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U
NIVERSIDADE
E
STADUAL
P
AULISTA
F
ACULDADE
DE
O
DONTOLOGIA
DE
A
RARAQUARA
I
NDRI
N
OGUEIRA
A
TIVIDADE
A
NTIBACTERIANA
E
C
ITOTOXICIDADE
DO
A
GREGADO
DE
T
RIÓXIDO
M
INERAL
A
SSOCIADO
A
D
IFERENTES
C
ONCENTRAÇÕES
DE
C
LOREXIDINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Odontológicas
da Faculdade
de Odontologia de Araraquara
, da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
para
obtenção do título de Mestre em
Ciências
Odontológicas – Área de Odontopediatria.
Orientadora: Profª Drª Elisa Maria Aparecida Giro
Araraquara
2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Nogueira, Indri.
Atividade antibacteriana e citotoxicidade do agregado de
trióxido mineral associado a diferentes concentrações de clorexidina
/ Indri Nogueira. – Araraquara: [s.n.], 2008.
95 f. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) –
Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Odontologia
Orientadora: Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro
1. Bactérias 2. Clorexidina 3. Endodontia 4. Materiais
biocompatíveis 5. Microbiologia. I. Título
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, CRB-8/4612
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
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INDRI NOGUEIRA
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E CITOTOXICIDADE DO AGREGADO
DE TRIÓXIDO MINERAL ASSOCIADO A DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES DE CLOREXIDINA
COMISSÃO JULGADORA
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE
Presidente e Orientador: Profª Drª Elisa Maria Aparecida Giro
2º Examinador: Prof. Dr. Carlos Alberto de Souza Costa
3º Examinador: Prof. Dr. João Eduardo Gomes Filho
Araraquara, 30 de julho de 2008.
DADOS CURRICULARES
INDRI NOGUEIRA
30 de março de 1981 Nascimento em Brasília – DF
Filiação Sebastião Sávio Nogueira
Lim Hang Lan Nogueira
2001 - 2004 Curso de Graduação em Odontologia na
Faculdade de Odontologia de Araraquara
- Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho”
2005 - 2006 Estágio de Atualização em Endodontia
na Faculdade de Odontologia de
Araraquara, Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” -
Departamento de Dentística
Restauradora
2005 - 2006 Estágio de Atualização em Emergência
em Odontopediatria na Faculdade de
Odontologia de Araraquara,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho” - Departamento de
Clínica Infantil.
2006 - 2008 Curso de Pós-Graduação em nível de
Mestrado em Ciências Odontológicas,
Área de concentração em
Odontopediatria, na Faculdade de
Odontologia de Araraquara,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”
Poema da Paz
0 dia mais belo? Hoje
0 dia mais belo? Hoje0 dia mais belo? Hoje
0 dia mais belo? Hoje
A coisa mais fácil? Equivocar
A coisa mais fácil? EquivocarA coisa mais fácil? Equivocar
A coisa mais fácil? Equivocar-
--
-se
sese
se
O obstáculo maior? 0 medo
O obstáculo maior? 0 medoO obstáculo maior? 0 medo
O obstáculo maior? 0 medo
0 erro maior? Abandonar
0 erro maior? Abandonar0 erro maior? Abandonar
0 erro maior? Abandonar-
--
-se
sese
se
A raiz de todo
A raiz de todoA raiz de todo
A raiz de todos os males? 0 egoísmo
s os males? 0 egoísmos os males? 0 egoísmo
s os males? 0 egoísmo
A distração mais bela? 0 trabalho
A distração mais bela? 0 trabalhoA distração mais bela? 0 trabalho
A distração mais bela? 0 trabalho
A pior derrota? 0 desalento
A pior derrota? 0 desalentoA pior derrota? 0 desalento
A pior derrota? 0 desalento
Os melhores professores? As crianças
Os melhores professores? As criançasOs melhores professores? As crianças
Os melhores professores? As crianças
A primeira necessidade? Comunicar
A primeira necessidade? ComunicarA primeira necessidade? Comunicar
A primeira necessidade? Comunicar-
--
-se
sese
se
0 que mais faz feliz? Ser útil aos demais
0 que mais faz feliz? Ser útil aos demais0 que mais faz feliz? Ser útil aos demais
0 que mais faz feliz? Ser útil aos demais
0 mistério maior? A morte
0 mistério maior? A morte0 mistério maior? A morte
0 mistério maior? A morte
0 pior defeito? 0 mau humor
0 pior defeito? 0 mau humor0 pior defeito? 0 mau humor
0 pior defeito? 0 mau humor
A
A A
A coisa mais perigosa? A mentira
coisa mais perigosa? A mentiracoisa mais perigosa? A mentira
coisa mais perigosa? A mentira
0 sentimento pior? 0 rancor
0 sentimento pior? 0 rancor0 sentimento pior? 0 rancor
0 sentimento pior? 0 rancor
0 presente mais belo? 0 perdão
0 presente mais belo? 0 perdão 0 presente mais belo? 0 perdão
0 presente mais belo? 0 perdão
0 mais imprescindível? 0 lar
0 mais imprescindível? 0 lar0 mais imprescindível? 0 lar
0 mais imprescindível? 0 lar
A estrada mais rápida? 0 caminho correto
A estrada mais rápida? 0 caminho corretoA estrada mais rápida? 0 caminho correto
A estrada mais rápida? 0 caminho correto
A sensação mais grata? A paz interior
A sensação mais grata? A paz interiorA sensação mais grata? A paz interior
A sensação mais grata? A paz interior
0 resguardo mais eficaz? 0 sorriso
0 resguardo mais eficaz? 0 sorriso0 resguardo mais eficaz? 0 sorriso
0 resguardo mais eficaz? 0 sorriso
0 melhor remédio? 0 ot
0 melhor remédio? 0 ot0 melhor remédio? 0 ot
0 melhor remédio? 0 otimismo
imismoimismo
imismo
A maior satisfação? 0 dever cumprido
A maior satisfação? 0 dever cumpridoA maior satisfação? 0 dever cumprido
A maior satisfação? 0 dever cumprido
A força mais potente do mundo? A fé
A força mais potente do mundo? A féA força mais potente do mundo? A fé
A força mais potente do mundo? A fé
As pessoas mais necessárias? Os pais
As pessoas mais necessárias? Os paisAs pessoas mais necessárias? Os pais
As pessoas mais necessárias? Os pais
A coisa mais bela de todas? 0 amor
A coisa mais bela de todas? 0 amorA coisa mais bela de todas? 0 amor
A coisa mais bela de todas? 0 amor
Madre Teresa de Calcutá
DEDICATÓRIA
A Deus
A Deus A Deus
A Deus
Por permitir minha entrada no curso de mestrado, por capacitar-me
para realizá-lo, pela fé, esperança e força concedidas em todos os
momentos, principalmente, nas dificuldades.
“Tudo posso naquele que me fortalece”
(Filipenses 4, 13)
Ao meu
Ao meuAo meu
Ao meu
pai, Sávio e à minha mãe, Lim
pai, Sávio e à minha mãe, Lim pai, Sávio e à minha mãe, Lim
pai, Sávio e à minha mãe, Lim
Pelo exemplo que são em minha vida de amor, fé, sabedoria,
humildade, fortaleza, educação e determinação. Obrigada pelas
orações e pelo apoio, mesmo apesar da distância.
. .
. Amo muito vocês!
“Pais brilhantes estimulam os filhos a fazer de cada lágrima
uma oportunidade de crescimento”
(Augusto Cury)
Ao meu noivo, amor da minha vida, César
Ao meu noivo, amor da minha vida, CésarAo meu noivo, amor da minha vida, César
Ao meu noivo, amor da minha vida, César
Pelo carinho, pela paciência nas horas de angústia e estresse, pela
confiança, pelos ensinamentos, motivação e encorajamento.
Obrigada pelo amor e compreensão. Te amo muito!
“O amor é paciente, é benigno ...
tudo sofre, tudo crê, tudo espera, tudo suporta”
(1 Coríntios 13: 4,7)
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À
À À
À Professora Drª Elisa Maria Aparecida Giro
Professora Drª Elisa Maria Aparecida GiroProfessora Drª Elisa Maria Aparecida Giro
Professora Drª Elisa Maria Aparecida Giro
Pela orientação, atenção, dedicação e amizade. Agradeço a Deus
por ter conhecido uma pessoa tão especial, com dons maravilhosos e
com um coração repleto de bondade. Com a senhora pude aprender o
valor e o significado de: amor, humildade, paciência, sinceridade,
compreensão, ética e justiça.
Ao Professor Dr
Ao Professor DrAo Professor Dr
Ao Professor Dr. Carlos Alberto de Souza Costa
. Carlos Alberto de Souza Costa. Carlos Alberto de Souza Costa
. Carlos Alberto de Souza Costa
Pela orientação, paciência, confiança, ensinamentos e conselhos
concedidos. Obrigada pela assistência no desenvolvimento desse
trabalho, por permitir a realização de parte deste no Laboratório de
Patologia Experimental - UNESP e pela ajuda na obtenção do
material utilizado.
Ao Professor Antonio Carlos Pizzolitto
Ao Professor Antonio Carlos PizzolittoAo Professor Antonio Carlos Pizzolitto
Ao Professor Antonio Carlos Pizzolitto
Pelo apoio, atenção, auxílio e por disponibilizar o Laboratório de
Microbiologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP,
para que a análise antibacteriana deste estudo fosse realizada.
Às
Às Às
Às queridas
queridas queridas
queridas amigas, Juliana Gondim e Fernanda Lessa
amigas, Juliana Gondim e Fernanda Lessaamigas, Juliana Gondim e Fernanda Lessa
amigas, Juliana Gondim e Fernanda Lessa
Pela amizade, disposição, participação e auxílio na realização desse
trabalho. Vocês são muito especiais!
Aos meus irmãos Rudi e Hendri
Aos meus irmãos Rudi e Hendri Aos meus irmãos Rudi e Hendri
Aos meus irmãos Rudi e Hendri
Pelo amor, carinho e, mesmo à distância, por sempre permanecerem
companheiros.
À minha segunda família: Madalena
À minha segunda família: MadalenaÀ minha segunda família: Madalena
À minha segunda família: Madalena,
,,
,
Luis
LuisLuis
Luis
Evanir (Vani
Evanir (VaniEvanir (Vani
Evanir (Vani)
))
),
, ,
,
Tiago e Vítor
Tiago e Vítor Tiago e Vítor
Tiago e Vítor
Pelo acolhimento nos finais de semana, pelo amor, carinho e
conselhos. Agradeço a Deus por ter colocado vocês em minha vida!
“Você pode sonhar, projetar, criar e construir o lugar mais maravilhoso do
mundo mas precisará de pessoas para tornar o sonho realidade.”
(Walt Disney)
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, representados pelo
Digníssimo Diretor Prof. D
Prof. DProf. D
Prof. Dr. José Cláudio Martins Segalla
r. José Cláudio Martins Segallar. José Cláudio Martins Segalla
r. José Cláudio Martins Segalla,
,,
, pela Vice-
Diretora Profª Drª
Profª Drª Profª Drª
Profª Drª Andréia Affonso Barretto Montandon
Andréia Affonso Barretto MontandonAndréia Affonso Barretto Montandon
Andréia Affonso Barretto Montandon
e pela
digníssima ex-Diretora Profª Drª Rosemary Adriana Chiérici
Profª Drª Rosemary Adriana Chiérici Profª Drª Rosemary Adriana Chiérici
Profª Drª Rosemary Adriana Chiérici
Marcontonio
MarcontonioMarcontonio
Marcontonio.
Ao Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP, representado pela Chefe de
Departamento Profª Drª Angela Cristina Cilense Zuanon
Profª Drª Angela Cristina Cilense ZuanonProfª Drª Angela Cristina Cilense Zuanon
Profª Drª Angela Cristina Cilense Zuanon e pela Vice-
Chefe Profª Drª
Profª Drª Profª Drª
Profª Drª L
LL
Lídia Parsekian Martins.
ídia Parsekian Martins.ídia Parsekian Martins.
ídia Parsekian Martins.
À Coordenação da Pós-Graduação em Ciências Odontológicas
da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, representada
pelos Professores:
Drª
Drª Drª
Drª Rita de Cássia Loiola Cordeiro
Rita de Cássia Loiola CordeiroRita de Cássia Loiola Cordeiro
Rita de Cássia Loiola Cordeiro, Dr. Dirceu
Dr. Dirceu Dr. Dirceu
Dr. Dirceu
Barnabé Ravelli
Barnabé RavelliBarnabé Ravelli
Barnabé Ravelli, Drª Josimeri Hebling
Drª Josimeri HeblingDrª Josimeri Hebling
Drª Josimeri Hebling Costa
CostaCosta
Costa e Dr. Luiz Gonzaga
Dr. Luiz Gonzaga Dr. Luiz Gonzaga
Dr. Luiz Gonzaga
Gandini Júnior
Gandini JúniorGandini Júnior
Gandini Júnior.
..
.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq
CNPqCNPq
CNPq) pelo suporte financeiro.
À Empresa
EmpresaEmpresa
Empresa
Angelus
AngelusAngelus
Angelus
®
®®
®
(Indústria de Produtos Odontológicos
Ltda., Londrina, PR, Brasil), por ter cedido o material para ser
utilizado nos experimentos.
Ao Prof. Dr. Elliot W. Kitagima do NAP/MEPA – ESALQ/USP,
Piracicaba, São Paulo, Brasil, por disponibilizar o microscópio
eletrônico de varredura (MEV) para a análise da morfologia celular.
Aos professores da Disciplina de Odontopediatria da
Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, Profª Drª
Profª Drª Profª Drª
Profª Drª Angela
Angela Angela
Angela
Cristina Cilense Zuanon,
Cristina Cilense Zuanon, Cristina Cilense Zuanon,
Cristina Cilense Zuanon, Prof. Dr.
Prof. Dr. Prof. Dr.
Prof. Dr. Cyneu Aguiar Pansani,
Cyneu Aguiar Pansani, Cyneu Aguiar Pansani,
Cyneu Aguiar Pansani, Profª Drª
Profª Drª Profª Drª
Profª Drª
Elisa Maria Apareci
Elisa Maria ApareciElisa Maria Apareci
Elisa Maria Aparecida Giro,
da Giro, da Giro,
da Giro, Prof. Dr.
