
pico no fim da tarde (figura 14) (tabela 3).
Raiz
40
arboidr (
µ
g.g
-1
)
0
10
20
30
12345
horas
c ato
Hipocótilo
40
(
µ
g. g
-1
0
10
20
30
12345
horas
carboidrato )
Cotilédone
0
10
20
30
40
12345
horas
oidr
-1
)
Figura 14. Análise qualitativa de carboidratos solúveis por HPAEC-PAD nos diferentes
ó
c
carb ato (
µ
g.g
Eófilo
0
10
20
30
40
12345
horas
carboidrato (
µ
g.g
-1
)
Epicótilo
0
10
20
30
40
12345
horas
oidr
µ
g. g
Metáfilo
0
10
20
30
40
12345
horas
carboidrato (
µ
g.g
-1
)
0 2 6
12
18
0 2 6
12
18
0 2
6
12 18
0
2 6
12
18
0
2 6
12
18
0
2
6
12 18
A
B
A
B
A
B
A
B
aa
a
aaa
a
a
aaaaa
a
a
a
a
aa
A
B
A
B
A
A
B
B
A
B
A
A
B
A
B
B
a
a
a
aa
a
a
a
a
BC
C
A
A
B
A
ab
b
a
ab
a
ab
a
b
bb
A
A
B
B
B
a
a
a
a
a
ab
a
bb
b
C
B
B
B
A
a
b
b
a
a
a
a
a
a
b
a
a
a
-1
)atos ( carb
33
O cotilédone foi o órgão que apresentou as concentrações mais baixas de
sacarose. A concentração mais baixa foi às 2:00, havendo um pico às 18:00. Neste
mesmo horário, também há tendência de aumento de monossacarídeos, o que faz com
que este seja o horário de maior concentração de açúcares livres neste órgão. Já no
0 2 6 12 18
eófilo e no epicótilo, as concentrações de sacarose são bem mais altas, principalmente à
noite. Os dois órgãos apresentaram picos de sacarose de madrugada seguidos de uma
queda no período de luz. No caso do eófilo, as concentrações de monossacarídeos são
ligeiramente maiores à noite, mas no epicótilo o aumento de glucose de madrugada é
bastante conspícuo, com concentrações próximas às da sacarose. No metáfilo,há uma
queda na concentração de açúcares livres às 2:00 e às 6:00, seguido de um aumento nos
horários seguintes. Tanto a concentração de sacarose como a de monossacarídeos
aumenta, sendo que no fim da tarde a concentração de monossacarídeos é maior que a
de sacarose (figura 14) (tabela 3).
Tabela 3. Razão sacarose/monossacarídeo nos diferentes órgãos da plântula nos
diferentes horários do dia.
Raiz 13,68 16,30 7,27 6,26 14,11
Hipocótilo 9,45 7,84 3,20 8,70 30,24
Cotilédone 1,47 0,24 0,40 0,31 0,65
ilo 5,08 3,50 2,90 4,44 6,46
tilo
Eóf
Epicó 0,98 1,47 4,12 1,82 3,25
Metáfilo 0,99 4,27 2,00 0,21 0,31
34
DISC O
. Sacarose sintase (Sus) (EC 2.4.1.13)
A determinação da atividade de sacarose sintase mostrou que a forma de
apresentação dos resultados pode i terpretação. Quando os dados são
apresentados na forma de atividade por massa fresca (figura 7), os cotilédones aparecem
com atividade muito acima das folhas (eófilo e
metáfil
eria
manter
USSÃ
1
nfluenciar a in
como sendo o órgão de maior atividade,
o). No entanto, quando os dados são expressos como atividade específica (figura
8) a maior atividade é a do epicótilo (parte do caule acima do ponto de inserção dos
cotilédones) e o cotilédone aparece como a menor atividade específica. Essa diferença é
especialmente importante em sistemas de reserva (cotilédones, tubérculos, xilopódios,
etc), onde a mobilização de proteínas de reserva pode alterar o teor de proteínas
alterando a atividade específica. Como os demais órgãos não possuem reservas típicas
de proteínas, a comparação entre eles pode ser feita através da atividade específica.
