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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
KATIA CRISTINA UGOLINI MUGNOL
ESTADOS DE SPIN E PROPRIEDADES CATALÍTICAS
DE PORFIRINAS EM MICROAMBIENTES DE
APOPROTEÍNAS, MICELAS E LIPOSSOMOS
MOGI DAS CRUZES
2009
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
KATIA CRISTINA UGOLINI MUGNOL
ESTADOS DE SPIN E PROPRIEDADES CATALÍTICAS
DE PORFIRINAS EM MICROAMBIENTES DE
APOPROTEÍNAS, MICELAS E LIPOSSOMOS
Orientadora : Prof. Dra. Iseli Lourenço Nantes
MOGI DAS CRUZES
2009
Tese apresentada à Universidade de
Mogi das Cruzes para obtenção do
título de Doutora em Biotecnologia.
Área de Concentração: Biológica
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ICHA
C
ATALOGRÁFICA
Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Mugnol, Katia Cristina Ugolini
Estados de spin e propriedades catalíticas de
porfirinas em microambientes de apoproteínas, micelas e
lipossomos / Kátia Cristina Ugolini Mugnol. – 2009.
233 f.
Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade de
Mogi das Cruzes, 2009
Área de concentração: Ciências Biológicas
Orientador: Profª Drª Iseli Lourenço Nantes
1. Porfirinas 2. Espectroscopia 3. Atividade
catalítica 4. Apoproteínas 5. Micelas 6. Lipossomos I.
Nantes, Iseli Lourenço
CDD 660.6
DEDICATÓRIA
Dedico esta conquista ...
Ao meu adorado pai, Valério, que sempre demonstrou com seu
exemplo que com esforço e honestidade somos capazes de superar as
agruras da vida para alcançar nossos objetivos.
À minha querida mãe, Zelma, que sempre foi cúmplice nas minhas
conquistas e que com sua perseverança demonstrou que nós
construímos os nossos talentos, nosso futuro e nossa felicidade.
Ao meu querido irmão e amigo, Marco Antônio, por seu apoio, por seus
conselhos, pela parceria nas horas mais inusitadas e pelo
fortalecimento da esperança de que somos capazes de superar nossas
próprias expectativas.
À minha cunhada e irmã, Adriana, por ter conquistado meu coração e
meu respeito durante os anos em que enfrentamos juntas tantos
desafios e me mostrado que somos capazes de ser e fazer muito mais
quando somos capazes de amar.
À orientadora e amiga, Iseli, por ter aberto tantas oportunidades e
por ter me mostrado todos os dias destes últimos anos que a ciência
é mais do que desafio, é paixão, e que somente com dedicação e muito
suor somos capazes de dar nossa contribuição.
À todos os amigos que dela participaram, direta ou indiretamente.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Otaciro Rangel Nascimento pela importante contribuição para este
trabalho, pelo carinho, pela paciência e acima de tudo pelo exemplo de vida.
Ao Prof Dr Ivarne Tersariol, pelas muitas orientações, críticas e pelos momentos
de descontração durante o árduo trabalho.
Ao Prof Dr Tiago Rodrigues, por sua colaboração e por seu exemplo de que a
dedicação e a vocação superam a inexperiência da juventude e são capazes de construir
alicerces sólidos na ciência.
À Profa Dra Regina Lúcia Batista Costa de Oliveira pela contribuição em etapas
importantes deste trabalho e pessoalmente por sua amizade e exemplo de força e
competência.
Ao Prof Dr Rafael Radi pela oportunidade de tanto aprendizado técnico,
científico, cultural e humano no período em que passei em seu laboratório na Facultad de
Medicina de La Universidad de La Republica em Montevidéu, Uruguai. Posso dizer, com
certeza, que foram os melhores meses da minha vida.
Às Profas Dras Laura Castro e Mónica Marín por sua acolhida, amizade e
importante contribuição científica enquanto estive no Uruguai e à querida Profa
Verónica Tórtora, amiga de todas as horas e guia incansável no passo a passo de todos os
projetos conduzidos em Montevidéu.
Aos queridos amigos de Montevidéu, que para sempre estarão guardados na minha
alma por seu exemplo de dedicação e superação na conquista de seus objetivos.
Aos queridos amigos do Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica, em
especial Cíntia Kawai, Carolina Gregorutti, Priscila Afonso de Faria, Felipe Pessoto, César
Henrique Yokomizo, Tatiana Prieto, Juliana Conrado, Juliana Mafra, Juliana Casares,
Débora Pereira Santana e Guilherme de Oliveira por sua parceria nesta conquista e pelos
agradáveis momentos que passamos juntos.
À Universidade de Mogi das Cruzes (UMC) e Fundação de Amparo ao Ensino e
Pesquisa (FAEP) pelo apoio estrutural e financeiro.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
bolsa concedida e pela oportunidade de estágio de doutorado no exterior.
“O segredo é não correr atrás das borboletas ... É cuidar do jardim
para que elas venham até você.”
Mário Quintana
RESUMO
Porfirinas são moléculas de extrema importância na natureza e hoje têm seu papel ampliado,
uma vez que vêm sendo empregadas também como ferramentas nanotecnológicas envolvidas
no tratamento de efluentes e resíduos industriais, no desenvolvimento de biosensores, em
sistemas de captação de energia solar e também em terapia fotodinâmica como uma nova
arma no tratamento do câncer. O estudo de como as porfirinas se interrelacionam com
membranas biológicas, proteínas e outras biomoléculas é possível mediante a utilização de
sistemas-modelo de membrana, como micelas e lipossomos, o que permite não só o
conhecimento dos processos metabólicos em que estão envolvidas como também a modulação
dos mesmos. A interação de porfirinas com apohemoproteínas é particularmente interessante,
permitindo o estudo das interações entre o grupo prostético representado pela porfirina e a
cadeia proteica, ponto chave, por exemplo, na biogênese do citocromo c. A formação de
complexos entre proteínas não biológicas e apohemoproteínas, por sua vez, tem potenciais
aplicações biotecnológicas no futuro. Neste trabalho, focamos o estudo da atividade catalítica,
do estado de spin e dos ligantes axiais do ferro porfirínico a partir da interação da
protoporfirina IX e da porfirina não-biológica meso-tetrakis 2,6-dicloro-3-sulfonatofenil
(Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP) com apocitocromo c e apomioglobina na forma de complexos não-
covalentes tendo como sistemas-modelo comparativos de meios hidrofóbicos micelas
aniônicas de SDS, catiônicas de CTAB e lipossomos de DODAB. O trabalho revelou a partir
de espectroscopia no UV-vis e de fluorescência, CD e MCD e EPR que a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP possui atividade catalítica sobre peróxidos e aldeídos e que na
presença de apocitocromo c forma com ele um complexo não-covalente bem estruturado que
perde esta atividade. Complexada ao apocitocromo c e também à apomioglobina, a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP passa de forma alto para baixo spin, indicando hexacoordenação com
ligantes de campo forte, formando uma estrutura bis-histidina, confirmada a partir de
complexos não-covalentes porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c mutado nas
histidinas 26 e 33 (H26N/H33N). A protoporfirina IX, por sua vez, também apresenta
atividade catalítica sobre peróxidos e aldeídos, preservada inclusive quando a porfirina está
complexada a apocitocromo c e apomioglobina. Nestas condições, porém, mantém-se na
forma alto spin, pentacoordenada. Por microscopia de força atômica foram evidenciadas
nanoestruturas formadas quando da associação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com
lipossomos de DODAB, as quais possuem perspectivas de aplicação nanotecnológica em
diferentes áreas.
Palavras chave: porfirina, espectroscopia, micelas, apohemoproteínas, citocromo c, estados
de spin, atividade catalítica.
ABSTRACT
Porphyrins are important molecules in nature and now have their role expanded, as have been
employed as tools for nanotechnology also involved in wastewater treatment and industrial
waste, development of biosensors, systems of solar energy and also in photodynamic therapy
as new weapon in cancer treatment. The study of how porphyrins are interrelated with
biological membranes, proteins and other biomolecules is possible through the use of model
systems for membrane as micelles and liposomes, which allows not only the knowledge of the
metabolic processes that are involved as well as modulation of the same. The interaction of
porphyrins with apohemoproteins is particularly interesting, allowing the study of interactions
between the prosthetic group represented by the porphyrin and the protein chain, fundamental,
for example, in the biogenesis of cytochrome c. The formation of complexes between proteins
and non-biological porphyrins, in turn, has potential biotechnological applications in the
future. In this paper, we focus on the study of the catalytic activity of the spin state and axial
ligand of iron porphyrin from the interaction of protoporphyrin IX and non-biological
porphyrin meso-tetrakis 2,6-dichloro-3-sulfonatophenyl (Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP) with
apocytochrome c and apomyoglobin in the form of non-covalent complexes and with model
systems of hydrophobic medium, the anionic and cationic micelles of SDS and CTAB,
respectively, and DODAB liposomes. The work revealed from spectroscopic UV-vis and
fluorescence, CD and MCD and EPR that the Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP in homogeneous
medium exhibit catalytic activity with peroxides and aldehydes and when incorporated by
apocytochrome c in a non-covalent form the porphyrin lost this activity. Complexed with
apocytochrome c or with apomyoglobin the porphyrin Fe(III)TDC (SO
3
-
Na
+
)PP is so high to
low spin, indicating hexacoordination with strong field ligands, forming a bis-histidine
structure, confirmed by non-covalent complex Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocytochrome c
mutated in the histidines 26 and 33 (H26N/H33N). The protoporphyrin IX, in turn, also shows
catalytic activity with peroxides and aldehydes, preserved even when the porphyrin is
complexed to apocytochrome c and apomyoglobin. Under these conditions, however, remains
as high spin form, pentacoordinated. By atomic force microscopy were shown nano-structures
formed when the association of porphyrin Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP with DODAB liposomes,
which have prospects of nanotechnology application in different areas.
Key words: porphyrin, spectroscopy, micelles, apohemeproteins, cytochrome c, spin states,
catalytic activity.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1.
Estrutura geral das porfirinas ................................................................
20
Figura 2.
Porfirinas de ocorrência natural ............................................................
21
Figura 3.
Isômeros possíveis para uma porfirina ..................................................
22
Figura 4.
Nomenclatura de porfirinas segundo Fisher .........................................
22
Figura 5.
Nomenclatura de porfirinas segundo a IUPAC .....................................
23
Figura 6.
Porfirina 1,4-dietil-1,3,5,8-tetrametilporfirina-6,7-ácido propiônico ...
23
Figura 7.
Estrutura do porfobilinogênio ...............................................................
24
Figura 8.
Protoporfirina IX ...................................................................................
25
Figura 9.
Hemoproteínas de importância biológica baseadas em ferro ................
27
Figura 10.
Automontagem de porfirinas com clusters de rutênio ..........................
28
Figura 11.
Porfirina modificada com unidades de rutênio-bipiridina ....................
29
Figura 12.
Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP ........................................................
32
Figura 13.
Estrutura micelar básica ........................................................................
34
Figura 14.
Modelo de lipossomo ............................................................................
34
Figura 15.
Modelo de interação grupo heme-cadeia proteica ................................
36
Figura 16.
Plasmídio PJRhrsN2 .............................................................................
54
Figura 17.
Estruturas do SDS e do CTAB ..............................................................
62
Figura 18.
Estrutura do DODAB ............................................................................
63
Figura 19.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato de sódio com t-BuOOH ............................................................
69
Figura 20.
Espectros de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato de sódio com t-BuOOH ............................................................
71
Figura 21.
Espectros de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato de sódio com t-BuOOH ..........................................................
72
Figura 22.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato de sódio com DPAA .................................................................
73
Página
Figura 23.
Espectros de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato de sódio com DPAA .................................................................
74
Figura 24.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato de sódio com t-BuOOH e DPAA .............................................
75
Figura 25.
Espectro UV-vis da protoporfirina IX em tampão fosfato de sódio
com t-BuOOH ......................................................................................
76
Figura 26.
Espectro de EPR da protoporfirina IX em tampão fosfato de sódio
com t-BuOOH ......................................................................................
77
Figura 27.
Espectros UV-vis e de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em
micelas de SDS .....................................................................................
78
Figura 28.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em micelas de
SDS com t-BuOOH .............................................................................
80
Figura 29.
Espectros de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em micelas
de SDS com t-BuOOH ........................................................................
81
Figura 30.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em micelas de
SDS com DPAA ....................................................................................
82
Figura 31.
Espectro UV-vis da protoporfirina IX em tampão fosfato de sódio e
em SDS .................................................................................................
83
Figura 32.
Espectro UV da protoporfirina X em micelas de SDS sob ação de
t-BuOOH ...............................................................................................
84
Figura 33.
Espectros de EPR da protoporfirina em SDS com t-BuOOH .............
85
Figura 34.
Espectro UV-vis e de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em
tampão fosfato de sódio e em micelas de CTAB ..................................
86
Figura 35.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em micelas de
CTAB com t-BuOOH .........................................................................
87
Figura 36.
Espectros de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em micelas
de CTAB com t-BuOOH .....................................................................
88
Figura 37.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em micelas de
CTAB com DPAA ................................................................................
89
Figura 38.
Espectro UV-vis da protoporfirina IX em micelas de CTAB com t-
BuOOH ................................................................................................
91
Figura 39.
Espectro de EPR da protoporfirina IX em micelas de CTAB com t-
BuOOH ...............................................................................................
92
Figura 40.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato e em lipossomos de DODAB ....................................................
93
Página
Figura 41.
Espectro de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato de sódio e em lipossomos de DODAB .....................................
94
Figura 42.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em lipossomos
de DODAB sob ação de t-BuOOH .....................................................
95
Figura 43.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em lipossomos
de DODAB sob ação de DPAA ............................................................
96
Figura 44.
Imagem macroscópica das estruturas poliméricas formadas entre a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e lipossomos de DODAB ..............
97
Figura 45.
Imagem por microscpia de força atômica das estruturas formadas
entre a Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e os lipossomos de DODAB .............
98
Figura 46.
Espectro UV-vis e de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em
tampão fosfato e com histidina .............................................................
100
Figura 47.
Espectro de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
fosfato e com histidina ..........................................................................
101
Figura 48.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
histidina com t-BuOOH ......................................................................
102
Figura 49.
Comparação entre as velocidades de reação da porfirina com t-
BuOOH em tampão fosfato e com histidina .......................................
103
Figura 50.
Espectro de EPR da porfirina em tampão histidina com t-BuOOH ....
104
Figura 51.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
histidina pH 5,5, com t-BuOOH ..........................................................
105
Figura 52.
Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão
histidina com DPAA .............................................................................
106
Figura 53.
Espectro UV-vis dos complexos Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e
protoporfirina IX em apocitocromo c ...................................................
108
Figura 54.
Espectro de fluorescência da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em
tampão fosfato e em apocitocromo c ....................................................
110
Figura 55.
Espectro de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da
protoporfirina IX em apocitocromo c ...................................................
112
Figura 56.
Espectro de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da
protoporfirina IX em apocitocromo c ...................................................
113
Figura 57.
Espectro UV-vis do complexo porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c com t-BuOOH ................................................
114
Figura 58.
Espectro de EPR do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c com t-BuOOH ..............................................
115
Página
Figura 59.
Espectro UV-vis do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo
c com DPAA .........................................................................................
116
Figura 60.
Representação da estrutura terciária do citocromo c com destaque aos
aminoácidos substituídos ......................................................................
117
Figura 61.
Eletroforese em gel de agarose dos plasmídios C14A/H26N/H33N e
C17A/H26N/H33N ...............................................................................
118
Figura 62.
Sequenciamento pelo método de Sanger e análise do DNA
plasmidial C14A/H26N/H33N ..............................................................
119
Figura 63.
Sequenciamento pelo método de Sanger e análise do DNA
plasmidial C17A/H26N/H33N ..............................................................
119
Figura 64.
Western-blot dos produtos de expressão dos plasmídios pwt,
C14A/H26N/H33N e C17A/H26N/H33N ............................................
121
Figura 65.
Imagens da coluna cromatográfica, produto da eluição e espectro
UV-vis do citocromo c pwt ...................................................................
123
Figura 66.
Espectro UV-vis dos complexos da Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da
protoporfirina IX com o apocitocromo c pwt .......................................
124
Figura 67.
Espectro UV-vis do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo
c pwt em comparação ao com o apocitocromo nativo ..........................
125
Figura 68.
Espectro de MCD dos complexos entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e apocitocromos c nativo e pwt ................................................
127
Figura 69.
Espectro UV-vis do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo
c pwt com t-BuOOH ...........................................................................
128
Figura 70.
Espectro de EPR do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt com t-BuOOH ........................................
129
Figura 71.
Espectro UV-vis do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo
c pwt com DPAA ..................................................................................
130
Figura 72.
