( PDF ) Atividade antioxidante, composição fenólica e mineral de vinhos espumantes brasileiros

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UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

COORDENADORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

Atividade antioxidante, composição fenólica e mineral

de vinhos espumantes brasileiros

CLÁUDIA ALBERICI STEFENON

Caxias do Sul

2006

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CLÁUDIA ALBERICI STEFENON

Atividade antioxidante, composição fenólica e mineral

de vinhos espumantes brasileiros

Caxias do Sul

2006

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da Universidade

de Caxias do Sul, visando a obtenção do grau de

Mestre em Biotecnologia.

Orientadora: Prof

Mirian Salvador

Co-orientador: Prof Dr João A.P. Henriques

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iii

Dedico esse trabalho aos meus pais Antonio (in

memorian) e Lourdes pelos ensinamentos ao longo

da vida; a minha irmã Luciana pelo carinhoso

incentivo; aos meus filhos Anderson e Caio, fonte de

amor e coragem para enfrentar e ultrapassar todos

os obstáculos, e ao meu amado esposo Ivo pelo amor

e apoio incondicionais durante esta caminhada.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que contribuíram para o sucesso desse trabalho, especialmente:

À Prof

Mirian Salvador, pela orientação, confiança e amizade e ao Prof. Dr. João

A. P. Henriques, pela co-orientação, incentivo e amizade;

À Prof

Regina Vanderlinde, à Prof

Maria Lúcia Yoneama e ao Prof. Dr.

Jhonny Ferraz Dias, pela colaboração e companheirismo;

À CAPES, ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia a à Pró-Reitoria de Pós-

Graduação e Pesquisa da Universidade de Caxias do Sul;

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia desta Universidade,

especialmente ao coordenador do Curso, Prof. Dr. Maurício M. da Silveira;

Aos funcionários do INBI/UCS, especialmente à Claudia B. Marques, pela paciência e

amizade e aos colegas do Laboratório de Alimentos, em especial à Luciana Kurz, pela

agradável convivência e amizade;

Às bolsistas de iniciação científica, especialmente à Camila de Martini Bonesi e

Mariangela Colombo, pelo carinho e presença constante durante esta jornada.

Aos colegas de curso, em especial à minha grande amiga Morgane P. Franzoni, pelo

apoio e amizade incondicional;

Ao Laboratório Randon Ltda pela imprescindível parceria e credibilidade aportada a

esta dissertação.

Às empresas vinícolas, Casa Valduga Ltda, Cave de Amadeu Ltda, Cooperativa

Vinícola Aurora Ltda, Estabelecimento Vinícola Armando Peterlongo Ltda, Möet Henessy –

Vinhos e Destilados; Vinhos Salton S/A e Vinícola Monte Lemos Ltda, por terem cedido

gentilmente as amostras utilizadas neste trabalho e à Associação Brasileira de Enologia, pela

constante luta pelo reconhecimento do papel do enólogo nas diversas áreas de atuação desta

profissão.

A Deus, por ter iluminado meus passos até aqui.

“Caso acredite

se que o vinho possua um

composto protetor contra doenças, então

devemos considerar quase um sacrilégio

tentar isolar esta substância. O medicamento

já se encontra pronto e em uma forma

altamente palatável.”

St. Leger et al., 1979.

ÍNDICE

LISTA DE TABELAS E QUADRO.....................................................................................viii

LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................x

LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................................xi

RESUMO................................................................................................................................xii

ABSTRACT...........................................................................................................................xiii

1.INTRODUÇÃO................................................................................................................ 1

2. REVISÃO DA LITERATURA....................................................................................... 3

2.1 Substâncias antioxidantes presentes em uvas e vinhos................................................ 3

2.1.1 Polifenóis.....................................................................................................................4

2.1.1.1 Polifenóis não-flavonóides....................................................................................... 6

2.1.1.2 Polifenóis flavonóides.............................................................................................. 7

2.1.1.3 Ácido L-ascórbico.................................................................................................. 10

2.2 Vinhos espumantes...................................................................................................... 12

2.3 Avaliação da atividade antioxidante........................................................................... 15

2.4 Quantificação de polifenóis......................................................................................... 16

2.5 Metais em uvas e vinhos.............................................................................................. 16

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................... 19

3.1 Artigo 1 - Antioxidant activity of sparkling wines made using Charmat and

Champenoise Methods ...................................................................................................... 20

3.2 Artigo 2 - Influência da Segunda Fermentação na Composição Fenólica e Mineral

de Vinhos Espumantes...................................................................................................... 47

3.3. Considerações gerais e perspectivas.......................................................................... 71

vii

4. CONCLUSÕES............................................................................................................. 77

5. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR........................................................................ 78

ANEXO I..............................................................................................................................I

ANEXO I I ........................................................................................................................III

viii

LISTA DE TABELAS E QUADRO

Quadro 1. Classificação dos compostos fenólicos de acordo com o esqueleto básico ..........4

ARTIGO 1

Table 1. Main characteristics of the sparkling wines studied ............................................ 37

Table 2. Mean concentration values of sugar, total polyphenols, total flavonoids, total

hydroxicinnamates (TH) and

ascorbic acid in the sparkling wines analyzed

..........................38

Table 3

. Phenolic compounds (mg/L) identified by HPLC

in the sparkling wines analyzed

....39

Table 4. Anthocyanin contents (mg/L) identified by HPLC in red/rosé spakling wines... 40

Table 5. Mean

values of IC

for the different sparkling wines analyzed

..................................41

Table 6. Mean survival values of the Saccharomyces cerevisae yeast treated with hydrogen

peroxide (H

) 75mM in the presence and absence of the different sparkling wines ..... 42

Table 7. Variance explained by the first PCs ..................................................................... 43

ARTIGO 2

Tabela 1. Principais características dos vinhos base e espumantes estudados .................. 51

Tabela 2. Valores médios dos principais parâmetros enológicos dos vinhos base e

espumantes analisados.........................................................................................................55

Tabela 3. Valores médios da concnetração de ácido ascórbico, polifenóis totais,

flavonóides totais, hidroxicinamatos totais e pressão nas amostras analisadas.................57

Tabela 4. Compostos fenólicos identificados por CLAE nos vinhos base e nos seus

respectivos espumantes........................................................................................................59

Tabela 5. Teor de metais determinado nas diferentes amostras de vinhos espumantes

através da técnica de PIXE..................................................................................................61

ANEXO I

Tabela I.1. Teor de Metais Determinado nas Diferentes Amostras de Vinhos Espumantes

Através da Técnica de PIXE.................................................................................................II

ANEXO II

Tabela II.1. Valores Médios de IC

para os Diferentes Vinhos base e Espumantes

Analisados ............................................................................................................................IV

Tabela II.2. Valores Médios de Sobrevivência da Levedura Saccharomyces cerevisiae

Tratada com Peróxido de Hidrogênio 75mM em Presença e Ausência dos Diferentes

Vinhos base e Espumantes.................................................................................................... V

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema simplificado da biossíntese dos compostos fenólicos..............................5

Figura 2. Estruturas dos ácidos gálico (a) e elágico (b) ........................................................6

Figura 3. Estrutura do ácido caféico.....................................................................................7

Figura 4. Estrutura do resveratrol (trans 3,5,4

- trihidroxiestilbeno) .................................7

Figura 5. Estrutura da (+)-catequina (R

= H, R

= OH e R

= H) e da (-)-epicatequina (R

= OH, R

= H e R

= H)..........................................................................................................8

Figura 6. Estrutura das antocianinas mais freqüentemente encontradas na natureza.......9

Figura 7. Estrutura das procianidinas B

, B

.........................................................10

Figura 8. Estrutura do ácido L-ascórbico .......................................................................... 11

Figura 9. Esquema simplificado dos métodos de elaboração de vinhos espumantes

Charmat (a) e Champenoise (b) ........................................................................................... 14

Figura 10. Princípio básico da técnica de PIXE ................................................................. 18

ARTIGO 1

Fig. 1. Scores plot of the phenolic compounds and main characteristics of the

Champenoise sparkling wines using the two first principal components obtained by

PCA……………………………………………………………………………………………44

Table 2. Scores plot of the phenolic compounds and main characteristics of the Charmat

Demi-sec sparkling wines using the two first principal components obtained by PCA… 45

Table 3

Scores plot of the phenolic compounds and main characteristics of the Charmat

Brut sparkling wines using the two first principal components obtained by PCA........... 46

LISTA DE ABREVIATURAS

GA - Galic Acid

AM - Alexandria Muscat

C - Catechin

CH - Chardonnay

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CMa - Candia Malvasia

CMu - Canelli Muscat

CS - Cabernet Sauvignon

DE - Dry Extract

DPPH

•

••

•

- 1,1-Difenil 2-Picrilhidrazil

EC – Epicatechin

- Peróxido de Hidrogênio

IR - Italic Riesling

MaB - Malvasia Bianca

MaC - Malvasia de Cândia

MB – Moscato Bianco

ME – Merlot

MoC – Moscato Canelli

PIXE - Particle-Induced X-Ray Emission

PN - Pinot Noir

ProB1, B2, B3 e B4 - Procyanidins B1, B2, B3 e B4

PR - Prosecco

RDE - Reduced Dry Extract

SE - Semillon

UV - Ultra-Violeta

WMu - White Muscat

WMa - White Malvasia

xii

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade antioxidante de vinhos

espumantes Brasileiros provenientes da Serra Gaúcha, Rio Grande do Sul, Brasil, elaborados

através dos métodos Charmat e Champenoise, bem como identificar as possíveis

modificações no perfil fenólico e mineral decorrentes da segunda fermentação dos vinhos

base. A medida da atividade antioxidante in vitro baseou-se na capacidade de varredura dos

diferentes vinhos espumantes frente ao radical livre 1,1 difenil-2-picrilhidrazil (DPPH

). Os

estudos in vivo foram realizados em células eucarióticas da levedura Saccharomyces

cerevisiae tratadas com os vinhos espumantes e com o agente oxidante peróxido de

hidrogênio. A composição fenólica foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) e o perfil mineral foi determinado através da técnica de PIXE (particle-induced X-ray

emission). Os vinhos espumantes Charmat e Champenoise, tanto brut quanto demi-sec,

apresentaram significativa atividade antioxidante, a qual foi associada à presença de

compostos fenólicos. De modo geral, espumantes Charmat brut apresentaram maior atividade

antioxidante que os Charmat demi-sec e os Champenoise. Após a segunda fermentação,

observou-se uma significativa redução na concentração de polifenóis totais e flavonóides

totais nos espumantes Charmat e um aumento destes compostos nos Champenoise. A

concentração de hidroxicinamatos totais e de metais diminuiu após a segunda fermentação,

independentemente do método de elaboração. Após a segunda fermentação, verificou-se

aumento nas atividades antioxidantes em comparação com os respectivos vinhos base.

Embora outros estudos sejam necessários, este trabalho demonstra o potencial antioxidante

dos vinhos espumantes Charmat e Champenoise, bem como as diferenças encontradas na

composição fenólica e mineral após a segunda fermentação.

xiii

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate the antioxidant capacity of Brazilian

sparkling wines of Serra Gaúcha, Rio Grande do Sul, Brasil, elaborated by Charmat and

Champenoise methods, as well as identifying any possible modification in the phenolic and

mineral composition after the second fermentation of the base wine. In vitro, antioxidant

activity was determined by the capacity of the different sparkling wines to scavenge the free

radical 1,1 difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH

). In vivo, studies were done using

Saccharomyces cerevisiae eukaryotic cells treated with the sparkling wines and/or with the

oxidant agent hydrogen peroxide. The phenolic composition was evaluated by high

performance liquid chromatography (HPLC) and the mineral profile was determined by

PIXE (particle-induced X-ray emission) technique. Brut and demi-sec Charmat and

Champenoise sparkling wines presented significant antioxidant activity, which was associated

to the presence of phenolic compounds. In general, the Charmat brut sparkling wines

presented higher antioxidant activity than the Charmat demi-sec and Champenoise wines.

After the second fermentation, it was observed a significant reduction in the concentration of

both total phenolic compounds and total flavonoids in Charmat sparkling wines and increased

titres of these compounds in Champenoise wines. Total hidroxycinamate and metal

concentrations decreased after the second fermentation, despite of the elaboration method.

After the second fermentation, increased antioxidant activities were observed in comparison

to the respective base wines. Although further studies are needed, this work reveals the

antioxidant activity of the sparkling wines Charmat and Champenoise, as well as the

differences found in the phenolic and mineral profile after the second fermentation.

1. INTRODUÇÃO

Inúmeros estudos já demonstraram que o consumo moderado de vinhos,

principalmente tintos, pode trazer benefícios à saúde humana. Acredita-se que este efeito

benéfico ocorra devido à presença, nestes vinhos, de compostos fenólicos, os quais podem

agir como queladores de íons metálicos e/ou seqüestradores de espécies reativas, que estão

associadas a várias doenças como, por exemplo, mal de Parkinson, esclerose múltipla,

retinopatias, aterosclerose, infarto do miocárdio, efisema pulmonar, cirrose hepática e vários

tipos de câncer.

Os vinhos espumantes são obtidos através da segunda fermentação de vinhos

convencionais, denominados de vinhos base, objetivando a produção natural de dióxido de

carbono

(espumantização). Os principais métodos de elaboração utilizados são os processos

Charmat (segunda fermentação em grandes recipientes vinários) e Champenoise (segunda

fermentação na própria garrafa). No Brasil, os vinhos utilizados para a elaboração de vinhos

espumantes são oriundos de uvas da espécie Vitis vinifera, com concentrações finais de açúcar

variáveis em função do tipo de vinho espumante como, por exemplo, até 15,0 g.L

-1

(brut) e

entre 15,1 a 20,0 g.L

-1

(demi-sec).

Acredita-se que o perfil fenólico dos vinhos espumantes seja similar ao do seu

respectivo vinho base, que pode ser elaborado somente com variedades brancas (base blanc

de blancs) ou através de mesclas entre cultivares brancas e tintas (base blanc de noirs). Até o

momento, não existem dados sobre as modificações nos perfis fenólico e mineral decorrentes

da segunda fermentação. Além disso, também são pouco conhecidos os benefícios que o

consumo moderado de vinhos espumantes poderia aportar à saúde humana.

No Brasil, em 2004, mais de cinco milhões de litros de vinhos espumantes foram

consumidos, com a aptidão da Serra Gaúcha para a elaboração de espumantes já sendo

reconhecida e comparada à da mais importante região do mundo, a Champagne, na França.

Em vista disso, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade antioxidante de

vinhos espumantes brasileiros elaborados pelos métodos Charmat e Champenoise, bem como

determinar a concentração dos compostos fenólicos e de metais destas amostras. A influência

da concentração de açúcar e do tipo de uva e/ou assemblage na atividade antioxidante

também foi investigada. Além disso, verificou-se o efeito da segunda fermentação nos perfis

fenólico e mineral dos vinhos espumantes.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Substâncias antioxidantes presentes em uvas e vinhos

Antioxidantes são compostos que podem auxiliar na manutenção do equilíbrio redox,

funcionando como bloqueadores dos processos de óxido-redução desencadeados por espécies

reativas em excesso. Entre os antioxidantes mais conhecidos, podem-se citar as vitaminas,

principalmente A, C e E, e os polifenóis, entre outros compostos (Halliwell & Gutteridge,

1999).

Os vinhos possuem quantidades significativas de polifenóis (ácidos fenólicos,

estilbenos, flavonóides, etc.), além de outros compostos, como por exemplo, o ácido

ascórbico (Ribéreau-Gayon et al., 2003), e apresentam, portanto, reconhecida atividade

antioxidante, a qual está associada à prevenção de cardiopatias e câncer, principalmente (Cui

et al., 2002; Eng et al., 2003; Da Luz & Coimbra et al., 2004; Newaz et al., 2005).

Uma vez que os vinhos espumantes são elaborados através da segunda fermentação de

vinhos base (obtidos de uvas brancas, rosadas e/ou tintas), acredita-se que sua composição

fenólica seja semelhante. Entretanto, até o momento, não existem estudos sobre o perfil

fenólico dos vinhos espumantes elaborados no Brasil e a relação com sua possível atividade

antioxidante.

2.1.1 Polifenóis

Os polifenóis possuem, no mínimo, um anel aromático no qual, ao menos um

hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila. Podem ser classificados, segundo o

tipo de esqueleto principal, em não-flavonóides e flavonóides, conforme representado na

Tabela 1 (Carvalho et al., 2001).

Quadro 1. Classificação dos compostos fenólicos de acordo com o esqueleto básico

(adaptado de Carvalho et al., 2001).

Nomenclatura

Esqueleto Básico

(C6







CX)*

Classes de Polifenóis

C6 Fenóis simples, benzoquinonas



C1 Derivados do ácido benzóico



C2 Acetofenonas e ácidos fenilacéticos



C3 Fenilpropanóides, derivados dos ácidos cinâmicos



C4 Naftoquinonas



C6 Xantonas

NÃO-FLAVONÓIDES



Estilbenos



C6 Flavonóides

(C6



C3)

Lignanas

(C6



C6)

Diflavonóides

(C6)

Melaninas vegetais

(C6



C3)

Ligninas

(C6



C1)

Taninos hidrolisáveis

FLAVONÓIDES

(C6



C6)

Procianidinas ou taninos condensados

* C6 corresponde ao anel benzênico e CX à cadeia substituinte com X átomos de carbono.

