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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS E SUA CORRELAÇÃO COM O
DESFECHO DE SEPSE
Giane Michele Frare Peck
CRICIÚMA – SANTA CATARINA
2007
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1
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS E SUA CORRELAÇÃO COM O
DESFECHO DE SEPSE
Giane Michele Frare Peck
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Área de Concentração: Fisiopatologia
Orientador: Prof. Dr.Felipe Dal Pizzol
CRICIÚMA – SANTA CATARINA
2007
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2
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Bibliotecária: Flávia Cardoso – CRB 14/840
Biblioteca Central Prof. Eurico Back – UNESC
P366a Peck, Giane Michele Frare.
Ativação de macrófagos e sua correlação com desfecho de
sepse / Giane Michele Frare Peck ; orientador: Felipe Dal
Pizzol. -- Criciúma: Ed. do autor, 2007.
62 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, 2007.
1. Sepse . 2. Síndrome da resposta inflamatória sistêmica.
3. Macrófagos. 4. Imunidade. I. Título.
CDD. 21ª ed. 616.079
3
Dedico esta dissertação a meus filhos Maria Luiza e
Pedro Caetano que são a razão do meu esforço na
busca de superação, crescimento e melhora
pessoal a cada dia e a toda a minha família,
sempre incansável no apoio e incentivo.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS, por me permitir realizar esta tarefa.
Aos meus filhos por existirem.
Ao meu marido pelo apoio, compreensão e
incentivo nos momentos difíceis.
Aos meus pais que sempre acreditaram que seria possível.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol pelo incentivo,
pela paciência, confiança e ajuda em todos os momentos.
Ao Prof. Dr Newton Lucchiari (in memoriam), por ter me
despertado o desejo da pesquisa.
Enfim, a todos que de alguma forma contribuiram
para a realização desta dissertação.
Muito Obrigado!
5
RESUMO
A sepse é definida como "síndrome da resposta inflamatória sistêmica
(SIRS) que ocorre durante a infecção”. Apesar dos avanços na medicina nas últimas
décadas, o diagnóstico precoce e o tratamento dos quadros sépticos permanecem
um desafio para os intensivistas. A resposta imunológica do organismo à sepse,
especialmente a ativação dos macrófagos durante a resposta imune inata, tem se
mostrado uma importante ferramenta para o diagnóstico e tratamento da sepse. Este
estudo pretende determinar a relação entre ativação de macrófagos, a gravidade e
evolução dos pacientes sépticos internados em UTI. Para isto foi realizado um
estudo de coorte prospectivo de 23 pacientes admitidos na UTI do Hospital São José
de Criciúma com diagnóstico de sepse, sepse grave ou choque séptico identificados
pelos critérios da Conferência de Consenso do American College of Chest
Physicians e Society of Critical Care Medicine de 1992. O material utilizado foi o soro
restante da análise de rotina da UTI, solicitados pelo médico intensivista de plantão
nas primeiras 24 horas de admissão do paciente séptico. Então, macrófagos do
peritônio de ratos Wistar foram cultivados em meio RPMI e ativados com 2% de soro
dos pacientes sépticos para a determinação de TNF-α, IL-1β, óxido nítrico (citocinas
pró-inflamatórias) e IL-10 (citocina antiinflamatória). As citocinas foram dosadas por
ELISA e o Óxido Nítrico foi determinado pela reação de Griess. Para determinação
de fagocitose e atividade microbicida, os macrófagos ativados com o soro dos
pacientes sépticos, foram infectados com E. coli ATCC1105 na razão de 10:1
bactérias/macrófagos e após cultura pela técnica de Miles-Misra, as UFC foram
contadas. Nossos resultados mostraram aumento das citocinas pró-inflamatórias,
demonstrando ativação de macrófagos pela via clássica, nos quadros mais leves de
sepse e aumento de citocina antiinflamatória (demonstrando ativação dos
macrófagos pela via alternativa) nos casos mais severos de sepse. Além disto, nos
casos de ativação por via alternativa, foi pior o desfecho dos casos de sepse. Os
dados levantados sugerem que na sepse humana observa-se um perfil de resposta
de macrófagos similar àquela observada no modelo animal, ou seja, com a ativação
clássica destas células na sepse leve e moderada e estimulação dos macrófagos
pela via alternativa nos casos de sepse severa.
Palavras-chave: Sepse; Sepse Grave; Citocinas; Ativação de Macrófagos.
6
ABSTRACT
Sepsis is defined as “Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS)
which occurs during infection”. In spite of recent advances in medical science, the
precocious diagnosis and the treatment of septic condition, still being a challenge for
the intensive care doctors. The organism immunological response to sepsis,
especially macrophages activation during innate immune response; it is an important
tool for its diagnosis and treatment. This study aims to determinate the link among
macrophages activation, severity and progression of septic patients hospitalized in
the ICU. In order to analyze this correlation, it was carried out a prospective cohort
study with 23 patients admitted in Hospital São José ICU at Criciúma, with the
diagnosis of sepsis, severe sepsis or septic shock identified through the Consensus
Conference of the American College of Chest Physicians and Society of Critical Care
Medicine in 1992. Material used was the serum remaining from the routines analysis
of the ICU, solicited by intensive care doctor at the first 24 hours of the septic
patients’ admission. Peritoneum macrophages from Wistar rats, were cultivated in
RPMI medium and activated with 2% of septic patients serum to determinate TNF-α,
IL-1β, nitric oxide (pro-inflammatory cytokines) and IL-10 (anti-inflammatory cytokine)
levels. Cytokines levels were determined through ELISA assay and nitric oxide was
determined through Griess’ reaction. To evaluate phagocytosis and microbicidal
activity, the macrophages activated with septic patients serum, were infected with E.
coli ATCC1105 in the ratio of 10:1 bacteria/macrophage and after cultured using
Miless-Misra technique, then the CFU were counted. Our results showed an increase
of the pro-inflammatory cytokines, demonstrating macrophages activation through
classical via, in the less severe cases of sepsis and an increase of anti-inflammatory
cytokine (showing macrophages activation through alternative via) in the more
severe cases of sepsis. Furthermore, in the cases of alternative via activation, the
sepsis final outcome was worse. These data suggests that in the human sepsis,
there is a macrophages response pattern similar to those observed in animal model
of sepsis, that is, with the classical activation of these cells in the less severe and
moderated sepsis and macrophages stimulation through alternative via in the cases
of severe sepsis.
Key-words: Sepsis; Severe Sepsis; Cytokines; Macrophages Activation.