Espectro UV-vis e de MCD do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina ..........................................................................
132
Figura 73.
Espectro de MCD do complexos da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e apocitocromo c e apomioglobina .........................................
133
Figura 74.
Espectro de EPR do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina ..........................................................................
133
Figura 75.
Espectro UV-vis do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina com t-BuOOH ...............................................
134
Figura 76.
Espectro UV-vis do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina com t-BuOOH ................................................
135
Página
Figura 77.
Espectro UV-vis da mioglobina com t-BuOOH .................................
136
Figura 78.
Espectro UV-vis da mioglobina com DPAA ........................................
137
Figura 79.
Espectro UV-vis e de MCD do complexo protoporfirina
IX/apomioglobina .................................................................................
138
Figura 80.
Espectro de MCD dos complexo protoporfirinaIX/apocitocromo c e
protoporfirina IX/apomioglobina ..........................................................
139
Figura 81.
Espectros de EPR dos complexo protoporfirina IX/apocitocromo c e e
protoporfirina IX/apomioglobina ..........................................................
139
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1.
Análise comparativa entre as sequências de aminoácidos do
citocromo c nativo, citocromo c expresso a partir do plasmídio
PJRhrsN2 (H26N/H33N) e das formas mutantes de citocromos c
C14A/H16N/H33N e C17A/H16N/H33N ...........................................
120
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
t-BuOOH – tert-butil hidroperóxido
DPAA – difenilacetaldeído
SDS – dodecil-sulfato de sódio
CTAB – brometo de dexadeciltrimetilamonio
DODAB – dioctadecil-metilamonio
ROOH – peróxido
pwt – pseudo-wild type
PDT – terapia fotodinâmica
AFM – microscopia de força atômica
SPM – scanning probe microscopy
CD – dicroísmo circular
MCD – dicroísmo circular magnetic
EPR – ressonância paramagnética eletrônica
UV-vis – ultra-violeta visível
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO .....................................................................................................
19
1.1. As Porfirinas ....................................................................................................
20
1.2. Hemoproteínas .................................................................................................
24
1.3. Porfirinas e aplicações bio e nanotecnológicas ...............................................
27
1.3.1. A porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP .....................................................
31
1.4. Interação de porfirinas com sistemas heterogêneos ........................................
33
1.4.1. Micelas, vesículas e lipossomos como ambientes heterogêneos
para porfirinas .........................................................................................
33
1.4.2. Complexos porfirina-apoproteína ..........................................................
36
1.4.2.1. Complexos não-covalentes porfirina-apoproteína ....................
38
1.4.2.2. Utilização de proteínas recombinantes no estudo da interação
entre porfirinas e apoproteínas ..................................................
40
1.5. Propriedades catalíticas das porfirinas ............................................................
41
1.6. Caracterização espectroscópica de porfirinas ..................................................
47
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................
51
2.1. Objetivos gerais ...............................................................................................
51
2.2. Objetivos específicos .......................................................................................
51
3. MÉTODOS ...............................................................................................................
52
3.1. Síntese da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e preparo das soluções ............
52
3.2. Obtenção das apohemoproteínas – apocitocromo c e apomioglobina .............
52
3.2.1. Obtenção do apocitocromo c .................................................................
52
3.2.2. Obtenção da apomioglobina ..................................................................
53
3.3. Obtenção de formas mutantes de citocromo c por mutação sítio-dirigida ......
54
3.3.1. Construção dos oligonucleotídeos para cada mutação desejada ...........
56
3.3.2. Obtenção dos plasmídios com as mutações sítio-específicas ................
57
3.3.3. Isolamento e eletroforese do DNA plasmidial mutante ........................
58
3.3.4. Sequenciamento do DNA plasmidial ....................................................
59
3.3.5. Transformação em vetores de expressão ...............................................
59
3.3.6. Expressão e purificação das formas mutantes de citocromo c ..............
60
Página
3.3.7. Eletroforese da proteína mutante em gel de acrilamida ........................
61
3.3.8. Técnica de western-blot usando anticorpo anti-citocromo c .................
61
3.4. Preparo das micelas aquosas de SDS e CTAB ................................................
62
3.5. Preparo de lipossomos de DODAB .................................................................
62
3.6. Preparo dos filmes para microscopia de força atômica ...................................
63
3.7. Preparo de soluções para testes de atividade catalítica ...................................
64
3.8. Espectroscopia de absorção UV-vis ................................................................
64
3.9. Espectroscopia de fluorescência ......................................................................
65
3.10. Dicroísmo Circular (CD) e Dicroísmo Circular Magnético (MCD) .............
65
3.11. Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) ..............................................
65
3.12. Microscopia de Força Atômica .....................................................................
66
3.13. Análise dos dados ..........................................................................................
67
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................
68
4.1. Características espectroscópicas, estados de spin e atividade catalítica da
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da protoporfirina IX em ambientes
homogêneo e heterogêneo não-proteico ..........................................................
68
4.1.1. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina X em meio
homogêneo ..............................................................................................
68
4.1.2. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina X em meio
heterogêneo .............................................................................................
78
4.1.2.1. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina X em meio
heterogêneo de micelas aniônicas de SDS ..............................................
78
4.1.2.2. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina X em meio
heterogêneo de micelas catiônicas de CTAB .........................................
85
4.1.2.3. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina X em meio
heterogêneo de lipossomos de DODAB ...............................................
93
4.1.3. Efeito da histidina como ligante axial do ferro no estado de spin e na
atividade catalítica da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP .....................
99
4.2. Características espectroscópicas, estados de spin e atividade catalítica de
porfirinas em ambientes protéicos ....................................................................
107
Página
4.2.1. Características espectroscópicas e atividade catalítica dos complexos
não-covalentes porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c e
protoporfirina IX/apocitocromo c ...........................................................
107
4.2.2. Investigação dos possíveis ligantes do ferro porfirínico em complexos
não-covalentes porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c e
protoporfirina IX/apocitocromo c utilizando formas mutantes de
citocromo c .............................................................................................
117
4.2.3. Características espectroscópicas, atividade catalítica e estado de spin
dos complexos Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina e
protoporfirina IX/apomioglobina ...........................................................
131
5. CONCLUSÕES .......................................................................................................
141
6. PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................................
144
REFERÊNCIAS .........................................................................................................
146
ANEXO A ....................................................................................................................
159
ANEXO B ....................................................................................................................
204
1. INTRODUÇÃO
Pág.19
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
1. INTRODUÇÃO
Porfirinas são moléculas que exercem papel de vital importância em diferentes
sistemas biológicos e hoje, mesmo as de caráter não-biológico, têm várias aplicações já
demonstradas, principalmente no que concerne às áreas de nanotecnologia e construção de
sistemas supramoleculares. Sendo as porfirinas moléculas de grande importância em sistemas
biológicos e tendo-se desenvolvido métodos para obtenção de porfirinas sintéticas visando
inicialmente seu uso como catalisadores de reações de oxidação de hidrocarbonetos, o estudo
de suas propriedades básicas e da capacidade que possuem de interagir com outros compostos
formando complexos ativos abre perspectivas para diferentes aplicações práticas em
biotecnologia, nanotecnologia e química supramolecular.
Suas propriedades catalíticas favorecem sua utilização como catalisadores no
tratamento de efluentes e resíduos industriais, assim como para o desenvolvimento de
biossensores
(
1
)
sendo que, paralelamente, as porfirinas podem ser também empregadas na
terapia fotodinâmica (PDT) contra vários tipos de neoplasias, dada sua capacidade de gerar
oxigênio singlete quando submetidas à irradiação em face de sua atividade
fotosensibilizadora. Compostos de coordenação contendo íons Európio (Eu
3+
) deixaram de ser
utilizados unicamente em sistemas ópticos e como marcadores de ensaios baseados em
fluorimetria e hoje, quando associados a determinadas porfirinas, demonstram ser capazes de
atuar também como agentes iniciadores de necrose pós-irradiação e assim serem úteis na PDT
(
2
,
3
,
4
,
5
,
6
,
7
)
.
Outro exemplo prático é a aplicação de compostos-modelo contendo porfirinas no
estudo de sistemas fotossintéticos e em processos de aproveitamento de energia solar.
Sistemas doador-receptor contendo porfirinas têm sido estudados para evidenciar os vários
postulados sobre a transferência de elétrons. Nestes sistemas são avaliados parâmetros
fotoquímicos e fotofísicos como geometria molecular, diferença de potencial eletrônico,
distância para transferência de energia entre outros aspectos relativos ao tema
(
8
)
.
Além das aplicações biotecnológicas, a compreensão de fenômenos biológicos
também envolve o estudo da relação, por exemplo, entre porfirinas e membranas biológicas
ou entre porfirinas e proteínas. A compreensão da biogênese do citocromo c, importante
hemoproteína envolvida no transporte de elétrons mitocondrial e na apoptose, pode advir de
estudos desta natureza, onde sistemas miméticos fornecem informações fundamentais para a
compreensão de fenômenos biológicos complexos.
1. INTRODUÇÃO
Pág.20
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
1.1 As Porfirinas
Na Idade Média, principalmente na Grécia, os nobres se utilizavam de trajes tingidos
com um pigmento de cor púrpura intensa, tonalidade esta tida como um sinal de poder e
privilégio, visto que o pigmento era bastante raro, extraído de moluscos pelos fenícios, e
comercializado a preços impraticáveis para a população em geral. O termo porphura,
originário do grego, foi empregado para definir essa cor
(
9
)
. Em função de coloração similar,
uma classe de moléculas organometálicas ganhou a denominação de porfirina.
Porfirinas são definidas como uma grande classe de moléculas fortemente coradas ou
púrpuras, de origem natural ou sintética, que têm em comum uma estrutura química formada
por um anel macrocíclico aromático consistindo de quatro resíduos tipo pirrol, este um anel de
cinco membros de quatro átomos de carbono e um átomo de nitrogênio, mantidos unidos por
grupos meteno (Figura 1). A maioria das porfirinas contém na porção central um metal de
transição, geralmente o ferro, o qual é diretamente responsável pela maioria das funções
exercidas pela porfirina
(
10
)
.
Neste caso, o metalomacrociclo formado é chamado de
metaloporfirina ou heme
(
11
)
.
A importância biológica que as porfirinas
exercem é inquestionável. Foi o químico alemão Hans
Fischer, prêmio Nobel de Química em 1930 por seus
estudos sobre porfirinas, que abriu caminho para estudos
que permitiram demonstrar que pequenas variações no
tema estrutural básico do macrociclo tetrapirrólico levam
a grande diversidade de funções bioquímicas. Hoje é
sabido que não são poucos os representantes biológicos
dessa importante classe de moléculas. Várias proteínas,
como a hemoglobina, a mioglobina, os citocromos e a
clorofila têm porfirinas como constituinte prostético. Na
hemoglobina e na mioglobina, por exemplo, a protoporfirina IX, um heme complexado com
ferro, atua como ligante reversível do oxigênio, permitindo o transporte deste pelo corpo ou
sua estocagem em tecidos musculares. Já a clorofila, que também possui como constituinte
um macrociclo tetrapirrólico, possui como íon metálico central o magnésio.
Substituições em quaisquer das oito posições periféricas que compõem a estrutura
básica de uma porfirina acarretam assim modificações estruturais e funcionais importantes.
N
N
NH
NH
X
X
X
X
X
X
X
X
Figura 1 - Estrutura geral das
porfirinas.
1. INTRODUÇÃO
Pág.21
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Tem-se como exemplo três importantes porfirinas de importância biológica: as uroporfirinas,
as coproporfirinas e as protoporfirinas (Figura 2). Para cada uma delas são quatro as formas
isoméricas conhecidas, sendo que as de ocorrência natural pertencem aos tipos I ou ao III,
sendo que apenas este último desempenha um papel funcional na síntese do heme.
Figura 2 - Alguns exemplos de porfirinas de ocorrência natural
Assim, havendo dois grupos diferentes, há quatro isômeros possíveis para uma
porfirina. Seguindo um dos exemplos citados acima, o da uroporfirina, tem-se quatro grupos
ácido acético (CH
2
CO
2
H), representados no Figura 3 pela letra A e quatro grupos ácido
propiônico (CH
2
CH
2
CO
2
H), representados no mesmo esquema pela letra P. Quatro tipos
diferentes de configurações são possíveis e tendem a promover diferentes propriedades às
moléculas. No caso da uroporfirina, é a configuração do tipo III que possui atividade
biológica.
M
P
M
M
M
P
P
P
P
P
P
P
A
A
A
A
V
P
P
M
M
V
M
M
Coproporfirina III Uroporfirina III Protoporfirina IX
Sendo M = metil, P = ácido propiônico, A = ácido acético, V = vinil
1. INTRODUÇÃO
Pág.22
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 3 – Combinações possíveis formando isômeros para uma porfirina. A letra A representa os grupos ácido
acético e a letra P os grupos ácido propiônico.
As porfirinas biológicas, mas principalmente as sintéticas, assumem hoje a
nomenclatura determinada pela IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry),
introduzida em 1979 e finalizada em 1987. Entretanto muitas ainda aparecem na literatura
seguindo as denominações conforme a nomenclatura de Fischer.
Pela nomenclatura de Fischer, os carbonos recebem designações conforme o Figura 4
sendo um exemplo a -mesotetrakisfenilporfirina.
Figura 4 – Sistemática da nomenclatura definida por Fisher, tendo a -mesotetrakisfenilporfirina como um
exemplo.
N
NH
N
NH
I
II
III
IV
1
2
3
4
5
6
7
8
-cabonos
-carbonos 1 a 8
Meso-carbonos , ,
e
N
N
N
N
-mesotetrakisfenilporfirina
1. INTRODUÇÃO
Pág.23
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Já pela sistemática da IUPAC todos os átomos são seqüencialmente numerados,
conforme demonstrado na Figura 5.
Como outro exemplo, a porfirina apresentada na Figura 6, pela nomenclatura segundo
Fischer, é denominada como 2,4-dietil-1,3,5,8-tetrametilporfirina-6,7-ácido dipropiônico
enquanto pela IUPAC passa a ser dita 7,12-dietil-
3,8,13,17-tetrametilporfirina-2,18-ácido dipropiônico.
As porfirinas podem ser classificadas em três
grandes categorias: as originárias de um heme natural, as
alquil-substituídas e as meso-tretrafenilporfirinas e seus
derivados, podendo todas elas serem hoje sintetizadas em
laboratório por métodos químicos. Para este trabalho
utilizamos uma porfirina originária de heme natural,
biológica, e uma meso-tetrafenilporfirina sintética, não-
biológica.
N
N
N
N
Me
Me
Me
Me
Co
2
H
Co
2
H
Figura 6– Porfirina 2,4-dietil-1,3,5,8-
tetrametilporfirina-6,7-ácido
dipropiônico
N
N
N
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
8
1
8
2
8
3
Figura 5 – Sistemática IUPAC para
denominação de porfirinas.
1. INTRODUÇÃO
Pág.24
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
1.2 Hemoproteínas
O complexo formado entre proteínas específicas e porfirinas compõe o que se
denominada hemoproteína. As hemoproteínas são, portanto, estruturas em que o grupo heme
está envolvido pela estrutura tridimensional formada pela cadeia polipeptídica que compõe a
proteína. Na maioria dos casos, somente a combinação do heme com a cadeia protéica confere
funcionalidade à proteína, que ativa passa a ser denominada holoproteína. Elas são
onipresentes na natureza e representam funções de máxima importância, estando envolvidas
em uma variedade de processos biológicos que vão do transporte e armazenamento de O
2
à
transferência reversível de elétrons e catálise homolítica e heterolítica por reações redox. Mais
recentemente as hemoproteínas têm tido reconhecida sua participação também no transporte
de óxido nítrico.
As hemoproteínas diferem uma das outras pela cadeia polipeptídica, pela estrutura do
grupo heme, pelo estado de oxidação do ferro e principalmente pelo ligante axial. O maior
diâmetro do átomo de ferro implica em que o mesmo se desloque lateralmente enquanto
coordena-se com os átomos de nitrogênio apicais dos quatro grupos pirrólicos
(
12
)
. A
influência da orientação dos planos dos ligantes axiais é efetiva sobre a configuração
eletrônica e as propriedades das hemoproteínas frente aos demais sistemas ferroporfirínicos
em geral.
Em moléculas biológicas as porfirinas são constituídas por quatro moléculas do
derivado monopirrólico dito porfobilinogênio (Figura 7). A síntese do heme ocorre parte na
mitocôndria e parte no citosol. Os eritrócitos são os mais importantes centros de biossíntese
do heme, respondendo por cerca de 85% do total produzido no
organismo. Os outros 15% são quase que totalmente sintetizados
pelas células hepáticas, onde o nível de produção é ajustado
conforme as condições metabólicas, diferentemente do que ocorre
nos eritrócitos, onde a síntese do heme ocorre apenas até o
momento em que a célula atinge a maturidade
(
13
)
.
