( PDF ) Estudo das alterações cromossômicas e análise de metilação nos genes p15INK4B e p16INK4A em síndrome mielodisplásica primária na infância no estado do Rio de Janeiro

Download PDF

ads:

Eliane Ferreira Rodrigues

Estudo das Alterações Cromossômicas e

Análise de Metilação nos Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância no Estado

do Rio de Janeiro

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – 2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ELIANE FERREIRA RODRIGUES

Estudo das Alterações Cromossômicas e Análise de Metilação nos

Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

em Síndrome Mielodisplásica Primária

na Infância no Estado do Rio de Janeiro

2007

Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de

Pós-

graduação em Biofísica, Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio

de Janeiro, co

mo parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Ciências.

Orientadoras: Teresa de Souza Fernandez

Eliana Saul Furquim Werneck

Abdelhay

ads:

RODRIGUES, Eliane Ferreira

Estudo das Alterações Cromossômicas e Análise de Metilação nos Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância no Estado do Rio de

Janeiro / Eliane Ferreira Rodrigues. Rio de Janeiro: UFRJ, IBCCF, 2007.

XVIII, 119 p.

Orientadoras: Teresa de Souza Fernandez e Eliana Saul Furquim Werneck

Abdelhay

Dissertação (Mestrado em Ciências) – UFRJ/ IBCCF/ Programa de Pós-

graduação em Biofísica - Biologia Molecular, 2007.

Referências Bibliográficas: f. 82-93

1. Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância. 2. Alterações

Cromossômicas. 3. Metilação 4. p15

INK4B

e p16

INK4A

. I Fernandez, Teresa de Souza;

Abdellhay, Eliana Saul Furquim Werneck II. Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em

Biofísica. III. Título

iii

Este trabalho foi desenvol

vido no Laboratório de Citogenética, no Centro de Transplante de Medula

Óssea do Instituto Nacional do Câncer (CEMO-

INCA), em colaboração com o Serviço de Genética

Humana da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (SERVGEN-UERJ).

Durante o desenvolviment

o deste projeto de pesquisa fomos beneficiados por auxílios do Ministério

da Saúde- INCA e da FAPERJ.

A minha amada família.

AGRADECIMENTOS

- À Deus por ter me protegido e acompanhado em toda a minha caminhada;

- Aos meus pais pelo amor incondicional, incentivo, apoio, compreensão e paciência ao

longo de toda a minha vida;

- Ao meu irmão por se fazer presente na minha vida e pelo apoio e incentivo;

- Ao meu namorado Leonardo, por tornar meus dias mais felizes e me incentivar a cada dia

a seguir sempre em frente, por toda a sua ajuda na confecção desta tese, compreensão, carinho

e paciência;

- Ao Dr. Luis Fernando Bouzas diretor do CEMO-INCA, pela oportunidade e todo o apoio

que recebemos para realização deste projeto de pesquisa;

- À Dra. Teresa de Souza Fernandez, minha orientadora, por acreditar no meu potencial

incentivando-me a sempre conseguir o melhor, por todo conhecimento transmitido e

principalmente pela amizade;

- À Dra. Eliana Abdelhay pelo seus ensinamentos, experiência, apoio e auxílio durante a

elaboração desta tese;

- Às Professoras Dra. Cíntia Barros Santos-Rebouças e Dra. Márcia Mattos Gonçalves

Pimentel do Laboratório de Serviço de Genética Humana da Universidade do Estado do Rio

de Janeiro (SERVGEN-UERJ), pela valiosa colaboração e enorme ajuda em toda a parte de

biologia molecular;

- À Dra. Gilda Alves Brown do Laboratório de Genética Aplicada – Serviço de

Hematologia do INCA pelo auxílio na obtenção e no cultivo da linhagem celular DLD-1;

- Aos pesquisadores Dr. André Vettore e Dra. Andréa Seixas e ao técnico Fabrício de

Carvalho do Instituto de Ludwig São Paulo por cederem a linhagem DLD-1 para a nossa

pesquisa;

vii

- À Dra. Hilda do Laboratório de Imunologia do Centro de Transpalnte de Medula Óssea –

INCA por ter cedido a linhagem Raji para a nossa pesquisa;

- À Beatriz e Lílian do Programa de Biologia Molecular do Instituto de Biofísica -UFRJ,

pelo auxílio no sequenciamento das amostras;

- Ás minhas amigas Daiane e Michelle por todo o carinho e companherismo durante toda a

minha vida acadêmica, e pelo enorme laço de amizade que nos une;

- Às minhas amigas Adriana e Luize por toda a ajuda prática, pelos conselhos e pelas

demonstrações de carinho e amizade ao longo destes anos;

- Aos amigos de trabalho Aline, Moises, Amanda e Luciano por todos os momentos de

descontração;

- Aos mais recentes amigos Eleonidas e Elenice por suas preciosas dicas e experiência;

- À todas as pessoas do laboratório SERVGEN-UERJ, Claúdia, Mário, Jussara, Juliana,

Karla, Natália, Adriana, Cristiane e Mariana por terem me recebido com carinho e amizade no

laboratório;

- À toda equipe do CEMO, médicos, enfermeiros e técnicos que de certa forma

contribuíram para a realização deste projeto;

- Aos meus professores da Faculdade de Formação de Professores da UERJ que

contribuíram para minha formação;

viii

RESUMO

A Síndrome Mielodisplásica (SMD) primária é rara na infância representando cerca de

4% de todas as malignidades hematológicas desta faixa etária. Devido a sua raridade muitas

vezes torna-se difícil o seu diagnóstico. Alterações citogenéticas envolvendo o cromossomo 7

(-7/7q-) representam as principais alterações neste grupo de pacientes e estão associadas com

mau prognóstico. Entretanto, existem controvérsias em relação ao valor prognóstico de

algumas alterações cromossômicas como +8 e del(11)(q23). Mudanças no padrão de

metilação do DNA são freqüentemente observadas em adultos e parecem estar associadas

com a transformação leucêmica. No entanto, poucos estudos mostraram o papel de mudanças

no padrão de metilação em genes importantes que controlam o ciclo celular, como p15

INK4B

p16

INK4A

em SMD na infância. Este trabalho apresentou como objetivos caracterizar as

alterações cromossômicas em SMD primária na infância e analisar a presença de metilação na

região promotora dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

, no sentido de identificar marcadores

biológicos que auxiliem o diagnóstico e a definição de fatores prognósticos, contribiundo na

escolha de protocolos de tratamento. Foram analisados citogeneticamente, no período de 1991

a 2006, 64 pacientes, com idades entre 5 meses a 18 anos. A análise citogenética foi realizada

através da técnica de bandeamento G e através da citogenética molecular (FISH). A

frequência de cariótipos anormais foi 72% dos 61 pacientes analisados. Em três casos o índice

mitótico foi nulo. De acordo com a classificação para SMD da infância, 35 pacientes

apresentaram CR, 14 AREB, 10 AREB-t e 5 LMMJ. Nos subtipos mais avançados da doença

a freqüência de casos com alterações cromossômicas foi maior. As anomalias cromossômicas

mais freqüentes foram: -7/7q

, del(11)(q23), cariótipos complexos e del(17)(p12). Não foi

verificada uma alteração cromossômica específica por subtipo. Nossos resultados sugerem

que o padrão cromossômico em SMD primária na infância é caraterizado principalmente por

perdas parcias e completas de cromossomos (deleções e monossomias), assim como ganhos

cromossômicos (trissomias). A análise citogenética auxiliou no diagnóstico dos casos com

suspeita de SMD primária pediátrica e foi uma importante ferramenta para a escolha do

tratamento. O estudo da presença de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

p16

INK4A

em 45 pacientes foi realizado pela técnica reação em cadeia da polimerase específica

para a metilação (MSP). Todas as amostras positivas para a metilação de ambos os genes

foram sequenciadas, como metodologia confirmatória. A análise molecular revelou que 16

pacientes (35,5%) apresentaram metilação para o gene p15

INK4B

e apenas 4 (8,8%) para o

gene p16

INK4A

. As maiores freqüências de metilação para os genes p15

INK4B

e p16

INK4A

foram

observadas nos subtipos mais agressivos de SMD. Evolução da doença foi verificada em 22

pacientes (36%). A correlação entre a presença de uma alteração cromossômica específica

com metilação nos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

mostrou uma forte associação entre a metilação

em p15

INK4B

e alterações envolvendo o cromossomo 7, sugerindo uma provável via de

evolução da doença. Nossos resultados sugerem que as alterações cromossômicas, -7/7q-; +8

e del(11)(q23), e a presença de metilação em p15

INK4B

e p16

INK4A

estão associadas com mau

prognóstico, sendo prováveis marcadores biológicos de evolução da doença.

ABSTRACT

Primary Myelodysplastic Syndrome (MDS) is rare in children representing around 4%

of all hematologic malignancies in childhood. Because of its rarity the diagnosis is usually

difficult. Chromosomal alterations involving chromosome 7 (-7/7q-) represent the main

alteration in this group of patients and are associated with poor prognosis. However, there is

controversy in relation of prognosis value of some chromosomal alterations as +8 and

del(11)(q23). Changes on the DNA methylation pattern are frequently observed in adults and

seem to be associated with leukemic transformation. Nevertheless, few studies investigated

the role of changes on methylation pattern in important genes that regulate cell cycle, as

p15

INK4B

and p16

INK4A

in primary MDS in childhood. The aim of this study was to characterize

chromosomal alterations in childhood MDS and analyze the presence of methylation in

promoter regions of p15

INK4B

and p16

INK4A

genes, to identify biologic markers that would aid

the diagnosis and the definition of prognostic factors, contributing on treatment choice. In this

study 64 patients with age between 5 months to 18 years old were analyzed cytogenetically,

between 1991 and 2006. Cytogentic analysis was performed by G banding and by molecular

cytogenetic (FISH). The frequency of abnormal karyotypes was 72% in 61 patients analyzed.

In three cases the mitotic index was null. Acording to the classification of primary MDS in

childhood, 35 patients presented CR, 14 RAEB, 10 RAEB-t and 5 JMML. In more advanced

subtypes of disease the frequency of cases with chromosomal alterations was higher. The

most frequent chromosomal abnormalities were: -7/7q

, del(11)(q23), complex karyotypes and

del(17)(p12). No specific chromosomal alteration could be related to subtype. Our results

suggest that the chromossomal pattern in primary MDS childhood is characterized mainly by

partial and complete lose of chromosomes (deletion and monosomy), as well as chromosomal

gain (trisomy). The cytogenetic analysis aided in diagnosis of cases with suspicion of

pediatric primary MDS and it was an important tool for treatment choose. The study of

methylation in the promoter region of p15

INK4B

and p16

INK4A

genes in 45 patients was

performed by methyl specific polymerase chain reaction

(

MSP). All samples positive for

methylation in both genes were sequenced as a confirmatory methodology. The molecular

analysis revealed that 16 patients (35,5%) presented methylation on p15

INK4B

gene and 4

(8,8%) on p16

INK4A

gene. The higher frequency of methylation in p15

INK4B

and p16

INK4A

genes

was observed in more aggressive subtypes of MDS. Evolution of disease was verified in 22

cases (36%). The correlation between karyotype and methylation in the p15

INK4B

and p16

INK4A

genes showed a strong association between methylation in p15

INK4B

gene and alterations

involving chromosome 7, suggesting a pathway of disease evolution. Our results suggest that

chromosomal alterations –7/7q-, +8, del(11)(q23) and the presence of methylation in p15

INK4B

and p16

INK4A

were associated with poor prognosis, being possibe biologic markers of disease

evolution.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A adenina

ALIP localização anormal de precurssores imaturos

AR anemia refratária

ARDM

anemia refratária com displasias multilinhagem

ARDM-SA

anemia refratária com displasias multilinhagem com sideroblastos em anel

AREB anemia refratária com excesso de blastos

AREB-t anemia refratária com excesso de blastos em transformação

ARSA anemia refratária com sideroblastos em anel

ARA-C arabinosídeo citosina

ATG anti-linfócito globulina

C citosina

CDK quinases dependentes de ciclinas

CDKI inibidores de quinases dependentes de ciclinas

CpG região de alta densidade de dinucleotídeos citosina-guanina

CR citopenia refratária

CSF-1 fator estimulador de colônia 1

CTH células tronco hematopoéticas

DAPI

4,6-diamidino-2-fenilindol

dATP 2’ desoxiadenosina 5’ trifosfato

dCTP 2’ desoxicitidina 5’ trifosfato

del deleção

dGTP 2’ desoxiguanosina 5’ trifosfato

DNA ácido desoxirribonucléico

DNMT DNA metiltransferase

dNTPs desoxirribonucleotídeos trifosfatos

dTTP 2’ desoxitimidina 5’ trifosfato

EDTA ácido etilenodiaminotetrácético

FAB Grupo Franco-Americano-Britânico

FISH

hibridização “in situ” por fluorescência

FITC isotiocianato de fluoresceína

G guanina

GCB-MDS-PED

Grupo Cooperativo Brasileiro em SMD Pediátrica

GDP guanosina 5’ difosfato

GM-CSF

fator de estimulação de colônias granulócito-macrófago

GTP guanosina 5’ trifosfato

GTPase guanosina trifosfatase

G6PD glicose 6 fosfato desidrogenase

HDACs histonas desacetilases

HLA antígeno de histocompatibilidade

HPRT hipoxantina fosforibosil transferase

IMT

inibidores da metiltransferase

inv inversão

IPSS Sistema Internacional de Escala Prognóstica

Kilobases

LA leucemia aguda

LLA leucemia linfoblástica aguda

LMA leucemia mielóide aguda

xii

LMMC leucemia mielomonocítica crônica

LMMJ leucemia mielomonocítica juvenil

M metilado

MO medula óssea

mL mili litro

MPBs proteínas ligadoras de CpGs metilados

MSP reação em cadeia da polimerase específica para a metilação

NF1 neurofibromatose do tipo 1

OMS Organização Mundial de Saúde

p braço curto do cromossomo

Ph cromossomo Philadelphia

pRB proteína de retinoblastoma

q braço longo do cromossomo

RFLP polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição

RNA ácido ribonucléico

rpm rotações por minuto

RPMI “Roswell Park Memorial Institute” - meio de cultivo de células

SAM S-adenosil-L-metionina

SD Síndrome de Down

SMD Síndrome Mielodisplásica

T timina

t translocação

TCTCU transplante de células tronco de cordão umbilical

TCTH transplante de células tronco hematopoéticas

xiii

TMO transplante de medula óssea

TNF-α

fator de necrose tumoral- α

TNFR-α

receptor de fator de necrose tumoral- α

U não metilado

+ ganho de cromossomo

- perda de cromossomo

ºC graus Celsius

xiv

ISTA DE FIGURAS

Figuras

Modelo de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD..........................................

Região de metilação na seqüência do DNA e adição do grupamento metila pelas

enzimas DNMT..............................................................................................................

Atividade transcricional do gene de acordo com o padrão de metilação.......................

Modelo para o silenciamento transcricional dependente de metilação..........................

Classificação da Síndrome Mielodisplásica e Doenças Mieloproliferativas na

Infância...........................................................................................................................

Efeito do tratamento com bissulfito em uma amostra de DNA com seqüências ricas

em dinucleotídeos CpG..................................................................................................

Freqüência das alterações cromossômicas em SMD primária na infância....................

Análise por hibridização in situ por fluorescência utilizando a sonda de dupla

marcação do cromossomo 7 e a sonda da região 11q23 (MLL) ....................................

Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH) utilizando a sonda

da região p13.1 do cromossomo 17 (p53) e a sonda da região 11q23 (MLL) ...............

Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH) utilizando a sonda

de dupla marcação do cromossomo 5............................................................................

Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH) utilizando a sonda

da região p13.1 do cromossomo 17 (p53) .....................................................................

Análise por hibridização in situ por fluorescência utilizando a sonda de dupla

marcação do cromossomo 7 ..........................................................................................

Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos

produtos de PCR referente a análise de metilação do gene p15

INK4B

após a

modificação do DNA com bisulfito ............................................................................

Análise do sequenciamento do gene p15

INK4B

(5’→ 3’) através do programa

“BioEdit Sequence Alignment Editor” ........................................................................

Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos

produtos de PCR referente à análise de metilação da região promotora do gene p16

após a modificação do DNA com bisulfito ...................................................................

Análise do sequenciamento do gene p16

INK4A

(5’→ 3’) através do programa

“BioEdit Sequence Alignment Editor” .........................................................................

Correlação entre a presença de metilação nos genes p15

INK4B

e 16

INK4A

e o cariótipo

em crianças portadoras de SMD primária .....................................................................

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabelas

Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo os critérios propostos pelo

Grupo FAB em 1982 ....................................................................................................

Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo a proposta OMS em 2000..... 6

Pontuação segundo os Parâmetros Críticos do IPSS (1997) em Síndromes

Mielodisplásicas ...........................................................................................................

Diferenças entre SMD em Crianças e em Adultos ....................................................... 22

Oligonucleotídeos utilizados na técnica MSP para análise dos genes p15

INK4B

p16

INK4A

..........................................................................................................................

Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância .................. 41

Freqüência de Casos com Cariótipos Anormais em SMD Primária na Infância .......... 45

Distribuição do Padrão Cromossômico por Subtipo de SMD Primária na Infância .... 47

Freqüência de Pacientes com SMD Primária na Infância de acordo com o IPSS

(1997) que mostraram evolução da doença...................................................................

Identificação de Metilação no Gene p15

INK4B

em SMD Primária na Infância .............. 55

Freqüência de Metilação no Gene p15

INK4B

nos Subtipos da SMD Primária na

Infância............................................................................................................................

Identificação de Metilação no Gene p16

INK4A

em SMD primária na infância ............... 59

Freqüência de Metilação no Gene p16

INK4A

nos Subtipos da SMD Primária na

Infância............................................................................................................................

Correlação entre a Presença de Metilação nos Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

com o

Padrão Cromossômico em SMD Primária da Infância ..................................................

xvii

SUMÁRIO

Resumo.............................................................

....................................................................

viii

Abstract.................................................................................................................................

Lista de abreviaturas e siglas............................................................................................ ...

Lista de figuras.....................................................................................................................

xiv

Lista de tabelas.....................................................................................................................

xvi

1. Introdução.........................................................................................................................

1.1 Síndrome Mielodisplásica........................................................................................... 1

1.1.1 Classificação e Escala Prognóstica em SMD Primária..........................................

1.1.2

Teoria de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD Primária.....................

1.1.3 Alterações Cromossômicas em SMD Primária ....................................................

1.1.4 Oncogengenes e Genes Supressores de Tumor Envolvidos no Desenvolvimento

da SMD Primária..................................................................................................................

1.1.5 Alterações Epigenéticas em SMD Primária: Metilação dos Membros da

Família InK4 p15 e p16

.......................................................................................................

1.1.6

SMD Primária na Infância.....................................................................................

2. Obj

etivos...........................................................................................................................

3. Materiais e Métodos.........................................................................................................

3.1 Pacientes......................................................................................................................

3.2 Análise Citogenética ..............................................................................................

.....

3.2.1

Cultura de Células de Medula Óssea.....................................................................

3.2.2 Término das Culturas e Preparação das Lâminas.............................................

.....

3.2.3 Bandeamento G.....................................................................................................

3.2.4 Análise Cromossômica ..............................................................................

...........

3.3 Citogenética Molecular: Análise por Hibridização “in situ” por Fluorescência

(FISH)...................................................................................................................................

3.4 An

álise Molecular........................................................................................................

3.4.1 Cultura de Células da Linhagem DLD-

1 e Raji.....................................................

3.4.2 Ext

ração de DNA...................................................................................................

3.4.3 Análise de Metilação dos Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

pelo Método MSP..............

3.4.3.1 Tratamento do DNA com

Bisulfito.................................................................

3.4.3.2

Reação em Cadeia da Polimerase Específica para a Metilação (MSP)...........

3.4.3.3 Avaliação dos Produtos Gerados pela PCR nos Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

....

xviii

3.4.3.4 Sequenciamento de DNA................................................................................

4. Resultados........................................................................................................................

4.1 Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância.................

4.1.1 Freqüência de Casos com Alterações Cromossômicas por Subtipos de SMD

Primária na Infância .........................

....................................................................................

4.2 Citogenéica Molecular: Aplicação do FISH em SMD Primária na Infância...............

4.3 Distribuição dos Pacientes com SMD Primária na Infância segundo os Grupos de

Risco (IPSS)..........................................................................................................................

4.4 Análise Molecular........................................................................

................................

4.4.1 Análise da Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p15

INK4

Pacientes com SMD Primária na Infância ...........................................................................

4.4.1.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação

do Gene p15

INK4B

.................................................................................................................

4.4.2 Freqüência de Metilação em p15

INK4B

nos Subtipos de SMD Primária na

Infância ................................................................................................................................

4.4.3 Análise da Freqüência de Metilação no Gene p16

INK4A

em Pacientes com SMD

Primária na Infância .............................................................................................................

4.5.3.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação

do Gene p16

INK4A

..................................................................................................................

4.4.4 Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p16

INK4A

nos

Subtipos de SMD Primária na Infância ...............................................................................

4.5 Correlação entre a Presença de Metilação nos Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

e o

Padrão Cromossômico em SMD Primária na Infância ........................................................

5. Discussão..........................................................................................................................

6. Conclusões.........................................................................................

...............................

7. Referências Bibliográficas................................................................................................

8. Anexos .............................................................................................................................

8.1 Anexo 1...........................................................................................................................

8.1.1 Aprovação pelo Comitê de Ética do Projeto de Pesquisa ..........................................

8.1.2 Termo Informado e Esclarecido..................................................................................

8.2 Anexo 2 ............................................................................

..............................................

8.2.1 Cariótipos.................................................................................................................. 99

1. INTRODUÇÃO

1.1 Síndrome Mielodisplásica

A síndrome mielodisplásica (SMD) compreende um grupo de doenças hematopoéticas

de natureza clonal de célula tronco pluripotente, que se caracteriza por uma hematopoese

ineficaz, apoptose intramedular aumentada, presença de displasias na medula óssea e

citopenias em uma ou mais linhagens (DELFORGE, 2003).

Uma grande variedade de agentes genotóxicos têm sido implicada na sua etiologia,

sendo os mais conhecidos e estudados as drogas citotóxicas, especialmente os agentes

alquilantes e os inibidores da topoisomerase II, nestes casos a SMD é denominada secundária

(NISSE et al., 2001).

As SMDs primárias, ou “de novo”, ocorrem quando o paciente não foi submetido a

nenhum tratamento prévio com medicamentos citotóxicos nem esteve em contato com agentes

mutagênicos, não havendo portanto causa conhecida para o aparecimento da doença.

Entretanto, há um consenso de que fatores hereditários, ambientais e a senescência da

hematopoese podem influenciar no surgimento da SMD (LORAND-METZE, 2005). A SMD

primária afeta preferencialmente pessoas acima dos 50 anos de idade, sendo rara na infância.

A incidência anual desta síndrome é de aproximadamente 3.5-10 a cada 100.000 indivíduos

da população geral e de 12-50 a cada 100.000 indivíduos da população idosa. O aumento da

freqüência e da incidência da SMD podem ser atribuídos ao crescimento da expectativa de

vida e ao reconhecimento e diagnóstico desta doença (NISHINO & CHANG, 2005).

A história natural da SMD é altamente variável, podendo apresentar formas brandas,

com sobrevivência alta e baixa taxa de transformação leucêmica ou formas mais agressivas

que podem evoluir rapidamente para leucemia mielóide aguda (LMA). Pacientes com SMD

raramente transformam para leucemia linfóide aguda (LLA) (DELFORGE, 2003).

Uma das características da SMD é a presença de citopenias periféricas, isoladas ou em

associação. As citopenias mais comuns em SMD são anemia, neutropenia e a

trombocitopenia. Uma outra característica é a presença de alterações morfológicas decorrentes

de defeitos de diferenciação celular chamadas de displasias. Estas alterações ocorrem

principalmente nas linhagens eritróide, granulocítica e megacariocítica (OGATA, 2006).

A renovação celular é aumentada na maioria dos pacientes com mielodisplasia, sendo

a medula óssea geralmente, hipercelular ou normocelular. O aparente paradoxo entre medula

óssea hipercelular e sangue periférico com citopenias foi esclarecido quando se mostrou que

pacientes com SMD apresentam taxas de apoptose intra-medular aumentada, causando assim

as citopenias no sangue periférico. Nos estágios mais avançados da doença a taxa apoptótica

diminui, permitindo a proliferação de células imaturas (blastos) e contribuindo para a

transformação leucêmica (PARKER et al., 2000; HELLSTRÖM-LINDBERG et al., 2000).

Em alguns casos raros, pacientes podem apresentar a medula óssea hipocelular, podendo levar

a um diagnóstico duvidoso com anemia aplástica (WONG & SO, 2002). A SMD é

considerada hipocelular se tiver menos de 30% de celularidade em indivíduos jovens, e menos

de 20% em indivíduos idosos (TOMONAGA & NAGAI, 2002).

O diagnóstico da SMD é feito inicialmente através de um hemograma (que indica a

presença de uma ou mais citopenias no sangue periférico e ausência de resposta para vitamina

B12 e ácido fólico), seguido da análise de biópsia e de mielograma de medula óssea para

identificar as displasias presentes, a possível presença de blastos caracterizando estágios mais

avançados da doença e a presença de precursores imaturos com localização anormal (ALIP).

Estudos adicionais auxiliam no estabelecimento do diagnóstico, incluindo a análise

citogenética e a imunofenotipagem (LIST et al., 2004).

Grande variedade de tratamentos vem sendo utilizada em pacientes adultos e crianças

com SMD primária, com o objetivo de eliminar as citopenias, assim como de recuperar a

hematopoese. Uma das terapias utilizadas é a de suporte que envolve as transfusões

sanguíneas, antibióticos, fatores de crescimento isolados ou em combinação, ciclosporina ou

anti-linfócito globulina (ATG) que são também utilizados em pacientes que apresentam

medula óssea hipocelular. Nos subtipos mais avançados da SMD (AREB, AREB-t, LMMC) é

utilizada a quimioterapia com agente único: hidroxiurea, etoposídeo, mercaptopurina, baixa

dose de arabinosídeo citosina (ARA-C). Em alguns casos é utilizada a quimioterapia intensiva

similar àquela dada a pacientes com LMA, como a combinação de fludarabina e alta dose de

ARA-C, induzindo a remissão nesses doentes (HELLSTRÖM-LINDBERG et al., 2000).

O transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH) alogenêico é a única opção

terapêutica curativa para pacientes com SMD, no entanto, o seu uso é limitado a pacientes até

55 anos de idade e que possuam doadores histocompatíveis (GIRALT, 2005; WONG et al.,

2005). Para pacientes jovens com SMD ou LMA secundária a SMD, o TCTH alogenêico é

apontado como a melhor opção de tratamento (YUSUF et al., 2004; ESPIGADO et al., 2005).

Atualmente, o sangue de cordão umbilical tem sido utilizado como uma satisfatória fonte de

células tronco para diversos grupos de pacientes adultos e pediátricos. Estudos demonstraram

que após o transplante de sangue de cordão umbilical a taxa de recaída, de sobrevida livre da

doença e a sobrevida total dos pacientes com malignidades mielóides é similar a de outras

fontes de células tronco hematopoéticas (BALLEN et al., 2006; BRUNSTEIN et al., 2007).

Desta forma, o sangue de cordão umbilical é uma fonte alternativa de células tronco

hematopoéticas para pacientes que necessitam de um transplante alogenêico, mas não

apresentam doadores histocompatíveis.

Com a delineação das características biológicas que norteiam o fenótipo da SMD,

novas drogas introduzidas no tratamento desta doença têm mostrado um grande potencial

terapêutico. Como por exemplo, agentes imunossupressores, anti-angiogênicos

(principalmente a talidommida) (MUSTO, 2004), citoprotetores (amifostina), inibidores do

receptor da tirosina quinase (mesilato de imatinibe) (GILES et al., 2003) e inibidor de farnesil

transferase (inibidor da via Ras) (KURZROCK et al., 2004). Além disso, uma nova classe

terapêutica chamada inibidores da metiltransferase (IMT) vem sendo utilizada no tratamento

da SMD. Os representantes desta classe incluem a azacitidina (5-azacitidina) e decitabina (5-

aza 2’ deoxicitidina). Ambos são agentes hipometilantes que se incorporam no DNA e então

irreversivelmente ligam-se e inibem a ação da DNA metiltransferase. Esta interação resulta

inicialmente em um DNA semi-metilado, no entanto, após outros ciclos celulares, este, torna-

se totalmente não metilado. A ação destes fármacos leva à reativação de genes

epigeneticamente reprimidos, como genes supressores de tumor. Resultados iniciais

demonstraram que pacientes com SMD de alto risco têm um aumento no tempo de

transformação para LMA e sobrevida (SILVERMAN & MUFTI, 2005; ATALLAH et al.,

2007).

Devido à introdução de novas formas de tratamento torna-se importante o estudo da

correlação das características citogenéticas, celulares e moleculares com as características

clínicas da doença e a resposta ao tratamento, auxiliando desta forma no desenvolvimento de

esquemas de classificação e de escalas prognósticas.

1.1.1 Classificação e Escala Prognóstica em SMD Primária

Até 1976 as mielodisplasias incluíam uma variedade de anormalidades hematológicas

classificadas como síndromes ou estados pré-leucêmicos. Entretanto, essa classificação era

insatisfatória, uma vez que não havia um termo definido para designar as citopenias

geralmente associadas com a medula hiperplásica, com displasias e progressão variável para

leucemia aguda.

Em 1982, um grupo internacional de hematologistas franceses, americanos e britânicos

(grupo FAB) aplicou o nome “síndrome mielodisplásica” e classificou esta doença em 5

subtipos (tabela 1), usando como critérios a porcentagem de blastos na medula óssea e no

sangue periférico e características morfológicas (a presença ou ausência de sideroblastos em

anel e de bastões de Auer) (BENNETT et al., 1982).

Tabela 1: Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo os Critérios propostos pelo

Grupo FAB em 1982

Células Blásticas (%)

Subtipo

Monócitos

(µ

µµ

µl) Sangue

Periférico

Sideroblastos

em anel

(%) Medula óssea

Sangue

Periférico

Medula

óssea

Bastões de Auer

Medula óssea

Não < 15 < 1 < 5 Não

ARSA

Não > 15 < 1 < 5 Não

AREB

Não Não < 5 5 - 20 Não

AREB-t

Não Não > 5 20 - 30 Sim ou Não

LMMC

> 1000 Não < 5 < 20 Não

AR- anemia refratária; ARSA- anemia refratária com sideroblastos em anel; AREB- anemia refratária

com excesso de blastos; AREB-t- anemia refratária com excesso de blastos em transformação;

LMMC- leucemia mielomonocítica crônica (BENNETT et al., 1982).

Desde que foi introduzida, vários estudos comprovaram a utilidade da classificação

FAB, tanto para o monitoramento de estudos envolvendo um grande número de pacientes

com SMD, permitindo comparações entre os diversos trabalhos, quanto para o tratamento de

pacientes. No entanto, para a determinação de um prognóstico preciso, esta classificação

apresentava alguns problemas: distinguia somente duas categorias de risco, baixo (AR e

ARSA) e alto risco (AREB, AREB-t e LMMC) e dentro de um mesmo subgrupo FAB os

pacientes mostravam grandes variações na evolução da doença e na sobrevivência,

especialmente dentro dos subgrupos AR e ARSA. A denominação “anemia refratária” nem

sempre é adequada, sendo a anemia apenas uma de três possíveis citopenias em SMD; a

expressão citopenia refratária foi sugerida por alguns autores (GARANDEAU et al., 2000). A

LMMC apresenta em alguns casos características de síndrome mielodisplásica e em outros de

síndrome mieloproliferativa, desta forma sua inclusão na SMD vem sendo discutida nas

classificações mais recentes, como a classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS)

(tabela 2) (HARRIS et al., 2000).

Tabela 2: Classificação das Síndromes Mielodisplásicas segundo a proposta OMS em 2000.

Subtipo Sangue periférico Medula óssea

anemia / ausência de blastos

blastos <5%

celularidade variável

atipias discretas

ARSA

anemia

ausência de blastos

monócitos <1%

blastos <5%

sideroblastos em anel >15%

atipias discretas

ARDM

citopenias

sem ou raros blastos

displasia em : 10% das células

de 2 ou 3 linhagens

blastos <5%

sem bastonetes de Auer

ARDM - SA

citopenias

sem ou raros blastos

displasia em 2 ou 3 linhagens

blastos <5%

sem bastonetes de Auer

sideroblastos em anel >15%

AREB-1

blastos <5%

pancitopenia

blastos 5-9%

hipercelular com atipias

nas 3 séries

AREB-2

blastos <5%

pancitopenia

blastos 10-19%

hipercelular com atipias

nas 3 séries

Síndrome 5q-

anemia / blastos < 5%

plaquetas normais ou

aumentadas

micromegacariócitos

blastos < 5%

citogenética : del(5q)

SMD não

classificada

neutropenia e/ou plaquetopenia

mas não anemia

blastos <5%

atipias discretas

AR: Anemia Refratária; ARSA: Anemia Refratária com Sideroblastos em Anel; AREB: Anemia

Refratária com Excesso de Blastos; ARDM: Anemia Refratária com Displasia Multilinhagem;

ARDM-SA: Anemia Refratária com Displasia Multilinhagem com Sideroblastos em Anel; SMD:

Síndrome Mielodisplásica (Harris et al , 2000).

A Organização Mundial da Saúde sugeriu novos critérios de classificação para SMD,

sendo incorporado muitos conceitos e definições do sistema FAB. Esta classificação

acrescentou dados para melhorar a definição dos subgrupos, assim como a sua relevância

clínica. A maior diferença entre as duas classificações é o desaparecimento do subtipo AREB-

t, sendo considerada a transformação para LMA a partir de 20% de blastos na medula óssea

(HARRIS et al., 2000).

As citopenias refratárias, com ou sem sideroblastos, são divididas em AR e ARSA,

quando a medula óssea apresenta somente uma displasia, e em citopenia refratária com

displasia em multilinhagem (CRDM) e CRDM com sideroblastos em anel (CRDM-SA),

quando a medula óssea apresenta várias displasias.

Foram criados dois subtipos para AREB: AREB-1 (5 a 10% de blastos na medula

óssea) e AREB-2 (11 a 20% de blastos na medula óssea). O subtipo LMMC foi retirado da

categoria de SMD para um novo grupo de doenças mielodisplásicas /mieloproliferativas.

Dados citogenéticos foram incorporados à classificação OMS, como a adição do

subtipo síndrome do 5q-, como uma entidade separada. Esta síndrome é bem estabelecida

entre os pacientes com SMD, estando associada com características clínicas específicas como

anemia macrocítica, hiperplasia micromegacariocítica, menos de 5% de mieloblastos

medulares com um diagnóstico de AR. A faixa etária alvo é constituída principalmente por

pacientes acima dos 50 anos de idade e do sexo feminino (MHAWECH P & SALEEM,

2001).

Apesar de ter como objetivos melhorar o valor prognóstico e clínico da classificação

FAB, esta classificação levantou algumas críticas (HEAD, 2002; HELLSTRÖM-LINDBERG

et al., 2000). As principais falhas apontadas foram a criação de categorias imprecisas e sem

bases biológicas ou genéticas (citopenias refratárias com displasias de várias linhagens e

SMD inclassificável) e a falta de precisão prognóstica. Estudos recentes comparando ambas

classificações sugerem que a classificação da OMS estabelece subgrupos mais homogêneos

de pacientes e apresenta um grande valor prognóstico quando comparada com o sistema FAB,

entretanto, controvérsias ainda permanecem (BENNETT, 2005).

Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de determinar quais os fatores que

mais influenciam a sobrevivência e a freqüência de evolução para LMA nos pacientes com

SMD, de modo a permitir a elaboração de escalas prognósticas. A porcentagem de blastos na

medula óssea, as alterações citogenéticas e o número de citopenias são atualmente utilizados

como os parâmetros mais importantes para as escalas prognósticas; outros fatores de menor

importância incluem sexo, idade, contagem de plaquetas e de hemoglobina no sangue

periférico e presença de ALIP (GREENBERG et al., 1997).

A classificação de grupos de risco em SMD mais recente corresponde ao Sistema

Internacional de Escala Prognóstica (IPSS) (GREENBERG et al., 1997). Após estudarem

retrospectivamente os dados citogenéticos, morfológicos e clínicos de 816 pacientes, um

número maior do que o número usado para a elaboração de qualquer outra classificação, foi

concluído que a porcentagem de blastos na medula óssea, o número de citopenias no sangue

periférico e a citogenética eram os fatores prognósticos de maior importância, tanto em

relação ao tempo de sobrevivência, como quanto à taxa de transformação leucêmica. A

maneira como a pontuação foi atribuída a cada parâmetro está descrita na tabela 3.

O IPSS dividiu então a SMD em 4 grupos: baixo, intermediário 1, intermediário 2 e

alto risco. A aplicação do IPSS tem gerado discussão em relação aos grupos separados por

cariótipo. Em alguns estudos, a trissomia do cromossomo 8 e a del(11)(q23), por exemplo,

estão freqüentemente associadas com a evolução da doença (FERNANDEZ et al., 2000;

SOLÉ et al., 2000). Entretanto, o IPSS classifica estas alterações cromossômicas como

prognóstico intermediário, sendo, portanto, necessária uma análise mais refinada em relação

aos grupos de risco segundo o cariótipo.

TABELA 3: Pontuação segundo os Parâmetros Críticos do IPSS (1997) em Síndromes

Mielodisplásicas

Pontuação

Variáveis Prognósticas

0 0,5 1 1,5 2,0

Blastos M.O. < 5% 5 -10% - 11 - 20% 21 - 30%

Cariótipo * Bom Intermediário Mau

Citopenias 0 - 1 2 - 3

“Pontuação” para os grupos de risco: Baixo risco (0 pontos); Intermediário 1 (0,5-1,0 pontos);

Intermediário 2 (1,5-2,0); Alto risco (> ou = 2,5). Cariótipos*: bom prognóstico: cariótipos normais,

-Y, del(5q), del(20q), mau prognóstico: cariótipos complexos, anomalias envolvendo o cromossomo

7; prognóstico intermediário: outras anomalias cromossômicas (GREENBERG et al., 1997).

Apesar de vários estudos na área de citogenética e de biologia molecular ainda não foi

identificado o preciso mecanismo que leva ao aparecimento da SMD e quais são os eventos

envolvidos na via de evolução da doença para leucemia aguda (DELFORGE, 2003; NISHINO

E CHANG, 2005; PANANI & ROUSSOS, 2005). No entanto, todos os modelos sugeridos

referem-se a um processo de múltiplas etapas (RASKIND et al, 1984; ROSENFELD & LIST,

2000; MUTFI, 2004; OGATA, 2006).

1.1.2 Teoria de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD Primária

As investigações sobre a patofisiologia da SMD têm confirmado a heterogeneidade e a

complexidade biológica desta doença. Avanços na tecnologia têm promovido observações que

levam a sugerir hipóteses sobre o desenvolvimento da SMD. A hipótese mais aceita é que

uma mutação inicial na célula tronco hematopoética pluripotente (a qual pode ser herdada ou

adquirida), resulte na sua expansão limitada. Numa segunda etapa, uma dessas células adquire

uma nova mutação, que leva a alterações na função celular e conseqüentemente evolução do

clone pré-maligno. Este clone, o qual tem vantagens no crescimento, é associado com

displasias, disfunção celular (como excesso de secreção local de citocinas inibitórias), alta

taxa de morte celular programada (apoptose), hematopoese ineficiente, defeitos de

diferenciação e instabilidade genômica. Aquisições de novas mutações, como perda da função

de genes supressores de tumor ou mutações em oncogenes, dentro de uma célula neste clone

anormal levam a um aumento no número de células blásticas ocorrendo a evolução para

leucemia (transformação leucêmica) (fig. 1) (AUL et al., 1998; ROSENFELD & LIST, 2000;

MUFTI, 2004).

Fig. 1: Modelo de Múltiplas Etapas no Desenvolvimento da SMD. Evento 1- mutação inicial na célula

tronco hematopética. Evento 2- aquisições de novas mutações que levam à alterações na função

celular. Evento 3- aparecimento de novas mutações levando à perda de função de genes supressores de

tumor e mutações em oncogenes (AUL et al., 1998).

Três linhas de evidências suportam este modelo e a existência de pré-disposição

genética para SMD: (1) a ocorrência de LMA e SMD em famílias com um defeito de reparo

no DNA herdado ou neurofibromatose tipo 1; (2) estudos de mapeamento genético em raras

famílias com histórico familiar de SMD e LMA; e (3) estudos da associação de vários

polimorfismos genéticos em LMA e SMD (HELLSTRÖM-LINDBERG et al., 2000).

Embora muitas alterações cromossômicas tenham sido detectadas em SMD, os genes

envolvidos estão sendo ainda identificados, este desconhecimento leva ao questionamento se

estas alterações genéticas são um evento inicial levando ao desenvolvimento da SMD ou se

são eventos secundários contribuindo para a transformação leucêmica (LOOK, 2005).

1.1.3 Alterações Cromossômicas em SMD Primária

A concepção de SMD como uma doença de célula tronco hematopoética de natureza

clonal, foi inicialmente demostrada por estudos envolvendo a inativação do cromossomo X

(JANSSEN et al., 1989), assim como estudos isoenzimáticos da glicose 6 fosfato

desidrogenase (G6PD) (RASKIND et al., 1984). A descoberta de alterações cromossômicas

não randômicas em SMD primária confirmou esta clonalidade, oferecendo um meio de

identificar o clone maligno e de apontar alguns oncogenes e genes supressores de tumor

possivelmente envolvidos com o desenvolvimento e a evolução da doença.

As alterações citogenéticas clonais podem ser detectadas em 30 – 50% dos pacientes

adultos com SMD primária, no entanto, nenhuma alteração citogenética específica foi ainda

definida para este grupo de pacientes (PANANI & ROUSSOS, 2005). Essas alterações variam

de uma simples mudança estrutural ou numérica a complexas lesões genômicas envolvendo

três ou mais cromossomos distintos. Aberrações citogenéticas simples ocorrem

freqüentemente nos estágios iniciais da doença, entretanto, em estágios de transformação

leucêmica e/ou durante a progressão da doença são comuns mudanças genômicas mais

complexas (FERNANDEZ et al., 2000).

As alterações cromossômicas mais freqüentes em SMD são a deleção do braço longo

dos cromossomos 5 (del5q), 7 (del7q), 11 (del11q) e 20 (del20q), a monossomia do 7 (-7), a

deleção do braço curto dos cromossomos 17 (del 17p) e 12 (del 12p), a trissomia do

cromossomo 8 (+8) e inversão do cromossomo 3 (inv 3). Translocações recíprocas são raras e

incluem: t(1;7)(q10;p10), t(1;3)(p36;q21), t(3;3)(q21;q26); t(6;9)(p23;q34), t(5;12)(q33;p13),

e t(5;7)(q33;p11.2) (DELFORGE, 2003; PANANI & ROUSSSOS, 2005, BORGONOVO et

al., 2005).

Anormalidades citogenéticas envolvendo o cromossomo 5 incluem a del(5q), -5 e as

translocações não balanceadas. A deleção do braço longo do cromossomo 5 pode ser terminal,

ou na maioria dos casos intersticial, com o ponto de quebra na região 5q13q33 ou 5q31q33.

Neste caso, não se observa uma freqüência aumentada de evolução para leucemia, a menos

que exista uma combinação com outros defeitos cromossômicos (PANANI & ROUSSOS,

2005).

Monossomia do 7 é a alteração cromossômica de maior freqüência em SMD primária

da infância. Esta alteração está associada com mau prognóstico, sendo a sobrevivência dos

pacientes baixa devido a complicações causadas pelas citopenias, disfunção medular ou

transformação para LMA (KARDOS et al., 2003). Deleção 7q é também freqüentemente

encontrada em SMD, sendo geralmente acompanhada de outras alterações cromossômicas

predizendo mau prognóstico (MHAWECH & SALEEM, 2001).

A incidência do ganho do cromossomo 8 em SMD primária é de aproximadamente

10%, sendo observada em todos os subtipos FAB (PANANI & ROUSSOS, 2005).

Anormalidades do braço longo do cromossomo 11 são comuns em malignidades

mielóides, sendo observadas em 5% dos casos de SMD primária. Geralmente esta alteração

está acompanhada de cariótipos complexos e tem um prognóstico não favorável (PANANI &

ROUSSOS, 2005).

A deleção do braço curto do cromossomo 17, del(17p), tem sido descrita em 4% dos

pacientes com SMD, estando freqüentemente associada com alterações adicionais envolvendo

principalmente os cromossomos 5 e 7. Pacientes com esta alteração geralmente apresentam as

seguintes características morfológicas: disgranulopoese com hipolobulação pseudo-Pelger-

Hüet, hipo-granulação e vacúolos observados em pequenos neutrófilos (VALLESPI et al.,

1998). Clinicamente a doença é agressiva com resistência ao tratamento e curta sobrevida. O

gene p53 localizado na região 17p13 é tipicamente perdido nestes casos e inativação do

segundo alelo no cromossomo homólogo ocorre em aproximadamente 70% dos casos (LAI et

al., 1995).

Deleção do braço longo do cromossomo 20 como anomalia única ou em associação

com outras alterações, ocorre com uma incidência de aproximadamente 5%. A deleção 20q é

usualmente intersticial, afetando em geral a região 20q11 e 20q13 (PANANI & ROUSSOS,

2005). De acordo com o IPSS e um estudo recente, pacientes que apresentam esta alteração

de forma isolada apresentam um prognóstico favorável (LIU et al., 2006), entretanto, alguns

estudos demonstram que esta anomalia está associada com um pior prognóstico (CAMPBELL

& GARSON, 1994).

A incidência destas alterações citogenéticas pode refletir em uma instabilidade

genômica clonal, levando a uma pré-disposição para aquisições adicionais de lesões genéticas.

Estudos citogenéticos de acompanhamento da evolução de SMD para LMA puderam

demonstrar que anomalias cromossômicas simples ocorrendo em subtipos de SMD são

acrescidas de outras anomalias durante a progressão da doença (FERNANDEZ et al., 2000),

estando envolvidas alterações em oncogenes e genes supressores de tumor (MORI et al.,

2000; MHAWECH & SALEEM, 2001).

1.1.4 Oncogengenes e Genes Supressores de Tumor Envolvidos no Desenvolvimento da

SMD Primária

Múltiplas vias genéticas estão envolvidas na patogênese da SMD. Estudos têm

demonstrado que a ativação de certos oncogenes, assim como a inativação de genes

supressores de tumor exercem um papel importante no desenvolvimento desta doença.

Alterações em oncogenes como N-ras (FERNANDEZ et al., 1998) e, genes supressores de

tumor como NF1e p53 foram descritas em SMD (KIKUKAWA et al., 1999; SIDE et al.,

1998).

A função da proteína RAS é transduzir sinais a nível da membrana plasmática para o

interior da célula, associados a divisão e diferenciação celular. As proteínas ras se ligam a

nucleotídeos de guanina GDP e GTP com alta afinidade e possuem uma atividade GTPase

intrínsica. Essas proteínas funcionam como “switches” moleculares que são ativas quando

GTP é ligado a elas e inativas quando GDP está ligado.

Mutação no proto-oncogene N-ras sinaliza de forma constitutiva sinais para a

proliferação celular. Estudos demonstraram mutação pontual no oncogene N-ras em 10% a

40% das SMD, sendo esta alteração associada com diminuição na sobrevida e alta incidência

de progressão leucêmica (NIIMI et al., 2006). Entretanto, alguns estudos sugerem que a

mutação N-ras ocorre em estágios iniciais da SMD, uma vez que pacientes com cariótipos

normais dos subtipos menos agressivos da doença AR e ARSA podem apresentar N-ras

mutado (FERNANDEZ et al., 1998). Os achados de mutação N-ras em SMD ainda são

controversos e têm sido sugerido que a mutação no oncogene N-ras pode ocorrer em estágios

inicias ou avançados da doença podendo contribuir para a patogênese da SMD por estimular

inicialmente a expansão clonal ou tardiamente a transformação leucêmica (NISHINO &

CHANG, 2005).

Outro gene alterado descrito em pacientes com SMD é o fms. O gene fms codifica o

receptor de superficíe celular CSF-1 ou CSF de macrófagos, sendo sua atividade dependente

da ligação à tirosina quinase. CSF-1 quando ativo promove a proliferação e diferenciação de

células hematopoéticas da série monócito-macrófago. Mutações no gene c-fms resulta em uma

proteína com mudanças conformacionais, levando à ativação constitutiva do receptor.

Mapeado na região q33 do cromossomo 5, o gene fms tem sido implicado na patogênese de

doenças hematológicas da linhagem mielóide. Uma mutação pontual no codon 969 tem sido

reportada com aumentada incidência em subtipos mais avançados de SMD (NISHINO &

CHANG, 2005).

O gene MLL, mapeado na região q23 do cromossomo 11, age como fator de

transcrição envolvido na diferenciação celular e foi descrito como associado com a

transformação para LMA em pacientes com SMD (IBRAHIM et al., 2000).

Os produtos dos genes descritos participam como fatores fundamentais nos programas

de proliferação e diferenciação celular. Já as proteínas derivadas dos proto-oncogenes bcl-2,

c-myc e do gene supressor de tumor p53 têm sido descritas como elementos regulatórios

chave da via apoptótica. Bcl-2 representa uma classe de reguladores negativos da apoptose.

Realiza sua função através da dimerização com membros de sua família e com outros

reguladores, como p53 e RAS. Aumento da expressão de bcl-2 tem sido correlacionado com a

progressão da SMD, sendo observada uma super expressão dessa proteína em subtipos de

maior risco (AREB e AREB-t) (BOUDARD, 2002).

Além destes oncogenes diversos genes supressores de tumor parecem ter papéis de

destaque no estabelecimento e evolução de neoplasias, como o p53. O gene p53 se localiza no

braço curto do cromossomo 17 na posição 17p13, em humanos e o seu produto é uma

fosfoproteína nuclear. A proteína p53 atua como um "guarda molecular" monitorando a

integridade do genoma, tendo um papel de pivô na mediação da resposta celular ao dano do

DNA, induzindo a parada de crescimento em G1 e a apoptose (CHANG et al., 1993; PERRY

& LEVINE, 1993). Mutação no gene p53 têm sido correlacionada com estágios mais

avançados da doença, sugerindo que seja um evento relacionado ao processo de

transformação leucemica (ADAMSON et al., 1995; KIKUKAWA et al., 1999).

Recentemente alterações epigenéticas, como metilação aberrante da ilha CpG na

região promotora de genes envolvidos no controle do ciclo celular, têm sido descritas

inativando genes supressores de tumor e contribuindo para o desenvolvimento de neoplasias

(GALM et al., 2006).

1.1.5 Alterações Epigenéticas em SMD Primária: Metilação dos Membros da Família

InK4 p15 e p16

O termo epigenética refere-se a modificações covalentes reversíveis e herdadas da

molécula de DNA, sem que haja alteração na seqüência de bases (GALM et al., 2006). O

principal mecanismo epigenético conhecido é o controle da atividade transcricional através da

alteração da estrutura da cromatina, sinalizada pela metilação do DNA (WEINHOLD, 2006).

Essa modificação endógena desempenha um papel essencial no silenciamento transcricional

em muitos processos, tais como a inativação do cromossomo X, a impressão parental, o

controle da expressão gênica tecido-específica e a manutenção da integridade cromossômica,

agindo também na defesa do genoma contra elementos genéticos móveis (LAIRD &

JAENISCH, 1996).

