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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS DO APARELHO REPRODUTIVO,
EPITÉLIO SEMINÍFERO E MAPAS ELETROFORÉTICOS BIDIMENSIONAIS
DO PLASMA SEMINAL DE CARNEIROS MORADA NOVA
FABIANE MARIA LIMA SOUSA
FORTALEZA, CE
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS DO APARELHO REPRODUTIVO,
EPITÉLIO SEMINÍFERO E MAPAS ELETROFORÉTICOS BIDIMENSIONAIS
DO PLASMA SEMINAL DE CARNEIROS MORADA NOVA
AUTOR (A): FABIANE MARIA LIMA SOUSA
FORTALEZA-CE
2010
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-
Graduação em Zootecnia, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Zootecnia - Área de
Concentração: Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Arlindo de Alencar Araripe N. Moura, PhD.
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S696e Sousa, Fabiane Maria Lima
Estudo das características do aparelho reprodutivo, epitélio seminífero e
mapas eletroforéticos bidimensionais do plasma seminal de carneiros
Morada Nova / Fabiane Maria Lima Sousa. -- Fortaleza, 2010.
90 f.; il.; enc.
Orientador: Prof. PhD. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura
Área de concentração: Reprodução Animal
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de
Ciências Agrárias, Depto. de Zootecnia, Fortaleza, 2010.
1. Ovino. 2. Avaliação histológica. 3. Biometria testicular. 4.
Eletroforese bidimensional. I. Moura, Arlindo de Alencar Araripe Noronha
(Orient.). II. Universidade Federal do Ceará – Pós-Graduação em Zootecnia
III.Título
CDD 636.08
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FABIANE MARIA LIMA SOUSA
ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS DO APARELHO REPRODUTIVO,
EPITÉLIO SEMINÍFERO E MAPAS ELETROFORÉTICOS BIDIMENSIONAIS
DO PLASMA SEMINAL DE CARNEIROS MORADA NOVA
Dissertação aprovada em 14 de Maio de 2010
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Prof. Dr. ARLINDO DE ALENCAR ARARIPE N. MOURA
(ORIENTADOR)
____________________________________________________
Dr. CARLOS EDUARDO AZEVEDO SOUZA
CONSELHEIRO (UFC)
____________________________________________________
Profª. Dra. ANA CLÁUDIA NASCIMENTO CAMPOS
CONSELHEIRA (UFC)
____________________________________________________
Profª. Dra. CARLA RENATA FIGUEIREDO GADELHA
CONSELHEIRA (UFC)
____________________________________________________
Dra.CLÁUDIA ROBERTA DE ANDRADE
CONSELHEIRA (UFC)
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Zootecnia, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Zootecnia - Área de
Concentração: Reprodução Animal.
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"Somos o que repetidamente
fazemos. A excelência, portanto,
não é um feito, mas um hábito."
Aristóteles
6
Ao meu namorado, que mesmo
longe, foi sempre uma companhia
constante, me ajudando nas horas em
que batia a solidão, tristeza e o
desespero, não me deixando desistir.
Ofereço
Aos meus pais, pelo incentivo,
apoio e amor incondicional, pelo
exemplo de força e superação, pelo
esforço que fizeram para que eu
pudesse realizar mais esse sonho.
A vocês devo tudo o que sou.
Ao meu irmão e toda minha
família, pelos conselhos e presença em
minha vida.
Dedico
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus, que é presença constante em minha vida, quem me dá
força, sabedoria, discernimento, fé e paciência para seguir em frente.
À minha família e meu namorado, que sempre me apoiaram e acreditaram em
mim, mesmo quando nem eu acreditei.
À Universidade Federal do Ceará e ao Programa de Pós-Graduação em
Zootecnia, pela oportunidade de realização do curso.
A coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de estudo.
Ao meu orientador prof. Arlindo Moura, pelos ensinamentos profissionais e
pela colaboração durante as vezes que necessitei.
Ao Dr. Carlos Eduardo Souza, pela sua paciência e disponibilidade em todos os
momentos em que eu precisei. Eduardo, você não sabe como sou grata por todos os
momentos em que pude contar com você, mesmo sabendo das suas limitações esteve
sempre prontificado a me ajudar.
A Érika Menezes, que mesmo antes de fazer parte da mesma equipe de
trabalho, já me ajudava, profissional e pessoalmente, a você o meu muito obrigada pela
colaboração.
Ao meu amigo João Paulo, colega de graduação e de pós-graduação, por todas
as conversas comigo dispensadas e por toda a ajuda a mim prestada.
Aos demais os membros da equipe de reprodução animal, Ítalo, Rodrigo,
Alethéia com quem pude contar durante a execução do experimento.
A professora Ana Cláudia, por disponibilizar materiais necessários para
execução do experimento.
8
Ao professor Airton Araújo, que se prontificou a ajudar na coleta dados na
parte inicial do experimento.
Ao professor Magno, Roberto e todo o pessoal do NEEF pela colaboração,
disponibilizando os animais utilizados durante a realização do experimento.
A minha ex-professora e orientadora, mas sempre amiga, Fátima Révia, pelo
apoio que me deu durante a seleção para o mestrado, torcendo sempre por mim.
Aos meus amigos Joaquim Bezerra, Bartolomeu Neto, Allysson Ney, Camila,
Marcell e em especial minha amiga Sueli Santos, que me acolheram em suas casas quando
eu não tinha para onde ir. Su, obrigada pelas vezes em que pôde me acolher, tanto aqui
como na minha graduação em Sobral, sou grata por isso e espero sempre lhe ajudar quando
também precisar.
Às minhas queridas amigas da pós-graduação Roseane, Ariane, Priscila, Nádia
e Leonília (in memorian), por todos os bons momentos que tivemos juntas, pelas
conversas, pela companhia, pelas muitas palavras de consolo, pelo incentivo, pelo colo,
pela ajuda. Obrigada por tudo, vou sentir muita falta de vocês.
À banca examinadora pela atenção dispensada na correção deste trabalho.
A todos que sempre estiveram comigo nesta caminhada, direta ou indiretamente.
O meu mais sincero obrigada!
9
LISTA DE TABELAS
página
TABELA 1. Biometria testicular, epididimária e das glândulas sexuais acessórias
de ovinos da raça Morada Nova...........................................................
49
TABELA 2. Coeficientes de correlação de Pearson para as características
biométricas testiculares e epididimárias de ovinos da raça Morada
Nova.................................................................................................
52
TABELA 3. Estatística descritiva das características histológicas testiculares de
ovinos da raça Morada Nova...............................................................
54
TABELA 4. Número por seção transversal e por testículo e produção diária de
células germinativas de ovinos da raça Morada Nova.............................
56
TABELA 5. Proporções celulares entre diferentes tipos de células germinativas e
células de Sertoli em ovinos da raça Morada Nova.................................
59
TABELA 6. Mensurações dos núcleos e nucléolos dos diferentes tipos de células
germinativas e de Sertoli em ovinos da raça Morada Nova às 42
semanas de idade..................................................................................
59
TABELA 7. Correlações entre a biometria testicular e características histológicas
de ovinos da raça Morada Nova..............................................................
62
10
LISTA DE FIGURAS
página
FIGURA 1. Mapa das proteínas do plasma seminal de carneiros da raça Morada
Nova, representado através do “master gel” gerado com o software
PDQuest (figura 1A), baseado no gel referência (figura 1B). Os géis
foram obtidos com eletroforese bidimensional e corados com
Coomassie Blue...................................................................................
65
11
LISTA DE ABREVIAÇÕES
μg - micrograma
μl - microlitro
μm - micrômetro
μm³ - micrômetro cúbico
°C - graus Celsius
AE - Altura do epitélio germinativo
BSP - proteína ligante do espermatozóide
CCabEp - comprimento da cabeça do epidídimo
CCorpEp - comprimento do corpo do epidídimo
CCaudEp - comprimento da cauda do epidídimo
CE - circunferência escrotal
cm - centímetros
CS - célula de Sertoli
CT - comprimento testicular
CV - coeficiente de variação
DT - diâmetro testicular
FSH - hormônio folículo estimulante
G - gravidade
HE - hematoxilina - eosina
kDa - kiloDalton
kg - quilograma
L - comprimento tubular total
mA - miliAmpere
12
mL - mililitro
mg - miligrama
NS - contagem de células de Sertoli por secção tubular transversal
NS-T - Solução salina (0,9%) acrescida de Triton X
PB - proteína bruta
pH - potencial hidrogeniônico
ppm - partes por milhão
PT - peso testicular
Pt - total de pontos
SPRD - sem padrão racial definido
sptz/gT – espermatozóides por grama de testículo
V - Volt
VI - volume intersticial
VT - volume testicular
VTS - volume dos túbulos seminíferos
13
RESUMO
Informações sobre aspectos fisiológicos reprodutivos da raça Morada Nova,
especialmente para os machos, ainda são escassas e a falta destes conhecimentos torna-se
um empecilho para aplicação de melhores estratégias de manejo e biotécnicas reprodutivas.
Baseado nisto, este estudo teve como objetivos descrever as características biométricas do
aparelho reprodutivo em ovinos Morada Nova e os aspectos quanti-qualitativos da
espermatogênese e correlacioná-los, bem como caracterizar os mapas eletroforéticos das
proteínas do plasma seminal destes animais. Foi realizada coleta de sêmen, por meio de
eletroejaculação em 15 ovinos da raça Morada Nova, dos quais apenas 12 responderam. As
amostras de sêmen foram centrifugadas para separação do plasma seminal, onde este foi
utilizado na determinação da concentração protéica total e do perfil protéico através de
eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os dados biométricos
foram obtidos a partir dos testículos, epidídimos e das glândulas sexuais acessórias do
grupo de 15 animais que foram abatidos com idade média de 42 semanas e peso vivo
médio de 28 kg. Imediatamente antes do abate, foi tomada a medida de circunferência
escrotal (CE) de cada animal. Em seguida, os testículos, epidídimos e glândulas sexuais
acessórias foram pesados e mensurados individualmente (direito e esquerdo). Amostras
dos testículos foram fixadas em fluido de Bouin para avaliação dos túbulos seminíferos. O
parênquima testicular foi avaliado quanto ao diâmetro (DT), volume (VT) e comprimento
dos túbulos seminíferos, altura do epitélio germinativo (AE) e população de células de
Sertoli e germinativas. A proporção do parênquima testicular ocupado por túbulos
seminíferos foi o equivalente a 84,8 ± 0,1%. O rendimento geral da espermatogênese foi de
59,8 ± 3,73 células. Cada célula de Sertoli (CS) foi capaz de sustentar 7,7 ± 0,51
espermátides arredondadas. Foram realizadas análises de correlação de Pearson (p < 0.05)
entre as características estudadas e as variáveis foram descritas na forma de médias e
respectivos erros-padrão através do programa estatístico StatView, 5.0 (SAS, 2003).
Nenhuma diferença foi detectada entre os valores direito e esquerdo para nenhum dos
parâmetros testiculares, epididimários ou das glândulas sexuais acessórias. Correlações
significativas foram verificadas entre peso e as demais medidas testiculares: comprimento
(CT), diâmetro (DT) e volume do parênquima (VPar) e outras medidas do aparelho
reprodutor como peso (PEp) e comprimento total (CEp) do epidídimo e comprimento do
corpo do epidídimo (CCorpEp). O peso e diâmetro testicular, mostraram-se indicadores da
função reprodutiva do carneiro estando correlacionado com todas as variáveis histológicas
descritas. Com relação à análise eletroforética bidimensional, um total de 103 spots foram
identificados, estando 45 destes presentes em todos os géis, os spots presente indicam a
presença de proteínas importantes do plasma seminal. De acordo com os resultados
obtidos, as medidas das gônadas apresentaram correlações com as demais estruturas do
trato reprodutivo e atividade espermatogênica, e os mapas eletroforéticos do fluido seminal
mostraram-se semelhantes aos de ovinos Santa Inês adultos.
Palavras-chave: ovinos deslanados, avaliação histológica, biometria testicular,
eletroforese bidimensional.
14
ABSTRACT
Information on the reproductive physiological aspects about Morada Nova
breed, especially for males, are still few and the lack of knowledge about that becomes a
hindrance to implementation best management strategies and reproductive biotechnologies,
based on this, this study aimed to describe the biometric characteristics of the reproductive
tract in Morada Nova sheep as well as quantitative and qualitative aspects of
spermatogenesis and correlate them, and to characterize the electrophoretic maps of the
seminal plasma of these animals. Semen was collected by electroejaculation in 15 male
sheep of the Morada Nova breed, of which only 12 responded. The samples were
centrifuged, for separation of seminal plasma, where it was used to determine of total
protein concentration and protein profile by denaturing electrophoresis in polyacrylamide
gel (SDS-PAGE). Biometric data were obtained from the testicles, epididymis and
accessory sex glands of the group of 15 animals that were slaughtered with an average age
of 42 weeks and average weight of 28 kg. Immediately before slaughter, was taken to
measure scrotal circumference (SC) of each animal. Then, the testicles, epididymis and
accessory sex glands were weighed and measured individually (left and right). Testicles
samples were fixed in Bouin's fluid for evaluation of seminiferous tubules. The testicular
parenchyma was evaluated for diameter (TD), volume (VT) and length of seminiferous
tubules, germinal epithelium height (EA) and a population of Sertoli cells and germinal
cells. The proportion of testicular parenchyma occupied by seminiferous tubules was
equivalent to 84.8 ± 0.1%. The overall yield of spermatogenesis was 59.8 ± 3.73 cells.