Aos polifenóis, em geral, atribui-se a capacidade de quelar metais, seqüestrar o radical

superóxido e o oxigênio singlet. Os polifenóis apresentam, ainda, atividade antitrombótica,

antinflamatória, antiviral, antialérgica e de proteção aos hepatócitos (Croft, 1998; Landrault et

al., 2001; Roig et al., 2002; Yilmaz & Toledo, 2004).

A biossíntese dos polifenóis pode ocorrer a partir de carboidratos, através de duas

rotas biogenéticas (Figura 1): pela via do ácido chiquímico (A) ou pela via do acetato-

polimalato (B). A origem biogenética determina o padrão de substituintes do polifenol

resultante. Dessa maneira, através da rota do ácido chiquímico, obtêm-se compostos com

grupos hidroxilas em posição orto, que se formam a partir do ácido cinâmico. Por outro lado,

pela rota acetato-polimalato, originam-se compostos com grupos hidroxilas em posição meta

(Croft, 1998; Carvalho et al., 2001).

Figura 1. Esquema simplificado da biossíntese dos compostos fenólicos (adaptada de

Carvalho et al., 2001; Rosier, 2003).

CHALCONAS

(precursor comum)

PIRUVATO

TANINOS

ACETIL CoA

MALONIL CoA

FLAVONÓIDES

ERITROSE 4P

Ácido

CHIQUÍMICO

ANTOCIANINAS

Ácido

CINÂMICO

Ácido

BENZÓICO

FENILALANINA

Fenóis

Via das

PENTOSES

Fosfoenol

piruvato

Via

GLICOLÍTICA

(A) (B)

HEXOSES

Em videiras, as características genéticas de cada variedade influenciam diretamente a

formação de compostos fenólicos (Bowers et al., 1993; Boulton et al., 1995). Diversos

fatores vitícolas estão intrinsecamente ligados ao processo de biossíntese, tais como, porta-

enxerto, temperatura, umidade, exposição solar, tipo de solo, adubação e manejo do dossel,

bem como, da maturação da uva e suas sementes (Boulton et al., 1995; Yokotsuka et al.,

1999; Delgado et al., 2004; Cortell et al., 2005), entre outros. No processo de elaboração de

vinhos espumantes a concentração de polifenóis varia também em função das diversas

técnicas que podem ser utilizadas, tais como: rendimento da prensagem, tempo e temperatura

de maceração, levedura utilizada, período fermentativo, clarificação, estabilização, filtração,

amadurecimento e envelhecimento (Singleton et al., 1983; Cheynier et al., 1993; Mayén et

al., 1995; Wightman et al., 1997; Vasserot et al., 1997; Fuhrman et al., 2001; Dunn et al.,

2005; Mazauric & Salmon, 2005), entre outros.

2.1.1.1 Polifenóis não-flavonóides

Entre os compostos denominados não-flavonóides, os derivados do ácido benzóico, do

ácido cinâmico e estilbenos merecem atenção especial. O ácido gálico é o derivado do ácido

benzóico mais importante em enologia e é encontrado na natureza geralmente na forma de seu

dímero de condensação, o ácido elágico (Figura 2, Carvalho et al., 2001). Atua como varredor

de radicais livres em pH estomacal (Jamroz & Beltowski, 2001), além de possuir atividades

antifúngica e antiinflamatória (Yilmaz & Toledo, 2004).

Figura 2. Estruturas dos ácidos gálico (a) e elágico (b) (Ribéreau-Gayon et al., 2003).

Entre os derivados do ácido cinâmico distribuídos no reino vegetal estão os ácidos

caféico e ferúlico. O ácido caféico (Figura 3) é um dos compostos mais encontrados (na forma

livre ou esterificada com o ácido tartárico) em vinhos brancos (Andrés-Lacueva et al., 2002;

Ribéreau-Gayon et al., 2003). Apresenta atividade antibacteriana e antiviral e é capaz de

inibir a enzima lipoxigenase, que está relacionada com a biossíntese de leucotrienos e

prostaglandinas (Trueba & Sanchez, 2001).

Figura 3. Estrutura do ácido caféico (Ribéreau-Gayon et al., 2003).

O resveratrol (trans 3,5,4’ – trihidroxiestilbeno) é um estilbeno presente em vinhos,

principalmente tintos. Por ser uma das fitoalexinas responsáveis pela resposta imune da

planta a ataques fúngicos, o seu teor é dependente do nível de estresse sob o qual se

encontrava a videira durante a produção do fruto (Flanzy, 2003). O resveratrol (Figura 4)

apresenta atividade antioxidante in vivo, propriedades antiaterogênica, apoptótica e de

redução dos riscos de câncer (Leiro et al., 2004; Yilmaz & Toledo, 2004).

Figura 4. Estrutura do resveratrol (Flanzy, 2003).

2.1.1.2 Polifenóis flavonóides

Os flavonóides estão presentes em plantas, frutos, verduras e legumes e são

responsáveis, muitas vezes, pelo odor e cor dos vegetais (Croft, 1998). Estes compostos

possuem um esqueleto de quinze átomos de carbono (C6-C3-C6) caracterizados pela presença

de dois anéis aromáticos unidos por um heterociclo oxigenado (Trueba & Sánchez, 2001;

Flanzy, 2003; Ribéreau-Gayon et al., 2003).

As subclasses mais estudadas de flavonóides são as flavanonas (hesperidina,

naringenina), flavonas (apigenina, luteolina), flavonóis (quercetina, miricetina), flavanóis

(catequina, epicatequina, taninos condensados) e isoflavonas (genesteína, daizeína) (Ross &

Kasum, 2002). As estruturas da (+)-catequina e da (-)-epicatequina, compostos abundantes em

vinhos, são mostradas na Figura 5.

Figura 5. Estrutura da (+)-catequina (R

= H, R

= OH e R

= H) e da (-)-epicatequina (R

OH, R

= H e R

= H) (Flanzy, 2003).

As antocianidinas (forma livre) se apresentam mais estáveis quando ligadas a uma

molécula de açúcar, em geral glicose ou galactose. Podem fazer parte de grandes complexos

coloridos e/ou estarem complexadas com diferentes metais (Croft, 1998; Zuanazzi et al.,

2001). Entre as antocianinas mais freqüentemente encontradas na natureza (Figura 6), a mais

abundante em variedades de Vitis vinifera tintas é denominada de 3-monoglicosídio de

malvidina (Ribéreau-Gayon et al., 2003) e apresenta importante capacidade antioxidante

frente às espécies reativas do oxigênio (Sánchez-Moreno et al., 2003).

Figura 6. Estruturas das antocianinas mais freqüentemente encontradas na natureza (Cabrita

et al., 2003).

Os taninos (derivados da polimerização de moléculas elementares de função fenol) são

classificados, segundo sua estrutura química, em: a) taninos hidrolisáveis, compreendendo os

galotaninos e os elagitaninos, os quais liberam, após hidrólise ácida, os ácidos gálico e

elágico; b) taninos condensados, formados pela condensação de duas ou mais unidades 3-

flavanol (catequina ou epicatequina), também denominados de procianidinas, por possuírem a

propriedade de liberar as antocianidinas (Flanzy, 2003; Ribéreau-Gayon et al., 2003; Santos

& Mello, 2001). As procianidinas (Figura 7) B

, B

e B

(dímeros resultantes da

condensação de duas unidades de 3-flavanol unidas em C4-C8) atuam como protetores da

membrana celular, inibidores da peroxidação lipídica, varredores de radicais livres e

queladores de metais (Roig et al., 2002).

Várias classes de flavonóides mostraram capacidade de diminuir a formação de

malondialdeído (um produto decorrente da peroxidação lipídica) e de seqüestrar radical

hidroxila (Puppo, 1992). A atividade varredora dos flavonóides tem sido observada, também,

contra espécies reativas do nitrogênio e do ácido hipocloroso (Cotelle et al., 1996; Van Acker

et al., 1998; De Groot & Rauen, 1998).

Figura 7. Estruturas das procianidinas B

, B

e B

(Cabrita et al., 2003).

2.1.1.3 Ácido L-ascórbico

O ácido L-ascórbico ou vitamina C (Figura 8) é um importante antioxidante com

diversas funções metabólicas em plantas, animais e fungos. (Smirnoff et al., 2001; Valpuesta

& Botella, 2004). Humanos, além de primatas e outros mamíferos, não são capazes de

sintetizar o ácido L-ascórbico, pois o gene responsável pela codificação da enzima

responsável pelo último passo na via encontra-se não funcional (Valpuesta & Botella, 2004).

Devido à sua importância para o organismo humano (formação do tecido conjuntivo,

transporte de íons, proteção das células contra os danos causados por radicais livres, etc.),

alimentos ricos em ácido L-ascórbico vêm sendo incorporados à dieta já há muito tempo

(Valpuesta & Botella, 2004; Newaz et al., 2005). Em plantas, além do papel antioxidante, a

vitamina C está associada ao crescimento celular e a biossíntese de ácido giberélico

(regulador de crescimento), antocianinas e inúmeros metabólitos secundários (Barata-Soares

et al., 2004).

Figura 8. Estrutura do ácido L-ascórbico (Hancock et al., 2000).

Em fungos, incluindo leveduras do gênero Saccharomyces, ocorre a biossíntese de D-

eritroascorbato, um análogo do ácido ascórbico, a partir de uma molécula de D-arabinose

(Smirnoff et al., 2001). Em S. cerevisiae, especificamente, a formação de ácido L-ascórbico

ocorre quando as células são crescidas em meios de cultura contendo L-galactose, L-

galactona-1,4-lactona ou L-gulona-1,4-lactona (Hancock et al., 2000; Sauer et al., 2004). Em

vinhos, existem pequenas quantidades de arabinose e galactose, o que poderia favorecer a

biossíntese de ácido ascórbico durante a segunda fermentação. Além disso, as substâncias

pécticas dos vinhos também podem colaborar na biogênese deste ácido. (Ribéreau-Gayon et

al., 2003).

Diferentes espécies de plantas possuem, caracteristicamente, distintas concentrações

de ácido L-ascórbico. Os altos teores encontrados nas folhas sugerem que a biossíntese deste

ácido pode ser regulada pela oferta de luz. Em uvas, de acordo com o estágio de maturação, a

concentração oscila em torno de 50 mg.L

-1

(Ribéreau-Gayon et al., 2003). Nos vinhos e

espumantes, diferentes teores de ácido ascórbico podem ser encontrados em função da

variedade e grau de maturação das uvas, das práticas de vinificação (Ribéreau-Gayon et al.,

2003), da adição deste ácido como coadjuvante ao dióxido de enxofre (Marks & Morris,

1993) e da levedura utilizada (Hancock et al., 2000; Sauer et al., 2004), entre outros aspectos.

2.2 Vinhos espumantes

Este tipo de vinho é atualmente produzido na maioria dos países vitivinícolas,

incluindo o Brasil. Os vinhos espumantes recebem diferentes denominações em função do

país de origem, como, por exemplo, Champagne na França, Cavas na Espanha, sparkling

wine nos Estados Unidos, spumanti na Itália, vinho espumante no Brasil, etc. De acordo com

a Legislação Brasileira (Decreto nº 99.066 de 08/03/1990), os vinhos espumantes podem ser

elaborados somente com cultivares Vitis vinifera.

Em síntese, o processo de elaboração de vinhos espumantes consiste, primeiramente,

na obtenção do vinho base, que ocorre através da transformação da matéria-prima (uva) em

vinho. O vinho base pode ser obtido de variedades brancas (base blanc de blancs) ou através

de mesclas entre cultivares brancas e tintas (base blanc de noirs). Após, procede-se a segunda

fermentação, que pode ocorrer através dos métodos Charmat (grandes recipientes vinários) ou

Champenoise (na própria garrafa) (Flanzy, 2003; Ribéreau-Gayon et al., 2003). Além disso,

inúmeras variações são possíveis no que diz respeito ao teor de açúcar, tais como, até 6,0 g.L

-1

(extra-brut), de 6,1 a 15,0 g.L

-1

(brut), de 15,1 a 20,0 g.L

-1

(seco), de 20,1 a 60,0 g.L

-1

(demi-

sec) e mais de 60,0 g.L

-1

(doce) (Decreto nº 99.066 de 08/03/1990), sendo que os espumantes

Champenoise, são normalmente elaborados dentro das classes extra-brut a seco.

O método Charmat (Figura 9) é iniciado com a escolha de um assemblage (mistura

harmoniosa entre os vinhos que farão parte do produto final) ou de um vinho varietal (vinho

com no mínimo 75% de uma determinada uva). O vinho base é transferido para recipientes

vinários resistentes à pressão (autoclaves) e adiciona-se licor de tirage (uma parcela de vinho

base, açúcar refinado e leveduras em uma proporção necessária para atingir uma pressão de de

cerca 6 atmosferas). Desta forma, a segunda fermentação torna-se um processo mais rápido,

sendo que a temperatura é controlada (~ 10ºC) e o período de fermentação pode levar de dias

a algumas semanas. A técnica sur lie (autólise das leveduras) pode ser realizada (a duração é

variável, mas não costuma ultrapassar um período de 6 meses). Após alguns dias de repouso à

baixa temperatura efetuam-se as transferências para as cubas de acabamento (para

determinação da concentração final de açúcar), filtração e engarrafamento (Flanzy, 2003;

Miele & Miolo, 2003).

O método Champenoise (Figura 9) também é iniciado com a obtenção do vinho base

(assemblage ou varietal). Este vinho é então engarrafado e adiciona-se licor de tirage. A

segunda fermentação é um processo lento, que ocorre em ambientes com temperatura

controlada (+/- 10ºC) e dura em média 60 dias. A próxima etapa é a sur lie, em que o vinho

espumante permanece por um período mínimo de 8 meses a uma temperatura que varia de 15

a 18ºC. Após o período de envelhecimento, efetua-se o remuage para decantar os sedimentos

(aproximadamente 20 dias). Finaliza-se o processo através do dégorgement (descarte dos

sedimentos), adição de licor de expedição (para determinar da concentração final de açúcar) e

uso de conservantes (Flanzy, 2003; Miele & Miolo, 2003).

Uma vez que os vinhos espumantes são elaborados a partir de uvas brancas e/ou tintas

(com ou sem maceração pelicular), acreditasse que sua composição seja função das

características de cada varietal e do processo de elaboração, devendo-se considerar, no

entanto, o aporte de polifenóis em produtos obtidos com a participação de vinhos tintos

(espumantes rosados ou tintos) (Andrés-Lacueva et al., 2002; Sanchéz-Moreno et al., 2003;

Fragopoulou et al., 2003; Pozo-Bayón et al., 2004). A presença de hidroxicinamatos (em

especial, ácido caftárico e coutárico) e trans-resveratrol foi descrita em espumantes

elaborados com a participação de variedades brancas e tintas (Cheynier et al., 1993; Chamkha

et al., 2003; Pózo-Bayon et al., 2003). Além destes, foram identificados, ainda, compostos

como os ácidos gálico, ferúlico e catequina (Ibern-Gómez, et al., 2000).

Até o momento, são poucos os estudos existentes sobre a atividade biológica de vinhos

espumantes. Cavas mostraram-se capazes de inibir a peroxidação lipídica in vitro (Satué-

Gracia et al., 1999) e a administração de Champagnes aumentou a concentração de vitamina

E no plasma sangüíneo (Cartron et al., 2003).

Figura 9. Esquema simplificado dos métodos de elaboração de vinhos espumantes Charmat

(a) e Champenoise (b) (adapatada de Miolo & Miele, 2004).

Vinho base

Licor de tiragem e

Fermentação

Estabilização à frio

Filtração

Licor de expedição

Filtração

Engarrafamento

Método Charmat

(autoclave)

Vinho base

Licor de tiragem

Engarrafamento

Fermentação na garrafa

Envelhecimento

Autólise

Remuage

Pupitres

Dégorgement

Licor de expedição

Rotulagem

Método Champenoise

(clássico ou tradicional)

Sur Lie

(autólise das leveduras)

Remuage

Pupitres

Dégorgement

Licor de Expedição

2.3 Avaliação da atividade antioxidante

Diferentes metodologias têm sido desenvolvidas para obter-se uma medição

qualitativa ou quantitativa, da capacidade antioxidante de compostos, com base em testes

químicos ou utilizando-se culturas celulares. Dentre os testes in vitro existentes, a medida de

capacidade de varredura do radical DPPH

•

(1,1 difenil 2-picrilhidrazil) vem sendo bastante

utilizada. O DPPH

•

é um radical estável que pode ser reduzido por um antioxidante,

resultando na diminuição de coloração que é, então, determinada espectrofotometricamentea

517 nm (Cao et al., 1993; Espin et al., 2000; Fukumoto & Mazza, 2000).

Embora os ensaios in vitro sejam, geralmente, de mais fácil execução, nem sempre os

resultados obtidos corroboram os observados em sistemas biológicos (Henriques et al., 2001;

Soares et al., 2003). Em células, a expressão da atividade antioxidante é mais complexa pois

envolve questões de permeabilidade celular e possível metabolização dos compostos

ensaiados, além de um complexo sistema regulatório enzimático de defesas antioxidantes

endógenas celulares (Gralla & Valentine, 1991; Halliwell & Gutteridge, 1999). Desta

maneira, torna-se interessante associar os dois tipos de metodologias a fim de que sejam

obtidos resultados mais confiáveis.