A síntese se dá a partir da glicina e da succil-CoA, que
sofre condensação catalisada pela 5-ALA sintase, enzima
mitocondrial reguladora da síntese do heme, formando-se o 5-
ALA (ácido 5--aminolevulínico). No citosol, duas destas
moléculas se condensam formando uma molécula que contém um
anel pirrol, o porfobilinogênio (PBG). Quatro PBGs, por sua vez, se combinam formando um
N
H
CH
2
CH
2
NH
3
+
CH
2
COO-
CH
2
COO-
Figura 7 – Estrutura do
Porfobilinogênio
1. INTRODUÇÃO
Pág.25
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
composto linear tetrapirrol que entra em um ciclo para fornecer uroporfirinogênio III e então
coproporfirina III. Os estágios finais da via ocorrem na mitocôndria, onde seqüências de
reações de oxidação e carboxilação das cadeias laterais do uroporfirinogênio III formam a
protoporfirina IX (Figura 8). Na etapa final, ferro é adicionado pela ferroquelatase,
compondo-se o grupo heme que, formado, exibe um efeito do tipo retroalimentação que acaba
por inibir a 5-ALA sintase e interromper a síntese de novas moléculas
(
14
,
15
,
16
)
. A
protoporfirina IX assim formada e presente na maior parte das hemoproteínas de interesse
biológico, recebe o nome usual de hemina.
Constitui-se então o heme de uma estrutura planar representada pelo ferro coordenado
ao anel tetrapirrólico referido como protoporfirina IX e classifica-se como um grupo
prostético presente na hemoglobina, na mioglobina, nos citocromos e, similarmente, na
clorofila. Esta difere das demais hemoproteínas citadas por ser um derivado porfirínico
contendo Mg
2+
em sua estrutura ao invés do ferro.
Defeitos na biossíntese do heme resultam no acúmulo de porfirina ou de seus
precursores nos eritrócitos, nos fluidos corporais e no fígado e configuram uma patologia
genericamente conhecida como porfiria, conhecida desde a antiguidade. Relatos históricos
sugerem que Hipócrates já havia reconhecido alguns de seus sinais e que provavelmente esta
patologia foi também a fonte das histórias envolvendo os lendários vampiros. Acredita-se que
personalidades históricas como o Rei George III da Inglaterra, o pintor Vincent Van Gogh e o
escultor mineiro Antonio Francisco Lisboa, o Aleijadinho, tenham sofrido desta patologia que
possui sintomas diversos como lesões na pele, dor abdominal e distúrbios mentais que podem
ser erroneamente interpretados como psiquiátricos. O nome porfiria, entretanto, foi
reconhecido em 1874 devido à coloração púrpura apresentada pela urina de seus portadores e
a descrição oficial de um caso como sendo de porfiria foi dada em 1889 pelo Dr. B.J.Stokvis,
N
CH
3
CH
2
CH
2
CO
2
H
N
CH
2
CH
2
CO
2
HCH
3
N
N
CH=CH
2
CH
3
CH
3
CH=CH
2
Fe
Figura 8 – Protoporfirina IX
1. INTRODUÇÃO
Pág.26
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
mas somente em 1937 foram publicados trabalhos completos sobre esta patologia pelo médico
sueco Jan Gösta Waldenström.
Quando o defeito se concentra nos eritrócitos, geralmente resultado de deficiência de
uroporfirinogênio III co-sintase ou de ferroquelatase (porfiria eritropoética congênita e
protoporfiria eritropoética, respectivamente), a doença tem como sintomas principais a
coloração avermelhada da urina, fortes tons marrom-avermelhados e alta fluorescência dos
dentes quando expostos à luz ultravioleta e uma hipersensibilidade da pele à luz que
geralmente resulta em úlceras e cicatrizes desfigurantes. Já quando o defeito concentra-se no
fígado tendo como base a deficiência da porfobilinogênio-deaminase (porfiria intermitente
aguda), existem ataques intermitentes de dores abdominais e disfunções neurológicas pouco
características. A pele não fica tão fotossensível quando no defeito biossintético eritrocitário,
mas há uma excreção renal exacerbada de ácido 5- -aminolevulínico (ALA) e de
porfobilinogênio (PBG).
Desta forma, a porfiria de origem eritrocitária torna o portador anêmico, pálido e
altamente fotossensível, o que o faz fugir da luz solar, fato que corrobora, junto a uma
propensão ao ato de beber sangue, uma das mais conhecidas lendas da Idade Média, o
vampirismo.
Pode-se dizer que a característica comum às hemoproteínas é o grupo prostético, o
heme, e que sua larga variedade de papéis biológicos representa a modulação altamente
sintonizada das propriedades do ferro hemínico por seus ligantes axiais e arredores proteicos
(
17
)
. Qualquer que seja a estrutura da hemoproteína é consenso que a ferroprotoporfirina IX, o
grupo heme presente, é quem constitui o centro ativo das hemoproteínas com importantes
papéis biológicos (Figura 9).
1. INTRODUÇÃO
Pág.27
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
1.3 Porfirinas e aplicações bio e nanotecnológicas
Porfirinas biológicas e sintéticas têm sido amplamente utilizadas em pesquisas que
abrangem as mais diferentes áreas de atuação, visto suas propriedades básicas e a capacidade
que possuem de interagir com outros compostos formando complexos ativos.
Metaloporfirinas têm sido sistematicamente sintetizadas em laboratório, sendo que o
início da aplicação destas remete há mais de 30 anos, onde começou seu uso como
catalisadores de uma variedade de reações de oxidação de hidrocarbonetos. Têm-se assim
sistemas químicos que envolvem a transferência do átomo de oxigênio para substratos
orgânicos, catalisados por metaloporfirinas, similarmente ao que ocorre nos organismos vivos
em relação ao citocromo P-450. Estas porfirinas sintéticas com finalidades catalíticas
incorporam como grupo metálico principalmente o Manganês, o Ferro, o Rutênio e o Cromo
(
18
)
, sendo que uma grande variedade de oxidantes podem ser utilizados como doadores de
oxigênio, como peroxiácidos, cloretos, hidroperóxidos, peróxido de hidrogênio entre outros.
A evidência de ciências como a Nanotecnologia e a Química Supramolecular elevaram
ainda mais as aplicações das porfirinas biológicas e sintéticas, que transcenderam o foco
principal destes primeiros estudos.
A Química Supramolecular e a Nanotecnologia, nascidas oficialmente no final da
década de 1950, têm se utilizado cada vez mais e de forma mais controlada de biomoléculas,
explorando sua organização e seus efeitos cooperativos para as mais diversas finalidades.
Máquinas e dispositivos microscópicos, por exemplo, podem ser montados utilizando-se
biomoléculas que, organizadas e adaptadas para uma determinada função, tornam-se capazes
de executar atividades específicas, altamente eficientes e controladas, que vão desde a
Figura 9 – Hemoproteínas de importância biológica baseadas em ferro, envolvidas no transporte e
armazenamento de oxigênio (hemoglobina e mioglobina), a transferência de elétrons (citocromos) e a
oxidação catalítica de compostos orgânicos (HRP). (Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
1. INTRODUÇÃO
Pág.28
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
produção de alimentos até o tratamento de doenças, sejam refazendo moléculas presentes na
natureza, seja criando novas.
Para tanto, estas nanoestruturas tendem a ser construídas utilizando-se do próprio
poder intrínsico de uma molécula de se organizar e interagir com outras moléculas. Podem ser
também devidamente trabalhadas para serem usadas como blocos de montagem visando gerar
estruturas ainda mais estáveis, complexas e funcionais. A identidade de cada componente
pode ser preservada, enquanto o arranjo torna-se um método de interação simbiótica,
conferindo ao complexo novas propriedades.
A ligação entre as moléculas pode se dar por interações hidrofóbicas ou hidrofílicas,
por pontes de hidrogênio, através de pareamento iônico ou mesmo ser uma relação tipo
hospedeiro-convidado. É um complexo formado, muitas vezes, de maneira muito semelhante
ao que ocorre em sistemas biológicos quando anticorpos formam complexos não-covalentes
com o substrato
(
19
)
.
Facilitando o processo e permitindo às
biomoléculas interagirem de forma adequada e
energeticamente favorável, a montagem do complexo pode
ocorrer de forma espontânea, caracterizando um processo
natural conhecido como auto-montagem. Esta é facilitada
quando são utilizados complexos metálicos, os quais
atuam como conectores naturais, tendo-se como exemplo
representativo aqueles que contêm porfirinas em sua
estrutura.
Um exemplo é dado na Figura 10, onde ocorre uma
associação coordenativa espontânea entre uma porfirina e
quatro unidades de clusters triangulares de Rutênio, um
metal raro utilizado para endurecer ligas de platina e
paládio. A porfirina, que por si só já apresenta atividade
catalítica importante, tem esta capacidade aumentada na
presença dessas unidades periféricas, adquirindo também a
capacidade de realizar transferência de elétrons.
Filmes supramoleculares de porfirinas modificadas com complexos de rutênio
também, como demonstrado na Figura 11, são viáveis como sensores eletroquímicos
eficientes, podendo detectar espécies como dióxido de enxofre, nitrito, sulfito, dopamina e
fármacos
(
20
)
.
Figura 10 - Automontagem de uma
porfirina com quatro unidades de
clusters de rutênio periféricos,
dirigida por afinidade química, está
sendo representada pela associação
de peças de LEGO, ilustrando
como os complexos metálicos
podem ser usados para construir
estruturas supramoleculares
dotadas de funcionalidade
(20)
.
1. INTRODUÇÃO
Pág.29
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
A detecção de sulfito por sensores constituídos por filmes de porfirina é muito útil, por
exemplo, na indústria de vinhos. O sulfito é utilizado como um antioxidante, retirando
oxigênio da bebida e atuando assim como um conservante. Sua quantidade, entretanto, precisa
ser regularmente controlada durante o processo produtivo, visto seus efeitos negativos à saúde
quando ultrapassados os limites de segurança definidos. Assim, sensores constituídos por
filmes supramoleculares de porfirinas, entram em contato com o vinho, acusando uma
corrente elétrica diretamente proporcional à concentração de sulfito na amostra. Têm-se
medições regulares, de leitura imediata, com baixíssimos volumes de amostra e a um custo
menor do que os sensores eletrônicos usuais.
A montagem destes filmes de porfirinas é um processo fácil tecnicamente. No caso
acima, uma lâmina de vidro foi mergulhada em um recipiente contendo uma solução de
porfirina com carga elétrica positiva
previamente ligada a quatro moléculas de
rutênio e a seguir em outro recipiente
contendo um preparado de porfirina ligada a
quatro grupos sulfonato e com carga
negativa. Por último a lâmina é mergulhada
em água para extrair o excesso dos
compostos. A cada ciclo destes, forma-se
sobre a lâmina um filme com duas camadas,
a primeira com porfirina positiva e a segunda
com porfirina negativa, sendo que novas
camadas podem ser adicionadas, aumentando a espessura do filme, pela repetição seqüencial
do processo. O rearranjo molecular das porfirinas gera compostos com propriedades
totalmente diferentes das substâncias que lhe deram origem
(5)
.
Nanotubos visando extrair hidrogênio da água também são exemplos da aplicação das
porfirinas em nanotecnologia. Pesquisadores do Laboratório Sandia, dos Estados Unidos,
desenvolveram nanotubos compostos inteiramente de porfirina que, estimulados por luz,
podem ser moldados para formarem depósitos de platina e de outros metais em sua face
interna e externa, constituindo o cerne de dispositivos capazes de quebrar a molécula de água
em seus constituintes atômicos, oxigênio e hidrogênio
(6)
.
O impacto causado no meio ambiente por agentes poluentes tem aumentado a
necessidade de desenvolvimento de ferramentas para o tratamento da água e demais processos
de biorremediação. A oxidação fotoquímica, particularmente utilizando oxigênio molecular, é
Figura 11 - Representação simplificada de
molécula de porfirina modificada (centro) com
quatro unidades de rutênio-bipiridina (periféricos)
proporciona filmes moleculares com propriedades
catalíticas, ativadas pela oxidação dos sítios de
rutênio
(20)
.
1. INTRODUÇÃO
Pág.30
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
um meio importante para atingir tal objetivo, sendo que o oxigênio singlete é particularmente
um importante candidato para tal aplicação, bem como em diversas terapias fotodinâmicas
para tratamento do câncer. Assim, o desenvolvimento de novas moléculas sintéticas capazes
de uma produção eficiente desta espécie radicalar é algo desejável e entre os candidatos a esta
função estão as porfirinas, as metaloporfirinas e as ftalocianinas que têm demonstrado serem
eficientes fotossensibilizadores capazes de produzir oxigênio singlete em quantidade
suficiente
(
21
)
.
O papel das porfirinas no combate ao câncer, principalmente o de pele tipo não-
melanoma, também vem sendo muito valorizado e surge na forma de Terapia Fotodinâmina
(TFD). Esta terapia consiste basicamente em um método que visa a destruição de tumores
sólidos pela irradiação direta de um fotossensibilizador que foi distribuído
predominantemente aos tecidos doentes. Quando de sua foto-excitação, estas moléculas levam
à geração de radicais livres que promovem danos biológicos que podem ir da alteração ou
perda da estrutura e função celular até, mais freqüentemente, à sua morte. Estudos têm levado
em conta o uso de drogas sintetizadas a partir de porfirinas que, quando na corrente
sanguínea, além de não causarem grande toxicidade por estarem naturalmente presentes nos
eritrócitos na forma de hemoglobina, concentram-se em células tumorais numa proporção
vinte vezes maior do que nas células sadias. Irradiando-se a região do tumor com um feixe de
laser na faixa de 630 nm, a droga absorve a energia luminosa e reage com o oxigênio,
tornando-o altamente reativo às membranas da célula cancerosa e levando-a a morte
(7)
.
Compostos de coordenação com íons Európio (Eu
3+
), potencialmente utilizáveis em
sistemas ópticos, luminóforos e marcadores em fluorimunoensaios, quando associados a uma
porfirina sintética, a tetrapiridilporfirina (TPyPPH
2
), na forma de acetil-acetonato de európio
(Eu(acac)
3
)
também demonstram potencial para aplicação como agentes de TFD
(
22
)
.
Utilidade similar tem sido atribuída a hidroxinitrofenilporfirinas sintéticas como a
5,10,15,20-tetrakis(2-hidroxi-5-nitrofenil)porfirina (T
2
H
5
NPPH
2
) e a 5-mono(carboxifenil)-
10,15,20-tris(2-hidroxi-5-nitrofenil)porfirina (MCT
2
H
5
NPPH
2
), e também à 5,10,20-
tris(pentafluorofenil)-20-(4-piridil)porfirina, que têm se mostrado capaz de iniciar a necrose
de tecidos tumorais após fotosensibilização possivelmente pela formação de oxigênio singlete
(
23
) (
24
)
.
Ainda em medicina, estudos vêm sendo desenvolvidos para utilização de porfirinas em
“drug delivery”, um sistema de entrega de drogas mais direcionada aos tecidos doentes. A
pesquisa vem se desenvolvendo seguindo a linha de produção de “pacotes” de moléculas de
porfirinas, altamente estáveis e de porosidade elevada, regularmente distribuída e bastante
1. INTRODUÇÃO
Pág.31
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
seletiva, dentro dos quais pretende-se acondicionar drogas específicas e que requerem uma
liberação fracionada. Nestes estudos tem-se utilizado a tetra(4-aminofenil)porfirina e a
aquazinco-tetra(4-carboxifenil)porfirina
(
25
)
.
Outro exemplo é a aplicação de compostos-modelo contendo porfirinas no estudo de
sistemas fotosintéticos e em processos de aproveitamento de energia solar. Sistemas doador-
receptor contendo porfirinas têm sido estudados para evidenciar os vários postulados sobre a
transferência de elétrons. Aqui avaliam-se parâmetros fotoquímicos e fotofísicos como
geometria molecular, diferença de potencial eletrônico, distância para transferência de energia
entre outros aspectos relativos ao tema
(9)
.
Metaloporfirinas sintéticas têm sido utilizadas como modelos de heme-enzimas, como
as peroxidases, as catalases e o citocromo P-450 no que se denomina química biomimética.
Estas porfirinas sintéticas são costumeiramente análogas ao grupo prostético do citocromo P-
450 e vêm servindo há algum tempo como catalisadores em reações de oxidação de
hidrocarbonetos com vários doadores de oxigênio na busca de catalisadores com maior
seletividade, rendimento, velocidade e estereoespecificidade
(
26
)
.