Embora o hipocótilo não seja um órgão de crescimento intenso, a alta atividade
de Sus pode estar associada à síntese de amido transitório observado neste órgão (Tiné,
1997). O hipocótilo acumula amido no parênquima e este amido é mobilizado após o
esgotamento das reservas cotiledonares. Uma das funções deste armazenamento s
a força de dreno para o transporte dos carboidratos exportados pelos cotilédones
mesmo que o resto da parte aérea não tenha a demanda suficiente. Com isso, seria
garantida a transferência dos carboidratos sem que houvesse um acúmulo de sacarose
nos cotilédones, o que poderia interferir no processo de desmonte e mobilização do
xiloglucano de reserva.
O epicótilo apresentou alta atividade específica. Desde o trabalho de Santos
(2002), sabe-se que a reserva de carboidratos dos cotilédones de Hymenaea courbaril é
35
importante para o crescimento da parte aérea, para onde a maior parte do carbono é
mobilizada. Esta informação está de acordo com a alta atividade específica de Sus
encont
cidade de dreno dos órgãos e a
ativida
rada na parte aérea da plântula, em contraste com a atividade menor nas raízes,
outro órgão com intensa taxa de crescimento. Neste ponto, é importante salientar que o
experimento foi realizado em vasos, o que poderia ter limitado o crescimento das raízes,
alterando sua taxa metabólica. O eófilo apresentou uma baixa atividade, compatível
com sua posição de fonte de carboidratos (via fotossíntese) dentro da plântula. Embora
neste horário (de madrugada) não haja luz para fotossíntese, as folhas
fotossinteticamente ativas acumulam amido temporário durante o dia e não precisam
importar carboidratos de outras fontes durante a noite.
Comparando os dados de atividade específica de Sus com os dados de força de
dreno, que é a porcentagem de contagens de cintilações por grama de matéria seca, em
plântulas de Hymenaea courbaril disponíveis na literatura (Santos & Buckeridge,
2004), foi possível calcular a correlação entre a capa
de de Sus (figura 15). O coeficiente de correlação foi de 0,91, um excelente
resultado considerando que são dois experimentos independentes realizados com plantas
nativas, onde se espera uma grande variabilidade dos dados. A alta correlação
encontrada sugere que o catabolismo de sacarose pela Sus é um importante elemento no
estabelecimento de drenos de carboidratos dentro da plântula e pode ser usado como um
marcador das relações fonte-dreno entre os diferentes órgãos da plântula. Na literatura, é
sugerido que alta atividade desta enzima é indicativa de dreno ativo de sacarose (Sung
et al., 1989; Wang et al., 1993). O fato da atividade de Sus ter sido maior em metáfilo
do que em eófilo corrobora com os dados de Buczynski et al (1993): folhas maduras são
relativamente destituídas de Sus.
36
r
2
40
50
o
= 0,91
0
10
20
30
0 5 10 15 20 25 30 35
Atividade específica de SS
Capacidade de dren
Figura 15. Correlação entre capacidade de dreno (tabela 1) e atividade específica de
sacarose sintase em plântulas coletadas às duas horas (figura 8). Cada ponto
corresponde a um órgão de plântula de Hymenaea courbaril.
células, sendo a sacarose
xportada do citosol para o vacúolo, onde é hidrolisada e os monossacarídeos
resultan
Dois elementos também devem ser levados em consideração na interpretação
dos dados obtidos: os “ciclos fúteis” e a compartimentalização celular. Sabe-se que
existem ciclos de síntese e degradação de sacarose dentro das
e
tes são novamente exportados para o citosol onde são usados na biossíntese de
sacarose novamente (Nguyen-Quoc & Foyer, 2001). A compartimentalização das
enzimas no interior das células pode criar uma situação onde, embora a atividade
medida da enzima seja alta, os substratos não estão disponíveis para a enzima in vivo.
De fato, dificilmente as enzimas estarão em uma condição de saturação de substrato e
baixa concentração de produto dentro das células. Esses dois elementos fazem com que
a atividade medida seja sempre um potencial e não a atividade que realmente ocorre nas
células. É possível que todas as atividades medidas estejam superestimadas, mas tais
37
restrições se aplicam a todas metodologias de determinação da atividade enzimática in
vitro e atualmente não dispomos de metodologias que possam suplantar essas limitações
inerentes aos trabalhos bioquímicos.