Prof. Dr. Prof. Dr.
Prof. Dr. Fábio César Abreu
Fábio César AbreuFábio César Abreu
Fábio César Abreu-
--
-e
ee
e-
--
-Lima,
Lima, Lima,
Lima, Profª
Profª Profª
Profª
Drª
Drª Drª
Drª Josimeri Hebling,
Josimeri Hebling, Josimeri Hebling,
Josimeri Hebling, Profª Drª
Profª Drª Profª Drª
Profª Drª Lourdes Aparecida Martins dos
Lourdes Aparecida Martins dos Lourdes Aparecida Martins dos
Lourdes Aparecida Martins dos
Santos
SantosSantos
Santos-
--
-Pinto (Tuka) e
Pinto (Tuka) e Pinto (Tuka) e
Pinto (Tuka) e Profª Drª
Profª Drª Profª Drª
Profª Drª Rita de Cássia Loiola Cordeiro
Rita de Cássia Loiola CordeiroRita de Cássia Loiola Cordeiro
Rita de Cássia Loiola Cordeiro.
..
.
Às queridas amigas de turma de mestrado: Ana Luísa
Ana LuísaAna Luísa
Ana Luísa
B. M. de
B. M. de B. M. de
B. M. de
Oliveira
OliveiraOliveira
Oliveira,
, ,
, Camila
Camila Camila
Camila Fávero de Oliveira,
Fávero de Oliveira,Fávero de Oliveira,
Fávero de Oliveira,
Hérica
HéricaHérica
Hérica
Adad Ricci
Adad RicciAdad Ricci
Adad Ricci,
, ,
, Elcilaine
Elcilaine Elcilaine
Elcilaine
Rizzato Azevedo
Rizzato Azevedo Rizzato Azevedo
Rizzato Azevedo e Lícia
e Líciae Lícia
e Lícia
Bezerra Cavalcante
Bezerra CavalcanteBezerra Cavalcante
Bezerra Cavalcante.
..
. Obrigada pelos
momentos de descontração, convivência, amizade e aprendizado.
Às queridas amigas-irmãs Christiane
ChristianeChristiane
Christiane
Castro, Débora
Castro, DéboraCastro, Débora
Castro, Débora
Barbosa
Barbosa Barbosa
Barbosa e
e e
e
Eliane
ElianeEliane
Eliane
Milazzo
MilazzoMilazzo
Milazzo,
,,
, que mesmo à distância, estavam sempre presentes e
sempre torcendo pelo meu sucesso. Obrigada pelas orações, carinho e
força de vocês.
Aos queridos amigos, Ana Paula Faloni,
Ana Paula Faloni,Ana Paula Faloni,
Ana Paula Faloni,
Filipe Abi Rached,
Filipe Abi Rached,Filipe Abi Rached,
Filipe Abi Rached,
Isabella Haneda, Sabrina Aquino e
Isabella Haneda, Sabrina Aquino e Isabella Haneda, Sabrina Aquino e
Isabella Haneda, Sabrina Aquino e Marcinha
MarcinhaMarcinha
Marcinha
Tanaka
TanakaTanaka
Tanaka. Obrigada
pela amizade, pelas horas de alegria e descontração, pelo carinho,
atenção e conselhos dados.
Aos amigos do Programa de Pós-Graduação da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP, do curso de Odontopediatria:
Andreza
AndrezaAndreza
Andreza
M. F. Aranha
M. F. AranhaM. F. Aranha
M. F. Aranha, Érika
, Érika, Érika
, Érika
Botelho Josgrilberg
Botelho JosgrilbergBotelho Josgrilberg
Botelho Josgrilberg,
, ,
, Fábio
FábioFábio
Fábio
L. F.
L. F. L. F.
L. F.
Scanavino
ScanavinoScanavino
Scanavino, Fernanda
, Fernanda, Fernanda
, Fernanda
C. R. Lessa
C. R. LessaC. R. Lessa
C. R. Lessa, Hermes
, Hermes, Hermes
, Hermes
Pretel
PretelPretel
Pretel, Jonas
, Jonas, Jonas
, Jonas
de Almeida
de Almeida de Almeida
de Almeida
Rodrigues
RodriguesRodrigues
Rodrigues, Júnia
, Júnia, Júnia
, Júnia
C. L. Ferrari dos Santos
C. L. Ferrari dos SantosC. L. Ferrari dos Santos
C. L. Ferrari dos Santos, Luciana
, Luciana, Luciana
, Luciana
Monti Lima
Monti LimaMonti Lima
Monti Lima,
, ,
,
Mariane Emi Sanabe,
Mariane Emi Sanabe, Mariane Emi Sanabe,
Mariane Emi Sanabe, Murilo
MuriloMurilo
Murilo
de Sousa Guimarães
de Sousa Guimarãesde Sousa Guimarães
de Sousa Guimarães, Cármem
, Cármem, Cármem
, Cármem
Regina
Regina Regina
Regina
Coldebella
ColdebellaColdebella
Coldebella,
, ,
, Juliana
Juliana Juliana
Juliana O.
O. O.
O. Gondim,
Gondim, Gondim,
Gondim, Michele
MicheleMichele
Michele
Baffi Diniz
Baffi DinizBaffi Diniz
Baffi Diniz, Nan
, Nan, Nan
, Nancy
cycy
cy
Tomoko
Tomoko Tomoko
Tomoko
Sacono
SaconoSacono
Sacono, Simone
, Simone, Simone
, Simone
di Salvo Mastrantonio
di Salvo Mastrantoniodi Salvo Mastrantonio
di Salvo Mastrantonio, Cris
, Cris, Cris
, Cristiane Maria da Costa e
tiane Maria da Costa e tiane Maria da Costa e
tiane Maria da Costa e
Silva
SilvaSilva
Silva,
, ,
, Débora da Silva Lopes,
Débora da Silva Lopes, Débora da Silva Lopes,
Débora da Silva Lopes, Fabiano
FabianoFabiano
Fabiano
Jeremias
JeremiasJeremias
Jeremias, Juliana
, Juliana, Juliana
, Juliana
Feltrin de
Feltrin de Feltrin de
Feltrin de
Souza
SouzaSouza
Souza, Marcela
, Marcela, Marcela
, Marcela
Martini Tagliani e Mácia Hiromi
Martini Tagliani e Mácia Hiromi Martini Tagliani e Mácia Hiromi
Martini Tagliani e Mácia Hiromi Tanaka
TanakaTanaka
Tanaka.
..
.
Aos amigos de laboratório de Patologia Experimental pelos
momentos de alegria e de aprendizado: Adriano Augusto M. de
Adriano Augusto M. de Adriano Augusto M. de
Adriano Augusto M. de
Mendonça, Adriano Fonseca de Lima, Ana Paula Dias Ribeiro,
Mendonça, Adriano Fonseca de Lima, Ana Paula Dias Ribeiro, Mendonça, Adriano Fonseca de Lima, Ana Paula Dias Ribeiro,
Mendonça, Adriano Fonseca de Lima, Ana Paula Dias Ribeiro,
Andreza Almeida, Andreza Maria Fabio Aranha, Camila Fávero de
Andreza Almeida, Andreza Maria Fabio Aranha, Camila Fávero de Andreza Almeida, Andreza Maria Fabio Aranha, Camila Fávero de
Andreza Almeida, Andreza Maria Fabio Aranha, Camila Fávero de
Oliveira, Cármen Regina Coldebella, Carolina B. Brito, Castelo Pedro
Oliveira, Cármen Regina Coldebella, Carolina B. Brito, Castelo Pedro Oliveira, Cármen Regina Coldebella, Carolina B. Brito, Castelo Pedro
Oliveira, Cármen Regina Coldebella, Carolina B. Brito, Castelo Pedro
V. Ci
V. CiV. Ci
V. Cidade, Cláudia Huck, Daniela Cristina Barbosa, Darlon Martins,
dade, Cláudia Huck, Daniela Cristina Barbosa, Darlon Martins, dade, Cláudia Huck, Daniela Cristina Barbosa, Darlon Martins,
dade, Cláudia Huck, Daniela Cristina Barbosa, Darlon Martins,
Fernanda da Silveira Vargas,
Fernanda da Silveira Vargas, Fernanda da Silveira Vargas,
Fernanda da Silveira Vargas, Fernanda C. R. Lessa,
Fernanda C. R. Lessa,Fernanda C. R. Lessa,
Fernanda C. R. Lessa,
Flávia Cristina
Flávia Cristina Flávia Cristina
Flávia Cristina
Coimbra, Flávia Zardo Trindade, Gislaine C. Padovani
Coimbra, Flávia Zardo Trindade, Gislaine C. PadovaniCoimbra, Flávia Zardo Trindade, Gislaine C. Padovani
Coimbra, Flávia Zardo Trindade, Gislaine C. Padovani, João F. Kina
, João F. Kina, João F. Kina
, João F. Kina,
, ,
,
Juliana Pirola Garcia, Karina A. Neves, Keren C. F. Jordão,
Juliana Pirola Garcia, Karina A. Neves, Keren C. F. Jordão,Juliana Pirola Garcia, Karina A. Neves, Keren C. F. Jordão,
Juliana Pirola Garcia, Karina A. Neves, Keren C. F. Jordão,
Luciana
Luciana Luciana
Luciana
Rocha Coimbra, Marcela Tagliani, Maria da Glória Vie
Rocha Coimbra, Marcela Tagliani, Maria da Glória VieRocha Coimbra, Marcela Tagliani, Maria da Glória Vie
Rocha Coimbra, Marcela Tagliani, Maria da Glória Vieira Celli,
ira Celli, ira Celli,
ira Celli,
Nancy Tomoko Sacono
Nancy Tomoko Sacono Nancy Tomoko Sacono
Nancy Tomoko Sacono e Pedro Paulo Chaves de Souza
e Pedro Paulo Chaves de Souzae Pedro Paulo Chaves de Souza
e Pedro Paulo Chaves de Souza.
..
.
Às Estagiárias da Odontopediatria, pelos conhecimentos
compartilhados: I
II
Ioneide
oneideoneide
oneide
Maria G. Brandão
Maria G. BrandãoMaria G. Brandão
Maria G. Brandão, Keli
, Keli, Keli
, Keli
Regina Victorino
Regina VictorinoRegina Victorino
Regina Victorino,
, ,
,
Keren
KerenKeren
Keren
Crist
CristCrist
Cristina F. Jordão
ina F. Jordãoina F. Jordão
ina F. Jordão, Larissa
, Larissa, Larissa
, Larissa
Stangari
StangariStangari
Stangari, Lígia
, Lígia, Lígia
, Lígia
Nunes
NunesNunes
Nunes
de Moraes
de Moraes de Moraes
de Moraes
Ribeiro
RibeiroRibeiro
Ribeiro, Mariana
, Mariana, Mariana
, Mariana
Fiochi Pena
Fiochi PenaFiochi Pena
Fiochi Pena
e Natália
e Natáliae Natália
e Natália
Apolinário de Lima
Apolinário de LimaApolinário de Lima
Apolinário de Lima.
..
.
À técnica do Laboratório de Microbiologia, UNESP – Farmácia,
Maria do Carmo
Maria do CarmoMaria do Carmo
Maria do Carmo e às técnicas dos Laboratórios de Microbiologia e
Patologia Experimental, UNESP – Odontologia, S
SS
Sônia
ônia ônia
ônia F. da Silveira
F. da Silveira F. da Silveira
F. da Silveira
Vargas
VargasVargas
Vargas
e Juliana Pirola.
e Juliana Pirola.e Juliana Pirola.
e Juliana Pirola. Obrigada pela ajuda, compreensão e
paciência.
Aos funcionários do Departamento de Clínica Infantil da
Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, Sonia Maria
Sonia Maria Sonia Maria
Sonia Maria
Tircailo, Célia
Tircailo, CéliaTircailo, Célia
Tircailo, Célia
Ap. Brogna B.da Silva,
Ap. Brogna B.da Silva, Ap. Brogna B.da Silva,
Ap. Brogna B.da Silva, Dulce Helena Oliveira
Dulce Helena OliveiraDulce Helena Oliveira
Dulce Helena Oliveira, Odete
, Odete, Odete
, Odete
A.
A. A.
A.
Goveia
GoveiaGoveia
Goveia, Pedr
, Pedr, Pedr
, Pedro C. Alves
o C. Alveso C. Alves
o C. Alves,
, ,
,
Tâ
TâTâ
Tânia,
nia,nia,
nia,
A. M. dos Santos, Antônio P. Cabrini
A. M. dos Santos, Antônio P. CabriniA. M. dos Santos, Antônio P. Cabrini
A. M. dos Santos, Antônio P. Cabrini
(
((
(Totó
TotóTotó
Totó), Cristina
), Cristina), Cristina
), Cristina
Ferreira Afonso
Ferreira AfonsoFerreira Afonso
Ferreira Afonso
e Márcia
e Márciae Márcia
e Márcia
Elena C. dos S
Elena C. dos SElena C. dos S
Elena C. dos Santos
antosantos
antos
que com
seus trabalhos sempre nos ajudaram.
Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP, Mara
MaraMara
Mara
Cândida Munhoz do
Cândida Munhoz do Cândida Munhoz do
Cândida Munhoz do
Amaral
AmaralAmaral
Amaral, Rosângela
, Rosângela, Rosângela
, Rosângela
Aparecida Silva dos Santos
Aparecida Silva dos SantosAparecida Silva dos Santos
Aparecida Silva dos Santos,
, ,
, José
José José
José Alexandre
Alexandre Alexandre
Alexandre
Garcia
Garcia Garcia
Garcia e Flávia
e Fláviae Flávia
e Flávia Sousa de Jesus
Sousa de JesusSousa de Jesus
Sousa de Jesus pela atenção, carinho e educação
com que sempre me atenderam.