Estas metaloporfirinas sintéticas atuam também como modelos no estudo da interface
entre a química biológica e a química inorgânica, auxiliando a desvendar e copiar o mais
fielmente possível os sistemas enzimáticos selecionados pelos organismos vivos durante seu
processo evolutivo
(
27
)
. Ainda neste campo, pesquisadores têm sido inspirados a mimetizar
processos de catálise enzimática, altamente efetivos e eficientes, e, a partir das estruturas
naturais, altamente complexas, proceder à síntese de compostos por vezes mais simples
(
28
)
.
1.3.1 A porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
Porfirinas do tipo meso-tetrakis vêm sendo empregadas em diferentes estudos
envolvendo atividade catalítica, terapia fotodinâmica e aparatos nanotecnológicos como
sensores e captadores de energia solar.
A porfirina selecionada para este trabalho foi a meso-tetrakis-2,6-dicloro-3-
sulfonatofenil, representada na Figura 12. Trata-se de uma porfirina não-biológica sintetizada
e cedida pelo grupo da Profa Dra Yassuko Iamamoto, do Departamento de Química da
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras da USP de Ribeirão Preto, com a qual ainda são
poucos os trabalhos publicados. Suas características estruturais e funcionais, entretanto, já
demonstraram resultados promissores no campo da bionanotecnologia. Possui grupos
sulfonatofenil que lhe dão caráter aniônico e como metal o ferro na sua forma Fe(III),
1. INTRODUÇÃO
Pág.32
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
podendo este metal ser facilmente substituído por zinco ou manganês se necessários estudos
nesta área.
Porfirina similar à Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP foi utilizada, por exemplo, em estudos
fotoquímicos de degradação de 4-clorofenol , onde os produtos obtidos foram identificados
como benzoquinona e hidroquinona. A pesquisa sugere que a irradiação da porfirina gerou
oxigênio singlete suficiente para reagir com o clorofenol e assim gerar quinonas
(
29
)
.
Metaloporfirinas sintéticas como esta vêm sendo empregadas, por exemplo, como um
modelo de heme-enzimas, onde a manipulação dos ligantes do anel porfirínico é adotada
como estratégia para melhorar a eficiência catalítica da porfirina não-biológica em
comparação a moléculas biológicas como as peroxidases, as catalases e o citocromo P450
(
30
)
.
A grande diferença, entretanto, entre os sistemas modelo baseados em porfirinas sintéticas e
os sistemas biológicos, baseados em porfirinas inseridas em ambientes protéicos, é que este
cria um sítio de isolamento para a porfirina, controlando sua reatividade, promovendo um
ambiente hidrofóbico para a ação de substratos, agindo como um sistema seletivo de oxidação
(
31
,
32
)
.
N
N
N
N
Fe
+
SO
3
-Na+
Cl
Cl
SO
3
-Na+
Cl
Cl SO
3
-Na+
Cl
ClSO
3
-Na+
Cl
Cl
Figura 12 - Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
1. INTRODUÇÃO
Pág.33
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
1.4 Interação de porfirinas com sistemas heterogêneos
Nos sistemas biológicos, as porfirinas mantêm estreitas relações com o ambiente em
que se encontram e este é fator importante na modulação de sua atividade. Estudos que
empregam sistemas modelo são assim muito úteis para a compreensão destas relações, bem
como permitem desvendar mecanismos para modular a função da porfirina. Modelos da
interação destas porfirinas com sistemas heterogêneos, como micelas, vesículas, lipossomos e
outros agregados com interfaces anisotrópicas, modelos mais simples de membranas
biológicas, permitem o estudo de sua reatividade química
(
33
,
34
)
, bem como a avaliação de
alterações estruturais e funcionais quando de sua incorporação em apohemoproteínas.
Estes microambientes criam condições para a modulação da atividade catalítica e das
propriedades fotoquímicas das porfirinas, seja por influência das cadeias proteicas que se
enovelam ao seu redor, seja pela presença de ligantes exógenos que venham a ocupar as
posições livres de coordenação do metal presente na porfirina bem como a natureza dos
substituintes do próprio anel porfirínico
(
35
)
.
1.4.1 Micelas, vesículas e lipossomos como ambientes heterogêneos para
porfirinas
Estudar a relação das metaloporfirinas com sistemas heterogêneos, como micelas,
vesículas, lipossomos e outros agregados com interfaces anisotrópicas, modelos mais simples
de membranas biológicas, como citado anteriormente, é bastante útil, pois as interfaces, além
de poderem controlar as propriedades físicas dos agregados, tendem a afetar a reatividade
química destes
(
36
)
. É sabido que a ligação entre tensoativos e proteínas causa modificações
nas estruturas secundária e terciária destas, influenciando diretamente sua função
(
37
)
, o que
corrobora o fato de que o mesmo também se aplica à classe específica das
hemoprotoporfirinas. Reações químicas podem ser aceleradas ou inibidas, ao mesmo tempo
em que se pode alterar o mecanismo da reação ou a composição dos produtos desta. Além de
se afetar as propriedades catalíticas destas proteínas, a interface pode alterar também o
reconhecimento delas pelos ligantes presentes, por exemplo, em uma membrana biológica ou,
quando com finalidade terapêutica, modular a ação de drogas.
Surfactantes são extensamente utilizados em estudos envolvendo proteínas,
principalmente como sistemas-modelo de membranas, e não é diferente para as
metaloporfirinas. O termo surfactante advém da contração do termo em inglês “surface-active
agents” e tem como sinônimo usual o termo tensoativo, dado possuir uma superfície ativa
1. INTRODUÇÃO
Pág.34
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
devida à concentração de determinadas espécies em uma região interfásica que pode ser do
tipo ar-água, óleo-água ou sólido-líquido. Os surfactantes são moléculas anfifílicas, ou seja,
possuem uma porção polar, geralmente formada por grupo carboxílico, e uma região apolar,
representada por uma cadeia hidrocarbônica de tamanho variável.
Quase todos os tensoativos conhecidos adquirem uma conformação característica em
um processo dito micelização (Figura 13), oriundo da necessidade de diminuir a área de
contato das cadeias hidrocarbônicas do surfactante, que tem caráter hidrofóbico, com a água
presente no meio. Esta organização é dependente do meio em que o tensoativo encontra-se
inserido, podendo, inclusive, formar micelas totalmente invertidas, ditas reversas, ou,
conforme suas dimensões e o número de caudas
hidrofóbicas, pode formar sistemas de bicamadas ditos
lipossomos (Figura 14). Uma definição mais formal da
micela reversa a caracteriza como sendo um “agregado
esférico composto de moléculas anfifílicas que se auto-
organizam com as cadeias carbônicas voltadas para o
solvente orgânico e o grupo cabeça-polar posicionado
no sentido inverso, sendo a água prontamente
solubilizada no centro destes agregados formando o
chamado poço-aquoso”
(
38
)
.
O tamanho da porção polar e o comprimento da cadeia hidrocarbônica dão
características diferentes à forma e dimensões
adquiridas pelas micelas formadas, seja elas
micelas reversas ou não, bem como ao número de
moléculas de tensoativo que as compõem, este dito
número de agregação.
As micelas são, portanto, agregados
coloidais termodinamicamente estáveis, formados
espontaneamente por compostos anfifílicos acima
de uma determinada concentração e em uma
determinada condição de temperatura. Esta
concentração ideal é dita concentração micelar
crítica (CMC), e define de forma categórica a
formação dos complexos micelares. A temperatura ideal, por sua vez, é dita temperatura
micelar crítica (TMC), e consiste da menor temperatura que favorece a formação das micelas,
Figura 13- Estrutura básica da micela
(Fonte: http://sebbm.bq.ub.es)
Figura 14 – Modelo de lipossomo.
1. INTRODUÇÃO
Pág.35
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
sendo intimamente dependente da pureza e das características do tensoativo. A CMC vai
depender, portanto, da estrutura do tensoativo e das condições do meio ambiente (força-
iônica, contra-íons, temperatura, pH, etc.).
Estas organizações características favorecem várias linhas de pesquisa em que
proteínas são incorporadas a estas micelas visando estudar as relações da proteína com os
diferentes ambientes constituídos, evidenciar possíveis alterações estruturais delas
decorrentes, bem como promover condições controladas de reatividade.
A utilização de vesículas e lipossomos também permite, de forma análoga, mimetizar
o que ocorre na interação de proteínas com membranas biológicas
(
39
)
. Os lipossomos são
formados por moléculas anfifílicas que possuem dupla cauda hidrofóbica, as quais se
organizam em bicamadas que se fecham em uma estrutura esférica oca em resposta à repulsão
ao meio aquoso. Esta organização acaba por formar um compartimento aquoso na cavidade
interna envolto por um domínio hidrofóbico em bicamada.
Exemplos de tensoativos empregados como sistemas-modelo de membrana biológica
no estudo de hemoproteínas e porfirinas são o CTAB (Brometo de Dexametiltrimetilamônio)
e o SDS (Dodecil Sulfato de Sódio). O primeiro é um surfactante monocaudal catiônico que
possui número de agregação igual a 100 e tem concentração micelar crítica em torno de 1,0
mM. Já o SDS possui número de agregação igual a 66, também é um tensoativo de cauda
única, porém tem caráter aniônico e sua CMC em água se aproxima de 7 mM.
Lipossomos podem ser formados, por exemplo, pelo Dioctadecil-dimetilamônio
(DODAB), que consiste de um tensoativo de cauda dupla, catiônico, com peso molecular em
torno de 631 g/mol e fórmula C
38
H
80
NBr e que compõe vesículas com dimensões médias de
400 nm.
O interior hidrofóbico destas micelas e lipossomos proporcionam às porfirinas um
microambiente que, em parte, mimetiza a presença de uma cadeia proteica no que concerne a
hidrofobicidade do ambiente e a capacidade de selecionar potenciais substratos por afinidade
(
40
,
41
)
. Estudos recentes do comportamento de microperoxidase em micelas de CTAB
permitiram acompanhar um ciclo catalítico completo na presença de tert-butil hidroperóxido
(t-BuOOH), sendo o fato mais relevante a possibilidade de modulação da velocidade com que
este ciclo acontece neste ambiente, favorecendo assim o emprego do sistema na construção de
biosensores e biocatalisadores
(
42
,
43
)
. A interação de citocromo c com micelas de SDS ou com
lipossomos de dicetilfosfato (DCP), por sua vez, promove alterações nos ligantes do ferro
hemínico, causando mudanças no seus estado de spin de sua forma nativa baixo spin para o
estado de baixo spin alternativo e também para a forma de alto spin
(25)
.
1. INTRODUÇÃO
Pág.36
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Tais situações comprovam a modulação na estrutura e na atividade de hemoproteínas
pelo microambiente em que se encontra inserido o grupo heme.
1.4.2 Complexos porfirina-apoproteína
Os mesmos conceitos se aplicam ao estudo das porfirinas presentes de forma isolada
nestes microambientes heterogêneos a quando incorporadas às proteínas. A associação de
porfirinas com proteínas envolve coordenação com o centro metálico e interações
hidrofóbicas, podendo o grupo heme estar ligado de forma covalente, como no caso do
citocromo c, ou não-covalente, como na hemoglobina, na mioglobina e na HRP.
Assim, a incorporação de porfirinas
biológicas e sintéticas a apohemoproteínas,
formas que tiveram o grupo heme extraído
e acabam compondo-se em uma estrutura
secundária e terciária diferenciada, pode
contribuir para a compreensão de muitos
mecanismos que vão da estrutura à
atividade das formas ativas destes
complexos e, mais especificamente,
permitem inferir dados sobre a biogênese
do citocromo, o papel da estrutura da
porfirina e seus ligantes axiais no
enovelamento protéico bem como o
desenvolvimento de catalisadores com
aplicações nanotecnológicas.
É sabido que nas hemoproteínas em geral o grupo heme é mantido ligado à estrutura
protéica por interações do ferro com os ligantes axiais (Figura 15) e por forças não covalentes
e nos citocromos da classe c e nas peroxidases de mamíferos o grupo heme também faz
ligações covalentes com aminoácidos da proteína. Tem-se demonstrado também que as
ligações covalentes podem ser formadas por processo autocatalítico envolvendo reação do
complexo heme-apoproteína com substratos
(
44
,
45
)
.
No caso do citocromo c, por exemplo, a forma sem o grupo heme, dita apocitocromo
c, é a forma precursora, desenovelada (unfolded), da proteína em sua forma nativa. A maioria
das proteínas mitocondriais que são sintetizadas no citosol requer a presença de uma
Figura 15 - Modelo de interação entre o grupo heme
a cadeia proteica.
(Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)
1. INTRODUÇÃO
Pág.37
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
sequência amino-terminal composta por 20 a 30 aminoácidos para que ocorra a sua ligação a
receptores presentes na superfície da organela e sua posterior translocação através da
membrana externa da mitocôndria
(
46
)
. Complexos presentes na membrana externa e interna,
respectivamente chamados de TOM e TIM, agem como translocases nesse processo de
migração das proteínas citosólicas ao interior da mitocôndria. Além disso, a translocação
nestes casos é dependente do potencial eletroquímica criado pela cadeia transportadora de
elétrons e requer também que a proteína esteja ao menos parcialmente desestruturada para que
passe pelo processo. O apocitocromo c, entretanto, segue uma outra sistemática. É também
uma proteína sintetizada no citosol e importada para o interior da mitocôndria. Entretanto, não
possui a referida sequência amino-terminal, sua importação não requer ATP, potencial de
membrana ou mesmo ativação do maquinário mitocondrial protéico de translocação,
inserindo-se espontânea e parcialmente através da membrana externa da organela
(
47
)
.
Passando pela membrana mitocondrial externa, é então reconhecido pela enzima citocromo c
heme-liase, que promoverá a ligação covalente entre dois de seus resíduos de aminoácidos, as
cisteínas 14 e 17, e o grupo heme. Quando esta incorporação ocorre, a heme-liase se dissocia
em função do enovelamento proteico (folding) decorrente da estruturação adquirida,
compondo-se então a forma a nativa do citocromo c, agora estruturalmente estável e
funcionalmente ativa, e que permanecerá confinada à face externa da membrana mitocondrial
interna
(
48
,
49
,
50
,
51
)
.
O grupo heme exerce um papel importante na estabilização da proteína e na
manutenção de sua estrutura nativa, sendo que alterações em seu estado redox implicam em
alterações estruturais e funcionais significativas
(
52
)
. Em estudos comparativos com
apocitocromo c e citocromo c ferro-livre, o papel do heme na estruturação do citocromo c fica
evidente
(
53
)
.
O grupo heme fica inserido no interior da molécula do citocromo c cujo ambiente
hidrofóbico é mantido pela cadeia polipeptídica que o envolve e pela ligação covalente entre
seus grupos vinil e as cisteínas 14 (C14) e 17 (C17) da cadeia, bem como pela coordenação do
ferro com o nitrogênio da histidina 18 (H18) e da metionina 80 (M80).
O apocitocromo c pode ser obtido “in vitro” pela retirada química do grupo heme,
sendo que no processo perde a estrutura que é característica da forma proteica nativa,
comportando-se como uma proteína desestruturada em solução, ficando o triptofano 59 e as
quatro tirosinas expostas ao solvente e as duas metioninas e as três histidinas passíveis de
sofrer carboximetilação
(
54
)
. Ao se associar novamente ao grupo heme, mesmo que de forma
não-covalente, é capaz de readquirir estrutura secundária e terciária, apresentando domínios
1. INTRODUÇÃO
Pág.38
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
estruturais semelhantes aos da proteína nativa. Estudos descrevem que, apesar da coordenação
do átomo de ferro com a histidina 18 e a metionina 80 estar diretamente relacionada à
estabilidade da proteína nativa, isto não é relevante para o enovelamento da mesma. A ligação
covalente do anel porfirínico com as cisteínas 14 e 17, por sua vez, é fundamental para o
citocromo existir em sua conformação nativa estável. Entretanto, estudos revelam que o
estado de oxidação do grupo heme interfere na afinidade entre este e o apocitocromo c
(
55
)
.
Como a biogênese do citocromo c envolve justamente essa interação entre o
apocitocromo c e o grupo heme, a compreensão dos mecanismos envolvidos neste processo é
bastante pertinente e permite extrapolar os dados para a compreensão da organização
estrutural das hemoproteínas e apresenta grande potencial no desenvolvimento de novos
catalisadores baseados em porfirinas associadas a apoproteínas, especialmente em se tratando
de porfirinas não-biológicas.
A mioglobina, por sua vez, possui um mecanismo de ligação do grupo heme à cadeia
proteica ainda pouco conhecido. Enquanto a apomioglobina é produzida no sarcoplasma, o
grupo heme é sintetizado na membrana mitocondrial interna. Desta forma, considerando-se
que a apomioglobina e o grupo heme são sintetizados em compartimentos distintos e também
que a proteína tem caráter hidrofílico enquanto o grupo heme tem caráter hidrofóbico, a
localização e as circunstâncias em que ocorre a ligação entre eles permanece obscura
(
56
)
.