2. Invertases (EC 3.2.1.26)
2.1. Invertase insolúvel
O nascimento do sol (início da fotossíntese) leva às alterações no metabolismo
e carbono que se refletem no padrão de atividade da invertase insolúvel. A única
ade não apresenta variações estatisticamente significativas,
queda às 6:00 horas. Considerando que praticamente todos os
d
exceção é a raiz cuja ativid
embora haja uma ligeira
outros órgãos apresentaram alterações de atividade neste horário, é possível que não
tenha sido obtida uma diferença significativa apenas pelo uso de uma amostra pequena.
Apesar de este ser o único órgão da planta que não fica exposto às variações de
disponibilidade de luz, espera-se que o órgão perceba as variações metabólicas que
ocorrem nas outras partes da planta, seja através de sinalização específica com
reguladores de crescimento, seja através de variações na disponibilidade de
carboidratos, uma vez que tais moléculas podem atuar como sinalizadores (“sugar
sensing”). Neste último caso, é importante lembrar que o modelo de mobilização de
reservas proposto para H. courbaril prevê a disponibilidade de sacarose vindo da parte
aérea durante todo o dia, pela exportação das folhas fotossinteticamente ativas (durante
o dia) ou pela mobilização das reservas cotiledonares (durante a noite). Essa sincronia
dos dois metabolismos pode levar ao fornecimento ininterrupto de sacarose para a raiz,
o que poderia explicar a pequena variação dessa invertase ao longo do dia.
Entre as invertases cuja atividade varia ao longo do dia, podemos separar os
órgãos em dois grandes grupos: os que apresentam um aumento ao amanhecer
38
(hipocótilo, epicótilo e metáfilo) e os que apresentam uma redução ao amanhecer
(cotilédone e eófilo). É interessante notar que o segundo grupo é formado pelos dois
no
etabolismo de carboidratos em todos os órgãos às 2 horas, o que coincide com o
co de atividade das enzimas de degradação do xiloglucano
(Amara
órgãos que correspondem às duas fontes de carbono na planta. Como essas duas fontes
funcionam em momentos distintos, no entanto, esperaríamos que o padrão de atividade
dos eófilos e dos cotilédones fosse inverso, uma vez que estes órgãos exportam sacarose
em momentos distintos do dia. Outros processos fisiológicos tais como expansão celular
(Winter & Huber, 2000), partição de sacarose e transdução de sinais de estresse (Sturm,
1999) poderiam, portanto, estar associados a tais variações de atividade. Quais fatores
levariam às alterações na atividade observadas, no entanto, não estão claros e no
momento, ainda não é possível interpretar o significado biológico dessas variações.
2.2. Invertase solúvel ácida
As dosagens de invertase solúvel ácida mostram uma clara diferença entre o
metabolismo noturno e o diurno. Aparentemente, há uma grande alteração
m
período observado para o pi
l, 2005). Embora o vacúolo não esteja diretamente ligado ao desmonte do
xiloglucano e à conversão de seus monossacarídeos constituintes em sacarose, esta
organela participa diretamente do metabolismo de carbono, sendo um importante
elemento tanto no armazenamento quanto na compartimentalização dos produtos de
degradação (Nguyen-Quoc & Foyer, 2001). A existência de diferentes tipos de vacúolos
é evidenciada por diferentes isoformas das proteínas intrínsecas do tonoplasto, que
podem ser utilizadas como marcadores de função desses vacúolos (Jauh et al, 1999).
Ao analisarmos os dados de atividade específica, vemos que a maioria dos
órgãos apresenta uma queda de atividade às 6 horas (cotilédones, epicótilo, metáfilo,
39
hipocótilo e raiz), enquanto o eófilo apresenta o seu pico de atividade exatamente neste
período no qual a fotossíntese está começando neste órgão. Nos órgãos fonte, portanto,
o pico
além das relações de fonte e dreno como regulação osmótica e
crescim
re os
de atividade desta enzima parece estar ligado à alta disponibilidade de
carboidratos na célula. Neste caso, a alta capacidade hidrolítica no vacúolo pode estar
ligada a desvios no metabolismo quando a disponibilidade de sacarose é maior do que a
capacidade de exportação da célula. Ou seja, em caso de haver um acúmulo de sacarose
no interior da célula, o dissacarídeo seria importado pelo vacúolo e o carbono desviado
para outras vias metabólicas como síntese de amido ou mesmo o armazenamento no
vacúolo. Órgãos dreno como epicótilo, hipocótilo e raiz, embora também tenham picos
de atividade de madrugada, têm picos de atividade no fim da tarde, o que compõe um
cenário mais complexo.