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APACHE - Acute Physiology And Chronic Health Evaluation
CABG - Cirurgia de Revascularização do Miocárdio
CARS - Síndrome da Resposta Inflamatória Compensatória
EAO - Espécies Ativas de Oxigênio
EUA - Estados Unidos da América
HBSS - Hanks Buffered Saline Solution
IL-1 - Interleucina -1
iNOS - Sintase de NO induzível
LPS - Lipopolissacarídeo
MARS - Síndrome da Resposta Inflamatória Mista
MODS - Síndrome da Insuficiência de Múltiplos Órgãos
NO - Óxido Nítrico
PAF - Fator Ativador Plaquetário
PBS - Solução Salina Tamponada com Fosfato
SIRS - Resposta Inflamatória Sistêmica
SOFA - Sequential Organ Failure Assessment
TNF - Fator de Necrose Tumoral
TNFα - Fator de Necrose Tumoral alfa
TSA – Solução de caldo nutriente de soja com 2% de Agar-Agar
UFC – Unidades Formadoras de Colônia
UTI - Unidades de Terapia Intensiva
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: O APACHE II: Sistema de Classificação de Gravidade de Doença............18
Figura 2: Avaliação Seqüencial de Falência Orgânica...............................................19
Figura 3: A Resposta aos Patógenos.........................................................................23
Figura 4: Balanço entre Resposta Pró-inflamatória vs. Anti-inflamatória...................26
Figura 5: Concentração de IL-1β e Severidade da Sepse.... ..................................35
Figura 6: Concentração de IL-1β e Desfecho nos Pacientes Sépticos......................35
Figura 7: Correlação APACHE II x IL-1β ………………….........................................36
Figura 8: Correlação SOFA x IL-1β …………………………………………….............36
Figura 9: Curva ROC IL-1β........................................................................................37
Figura 10: Concentração de TNF-α e Severidade da Sepse.....................................37
Figura 11: Concentração de TNF-α e Desfecho da Sepse........................................38
Figura 12: Correlação APACHE II x TNF-α................................................................39
Figura 13: Correlação SOFA x TNF-α.......................................................................39
Figura 14: Curva ROC TNF-α....................................................................................40
Figura 15: Correlação TNF-α x IL-1β.........................................................................40
Figura 16: Concentração de Oxido Nítrico e Sepse Severa.......................................41
Figura 17: Concentração de Óxido Nítrico e Desfecho nos Pacientes Sépticos.......41
Figura 18: Concentração de IL- 10 e Severidade da Sepse......................................42
Figura 19: Concentração de IL-10 e Desfecho da Sepse..........................................43
Figura 20: Correlação APACHE II x IL-10..................................................................43
Figura 21: Correlação SOFA x IL-10..........................................................................44
Figura 22: Curva ROC da IL-10..................................................................................45
Figura 23: Fagocitose e Severidade da Sepse..........................................................46
9
Figura 24: Fagocitose e Desfecho da Sepse.............................................................47
Figura 25: Correlação entre Fagocitose e Interleucina 10.........................................48
Figura 26: Correlação entre TNF-α e Fagocitose.......................................................49
Figura 27: Correlação entre Interleucina 10 e Fagocitose.........................................50
Figura 28: Microbicida e Gravidade da Sepse...........................................................51
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................12
2 REFERENCIAL TEÓRICO....................................................................................15
2.1 Classificação.......................................................................................................15
2.2 Índices Prognósticos...........................................................................................16
2.3 Fisiopatologia da Sepse......................................................................................19
2.4 Papel dos Monócitos Macrófagos.......................................................................24
2.5 Sepse e sua Relevância Social...........................................................................27
3 OBJETIVOS...........................................................................................................28
3.1 Objetivo Geral.....................................................................................................28
3.2 Objetivos Específicos..........................................................................................28
4 MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................29
4.1 Delineamento de Pesquisa.................................................................................29
4.2 Sujeitos da Pesquisa...........................................................................................29
4.3 Coleta de Material...............................................................................................30
4.4 Cultura de Macrófagos........................................................................................31
4.5 Fagocitose e Atividade Microbicida ....................................................................31
4.6 Dosagem de Citocinas.........………………………...............................................32
4.7 Análise Estatística...............................................................................................32
4.8 Aspectos Éticos...................................................................................................33
5 RESULTADOS.......................................................................................................34
6 DISCUSSÃO..........................................................................................................49
7 CONCLUSÃO........................................................................................................55
11
8 REFERÊNCIAS......................................................................................................57
ANEXO......................................................................................................................63
12
1 INTRODUÇÃO
A sepse é a tradução clínica da existência de um foco infeccioso
desencadeador de uma resposta inflamatória sistêmica e é caracterizada por intensa
inflamação e profusa injúria tissular (UPTODATE, 2006). Nesta síndrome, tecidos
distantes do insulto original mostram os sinais cardinais de inflamação, incluindo
vasodilatação, aumento da permeabilidade microvascular e acúmulo de leucócitos.
Apesar do rápido progresso nos cuidados de saúde nas últimas décadas, a
incidência de sepse tem aumentado ao longo dos últimos setenta anos e, juntamente
com suas seqüelas continua como a maior ameaça a vida de pacientes em Unidades de
Terapia Intensiva (UTI) (OSUCHOWSKI et al, 2006). São mais de 20 anos de extensas
pesquisas e desenvolvimento de numerosas terapêuticas usadas em ensaios clínicos,
porém os índices epidemiológicos continuam piorando (RITTIRSCH et al, 2007).
O aumento nas taxas de incidência e de morbimortalidade relacionadas à
sepse nas últimas décadas, está diretamente relacionado aos avanços médicos obtidos
nesse período, onde cada vez mais, são tratados pacientes gravemente doentes e em
estágios de doença mais avançados (CARVALHO e TROTTA, 2003).
A sepse é a principal causa de morte em pacientes criticamente doentes nos
Estados Unidos da América (EUA) (HOTCHKISS e KARL, 2003). Angus e colaboradores,
em 2001, estimaram a incidência de sepse severa em 751.000 casos por ano nos EUA,
correspondendo a 3 casos por 1.000 habitantes, sendo que 28,6% destes casos vão a
óbito.
Conforme Antonelli e colaboradores em 2007, o choque séptico é causa de 6,3
a 14,7% das admissões em UTI.
No Brasil, como na América Latina em geral, dados consistentes sobre a
incidência e desfecho dos casos de sepse são escassos. Um estudo realizado por Silva e
13
colaboradores em 2004 sugere que a sepse um grande problema nas UTIs do Brasil. No
estudo a incidência de sepse ficou em torno de 57 casos por 1.000 pacientes/dia,
correspondendo a 30,5% das admissões em UTI. A taxa de mortalidade dos pacientes
com SIRS, sepse, sepse severa e choque séptico foi de 24.2%, 33.9%, 46.9% e 52.2%
respectivamente.
14
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Classificação
Vários termos e definições imprecisas eram utilizados nos casos de sepse, o
que dificultava a identificação do quadro real e a instauração precoce de terapia. Em
1992, duas sociedades americanas (American College of Chest Physicians e Society of
Critical Care Medicine) realizaram uma conferência de consenso para melhor definir os
termos utilizados e relacioná-los com a fisiopatologia e a gravidade dos quadros
inflamatórios secundários à infecção (tabela 1).
Tabela 1: Definições em Sepse
Síndrome da
Resposta Inflamatória
Sistêmica (SIRS)
Resposta inflamatória sistêmica a uma variedade de agressões clínicas
severas, que se manifesta por duas ou mais destas condições:
1. Temperatura corporal > 38°C ou < 36°C;
2. Freqüência cardíaca > 90 batidas por minuto;
3. Freqüência respiratória > 20 inspirações por minuto ou PaCO
2
<
32mmHg;
4. Contagem de glóbulos brancos >12000/cumm, < 4000/cumm ou
>10% das formas imaturas.
Bacteremia
Presença de bactérias vivas no sangue
Infecção
Fenômeno microbiológico caracterizado por uma resposta
inflamatória sistêmica à presença de microrganismos ou a invasão
5. de um tecido, normalmente estéril, por estes microrganismos
Sepse
Síndrome da resposta inflamatória sistêmica associada à infecção.
Sepse Grave
Sepse associada à disfunção de orgãos, hipoperfusão ou hipotensão.
Hipoperfusão e anormalidades de perfusão podem incluir, mas não
estão limitadas a acidose láctica, oligúria ou alteração aguda do estado
mental.
Continuação =>
15
Choque Séptico
Sepse com hipotensão e anormalidades de perfusão, apesar de infusão
adequada de fluído. As anormalidades incluem mas não estão limitadas
a acidose láctica, oligúria ou alteração aguda do estado mental.