Aos amigos e funcionários da Biblioteca da Faculdade de
Odontologia de Araraquara - UNESP por todo carinho, amizade,
atenção, paciência e por estarem sempre dispostos a ajudar: Adriano
AdrianoAdriano
Adriano
Ferreira Luiz
Ferreira LuizFerreira Luiz
Ferreira Luiz,
, ,
, Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, Eliane
Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, Eliane Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, Eliane
Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, Eliane
Cristina Marq
Cristina MarqCristina Marq
Cristina Marques de Mendonça Spera,
ues de Mendonça Spera, ues de Mendonça Spera,
ues de Mendonça Spera, Eliane
ElianeEliane
Eliane
Maria Sanches Scarso
Maria Sanches ScarsoMaria Sanches Scarso
Maria Sanches Scarso,
, ,
,
Maria Aparecida Capela Carvalho, Marley Cristina Chiusoli
Maria Aparecida Capela Carvalho, Marley Cristina Chiusoli Maria Aparecida Capela Carvalho, Marley Cristina Chiusoli
Maria Aparecida Capela Carvalho, Marley Cristina Chiusoli
Montagnoli, Maria Helena Matsumoto Komatsi Leves,
Montagnoli, Maria Helena Matsumoto Komatsi Leves, Montagnoli, Maria Helena Matsumoto Komatsi Leves,
Montagnoli, Maria Helena Matsumoto Komatsi Leves, Maria Inês
Maria InêsMaria Inês
Maria Inês
Carlos
CarlosCarlos
Carlos, Odete
, Odete, Odete
, Odete
Aparecida Camilo
Aparecida CamiloAparecida Camilo
Aparecida Camilo, Sílvia
, Sílvia, Sílvia
, Sílvia
Helena Acquarone Lavras
Helena Acquarone LavrasHelena Acquarone Lavras
Helena Acquarone Lavras.
..
.
Aos amigos e funcionários da seção de Esterilização pela
amizade, atenção e disposição que sempre nos atenderam: Aurelúcia
AurelúciaAurelúcia
Aurelúcia
Vieira Rocha, Marco Antônio Pereira e Paulo R. M. Pagliarine.
Vieira Rocha, Marco Antônio Pereira e Paulo R. M. Pagliarine.Vieira Rocha, Marco Antônio Pereira e Paulo R. M. Pagliarine.
Vieira Rocha, Marco Antônio Pereira e Paulo R. M. Pagliarine.
A todos os professores e funcionários desta Faculdade pela
atenção e contribuição para minha formação acadêmica,
profissional e humana.
E a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a
realização deste trabalho, o meu mais sincero agradecimento.
Muito obrigada!!!
Muito obrigada!!!Muito obrigada!!!
Muito obrigada!!!
P
REFÁCIO
Esta tese será apresentada na forma de dois artigos intitulados:
Artigo 1 – “Atividade antibacteriana do agregado de trióxido mineral
associado a diferentes concentrações de clorexidina” - Será submetido para
publicação no Journal of Endodontics.
Artigo 2 – “Efeito citotóxico do agregado de trióxido mineral associado à
clorexidina sobre cultura de fibroblastos” - Será submetido para publicação no
Journal of Endodontics.
S
UMÁRIO
A
NEXOS....................................................................................................................................................................................
85
L
ISTA DE
A
BREVIATURAS,
S
IGLAS E
S
ÍMBOLOS..........................................................................................................
13
R
ESUMO...............................................................................................................................................................................
14
A
BSTRACT............................................................................................................................................................................
16
I
NTRODUÇÃO.......................................................................................................................................................................
18
P
ROPOSIÇÃO.......................................................................................................................................................................
23
A
RTIGO
1
–
“
A
TIVIDADE
A
NTIBACTERIANA
DO
A
GREGADO
DE
T
RIÓXIDO
M
INERAL
A
SSOCIADO
A
D
IFERENTES
C
ONCENTRAÇÕES
DE
C
LOREXIDINA”
..........................................................................................
24
A
RTIGO
2
–
“E
FEITO
C
ITOTÓXICO
DO
A
GREGADO
DE
T
RIÓXIDO
M
INERAL
A
SSOCIADO
À
C
LOREXIDINA
SOBRE
C
ULTURA
DE
F
IBROBLASTOS”
..................................................................................................................................................................
45
C
ONSIDERAÇÕES
F
INAIS ..................................................................................................................................................
74
C
ONCLUSÃO.........................................................................................................................................................................
77
R
EFERÊNCIAS......................................................................................................................................................................
78
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
CHX - clorexidina
DMEM - Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium
DNA - ácido desoxirribonucléico
E. coli - Escherichia coli
E. faecalis - Enterococcus faecalis
HCl - ácido clorídrico
HMDS - Hexametil-disiloxano
MMPs - metaloproteinases
MPDL - mouse periodontal ligament fibroblast cells (fibroblastos do ligamento
periodontal de camundongos)
MTA - Mineral Trioxide Aggregate ou agregado de trióxido mineral
MTT - metiltetrazolium - ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyltetrazolium
bromide)
p - nível de significância estatística
P. aeruginosa - Pseudomonas aeruginosa
PBS - Solução salina fosfatada tamponada
pH - potencial hidrogeniônico
S. aureus - Staphylococcus aureus
SDH - desidrogenase succínica
SFB - soro fetal bovino
UFC - unidades formadoras de colônia
UI/mL - unidades internacionais por mililitros
Resumo
_________________________________________________________14
Nogueira I. Atividade antibacteriana e citotoxicidade do agregado de trióxido
mineral associado a diferentes concentrações de clorexidina [dissertação
mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2008.
Resumo
Para que um material seja indicado como retrobturador, é desejável que
apresente várias propriedades, entre elas, intensa atividade antibacteriana e
aceitável biocompatibilidade. O presente trabalho teve como objetivo avaliar, in
vitro, o efeito antibacteriano e citotóxico do Agregado de Trióxido Mineral
(MTA-Branco, Angelus
®
Indústria de Produtos Odontológicos Ltda., Londrina,
PR, Brasil), associado à solução de clorexidina (CHX) em diferentes
concentrações. Para a análise da atividade antibacteriana foi empregado o método
de difusão em ágar Müller-Hinton e foram utilizados os microrganismos
Staphylococcus aureus (ATCC - 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC -
27853), Escherichia coli (ATCC - 25922) e Enterococcus faecalis (ATCC -
29262). Em placas de Petri contendo a suspensão bacteriana com meio de cultura,
foram preparados poços com 4 mm de diâmetro e 5 mm de profundidade, os quais
foram preenchidos com o cimento MTA preparado com água destilada estéril
(G1-controle) ou com solução de CHX nas concentrações de 0,06% (G2), 0,12%
(G3), 0,2% (G4) e 1% (G5). As placas foram incubadas em condições de
aerobiose a 37ºC por 24 horas e os halos de inibição do crescimento bacteriano
foram medidos em milímetros. Para avaliar a citotoxicidade do MTA associado às
diferentes concentrações de CHX, o metabolismo e a morfologia celular foram
avaliados por meio do teste do MTT e da análise da microscopia eletrônica de
varredura, respectivamente. Corpos de prova de 4 mm de diâmetro e 2 mm de
espessura foram preparados com as associações de materiais e imersos em 1,1 mL
de meio de cultura (DMEM) por 24 horas ou por 7 dias para obtenção dos
extratos. DMEM completo (grupo controle - G6) e os extratos de cada grupo
foram aplicados sobre cultura de fibroblastos do ligamento periodontal de
camundongos, os quais foram incubados por 24 horas a 37ºC com 5% de CO
2
e
95% de ar. A adição de CHX 1% ao MTA aumentou a atividade antibacteriana do
Resumo
_________________________________________________________15
cimento sobre S. aureus (p<0,05). Para E. coli e P. aeruginosa não houve
diferença estatística em relação aos tamanhos dos halos de inibição para todos os
materiais estudados (p>0,05). Para o E. faecalis, MTA + CHX 0,2% e MTA +
CHX 1% apresentaram menores halos de inibição quando comparados aos demais
grupos (p<0,05). Para os extratos de 24 horas, a redução do metabolismo celular
para os grupos G1 a G5 foi de 11,87%; 23,63%; 21,87%; 34,64% e 83,01%,
respectivamente; para os extratos de 7 dias, o metabolismo das células decresceu
em 61,35%; 71,45%; 75,43%; 81,26% e 86,13%, respectivamente. Para ambos os
períodos de obtenção dos extratos e para todos os grupos experimentais, o
metabolismo celular foi estatisticamente menor do que para o grupo controle (G6)
(p<0,05). O menor efeito citotóxico foi observado para G1 (p<0,05), seguido
pelos grupos G2 e G3 que não apresentaram diferença estatisticamente
significante entre si (p>0,05). Os grupos G4 e G5 apresentaram os maiores efeitos
citotóxicos, sendo G5 mais citotóxico do que G4 (p<0,05). Concluiu-se que: 1) a
adição de clorexidina ao MTA independente da concentração utilizada, não
resultou em melhora da atividade antibacteriana sobre as espécies estudadas, com
exceção do S. aureus; 2) quanto maior a concentração de CHX incorporada ao pó
do MTA, maior a toxicidade do cimento sobre fibroblastos do ligamento
periodontal de camundongos (MDPL); 3) o extrato de 7 dias foi mais citotóxico
que o extrato de 24 horas.
Palavras-chave: Bactérias; clorexidina; endodontia; materiais biocompatíveis;
microbiologia.
Abstract
_________________________________________________________16
Nogueira I. Antibacterial activity and cytotoxic effects of mineral trioxide
aggregate associate with different concentrations of chlorhexidine [dissertação
mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2008.
Abstract
An ideal root-end filling material should present several properties,
including antibacterial activity and biocompatibility. The aim of this in vitro study
was to investigate the antibacterial and cytotoxic effects of Mineral Trioxide
Aggregate (MTA-White, Angelus
®
Indústria de Produtos Odontológicos Ltda.,
Londrina, PR, Brasil) mixed with different concentrations of chlorhexidine
(CHX). For antibacterial activity analysis diffusion method on Müller-Hinton agar
was employed. The bacterial strains used were Staphylococcus aureus (ATCC -
25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC - 27853), Escherichia coli (ATCC -
25922) e Enterococcus faecalis (ATCC - 29262). In Petri plates containing culture
medium with bacterial suspension, wells were made measuring 4 mm in diameter
and 5 mm in depth. The wells were completely filled with MTA mixed with
sterile distilled water (G1) or with different concentrations of CHX: 0.06 % (G2),
0.12% (G3), 0.2% (G4) and 1% (G5). The plates were incubated in aerobic
conditions at 37ºC for 24 hours, and then the diameters of the zones of bacterial
inhibition were measured. To evaluate the cytotoxicity of the MTA mixed with
different concentrations of CHX, the cell metabolism and cells morphology were
evaluated by the MTT assay and scanning electron microscopy, respectively.
Round-shaped samples measuring 4 mm in diameter and 2 mm in thickness were
prepared with the association of materials and immersed in 1.1 mL of culture
medium (DMEM) and incubated for 24 hours or 7 days. The extracts from every
sample and pure DMEM (control group - G6) were applied on mouse periodontal
ligament fibroblast cells culture and incubated at 37ºC with 5% CO
2
and 95% air
for 24 hours. The addition of CHX 1% to MTA increased the antibacterial activity
of the cement against S. aureus (p <0.05). There was no statistically significant
difference in size of inhibition zones against E. coli and P. aeruginosa for the
studied materials (p> 0.05). Against E. faecalis, MTA + CHX 0.2% and MTA +
Abstract
_________________________________________________________17
CHX 1% determined lower inhibition zones when compared to the other groups
(p <0.05). To 24-hour extracts the reduction of cell metabolism was 11.87%;
23.63%; 21.87%; 34.64%; and 83.01%, respectively for groups G1 to G5. To 7-
day extracts, the metabolism of the cultured cells decreased by 61.35%; 71.45%;
75.43%; 81.26%; and 86.13% respectively for groups G1 to G5. For both periods
of extracts obtained and for all experimental groups, the cell metabolism was
significantly lower than in control group (G6) (p<0.05). The lowest cytotoxic
effect was observed for G1 (p<0.05) followed by G2 and G3 groups that did not
show a statistically significant difference between them (p>0.05). The groups G4
and G5 had the higher cytotoxic effects and G5 was more cytotoxic than G4
(p<0.05). It was concluded that: 1) the addition of chlorhexidine to MTA
independent of the concentration used did not improve the antibacterial activity
against studied microorganisms (except against S. aureus); 2) all concentrations of
chlorhexidine mixed with MTA caused intense cytotoxic effects when extracts
obtained in both periods were applied directly on mouse periodontal ligament
fibroblast cells (MDPL); 3) the extract of 7 days was more cytotoxic than the
extract of 24 hours.
Keywords: Bacteria; biocompatible materials; chlorhexidine; endodontics;
microbiology.
Introdução
_______________________________________________________18
INTRODUÇÃO
Um dos principais objetivos da terapia endodôntica é a eliminação de
irritantes presentes no interior do sistema de canais radiculares, seguida da
obturação da forma mais hermética possível. Os canais radiculares de dentes
necrosados têm a capacidade de abrigar várias espécies bacterianas e seus
subprodutos
33
e sua complexidade anatômica dificulta ou impossibilita uma
limpeza completa mesmo com o uso de técnicas e instrumentos apropriados,
podendo levar ao insucesso do tratamento. Assim, é relativamente freqüente a
persistência de lesões periapicais, e, principalmente quando o retratamento do
canal não é bem sucedido ou não é possível, torna-se necessária a intervenção
cirúrgica parendodôntica
43
. Esse procedimento consiste na exposição da região
periapical, curetagem para remoção da lesão patológica, ressecção do ápice
radicular, preparo de uma cavidade e inserção de material retrobturador.
O material ideal para procedimentos de obturação retrógrada deve aderir-
se e adaptar-se adequadamente às paredes dentinárias do preparo, favorecendo um
bom selamento apical, a fim de prevenir a infiltração de microrganismos e de seus
subprodutos provenientes do canal radicular para o tecido periapical
18,47
. Além
disso, deve ser biocompatível, insolúvel nos fluidos tissulares, ter estabilidade
dimensional, não sofrer corrosão, ser de fácil manipulação e ter radiopacidade
18
.
Durante muitos anos o amálgama foi o material de eleição nos
procedimentos de retrobturação. Entretanto, algumas de suas desvantagens como
a liberação de mercúrio, presença de corrosão e expansão tardia desestimularam o
seu uso
17,18
. Com a finalidade de contornar essas desvantagens do amálgama,
Introdução
_______________________________________________________19
cimentos à base de óxido de zinco e eugenol passaram a ser utilizados como
materiais para obturação retrógrada. Todavia, esses materiais também apresentam
algumas desvantagens como elevada solubilidade e irritação aos tecidos vivos
18
.