A incorporação de porfirinas não-biológicas a estes sistemas proteicos,
especificamente a apohemoproteínas, oferece novas e interessantes perspectivas. Estudos de
modificações conformacionais, de mecanismos de ação, de intermediários moleculares e de
rotas de processos catalíticos prometem novas aplicações à medida que novas combinações
sejam testadas e novos resultados sejam obtidos.
Modelos de heme sintéticos utilizados nos estudos que objetivam avaliar a influência
de ligantes axiais e de substituintes periféricos em hemoproteínas têm por desvantagem não
estarem inseridos nos complexos impedimentos estéricos das proteínas, de modo que a
extrapolação das informações obtidas para sistemas biológicos acaba prejudicada
(14)
. Assim,
a incorporação de porfirinas não-biológicas em apohemoproteínas é um projeto que visa
minimizar esta desvantagem e assim atender a muitas das demandas acima explicitadas.
1.4.2.1 Complexos não-covalentes porfirina-apoproteína
Algumas hemoproteínas, como referido anteriormente, possuem o grupo heme ligado
de forma covalente à cadeia protéica, como é o caso do citocromo c. Outras, ao contrário, têm
1. INTRODUÇÃO
Pág.39
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
sua função modulada justamente pelo fato de heme estar ligado de forma não-covalente à sua
cadeia protéica, como é o caso da hemoglobina e da mioglobina.
Estudos da biogênese do citocromo c propuseram que a ligação entre o grupo heme e o
apocitocromo c se dá inicialmente de forma não-covalente e que este passo pode representar
um intermediário na reorganização estrutural da proteína, passo esse que precederia a ação da
enzima heme-liase e consequentemente a origem da forma nativa do citocromo c, onde a
porfirina apresenta-se ligada covalentemente à fração protéica, com todas as suas
propriedades. Estes estudos determinaram também que a afinidade da proteína pelo grupo
prostético depende do estado de oxidação deste e sugere-se ainda que a estequiometria da
ligação também dependa deste estado de oxidação do heme, mais especificamente do ferro
hemínico, sendo que em condições redutoras, como na presença de cianeto, tem-se um grupo
heme para cada apocitocromo, enquanto que em condições oxidantes, é possível ter-se
múltiplos hemes por proteína
(
57
)
.Nas experimentações in vitro de complexação do grupo
heme ao apocitocromo c, obtém-se forma similar ao que se supõe ser o primeiro estágio da
biogênese do citocromo c, isto é, o complexo não-covalente porfirina-apoproteína. A ligação
entre o grupo heme e o apocitocromo c pode ser acompanha por mudanças no espectro de
absorção do grupo heme e também através de experimentos de fluorimetria, uma vez que há
supressão da fluorescência do triptofano da proteína quando formado o complexo. A
supressão depende da distância entre o ferro porfirínico e o triptofano e ocorre por
transferência de energia do tipo Forster
(57)
.
O complexo não-covalente apresenta uma estrutura muito similar à forma nativa do
citocromo c, o que pode ser verificado pelo fato de sua mobilidade eletroforética ser muito
similar àquela do citocromo c nativo. Em outros testes, Goldberg et al demonstraram
utilizando anticorpos monoclonais que o complexo não covalente apresenta domínios
estruturais semelhantes aos da proteína nativa, apensar de que os anticorpos se ligaram a sítios
antigênicos diferentes no citocromo c nativo.
No holocitocromo c o núcleo da molécula contém confinado um grande número de
resíduos de aminoácidos hidrofóbicos em contato com o grupo heme, o que não ocorre no
apocitocromo c onde estes resíduos acabam expostos ao solvente
(
58
)
.
Considerando os dados da literatura, percebe-se que muitas questões acerca da
estrutura e das propriedades de holocitocromo c na forma de complexo não covalente como,
por exemplo, a influência do metal coordenante no processo de incorporação da porfirina e a
reatividade deste complexo com compostos que sabidamente reagem com citocromo c nativo
permaneciam sem resposta. Essas questões são relevantes se considerarmos que no processo
1. INTRODUÇÃO
Pág.40
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
de biogênese do citocromo c, a organização do complexo não covalente deve ser a etapa que
precede a formação de citocromo c nativo pela ação da enzima heme liase.
Recentemente, importante contribuição foi feita a respeito face ao estudo
espectroscópico (UV-visível, Dicroísmo Circular e EPR) dos complexos não covalentes com
a utilização de hematina e zinco hematina. Verificou-se que, de acordo com o pH do meio,
diferentes ligantes axiais do ferro ou do zinco podem estar presentes e que a espectroscopia
Raman pode ser uma alternativa para a definição dos ligantes axiais que foram propostos para
estes complexos
(
59
)
.
A literatura em geral demonstra, entretanto, que existem ainda muitas questões
pendentes sobre a estrutura e as propriedades do holocitocromo c na forma de complexo não
covalente, desde a influência exercida pelo metal presente no grupo heme até sua reatividade
frente a compostos que sabidamente reagem com o citocromo c nativo, como peróxidos e
aldeídos.
1.4.2.2 Utilização de proteínas recombinantes no estudo da interação entre porfirinas e
apoproteínas
A utilização de proteínas com modificações pontuais em certos resíduos de
aminoácidos é uma ferramenta importante no estudo de sua estrutura, função, relação com
membranas biológicas e também para a avaliação do efeito que certos aminoácidos exercem
sobre seu enovelamento e incorporação de grupos prostéticos, como o heme.
Formas mutantes de citocromo c obtidas por técnicas de DNA recombinante, por
exemplo, onde são efetuadas mutações sítio-específicas em resíduos de aminoácidos
envolvidos na interação da proteína com membranas e em sua atividade peroxidásica, são de
grande valia para a determinação de características estruturais e funcionais das hemoproteínas
bem como para o desenvolvimento de sistemas catalíticos mais estáveis
(
60
,
61
)
. Sendo o
citocromo c um importante transdutor de energia, envolvido na transferência de elétrons na
cadeia respiratória, na modulação do potencial redox e nos processos apoptóticos, a
construção de formas mutantes sítio-específicas pode também contribuir para a compreensão
dos mecanismos em que está envolvido e também em estudos evolutivos, uma vez que sendo
uma proteína altamente conservada atua como importante marcador filogenético.
Para a obtenção de formas mutantes de citocromo c são empregadas técnicas de
biologia molecular baseadas em DNA recombinante. A mutação sítio-dirigida é guiada por
oligonucleotídeos construídos a partir de um trecho da seqüência de bases do gene que
1. INTRODUÇÃO
Pág.41
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
codifica a proteína desejada e que está inserido em um plasmídio modelo, dito template. O
oligonucleotídeo tem substituídas bases específicas neste trecho da seqüência que irão assim
codificar o aminoácido substituinte.
Segundo Rumbley et al, a produção de proteína recombinantes, entretanto, envolve
aspectos práticos bastante complexos e o rendimento do processo nem sempre é suficiente
para atender às necessidades experimentais. Especificamente para o citocromo c, os
problemas estão relacionados ao complexo processo pós-transcricional exigido pela proteína.
A partir da síntese citoplasmática de apo-proteína, tornam-se necessários a excisão do N-
terminal da metionina, exportação do sítio de ligação –C-X-X-C-H- através de membrana e a
ligação covalente do heme na forma de pontes tioéter entre os grupos sulfidril do sítio de
ligação proteica e o grupo vinil do heme por ação da heme-liase. Somente nesta condição
tem-se uma proteína funcional.
A obtenção de formas mutantes, portanto, está mais vinculada à capacidade de
expressão, de realizar as modificações pós-transcricionais necessárias e assim manter a
estrutura terciária da proteína do que aos processo relacionados à mutação em si.
1.5 Propriedades catalíticas das porfirinas
Peroxidases são uma classe de enzimas presentes em animais e plantas e que possuem
em comum grupos prostéticos genericamente denominados grupo heme, porém representado
em quase todas as situações pela protoporfirina IX. Estas enzimas são ativadas por peróxidos
para estados de alta valência que são capazes de oxidar uma variedade de substratos. Possuem
assim a capacidade de clivar peróxidos orgânicos e/ou o peróxido de hidrogênio
(
62
,
63
)
.
Dentre as peroxidases mais citadas na literatura, destaca-se a horseradish peroxidase
(HRP), descoberta em 1903 e extensivamente estudada a partir de então por sua habilidade de
agir sobre uma grande variedade de substratos e por seu potencial nanotecnológico
(
64
,
65
)
. São
várias as isoenzimas já identificadas do que genericamente se denomina como HRP, sendo a
mais abundante a do tipo C, composta por uma cadeia polipeptídica simples com 308 resíduos
de aminoácidos
(
66
)
.
A HRP tem sido empregada como modelo no estudo das peroxidases e mais
especificamente no estudo de ciclos catalíticos desta classe de enzimas. São cincos os estados
de oxidação da HRP conhecidos e formados durante os ciclos das peroxidases e oxidases da
enzima: o ferroso, o férrico, os Compostos I e II e o oxi-ferroso. Estes intermediários de alta
1. INTRODUÇÃO
Pág.42
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
valência são característicos da ocorrência de ciclo catalítico por diferentes peroxidases, como
será visto na sequência.
Importantes papéis biológicos são atribuídos às peroxidases. Em plantas, por exemplo,
salienta-se sua participação na síntese da lignina, na incorporação de glicoproteínas ricas em
hidroxiprolina à parede celular e à destruição peroxidativa do ácido indolacético e de outros
fatores importantes que agem como reguladores de crescimento
(
67
)
.
O grupo heme presente nas peroxidases age como um centro catalítico e usa peróxidos
como agentes oxidantes para gerar intermediários de alta-valência. Estas enzimas são
classificadas em duas grandes famílias, sendo que uma delas inclui peroxidases de plantas,
fungos e bactérias e a outra as peroxidases de mamíferos. Existem consideráveis diferenças
entre as duas famílias no que concerne à estrutura secundária e terciária assumida por elas,
bem como quanto ao grupo prostético
(
68
)
. Em peroxidases de mamíferos, por exemplo, é
característica a presença de ligações covalentes entre o grupo heme e a apoproteína. Em
lactoperoxidases e peroxidase de eosinófilos estas ligações covalentes são duas pontes tipo
éster entre o grupo metil e o heme, sendo que especificamente nas mieloperoxidases há ainda
uma terceira ligação covalente, esta entre os grupos vinil e o resíduo de metionina da cadeia
proteica. Existem também diferenças na natureza do ligante proximal do ferro hemínico,
sendo que o conjunto dessas particularidades influencia diretamente nas propriedades
assumidas pela enzima
(
69
,
70
)
.
Peróxido de hidrogênio e peróxidos orgânicos são gerados constantemente nas células
pela dismutação do íon superóxido, um produto da redução incompleta do oxigênio molecular
na cadeia respiratória e mais tardiamente pela oxidação de moléculas orgânicas como as
cadeias acídicas dos lipídios insaturados, presentes, por exemplo, nas membranas celulares.
Estes peróxidos podem sofrer clivagem homolítica por metais de transição, como o Fe(II) e o
Cu(II) gerando espécies radicalares altamente reativas, os radicais livres hidroxil e alcoxil,
ambos com potencial para danificar moléculas biológicas como lipídios, proteínas e o DNA.
A atividade das peroxidases exerce assim um papel essencial como mecanismo
antioxidante celular. Exemplos são a catalase e a glutationa, ambas com propriedades
peroxidásicas, sendo que esta última não é, entretanto, uma hemoproteína. Em condições
fisiológicas, tanto a glutationa quanto a catalase degradam peróxido de hidrogênio cumprindo
um ciclo catalítico onde a enzima é oxidada pelo peróxido de hidrogênio a um intermediário
de alta valência, o Composto I (oxoferril -cátion), conforme Equação 1. O uso do peróxido
de hidrogênio como um agente redutor de dois elétrons para formar o Composto I é uma
característica exclusiva da catalase.
1. INTRODUÇÃO
Pág.43
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
PorfFe(III) + HOOH → Por
+
.
Fe(IV)=O + HOH (Equação 1)
(Composto I)
Este intermediário formado é uma enzima altamente oxidante e promove na sequência
a dupla oxidação de uma segunda molécula de peróxido de hidrogênio a oxigênio molecular e
é convertida a sua valência nativa (Equação 2) ou pode ser reduzida de férrica a ferrosa, na
presença de oxigênio molecular, e converter-se a Composto III (Fe(II)-O
2
ou Fe(III)-O
2
-.
,
sendo a primeira forma similar à assumida pela oxihemoglobina e pelo oximioglobina). Este
composto III pode ser também gerado pela reação do Composto II com excesso de peróxido e
então retornar à forma nativa por desprendimento do íon superóxido.
Porf
+
Fe(IV)=O + HOOH → PorfFe(III) + HOH + O
2
(Equação 2)
As demais peroxidases promovem a clivagem do peróxido passando pelo Composto
O, um intermediário em que ocorre coordenação do peróxido com o ferro porfirínico. Nesta
primeira etapa do ciclo, o sexto ligante da enzima é desprotonato e substituído pelo peróxido
(Equações 3 e 4).
PorfFe(III)-OH
2
↔ PorfFe(III)-OH + H
+
(Equação 3)
PorfFe(III)-OH + ROOH ↔ PorfFe(III)-OOR + HOH (Equação 4)
(Composto 0)
A partir da formação do Composto O, são dois os caminhos possíveis para a clivagem
do peróxido, um dito clivagem homolítica e o outro clivagem heterolítica.
Na clivagem heterolítica, gera-se um derivado alcoólico (ROH) e o Composto I, o qual
reagem com outra molécula de peróxido gerando o Composto II e o radical peroxil (ROO
.
),
conforme demonstrado nas Equações 5 e 6.
1. INTRODUÇÃO
Pág.44
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
PorfFe(III)-OOR ↔ Porf
+.
Fe(IV)=O + ROH (Equação 5)
Porf
+.
Fe(IV)=O + ROOH ↔ PorfFe(IV)=O + ROO
.
(Equação 6)
(Composto II)
Na clivagem homolítica, por sua vez, forma-se diretamente o Composto II (Equação 7)
PorfFe(III)-OOR + ROOH ↔ PorfFe(IV)=O + RO
.
(Equação 7)
Em ambas as condições, a porfirina pode retornar à sua forma nativa pela reação do
Composto II com outra molécula de peróxido (Equação 8) ou mesmo por ação de um agente
redutor, como o difenilacetaldeído (DPAA).
PorfFe(IV)=O + ROOH ↔ PorfFe(III)-OH
2
+ ROO
.
(Equação 8)
Como dito anteriormente, a horseradish peroxidase (HRP), mais especificamente a
isoenzima do tipo C, vem sendo muito utilizada em estudos de atividade catalítica desde sua
descoberta em 1903
(68, 69)
.
Foi a partir do estudo desta enzima que se estabeleceram os conhecimentos sobre esses
intermediários de alta valência presentes no ciclo das peroxidases. Por isso, quando se fala em
catálise, tem-se que todas as peroxidases que já foram alvos de estudos apresentam este
mesmo ciclo composto por três etapas distintas, definido em comparação ao que foi
observado para a HRP
(
71
)
.
De maneira genérica, pode-se então definir o ciclo das peroxidases a partir da
formação inicial do Composto O, que é a espécie onde o hidroperóxido se coordena com o
ferro porfirínico, detectada no ciclo catalítico da HRP em baixas temperaturas. Este composto
precede assim formação de intermediários de alta valência, os Compostos I e II. A proteína no
estado férrico (PorfFe(III)) liga-se de forma reversível a um peróxido, de estrutura ROOH,
formando o Composto O (PorFe(III)-OOR), o qual cliva o peróxido em um processo que
envolve a transferência de dois elétrons, gerando como composto intermediário o Composto I
1. INTRODUÇÃO
Pág.45
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
(Por
+
.
Fe(IV)=O, o oxoferril -cátion). Este pode abstrair um único elétron oxidando uma
segunda molécula de peróxido ou qualquer outro agente redutor para formar o Composto II
(PorFe(IV)=O). Quando este reage com mais ROOH forma o Composto III, o complexo entre
peroxidase férrica e íon superóxido, conhecido como oxiperoxidase (PorFe(III)O
2
+
.
PorFe(II)O
2
). O Composto II também pode receber um elétron de um outro doador e voltar à
sua forma nativa PorFe(III), completando o ciclo catalítico
(
72
)
.