Pacientes que recebem agentes vasopressores ou inotrópicos podem
não ser hipotensivos no momento em que se medem essas
anormalidades.
Hipotensão induzida
por sepse
Pressão sistólica sangüínea < 90mmHg ou uma redução de > 40 mmHg
da linha de base na ausência de outras causas para hipotensão.
Disfunção Múltipla
de Órgãos e Sistemas
(MODS)
Presença de alteração na função de órgãos em um paciente com
enfermidade aguda de maneira tal, que a homeostase não possa ser
mantida sem intervenção.
Fonte: CONSENSUS CONFERENCE COMITEE, (1992).
A infecção de qualquer sítio anatômico pode resultar em sepse e choque
séptico. As principais fontes de choque séptico são os pulmões (cerca de 35%),
abdomen (cerca de 30%), as vias urinárias (cada vez menos freqüentes devido à
diminuição de manobras urológicas invasivas) e a pele (escaras e feridas) (Barreto
et al, 2001).
Os fatores de risco mais comuns ao desenvolvimento da sepse são:
¾ Medicina Invasiva (cateteres, monitorização, diagnóstico);
¾ Terapias Imunossupressoras (câncer e transplantes);
¾ Aumento da longevidade (particularmente de pacientes com doença
crônica como diabetes e câncer);
¾ Incidência aumentada de infecção por germes multirresistentes;
¾ Doenças imunossupressoras.
2.2 Índices Prognósticos
Os índices prognósticos são ferramentas empregadas para avaliar a
evolução clínica dos pacientes e a qualidade de uma determinada UTI, podendo
Continua
16
utilizar-se de comparações para o tratamento de pacientes através de estudos
(ABDULKADER, 2003). Alguns dos objetivos destes índices prognósticos estão
ligados à medição das alterações fisiológicas e identificação anatômica, a orientação
na triagem, ao prognóstico (incluindo risco de óbito), a padronização, a melhoria no
atendimento e estudos (CHANG et al, 1998). Referem-se a valores matemáticos ou
estatísticos, quantificados por escores numéricos, que variam de acordo com a
gravidade das lesões resultantes do traumatismo. Os índices prognósticos não
devem ser usados para avaliação individual do paciente.
O APACHE (Acute Physiology And Chronic Health Evaluation) II e o SOFA
(Sequential Organ Failure Assessment) são dois destes índices prognósticos usados
nos pacientes com sepse. Para o APACHE II são utilizados uma contagem de
pontos baseada em valores de 12 medidas fisiológicas rotineiras, idade, e estado de
saúde prévio para prover uma medida geral de severidade de doença (Figura 1)
(KNAUS et al 1995). Quando escores de APACHE II são combinadas com uma
descrição precisa da doença, eles podem estratificar prognosticamente os pacientes
gravemente doentes e ajudam investigadores que comparam o sucesso de novas e
diferentes formas de terapia (KNAUS et al 1995).
17
Figura 1: O APACHE II: Sistema de Classificação e Severidade de Doença
Fonte: Critical Care Medicine (1995).
O índice SOFA é a medida do tipo e severidade do desarranjo da função
fisiológica, somando os pontos de disfunção de seis sistemas orgânicos:
cardiovascular, respiratório, neurológico, renal, hepático e da coagulação (figura 2)
(VINCENT et al, 1998).
18
Figura 2: Avaliação Seqüencial de Falência Orgânica
Fonte: SZOSTAK, (2005).
2.3 Fisiopatologia da Sepse
A inflamação é uma resposta normal e essencial do hospedeiro contra
agentes infecciosos. Acredita-se que o início e progressão da sepse, se deva a uma
“desregulação” da resposta normal, com uma maciça e descontrolada ativação de
células inflamatórias, resultando numa anarquia metabólica, na qual “o próprio
organismo não consegue controlar o que ele próprio criou” (BONE, 1991).
19
A resposta inicial de um paciente a um insulto, como uma invasão
microbiana, trauma físico ou queimadura é uma reação inflamatória (TAKAHASHI et
al, 2004). O propósito da resposta inflamatória é proteger o hospedeiro dos efeitos
prejudiciais da agressão. Entretanto, como salientado pelo cirurgião John Hunter, há
mais de 20 anos, a resposta inflamatória também pode lesar o hospedeiro, pois
origina uma variedade de substâncias nocivas (como enzimas proteolíticas e
metabólitos do oxigênio) que podem levar a danos teciduais (FUJISHIMA e
AIKAWA, 1995).
Essa lesão é evitada por substâncias endógenas (como antioxidantes)
capazes de bloquear ou inativar os produtos nocivos da inflamação. Entretanto,
quando a resposta inflamatória sobrepuja os mecanismos normais disponíveis de
proteção do hospedeiro, ela torna-se causa de lesão tecidual. É o que ocorre na
SIRS.
Atualmente, os papéis de diversos mediadores na patogênese da sepse,
já estão esclarecidos. Os microorganismos causadores liberam ou secretam na
corrente sangüínea, componentes estruturais, como, por exemplo, lipopolissacarídeo
(LPS), capazes de estimular a liberação de mediadores derivados de células do
sistema imune ou de proteínas plasmáticas pré-formadas. Estes mediadores podem
induzir alterações profundas na fisiologia normal da vasculatura e dos órgãos-alvo.
Apesar de alguns mediadores serem mais importantes que outros,
provavelmente mediadores dos microorganismos e do hospedeiro interagem, sendo,
provavelmente, sua ação conjunta responsável pela patogênese da sepse.
Dentre os mediadores envolvidos na gênese da sepse pode-se destacar
(DAS, 2000):
¾ Citocinas e quimiocinas: derivadas de monócitos e macrófagos.
20
¾ Óxido nítrico (NO): aumento da modulação da expressão da óxido
nítrico sintase induzível (iNOS) leva a um aumento na produção de NO,
que pode estar associado parcialmente à hipotensão associada a
sepse (SZABO, 1998);
¾ Mediadores lipídicos: entre eles os metabólitos do ácido araquidônico e
o Fator Ativador de Plaquetas (PAF).
¾ Espécies ativas de oxigênio (EAO): recentemente tem-se identificado
as EAO como mediadores de diversas fases de dano celular e ativação
de células imunes durante a sepse (ZHANG et al, 2000);
¾ Proteínas do grupo de alta mobilidade I (HMG-I) (antigamente
conhecida como anfoterina): recentemente identificou-se esta proteína
estrutural da cromatina como um dos possíveis mediadores envolvidos
na mortalidade induzida pela sepse (WANG et al, 1999).
A interação dos diversos mediadores leva a depressão miocárdica,
alteração da função vascular e dano em órgãos-alvo (principalmente fígado, rim,
pulmão e sistema nervoso central). A principal conseqüência desta resposta
inflamatória é o comprometimento de muitos órgãos e o quadro de choque com
evolução para a síndrome da insuficiência de múltiplos órgãos (MODS), que é
acompanhada de alta mortalidade. Para ser efetiva, a terapia farmacológica na
sepse e SIRS deve mimetizar e compensar a defesa natural do organismo, com o
objetivo de bloquear a resposta inflamatória tão logo quanto possível (PARRILO,
1993, REA, 1996.).
Quando a infecção ou bacteremia ocorre, a primeira linha de defesa do
hospedeiro é realizada por células fagocitárias (macrófagos, monócitos e neutrófilos)
e pela via alternativa do complemento, agindo de maneira não específica. Logo
21
após, as imunoglobulinas e as células imunocompetentes iniciam uma resposta
imune específica. (PEREIRA, et al 1998).
Os componentes da parede bacteriana são os principais ativadores desta
resposta do hospedeiro: as endotoxinas dos microorganismos Gram-negativos
(principalmente o lipídio A) e o ácido teicóico dos microorganismos Gram-positivos.