Each Sertoli cell (SC) was able to sustain 7.7 ± 0.51 round spermatids. Were realized
analyses using Pearson correlation (p <0.05) between the studied characteristics and the
variables were described as means and their respective standard errors using the statistical
program Statview, 5.0 (SAS, 2003). No difference was detected between the left and right
values for any of the testicular parameters, epididymal and accessory sex glands.
Significant correlations were found between weight and other measures testicle: length
(TL), diameter (TD) and volume of parenchyma (VPAR) and other measures of
reproductive tract as weight (PEP) and total length of the epididymis (TLE) and of body of
the epididymis (LBEp). The testicular weight and diameter, were indicators of the
reproductive function of the ram was correlated with all histologic described. For
electrophoresis analysis, a total of 103 spots were identified, 45 these being present in all
gels, and these spots presents in gel indicate the presence of important proteins in the
seminal plasma. According to the results, measures of gonads showed correlations with the
other structures of the reproductive tract and spermatogenic activity, and electrophoretic
maps of seminal fluid were similar to Santa Inês sheep adults.
Keywords: hairy rams, histological evaluation, testicles size, two-dimensional
electrophoresis.
15
SUMÁRIO
página
LISTA DE TABELAS......................................................................................................
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................
LISTA DE ABREVIAÇÕES.............................................................................................
RESUMO......................................................................................................................
ABSTRACT...................................................................................................................
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................
16
2. REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................
18
2.1. MORFOLOGIA E DESENVOLVIMENTO TESTICULAR........................................
18
2.2. A ESPERMATOGÊNESE.................................................................................
20
2.3. CICLO DO EPITÉLIO SEMINÍFERO...............................................................
23
2.4. CÉLULAS DE SERTOLI..................................................................................
27
2.5. CÉLULAS DE LEYDIG...................................................................................
29
2.6. PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL.................................................................
30
2.7. GLÂNDULAS SEXUAIS ACESSÓRIAS...............................................................
32
2.8. O EPIDÍDIMO..............................................................................................
35
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................
38
3.1. LOCALIZAÇÃO DO EXPERIMENTO E MANEJO DOS ANIMAIS.............................
38
3.2. COLETA DE SÊMEN.....................................................................................
38
3.3.AVALIAÇÃO BIOMÉTRICA DO APARELHO REPRODUTIVO
MASCULINO.......................................................................................................
39
3.4. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA TESTICULAR........................................................
40
16
3.5. PRODUÇÃO ESPERMÁTICA DIÁRIA (DSP)......................................................
42
3.6. QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA TOTAL NO PLASMA
SEMINAL............................................................................................................
42
3.7. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL.................................................................
43
3.8. DIGITALIZAÇÃO E ANÁLISE DOS GÉIS............................................................
44
3.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................................
45
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................
46
4.1. BIOMETRIA TESTICULAR, EPIDIDIMÁRIA E DAS GLÂNDULAS SEXUAIS
ACESSÓRIAS.......................................................................................................
46
4.2. CORRELAÇÕES ENTRE AS VARIÁVEIS BIOMÉTRICAS DO APARELHO
REPRODUTIVO...................................................................................................
50
4.3. HISTOLOGIA TESTICULAR............................................................................
53
4.4. CORRELAÇÕES ENTRE A BIOMETRIA TESTICULAR E PARÂMETROS
QUANTITATIVOS DA ESPERMATOGÊNESE.............................................................
60
4.5. MAPAS ELETROFORÉTICOS DAS PROTEÍNAS SEMINAIS...................................
63
5. CONCLUSÕES..................................................................................................
66
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................
67
17
1. INTRODUÇÃO
A população ovina brasileira está estimada em pouco mais de 16,5 milhões de
cabeças, sendo que mais de 9 milhões deste efetivo estão localizadas no Nordeste (IBGE,
2008). Dentre as raças ovinas criadas nesta região, encontram-se principalmente as raças
deslanadas e seus mestiços. A raça Morada Nova é uma das principais raças nativas de
ovinos deslanados do Nordeste do Brasil (FACÓ et al., 2008). Ela é explorada para
produção de pele e carne, sendo esta muito apreciada no mercado internacional
(FERNANDES, 1992). Por serem animais de pequeno porte e bem adaptados às condições
climáticas do semi-árido (animais rústicos), são importantes nas pequenas propriedades,
onde constituem fonte de proteína na alimentação da população rural desempenhando
importante papel social. As ovelhas dessa raça possuem boa habilidade materna e alta
prolificidade (FACÓ et al., 2008).
No entanto, informações sobre aspectos fisiológicos reprodutivos desta raça
ainda são escassas, especialmente para os machos e a falta destes conhecimentos dos
reprodutores torna-se um empecilho para aplicação de melhores estratégias de manejo e
biotécnicas reprodutivas.
O plasma seminal é formado por secreções do epidídimo e glândulas sexuais
acessórias e contém proteínas que estão associadas a diversas características como
fertilidade (HENAULT e KILLIAN, 1996; FLOWERS, 1998; BRANDON et al., 1999),
capacidade de produção espermática (GILMONT et al., 1990; MÉTAYER et al., 2001),
congelabilidade (RONCOLETTA, 1999; RONCOLETTA et al., 1997, 1999, 2000) e
viabilidade do sêmen (AL SOMAI et al.,1994; BARRIOS et al., 2000), dentre outras.
Porém, o tema proteínas seminais na espécie ovina, ainda é bastante incipiente, e dada a
importância que estas possuem sobre inúmeras funções espermáticas, torna-se
18
imprescindível o desenvolvimento de estratégias para a identificação dos componentes do
plasma seminal desta espécie, bem como, por meio de análise histológica, ter o
conhecimento sobre as fases da evolução da espermatogênese e multiplicação e
diferenciação das células de Sertoli e Leydig, que é de fundamental importância para a
compreensão dos fatores que determinam o desenvolvimento das gônadas, puberdade e
potencial capacidade de produção espermática dos animais (WROBEL et al., 1995;
MOURA e ERICKSON, 1997; AGUIAR et al., 2006; MOURA et al., 1999b).
Dada a escassez de informações sobre a fisiologia reprodutiva de carneiros da
raça Morada Nova, especialmente no que se refere à biologia do epitélio seminífero, este
trabalho teve como objetivos, descrever as características biométricas do aparelho
reprodutivo e os aspectos quanti - qualitativos da espermatogênese nestes animais e suas
associações, bem como caracterizar os mapas eletroforéticos bidimensionais das proteínas
do plasma seminal.
19
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Morfologia e desenvolvimento testicular
Os testículos desenvolvem-se no abdômen, medialmente ao rim embrionário
(mesonefros), deslocando-se pelo canal inguinal, através do gubernáculo testicular,
alojando-se no escroto (HAFEZ, 1995), sua descida para a bolsa escrotal se dá a partir do
terceiro mês de gestação, pela ação da testosterona (NUNES et al., 1997) e segundo
NALBANDOV (1969), nos mamíferos, os testículos permanecem no interior do escroto a
uma temperatura de 0,5 a 4,0ºC inferior à corporal. São formados por uma túnica albugínea
de tecido conjuntivo denso, que apresenta uma camada parietal e outra visceral, que envia
septos e trabéculas para o interior do mesmo, dividindo-o em aproximadamente 250 a 400
lóbulos, de formato piramidal. A união destes septos no centro do testículo forma o
mediastino testicular, de tecido fibroso, contendo numerosos túbulos finos. Cerca de dois a
cinco túbulos seminíferos existem dentro de cada lóbulo testicular, mergulhados no tecido
intersticial, e terminam nos túbulos retos, os quais constituem a rede testicular (DYCE et
al., 1997; GEORGE et al., 1998; GERAGHTY et al., 1998).
Os testículos são responsáveis pela produção de espermatozóides, que
transmitem os genes do macho para a prole, e pela produção de andrógenos pelas células
de Leydig, (STANBENFELD e EDQVIST, 1996). Dentre os andrógenos sintetizados
incluem-se a testosterona e a diidrotestosterona, os quais são responsáveis pela
diferenciação do trato genital masculino e da genitália externa na fase fetal (PELLINIEMI
et al., 1996) e pelo aparecimento e manutenção dos caracteres sexuais secundários,
sustentação qualiquantitativa da espermatogênese a partir da puberdade (SHARPE, 1994;
ZIRKIN et al., 1994) e determina o comportamento sexual (HAFEZ, 2004). A
20
diidrotestosterona, em particular, é responsável pela manutenção funcional das glândulas
sexuais acessórias e do epidídimo (LUKE e COFFEY, 1994; FAN e ROBAIRE, 1998;
GOYAL et al., 1999).
Sob o ponto de vista morfofuncional, o testículo é constituído por dois
compartimentos, o compartimento tubular e o intertubular ou intersticial (RUSSELL et al.,
1990; FRANÇA e RUSSELL, 1998). No compartimento responsável pela produção de
espermatozóides encontramos os túbulos seminíferos, os quais conectam-se por meio de
duas extremidades à rede testicular ou rede testis, localizada na região do mediastino
testicular. Os túbulos seminíferos são constituídos pela túnica própria, epitélio seminífero e
lúmen. Os tipos celulares de origem embriologicamente distintas observadas no epitélio
seminífero são as células de Sertoli (origem somática) e as células germinativas
(espermatogênica). (CURTIS e AMANN, 1981; QUEIROZ E CARDOSO, 1989; EVANS
et al., 1996 WROBEL et al., 1995). Já o compartimento intertubular é formado por vasos
sangüíneos e linfáticos, nervos, células e fibras do tecido conjuntivo, macrófagos,
mastócitos e células de Leydig (AMANN, 1983). Em carneiros, o volume total de tecido
intersticial está correlacionado positivamente com a produção de células germinativas seja
por testículo ou por célula de Sertoli (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1993). Os
ovinos possuem os maiores testículos por unidade de peso corporal entre os animais
domésticos (STANBENFELD e EDQVIST, 1996). O peso de cada testículo em carneiros
adultos pode variar de 80 a 300g (CHEMINEAU et al., 1991), sendo que esta variação
pode sofrer influência de acordo com a raça, estado nutricional e estação (BARIL et al.,
1993).
O processo de desenvolvimento testicular envolve o aumento do tamanho deste
órgão, proliferação coordenada das células que o constitui e o amadurecimento das funções
diferenciadas das mesmas (NITTA e COOKE, 1997). Desta forma, os testículos possuem
21
estrutura dinâmica desde o nascimento à puberdade e todos os seus componentes passam
por etapas de proliferação e diferenciação antes da puberdade (VILAR, 1970).
SKINNER et al., (1968) afirmam que o crescimento dos testículos possui duas
fases distintas, a primeira indo desde o nascimento até o início da espermatogênese, se
dando de forma lenta, e uma fase de crescimento rápido, que começa no aparecimento da
espermatogênese até a maturidade sexual. Nesta fase é observado o crescimento testicular
máximo em mamíferos domésticos, sendo que em bovinos ocorre por volta do nono mês, em
ovinos e caprinos no quinto (ORTAVANT et al., 1977), em suínos no quarto mês (FRANÇA,
1987). A maturação sexual dos ovinos depende do tempo de secreção de LH,
demonstrando que as concentrações plasmáticas deste hormônio e o tamanho testicular
estão altamente correlacionados (CHANDOLIA et al., 1997; ARAVINDAKSHAN et al.,
2000).
Segundo GIPSON et al., (1985), FREITAS (1991), MUKOSA-MUGERWA e
AZAZ (1992) e SOUZA et al., (2003), as medidas testiculares em ovinos têm uma
correlação positiva principalmente com o peso vivo e a idade. Ovinos com maior peso vivo
tendem a apresentar maiores medidas de circunferência escrotal e machos com testículos
largos conferem às suas filhas uma puberdade precoce e um aumento nas suas taxas de
ovulação (BRAUN, 1980).
2.2. A espermatogênese
Os espermatozóides são produzidos por um processo denominado de
espermatogênese, o qual ocorre dentro dos túbulos seminíferos (STANBENFELD e
EDQVIST, 1996). Estes túbulos ocupam de 77 a 86% do volume testicular ovino
(QUEIROZ e CARDOSO, 1989; WROBEL et al., 1995; SOUZA et al., 2003) e são
22
constituídos por dois compartimentos: adluminal e basal. No adluminal se encontram as
células de sertoli, que são as células de suporte, e, submersas entre estas estão as células
germinativas em diferentes estados de desenvolvimento (espermatogônias, espermatócitos
primários e secundários, espermátides) (DADOUNE e DEMOULIN, 1993). No lúmen dos
túbulos, aparecem os espermatozóides maduros (GONZÁLEZ, 2002). O compartimento
basal separa o compartimento adluminal de qualquer contato com o sangue (barreira
hemato-testicular), estando constituído por uma membrana basal de características
conjuntivo-fibrosas (GONZÁLEZ, 2002) onde permanecem as espermatogônias
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Existe ainda um compartimento entre os túbulos
seminíferos denominado de compartimento intersticial, espaço, que contém tecido
conjuntivo frouxo, onde se encontram as células de leydig ou células intersticiais,
produtoras de testosterona, células livres (fibroblastos, macrófagos, linfócitos e
mastócitos), nervos do parênquima testicular e numerosos vasos sanguíneos e linfáticos
(DADOUNE e DEMOULIN, 1993; GONZÁLEZ, 2002), que são essenciais para o
movimento dos hormônios e nutrientes para dentro e para fora do testículo (O’DONNEL et
al., 2001).