O agregado de trióxido mineral (MTA) foi introduzido na endodontia em
1993 por Lee et al.
29
e tem sido indicado para procedimentos de retrobturação,
perfurações radiculares e de furca
2,35,49
, em pulpotomias e capeamento pulpar
direto
14,36,53
, e em casos de dentes com rizogênese incompleta, como barreira
apical
53
. Seus principais componentes são: silicato de tricálcio, aluminato de
tricálcio, óxido de tricálcio, óxido de silicato e partículas hidrófilas. Quando o pó
de MTA é hidratado, há a formação de um gel coloidal que se solidifica em menos
de 4 horas após sua manipulação, criando uma barreira praticamente
impermeável
47
. Foi demonstrado que, além de radiopacidade satisfatória e baixa
solubilidade, este cimento apresenta pH elevado (10,2 a 12,5)
48
, o qual pode
contribuir para a formação de tecido mineralizado quando o material é usado para
retrobturação
51,52
.
Como o MTA é recomendado para aplicação sobre os tecidos periodontal,
ósseo e pulpar, é importante conhecer seus efeitos citotóxicos e suas propriedades
biológicas. Dentro desse contexto, estudos in vitro mostraram a manutenção da
viabilidade e proliferação de células pulpares
27,44
e de fibroblastos do ligamento
periodontal e gengivais de humanos
6
quando em contato com o MTA. Em relação
aos osteoblastos, o MTA, assim como um cimento a base de hidróxido de cálcio
(Dycal), estimularam o crescimento celular, sugerindo que o cálcio liberado por
esses materiais tem a capacidade de regular o crescimento dessas células
45
. Em
Introdução
_______________________________________________________20
estudo usando cementoblastos, o MTA induziu a proliferação celular e a
expressão de proteínas como fosfatase alcalina, osteocalcina e colágeno tipo I, as
quais estão relacionadas com o processo de cementogênese
46
.
Estudos in vivo
1,52
mostraram formação de cemento sobre o MTA quando
este foi usado como material retrobturador. Também foi observado que, quando
em contato com o tecido conjuntivo subcutâneo de ratos, tanto o MTA quanto o
hidróxido de cálcio, promoveram a deposição de granulações caracterizadas como
cristais de calcita, as quais são formadas a partir da reação do cálcio do material
com o dióxido de carbono do tecido conjuntivo
24
. Esta reação sugere uma resposta
pulpar semelhante ao hidróxido de cálcio quando da aplicação do MTA sobre este
tecido conjuntivo especializado.
O óxido de cálcio é um dos principais constituintes do MTA e, em
presença de umidade, promove a formação do hidróxido de cálcio, o qual é
responsável pelo pH altamente alcalino do material
24
e pode explicar a ação
antimicrobiana do MTA. Como o pH acima de nove tem a capacidade de inativar
enzimas da membrana celular de alguns microrganismos, há perda da atividade
biológica da membrana citoplasmática ou destruição de fosfolipídios ou ácidos
não-saturados, levando então, a danos na integridade da membrana
citoplasmática
12
.
O MTA apresenta atividade antibacteriana sobre algumas espécies
anaeróbias facultativas
49,53
, contudo, não inibe as anaeróbias estritas
49
. Em relação
a bactérias freqüentemente isoladas em canais radiculares de dentes com necrose
Introdução
_______________________________________________________21
pulpar e reação periapical, alguns trabalhos não mostraram ação antibacteriana do
cimento sobre E. faecalis
12,32,49
, E. coli
32,49
, S. aureus
12,32,49
e P. aeruginosa
12
.
Estudos recentes
22,25,28,39,41,42
sugeriram a associação da clorexidina (CHX)
com o MTA, na tentativa de aumentar o seu efeito antimicrobiano. A CHX é uma
molécula catiônica capaz de adsorver-se à parede celular bacteriana e unir-se a
moléculas carregadas negativamente (proteínas e lipopolissacarídeos), alterando a
permeabilidade da membrana com posterior precipitação de componentes
intracelulares microbianos
26
. Todavia, assim como demonstrado por diferentes
agentes químicos recomendados para irrigação de cavidades e canais
radiculares
9,21,34
, a CHX também apresenta efeitos citotóxicos definidos sobre
diferentes linhagens celulares
7,8,16,20,23,31,37,40
. Experimentos in vitro realizados
com fibroblastos humanos observaram que esses efeitos citotóxicos podem
também inibir a síntese protéica
20,31,37
. No entanto, o efeito tóxico dessa
substância é dependente do tempo de exposição e concentração utilizada
23
.
A CHX a 0,12% aumenta a atividade antimicrobiana do MTA sobre os
microrganismos: E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, S. sanguis, A.
odontolyticus, F. nucleatum e C. albicans
41
. Entretanto, na mesma concentração
induz, in vitro, aumento na apoptose de macrófagos e fibroblastos
22
, sugerindo
que essa mistura pode, in vivo, interferir na regeneração dos tecidos periapicais.
Todavia, ainda pouco se sabe sobre os efeitos citotóxicos e
antimicrobianos da associação MTA e CHX, principalmente quando diferentes
concentrações de CHX são adicionadas ao cimento. Assim, pesquisas nesta área
específica são de grande interesse a fim de determinar quais concentrações de
Introdução
_______________________________________________________22
CHX incorporadas ao MTA poderiam aumentar o potencial antimicrobiano do
cimento, sem causar danos celulares. Os dados obtidos in vitro poderiam
direcionar o desenvolvimento de pesquisas in vivo com o objetivo de fornecer
procedimentos clínicos e tratamentos mais seguros para o cirurgião-dentista e seus
pacientes.
Proposição
__________________________________________________________
PROPOSIÇÃO
PROPOSIÇÃO GERAL
Avaliar a atividade antibacteriana e a citotoxicidade do agregado de trióxido
mineral (MTA-Branco, Angelus
®
Indústria de Produtos Odontológicos Ltda.,
Londrina, PR, Brasil) associado a diferentes concentrações de clorexidina (CHX).
PROPOSIÇÃO ESPECÍFICA
1. Avaliar o potencial antibacteriano do MTA (MTA-Branco, Angelus
®
Indústria
de Produtos Odontológicos Ltda., Londrina, PR, Brasil) associado a diferentes
concentrações de clorexidina, por meio do teste de difusão em ágar, sobre os
microrganismos Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa e Enterococcus faecalis.
2. Avaliar a citotoxicidade do MTA (MTA-Branco, Angelus
®
Indústria de
Produtos Odontológicos Ltda., Londrina, PR, Brasil) associado a diferentes
concentrações de clorexidina sobre cultura de fibroblastos por meio das análises
do metabolismo e da morfologia celular.
Artigo 1
_________________________________________________________48
Atividade antibacteriana do agregado de trióxido mineral
associado a diferentes concentrações de clorexidina
Autores: Indri Nogueira
1
, Juliana O. Gondim
1
, Antonio C. Pizzolitto
2
, Carlos
A. S. Costa
3
, Elisa M. A. Giro
1*
1
Departamento de Clínica Infantil, Faculdade de Odontologia de Araraquara –
UNESP, Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brasil.
2
Departamento de Microbiologia Clínica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas
de Araraquara – UNESP, Rua Expedicionários do Brasil, 1621, Araraquara, SP,
Brasil.
3
Departamento de Fisiologia e Patologia, Faculdade de Odontologia de
Araraquara – UNESP, Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brasil.
* Autor para correspondência
Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP
Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brasil. 14801-903
Phone: +55 16 33016336
E-mail: [email protected]
Artigo 1
_________________________________________________________25
Resumo
O objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, o efeito antibacteriano de uma
formulação de agregado de trióxido mineral (MTA) associado a diferentes
concentrações de clorexidina (CHX). Para esta avaliação, foi empregado o método
de difusão em ágar, utilizando os microrganismos Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Enterococcus faecalis. Em placas de
Petri contendo a suspensão bacteriana misturada ao meio de cultura, foram
confeccionados poços com 4 mm de diâmetro e 5 mm de profundidade, os quais
foram preenchidos com o MTA preparado com água destilada estéril ou com
CHX em diferentes concentrações (0,06%, 0,12%, 0,2% e 1%), totalizando 10
poços para cada associação. As placas foram incubadas em condições de
aerobiose a 37ºC por 24 horas e os halos de inibição de crescimento dos
microrganismos foram medidos em milímetros. Os dados obtidos foram
analisados estatisticamente utilizando o teste de Kruskal-Wallis complementado
pelo teste de Mann-Whitney, com nível de significância de 5% (α=0,05). A adição
de CHX 1% ao MTA aumentou a atividade antibacteriana do cimento sobre S.
aureus (p< 0,05). Para E. coli e P. aeruginosa não houve diferença estatística em
relação aos diâmetros dos halos de inibição para todos os materiais estudados
(p>0,05). Para o E. faecalis, MTA + CHX 0,2% e MTA + CHX 1% apresentaram
menores halos de inibição quando comparados aos demais grupos (p<0,05).
Baseado nas condições experimentais deste trabalho pôde-se concluir que a adição
de CHX ao MTA: 1) aumentou a atividade antibacteriana para o microrganismo S.
aureus apenas na concentração de 1%; 2) não melhorou a atividade antibacteriana
do cimento sobre E. coli e P. aeruginosa; 3) promoveu redução da atividade
antibacteriana sobre o E. faecalis, nas maiores concentrações estudadas.
Palavras-chave: Bactérias; clorexidina; endodontia; materiais dentários;
microbiologia.
Artigo 1
_________________________________________________________26
Introdução
A persistência de microrganismos no sistema de canais radiculares e nos
túbulos dentinários após o tratamento endodôntico convencional, geralmente está
associada ao insucesso, com o desenvolvimento de lesão periapical crônica (1, 2).
Nestes casos, quando não é possível o retratamento dos canais radiculares, a
intervenção cirúrgica parendodôntica associada à retrobturação torna-se necessária
para a manutenção do dente na cavidade bucal (3).
Dentre os materiais indicados para a retrobturação, o Agregado de
Trióxido Mineral (MTA), composto por silicato, aluminato e óxido de tricálcio,
além de óxido de silicato e bismuto, tem sido amplamente utilizado (4). Estudos
comparando o MTA ao amálgama e a cimentos à base de óxido de zinco e
eugenol, mostraram que o MTA apresenta melhor adesão às paredes dentinárias e
melhor adaptação marginal (5), proporcionando melhor selamento apical (6) e,
conseqüentemente, menor microinfiltração bacteriana (7). Outras propriedades
favoráveis também foram observadas como baixa solubilidade (4), boa
radiopacidade (4), adequada expansão quando em contato com a umidade (7),
força de compressão semelhante ao amálgama (6) e, adequada biocompatibilidade
(3, 6, 8).
Além dessas propriedades, um material retrobturador deve possuir
atividade antibacteriana a fim de evitar que bactérias remanescentes do sistema de
canais radiculares reinfectem a região periapical ou invadam o cemento via
periápice determinando a persistência da lesão crônica (9).
Artigo 1
_________________________________________________________27
O MTA preparado com água destilada estéril apresenta efeito
antibacteriano o qual pode ser atribuído, em parte, ao seu elevado pH, que
aumenta de 10,2 imediatamente após a manipulação para aproximadamente 12,5
em cerca de três horas, permanecendo, então, constante por tempo prolongado
(10). Entretanto, este material não apresenta adequada atividade antibacteriana
sobre algumas bactérias encontradas no sistema de canais radiculares de dentes
infectados, como por exemplo, Enterococcus faecalis (9, 11), Staphylococcus
aureus (9, 11), Escherichia coli (9, 11) e Pseudomonas aeruginosa (11).
Com o objetivo de melhorar a atividade antibacteriana do MTA, a água
destilada usada durante a manipulação tem sido substituída pela CHX (12-14). A
CHX possui propriedade de adsorver-se a substratos aniônicos da parede celular
de bactérias sendo liberada lentamente (substantividade). Desta forma, causa a
quebra de componentes intracelulares e a coagulação e precipitação do
citoplasma, provendo um efeito antibacteriano de longa duração (15). Devido às
suas propriedades catiônicas, a clorexidina também se adere à hidroxiapatita da
dentina (16) e a liberação gradual desta protege a região contra a colonização de
microrganismos (17).
Apesar da CHX mostrar-se efetiva in vitro contra a maioria das espécies
microbianas encontradas em canais radiculares infectados (18), pouco é conhecido
com relação às propriedades antibacterianas da associação MTA/CHX. Desta
forma, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito antibacteriano do MTA
associado a diferentes concentrações de CHX sobre as espécies Staphylococcus
aureus (ATCC - 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC - 27853), Escherichia
Artigo 1
_________________________________________________________28
coli (ATCC - 25922) e Enterococcus faecalis (ATCC - 29262), as quais são
freqüentemente identificadas em infecções de canais radiculares e na ocorrência
de lesões periapicais refratárias.
Material e Métodos
Os materiais utilizados neste estudo assim como sua composição,
quantidade usada na preparação e respectivos fabricantes estão apresentados na
Tabela 1.
Para a avaliação in vitro da atividade antibacteriana do MTA (MTA-
Branco - Angelus
®
Indústria de Produtos Odontológicos Ltda., Londrina, PR,
Brasil) associado a diferentes concentrações de CHX (0,06%, 0,12%, 0,2% e 1%)
(HENRIFARMA Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda., São Paulo, SP,
Brasil) foi utilizado o teste de difusão em ágar. A atividade antibacteriana foi
testada sobre os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus (ATCC -
25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC - 27853), Escherichia coli (ATCC -
25922) e Enterococcus faecalis (ATCC - 29262).
As cepas bacterianas foram semeadas em caldo Müller-Hinton (Acumedia
Manufacturers, Inc. Baltimore, Maryland, USA) e permaneceram por 24 horas em
estufa bacteriológica a 37ºC para obtenção de suspensão padrão com turbidez
correspondente a 0,5 da escala de MacFarland, aproximadamente 1,5x10
8
UFC/mL de meio de cultura.