A levedura S. cerevisiae é um dos melhores modelos de sistema biológico para estudos

de citotoxicidade, avaliação de capacidade antioxidante e genotoxicidade de inúmeros

compostos (Henriques et al., 2001; Maris et al., 2001; Pungartnik et al., 2002; Soares et al.,

2003; Raspor, et al., 2005), mostrando-se um ensaio rápido, sensível, econômico e

reprodutível, apresentando resultados confiáveis na identificação da atividade biológica. Os

dados obtidos nesse tipo de teste apresentam uma correlação de, aproximadamente, 70% em

relação ao observado no homem (Rabello-Gay et al., 1991).

2.4 Quantificação de polifenóis

Diferentes metodologias têm sido desenvolvidas para a determinação qualitativa ou

quantitativa dos teores de polifenóis em extratos vegetais, produtos a base de frutas ou ervas,

bem como em derivados da uva. Dentre as técnicas existentes, a espectrofotometria UV com

diferentes comprimentos de onda, tem sido uma ferramenta útil e amplamente utilizada em

enologia (Zoecklein et al., 2000).

Os polifenóis de mostos e vinhos absorvem as radiações do espectro ultravioleta (UV)

e, portanto, para a quantificação de polifenóis totais em vinhos brancos, utiliza-se a leitura da

absorbância a 280nm (Iland et al., 2000; Zoecklein et al, 2000; Ribéreau-Gayon et al., 2003).

Para a dosagem de hidroxicinamatos totais utiliza-se a leitura da absorbância a 320nm

(Zoecklein et al., 2000). O teor de flavonóides totais pode ser obtido através de fórmula

específica (FT = [A

280

– 4] – (0,66) x [A

320

– 1,4]), conforme descrito por Iland et al., (2000).

Para a identificação de compostos isolados, utiliza-se, normalmente, a cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE), realizada com colunas cromatográficas e fases móveis

apropriadas (Zoecklein et al., 2000).

2.5 Metais em uvas e vinhos

A uva, como todo produto vegetal, possui uma composição variada de elementos

minerais que depende do tipo de solo, clima, cultivar, porta-enxerto, adubações efetuadas,

tratamentos fitossanitários, maturação da uva, técnicas de vinificação, produtos e práticas

enológicas e do contato do vinho com materiais e equipamentos utilizados nas fases de

elaboração, conservação, estabilização e engarrafamento (Creasy et al., 1993; Thomas et al.,

1993; Jaganathan & Dugar, 1998; Rizzon, 2005).

Alguns dos minerais presentes nos vinhos são indispensáveis para o processo

fermentativo, como fonte de nutrientes para as leveduras (fósforo, enxofre, etc.). Outros

podem ser tóxicos, como, por exemplo, chumbo e cobre, devendo ser estabelecidos limites

para preservar a saúde do consumidor (Kocsonya et al., 2002; Rizzon, 2005). O perfil mineral

de um vinho pode, ainda, contribuir para sua caracterização em função da origem geográfica

(Almeida & Vasconcelos, 2003; Thiel et al., 2004).

O potássio, o cálcio e o magnésio, os cátions mais importantes no vinho, são

classificados como macro-elementos em relação ao teor. O ferro está presente nos vinhos em

pequena quantidade, na forma de íon ferroso, mais facilmente assimilável. O vinho possui

também pequena quantidade de lítio, ao qual é atribuído efeito antidepressivo. Outros cátions

classificados como micro-elementos (sódio, manganês, zinco e rubídio), além de alumínio,

silício, titânio, cromo e níquel (Rizzon, 2005; Chen et al., 1994; Monaci et al., 2003; Lara et

al., 2005), podem estar presentes nos vinhos em concentrações reduzidas.

Atualmente, muitas descobertas foram feitas na determinação de elementos-traço em

materiais biológicos e ambientais utilizando técnicas nucleares. Entre estas, pode-se citar a

técnica de PIXE (Particle-Induced X-Ray Emission), baseada na emissão de raios-X

característicos dos elementos presentes em uma amostra quando esta é irradiada por feixes de

íons carregados (prótons, partícula α) (Figura 10, Maxwel et al., 1995; Kertész et al., 2005).

Esse procedimento possibilita a identificação e a quantificação simultânea dos

elementos da tabela periódica (do sódio ao urânio) de forma rápida e precisa. Além disso, essa

técnica exige uma pequena quantidade de material para a análise e não é destrutiva, ou seja, as

amostras irradiadas por PIXE podem posteriormente ser analisadas por outras técnicas

complementares. É uma técnica com alta sensibilidade, permitindo medir a concentração de

elementos presentes em nível de traços (Johansson et al., 1995; Kenedy et al., 1999; Uzonyi

& Szabó, 2005).

Figura 10.

Princípio básico da técnica de PIXE. Em (1) um feixe de prótons provoca a

emissão de um elétron da camada K de um átomo de cálcio. Em (2) são mostrados dois

possíveis modos de preenchimento da vacância deixada nessa camada, com os respectivos

raios-X emitidos (reproduzida de Kern, 2004).

(2) (1)

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Este capítulo é apresentado na forma de dois artigos científicos, seguidos por

considerações gerais e perspectivas. Além dos dados apresentados nos artigos mencionados,

determinou-se também o perfil mineral dos vinhos espumantes discutidos no ítem 3.1

(ANEXO I) e a atividade antioxidante dos vinhos base, constantes do ítem 3.2 (ANEXO II).

Estes resultados serão incluídos em publicações futuras.

3.1 Artigo 1

O artigo constante neste ítem, o qual será submetido à revista Food Research

International, tem como objetivo principal avaliar a atividade antioxidante de dezenove

vinhos espumantes brasileiros elaborados pelos métodos Charmat (n = 12) e Champenoise (n

= 7) por conceituadas vinícolas da Serra Gaúcha, no Rio Grande do Sul, estado responsável

por mais de 90 % da produção deste tipo de vinho. As principais características enológicas, a

composição fenólica e o teor de ácido ascórbico destes vinhos espumantes, bem como a

influência do método de elaboração e da concentração de açúcar na atividade antioxidante,

também são discutidos.

Antioxidant activity of sparkling wines

made using Charmat and Champenoise methods

Cláudia A. Stefenon

, Mariangela Colombo

, Regina Vanderlinde

a,b

João A. P. Henriques

a, c

, Mirian Salvador

a *

Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul, Caxias do Sul, RS, Brasil

Laboratório de Referência Enológica, Caxias do Sul, RS, Brasil

Faculdade de Farmácia, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brasil

Address for correspondence: Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, Rua Francisco

Getúlio Vargas, 1130, 95070-560, Caxias do Sul, RS, Brasil. Tel.: +55-54-3218-2664, e-mail:

claudia.alberici@terra.com.br

Abstract

Several studies on the antioxidant capacity of wines were performed, but very little is

known on this activity in sparkling wines. Therefore the objective of this study was to

evaluate the antioxidant activity of 19 Brazilian sparkling wines made using the Charmat

(second fermentation in large containers) or the Champenoise method (second fermentation in

the bottle itself). All the sparkling wines tested showed significant antioxidant activity, both in

vivo and in vitro. Generally Charmat brut sparkling wines presented more antioxidant activity

than the Charmat demi-sec and the Champenoise ones. In most of the sparkling wines studied,

the majority compound found was gallic acid, although trans-resveratrol, (+)-catechin, (-)-

epicathechin and procyanidins B

, B

and B

were also identified. Significant differences

were observed in the concentrations of these compounds, considering the type of

grape/assemblage used and the method to make sparkling wines and this data were.

Keywords: Sparkling wine; Antioxidant; Saccharomyces cerevisiae; DPPH

•

; Phenolic compounds.

1. Introduction

The process of making sparkling wines begins by obtaining the base wine from white

grapes (blanc de blancs) or from white and red grapes (blanc de noirs). White base wines are

obtained when fermentation takes place without contact between the most and the grape skins.

When a period of maceration occurs (with the skins) the wines obtained will be red or rosés,

depending on the time and intensity of this maceration (Hidalgo, Pueyo, Pozo-Bayón,

Martínez-Rodríguez, Martín-Álvarez, & Polo, 2004). The base wine is then submitted to a

second fermentation, in order to produce carbon dioxide naturally. The main methods used to

make sparkling wines are: the Charmat method (second fermentation in large containers) and

the Champenoise method (second fermentation in the bottle itself). Sparkling wines may be

varietals (only a single variety of grapes) or assemblage/coupage (cuts between two or more

varieties of grapes) (Ribéreau-Gayon, Glories, Maujean, & Dubourdieu, 2003). After the end

of the second fermentation, the sparkling wines may be classified according to sugar content.

Brazilian Law classifies sparkling wines in 5 classes, including brut (6.1 to 15 g/L of sugar)

and

demi-sec (15.1 to 20 g/L) (BRASIL, 1990).

Sparkling wines are rich in phenolic compounds (Pozo-Bayón, Hernández, Martín-

Álvares, & Polo, 2003; Chamkha, Cathala, Cheynier, & Douillard, 2003; Ibern-Gómes,

Andrés-Lacueva, Lamuela-Raventós, Buxaderas, Singleton, & de la Torre-Boronat, 2000),

with known antioxidant activity (Yilmaz, & Toledo, 2004; Cartron et al. 2003; Roig, Cascón,

Arola, Bladé, & Salvadó, 2002; Satué-Gracia, Andrés-Lacueva, Lamuela-Raventós, &

Frankel, 1999). The content of these compounds, however, depends on several factors,

including variety of grape, fruit growth and ripening conditions, quality of the base wine,

yeast used and sur lie (time needed to mature) (Mazauric & Salmon, 2005; Cortell, Halbleib,

Gallagher, Righetti, & Kennedy, 2005; Delgado, Martín, del Álamo, & González, 2004).

Several studies have already been performed in order to evaluate the antioxidant

activity of red and white wines (Cartron et al. 2003; De Beer, Joubert, Gelderblom, &

Manley, 2003; Jamroz & Beltowski, 2001; Landrault, Poucheret, Ravel, Gasc, Cros, &

Teissedre, 2001); however, there are few data on the antioxidant capacity of sparkling wines

(Cartron et al. 2003; Satué-Gracia et al. 1999). Furthermore, there are no reports on the

influence of the different methods for making and/or sugar concentration in the biological

activity of these wines.

Therefore, the purpose of this study was to determine the antioxidant capacity of

Brazilian sparkling wines in vitro (scavenging capacity of the free radical 1.1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl (DPPH

•

) and in vivo (in eukaryotic cells of the Saccharomyces cerevisiae

yeast). The influence of the different methods used to make it (Charmat or Champenoise), the

concentration of sugar (brut or demi-sec) and the phenolic composition on the antioxidant

activity of these wines was also evaluated.

2. Material and methods

2.1. Samples

Nineteen sparkling wines were studied; twelve Charmat (seven brut and five demi-

sec) and seven Champenoise, made by seven different wineries in the “Serra Gaúcha”, the

mountains situated in the south of Brazil. The main characteristics of the sparkling wines used

are shown in Table 1. These samples were made from twelve varieties: Pinot Noir (PN),

Chardonnay (CH), Italic Riesling (IR), Semillon (SE), White Muscat (WMu), Merlot (ME),

Cabernet Sauvignon (CS), Prosecco (PR), White Malvasia (WMa), Candia Malvasia (CMa),

Canelli Muscat (CMu) and Alexandria Muscat (AM). The first fermentation (base wines) was

performed at 15 °C for an average of 16 days. In the second fermentation, the mean

temperature was 12 ± 2 °C with the foam formation time varying between 30 and 90 days.

The aging period varied from zero to 540 days (Table 1). Except for sparkling wines 9, 10 and

11, obtained from fermentations with S. cerevisiae, in all the others S. bayanus was used in

both fermentations. In order to perform the assays, the sparkling wines were previously

degassed, using a vacuum pump with a valve for air removal, coupled to a workbench

agitator.

2.2. Chemical reagents

DPPH

•

, trans-resveratrol, (+)-catechin, (-)-epicatechin, gallic acid and procyanidin B

were acquired from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. The procyanidins B

, B

and B

were

kindly provided by Dr. Regina Vanderlinde (Instituto Brasileiro do Vinho, Brazil). The

anthocyanins 3-glycoside of cyanidine, 3-glycoside of delphinidine, 3-glycoside of peonidine

and 3-glycoside of malvinidine were acquired from Extrasynthese, Gennay, France. The other

reagents were acquired from E. Merck, Damstadt, Germany.

3. Methods

3.1. Enological analysis of sparkling wines

The alcohol content, total acidity, pressure, volatile acidity, pH, free and total SO

, dry

extract and reduced dry extract, concentration of sugar and ascorbic acid were determined

using the methods described by Zoecklein, Fugelsang, Gump, & Nury, 2000. All analyses

were performed in duplicate.

3.2. Determination of polyphenols by UV spectrophotometry

Total polyphenols and total hydroxycinnamates were quantified by measuring the

absorbances at 280 nm and 320 nm (Shimadzu UV-1700 spectrophotometer), respectively.

The results of total polyphenols were expressed as mg/L of catechin and those of

hydroxycinnamates as mg/L of caffeic acid. The total flavonoids (TF) were calculated using

the following formula, as described by Iland, Ewart, Sitters, Markides, & Bruer, 2000:

TF = [(A

280

– 4) – 0.66] x (A

320

– 1.4).

The results were expressed in mg/L of catechin. All the analyses were performed in duplicate.

3.3. Determination of polyphenols by HPLC

Just before the analysis by high-efficiency liquid chromatography, 5 mL of each

sample were filtered through a cellulose membrane with a 0.20 µm-diameter. The equipment

used for analysis consisted of a chromatographic system with a liquid gradient LC-DAD

Series 1100 (Palo Alto, CA), with a Diode Array (DAD) detector system. A Zorbax 300 SB

C18 (12 mm x 4.6 mm x 5 µm) pre-column and a C18-ODS (150 mm x 4 mm x 5 µm)

(Agilent Technologies, USA) column were used.

In order to determine trans-resveratrol, a mobile phase consisting of the ultra pure

water and acetonitrile (75:25 v/v) pH 3.0 was used, at a constant flow of 1.0 mL/min for 20

min at a controlled temperature of 20 °C. The peak was detected at 306 nm and the sample

volume injected was 20 µL (Jeandet, Bessis, Maume, Meunier, Peyron, & Trollat, 1995).

In order to determine cianidine-3-glycoside, delphinidine-3-glycoside, peonidine-3-

glycoside and malvidine-3-glycoside, a mobile phased was used, comprised of solvents A,

ultra pure water/formic acid/acetonitrile (87:10:3 v/v/v) and B, ultra pure water/formic

acid/acetonitrile (40:10:50 v/v/v) at a continuous flow of 0.8 mL/min

at a controlled

temperature of 25 °C. The peak was detected at 518 nm and the sample volume injected was

50 µL.

The elution conditions were: 50-60% (30 min), 60-100% (30 min) and 100-50% (10

min) (OIV- Resolution OENO 22/2003).

In order to determine the concentrations of procyanidins B

, B

e B

, (+)-catechin,

(-)-epicatechin and gallic acid, a mobile phase was used constituted by solvent A (50 mmol/L

of ammonium hydroxide diphosphate pH 2.6), solvent B (20% of A and 80% of acetonitrile)

and by solvent C (0.2 mol/L of orthophosphoric acid pH 1.5), at a constant flow of 0.5

mL/min at a controlled temperature of 40 °C. The peak was detected at 204 nm and the

sample volume injected was 5 µL. Elution conditions were: 100% of A for 5 min; 96% of A

and 4% of B for 10 min; 92% of A and 8% of B for 10 min; 8% of B and 92% of C for 20

min; 30% of B and 70% of C for 5 min; 40% of B and 60% of C for 5 min; 80% of B and

20% of C for 5 min; 100% of A for 5 min. (Lamuela-Raventós & Waterhouse, 1994).

3.4. Evaluation of antioxidant activity in vitro

The scavenging capacity of free radical DPPH

•

was measured adding to the sparkling

wines pure or diluted in distilled water [0.1; 1.0; 10 and 50% (v/v)] a Tris-HCl buffer

solution (100 mM, pH 7.0) containing 250 µM of DPPH

•

dissolved in ethanol. In the control

tube, sterilized distilled water was used in place of sparkling wines. The tubes were kept in

the dark for 20 minutes and the absorbance was measured at 517 nm (Shimadzu UV-1700

spectrophotometer) (Yamaguchi, Takamura, Matoba, & Terão, 1998). The results were

expressed in values of IC

(quantity of sparkling wine needed to reduce 50% of the free

radical DPPH

•

), calculated by polynomial regression graphs (Mensor et al., 2001), using the

mean of triplicates.

3.5. Evaluation of antioxidant activity in vivo

The assays in vivo were performed using cells of S. cerevisiae XV 185-14c yeast

(MAT α ade 2-1, arg 4-17, his 1-7, lys 1-1, trp 1-1, trp 5-48, hom 3-10), kindly provided by

Dr. R. C. Von Borstel (Departament of Genetics, University of Alberta, Canada). Cell

suspensions of 2 x 10

cells/mL obtained from the exponential growth phase were treated with

hydrogen peroxide 75 mM, in the presence and absence of sparkling wines. The tubes were

incubated for 1 h at 28 ºC. Then the samples were diluted into a 0.9% (p/v) sodium chloride

solution, seeded into an YPD culture medium (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20

g/L of dextrose and 20 g/L of agar-agar) and incubated for 72 h at 28 ºC. After incubation, the

colonies were counted, and 100% survival was considered the total of colonies observed on

the control plate (untreated cells).