Outras hemoproteínas, como o citocromo c, a mioglobina, as neuroglobinas e
citoglobinas também exibem atividade peroxidásica celular. No caso do citocromo c acredita-
se que essa propriedade tenha relação com o desprendimento do citocromo c da membrana
mitocondrial interna e consequentemente com a ativação da cadeia de caspases e
consequentemente do processo apoptótico. Essa atividade peroxidásica pode ter também
relação com a atividade oxidante do citocromo c sobre a fosfatidilserina, cuja externalização
decorrente é um importante sinalizador para os macrófagos durante o processo de morte
celular programada
(
73
,
74
)
.
Como é possível notar, o ciclo das peroxidases gera radicais livres, que são espécies
químicas que possuem ao menos um elétron desemparelhado, o que os torna pouco estáveis e
capazes de reagir com um grande número de outros compostos. Radicais livres são espécies
geradas regularmente nos organismos vivos, ocorrendo sua produção em maior escala durante
a redução do oxigênio molecular que ocorre na cadeia respiratória mitocondrial. Nesta,
geram-se radicais livres de oxigênio, ditas espécies reativas de oxigênio (EROS) que agem
sobre diferentes biomoléculas causando diferentes níveis de lesões, processo descrito como
estresse oxidativo
(
75
)
. Dentre as biomoléculas alvo dos ataques, tem-se, por exemplo, os
lipídios constituintes das membranas celulares, que sofrem o que se denomina como
lipoperoxidação, e o próprio DNA, o que leva a lesões oxidativas tais que podem acarretar
disfunções genônicas e mesmo mutações pontuais.
As porfirinas possuem diferentes formas de ação como peroxidases em função do
microambiente em que se encontram inseridas, bem como do metal presente em sua estrutura
e de seus ligantes axiais. O estudo de modelos de peroxidases, como é o caso das
microperoxidases, traz informações importantes sobre os efeitos moduladores do
microambiente, do metal e dos ligantes. As microperoxidase são peptídeos obtidos por
hidrólise do citocromo c catalisada por tripsina e que mantêm o grupo heme ligado
covalentemente aos resíduos de cisteína 14 e 17 e moléculas de água ocupando a sexta
posição de coordenação no lugar da metionina quando em pH neutro, o que lhes confere
1. INTRODUÇÃO
Pág.46
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
atividade peroxidásica
(
76
,
77
,
78
)
. Por suas características estruturais, as diferentes
microperoxidases, identificadas em função do número de resíduos de aminoácidos que
mantêm, têm sido usadas no estudo da estrutura e das propriedades catalíticas de diferentes
peroxidases e citocromos, tendo aplicação, inclusive, no desenvolvimento de sensores
eletrônicos pelas propriedades aqui referidas
(
79
)
.
Os ligantes do ferro hemínico respondem, portanto, por diferentes mecanismos
catalíticos. Os ligantes proximais do ferro hemínico incluem, por exemplo, a histidina na
peroxidase, a tirosina na catalase e a cisteína no citocromo p450.
O difenilacetaldeído (DPAA) é utilizado como modelo de composto carbonílico
visando estudar os efeitos biológicos desencadeados por espécies excitadas geradas por
hemoproteínas, uma vez que tem a capacidade de promover a dissipação do potencial de
membrana mitocondrial e causar dano ao DNA desta organela, bem como a lipídios e
proteínas de sua estrutura
(
80
)
. Trata-se de um aldeído altamente hidrofóbico que pode ser
oxidado por uma gama extensa de hemoproteínas, como o citocromo c, a HRP, a mioglobina
e a hemoglobina
(
81
)
.
A reação do citocromo c com DPAA, por exemplo, gera espécies excitadas de vida
longa como a benzofenona triplete, fonte potencial de oxigênio singlete por meio de
transferência de energia através de processo de colisão em meios aerados, sendo que ambas
geram danos celulares
(
82
,
83
)
. Assim como a reação de hemoproteínas com peróxidos, a reação
com compostos carbonílicos, incluindo-se aqui o DPAA, depende da estrutura da proteína e
do pH do meio
(
84
,
85
)
.
Em estudos quanto à ação do DPAA sobre o citocromo c foram obtidos resultados
compatíveis com a existência de dois resíduos de tirosina envolvidos na transferência de
elétrons do DPAA para o citocromo c, bem como observado que o DPPA reduz o citocromo c
de forma tempo e concentração dependentes. Pela estrutura do citocromo c é provável que os
resíduos de tirosina envolvidos neste processo de transferência de elétrons sejam apenas dois
dos quatro presentes na cadeia polipeptídica, provavelmente as tirosinas 67 e 74 em função de
sua proximidade ao grupo heme e possibilidade decorrente disto de transferência de elétrons
dos anéis “estaqueados” do DPAA ao grupo heme
(
86
)
. Disto se conclui que o stacking dos
anéis fenil do DPAA com os grupos fenol da tirosina seja essencial para que a transferência
de elétrons do DPAA para o citocromo c aconteça.
1. INTRODUÇÃO
Pág.47
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
1.6 Caracterização espectroscópica de porfirinas
Técnicas como Espectroscopia no UV-vis, Dicroísmo Circular (CD) e o Dicroísmo
Circular Magnético (MCD) e, levando-se em conta mais especificamente o monitoramento do
estado de spin do metal hemínico, a Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR), têm
permitido monitorar, em conjunto ou isoladamente, alterações de estrutura, estados de spin,
ligantes do ferro hemínico entre outras propriedades de proteínas e porfirinas em diferentes
microambientes.
A espectroscopia eletrônica é uma técnica amplamente utilizada no estudo da
propriedade dos átomos e moléculas de absorver e/ou emitir energia em uma das regiões do
espectro eletromagnético. É bastante útil também na determinação da concentração de
substâncias, no estudo da conformação de metaloproteínas e na determinação do estado redox
do ferro hemínico, entre outras aplicações. Trata-se basicamente de análise baseada em
diferenças de espectro de absorção molecular na região do ultra-violeta e do espectro visível
em função da estrutura eletrônica das moléculas. A transição eletrônica, conforme a teoria
quântica, define-se pela migração dos elétrons de átomos e moléculas para orbitais de maior
energia quando absorvem energia radiante fornecida pela luz nos diferentes comprimentos de
onda.
Moléculas absorvem luz em diferentes comprimentos em função, por exemplo, do
número e arranjo de seus elétrons, visto que a energia incidente deve ser igual à diferença
energética entre o orbital fundamental e o orbital excitado para que a transição ocorra.
Quando a absorção de um fóton de energia excita elétrons de um grupo funcional, este
transmite cor, correspondente esta à luz que não foi absorvida
(
87
)
.
Bandas de absorção apresentam posições e intensidades diferentes para diferentes
compostos. A posição corresponde ao comprimento de onda da radiação cuja energia é igual à
necessária para a ocorrência da transição eletrônica, enquanto que a intensidade da absorção
depende da polaridade do estado excitado e da possibilidade de interação entre a energia
radiante e o sistema eletrônico, permitindo a passagem do estado fundamental a um estado
excitado
(
88
)
.
O espectro de absorção de um composto, construído na forma de um gráfico que
relaciona os comprimentos de onda com a respectiva absorção da energia luminosa, constitui-
se um instrumento valioso para sua identificação bem como de sua estrutura. No estudo de
proteínas, os principais parâmetros considerados são o pico máximo de absorção em
determinados comprimentos de onda (
máximo
) e o coeficiente de absorção molar (),
1. INTRODUÇÃO
Pág.48
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
definidos para diversas substâncias. Como estes parâmetros alteram-se, por exemplo, quando
há modificações na estrutura química da molécula, a aplicação da espectroscopia na
caracterização de macromoléculas e de seu comportamento em diferentes microambientes é
bastante útil.
Metaloproteínas, por exemplo, apresentam no espectro UV-vis duas transições
eletrônicas, as bandas Q, de baixa intensidade, entre 550 e 600 nm e a banda Soret, de alta
intensidade, entre 380 e 450 nm. Estas bandas são, na verdade, um retrato do grupo heme
presente em sua estrutura, que tem elétrons delocalizados nos orbitais π do anel porfirínico. A
banda Soret no espectro de absorção é o resultado da excitação dos elétrons π delocalizados
para orbitais de maior energia com momento angular similar ao do mais alto orbital ocupado.
Esta transição é dita um evento permitido e resultado em alto valor de ε. Ao contrário, as
bandas e , que compõem as bandas Q, provém de uma excitação comparável, mas com
promoção de elétrons para orbitais de momento angular diferente, dita transição proibitiva, e,
portanto, os valores de são menores.
Já as bandas N, L e M são bandas da região do ultra-violeta, sendo que a banda N,
especificamente, traz importantes informações sobre os ligantes axiais do ferro porfirínico.
Em porfirinas base-livre, a presença de dois prótons leva à redução da simetria. Como
conseqüência o espectro de absorção visível da região das bandas Q passa de duas para quatro
bandas, separadas entre si por cerca de 30 nm
(
89
)
.
Os ligantes axiais e o solvente são também determinantes na configuração eletrônica
assumida por uma porfirina. Estes ligantes são determinantes nas propriedades da porfirina,
não só pela sua identidade, mas também por sua disposição espacial
(
90
)
.
As porfirinas podem apresentar-se em conformações planares ou conformações
distorcidas, o que varia em função da relação entre o íon metálico e os seus ligantes axiais.
Quanto mais distorcido o anel, maior o deslocamento para o vermelho (deslocamento
batocrômico, dito red shift), isto em função da maior desestabilização do homo em relação ao
lumo (orbital molecular desocupado de menor energia) em sistemas distorcidos
(
91
)
.
A utilização de técnicas espectroscópicas é bastante útil no estudo de porfirinas. O
EPR, por exemplo, é uma ferramenta de extrema relevância em bioquímica. Esta técnica
fundamenta-se no momento magnético associado à presença de elétrons desemparelhados em
uma dada molécula e na observação de transições de elétrons entre os níveis de energia
definidos pelas duas orientações do seu spin quando aplicado um campo magnético
controlado. É assim utilizada para moléculas que possuem elétrons desemparelhados, já que
as demais não geram sinal por possuírem um momento magnético igual a zero.
1. INTRODUÇÃO
Pág.49
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Esta técnica permite avaliar a estrutura de moléculas biológicas via centro
paramagnético e também de várias de suas propriedades. Pode ser utilizada, por exemplo,
para a determinação da simetria em que o sítio paramagnético está inserido ou mesmo para
comprovar a produção de radicais livres produzidos durante reações de óxido-redução.
A determinação do valor de g, definido como “tensor giromagnético” ou “g efetivo”, é
fundamental para determinar os estados de spin das porfirinas e hemoproteínas. Funciona
como uma cédula de identidade que permite a identificação de diferentes espécies
paramagnéticas sendo determinado a partir da seguinte condição de ressonância: g = (7,14 x
10
-7
) . ν/H, onde ν, em MHz, é a freqüência da microonda empregada e H representa o campo
magnético de ressonância medido em Gauss, sendo o fator apresentado entre parênteses
calculado através da relação entre a constante de Plank (h = 6,6262 x 10
-27
erg.S) e o valor do
magneton de Bohr (β = 9,2741 x 10
-21
erg.G
-1
). Este valor de g atua como uma identidade da
espécie paramagnética dos elementos e produtos de reação presentes em uma amostra, de
modo que sua determinação permite avaliar estado de spin, presença de ligantes do ferro
hemínico, alterações na valência do metal, detecção e identificação de radicais livres e o
efeito que estes causam sobre o anel porfirínico, via observação dos sinais de ataque à
porfirina, entre outros.
Em estudos sobre a configuração eletrônica de grupos heme, as formas assumidas
pelos espectros e os valores de g são evidências consistentes para as diferentes configurações
que adquirem os orbitais do ferro. Visando diferenciar as conformações planar e distorcida
das ferroporfirinas baseado nos valores de g, alguns autores referem ser possível usar o
somatório dos quadrados dos valores das componentes do tensor g (g
xx
, g
yy
e g
zz
), dita ∑g
2
. Se
este valor for aproximadamente 16, a conformação do anel é dada como planar, enquanto que
se o valor for inferior a 14 a conformação é dita distorcida
(92)
.
As temperaturas empregadas para o estudo de hemeproteínas como o citocromo c são
de grande importância para a qualidade do sinal procedente do ferro hemínico. Geralmente
requer-se o uso de temperaturas criogênicas para que os sinais possam ser devidamente
detectados. Estas baixíssimas temperaturas são atingidas pela circulação de hélio líquido e
permite avaliar com bastante propriedade a geometria e estado de spin do ferro hemínico. As
situações de alto spin são melhor percebidas no limite inferior deste intervalo, enquanto que
as formas de baixo spin e baixo spin alternativo requerem temperaturas próximas ao limite
superior.
O Dicroísmo Circular (CD) baseia-se nas propriedades óticas de proteínas e outras
biomoléculas. Quando de sua interação com luz circularmente polarizada, as biomoléculas
1. INTRODUÇÃO
Pág.50
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
promovem alteração da luz incidente, refletindo a elipticidade da molécula, referida como
(teta) a qual é medida por cálculos entre a diferença da absorção da luz circularmente
polarizada à direita e à esquerda após sua passagem pela amostra.
Quando aplicado um campo magnético a este sistema, tem-se o Dicroísmo Circular
Magnético (MCD). Aqui tem-se medida a diferença entre a absorção da luz polarizada à
direita e à esquerda por ação de um campo magnético aplicado paralelamente à direção da
propagação da luz. Fornece sinais mais estáveis, menos sensíveis às condições do meio e às
mudanças conformacionais provenientes da assimetria do cromóforo.
A espectroscopia de fluorescência, por sua vez, é muito útil na avaliação do grau de
enovelamento protéico, uma vez que o apocitocromo c exibe fluorescência, a qual é suprimida
quando o grupo heme é incorporado, sendo que o grau de supressão varia com a distância
heme-triptofano e assim com o enovelamento protéico ao redor do grupo heme. Esta
supressão da fluorescência, que define qualquer redução na intensidade da fluorescência em
função de constituintes presentes na amostra, podendo ser do tipo auto-supressão, quando a
substância em si acarreta tal efeito, ou pela transferência de energia por colisão de moléculas
excitadas com moléculas do solvente ou de outros solutos presentes
(
92
)
.
Como descrito até este momento, o estudo sobre a dinâmica das porfirinas vem
mostrando resultados aplicáveis em diferentes campos da ciência. Porfirinas não-biológicas
vêm sendo empregadas na construção de estruturas supramoleculares que podem ser
empregadas como biosensores, captadores de luz solar, nanomotores, catalisadores voltados
para síntese química, tratamento de resíduos industriais sistemas de transferência de elétron
fotoinduzida
(
93
)
, entre outras aplicações referidas na introdução deste trabalho. Destaque deve
ser dado ao potencial que as porfirinas, biológicas e sintéticas, têm como modelos para o
estudo de fenômenos biológicos, que vão da compreensão da biogênese do citocromo c e das
propriedades fundamentais do citocromo P-450 ao estudo e aplicação tecnológica do ciclo
catalítico das peroxidases. O estudo das propriedades, dos ligantes e do potencial como
peroxidase exercido pelas diferentes porfirinas justifica a temática deste trabalho, quem tem
como objetivos o estudo espectroscópico e a observação da atividade catalítica de duas
diferentes porfirinas, uma biológica e outra sintética, em diferentes microambientes, um dos
quais suprido por apohemoproteínas.
2. OBJETIVOS
Pág.51
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
Determinar as características espectroscópicas, os ligantes axiais e a atividade catalítica da
porfirina não-biológica Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da protoporfirina IX quando no interior da
estrutura terciária de apohemoproteínas selvagens e mutantes e em microambientes
heterogêneos constituídos por micelas aquosas, aniônicas e catiônicas e lipossomos.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Realizar a caracterização espectroscópica da porfirina não-biológica Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da protoporfirina IX em microambientes criados por apocitocromo c e
apomioglobina e sua atividade catalítica sobre t-BuOOH e DPAA.
2.2.2 Construir espécies mutantes de citocromo c via mutagênese sítio-dirigida com
substituição das cisteínas 14 e 17 por alanina visando manipular o microambiente do ferro
hemínico e seus ligantes axiais de tal forma a propiciar alterações estruturais e de atividade
catalítica dos sistemas constituídos pelas porfirinas não-biológicas e forma apo desta
hemoproteína.
2.2.3 Expressar e purificar citocromo c de coração de cavalo expresso em cepas de
Escherichia coli mutante nas histidinas 26 e 33 (H26N/H33N).
2.2.4 Efetuar a caracterização espectroscópica da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da
protoporfirina IX em micelas aquosas de SDS e CTAB e lipossomos de DODAB visando a
obtenção de dados comparativos ao efeito específico do microambiente hidrofóbico
proporcionado pelas apoproteínas e sua atividade catalítica sobre t-BuOOH e DPAA.
2.2.5 Determinar o efeito dos ligantes axiais do ferro porfirínico sobre a geometria, estado
de spin e reatividade das porfirinas associadas a micelas e lipossomos por adição de histidina.