A espermatogênese é um processo sincrônico e regular de diferenciação celular
através do qual uma espermatogônia tronco é multiplicada e gradativamente diferenciada
em células haplóides altamente especializadas, os espermatozóides. Esse processo, que
ocorre nos túbulos seminíferos, dura em torno de 40 a 60 dias na maioria dos mamíferos
estudados (FRANÇA e RUSSELL, 1998), e no carneiro dura aproximadamente 49 dias
(COUROT et al., 1970). As espermatogônias, células germinativas imaturas, localizam-se
na periferia dos túbulos seminíferos, próximos à lâmina basal, onde proliferam
continuamente (NETO et al., 2005). No carneiro, as espermatogônias dividem-se a cada
10,4 dias, e poderiam gerar, oito dias depois, em teoria, 64 espermatócitos I, cuja prófase
23
dura 14 dias. Estes entram em meiose, a qual dura cerca de 24 horas, originando
potencialmente 256 espermátides que gerarão, após 14 dias, igual número de
espermatozóides (COURTENS, 1983). No carneiro, reconhecem-se seis gerações de
espermatogônias, sendo três do tipo A, uma intermediária e duas do tipo B
(HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1976; JOHNSON et al., 1991).
A espermatogênese é um processo contínuo que pode ser dividido em três fases
distintas: a mitótica (espermatogonial ou proliferativa), a meiótica e a de diferenciação ou
espermiogênica (espermiogênese), cada uma caracterizada por mudanças morfológicas e
bioquímicas dos componentes do citoplasma e núcleo celular (COUROT et al., 1970).
A fase mitótica assegura a produção de grande número de células germinativas,
na qual as espermatogônias-tronco sofrem rápidas e sucessivas divisões mitóticas,
resultando em outras espermatogônias-tronco, no intuito de repor sua população, e dão
origem à outra população de espermatogônias A que se diferenciam em espermatogônias
intermediárias e B. Depois da última mitose, que forma a espermatogônia tipo B,
espermatócitos no estágio pré leptóteno primários são formados. (STANBEFELD e
EDQVIST, 1996; COURTENS, 1983; RUSSELL et al., 1990; JOHNSON et al., 2000).
Estes replicam seu DNA e iniciam a meiose, deste processo sairão as espermátides
(O’DONNEL et al., 2001).
A meiose tem como função a redução do número de cromossomos da célula
germinativa para o estado haplóide (STANBEFELD e EDQVIST, 1996). Deste modo,
espermatócitos primários (4n) passam a espermatócitos secundários (2n), e estes a
espermátides arredondadas (1n).
A espermiogênese é a fase do ciclo em que as espermátides (arredondadas) sofrem
uma série de alterações e passam a espermatozóides. As espermátides arredondadas se
diferenciam em espermátides alongadas, envolvendo achatamento nuclear, condensação da
24
cromatina e paralisação da transcrição. Inicialmente, há uma compactação da cromatina e
alongamento nuclear, depois forma-se o acrossomo a partir do complexo de Golgi, a
formação da cauda, e eliminação de grande parte do citoplasma, caracterizado pela
eliminação de água, formando um corpo residual de citoplasma o qual é fagocitado pelas
células de Sertoli. Ao final da espermiogênese, junto com a liberação de citoplasma
residual ocorre a eliminação das pontes citoplasmáticas, fazendo com que os
espermatozóides individualizados possam ser liberados na luz dos túbulos seminíferos e
depois impulsionados ao epidídimo. Este processo é a espermiação (COURTENS, 1983;
RUSSELL et al., 1990; JOHNSON et al., 2000; GARTNER e HIATT, 2003).
O processo de multiplicação, meiose e diferenciação das células germinativas
em estádios mais avançados de desenvolvimento está sincronizado com as mudanças
morfológicas e hormonais e a expressão gênica nas células de Sertoli e Leydig (ANWAY
et al., 2003; WALKER, 2003). As interrupções no processo espermatogênico também
interferem nas células de Sertoli (MOURA e ERICKSON, 2001) causando, em última
instância, modificações no padrão normal de desenvolvimento e na capacidade reprodutiva
dos animais. Devido a perdas de células germinativas, seja por insultos aos testículos,
injúrias, lesões, doenças, a relação destas com as células de Sertoli é alterada, e a produção
de espermatozóides é afetada (JOHNSON et al., 1997).
O conhecimento da espermatogênese e fisiologia testicular é fundamental para
a identificação de causas potenciais de infertilidade e subfertilidade e a compreensão dos
processos que definem a capacidade de produção espermática. (AGUIAR et al., 2006).
2.3. Ciclo do epitélio seminífero
Os ciclos do epitélio seminífero (CES) ou ciclos espermatogênicos são
associações celulares da espermatogênese que aparecem ao longo dos túbulos seminíferos
25
(GONZÁLEZ, 2002), assim, ao se examinar uma secção transversal de túbulo seminífero,
verifica-se que as células espermatogênicas estão organizadas de modo a formar camadas,
desde a membrana basal até o lúmen tubular (CASTRO et al., 1997). Quando as
associações celulares se repetem é estabelecido um ciclo seminífero (GONZÁLEZ, 2002).
Tratando-se de um fenômeno temporal, o ciclo do epitélio seminífero deve ser mensurado
em termos de unidade de tempo, estimando-se a sua duração em dias. A duração deste
ciclo é geralmente constante para uma determinada espécie, variando, no entanto de uma
espécie para outra (AMANN, 1970; COUROT et al., 1970; RUSSELL et al., 1990).
Estimativas da duração do CES têm sido descritas em diferentes espécies, 13,5 dias em
touros (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1964); 8,6 dias em suínos (SWIERSTRA,
1968); 10,4 dias em carneiros (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al., 1964); 10,9 dias em
coelhos (SWIERSTRA e FOOTE, 1965), 13, 6 dias no cão (FOOTE et al., 1972) e quanto
à espécie humana, a duração foi estimada em 16 dias (HELLER e CLEMONT, 1963).
A identificação dos diferentes estádios desse ciclo é essencial para a realização
de estudos quantitativos da espermatogênese, sendo importante para compreendê-la, bem
como para determinar fases específicas do processo, que podem ser afetadas por
tratamento ou droga (BERNDTSON, 1977). A maneira mais usual de classificação do CES
baseia-se na avaliação morfológica das espermátides, especialmente seu núcleo (FRANÇA
e RUSSELL, 1998) juntamente com eventos meióticos (WROBEL et al., 1995). Esse
sistema designado como método da morfologia tubular por BERNDTSON (1977) permite
a obtenção de oito estágios do ciclo, sendo a espermiação a divisora de dois ciclos
(WROBEL et al., 1995; JOHNSON et al., 2000).
No estágio 1 estão presentes espermatócitos em pré-leptoténo e paquíteno. Os
primeiros são encontrados principalmente na região basal, e também na região
intermediária. A região nuclear é caracterizada por heterocromatina de padrão reticular,
26
com um pequeno nucléolo. Elas apresentam um diâmetro nuclear de 7,68μm e volume
celular de 622μm³, constituindo cerca de 5% do epitélio tubular. Os espermatócitos em
paquíteno apresentam-se maiores, com 1.943,43μm³, e núcleo medindo 10,70μm. Eles
estão localizados próximo ao lúmen e seu desenvolvimento se dá durante a maior parte da
prófase meiótica. A cromatina distribuída pelo núcleo, com pequenas quantidades de
heterocromatina localizadas na membrana nuclear interna, juntamente com o nucléolo. Por
fim, uma geração de espermátides na fase “cap” está envolvida nos processos laterais das
células de Sertoli. Estas células mostram-se com núcleo reduzido quando comparadas
àquelas na fase de Golgi, com redução no número de nucléolos. No fim dessa fase, o
núcleo está periférico, com um grande complexo de Golgi no pólo celular. Este estágio
ocupa cerca de 18% do CES, e o epitélio do túbulo mede cerca de 79μm (WROBEL et al.,
1995).
No segundo estágio o epitélio apresenta cerca de 17,4μm de espessura. Os
espermatócitos em leptóteno apresentam o dobro do volume celular (1.303μm³) e nuclear
(9,72μm) daqueles em pré-leptóteno e heterocromatina concentrada em uma das metades
do núcleo. Estas células atravessam a barreira hemato-testicular, e a primeira geração de
espermatócitos atinge o paquíteno. As espermátides entram na fase acrossômica, e estão
situadas nos processos apicais das células de Sertoli, com seus acrossomas localizados
basalmente, iniciando o alongamento nuclear. Organelas, como o retículo endoplasmático
e o complexo de Golgi, perdem seu formato normal e se desintegram, havendo invasão de
extensões do citoplasma das células de Sertoli no citoplasma das espermátides no final
dessa fase (COURTENS e LOIR, 1981; WROBEL et al., 1995).
No estágio 3, os espermatócitos em leptóteno do estágio anterior atingem o
zigóteno, atravessando a barreira hemato-testicular e entrando na região adluminal. Estas
células medem cerca de 10,30μm e 1.360μm³, respectivamente, para o diâmetro nuclear e
27
volume celular. Já os paquítenos entram em diplóteno, as maiores células germinativas,
atingindo 2.994μm³ de volume celular. As distribuições de organelas e de cromatina são
idênticas àquelas dos paquítenos, com um diâmetro nuclear de 11,93μm. As mitocôndrias
começam a isolar-se, liberando sua densa matriz no citoplasma (WROBEL et al., 1995).
O estágio 4 compreende a fase de meiose, indo da metáfase da primeira divisão
meiótica até o final da segunda divisão. As células mais comuns são espermatócitos
secundários e espermátides arredondadas recém-formadas. Mas encontram-se ainda
espermatócitos em final de zigóteno ou início do paquíteno e espermátides alongadas Os
espermatócitos secundários têm vida breve e ocorrem apenas nesse estágio. Seu volume
celular (1.369,68μm³) e nuclear (342μm³) é aproximadamente, a metade daquele dos
diplótenos (WROBEL et al., 1995).
Os estágios 5, 6 e 7 foram agrupados em um só, uma vez que apresentam curta
duração e não diferem significativamente entre si. Este estágio é caracterizado por uma
única geração de espermatócitos e duas gerações de espermátides. As espermátides recém-
formadas estão na fase de Golgi, apresentando dimensões semelhantes às dos
espermatócitos secundário, com núcleo central e esférico, cromatina granulada e com até
três nucléolos. O retículo endoplasmático liso predomina, formando túbulos curtos,
enquanto as mitocôndrias distribuem-se ao acaso. As espermátides mais velhas estão em
fase de maturação. Este fenômeno inicia-se no estágio 4 e vai até a espermiação. Ele
envolve alterações, tais como o desenvolvimento da peça intermediária, com mitocôndrias
organizadas em 40 a 45 voltas em espiral. O citoplasma é reduzido por um processo de
autólise, acompanhado por intensas alterações no núcleo (LOIR e COURTENS, 1979;
WROBEL et al., 1995).
Durante o estágio 8, ocorre a espermiação das espermátides maduras, que
marca o limite entre dois ciclos do epitélio seminífero. A geração de espermátides jovens
28
do estágio anterior entra na fase de “cap”, e os espermatócitos encontram-se em paquíteno,
e reinicia-se o ciclo no estágio 1 (WROBEL et al., 1995).
2.4. Células de Sertoli
O número de células de Sertoli nos testículos é estabelecido durante a
puberdade, e se mantém constante nos machos adultos (GILULA et al., 1976). A célula de
Sertoli é o primeiro tipo celular somático a se diferenciar na gônada primitiva. Nesta fase
tais células expressam um gene que é responsável pela determinação do sexo gonádico
masculino, tornando-as uma das responsáveis pela diferenciação e organização dos
testículos. O hormônio anti-Mulleriano, responsável pela regressão dos ductos de Muller,
que formariam a tuba uterina, útero e parte da vagina, é produzido pelas células de Sertoli
(FRANÇA e GARCIA, 2005).
Durante o desenvolvimento testicular as células de Sertoli apresentam duas
fases funcionais distintas, chamadas de fase de proliferação e de maturação (RUSSELL e
GRISWOLD, 1993). A proliferação é controlada por diversos fatores como os hormônios
hipofisários (FSH principalmente) e fatores intratesticulares. Além disso, a proliferação e
função das células de Sertoli podem ser diminuídas pelo estrógeno e ser influenciada por
fatores genéticos, nutricionais, e época de nascimento em animais sazonais (RUSSELL e
GRISWOLD, 1993). A ação dos andrógenos na espermatogênese acontece via células de
Sertoli, já que as células germinativas não têm receptores para andrógenos (LYU e
HANDELSMAN, 2003). O número de células germinativas está diretamente ligado ao
número de células de Sertoli funcionais, portanto o tamanho potencial do testículo e a taxa
de produção espermática já estão estabelecidos durante o período de proliferação das
células de Sertoli (RUSSELL e GRISWOLD, 1993). Fatores endócrinos são os principais
29
reguladores da divisão e diferenciação destas células, entre eles o hormônio tireoidiano
inibe a divisão e promove a maturação de células de Sertoli pré-púberes, a partir da
puberdade as células de Sertoli tornam-se maduras e não se dividem mais, constituindo
assim uma população estável no túbulo seminífero. Este período coincide com a
especialização destas células (FRANÇA e GARCIA, 2005).
As células de Sertoli são importantes para o controle do desenvolvimento das
células germinais tanto a respeito da função nutritiva quanto da função reguladora
(STANBEFELD e EDQVIST, 1996; JOHNSON, 1991). Estas células têm longos
processos que contornam os espermatócitos e espermátides e provém uma estreita
interação com as células germinais durante todo o seu desenvolvimento (STANBEFELD e
EDQVIST, 1996), exercem papel vital na regulação da espermatogênese, portanto
qualquer disfunção destas pode ocasionar alterações e ou degenerações das células
germinativas e infertilidade (RUSSELL e GRISWOLD, 1993), porém, não exercem
influência no tempo de duração da espermatogênese, que é intrínseco de cada espécie, esta
função é determinada pelo genótipo das células germinativas (FRANÇA e GARCIA,
2005).