Para a realização do teste de difusão foram usadas cinco placas de Petri
(20 x 100 mm) para cada microrganismo, nas quais
foram vertidos 20 mL de ágar
Artigo 1
_________________________________________________________29
Müller-Hinton a 45ºC, acrescidos de 300 µL do inóculo bacteriano. Após
solidificação (aproximadamente 30 minutos), em cada placa, foram
confeccionados cinco poços eqüidistantes (um para cada material) com 4 mm de
diâmetro e 5 mm de profundidade (Figura 1 - Anexo), de forma que cada uma das
placas recebesse todos os materiais estudados. O experimento foi realizado em
duplicata.
Para todos os grupos, os materiais foram manipulados sob condições
assépticas, na proporção de 100 mg de pó/30 µL de líquido, sendo que o grupo G1
(MTA + água destilada estéril) foi utilizado como grupo controle. Nos grupos G2
a G5, a água destilada foi substituída pelas soluções de CHX em diferentes
concentrações (G2 = MTA + CHX 0,06%; G3 = MTA + CHX 0,12%; G4 = MTA
+ CHX 0,2%; G5 = MTA + CHX 1%).
Após manipulação, os materiais foram inseridos com auxílio de insersor e
condensador de amálgama previamente esterilizados, nos poços confeccionados
nas placas de Petri até seu completo preenchimento (Figura 2 - Anexo).
Para a pré-difusão dos materiais, as placas foram mantidas em temperatura
ambiente por uma hora e depois foram incubadas a 37ºC por 24 horas em
condições de aerofilia. Em seguida, com auxílio de um paquímetro digital
(Mytutoyo Sul Americana Ltda., SP, BR), foi realizada a medição do diâmetro
dos halos de inibição em milímetros. As medidas foram determinadas a partir de
dois pontos opostos localizados nos limites mais externos do halo de inibição
formado ao redor de cada poço, incluindo a medida do diâmetro do poço (Figura 3
- Anexo). Para assegurar que não havia crescimento bacteriano na região
Artigo 1
_________________________________________________________30
correspondente aos halos, as placas foram avaliadas em microscópio de luz
(Olympus, modelo VT-II, Tokyo, Japão), com aumento de 20 vezes.
Os dados foram avaliados quanto à normalidade e homogeneidade de
variâncias. Como a distribuição destes não obedeceu à curva de normalidade e não
houve homogeneidade de variâncias, foi aplicado o teste não paramétrico de
Kruskal-Wallis para comparação dos halos de inibição dos diferentes materiais
para um mesmo microrganismo e, também, para comparação dos halos de inibição
de cada material para os diferentes microrganismos. Quando a hipótese nula de
igualdade entre os grupos foi rejeitada, testes de Mann-Whitney foram aplicados
para identificar as diferenças. Para todos os testes estatísticos aplicados foi
considerado o nível de significância de 5% (α = 0,05).
Resultados
Os valores das medianas, assim como os valores mínimo e máximo das
medidas dos diâmetros dos halos de inibição de cada material estudado de acordo
com a cepa bacteriana estão apresentados na Tabela 2.
Comparando os diferentes materiais para cada microrganismo usado no
estudo, pôde-se observar que para o S. aureus, o grupo G5 (MTA + CHX 1%)
promoveu o maior halo de inibição (p<0,05) em relação aos demais grupos (G1 =
MTA + H
2
O; G2 = MTA + CHX 0,06%; G3 = MTA + CHX 0,12% e G4 = MTA
+ CHX 0,2%), os quais não apresentaram diferenças estatisticamente significantes
entre si (p>0,05). Para E. coli e P. aeruginosa não houve diferença estatística
significante em relação aos diâmetros dos halos de inibição para todos os
Artigo 1
_________________________________________________________31
materiais estudados (p>0,05). Para E. faecalis, o grupo G5 apresentou diâmetro de
halo de inibição inferior aos grupos G1 a G3 (p<0,05) e semelhante ao grupo G4
(p>0,05), o qual não diferiu dos demais grupos (p>0,05).
A comparação do diâmetro dos halos de inibição de cada material em
relação aos diferentes microrganismos mostrou que para os grupos G1 e G2, os
halos de inibição observados para a E. coli foram semelhantes àqueles da P.
aeruginosa (p>0,05) e menores do que os apresentados pelo S. aureus e E.
faecalis (p<0,05). Para os grupos G3 e G4, os halos de inibição foram
significantemente maiores para o S. aureus (p<0,05), seguido pelo E. faecalis e
pela P. aeruginosa, a qual não apresentou diferença em relação a E. coli. Para o
grupo G5, os halos de inibição para o S. aureus foram significantemente maiores
daqueles apresentados pelos demais microrganismos (p<0,05), os quais não
apresentaram diferenças entre si (p>0,05).
Discussão
Neste estudo, para avaliar a atividade antibacteriana do MTA associado à
água destilada estéril ou à clorexidina em diferentes concentrações, foi empregado
o método de difusão em ágar, usando a técnica de confecção de poços. Esse
método é comumente usado para avaliar a atividade antimicrobiana de materiais
endodônticos (19, 20) . Porém, alguns fatores como controle e padronização da
densidade do inóculo, meio de cultura, seleção dos microrganismos, temperatura
de incubação das placas e pontos de leitura dos halos de inibição podem afetar a
dinâmica e a variabilidade de testes de difusão (21). Também devem ser
Artigo 1
_________________________________________________________32
consideradas a solubilidade e a capacidade de difusão dos materiais em ágar (11,
22), a área de contato entre o ágar e o material experimental, o peso molecular do
agente antimicrobiano, a concentração do material em teste, a viscosidade do gel
de ágar, a concentração iônica do material em relação ao meio (20) e a toxicidade
da substância teste para cada bactéria (19).
Durante a mistura para obtenção dos materiais utilizados no presente
estudo, foi observada consistência semelhante, porém, não foram realizados testes
químicos para analisar a interação dos componentes do cimento MTA com as
diferentes concentrações de CHX, as quais podem ter modificado algumas
propriedades do cimento, como por exemplo a sua difusão. Em adição,
substâncias que agem por meio de seus altos valores de pH, como ácidos e bases,
podem ter sua atividade alterada pela capacidade de neutralização do meio de
cultura (23). Além disso, devido ao MTA possuir baixa solubilidade (4), este não
se difunde muito bem em ágar e requer um longo período para alcalinizar o meio
(23).
Em relação aos microrganismos utilizados neste estudo, estes foram
selecionados por serem isolados com freqüência em canais infectados (1, 24-26) e
por terem sido, também, utilizados em outras pesquisas que avaliaram a ação
antimicrobiana do MTA e da CHX (2, 4, 11-13, 21, 23). O E. faecalis, em
particular, foi estudado por ser o microrganismo mais freqüentemente isolado em
casos de dentes com lesões periapicais refratárias (1, 26) e por estabelecer
infecções de difícil tratamento (27).
Artigo 1
_________________________________________________________33
Os resultados do presente trabalho mostraram que todos os materiais
avaliados, inclusive o MTA com água destilada, apresentaram efeito
antibacteriano sobre as cepas utilizadas. Porém, esses resultados diferem daqueles
observados nos trabalhos de Torabinejad et al. (9) e Estrela et al. (11), nos quais o
MTA não mostrou atividade antibacteriana sobre E. faecalis, S. aureus, E. coli e
P. aeruginosa. No trabalho realizado por Torabinejad et al. (9), além de o MTA
ser de procedência diferente daquele utilizado no presente estudo, foi empregada a
técnica de colocação direta do material sobre a superfície do ágar, diferentemente
da metodologia utilizada neste trabalho, onde poços foram confeccionados no ágar
e os materiais foram condensados, reproduzindo o volume exato de MTA por
amostra e proporcionando uma maior superfície de contato do material com o
meio inoculado com cada uma das cepas bacterianas. Estrela et al. (11), utilizando
metodologia semelhante à do presente estudo, verificaram que o MTA apresentou
somente halos de difusão para os microrganismos S. aureus, E. faecalis e P.
aeruginosa. O MTA Pro-Root
®
(Dentsply - Tulsa Dental, OK, USA) utilizado no
estudo de Estrela et al. (11) difere do MTA-Branco (Angelus
®
Indústria de
Produtos Odontológicos Ltda., Londrina, PR, Brasil) utilizado neste estudo com
relação às porcentagens de Silício e Ferro (maiores para o primeiro) e de Cálcio
(maior para o MTA-Branco – Angelus
®
), o que pode em algum grau influenciar
os resultados.
No presente estudo, para S. aureus, bactéria gram-positiva, foi observado
maior halo de inibição em relação às outras cepas. E. faecalis, também bactéria
gram-positiva, apresentou halos de diâmetros intermediários, enquanto, os
Artigo 1
_________________________________________________________34
menores halos, foram obtidos para E.coli e P. aeruginosa, bactérias gram-
negativas. Essas diferenças de comportamento podem ser justificadas devido aos
distintos graus de resistência inerentes a cada bactéria. A menor resistência de
bactérias gram-positivas quando comparadas às gram-negativas pode estar
relacionada às diferenças nas paredes celulares destes microrganismos (28). O E.
faecalis apesar de ser uma bactéria gram-positiva é capaz de sobreviver em pH
extremamente alcalino, em torno de 11,1 (29). Como o pH do MTA permanece
altamente alcalino (entre 10,2 e 12,5) por um longo período de tempo, este parece
contribuir para a zona de inibição observada inclusive no grupo MTA associado a
água destilada estéril (13).
Comparando os diâmetros dos halos de inibição das diferentes associações
empregadas neste estudo, observou-se que para o S. aureus, o grupo G5 (MTA +
CHX 1%) apresentou maior halo de inibição em relação aos demais grupos
(p<0,05), sendo estes semelhantes entre si (p>0,05). Entretanto, para E. coli e P.
aeruginosa, não houve diferença estatística entre os grupos (p>0,05) e, para o E.
faecalis, os halos de inibição relacionados aos grupos G4 (MTA + CHX 0,2%) e
G5 (MTA + CHX 1%) foram menores quando comparados com os demais
(p<0,05).
Os resultados observados neste trabalho concordam parcialmente com
aqueles apontados por Stowe et al. (12), que compararam a associação MTA +
água destilada com MTA + CHX 0,12%, observando aumento do halo de inibição
sobre E. coli, S. aureus, E. faecalis e halo de inibição igual ou menor sobre a P.
aeruginosa com a associação MTA + CHX 0,12%. As diferenças nos resultados
Artigo 1
_________________________________________________________35
podem ser explicadas pela maior quantidade de solução de CHX incorporada ao
MTA por Stowe et al. (12) (36µL) do que no presente estudo (30 µL), e às
diferenças na composição do MTA utilizado (MTA Pro-Root
®
e MTA-Branco
Angelus
®
).
Em um estudo testando a atividade antibacteriana de medicamentos usados
intracanal, entre eles a CHX 0,12% e 0,2%, Barbosa et al. (1997) (30) observaram
maior halo de inibição sobre S. aureus, P. aeruginosa e E. faecalis com a CHX
0,2%. Resultado diferente foi observado no presente estudo, no qual a CHX
misturada ao MTA nas concentrações de 0,12% e 0,2%, não apresentaram
diferença significativa no tamanho dos halos de inibição para os mesmos
microrganismos. Este resultado sugere uma interação da CHX com o cimento,
alterando sua difusão e, conseqüentemente, o tamanho dos halos de inibição
quando comparados com aqueles obtidos por Barbosa et al. (1997) (30) com a
solução de clorexidina isoladamente.
O MTA parece possuir mecanismo de ação semelhante ao apresentado
pelo hidróxido de cálcio com relação à atividade antibacteriana (10) e à formação
de barreira mineralizada (31, 32). Isso pode ser justificado pelo fato do óxido de
cálcio presente no MTA quando em contato com os fluidos tissulares, promover a
formação de silicato de cálcio e hidróxido de cálcio (4). Em estudo realizado por
Lynne et al. (33), no qual foi avaliada a atividade antibacteriana do hidróxido de
cálcio, da solução de CHX a 0,12% (Peridex
®
) e da associação destes sobre E.
faecalis em amostras de dentina infectadas, a solução de hidróxido de cálcio
apresentou maior atividade antibacteriana em comparação à solução de CHX e à
Artigo 1
_________________________________________________________36
associação de ambos. Esses resultados foram explicados pela neutralização das
propriedades do hidróxido de cálcio pela CHX, além de, provavelmente, esta ter
afetado as propriedades físicas e químicas do hidróxido de cálcio, assim como a
sua capacidade de dissociação. Zerella et al. (34) mostraram em estudo utilizando
absorbância de luz ultravioleta, que mais de 99% da CHX precipitava na presença
do hidróxido de cálcio e que a dissociação da CHX em meio aquoso é menor em
pH básico, ou seja, a maioria as moléculas de CHX na presença de hidróxido de
cálcio não sofreram dissociação. Os autores sugeriram que a CHX sofre
desprotonação dos grupos guanidina em pH maior que oito gerado pelo hidróxido
de cálcio em meio aquoso, e que isso seria responsável pela redução da ação
antimicrobiana da CHX associada ao hidróxido de cálcio. Como o MTA tem
mecanismo de ação e pH semelhantes ao hidróxido de cálcio, é provável que,
também, provoque uma redução da atividade antibacteriana da CHX.
Em estudo avaliando a influência do hidróxido de cálcio sobre a
fragmentação do digluconato de CHX por meio de espectrometria de massa, foi
constatado que na mistura do digluconato de CHX a 0,2% com o hidróxido de
cálcio, não foi encontrada a CHX, indicando a sua total fragmentação (35). O
autor sugere que o efeito antimicrobiano observado por alguns estudos para essa
associação de medicamentos não se deve à CHX e sim à ação dos diferentes
subprodutos de sua fragmentação.
Baseado nessas informações, pode-se inferir que o mesmo possa ter
ocorrido quando da associação do MTA à CHX em concentrações crescentes de
0,06% a 1%, resultando em ausência de diferença estatística com relação ao
Artigo 1
_________________________________________________________37
tamanho dos halos de inibição para E. coli e P. aeruginosa e em menores halos de
inibição sobre o E. faecalis quando comparados ao MTA manipulado com água
destilada.