3. MÉTODOS
Pág.52
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3. MÉTODOS
Todos os reagentes e soluções utilizadas no decurso deste trabalho foram de grau P.A.
e obtidos de empresas certificadas.
3.1 Síntese da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e preparo das soluções de
trabalho
A porfirina 2,6-dicloro-3-sulfonatofenil, Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, porfirina aniônica
cuja estrutura encontra-se apresentada na Figura 12, foi sintetizada pelo grupo da Profa Dra
Yassuco Iamamoto do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo segundo metodologias descrita por Lindsey
(
94
)
, Gonçalves et al
(
95
)
e Kadish et al
(
96
)
. Possui massa molecular de 1397,66 e o ferro
encontra-se no estado Fe(III).
Tratando-se de uma porfirina hidrossolúvel, as soluções de trabalho foram preparadas
por solubilização direta da porfirina liofilizada em tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4.
Apesar de tratar-se de uma porfirina pouco fotossensível, as soluções estoque e soluções de
trabalho foram mantidas ao abrigo de luz e à temperatura ambiente.
Todas as reações foram realizadas com porfirina 100 M em função da necessidade de
alta concentração para obtenção de sinais mais intensos e melhor definidos de EPR, CD e
MCD.
3.2 Obtenção das Apohemoproteínas – Apocitocromo c e Apomioglobina
A obtenção das apohemoproteínas se deu pela extração química do grupo heme
utilizando-se de proteínas comerciais e de proteínas recombinantes, conforme técnicas
descritas a seguir.
3.2.1 Obtenção do Apocitocromo c - Para o preparo de apocitocromo c foi utilizado
método descrito por Goldberg et al
(
97
)
, onde 100 mg de citocromo c (Sigma) é solubilizado
em água deionizada, recebendo em seguida solução de sulfato de prata (160 mg de sulfato de
prata dissolvidos em 18 ml de água deionizada) e 1,6 ml de ácido acético P.A. Neste
momento ocorre precipitação de parte do grupo heme presente na proteína. Incuba-se por 4
horas a exatos 40ºC, com a amostra protegida da luz e centrifuga-se por 30 minutos a 10ºC e
6500 Xg. O sobrenadante é dialisado por 12 horas utilizando-se membrana de 3,5 kDa contra
3. MÉTODOS
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2 litros de solução de ácido acético 0,1 N e depois por mais duas vezes por período de 12
horas cada contra 2 litros de tampão acetato de amônio 50 mM pH 5,0. Nova centrifugação é
necessária, novamente por 30 minutos a 10ºC e 6500 Xg sendo ao sobrenadante adicionado
250 l de solução saturada de sulfato de amônio. Mistura-se delicadamente e procede-se a
incubação à temperatura ambiente por 1 hora, sem agitação. Novamente centrifuga-se por 30
minutos a 10ºC e 6500 Xg, descartando-se o sobrenadante ao final. Ressuspende-se o
precipitado (pellet) formado com 20 ml de solução referenciada como MIX 1 (cloreto de
guanidina 6 M + Acetato de amônio 50 mM + 2-mercaptoetanol, com ajuste do pH para 5,0
utilizando-se ácido acético e NaOH). Dializa-se por 3 horas a 4ºC contra 2 litros de tampão
acetato de amônio 50 mM pH 5,0 acrescido de 700 l de acetato de amônio, novamente em
membrana de 3,5 kDa, trocando o tampão após este período por mais 2 litros com a mesma
composição para nova diálise por mais 12 horas. Centrifuga-se por 30 minutos a 10ºC e 6500
Xg. O sobrenadante obtido é solução de apocitocromo c, devendo ser aliquotado, liofilizado e
armazenado sob congelamento a -20ºC. Durante todo o processo deve-se proteger a amostra
da luz, uma vez que a proteína pode sofrer degradação se exposta. O 2-mercaptoetanol pode
ser substituído no processo por DDT (ditiotreitol), nas mesmas condições e concentrações,
sem prejuízo ao produto final.
O coeficiente de extinção molar () para o apocitocromo c é igual a 10580.cm
-1
.M
-1
em comprimento de onda de 277 nm
(
98
)
.
Para a obtenção de apocitocromo c mutante, com substituição das histidinas 26 e 33
por asparagina, neste trabalho referenciado como apocitocromo c pwt, o processo utilizado foi
o mesmo descrito acima, porém a partir da proteína expressa em cepas de Escherichia coli,
purificada e liofilizada em substituição à proteína comercial.
3.2.2 Obtenção da Apomioglobina - Para obtenção de apomioglobina é utilizada técnica
definida por Teale
(
99
)
, muito mais simples do que para a obtenção do apocitocromo c, visto o
heme na mioglobina estar ligado de forma não-covalente à proteína sendo assim mais fácil
extraí-lo do complexo, diferente do citocromo c, onde a ligação entre o heme e a cadeia
proteica é covalente. A mesma metodologia pode ser aplicada para obtenção de
apohemoglobina e apoHRP. Para tanto adiciona-se à solução da hemoproteína, preparada em
água deionizada, igual volume de metiletilcetona (MEK – 2-Butanona). Após agitação suave,
mantém-se a solução em banho de gelo até que haja separação em duas fases. O sobrenadante
conterá cetona e o grupo heme, enquanto a fase inferiormente posicionada conterá a
3. MÉTODOS
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apohemoproteína. Não é necessário centrifugar a solução. A fase inferior, que contém a
apoproteína, deve ser dialisada contra água em membrana de 3,5 kDa por 4 horas com troca e
repetição do processo por mais 4 horas e depois aliquotada, liofilizada e armazenada sob
congelamento a -20ºC. Da mesma forma que para o apocitocromo c, recomenda-se proteger a
amostra da luz durante todo o processo.
O coeficiente de extinção molar () para a apomioglobina é igual a 13500.cm
-1
.M
-1
em
comprimento de onda de 280 nm
(
100
)
.
3.3 Obtenção de formas mutantes de citocromo c por mutação sítio-dirigida
Para a obtenção de formas mutantes de citocromo c foi utilizado como molde o
plasmídio desenhado por Rumbley, Hoand e Englander, chamado PJRhrsN2, demonstrado
pela Figura 16, que contém o gene para expressão de citocromo c e também o gene que
codifica a heme-liase, permitindo assim a obtenção da proteína funcional, com grupo heme
unido covalentemente à cadeia polipeptídica
(
101
)
. Este plasmídio vem sendo utilizado também
por outros grupos para expressão de formas mutantes de citocromo c no estudo das
propriedades do nitro-citocromo c
(
102
)
. Dentre os demais constituintes básicos ao plasmídio, o
PJRhrsN2 possui o gene para -lactamase (Ampr) que confere resistência à ampicilina e que
atua como forma de seleção de colônias transformadas.
Figura 16 - Plasmídio PJRhrsN2 (RUMBLEY, J.N.; HOAND, L. and ENGLANDER, S.W. Recombinant
equyne cytochrome c in Escherichia coli: high-level expression, characterization, and folding and assembly
mutants. Biochemistry, v. 41, pp.13894-13901, 2002).
3. MÉTODOS
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Em vários estudos de expressão de citocromo c recombinante o rendimento obtido foi
muito baixo, possivelmente pela dificuldade da incorporação de forma covalente do grupo
heme à apoproteína. Alguns autores tentaram executar a maturação do apocitocromo c, a
apoproteína ainda sem o grupo heme, usando maquinaria do hospedeiro (Escherichia coli).
Outros tentaram a expressão em leveduras ou mesmo a expressão heteróloga de citocromo
c
551
de Pseudomonas aeruginosa em Escherichia coli. Em todos os casos o rendimento era
inferior a 2 mg/dL de proteína
(
103
,
104
,
105
)
.
Em 1998, Mauk et al
(
106
)
apresentaram a expressão de citocromo c de leveduras em
Escherichia coli por coexpressão de heme-liase da própria levedura, obtendo um maior
rendimento (15 mg/L), porém a instabilidade de alguns plasmídios levava à degradação do
produto. Posteriormente, Rubley et al fizeram modificações em protocolos já existentes
usando sistema de expressão de Pollock, e o grupo conseguiu aumentar a expressão de
citocromo c equino recombinante para 60 a 80 mg/L e com alto grau de pureza.
Inicialmente, substituindo o gene da heme liase de levedura pelo de cavalo (plasmídio
pCYCrrsN) o rendimento se manteve baixo (2 mg/L) e ainda com instabilidade plasmidial, de
modo similar a outros grupos que tentavam expressar citocromo c em leveduras. Foram então
inseridas várias modificações que resultaram em melhor rendimento e maior estabilidade do
produto final. Realizaram a clonagem do gene do citocromo c de coração de cavalo e da heme
liase de levedura em plasmídio pUC18 para posterior inserção no plasmídio de expressão.
Posteriormente, o gene de citocromo c foi amplificado por PCR a partir do plasmídio pAB458
e clonado no plasmídio de expressão pBPCYC1(wt/3) de Pollock e Mauk, que possui
promotor lac e trc, genes de citocromo c e de heme liase, ambos de levedura, e gene de
resistência à ampicilina. Destas modificações obteve-se um plasmídio denominado
pCYChrsN. Foi então introduzido um RBS (ribosome binding site) no PCYChrsN originando
o plasmídio pJRhsN e deste, por subclonagem de fragmentos obtidos por ação de
SmaI/HindIII em pUC18, obteve-se o pJRhsN2. Em função do fato de que a histidina 33 na
forma neutra traz barreiras cinéticas para o enovelamento proteico, foram realizadas mutações
sítio específicas no gene do citocromo c presente neste plasmídio com substituição das
histidinas 26 e 33 por asparagina. Este possui, portanto, gene de citocromo c de cavalo porém
H26N/H33N, gene para expressão de heme-liase de levedura, gene que confere resistência à
ampicilina e promotor lac.
Para a realização do presente trabalho, o plasmídio PJRhrsN2 foi cedido pelo Prof Dr
Rafael Radi, do Laboratório de Oncologia Básica e Biologia Molecular da Faculdade de
Medicina da Universidad de La Republica, em Montevidéu, Uruguai, sendo que a maior parte
3. MÉTODOS
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dos procedimentos aqui relatados para obtenção dos plasmídios com mutações sítio-dirigidas
e para a expressão e purificação das formas recombinantes de citocromo c foram realizados,
durante estágio de doutoramento financiado pela CAPES, nas dependências do seu
laboratório, sob orientação direta da Profa Dra Laura Castro e da Profa Verónica Tórtora e
também no Laboratório de Bioquímica, da Faculdade de Ciências, pertencente à mesma
universidade, sob supervisão da Profa Dra Mónica Marín.
A partir do plasmídio PJRhrsN2 foi possível realizar mutações sítio-específicas
dirigidas por oligonucleotídeos seguindo protocolos existentes na literatura
(103,
107
,
108
)
.
Em função das modificações inseridas no gene para expressão de citocromo c no
PJRhrsN2, o citocromo c produzido a partir deste plasmídio (citocromo c H26N/H33N)
recebeu a denominação de citocromo c pseudo-wild type (pwt).
Visando atender às necessidades deste projeto, foram expressos o citocromo c pseudo-
wt (H26Ne H33N) e citocromo c com mutações adicionais nas cisteínas 14
(C14A/H26N/H33N) e 17 (C17A/H26N/H33N). A obtenção destas formas mutantes de
citocromo seguiu a sequência de eventos relatadas a seguir.
3.3.1 Construção dos oligonucleotídeos específicos para cada mutação desejada –
Para a obtenção de formas mutantes nas cisteínas 14 e 17, foram desenhados
oligonucleotídeos com as substituições necessárias para troca destes aminoácidos por alanina,
passando os mesmos a serem denominados então como citocromo c C14A e citocromo c
C17A, apesar de que estas formas são também naturalmente mutantes nas histidinas 26 e 33
em função das substituições previamente realizadas quando da inserção do gene para o
citocromo c de coração de cavalo no plasmídio PJRhrsN2. Os oligonucleotídeos foram
sintetizados pela empresa IDT - Integrated DNA Technologies (Coralville, EUA) a partir do
gene para expressão de citocromo c de cavalo inserido no plasmídio PJRhrsN2.
Para obtenção do mutante na cisteína 14, foi desenhado o seguinte oligonucleotídeo,
cuja região destacada em vermelho corresponde à substituição que codificou para a alanina na
posição 14 da cadeia polipeptídica do citocromo c:
o C14AF 5’- GAA GAT TTT CGT TCA AAA GGC TGC TCA ATG TCA CAC TGT CG -3’
o C14Ar 5’- CGA CAG TGT GAC ATT GAG CAG CCT TTT GAA CGA AAA TCT TC -3’
Sequência do plasmídio nessa região, onde se encontra destacado em verde o códon que codifica
a cisteína 14: 5’- GAA GAT TTT CGT TCA AAA GTG TGC TCA ATG TCA CAC TGT CG -3’
3. MÉTODOS
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Para obtenção do mutante na cisteína 17, desenhado o seguinte oligonucleotídeo, cuja
região destacada em vermelho corresponde à substituição que codificou para a alanina na
posição 17 da cadeia polipeptídica do citocromo c:
o C17AF 5’- CGT TCA AAA GTG TGC TCA AGC TCA CAC TGT CGA AAA AGG -3’
o C17Ar 5’- CCT TTT TCG ACA GTG TGA GCT TGA GCA CAC TTT TGA ACG-3’
Sequência do plasmídio nessa região, onde se encontra destacado em verde o códon que codifica
a cisteína 17: 5’- CGT TCA AAA GTG TGC TCA ATG TCA CAC TGT CGA AAA AGG -3’
3.3.2 Obtenção dos plasmídios com as mutações sítio-específicas – A partir do
plasmídio PJRhrsN2 e dos oligonucleotídeos confeccionados, procedeu-se à mutação sítio-
dirigida no gene do citocromo c presente no PJRhrsN2 para produção de um plasmídio com
substituição do resíduo de cisteína 14 por alanina e outro com substituição do resíduo de
cisteína 17 também por alanina. Para tanto foi utilizado kit Quickchange II Site-Directed
Mutagenesis da Stratagene (código 200523). O processo consistiu em adicionar em tubos
apropriados para Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 10 l de água deionizada, 1,5 l do
oligonucleotídeo Ar e 1,5 l do oligonucleotídeo AF, estes dois últimos específicos para a
mutação desejada, isto é, para a obtenção de plasmídios mutantes para citocromo c C14A e
C17A. A cada tubo contendo os oligonucleotídeos para cada um dos mutantes adicionou-se
28 l de água recém-deionizada, 5 l de tampão, 1 l de dNTP’s e 1 l de DNA polimerase,
todos estes conteúdo do kit utilizado. Seguindo todos os protocolos de segurança específicos
para utilização de técnicas de biologia molecular, a cada tubo de amostra foram então
adicionados 2 l do plasmídio PJRhrsN2. As amostras foram submetidas a ciclos de PCR em
termociclador, utilizando-se como parâmetros início a 95ºC por 5 minutos seguidos de 18
ciclos sendo 45 segundos a 95ºC, 1 minuto a 54ºC e 4,30 minutos a 68ºC tendo finalização
por 5 minutos a 68ºC. Concluídos os ciclos de PCR, as amostras foram retiradas do
termociclador e mantidas em gelo por 2 minutos. A seguir, adicionado a cada tubo 1 l de
DpnI, enzima de restrição que acompanha o kit, e incubados em banho-maria a 37ºC por 1
hora para digestão do molde e obtenção exclusivamente do DNA desejado já devidamente
amplificado. Retirados do banho-maria, os tubos foram mantidos em gelo por 2 minutos. Em
tubos cônicos plásticos estéreis e previamente gelados foram adicionados 50 l de células
bacterianas supercompetentes que acompanham o kit e a elas 1 l da solução contendo o
DNA amplificado. Após homogeneização delicada os tubos foram mantidos em gelo por 30
minutos e a seguir sofreram choque térmico por transferência rápida dos tubos gelados a
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banho-maria, sob agitação leve, a exatos 42ºC por 45 segundos, seguido de retorno dos tubos
ao banho de gelo, onde permaneceram por mais 2 minutos. A cada tubo foram então
adicionados 500 l de meio NZY Broth autoclavado e suplementado com 12,5 ml de MgCl
2
1M, 12,5 ml de MgSO
4
1M e 20 ml de glicose a 20% (v/v). Os tubos foram incubados por 1
hora em agitador orbital a velocidade de 225 rpm, e o cultivo transferido para meio sólido LB
ágar contendo ampicilina (1 l de ampicilina a 100 mg/ml por ml de meio LB ágar) e
cultivados a 37ºC por 16 horas em estufa microbiológica. Decorrido o tempo de incubação, as
colônias obtidas, supostamente contendo o plasmídio com a mutação desejada, foram
submetidas a isolamento do DNA plasmidial, eletroforese e seqüenciamento para confirmação
do sucesso da mutação.