Elas também atuam no controle da maturação e da migração das células
germinativas; estão envolvidas na síntese de proteínas e de esteróides, no controle da
passagem das secreções entre os compartimentos tubulares e intersticiais, fagocitam
células germinativas em degeneração, (DADOUNE e DEMOULIN, 1993); bem como,
corpos citoplasmáticos residuais deixados por espermátides adultas quando na
espermatogênese (AMANN, 1993), além de formarem a barreira hemato-testicular
(JOHNSON, 1991). Os capilares sanguíneos dos testículos são do tipo fenestrado e
permitem a passagem de moléculas grandes. As espermatogônias têm livre acesso a
substâncias presente no sangue, porém as junções ocludentes entre as células de Sertoli
30
formam uma barreira à passagem de moléculas grandes pelo espaço entre elas, assim as
células de etapas mais avançadas da espermatogênese são protegidas de substâncias do
sangue e de agentes nocivos (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
2.5. Células de Leydig
As células de Leydig são encontradas em conjuntos e associadas aos
capilares linfáticos e sanguíneos, são relativamente grandes, poliédricas e limitadas pela
membrana plasmática que contém microvilos. Seu núcleo está localizado excentricamente
no citoplasma com um a três nucléolos e usualmente apresenta forma arredondada ou oval.
Grânulos de heterocromatina formam uma camada intimamente associada ao envoltório
nuclear, sendo esta uma característica universal destas células (SETCHEL, 1991). É o tipo
celular mais comum encontrado no interstício, que situa-se entre os túbulos seminíferos, a
qual é primariamente envolvida na secreção de andrógenos, notavelmente a testosterona,
que é importante para o desenvolvimento e manutenção da espermatogênese e das
características masculinas (O’DONNEL et al., 2001), sendo responsáveis por cerca de 95%
da produção de testosterona circulante num indivíduo adulto (DELLA COLLETA e
CARVALHO, 2005). Nos mamíferos existem dois tipos de células de Leydig: as células de
Leydig fetais, que são produtoras de testosterona responsável pela masculinização fetal e
as células de Leydig do tipo adulta produtoras de testosterona responsável pelas
características sexuais secundárias e pelo processo espermatogênico (KERR e KNELL,
1988; KUOPIO et al., 1989; HUTANIEMI et al., 1992).
Inúmeros fatores podem influir na quantidade de células de Leydig por animal,
dentre os quais podem ser destacados a quantidade de hormônio luteinizante (LH)
disponível; o número de receptores de LH por célula; a quantidade de testosterona que a
31
célula é capaz de secretar em um dado período de tempo; a velocidade com que a
testosterona deixa o testículo via vasos linfáticos, sanguíneos e fluido seminal; o volume
sanguíneo de animal e a taxa de metabolismo da testosterona (RUSSELL et al., 1994;
RUSSELL, 1996).
A produção da testosterona, pelas células de Leydig, é controlada pelo LH.
Aumentos na secreção de LH são seguidos, dentro de 30 a 60 minutos, por níveis
aumentados de testosterona que duram de uma a várias horas, este hormônio também tem
efeito tópico sobre as células de Leydig, estimulando-as a se hipertrofiar, a remoção do LH
cessa a produção de testosterona e leva a uma grande redução no tamanho destas células
(STANBENFELDT e EDQVIST, 1996). A testosterona produzida pelas células de Leydig
desloca-se para dentro do túbulo seminífero por difusão simples ou facilitada. Altas
concentrações são necessárias para a espermatogênese e especialmente para o processo de
meiose (STANBENFELDT e EDQVIST, 1996).
2.6. Proteínas do plasma seminal
O plasma seminal é composto por secreções de diversas partes do trato
reprodutivo, incluindo testículo, epidídimo e glândulas sexuais acessórias
(YANAGIMACHI, 1994). Possui um significado fisiológico importantíssimo, servindo
como meio de transporte para as células espermáticas até o trato genital da fêmea (EVANS
e MAXWELL, 1990), previne a capacitação espermática prematura (YANAGIMACHI,
1994; EVANS e MAXWELL, 1990) e protege as células espermáticas contra danos
oxidativos (SCHÖNECH et al., 1996).
A composição iônica do plasma seminal varia nas diferentes espécies, sendo
os principais íons: sódio, potássio, cloreto, cálcio, magnésio e zinco (WHITE, 1988). Sua
composição ainda inclui aminoácidos, açúcares, ácido cítrico, minerais, prostaglandinas,
32
enzimas e outras proteínas (EVANS e MAXWELL, 1990). As interações entre as células
espermáticas e o fluído seminal iniciam-se desde a espermatogênese, contudo, durante a
passagem pelo epidídimo, a membrana plasmática dos espermatozóides sofre extensivas
alterações biológicas (TULSIANI et al., 1997, NAABY-HANSEN et al., 1997). Como os
espermatozóides perdem toda a capacidade de sintetizar e secretar proteínas na
espermatogênese (SHABANOWITZ e KILLIAN, 1987), novas proteínas são aderidas pela
interação da célula espermática com o meio. Todas as modificações na membrana
plasmática, durante a maturação epididimal, regulam a capacidade espermática para
movimentação e ligação à zona pelúcida (VARRICCHIO et al., 1996).
O conteúdo protéico do plasma seminal de mamíferos varia de 3 a 7%,
dependendo da espécie (WHITE, 1988). Atualmente, com o avanço das técnicas de
biologia molecular, muitas proteínas foram identificadas e caracterizadas (AYYAGARI et
al., 1987; KILLIAN et al., 1993; FRAZER e BUCCI, 1996; MOREAU e MANJUNATH,
1999; RONCOLETTA et al., 2006), muitas destas proteínas secretadas nos fluidos do trato
reprodutivo masculino, em especial no plasma seminal, estão associadas a inúmeros
aspectos da função reprodutiva em ruminantes (KILLIAN et al., 1993; BELLIN et al.,
1998; SPROTT et al., 2000; MOURA et al., 2006a). Diversos autores sugerem a presença,
ausência ou concentração de proteínas no plasma seminal como responsável pela
fertilidade espermática em reprodutores bovinos (HENAULT e KILLIAN, 1996), suínos
(FLOWERS, 1998) e eqüinos (BRANDON et al., 1999) e com a congelabilidade
(RONCOLETTA, 1999; RONCOLETTA et al., 1997, 1999, 2000) e a viabilidade do
sêmen (AL SOMAI et al.,1994; BARRIOS et al., 2000).
Em bovinos, HENAULT e KILLIAN (1996) notaram aumento na taxa de
penetração de ovócitos por espermatozóides de animais de baixa ferlitidade devido à
adição de plasma seminal de animais de alta fertilidade. Na espécie eqüina, a adição de
33
plasma seminal de garanhões de alta fertilidade em espermatozóides de animais de baixa
fertilidade elevou a resistência dos espermatozóides a congelação e descongelação,
concluindo que a composição do plasma seminal é um fator que determina a
susceptibilidade individual de garanhões para criopreservação do sêmen (AURICH e
HOPPE, 1996). As proteínas do plasma seminal parecem ser importantes para a
manutenção da motilidade em carneiros, para a melhoria da viabilidade espermática, e por
protegerem a membrana plasmática dos espermatozóides de ovinos dos danos causados
pelas baixas temperaturas de preservação (BARRIOS et al., 2000; PÉREZ-PÉ et al., 2001).
2.7. Glândulas sexuais acessórias
As glândulas sexuais acessórias em pequenos ruminantes são constituídas
pelas ampolas, glândulas vesiculares, glândulas bulbo-uretrais e próstata (CAMPOS,
2003). A contribuição de cada glândula varia entre as espécies, devido à diferença de
tamanho dessas glândulas e até mesmo a ausência de algumas delas em algumas espécies
(GONZÁLEZ, 2002). As ampolas são dilatações da extremidade uretral e canal deferente,
que armazenam pequenas quantidades de espermatozóides antes da ejaculação (BARIL et
al., 1993).
As glândulas vesiculares estão presentes em todos os machos dos animais
domésticos, exceto no cão e no gato. São órgãos pares, compactos, achatados, túbulo -
alveolares, e com a superfície externa distintamente lobulada. Situam-se dorso-
lateralmente ao colo da bexiga, laterais às porções terminais de cada ducto deferente, total
ou parcialmente dentro da prega genital (HAFEZ, 1995; DYCE et al., 1997; SCHALLER,
1999). As glândulas vesiculares contribuem com a maior parte do volume do plasma
seminal (STANBENFELDT e EDQVIST, 1996), produzindo um fluido que constitui 70%
34
do volume do sêmen, rico em frutose que é fonte de energia para os espermatozóides. A
produção de frutose pelas glândulas vesiculares é controlada pelos níveis de testosterona,
sendo um indicativo da atividade andrógena. A cor amarelo-claro, característica do sêmen,
deriva do pigmento lipocromo, liberado pelas glândulas vesiculares (LANGFORD et al.,
1989; GARTNER e HIATT, 2003). Estas glândulas também secretam outros açúcares
além da frutose, como a glicose, ribose, sorbitol e inositol (HAFEZ E HAFEZ, 2000) e em
animais que não as possuem, a reserva energética de frutose é suprida pela próstata, como
observado em coelhos (MANN, 1946).
As glândulas bulbouretrais ou glândulas de Cowper são formações pares e
pequenas, que ocorrem em todos os animais domésticos, exceto no cão. Localizam-se na
extremidade caudal da parte pélvica da uretra. São glândulas mucosas túbulo - alveolares,
cobertas por uma espessa camada de tecido fibroso denso, e numerosas fibras musculares
lisas. Septos provenientes da cápsula dividem a glândula em vários lóbulos e cada glândula
apresenta um único ducto excretor que desemboca na uretra pélvica (NICKEL et al., 1973;
GETTY, 1986; GEORGE et al., 1998; GERAGHTY et al. 1998; GARTNER e HIATT,
2003). Nos ruminantes, a secreção destas glândulas, caracterizada como um fluido espesso
e escorregadio é lançada à uretra antes da ejaculação, para neutralizar e lubrificar a mesma
(DELLMANN e WROBEL, 1982), sendo a primeira das secreções glandulares liberada
após a ereção do pênis. As últimas secreções provêm das glândulas vesiculares,
responsáveis por um aumento significativo do volume do sêmen (GARTNER e HIATT,
2003).
Durante a estação não reprodutiva, as glândulas bulbouretrais hipertrofiam e
aumentam a sua atividade, sob influência das altas concentrações plasmáticas de prolactina
e produzem mais fosfolipase A2 (NUNES, 1982). Isto está de acordo com o sugerido por
LA FALCI et al., (2002), ao afirmarem que um excesso de atividade de fosfolipase A2
35
pode ser observado no plasma seminal caprino durante a estação não sexual o que podem
produzir lisolipídeos em excesso, os quais causam danos à membrana espermática.
As glândulas vesiculares e bulbo-uretrais em pequenos ruminantes são bem
desenvolvidas em relação à próstata, cuja parte externa (corpo) está ausente e a interna
encontra-se disseminada ao longo da uretra pélvica não penetrando na curvatura muscular
(DELLMANN e BROWN, 1982). Devido à presença de outras glândulas secretoras bem
desenvolvidas, a contribuição da próstata para a formação do plasma seminal é pequena
(WHITE, 1973). No entanto, é conhecido que sua secreção, alcalina e de aspecto leitoso,
contribui para estimular a motilidade dos espermatozóides (NUÑEZ, 1993). As secreções
prostáticas incluem os componentes: zinco, frutose, ácido cítrico, colesterol, numerosas
proteínas e alguns aminoácidos livres e algumas enzimas como as fosfatases ácidas e
alcalinas, enzimas proteolíticas e aminotransferases - aspartato originam-se na próstata
(STANBENFELDT e EDQVIST, 1996).
Sabe-se ainda em relação às glândulas sexuais acessórias, que estas secretam
proteínas, um grupo destas proteínas é conhecido coletivamente por (BSPs), Bovine
Seminal Plasma Proteins (uma vez que foram isoladas em bovinos) e que tem participação
importante no processo de capacitação espermática (THÉRIEN et al., 1995, 1997, 2001;
MANJUNATH e THÉRIEN, 2002), interações entre espermatozóide e oócito
(GONÇALVES et al., 2006; HAO et al., 2006). A osteopontina pode ser encontrada na
forma solúvel, ou associada à membrana celular (PATARCA et al., 1993) e parece estar
envolvida em diversas atividades, incluindo adesão celular, remodelamento de membranas,
alterações no cito-esqueleto, modulação imunológica, interação dos espermatozóides com
o epitélio do oviduto e outras (DENHARDT et al., 1995, 2001; MAZZALI et al., 2002;
DENHARDT, 2004). No trato reprodutivo masculino, essa proteína é expressa nas células
epiteliais das ampolas e glândulas vesiculares, em espermátides alongadas nos testículos,
36
além do epidídimo e espermatozóides epididimários (SIITERI et al., 1995; RODRIGUEZ
et al., 2000). Porém, devido o plasma seminal ser compreendido de secreções originadas
das glândulas sexuais acessórias, epidídimo e testículo é difícil definir a contribuição de
cada um destes órgãos para a performance reprodutiva (MOURA et al., 2006).