A metilação do DNA é um processo epigenético natural que constitui a modificação

endógena mais comum no genoma de mamíferos, sendo essencial para o desenvolvimento do

organismo (GALM et al, 2006). A metilação ocorre somente nas bases citosina que estão

localizadas próximas das bases guanina de um dinucleotídeo simétrico, CpG (fig. 2A).

Citosinas metiladas representam 0,75-1% do total de bases do DNA (WORM &

GULDBERG, 2002).

O padrão de metilação da célula é precisamente reproduzido após a síntese do DNA e

estavelmente transmitido para as células filhas. A adição de um grupamento metila (CH

) na

posição 5 da citosina é um evento catalisado por um grupo de enzimas chamadas DNA

metiltransferases (DNMT). A S-adenosil-metionina (SAM) serve como doadora de radicais

metila nas reações de transmetilação (fig. 2B). A transmetilação é inibida, através de

competição, pela S-adenosil-homocisteína (WORM & GULDBERG, 2002).

Fig. 2: Região de metilação na seqüência do DNA e adição do grupamento metila pelas enzimas

DNMT. (A) O genoma humano apresenta grupos metil, os quais ocorrem exclusivamente em resíduos

de citosina dentro de um dinucleotídeo simétrico CpG. (B) A adição do grupo metil a citosina é

catalizada pela DNA metiltransferase (DNMT), usando a S-adenosil-L-metionina (SAM) como um

substrato (WORM & GULDBERG, 2002).

As ilhas CpGs são encontradas em pequenas regiões de 1-2 Kb, representando,

aproximadamente, 2% do genoma, e possuem propriedades distintas quando comparadas com

o restante do DNA genômico. Com relação a sua distribuição, as ilhas CpGs são comumente

encontradas dentro ou próximas a promotores de genes de manutenção (RAKYAN et al,

2001). Aproximadamente 70% dos dinucleotídeos CpGs estão metilados, no entanto, muitas

ilhas CpGs apresentam-se livres de metilação, estando associadas com a atividade

transcricional do gene. Genes que são ativamente transcritos tendem a ter baixos níveis de

metilação das suas regiões promotoras, enquanto que genes silenciosos, isto é, que não se

expressam em determinados tecidos ou circunstâncias, têm sua região promotora altamente

metilada (fig. 3) (WORM & GULDBERG, 2002).

Fig. 3: Atividade transcricional do gene de acordo com o padrão de metilação. Citosinas não metiladas

são amplamente encontradas em ilhas CpGs, as quais usualmente mapeiam no promotor e nas regiões

do primeiro exon de genes “housekeeping”. (A) O estado completamente desmetilado de uma ilha

CpG na região promotora esta relacionado com a atividade transcricional, entretanto (B) metilação

completa causa o silenciamento transcricional (WORM & GULDBERG, 2002).

A metilação do DNA promove mudanças na estrutura da cromatina, modificando as

interações entre o DNA e os fatores de transcrição. Tais mudanças podem, reversível ou

irreversivelmente, regular as funções do genoma atuando na repressão transcricional e na

organização da cromatina.

Estudos iniciais sobre o efeito inibitório da metilação sugeriram uma interferência

direta dos grupamentos metila na ligação de fatores de transcrição a seus sítios de

reconhecimento na cromatina. Sendo assim, os fatores de transcrição que se associam a

seqüências que contêm dinucleotídeos CpG não conseguem se ligar a essas seqüências

quando os resíduos CpG estão metilados. No entanto, modelos alternativos referem-se a

mudanças na arquitetura do nucleossomo como um elemento de repressão. Este modelo foi

reforçado pela identificação de uma família de proteínas que preferencialmente ligam-se a

CpGs metilados (MBPs - proteínas ligadoras de CpG metilados) (WADE, 2001). Algumas

destas proteínas têm sido diretamente implicadas no silenciamento de genes dependentes de

metilação, por recr9utar histonas desacetilases (HDACs) para o local da metilação. HDACs

catalizam a remoção dos grupos acetil dos nucleossomos, convertendo a estrutura da

cromatina aberta para transcrição para uma estrutura fechada, a qual torna-se inacessível à

maquinaria transcricional basal (fig. 4) (WORM & GULDBERG, 2002; GALM et al.,2006).

Fig. 4: Modelo para o silenciamento transcricional dependente de metilação. Citosinas metiladas são

reconhecidas por proteínas ligadoras de metil CpG (MBPs), as quais recrutam histonas desacetilases

(HDACs) para o local da metilação, convertendo a cromatina em uma estrutura fechada que se torna

inacessível à maquinária de transcrição (WORM & GULDBERG, 2002).

A metilação do DNA foi observada pela primeira vez em câncer humano em 1983

(FREINBERG & VOLGELSTEIN, 1983). No câncer, a hipermetilação de regiões promotoras

de genes supressores de tumor é uma importante alteração epigenética que está despertando

um grande interesse para o de desenvolvimento de novas terapias. Estudos em malignidades

hematológicas têm mostrado uma forte relação entre metilação e fenótipo neoplásico, estando

envolvidos principalmente os membros da família INK 4, p15 e p16, que desempenham um

importante papel no controle do ciclo celular (LEHMANN et al., 2004).

Os genes p15

INK4B

e p16

INK4A

estão localizados na região p21 do cromossomo 9. As

proteínas codificadas por esses genes induzem a parada do ciclo celular na fase G1-S através

da inibição da atividade do complexo ciclina D e CDK4 e CDK6. A transição da fase G1 para

S, representa um ponto extremamente importante no relógio do ciclo celular. A metilação em

regiões promotoras dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

induz a repressão transcricional desses dois

genes, contribuindo para a passagem direta da célula para a fase S (COTRAN et al., 2000).

Dessa forma, a inibição da expressão deses genes está associada com alta taxa de proliferação

celular (LEES, 1995).

Em neoplasias hematológicas, através de estudos cromossômicos, têm sido verificado

que os genes p15

INK4B

e p16

INK4A

estão freqüentemente deletados em leucemia linfóide aguda

em crianças e adultos (STREFFORD et al., 2007). No entanto, em SMD estes dois genes são

raramente mutados ou deletados (NAKAMAKI et al., 1997). Estudos mostraram que p15

INK4B

atua como um importante regulador da proliferação e diferenciação das linhagens mielóides,

monocítica e megacariocítica, inibindo esses processos (TEOFILI et al., 2001).

Posteriormente, foi demonstrado através do emprego de técnicas de biologia molecular (MSP-

PCR) que o silenciamento transcricional dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

via metilação

aberrante é um evento crítico na leucemogênese, e a metilação no gene p15

INK4B

têm sido

freqüentemente associada a leucemias agudas, tanto linfóide quanto mielóide, em crianças e

adultos (HERMAN et al., 1996, AU et al., 2003; GARCIA-MANERO et al., 2002).

No sentido de verificar o papel desses dois genes no processo de desenvolvimento e

evolução da SMD para LMA foram realizados alguns estudos correlacionando alterações nos

genes com os subtipos da doença segundo a classificação FAB. Alguns grupos demonstraram

que a metilação aberrante de p15

INK4B

ocorre com maior incidência nos casos de expansão

blástica como AREB, AREB-t e LMA resultante de transformação de SMD e mais raramente

nos subtipos iniciais da doença (UCHIDA et al., 1997; QUESNEL et al., 1998). No entanto,

outros estudos mostraram que alterações nos padrões de metilação em p15

INK4B

podem ocorrer

em todos os subtipos da doença (TIEN et al., 2001; AGGERHOLM et al., 2006; HOFMANN

et al., 2006). Dessa forma, não é claro se esta alteração epigenética ocorre em fases iniciais do

diagnóstico ou se é um evento associado à transformação leucêmica e qual o seu impacto

prognóstico.

A maioria desses trabalhos foi realizada em pacientes adultos com SMD primária,

existindo poucos estudos de investigação da incidência e do papel da metilação dos genes

p15

INK4B

e p16

INK4A

no prognóstico em SMD primária na infância.

1.1.6 SMD Primária na Infância

A SMD primária na infância representa cerca de 4% de todas as malignidades

hematológicas da faixa pediátrica (HASLE et al., 2003). Em alguns casos, ela pode estar

presente em crianças com doenças genéticas como a Síndrome de Down ou a Anemia de

Fanconi. Nestes casos existe uma predisposição genética para o desenvolvimento da SMD.

Em outros casos ela apenas se manifesta idiopaticamente. Crianças que apresentam essa

doença hematológica estão associadas a um pior prognóstico quando comparadas com os

adultos. No Brasil, de acordo com o Grupo Cooperativo Brasileiro em SMD Pediátrica (GCB-

MDS-PED), a taxa de sobrevida total para pacientes com SMD na infância que não foram

tratados com transplante de medula óssea é de 20-25% (VALERA et al., 2004).

Embora a SMD na infância seja considerada uma doença com características

displásicas e hematopoese ineficaz, como a SMD do adulto, as características clínicas, a

presença de anormalidades associadas e a caracterização das alterações cromossômicas têm

indicado que a SMD durante a infância represente uma diferente questão biológica

(POLYCHRONOPOULOU et al., 2004). As principais diferenças entre a SMD na infância e

no adulto são: incidência extremamente rara de ARSA na infância ao passo que em adultos

consiste em cerca de 25% dos casos; a monossomia do 7 é a alteração cromossômica mais

freqüente na infância e nos adultos é a deleção do braço longo do cromossomo 5; as

possibilidades terapêuticas em adultos com SMD são limitadas devido à idade avançada,

sendo indicada geralmente uma terapia paliativa, enquanto que nas crianças com SMD a

principal terapia é a curativa, através do transplante de medula óssea (HASLE &

NIEMEYER, 2002). Na tabela 4 podemos observar as principais diferenças entre a SMD em

crianças e em adultos.

Tabela 4: Diferenças entre SMD em Crianças e em Adultos

Parâmetros Crianças Adultos

• Incidência/milhão

3.6 >35

• ARSA

<2% 25%

• Alterações Citogenéticas

60% 40%

• -7/7q-

30% 10%

• -5/5q-

1-2% 20%

• Anormalidades clínicas associadas

30% <5%

• Objetivo principal do tratamento

Curativo Paliativo

(HASLE & NIEMEYER, 2002)

A SMD na infância pode apresentar características específicas que dificultam a sua

inclusão nos sistemas de classificação tradicionais, tendo sido propostos subgrupos

específicos da SMD para a infância. Por exemplo, pacientes de menos de 4 anos que

apresentavam monossomia do cromossomo 7 foram inicialmente classificados em uma

síndrome distinta, a síndrome de monossomia do 7 (GYGER et al., 1982; HUTTER et al.,

1984; PASSMORE et al., 1995). Esta estava tipicamente associada a uma doença

mieloproliferativa crônica rara na infância, com mau prognóstico (EVANS et al., 1988). No

entanto, outros estudos mostraram que pacientes com monossomia do 7 podiam por vezes ser

classificados nos outros subgrupos FAB, descartando conseqüentemente a síndrome de

monossomia do 7 (BRANDWEIN et al., 1990; HASLE et al., 1999). Para diferenciar os

pacientes que apresentavam SMD com características mieloproliferativas, foi adotado um

novo subgrupo, a leucemia mielomonocítica juvenil (LMMJ). A LMMJ diferencia-se da

LMMC do tipo adulto, tanto biologicamente (a contagem de leucócitos é mais alta, sendo

superior a 13000/µL e a faixa etária atingida é de menos de 4 anos de idade, ao contrário do

que acontece geralmente na LMMC) como citogeneticamente (as translocações encontradas

em LMMC, como t(5;12), ainda não foram descritas em LMMJ) (NIEMEYER et al., 1997;

SIDE et al, 1998; LUNA-FINEMAN et al, 1999). A LMMJ, assim como a LMMC do tipo

adulto, é diferenciada citogeneticamente das doenças mieloproliferativas pela ausência do

cromossomo Philadelphia (Ph). O prognóstico dos pacientes com LMMJ é significativamente

pior do que de LMMC (EMANUEL, 1999; ARICO et al., 1997). A SMD infantil tem sido

portanto classificada em SMD do tipo adulto, à qual se aplica a classificação FAB,

acrescentando a LMMJ (SASAKI et al., 2001).

Entretanto, a utilização dos sistemas de classificação tradicionais FAB (BENNETT et

al., 1982) e OMS (HARRIS et al., 2000) baseados em SMD do adulto, têm sido tema de

muita discussão em SMD na infância. Hasle et al. em 2003 sugeriram novos critérios para

classificação da SMD da infância, sendo os critérios mínimos: citopenias sem uma causa

esclarecida (anemia, neutropenia e trombocitopenia); pelo menos duas linhagens apresentando

displasias, alteração citogenética clonal adquirida e número de blastos igual ou maior que 5%

na medula óssea. Nesta classificação da SMD na infância são reconhecidos três grupos: o

grupo das doenças mieloproliferativas e mielodisplásicas (LMMJ), o qual apresenta

características mieloproliferativa e mielodisplásica; o grupo da síndrome de Down associada

com a SMD, uma vez que esses pacientes apresentam características clínicas e prognósticas

distintas; e o grupo da SMD primária propriamente dita, o qual foi subdividido em: citopenia

refratária (CR), anemia refratária com excesso de blastos (AREB) e anemia refratária com

excesso de blastos em transformação (AREB-t) (fig. 5).

Fig. 5: Classificação da Síndrome Mielodisplásica na Infância. LMMJ- leucemia mielomonocítica

juvenil; CR - Citopenia Refratária; AREB - Anemia Refratária com excesso de blastos; AREB-t -

Anemia Refratária com excesso de blastos em transformação; SMD- síndrome mielodisplásica; LMA-

leucemia mielóide aguda SP- sangue periférico; MO- medula óssea (modificado de HASLE et al.,

2003).

A LMMJ ocorre principalmente em meninos com menos de 2 anos de idade, que

apresentam hepatoesplenomegalia, febre, infecção, sangramento, alta contagem leucocitária

com monocitose absoluta, anemia, trombocitopenia e hemoglobina fetal aumentada. Pacientes

que apresentam neurofibromatose do tipo 1 (NF1) possuem risco aumentado de

desenvolverem LMMJ. Citogeneticamente a LMMJ é caracterizada em 25-30% dos casos

Síndrome Mielodisplásica

Células Blásticas(%)

S.P. M.O.

CR 2% ≥5%

AREB <2 – 19%

5–19%

AREB-t >20 -29%

20–29%

Síndrome

de Down

LMMJ

Doenças Mieloproliferativas/

Mielodisplásicas

pela monossomia do cromossomo 7, 10% apresentam outras alterações cromossômicas e em

cerca de 60% dos casos os cariótipos são normais. Em nível molecular é freqüentemente

caracterizada por mutações em NF1 e N-ras, apresentando a via de sinalização para

proliferação celular ativada de forma permanente (EMANUEL, 1999). As crianças com

LMMJ apresentam mau prognóstico e resistência à quimioterapia convencional (WOODS et

al., 2002), sendo o transplante de células tronco alogenêico o único tratamento curativo. Com

este tratamento, aproximadamente 30% dos pacientes alcançam a cura, entretanto, a taxa de

recaída é alta (em torno de 40-50% dos casos) (YUSUF et al., 2004).

A Síndrome de Down (SD) é a condição de predisposição genética mais freqüente

observada em crianças com o diagnóstico de SMD, estando presente em 25% dos casos

diagnosticados com AR, AREB ou AREB-t. A LMMJ ocorre com uma menor freqüência. A

alteração cromossômica clonal mais comum em crianças com SMD associada com a SD é a

trissomia do cromossomo 8 e o ganho de um cromossomo 21, dessa forma a criança apresenta

uma tetrassomia (sendo um cromossomo 21 constitucional associado com a SD e o outro

adquirido associado com a SMD). Estudos moleculares relataram a presença de mutações no

gene GATA-1 associado com o desenvolvimento de LMA em pacientes portadores de SD

(MUNDSCHAU et al, 2003). No entanto, até o momento não existem relatos de alterações

moleculares relacionadas com SMD em crianças com SD. Em relação ao prognóstico,

crianças com SD e SMD apresentam prognóstico bom ou intermediário, evoluindo

freqüentemente para LMA-M7. Essas crianças são tratadas com protocolos de LMA, tendo

uma boa evolução clínica com baixo risco de recaída. O transplante de células tronco

alogenêico está associado com excesso de toxicidade sem ganho terapêutico (BEVERLY et

al, 1998).

Como podemos notar, essa classificação exclui o subgrupo anemia refratária com

sideroblastos em anel (ARSA) devido a sua freqüência ser muito baixa na infância,

aproximadamente 2% dos casos (CHAN et al., 1997; HASLE et al., 2003).

Em relação à distribuição de casos segundo os subtipos, AR tem sido apontada por

alguns estudos como relativamente comum, acometendo em torno de 40-60% dos pacientes

(POLYCHRONOPOULOU et al., 2004), enquanto os subtipos AREB e AREB-t aparecem

em cerca de 15-20% da SMD na infância (WEBB et al., 2001; PASSMORE et al., 2003). No

entanto, outros estudos mostraram que a maior freqüência de casos de SMD na infância

ocorre nos subtipos mais avançados da doença (AREB e AREB-t) (VIDAL et al., 2006).

Grandes diferenças vêm sendo demonstradas entre crianças e adultos com SMD. As

características clínicas são diferentes e os fatores que predizem a sobrevida ou a progressão

em adultos são de pouco valor para crianças. Hasle et al. em 2004, avaliando o sistema de

escala prognóstica, o IPSS, em um grupo de 308 crianças com SMD primária e LMMJ,

verificaram que esta escala apresenta valor limitado, tanto para SMD pediátrica quanto para

LMMJ. Crianças com SMD freqüentemente apresentam citopenias em duas ou três linhagens,

sendo poucas crianças classificadas como de baixo risco, segundo esse sistema.

Estudos sobre as características morfológicas do sangue periférico e medula óssea

demonstraram presença de displasias nas linhagens eritróide, mielóide e megacariocítica. Tem

sido descrita a presença de medula óssea hiper e normocelular em SMD na infância

(POLYCHRONOPOULOU et al., 2004). Estudos de biópsia de medula óssea revelaram a

presença de hipocelularidade nos pacientes do subtipo AR em cerca de 60% dos casos, sendo

que este achado é atribuído ao fato de que a avaliação da celularidade da medula óssea em

crianças não é adequadamente descrita (POLYCHRONOPOULOU et al., 2004). Ainda não

existem estudos relatando se a hipocelularidade da medula óssea está relacionada com um

prognóstico diferencial em comparação com a medula normocelular ou hipercelular.

Em relação aos estudos citogenéticos, estes mostraram um papel fundamental no

diagnóstico de todos os casos de suspeita de SMD pediátrica, sendo utilizados para a

confirmação da natureza clonal desta doença (SASAKI et al., 2001; PASSMORE et al.,

2003). Alterações citogenéticas podem ser detectadas em 50-70 % dos pacientes com SMD

primária da infância (WEBB et al., 2001; KARDOS et al , 2003; YSUSUF et al., 2004). A

monossomia do 7 é a anormalidade cromossômica mais freqüente nestes pacientes, sendo

encontrada em aproximadamente 19 a 23% dos casos. Esta alteração está associada com mau

prognóstico e uma rápida progressão para LMA (SASAKI et al., 2001; PASSMORE et al.,

2003; AKTAS & TUNCBILEK, 2006). O transplante de células tronco hematopoéticas

alogenêico, na fase inicial da doença, tem sido apontado como a terapia mais indicada para

essas crianças (YSUSUF et al., 2004). Outras alterações descritas em SMD primária na

infância foram: del(5q), +8, del(17p), del (11q) e hiperdiploidia (FERNANDEZ et al., 2003;

PITMAN et al., 2006; KARDOS et al., 2003).

Os mecanismos moleculares envolvidos em SMD na infância ainda não estão bem

definidos. Um recente estudo com os genes p53 e fms demonstrou a inexistência de mutação

nas seqüências analisadas, sugerindo que os mecanismos moleculares de evolução da SMD

em crianças são diferentes daqueles observados em adultos (JEKIC et al, 2006). A presença

de mutações no onocogene N-ras e K-ras ocorre em uma freqüência muito baixa em SMD da

infância. Em um estudo de 35 pacientes, apenas três mostraram a presença de mutação em

N-ras, estando esse grupo associado com cariótipos normais (JEKIC et al., 2004).

A metilação aberrante do DNA é freqüentemente observada em adultos com SMD e tem

sido reconhecida como uma importante alteração epigenética em sua patogênese . Hasegawa

et al. em 2005 realizaram o primeiro estudo mostrando a presença de metilação envolvendo os

genes p15

INK4B

e p16

INK4A

em crianças com SMD. Neste estudo foi verificado que a freqüência

de metilação em p15

INK4B

foi alta estando presente em 78% dos casos, entretanto, foi um

achado raro em LMMJ. Não foi detectada neste estudo presença de metilação em p16

INK4A

(HASEGAWA et al., 2005). O estudo de metilação do DNA é importante uma vez que um

dos tratamentos mais recentes para SMD utiliza inibidores da metilação do DNA como

decitabina e azacitidina que têm promovido resposta citogenética para os pacientes de alto

risco. Entretanto, não é conhecida nenhuma correlação entre uma alteração epigenética

envolvendo um gene específico e a resposta a um agente inibidor de metilação (ATALLAH et

al., 2007).

Devido à raridade da SMD na infância, estudos sobre a sua patogênese não têm sido

adequados e a via que leva a uma hematopoese anormal e a associação com alterações

genéticas e epigenéticas precisam ser estudadas, existindo poucos dados na literatura que

correlacionem estas alterações com o diagnóstico, prognóstico e evolução da doença. Dessa

forma, torna-se fundamental a caracterização de marcadores citogenéticos e moleculares que

auxiliem o diagnóstico e a definição de fatores prognósticos em SMD primária na infância,

principalmente em relação a definição de grupos de risco de acordo com a presença de uma

alteração cromossômica específica ou uma alteração molecular, sendo importante esse

esclarecimento para auxiliar na escolha de protocolos de tratamento.

2. OBJETIVOS

A síndrome mielodisplásica primária é um grupo de doenças altamente heterogêneo do

ponto de vista clínico, morfológico e biológico, tanto em pacientes adultos quanto em

crianças. No sentido de definir os fatores prognósticos em SMD primária na infância

relacionados com o desenvolvimento desta doença e com a evolução para leucemia mielóide

aguda, o presente trabalho apresentou como objetivos:

1) Realizar uma análise citogenética retrospectiva e prospectiva em pacientes portadores

de SMD primária na infância e acompanhar citogeneticamente e clinicamente estes pacientes

para observar as principais anomalias numéricas e estruturais envolvidas no processo de

transformação leucêmica;

2) Caracterizar o padrão cromossômico de pacientes com SMD primária na infância;

3) Aplicar a técnica de FISH para confirmar as alterações cromossômicas nos seguintes

casos: quando os cromossomos apresentassem baixa resolução pela técnica de bandeamento G,

quando o número de metáfases analisadas para caracterizar um clone fosse pequeno e para o

monitoramento do tratamento quando a preparação citogenética fosse sem mitose;

4) Analisar o padrão de metilação na região promotora do gene p15

INK4B

em células de

medula óssea de pacientes com SMD primária na infância e comparar com o padrão obtido em

doadores para o TMO;

5) Analisar o padrão de metilação na região promotora do gene p16

INK4A

em células de

medula óssea de pacientes com SMD primária na infância e comparar com o padrão obtido em

doadores para o TMO;

6) Correlacionar o padrão de metilação dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

com os subtipos da

classificação de SMD primária na infância;

7) Correlacionar o padrão de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

com o cariótipo dos pacientes, na tentativa de sugerir vias de evolução da SMD para LMA;

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Pacientes

Foram estudadas retrospectivamente e prospectivamente no período de 1991 a 2006, 64

amostras de medula óssea de pacientes com síndrome mielodisplásica primária na infância

provenientes das seguintes Instituições: Centro de Transplante de Medula Óssea (CEMO-

INCA), Serviço de Hematologia (INCA), Instituto Estadual de Hematologia Arthur Siqueira

Cavalcanti (HEMORIO), Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE-UERJ) e Instituto de

Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG -UFRJ). A idade dos pacientes variou de

5 meses a 18 anos, sendo 40 do sexo masculino e 24 do sexo feminino. Os estudos

hematológicos e clínicos foram realizados pelos próprios hematologistas nas instituições de

origem, como parte da investigação de rotina e os diagnósticos seguiram os critérios

propostos pela classificação de SMD primária da infância segundo HASLE et al (2003).

Foram excluídos deste estudo os pacientes acima de 18 anos de idade e portadores de

SMD secundária. Para as análises moleculares foram utilizados como grupo controle células

de medula óssea de doadores provenientes do CEMO-INCA.

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de

Câncer (Anexo 1). Todos os procedimentos realizados seguiram as normas de bioética

segundo a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.

3.2 Análise Citogenética

3.2.1 Cultura de Células de Medula Óssea

Para este procedimento, utilizamos a técnica de TESTA et al(1985) com algumas

modificações. As células da medula óssea foram lavadas com meio RPMI 1640 (Sigma), em

seguida, foi feita uma diluição de 1:20 da suspensão celular em líquido de Thomas (1mL de

ácido acético glacial, uma gota de violeta genciana, 100mL de água destilada) e as células

foram contadas na câmara de Newbauer em microscópio ótico Olympus (contraste de fase).

Foram incubadas de 5 x 10

a 10 x 10

células/mL em 80% de RPMI e 20% de soro fetal

bovino GIBCO, a 37

C, numa atmosfera de 5% de CO

por 24 horas. Duas horas antes do

término da cultura, foram adicionados 0.05µg/mL de colchicina e a cultura foi incubada

novamente por mais 1 hora nas mesmas condições.