3.6. Data analysis

The data were analyzed using the following tests: Kruskal-Wallis H, Spearman

Correlation and Principal Component of Analysis (PCA), through program SPSS 12.0 for

Windows.

4. Results and discussion

4.1. Enological analysis and determination of polyphenols by UV spectrophotometry

The alcohol contents of the different sparkling wines analyzed varied from 11.23 to

13.05% (v/v), and total acidity from 5.08 to 8.21 g/L of tartaric acid. The mean levels of

pressure, volatile acidity and pH were 5.7 ± 0.2 atm, 0.588 ± 0.091 g/L of acetic acid and 3.29

± 0.14 g/L, respectively. The mean concentrations of free SO

were 20.00 ± 8.12 mg/L and

total SO

were 122.00 ± 37.25 mg/L. The analysis of the dry extract and reduced dry extract

showed, respectively, values of 23.45 ± 3.57 and 19.10 ± 2.95 mg/L for the brut samples, and

58.34 ± 9.93 and 16.05 ± 2.69 mg/L for the demi-sec sparkling wines (data not shown). The

sugar concentration varied from 5.48 to 12.47 g/L, for the brut samples, and from 36.15 to

54.41 g/L for the demi-sec sparkling wines (Table 2). These values are found within the range

established by Brazilian law (BRASIL, 1990) for sparkling wines.

Higher values of total polyphenols, total flavonoids and total hydroxycinnamates were

found in samples 7 and 12 (red sparkling wines). As to the whites, major variations were

observed depending on the grape/assemblage used and the method by which the sparkling

wine was made. The ascorbic acid content of the sparkling wines studied varied from 11.40 to

79.40 mg/L (Table 2). Up to the present, there are no data in the literature concerning the

content of this acid in sparkling wines, and it is believed that its concentration is the result of

the variety of grape and its degree of maturity (Ribéreau-Gayon et al., 2003), the offer of

sunlight on the vine (Valpuesta & Botella, 2004), the yeast metabolism (Hancock, Galpin, &

Viola, 2000) and/or the ascorbic acid added to them (Marks & Morris, 1993).

4.2. Polyphenols analysis by HPLC

In most of the sparkling wines analyzed, the main phenolic component was gallic acid,

at levels varying from 0.5 to 50.5 mg/L. The sparkling wine prepared with 10% Chardonnay,

60% Merlot and 30% Pinot Noir (sample 12) added higher contents of all polyphenols

analyzed. Larger amounts of trans-resveratrol, (+)-catechin and procyanidins B

, B

and B

were observed in sample 7, produced with the following grapes: Italic Riesling (40%), Merlot

(10%) and Cabernet Sauvignon (50%). Higher values of (-)-epicatechin were obtained in the

sparkling wine produced with 40% Pinot Noir and 60% Chardonnay (sample 1). Sparkling

wine 10, prepared with Chardonnay grapes (100%), presented the highest levels of

procyanidin B

(Table 3).

So far no studies have been performed on the phenolic composition of Charmat

sparkling wines. As to the Champenoise, it was observed that the Brazilian sparkling wines

presented (Table 3) higher concentrations of gallic acid than those reported for Spanish

sparkling wines prepared using the following varieties Macabeo, Xarel.lo, Parellada,

Chardonnay, Trepat, Monastrel and Garnacha (Pozo-Bayón et al., 2003; Ibern-Gómes et al.,

2000; Satué-Gracia et al., 1999). Similar values of (+)-catechin were described in Spanish

sparkling wines (Ibern-Gómes et al., 2000), as well as in French Champagnes of the Pinot

Noir and Chardonnay varieties (Chamkha et al., 2003). The (-)-epicatechin and trans-

resveratrol content of the Brazilian sparkling wines prepared using the Champenoise method

proved similar to that found in French Champagnes (Chamkha et al., 2003). Procyanidin B

values similar to those found in the present study were described for Spanish sparkling wines

(Satué-Gracia et al., 1999). As far as we know this is the first report on the presence of

procyanidins B

, B

and B

in sparkling wines.

For the red and rosé sparkling wines the contents of cyanidine-3-glycoside,

delphinidine-3-glycoside, peonidine-3-glycoside and malvidine-3-glycoside, four important

anthocyanins found in red grapes and wine (Zoecklein et al., 2000) were also quantified

(Table 4). As expected, the sample of rosé sparkling wine (sample 13) presented lower

concentrations among the four compounds analyzed compared to the two samples of red

sparkling wines (7 and 12). The main and most plentiful anthocyanin found in red varieties,

malvidine monoglycoside (Ribéreau-Gayon et al., 2003), was the main compound in the three

sparkling wine samples evaluated.

4.3. Evaluation of antioxidant activity in vitro

Table 5 shows the Charmat brut sparkling wine (sample 3) made from an assemblage

of Italic Riesling, Semillon and White Muscat grapes, presented the highest degree of

antioxidant activity (IC

= 1.83 ± 0.49%). The Charmat brut sparkling wines (samples 3, 5

and 6) showed a higher antioxidant capacity than their respective demi-sec peers (samples 15,

16 and 17) (Table 5). Higher values of (+)-catechin, procyanidin B2 and gallic acid (Table 3)

were found in these brut sparkling wines, compared to their demi-sec peers.

Sparkling wines 6 (Charmat) and 10 (Champenoise) were prepared exclusively with

the Chardonnay variety, and the greatest capacity for scavenging of free radical DPPH

•

(Table

5) was observed in sample 6, which presented higher ascorbic acid contents (Table 2), trans-

resveratrol, (+)-catechin, (-)-epicatechin and procyanidins B

, B

and B

than sample 10

(Table 3).

The same assemblage (40% Pinot Noir and 60% Chardonnay), when submitted to the

different methods to make it showed differences in the antioxidant capacity. Sample 8

(Champenoise) presented higher antioxidant activity than sparkling wine 1 (Charmat) (Table

5). Higher values of total flavonoids (Table 2) and procyanidins B

and B

(Table 3) were

found in sparkling wine 8.

Sparkling wines 11 and 14, obtained by assemblage of the Pinot Noir (20%) and

Chardonnay grapes (80%), were prepared using the Champenoise method by different

wineries. Sample 11 presented a greater capacity to scavenge free radical DPPH

•

than sample

14 (Table 5). The latter showed lower (+)-catechin, (-)-epicatechin, gallic acid and

procyanidin B

, B

and B

contents (Table 3), indicating the influence of the vinification

techniques adopted by each winery on the phenolic composition and antioxidant activity of

the sparkling wines.

Apparently, antioxidant activity does not depend exclusively on the total polyphenols

content. Samples 7 and 12 (red sparkling wines) with significant amounts of phenolic

compounds (Tables 2, 3 and 4) did not show the highest antioxidant activity. Studies have

already demonstrated that the biological activity of resveratrol, specifically the inhibition of

the tyrosinekinase protein p56, is diminished when glycosilation of the hydroxyl groups

occurs (Soleas, Diamandis, & Goldberg, 1997). Therefore, it is possible that some

polyphenols, when connected to carbohydrates (for instance the anthocyanidines of red wines)

present less antioxidant activity than their respective aglycones, which might account at least

in part for the results observed. Among the red sparkling wines, the presence of a negative

correlation between the antioxidant capacity in vitro and the concentrations of cyanidine-3-

glycoside, peonidine-3-glycoside and malvidine-3-glycoside (all with a value of r = 0.985)

and delphinidine-3-glycoside (r = 1), at a level of significance of p = 0.01 corroborates this

hypothesis.

4.4. Evaluation of the antioxidant activity in vivo

In order to determine antioxidant activity in vivo, the highest non-cytotoxic

concentration of sparkling wines was used, i.e., 10.0% (v/v) (data not shown). All the samples

evaluated were able to protect the yeast cells against damage caused by hydrogen peroxide

(Table 6).

Of the two red sparkling wines studied, sample 12, which presented the highest

polyphenol and ascorbic acid contents of all the sparkling wines evaluated (Tables 2 and 3)

showed higher antioxidant activity in vivo than sparkling wine 7 (Table 6).

Differences in the antioxidant activity of sparkling wines because of the Charmat and

Champenoise methods used to make them are shown in this study. Similarly to what was

observed in vitro, the Charmat brut sparkling wines generally presented a higher antioxidant

capacity than those prepared by the Champenoise method, including the cases in which the

sparkling wines were made using the same varieties/assemblages and/or by the same wineries

(samples 1 and 8, and 6 and 10) (Table 6).

The greatest differences between the two methods of making sparkling wines are the

sur lie time and the area of contact between the sparkling wine, the yeasts and the larger

container. It has already been demonstrated that the yeasts are able to adsorb different

compounds present in the wines, including catechin and epicatechin (Mazauric & Salmon,

2005; Ribéreau-Gayon et al., 2003). The white Charmat sparkling wines, both brut (samples 1

and 6) and demi-sec (sample 17), prepared with a shorter sur lie time than their respective

peers Champenoise (samples 8 and 10) (Table 1), presented higher (+)-catechin and (-)-

epicatechin contents (Table 3). A negative correlation was observed between the sur lie

period and antioxidant activity in vivo (r = - 0.519, p = 0.01), i.e., the longer the sur lie

period, the smaller was the antioxidant capacity of the sparkling wines. This correlation was

even greater in the group of the Champenoise sparkling wines (r = - 0.842, p = 0.05). The

statistical analysis of the principal components (PCA), for all sparkling wines, revealed that

the first two principal components explain more than 70% of total variance (Table 7). This

analysis corroborated ours data, since the sur lie variable appears as one of the factors of

bigger influence on the antioxidant activity in the Champenoise (Fig. 1) than Charmat

sparkling wines (Fig. 2 and 3).

The Charmat demi-sec sparking wines (samples 15, 16 and 17) presented lower

antioxidant activity (Table 6) than observed for their respective Charmat brut peers (samples

3, 5 e 6), similarly to what was observed in vitro. Negative correlations between the in vivo

antioxidant capacity and the sugar contents (r = - 0.476, p = 0.01) and dry extract (r = - 0.346,

p = 0.05) were found in these two groups of sparkling wines. This is the first time that

differences are shown in the antioxidant potential of sparkling wines as a function of its sugar

concentration. Orange juices with added sugar showed less antioxidant activity than juices

without added sugar (Franke et al., 2004), corroborating the results found in our work. The

PCA analysis showed that, for the group of Charmat demi-sec sparkling wines, the sugar

concentration was one of the main variables that had influenced the antioxidant response of

these wines (Fig. 2).

The phenolic compounds have an acknowledged antioxidant capacity, and can

scavenger free radicals, chelate metals, and diminish lipid peroxidation (Yilmaz & Toledo,

2004; Cartron et al., 2003; Roig et al., 2002; Jamroz & Beltowski, 2001). Polyphenol

formation by the vine is influenced by natural factors such as variety of grape, genetic

susceptibility to diseases, climate and soil, besides viticultural management (rootstock, vigor,

exposure to sunlight as a function of the conduction system, fertilization, etc.) (Cortell et al.,

2005; Delgado et al., 2004; Ribéreau-Gayon et al., 2003). Enology also plays an important

role in determining the phenolic profile of the final product, using techniques such as

industrial maturing, press yield, maceration time and temperature, yeast used, fermentation

period, clarification, stabilization, filtration, maturing, aging, etc. (Mazauric & Salmon, 2005;

Ribéreau-Gayon et al., 2003).

In this study, the phenolic compounds showed an important role in the antioxidant

activity. Interestingly, the PCA analysis showed a stronger association between the phenolic

compounds and the antioxidant activity for the Champenoise than Charmat sparkling wines

(Fig. 1, 2 and 3). Then, the phenolic compounds role may be greater in the antioxidant activity

for the sparkling wines made by Champenoise method. Moreover, the table 7 shows that the

two first principal components were responsible for more than 85% of variance these method.

Summarizing, the results presented in this study show that: a) the Charmat and

Champenoise sparkling wines, both brut and demi-sec, present significant antioxidant activity,

which is associated with the presence of phenolic compounds; b) in general, Charmat brut

sparkling wines present higher antioxidant activity than the demi-sec Charmats and the

Champenoise; c) there are major differences in the concentrations of phenolic compounds in

sparkling wines as a function of the type of grape/assemblage used and the method used to

make them.

Although further studies are needed, the data shown in this work suggest that it is

possible to obtain a specific phenolic profile in sparkling wines by choosing the grapes and/or

assemblages (blanc de blancs or blanc de noirs) and the enological practices adopted, thus

enabling the production of sparkling wines with greater antioxidant activity and thus with a

higher added value. Furthermore, the moderate/guided consumption of sparkling wines may

be a further alternative in seeking a healthy life.

Acknowledgements

CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), UCS

(Universidade de Caxias do Sul), LABRAN (Laboratório Randon Ltda), ABE (Associação

Brasileira de Enologia), Möet Henessy do Brasil – Vinhos e Destilados Ltda, Casa Valduga

Ltda, Cave de Amadeu Ltda, Cooperativa Vinícola Aurora Ltda, Estabelecimento Vinícola

Armando Peterlongo Ltda, Vinhos Salton S/A e Vinícola Monte Lemos Ltda. The authors

thank Ana Cristina Andreazza for her technical assistance in data analysis and to Dr. Luis

Fernando Revers for his assistance in discussion.

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Table 1

Main characteristics of the sparkling wines studied

Samples Assemblage Wineries Base wines Sur lie *

(days)

Charmat Brut

1 40% PN, 60% CH A** Blanc de Noirs 30

2 60% PN, 40% CH B Blanc de Noirs 126

3 50% IR, 30% SE, 20% WMu C Blanc de Blancs No aging

4 50% IR, 33% PN, 17% CH B Blanc de Noirs 60

5 30% IR, 70% CH D Blanc de Blancs 60

6 100% CH E Blanc de Blancs 30

7 40% IR, 10% ME, 50% CS B Red 193

Champenoise

8 40% PN, 60% CH A Blanc de Noirs 180

9 100% PR F Blanc de Blancs 150

10 100% CH F Blanc de Blancs 540

11 20% PN, 80% CH F Blanc de Noirs 270

12 10% CH, 60% ME, 30% PN F Red 365

13 50%PN, 50% CH F Rosé 150

14 20% PN, 80% CH G Blanc de Noirs 365

Charmat Demi-sec

15 50% IR, 30% SE, 20% WMu C Blanc de Blancs No aging

16 30% IR, 70% CH D Blanc de Blancs 60

17 100% CH E Blanc de Blancs 30

18 56% WMa, 25% CMa,

10% CMu, 9% AM

B Blanc de Blancs 8

19 74% IR, 14% PN, 12% CH B Blanc de Noirs 30

* Time needed to mature; ** Distinct letters corresponding to different wineries in the Serra

Gaúcha/Rio Grande do Sul/Brazil. Grape legend: Pinot Noir (PN), Chardonnay (CH), Italic

Riesling (IR), Semillon (SE), White Muscat (WMu), Merlot (ME), Cabernet Sauvignon (CS),

Prosecco (PR), White Malvasia (WMa), Candia Malvasia (CMa), Canelli Muscat (CMu) and

Alexandria Muscat (AM).

Table 2

Mean concentration values of sugar, total polyphenols, total flavonoids, total hydroxycinnamates and ascorbic acid in the sparkling

wines analyzed.

Samples Assemblage

Sugar ± Sd*

(g/L)

Total

polyphenols ± Sd

(mg/L

of catechin)

Total

flavonoids ± Sd

(mg/L

of catechin)

Total

hydroxycinnamates ± Sd

(mg/L

of caffeic acid)

Ascorbic acid

± Sd (mg/L)

Charmat

Brut

40% PN, 60% CH

12.47 ± 0.23

a**

353.94 ± 4.19

a**

155.75 ± 2.94

a**

39.78 ± 0.22

a**

33.30 ± 0.03

a**

60% PN, 40% CH

5.48 ± 0.26

185.08 ± 7.13

52.25 ± 4.19

26.61 ± 0.61

21.90 ± 0.01

50% IR, 30% SE, 20% WMu

11.42 ± 0.08

163.70 ± 4.19

6.16 ± 1.68

31.50 ± 0.50

28.90 ± 0.03

50% IR, 33% PN, 17% CH

9.33 ± 0.20

193.04 ± 1.68

23.76 ± 1.67

33.94 ± 0.55

11.40 ± 0.04

30% IR, 70% CH

8.94 ± 0.17

519.87 ± 0.00

301.98 ± 1.67

43.66 ± 0.33

21.80 ± 0.03

100% CH

10.48 ± 0.22

420.14 ± 3.35

220.27 ± 12.15

40.05 ± 3.05

22.60 ± 0.06

40% IR, 10% ME, 50% CS

10.55 ± 0.29

1351.19 ± 3.35

779.66 ± 6.70

113.33 ± 0.66

32.60 ± 0.04

Champenoise

40% PN, 60% CH

5.84 ± 0.14

362.32 ± 0.84

192.20 ± 1.67

34.11 ± 0.22

11.90 ± 0.03

100% PR

7.28 ± 0.15

483.00 ± 5.86

234.10 ± 5.87

49.95 ± 0.05

20.50 ± 0.02

100% CH

8.04 ± 0.19

620.43 ± 4.19

364.83 ± 4.19

51.33 ± 0.00

16.70 ± 0.03

20% PN, 80% CH

7.24 ± 0.11

493.47 ± 2.93

242.48 ± 5.03

50,39 ± 0.39

21.20 ± 0.01

10% CH, 60% ME, 30% PN

9.91 ± 0.07

2790.92 ± 41.90

1869.93 ± 22.63

185.00 ± 3.89

79.40 ± 0.02

50%PN, 50% CH

6.59 ± 0.20

616.24 ± 37.71

300.72 ± 21.37

63.33 ± 3.33

43.60 ± 0.04

20% PN, 80% CH

5.89 ± 0.19

374.89 ± 0.84

216.08 ± 0.42

31.78 ± 0.11

46.50 ± 0.03

Charmat

Demi-sec

50% IR, 30% SE, 20% WMu

37.49 ± 0.39

185.49 ± 0.84

15.38 ± 1.68

34.16 ± 0.16

29.00 ± 0.03

30% IR, 70% CH

51.06 ± 0.14

508.97 ± 3.35

306.17 ± 9.22

42.77 ± 0.44

19.10 ± 0.07

100% CH

54.41 ± 0.09

523.22 ± 3.35

296.95 ± 1.68

45.44 ± 0.33

19.50 ± 0.04

56% WMa, 25% CMa,

10% CMu, 9% AM

36.15 ± 0.13

339.69 ± 0.84

145.69 ± 0.42

38.94 ± 0.05

61.30 ± 0.03

74% IR, 14% PN, 12% CH

36.40 ± 0.04

216.92 ± 0.42

32.55 ± 0.42

36.94 ± 0.05

15.70 ± 0.03

* Standard deviation; ** Data followed by different letters for each column differ significantly by Kruskal Wallis H test (p

≤

0.05). Grape

legend: Pinot Noir (PN), Chardonnay (CH), Italic Riesling (IR), Semillon (SE), White Muscat (WMu), Merlot (ME), Cabernet Sauvignon

(CS), Prosecco (PR), White Malvasia (WMa), Candia Malvasia (CMa), Canelli Muscat (CMu) and Alexandria Muscat (AM).