2.8. O epidídimo
O epidídimo é um órgão alongado, intimamente ligado a cada testículo em sua
porção medial (NUNES, 2001) pelo mesoepidídimo e ligamento testicular próprio (CBRA,
1998), são compostos de um único túbulo enovelado originado dos ductos de Wolf
(THIBAULT e LEVASSEUR, 1991), que se inicia nos cones eferentes da rede testis
(BARIL et al., 1993) possuindo uma matriz densa e fibrosa, o lúmen é revestido por uma
camada basal de células pequenas e uma camada superficial de epitélio colunar ciliado
(HAFEZ, 2004). Nos ovinos este túbulo pode chegar a 60 metros (EVANS e MAXWELL,
1990; THIBAULT e LEVASSEUR, 1991). A camada epitelial do epidídimo consiste de
diferentes espécies de células; células colunares principais, pequenas células basais sobre a
membrana basal e alguns linfócitos. A luz dos túbulos epididimários é delineada com
epitélio feito de uma camada basal de pequenas células e uma camada superficial de
células ciliadas colunares altas (HAFEZ, 2004). O peso de cada epidídimo pode variar de
20 a 30 g (THIBAULT e LEVASSEUR, 1991)
O epidídimo costuma ser dividido didaticamente em três regiões distintas:
cabeça (caput epididymidis), unida à parte superior do testículo; corpo (corpus
epididymidis), que é a parte mais estreita e cauda (cauda epididymidis), nos ovinos tem
forma circular e desemboca no canal deferente (MARTAN, 1969; HAFEZ, 2004;
DELLMANN e WROBEL, 1982). Segundo AMANN (1986) o segmento inicial do
37
epidídimo tem a função de reabsorção, enquanto o segmento intermediário tem a função de
maturação espermática e o segmento terminal está envolvido com o armazenamento dos
espermatozóides férteis.
O epidídimo é essencial para a reprodução normal dos mamíferos, pois os
espermatozóides que deixam os testículos são incapazes de fertilizar o oócito, adquirindo
esta potencialidade durante o trânsito epididimário (AMANN et al., 1993) que dura
aproximadamente 8 a 15 dias em ruminantes e pode ser reduzido de 10 a 20% pelo
aumento da freqüência de ejaculação. Além disso, a duração do trânsito epididimário varia
com a espécie animal (AMANN, 1981).
As secreções produzidas pelo epidídimo são responsáveis por mudanças na
estrutura do espermatozóide (MARTAN, 1969), que ao longo do epidídimo, sofrem
mudanças quanto à motilidade, morfologia (JINDAL e PANDA, 1980), composição da
membrana plasmática, mitocôndrias, componentes fibrosos e microtubulares da peça
intermediária (POULOS et al., 1974). As mudanças ocorridas na maturação durante o
trânsito epididimário podem, possivelmente, ser devido às alterações bioquímicas e
biofísicas que ocorrem durante este período (AMANN et al., 1993).
Durante sua armazenagem no epidídimo, que se dá principalmente na cauda,
onde se localizam cerca de 75% dos espermatozóides epididimários, os gametas
masculinos permanecem imóveis, com o metabolismo mais basal possível (WHITE, 1973).
Isto se deve ao efeito da proteína imobilina, um fator quiescente, secretado pelas células do
epitélio epididimário (GARNER e HAFEZ, 2004). A especial habilidade da cauda do
epidídimo para estocar espermatozóides depende de baixas temperaturas do escroto e da
ação do hormônio sexual masculino (FOLDESY e BEDFORD, 1982).
Durante a maturação epididimária, as modificações na composição lipídica da
membrana plasmática dos espermatozóides têm como objetivo promover a estabilização da
38
membrana destes para seu armazenamento no epidídimo e seu transporte nos tratos
reprodutivos do macho e da fêmea, e fornecer a eles a capacidade fecundante através do
estabelecimento da organização molecular necessária à capacitação e fertilização ao
entrarem em contato com os fluidos do sistema reprodutivo da fêmea (PARKS e
HAMMERSTEDT, 1985).
Segundo ASHDOWN e HAFEZ (1995), EVANS e MAXWELL (1990) e
HAFEZ, (2004), o epidídimo possui várias funções: (I)- Condução dos espermatozóides
recém formados no testículo até a cauda do epidídimo, que ocorre devido à atividade do
epitélio ciliado dos ductos eferentes e às contrações da parede muscular do ducto
epididimário; (II)- Maturação espermática, que ocorre durante a passagem através do
epidídimo. A motilidade aumenta à medida que os espermatozóides entram no corpo do
epidídimo, a capacidade de fertilização aumenta quando os espermatozóides entram em
contato com o ambiente da cauda do epidídimo e somente termina com o contato destes
com o trato genital da fêmea; (III)- Armazenamento espermático, onde a cauda do
epidídimo é o principal órgão de armazenamento contendo cerca de 75% dos
espermatozóides epididimários e (IV)- Reabsorção de fluidos, no ovino por exemplo de
cerca de 60 mL de fluidos que deixam os testículos diariamente, por volta de 99% são
reabsorvidos na cabeça do epidídimo pelo seguimento inicial do ducto do epidídimo e (V)-
O epidídimo possui ainda função secretória que visa manter a viabilidade do
espermatozóide durante o armazenamento (GONZÁLEZ, 2002), uma vez que no processo
de maturação dos espermatozóides epididimários estão envolvidas diversas proteínas
provenientes do fluído epididimal (JOHNSTON et al., 2001).
39
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Localização do experimento e manejo dos animais
O presente estudo foi conduzido no Departamento de Zootecnia, pertencente ao
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Ceará (UFC), localizado em
Fortaleza-CE. A cidade de Fortaleza está situada na zona litorânea a 15,49 m de altitude,
30° 43` 02” de latitude sul e 38° 32`35” de longitude oeste. A precipitação média anual é
de 1378,3mm e a umidade relativa média do ar, de 78%. O clima da cidade, de acordo com
a classificação de Koppen é AW, com clima quente e úmido, suas médias térmicas são de
26 a 27 °C, com máximas de 30 °C e mínimas de 19 °C.
Foram utilizados quinze cordeiros machos da raça Morada Nova, com idade
média de 42,0 ± 0,4 semanas e peso vivo de 28,1 ± 1,0 kg os quais foram mantidos em
confinamento, alimentados com concentrado e feno de Tifton-85 (13,86% PB), segundo
recomendações do NRC (2007), com livre acesso a água e mistura mineral. Os cordeiros
foram abatidos segundo métodos recomendados pelo Ministério da Agricultura e
Abastecimento (BRASIL, 1980). Imediatamente antes do abate, foram coletadas amostras
de sêmen, onde apenas doze do grupo de quinze animais responderam e também foi
tomada sequencialmente a medida de circunferência escrotal (CE) de todo o grupo.
3.2. Coleta de sêmen
Amostras de sêmen foram coletadas deste grupo de 15 carneiros, por meio de
eletroejaculação. Após limpeza do prepúcio, o sêmen foi colhido em um copo coletor
graduado acoplado à abertura prepucial e imediatamente após coleta, centrifugou-se as
amostras a 700G à 4º C, por 10 minutos para a separação do plasma e espermatozóides.
40
Em seguida, procedeu-se a uma nova centrifugação a 5000G (4ºC) por 30 minutos para a
retirada de debris e possíveis espermatozóides ainda existentes. As amostras foram
aliquotadas em 100 µl em micro tubos de 0,6 mL e mantidas a -80º C para posterior
análise do perfil protéico.
3.3. Avaliação biométrica do aparelho reprodutivo masculino
Após o abate, retirou-se as bolsas escrotais destes animais, removeu-se a túnica
albugínea dos testículos e separou-se dos mesmos os epidídimos. Em seguida, estas
estruturas foram pesadas e mensuradas separadamente (direito e esquerdo), anotando-se as
seguintes variáveis: comprimento (CT), diâmetro (DT) e peso (PT) e espessura testicular;
comprimento total, comprimento da cabeça (CCabEp), corpo (CCorpEp), cauda
(CCaudEp) e peso do epidídimo. As medidas foram tomadas com auxílio de um
paquímetro e as pesagens realizadas em balança de precisão.. As glândulas vesiculares e
bulbo-uretrais foram dissecadas e pesadas também individualmente. O volume testicular
(VT) foi calculado segundo a fórmula: VT= 1/6π x CT x DT
2
(SETCHELL e WAITES,
1964; WROBEL et al., 1995; SOUZA et al., 2003) e a este resultado aplicou-se o fator de
correção (x 0,945), uma vez que os testículos não são totalmente elipsóides (WROBEL,
1990). O volume do parênquima testicular foi calculado subtraindo-se 11% do volume
testicular, correspondente ao mediastino e à túnica albugínea (WROBEL et al., 1995). A
densidade testicular foi calculada através da razão entre o peso e o volume testicular
(BIELLI et al., 2000).
41
3.4. Avaliação histológica testicular
Um fragmento da região central do testículo esquerdo, com aproximadamente
4 mm de espessura, foi retirado e imerso em fluido de Bouin por 24 horas para a fixação e
transferido para uma solução de etanol a 70%. Em seguida, estes fragmentos foram
desidratados em concentrações crescentes de etanol (70 a 100%), diafanizados em xilol e
imersos em blocos de parafina (MOURA e ERICKSON, 1997; SOUZA, 2003, SOUZA et
al., 2003). Após os blocos terem sido cortados em secções de 5 μm de espessura e
montados em lâminas, procedeu-se ao processo de desparafinização em lavagens com xilol
e incubações em concentrações decrescentes de etanol (100 a 70%) e finalmente
tratamento com hematoxilina-eosina (HE; SOUZA et al., 2003).
O diâmetro dos túbulos seminíferos (DTS) foi obtido microscopicamente pela
mensuração de 10 secções transversais para cada testículo, com uma ocular possuindo
régua em aumento de 400X. O mesmo procedimento foi utilizado para a medição da altura
do epitélio germinativo (AE). Para cada seção, o DTS foi obtido como a média de dois
valores e a espessura epitelial como a média de quatro mensurações (SOUZA, 2003).
Avaliou-se as proporções volumétricas de túbulos seminíferos (VTS) e o espaço intersticial
(VI) segundo o método descrito por BIELLI et al., (2001), também em aumento de 400X.
Foram contados 600 pontos (aleatoriamente) em cada lâmina, totalizando 11.400 pontos
para a determinação do percentual volumétrico ocupado pelos componentes estudados
(CHALKLEY, 1943) e o volume ocupado pelos componentes de interesse -Vt (túbulo ou
interstício) foi calculado através da fórmula: Vt= Pt/Pi, onde, Pi representa o número de
pontos sobre os componentes de interesse e Pt, o total de pontos contados. A população
celular presente nos túbulos seminíferos foi estimada segundo HOCHEREAU-DE-
REVIERS et al., (1990) através da contagem dos núcleos das células da linhagem
42
germinativa e das células de Sertoli em dez secções transversais (em aumento de 1000X),
adotando os estágios 1 e 8 do ciclo do epitélio seminífero (CES) para a contagem de
células. As contagens celulares foram corrigidas para o diâmetro nuclear e a espessura do
corte pela fórmula de Abercrombie (ABERCROMBIE, 1946): N= NC x (5µm/5 µm +
diam. nuclear (µm), onde N representa a real contagem celular e NC representa o número
de células contadas por seção.
Foram mensurados ainda os diâmetros nucleares das referidas células,
contando-se dez unidades por tipo celular em aumento de 1000X, com ocular
micrométrica. A população de células de Sertoli por testículo foi estimada através da
fórmula: NTS= Ns x L/ espessura do corte, onde Ns é o número médio de células de Sertoli
por seção transversal de túbulo seminífero e L é o comprimento total dos túbulos
seminíferos (BIELLI et al., 2001). O mesmo procedimento foi adotado para estimar a
população das demais células da linhagem germinativa. Considerando que os túbulos
seminíferos são cilíndricos, o comprimento tubular foi calculado de segundo MARSHALL
e PLANT (1996): L= VTS/π x (DTM/2)
2.
As populações de células de Sertoli e células
germinativas foram calculadas com base em dez secções transversais de túbulos
seminíferos por animal (BERNDTSON et al., 1977; MOURA e ERICKSON, 1997;
SOUZA, 2003). Baseados nos valores de N para cada tipo celular determinou-se as
proporções do número de espermatogônias A e de espermátides por células de Sertoli e
espermatogônias A, bem como a produção diária de células germinativas, que foi calculada
a partir de seus números totais por testículo, divido pela duração do ciclo do epitélio
germinativo em carneiros (ORTAVANT, 1959; HOCHEREAU-DE-REVIERS et al.,
1990).
43
3.5. Produção espermática diária (DSP)
O protocolo para determinar a produção diária de espermatozóides baseou-se
no método descrito por BIELLI et al., (1999), com modificações. Para tanto, fragmentos de
1 cm³ do parênquima testicular de cada animal (previamente congelados) foram
homogeneizados com auxilio de um homogeneizador por 1,5 minutos em 200 mL de
solução Triton X-100 (0,05%) em 0,9 % de NaCl (NS-T). Em seguida, o homogeneizado
foi acrescido de NS-T até completar 500 mL e submetido a uma nova homogeneização
através de leve agitação. Uma alíquota de 125 mL desta solução foi transferida para outra
proveta, e completada até 500 mL com NS-T. Por fim, uma alíquota de 10 mL desta
suspensão foi filtrada em dupla camada de gaze para remoção de debris. A contagem de
espermátides alongadas foi realizada com auxilio de uma câmara de Neubauer e procedeu-
se, neste caso, a quatro contagens por amostra de forma que o coeficiente de variação entre
as mesmas fosse menor ou igual a 15%. Na eventualidade deste coeficiente apresentar
valor superior, nova série de quatro avaliações foi realizada. As partir das médias destas
contagens utilizou-se a seguinte fórmula para determinação da produção espermática
diária: espermátides/g de testículo = ∑ das espermátides x 1000 x 875, onde 1000 é o fator
de correção de 1 mm
3
para mL e 875 corresponde à taxa de diluição.