Estes componentes desencadeiam uma cascata inflamatória, sendo, inicialmente,
liberados o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFα) e a Interleucina-1 (IL-1), que
estimulam uma intensa resposta celular, com liberação de mediadores secundários,
quimiotaxia e ativação de granulócitos (THIJS e HACK, 1995). Os mediadores
secundários são responsáveis pela reativação das células fagocitárias e da cascata
inflamatória, formando um ciclo vicioso inflamatório (BONE, 1991).
Estudos atuais mostram que pacientes com sepse mostram características
consistentes com imunossupressão, incluindo inabilidade para combater infecções e
uma predisposição a infecções nosocomiais (HOTCHKISS e KARL, 2003). Uma
razão para a falha das estratégias anti-inflamatórias em pacientes com sepse, pode
ser as mudanças que ocorrem na síndrome o tempo todo. Tem sido postulado que a
resposta imune na sepse representa a interação entre dois fenômenos contrastantes
no status inflamatório do paciente. No início a SIRS é caracterizada por excessiva
produção de mediadores inflamatórios (status hiperinflamatório) que é então
progressivamente suprimida pelo desenvolvimento de uma resposta antiinflamatória
(status hipo-inflamatório), a síndrome da resposta inflamatória compensatória
(CARS). Entre estes dois momentos, ocorreria a síndrome da resposta inflamatória
mista (MARS), representando uma homeostase temporária entre o declínio da SIRS
e ascensão da CARS. Porém, Osuchowski e colaboradores em 2006, evidenciaram
que a resposta inflamatória é dinâmica e que as citocinas não apresentam um
22
comportamento linear, havendo presença tanto de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α
e IL-6), como de citocinas antiinflamatórias (IL10) e modulação por antagonistas
(IL1Ra) na fase inicial da sepse.
As células T CD4 ativadas são programadas para secretar citocinas com
perfis distintos e antagonistas. As células T helper tipo 1 (Th 1) secretam citocinas
com padrão pró-inflamatório, como IL-1, IL-6 e TNF-α; já as células T helper tipo 2
(Th 2), secretam citocinas com padrão antiinflamatório como IL- 4 e IL-10)
(Figura.3). Além disto, quando um macrófago ingere uma célula apoptótica, ele
sinaliza para a liberação de citocinas com perfil Th2 ou até para anergia. Quando há
ingestão de célula necrótica há liberaçção de citocinas com perfil Th1 (Figura 3).
Figura 3: A Resposta aos Patógenos
Fonte: HOTCHKISS, (2006).
23
2.4 Papel dos Monócitos Macrófagos
A ativação do sistema imune inato é ponto central no desenvolvimento e
letalidade associada a sepse (FUJIMURA et al, 2000). O reconhecimento do
patógeno através da ativação de receptores tipo Toll leva a secreção de citocinas e
conseqüente início da resposta inata com recrutamento e ativação de neutrófilos e
macrófagos que são essenciais para a morte do patógeno (CALLAHAN et al, 2001).
Os macrófagos, juntamente com os neutrófilos, constituem uma das
primeiras linhas de defesa contra infecções, após as barreiras naturais da pele e
mucosas. As endotoxinas causam a liberação de citocinas diretamente destas
células, ao mesmo tempo, os microorganismos presentes no foco de infecção são
fagocitados. Isto causa um aumento do consumo de oxigênio pelos macrófagos e a
produção de radicais livres de oxigênio, juntamente com proteases e hidrolases, que
são capazes de causar danos a estes patógenos. Com o processo de ativação por
via clássica dos macrófagos, uma das substâncias sintetizadas é o NO, que
desempenha um papel importante na função bactericida dos macrófagos. O NO é
um gás radical livre solúvel, altamente lábil e produzido por uma enzima denominada
óxido nítrico sintase induzível (iNOS), que tem a propriedade de gerar NO a partir do
aminoácido arginina e oxigênio molecular (PARSLOW et al, 2004). Na presença de
outras espécies de oxigênio no interior do vacúolo fagocítico, o NO é convertido em
outros produtos, como o peroxinitrito, que são altamente tóxicos para bactérias,
leveduras, vírus e outros patógenos. Os macrófagos ativados também secretam
muitos outros mediadores inflamatórios, tais como leucotrienos e o fator ativador
plaquetário (PAF), que são ativos em células distantes e amplificam a reação
inflamatória (PEREIRA et al, 1998).
24
Os macrófagos quando ativados, são fagócitos ávidos que internalizam
quaisquer partículas estranhas ou restos celulares com os quais entram em contato
(PARSLOW et al, 2004). Estas propriedades fagocíticas e bactericidas são
essenciais para a defesa do hospedeiro, mas, quando a ativação dos macrófagos
torna-se descontrolada, estas células contribuem para o desenvolvimento de uma
reação inflamatória generalizada (BONE, 1991). O equilíbrio entre resposta anti e
pró-inflamatória deve ser mantido para eliminar o patógeno sem induzir lesão ao
hospedeiro (FUJIMURA et al, 2000). Desta forma, o macrófago tem papel central no
início da resposta inata e adquirida e depende da forma de sua ativação, a
efetividade da resposta contra o patógeno (FUJIMURA et al, 2000). Atualmente se
identificam duas formas distintas de ativação dos macrófagos: ativação clássica e
ativação alternativa (Figura.4) (GORDON, 2003).
A ativação clássica de macrófagos leva a secreção de óxido nítrico e
citocinas pró-inflamatórias, além de estimular a fagocitose e capacidade de eliminar
o patógeno. A ativação alternativa de macrófagos leva a secreção de citocinas anti-
inflamatórias e redução da fagocitose e capacidade de eliminar o patógeno, são
hiporesponsivos ao estímulo inflamatório e estão envolvidos em angiogênese e
remodelamento de tecido (GORDON 2003). No caso de inflamação severa/crônica
isto pode ser uma adaptação para evitar dano ao hospedeiro (DAL PIZZOL, 2004;
TAKAHASHI, 2004).
25
Figura 4: Balanço entre Resposta Pró-inflamatória vs. Anti-inflamatória
Fonte: Gordon, (2002).
Atualmente há controvérsias quanto ao tempo em que via clássica e via
alternativa acontecem e o grau com que estas células mudam o fenótipo (GORDON,
2003). A ordem para estas mudanças é muito importante para futuras terapias
antiinflamatórias.
Recentemente, se determinou que em modelo animal de sepse a ativação
alternativa de macrófagos é relacionada com maior mortalidade (TAKAHASHI et al,
2004). Em humanos não há clara evidência de que a ativação de macrófagos tem
relação com desfecho em sepse, (até poucos anos se entendia a mortalidade por
sepse associada a SIRS (FUJIMURA et al, 2000). Parece que tanto a SIRS quanto a
CARS estão relacionadas à mortalidade em sepse, apesar de que as informações
neste sentido ainda são escassas na literatura (FUJIMURA et al, 2000 e
ANTONELLI et al, 2007).
IL-6
TNF
IL-1
Óxido nítrico e
superóxido
Microbicida
Importante
na fase
inicial
Receptor
de manose
IFN-gama
+
LPS
IL-4 ou
IL-13
endocitose
Reparo de
tecidos
imunidade
humoral
angiogênese
Importante na
fase de
resolução.
SIRS
Falência de órgãos,
coagulopatias e morte.
Importância dos radicais
livres nestes processos.
CARS
Disseminação
do agente patogênico.
Comprometimento de órgãos.
