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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRPARIAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PESCA
ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DE GALACTANAS SULFATADASDE ALGAS
MARINHAS VERMELHAS DO GÊNERO Halymenia E SEU EFEITO
IMUNOESTIMULANTE NO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus vannamei
JOSÉ ARIÉVILO GURGEL RODRIGUES
FORTALEZA-CEARÁ-BRASIL
NOVEMBRO/2006
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ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DE GALACTANAS SULFATADASDE ALGAS
MARINHAS VERMELHAS DO GÊNERO Halymenia E SEU EFEITO
IMUNOESTIMULANTE NO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus vannamei
JOSÉ ARIÉVILO GURGEL RODRIGUES
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À COORDENAÇÃO DO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PESCA DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ, COMO REQUISITO PARCIAL PARA
A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM ENGENHARIA DE PESCA
FORTALEZA-CEARÁ-BRASIL
NOVEMBRO/2006
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Esta dissertação foi submetida à Coordenação do Programade Pós-
Graduação em Engenharia de Pesca como parte dos requisitos necessários à
obtenção do grau de Mestre em Engenharia de Pesca, outorgado pela
Universidade Federal do Ceará e encontra-se à disposição dos interessados na
Biblioteca de Ciências e Tecnologia da referida Universidade.
A transcrição de qualquer trecho desta dissertação é permitida, desde
que seja feita de acordo com as normas da ética científica.
______________________________
José Ariévilo Gurgel Rodrigues
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 17/11/2006
_______________________________________
Prof. Wladimir Ronald Lobo Farias, D.Sc.
Orientador da Dissertação
Presidente
________________________________________
Prof. Paulo Antônio de Souza Mourão, Ph.D.
Conselheiro
________________________________________
Prof
a
. Silvana Saker Sampaio, Ph.D
Conselheiro
Dedico este trabalho a Deus, pelo desfecho de mais
uma etapa de minha vida, e para todos aqueles que
sempre me deram incentivos em continuar na busca
pelas minhas metas profissionais.
AGRADECIMENTO
Primeiramente a Deus, ao qual devo tudo que conquistei a te hoje, pela sua
companhia na bisca pelas minhas convicções e anseios profissionais, a
Engenharia de Pesca. Através de seus ensinamentos, procurarei sempre agir
com ética e postura responsável entre as pessoas;
A minha família, Célia e Ari (meus pais) e Aracélia e Celina (minhas irmãs),
que mesmo ainda sem compreenderem a minha perseverança pelos meus
ideais profissionais;
As minhas tias e avô, que não estão mais entre meu convívio, dedico também
este trabalho de dissertação;
Os meus louváveis agradecimentos ao meu mestre, orientador e amigo, Prof.
Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias, pelas horas de dedicação, paciência e
ensinamentos profissionais (concedidos a mim) durante todo o meu curso de
mestrado, os quais procurarei transmitir em um futuro próximo;
Também aos meus profundos amigos Silvana e Alexandre. A Prof. Silvana
presto minha profunda admiração pelo seu carisma, cordialidade e conselhos
prestados a minha pessoa. E ao Prof. Alexandre, retrato aqui, uma grande
consideração também pela sua pessoa e nunca esquecerei o que fizestes por
mim durante todo o meu curso de mestrado. Muito obrigado!;
Ao Dr. Paulo Antônio de Souza Mourão, Professor da Universidade do Rio de
Janeiro, pela sua grande atenção e disponibilidade em aceitar ao meu convite
para participar de minha banca de defesa de dissertação de mestrado;
Ao Prof. Francisco Hiran Farias Costa, pela disponibilidade do laboratório de
Aqüicultura para a realização de pesquisa;
Ao Coordenador do curso de mestrado em Engenharia de Pesca, Prof. Dr.
Manuel Furtado, pela sua atenção durante todo o meu curso de mestrado.