O fato de o padrão de atividade das diferentes isoformas de invertase ser distinto
indica que tais enzimas podem estar associadas a diferentes processos metabólicos
(Sturm, 1999). Isso evidencia a importância dessas enzimas em diferentes aspectos do
metabolismo de sacarose
ento celular (Sturm & Tang, 1999). Além disso, ao considerarmos que os
carboidratos atuam não apenas como substrato para o metabolismo, mas também como
moléculas sinalizadoras afetando a expressão de diversos genes (Rolland et al, 2002,
Blässing et al, 2005), a importância dessas atividades de enzimas do catabolismo de
sacarose pode ser estendida a diversos outros processos por possibilitar a alteração das
concentrações locais de carboidratos e da razão entre sacarose e monossacarídeos.
A forma de apresentação dos dados pode influenciar a interpretação, pois nem
sempre o horário de maior atividade por grama de matéria fresca coincide com o de
maior atividade específica. A baixa atividade específica nos cotilédones pode ser devido
à presença de proteínas de reserva no órgão, o que dificulta a comparação ent
40
órgãos
atividade da
inverta
vr2, um dos genes que codificam isoformas vacuolares, no início do período
de luz
am um pico de atividade ao
meio dia. O hipocótilo apresentou um pico de atividade por massa no fim do dia, mas a
ostrou que o pico de atividade específica é ao meio dia,
. No caso dos cotilédones, a atividade específica mostra um grande pico de
atividade durante a degradação do polissacarídeo de reserva, diferente da interpretação
dada aos dados apresentados na forma de atividade por massa (figura 10).
Embora a forma mais amplamente utilizada na literatura científica para
expressar os dados de atividade enzimática seja a atividade específica, ainda não está
clara qual a melhor forma de expressar os dados nesse trabalho. Dois problemas podem
ser resolvidos no caso da expressão por massa e não por proteína: (1) a
se insolúvel só pode ser expressa por massa, já que a dosagem de proteínas é
inviável e; (2) um dos órgãos é um órgão de reserva de proteínas (cotilédone) e a
expressão dos dados na forma de atividade específica pode dificultar a interpretação por
sobrepor dois processos distintos: a mobilização de carboidratos e a mobilização de
proteínas.
O órgão que apresentou a maior atividade específica foi o eófilo, que possui um
grande pico às 6:00 horas, seguido de declínio. Esse padrão corrobora o trabalho de
Kim et al. (2000a), que relatou uma atividade máxima de invertase vacuolar e nível de
transcrito I
e seus declínios durante o dia em folhas de milho. O pico de atividade no início
do período de alta disponibilidade de carbono reforça a idéia de que esta enzima não
está associada ao estabelecimento de um dreno de sacarose.
2.3. Invertase solúvel neutra
O perfil de atividade desta isoforma foi distinto de todos os padrões obtidos com
as outras enzimas. Exceto pela raiz, todos os órgãos apresent
quantificação de proteínas m
41
mostran
fotossintética ao meio dia, possivelmente devido à fotoinibição
pela alt
à tarde. Esta alteração ocorre em
praticam
do que naquelas amostras de 18 horas houve uma alta solubilização de enzimas
que levou ao aumento da atividade absoluta. O mesmo efeito de extração de enzimas
ocorre nos cotilédones.
Por ser o principal órgão fotossintético, é razoável supor que o metabolismo do
eófilo esteja intimamente ligado à fotossíntese. Dados de nosso laboratório sobre
fotossíntese em eófilos de H. courbaril mostram que geralmente existe uma depressão
na taxa de assimilação
a irradiação neste horário ou pela queda na umidade relativa do ar que força o
fechamento estomático. A relação desta fotoinibição com o aumento da atividade de
invertase neutra não está clara e dificilmente uma relação direta poderá ser estabelecida,
mas ambos os fenômenos devem ser levados em consideração nos estudos futuros de
metabolismo de carbono em folhas de H. courbaril.