ATIVAÇÃO CLÁSSICA
DE MACRÓFAGOS
A
TIVAÇÃO ALTERNATIVA
DE MACRÓFAGOS
26
2.5 Sepse e sua Relevância Social
Apesar da importância da sepse na mortalidade global em UTIs, os
tratamentos atualmente empregados são meramente de suporte. A grande
incidência, associado à gravidade da sepse seria, por si só, suficiente para justificar
o aprofundamento no conhecimento de sua fisiopatologia e a tentativa de novas
possibilidades terapêuticas. Associada a grande mortalidade envolvida, encontramos
que o gasto direto e indireto com sepse, atinge altas cifras em nosso país. Um
melhor entendimento da fisiopatologia da sepse através de trabalhos experimentais
pode fornecer dados preliminares e novos protocolos experimentais de tratamento,
para serem posteriormente validados em ensaios clínicos e empregados na prática
médica (FINK, 1990). Em 2004, Dellinger e colaboradores referiam o fato de que
recomendações baseadas em evidências podem ser feitas com respeito a muitos
aspectos do tratamento agudo da sepse e choque séptico, o que leva a esperança
de que isto se traduza em melhora nos resultados do tratamento dos pacientes
criticamente doentes. A possibilidade de diminuir a mortalidade por sepse e reduzir
os gastos com internação em UTIs (alto custo com antibióticos de largo espectro,
recursos técnicos, humanos e tecnológicos associados com o manejo do paciente)
justificam a necessidade de maior investimento no estudo desta patologia.
27
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Determinar a relação entre a ativação de macrófagos, a severidade e a
mortalidade nos pacientes sépticos (sepse + sepse moderada + sepse grave +
choque séptico).
3.2 Objetivos Específicos
9 Determinar correlação entre secreção de citocinas pró-inflamatórias por
macrófagos de ratos Wistar ativados por soro de pacientes sépticos
com a severidade e mortalidade destes pacientes;
9 Determinar correlação entre secreção de óxido nítrico por macrófagos
de ratos Wistar ativados por soro de pacientes sépticos com a
severidade e mortalidade destes pacientes;
9 Determinar correlação entre secreção de citocinas antiinflamatórias por
macrófagos de ratos Wistar ativados por soro de pacientes sépticos
com a severidade e mortalidade destes pacientes;
9 Determinar correlação entre capacidade de fagocitose e destruição de
bactérias por macrófagos de ratos Wistar ativados por soro de
pacientes sépticos, com a severidade e mortalidade destes pacientes;
28
4. METODOLOGIA
4.1 Delineamento de Pesquisa
Coorte Prospectivo
4.2 Sujeitos da Pesquisa
Foram avaliados 33 pacientes admitidos pelo médico plantonista, na
Unidade de Tratamento Intensivo (UTI) do Hospital São José de Criciúma (SC), com
o diagnóstico de sepse, sepse grave ou choque séptico identificados pelos seguintes
critérios, conforme a Conferência de Consenso do American College of Chest
Physicians e Society of Critical Care Medicine:
¾ Sepse: duas ou mais das seguintes condições 1) temperatura corporal >38
0
C
ou <36
0
C; 2) freqüência cardíaca > 90 batimentos/minuto; 3) freqüência
respiratória > 20 movimentos/minuto ou pressão arterial de CO
2
<32 mm Hg;
4) Contagem total de leucócitos >12.000 células/mm
3
, <4.000 células/mm
3
, ou
> 10% de células imaturas; associada à evidência de um foco séptico ou
hemocultura positiva.
¾ Sepse grave: sepse com um ou mais sinais de disfunção orgânica,
hipoperfusão ou hipotensão.
¾ Choque séptico: sepse com hipotensão (pressão arterial sistólica <90 mm/Hg
ou uma diminuição na pressão arterial sistólica em relação a pressão basal de
mais de 40 mm/Hg) refratária a reposição líquida adequada.
29
Foram incluídos 33 pacientes que, além dos critérios acima citados,
preencham os seguintes critérios:
9 Idade acima de 18 anos,
9 Não apresentavam critérios diagnósticos de insuficiência hepática ou
renal crônicas
9 Não apresentem câncer em tratamento quimio ou radioterápico,
9 Não apresentavam imunodeficiências.
Como controle, foram incluídos soro de voluntários saudáveis entre 20 - 40
anos (n=4) e de pós operatório imediato de cirurgia de revascularização do
miocárdio (CABG) (n=4).
4.3 Coleta de Material
O material utilizado foi o soro restante das análises de rotina da UTI,
solicitados pelo médico intensivista nas primeiras 24 horas da admissão do paciente,
não sendo solicitada coleta especial para fins desta pesquisa. Como foi utilizado
material biológico sem identificação, coletado na rotina assistencial do paciente que
seria desprezado pelo laboratório, o paciente não foi seguido pelo pesquisador,
apenas foram coletadas informações de seu prontuário (como APACHE, SOFA e
desfecho final) não havendo necessidade de termo de consentimento informado. A
confidencialidade dos dados do paciente foi absoluta
30
4.4 Cultura de Macrófagos
Três ml de solução PBS, ajustada para pH 7,4, foram injetados no
peritônio de ratos Wistar. O abdômen foi massageado e as células do exsudato
peritoneal, consistindo de linfócitos e macrófagos, foram coletadas, permitindo uma
recuperação de 90 a 95% do volume injetado. Os macrófagos foram identificados
por morfologia no microscópio óptico, foram contados em uma câmara Neubauer e
regulados em solução PBS para 5x10
5
macrófagos/ml. A viabilidade celular foi,
rotineiramente mensurada, antes e depois de cada experimento, pelo teste de
exclusão do corante azul de trypan. Em todos os casos, a viabilidade foi acima de
95%. Todas as incubações foram efetuadas a 37°C em estufa humidificada com 5%
de CO2. Então, 1x10
6
células foram cultivadas em placas de 24 poços em meio
RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino. Após 24 horas de
incubação, o meio foi restituído com meio RPMI livre de soro fetal bovino e
incubadas por mais 6 horas com soro dos pacientes do estudo. Neste tempo, mais
de 97% das células cultivadas foram identificadas como macrófagos.
4.5 Fagocitose e Atividade Microbicida
Após 6 horas de incubação os macrófagos foram infectados com
Escherichia Coli (ATCC1105) na razão de 10:1 bactérias/macrófago e incubadas por
20 minutos. Após esse período, as células foram lavadas três vezes com HBSS
suplementado com gentamicina para evitar bactérias contaminantes e novamente
com RPMI livre de antibiótico para retirar qualquer traço de gentamicina.
31
Um grupo de células foi imediatamente lisado (para acessar o potencial
fagocítico) em 1mL Triton X-100 (0,1% concentração final), enquanto outro grupo foi
cultivado por uma hora a mais (atividade bactericida) antes da lise. Diluições
seriadas de base 10 desta suspensão, foram incubadas em TSA pela técnica de
Miles- Misra (QUIN et al, 1994). Unidades formadoras de colônia foram contadas
após incubação a 37°C em estufa de CO2 durante 12 a 14 horas.
4.6 Dosagem de Citocinas
1x10
6
macrófagos do peritônio de ratos Wistar foram cultivados em meio
RPMI por 6 horas e ativados com 2% do soro coletado dos pacientes. Após este
tempo, o sobrenadante foi coletado para análise de citocinas pró-inflamatórias (IL-1,
TNF-α) e antiinflamatórias (IL-10) por ELISA conforme recomendação do fabricante
(Kit R&D Systems).
A produção de NO pelas células estimuladas foi quantificado pela reação
de Griess (VERDON, 1995).
Os valores foram quantificados em relação à porcentagem de células
cultivadas sem soro.