Muito obrigado!;
Não poderia deixar de agradecer também aos estudantes de graduação (UFC)
que me ajudaram tornar este trabalho de dissertação real. Presto meus
sinceros agradecimentos a Daniel Barroso de Alencar, Jefferson, Anderson,
Anita, Lorena Soares Monteiro, Felipe, Rômulo Malta e Rafael. Em especial
ao estudante Daniel, do qual foi muito importante na execução deste trabalho;
Aos estudantes de mestrado, Kelma Pires, Glácio Sousa Araújo e Valeska
Martins Torres, do curso de Engenharia de Pesca da Universidade Federal do
Ceará. Em especial a Kelma, a qual nunca se negou a oferecer alguma ajuda
neste trabalho. Obrigado!;
As alunas de iniciação científica do laboratório (BIOMOL), Raphaela Melo e
Anúsia, pela compreensão na hora de execução do trabalho;
Os meus agradecimentos aos estudantes de graduação, Eduardo Izidorio de
Melo, e de pós graduação, Fábio Rabelo Melo e Leonardo Paes Cinelli, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (Laboratório de Tecido Conjuntivo),
pela atenção (cedida a mim) durante o início do meu projeto de mestrado;
Ao Engenheiro Agrônomo, Francisco Élder Calvacante Barros, pela sua
disponibilidade no momento inicial deste trabalho;
A FUNCAP, pelo auxílio financeiro no momento inicial do trabalho e em prol do
desenvolvimento da ciência e tecnologia no Estado do Ceará;
A CAPES, pelo auxílio financeiro no momento inicial do trabalho e em prol do
desenvolvimento da ciência e tecnologia no Brasil;
A indústria de ração FRI-RIBE, representada pelos Engenheiros de Pesca Ítalo
Régis Castelo Branco (Coordenador Técnico) e Jeffersson Couto
(Representante de Vendas), pela diação do insumo do qual foi fundamental
durante o período experimental;
A Fazenda Dú Vale, localizada no município de Jaguaruana/CE, pela doação
dos camarões, e por ter me acolhido muito bem, em um momento
extremamente difícil. Presto aqui, os meus sinceros agradecimentos;
Aos funcionários Antônio, Omar Ribeiro, Omar, Edílson, Zacarias, Leni e
Henrique, o meu muito obrigado!;
A secretária do curso de mestrado em Engenharia de Pesca, Rogéria, pela sua
atenção e consideração.
Obrigado a todos!
SUMÁRIO
Página
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
RESUMO
iii
ADSTRACT
v
LISTA DE FIGURAS
vi
LISTA DE TABELAS
viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ix
1. INTRODUÇÃO
1
1.1. Algas marinhas. 1
1.2. O gênero Halymenia. 3
1.3. Polissacarídeos sulfatados (PS) de algas marinhas. 4
1.4. Atividades biológicas dos polissacarídeos sulfatados. 9
1.4.1. Atividade anticoagulante. 12
1.4.2. Atividade imunoestimulante. 15
1.5. Produção de camarão marinho, Litopenaeus vannamei, no
Brasil e no mundo.
20
2. MATERIAIS E MÉTODOS
26
2.1. Coleta e identificação das algas marinhas. 26
2.2. Extração dos polissacarídeos sulfatados. 27
2.3. Fracionamento dos polissacarídeos sulfatados em coluna de
troca iônica.
30
2.4. Teste de Dubois. 30
2.5. Eletroforese em gel de agarose. 31
2.6. Atividade anticoagulante. 31
2.7. Efeito imunoestimulante. 32
2.7.1. Aquisição e manejo dos camarões Litopenaeus
vannamei.
32
2.7.2. Preparação das soluções de polissacarídeos sulfatados. 33
2.7.3. Procedimento experimental. 33
2.7.4. Análises fídico-químicas. 34
2.8. Análises estatísticas. 35
2.9. Extração dos polissacarídeos sulfatados dos camarões. 36
2.10. Fracionamento dos polissacarídeos sulfatados em coluna de
troca iônica.
37
2.11. Eletroforese em gel de agarose. 37
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
38
3.1. Extração dos polissacarídeos sulfatados. 38
3.2. Fracionamento dos polissacarídeos sulfatados em DEAE-
celulose.
39
3.3. Eletroforese em gel de agarose. 43
3.4. Atividade anticoagulante (aPTT). 46
3.5. Efeito imunoestimulante. 49
3.5.1. Biomassa viva final. 50
3.5.2. Parâmetros físico-químicos. 55
3.5.3. Extração dos polissacarídeos sulfatados dos camarões. 56
3.5.4. Análise cromatográfica, em coluna de DEAE-celulose,
dos extratos brutos de polissacarídeos sulfatados obtidos das algas e
dos camarões.
57
3.5.5. Eletroforese das frações eluídas a partir do extrato bruto
dos camarões.