Table 3

Phenolic compounds (mg/L) identified by HPLC in the sparkling wines analyzed

Samples Assemblage Galic

acid

trans –

resveratrol

Catechin

Epicatechin

Procyanidin

Charmat Brut

40% PN, 60% CH

4.800 0.131 4.039 6.267 0.559 0.118 1.367 1.265

60% PN, 40% CH

2.980 0.196 1.697 0.792 0.258 0.026 1.190 0.144

50% IR, 30% SE, 20% WMu

3.550 0.082 2.732 3.108 0.202 0.470 1.199 0.146

50% IR, 33% PN, 17% CH

0.500 0.101 1.266 0.230 3.128 1.113 0.259 0.918

30% IR, 70% CH

14.510 0.172 6.635 2.409 5.112 0.466 1.563 1.127

100% CH

11.370 0.087 7.080 3.531 3.447 0.816 2.048 1.398

40% IR, 10% ME, 50% CS

10.030 0.675 8.773 4.287 6.304 2.314 6.045 2.381

Champenoise

40% PN, 60% CH

2.130 0.099 1.952 0.460 4.357 0.934 1.809 0.270

100% PR

10.050 0.066 2.661 0.994 5.726 1.088 1.127 0.176

100% CH

18.210 0.038 1.313 0.221 1.732 2.805 0.798 0.147

20% PN, 80% CH

9.690 0.062 2.790 1.080 5.710 1.050 1.040 0.170

10% CH, 60% ME, 30% PN

50.460 3.699 25.030 18.120 27.840 9.380 13.870 3.410

50%PN, 50% CH

17.190 0.041 2.480 1.100 4.220 0.650 1.980 0.340

20% PN, 80% CH

0.590 0.306 0.840 0.210 2.520 0.360 1.820 0.050

Charmat Demi-sec

50% IR, 30% SE, 20% WMu

1.400 0.091 2.439 0.732 0.784 0.178 1.427 0.575

30% IR, 70% CH

14.100 0.185 6.589 2.345 3.944 0.364 1.334 0.901

100% CH

1.080 0.113 6.246 3.590 2.808 0.744 2.868 1.208

56% WMa, 25% CMa,

10% CMu, 9% AM

0.890 0.172 1.379 0.401 4.127 0.141 0.519 0.417

74% IR, 14% PN, 12% CH

0.740 0.138 1.240 0.188 3.166 1.215 0.364 0.540

Grape legend: Pinot Noir (PN), Chardonnay (CH), Italic Riesling (IR), Semillon (SE), White Muscat (WMu), Merlot (ME), Cabernet

Sauvignon (CS), Prosecco (PR), White Malvasia (WMa), Candia Malvasia (CMa), Canelli Muscat (CMu), Alexandria Muscat (AM).

Table 4

Anthocyanin contents (mg/L) identified by HPLC in red/rosé sparkling wines

Samples Sparkling wines Cyanidine

3-glycoside

Delphinidine

3-glycoside

Peonidine

3-glycoside

Malvidine

3-glycoside

Charmat

7 40% IR, 10% ME, 50% CS 0.964 0.843 1.043 10.130

Champenoise

12 10% CH, 60% ME, 30% PN

0.677 1.319 0.613 7.045

50% PN, 50% CH 0.296 0.623 0.178 1.797

* Rosé sparkling wine. Grape legend: Italic Riesling (IR), Merlot (ME), Cabernet Sauvignon (CS),

Chardonnay (CH) and Pinot Noir (PN).

Table 5

Mean values of IC

for the different sparkling wines analyzed

Samples Sparkling wines

± Sd* (%)

Charmat Brut

40% PN, 60% CH

11.80 ± 1.28

a**

60% PN, 40% CH

13.03 ± 1.19

50% IR, 30% SE, 20% WMu

1.83 ± 0.49

50% IR, 33% PN, 17% CH

80.76 ± 2.75

30% IR, 70% CH

20.76 ± 5.12

100% CH

20.26 ± 0.32

40% IR, 10% ME, 50% CS

31.50 ± 0.42

Champenoise

40% PN, 60% CH

9.05 ± 1.04

100% PR

19.63 ± 0.63

100% CH

30.83 ± 2.01

20% PN, 80% CH

11.09 ± 1.81

10% CH, 60% ME, 30% PN

32.83 ± 0.13

50%PN, 50% CH

16.77 ± 0.54

20% PN, 80% CH

39.53 ± 1.53

Charmat Demi-sec

50% IR, 30% SE, 20% WMu

26.87 ± 0.58

30% IR, 70% CH

32.56 ± 0.43

100% CH

25.04 ± 0.13

56% WMa, 25% CMa, 10% CMu, 9% AM

23.73 ± 0.57

74% IR, 14% PN, 12% CH

26.10 ± 1.93

* Standard deviation; ** Data followed by different letters for each column differ significantly by

Kruskal Wallis H test (p

≤

0.05). Grape legend: Pinot Noir (PN), Chardonnay (CH), Italic Riesling

(IR), Semillon (SE), White Muscat (WMu), Merlot (ME), Cabernet Sauvignon (CS), Prosecco (PR),

White Malvasia (WMa), Candia Malvasia (CMa), Canelli Muscat (CMu) and Alexandria Muscat

(AM).

Table 6

Mean survival values of the Saccharomyces cerevisiae yeast treated with hydrogen peroxide (H

)

75mM in the presence and absence of the different sparkling wines

Samples

(10% v/v)

Treatments

Survival ± Sd* (%)

Charmat Brut

1 40% PN, 60% CH

93.55 ± 0.25

a**

2 60% PN, 40% CH

93.65 ± 4.75

3 50% IR, 30% SE, 20% WMu

96.90 ± 3.10

4 50% IR, 33% PN, 17% CH

100.00 ± 0.00

5 30% IR, 70% CH

78.70 ± 3.70

6 100% CH

96.75 ± 0.35

7 40% IR, 10% ME, 50% CS

62.43 ± 8.30

Champenoise

8 40% PN, 60% CH

84.22 ± 1.91

9 100% PR

56.80 ± 1.00

10 100% CH

53.58 ± 0.95

11 20% PN, 80% CH

34.80 ± 0.50

12 10% CH, 60% ME, 30% PN

85.50 ± 0.90

13 50%PN, 50% CH

65.41 ± 1.21

14 20% PN, 80% CH

85.05 ± 3.35

Charmat Demi-sec

15 50% IR, 30% SE, 20% WMu

65.45 ± 1.05

16 30% IR, 70% CH

64.85 ± 2.35

17 100% CH

79.20 ± 3.60

18 56% WMa, 25% CMa, 10% CMu, 9% AM

100.00 ± 0.00

19 74% IR, 14% PN, 12% CH

95.30 ± 4.70

(control)

27.95 ± 0.25

* Standard deviation; ** Data followed by different letters for each column differ significantly by

Kruskal Wallis H test (p

≤

0.05). Grape legend: Pinot Noir (PN), Chardonnay (CH), Italic Riesling

(IR), Semillon (SE), White Muscat (WMu), Merlot (ME), Cabernet Sauvignon (CS), Prosecco (PR),

White Malvasia (WMa), Candia Malvasia (CMa), Canelli Muscat (CMu) and Alexandria Muscat

(AM).

Table 7

Variance explained by the first PCs

PC Eigenvalue Explained

variance (%)

Cumulative

variance (%)

Charmat Brut

1 11.83 51.45 51.45

2 4.70 20.41

71.86

Champenoise

1 15.94 69.29 69.29

2 3.92 17.03

86.32

Charmat Demi-sec

1 12.41 53.95 53.95

2 4.37 19.00

72.95

Fig. 1. Scores plot of the phenolic compounds and main characteristics of the Champenoise

sparkling wines using the two first principal components obtained by PCA.

1.0

0.5

0.0

0.5

1.0

-1.0

-0.5

1.0

PC 1 (69.29%)

PC 2 (17.03%)

scorbic acid

resveratrol

procyanidin B3

reduced dry extract

procyanidin B1

dry extract

total flavonoids

sur lie

catechin

total polyphenols

sugar

galic acid

total

hydroxycinnamates

epicatechin

procyanidin B2

procyanidin B4

Fig. 2. Scores plot of the phenolic compounds and main characteristics of the Charmat Demi-sec

sparkling wines using the two first principal components obtained by PCA.

1.0

0.5

0.0

0.5

1.0

0.5

0.0

0.5

1.0

PC 1

(53.95%)

2 (19.00%)

ascorbic acid

resveratrol

procyanidin B3

reduced dry extract

procyanidin B1

dry extract

total flavonoids

sur lie

catechin

total polyphenols

sugar

galic acid

total

hydroxycinnamates

epicatechin

procyanidin B2

procyanidin B4

Fig. 3. Scores plot of the phenolic compounds and main characteristics of the Charmat brut

sparkling wines using the two first principal components obtained by PCA.

-1.0

-0.5

0.0

1.0

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

PC 1 (51.

45%)

PC 2

(

20.44

scorbic acid

resveratrol

procyanidin B3

reduced dry extract

procyanidin B1

dry extract

total flavonoids

sur lie

catechin

total polyphenols

sugar

galic acid

total

hydroxycinnamates

epicatechin

procyanidin B2

procyanidin B4

3.2 Capítulo 2

O artigo constante neste ítem, o qual será submetido à revista indexada internacional,

tem como objetivo principal avaliar as modificações no perfil fenólico e mineral ocorridas

durante a segunda fermentação de vinhos base conduzidas através dos métodos Charmat e

Champenoise.

Influência da segunda fermentação na composição fenólica e mineral

de vinhos espumantes

Cláudia Alberici Stefenon

, Camila de Martini Bonesi

, Israel Pedruzzi

, Daniel Prá

, Regina

Vanderlinde

1,2

,Jhonny Ferraz Dias

, Maria Lúcia Yoneama

, Mirian Salvador

, João Antonio

Pêgas Henriques

1,3*

Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul, Caxias do Sul, RS, Brasil;

Laboratório de

Referência Enológica, Caxias do Sul, RS, Brasil;

Centro de Biotecnologia/Instituto de Física, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil;

Universidade do Vale do Rio dos Sinos, São Leopoldo,

RS, Brasil;

Faculdade de Farmácia, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brasil

Palavras chave: vinho espumante, polifenóis, composição mineral, PIXE, CLAE

Resumo

Embora a composição dos vinhos espumantes Champenoise já seja conhecida, não há,

até o momento, estudos sobre as modificações na composição fenólica e no perfil mineral

decorrentes da segunda fermentação de vinhos espumantes Charmat e Champenoise. Em vista

disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar as modificações no perfil fenólico e mineral

ocorridas durante a segunda fermentação de vinhos base da Serra Gaúcha, Rio Grande do Sul,

Brasil, uma das regiões de maior destaque na produção de vinhos espumantes em todo o

mundo. A determinação da composição fenólica foi realizada através de CLAE

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e a quantificação de metais foi obtida pela técnica

de PIXE (Particle-Induced X-Ray Emission). Os resultados obtidos mostraram que após a

segunda fermentação, ocorre: a) significativa redução de polifenóis totais e flavonóides totais

nos espumantes Charmat e aumento na concentração destes compostos nos espumantes

Champenoise, b) diminuição na concentração de hidroxicinamatos totais, independentemente

do método de elaboração, c) aumento no teor de ácido gálico nos espumantes brut; d)

diminuição nos teores de trans-resveratrol nos espumantes Charmat, e) aumento de trans-

resveratrol nos espumantes Champenoise, f) diminuição na concentração de minerais em

todos os espumantes analisados. Embora outros estudos sejam necessários, este trabalho

mostra, pela primeira vez, as diferenças encontradas na composição fenólica e mineral de

vinhos espumantes em função dos métodos de elaboração e concentração de açúcar.

Endereço para correspondência: Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do

Sul, Rua Francisco Getúlio Vargas, 1130, 95070-560, Caxias do Sul, RS, Brasil. Telefone:

+55-54-3218-2664.e-mail:[email protected].gov.br

Introdução

O processo de elaboração de vinhos espumantes é iniciado com a obtenção de um

vinho base varietal (a partir de apenas uma uva) ou assemblage (elaborado com cortes entre

duas ou mais uvas), a partir de uvas brancas (blanc de blancs) ou de uvas brancas e tintas

(blanc de noirs) (Hidalgo et al., 2004). Os vinhos base são submetidos a uma segunda

fermentação, objetivando a produção natural de dióxido de carbono. Os principais métodos de

elaboração são o Charmat (segunda fermentação em grandes recipientes vinários) e o

Champenoise (segunda fermentação na própria garrafa) (Ribéreau-Gayon et al., 2003). Após

o término da segunda fermentação, os vinhos espumantes podem ser divididos em classes

(Brasil, 1999), em função do seu teor de açúcar como, por exemplo, brut (até 15 g.L

-1

) ou

demi-sec (de 15,1 a 20 g.L

-1

A composição dos vinhos espumantes Champenoise é, em geral, similar aos seus

respectivos vinhos de origem (Flanzy, 2003). Entretanto, não há, até o momento, estudos

sobre as modificações na composição fenólica e no perfil mineral decorrentes da segunda

fermentação em vinhos espumantes, tanto Charmat quanto Champenoise.

Os compostos fenólicos apresentam reconhecida atividade antioxidante, a qual está

associada à diminuição na incidência de várias patologias, como aterosclerose e câncer (Eng

et al., 2003; Da Luz & Coimbra, 2004). Embora muitos minerais sejam essenciais para o

homem, quando em excesso, podem formar espécies reativas, incluindo o radical OH

•

, para o

qual o organismo não possui defesas antioxidantes (Halliwell & Gutteridge, 1999; Kern et al.,

2005).

Em vista disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar as modificações no perfil fenólico

e mineral ocorridas durante a segunda fermentação de vinhos base da Serra Gaúcha, Rio

Grande do Sul/Brasil, uma das regiões de maior destaque na produção de vinhos espumantes

no mundo.

Material e métodos

Amostras

Foram analisados quatro vinhos base, os quais originaram cinco vinhos espumantes, sendo

dois Charmat brut, dois demi-sec e um Champenoise. Todas as amostras foram cedidas por

vinícolas da Serra Gaúcha, Rio Grande do Sul/Brasil. De acordo com a legislação brasileira,

os vinhos espumantes são classificados como brut quando apresentam até 15 g.L

-1

de açúcar e

demi-sec entre 20,1 e 60,0 g.L

-1

. A primeira fermentação (vinhos base) foi conduzida a 15 °C

por um período médio de 16 dias. Na segunda fermentação, a média da temperatura foi 12 ±

2°C e o tempo de tomada de espuma variou entre 30 e 90 dias. A levedura Saccharomyces

bayanus foi utilizada em ambas fermentações. As principais características das amostras

estudadas são apresentadas na Tabela 1. Antes dos ensaios, os vinhos espumantes foram

previamente desgaseificados, utilizando-se uma bomba de vácuo, dotada de válvula de

expulsão de ar, acoplada a um agitador de bancada.

Reagentes Químicos

Trans-resveratrol, (+)-catequina, (-)-epicatequina, ácido gálico e a procianidina B

foram

adquiridos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. As procianidinas B

, B

e B

foram gentilmente

cedidas pela Dra. Regina Vanderlinde (Instituto Brasileiro do Vinho, Brasil). Acetonitrila

(grau CLAE) e os demais reagentes foram adquiridos de E. Merck, Damstadt, Alemanha.

Análises Enológicas dos Vinhos Espumantes

A pressão, graduação alcoólica, concentração de açúcar, extrato seco e extrato seco reduzido,

acidez total, acidez volátil, pH, SO

livre e total e ácido ascórbico foram determinados usando

métodos descritos por Zoecklein et al. (2000). Todas as análises foram realizadas em

duplicata.