4.7 Análise Estatística
A diferença entre os grupos foi avaliada pela análise de variância de uma
via (ANOVA). Quando o valor de F foi significativo comparações post hoc foram
32
feitas pelo teste de Newman-Keuls. Diferença entre grupos individuais foi avaliada
com teste t de Student. Correlação entre parâmetros bioquímicos e clínicos foi
determinada pelo teste de Pearson.
4.8 Aspectos Éticos
O estudo observa as normas éticas de conduta em pesquisa e foi
aprovado pelo Comitê de Ética da UNESC, conforme anexo 1.
33
5. RESULTADOS
Dos 33 pacientes que tiveram seu soro analisado, 10 apresentavam
critérios de sepse, sendo que destes um foi a óbito; 12 apresentavam critérios de
sepse severa e destes 7 foram a óbito; os pacientes que apresentaram choque
séptico foram 11 e destes 7 foram a óbito (tabela 2). O índice APACHE II para os
sobreviventes foi em torno de 16,1 e para os não sobreviventes foi de 26,4. Quanto
ao índice SOFA os pacientes sobreviventes apresentaram um escore em torno de
6,6 e os não sobreviventes em torno de 10,1(tabela 2).
Tabela 2: Dados Demográficos do Estudo
Não Sobreviventes Sobreviventes
Idade 57 + 15 62 + 22 NS
APACHE II 26,4 + 3 16,1 + 5 <0,001
SOFA 10,1 +
2,8 6,5 + 2,6 = 0,001
Sepse 1 (10%) 9 (90%)
Sepse Severa 7 (58%) 5 (42%)
Choque Séptico 7 (64%) 4 (36%) = 0,01
A produção de IL-1β por macrófagos de ratos Wistar estimulados pelo
soro coletado dos participantes do estudo, mostrou elevação estatisticamente
significante nos pacientes em pós-operatório imediato de cirurgia de
revascularização do miocárdio (CABG), nos pacientes com sepse e nos pacientes
com sepse severa, não apresentando elevação significativa nos pacientes com
choque séptico (figura 5).
34
p < 0,005
Figura 5: Concentração de IL - 1β e Severidade da Sepse
Avaliando a concentração de IL-1β e o desfecho do paciente séptico,
observou-se que houve um aumento estatisticamente significante de IL-1β nos
pacientes sobreviventes em relação aos não sobreviventes (figura 6).
p < 0,001
Figura 6: Concentração de IL-1β e Desfecho nos Pacientes Sépticos
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
healthy CABG Sepsis Severe sepsis Septic shock
IL-1
β
(% control)
*
*
*
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
non-survivor survivor
IL-1
β
(% control)
*
Saudável CAGB Sepse Sepse Severa Choque Séptico
Não sobrevivente Sobrevivente
35
Observando-se as correlações entre os índices APACHE II e SOFA
(figuras 7 e 8) com a concentração da IL-1β , percebe-se que existe uma correlação
negativa e com significância estatística.
Figura 7: Correlação APACHE II x IL-1β
Figura 8: Correlação SOFA x IL-1β
0,00 1000,00 2000,00 3000,00 4000,00
IL1
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
APACHEII
0,00 3,00 6,00 9,00 12,00 15,00
SOFA
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
IL1
r = -0.563 p=0.001
r = -0.522 p=0.002
36
Analisando a curva ROC da IL-1β, obtém-se uma área acima da curva de
0,883 sendo a IL-1β > 1360 pg/ml, mostrando uma sensibilidade de 94% e
especificidade de 77% para mortalidade dos pacientes (figura 9).
Figura 9: Curva ROC IL-1β
Com relação ao TNF-α, observou-se que a produção deste por
macrófagos de ratos Wistar estimulados pelo soro coletado dos participantes do
estudo, foi menor nos pacientes com sepse severa e choque séptico (figura 10).
p< 0,05
Figura 10: Concentração de TNF-α e Severidade da Sepse
0,00,20,40,60,81,0
1 - Specificity
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Sensitivity
ROC Curve
0
50
100
150
200
250
300
350
400
healthy CABG Sepsis Severe sepsis Septic shock
TNF-
α
(% control)
*
*
Saudável CAGB Sepse Sepse Severa Choque Séptico
37
Em relação a concentração de TNF-α e o desfecho no paciente séptico,
houve diferença com significância estatística entre sobreviventes e não
sobreviventes (figura 11).
Figura 11: Concentração de TNF-α e Desfecho da Sepse
Ao se observar as correlações entre os índices APACHE II e SOFA
(figuras 12 e 13) com a concentração de TNF-α produzido por macrófagos de ratos
Wistar estimulados pelo soro coletado dos participantes do estudo, percebe-se que
existe uma correlação negativa, mostrando que a piora dos índices, não é
acompanhada pelo aumento do TNF-α.
Analisando a curva ROC do TNF-α (figura 14), obtém-se uma área acima da
curva de 0,836, sendo o TNF-α > 137 pg/ml, mostrando uma sensibilidade de 81% e
especificidade de 77% para mortalidade dos pacientes estudados (figura 14).
0
50
100
150
200
250
300
350
non-survivor survivor
TNF-
α
(% control)
*
p < 0,001
Não sobrevivente Sobrevivente
38
Figura 12: Correlação APACHE II x TNF-α
Figura 13: Correlação SOFA x TNF-α
0,00 100,00 200,00 300,00 400,00
TNF
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
APACHEII
0,00 3,00 6,00 9,00 12,00 15,00
SOFA
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
TNF
r = -0.805 p<0.001
r = -0.691 p<0.001
39
Figura 14: Curva ROC TNF-α
Analisando-se a correlação entre TNF-α e IL-1β, percebe-se uma
correlação positiva e significante (figura 15), indicando que as duas citocinas estão
aumentando concomitantemente.
Figura 15: Correlação TNF-α x IL-1β
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
1 - Specificity
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Sensitivity
Diagonal segments are produced by ties.
ROC Curve
0,00 100,00 200,00 300,00 400,00
TNF
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
IL1
r = 0.49 p=0.002
40
Quanto à produção de Óxido Nítrico por macrófagos de ratos Wistar
estimulados pelo soro coletado dos participantes do estudo, os resultados revelam
um aumento estatisticamente significante nos casos de sepse e sepse severa (figura
16).
Figura 16: Concentração de Óxido Nítrico e Severidade da Sepse
Neste estudo não houve relação entre produção de NO por macrófagos de
ratos Wistar estimulados pelo soro coletado dos participantes do estudo e o
desfecho nos pacientes sépticos (figura 17).
Figura 17: Concentração de Óxido Nítrico e Desfecho nos Pacientes Sépticos
0
50
100
150
200
250
300
healthy CABG Sepsis Severe sepsis Septic shock
NO (% control)
*
*
0
50
100
150
200
250
300
non-survivor survivor
NO (% control)
p < 0,005
Saudável CAGB Sepse Sepse Severa Choque Séptico
p< 0,005
Não sobrevivente Sobrevivente
41
Quanto a IL-10 (figura 18) produzida por macrófagos de ratos Wistar
estimulados pelo soro coletado dos participantes do estudo, os dados revelaram
aumentos estatisticamente significantes nos casos de pós-operatório imediato de
revascularização do miocárdio e nos paciente em sepse severa e choque séptico
(figura 18).