Conclusão
Todos os materiais em teste apresentaram atividade antibacteriana
manifestada por meio da presença de halo de inibição. A adição de CHX ao MTA
determinou aumento da atividade antibacteriana para o microrganismo S. aureus
apenas na concentração de 1%; não melhorou a atividade antibacteriana do
cimento sobre E. coli e P. aeruginosa e promoveu redução da atividade
antibacteriana sobre o E. faecalis, nas maiores concentrações estudadas.
Agradecimentos
À Angelus
®
Indústria de Produtos Odontológicos Ltda, pelo fornecimento do
MTA e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
CNPq (Processo: 301029/2007-5) pelo suporte financeiro para a realização desta
pesquisa.
Artigo 1
_________________________________________________________38
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Artigo 1
_________________________________________________________43
Tabela 1 - Apresentação dos materiais utilizados no estudo (composição,
fabricante e quantidade utilizada na preparação do cimento)
Material Composição
Fabricante
Quantidade
MTA
Branco
SiO
2
; K
2
O; Al
2
O
3
; Na
2
O; Fe
2
O
3
;
SO
3
; CaO; Bi
2
O
3
; MgO e resíduos
insolúveis (sílica cristalina, óxido
de cálcio e sulfato de potássio e
sódio)
Angelus
®
Indústria de
Produtos Odontológicos
Ltda,Londrina, PR, Brasil
100 mg
Clorexidina
Solução aquosa de
gluconato de clorexidina
HENRIFARMA Produtos
Químicos e Farmacêuticos
Ltda, São Paulo, SP,
Brasil
30µL
Água
Destilada
Estéril
----
Laboratório de Fisiologia
e Patologia Experimental
Faculdade de Odontologia
de Araraquara - UNESP
30µL
Artigo 1
_________________________________________________________44
Tabela 2 – Diâmetro do halo de inibição (mm) obtido de acordo com a cepa
bacteriana e o material estudado (mediana, mínimo e máximo)
G1
G2
MATERIAL
G3
G4
G5
CEPA
BACTERIANA
MTA
+
H2O
MTA
+
CHX 0,06%
MTA
+
CHX 0,12%
MTA
+
CHX 0,2%
MTA
+
CHX 1%
S. aureus
(ATCC - 25923)
13,7 (13,1 - 15,4)
A b
14 (13,1 - 14,6)
A b
14,3 (13,2 - 14,7)
A b
14 (13 - 14,7)
A b
14,9 (13,9 - 15,5)
A a
E. coli
(ATCC - 25922)
11,8 (11,3 - 13,5)
B a
11,9 (11,1 - 13)
B a
12 (11,2 - 13)
C a
12,2 (11,2 - 12,7)
C a
12,5 (11,7 - 13,3)
B a
P.aeruginosa
(ATCC - 27853)
12,8 (11,3 - 14,5)
AB a
12,4 (11,1 - 13)
AB a
12,7 (11,4 - 14,5)
BC a
12,8 (11,2 - 13,7)
BC a
12,4 (11,8 - 14,3)
B a
E. faecalis
(ATCC - 29262)
13,5 (12,5 - 14,6)
A a
13,8 (13,2 - 14,6)
A a
13,4 (12,5 - 14,4)
B a
13,1 (12,1 - 14,4)
B ab
12,5 (12 - 14)
B b
* Valores seguidos por letras maiúsculas iguais nas colunas e letras minúsculas iguais nas linhas
não apresentam diferença estatisticamente significante (Mann-Whitney, p>0,05).
Artigo 2
__________________________________________________________45
Efeito citotóxico do agregado de trióxido mineral associado à
clorexidina sobre cultura de fibroblastos
Autores: Indri Nogueira
1
, Fernanda C. R. Lessa
1
, Carlos A. S. Costa
2
,
Elisa M. A. Giro
1*
1
Departamento de Clínica Infantil, Faculdade de Odontologia de Araraquara –
UNESP, Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brasil.
2
Departamento de Fisiologia e Patologia, Faculdade de Odontologia de
Araraquara – UNESP, Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brasil.
* Autor para correspondência
Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP
Rua Humaitá, 1680, Araraquara, SP, Brasil. 14801-903
Phone: +55 16 33016336
E-mail: [email protected]
Artigo 2
__________________________________________________________46
Resumo
O objetivo desse estudo in vitro foi avaliar a citotoxicidade de uma
formulação de agregado de trióxido mineral (MTA) associado a diferentes
concentrações de clorexidina (CHX) sobre cultura de fibroblastos (MPDL). Para
isto, corpos de prova com 4 mm de diâmetro e 2 mm de espessura foram
preparados com cada uma das associações: MTA + água destilada (G1), MTA +
CHX 0,06% (G2), MTA + CHX 0,12% (G3), MTA + CHX 0,2% (G4) e MTA +
CHX 1% (G5). Os corpos de prova foram imersos individualmente em recipientes
contendo 1,1 mL de meio de cultura DMEM, onde permaneceram por 24 horas ou
por 7 dias para a obtenção dos extratos. Fibroblastos do ligamento periodontal de
camundongos (20.000 células/cm
2
) foram semeados em compartimentos de placas
para cultura de células de 24 compartimentos e incubados por 48 horas a 37ºC
com 5% de CO
2
e 95% de ar. Decorrido este período, o meio de cultura de cada
compartimento foi substituído por 1 mL dos extratos dos materiais e as células
foram incubadas por mais 24 horas. O meio de cultura (DMEM) foi usado como
grupo controle negativo (G6). A citotoxicidade foi avaliada pela análise do
metabolismo celular (teste do MTT) e pela análise da morfologia celular em
microscopia eletrônica de varredura. Para os extratos de 24 horas houve redução
do metabolismo celular de 11,87%; 23,63%; 21,87%; 34,64% e 83,01%,
respectivamente, para os grupos G1 a G5. Para os extratos de sete dias, a redução
foi de 61,35%; 71,45%; 75,43%; 81,26% e 86,13%, respectivamente. Para ambos
os períodos de obtenção dos extratos, o metabolismo celular foi estatisticamente
menor para todos os grupos experimentais quando comparados com o grupo
controle (p<0,05). O menor efeito citotóxico foi observado para G1 (p<0,05),
seguido pelos grupos G2 e G3, que não apresentaram diferença estatisticamente
significante entre si (p>0,05). Os grupos G4 e G5 apresentaram os maiores efeitos
citotóxicos (p<0,05), sendo G5 mais citotóxico do que G4 tanto para o extrato de
24 horas quanto de 7 dias. A análise em microscopia eletrônica de varredura
demonstrou que o aumento da concentração de clorexidina incorporada ao MTA
resultou em uma redução do número de células aderidas ao substrato de vidro e
marcante alteração na morfologia celular. Baseado nas condições experimentais
deste trabalho, pode-se concluir que, independente do tempo de obtenção dos
extratos, quanto maior a concentração de CHX incorporada ao MTA, mais tóxico
o cimento para os fibroblastos do ligamento periodontal de camundongos (MDPL)
e o extrato de 7 dias foi mais citotóxico que o extrato de 24 horas.
Palavras-chave: Clorexidina; endondontia; fibroblastos; materiais
biocompatíveis; viabilidade celular.
Artigo 2
__________________________________________________________47
Introdução
A cirurgia parendodôntica é indicada em casos de patologia perirradicular
persistente, sendo que o material retrobturador ideal deve promover selamento
adequado do periápice, apresentar boa adesão à estrutura dental, baixa
solubilidade, estabilidade dimensional e ser antimicrobiano (1, 2). Além destas
propriedades, por permanecer em contato com a região periapical, o material
retrobturador deve ser biocompatível (1) e permitir o reparo dos tecidos
periapicais pela neoformação de cemento, ligamento periodontal e osso alveolar
(3-5).
Vários materiais para retrobturação têm sido utilizados no decorrer dos
anos, como o amálgama, cimentos a base de óxido de zinco e eugenol, guta-
percha, resina composta, cimentos de ionômero de vidro e compômeros (6).
Contudo, nenhum desses materiais preenche as propriedades desejáveis para um
material retrobturador ideal. O amálgama e os cimentos a base de óxido de zinco e
eugenol tiveram seu uso desestimulado por apresentarem várias características
desfavoráveis. Com a utilização do amálgama foram observadas: liberação de
mercúrio e outros íons, corrosão, manchamento, expansão tardia, infiltração
marginal e presença de reações inflamatórias agudas (1, 5, 7). Por outro lado, os
cimentos a base de óxido de zinco e eugenol, apresentam sensibilidade à umidade
com conseqüente solubilidade e são altamente tóxicos aos tecidos vivos (1, 4, 7,
8).
Diferentes formulações de agregado de trióxido mineral (MTA) foram
desenvolvidas com a finalidade de selar comunicações entre os canais radiculares
Artigo 2
__________________________________________________________48
e o periodonto (2), e, recentemente passaram a ser usadas também como
retrobturadores (2, 5, 9-14). Estudos in vivo têm mostrado a sua
biocompatibilidade com os tecidos perirradiculares, permitindo o reparo com
formação de cemento inclusive sobre o material (3-5, 8). Comparado ao
amálgama e aos cimentos a base de óxido de zinco e eugenol, o MTA apresenta
melhor selamento apical (2, 9) e adaptação às paredes dentinárias (12), baixa
citotoxicidade (7, 15), além de induzir menor reação inflamatória nos tecidos
periapicais adjacentes à área de ressecção radicular (3-5, 8).
O estímulo para a reparação tecidual depende da ausência de agentes
irritantes originários de produtos metabólicos bacterianos e da origem físico-
química dos materiais seladores (16). Apesar das várias propriedades apresentadas
pelas formulações de MTA, alguns estudos apontam que este material não
apresenta efeito antibacteriano sobre alguns microrganismos geralmente
encontrados em canais infectados, como o Enterococcus faecalis, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli (14, 17, 18).
Com o objetivo de melhorar a atividade antimicrobiana do MTA, tem sido
proposta a incorporação da clorexidina (CHX) a este material (19-21). Na
concentração de 0,12%, a CHX associada ao MTA, parece promover uma melhor
atividade antimicrobiana (19) sem alterar a capacidade seladora do material (20).
Porém, esta mesma concentração de CHX adicionada ao MTA, quando em
contato com fibroblastos de gengiva de camundongos e macrófagos, induziu
maior taxa de apoptose quando comparado ao MTA preparado com água destilada
(21). Todavia, os efeitos que a adição de diferentes concentrações de CHX ao
Artigo 2
__________________________________________________________49
MTA pode causar às células do ligamento periodontal ainda não estão
completamente elucidados.
Uma vez que o material retrobturador permanece em íntimo contato com
tecidos perirradiculares, sua citotoxicidade deve ser melhor avaliada antes da
realização de estudos in vivo. Visando a aplicação dessa associação de materiais
em procedimentos de retrobturação, o objetivo desse trabalho foi avaliar a
citotoxicidade de uma formulação de MTA (MTA-Branco - Angelus
®
Indústria de
Produtos Odontológicos Ltda., Londrina, PR, Brasil) preparado com diferentes
concentrações de CHX sobre cultura de fibroblastos do ligamento periodontal de
camundongos (MPDL), por meio da análise do metabolismo e morfologia celular.
Material e Métodos
Cultura das células
Para a avaliação da citotoxicidade da associação do MTA com diferentes
concentrações de CHX, foi utilizada linhagem estabelecida de fibroblastos do
ligamento periodontal de camundongos (MPDL). Em capela de fluxo laminar
vertical (Bio Protector Plus 12 – Veco, São Paulo, SP, Brasil), as células foram
semeadas em frascos de cultura esterilizados de 75 cm
2
(Costar Corp., Cambridge,
MA, USA), utilizando o meio de cultura Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
(DMEM, SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO, USA) suplementado com 10% de
soro fetal bovino (SFB - Cultilab, Campinas, SP, Brasil), 100 UI/mL de
penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 2 mmol/L de glutamina (GIBCO,
Artigo 2
__________________________________________________________50
Grand Island, NY, USA). Estas células foram mantidas em incubadora
umidificada a 37
o
C, com 5% de CO
2
e 95% de ar, sendo que repiques foram
realizados até a obtenção do número de células suficientes para a realização do
experimento. Em seguida, 2x10
4
células/cm
2
foram semeadas em placas de
acrílico esterilizadas de 24 compartimentos (Costar, Cambridge, MA, USA)
contendo 1 mL de meio de cultura DMEM suplementado. As placas foram
mantidas em incubadora a 37
o
C, com 5% de CO
2
e 95% de ar, durante 48 horas.
Confecção dos corpos de prova
Os materiais utilizados neste estudo assim como sua composição química e
respectivos fabricantes estão apresentados na Tabela 1.
O MTA-Branco (Agregado de Trióxido Mineral - Angelus
®
Indústria de
Produtos Odontológicos Ltda., Londrina, PR, Brasil)l foi manipulado utilizando-
se placa de vidro e espátula esterilizadas, na proporção de 100 mg de pó/30 µL de
líquido (recomendada pelo fabricante). No grupo G1, o MTA foi manipulado com
água destilada estéril. Nos grupos G2 a G5, a água destilada foi substituída pela
solução de CHX em diferentes concentrações (G2 = MTA + CHX 0,06%, G3 =
MTA + CHX 0,12%, G4 = MTA + CHX 0,2% e G5 = MTA + CHX 1%). Para o
preparo e padronização dos corpos de prova (4 mm de diâmetro e 2 mm de
espessura), foram utilizadas matrizes bipartidas de aço inoxidável esterilizadas.
Foram confeccionados 20 corpos de prova para cada grupo experimental, sendo
16 utilizados para a avaliação do metabolismo celular e 4 para a análise da
morfologia celular em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os corpos de
Artigo 2
__________________________________________________________51
prova permaneceram nas matrizes por 10 minutos em estufa umidificada a 37ºC
para reação de presa inicial do material. Em seguida, foram removidos das
matrizes e colocados individualmente em compartimentos de placas de acrílico
esterilizadas de 24 compartimentos, cada um contendo 1,1 mL de meio de cultura
DMEM sem soro fetal bovino. Metade dos corpos de prova permaneceram
submersos no meio de cultura por 24 horas e a outra metade por 7 dias em
incubadora a 37
o
C, com 5% de CO
2
e 95% de ar, para obtenção dos extratos dos
materiais, ou seja, o meio de cultura contendo os produtos liberados pelo material.