3.2.2 Término das Culturas e Preparação das Lâminas

Neste procedimento o método utilizado foi o de HUNGERFORD (1965) com

modificações. Ao final da incubação, o material foi centrifugado a 1500 rpm (centrifuga

EPPENDORF- modelo 5804) por 6 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado

ressuspenso em 5mL de uma solução hipotônica (KCl 0,075M). O material foi incubado a

C por 15 minutos, sendo em seguida centrifugado a 1500 rpm (centrifuga EPPENDORF-

modelo 5804) por 6 minutos. O precipitado foi fixado com Solução Carnoy 3:1 (metanol :

ácido acético), sendo na primeira fixação adicionado lentamente um volume de 5mL. Após 20

minutos à temperatura ambiente, o material foi centrifugado a 1500 rpm (centrifuga

EPPENDORF- modelo 5804) durante 6 minutos e o sobrenadante desprezado. O

procedimento foi repetido mais 2 vezes e o precipitado da última fixação foi ressuspenso em

um pequeno volume de fixador, que variou de acordo com a quantidade de material. As

lâminas foram preparadas pingando-se uma gota de suspensão celular em uma lâmina limpa e

umedecida e o material foi fixado sobre a lâmina na chama. A primeira lâmina obtida foi

corada com corante Giemsa 2% em tampão fosfato (0,102M de NaH

; 0,098M de

HPO

pH 6,8) e observada no microscópio ótico para verificar o índice mitótico e a

qualidade das metáfases. As demais lâminas foram envelhecidas de 1 dia a 1 semana à

temperatura ambiente para o bandeamento G.

3.2.3 Bandeamento G

Para obtenção de padrões de bandeamento G foi utilizada a técnica de SEABRIGHT

(1971), com o seguinte procedimento: as lâminas foram incubadas em uma solução de tripsina

0.1% em solução Dulbeco (0,137M NaCl; 0,0027M KCl; 0,0015M KH

; 0,011M

NaH

; pH 7.8), em tempos que variaram de 1 segundo a 1 minuto. Em seguida, as lâminas

foram lavadas com solução de soro fisiológico (NaCl 9%) e coradas em uma solução de

Giemsa (Merck) a 2% em tampão fosfato durante 15 minutos.

3.2.4 Análise Cromossômica

Os cromossomos foram identificados e classificados de acordo com o Sistema

Internacional de Nomenclatura de Citogenética Humana de 1995 (ISCN, 1995). A análise

cromossômica foi realizada em microscopia ótica utilizando no mínimo 20 metáfases por

paciente. Um caso foi considerado anormal quando três ou mais células apresentaram a

mesma anomalia cromossômica estrutural e/ou numérica. Foram adquiridas através do

Sistema de Cariotipagem Cytovision Applied Image de 5 a 10 metáfases para a montagem dos

cariótipos de cada paciente.

3.3 Citogenética Molecular: Análise por Hibridização “in situ” por Fluorescência (FISH)

Para a técnica de FISH foi utilizado o material da preparação citogenética (metáfases e

núcleos interfásicos em fixador). Foram utilizadas as sondas para a investigação das regiões

q33-q34 do cromossomo 5 (LSI CSF1R SO/ LSID5S23:D5S721 SG) e da região q31 do

cromossomo 7 (LSI D7S486 spectrum orange/CEP 7 spectrum green), do gene MLL mapeado

no cromossomo 11 na região q23 (LSI MLL dual color break apart rearrangement probe) e do

gene p53 mapeado no cromossomo 17 na região p13 ( LSI p53, spectrum orange). Todas as

sondas utilizadas foram da Vysis, Abbott Laboratories, USA.

As lâminas foram preparadas em lençol d’água e envelhecidas durante 24 horas. Após

este período, as lâminas foram colocadas em uma solução 2x SSC (a partir de diluição de uma

solução 20x SSC: 3,0M NaCl e 0,3M Citrato de Sódio, pH 7,0) a 37º

C por 30 minutos;

desidratadas em série com etanol 70%, 80% e 95% à temperatura ambiente por 2 minutos. Em

seguida, o material foi desnaturado em uma solução de 70% formamida / 2x SSC, a 73

C por

5 minutos. Foi dimensionado 10µl de sonda previamente desnaturada a uma temperatura de

73ºC por 5 minutos, em uma área de 25mm x 25mm e aplicada lamínula de vidro. As lâminas

foram seladas com cola de isopor e incubadas por 16 horas em câmara úmida a 37ºC. Após o

período de hibridização, as lâminas foram transferidas para solução de 0,4x SSC e 0,3%

IGEPAL (SIGMA) a 73

C durante 2 minutos. Os cromossomos e os núcleos interfásicos

foram corados em uma solução de DAPI/Antiphade (125ng/mL) e a área foi coberta com uma

lamínula de vidro e selada com esmalte incolor. A análise foi realizada em microscópio de

fluorescência (OLYMPUS BX51) com filtros apropriados e o resultado obtido foi adquirido

pelo Sistema de FISH da Cytovision Applied Image.

3.4 Análise Molecular

3.4.1 Cultura de Células da linhagem DLD-1 e Raji

Para a análise da presença de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

p16

INK4A

em células da medula óssea dos pacientes com SMD primária na infância foram

utilizados como controles negativos, DNA de células de medula óssea de doadores para o

TMO e como controles positivos DNA de células das linhagens Raji (derivada de Linfoma de

Burkitt), que apresenta metilação para o gene p15

INK4B

(HERMAN et al., 1996) e DLD-1

(derivada de adenocarcinoma de coloretal), que apresenta metilação para o gene p16

INK4A

(comunicação pessoal com o grupo de pesquisa do Dr. André Vettore e Dra. Andréa Seixas do

Instituto Ludwig). As células em cultura das linhagens DLD-1 e Raji foram cedidas

gentilmente pelo Instituto Ludwig - São Paulo e pelo Laboratório de Imunologia do CEMO-

INCA, respectivamente.

As células da linhagem DLD-1 foram cultivadas em 90% de meio de cultura RPMI

1640 (Sigma) e 10% de soro fetal bovino (HYCLONE) em garrafas de cultura (50mL) a

C, numa atmosfera de 5% de CO

. As culturas foram observadas diariamente em

microscópio invertido (Leitz). Após dois dias de cultura, quando as células encontravam-se

em uma monocamada homogênea, foi adicionanda uma solução de 0,25% de tripsina e

0,53mM de EDTA à temperatura ambiente para o repique das células (em uma razão de 1:3

células) e estas foram novamente incubadas nas mesmas condições, para amplificação celular

e posterior extração de DNA.

As células da linhagem Raji foram cultivadas nas mesmas condições da linhagem

DLD-1, no entanto, devido este tipo celular crescer em suspensão, não foi adicionada solução

de tripsina antes de realizar o repique. Para o repique, as células foram centrifugadas a 1500

rpm (centrifuga EPPENDORF- modelo 5804) por 5 minutos, em seguida foi feita uma

diluição de 1:20 da suspensão celular em líquido de Thomas e as células foram contadas na

câmara de Newbauer em microscópio óptico (OLYMPUS BX50). Foram incubadas 4x10

/mL

células em garrafas de cultura (50mL) em 90% de meio RPMI 1640 (Sigma) e 10% de soro

fetal bovino (GIBCO) a 37

C, numa atmosfera de 5% de CO

Para a obtenção de DNA das amostras dos controles positivos, negativos e dos

pacientes foi realizado o procedimento descrito a seguir.

3.4.2 Extração de DNA

O DNA das células de medula óssea de 45 crianças (17 amostras prospectivas e 28

amostras retrospectivas) com SMD primária, 10 doadores de medula óssea (controles

negativos), e das linhagens Raji (controle positivo para metilação no gene p15

INK4B

) e DLD-1

(controle positivo para metilação no gene p16

INK4A

) foi extraído pelo método de Dnazol

(INVITROGEN), segundo o protocolo do fabricante. As células mononucleares foram

separadas por centrifugação a 1500 rpm por 20 minutos (centrifuga EPPENDORF- modelo

5804) utilizando gradiente de densidade Ficoll-Paque (AMERSHAM BIOSCIENCES) e

lavadas com solução de soro fisiológico (9% NaCl). Após a lavagem foi adicionado 1mL do

reagente Dnazol (INVITROGEN). O material foi homogeneizado lentamente, em seguida o

DNA foi precipitado. A precipitação do DNA foi feita em etanol 100% e o material foi lavado

em etanol 75%. A amostra de DNA foi seca à temperatura ambiente, ressuspensa em solução

de Tris-EDTA (10mM de Tris e 1mM de EDTA, pH 7,4) e armazenada a uma temperatura de

aproximadamente 15ºC. Um gel de agarose de 0,8% corado com brometo de etídeo

(0,5µg/mL) foi feito para a verificação da integridade do DNA e presença de RNA. A

concentração de DNA nas amostras foi verificada no espectrofotômetro através de leitura em

comprimento de onda 260nm (Biophotometer 8,5mm- EPPENDORF).

3.4.3 Análise de Metilação dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

pelo Método MSP

3.4.3.1 Tratamento do DNA com Bisulfito

Cada amostra de DNA (pacientes, controles negativos e controles positivos) foi tratada

com bisulfito de acordo com o método descrito por Herman et al. (1996) com algumas

modificações. O tratamento com bisulfito induz a desaminação das bases citosinas não

metiladas, convertendo-as em uracil, as quais após a reação de PCR são amplificadas como

timina, no entanto, citosinas metiladas permanecem inalteradas (fig. 6).

Fig. 6: Efeito do tratamento com bisulfito em uma amostra de DNA com seqüências ricas em

dinucleotídeo CpG. Todas as citosinas fora do dinucleotídeo CpG são desaminadas e convertidas em

uracil. As citosinas não metiladas que se encontram dentro do dinucleotídeo CpG sofrem a ação do

bisulfito e são convertidas em uracil, no entanto, as citosinas metiladas permanecem inalteradas (*)

(GALM, 2006).

Amostras de DNA (2µg) em 50µL de água destilada foram previamente desnaturadas em

uma solução de NaOH 0.2mol/L por 10 minutos a 37°C. Após este período foram adicionados

30µL de hidroquinona (10mM, SIGMA) e 520µL de sulfito de sódio hidrogenado, pH 5,0

(3M, SIGMA). Foi adicionado óleo mineral sobre as amostras, sendo estas então mantidas em

banho-maria a 50°C durante 16 horas. Após este período, o óleo mineral foi retirado das

amostras e o DNA foi purificado utilizando o kit Wizard DNA Clean-Up System

(PROMEGA). Foi adicionado 1mL de resina no material, homogenizado lentamente e filtrado

em uma coluna. As colunas foram lavadas utilizando 2mL de isopropanol 80%. Para eluir o

DNA da coluna foi utilizado 50µL de água MILIQ a 70°C. A modificação do DNA foi

finalizada com o tratamento em uma solução de NaOH 0.3mol/L por 5 minutos a temperatura

ambiente. Em seguida, para a precipitação do DNA foi adicionada 5.5µL de acetato de sódio

(3M, pH 5,2) e 200µL etanol 100%. As amostras foram mantidas a uma temperatura de 3°C

durante 16 horas. Após este periodo, as amostras foram centrifugadas a 7000 rpm (centrifuga

EPPENDORF- modelo 5804) por 30 minutos e o sobrenadante desprezado. O DNA foi

lavado em etanol 70%, seco à temperatura ambiente e ressuspenso em 20µL de água

destilada.

3.4.3.2 Reação em Cadeia da Polimerase específica para a Metilação (técnica MSP)

Para verificar a presença de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

utilizamos a técnica MSP (reação da polimerase específica para a metilação). Nesta análise,

usamos os oligonucleotídeos descritos na tabela 5 segundo Herman et al. (1996).

Tabela 5: Oligonucleotídeos* utilizados na técnica MSP para análise do gene p15

INK4B

p16

INK4A

Genes Seqüencia dos Oligonucleotídeos (5’ – 3’)

p15-Mf

GCGTTCGTATTTTGCGGTT

p15-Mr

CGTACAATAACCGAACGACCGA

p15-Uf

TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT

p15-Ur

CCATACAATAACCAAACAACCAA

p16-Mf

TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC

p16-Mr

GACCCCGAACCGCGACCGTAA

p16-Uf

TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT

p16-Ur

CAACCCCAAACCACAACCATAA

M- oligonucleotídeo específico para o alelo metilado; U- oligonucleotídeo específico para

alelo não metilado; f- “forward” = senso; r- “reverse” = anti-senso (*HERMAN et al.,1996).

As condições finais, nas quais as reações de PCR foram conduzidas, consistiram de 3µL

do DNA modificado por bisulfito, MgCl

6.7mM (INVITROGEN), 5µL de tampão de reação

(200mM tris-HCl pH 8.4, 500mM KCl) (INVITROGEN), dATP 1.25mM, dTTP 1.25mM,

dCTP 1.25mM e dGTP 1.25mM (INVITROGEN), 1nmol de cada oligonucleotídeo e 1U de

Taq polimerase (INVITROGEN) para um volume final de 50µL.

A reação foi realizada utilizando-se o termociclador PTC-150 (MJ Research) e as

condições de ciclagem para ambos os genes incluíram: desnaturação inicial a 95ºC por 10

minutos, “hot-started” a 72ºC por 5 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 minuto,

pareamento a 60ºC por 30 segundos, extensão a 72°C por 30 segundos; e extensão final a

72°C por 10 minutos. Após a amplificação, os produtos foram visualizados em gel de

poliacrilamida.

3.4.3.3 Avaliação dos Produtos gerados pela PCR nos Genes p15

INK4B

e p16

INK4A

Após a amplificação, os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de

poliacrilamida 5%.

O preparo do gel foi realizado com 1,5mL de solução de acrilamida (AMERSHAM

BIOSCIENCES): bis-acrilamida (AMERSHAM BIOSCIENCES) 20% (19:1), 0,3 mL de

tampão TBE 10X [tris 0,89M (AMERSHAM BIOSCIENCES); ácido bórico 0,89M

(ISOFAR); EDTA 0,02M (AMERSHAM BIOSCIENCES)], 42µL de persulfato de amônio

10% (AMERSHAM BIOSCIENCES), 6µL de TEMED (INVITROGEN) e água destilada

para volume final de 6mL. Em um volume de 5µL do produto de PCR foram acrescentados

2µL do corante de corrida [azul de bromofenol 0,25% (AMERSHAM BIOSCIENCES);

xileno cianol 0,25% (AMERSHAM BIOSCIENCES); glicerol 30% (ISOFAR)]. A

eletroforese foi realizada em cuba vertical (Cuba Mini-Protean – BIO-RAD) a 110V por 50

minutos e o TBE 0,5X foi utilizado como tampão de corrida. Em seguida, o gel foi corado

com nitrato de prata (MERCK) (Santos, 2002). Para fins comparativos, foi utilizado o padrão

de peso molecular “Low DNA Mass Ladder” (INVITROGEN).

3.4.3.4 Sequenciamento de DNA

Em todas as amostras positivas para a presença de metilação na região promotora dos

genes p15

INK4B

e p16

INK4A

foi realizado o sequenciamento automático do DNA, como uma

metodologia adicional confirmatória. As amostras positivas derivadas do produto de PCR

foram purificadas utilizando o kit GFX

PCR (DNA and Gel Band purification Kit-

AMERSHAM BIOSCIENCES), segundo recomendações do fabricante. Um volume de 30µL

do produto de PCR foram acrescentados em 500µL de tampão de captura e colocadas em um

tubo contendo uma coluna. A amostra foi centrifugada a 6000 rpm por 30 segundos e o

precipitado descartado. Foi adicionado 500

µL de tampão de lavagem (10mM TE; etanol 80%)

na coluna e centrifugado novamente a 6000 rpm por 30 segundos. A coluna foi lavada com

20µL de água destilada e centrifugada a 6000 rpm por 1 minuto para eluir o DNA. O DNA

purificado foi quantificado através do espectrofotômetro em leitura em comprimento de onda

de 260nm(Biophotometer 8,5mm- EPPENDORF).

O sequenciamento foi realizado utilizando a Plataforma ABI PRISM 3100 Genetic

Analyser (Applied Biossistems). Para cada amostra de produto de PCR foram realizados dois

sequenciamentos, um utilizando oligonucleotídeos senso (f) e outro oligonucleotídeos anti-

senso (r). Para a reação de sequenciamento foi utilizado 100ng do DNA purificado e 3,2pmol

do oligonucleotídeo (tabela 7), em um volume total de 7µL, 1 µL de tampão 5x (Tris HCl

400mM; MgCl

10mM, pH 9,0), 1µL de H

O ultra pura e 1µL do “Mix Big Dye” (Taq +

fluoróforos + MgCl

). As condições de ciclagem foram 25 ciclos de desnaturação a 96ºC por

10 segundos, pareamento a 50ºC por 5 segundos e extensão a 60ºC por 4 minutos.

Após a PCR, o material foi precipitado com 40µL de isopropanol 75%, deixado a

temperatura ambiente por 15 minutos e centrifugado a 4000 rpm (centrifuga EPPENDORF-

modelo 5804) por 45 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado lavado com

50µL de etanol 70% e centrifugado por 15 minutos a 4000 rpm (centrifuga EPPENDORF-

modelo 5804). Após secar por 15 minutos a 37°C foram acrescentados 10µL de formamida

ultrapura (MERCK). O material foi então desnaturado por 10 min a 96°C em máquina de

PCR e mantido no gelo. A placa foi então colocada na Plataforma 3100 para a leitura da

seqüência. A análise do resultado do sequenciamento foi feita através do programa

“

BioEdit

Sequence Alignment Editor”

Resultados

4.1 Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância

No presente estudo foi feita a análise citogenética em 64 pacientes com síndrome

mielodisplásica primária na infância com idades que variaram de 5 meses a 18 anos, sendo 40

do sexo masculino e 24 do sexo feminino. Do total de pacientes analisados de acordo com a

classificação para SMD da infância (HASLE et al., 2003), 35 apresentaram CR, 14 AREB, 10

AREB-t e 5 LMMJ. Neste estudo não foram caracterizados pacientes com ARSA. Duas

crianças eram portadoras da Síndrome de Down (pacientes nº36 e nº58, tabela 6). Em três

casos (pacientes nº7, nº11 e nº37, tabela 6) não foi possível a obtenção de mitoses para a

análise citogenética. Nos demais casos, o índice mitótico variou de regular para bom, com

uma boa qualidade de cromossomos metafásicos para definição do padrão cromossômico.

Alterações cromossômicas foram detectadas em 44 pacientes (72%) dos 61 casos

analisados (tabela 6). A análise citogenética auxiliou no diagnóstico dos casos com suspeita

de SMD primária pediátrica e foi uma importante ferramenta para a escolha do tratamento.

Tabela 6: Análise Citogenética em Síndrome Mielodisplásica Primária na Infância

Nº

Idade/

Sexo

Subtipo

Cariótipo Evolução

da doença

Grupos

de Risco

(IPSS)

1 8a /F CR 46,XX,del(9)(p21)[3]/46,XX[19] não/TMO/óbito

int-1

2 13a /M

CR 46,XY,del(17)(p12)[9]/46,XY,del(17)(p12),

del(12)(p13)[5]/46,XY,del(11)(q23)[3]/46,XY[34]

não /TCTCU int-1

3 9a /M

CR 46,XY,del(3)(p23)[5]/46,XY[38] sim/ Epo/AREB

int-1

3a 10a /M

AREB 46,XY,del(3)(p23)[11]/46,XY[21] Epo/óbito int-2

4 1a /M

CR 46,XY[32] não/transfusão int-1

5 3a /M

CR 46,XY,+der(3)del(3)(q21),-7,-9,+mar[2]/46,XY[27]

sim/AREB/

int-2

6 13a /F

CR 46,XX,del(5)(q15q35)[15]/46,XX[38] não/TMO int-1

7 5m /M

CR sem mitose não/transfusão ------

8 14a /M

CR 46,XY,del(11)(q23)[5]/46,XY[27] não/ transfusão int-1

9 7a /F CR 46,XX,del(12)(p13)[10]/46,XX[28] não/TMO int-1

10 11a /M

CR 46,XY[26] não/ transfusão int-1

11 8a /M

CR sem mitose não transfusão ------

12 15a /F

CR 46,XX[22] não/ transfusão int-1

13 5a /M

CR 46,XY[35] não/ transfusão/

óbito

int-1

14 8a /M

CR 46,XY[33] não/ transfusão/

óbito

int-1

15 7a /M

CR 46,XY[20] não/ transfusão int-1

16 16a /M

CR 46,XY[41] não/ transfusão int-1

17 18m/F CR 46,XX[40] sim/GM-CSF

/AREB

int-1

17a

2a /F AREB 46,XX,del(11)(q23)[15]/46,XX[18] óbito int-2

18 7a /M

CR 46,XY,-7,+20[13]/46,XY[17] não/TMO int-2

19 7a /M

CR 46,XY,del(12)(p12)[6]/46,XY[37] não/TMO int-1

20 8a /F CR 46,XX[30] não/ transfusão int-1

21 18a/F

CR 46,XX,del(6)(q21)[13]/46,XX[25] sim /AREB int-1

21a

18a/F

AREB 46,XX,del(6)(q21)[10]/46,XX[12] TMO int-2

22 7a /M

CR 46,XY[32] não/ transfusão int-1

23 15a /F

CR 46,XX[36] não/ transfusão int-1

24 16a /F

CR 47,XX,+mar[2]/46,XX[27] não/TMO/óbito

int-1

25 7a /F CR 46,XX[30] não/ transfusão int-1

26 6a /F CR 46,XX[32] não/ transfusão int-1

27 14a /M

CR 46,XY,del(17)(p12)[15]/46,XY[28] não/TMO int-1

28 18a /M

CR 46,XY,del(17)(p12)[4]/ 46,XY[25] não/TMO int-1

29 7a /M

CR 46,XY[20] não/TMO int-1

30 12a /M

CR 46,XY,del(17)(p12)[12]/46,XY[8] não/TMO int-1

31 11a /F

CR 46,XX[20] não/TMO int-1

32 17a /F

CR 51,XX,+4,+6,+8,+14,+20[3]/46,XX[41] não/TMO int-1

33 18a /M

CR 46,XY,csb[6]/46,XY[20] não/TMO int-1

34 9a /M

CR 46,XY,del(17)(p12)[5]/46,XY[16] não/TMO int-1

35 10a /F

CR 46,XX,csb[8]/46,XX[31] não/TMO int-1

36 17m /F

AREB 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?,p13),+21c[15]/

47,XX,+21c[6]

sim/LMA/

QT/óbito

alto-risco

37 7a/M AREB sem mitose não/ transfusão ------

38 2a /M

AREB 45,XY,-19[4]/46,XY[25] não/ transfusão int-2

39 9m /M

AREB 46,XY,del(6)(q23)[5]/46,XY[15] não/ transfusão int-2

40 5a /M

AREB 47,XY,+8[11]/46,XY[34] sim/ LMA/

QT /óbito

int-2

41 16a /M

AREB 47,XY,+8[30]/46,XY[21] sim /LMA/

QT/óbito

int-2

42 7a /F

AREB 46,XX,i(9)(q10)[15]/46,XX[7] sim/LMA/

TMO/ óbito

int-2

43 15a /F

AREB 46,XX,del(11)(q23)[14]/46,XX[23] sim/LMA/

TMO/óbito

int-2

44 13a /F

AREB 46,XX,del(7)(q22)[10]/46,XX[12] não/TMO alto risco

45 12a /M

AREB 46,XY,del(11)(q23)[12]/46,XY[8] sim/LMA/

QT/ óbito

int-2

46 6a /F AREB 58,XX,+X,+3,+5,+6,+8,+10,+11,+12,+13,+18,+20,

+21[5]/58,XX,idem,dup(1)(q21q31)[14]/46,XX[21]

sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

47 14a /M

AREB 46,XY,del(7)(q22)[10]/46,XY,del(7)(q22),

del(12)(p12)[3]/46,XY[7]

sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

48 18a /M

AREB 46,XY[20] não/TMO int-1

49 17a /M

AREB 46,XY[20] não/TMO int-1

50 2a /F AREB-t

46,XX,t(4;7)(p16;p15)[16]/46,XX[23] sim/LMA/

QT/óbito

alto risco

51 4a /F AREB-t

49,XX,dup(1)(q21q32),+6,+8,+mar[4]/46,XX[16] sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

52 1a /M

AREB-t

46,XY,add(9)(q34)[5]/46,XY,inv(1)(q21),

add(9)(q34)[4]/46,XY[22]

sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

53 10a /M

AREB-t

45,XY,-7[26]/46,XY[4] sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

54 21m/M

AREB-t

45,XY,-7[24]/46,XY[6] sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

55 12a /M

AREB-t

45,XY,-7[18]/46,XY[2] não/ TMO/ óbito

alto risco

56 5a /M

AREB-t

46,XY,t(5;8)(q32;q22)[23]/46,XY[8] sim/LMA/

QT/ óbito

alto risco

57 22m/M

AREB-t

45,XY,-7[14]/46,XY[6] sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

58 12a /M

AREB-t

58,XY,+8,+13,+13,+14,+15,+20,+21c,+21,+21,

+21,+22,+22[20]/47,XY,+21c[2]

sim /LMA/

QT/óbito

alto risco

59 17a /M

AREB-t

47,XY,+8[22]/46,XY[4] sim /LMA/

TMO/óbito

alto risco

60 21m /F

LMMJ 46,XX,inv(5)(q11q21),-9,+mar[2]/46,XX[38] não/QT/óbito alto risco

61 2a /M

LMMJ 47,XY,+16[6]/46,XY[17] não/QT int-2

62 2a /M

LMMJ 46,XY,del(11)(q23)[10]/46,XY[10] sim /LMA/

QT/óbito

int-2

63 1a /F LMMJ 46,XX,del(11)(q23)[5]/46,XX[24] não/QT/óbito int-2

64 8a /M

LMMJ 45,XY,-7[20]/46,XY[2] não/ TMO/ óbito

alto risco

CR - citopenia refratária; AREB - anemia refratária com excesso de blastos; AREB-t - anemia

refratária com excesso de blastos em transformação; LMMJ- leucemia mielomonocítica juvenil;

LMA- leucemia mielóide aguda; a - ano(s), m- meses, F- feminino, M- masculino, TMO- transplante

de medula óssea alogenêico, TCTCU- transplante de células tronco de cordão umbilical, QT-

quimioterapia; GM-CSF - fator de estimulação de colônias granulócito-macrófago, Epo-

eritropoetina; int-1- intermediário 1; int-2- intermediário 2; números 3a, 17a e 21a- acompanhamento

dos paciente 3, 17 e 21 respectivamente.