Figura 18: Concentração de IL- 10 e Severidade da Sepse
Em relação à concentração de IL-10 produzida por macrófagos de ratos
Wistar estimulados pelo soro coletado dos participantes do estudo, e o desfecho no
paciente séptico, houve diferença com significância estatística entre sobreviventes e
não sobreviventes (figura 19), sendo que nos não sobreviventes a elevação de IL-10
foi maior.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
healthy CABG Sepsis Severe sepsis Septic shock
IL-10 (% controll)
**
*
p < 0,005
Saudável CAGB Sepse Sepse Severa Choque Séptico
42
Figura 19: Concentração de IL-10 e Desfecho da Sepse
Observando as correlações entre os índices APACHE II e SOFA (figuras
20 e 21) com a concentração de IL-10 produzida por macrófagos de ratos Wistar
estimulados pelo soro coletado dos participantes do estudo, percebe-se que existe
uma correlação positiva, apesar de fraca, evidenciando que quanto pior o índice,
mais alto o valor de IL-10.
Figura 20: Correlação APACHE II x IL-10
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
non-survivor survivor
IL-10 (% control)
*
p < 0.001
10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
APACHEII
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
IL10
Não sobrevivente Sobrevivente
r = 0.77 p<0.001
43
Figura 21: Correlação SOFA x IL-10
Ao se construir a curva ROC da IL-10, obteve-se uma área de 0.94 acima
da curva, sendo a IL-10 > 270 pg/ml, evidenciando uma sensibilidade de 93% e
especificidade de 99% (Figura 22).
Figura 22: Curva ROC IL-10
0,00 3,00 6,00 9,00 12,00 15,00
SOFA
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
IL10
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
1 - Specificity
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Sensitivity
Diagonal segments are produced by ties.
ROC Curve
r = 0.757 p<0.001
44
Em relação a fagocitose, observa-se que houve menor capacidade dos
macrófagos de ratos Wistar estimulados pelo soro coletado dos participantes do
estudo em fagocitar as bactérias nos casos de sepse grave, choque séptico e nos
pós operatórios de revascularização do miocárdio (figura 23).
Figura 23: Fagocitose e Severidade da Sepse
Observamos, ainda, que houve maior capacidade de fagocitose pelos
macrófagos de ratos Wistar estimulados pelo soro coletado dos participantes do
estudo nos casos que sobreviveram a sepse em relação aos que não-sobreviveram
(figura 24).
Saudável
Saudável
Saudável CABG Sepse Sepse Grave Choque Séptico
p< 0,005
UFC
45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
OBITO CURA
*
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
OBITO CURA
*
Figura 24: Fagocitose e Desfecho da Sepse
Analisando-se as correlações entre fagocitose e interleucinas observa-se
que as correlações das interleucinas pró-inflamatórias IL-1 e TNF-α (figuras 26 e 27),
apesar de fracas mostraram-se positivas. A correlação da fagocitose com a
interleucina 10 (antiinflamatória) é negativa, evidenciando que quanto maior a
Interleucina 10, menor a fagocitose (figura 25).
rr
Figura 25: Correlação entre Fagocitose e IL-10
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00
fagocitose
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
IL10
p< 0,005 Não sobrevivente Sobrevivente
r -0,437 p< 0,025
UFC
46
Figura 26: Correlação entre TNF-α e Fagocitose
Figura 27: Correlação entre IL- 1 e Fagocitose
Não há relação entre ação microbicida dos macrófagos de ratos Wistar
estimulados pelo soro coletado dos participantes do estudo e gravidade da sepse
em nenhum dos grupos (figura 28).
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00
fagocitose
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
IL1
0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00
fagocitose
0,00
100,00
200,00
300,00
TNF
r 0,582 p<0,001
r 0,612 p<0,0008
47
Figura 28: Microbicida e Gravidade da Sepse
Saudável CAGB Sepse Sepse Severa Choque Séptico
UFC
48
6. DISCUSSÃO
Embora existam muitas controvérsias no campo da sepse, é bastante
uniforme o pensamento de que o processo de doença da sepse é extremamente
complexo. Muitos modelos animais têm sido usados para buscar conhecer as
respostas fisiopatológicas da sepse (OSUCHOWSKI et al, 2006), tentando
recapitular as alterações observadas na sepse humana.
Neste estudo foi demonstrado o papel das interleucinas e mediadores
inflamatórios na ativação de macrófagos e sua relação com a gravidade e desfecho
dos pacientes com quadro de sepse, objetivando melhor entendimento da
fisiopatologia da sepse para a busca de melhores tratamentos.
A interleucina 1β, uma das principais interleucinas pró-inflamatórias, e que
demonstra ativação da via clássica dos macrófagos, apresentou um aumento
significante nos casos de sepse e sepse severa, não ocorrendo o mesmo no choque
séptico. Além disso, houve maior sobrevida dos pacientes sépticos que
apresentavam maior nível de IL-1β. Isto evidencia que a ativação de macrófagos por
via clássica ocorre em casos mais leves de sepse e cursa com melhor sobrevida. A
correlação entre os índices que denotam gravidade nos casos de sepse, como o
SOFA e APACHE II reafirmam esta hipótese, visto que quanto melhor o índice,
maior o nível de IL-1β.
O TNF-α apresentou menor elevação nos casos de maior severidade,
como sepse severa e choque séptico, sugerindo que, nos casos mais graves, há
menor quantidade de interleucina pró-inflamatória e, portanto, menor ativação dos
macrófagos pela via clássica. Estes dados foram corroborados pela maior
sobrevivência dos pacientes que apresentaram maior nível de TNF-α e pelas
49
correlações entre os índices de gravidade SOFA e APACHE II que demonstraram
que quanto maior a gravidade do caso, menor o TNF-α.
Em relação ao NO, que também está presente quando da ativação
clássica dos macrófagos, os resultados são semelhantes às outra interleucinas pró-
inflamatórias. Os dados revelam um aumento significante nos casos de sepse e
sepse severa e não nos casos de choque séptico. Porém, não houve relação entre a
expressão de NO e a sobrevivência dos pacientes; a substância mostrou relação
com severidades e não com desfecho da sepse. Isto, talvez se justifique pelo fato de
que o NO é citotóxico em algumas células e citostático em outras, o que sugere que
a sensibilidade ao NO varia de uma célula para outra. As razões para isto não estão
ainda bem esclarecidas, (HIBBS et al, 1990). Além disso, estes resultados podem
estar relacionados com o fato de que o NO apresenta outras atividades como
neurotransmissão, controle da pressão sanguínea, coagulação do sangue e
participação na capacidade do sistema imunológico de destruir células tumorais e
parasitas intracelulares (GRIFFITH et al, 1995).
A modulação da sinalização imunológica durante a sepse tem sido
considerada como uma possibilidade de melhorar a resposta do paciente, buscando
evitar a fase de “descontrole” da resposta inflamatória. Estudos experimentais de
sepse demonstraram que a neutralização de mediadores como TNF-α e IL-1β por
anticorpos específicos e antagonistas de receptores, respectivamente, têm efeitos
benéficos e podem proteger animais de desfecho letal da sepse (TCHAIKOWSKY et
al, 2002). Grandes ensaios clínicos indicam que, neutralizando um mediador pró-
inflamatório, há melhora na disfunção de órgãos e no segmento de pacientes
(TCHAIKOWSKY et al, 2002). Embora a regulação para baixo da síntese e liberação
excessiva de citocinas pro-inflamatórias no primeiro período após contato com o
50
microrganismo, pode ser um processo evolucionário para reduzir a incidência de
necrose nos tecidos e conseqüente falência de múltiplos órgãos, uma quase
completa inibição destas citocinas pode levar a uma imunodeficiência em pacientes
com sepse severa. Portanto, somente a síntese e liberação equilibrada de citocinas
pró-inflamatórias pode ser benéfica ao hospedeiro (ERTEL et al, 1995).