3.6. Quantificação da concentração de proteína total no plasma seminal
Obteve-se inicialmente, uma curva analítica de calibração a partir de soluções
padrão, com concentrações de proteína conhecidas, encerrando 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45 e 50mg de albumina sérica bovina (BSA) mL
-1
. Adicionou-se a cada 100µL padrão,
2,5mL do reagente de Bradford (BRADFORD, 1976) e as leituras de absorbância feitas a
595 nm (Ultrospec III, Pharmacia LKB, Piscattaway, NJ, USA), após 10 minutos de
44
incubação. A curva de calibração foi, então, estabelecida por espectrofotometria em
triplicata, gerando uma equação linear de absorbância x concentração (R² = 0, 9761)
através da qual foi possível a determinação do teor de proteínas totais em cada uma das
amostras experimentais. Para quantificação dos teores de proteína, também em triplicata,
estas amostas foram previamente diluídas na proporção de 1:100, em água milli-Q,
adicionando-se a 100µl da amostra diluída 2,5 mL do reagente de Bradford. Após 10
minutos, procedeu-se à leitura em 595 nm, obtendo-se o valor de cada amostra como a
média das triplicatas.
3.7. Eletroforese bidimensional
Um volume de plasma seminal contendo 400µg de proteínas foi adicionado a
uma quantidade de solução de re-hidratação (Uréia 7M, Tiouréia 2M, Ditiotreitol (DTT) 65
mM, anfólitos livres 0,5% (IPG buffer, 3-10), CHAPS 0,5% e azul de bromofenol (traços)
suficiente para 250µl (SOUZA et al., 2009). A solução acima foi adicionada às canaletas
da bandeja de hidratação e incubada com tiras de 13 cm com gradiente de pH imobilizado
linear de 4-7 (IPGs; GE Lifesciences, USA) por aproximadamente 20 horas. A focalização
isoelétrica foi conduzida em um equipamento ETTAN
TM
IPGphorII
TM
(GE Lifesciences)
com a seguinte programação: 200V (200Vh), 500V (1000 Vh), 5000V (10.000 Vh),
10.000V (22.000 VhT), totalizando 33.200 Vh. Após a focalização, as tiras foram
incubadas no tampão de equilíbrio, contendo Tris (pH 8,8) 50mM, Glicerol 87%, Uréia
6M, SDS 2%, Azul de Bromofenol (Traços), Água Milli-Q (q.s.p. 50 mL).
Numa primeira etapa, as tiras foram mantidas, sob leve agitação, em solução de
equilíbrio (3 mL/tira) adicionada de 57,8 mg de DTT por 15 minutos, sendo, em seguida,
incubadas por mais 15 minutos com a solução de equilíbrio contendo 69,3 mg de
45
iodoacetamida. Após a etapa de equilíbrio, as proteínas foram separadas em géis de
poliacrilamida (SDS-PAGE; 15%T/ 0,8%C, 250V, 30 mA por gel) adicionados de
marcadores moleculares variando de 14,3 a 97 kDa, com base em sua massa molecular
(Hoefer SE 600, GE Lifesciences, Piscataway, NJ, USA) (O`FARREL, 1975, SOUZA et
al., 2009). Após a separação, as proteínas foram visualizadas utilizando-se o método do
Coomassie coloidal (CANDIANO et al., 2004), com modificações. Para tanto, os géis
foram lavados três vezes por 20 minutos, nas soluções 1 e 2, sequencialmente (200 mL/gel;
RÊGO et al., 2009):
Solução 1 Ácido fosfórico 2% e etanol 30%, em água.
Solução 2 Ácido fosfórico 2%, em água.
Após a última lavagem com a solução 2, os géis permaneceram em contato
com uma solução contendo ácido fosfórico 2%, etanol 18% e sulfato de amônio 15% em
água, por 20 minutos (200 mL/gel). Em seguida, adicionou-se à esta solução 4 mL/gel de
Coomassie Blue G-250 (solução aquosa a 2%). O corante permaneceu em contato com os
géis por cerca de 72 horas. Após este período, a solução contendo o corante foi desprezada,
e os géis lavados com água destilada.
3.8. Digitalização e análise dos géis
As imagens dos géis foram digitalizadas utilizando o ImageScanner II (GE
Lifesciences, USA) na resolução de 600 dpi. As imagens foram salvas como arquivos
TIFF e analisadas utilizando-se o aplicativo PDQuest, versão 8.0.1 (Bio-Rad Laboratories,
USA).Um gel representativo de todos os géis (gel sintético ou gel máster) foi criado com
base nos géis de todos os indivíduos e “spots” presentes consistentemente nos mapas
também foram adicionados a ele, conforme descrito por MOURA et al., (2006) e SOUZA
46
et al., (2009). Proteínas presentes em diferentes regiões dos géis foram utilizadas como
marcos de localização de forma a permitir o alinhamento correto de cada spot nos
diferentes géis. A quantificação dos spots foi dada em ppm da densidade óptica integrada
total de cada gel, fornecida pelo aplicativo PDQuest (MOURA et al., 2006a).
3.9. Análise Estatística
As variáveis foram descritas na forma de médias e respectivos erros-padrão e
as correlações entre estas, determinadas através do método de Pearson (SAS, 2003).
47
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Biometria testicular, epididimária e das glândulas sexuais acessórias
No presente estudo, os cordeiros apresentaram valores de circunferência
escrotal (CE), diâmetro (DT) e peso testicular (PT) de 27,5 ± 0,5cm; 4,6 ± 0,1cm e 109,5 ±
6,0g, respectivamente (Tabela 1). Segundo AMANN (1970), o peso testicular apresenta
alta correlação com a produção espermática diária e a reserva espermática gonadal e
extragonadal, porém, sua mensuração não pode ser feita diretamente, o que torna mais
prático e simples a utilização da circunferência escrotal.
A CE também é indicadora da produção espermática bem como de outros
parâmetros reprodutivos como, capacidade de monta e desenvolvimento sexual
(BORGOHAIN et al., 1983) de forma que, carneiros com maior circunferência escrotal
realizam cobertura mais cedo e suas filhas atingem a puberdade mais precocemente, com
maior taxa de ovulação (OTT e MENON, 1980). Segundo LÔBO et al., (1997), a seleção
de reprodutores ovinos por meio da CE poderá contribuir para a elevação das taxas de
crescimento de animais jovens e melhoria da eficiência reprodutiva dos rebanhos. Ainda
segundo estes autores, a circunferência escrotal deve ser utilizada nos programas de
melhoramento genético da raça Morada Nova devido à facilidade de mensuração e de
associação com características de crescimento.
O valor de circunferência escrotal do atual experimento foi semelhante ao
observado por QUEIROZ e CARDOSO (1989) em ovinos sem padrão racial definido
(SPRD) adultos (entre 25,1 ± 2,0 e 29,0 ± 1,8cm) em diferentes meses do ano;
MONTEIRO (2007), que obteve medidas 27,82 ± 1,77cm quando trabalhando também em
48
ovinos SPRD com idade variando de 36 a 56 semanas de idade e LÔBO (1996), que
reportou valor de de 23,82cm para CE de ovinos Morada Nova com 48 semanas de idade.
O valor de peso testicular aferido no presente estudo, por sua vez, foi
semelhante ao encontrado por MARTINS (2006) e MONTEIRO (2007), que relataram
valores de 110,4 ± 34,8g e 123,97 ± 26,58g, respectivamente, em carneiros deslanados sem
padrão racial definido com idades compatíveis com a dos animais utilizados no presente
trabalho. QUEIROZ e CARDOSO (1989) observaram em ovinos deslanados SPRD,
valores para peso testicular que variaram de 90,3 a 127,1g em animais abatidos nos meses
de junho a novembro no sudeste do Brasil. Em que pese o fato de que os valores de CE são
influenciados por diversos fatores como raça, idade e peso dos animais, os resultados
apresentados neste estudo são equivalentes àqueles publicados anteriormente em ovinos
Morada Nova ou sem raça definida.
As aferições das medidas testiculares são consideradas importantes uma vez
que, quando determinadas em animais jovens, podem fornecer indicação confiável do
desempenho reprodutivo do animal adulto (YARNEY e SANFORD, 1993).
O índice gonadossomático corresponde à proporção do peso corporal alocado
em testículos e é um parâmetro representativo do investimento específico na produção
espermatogênica (AMANN, 1970). No presente estudo, este indíce foi de 0,4 ± 0,02 % e,
segundo KENAGY e TROMBULAK (1986), mamíferos de menor porte alocam maiores
proporções de massa corporal e de gasto de energia para o tecido testicular do que
mamíferos de maior porte, sendo este investimento, não específico para espécies e não se
correlaciona à forma ou mesmo posição dos testículos no corpo. Ainda segundo estes
autores, o tamanho relativo dos testículos não se correlaciona com sua localização
corporal, porém, é um forte indicador do sistema de acasalamento de uma determinada
espécie (SHORT, 1997).
49
As médias encontradas para peso e comprimento do epidídimo foram de 17,4 ±
1,0 e 14,7 ± 0,3 cm, respectivamente (Tabela 1), valores estes semelhantes aos encontrados
por MARTINS (2006) em ovinos deslanados sem padrão racial definido. Ainda no atual
estudo, obteve-se medições de 3,0 ± 0,1; 3,8 ± 0,2 e 8,1 ± 0,2 cm para os comprimentos da
cauda, cabeça e corpo do epidídimo. Com relação à primeira medida, MARTINS (2006)
obteve um valor praticamente idêntico (3,1 ± 0,4 cm), mas este autor reportou aferições
maiores para a cabeça e corpo do epidídimo (4,5 ± 0,6 e 10,2 ± 1,4 cm, respectivamente),
em animais SPRD com idades análogas às dos carneiros utilizados no presente trabalho. A
razão de tais discrepâncias de resultados não está clara com base nas informações
disponíveis, mas pode obviamente está relacionada com diferenças entre raças e
anatômicas, uma vez que no estudo com ovinos SPRD o comprimento dos testículos foi
maior do que nos ovinos Morada Nova, fazendo com que a cabeça e o corpo do
epdidídimo se alongassem.
No presente estudo, as glândulas vesiculares e bulbo-uretrais apresentaram
pesos médios de 4,1 ± 0,1 e 1,1 ± 0,1 g, respectivamente (Tabela 1). Estes valores, no
entanto, inferiores aos encontrados por MARTINS (2006), em ovinos SPRD (8,8 ± 2,9 e
2,3 ± 0,9g), respectivamente. Nenhuma diferença estatística foi detectada entre os valores
direito e esquerdo para nenhum dos parâmetros testiculares, epididimários ou das glândulas
sexuais acessórias (Tabela 1), resultados estes que estão de acordo com a afirmativa de
SISSON (1986) de que em pequenos ruminantes o desenvolvimento do trato genital é
simétrico e harmônico.
50
Tabela 1. Biometria testicular, epididimária e das glândulas sexuais acessórias de ovinos da
raça Morada Nova (média ± erro-padrão da média).
Parâmetro
Direito
Esquerdo
Média
Testículo
Peso (g)
109,8 ± 6,0
109,3 ± 6,0
109,5 ± 6,0
Comprimento (cm)
6,2 ± 0,2
6,3 ± 0,2
6,3 ± 0,2
Diâmetro (cm)
4,6 ± 0,1
4,6 ± 0,1
4,6 ± 0,1
Espessura (cm)
3,6 ± 0,1
3,6 ± 0,1
3,6 ± 0,1
Volume (mL)
65,0 ± 4,0
65,8 ± 4,3
65,4 ± 4,1
Volume do parênquima (mL)
58,0 ± 3,5
58,5 ± 3,8
58,2 ± 3,7
Densidade (g/mL)
1,7 ± 0,03
Índice gonadossomático (%)
0,4 ± 0,02
Circunferência escrotal (cm)
27,5 ± 0,5
Epidídimo
Peso (g)
17,5 ± 1,0
17,3 ± 1,0
17,4 ± 1,0
Comprimento total (cm)
14,4 ± 0,3
14,8 ± 0,3
14,7 ± 0,3
Comprimento da cabeça (cm)
3,7 ± 0,2
3,8 ± 0,2
3,8 ± 0,2
Comprimento do corpo (cm)
8,1 ± 0,2
8,0 ± 0,2
8,1 ± 0,2
Comprimento da cauda (cm)
3,0 ± 0,1
3,1 ± 0,1
3,0 ± 0,1
Glândulas sexuais acessórias
Peso das glândulas vesiculares (g)
4,1 ± 0,1
4,1 ± 0,2
4,1 ± 0,1
Peso das glândulas Bulbo-uretrais (g)
1,1 ± 0,1
1,1 ± 0,1
1,1 ± 0,1
51
4.2. Correlações entre as variáveis biométricas do aparelho reprodutivo
O peso testicular apresentou correlações com a medida de circunferência
escrotal (r = 0,73), comprimento (r = 0,86), diâmetro (r = 0,95) e volume do parênquima
testicular (r = 0,98), peso (r = 0,75), comprimento total (r = 0,82) e comprimento do corpo
do epidídimo (r = 0,67; Tabela 2). Estes resultados foram semelhantes aos observados por
MARTINS (2006) e SOUZA (2003), ao estudarem os mesmos parâmetros em carneiros
SPRD e Santa Inês, respectivamente. O diâmetro testicular mostrou-se como indicador do
peso (r = 0,95), comprimento (r = 0,74) e volume do parênquima testicular (r = 0,97;
Tabela 2), resultado muito próximo ao obtido por MARTINS (2006) em carneiros
deslanados SPRD (r = 0,88; 0,87 e 0,94, respectivamente). Este resultado evidencia que a
largura testicular, além de ser uma variável de fácil mensuração, pode ser usada como
indicador das demais características testiculares.