4.1.1 Freqüência de Casos com Alterações Cromossômicas por Subtipos de SMD

Primária na Infância

Para o cálculo da freqüência de casos com anomalias cromossômicas nos subtipos foi

considerado como 100% o total de casos analisados por subtipo. Dos 33 pacientes com CR,

18 (54,5%) apresentaram cariótipo anormal. Nos subtipos mais avançados da doença a

freqüência de casos com alterações cromossômicas foi maior, sendo verificada em 11 (85%)

dos 13 pacientes com AREB, em 10 (100%) dos casos com AREB-t e em 5 (100%) dos casos

de LMMJ (tabela 7). Portanto, podemos perceber que conforme o subtipo da SMD se torna

mais avançado o número de casos com cariótipos anormais aumenta.

Tabela 7: Freqüência de Casos com Cariótipos Anormais em SMD Primária na Infância

Classificação Total de Pacientes Analisados Nº de casos com cariótipos

anormais

CR 33 18 (54,5%)

AREB 13 11 (85%)

AREB-t 10 10 (100%)

LMMJ 5 5 (100%)

Total 61 44 (72%)

Verificamos que diferente das leucemias, o padrão cromossômico em pacientes

portadores de SMD primária na infância é caracterizado principalmente por perdas parciais e

completas de cromossomos (as deleções e as monossomias), assim como o ganho

cromossômico (trissomias). Neste estudo foram encontrados poucos casos de translocações

cromossômicas. Como podemos observar na figura 7, as anomalias cromossômicas mais

freqüentes foram: alterações envolvendo o cromossomo 7 (-7/7q

), sendo verificadas em 8

pacientes (18%), cariótipos complexos em 6 pacientes (14%), del(11)(q23) em 5 pacientes

(11%), e a del(17)(p12) em 4 pacientes (9%). Outras alterações encontradas com menor

freqüência foram: +8, alterações envolvendo o cromossomo 9 [add(9)(q34), del(9)(p21) e

i(9)(q10)] e translocações cromossômicas, sendo observados em 3 pacientes (7%) cada

alteração cromossômica; del(6)(q21), del(12)(p13) e quebras cromatídicas em 2 pacientes

(4,5%) e del(3)(p23), del(5)(q15q35),+16, alteração cromossômica biclonal, -19 e +mar em 1

paciente (2%). Os cariótipos mostrando as principais alterações cromossômicas detectadas

neste estudo podem ser visualizados no anexo 2.

Fig. 7: Freqüência das alterações cromossômicas em SMD primária na infância.

Estudando a distribuição das alterações cromossômicas por subtipo, foi verificado que

aparentemente não há uma especificidade de uma alteração cromossômica por subtipo. No

subtipo CR, os pacientes apresentaram cariótipos normais, del(3p), del(5q), del(6q), -7

associado com +20, del(9p), del(11q), del(12p), del(17p), +mar e cariótipo complexo, sendo a

alteração mais freqüente a del(17p). No subtipo AREB a incidência de cariótipos normais foi

baixa predominando as seguintes alterações cromossômicas: del(6q), del(7q), +8, i(9q),

del(11q), der(17), -19 e cariótipos complexos, no entanto, a del(7q), +8 e del(11)(q23) foram

as alterações mais freqüentes; em AREB-t todos os pacientes apresentaram alterações

cromossômicas, como: -7, add(9q) associado com inv(1q), +8, t(5;8) e cariótipos complexos,

sendo a alteração mais freqüente a -7. Os pacientes classificados como LMMJ não

10%

12%

14%

16%

18%

Freqüência de casos

q)/

-7

(11)

(

)

add(9q)/ del(9p)/ i

(

9q)

)

-19

+mar

apresentaram cariótipos normais, tendo como alterações cromossômicas a -7, del(11)(q23),

+16 e cariótipos complexos, no entanto, a del(11)(q23) foi a alteração mais freqüente.

Podemos observar que a monossomia do cromossomo 7 esteve presente principalmente nos

subtipos mais avançados da doença (tabela 8).

Tabela 8: Distribuição do Padrão Cromossômico por Subtipo de SMD Primária na Infância

Subtipo

Cariótipo N° de

pacientes

%/ subtipo

(33 pacientes)

cariótipo normal

del(3p)

del(5q)

del(6q)

-7 e +20

del(9p)

del(11)(q23)

del(12p)

del(17p)

+mar

alteração biclonal

quebras cromatídicas

cariótipos complexos

46%

12%

AREB

(13 pacientes)

cariótipos normais

del(6q)

del(7q)

i(9q)

del(11)(q23)

-19

translocações cromossômicas

cariótipos complexos

15%

AREB-t

(10 pacientes)

cariótipos normais

-7

add(9q) e inv(1q)

translocações cromossômicas

cariótipos complexos

40%

10%

20%

LMMJ

(5 pacientes)

cariótipos normais

-7

del(11)(q23)

+16

cariótipos complexos

20%

40%

20%

4.2 Citogenéica Molecular: Aplicação do FISH em SMD Primária na Infância

(B A metodologia da citogenética molecular (FISH) foi utlizada em sete pacientes com

SMD primária na infância. Em três pacientes, que não apresentaram mitose para análise

através da citogenética clássica, para afastarmos alterações cromossômicas de mau

prognóstico foram utilizadas as sondas do cromossomo 7 e da região q23 do cromossomo 11.

Os três pacientes mostraram os sinais normais, respectivos de cada cromossomo (fig. 8).

Fig 8: Análise por hibridização in situ por fluorescência. (A) FISH utilizando a sonda do cromossomo

7 (LSI D7S486 spectrum orange/CEP 7 spectrum green, Vysis, Inc. Downers Grove, USA). Podemos

observar quatro marcações nos núcleos interfásicos, caracterizando uma célula normal para o

cromossomo 7. O segmento da sonda de cor verde marca a região centromérica do cromossomo 7 e o

de cor vermelha, a região q31. (B) FISH utlizando a sonda da região 11q23 (LSI MLL Dual Color,

Vysis, Inc. Downers Grove, USA). Podemos observar que ocorreu a marcação normal do gene nos

dois cromossomos na metáfase, mostrando a presença dos dois alelos. O mesmo podemos observar no

núcleo interfásico.

Utilizamos a técnica de FISH para confirmação da presença da deleção do braço curto

do cromossomo 17 e a deleção do braço longo do cromossomo 11 na região q23, em uma

criança com SMD hipocelular, CR, que apresentou dois clones caracterizados

citogeneticamente:46,XY,del(17)(p12)[9]/46,XY,del(17)(p12),del(12)(p13)[5]/46,XY,del(11)

(q23)[3]/ 46,XY[34] (fig.9A). Neste caso foram realizadas duas preparações, uma utilizando a

sonda do gene p53 mapeado na região p13.1 do cromossomo 17 e a outra utilizando a sonda

do gene MLL mapeado no braço longo do cromossomo 11, na região q23. A análise por FISH

(A)

(B)

17p(12)

12p(13)

11q(23)

(A)

detectou a ausência dos alelos dos genes p53 e MLL (fig. 9B e 9C, respectivamente). Este

caso é o primeiro relato da literatura, mostrando uma alteração citogenética biclonal

envolvendo os cromossomos 11 e 17 em SMD hipocelular na infância. A análise citogenética

exerceu um papel fundamental para a confirmação da doença, uma vez que esta criança não

apresentava diagnóstico concluído. Este paciente foi indicado para o transplante de medula

óssea alogenêico (TMO), entretanto, não possuía doador HLA compatível, sendo submetido

ao transplante de células tronco de cordão umbilical (TCTCU) (doador feminino) e hoje, 15

meses após o transplante ele se encontra em remissão citogenética completa (100% de células

femininas).

Fig. 9: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial,

bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica biclonal: del(17)(p12)/

del(17)(p12),del(12)(p13) e del(11)(q23); FISH utilizando as sondas dos genes p53 (B) e MLL (C).

Podemos observar que tanto em B quanto em C ocorreu a marcação do gene em apenas um

cromossomo na metáfase, mostrando a ausência de seu respectivo alelo (setas). O mesmo podemos

observar no núcleo interfásico (setas). Na figura C podemos observar um núcleo interfásico com duas

marcações, caracterizando uma célula normal.

(C)

(B)

A técnica de FISH também foi aplicada em um caso de SMD hipocelular classificada

como CR que apresentou o seguinte padrão cromossômico: 46,XX,del(5)(q15q35)[15]/

46,XX[38] (fig. 10A). A del(5q) corresponde a uma alteração cromossômica muito rara na

infância, desta forma, para caracterizarmos melhor esta alteração e verificarmos se houve a

perda do gene c-fms (localizado na região q33), utilizamos a sonda que marca o braço curto

do cromossomo 5 (cor verde) e a região 5q33-q34 (cor vermelha) (LSI CSF1R SO/

LSID5S23:D5S721 SG – Vysis, Inc. Downers Grove, USA). Nosso resultado mostrou a

perda da região q33-q34 do cromossomo 5 neste paciente (fig. 10B), confirmando nosso

achado prévio da citogenética clássica.

Fig. 10: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial,

bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica: del(5)(q15q35). (B) FISH utilizando a sonda de

dupla marcação do cromossomo 5. O segmento da sonda de cor verde marca o braço curto do

cromossomo 5 e o de cor vermelha, a região 5q33-q34. Podemos observar a marcação em dois

núcleos interfásicos, um núcleo apresentando quatro sinais caracterizando os dois cromossomos 5

normais e outro núcleo apresentando três sinais(seta), confirmando a perda da região q33-q34.

Para investigarmos o envolvimento do gene supressor de tumor p53, em um

cromossomo derivativo, resultante da translocação não balanceada envolvendo provavelmente

o braço longo do cromossomo 1 e o braço curto do cromossomo 17, utilizamos a técnica de

FISH. Este paciente era portador da SD e a análise por citogenética clássica mostrou o

(A)

(B)

seguinte padrão cromossômico: 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?;p13),+21c[15]/47,XX,+21c[6]

(fig. 11A). Através da análise por FISH foi confirmado o derivativo do cromossomo 17, sem

o envolvimento do gene supressor de tumor p53 (fig. 11B). Esta paciente foi tratada com

quimioterapia, evoluindo para LMA e logo após foi a óbito.

Fig. 11: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial,

bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica: der(17)t(1?;17)(q32?;p13). (B) Análise por

FISH utilizando a sonda do gene p53 localizado na região p13.1 do cromossomo 17, mostrando a

presença do gene p53 nos dois cromossomos.

Para realizar o acompanhamento de evolução da doença e monitoramento terapêutico

(pós QT) de um paciente apresentando AREB-t e monossomia do cromossomo 7 ao

diagnóstico (fig. 12A), aplicamos a técnica de FISH. Para esta análise foi utilizada a sonda

com dupla marcação do cromossomo 7 (fig. 12B). Esta metodologia foi aplicada, pois para

definição do padrão cromossômico no acompanhamento de evolução da doença, o número de

metáfases analisadas foi pequeno, apenas 12, entretanto, não observamos a presença de

alterações cromossômicas adicionais. O FISH mostrou através de 300 células analisadas

(metáfases e núcleos interfásicos) um aumento do clone apresentando a monossomia do

cromossomo 7 (95%). Esta criança evoluiu para LMA e foi tratada com QT. No

monitoramento da terapia observamos células com monossomia do cromossomo 7, indicando

a recaída da doença.

(A)

(B)

Fig. 12: Análise por citogenética clássica e citogenética molecular (FISH). (A) Cariótipo parcial,

bandeamento G, mostrando a alteração cromossômica: -7. (B) FISH: sonda do cromossomo 7 (LSI

D7S486 spectrum orange/ CEP 7 spectrum green, Vysis, Inc. Downers Grove, USA). O segmento da

sonda de cor verde marca a região centromérica do cromossomo 7 e o de cor vermelha, a região q31.

Podemos observar quatro marcações nos núcleos interfásicos, caracterizando uma célula normal para o

cromossomo 7. Observamos a presença de alguns núcleos com apenas dois sinais, caracterizando a

monossomia de 7 (setas). Na metáfase, observamos também a marcação em apenas um cromossomo,

confirmando a monossomia de 7 (seta).

4.3 Distribuição dos Pacientes com SMD Primária na Infância segundo os Grupos de

Risco (IPSS)

Utilizamos os critérios adotados pelo IPSS (tabela 3) para classificar os pacientes com

SMD primária na infância de acordo com os grupos de risco. O IPSS tem por objetivo prever

o tempo de sobrevivência e a taxa de transformação leucêmica. Verificamos que nenhum dos

nossos pacientes foi classificado como de baixo risco, sendo o grupo de risco mais freqüente o

intermediário 1 (tabela 9). Dos 61 pacientes 33 (54%) foram classificados como intermediário

1, 12 (20%) intermediário 2 e 16 (26%) alto risco.

Evolução da doença foi verificada em 34,4% (22) do total dos 64 pacientes estudados.

Correlacionando os grupos de risco com a taxa de evolução da doença, verificamos que os

pacientes classificados com alto risco, apresentaram a maior taxa de evolução da doença. Dos

(A)

(B)

pacientes classificados como intermediário 1 (33) e intermediário 2 (12), apenas 3 (9%) e 5

(42%) apresentaram evolução da doença e 18% e 58,3% foram à óbito respectivamente. No

entanto, 12 (75%) dos 16 pacientes classificados como alto risco apresentaram evolução da

doença, revelando um pior prognóstico e alta taxa de mortalidade (94%).

Tabela 9: Freqüência de Pacientes com SMD Primária na Infância de acordo com o IPSS

(1997) que mostraram evolução da doença

Classificação

IPSS

Grupos de Risco

Total de Pacientes

Pacientes que mostraram

evolução da doença (%)

N° de óbitos

Baixo 0 0 0

Intermediário 1 33 3 (9%) 6 (18%)

Intermediário 2 12 7 (58,3%) 7 (58,3%)

Alto 16 12 (75%) 15 (94%)

Total 61 22 (36%) 28 (46%)

OBS: três pacientes não apresentaram mitose, dessa forma não foi possível aplicar o IPSS.

Diferentes tratamentos foram utilizados em nossos pacientes como transfusão

sanguínea que foi aplicada em 18 pacientes (28%), fatores de crescimento em 2 pacientes

(3%), quimioterapia em 19 pacientes (30%) e TMO em 25 pacientes (39%). A quimioterapia

revelou-se como sendo o pior tratamento para estes pacientes com uma taxa de mortalidade de

84%. O transplante de medula óssea alogenêico demonstrou ser eficaz para este grupo de

pacientes, apresentado uma taxa de mortalidade de 28%.

4.4 Análise Molecular

A análise do padrão de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

45 pacientes com SMD primária na infância foi realizada pela técnica MSP. Os pacientes

foram distribuídos segundo a classificação em: 26 casos com CR, 9 com AREB, 8 com

AREB-t e 2 com LMMJ. A metilação em p15

INK4B

foi detectada em 35,5% dos pacientes e em

p16

INK4A

em 8,8% do total de casos analisados.

4.4.1 Análise da Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p15

INK4B

Pacientes com SMD Primária na Infância

Para a análise da presença de metilação no gene p15

INK4B

em pacientes com SMD

primária na infância, nós utilizamos como controle negativo o DNA de células mononucleares

de doadores de medula óssea e como controle positivo o DNA das células da linhagem Raji.

Em todas as amostras foram amplificadas as regiões promotoras do gene p15

INK4B

através da

reação em cadeia da polimerase específica para a metilação (MSP) com 100% de sucesso

após otimização das concentrações dos reagentes e das condições de ciclagem.

Não foi detectada a presença de metilação no gene p15

INK4B

nas 10 amostras de DNA dos

doadores de medula óssea. As células da linhagem Raji não apresentaram 100% de metilação

para este gene, sendo detectada também a presença de células não metiladas para este gene,

como observado por Herman et al., 1996 (fig. 13A).

Das 45 amostras de DNA de pacientes com SMD primária analisadas 16 (35,5%)

apresentaram metilação na região promotora deste gene (tabela 10). No entanto, nenhum

destes pacientes apresentou metilação em 100% das células analisadas, como podemos

verificar na fig.13B, a qual mostra a presença do gene tanto nas reações que foram utilizados

oligonucleotídeos específicos para metilação (M), quanto nas reações com oligonucleotídeos

específicos para o gene não metilado (U), sugerindo desta forma que o gene apresenta-se

metilado em apenas uma porcentagem de células.

(A) (B)

Fig. 13: Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos produtos de

PCR referente à análise de metilação do gene p15

INK4B

após a modificação do DNA com bisulfito. (A)

Linha L: marcador de peso molecular “Low DNA Mass Ladder” (INVITROGEN); linhas U:

fragmentos relativos ao produto de PCR de 154pb realizado com oligonucleotídeos específicos para o

gene não metilado; linha M: fragmentos relativos ao produto de PCR de 148pb realizado com

oligonucleotídeos específicos para o gene metilado. Água: controle da reação; doador: controle

negativo para metilação; linhagem celular Raji: controle positivo para metilação e paciente nº1 (tabela

10). (B) 1-4: pacientes positivos para a metilação na região promotora do gene p15

INK4B

(pacientes nº.

9, 18, 42, 53 da tabela 10)

Tabela 10: Identificação de Metilação no Gene p15

INK4B

em SMD Primária na Infância

Paciente Subtipo Idade / Sexo Metilação no gene p15

1 CR 8a / F -

2 CR

13a / M

4 CR 1a / M -

5 CR 3a / M -

6 CR 13a / F -

7 CR 5m /M -

8 CR 14a / M -

9 CR 7a / F +

10 CR 11a / M -

11 CR 8a / M -

12 CR 15a / F +

13 CR 5a / M -

14 CR 8a / M -

15 CR 7a / M -

16 CR 16a / M -

17a AREB 18m / F +

18 CR 7a / M +

19 CR 7a / M -

20 CR 8a / F -

21 CR 18a/F +

22 CR 7a / M -

23 CR 15a / F -

24 CR 16a / F +

25 CR 7a / F -

26 CR 6a / F -

27 CR 14a / M -

29 CR 7a/M -

36 AREB 17m / F -

40 AREB 5a / M -

41 AREB 16a / M -

42 AREB 7a / F +

43 AREB 15a / F -

44 AREB 13a / F +

45 AREB 12a / M +

47 AREB 14a / M +

50 AREB-t 2a/F +

53 AREB-t 10a / M +

54 AREB-t 21m / M +

55 AREB-t 12a / M +

56 AREB-t 5a / M -

57 AREB-t 22m / M +

58 AREB-t 12a / M -

59 AREB-t 17a / M -

60 LMMJ 21m / F -

63 LMMJ 1a /F +

4.4.1.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação na

Região Promotora do Gene p15

INK4B

Todas as 16 amostras de produto da MSP positivas para metilação (M) na região

promotora do gene p15

INK4B

dos pacientes com SMD primária, uma amostra da linhagem

celular Raji (controle positivo) e uma amostra para ausência de metilação (U) (controle

negativo, doador de medula óssea) foram seqüenciadas com o objetivo de confirmar a

presença de metilação e demonstrar a modificação do DNA pelo tratamento com bisulfito,

comprovando a eficiência desta técnica. Para cada paciente foram realizadas duas reações de

sequenciamento, uma utilizando oligonucleotídeo F (“forward”= senso) e a outra utilizando o

oligonucleotídeo R (reverse = anti-senso).

A análise do sequenciamento demonstrou que os DNAs foram modificados pelo

tratamento com bisulfito. Como podemos verificar na fig. 14, quando comparamos a

seqüência selvagem (S) com a seqüência não metilada (U) percebemos, que todas as citosinas

não metiladas foram convertidas em timinas após a técnica MSP em ambos os genes. Além

disso, quando comparamos a seqüência não metilada (U) com a seqüência metilada (M),

verificamos os sítios de metilação (*), confirmando dessa forma, a presença de metilação

nestes pacientes.

* * * * * * *

Fig. 14: Análise do sequenciamento do gene p15

INK4B

(5’→ 3’) através do programa “BioEdit

Sequence Alignment Editor”. (A) Comparação da seqüência da região promotora do gene p15

INK4B

selvagem (S) com amostra de DNA tratada com bisulfito de um doador- seqüência não metilada (U) e

um paciente com SMD positivo para a metilação (M), mostrando que houve a conversão de todas as

citosinas não metiladas em timinas após a amplificação e os sítios específicos de metilação na

sequência metilada (*); (B) Gráfico mostrando o resultado do sequenciamento do gene p15

INK4B

de um

paciente positivo para metilação.

4.4.2 Freqüência de Metilação em p15

INK4B

nos Subtipos de SMD Primária na Infância

A correlação entre a freqüência de metilação no gene p15

INK4B

e os diferentes subtipos foi

calculada e pode ser vista na tabela 11. Como podemos notar as maiores freqüências de

metilação para o gene p15

INK4B

estiveram presentes nos subtipos mais agressivos de SMD

como AREB, AREB-t e LMMJ, com as freqüências de 55,5% e 62,5% e 50%

respectivamente. No subtipo menos agressivo da doença como, CR, a freqüência foi mais

baixa sendo 19% do total de pacientes analisados para este grupo. Dos 16 pacientes positivos

para metilação, 9 apresentaram evolução da doença (56%) e 11 pacientes faleceram (69%).

(A)

(B)

Nossos resultados sugerem que a metilação na região promotora do gene p15

INK4B

está

associada com maior risco de evolução da doença e confere mau prognóstico.

Tabela 11: Freqüência de Metilação no Gene p15

INK4B

nos Subtipos de SMD Primária na

Infância

Classificação N° de pacientes N° de pacientes com metilação em

p15

INK4B

CR 26 5 (19%)

AREB 9 5 (55,5%)

AREB-t 8 5 (62,5%)

LMMJ 2 1 (50%)

Total 45 16 (35,5%)

4.4.3 Análise da Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p16

INK4A

Pacientes com SMD Primária na Infância

No estudo do padrão de metilação no gene p16

INK4A

em pacientes com SMD primária

na infância, foram utilizados como controle negativo DNA de células mononucleares de

doadores de medula óssea e como controle positivo DNA de células da linhagem DLD-1. A

análise do padrão de metilação nos DNAs dos 10 doadores de medula óssea revelou ausência

de metilação em todas as amostras. A amostra de DNA das células da linhagem DLD-1

apresentou 100% de metilação.

A metilação na região promotora do gene p16

INK4A

foi detectada em apenas quatro

(8,8%) dos 45 pacientes portadores de SMD primária na infância (tabela 12). No entanto,

nenhum dos pacientes apresentou este gene totalmente metilado, sendo positivos também para

a MSP com oligonucleotídeos específicos para o gene não metilado (fig. 15).

Tabela 12: Identificação de Metilação no Gene p16

INK4A

em SMD Primária na Infância

Paciente Subtipo Idade / Sexo

Metilação no gene

p16

INK4A

1 CR 8a / F -

2 CR

13a / M

4 CR 1a / M -

5 CR 3a / M -

6 CR 13a / F -

7 CR 5m /M -

8 CR 14a / M -

9 CR 7a / F -

10 CR 11a / M -

11 CR 8a / M -

12 CR 15a / F -

13 CR 5a / M -

14 CR 8a / M -

15 CR 7a / M -

16 CR 16a / M -

17a AREB 18m / F +

18 CR 7a / M -

19 CR 7a / M -

20 CR 8a / F -

21 CR 18a/F -

22 CR 7a / M -

23 CR 15a / F -

24 CR 16a / F -

25 CR 7a / F -

26 CR 6a / F -

27 CR 14a / M -

29 CR 7a/M -

36 AREB 17m / F -

40 AREB 5a / M -

41 AREB 16a / M -

42 AREB 7a / F -

43 AREB 15a / F +

44 AREB 13a / F -

45 AREB 12a / M -

47 AREB 14a / M -

50 AREB-t 2a/F -

53 AREB-t 10a / M -

54 AREB-t 21m / M -

55 AREB-t 12a / M -

56 AREB-t 5a / M +

57 AREB-t 22m / M +

58 AREB-t 12a / M -

59 AREB-t 17a / M -

60 LMMJ 21m / F -

63 LMMJ 1a /F -

(A) (B)

Fig. 15 – Fotografia de gel de poliacrilamida 5% utilizado para verificar a amplificação dos produtos

de PCR referente à análise de metilação da região promotora do gene p16

INK4A

após a modificação do

DNA com bisulfito. (A) Linha L: marcador de peso molecular “Low DNA Mass Ladder”

(INVITROGEN); linhas U: fragmentos relativos ao produto de PCR de 151pb, realizado com

oligonucleotídeos específicos para o gene não metilado; linha M: fragmentos relativos ao produto de

PCR de 150pb realizado com oligonucleotídeos específicos para o gene metilado. Água: controle da

reação; doador: controle negativo para metilação; linhagem celular DLD-1: controle positivo para

metilação e paciente nº1 (tabela 12). (B) 1-4: pacientes positivos para a metilação na região promotora

do gene p16

INK4A

(pacientes nº 56, 17a, 57 da tabela 12)

4.4.3.1 Confirmação por Sequenciamento das Amostras Positivas para a Metilação na

Região Promotora do Gene p16

INK4A

As quatro amostras do produto da MSP positivas para metilação (M) no gene p16

INK4A

de pacientes com SMD primária, uma amostra da linhagem DLD-1 (controle positivo) e uma

amostra para ausência de metilação (U) (controle negativo - doador de medula óssea) do gene

p16

INK4A

foram seqüenciadas.