Quando são avaliados os resultados obtidos neste estudo no que concerne as
citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β), que promovem a ativação dos
macrófagos pela via clássica, pode-se perceber que há maior expressão destas
citocinas nos quadros menos severos de sepse e que estes casos apresentaram
maior índice de sobrevivência. As correlações entre os índices de gravidade de
doença e as citocinas pró-inflamatórias, demonstraram que, como o pressuposto,
estas citocinas apresentam menor expressão conforme maiores os índices SOFA e
APACHE II. Quanto maior a gravidade da doença, menor o índice de citocinas pró-
inflamatórias e menor ativação dos macrófagos por via clássica.
A Interleucina 10 (IL-10) apresenta conhecida propriedade antiinflamatória.
Em um estudo realizado por Friedman e colaboradores em 1997, foi confirmado que
esta interleucina é de fato parte da resposta inflamatória aguda, sendo liberada,
junto com citocinas pró inflamatórias como TNF e IL-6, em pacientes com choque
séptico. Além deste fato, os níveis de IL-10 estão diretamente correlacionados com a
severidade da inflamação e o desenvolvimento de falência de órgãos no choque
séptico.
Friedman e colaboradores, em 1997, também concluíram, que a liberação
de IL-10 durante o choque séptico, surge como uma resposta antiinflamatória natural
controlando a produção de outras citocinas e toxinas da bactéria invasora. Este fato
51
sugere que esta reação antiinflamatória é parte de um complexo sistema de
modulação da resposta imune.
Neste estudo houve aumento da nos casos de choque séptico e sepse
severa, sugerindo que houve ativação de macrófagos por via alternativa nos casos
mais graves de sepse. Em relação a mortalidade, esta foi maior quanto maior o
nível de IL-10. Os índices de gravidade corroboraram com estes dados, visto que
quanto pior o índice SOFA e o APACHE II, maiores os índices de IL-10. Podemos
afirmar que, quanto maior o índice de citocinas antiinflamatórias (demonstrando
maior ativação de macrófagos pela via alternativa), piores os índices de gravidade
SOFA e APACHE II e pior o desfecho da sepse.
Ertel e colaboradores, em 1995, levantaram a hipótese de que dois
mecanismos (resposta inflamatória sistêmica e sistema imune funcionando
efetivamente) são essenciais para o hospedeiro na eliminação de microrganismos
invasores durante a sepse, dependendo do tipo de ativação do macrófago. Gordon
em 2003, afirmou que muitos estudos mostraram que a ativação clássica dos
macrófagos depende da ativação específica de células T helper 1 (Th1) e que a
ativação alternativa dos macrófagos é produzida geralmente pelas células tipo T
helper 2 (Th2). Observando os efeitos antiinflamatórios e o possível papel no
trofismo e processo de reparo celular, alguns autores têm proposto que a ativação
alternativa de macrófagos tem poder de contribuir no controle do processo pró-
inflamatório e antiinflamatório em processos de saúde e doença. Desta maneira, o
conhecimento é essencial para o entendimento das mudanças dinâmicas que os
macrófagos mostram no limite das situações fisiológicas e patológicas, como base
para uma manipulação terapêutica mais seletiva (Gordon, 2003).
52
Takahashi et al em 2004 demonstraram em um estudo feito com
camundongos, que a regulação da ativação de macrófagos por via clássica em
indivíduos com sepse severa (que demonstraram ativação de macrófagos
preferencialmente pela via alternativa) pode melhorar a resistência a infecções
bacterianas no hospedeiro.
Dal-Pizzol 2004, afirmou que estratégias para prevenir a ativação alternativa
podem representar uma nova opção terapêutica em SIRS e sepse.
Em relação à fagocitose, que representa uma das armas que o hospedeiro
apresenta para defender-se de invasores e é realizada pelos neutrófilos e
macrófagos, os resultados obtidos neste estudo evidenciaram que houve menor
capacidade em fagocitar as bactérias nos casos de sepse grave e choque séptico.
Portanto, neste caso, a maior severidade da sepse relacionou-se com menor
fagocitose. Quando são analisadas as correlações entre IL-1β e TNF-α (pró-
inflamatórias) e a fagocitose, evidencia-se uma maior função fagocitária quanto
maior o nível de interleucinas pró-inflamatórias, demonstrando ativação do
macrófago por via clássica.
Já, quando se analisa a correlação da fagocitose com a IL-10, vê-se que é
negativa, portanto quanto maior a interleucina 10 (ativação alternativa do
macrófago), menor a capacidade de fagocitose pelo macrófago
A análise dos resultados deste estudo, permitem a afirmação de que há
uma relação direta entre aumento de interleucinas antiinflamatórias e a ativação de
macrófagos pela via alternativa, com menor capacidade de fagocitose pelo
macrófago e maior mortalidade por sepse grave e choque séptico.
Entretanto, em relação a capacidade microbicida do macrófago, não
houve diferença entre os grupos. Este fato não era esperado, pois se acreditava que
53
estes macrófagos tivessem menor capacidade microbicida nos casos mais graves de
sepse. Pode-se inferir que este fato tenha ocorrido, devido a possível presença de
uma população heterogênea de macrófagos nas placas analisadas, em virtude de
não se ter uma definição clara do momento de mudança da ativação macrofágica, e
estes macrófagos podem ter compensado a função microbicida. Uma outra
especulação é de que o tempo de cultivo possa ter sido curto para permitir a ação
dos macrófagos.
Os dados levantados neste estudo sugerem que o conhecimento e controle
do tipo de ativação dos macrófagos, poderia ser uma importante aquisição para o
tratamento da sepse, visto que a modulação desta resposta poderia levar a
diminuição do excesso de resposta inflamatória, bem como melhorar esta resposta
quando desejada maior atividade inflamatória do hospedeiro, como nos casos
severos de sepse, em que os macrófagos são ativados preferencialmente pela via
alternativa, que é antiinflamatória.
54
7. CONCLUSÃO
Buscando entender a relação entre SIRS/Sepse e as respostas imunes do
hospedeiro, examinou-se como a resistência antibacteriana realizada pelos
macrófagos é influenciada nas diferentes classificações da doença.
Os dados mostraram que nos casos mais leves de sepse (sepse e sepse
moderada) os níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, TNF-α) e de NO
apresentaram valores maiores, indicando ativação de macrófagos preferencialmente
pela via clássica e nestes casos se observou melhor desfecho da sepse.
Nos casos mais severos (sepse grave e choque séptico) houve maior
ativação de macrófagos pela via alternativa (com aumento de IL-10, interleucina anti-
inflamatória), observando-se pior desfecho dos casos de sepse.
Os resultados deste estudo permitem a inferência de que existe relação
diretamente proporcional entre a liberação de citocinas pró-inflamatórias,
principalmente o TNF-α, e a evolução clínica benéfica dos pacientes sépticos. A
atividade antiinflamatória mostrou relação diretamente proporcional ao pior
prognóstico e a pior evolução destes pacientes. Podemos ainda referir, que o TNF-α
mostrou-se a citocina pró-inflamatória mais fidedigna e o NO o pior, ou menos
fidedigno.
É importante ressaltar que algumas limitações podem ter interferência
nestes resultados, como o número reduzido de pacientes, pouco tempo no cultivo do
macrófago para medida do seu potencial bactericida, o grau de estresse dos
voluntários saudáveis que podem ter levado a um aumento das citocinas neste
grupo. Porém, acreditamos que este estudo pode ser importante na busca de
55
modulação da resposta inflamatória o que poderia propiciar um diagnóstico e
tratamento mais precoce possível, o que ainda é a maior arma para vencer a sepse.
56
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62
ANEXO
63
ANEXO 1 – Resolução Comitê de Ética
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