A circunferência escrotal apresenta associação com inúmeras variáveis como o
peso corporal e a idade (MUKOSA-MUGERWA e AZAZ, 1992; JOBIM et al., 1989;
FREITAS et al., 1991; OSINOWO et al., 1992), peso testicular (HAHN et al., 1969;
CLARK et al. 2003; CARDOSO E QUEIROZ, 1988;), percentagem de espermatozóides
normais (CLARK et al., 2003; WIENNER e RUTTLE, 1987), concentração e
turbilhonamento do sêmen (SOUZA e COSTA, 1992; SOUZA et al., 2001), peso
epididimário, (OSINOWO et al., 1992), produção espermática, capacidade de serviço e
desenvolvimento sexual (COULTER e FOOTE, 1979; OTT e MENON, 1980; YARNEY
et al., 1990; SOUZA et al., 2001; CLARK et al., 2003), comprimento, largura e diâmetro
testicular (SOUZA et al., 2001; MOURA et al., 1999; SOUZA e COSTA, 1992; FREITAS
et al., 1991), diâmetro dos túbulos seminíferos (AMANN e SCHANBACHER, 1983;
GARCIA DERAGON e LEIDIC, 1990; OSINOWO et al., 1992). As medidas testiculares,
52
como a CE também estão correlacionadas com os parâmetros quantitativos dos túbulos
seminíferos e, conseqüentemente, ao número de espermatozóides produzidos por dia e por
grama de parênquima testicular (AMMAN e SCHANBACHER, 1983; GARCIA
DERAGON e LEIDIC, 1990). Estas associações da CE envolvendo as medidas das
gônadas e características seminais devem-se à extensa área dos testículos
(aproximadamente 85%) ocupada pelos túbulos seminíferos, responsáveis pela
espermatogênese (WROBEL et al., 1995).
As correlações entre medidas testiculares e peso vivo geralmente são
expressivas nas fases de pré-puberdade e puberdade, mas tornam-se paulatinamente sem
significancia à medida que o animal atinge a fase adulta (MOURA e ERICKSON, 1997;
YARNEY e SANFORD, 1993, 1997; SOUZA et al., 2009).
53
Tabela 2. Coeficientes de correlação de Pearson para as características biométricas testiculares e epididimárias de ovinos da raça Morada
Nova.
PT
CT
DT
VPar
PEp
CEp
CCabEp
CCorpEp
CCaudEp
CE
0,73**
ns
0,85**
0,78**
0,59*
0,60*
ns
0,64*
ns
PT
0,86**
0,95**
0,98**
0,75**
0,82**
ns
0,67**
ns
CT
0,74**
0,87**
0,57*
0,68**
ns
ns
0,53*
DT
0,97**
0,75**
0,79**
ns
0,67**
ns
VPar
0,74**
0,81**
ns
0,66**
ns
PEp
0,76**
ns
ns
ns
CEp
ns
0,83**
ns
CCabEp
ns
ns
CCorpEp
ns
* p<0,05;** p<0,01; Testículo: (PT: peso; CT: comprimento; DT: diâmetro; VPar: volume do parênquima); Epididimo:
(PEp: peso total; CEp: comprimento; CCabEp :comprimento da cabeça; CCorpEp: comprimento do corpo; CCaudEp: comprimento da cauda).
54
4.3. Histologia testicular
No presente estudo, as médias encontradas para o diâmetro e o comprimento
total dos túbulos seminíferos e espessura do epitélio germinativo foram de 188,3 ± 4,0 µm,
2291,1 ± 113,5 m e 58,0 ± 3,0 µm, respectivamente (Tabela 3). O comprimento total de
túbulos seminíferos está relacionado a três parâmetros estruturais: tamanho do testículo,
diâmetro tubular e densidade volumétrica dos túbulos seminíferos (BASCOM e OSTRUD,
1925) e existe grande variação no número e dimensões (diâmetro e comprimento) dos
túbulos seminíferos nas diferentes espécies de mamíferos (FRANÇA e RUSSELL, 1998).
QUEIROZ e CARDOSO (1989) descreveram médias de 152,7 ± 11,2 a 171,0
± 6,4µm para diâmetro tubular e de 77,6 ± 3,2 a 86,5 ± 3,6 % de proporção volumétrica
dos túbulos seminíferos em carneiros SPRD adultos, criados no Nordeste de Minas Gerais,
valores pouco menores aos do atual estudo no primeiro caso, mas coerentes no segundo. O
valor médio obtido para diâmetro tubular por MARTINS (2006; 164,2 ± 20,0 µm) em
carneiros SPRD e SOUZA (2003; 207,12 ± 2,95 μm) em ovinos Santa Inês, foram
respectivamente inferior e superior ao atual estudo, resultado que evidencia obviamente o
efeito da raça sobre tal variável. A medida do diâmetro tubular é uma abordagem
classicamente utilizada como indicador da atividade espermatogênica em investigações
envolvendo a função testicular (ATTAL e COUROT, 1963; GODINHO e CARDOSO,
1979; SINHA HIKIN et al., 1991; RUSSELL et al.,1994; MUÑOZ et al., 1998) e reflete o
grau de desenvolvimento testicular durante a transição entre a pré-puberdade até pós-
puberdade.
A proporção do parênquima testicular ocupado por túbulos seminíferos do
atual estudo foi 84,8 ± 0,1% (Tabela 3), semelhante ao encontrado em veado-catingueiro
(85,86%; COSTA, 2009), caprino (87,7%; LEAL et al., 2004), carneiros e porcos (85%;
55
FRANÇA e RUSSELL, 1998) e touro (85%; SETCHELL, 1991), constatando que este
compartimento constitui a maior parte do testículo. O parênquima testicular consiste na
parte funcional dos testículos e apresenta dois compartimentos: o tubular e o intersticial
(RUSSELL et al., 1990). A proporção média do parênquima testicular ocupado pelo tecido
intersticial foi 15,2 ± 0,1 % (Tabela 3), estando de acordo com (GONZÁLEZ, 2002) que
descreve que esta proporção varia nas diferentes espécies, desde 10-15% no cão, rato e
carneiro, 25-35% no homem e quase 40% no porco e cavalo. Em ovinos, o volume total de
tecido intersticial está correlacionado positivamente com a produção de células
germinativas, seja por testículo ou por célula de Sertoli (HOCHEREAU-DE-REVIERS et
al., 1993). Os demais valores para os parâmetros histológicos estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3. Estatística descritiva das características histológicas testiculares de ovinos da
raça Morada Nova (média ± erro-padrão da média).
Parâmetro
X ± EPM
Proporção do parênquima testicular ocupado por túbulos
seminíferos (%)
84,8 ± 0,1
Epitélio
64,7 ± 1,2
Lúmen
20,0 ± 1,1
Espaço intersticial (%)
15,2 ± 0,1
Células de Leydig
14,6 ± 0,1
Vasos sanguíneos
0,6 ± 0,1
Vasos linfáticos
0,01 ± 0,01
Diâmetro tubular (µm)
188,3 ± 4,0
Diâmetro luminal (µm)
75,0 ± 3,5
Espessura do epitélio germinativo (µm)
58,0 ± 3,0
Comprimento total dos túbulos seminíferos (m)
2291,1 ± 113,5
No presente trabalho, a população de células germinativas descritas foi de 0,3 x
10
9
espermatogônias A; 5,8 x 10
9
espermatócitos em paquíteno e 17,5 x 10
9
espermátides
56
arredondadas, além de 1,9 ± 0,1 x 10
9
células de Sertoli por testículo e 11,5 ± 0,5 células de
Sertoli (CS) por seção transversal de túbulo seminífero, conforme mostrado na Tabela 4.
A população média de células germinativas por testículo encontradas por
MARTINS (2006) em ovinos SPRD foi de 0,7 espermatogônias A; 10,8 espermatócito em
paquíteno e 39,1 espermátides arredondadas e a população descrita por SOUZA (2003) em
ovinos Santa Inês, foi de 0,56; 13,3 e 53,8, respectivamente. Pode-se observar então, que
os valores descritos para as populações de células germinativas do atual estudo mostraram-
se inferiores as dos estudos comparados, sugerindo assim uma menor eficiência
espermatogênica.
A contagem das células germinativas e de Sertoli em secções transversais
permite a obtenção de índices que refletem o rendimento intrínseco da espermatogênese
(ORTAVANT et al., 1977) e o número de células de Sertoli por testículo é o principal fator
na determinação da produção espermática e no tamanho do testículo (FRANÇA et al.,
1995). O resultado obtido no atual experimento para células de Sertoli por secção
transversal foi superior ao encontrado por MARTINS (2006; 8,3 ± 1,5) em ovinos SPRD e
semelhante ao de SOUZA (2003), que observou 14,9 ± 0,4 células de Sertoli (CS) por
secção transversal de túbulo seminífero em ovinos Santa Inês com um ano de idade.
Porém, em relação ao número total de CS por testículo o valor foi similar ao de MARTINS
(2006), que encontrou em ovinos SPRD 2,2 ± 0,8 x 10
9
e muito menor que o observado por
SOUZA (2003; 7,72 x 10
9
) em ovinos Santa Inês.
Visto que as células de Sertoli são o tipo celular responsável pelo aporte
nutricional e pela proteção física conferida às células da linhagem germinativa para que
possam se desenvolver, dividir e se diferenciar em espermatozóides, essa inferioridade no
total destas células pode ser um dos motivos pela qual o rendimento espermatogênico dos
animais estudados possua um potencial reduzido em relação ao dos estudos comparados.
57
Tabela 4. Número por seção transversal e por testículo e produção diária de células
germinativas de ovinos da raça Morada Nova.
Tipo celular
Por seção
transversal
Por testículo
População
População (x 10
9
)
Produção diária (x 10
7
)
Célula de Sertoli
11,5 ± 0,5
1,9 ± 0,1
Espermatogônia A
1,5 ± 0,1
0,3 ± 0,02
2,6 ± 0,2
Espermatócito em
paquíteno
34,0 ± 1,5
5,8 ± 0,5
55,6 ± 4,3
Espermátide
arredondada
85,5 ± 4,0
17,5 ± 1,3
167,9 ± 12,7
Com a finalidade de avaliar a eficiência do processo espermatogênico e das
células de Sertoli nos animais experimentais, foram estimadas as razões entre os números
de células da linhagem espermatogênica e entre estes e o número de CS. Neste trabalho, o
coeficiente de eficiência de mitoses espermatogoniais (espermatócitos em paquíteno:
espermatogônias A), foi de 23,3 ± 1,4; o rendimento geral da espermatogênese
(espermátides arredondadas:espermatogônia A), de 59,8 ± 3,73, o rendimento meiótico
(espermátide arredondada:paquíteno) de 2,6 ± 0,08 e o índice de célula de Sertoli, que
mede a eficiência desta célula (espermátide arredondada:célula de Sertoli), de 7,7 ± 0,51.
As razões entre os demais tipos de células germinativas e entre estas e as CS, podem ser
observadas na Tabela 5.
Teoricamente, em cada divisão mitótica o número de células dobra, mas, na
prática, tal resultado dificilmente é encontrado, devido à ocorrência de apoptose nas células
58
germinativas durante o processo espermatogênico, em geral, são produzidos de 15 a 50%
do potencial total de espermatozóides que podem ser originados (CASTRO et al., 1997;
FRANÇA e RUSSELL, 1998). Esse mecanismo natural de perdas permite que a produção
de células espermatogênicas seja proporcional à capacidade de suporte das células de
Sertoli dos túbulos seminíferos e eliminação de células anormais ou com cromossomos
aberrantes (SHARP, 1994). Os processos de apoptose e perdas das células germinativas
durante a espermatogênese variam durante o desenvolvimento sexual e em função da idade
e da espécie (JOHNSON et al., 2000).
O resultado do atual estudo para eficiência espermatogonial foi superior ao de
MARTINS (2006), que obteve 14,5 ± 4,9 espermatócitos em paquíteno por
espermatogônia A e semelhante a SOUZA (2003), que observou 25,29 ± 1,77 para a
mesma relação, revelando assim uma boa eficiência mitótica. As proporções numéricas
entre espermatogônias A e os demais tipos celulares por secção transversal de túbulos
seminífero são utilizados como meios para se estimar o coeficiente de eficiência da
espermatogênese (CASTRO et al., 1997). Em ovinos SPRD, MARTINS (2006) obteve um
rendimento geral da espermatogênese de 53,0 ± 16,3 (espermátide
arredondada:espermatogônia A), enquanto SOUZA (2003) observou para a mesma relação
103 ± 9,03, sendo este um valor bem maior que do estudo atual, indicando uma alta
capacidade de produção espermática, uma vez que cada espermátide, após sofrer uma série
de modificações, se diferenciam em espermatozóides. O número de espermatozóides
produzidos por grama de parênquima testicular é outra medida de eficiência da
espermatogênese e não é influenciada pela diferença no tamanho testicular entre os animais
(JOHNSON et al., 2000), sendo que no atual experimento o valor para esta produção foi de
64 x 10
6
(sptz/gT).