Como grupo controle negativo, foi utilizado o meio de cultura DMEM (G6).
Avaliação do metabolismo celular
A análise do metabolismo celular foi realizada por meio da demonstração
citoquímica da desidrogenase succínica (SDH), enzima que representa a taxa de
respiração mitocondrial das células viáveis. Para atingir este objetivo, foi utilizada
a análise colorimétrica do metiltetrazolium (teste do MTT) (22).
Após o período de 48 horas de incubação das células com o meio de
cultura, este foi substituído por 1 mL dos extratos de 24 horas ou de 7 dias. As
células em contato com esses extratos foram incubadas por mais 24 horas, nas
mesmas condições descritas.
Em seguida, oito espécimes de cada grupo tiveram os extratos substituídos
por 900 µL de meio de cultura DMEM e 100 µL de solução de MTT (5 mg/mL
em solução salina fosfatada tamponada). Após 4 horas de incubação a 37ºC, o
meio de cultura com a solução de MTT foi removido e cada compartimento
Artigo 2
__________________________________________________________52
recebeu 600 µL de solução de isopropanol acidificado em HCl a 0,04 N para
solubilizar os cristais de formazan formados. Três alíquotas de 100 µL de cada
compartimento foram transferidas para placas de 96 compartimentos (Costar
Corp., Cambridge, MA, USA). A coloração produzida foi quantificada por
espectrofotometria em Leitor Universal de ELISA (ELX 800 - Universal
Microplate Reader- BIOTEK Instruments, ICC, USA) em um comprimento de
onda de 570 nm. Os resultados foram obtidos por meio da média, em valores
numéricos, das três alíquotas de cada compartimento. Em seguida, o efeito
inibitório dos diferentes grupos estudados sobre o metabolismo celular foi
calculado em porcentagem, sendo que o grupo controle negativo (DMEM) foi
considerado como 100% do metabolismo celular.
Avaliação da morfologia celular
Para análise da morfologia celular em MEV foram utilizados dois
compartimentos de placas de acrílico de 24 compartimentos para cada grupo (G1
a G6) e período de obtenção dos extratos (24 horas e 7 dias). Na base de cada
compartimento foi posicionada uma lamínula de vidro esterilizada (Fisher
Scientific, Pittsburg, PA, USA) de 12 mm de diâmetro.
Foram semeadas 2x10
4
células/cm
2
em cada compartimento como descrito
anteriormente. Decorrido o período de 48 horas de incubação, o meio de cultura
de cada compartimento foi substituído pelos extratos obtidos dos materiais ou pela
solução controle (DMEM) e as placas foram mantidas por mais 24 horas em
incubadora.
Artigo 2
__________________________________________________________53
Em seguida, os extratos e o controle foram aspirados e, os compartimentos
contendo as lamínulas de vidro com as células aderidas foram lavados com PBS.
Em seguida, as células foram fixadas por 2 horas em glutaraldeído 2,5% (1 mL
por compartimento), submetidas à lavagem por três vezes com 1 mL de PBS (5
minutos cada lavagem), pós-fixação em 200 µL de tetróxido de ósmio a 1% por
60 minutos, lavagem por duas vezes em 1 mL de PBS (5 minutos cada lavagem) e
por duas vezes com 1 mL de água deionizada (15 minutos cada lavagem). As
células foram, então, desidratadas em etanol 30%, 50% e 70%, por 30 minutos em
cada solução e em etanol 95% e 100% por duas vezes de 30 minutos. Em seguida,
as lamínulas foram mantidas em 200 µL de HMDS (Hexametil-disiloxano –
ACROS ORGANICS, New Jersey, USA), um solvente de baixa tensão superficial
que auxilia na secagem das células, sendo realizadas três trocas de 20 minutos
cada.
As lamínulas de vidro com as células aderidas foram, então, removidas dos
recipientes de acrílico e fixadas em stubs metálicos, os quais permaneceram em
dessecador por 12 horas. Em seguida, procedeu-se a metalização dos espécimes
com ouro, sendo que a morfologia celular foi avaliada em microscópio eletrônico
de varredura (ZEISS, model DSM-940A, Oberkochen, Germany). A análise da
morfologia celular foi realizada de forma descritiva.
Artigo 2
__________________________________________________________54
Tratamento estatístico dos dados
O conjunto de dados referentes ao metabolismo celular foi avaliado quanto
à distribuição e homogeneidade de variância. Como a distribuição dos dados não
foi normal e não houve homogeneidade de variâncias, foram utilizados os testes
não-paramétricos de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney para a realização das
inferências. Todos os testes estatísticos foram considerados ao nível de
significância de 5% (α = 0,05).
Resultados
As medianas dos valores da absorbância referentes ao metabolismo
celular, assim como os valores mínimo e máximo estão apresentadas na Tabela 2.
A redução percentual média do metabolismo celular está apresentada nas Figuras
1 e 2, para os extratos de 24 horas e de 7 dias, respectivamente.
Para os extratos obtidos no período de 24 horas, a redução percentual do
metabolismo celular foi de 11,87%; 23,63%; 21,87%; 34,64% e 83,01%, para os
grupos G1 a G5, respectivamente. O grupo G1 apresentou menor redução do
metabolismo celular em relação ao grupo controle (G6), quando comparado aos
demais grupos (p<0,05). Os grupos G2 e G3 foram estatisticamente semelhantes
(p>0,05) e, apresentaram menor porcentagem de redução do metabolismo celular
quando comparados aos grupos G4 e G5. O grupo G5, por sua vez, foi o grupo
que apresentou maior taxa de redução do metabolismo celular.
Artigo 2
__________________________________________________________55
Para os extratos de 7 dias, a redução do metabolismo celular foi de
61,35%; 71,45%; 75,43%; 81,26% e 86,13%, respectivamente, para os grupos G1
a G5.
Em relação à análise realizada por meio da microscopia eletrônica de
varredura, no grupo controle (G6 - DMEM) observou-se grande número de
células MPDL aderidas ao substrato de vidro (Figuras 3A e 5A), as quais exibiam
características morfológicas típicas como forma achatada, superfície lisa e longos
prolongamentos citoplasmáticos fortemente aderidos à superfície da lamínula de
vidro (Figura 4A e 6A). Quando o extrato de 24 horas foi colocado em contato
com as células, no grupo G1 (MTA + água destilada) observou-se uma redução no
número de células MPDL, as quais apresentavam-se dispostas sobre toda a
lamínula de vidro formando em algumas regiões pequenos agrupamentos (Figura
3B). Morfologicamente (Figura 4B), as células mostraram características
semelhantes às do grupo controle (Figura 4A). Nos grupos G2 (MTA + CHX
0,06%) e G3 (MTA + CHX 0,12%), também houve redução do número de
fibroblastos em relação ao grupo controle. Assim como em G1, observou-se, para
estes grupos, formação de agrupamentos, porém, com menor densidade celular
(Figuras 3C e 3D). Os fibroblastos apresentavam-se com volume diminuído e
morfologia estrelada, exibindo longos prolongamentos citoplasmáticos sobre o
substrato de vidro (Figuras 4C e 4D). No Grupo G4 (MTA + CHX 0,2%), as
células estavam presentes em menor número e com volume reduzido em relação
aos grupos G2 e G3, e foram observados poucos agrupamentos celulares sobre a
lamínula de vidro (Figura 3E). A presença de poucos prolongamentos
Artigo 2
__________________________________________________________56
citoplasmáticos alongados e afilados foi notada neste grupo, sendo que restos
citoplasmáticos de células mortas permaneceram aderidos ao substrato de vidro
(Figura 4E). No Grupo G5 (MTA + CHX 1%) não foi observada a presença de
fibroblastos, mas apenas de pequenas estruturas com formato irregular (Figura
3F), sugestivas de fragmentos de componentes celulares.
Para os extratos de 7 dias, as alterações foram mais acentuadas quando
comparadas com aquelas observadas para os extratos de 24 horas. Porém, da
mesma forma que para os extratos de 24 horas, o número de células diminuiu à
medida que aumentou a concentração da solução de CHX adicionada ao MTA
(Figura 5B-F). A morfologia celular se assemelhou àquela dos grupos
correspondentes com extratos de 24 horas (Figura 6A-E).
Uma comparação entre os grupos demonstrou que quanto maior a
concentração de CHX incorporada ao MTA mais intensa foi a redução do número
de células aderidas ao substrato de vidro e a alteração da morfologia celular.
Assim, foi demonstrado que as alterações de número e morfologia celular foram
dose-dependentes.
Discussão
A avaliação da biocompatibilidade dos materiais utilizados para
retrobturação possui grande relevância clínica, uma vez que esses materiais
podem causar irritação dos tecidos periapicais e retardar a cicatrização na região
(21).
Artigo 2
__________________________________________________________57
Os testes de citotoxicidade em cultura de células têm sido muito utilizados
por serem relativamente simples e por fornecerem informações valiosas, as quais
indicam se os materiais apresentam propriedades que justificam a realização de
testes complementares in vitro e in vivo (23). Neste estudo, para a avaliação da
citotoxicidade dos componentes liberados pela associação do MTA com a
clorexidina (CHX), foi empregado o teste colorimétrico do metiltetrazolium (teste
do MTT), que determina o metabolismo celular pela avaliação da taxa de
respiração mitocondrial das células viáveis. As mitocôndrias das células viáveis
possuem uma enzima denominada desidrogenase succínica que, quando em
contato com os anéis de tetrazolium da solução de MTT, formam cristais de
formazan que possuem coloração violeta (22). O teste do MTT foi selecionado,
baseado no fato de o MTA ser uma substância hidrófila que libera componentes
iônicos, os quais são capazes de interferir com as atividades enzimáticas
intracelulares (24).
A linhagem de células do ligamento periodontal de camundongos (MPDL)
foi utilizada, uma vez que, em uma situação clínica de cirurgia parendodôntica
com retrobturação, são células semelhantes a essas que permanecem em contato
com o material retrobturador e são responsáveis pela formação e manutenção dos
anexos do ligamento periodontal, assim como estão envolvidas na reparação,
remodelação e regeneração do cemento e tecido ósseo adjacentes (25).
O uso de extratos simula o ambiente pós-cirúrgico imediato, no qual os
elementos tóxicos liberados pelo material retrobturador nos fluidos teciduais,
atuam diretamente sobre as células e tecidos periapicais. Além disso, os extratos
Artigo 2
__________________________________________________________58
podem ser usados em várias concentrações para a avaliação da relação dose-
resposta (15). No presente estudo, os elementos liberados em 24 horas pelo MTA
recém manipulado associado às diferentes soluções de CHX causaram menor
redução do metabolismo celular (G1: 11,87%; G2: 23,63%; G3: 21,87%; G4:
34,64%; G5: 83,01%) quando comparados aos extratos obtidos no período de 7
dias (G1: 61,35%; G2: 71,45%; G3: 75,43%; G4: 81,26%; G5: 86,13%). Essa
diferença pode ser explicada porque em períodos mais longos, maior número e
quantidade de componentes tóxicos são liberados do material para o meio,
causando assim, maiores danos celulares.
Neste estudo, os corpos de prova foram colocados em contato com o meio
de cultura para obtenção dos extratos 10 minutos após a manipulação dos
materiais, tempo necessário para a presa inicial. Entretanto, como o MTA demora
cerca de 4 horas para atingir a presa final (2), o menor tempo de espera para a
colocação dos corpos de prova em meio de cultura pode ter determinado uma
maior liberação de componentes, tornando este mais tóxico às células. Keiser et
al. (2000) (15) avaliando o MTA recém manipulado e com 24 horas de presa,
mostraram que a toxicidade sobre fibroblastos do ligamento periodontal de
humanos diminuiu significativamente após 24 horas de presa (cerca de 78% de
viabilidade celular) comparado ao extrato do MTA recém manipulado (cerca de
40% de viabilidade celular).
O extrato obtido do MTA associado à água destilada foi o grupo
experimental que apresentou a menor taxa de redução do metabolismo celular e,
menor alteração do número e da morfologia celular em relação ao grupo controle
Artigo 2
__________________________________________________________59
(DMEM), independente do período de obtenção do extrato. Estudos avaliando a
citotoxicidade do MTA associado à água destilada, em cultura de fibroblastos
periodontais de humanos, não mostraram efeitos tóxicos relacionados ao MTA
(26) e determinaram a indução de expressão de fosfatase alcalina, osteonectina e
osteopontina por essas células (27).
Em cultura de células pulpares, estudos avaliando a citotoxicidade,
demonstraram que o MTA induziu a proliferação celular, sugerindo que esse
material é biocompatível e possui um efeito positivo na regeneração do complexo
dentino-pulpar in vivo (28, 29). Além disso, o MTA quando em contato com
matriz de dentina, parece induzir a liberação de fatores de crescimento e outras
moléculas bioativas que têm potencial para estimular a dentinogênese reparadora
resultando na formação de barreira mineralizada (30). Segundo Mitchell et al.
(1999) (31), o MTA estimula a expressão de IL-6 e IL-8, as quais são
responsáveis pela mobilização e o recrutamento de precursores de osteoclastos,
bem como, pelo aumento da angiogênese. Isto sugere, que este material além de
biocompatível, pode promover o reparo pela estimulação da remodelação óssea.
Microanálises realizadas utilizando o pó do MTA mostraram que o cálcio
e o fósforo são os principais íons presentes neste material (11). Como estes íons
também são os principais componentes dos tecidos duros dentais, esta pode ser
uma explicação plausível para a boa compatibilidade biológica apresentada pelo
MTA quando usado em contato com células e tecidos vivos (11). Esses dados
podem ainda, explicar a pequena redução do metabolismo das células MPDL
Artigo 2
__________________________________________________________60
provocada pelo extrato de 24 horas do MTA associado à água destilada, obtida
nesse estudo (11,87%).