61
4. CONCLUSÃO
64
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
65
RESUMO
Muitos compostos têm sido descritos como anticoagulantese
imunoestimulantes, dentre essas os polissacarídeos sulfatados (PS) de algas
marinhas que também são conhecidos por apresentar outras atividades
biológicas, tais como antitrombótica e antiviral. A descoberta de novas drogas
anticoagulantes é importante para prevenir os efeitos adversos do uso da
heparina, como hemorragias e trombocitopenia. Além disso, o uso de
imunoestimulantes também pode reduzir o impacto do estresse no cultivo
intensivo de organismos aquáticos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
atividade anticoagulante de galactanas sulfatadas de duas espécies de algas
marinhas vermelhas do gênero Halymenia e o seu efeito imunoestimulante no
camarão branco Litopenaeus vannamei. Os PS foram extraídos, através de
digestão enzimática, a partir de algas marinhas coletadas na Praia de
Fleixeiras/CE. Em seguida, os extratos brutos foram fracionados em coluna de
DEAE-celulose, sendo as frações eluídas com soluções de diferentes
concentrações de NaCl e o grau de purificação analisado por eletroforese. A
atividade anticoagulante das frações foi avaliada pelo teste do aPTT, utilizando
plasma de coelho citratado, sendo o tempo de coagulação registrado em um
coagulômetro. Para avaliar efeito imunoestimulante, três doses diferentes de
PS foram administradas, através de banhos de imersão, no camarão L.
vannamei. Os tratamentos, com três repetições cada, foram 0,5 μg.L
-1
; 1,5
μg.L
-1
e 1,0 mg.L
-1
, e um controle, sem polissacarídeos. O experimento teve
duração de 20 dias, dos quais 15 dias foram para a aplicação das soluções de
PS e 5 dias de indução de estresse, através da ausência de renovação de
água do cultivo. A administração das doses foi realizada, duas vezes por dia
(09:00 e 17:00 h), após as trocas de água e antes da alimentação doa animais.
Depois de 15 dias de imersão, não houve diferenças significativas entre as
taxas de mortalidade dos tratamentos. Entretanto, depois do período do
estresse, o tratamento com 1,0 mg.L
-1
apresentou uma mortalidade
significativamente menor do que as observadas nos tratamentos s/PS e 0,5
μg.L
-1
. Com relação à atividadeanticoagulante, as frações obtidas da espécie
H. pseudofloresia apresentaram uma maior atividade, sendo a mais ativa
aquela eluída com 1,25 Mde NaCl da coluna de troca iônica, obtida da 1ª
extração. Assim, com a realização deste trabalho, foi possível obter PS da alga
marinha vermelha H. pseudofloresia com atividade anticoagulante superior à
heparina e capaz de reduzir a mortalidade do camarão L. vannamei submetidos
à condições de estresse.
ABSTRACT
Many substances have been shown to possess anticoagulant and
immunostimulant activities, including sulfated polysaccharides (SP) of marine
algae. They also exhibit antithrombotic and antiviral activities. It is important to
describe new substances capable of preventing known adverse effects of
heparin such as hemorrhages and thrombocytopenia. Moreover, the use of
immunostimulants can also lessen cultivated aquatic organism stress. The aim
of this work was to evaluate both the anticoagulant activity of sulfated galactans
present in two species of red marine seaweed belonging to genus Halymenia
and their immunostimulant effects on white Pacific shrimp Litopenaeus
vannamei. SP were extracted from marine seaweed collected in Praia de
Fleixeiras-CE. Following the extraction, crude extracts were fractioned in DEAE-
cellulose column and fractions were eluted with different concentrations of NaCl
solution. Fraction purification grade was evaluated by electrophoresis.
Anticoagulant activity was analyzed by aPTT’s test using rabbit plasma and the
clotting time was measured in a coagulometer. Three different amount of SP
(0.5 and 1.5 μg.L
-1
and 1.0 mg.L
-1
) were used twice a day (9 and 17h) to
evaluate immunostimulant activity on L. vannamei through immersion baths,
after changing tank water and before feeding the animals. The control group
was maintained without SP addition. The experiment lasted 20 days. Shrimps
were treated by immersion in SP for the first 15 days, and in the last 5 days they
were submitted to stress when no water was renewed. There was no significant
difference on mortality among the treatments. After the stress, the mortality of
shrimps treated with 1.0 mg.L
-1
was lower than the others (control group, 0.5
and 1.5 μg.L
-1
). Anticoagulant activity was detected in fractions obtained from H.
pseudofloresia, the highest being in that eluted with 1.25 M NaCl from the first
extraction procedure. Thus, it was possible to obtain SP from red marine
seaweed H. pseudofloresia which showed higher anticoagulant activity than
heparin and was capable of lowering mortality of L. vannamei under stress
conditions.