A análise do sequenciamento foi realizado pelo programa

“BioEdit Sequence Alignment

Editor”

demonstrando que os DNAs foram modificados pelo tratamento com bisulfito,

comprovando a eficiência do método. Podemos verificar através da comparação da seqüência

selvagem (S) que todas as citosinas não metiladas foram convertidas em timinas após a

técnica MSP. O resultado do sequenciamento dos pacientes selecionados confirmou a

presença de metilação nesta região do gene p16

INK4A

, sendo este dado verificado quando

comparamos a seqüência não metilada (U) com a seqüência metilada (M), na qual podemos

perceber os sítios de metilação (*) (fig. 16).

S-

M-

* * * * * * *

Fig. 16: Análise do sequenciamento do gene p16

INK4A

(5’→ 3’) através do programa “BioEdit

Sequence Alignment Editor”. (A) Comparação da seqüência da região promotora do gene p16

INK4A

selvagem (S) com a amostra de DNA tratada com bisulfito de um doador - seqüência não metilada (U)

e um paciente com SMD positivo para a metilação (M), mostrando que houve a conversão de todas as

citosinas não metiladas em timinas após a amplificação e os sítios específicos de metilação na

sequência metilada (*); (B) Gráfico mostrando o resultado do sequenciamento do gene p16

INK4A

de um

paciente positivo para metilação.

4.4.4 Freqüência de Metilação na Região Promotora do Gene p16

INK4A

nos Subtipos de

SMD Primária na Infância

A freqüência de metilação no gene p16

INK4A

em nossos pacientes com SMD primária na

infância foi baixa, sendo obervada apenas em 8,8% dos pacientes. No entanto, aqueles que

apresentaram esta alteração estavam classificados dentro dos subtipos mais agressivos da

doença, como AREB e AREB-t, ocorrendo como uma freqüência de 22,2% e 25%,

respectivamente. Não foram observados casos de metilação deste gene em pacientes

classificados com CR e LMMJ (tabela 13). Dos 4 pacientes que apresentaram metilação para

região promotora do gene p16

INK4A

, todos apresentaram evolução da doença (100%) e

(A)

(B)

faleceram. Nossos resultados sugerem que a presença de metilação está associada com

evolução da doença e mau prognóstico.

Tabela 13: Freqüência de Metilação no Gene p16

INK4A

nos Subtipos de SMD Primária na

Infância

Classificação

N° de pacientes N° de pacientes com metilação em

p16

INK4A

CR 26 0

AREB 9 2 (22,2%)

AREB-t 8 2 (25%)

LMMJ 2 0

Total 45 4 (8,8%)

4.5 Correlação entre a Presença de Metilação na Região Promotora dos Genes p15

INK4B

p16

INK4A

com o Padrão Cromossômico em SMD Primária na Infância

Na tabela 14 é possível observar que a metilação no gene p15

INK4B

esteve presente em

todos os subtipos de SMD primária na infância. No subtipo CR foi verificada metilação em

células apresentando cariótipo normal e com as alterações cromossômicas del(6q), -7 e +20,

del(12p) e +mar. Estes pacientes não apresentaram evolução da doença. No subtipo AREB foi

observada metilação nos pacientes com as alterações cromossômicas: del(7q) (2 pacientes),

i(9q) (1 paciente) e del(11)(q23) (2 pacientes). Os pacientes com estas alterações

apresentaram evolução para LMA, exceto o paciente apresentando del(7q) (paciente nº 44,

tabela 14), que foi submetido ao TMO.

No subtipo AREB-t, a metilação na região promotora do gene p15

INK4B

esteve presente

nos pacientes com - 7 (4 pacientes) e t(4;7) (1 paciente). Destes 5 pacientes, 4 apresentaram

evolução para LMA, o paciente (nº 55, tabela 14) apresentando -7 foi submetido ao TMO e

não mostrou evolução da doença.

Foi detectada metilação no gene p15

INK4B

em um dos dois pacientes com LMMJ. Este

paciente apresentava a del(11)(q23) e não apresentou evolução da doença.

A presença de metilação em p15

INK4B

não foi observada nos pacientes apresentando

trissomia do cromossomo 8, hiperdiploidia, t(5;8), no entanto, estes pacientes apresentaram

evolução da doença. Desta forma, provavelmente, existem diferentes vias que levam à

transformação leucêmica.

A metilação na região promotora do gene p16

INK4A

foi observada apenas nos subtipos

mais agressivos AREB e AREB-t, estando presente em pacientes com as alterações

cromossômicas -7 (1 paciente), del(11q) (2 pacientes) e t(5;8) (1 paciente). Todos os quatro

pacientes evoluiram da doença e faleceram.

Apenas os pacientes 17a e 57 mostraram metilação em ambos os genes. O paciente

17a foi inicialmente diagnosticado com CR e cariótipo normal. No entanto, apresentou

evolução da doença para um subtipo mais agressivo AREB, adquirindo alteração cariotípica, a

del(11)(q23). A análise do DNA para presença de metilação após a evolução detectou

positividade para ambos os genes. Já o paciente 57 classificado como AREB-t apresentou

como alteração citogenética a monossomia do 7. A análise molecular revelou a presença de

metilação nos dois genes estudados. Este paciente também apresentou evolução da doença.

Ambos os pacientes foram a óbito.

Tabela 14: Correlação entre a Presença de Metilação nos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

com o

padrão cromossômico em SMD primária da infância

N°

Idade/

Sexo

Subtipo Cariótipo

Metilação

nos genes

p15 p16

Evolução

doença

1 8a /F CR 46,XX,del(9)(p21)[3]/46,XX[19] - - não

2 13a /M

CR 46,XY,del(17)(p12)[9]/46,XY,del(17)(p12),

del(12)(p13)[5]/ 46,XY,del(11)(q23)[3]/46,XY[34]

- - não

4 1a /M

CR 46,XY[32] - - não

5 3a /M CR 46,XY,+der(3)del(3)(q21),-7,-9,+mar[2]/46,XY[27]

- - sim

6 13a /F CR 46,XX,del(5)(q15q35)[15]/46,XX[38] - - não

7 5m /M

CR sem mitose - - não

8 14a /M

CR 46,XY,del(11)(q23)[5]/46,XY[27] - - não

9 7a /F CR 46,XX,del(12)(p13)[10]/46,XX[28] + - não

10 11a /M

CR 46,XY[26] - - não

11 8a /M CR sem mitose - - não

12 15a /F CR 46,XX[22] + - não

13 5a /M CR 46,XY[35] - - não

14 8a /M CR 46,XY[33] - - não

15 7a /M CR 46,XY[20] - - não

16 16a /M

CR 46,XY[41] - - não

17a

2a /F AREB 46,XX,del(11)(q23)[5]/46,XX[18] + + sim

18 7a /M CR 46,XY,-7,+20[13]/46,XY[17] + - não

19 7a /M CR 46,XY,del(12)(p12)[6]/46,XY[37] - - não

20 8a /F CR 46,XX[30] - - não

21 18a/F CR 46,XX,del(6)(q21)[13]/46,XX[25] + - sim

22 7a /M CR 46,XY[32] - - não

23 15a /F CR 46,XX[36] - - não

24 16a /F CR 47,XX,+mar[2]/46,XX[27] + - não

25 7a /F CR 46,XX[30] - - não

26 6a /F CR 46,XX[32] - - não

27 14a /M

CR 46,XY,del(17)(p12)[15]/ 46,XY[28] - - não

29 7a/M CR 46,XY[20] - - não

36 17m /F

AREB 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?,p13),+21c[15]/

47,XX,+21c[6]

- - sim

40 5a /M AREB 47,XY,+8[11]/46,XY[34] - - sim

41 16a /M

AREB 47,XY,+8[30]/46,XY[21] - - sim

42 7a /F AREB 46,XX,i(9)(q10)[15]/46,XX[7] + - sim

43 15a /F AREB 46,XX,del(11)(q23)[14]/46,XX[23] - + sim

44 13a /F AREB 46,XX,del(7)(q22)[10]/46,XX[12] + - não

45 12a /M

AREB 46,XY,del(11)(q23)[12]/46,XY[8] + - sim

47 14a /M

AREB 46,XY,del(7)(q22)[10]/46,XY,del(7)(q22),

del(12)(p12)[3]/46,XY[7]

+ - sim

50 2a/F AREB-t 46,XX,t(4;7)(p16;p15)[16]/46,XX[23] + - sim

53 10a /M

AREB-t 45,XY,-7[24]/46,XY[6] + - sim

54 21m/M

AREB-t 45,XY,-7[14]/46,XY[8] + - sim

55 12a /M

AREB-t 45,XY,-7[18]/46,XY[2] + - não

56 5a /M AREB-t 46,XY,t(5;8)(q32;q22)[23]/46,XY[8] - + sim

57 22m/M

AREB-t 45,XY,-7[14]/46,XY[6] + + sim

58 12a /M

AREB-t 58,XY,+8,+13,+13,+14,+15,+20,+21c,+21,+21,+21,

+22,+22[20]/ 47,XY,+21c[2]

- - sim

59 17a /M

AREB-t 47,XY,+8[22]/46,XY[4] - - sim

60 21m /F

LMMJ 46,XX,inv(5)(q11q21),-9,+mar[2]/46,XX[38] - - não

63 1a /F LMMJ 46,XX,del(11)(q23)[5]/46,XX[24] + - não

A correlação entre a presença de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

p16

INK4A

com o padrão cromossômico em crianças portadoras de SMD primária com pode ser

observada na fig. 17. Nossos resultados sugerem uma forte correlação entre a metilação do

gene supressor de tumor p15

INK4B

e alterações envolvendo o cromossomo 7 (del(7q)/-7). Dos

16 pacientes positivos para a metilação no gene p15

INK4B

, 7 (44%) apresentaram alterações

envolvendo o cromossomo 7 e 3 (19%) apresentaram a del(11)(q23). Com uma menor

freqüência (6,2%), a metilação no gene p15

INK4B

foi observada em pacientes com cariótipo

normal, del(6q), i(9q), del(12p), t(4;7) e +mar. Em relação ao estudo de correlação entre o

cariótipo e a metilação em p16

INK4A

, nossos resultados sugerem que a metilação neste gene é

um evento raro em SMD da infância, entretanto parece estar associado com a transformação

leucêmica.

Fig. 17: Correlação entre o padrão cromossômico em crianças portadoras de SMD primária e presença

de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

e 16

INK4A

. U- não metilado, M- metilado.

10%

15%

20%

25%

30%

Freqüência de casos

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

p15U p15M p16U p16M

5. DISCUSSÃO

A síndrome mielodisplásica primária (SMD) é uma doença clonal de célula tronco

hematopoética, a qual ocorre predominantemente em idosos, sendo rara na infância. Embora

os aspectos clínicos, morfológicos e laboratoriais da SMD durante a infância não estejam

ainda completamente definidos, alguns estudos sugerem distintas características entre a SMD

no adulto e na criança (SASAKI et al., 2001; HASLE et al., 2003). No sentido de entender

melhor os mecanismos envolvidos nesta patogênese diversos estudos têm sido realizados.

Estudos iniciais em SMD na infância, utilizando a classificação FAB, mostraram que

a freqüência de pacientes apresentando o subtipo menos agressivo AR era baixa, ocorrendo

com maior incidência casos de AREB, AREB-t e LMMJ (NOWELL, 1992; LOCATELLI et

al., 1995; MARTINEZ-CLIMENT, 1997). No entanto, estudos mais recentes têm revelado

uma predominância do subtipo AR (KARDOS et al., 2003; POLYCHRONOPOULOU et al.,

2004). Provavelmente estas diferenças aconteceram devido à dificuldade do diagnóstico de

SMD primária na infância, principalmente nos casos com menos de 5% de blastos na medula

óssea, onde na prática clínica em pediatria, temos as anemias carenciais por deficiência de

vitamina B12 e folato, patologias mitocondriais e infecções virais que podem levar a achados

com dispoese de células hematopoéticas. Nestes casos tornam-se importantes diagnósticos

diferenciais para a SMD em pediatria, sendo de extrema importância a análise do mielograma,

biópsia de medula óssea e a análise citogenética. O estudo das alterações cromossômicas

nesse contexto auxilia não só no diagnóstico, mas evidencia aspectos importantes da biologia

da doença que se refletem no prognóstico e na evolução do paciente.

A classificação FAB para SMD primária, muito utilizada em adultos, vem sendo

substituída pela classificação proposta por Hasle et al. em 2003, por este grupo de pacientes

apresentar características particulares, como por exemplo a associação de doenças genéticas,

como a Síndrome de Down. Portanto, já existindo uma pré-disposição para o

desenvolvimento de neoplasias. Em nosso estudo foi utilizada a classificação proposta por

Hasle et al. (2003) em 64 pacientes sendo identificados os seguintes subtipos: 35 casos de CR,

14 casos de AREB, 10 casos de AREB-t e 5 casos de LMMJ, sendo dois pacientes portadores

de Síndrome de Down (1 AREB, 1 AREB-t). As idades dos pacientes variaram de 5 meses a

18 anos.

Existem poucos estudos com um grande número de pacientes com SMD primária na

infância devido a sua raridade. Entretanto, estudos multicêntricos ou de um longo período de

acompanhamento demonstraram que a incidência de alterações cromossômicas é de 40 a 80%.

Estes estudos revelaram uma alta freqüência de anormalidades citogenéticas, principalmente

nos subtipos mais agressivos da doença como AREB e AREB-t (LUNA-FINEMAN et al,

1999; SASAKI et al, 2001; POLYCHRONOPOULOU et al, 2004; LOPES et al, 2006). Em

três pacientes do nosso estudo não foi possível a obtenção de mitoses para o estudo do padrão

cromossômico. Anormalidades cromossômicas foram detectadas em 72% dos 61 casos

estudados. Com relação à distribuição da freqüência de alterações cromossômicas por subtipo

foi verificado que dos 33 pacientes com CR, 18 pacientes (54,5%) apresentaram cariótipos

anormais, nos subtipos mais avançados da doença a freqüência de casos com alterações

cromossômicas foi maior, sendo verificada em 11 (85%) dos 13 pacientes com AREB, em 10

pacientes com AREB-t (100%) e em 5 pacientes com LMMJ (100%). Nossos resultados são

semelhantes aos descritos na literatura, entretanto, tem sido descrita a presença de cariótipos

normais em pacientes portadores de LMMJ, fato não encontrado no presente estudo.

A variação na porcentagem de casos com alterações cromossômicas pode ser creditada

a diversos fatores como variações no número de mitoses analisadas ou amostragem com

tendências para subtipos específicos. Assim, em estudos contendo um maior número de casos

de AREB e AREB-t, o índice de anormalidades cromossômicas é elevado. Em nosso estudo,

procuramos analisar um grande número de metáfases por paciente, uma vez que no subtipo

inicial da SMD na infância, CR, o clone citogeneticamente anormal pode ser muito pequeno,

ao contrário do que acontece nos subtipos mais avançados da doença (AREB, AREB-t e

LMMJ).

Nossos resultados mostraram no subtipo CR a presença de células com cariótipos

normais e células com cariótipos anormais. Dente as células com cariótipos anormais

observamos as seguintes alterações: del(3p), del(5q), del(6q), -7, del(9p), del(11q), del(12p),

del(17p), +mar e cariótipos complexos. Nos subtipos AREB e AREB-t e LMMJ a incidência

de cariótipos normais foi baixa, sendo encontradas diversas anomalias citogenéticas como:

inv(1q), t(5;8), inv(5q), del(6q),-7, del(7q), +8, i(9q), add(9q), del(11q), +16, der(17), -19 e

cariótipos complexos. Ao contrário do que é encontrado em outras neoplasias hematológicas

(leucemias e linfomas), não tem sido possível estabelecer uma correlação entre anomalias

citogenéticas e subtipos de SMD. Dessa forma, assim como em outros estudos (LUNA-

FINEMAN et al., 1999; HARBOTT et al., 2000), nossos resultados sugerem a ausência de

uma alteração específica correlacionada com um subtipo da doença.

Neste estudo as anomalias cromossômicas mais freqüentes foram: as alterações

envolvendo o cromossomo 7 (18%); cariótipos complexos (14%), a del(11)(q23) (11%), e a

del(17)(p12) (9%). Portanto, assim como na SMD do adulto, as alterações cromossômicas em

SMD primária na infância são caracterizadas principalmente por perdas parciais ou totais de

cromossomos, com uma incidência relativamente alta também de ganho cromossômico e

ocorrendo em menor incidência as translocações cromossômicas. O padrão citogenético em

SMD primária sugere a inativação de genes supressores tumorais (ou sua haploinsuficiência)

necessária para o desenvolvimento de células hematopoéticas normais, principalmente as da

linhagem mielóide.

As alterações cromossômicas mais freqüentes em SMD primária na infância são: a

monossomia de 7 e a deleção 7q (AKTAS & TUNCBILEK, 2006). Estas alterações estão

associadas com mau prognóstico e elevado risco de transformação leucêmica. Nestes casos

têm sido sugerido o transplante de medula óssea alogenêico, principalmente em estágios

iniciais da doença (KARDOS et al, 2003). Vale a pena ressaltar, a importância da citogenética

selecionando pacientes com baixa contagem de blastos na medula óssea, para tratamentos

mais agressivos como o TMO. Esse fato aconteceu durante a realização deste estudo em dois

pacientes, um apresentando CR com a alteração cromossômica –7, +20, e o outro

apresentando AREB (com 7% de blastos na medula óssea) com a alteração cromossômica 7q-

Hoje, ambos pacientes estão vivos desempenhando suas funções normais e apresentando uma

boa qualidade de vida. Nossos resultados mostraram que dos 8

pacientes que apresentaram

alterações cromossômicas envolvendo o cromossomo 7, 4 (50%) evoluíram da doença e 6

(75%) foram a óbito.

Cariótipos complexos corresponderam ao segundo tipo de alteração cromossômica de

maior incidência em nosso estudo. Esta alteração esteve associada com todos os subtipos. Um

cariótipo complexo envolve três ou mais alterações cromossômicas, estruturais e/ou

numéricas e está associado com mau prognóstico. A hiperdiploidia é considerada um cariótipo

complexo. A hiperdiploidia I (número cromossômico modal maior que 46) é observada em

várias crianças com diferentes neoplasias como a LLA e sua presença confere um prognóstico

favorável (PUI, 1995). Já hiperdiploidia II (mais de 70 cromossomos), uma marca nos

tumores anaplásicos, em combinação com translocações pode identificar pacientes com alto

risco de apresentarem falha ao tratamento (DOUGLAS et al., 1986). Em nosso estudo

tivemos quatro casos de hiperdiploidia, dois associados com alteração cromossômica

estrutural, a duplicação do braço longo do cromossomo 1. Somente um paciente era do

subtipo inicial da doença CR, os outros três eram portadores de AREB e AREB-t. Poucos

estudos em SMD na infância correlacionaram o valor prognóstico da hiperdiploidia em SMD

na infância. Acar et al. (2001) descreveram uma criança com SMD hipocelular apresentando

hiperdiploidia associada com mau prognóstico, no entanto, esta criança apresentava alterações

congênitas. Portanto, em SMD da infância é necessário que um maior número de pacientes

com hiperdiploidia sejam estudados para definição do seu valor prognóstico.

A deleção do braço longo do cromossomo 11 na região q23 foi a terceira alteração mais

freqüente em nosso estudo. Nesta região cromossômica está mapeado o gene MLL,

frequentemente envolvido em leucemias agudas da infância (LLA e LMA). Geralmente, esse

gene está associado a alterações cromossômicas do tipo translocação, conferindo mau

prognóstico (MATHEW et al., 1999). De acordo com o IPSS alterações envolvendo o

cromossomo 11 são consideradas de prognóstico intermediário, no entanto, nossos resultados

sugerem que esta alteração está envolvida em casos de evolução da SMD (CR para AREB),

sendo necessário o estudo de um maior número de casos que confirmem esse achado.

A deleção do braço curto do cromossomo de 17 também apresentou uma significativa

incidência (10%) na nossa amostra, esta alteração é apontada segundo o IPSS como

prognóstico intermediário. Em nossos pacientes, a del(17p) esteve presente nos subtipos

iniciais CR e em casos com medula óssea hipocelular. Nestes casos vale a pena ressaltar o

valor da citogenética como um diagnóstico diferencial entre SMD hipocelular e anemia

aplástica, onde a presença de uma alteração cromossômica clonal carateriza a SMD. Esse

dado é muito importante, pois ambas as doenças são indicadas para o TMO alogenêico, no

entanto, o condicionamento pré-TMO é específico para cada doença (YOUNG et al., 2006;

DONEY et al., 1997). A nivel morfológico a del(17p) esteve associada com uma dispoese

significativa no setor granulocítio, ocorrendo a presença de células Pelguer-Hüet e assência de

granulações. Essas crianças apresentaram sérias infecções e foram indicadas para o

transplante de medula óssea apresentando uma boa resposta ao tratamento. Na literatura não

existem relatos da del(17p) na SMD na infãncia e seu valor prognóstico.

A trissomia do cromossomo 8 foi observada em 8% do total de casos analisados, esta

alteração cromossômica esteve presente em casos de AREB e AREB-t, estes pacientes

apresentaram evolução para LMA e faleceram. A trissomia do cromossomo 8 é a alteração

numérica mais comum em SMD primária nos adultos e parece ser predominante no sexo

masculino. Não se associa a um subtipo específico, mas geralmente se apresenta com

citopenia de uma ou três linhagens (CHAUFFAILLE, 2006). Pacientes com trissomia de 8

como anomalia isolada têm risco significativamente maior de transformação leucêmica e pior

comportamento do que esperado para o grupo intermediário de prognóstico segundo o IPSS,

fato que lança dúvidas quanto a definição prognóstica. Solé et al. (2000) e Fernandez et al.

(2000) sugerem que alterações envolvendo o cromossomo 8 estão associadas com mau

prognóstico e risco aumentado de transformação leucêmica.

A deleção do braço longo do cromossomo 5 foi observada em apenas um dos nossos

pacientes. Esta alteração cromossômica é extremamente rara em crianças. Uma revisão da

literatura descrita por Pitman et al. (2006) mostraram apenas 7 casos. Em SMD primária nos

adultos a del(5q) apresenta características morfológicas e clínicas específicas sendo

reconhecida como a Síndrome 5q-, entidade adotada pela classificação OMS. A clássica

síndrome 5q- foi descrita pela primeira vez em 1974 por Van den Berghe e colaboradores.

Esta alteração ocorre predominantemente em indivíduos do sexo feminino e idades

avançadas, estando relacionada com bom prognóstico e baixo risco de transformação

leucêmica. Entretanto, os poucos casos descritos na literatura apresentando del(5q) na infância

estiveram associados com mau prognóstico (PITMAN et al., 2006). Em nosso estudo, um

paciente do sexo feminino, de 13 anos de idade apresentou a del(5q) como única alteração

citogenética. Através da análise por FISH foi detectada a perda em um dos alelos do gene

c-fms localizado na região q33q34. Este gene codifica o receptor de crescimento de

macrófago e apresenta uma função importante para a proliferação e diferenciação de células

mielóides (KRYSINSKA et al., 2007). Um grande número de genes codificando fatores de

crescimento e receptores de fatores de crescimento tem sido localizados no braço longo do

cromossomo 5 na região 5q23q33. Isso inclui IL-3, IL-5, IL-9 e GM-CSF. Análises

moleculares detalhadas da anomalia 5q- têm demonstrado inversões submicroscópicas e

duplicações adjacentes nesta região, assim como deleções ou mutações de c-fms (BARTRAM,

1996; CRESCENZI et al., 2004). Dessa forma, é provável que a perda desta região esteja

diretamente envolvida com com desenvolvimento da doença. Devido à presença de citopenias

graves, nossa paciente foi indicada para o TMO alogenêico. Atualmente 15 meses pós TMO,

se encontra com 100% de quimerismo.

Clones citogeneticamente não relacionados (alteração cromossômica biclonal)

correspondem a um achado extremamente raro em doenças hemotólogicas. Em SMD, esta

alteração tem sido descrita com uma freqüência de 4.3-6.5% (HAN et al, 2006). Em nosso

estudo, foi observado um paciente com SMD hipocelular com a alteração cromossômica

biclonal, envolvendo os cromossomos 17 e 11. A freqüência da alteração citogenética biclonal

foi de 1,6%. Ainda não é claro, se clones citogeneticamente não relacionados indicam uma

verdadeira biclonalidade da doença hematológica ou se é um resultado de uma evolução

clonal de um precursor em comum. Nós acreditamos na hipótese de que clones não

relacionados cariotipicamente se originam de um clone maligno comum através de mudanças

moleculares submicroscópicas e processos de evolução. O clone com del(17p) adquiriu uma

segunda alteração del(12p) sugerindo evolução da doença. Neste caso, a análise por FISH

detectou a ausência dos alelos dos genes p53 e MLL, confirmado a deleção do braço curto do

cromossomo 17 e a deleção do braço longo do cromossomo 11, respectivamente. O clone

contendo a del(11q) estava presente em pequeno número, sendo visto em apenas 3 das 51

células analisadas, dessa forma a técnica de FISH foi fundamental para a confirmação desta

alteração. As alterações mais freqüentes descritas envolvendo clones não relacionados foram:

del(5q), +8, del(20q), del(7q),+11, +21 e –22 (HAN et al, 2006). De acordo com uma revisão

da literatura, este representa o primeiro caso de SMD pediátrica mostrando o envolvimento

destas alterações cromossômicas em SMD hipocelular- CR.

As alterações cromossômicas associadas à SMD são, na imensa maioria das vezes,

detectadas pela citogenética clássica, mas há casos, em particular aqueles em que ocorre

ausência de metáfases ou com clones pequenos, nos quais a anormalidade cromossômica não

é identificada pela técnica de bandeamento G, mas diagnosticada por FISH. Já foi

demonstrado que clones pequenos são mais bem detectados por citogenética molecular

(FISH) (CHAUFFAILLE et al., 2006). Além disso, a análise por FISH auxilia na confirmação

de alterações cromossômicas e estabelecimento de pontos de quebra. Pela técnica de FISH um

grande número de células podem ser examinadas e alterações cromossômicas específicas

podem ser detectadas, tanto em interfase quanto em metáfases. No entanto, esta técnica

apresenta algumas limitações, uma dessas limitações envolve a incapacidade de detecção de

anormalidades envolvendo regiões que não estejam na região da sonda (PANANI &

ROUSSOS, 2005). Estudos estabelecendo vantagens e desvantagens da análise cariotípica

clássica e FISH, sugerem que a combinação das duas metologias pode levar a um diagnóstico

mais acurado (ROMEO et al, 2002) .