Tabela 1. Principais características dos vinhos base e espumantes estudados.

Amostras Assemblage

Vinícola

Produtora

Base Sur Lie (dias)

Charmat Brut

Vinho base 1

Espumante 1

Pinot Noir (60%)

Chardonnay (40%)

A Blanc de Noirs 126

Vinho base 2

Espumante 2

Riesling Itálico (50%)

Semillon (30%)

Moscato (20%)

B Blanc de Blancs Sem

envelhecimento

Charmat Demi-sec

Vinho base 2

Espumante 3

Riesling Itálico (50%)

Semillon (30%)

Moscato (20%)

B Blanc de Blancs Sem

envelhecimento

Vinho base 4

Espumante 4

Riesling Itálico (74%)

Pinot Noir (14%)

Chardonnay (12%)

A Blanc de Noirs 30

Champenoise

Vinho base 5

Espumante 5

Pinot Noir (20%)

Chardonnay (80%)

C Blanc de Noirs 365

O vinho base 2 foi utilizado na elaboração dos vinhos espumantes 2 e 3.

Determinação de Polifenóis por Espectrofotometria UV

Polifenóis totais e hidroxicinamatos totais foram quantificados através da medida das

absorbâncias a 280nm e 320nm (espectrofotômetro Shimadzu UV-1700), respectivamente. Os

resultados de polifenóis totais foram expressos como mg.L

-1

de catequina e os de

hidroxicinamatos como mg.L

-1

de ácido caféico. Os flavonóides totais foram calculados

utilizando-se a seguinte fórmula: flavonóides totais = [A

280

– 4] – (0,66) x [A

320

– 1.4], de

acordo com Iland et al., (2000). Todas as análises foram realizadas em duplicata.

Determinação de Polifenóis por CLAE

Imediatamente antes das análises por cromatografia líquida de alta eficiência, 5 mL de cada

amostra foram filtradas em membrana de celulose com 0,20 µm de diâmetro. O equipamento

utilizado para análise consistiu de um sistema cromatográfico de gradiente líquido LC-DAD

Series 1100 (Palo Alto, CA), com sistema detector de Diode Array (DAD). Utilizaram-se uma

pré-coluna Zorbax 300 SB C18 (12 mm x 4,6 mm x 5 µm) e uma coluna C18-ODS (150 mm

x 4 mm x 5 µm) (Agilent Technologies, USA).

Análise de trans-resveratrol. Para a determinação de trans-resveratrol, utilizou-se uma

fase móvel composta pelos solventes água ultra-pura e acetonitrila (75:25 v/v) pH 3.0, a um

fluxo constante de 1.0 mL.min

-1

por 20 min em temperatura controlada a 20°C. O pico foi

detedtado em 306 nm, e o volume de amostra injetado foi 20 µL (Jeandet et al., 1995).

Análise de Antocianinas. Para a determinação de cianidina-3-glicosídeo, delfinidina-

3-glicosídeo, peonidina-3-glicosídeo e malvidina-3-glicosídeo, utilizou-se uma fase móvel

composta pelos solventes A, água ultra pura/ácido fórmico/acetonitrila (87:10:3 v/v/v) e B,

água ultra pura/ácido fórmico/acetonitrila (40:10:50 v/v/v), a um fluxo constante de 0.8

mL.min

-1

em temperatura controlada a 25 °C. O pico foi detectado a 518 nm e o volume de

amostra injetado foi 50 µL.

As condições de eluição foram: 50-60% (30 min), 60-100% (30

min) e 100-50% (10 min) (OIV, 2003).

Análise de procianidinas, (+)-catequina, (+)-epicatequina e ácido gálico. Para a

determinação das concentrações das procianidinas B

, B

e B

, (+)-catequina, (-)-

epicatequina e ácido gálico foi utilizada uma fase móvel composta pelo solvente A (50

mMol.L

-1

de difosfato de hidróxido de amônio pH 2,6), solvente B (20% de A e 80% de

acetonitrila) e pelo solvente C (0,2 Mol.L

-1

de ácido ortofosfórico pH 1,5), a um fluxo

constante de 0,5 mL.min

-1

em temperatura controlada a 40 °C. O pico foi detectado a 204 nm

e o volume de amostra injetado foi 5 µL. As condições de eluição foram: 100% de A por 5

min; 96% de A e 4% de B por 10 min; 92% de A e 8% de B por 10 min; 8% de B e 92% de C

por 20 min; 30% de B e 70% de C por 5 min; 40% de B e 60% de C por 5 min; 80% de B e

20% C por 5 min. e, 100% de A por 5 min. (Lamuela-Raventós & Waterhouse, 1994).

Análise da Composição Mineral por PIXE (Particle-Induced X-ray Emission)

A quantificação de metais em vinhos e espumantes foi realizada através da técnica de PIXE

(Johansson et al., 1995). Para tanto, 400 ml de cada amostra foram previamente secas em

estufa (Vulcan) e transformadas em pastilhas. Os ensaios foram conduzidos em um acelerador

3 MV Tandetron, utilizando-se um feixe de prótons (2 MeV) com uma corrente de 1 nA. O

tempo de análise para cada amostra oscilou em torno de 10 minutos e a mancha observada foi

da ordem de aproximadamente 2mm

. Cada pastilha foi posicionada na direção do feixe de

prótons através de um sistema eletro-mecânico. Os raios-X emitidos por indução do feixe de

prótons foram detectados através de um detector de Si(Li) (SLP series, EG&G Ortec, CA,

USA), com de resolução de 160 eV a 5,9 keV, posicionado a 135° em relação ao eixo X. O

procedimento de padronização baseou-se no manual de referência Standard Material 1515 -

NIST e a análise dos dados foi realizada através do código de GUPIX desenvolvido na

Universidade de Guelph (Maxwell et al., 1995).

Análise Estatística

Com exceção dos resultados obtidos por PIXE e por CLAE, os demais dados foram

analisados através dos testes Kruskal-Wallis H e correlação de Spearman (SPSS 12.0 for

Windows).

Resultados e Discussão

Análises Enológicas e Determinação de Polifenóis por Espectrofotometria UV

Os principais parâmetros enológicos dos vinhos base e seus respectivos espumantes são

mostrados na Tabela 2 e indicam que todos as amostras analisadas estão adequadas ao

previsto pela legislação brasileira (Brasil, 1999).

Após a segunda fermentação, observou-se maior graduação alcoólica, concentração de

açúcar e extrato seco em todos os espumantes analisados (Tabela 2). Estas modificações,

causadas pela ação das leveduras e adição de licor de tiragem, ocasionaram, obviamente,

alterações também nos níveis de extrato seco e extrato seco reduzido. A acidez total variou

significativamente após a segunda fermentação (Tabela 2), possivelmente em função das

técnicas de vinificação utilizadas e das interações entre gás carbônico, polifenóis e açúcar

(Boulton et al., 1995; Ribéreau-Gayon et al., 2003). Apesar das variações na acidez total, o

valor do pH mostrou-se praticamente constante em relação aos vinhos de origem (Tabela 2),

provavelmente devido aos sistemas tampão existentes nos vinhos (Boulton et al., 1995;

Dartiguenave et al., 2000). Os valores máximos permitidos pela legislação brasileira (Brasil,

1999) para acidez volátil e dióxido de enxofre são 1,2 g.L

-1

, em ácido acético, e 350 mg.L

-1

respectivamente. Valores abaixo do permitido para acidez volátil, SO

livre e SO

total foram

observados nos vinhos base e espumantes (Tabela 2), indicando a sanidade das uvas e a

utilização de boas práticas de vinificação (Boulton et al., 1995).

Tabela 2. Valores médios dos principais parâmetros enológicos dos vinhos base e espumantes analisados.

Amostras

Graduação

Alcoólica

± DP*

[%(v/v)]

Concentração

de Açúcar

± DP*

(g.L

-1

)

Extrato Seco

± DP*

(g.L

-1

)

Extrato Seco

Reduzido

± DP*

(g.L

-1

)

Acidez Total

± DP*

(mg.L

-1

ácido tartárico)

Acidez Volátil

± DP*

(mg.L

-1

ácido acético)

pH ± DP*

Livre

± DP*

(mg.L

-1

)

Total

± DP*

(mg.L

-1

)

Charmat Brut

Vinho base 1

10,78 ± 0,10

a**

1,09 ± 0,06

a**

21,35 ± 0,25

a**

21,30 ± 0,20

a**

7,77 ± 0,01

a**

0,525 ± 0,02 3,21 ± 0,33

15,50 ± 0,50

a**

56,00 ± 1,00

a**

Espumante 1

11,92 ± 0,03

5,48 ± 0,26

22,65 ± 0,25

18,20 ± 0,00

7,01 ± 0,01

0,555 ± 0,02 3,12 ± 0,10

14,50 ± 0,50

103,50 ± 0,50

Vinho base 2

11,08 ± 0,06

3,06 ± 0,06

17,75 ± 0,25

15,75 ± 0,25

7,00 ± 0,01

0,555 ± 0,02 3,45 ± 0,05

57,50 ± 0,50

135,50 ± 0,50

Espumante 2

11,93 ± 0,04

11,42 ± 0,08

26,95 ± 0,65

16,55 ± 0,75

7,62 ± 0,01

0,585 ± 0,02 3,18 ± 0,06

28,00 ± 1,00

144,50 ± 0,50

Charmat

Demi-sec

Vinho base 2

11,08 ± 0,06

3,06 ± 0,06

17,75 ± 0,25

15,75 ± 0,25

7,00 ± 0,01

0,555 ± 0,02 3,45 ± 0,05

57,50 ± 0,50

135,50 ± 0,50

Espumante 3

11,86 ± 0,05

37,49 ± 0,39

49,35 ± 0,75

12,85 ± 1,15

6,93 ± 0,01

0,615 ± 0,02 3,28 ± 0,04

34,50 ± 0,50

176,00 ± 1,00

Vinho base 4

10,73 ± 0,03

0,71 ± 0,02

16,95 ± 0,75

5,37 ± 0,01

0,252 ± 0,02 3,37 ± 0,03

14,50 ± 0,50

67,50 ± 1,50

Espumante 4

11,53 ± 0,04

36,40 ± 0,04

50,05 ± 0,65

13,59 ± 2,11

5,42 ± 0,02

0,525 ± 0,02 3,16 ± 0,04

15,50 ± 0,50

115,50 ± 0,50

Champenoise

Vinho base 5

11,49 ± 0,06

1,91 ± 0,06

19,30 ± 0,30

18,40 ± 0,20

5,50 ± 0,01

0,585 ± 0,02 3,33 ± 0,03

16,50 ± 0,50

53,50 ± 0,50

Espumante 5

12,62 ± 0,04

5,89 ± 0,19

25,55 ± 1,05

20,65 ± 1,25

6,11 ± 0,01

0,495 ± 0,02 3,39 ± 0,04

21,50 ± 0,50

119,50 ± 1,50

* Desvio Padrão; ** Letras distintas diferem significativamente pelo teste de Kruskal Wallis H (para p

≤

0,05);

O vinho base 2 foi utilizado na

elaboração dos vinhos espumantes 2 e 3.

O teor médio de vitamina C nos espumantes Charmat foi de 22,56 ± 4,53 mg.L

-1

(Tabela 3), sendo que o espumante Champenoise apresentou a maior concentração de ácido

ascórbico entre as amostras estudadas. Com exceção do vinho espumante 4, a concentração de

vitamina C aumentou após a segunda fermentação, o que pode ser atribuído à biossíntese

deste ácido pelas leveduras (Hancock et al., 2000) e/ou à adição de ácido ascórbico aos vinhos

espumantes (Marks & Morris, 1993). Correlação positiva foi observada entre a graduação

alcoólica e a concentração de ácido ascórbico (r = 0,530, p = 0,05) e entre os níveis de SO

total e este ácido (r = 0,610, p = 0,01).Observou-se, também, correlação positiva entre o

período de amadurecimento sobre as leveduras (sur lie) (Tabela 1) com os teores de extrato

seco (r = 0,446, p = 0,01) e com a graduação alcoólica (r = 0,513, p = 0,01) e correlação

negativa entre sur lie e acidez total (r = -0,486, p = 0,01), sugerindo a influência da levedura

na manutenção do equilíbrio necessário para o favorecimento da estabilidade e da

longevidade dos vinhos espumantes (Fleet, 1993).

A segunda fermentação e o método escolhido para a elaboração dos espumantes

exerceu influência, também, sobre o perfil fenólico e os teores de ácido ascórbico das

amostras estudadas. O espumante 5, elaborado através do método Champenoise, mostrou

aumento na concentração de polifenóis totais e flavonóides totais em relação ao vinho base de

origem. Ao contrário, a concentração destes compostos diminuiu nos espumantes Charmat

(tanto brut quanto demi-sec) em comparação aos seus respectivos vinhos base (Tabela 3). A

redução média nos níveis de polifenóis totais e de flavonóides totais observada nos vinhos

espumantes Charmat foi de 24,58 ± 0,72% e 57,19 ± 4,22%, respectivamente. A concentração

de hidroxicinamatos totais diminuiu após a segunda fermentação, independentemente do

método de elaboração (Tabela 3), provavelmente devido à ação das leveduras capazes de

Tabela 3. Valores médios da concentração de ácido ascórbico, polifenóis totais, flavonóides totais, hidroxicinamatos totais e pressão nas amostras

analisadas.

Amostras

Ácido Ascórbico

± DP*

(mg.L

-1

)

Polifenóis Totais

± DP*

(mg.L

-1

de catequina)

Flavonóides Totais

± DP*

(mg.L

-1

de catequina)

Hidroxicinamatos Totais

± DP*

(mg.L

-1

de ácido caféico)

Pressão

± DP*

(atm)

Charmat Brut

Vinho base 1

17,30 ± 0,03

a**

226,56 ± 0,00

a**

73,20 ± 0,00

a**

30,67 ± 0,00

a**

Espumante 1

21,90 ± 0,01

185,08 ± 7,13

52,25 ± 4,19

26,61 ± 0,61

5,70 ± 0,10

Vinho base 2

24,10 ± 0,01

240,38 ± 0,42

50,99 ± 0,42

38,00 ± 0,00

Espumante 2

28,90 ± 0,03

163,70 ± 4,19

6,16 ± 1,68

31,50 ± 0,50

5,60 ± 0,10

Charmat Demi-sec

Vinho base 2

24,10 ± 0,01

240,38 ± 0,42

50,99 ± 0,42

38,00 ± 0,00

Espumante 3

29,00 ± 0,03

185,49 ± 0,84

15,38 ± 1,68

34,16 ± 0,16

5,60 ± 0,10

Vinho base 4

18,00 ± 0,04

288,15 ± 9,64

73,20 ± 6,71

43,05 ± 0,061

Espumante 4

15,70 ± 0,03

216,92 ± 0,42

32,55 ± 0,42

36,94 ± 0,05

5,90 ± 0,10

Champenoise

Vinho base 5

24,00 ± 0,02

286,90 ± 2.52

119,29 ± 0,00

33,55 ± 0,55

Espumante 5

46,50 ± 0,03

374,89 ± 0.84

216,08 ± 0,42

31,78 ± 0,11

5,70 ± 0,10

* Desvio Padrão; ** Letras distintas diferem significativamente pelo teste de Kruskal Wallis H (para p

≤

0,05);

O vinho base 2 foi utilizado na

elaboração dos vinhos espumantes 2 e 3.

metabolizar e/ou adsorver até 20% do teor destes compostos (Zoecklein et al., 2000;

Ribéreau-Gayon et al., 2003).

O vinho espumante 2 (Charmat brut) apresentou menores concentrações de polifenóis

totais, flavonóides totais e hidroxicinamatos totais quando comparado ao vinho espumante 3

(Charmat demi-sec), ambos obtidos a partir do vinho base n° 2 (Tabela 3). Espumantes demi-

sec são elaborados para apresentar teores mais elevados de acidez total, favorecendo desta

maneira a oxidação de compostos fenólicos por metais, principalmente ferro (Lopez-Toledano

et al., 2002), metal presente em maior concentração no vinho espumante 2. Correlação

negativa foi observada entre acidez total e polifenóis totais (r = -0,485, p = 0,05), acidez total

e flavonóides totais (r = -0,527, p = 0,05), acidez volátil e polifenóis totais (r = -0,513, p =

0,05) e acidez volátil e hidroxicinamatos totais (r = -0,575, p = 0,01);

Determinação de Polifenóis por CLAE

A segunda fermentação dos vinhos base ocasionou aumento na concentração de ácido gálico

nos espumantes brut, provavelmente, devido à hidrólise de procianidinas esterificadas com

este ácido (Stevens et al., 2002; Jordão, 2000). Nos espumantes demi-sec, este tipo de reação

parece ser desfavorecida, provavelmente em razão da presença de açúcar (Tabela 4).

Os teores de trans-resveratrol apresentaram-se diminuídos nos espumantes Charmat

(tanto brut quanto demi-sec), em comparação aos vinhos de origem, provavelmente devido às

etapas de acabamento como clarificação e ou filtração (Vrhovsek et al., 1997; Threlfall et al.,

1999). A amostra 5, elaborada pelo método Champenoise, mostrou, no entanto, teor mais

elevado deste composto do que seu vinho base (Tabela 4). Tanto a fermentação malolática

(Pezet & Cuenat, 1996) quanto a ação de leveduras com superexpressão da enzima β-

glicosidase (Vrhovsek et al., 1997) podem aumentar a concentração de trans-resveratrol em

vinhos. O espumante 5 foi obtido com o maior tempo sur lie em relação às demais amostras

(Tabela 1). Observou-se correlação positiva entre a concentração de trans-resveratrol e o

período de sur lie (r = 0,456, p = 0,05), sugerindo a interferência do tempo de contato entre as

leveduras e os espumantes na concentração de trans-resveratrol.