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1.
Estrutura de um proteoglicano de mamífero (“agregan”)
mostrando a proteína central em azul e as cadeias de
condroitim sulfato (CS) e queratam sulfato (KS). Fonte:
Glycoword.
5
Figura 2.
Estruturas químicas de polissacarídeos sulfatados de
algas marinhas: (A) fucoidam; (B) agar; (C)
carragenanas.
7
Figura 3.
Unidades monoméricas do ácido algínico presente em
algas marinhas pardas (FAO, 1987).
8
Figura 4.
Unidade dissacarídica repetitiva da heparina (MIKUS et
al., 2004).
13
Figura 5.
Camarão marinho Litopenaeus vannamei. 21
Figura 6.
Alga marinha vermelha Halymenia pseudofloresia. Em
destaque o talo em formato de fita (A) e as regiões
dicotômicas em (B).
27
Figura 7.
Alga marinha vermelha Halymenia sp. Em destaque o
talo foleáceo expandido (A) fixo ao apressório (B).
27
Figura 8.
Fluxograma dos procedimentos de extração para a
obtenção dos polissacarídeos sulfatados totais.
29
Figura 9.
Vista parcial do sistema de aquários utilizado durante o
período experimental.
34
Figura 10.
Rendimento (%) dos extratos brutos das algas marinhas
vermelhas Halymenia sp e H. pseudofloresia, em cada
uma das extrações.
38
Figura 11.
Cromatografia em DEAE-celulose dos PS, obtidos na 1
a
(A), 2
a
(B) e 3
a
(C) extrações da alga marinha vermelha
Halymenia sp.
40, 41
Figura 12.
Cromatografia em DEAE-celulose dos PS, obtidos na 1
a
(A), 2
a
(B) e 3
a
(C) extrações da alga marinha vermelha
Halymenia pseudofloresia.
42
Figura 13.
Eletroforese em gel de agarose 0,5% das frações
obtidas na 1
a
e 3
a
extrações de PS da espécie
Halymenia sp. Extrato bruto (EB) e as frações F1; F2 e
F3.
44
Figura 14.
Eletroforese em gel de agarose 0,5% das frações
obtidas na 1
a
e 3
a
extrações de PS da espécie
Halymenia pseudofloresia. Extrato bruto (EB) e as
frações F1; F2 e F3.
45
Figura 15.
Mortalidade semanal dos camarões Litopenaeus
vannamei, por tratamento, durante o período
experimental.
Letras diferentes sobre as barras indicam diferenças significativas
ao nível de 5%.
50
Figura 16.
Biomassa final viva dos camarões Litopenaeus
vannamei, por tratamento, ao término do período
experimental.
Letras diferentes sobre as barras indicam diferenças significativas
ao nível de 5%.
51
Figura 17.
Variação da concentração do nitrogênio amoniacal
(mg.
-L
) durante o período de cultivo.
56
Figura 18.
Cromatografias em coluna de DEAE-celulose dos
extratos brutos obtidos dos camarões e da alga marinha
Halymenia pseudofloresia.
58
Figura 19. Eletroforeses em gel de agarose das frações do extrato
animal (F1c; F2c e F3c) e da alga marinha Halymenia
pseudofloresia (F1a; F2a e F3a).
62
LISTA DE FIGURAS
Página
Tabela 1.
Atividade anticoagulante (aPTT) das frações de
polissacarídeos sulfatados obtidas das algas vermelhas
Halymenia sp e H. pseudofloresia em relação à heparina
não fracionada.
47
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABCC.
Associação Brasileira dos Criadores de Camarão.
AIDS.
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida.
aPTT.
Tempo de Ativação Parcial da Tromboplastina.
CS.
Condroitim Sulfato.
DMB.
Azul Dimetil Dimetileno.
DS.
Dermatam Sulfato.
EB.
Extrato Bruto.
FAO.
Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Agricultura.
KS.
Queratam Sulfato.
NHP.
Necrose Hepatopancreática.
PG.
Proteoglicano.
PS.
Polissacarídeo Sulfatado.
TT.
Tempo da Trombina.
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