Aplicamos a metodologia da citogenética molecular-FISH para afastar alterações

cromossômicas de mau prognóstico, nos casos sem mitose ou quando o índice mitótico foi

muito baixo, e para confirmação de alterações cromossômicas previamente identificadas pela

citogenética clássica.

Devido à importância da citogenética esta foi incorporada em escalas prognósticas. O

Sistema Internacional de Escala Prognostica (IPSS) utiliza como variáveis prognósticas a

porcentagem de blastos na medula óssea, as alterações citogenéticas e o número de citopenias

para separar os pacientes em quatro grupos de risco. O IPSS tem mostrado grande valor

prognóstico para adultos com SMD. No entanto, alguns estudos sugerem que os fatores

prognósticos que predizem a sobrevida ou progressão em adultos são de pouco valor para

crianças (HASLE et al, 2004). Nós verificamos que dos 61 pacientes 33 (54%), foram

classificados como intermediário 1, 12 (19,6%) intermediário 2 e 16 (26%) alto risco. Em um

estudo japonês com crianças com SMD, a sobrevida diferiu entre os grupos de risco

citogenético adotado pelo IPSS (SASAKI et al, 2001). Estudos encontraram uma tendência

para uma sobrevida maior no grupo citogenético de risco intermediário (HASLE et al, 2004;

PASSMORE et al., 2003). Nossos dados revelaram que pacientes classificados como

intermediário 1, tiveram uma menor taxa de óbito. Não foram identificados pacientes de baixo

risco. Este fato aconteceu devido a todos os nossos pacientes com CR apresentarem 2

citopenias (anemia e neutroponia; anemia e trombocitopenia; neutropenia e trombocitopenia),

recebendo pontuação 0,5. Esta escala revelou que pacientes de alto risco apresentaram uma

alta probabilidade de transformação leucêmica e alta taxa de óbito. Mesmo quando protocolos

mais agressivos de tratamento foram utilizados, como TMO alogenêico, a resposta foi muito

baixa.

Várias estratégias terapêuticas vêm sendo utilizadas no tratamento para SMD da

infância e LMMJ. Um estudo brasileiro revisando os tipos de tratamentos aplicados em

crianças com SMD, verificou que as modalidades de tratamentos são muito heterogêneas não

havendo um grupo cooperativo com protocolo específico (VALERA et al, 2004). Devido a

SMD ser uma doença de célula tronco imatura, é considerada uma doença incurável quando

terapias convencionais são utilizadas. Atualmente o TMO permanece como a única opção

curativa para este grupo de pacientes, no entanto, para aquelas crianças que o TMO não é

possível, outras modalidades terapêuticas como quimioterapia, fatores de crescimento e

diversos outros agentes terapêuticos, são utilizados objetivando diminuir o número de

citopenias.

Nosso estudo mostrou que a melhor opção de tratamento para crianças com SMD

primária foi o TMO alogenêico. Entretanto, alguns pacientes apresentaram doença enxerto

versus hospedeiro, comprometendo a qualidade de vida dessas crianças. Apesar do TMO

alogênico ser o único tratamento atual que proporciona a cura, ele apresenta uma série de

complicações. Dentre essas complicações podemos citar aquelas relacionadas com a

recuperação da função medular, como um longo período de aplasia e o mais grave, a doença

enxerto versus hospedeiro, que dependendo do grau de severidade pode levar à morte.

Dessa forma é de extrema importância o conhecimento da biologia da SMD primária,

na tentativa de elaborar novas formas de tratamento. Neste sentido, a identificação de

alterações no padrão de metilação em genes supressores de tumor em SMD em adultos tornou

possível o desenvolvimento e a utilização de protocolos de tratamento que utilizam agentes

desmetilantes.

Alguns grupos já demonstraram a freqüência e a importância da hipermetilação na

região promotora de alguns genes como p15

INK4B

e p16

INK4A

, que estão envolvidos no controle

do ciclo celular, e no gene CALCA (calcitonina) que está envolvido com a regulação dos

níveis de cálcio no sangue em pacientes adultos com SMD. A freqüência de metilação do

gene p15

INK4B

em adultos com SMD ou leucemia aguda (LA) variou de 38% a 69% (UCHIDA

et al., 1997; QUESNEL et al, 1998; HOFMANN et al, 2006), podendo ser verificada no

diagnóstico ou durante a progressão da doença (TIEN et al, 2001).

Entretanto, apenas dois estudos mostraram a presença de metilação em SMD primária

na infância (HASEGAWA et al, 2005; VIDAL et al, 2006). Isso nos levou a investigar a

presença de metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

em 45 crianças com

SMD primária da infância, incluindo 25 do subtipo AR, 11 AREB, 7 AREB-t e 2 LMMJ pelo

método MSP. Metilação em pelo menos um destes genes foi verificada em 40% (18/45) dos

pacientes.

A freqüência de metilação no gene p15

INK4B

nos nossos pacientes com SMD da

infância foi de 35,5% (16/45). Hasegawa et al. (2005), em um estudo similar, apresentou uma

freqüência superior de metilação neste gene (78%), esta diferença pode estar relacionada ao

fato da maioria dos seus pacientes terem sido classificados dentro dos subtipos mais

agressivos AREB e LMMC ou em um subtipo duvidoso entre SMD e LMA-M6, o qual ele

denominou de AREB/M6. Outro estudo demonstrou uma freqüência de metilação em p15

INK4B

de 50%, sendo também todos os pacientes classificados dentro dos subtipos AREB e AREB-t

(VIDAL et al, 2006). Em nosso estudo as maiores freqüências de metilação para o gene

p15

INK4B

estiveram presentes nos subtipos mais agressivos de SMD como AREB, AREB-t e

LMMJ, com as freqüências de 54,5% e 71,5% e 50% respectivamente. No subtipo menos

agressivo da doença como CR, a freqüência de metilação foi mais baixa sendo observada em

16% dos pacientes. Hasegawa et al., em uma população de 18 pacientes classificados com

LMMJ detectou metilação em apenas 17% dos casos.

A metilação de vários genes tem sido associada a um pior prognóstico em pacientes com

leucemia aguda (LA), como por exemplo, o gene da calcitonina em LLA (GARCIA-

MANERO et al., 2002) e o gene MDR1 em LMA (GUARCIA-MANERO, 2003). No entanto,

metilação no gene ER foi associada com um bom prognóstico em pacientes com LMA

(TOYOTA et al., 2001). Em adultos com SMD, a metilação do gene p15

INK4B

esteve

associada com estágio agressivo da doença (AREB e AREB-t), sugerindo exercer um papel na

progressão e evolução para LMA (UCHIDA et al., 1997; QUESNEL et al., 1998). Em SMD

pediátrica tem sido verificada uma alta freqüência de metilação do gene p15

INK4B

, no entanto,

estes estudos não indicam se esta alteração está associada a bom ou mau prognóstico

(HASEGAWA et al., 2005). Dos 45 pacientes estudados para o padrão de metilação 17

mostraram evolução da doença e 9 (53%) desses pacientes tiveram metilação em p15

INK4B

. Os

nossos dados mostraram que metilação do gene p15

INK4B

provavelmente está envolvida no

processo de evolução da doença em direção à LMA, sugerindo que a proliferação de células

leucêmicas pode requerer um escape da regulação da fase G1 do ciclo celular.

A proteína codificada pelo gene p16

INK4A

age também como um regulador negativo do

ciclo celular, inibindo a ação das proteínas CDK4/6. Além disso, está associada ao processo

de diferenciação celular e manutenção da homeostase durante a diferenciação da linhagens

eritróides (MINAMI et al, 2003). Estudos têm demonstrado silenciamento deste gene por

metilação em tumores sólidos, como carcinoma hepatocelular (FUKAI et al, 2005). No

entanto, em malignidades hematológicas a freqüência de metilação neste gene é baixa ou nula

(TOYOTA et al., 2001; GARCIA-MANERO et al., 2002; HASEGAWA et al., 2005;

HOFMANN et al., 2006). Vidal et al. (2006) analisando o padrão de metilação de vários

genes em SMD da infância, não detectou metilação no gene p16 em nenhum dos pacientes

analisados. O mesmo resultado foi obtido por Hasegawa et al. (2005). Dos nossos 45

pacientes, apenas 4 (8,8%) apresentaram metilação neste gene. Todos os pacientes positivos

para metilação no gene p16

INK4A

estavam classificados dentro dos subtipos mais agressivos

AREB e AREB-t. Dessa forma, concordando com os dados da literatura, nossos resultados

mostraram uma baixa freqüência de metilação no gene p16

INK4A

, sugerindo que provavelmente

este não seja o principal evento envolvido na patogênese da SMD, tanto em adultos quanto

em crianças.

Metilação aberrante em ambos os genes foi vista em apenas 2 (4,4%) dos 45 pacientes

analisados. Embora o número de pacientes seja pequeno, a metilação em ambos os genes

p15

INK4B

e p16

INK4A

revelou ser um pior prognóstico para pacientes com SMD da infância,

visto que os pacientes evoluíram da doença e foram a óbito.

Em nosso trabalho estudamos a correlação entre a presença de uma alteração

cromossômica específica com a metilação na região promotora dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

Nossos resultados sugerem um forte associação envolvendo alterações no cromossomo 7

(-7/del7q) e metilação do gene p15

INK4B

, levando à evolução da doença. Além disso,

observamos associação entre a del(11)(q23) e alteração no padrão de metilação nos genes

p15

INK4B

e p16

INK4A

, relacionados também com a evolução da doença. Não foi encontrada

correlação entre alterações citogenéticas e presença de metilação em vários genes em

pacientes adultos e crianças com malignidades hematológicas primárias (LLA, LMA e SMD)

(GARCIA-MANERO et al., 2002). No entanto, Au et al.(2003) verificaram uma forte

correlação entre metilação do gene p15

INK4B

e alterações cromossômicas envolvendo o

cromossomo 7 (-7/7q-) em pacientes adultos com SMD secundária. Dos nossos 16 pacientes

positivos para a metilação no gene p15

INK4B

, 7 (44%) possuíam alterações envolvendo o

cromossomo 7, sugerindo que a metilação pode ser uma outra característica que confere a este

grupo de pacientes um pior prognóstico. No entanto, um estudo com maior número de

pacientes, é necessário para confirmar o nosso achado.

Embora algumas das alterações citogenéticas estejam associadas a um pior

prognóstico, as alterações moleculares envolvidas na iniciação e evolução desta doença

permanecem desconhecidas. Alguns estudos levantam a seguinte questão: se alterações

cromossômicas detectadas em SMD primária são eventos iniciais que levam ao

desenvolvimento da doença (causa) ou se são apenas fenômenos secundários (conseqüencia)

(CHAUFFAILLE, 2006). De acordo com a teoria de multíplas etapas, nossos resultados

sugerem que as alterações cromossômicas são eventos intermediários, desencadeando uma

grande instabilidade genética. A aquisição de alteração no padrão de metilação da região

promotora dos genes p15

INK4B

e p16

INK4A

seria um evento mais tardio, associado com a

transformação leucêmica. Seguindo este modelo uma provável via de evolução em SMD

primária na infância seria a associação -7/del(7q) e metilação em p15

INK4B

Nossos resultados apresentam implicações potenciais para a classificação e prognóstico

da SMD primária na infância. A detecção de metilação anormal em genes de pacientes com

SMD da infância pode ter um grande potencial como um fator prognóstico, podendo também

ser utilizado na identificação de pacientes que podem ser beneficiados pelo tratamento com

inibidores da metilação.

6. CONCLUSÕES

 A SMD primária na infância apresenta uma alta freqüência de alterações cromossômicas

(72%);

 O estudo citogenético mostrou que o padrão cariotípico da SMD primária na infância é

caracterizado principalmente por perdas parciais ou completas de cromossomos (deleções e

monossomias) e ganhos cromossômicos (trissomias);

 As translocações cromossômicas são encontradas com uma menor freqüência;

 A análise citogenética mostrou ser essencial no processo de diagnóstico de todos os casos

de suspeita de SMD pediátrica e foi uma importante ferramenta para a escolha do tratamento;

 As anomalias cromossômicas de maior freqüência neste estudo foram as alterações

envolvendo o cromossomo 7 (-7/ 7q-), cariótipos complexos, del(11)(q23) e del(17)(p12);

 A metilação da região promotora do gene p15

INK4B

é um evento frequente em subtipos

mais avançados da SMD primária na infância e está associada com a transformação

leucêmica.

 A metilação na região promotora do gene p16

INK4A

é um evento raro em SMD primária

na infância, estando possivelmente associada com a evolução da doença;

 A correlação entre o padrão de metilação em p15

INK4B

e p16

INK4A

e alterações

cromossômicas específicas mostrou uma forte associação entre -7/7q- e metilação em

p15

INK4B

, sugerindo uma provável via de evolução da doença;

 As alterações cromossômicas, -7/7q-; +8 e del(11)(q23), e a presença de metilação em

p15

INK4B

e p16

INK4A

estão associadas com mau prognóstico, sendo prováveis marcadores

biológicos de evolução da doença.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Acar H, Çaliskan U, Kaynak M, Yildirim, Selman M., Largaespada David A. Hyperdiploid

Karyotype in a childhood MDS patient. Clin. Lab. Haematol. 2001; 23: 255-258.

Adamson DJ, Dawson AA, Bennett B, King DJ, Haites NE. p53 mutation in the

myelodysplastic syndromes. Br. J. Haematol. 1995; 89: 6661-66.

Aggerholm A, Holm MS, Guldberg P, Olesen LH, Hokland P. Promoter hypermethylation of

p15

INK4B

, HIC1, CDH1, and ER is frequent in myelodysplastic syndrome and predicts poor

prognosis in early-stage patients. Eur. J. Haematol. 2006; 76: 23-32.

Aktas D & Tuncbilek E. Myelodysplastic syndrom associated with monosomy 7 in childhood:

a retrospective study. Cancer Genet. Cytogenet. 2006; 171: 72-75.

Arico M, Biondi A, Pui CH. Juvenile myelomonocytic leukemia. Blood.1997; 90: 479-488.

Atallah E, Kantarjian H, Garcia-Manero G. The role of decitabine in the treatment of

myelodysplastic syndromes. Exp. O. Pharmac. 2007; 8:65-73.

Au WY, Fung A, Man C, Ma SK, Wan TS, Liang R, Kwong YL. Aberrant p15 gene promoter

methylation in therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloide leukaemia:

clinicophatological and karyotypic associations. Br. J. Haematol. 2003; 120: 1062-1065.

Aul C, Bowen DT, Yoshida Y. Pathogenesis, etiology and epidemiology of myelodysplastic

syndromes. Haematologica, 1998; 83: 71-86.

Ballen KK, Haley NR, Kurtzberg J, Lane TA, Lindgren BR, Miller JP, Newman B,

McCullough. Outcomes of 122 diverse adult and pediatric cord blood transplant recipients

from a large cord blood bank. Transfusion. 2006; 46: 2063-2070.

Bartram CR. Molecular genetic aspect of myelodysplastic syndromes. Semin Hematol. 1996;

33: 139-149.

Bennett JM, Catovsky, D, Daniel, MT, Flandrin, G, Galton, DA, Gralnick, HR, Sultan, C.

Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes. Br J Haematol 1982; 51:

189-199.

Bennett JM. A comparative review of classification systems in myelodysplastic syndromes

(MDS). Semin Oncol. 2005; 32: S3-10

Beverly JL, Kobrinsky N, Barnard DR, Arthur DC, Buckley JD, Howells WB, Gold S,

Sanders J, Neudorf S, Smith FO, Woods WG. Distinctive Demography, Biology, and

Outcome of Acute Myeloid Leukemia and Myelodysplastic Syndrome in children with Down

Syndrome: children’s cancer group studies 2861 and 2891. Blood. 1998; 2: 608-615

Borgonovo T, Ribeiro EMSF, Cornélio DA, Schimid-Braz AT, Jamur VR, Wuicik L, Veiga

LBA, Ehmke NAM, Pasquini R, Cavalli IJ. Cytogenetic study of Brazilian patients with

myelodysplastic syndrome (MDS). Genetics and Molecular Biology. 2005; 28:654-660.

Boudard D, Vasselon C, Bertheas MF, Jaubert J, Mounier C, Reynaud J, Viallet A, Chautard

S, Guyotat D, Campos L. Expression and prognostic significance of Bcl-2 family proteins in

myelodysplastic syndromes. Am J Hematol, 2002; 70: 115-25.

Brandwein JM, Horsman DE, Eaves AC, Eaves CJ, Massing BG, Wadsworth LD, Rogers PC,

Kalousek DK. Childhood myelodysplasia: suggested classification as myelodysplastic

syndrome based on laboratory and clinical findings. Am J Pediatr Oncol. 1990; 12: 63-70.

Brunstein CG, Baker KS, Wagner JE. Umbilical cord blood transplatation for myeloid

malignancies. Curr Opin Hematol. 2007; 14: 162-9.

Campbell LJ & Garson OM. The prognostic significance of deletion of the long arm of

chromosome 20 in myeloid disorders. Leukemia. 1994; 8:67-71.

Chan GC, Wang WC, Raimondi SC, Behm FG, Krance RA, Chen G, Freiberg A, Ingram L,

Butler D, Head DR. Myelodysplastic syndrome in children: differentiation from acute

myeloid leukemia with a low blast count. Leukemia. 1997; 11: 206-211.

Chang F, Syrjanen CS, Tervahauta A, Syrjanen K. Tumorigenesis associated with the p53

tumor suppressor gene. Br. J. Cancer. 1993; 68:653-661.

Chauffaille, MLLF. Alterações moleculares em síndrome mielodisplásica. Rev. Bras.

Hematol. Hemoter. 2006; 28: 188-193

Crescenzi B, La Starza R, Romoli S, Beacci D, Matteucci C, Barba G, Aventi A, Marynen P,

Ciolli S, Nozzoli C, Martelli MF, Mecucci C. Submicroscopic deletions in 5q- associated

malignancies. Haematologica. 2004; 89: 281-285.

Delforge M. Understanding the pathogenesis of myelodysplastic syndromes. The Hematol. J.,

2003; 4: 303-309.

Douglas EC, Look AT, Webber B, Parham D, Wilimas JA, Green AA, Roberson PK.

Hyperdiploidy and chromosomal rearrangements define the aplastic variant of Wilm’s tumor.

J Clin Oncol. 1986; 4: 975-981.

Doney K, Leisenring W, Storb R, Appelbaum FR. Primary treatment of acquired aplastic

anemia: Outcomes with bone marrow transplantation and immunosuppressive therapy. Annals

Internal. Med. 1997; 126: 107-115.

Emanuel PD. Myelodysplastic and myeloproliferative disorders in childhood: an update. Br. J.

Haematol. 1999; 105: 852-863.

Espigado I, Marín-Niebla A, Pérez-Hurtado JM, Ríos E, Carmona, Plaza E, Vaquero A,

Campo T, Soto IP, Martino ML, Parody R, Rodríguez-Fernandez JM. Hemopoietic Stem Cell

transplantation in Childhood: Reduction in Mortality and Improvement of Survival Over the

Years. Transpl. Proceed. 2005; 37:1555-1556.

Evans JP, Czepulkowski B, Gibbons B, Swansburry GJ, Chessells JM. Childhood monosomy

7 revisited. Br J Haematol. 1988; 69: 41-45.

Fernandez TS, Menezes, dS, Macedo Silva, ML, Tabak, D, Abdelhay, E. Correlation of N-ras

point mutations with specific chromosomal abnormalities in primary myelodysplastic

syndrome. Leuk Res 1998; 22: 125-134.

Fernandez TS, Abdelhay E, de Souza FT, Ornellas MH, Otero L, Tabak D. Chromosomal

alterations associated with evolution from myelodysplastic syndrome to acute myeloid

leukemia. Leuk. Res. 2000; 24: 839-848.

Fernandez TS, Ornellas MH, Tavares RC, Otero L, Diamond HR, Bouzas LF, Tabak D,

Abdelhay. Hyperdiploid karyotype in a child with hypocelular primary myelodysplastic

syndrome. Europ. J. Haematol. 2003; 71: 399-401.

Freinberg AP, Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes gene of some human cancers

from their normal counterparts. Nature, 1983; 301:89-92.

Fukai K, Yokosuka O, Imazeki F, Tada M, Mikata R, Miyazaki M, Ochiai T, Saisho H.

Methylation status of p14

ARF

, p15

INK4B

and p16

INK4A

genes in human hepatocellular carcinoma.

Liver Internat. 2005; 25:1209-1216.

Galm O, Herman JG, Baylin SB. The fundamental role of epigenetics in hematopoietic

malignancies. Blood Reviews. 2006; 20: 1-13.

Garandeau C, Pautas, E, Andreux, M, Andreux, J, Gaussem, P, Siguret, V. Myelodysplastic

syndromes. Ann. Biol. Clin. 2000; 58: 405-416.

Garcia-Manero G, Ramos-Bueso C, Daniel J, Williamson J, Kantarjian HM, Issa J J-P. DNA

methylation patterns at relapse in adult acute lymphocytic leukemia. Clin. Cancer Res. 2002;

8: 1897-1903.

Garcia-Manero G. Methylation, aging, and pediatric acute lymphocytic leukemia.

Leukemia. 2003; 17: 2063-4

Giles FJ, Stopeck, AT, Silverman, LR, Lancet, JE, Cooper, MA, Hannah, AL, Cherrington,

JM, O'Farrell, AM, Yuen, HA, Louie, SG, Hong, W, Cortes, JE, Verstovsek, S, Albitar, M,

O'Brien, SM, Kantarjian, HM, Karp, JE. SU5416, a small molecule tyrosine kinase receptor

inhibitor, has biologic activity in patients with refractory acute myeloid leukemia or

myelodysplastic syndromes. Blood. 2003; 102: 795-801.

Giralt S. Bone marrow transplant in myelodysplastic syndromes: new technologies, same

questions. Curr Hematol Rep. 2005; 4: 200-207.

Greenberg P, Cox, C, LeBeau, MM, Fenaux, P, Morel, P, Sanz, G, Sanz, M, Vallespi, T,

Hamblin, T, Oscier, D, Ohyashiki, K, Toyama, K, Aul, C, Mufti, G, Bennett, J. International

scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood. 1997; 89:

2079-2088.

Gyger M, Bonny Y, Forest L. Childhood monosomy 7 syndrome. Am J Hematol. 1982; 13:

329-334

Han JY, Theil KS, Hoeltge G. Frequencies and characterization of cytogenetically unrelated

clones in various hematologic malignancies: seven years of experiences in a single institution.

Cancer Genet. Cytogenet. 2006; 164: 128-132.

Harbott J, Haas OA, Kerndrup G, Michalová K, Sainati L, Slater R, Biondi A, Fenu S, Hasle

H, Kühne T, Mann G, Stary J, Van Wering ER, Baumann I, Nöllke P, Rogge T, Zimmermann

M, Niemeyer C. Cytogenetic evaluation of children with MDS and JMML. Results of the

European working group of childhood MDS (EWOG-MDS). Leukemia. 2000; 14-961.

Harris NL, Jaffe, ES, Diebold, J, Flandrin, G, Muller-Hermelink, HK, Vardiman, J, Lister,

TA, Bloomfield, CD. The World Health Organization classification of hematological

malignancies report of the Clinical Advisory Committee Meeting, Airlie House, Virginia,

November 1997. Mod Pathol. 2000; 13: 193-207.

Hasegawa Dmanabe A, Kubota T, Kawasaki H, Hirose I, Ohtsuka Y, Tsuruta T, Ebihara Y,

Goto Y, Zhao XY, Sakashita K, Koike K, Isomura M, Kojima S, Hoshika A, Tsuji K,

Nakahata T. Methylation status of the p15 and p16 genes in paedriatric myelodysplastic

syndrome and juvenile myelomonocytic leukaemia. Br. J. Haematol. 2005; 128: 805-812.

Hasle, Arico M, Basso G, Biondi A, Rajnoldi AC, Creutzig U, Fenu S, Fonotsch C, Haas OA,

Harbott J, Kardos G, Kerndrup G, Mann G, Niemeyer CM et al. Myelodysplastic syndrome,

Juvenile myelomonocytic leukemia, and acute myeloid leukemia associated with complete or

partial monosomy 7. Leukemia. 1999; 13: 376-385.

Hasle H and Niemeyer. Myelodysplastic syndrome and juvenile myelomonocytic leukemia in

children. 2002.

Hasle, H., Niemeyer, C. M., Chessels, j.m., Baumann, I., Bennett J.M, Kerndrup, G., Head,

D.R. A pediatric approach to the WHO classification of myelodysplastic and

myeloproliferative diseases. Leukemia. 2003; 17:277-282.

Hasle H., Baumann I., Bergsträsser E., Fenu S., Fischer ª, Kardos G., Kerndrup G., Locatelli

F., Rogge T., Schultz K.R., Stary J., Trebo M., Heuvel-Eibrink M.M.V.D., Harbott J., Nöllke

P., Niemeyer C.M. The international prognostic scoring sytem (IPSS) for childhoold

myelodysplastic syndrome (MDS) and juvenile myelomonocytic leukemia (JMML).

Leukemia. 2004; 18: 2008-2014.

Head DR. Proposed changes in the definitions of acute myeloid leukemia and myelodysplastic

syndrome: are they helpful? Curr Opin Oncol. 2002; 14: 19-23.

Hellström-Lindberg E., Willman C., Barrett A.J., Saunthararajah Y. Achievements in

understanding and treatment of myelodysplastic syndromes. Hematology. 2000; 110-132.

Herman J, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: A novel

PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. Medical Sciences.

1996; 93: 9821-9826.