Tabela 4. Compostos fenólicos identificados por CLAE nos vinhos base e nos seus

respectivos espumantes.

Polifenóis (mg.L

-1

)

Amostras

Ácido Gálico

trans -

Resveratrol

(+) -

Catequina

(-) -

Epicatequina

Procianidina

Charmat Brut

0,533 0,352 0,717 0,172 2,580 0,587 1,660 0,377

Vinho base 1

Espumante 1

2,980 0,196 1,697 0,792 0,258 0,026 1,190 0,144

1,370 0,135 2,760 0,850 2,180 0,240 3,820 0,490

Vinho base 2

Espumante 2

3,550 0,082 2,732 3,108 0,202 0,470 1,199 0,146

Charmat

Demi-sec

1,370 0,135 2,760 0,850 2,180 0,240 3,820 0,490

Vinho base 2

Espumante 3

1,400 0,091 2,439 0,732 0,784 0,178 1,427 0,575

0,760 0,229 1,142 0,221 2,763 1,294 0,531 0,608

Vinho base 4

Espumante 4

0,740 0,138 1,240 0,188 3,166 1,215 0,364 0,540

Champenoise

0,590 0,089 1,930 0,210 2,520 0,360 1,820 0,050

Vinho base 5

Espumante 5

1,370 0,306 0,840 0,850 2,180 0,240 3,820 0,490

O vinho base 2 foi utilizado na elaboração dos vinhos espumantes 2 e 3.

Nos espumantes Charmat, a concentração de (+)-catequina após a segunda

fermentação apresentou-se maior nos espumantes blanc de noir e menor nos obtidos a partir

do vinho base 2 (blanc de blancs). O espumante 5 (Champenoise) mostrou diminuição no teor

(+)-catequina em relação ao seu vinho base (Tabela 4). Sabe-se que a escolha dos varietais

(Pozo-Bayón et al., 2003) e das técnicas de vinificação (Boulton et al., 1995; Flanzy, 2003;

Ribéreau-Gayon et al., 2003; Mazauric & Salmon, 2005) podem interferir na composição

fenólica final de vinhos e espumantes. Além disso, como discutido anteriomente, há uma

estreita relação entre concentração de açúcar, graduação alcoólica, extrato seco e extrato seco

reduzido e o perfil fenólico dos vinhos espumantes. Observou-se correlação negativa entre o

teor de extrato seco reduzido e a concentração de (+)-catequina (r = -0,619, p = 0,01).

A (-)-epicatequina apresentou maior concentração nos espumantes brut (Charmat ou

Champenoise) do que os seus respectivos vinhos base (Tabela 4). Por outro lado, observou-se

uma pequena queda na concentração de (-)-epicatequina nos espumantes demi-sec, em relação

aos seus respectivos vinhos base, sugerindo, novamente, a interferência da concentração de

açúcar na composição fenólica.

De forma geral, as procianidinas B

, B

e B

tiveram suas concentrações

diminuídas após a segunda fermentação (Tabela 4). É possível que, à semelhança do

observado em vinhos tintos, esta diminuiçào seja devida, provavelmente, às reações de

condensação como, por exemplo, das procianidinas com proteínas e polissacarídeos, às

reações de polimerização entre as diferentes procianidinas e/ou com as suas unidades

precursoras flavan-3-ol e aos fenômenos de degradação oxidativa (Lopez-Toledano et al.,

2002; Ribéreau-Gayón et al., 2003). Estas interações podem sofrer a influência das diferentes

técnicas adotadas durante o processo de elaboração/amadurecimento (Boulton et al., 1995;

Flanzy, 2003; Ribéreau-Gayón et al., 2003; Mazauric & Salmon, 2005), explicando, ao menos

parcialmente, as diferenças encontradas.

Análise da Composição Mineral por PIXE

As concentrações dos dezoito metais identificados nas amostras de vinhos espumantes e em

seus respectivos vinhos base são apresentadas na Tabela 5. Os metais mais abundantes nos

Tabela 5. Teor de metais determinado nas diferentes amostras de vinhos base e espumantes através da técnica de PIXE.

Metais (mg.L

-1

)

Amostras

K Ca Mg Cu Zn Al S Mn Br Ni Cl Ti Si Cr Rb Fe P Sr

Charmat Brut

Vinho base 1 839,4 237,7 125,1 3,0 29,7

67,6 28,3 55,2 nd*

1,8 47,3

4,6 17,7

3,7 10,3

21,9 49,9 9,2

Espumante 1 622,8 106,4 103,3 1,4 5,8 48,7 19,6 6,8 nd nd

31,2

3,9 14,5

3,5 7,7 17,0 38,4 9,5

Vinho base 2 791,6 177,8 113,5 1,8 23,2

56,5 25,9 47,8 4,0 nd 39,4

24,4

15,4

nd 10,1

15,1 45,1 9,7

Espumante 2 537,5 115,4 109,9 1,5 19,5

nd 21,2 2,2 5,1 nd 33,0

3,5 14,2

2,7 5,4 14,1 43,2 nd

Charmat

Demi-sec

Vinho base 2

791,6 177,8 113,5 1,8 23,2

56,5 25,9 47,8 4,0 nd 39,4

24,4

15,4

nd 5,4 15,1 45,1 9,7

Espumante 3 357,0 89,8 94,8 1,5 19,2

nd 17,7 1,9 4,0 nd 26,2

nd 11,9

1,3 6,3 8,3 34,9 nd

Vinho base 4 887,6 256,0 135,1 2,8 28,6

73,3 32,1 55,2 nd 1,3 50,6

4,2 19,3

3,6 7,8 5,7 53,3 9,6

Espumante 4 489,6 87,6 97,8 1,5 18,4

nd 20,0 34,1 4,0 nd 27,1

2,7 12,3

nd 9,2 7,8 34,2 nd

Champenoise

Vinho base 5

1046,6 178,4 140,1 1,9 37,2

64,9 25,2 4,3 6,3 nd 43,3

5,2 18,1

3,9 14,9

24,9 53,3 nd

Espumante 5

728,8 134,5 119,1 nd 20,2

nd 20,4 2,7 4,6 1,8 35,7

3,7 14,9

nd 6,8 17,5 45,3 nd

* não detectado;

O vinho base 2 foi utilizado na elaboração dos vinhos espumantes 2 e 3.

vinhos base e espumantes analisados foram potássio, cálcio e magnésio, considerados

majoritários em vinhos (Ribéreau-Gayón et al., 2003; Rizzon, 2005). Não foi identificada a

presença de chumbo nas amostras ensaiadas, ao contrário do observado em espumantes

europeus e australianos (Chen et al., 1994; Moreno et al., 2004). Até o momento, não

existem relatos sobre a presença de S, Br, Cl, Ti, Si, Cr e Rb em vinhos espumantes, como

observado neste trabalho. Em relação aos demais metais, os teores encontrados foram

superiores aos identificados em Cavas, Champagnes e espumantes australianos elaborados

pelo método Champenoise (Chen et al., 1994; Moreno et al., 2004).

Com exceção de cromo, ferro, níquel, bromo, rubídio e estrôncio, os teores dos demais

metais diminuíram após a após a segunda fermentação em todos os espumantes analisados

(Tabela 5). Embora outros estudos sejam necessários, sabe-se que alguns metais são utilizados

ou adsorvidos pelas leveduras (Ribéreau-Gayón et al., 2003). Além disso, cobre, zinco, níquel

e ferro podem ser precipitados durante a segunda fermentação e/ou nos tratamentos de

estabilização dos vinhos espumantes (Goristein et al., 1984; Flanzy, 2003; Ribéreau-Gayón et

al., 2003) ou, ainda, serem quelados por compostos fenólicos (Wapnir, 1998; Franke et al.,

2004; Lopez-Toledano et al., 2002; Stevens et al., 2002). Com exceção, dos teores de bromo,

níquel, titânio, cromo e ferro, observou-se correlação negativa entre a concentração de ácido

gálico e os teores dos demais metais analisados. Trans-resveratrol e bromo, (+)-catequina e

níquel, (+)-catequina e rubídio, (-)-epicatequina e cromo, (-)-epicatequina e cobre, (-)-

epicatequina e rubídio e, procianidina B

e ferro, também apresentaram correlação negativa

entre si (dados não mostrados).

Após a segunda fermentação, observou-se aumento na concentração (ferro, bromo,

rubídio e estrôncio) ou o aparecimento de traços (cromo, níquel e bromo) de alguns metais.

Este fato deve-se, possivelmente, à contaminação com produtos enológicos e/ou ao contato

com filtros e materiais utilizados durante a elaboração dos espumantes conforme relatado por

Almeida & Vasconcelos, 2003; Monaci et al., 2003; Ribéreau-Gayón et al., 2003; Thiel et al.,

2004.

À exceção de bromo, rubídio e ferro, a concentração de todos os demais metais

mostrou correlação negativa com os teores de açúcar (dados não mostrados), indicando a

influência da concentração de açúcar no perfil mineral dos vinhos espumantes. Em geral, os

teores de metais diminuíram (Tabela 5) em função do aumento da graduação alcoólica,

extrato seco, acidez total e dióxido de enxofre (Tabela 2). Correlações negativas entre estes

parâmetros e diversos metais foram encontradas (dados não mostrados).

Observou-se, ainda, correlação negativa entre o período de sur lie (Tabela 1) e a

concentração de cobre (r = -0,765, p = 0,01), zinco (r = -0,591, p = 0,01) e enxofre (r = -

0,546, p = 0,05). Sabe-se que cobre e zinco podem ser utilizados pelas leveduras como co-

fatores em rotas metabólicas (Eide & Guerinot, 1997; Ribéreau-Gayón et al., 2003) e o

enxofre pode ser consumido pelas células em situações de estresse nutricional (Ribéreau-

Gayón et al., 2003). Correlação negativa foi observada, ainda, entre o período de sur lie e a

concentração de alumínio (r = -0,502, p = 0,05), o qual pode participar da regulação da

expressão gênica de determinadas proteínas envolvidas no processo de assimilação de

magnésio (Piña & Cervantes, 1996). É interessante salientar que os níveis de magnésio

diminuíram nos vinhos espumantes após a segunda fermentação (Tabela 5).

A atividade quelante do cobre pela vitamina C já foi demonstrada (Wapnir, 1998;

Halliwell, 2001; Linder, 2001; Baker et al., 2001; Franke et al., 2005).

Observou-se

correlação negativa entre os teores de ácido ascórbico e a concentração de cobre (r = -0,815, p

= 0,05) e manganês (r = -0,716, p = 0,01).

Em resumo, os dados obtido neste trabalho mostram, pela primeira vez, as alterações

no perfil fenólico e mineral decorrentes da segunda fermentação em vinhos espumantes

Charmat e Champenoise. Embora outros estudos sejam necessários, demonstrou-se que a

influência das características enológicas, principalmente os níveis de acidez, dióxido de

enxofre, açúcar e sur lie podem interferir na composição fenólica e mineral dos vinhos

espumantes. Interações entre compostos fenólicos e metais são importantes do ponto de vista

enológico (estabilidade e qualidade geral) e biológico. Alguns íons metálicos podem atuar

como co-fatores em diversas rotas metabólicas (Eide & Guerinot, 1997; Kern et al., 2005), no

entanto, dependendo de sua concentração, podem contribuir com a geração de espécies

reativas tóxicas ao organismo (Halliwel & Gutteridge, 1999). O perfil mineral característico

encontrado nos vinhos estudados neste trabalho pode contribuir, ainda, na indicação de

procedência destes vinhos.

Agradecimentos

CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior),

Universidade de Caxias do Sul, LABRAN (Laboratório Randon Ltda), ABE (Associação

Brasileira de Enologia), Möet Henessy do Brasil – Vinhos e Destilados Ltda, Casa Valduga

Ltda, Cave de Amadeu Ltda, Cooperativa Vinícola Aurora Ltda, Estabelecimento Vinícola

Armando Peterlongo Ltda, Vinhos Salton S/A e Vinícola Monte Lemos Ltda.

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3.3. Considerações gerais e perspectivas

A superfície territorial com cultivo da videira no País atinge cerca de 30.000 ha, sendo

que sua cadeia produtiva (incluindo vinhos e derivados) compreende aproximadamente 600

vinícolas e é responsável pelo sustento de mais de 16.000 famílias e outros milhares de

empregos diretos e indiretos (IBRAVIN, 2005). A elaboração de vinhos espumantes é uma

das áreas de maior destaque na Serra Gaúcha, com padrão de qualidade internacional que vem

ganhando espaço e notoriedade mundial, com um consumo aproximado de cinco milhões de

litros por ano (UVIBRA, 2005). Em 2004, os produtos obtidos a partir dos métodos Charmat

e Champenoise representaram 77% do mercado deste tipo de vinho (Miolo, 2005). O

surgimento de outras áreas vitivinícolas no Brasil aumenta, ainda mais, a importância de

pesquisas que favoreçam o constante aprimoramento das técnicas envolvidas no processo de

elaboração, bem como o entendimento dos prováveis benefícios aportado à saúde pelo

consumo moderado de vinhos espumantes.

O perfil enológico e mineral dos espumantes têm um importante papel, tanto do ponto

de vista enológico (estabilidade/qualidade geral) quanto do biológico (Goristein et al., 1984;

Ribéreau-Gayon et al., 2003; Jos et al., 2004). Os compostos fenólicos apresentam

reconhecida atividade antioxidante, capaz de contribuir na prevenção de inúmeras patologias,

inclusive aterosclerose e câncer (Eng et al., 2003; Da Luz & Coimbra, 2004). Embora muitos

minerais sejam essenciais ao homem, quando em excesso, podem formar espécies reativas,

incluindo OH

•

, para qual o organismo humano não possui defesas antioxidantes (Eide &

Guerinot, 1997; Halliwell & Gutteridge, 1999; Kern et al., 2005).

De modo geral, os espumantes Charmat apresentaram maior atividade antioxidante do

que os espumantes Champenoise. Após a segunda fermentação, a atividade antioxidante

aumenta e curiosamente, observa-se uma significativa redução de polifenóis totais e de

flavonóides totais, tanto nos espumantes Charmat brut quanto nos demi-sec. Isto reforça a

hipótese já relatada por outros autores, de que o efeito benéfico atribuído aos polifenóis

presentes nos vinhos, é, na verdade, resultado das interações e do sinergismo entre eles,

aquém de sua concentração (Roig et al., 2002). Ainda dentro deste contexto, observou-se que

os espumantes tintos/rosé, com maior concentração de compostos fenólicos, não apresentaram

maior atividade antioxidante (apesar do reduzido número amostrado) do que os espumantes

brancos, como se poderia esperar. Portanto, torna-se necessário um número maior de estudos

com o objetivo de esclarecer estes aspectos.

As uvas, em geral, apresentam baixas concentrações de ácido L-ascórbico, devido à

clivagem da molécula deste ácido, originando os ácidos tartárico e oxálico durante o período

de maturação (Barata-Soares et al., 2004). Como as uvas para a elaboração de espumantes são

colhidas um pouco antes da sua maturação plena (Mevél, 2005), não é surpreendente que os

vinhos base tenham apresentado maiores concentrações de ácido L-ascórbico do que vinhos

não destinados à elaboração de espumantes. Após a segunda fermentação, os espumantes

apresentaram um aumento na concentração de ácido L-ascórbico, podendo-se atribuir este

fato à biossíntese deste ácido pelas leveduras (Hancock et al., 2000) e/ou à adição do mesmo

aos espumantes (Marks & Morris, 1993). Uma maior concentração de vitamina C nos vinhos

espumantes poderia ser uma alternativa interessante, desde que utilizada de forma racional,

para reduzir a dose de utilização do dióxido de enxofre, realçar o frescor e, provavelmente,

aumentar a capacidade antioxidante destes vinhos. Para que ocorra a biossíntese de ácido L-

ascórbico por leveduras, a presença de galactose no meio é requerida. Leveduras modificadas

geneticamente para biossintetizar ácido L-ascórbico a partir de glicose ou para aumentar a

produção deste ácido a partir de galactose poderiam ser obtidas, levando-se sempre em

consideração as características enológicas de cada cepa.

Entre os diversos fatores avaliados neste estudo, pode-se observar que quanto maior o

período de amadurecimento sobre as leveduras (sur lie), menor a capacidade antioxidante dos

espumantes ensaiados. Esta técnica pode ser considerada a principal diferença entre os dois

métodos de elaboração de vinhos espumantes (Mevél, 2005), já que os espumantes Charmat,

em geral, são obtidos com um sur lie mais curto. Em vista disso, torna-se importante avaliar o

período “ideal” de amadurecimento nos espumantes Champenoise, para que se obtenha uma

considerável atividade antioxidante e se mantenham as características sensoriais mais

apreciadas neste tipo de produto.

A maior concentração de açúcar nos espumantes demi-sec diminuiu sua capacidade

antioxidante em relação aos seus respectivos pares brut. Entretanto, existe um vasto mercado

para vinhos e espumantes suaves (doces) no Brasil. Logo, é importante que se determine a

partir de qual concentração de açúcar a atividade antioxidante começa a diminuir, sem deixar

de contrabalançar com as características exigidas pelo mercado consumidor.