Esta isoforma apresentou um padrão de atividade completamente distinto das
demais. Isso reforça a idéia de que as isoformas de invertase têm funções distintas e são
reguladas de forma independente. Ao contrário das outras isoformas, em geral o
aumento da atividade da invertase citossólica se dá
ente todos os órgãos, independente de eles estarem naquele horário atuando
como fonte ou dreno de sacarose. Assim como para as isoformas anteriores, portanto,
não há uma relação clara entre a atividade dessas enzimas e o transporte de sacarose
entre os órgãos. Essa multiplicidade de funções das invertases reflete a diversidade de
funções da sacarose dentro da fisiologia das plantas e é um passo no sentido de entender
a necessidade de tantos genes para codificar isoenzimas que hidrolisam sacarose.
Diversos fatores interferem na força de dreno. Isso impossibilita reduzir toda a
capacidade de dreno do órgão a uma única enzima, uma vez que todo o metabolismo
42
subseqüente interfere no transporte de carboidratos, assim como carregadores
específicos, o metabolismo posterior dos carboidratos, carregamento dos vasos, etc.
3.Análise dos carboidratos
Nossos resultados mostraram grandes quantidades de sacarose na maioria dos
órgãos da plântula de Hymenaea courbaril: raiz, hipocótilo, eófilo e epicótilo. A
ades de sacarose geralmente indica que há alguma fonte de
energia
mido transitório,
que fun
e com exportação de sacarose, podemos dizer que a
tendênc
deria estar baixa como uma consequência da alta taxa
de exportação do órgão. Por outro lado, em órgãos dreno como hipocótilo, que
presença de grandes quantid
importante em ação na planta (Buckeridge et al, 2004), que nesta fase do ciclo
de vida da plântula de H. courbaril pode ser o cotilédone ou o eófilo.
As pequenas concentrações dos carboidratos solúveis no cotilédone dão força ao
fato de que os monossacarídeos originados da mobilização do xiloglucano de reserva já
seriam transformados em sacarose, para imediata exportação, ou em a
ciona como um “tampão” de carboidratos, evitando o aumento excessivo da
concentração citoplasmática de monossacarídeos (Tiné, 1997). Ao contrário do
esperado, portanto, o metabolismo deste órgão parece estar voltado para a manutenção
da concentração baixa de sacarose.
No eófilo, há uma queda na concentração de sacarose durante o dia.
Considerando que este é o período fotossintético da folha e neste período há uma alta
disponibilidade de carbono, inclusiv
ia nos órgãos fonte em H. courbaril, é a queda na concentração de sacarose livre
durante a exportação de carbono.
É importante notar que apenas as concentrações instantâneas foram medidas.
Não é possível inferir nada sobre o fluxo de carbono nestes órgãos. Ou seja, a
concentração local de sacarose po
43
apresen
ta baixas taxas de crescimento, mas acumula amido temporário, a alta
concentração de sacarose pode ser importante para desviar o metabolismo de carbono
para a síntese de nucleotídeos-açúcares, que são substratos para a síntese de amido.
Outros drenos como o metáfilo e o epicótilo, que apresentam altas taxas de crescimento
mas não acumulam amido, apresentam resultados qualitativamente diferentes, com altas
concentrações de monossacarídeos livres. De fato, o metáfilo apresentou as mais altas
atividades de invertase insolúvel e neutra entre todos os órgãos (figuras 9 e 13). De
forma semelhante, a alta atividade de invertase vacuolar de madrugada no epicótilo,
coincide com uma alta concentração de monossacarídeos livres.
44
CONCLUSÕES
1. O padrão de atividade de invertases ao longo do dia não se correlaciona
claramente com as relações fonte-dreno observadas entre os órgãos de
plântulas de Hymenaea cour obilização do xiloglucano de
reserva. A interpretação dos dados é dificultada pela existência de “ciclos
2.
e dreno do órgão
baril durante a m
fúteis” dentro da célula, pela compartimentalização da sacarose e pela
multiplicidade de funções das isoformas de invertases. Aparentemente as
invertases parecem mais correlacionadas com outros eventos que não o
estabelecimento de drenos de sacarose, o que mostra a importância dos estudos
futuros que a correlacionam com estresses hídricos e ao frio.
A alta correlação encontrada entre a capacidade de dreno dos órgãos e a
atividade de Sus sugere que o catabolismo de sacarose por esta enzima é um
importante elemento no estabelecimento de drenos de carboidratos dentro da
plântula, embora seja impossível reduzir toda a capacidade d
a uma única enzima.
45
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cotilédones de Hymenaea courbaril L. (JATOBÁ). Tese de doutorado, Universidade
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