Em relação à associação MTA/solução de CHX, um estudo avaliando a
ação do MTA ProRoot
®
misturado à CHX 0,12% sobre fibroblastos e macrófagos
logo após a manipulação, mostrou aumento na porcentagem de apoptose dessas
células e diminuição na síntese de DNA quando comparado ao MTA ProRoot
®
misturado à água destilada (21). Esses resultados estão de acordo com os
apresentados no presente trabalho, no qual foi observada redução de 21,87% do
metabolismo celular para o extrato de 24 horas do MTA + CHX 0,12%, e de
75,43% para o extrato de 7 dias. Esta redução do metabolismo celular foi
significativamente maior do que àquela observada para o MTA + água destilada
(11,87% e 61,35%, para os extratos de 24 horas e 7 dias, respectivamente. Além
disso, para o grupo MTA + CHX 0,12%, houve uma maior redução do número de
células, as quais apresentaram-se com volume diminuído e com morfologia
alterada, quando comparadas às células do grupo MTA + água destilada.
Algumas pesquisas afirmam que a citotoxicidade provocada pela
clorexidina é dose-dependente, ou seja, quanto maior é a concentração dessa
substância, maior a citotoxicidade por ela determinada (32-35). Essa característica
foi observada no teste do MTT deste estudo, pois quanto maior a concentração de
CHX adicionada ao MTA, maior foi a porcentagem de redução do metabolismo
celular. Observando-se a morfologia celular, essa particularidade também pôde ser
constatada. No grupo controle foi observada morfologia celular típica
caracterizada por forma achatada, superfície lisa e longos prolongamentos
Artigo 2
__________________________________________________________61
citoplasmáticos, porém, à medida que a concentração de CHX incorporada ao
MTA aumentou, maiores danos celular puderam ser visualizados. Dentre estes
danos, foi constatado desde a redução do número e do volume de células aderidas
ao substrato de vidro até estruturas totalmente irregulares, sugerindo o
rompimento do citoplasma e a fragmentação das células.
Apesar dos resultados apresentados, particularmente para os extratos
obtidos em 7 dias, mostrarem elevada citotoxicidade, a metodologia empregada
no presente experimento apresenta algumas limitações em reproduzir as condições
fisiológicas presentes na região periapical. Isso restringe a extrapolação dos
resultados para situações in vivo, uma vez que estes podem não refletir de forma
real os efeitos dos materiais quando aplicados em condições clínicas. Entretanto,
estes estudos laboratoriais servem como referência para futuros estudos in vivo, os
quais devem ser conduzidos com a finalidade de determinar os efeitos biológicos
induzidos pela associação MTA/CHX sobre diferentes tecidos.
Conclusão
Baseado nas condições experimentais desse trabalho, pôde-se concluir que
independente do tempo de obtenção dos extratos, quanto maior a concentração de
CHX incorporada ao MTA, mais tóxico é o cimento para os fibroblastos MDPL.
Independente da concentração da solução de CHX utilizada na preparação do
cimento MTA, este material apresenta maior citotoxicidade quanto maior o tempo
de obtenção do extrato.
Artigo 2
__________________________________________________________62
Agradecimentos
Ao Dr. Elliot W. Kitagima do NAP/MEPA – ESALQ/USP, Piracicaba,
São Paulo, Brasil, pelo auxílio para a microscopia eletrônica de varredura (MEV).
À Angelus
®
Indústria de Produtos Odontológicos Ltda., pelo fornecimento do
material MTA e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq (301029/2007-5) pelo suporte financeiro para a realização
desta pesquisa.
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Artigo 2
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Artigo 2
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Artigo 2
__________________________________________________________66
Tabela 1 - Apresentação dos materiais utilizados no estudo (composição química,
fabricante e quantidade utilizada na preparação do cimento)
Material Composição
Fabricante
Quantidade
MTA
Branco
SiO
2
; K
2
O; Al
2
O
3
; Na
2
O; Fe
2
O
3
;
SO
3
; CaO; Bi
2
O
3
; MgO e resíduos
insolúveis (sílica cristalina, óxido
de cálcio e sulfato de potássio e
sódio)
Angelus
®
Indústria de
Produtos Odontológicos
Ltda,Londrina, PR, Brasil
100 mg
Clorexidina
Solução aquosa de
gluconato de clorexidina
HENRIFARMA Produtos
Químicos e Farmacêuticos
Ltda, São Paulo, SP,
Brasil
30µL
Água
Destilada
Estéril
----
Laboratório de Fisiologia
e Patologia Experimental
Faculdade de Odontologia
de Araraquara - UNESP
30µL
Artigo 2
__________________________________________________________67
Figura 1 - Redução percentual do metabolismo celular de fibroblastos do
ligamento periodontal de camundongos (MPDL) expostos a extratos de 24 horas
do MTA associado à água destilada e à clorexidina em diferentes concentrações.
DMEM completo foi usado como controle negativo e representou 100% de
metabolismo celular. Colunas indicadas com letras iguais representam grupos que
não apresentam diferença estatisticamente significante (Mann-Whitney, p>0,05).
Artigo 2
__________________________________________________________68
Figura 2 - Redução percentual do metabolismo celular de fibroblastos do
ligamento periodontal de camundongos (MPDL) expostos a extratos de 7 dias do
MTA associado à água destilada e à clorexidina em diferentes concentrações.
DMEM completo foi usado como controle negativo e representou 100% de
metabolismo celular. Colunas indicadas com letras iguais representam grupos que
não apresentam diferença estatisticamente significante (Mann-Whitney, p>0,05).
Artigo 2
__________________________________________________________69
Tabela 2 – Metabolismo celular (Teste do MTT) de fibroblastos do ligamento
periodontal de camundongos (MPDL) após 24 horas de exposição aos extratos de
24 horas e 7 dias do MTA associado à água destilada ou à clorexidina em
diferentes concentrações. Meio de cultura DMEM completo foi usado como
controle negativo.
* Valores seguidos por letras maiúsculas iguais nas colunas e letras minúsculas
iguais nas linhas não apresentam diferença estatisticamente significante (Mann-
Whitney, p>0,05).
MATERIAL
Período de Obtenção do Extrato
24 horas
Med (mín – máx)
7 dias
Med (mín – máx)
MTA+H
2
O
(G1)
0,2461 (0,2219-0,2647) Ba 0,1279 (0,0687-0,1771) Bb
MTA+CHX0,06%
(G2)
0,2137 (0,1871-0,2374) Ca 0,1097 (0,0670-0,1524) Cb
MTA+CHX0,12%
(G3)
0,2146 (0,1917-0,2425) Ca 0,0831 (0,0517-0,1178) CDb
MTA+CHX0,2%
(G4)
0,1862 (0,1284-0,2168) Da 0,0595 (0,0492-0,0854) Db
MTA+CHX 1%
(G5)
0,0465 (0,0438-0,0557) Ea 0,0466 (0,0432-0,0490) Ea
DMEM
(controle negativo)
(G6)
0,2720 (0,2516-0,3213) Ab
0,3443 (0,2730-0,3742) Aa
Artigo 2
__________________________________________________________70
Figura 3 – Fotomicrografia em MEV de fibroblastos do ligamento periodontal de
camundongos (MPDL) aderidos à lamínula de vidro após contato com os extratos
de 24 horas do MTA associado à água destilada ou à CHX em diferentes
concentrações, assim como, o grupo controle. A. Grupo G6 (controle negativo):
DMEM, B. Grupo G1: MTA + água destilada, C. Grupo G2: MTA + CHX 0,06%,
D. Grupo G3: MTA + CHX 0,12%, E. Grupo G4: MTA + CHX 0,2%, F. Grupo
G5: MTA + CHX 1% (aumento original x 100, barra = 100 µm).
Artigo 2
__________________________________________________________71
Figura 4 - Fotomicrografia em microscopia eletrônica de varredura de
fibroblastos do ligamento periodontal de camundongos (MPDL) aderidos à
lamínula de vidro após contato com os extratos de 24 horas do MTA associado à
água destilada ou à CHX em diferentes concentrações, assim como, o grupo
controle. A. Grupo G6 (controle negativo): DMEM, B. Grupo G1: MTA + água
destilada, C. Grupo G2: MTA + CHX 0,06%, D. Grupo G3: MTA + CHX 0,12%,
E. Grupo G4: MTA + CHX 0,2 (aumento original x 500, barra = 20 µm).
Artigo 2
__________________________________________________________72
Figura 5 – Fotomicrografia em microscopia eletrônica de varredura de
fibroblastos do ligamento periodontal de camundongos (MPDL) aderidos à
lamínula de vidro após contato com os extratos de 7 dias do MTA associado à
água destilada ou à CHX em diferentes concentrações, assim como, o grupo
controle. A. Grupo G6 (controle negativo): DMEM, B. Grupo G1: MTA + água
destilada, C. Grupo G2: MTA + CHX0,06%, D. Grupo G3: MTA + CHX 0,12%,
E. Grupo G4: MTA + CHX 0,2%, F. Grupo G5: MTA + CHX 1% (aumento
original x 100, barra = 100 µm).
Artigo 2
__________________________________________________________73
Figura 6 – Fotomicrografia em microscopia eletrônica de varredura de
fibroblastos do ligamento periodontal de camundongos (MPDL) aderidos à
lamínula de vidro após contato com os extratos de 7 dias do MTA associado à
água destilada ou à CHX em diferentes concentrações, assim como, o grupo
controle. A. Grupo G6 (controle negativo): DMEM, B. Grupo G1: MTA + água
destilada, C. Grupo G2: MTA + CHX 0,06%, D. Grupo G3: MTA + CHX 0,12%,
E. Grupo G4: MTA + CHX 0,2% (aumento original x 500, barra = 20 µm).
Considerações Finais
_______________________________________________74
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Por ser biocompatível
3,38,51,52,56
e apresentar características como bom
selamento
4,47
e adaptação às paredes dentinárias
50
, o MTA tem sido indicado para
obturação retrógrada, para selamento e reparo de perfurações radiculares e de
furca, entre outros procedimentos clínicos amplamente empregados na
odontologia
2,14,35,36,47,51,53,55
.
Entretanto, como este material não apresenta adequada atividade
antibacteriana sobre algumas espécies presentes em infecções endodônticas
12,32,49
,
tem sido proposta a sua associação com a CHX, um agente antimicrobiano de
amplo espectro
10,11,13,26,34
. Todavia, a atividade antibacteriana da solução de CHX
depende da sua concentração e da susceptibilidade das espécies bacterianas,
podendo atuar como bacteriostático ou bactericida
13
. Além disso, a CHX,
inclusive em baixas concentrações, atua como inibidor de metaloproteinases
(MMPs)
19
. Estas enzimas proteolíticas são liberadas na presença de inflamação
pulpar e lesões periapicais, atuando na degradação da matriz orgânica
extracelular
5,30,54
. Portanto, a inibição dessas enzimas tem importante papel no
processo de reparo após tratamento endodôntico.
Por outro lado, de acordo com a concentração utilizada, a CHX pode ser
tóxica às células e tecidos
7,8,15,20,23,31,37,40
. Neste estudo, diferentes concentrações
dessa substância foram adicionadas ao MTA com a proposta de obter um
medicamento com boas propriedades antibacterianas e mínima citotoxicidade.
Contudo, a associação entre dois materiais nem sempre resulta na somatória dos
efeitos benéficos, e muitas vezes, estes podem ter a sua ação inibida. Tal fato pôde
Considerações Finais
_______________________________________________75
ser verificado na presente pesquisa, onde observou-se para a associação
MTA/CHX, ausência do aumento da atividade antibacteriana sobre três das quatro
espécies estudadas.
A adição de CHX ao MTA em concentrações elevadas, tal como 2%,
interfere na presa do material
28
, bem como nas propriedades mecânicas, tornando-
o quebradiço e com baixa resistência à compressão
25
. Com a incorporação de
CHX 1% ao MTA, observou-se neste estudo, que os corpos de prova
apresentaram-se mais quebradiços, sofrendo desintegração parcial ou total quando
permaneceram imersos em meio de cultura para a obtenção dos extratos. Essa
característica limita a concentração da CHX que pode ser incorporada ao MTA.
Como a associação MTA/CHX tem sido recentemente
sugerida
22,25,28,39,41,42
, a interação desses materiais ainda não está elucidada.
Entretanto, considerando que a permanência do MTA em contato com os tecidos
resulta na formação de hidróxido de cálcio
24,25
, sugere-se que a interação do MTA
com a CHX seja semelhante àquela que ocorre entre hidróxido de cálcio e
clorexidina. Na presença de hidróxido de cálcio, as moléculas de CHX, na sua
maioria, não sofrem dissociação devido ao pH alcalino deste material, resultando
em redução da sua ação antimicrobiana
57
.
Somando-se esta informação, ao fato de que a CHX pode ser tóxica às
células e aos tecidos vivos de acordo com a concentração utilizada
7,8,15,20,23,31,37,40
,
e considerando que, no presente estudo, os resultados obtidos com a associação
MTA/CHX não foram satisfatórios tanto em relação à melhora na atividade
antibacteriana quanto aos efeitos citotóxicos sobre fibroblastos (MPDL), outros
Considerações Finais
_______________________________________________76
estudos devem ser realizados com intuito de melhor investigar a interação e os
mecanismos de ação dessa e de outras associações, visando obter um material com
compatibilidade biológica aceitável e máxima propriedade antibacteriana.
Conclusão
___________________________________________________________
CONCLUSÃO
1. A adição de CHX ao MTA, independente da concentração utilizada, não
resultou em melhora da atividade antibacteriana sobre os microrganismos
estudados, com exceção do S. aureus.
2. Quanto maior a concentração de CHX incorporada ao MTA, mais tóxico foi o
cimento para os fibroblastos do ligamento periodontal de camundongos
(MDPL).
3. Independente da concentração da solução de CHX utilizada na preparação do
cimento MTA, o material apresentou maior citotoxicidade no maior tempo de
obtenção do extrato.
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ANEXOS
Figura 1
- Placa de Petri contendo ágar Müller-Hinton acrescido do inóculo
bacteriano e confecção dos poços para preenchimento com os materiais estudados.
Figura 2 - Inserção dos materiais nos poços confeccionados nas placas de Petri
com auxílio de insersor (A) e condensador de amálgama (B) previamente
esterilizados.
Figura 3 – Medição dos halos de inibição com auxílio de paquímetro digital.
A
B
Autorizo a reprodução deste trabalho.
(Direitos de publicação reservado ao autor)
Araraquara, 30 de julho de 2008.
INDRI NOGUEIRA
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