Hutter JJJr, Hecht F, Kaiser-McCawB, Hays T, Barank P, Cohin J, Rurie B. Bone marrow

monosomy 7: hematologic and clinical manifestations in childhood and adolescense.

Hematol. Oncol. 1984; 2: 2-12

Hofmann W-K, Takeuchi S, Takeuchi N, Thiel E, Hoelzer D, Koeffler HP. Comparative

analysis of hypermethylation of cell cycle control and DNA-mismatch repair genes in low-

density and CD34+ bone marrow cells from patients with myelodysplastic syndrome. Leuk.

Res. 2006; 30: 1347-1353.

Hungerford DA. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation

of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl. Stain Technol 1965; 40: 333-

338.

Ibrahim S, Estey EH, Pierce S, Glassman A, Keating M, O´Brien S, Kantarjian HM, Albitar

M. 11q23 abnormalities in patients with acute myelodysplastic syndrome as detected by

molecular and cytogenetic analyses. Am J Clin. Pathol. 2000; 114:793-7.

ISCN. An International System for Human Cytogenetic Nomeclature. Mitelman F, ed. Basel:

S Karger, 1995.

Janssen JW, Buschle, M, Layton, M, Drexler, HG, Lyons, J, van den, BH, Heimpel, H,

Kubanek, B, Kleihauer, E, Mufti, GJ, . Clonal analysis of myelodysplastic syndromes:

evidence of multipotent stem cell origin. Blood 1989; 73: 248-254.

Jekic B, Novakovic I, Lukovic L, Kuzmanovic M, Popovic B, Pastar I, Milasin J, Bunjevacki

G, Bunjevacki V. Low frequency of N-ras and K-ras gene mutation in childhood

myelodysplastic syndromes. Cancer Genet. Cytogenet. 2004; 154: 180-182.

Jekic B, Novakovic I, Lukovic L, Kuzmanovic M, Popovic B, Milasin J, Bunjevacki G,

Damnjanovic T, Cvjeticanin S, Bunjevacki V. Lack of Tp53 and FMS gene mutations in

children with myelodysplastic syndrome. Cancer Genet. Cytogenet. 2006; 166: 163-165.

Kardos G, Baumann I, Passmore J., Locatelli F., Hasle H., Schultz K.R., Stary J., Schmitt-

Graeff A., Fischer A., Harbott J., Chessells J.M., Hann I., Fenu S., Rajnoldi A.C., Kerndrup

G., Wering E.V.W, Rogge T., Nölke P., Niemeyer C.M. Refratory anemia in childhoold: a

retrospective analysis of 67 patients with particular reference to monosomy 7. Blood. 2003;

102: 1997-2003.

Kikukawa M, Aoki N, Sakamoto Y, Mori M. Study of p53 in elderly patients with

myelodysplastic syndromes by immunohistochemistry and DNA analisys. A. J. Pathol. 1999;

155: 717-21.

Krysinska H, Hoogenkamp M, Ingram R, Wilson N, Tagoh H, Laslo P, Singh H, Bonifer C. A

two-step, PU.1-dependent mechanism for developmentally regulated chromatin remodeling

and transcription of the c-fms gene. Mol Cell Biol. 2007; 27: 878-887.

Kurzrock R, Albitar, M, Cortes, JE, Estey, EH, Faderl, SH, Garcia-Manero, G, Thomas, DA,

Giles, FJ, Ryback, ME, Thibault, A, De Porre, P, Kantarjian, HM. Phase II study of R115777,

a farnesyl transferase inhibitor, in myelodysplastic syndrome. J Clin Oncol. 2004; 22: 1287-

1292.

Lai J-L, Preudhomme C, Zandecki M, Flactif M, Varumbeke M, Lepelley P. Myelodysplastic

syndromes and acute myeloid leukemia with 17p deletion. An entity characterized by specific

dysgranulopoiesis and high incidence of p53 mutations. Leukemia. 1995: 370-381.

Laird PW and Jaenisch R. The role of DNA methylation in cancer genetic and epigenetics.

Annu Rev Genet. 1996; 30:441-64.

Lees E. Cyclin dependent kinase regulation. Curr. Opin. Cell. Biol. 1995; 7: 773-780.

Lehmann U, Brakensiek K, Kreipe H. Role of epigenetic change in hematological

malignancies. Ann Hematol. 2004: 83: 137-152.

List AF, Vardiman J, Issa J-PJ, Dewitte TM. Myelodysplastic syndromes. American Society

of Hematology. 2004: 297-316.

Liu YC, Ito Y, Hsiao HH, Sashida G, Kodama A, Ohyashiki JH, Ohyshiki K. Risk factor

analysis in myelodysplastic syndrome patients with del(20q): prognosis revisited. Cancer

Genet. Cytogenet. 2006; 171: 9-16

Locatelli F, Zecca M, Pession A, Maserati E, De Stefano P, Severi F. Myelodysplastic

Syndromes: the pediatric point view. Haematologica. 1995; 80: 268-279.

Look AT. Molecular Pathogenesis of MDS. Amer. Society Hematol. 2005; 156-160

Lopes LF, Lorand-Metze I, Mendes WL, Seber A, Melo LN. Síndrome mielodisplásica na

infância. Rev. Brasil. Hematol. Hemoterap. 2006; 28: 226-237.

Lorand-Metze I. Síndromes Mielodisplásicas. Conceito e Classificação. Diagnóstico.

Evolução e Complicações. In: Hematologia: Fundamentos e Práticas. Editora Atheneu. Zago

MA, 2005; 519-536.

Luna-Fineman S, Shanno KM, Atwater SK, Davis J, Masterson M, Ortega J, Sanders J,

Steinherz P, Weinberg V, Lange BJ. Myelodysplastic and myeloproliferative disorders of

childhood: a study of 167 patients. Blood.1999; 93: 459-466.

Martinez-Climent JA. Molecular Cytogenetics of Childhoold hematolological malignancies.

Leukemia. 1997; 11:1999-2021

Mathew S, Behm FG, Dalton J, Raimondi SC. Comparison of cytogenetics, southern blotting,

and fluorescence in situ hybridization as methods for detecting MLL gene rearrangements in

children with acute leukemia and with 11q23 abnormalities. Leukemia. 1999;13: 1713-1720.

Mhawech P& Saleem A. Myelodysplastic syndrome: review of the cytogenetic and molecular

data. Clin. Rev. Oncology/Hematol. 2001; 40:229-238.

Minami R, Muta K, Umemura T, Motomura S, Abe Y, Nishimura J, Nawata H. p16

INK4A

induces differentiation and apoptosis in erythroid linage cells. Exp Hematol. 2003; 31: 355-

362.

Mori N, Morosetti R, Hoflehner E, Lubbert M, Mizogichi H, Koeffler HP. Allelic Loss in the

progression of myelodysplastic syndrome. Cancer Res. 2000; 60: 3039-42.

Mundschau G, Gurbuxani S, Gamis AS, Greene ME, Arceci RJ, Crispino JD. Mutagenesis of

GATA 1 is an initiating event in Down syndrome leukemogenesis. Blood. 2003; 101: 4298-

300.

Musto P. Thalidomide therapy for myelodysplastic syndromes: current status and future

perspectives. Leuk Res. 2004; 28: 325-332.

Mufti GJ. Pathobiology, classification, and diagnosis of myelodysplastic syndrome. Best

Practice & Research Clinical Haematology. 2004; 17: 543-557.

Nakamaki T, Bartram C, Seriu T, Kahan J, Fukuchi K, Tsuruoka N, et al. Molecular analysis

of the cyclin-dependent kinase inhibitor genes, p15, p16, p18 and p19 in the myelodysplastic

syndromes. Lek Res. 1997; 21: 235-240.

Niemeyer CM, Aricò M, Basso G, Cantù Rajnoldi A, Creutzig U, Haas OA, Harbott J, Hasle

H, Kerndrup G, Locatelli F, Mann G, Stollmann-Gibbels B, van’t Veer Korthof ET, van

Wering ER, Zimmermann M. Chronic myelomonocytic leukemia in childhood: a

retrospective analysis of 110 cases. European Working Group on Myelodysplastic

Syndromes in Childhood (EWOG-MDS). Blood. 1997; 89: 3534-3543.

Niimi H, Harada LH, Harada Y, Ding Y, Imagawa J, Inaba T, Kyo T and Kimura A.

Hyperactivation of the RAS signaling pathway in myelodysplastic syndrome with

AML1/RUNX1 point mutations. Leukemia. 2006; 20: 35–644.

Nishino HT & Chang C-C. Myelodysplastic Syndromes: Clinicophathologic features,

phatobiology, and molecular pathogenesis. Arch Pathol Lab Med. 2005; 129: 1299-1310.

Nisse C, Haguenoer Jm, Grandbastien B, Preudhomme C,Fontaine B, Brillet JM.

Occupational and enviromental risk factors of the myelodysplastic syndromes in the North of

France. Br J Haematol 2001; 112: 927-935.

Nowell PC. Chromosome abnormalities in myelodysplastic syndromes. Semin Oncol. 1992;

19: 25-33.

Ogata K. Myelodysplastic Syndromes: Recent progress in diagnosis and understanding of

their pathophysiology. J. Nippon Med Sch. 2006; 73: 300-307.

Panani AD & Roussos C. Cytogenetic aspects of adult primary myelodysplastic syndromes:

Clinical implications. Cancer Letters. 2005; 235: 177–190.

Parker JE, Mufti, GJ, Rasool, F, Mijovic, A, Devereux, S, Pagliuca, A. The role of apoptosis,

proliferation, and the Bcl-2-related proteins in the myelodysplastic syndromes and acute

myeloid leukemia secondary to MDS. Blood. 2000; 96: 3932-3938.

Passmore SJ, Hann IM, Stiller CA, Ramani P, Swanbury GS, Gibbsons B, Reeves BR,

Chessells JM. Peadiatric myelodysplastic: a study of 68 children and a new prognostic scoring

system. Blood. 1995; 85: 1742-1750.

Passmore SJ, Cheessells JM, Kempski H, Hann JM, Brownbill PA, Stiller CA. Paediatric

myelodysplastic syndromes and juvenila myelomonocytic leukemia in UK: a population-

based study of incidence and survival. Br J Haematol

2003; 121:758-767.

Perry ME & Levine, AJ. Tumor-suppressor p53 and the cell cycle. Curr Opin Genet Dev.

1993; 3: 50-54.

Pitman SD, Victorio A, Rowsell E, Morris J, Wang J. 5q- Syndrome in a child with slowly

progressive pancytopenia. A case report and review of the literature. J Pediatrr Hematol

Oncol. 2006; 28:115-119.

Polychronopoulou S, Panagiotou JP, Kossiva L, Mavrou A, Anagnostou D, Haidas S. Clinical

and morphological features of paediatric myelodysplastic syndromes: a review of 34 cases.

Acta Paediatric. 2004; 93: 1015-1023.

Pui CH. Childhood leukemias. N Engl J Med. 1995; 332: 1618-1630.

Quesnel B, Guillerm G, Vereecque R, Wattel E, Preudhomme, Bauters F, Vanrumbeke M,

Fenaux P. methylation of the p15

INK4

gene in myelodysplastic syndromes is frequent and

adquired during disease progression. Blood. 1998; 8: 2985-2990.

Rakyan VK, Preis J, Morgan HD, Whitelaw E. The marks, mechanisms and memory of

epigenetics states in mammalian. Biochem J. 2001; 356: 1-10.

Raskind WH, Tirumali, N, Jacobson, R, Singer, J, Fialkow, PJ. Evidence for a multistep

pathogenesis of a myelodysplastic syndrome. Blood. 1984; 63: 1318-1323.

Cotran RS, Kumar V, Collins T. Neoplasias. In: Robbins, Patologia Estrutural e Funcional.

Guanabara Koogan. 6ª ed., p. 253-254, 2000.

Romeo M, Chauffaille ML, Silva MRR, Bahia DMM. Comparison of cytogenetics with FISH

in 40 myelodysplastic syndrome patients. Leuk Res. 2002; 26:993-996.

Rosenfeld C & List A. A hypothesis for the pathogenesis of myelodysplastic syndromes:

implications for new therapies. Leukemia. 2000; 14.

Santos, Cíntia Barros. Síndrome do X frágil e retardo mental Fraxe: distribuição dos alelos

FRAXA e FRAXE em indivíduos portadores de retardo mental idiopático no Estado do Rio

de Janeiro. 2002. 200f. Tese (doutorado) – Centro biomédico, Instituto de biologia Roberto

Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2002.

Sasaki H, Manabe A, Kojima S, Tsuchida M, Hayashi Y, Ikuta K, Okamura J, Koike K,

Ohara A, Ishii E, Komada Y, Hibi S, Nakahata T. Myelodysplastic syndrome in childhood: a

retrospective study of 189 patients in Japan. Leukemia. 2001; 15: 1713-1720.

Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 1971; 2: 971-972.

Side LE, Emanuel PD, Taylor B, Franklin J, Thompson P, Castleberry RP, Shannon KM.

Mutations of the NF1 gene in children with juvenile myelomonocytic leukemia without

clinical evidence of neurofibromatosis type 1. Blood. 1998; 92: 267-272.

Silverman LR & Mufti G. Methylation inhibitor therapy in the treatment of myelodysplastic

syndrome. Nat Clin Pract Oncol. 2005; 2: 12-23.

Sole F, Espinet, B, Sanz, GF, Cervera, J, Calasanz, MJ, Luno, E, Prieto, F, Granada, I,

Hernandez, JM, Cigudosa, JC, Diez, JL, Bureo, E, Marques, ML, Arranz, E, Rios, R,

Martinez Climent, JA, Vallespi, T, Florensa, L, Woessner, S. Incidence, characterization and

prognostic significance of chromosomal abnormalities in 640 patients with primary

myelodysplastic syndromes. Grupo Cooperativo Espanol de Citogenetica Hematologica. Br J

Haematol 2000; 108: 346-356.

Strefford JC, Worley H, Barber K, Wright S, Stewart AR, et al. Genome complexity in acute

lymphoblastic leukemia is revealed by array-based comparative genomic hybridization.

Oncogene. 2007.

Teofili L, Martini M, Di Mario A, Rutella S, Urbano R, Luongo M, Leone G, Larocca LM.

Expression of p15

INK4b

gene during megakaryocytic differentiation of normal and

myelodysplastic hemetopoietic progenitors. Blood. 2001; 98:495-497.

Testa JR, Misawa, S, Oguma, N, Van Sloten, K, Wiernik, PH. Chromosomal alterations in

acute leukemia patients studied with improved culture methods. Cancer Res. 1985; 45: 430-

434.

Tien H-F, Tang J-L, Tsay W, Liu M-C, Lee F-Y, Wang C-H, Chen Y-C, Shen M-C.

Methylation of the p15INK4B gene in myelodisplastic syndrome: it can be detected early or

during disease progression and is highly associated with leukaemic transformation. Brit. J.

Haematol. 2001; 112: 148-154.

Tomonaga M & Nagai K. Hypocellular Myelodysplastic Syndromes and Hypocellular Acute

Myeloid Leukemia: Relationship to Aplastic Anemia. In: The Myelodysplastic Syndromes:

Pathobiol. Clin Management ed. John M Bennett. 2002; 121-138.

Toyota M, Kopecky KJ, Toyota M-O Jair K-W, Willman CL, Issa J-P. Methylation profiling

in acute myeloid leukemia. Blood. 2001; 97: 2823-2829.

Uchida T, Kinoshita T, Nagai H, Nakahara Y, Saito H, Hotta T, Murate T. Hypermethylation

of the p15INK4B gene in myelodysplastic syndromes. Blood. 1997;1403-1409.

Valera ET, Latorre MRD, Mandes WL, Seber A, Lee MLM, Paula MJA, Loggetto AR,

Velloso E, Niero-Melo L, Lopes LF. Treatment of pediatric myelodysplastic syndromes and

juvenile myelomonocytic leukemia: the Brazilian experience in the past decade. Leuk Res.

2004; 28: 933-939.

Vallespi T, Imbert M, Mecucci C, Preudhomme C, Fenaux, P. Diagnosis, classification, and

cytogenetics of myelodysplastic syndromes. Haematologica. 1998; 83: 258-275.

Van den Berghe H, Vernaelen K, Mecucci C, et al. The 5q- anomaly. Cancer Cytogenet.

1974; 17:189-255.

Vidal OD, Paixão VA, Brait M, Souto EX, Caballero OL, Lopes LF, Vettore AL. Aberrant

methylation in pediatric myelodysplastic syndrome. Leuk Res. 2006

Wade PA. Methyl CpG binding proteins: coupling chromatin architecture to gene regulation.

Oncogene. 2001; 20:3166-73.

Webb D.K.H., Passmore S.J., Hann I.M., Harrison G., Wheatley K., Chessells J.M. Results of

treatment of children with refrectory anaemia with excess blasts (RAEB) and RAEB in

transformation (RABE-t) in Great Britain 1990-99. Br J Haematol. 2001; 117: 33-39.

Weinhold B. Epigenetics: the science of change. Environ Health Perspect. 2006; 114:160-7

Wong KF & So CC. Hypoplastic Myelodysplastic Syndrome – a Clinical, Morphologic, or

Genetic Diagnosis? Cancer Genet Cytogenet. 2002; 138: 85-88.

Woods WG, Barnard DR, Alonzo TA, Buckley JD, Kobrinsky N, Arthur DC, Sanders J,

Neudorf S, Gold S, Lange BJ. Prospective study of 90 children requiring treatment for

juvenile myelomonocytic leukemia or myelodysplastic syndrome: a report from the children’s

cancer group. J Clin Oncol. 2002; 20: 434-440.

Wong R, Shahjahan, M, Wang, X, Thall, PF, De Lima, M, Khouri, I, Gajewski, J, Alamo, J,

Couriel, D, Andersson, BS, Donato, M, Hosing, C, Komanduri, K, Anderlini, P, Molldrem, J,

Ueno, NT, Estey, E, Ippoliti, C, Champlin, R, Giralt, S. Prognostic factors for outcomes of

patients with refractory or relapsed acute myelogenous leukemia or myelodysplastic

syndromes undergoing allogeneic progenitor cell transplantation. Biol Blood Marrow

Transplant. 2005; 11: 108-114.

Worm J and Guldberg P. DNA methylation: an epigenetic pathway to cancer and a promising

target for anticancer therapy. J Oral Pathol Med. 2002; 31: 443-9.

Young NS, Calado RT, Scheinberg P. Current concepts in the pathophysiology and treatment

of aplastic anemia. Blood. 2006; 108: 2509-2519.

Yusuf U., Frangoul H.A., Gooley T.A., Woolfrey A.E., Carpenter P.A., Andrews R.G., Deeg

H.J., Appelbaum F.R., Anasetti C., Storb R., Sanders J.E. Allogeneic bone marrow

transplantation in children with myelodysplastic syndrome or juvenile myelomonocytic

leukemia: the Seattle experience. Bone Marrow Transplant. 2004; 33:805-814.

8. ANEXOS

8.1 Anexo 1

TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO E ESCLARECIDO

A – JUSTIFICATIVA

A síndrome mielodisplásica (SMD) é considerada um estado pré-leucêmico, cerca de

10 a 40% dos casos evoluem para leucemia mielóide aguda (LMA). As causas principais de

óbito estão associadas com infecções de repetição, devido à queda de glóbulos brancos;

sangramentos, devido à queda de plaquetas; além da presença de cansaço, devido a

anemia refratária (que não responde ao tratamento). Para estes pacientes é necessário

transfusões sanguíneas periódicas. Atualmente é o transplante de medula óssea (TMO) que

pode proporcionar a cura para um grupo de pacientes com faixa etária até 55 anos. Para o

grupo de pacientes com idade superior aos 55 anos é oferecido tratamento com outros

métodos (por exemplo: transfusões sanguíneas, uso de fatores de crescimento entre

outros). Para os pacientes com SMD independente da idade é necessário a investigação

diagnóstica, pois em alguns casos esta doença pode ser semelhante a anemia aplástica

grave ou uma doença mieloproliferativa. Este diagnóstico é possível através de testes

realizados no sangue e em amostras de medula óssea, utilizando modernas técnicas de

citogenética e de biologia molecular. O emprego destas técnicas é fundamental no

diagnóstico diferencial e é importante quanto à decisão do regime preparatório

(quimioterapia e ou radioterapia) para o TMO. Além disso, alguns estudos relatam que os

pacientes com SMD devem ser transplantados no início da doença, antes do aparecimento

de células leucêmicas na medula óssea (diagnóstico precoce). Desta forma, a detecção de

um pequeno número de células anormais caracterizado a nível citogenético e/ou molecular

está relacionado a um curso clínico pós-transplante favorável.

Estamos realizando este estudo para definir quais são os testes mais eficientes na

identificação de marcadores citogenéticos e moleculares para um diagnóstico inicial e para a

caracterização de estágios de transformação leucêmica

B – DESCRIÇÃO DO PROGRAMA

Este estudo propõe a análise das características citogenéticas e moleculares de

amostras de medula óssea de pacientes e de doadores. Serão colhidas amostras de sangue

e de medula óssea (mielograma) para realização dos testes. Ressaltamos que estas

amostras são necessárias para todos os pacientes para auxiliar o diagnóstico. Não

estaremos realizando nenhum procedimento adicional aos da rotina. Os pacientes serão

submetidos a biópsia, sendo o material enviado para estudo no serviço de Patologia. As

técnicas de coleta de material são as mesmas aplicadas na rotina do serviço. Os resultados

obtidos serão relacionados com quadro clínico dos pacientes, afim de contribuir o para o

diagnóstico e prognóstico do mesmo.

C – INFORMAÇÕES GERAIS

As informações obtidas serão tratadas de forma confidencial e utilizadas para

avaliação proposta bem como para o estabelecimento de um programa de melhoria na

rotina de diagnóstico e definição do estágio da doença. Este é um benefício real para você e

outros pacientes participantes do programa. Você não será identificado em nenhuma

apresentação ou publicação. Não haverá qualquer ressarcimento pela

participação no

estudo. A qualquer momento o paciente e doador poderá desistir da participação, sem

contudo apresentar prejuízo quanto ao seguimento do tratamento a ser realizado nesta

instituição.

Nos casos de necessidade de atendimento este será prestado, como habitualmente,

na unidade de pacientes externos e internos das instituições Em caso de dúvidas quanto ao

protocolo, o contato no Comitê de Ética em Pesquisa

Divisão de Assistência Médica

TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO

Nome: _______________________Data de nascimento: _____________Idade: ____

Endereço:________________________________________Bairro: _______________

Cidade:____________________Estado:_______________CEP: _________________

Telefone: _______________________

Membro da equipe: _________________________ Carimbo: ____________________

Declaro que:

- Entendo que estarei participando deste estudo conforme informações obtidas acima

e com esclarecimento do médico.

- Entendo que as amostras de sangue e medula óssea estarão sendo colhidas

conforme o protocolo de rotina do serviço e que nenhum procedimento adicional será

necessário para o estudo.

- Entendo que não serei ressarcido por participar deste estudo.

- Entendo que as informações obtidas serão confidenciais e em nenhuma publicação

serei identificado.

- Consinto que as informações sejam utilizadas para publicações e apresentações.

- Consinto que as informações sejam utilizadas para um programa que beneficiará

pacientes prè e pós-transplante de medula óssea com diagnóstico de Síndrome

Mielodisplásica Primária.

Em conseqüência aceito, nos termos acima, participar deste estudo:

Data: __________________________

Assinatura do Médico: ________________________________________________

Assinatura do Paciente:________________________________________________

Em caso de Paciente menor de idade:

Assinatura do responsável (legal): _______________________________________

Testemunhas:

1)_______________________________________

2) _______________________________________

8.2 Anexo 2

8.2.1 Cariótipos

100

Paciente 2, 13 anos, masculino, CR.

Cariótipo:

46,XY,del(17)(p12)/46,XY,del(17)(p12),del(12)(p13)/46,XY,del(11)(q23).

101

Paciente 3, 9 anos, masculino, CR. Cariótipo: 46,XY,del(3)(p23).

102

Paciente 5, 3 anos, masculino, CR. Cariótipo: 46,XY,+der(3)del(3)(q21),-7,-9,+mar.

103

Paciente 6, 13 anos, feminino, CR. Cariótipo: 46,XX,del(5)(q15q35).

104

Paciente 8, 14 anos, masculino, CR, Cariótipo: 46,XY,del(11)(q23).

105

Paciente 9, 7 anos, feminino, CR. Cariótipo: 46,XX,del(12)(p13).

106

Paciente 27, 14 anos, masculino, CR. Cariótipo: 46,XY,del(17)(p12).

107

Paciente 36, 17 meses, feminino, AREB. Cariótipo: 47,XX,der(17)t(1?;17)(q32?,p13),+21c.

108

Paciente 38, 2 anos, masculino, AREB. Cariótipo: 45,XY,-19.

109

Paciente 39, 9 meses,masculino, AREB. Cariótipo: 46,XY,del(6)(q23).

110

Paciente 40, 5 anos, masculino, AREB. Cariótipo: 47,XY,+8.

111

Paciente 42, 7 anos, feminino, AREB. Cariótipo: 46,XX,i(9)(q10).

112

Paciente 50, 2 anos, feminino, AREB-t. Cariótipo: 46,XX,t(4;7)(p16;p15).

113

Paciente 51, 4 anos, feminino, AREB-t. Cariotipo: 49,XX,dup(1)(q21q32),+6,+8,+mar.

114

Paciente 52, 1 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 46,XY,inv(1)(q21),add(9)(q34).

115

Paciente 53, 10 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 45,XY,-7.

116

Paciente 56, 5 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 46,XY,t(5;8)(q32;q22).

117

Paciente 58, 12 anos, masculino, AREB-t. Cariótipo: 58,XY,+8,+13,+13,+14,+15,+20,+21c,+21,+21,+21,+22,+22.

118

Paciente 60, 21 meses, feminino, LMMJ. Cariótipo: 46,XX,inv(5)(q11q21),-9,+mar.

119

Paciente 61, 2 anos, masculino, LMMJ. Cariótipo: 47,XY,+16.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 