As três principais uvas utilizadas na elaboração de espumantes no Brasil são a Riesling

Itálico, a Chardonnay e a Pinot Noir. Observou-se que a uva e/ou o assemblage escolhido

também influenciou na capacidade antioxidante (para mais ou para menos) dos vinhos

espumantes estudados, a exemplo do relatado em Cavas (Satué-Gracia et al., 1999). Portanto,

em estudos posteriores, uma amostragem maior de espumantes varietais (apenas uma uva) e

variaçãoes específicas nos assemblages poderiam ser testadas em relação à atividade

antioxidante. Isto poderia ser útil para incentivar o cultivo de determinadas variedades, em

detrimento de outras, favorecendo a estruturação do setor, com uma visão de longo prazo.

A segunda fermentação e o método de elaboração influenciaram na concentração de

ácido gálico, trans-resveratrol, (+)-catequina, (-)-epicatequina e procianidinas B

, B

e B

dos vinhos espumantes ensaiados. O ácido gálico foi o composto majoritário nas amostras

ensaiadas, sendo que sua concentração foi maior que a encontrada em espumantes espanhóis

elaborados pelo método Champenoise (Satué-Gracia et al., 1999; Ibern-Gómez, et al., 2000;

Pozo-Bayón et al., 2003). O fato de este ácido ser considerado um bom antioxidante (Yilmaz

& Toledo, 2004) torna importante o resultado obtido, tanto do ponto de vista farmacológico

quanto do comercial. O trans-resveratrol é um dos compostos fenólicos mais estudados nos

dias atuais, com propriedades antioxidantes e antitumorais relatadas por diversos autores (Eng

et al., 2003; Soares et al., 2003; Yilmaz & Toledo, 2004). As diferenças encontradas na

concentração de trans-resveratrol entre os espumantes Charmat e Champenoise tornam

relevante a realização de mais pesquisas que permitam inferir sobre o uso de tecnologias que

visem a obtenção e/ou a preservação deste composto nos vinhos espumantes. As correlações

positivas encontradas no presente trabalho entre o período de sur lie e a concentração de

trans-resveratrol, bem como entre a concentração deste composto e a atividade antioxidante in

vivo, reforçam esta idéia.

Apesar das diferenças pontuais inerentes ao tipo de produto ensaiado, quantidades

significativas de procianidinas B

, B

e B

, bem como de suas unidades monoméricas (+)-

catequina e (-)-epicatequina foram observadas. Estes compostos também são considerados

bons antioxidantes (Roig et al., 2002; Yilmaz & Toledo, 2004), sendo esta a primeira vez em

que foi relatada a presença das procianidinas B

, B

e B

em vinhos espumantes. A interação

entre estes compostos (polimerizações e/ou clivagens) poderia, no futuro, ser explicada

através de testes que utilizem a técnica de marcação isotópica.

Apesar de as características enológicas não terem sido o foco principal deste estudo,

observou-se que os níveis de acidez, dióxido de enxofre, período de sur lie e concentração de

açúcar, principalmente, influenciaram na composição fenólica dos vinhos espumantes

avaliados. Além dos aspectos já discutidos sobre sur lie e também sobre a concentração de

açúcar pode-se dizer que, para a elaboração de vinhos espumantes, o parâmetro acidez é um

dos mais importantes por ser o responsável pelo equilíbrio entre estrutura, sabor e aroma.

Verificou-se que teores elevados de acidez podem influenciar negativamente a atividade

antioxidante dos vinhos espumantes; logo, torna-se útil investigar como isto ocorre e a partir

de que concentração haveria prejuízos sensoriais ou biológicos. O uso racional e cada vez

menor de conservantes em alimentos e bebidas está sendo recomendado no mundo inteiro,

devido aos seus efeitos potenciais à saúde (Boulton et al., 1995). A fração livre (SO

ativo)

de dióxido de enxofre, que é a realmente importante do ponto de vista enológico (Boulton et

al., 1995; Fleet, 1993), interferiu positivamente na atividade antioxidante dos vinhos

espumantes, enquanto que o SO

total exerceu papel negativo. Portanto, iniciativas para que,

tanto produtores de uva (responsáveis diretos pela qualidade e sanidade das uvas) quanto

empresários (compromisso social) e enólogos (responsáveis técnicos pelos produtos) sejam

conscientizados da importância deste fator, são realmente necessárias.

Observou-se, no artigo 2, um perfil mineral semelhante nos vinhos base amostrados. É

possível que, ao aumentar-se o grupo amostrado, separando-o por regiões produtoras das

uvas, seja possível utilizar os resultados como coadjuvantes em processos de indicação de

procedência almejados pelo setor como, por exemplo, Vale dos Vinhedos e Pinto Bandeira,

entre outros. A técnica de PIXE é altamente sensível (Maxwel et al., 1995; Kertész et al.,

2005) e pode ser recomendada para esta finalidade. Como esperado, os teores de metais

mostraram-se diminuídos após a segunda fermentação, independentemente do método de

elaboração. Entretanto, é provável que a presença de compostos fenólicos e de ácido L-

ascórbico, além de parâmetros enológicos (principalmente teores de açúcar, acidez e dióxido

de enxofre) e provavelmente as técnicas de vinificação (filtração, estabilização tartárica,

clarificação, etc), influencie na composição mineral dos vinhos espumantes, demonstrando

mais uma vez que muitos aspectos ainda não estão claramente elucidados.

Em resumo, este trabalho abre novas perspectivas de estudo em vinhos espumantes,

visando, principalmente, avaliar o papel benéfico à saúde decorrente do seu consumo

moderado e o conseqüente aumento no valor agregado deste produto. Além disso, é possível

definir as melhores técnicas enológicas necessárias para a elaboração de vinhos espumantes

com características específicas. Avaliações da capacidade antioxidante de indivíduos

suplementados com vinhos espumantes, bem como o estudo de possíveis efeitos mutagênicos

e/ou antimutagênicos destes produtos também poderiam ser realizados.

4. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que os vinhos espumantes

elaborados pelos métodos Charmat (brut e/ou demi-sec) ou Champenoise apresentaram

importante atividade antioxidante, tanto nos ensaios in vitro e in vivo. A segunda fermentação

modificou o perfil fenólico e mineral e aumentou a atividade antioxidante dos vinhos

espumantes estudados.

Especificamente, podem ser listadas as seguintes conclusões:

• Vinhos espumantes Charmat brut, elaborados pela mesma vinícola a partir do mesmo

vinho base, apresentaram maior atividade antioxidante que os seus respectivos pares

Charmat demi-sec e Champenoise;

• O tipo de uva e/ou o assemblage escolhido (blanc de blancs ou blanc de noirs)

influencia na capacidade antioxidante dos vinhos espumantes;

• Após a segunda fermentação, observou-se uma significativa redução de polifenóis

totais e flavonóides totais nos espumantes Charmat e aumento na concentração destes

compostos nos espumantes Champenoise;

• Obsevou-se uma significativa diminuição na concentração de hidroxicinamatos totais

e, em geral, na de metais, após a segunda fermentação dos vinhos base;

• A segunda fermentação e o método de elaboração influenciam na concentração de

ácido gálico, trans-resveratrol, (+)-catequina, (-)-epicatequina e procianidinas B

, B

e B

dos vinhos espumantes;

• Características enológicas, principalmente níveis de acidez, dióxido de enxofre,

período de sur lie e concentração de açúcar, influenciam nos perfis fenólico e mineral

e na atividade antioxidante dos vinhos espumantes.

5. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR

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. 5 ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS / Editora da UFSC,

1102 p.

ANEXO I

Tabela I.1. Teor de Metais Determinado nas Diferentes Amostras de Vinhos Espumantes Através da Técnica de PIXE.

Metais (mg.L

-1

)

Nº

Amostras

K Ca Mg Cu Zn Al S Mn

Br Ni Cl Ti Si Cr Rb Fe P Sr

Charmat Brut

40% PN, 60% CH

614,2 134,0 113,3 1,7 29,3

53,1 9,2 3,0 5,8 1,4 33,4

20,4

15,6 1,9 8,6 23,8 50,5 nd*

60% PN, 40% CH

622,8 106,4 103,3 1,4 26,8

48,7 19,6

6,8 nd nd 31,2

3,9 14,5 3,5 7,7 17,0 38,4 9,5

50% RI, 30% SE, 20% MB

537,5 115,4 109,9 1,5 19,5

nd 21,2

2,2 5,1 nd 33,0

3,5 14,2 2,7 10,1 14,1 43,2 nd

50% RI, 33% PN, 17% CH

679,5 124,6 106,7 1,8 20,6

52,0 24,1

34,9

nd nd 34,3

nd 15,0 nd 7,9 15,9 43,2 nd

30% IR, 70% CH

571,0 143,3 113,2 2,7 25,8

53,0 24,4

5,4 nd 1,8 36,0

21,4

14,4 2,3 8,1 15,1 42,6 nd

100% CH

535,6 115,2 104,6 1,3 24,7

49,8 14,6

2,2 nd 1,6 32,2

nd 14,5 2,4 9,9 11,8 47,4 nd

40% RI, 10% ME, 50% CS

617,0 135,0 107,1 1,6 26,1

52,2 20,6

3,9 nd 1,6 32,1

3,9 14,9 2,0 11,5 15,4 43,2 nd

Champenoise

40% PN, 60% CH

741,0 139,8 122,1 1,8 29,0

nd 21,1

2,4 4,2 1,7 36,8

1,8 15,0 2,9 7,3 15,1 44,7 nd

100% PR

683,0 143,2 112,7 nd 23,2

51,7 20,8

1,9 nd nd 33,7

22,7

14,6 nd 7,5 21,0 43,3 nd

100% CH

641,1 112,6 111,4 1,5 24,0

47,5 16,3

65,7

nd nd 30,3

3,7 13,6 1,9 5,1 18,9 42,3 nd

20% PN, 80% CH

731,0 159,5 121,9 1,5 23,5

54,8 17,8

2,1 5,0 nd 36,4

nd 15,6 nd 8,8 12,3 49,7 nd

10% CH, 60% ME, 30% PN

640,3 184,0 119,5 1,7 5,6 nd 25,5

2,8 nd nd 39,1

3,8 15,2 nd 8,9 15,7 44,6 9,7

50% PN, 50% CH

712,6 173,1 120,3 1,8 20,7

56,4 25,5

47,3

3,8 1,8 38,3

22,8

15,1 3,1 10,9 17,0 45,7 nd

20% PN, 80% CH

730,8 134,5 119,1 nd 20,2

nd 20,4

2,7 4,6 1,8 35,7

3,7 14,9 nd 6,8 17,5 45,3 nd

Charmat Demi-sec

50% RI, 30% SE, 20% MB

357,0 89,8 94,8 1,5 19,2

nd 17,7

1,9 nd nd 26,2

nd 11,9 1,3 6,3 8,3 34,9 nd

30% IR, 70% CH

403,7 101,0 100,0 nd 21,5

44,5 20,9

2,0 nd 1,3 28,9

2,1 12,4 nd 8,3 12,8 37,7 nd

100% CH

289,9 81,2 88,6 nd 17,9

40,1 18,7

1,5 nd nd 25,5

nd 11,5 nd nd 9,4 34,1 nd

56% MaB, 25% MaC,

10% MoC, 9% MA

447,0 75,8 96,0 1,6 23,3

nd 19,0

25,7

nd nd 25,6

3,3 12,5 nd 6,1 12,0 35,8 nd

74% RI, 14% PN, 12% CH

489,6 87,6 97,8 1,5 18,4

nd 20,0

34,1

4,0 nd 27,1

2,7 12,3 nd 9,2 7,8 34,2 nd

Legenda: Pinot Noir (PN), Chardonnay (CH), Riesling Itálico (RI), Semillon (SE), Moscato Bianco (MB), Merlot (ME), Cabernet Sauvignon (CS), Prosecco

(PR), Malvasia Bianca (MaB), Malvasia de Cândia (MaC), Moscato Canelli (MoC), Moscato de Alexandria (MA); * não detectado.

ANEXO II

Tabela II.1. Valores médios de IC

para os diferentes vinhos base e espumantes analisados.

N°

Amostras

± DP* (%)

Charmat Brut

Pinot Noir (40%) e Chardonnay (60%)

11,80 ± 1,28

a**

Pinot Noir (60%) e Chardonnay (40%)

13,03 ±

±±

± 1,19

Riesling Itálico (50%), Semillon (30%) e Moscato (20%)

1,83 ±

±±

± 0,49

Riesling Itálico (50%), Pinot Noir (33%) e Chardonnay (17%)

80,76 ± 2,75

Riesling Itálico (30%) e Chardonnay (70%)

20,76 ± 5,12

Chardonnay (100%)

25,26 ± 0,32

Riesling Itálico (40%), Merlot (10%) e Cabernet Sauvignon (50%)

31,50 ± 0,42

Champenoise

Pinot Noir (40%) e Chardonnay (60%)

9,05 ± 1,04

Prosseco (100%)

19,63 ± 0,63

Chardonnay (100%)

30,83 ± 2,01

Pinot Noir (20%) e Chardonnay (80%)

11,09 ± 1,81

Chardonnay (10%), Merlot (60%) e Pinot Noir (30%)

32,83 ± 0,13

Pinot Noir (50%) e Chardonnay (50%)

16,77 ± 0,54

Pinot Noir (20%) e Chardonnay (80%)

39,53 ±

±±

± 1,53

Charmat Demi-sec

Riesling Itálico (50%), Semillon (30%) e Moscato (20%)

26,87 ±

±±

± 0,58

Riesling Itálico (30%) e Chardonnay (70%)

32,56 ± 0,43

Chardonnay (100%)

25,04 ± 0,13

Malvasia Bianca (56%), Malvasia de Cândia (25%), Moscato Canelli (10%) e Moscato de Alexandria (9%)

23,73 ± 0,57

Riesling Itálico (74%), Chardonnay (14%) e Pinot Noir (12%)

26,10 ±

±±

± 1,93

Vinho Base

Pinot Noir (60%) e Chardonnay (40%) (base da amostra 2)

47,31 ±

±±

± 4,06

Riesling Itálico (50%), Semillon (30%) e Moscato (20%) (base das amostras 3 e 15)

32,17 ±

±±

± 2,72

22 Riesling Itálico (74%), Chardonnay (14%) e Pinot Noir (12%) (base da amostra 19)

35,41 ±

±±

± 4,17

23 Pinot Noir (20%) e Chardonnay (80%) (base da amostra 14)

39,72 ±

±±

± 7,18

* Desvio Padrão; ** Letras distintas diferem significativamente pelo teste de

Kruskal Wallis H

(para

≤

0,05).

Tabela II.2. Valores médios de sobrevivência da levedura Saccharomyces cerevisiae tratada com peróxido de hidrogênio 75mM em

presença e ausência dos diferentes vinhos base e espumantes.

Nº Tratamentos

Sobrevivência ± DP*

(%)

Charmat Brut

1 Pinot Noir (40%) e Chardonnay (60%) +H

93,55 ± 0,25

Pinot Noir (60%) e Chardonnay (40%) +H

93,65 ±

±±

± 4,75

Riesling Itálico (50%), Semillon (30%) e Moscato (20%) +H

96,90 ±

±±

± 3,10

Riesling Itálico (50%), Pinot Noir (33%) e Chardonnay (17%) +H

100,00 ± 0,00

Riesling Itálico (30%) e Chardonnay (70%) +H

78,70 ± 3,70

Chardonnay (100%) +H

96,75 ± 0,35

Riesling Itálico (40%), Merlot (10%) e Cabernet Sauvignon (50%) +H

62,43 ± 8,30

Champenoise

Pinot Noir (40%) e Chardonnay (60%) +H

84,22 ± 1,91

Prosseco (100%) +H

56,80 ± 1,00

Chardonnay (100%) +H

53,58 ± 0,95

Pinot Noir (20%) e Chardonnay (80%) +H

34,80 ± 0,50

Chardonnay (10%), Merlot (60%) e Pinot Noir (30%) +H

85,50 ± 0,90

Pinot Noir (50%) e Chardonnay (50%) +H

25,41 ± 1,21

Pinot Noir (20%) e Chardonnay (80%) +H

85,05 ±

±±

± 3,35

Charmat Demi-sec

Riesling Itálico (50%), Semillon (30%) e Moscato (20%) +H

65,45 ±

±±

± 1,05

Riesling Itálico (30%) e Chardonnay (70%) +H

64,85 ± 2,35

Chardonnay (100%) +H

79,20 ± 3,60

Malvasia Bianca (56%), Malvasia De Cândia (25%), Moscato Canelli (10%) e Moscato De Alexandria (9%)+H

100,00 ± 0,00

Riesling Itálico (74%), Pinot Noir (14%) e Chardonnay (12%) +H

95,30 ±

±±

± 4,70

Vinho Base

Pinot Noir (60%) e Chardonnay (40%) +H

64,55 ±

±±

± 4,86

Riesling Itálico (50%), Semillon (30%) e Moscato (20%) +H

84,60 ±

±±

± 2,20

22 Riesling Itálico (74%), Pinot Noir (14%) e Chardonnay (12%) +H

100,00 ±

±±

± 0,00

23 Pinot Noir (20%) e Chardonnay (80%) +H

80,65 ±

±±

± 2,45

Peróxido de Hidrogênio 75mM

27,95 ± 0,25

*Letras distintas diferem significativamente pelo teste de

Kruskal

Wallis H

(para

≤

0,05) .

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