59
O rendimento meiótico refere-se à eficiência das divisões meióticas durante o
processo espermatogênico. Embora teoricamente quatro espermátides possam ser
produzidas a partir de um espermatócito primário, uma perda significativa é observada
nesta fase, sendo que o período mais crítico para que isto ocorra é a metáfase, no fim da
meiose (ROOSEN-RUNGE, 1973). De uma forma geral, nos mamíferos esta perda é em
torno de 25 % (FRANÇA e RUSSELL, 1998). No presente estudo este rendimento foi de
1:2,6, ou seja 1 espermatócito em paquíteno para cada 2,6 espermátide arredondada,
equivalendo a uma perda de 35% de espermátides arredondadas quando se compara com a
razão teórica esperada (1:4), se o rendimento da espermatogênese fosse 100%.
O rendimento máximo da espermatogênese depende da população de células de
Sertoli, que nos ovinos, é definida antes da puberdade (HOCHEREAU-DE-REVIERS et
al., 1987; SHARPE, 1994). Em termos de eficiência da produção espermática por unidade
de área de túbulo seminífero, o índice mais importante é o número de espermátides por
células de Sertoli (SHARPE, 1994; FRANÇA e RUSSELL, 1998). MARTINS (2006) em
ovinos SPRD obteve para este índice 17,6 ± 4,8, valor este que foi maior que do atual
experimento, demonstrando uma menor eficiência da capacidade de suporte das CS dos
animais em estudo. Segundo FRANÇA e RUSSELL (1998), o índice de células de Sertoli
varia consideravelmente entre as espécies e, normalmente, quando a relação células de
Sertoli:espermátides arredondadas é alta, a produção espermática diária também é alta,
pois a habilidade das células de Sertoli em fornecer suporte às espermátides é
correlacionada com a produção espermática diária por grama de parênquima testicular.
Correlação positiva e significativa foi descrita entre o número total de células
de Sertoli e de espermatogônias A1 por testículo (HOCHEREAU-DE-REVIERS et al.,
1987), confirmando que a eficiência da produção espermatogênica é estabelecida no início
da espermatogênese (JOHNSON et al., 1994).
60
Tabela 5. Proporções celulares entre diferentes tipos de células germinativas e células de
Sertoli em ovinos da raça Morada Nova (média ± erro-padrão da média).
Parâmetro
X ± EPM
Espermatogônia A:célula de Sertoli
0,1 ± 0,01
Espermatócito em paquíteno:célula de Sertoli
3,0 ± 0,20
Espermatócito em paquíteno:espermatogônia A
23,3 ± 1,35
Espermátide arredondada:espermatogônia A
59,8 ± 3,73
Espermátide arredondada:célula de Sertoli
7,7 ± 0,51
Espermátide arredondada:espermatócito em paquíteno
2,6 ± 0,08
As espermatogônias podem ser identificadas com base na morfologia, dinâmica
e volume do núcleo, número de nucléolos por núcleo, posição topográfica em relação a
outras células e lâmina basal, além da disposição dos cromossomos durante a mitose
(CLERMONT e ANTAR, 1973). A mensuração dos núcleos e nucléolos dos diferentes
tipos de células da linhagem germinativa e células de Sertoli podem ser vistas na Tabela 6.
Tabela 6. Mensurações dos núcleos e nucléolos dos diferentes tipos de células
germinativas e de Sertoli em ovinos da raça Morada Nova às 42 semanas de idade (média
± erro-padrão da média).
Tipos celulares
Diâmetro nuclear
Diâmetro nucleolar
Célula de Sertoli
8,8 ± 0,16
3,7 ± 0,17
Espermatogônia A
7,6 ± 0,22
3,3 ± 0,15
Espermatócito em paquíteno
8,4 ± 0,17
Espermátide arredondada
6,3 ± 0,08
Os valores obtidos tanto para as células germinativas quanto para as células de
Sertoli, foram semelhantes aos descritos por SOUZA (2003) para a raça Santa Inês às 50
61
semanas de idade, onde observou diâmetro nuclear de 9,2 ± 0,13 μm e 9,6 ± 0,15 μm e
nucleolar e 3,2 ± 0,08 μm e 2,6 ± 0,04 μm para espermatogônias A e CS, respectivamente e
diâmetro nuclear dos espermatócitos em paquíteno e espermátides arredondadas de 8,2 ±
0,14 μm e 5,7 ± 0,05, respectivamente.
Esses achados mostram que o núcleo das células germinativas e de Sertoli não
apresentam grandes variações em animais de diferentes raças e idades, apesar de que,
segundo WROBEL et al., (1995), algumas variações podem ser evidenciadas de acordo
com o estágio do ciclo do epitélio seminífero em que estas estejam, considerando que as
células germinativas passam por processos de mitose e meiose, e as CS possuem diferentes
demandas metabólicas conforme o tipo de célula germinativa que está sendo suportada,
uma vez que se alteram também seu volume citoplasmático, tipo e distribuição das
organelas,
4.4. Correlações entre biometria testicular e parâmetros quantitativos da
espermatogênese
O peso e o diâmetro testicular foram os dois parâmetros que se correlacionaram
com todas as variáveis histológicas, dentre elas o volume (r = 0,97 e r = 0,94) e
comprimento dos túbulos seminíferos (r = 0,73 e 0,73), número de células de Sertoli por
testículo (r = 0,50 e r = 0,53) e produção diária de espermátides arredondadas (r = 0,79 e r
= 0,74). As demais correlações são apresentadas na Tabela 7. Estas correlações também
foram encontradas por MARTINS (2006) em ovinos SPRD e SOUZA (2003) em ovinos
Santa Inês, mostrando assim que estas características são intrinsecamente correlacionadas e
que o diâmetro testicular (DT) mostrou-se novamente como um bom indicador da função
reprodutiva do carneiro.
62
QUEIROZ e CARDOSO (1989) encontraram correlações positivas altas entre
peso testicular e população de espermatócitos primários (r = 0,70) e espermátides
arredondadas (r = 0,89), correlação esta também evidenciada no atual estudo (Tabela 6). O
principal componente do testículo é o túbulo seminífero, assim, uma correlação positiva é
claramente estabelecida entre a massa testicular e a produção espermática (OLAR et al.,
1983; ASSIS NETO et al., 2003).
O tamanho do testículo tem alta correlação com o peso testicular, sendo um
importante parâmetro na avaliação andrológica de mamíferos, pois, além de fornecer
valiosas informações a respeito da normalidade do testículo, permite inferir sobre a taxa de
produção espermática (AMANN, 1970; OLAR et al., 1983). O número de células de
Sertoli também está altamente correlacionado com o tamanho testicular adulto e define a
capacidade potencial de produção de células germinativas (SHARPE, 1994; BIELLI,
1999).
Geralmente existe correlação positiva entre diâmetro tubular e a atividade
espermatogênica. Assim, o estudo quantitativo das células que compõem o epitélio
seminífero, em secções transversais dos túbulos seminíferos, é muito importante para a
análise do processo espermatogênico. Este estudo permite um conhecimento mais
completo da espermatogênese e também de como a estrutura testicular comporta-se em
condições fisiológicas, experimentais e patológicas (FRANÇA e RUSSELL, 1998). Todos
os parâmetros quantitativos relacionados com o túbulo seminífero, como diâmetro tubular,
espessura do epitélio seminífero e o comprimento total e por grama de testículo,
apresentam relação positiva com a atividade espermatogênica (FRANÇA e RUSSELL,
1998; PAULA, 1999).
Pode-se então sugerir, que se alguma destas características for afetada, isso
implicará em redução no diâmetro testicular, volume testicular, com conseqüência sobre a
63
altura do epitélio germinativo, ocasionando assim uma redução no número de células
germinativas e consequentemente na produção espermática. Baseando-se nisto, evidencia-
se no atual estudo, que há uma sincronia nestas relações descritas, o que é importante para
a eficiência do processo espermatogênico.
Tabela 7. Correlações entre a biometria testicular e características histológicas de ovinos
da raça Morada Nova.
PT
CT
DT
VPar
Volume dos túbulos seminíferos (mL)
r = 0,97**
r = 0,87**
r = 0,94**
r = 0,98**
Diâmetro tubular (μm)
r= 0,76**
r= 0,63*
r= 0,75**
r= 0,78**
Comprimento dos túbulos seminíferos (m)
r= 0,73**
r= 0,66**
r= 0,73**
r = 0,73**
N° de células de Sertoli/testículo
r = 0,50*
ns
r = 0,53*
ns
N° de espermatogônias A/testículo
r = 0,60*
ns
r = 0,63*
r = 0,61*
N° de espermatócitos em paquíteno/seção
r = 0,71**
r = 0,56*
r = 0,69**
r = 0,69**
N° de espermatócitos em
paquíteno/testiculo
r = 0,90**
r = 0,74**
r = 0,87**
r = 0,88**
N° de espermátides arredondadas/seção
r = 0,57*
ns
r = 0,50*
r = 0,51*
N° de espermátides arredondadas/testículo
r = 0,79**
r = 0,66**
r = 0,74**
r = 0,75**
Produção diária de espermatogônias A
r = 0,61*
ns
r = 0,63*
r = 0,61*
Produção diária de espermatócitos em
paquíteno
r = 0,90**
r = 0,74**
r = 0,87**
r = 0,88**
Produção diária de espermátides
arredondadas
r = 0,79**
r = 0,66**
r = 0,74**
r = 0,75**
* p < 0,05; ** p < 0,01; PT: peso testicular; CT: comprimento testicular; DT: diâmetro
testicular; VPar: volume do parênquima.
19
64
4.5. Mapas eletroforéticos das proteínas seminais
Em média, foram detectados 103,3 ± 18,5 “spots” por gel do plasma
seminal dos carneiros Morada Nova, de acordo com o gel máster gerado pelo aplicativo
PDQuest®, (Figura 1) o qual representa uma combinação da todos os spots presentes no
gel de referência (Figura 2), além dos “spots” adicionados dos outros géis, os quais foram
pareados. Um total de 45 “spots” foi detectado consistentemente em todos os mapas, e
apesar do total de “spots” presentes em todos os géis terem sido inferior a 50% do total de
“spots” detectados, estes representam 65,2 ± 4,4% da intensidade total dos “spots” válidos.
Os mapas eletroforéticos do plasma seminal dos ovinos Morada Nova mostraram-se
similares àqueles dos carneiros Santa Inês adultos (SOUZA et al., 2009; RÊGO et al.,
2009). Spots mais intensos são observados na faixa de pI de 4 a 6 e 14 e 22 kDa, faixa esta
que inclui proteinas já identificadas no plasma seminal de carneiros Santa Ines, como as
“Ram Seminal Vesicles Protein” (RSVP- 14) e “Bodhesins” (1 e 2). As RSVPs são
proteínas pertencentes à família das BSPs (Binder of Sperm Protein) (BERGERON et al.,
2005; CARDOZO et al., 2006; MANJUNATH et al., 2009). Elas atuam na função de proteção
dos espermatozóides, prevenindo (PÉREZ-PÉ et al., 2001) e reparando (BARRIOS et al.,
2000) danos na membrana espermática sofridos durante a criopreservação. Homólogos destas
proteínas (MANJUNATH et al., 2009) tem sido identificados nos fluidos do trato reprodutivo
de touros (MANJUNATH et al., 1987; MOURA et al., 2007a), eqüinos, suínos (CALVETE et
al., 1997) e caprinos (VILLEMURE et al., 2003). As bodesinas 1 e 2 são proteínas
pertencentes à família das espermadesinas e apresentam identidade com as espermadesinas
descritas recentemente na espécie caprina (MELO et al., 2008). Sugere-se que as
espermadesinas são capazes de influenciar diversas funções reprodutivas, incluindo
capacitação espermática, estabilização do acrossoma e fusão espermatozóide – oócito durante
65
o processo de fertilização (TÖPFER-PETERSEN et al., 1998). Inicialmente, apenas uma destas
espermadesinas foi caracterizada no plasma seminal caprino, e denominada de BSFP (Buck
Seminal Fluid Protein - Proteína do Fluido Seminal de Caprinos; TEIXEIRA et al., 2002;
2006). Posteriormente, foram identificados 4 genes codificando espermadesinas no trato
reprodutivo de caprinos, denominadas Bdh-1 a Bdh-4, sendo que a BSFP passou a ser
identificada como Bdh-2 (MELO et al., 2008).
66
Figura 1. Mapa das proteínas do plasma seminal de carneiros da raça Morada Nova,
representado através do “master gel” gerado com o software PDQuest (figura 1A), baseado
no mapa referência (figura 1B). Os géis foram obtidos com eletroforese bidimensional e
corados com Coomassie Blue.
1A
1B
67
5. CONCLUSÕES
Esse trabalho torna disponível, pela primeira vez, informações sobre a
fisiologia reprodutiva de carneiros Morada Nova, uma raça de ovinos altamente adaptados
ao clima tropical e que representa um grupamento genético único e de valor inestimável
para a formação de novas raças, cruzamentos ou mesmo programas de melhoramento da
raça já existente.
Em conjunto, esses resultados representam aspectos relacionados à biometria
testicular, epididimária e das glândulas sexuais acessórias, epitélio seminífero e
características do perfil protéico do plasma seminal. As medidas da gônada apresentaram
correlações com as demais estruturas do trato reprodutivo e atividade espermatogênica, o
que viabiliza a inclusão destes parâmetros em programas de aferição da capacidade
potencial de produção espermática dos animais. Os mapas eletroforéticos do fluido seminal
mostraram-se muito semelhantes àqueles de ovinos Santa Inês adultos, com a expressão de
spots que predizem a presença de importantes proteínas no plasma seminal, fundamentais
para a função espermática e fertilidade dos reprodutores.
Os estudos conduzidos sobre a fisiologia reprodutiva dos animais Morada
Nova servirão de base para pesquisas futuras que visam a implementação de biotécnicas da
reprodução e estratégias de manejo eficiente destes rebanhos.
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