Para obtenção do citocromo c pseudo-wt (H26N/H33N), esta fase não é necessária em
função do plasmídio já conter as mutações especificadas.
3.3.3 Isolamento e eletroforese do DNA plasmidial mutante – Para a extração do
DNA plasmidial foi utilizado método baseado na precipitação alcalina baseada na técnica de
Birboim e Doly
(
109
,
110
)
que prevê diferenças na desnaturação entre o DNA plasmidial,
circular, e o DNA cromossomal, de maior peso molecular, quando em pH altamente alcalino.
Utilizando-se este princípio, a partir das colônias isoladas, foram realizados pré-cultivos em
meio líquido LB Broth contendo ampicilina, onde as colônias selecionadas foram inoculadas
em 3 ml de meio e incubadas a 37ºC, sob agitação em agitador orbital a 220 rpm por 8 horas.
Observado o crescimento bacteriano, o pré-cultivo de cada mutante foi centrifugado em
microtubo cônico por 5 minutos a 4ºC. Ao pellet obtido foram adicionados 100 l de solução
previamente gelada composta por Tris HCl 25 mM e EDTA 10 mM e pH ajustado para pH
8,0 à qual foi adicionada RNAse na proporção de 20 l/mL. Efetuada incubação por 15
minutos à temperatura ambiente para rompimento das células e ação da RNAse. Foram
adicionados 200 l de solução contendo NaOH 0,2 M e SDS 0,1%, misturando delicadamente
por inversão para rompimento do núcleo celular seguida de incubação por 5 minutos em
banho de gelo. Na sequência foram adicionados 150 lde solução contendo acetato de
potássio 3 M preparado em água com pH ajustado para 4,8 e o tubo foi agitado vigorosamente
e centrifugado por 20 minutos a 4ºC a 10000 Xg. Ao sobrenadante foram adicionados 0,7
volumes de isopropanol e a solução foi mantida a temperatura ambiente por 10 minutos
seguido de centrifugação por 30 minutos a 4ºC e 10000 Xg. Desprezado o sobrenadante, o
pellet foi ressuspenso com 800 l de etanol 70% gelado e em seguida centrifugado por 10
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minutos a 4ºC e 10000 Xg. O pellet obtido foi mantido à temperatura ambiente até evaporação
do etanol residual e então ressuspenso com 50 l de água deionizada e congelado a -20ºC para
posterior eletroforese.
A partir do isolamento do DNA plasmidial, procedeu-se à realização de eletroforese
em gel de agarose 0,8% utilizando tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) como tampão de
corrida e brometo de etídio como agente marcador do DNA. A visualização das bandas foi
realizada em câmara escura sob luz UV e o gel fotografado com sistema Kodak de captação
de imagens. A concentração do DNA para cada mutante foi obtida mediante cálculo
comparativo com padrão de corrida da Invitrogen de concentração conhecida.
Para obtenção do citocromo c pseudo-wt (H26A/H33A), esta fase não é necessária em
função do plasmídio já conter as mutações especificadas.
3.3.4 Sequenciamento do DNA plasmidial para confirmação das mutações – A
partir do plasmídio isolado e submetido à eletroforese em gel de agarose para visualização e
estimativa das concentrações obtidas, os plasmídios mutantes C14A/H26N/H33N e
C17A/H26N/H33N foram submetidos a seqüenciamento utilizando método enzimático de
Sanger no Instituto Pasteur de Montevidéu em seqüenciador automático de 4 capilares
ABI3130. Em paralelo, realizado também seqüenciamento do plasmídio PJRhrsN2 não
submetido a mutagênese visando confirmar a manutenção exclusiva das substituições das
histidinas 26 e 33 pela asparagina.
As análises das sequências obtidas foram realizadas utilizando-se o software BioEdit
Alignment Editor e os plasmídios que apresentaram as sequências adequadas unicamente com
a substituição dos aminoácidos desejados, sem outras substituições, deleções ou inserções no
plasmídio PJRhrsN2 foram selecionados para nova transformação em cepas bacterianas de
Escherichia coli.
3.3.5 Transformação em vetores de expressão – A partir do plasmídio com a mutação
confirmada pelo seqüenciamento, nova transformação em cepa bacteriana foi realizada tendo-
se escolhido como vetor de expressão a Escherichia coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen). Para
cada um dos microtubos que acompanha o kit foi adicionado 5 l do plasmídio mutante
respectivo à transformação desejada e, após mistura delicada, incubados por 30 minutos em
banho de gelo. Após este período, aplicado choque térmico por transferência imediata dos
microtubos a banho-maria a exatos 42ºC por exatos 30 segundos, sem agitação.
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Imediatamente transferidos de volta ao banho de gelo. Na sequência, adicionados 250 l de
meio enriquecido que acompanha o kit e mantido por 1 hora em incubação a 37ºC em agitador
orbital ajustado para 220 rpm. O cultivo foi então transferido para placas de petri contendo
meio sólido LB Ágar com ampicilina e estas mantidas em estufa microbiológica a 37ºC por
24 horas.
Este processo foi realizado para as formas mutantes C14A/H26N/H33N e
C17A/H26N/H33N bem como para o plasmídio PJRhrsN2, uma vez que nos interessa
também a obtenção do citocromo c pseudo-wt (H26N/H33N).
3.3.6 Expressão e purificação das formas mutantes de citocromo c – A partir das
colônias crescidas no LB Ágar, já transformados os plasmídios em cepas de Escherichia coli
BL 21 Star, se procedeu à expressão e purificação das formas mutantes de citocromo c
C14A/H26N/H33N, C17A/H26N/H33N e da forma pseudo-wt (H26N/H33N).
Para a expressão foram realizados pré-cultivos de Escherichia coli transformada com
DNA plasmidial contendo a mutação desejada em tubo cônico plástico estéril contendo 25 ml
de LB Broth com ampicilina e mantidos a 37ºC por 12 horas sob agitação constante em
agitador orbital ajustado para 220 rpm. O pré-cultivo foi então transferido para erlenmeyers
de capacidade mínima de 2 litro contendo 1 litro de meio Terrific (Invitrogen) com ampicilina.
Após incubação por 8 horas a 37ºC e agitação a 200 rpm procedeu-se à indução da expressão
do citocromo c adicionando ao meio 0,8 mM de IPTG (isopropil-tiogalactosídio) da Applied
Biosystem, um análogo não metabolizável da galactose utilizado como indutor de expressão
de genes sob controle de operons lac. O cultivo permaneceu em incubação por 50 horas,
tendo-se após a indução a temperatura reduzida para 30ºC e mantida a agitação a 200 rpm.
Alíquotas foram extraídas durante o período de incubação para verificação da presença de
citocromo c por espectroscopia no UV-vis. Passado o período de incubação as células foram
precipitadas por centrifugação a 4ºC e 5000 Xg por 20 minutos. Desprezado o sobrenadante
as células foram mantidas em banho de gelo e ressuspensas com tampão de lise (Tris HCl 50
mM, pH 8,0). Foram acrescidos alguns cristais de DNAse, fluoreto de fenilmetilsulfonila
(PMSF) 1 mM, 30 mg de lisozima e Tween20 2% (v/v). Após homogeneização, as células
foram rompidas por sonicação em banho de gelo e os restos celulares removidos por
centrifugação a 10000 Xg por 10 minutos a 4ºC. Ao sobrenadante, adicionado sulfato de
amônio, usando 351 g deste por litro de sobrenadante para precipitação do excesso de
proteínas presentes e mantido a 4ºC sob agitação por 15 minutos. O sobrenadante obtido após
centrifugação a 10000 Xg por 10 minutos a 4ºC foi dialisado por 12 horas contra 2 litros de
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tampão fosfato de potássio 10 mM, pH 7,5 sob agitação e temperatura de 4ºC com troca de
tampão após 6 horas de diálise. Adicionado ao dialisado 100 M de ferricianeto de potássio
para oxidação do citocromo previamente à filtração da solução em coluna cromatográfica de
troca iônica contendo como fase estacionária a carboximetilcelulose CM32 (Whatman
International Ltd) equilibrada com tampão fosfato de potássio 25 mM a pH 7,5. O citocromo c
retido na coluna foi eluído usando um gradiente de 40 a 250 mM de NaCl preparados no
mesmo tampão de equilíbrio da coluna. Foram efetuadas medidas de absorbância das
alíquotas obtidas, registrando valores em 280 e 410 nm para cálculo de pureza do citocromo
obtido tendo sido consideradas frações ideais as alíquotas em que a reação Abs
410nm
/Abs
280nm
foi maior ou igual a 3,2. Reunidas as alíquotas selecionadas, procedeu-se a nova diálise contra
tampão fosfato de potássio 10 mM pH 7,5 para retirada do NaCl. A proteína obtida foi
liofilizada e mantida a -20ºC.
3.3.7 Eletroforese da proteína mutante em gel de acrilamida – A partir da proteína
obtida pela expressão do plasmídio PJRhrsN2 com as mutações sítio-dirigidas desejadas, foi
realizada eletroforese em gel de acrilamida para posterior confirmação da presença de
citocromo c por Western-blot. Para este processo, foram utilizadas amostras obtidas antes do
processo cromatográfico de purificação. Para a realização da eletroforese em gel de
acrilamida previamente foi efetuada dosagem das proteínas utilizando-se o método de
Bradford
(
111
)
. Procedeu-se então à eletroforese em gel de acrilamida 15% preparado em
tampão Tris 1,25 M, pH 6,8, SDS 10%, APS 10% e TEMED (N,N,N',N'-Tetrametil
etilenodiamina). A corrida foi realizada em tampão Tris-Glicina-SDS em cuba ajustada para
100 V e 400 mA por 1,30 hora. O gel foi então direcionado para realização do western-blot.
3.3.8 Técnica de Western-blot usando anticorpo anti citocromo c – Visando
confirmar a presença de citocromo c a partir do produto da expressão do plasmídio PJRhrsN2
foi empregada a técnica de Western-blot. A partir do gel de eletroforese após a corrida das
amostras, realizada transferência de bandas para membrana de Western-blot utilizando
sistema semi-seco com tampão Tris-Glicina-SDS e Metanol ao qual se aplicou corrente de 1
mA/cm
2
por 1 hora. Realizada a transferência, a membrana foi corada por vermelho Ponceau
e assim confirmada a presença das bandas referentes às amostras e controles empregados. A
membrana foi então imersa em solução de bloqueio preparada com TBS (Tris-HCl 50 mM,
pH 7,4), NaCl 150 mM, Tween20 0,3% (v/v) e BSA 5% a 4ºC por 12 horas, sem agitação. Na
sequência, foi adicionado à membrana anticorpo anti-citocromo c (Pharmigen) como
3. MÉTODOS
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anticorpo primário e mantido o sistema em temperatura ambiente por 1 hora sob agitação
lenta. Após sequência de lavagens, foi adicionado à membrana como anticorpo secundário o
anti-mouse HRP (Invitrogen) e mantido nas mesmas condições de temperatura e agitação por
mais 1 hora. Após nova sequência de lavagens procedeu-se à revelação da membrana
utilizando-se o sistema West Fento da Thermo Scientific.
3.4 Preparo das micelas aquosas de SDS e CTAB
As micelas de SDS e CTAB foram preparadas em solução aquosa na concentração
desejada utilizando-se como solvente tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4. As micelas
foram obtidas nas concentrações desejadas partindo-se da CMC estabelecida para cada
surfactante em cada um dos meios selecionados. Tanto para as micelas de SDS quanto de
CTAB foi definida a concentração de trabalho em 15 mM, valor acima da CMC para ambos
os tensoativos, sendo a CMC para o SDS estimada em 1 mM quando em tampão fosfato de
sódio 5 mM e para o CTAB estimada em 0,07 mM no mesmo tampão
(
112
)
.
Figura 17 – Representação das estruturas do SDS e do CTAB.
3.5 Preparo de lipossomos de DODAB
Os lipossomos de DODAB (Dioctadecil-metilamônio) foram preparados seguindo
técnica para obtenção de vesículas gigantes, de dupla camada, as quais têm em média 400 nm
de diâmetro
(
113
)
. Para tanto, dissolveu-se em um becker a quantidade de DODAB (Sigma),
em gramas, necessária à obtenção de solução da concentração desejada. A solução foi
aquecida, em banho-maria, a exatamente 60ºC, sob agitação em agitador magnético e mantido
nessa condição por 10 minutos. A solução foi então ser transferida para um recipiente frio e
agitado em vórtex por 5 minutos, até seu resfriamento. Retornou-se então a solução ao becker
H
3
C
(CH
2
)
11
O
S
O
Na
+
O
O
C
16
H
33
N
+
(CH
3
)
3
Br
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
CTAB – Brometo de Dexadeciltrimetil Amônio
3. MÉTODOS
Pág.63
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
original e novamente a solução foi mantida sob agitação magnética a 60ºC por 10 minutos.
Repetiu-se o processo de resfriamento e aquecimento por 3 vezes no total.
Figura 18 – Representação da estrutura do DODAB.
3.6 Preparo dos filmes de DODAB e da associação porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/DODAB para microscopia de força atômica
Para obtenção das imagens por Microscopia de Força Atômica foram utilizadas como
suporte para a amostra placas de silício (Crystec - Kristall Technologie) previamente tratadas
por métodos descrito por Jass et al
(
114
)
. Placas de silício foram cortadas em quadrados de
dimensões aproximadas de 0,5 cm
2
e lavadas em solução de NH
4
OH – H
2
O
2
– H
2
O (1 : 1 : 5,
v/v/v) preparada no momento do uso. Para esta lavagem, as placas foram colocadas
individualmente em frascos de vidro e mantidas em banho-maria a 85
o
C por 5 minutos. A
seguir, foram lavadas em água deionizada por imersão por 3 minutos e colocadas em solução
de HCl - H
2
O
2
– H
2
O (1 : 1 : 6, v/v/v) preparada no momento do uso. Novamente foram
mantidas a 85
o
C por 5 minutos e lavadas posteriormente em água deionizada, por imersão,
por 30 minutos, com troca da água a cada 10 minutos. As placas foram mantidas em etanol até
o momento da preparação do filme, quanto foram então secas em jato de nitrogênio. Foram
então preparadas soluções contendo a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP associada às
vesículas gigantes de DODAB, por mistura direta da porfirina em meio aquoso em
lipossomos de DODAB previamente preparados conforme metodologia referida
anteriormente. Cerca de 10 l da mistura foram depositados sobre a placa de silício e após 10
minutos de contato o excesso foi removido da placa tocando a borda da mesma com papel-
filtro. As placas foram então mantidas sob refrigeração até secagem completa da amostra.
Para obtenção das imagens por microscopia de força atômica as placas foram submetidas à
análise à temperatura ambiente (20ºC) e pressão atmosférica (760 mmHg). As imagens foram
obtidas por determinação das forças de interação entre o “tip” e a superfície da amostra,
N
H
3
C
H
3
C
CH
3
CH
3
Br
+
DODAB – Dioctadeyl-methylamonium
3. MÉTODOS
Pág.64
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
seguindo orientações específicas de artigos relacionados à análise de lipossomos por AFM
(
115
,
116
)
.
3.7 Preparo de soluções para testes de atividade catalítica
Para os testes de atividade catalítica foram empregados Difenilacetaldeído (DPAA)
preparado em etanol compondo solução estoque a 10 mM e t-butil hidroperóxido (t-BuOOH)
em água deionizada compondo solução estoque a 1 M, ambas da Sigma-Aldrich. Ambas as
soluções-estoque foram mantidas congeladas a -20ºC para evitar degradação.
Figura 19 – Representação das estruturas do DPAA e do t-BuOOH.
A adição tanto do DPAA quanto do t-BuOOH a cada um dos sistemas testados se deu
por adição direta dos mesmos à solução presente na cubeta de cristal de quartzo usando
microseringa de vidro.
3.8 Espectroscopia de Absorção UV-vis
A espectroscopia de absorção no UV-vis realizada empregando o espectrofotômetro de
rede de fotodiodo Multispec 1501 da Shimadzu Corporation instalado no Centro
Interdisciplinar de Investigação Bioquímica (CIIB) da Universidade de Mogi das Cruzes
utilizando cubetas de cristal quartzo de caminho ótico 0,1 cm.
O equipamento conta com uma lâmpada de halogênio para medidas na faixa da luz
visível e uma lâmpada de deutério para a faixa no ultra-violeta. Para obtenção dos espectros
foi utilizado o software Shimadzu Hyper-UV, sendo o software Microcal Origin 6.0
empregado para migração, análise e apresentação final dos espectros obtidos.
H
3
C
H
3
C
CH
3
OH
O
tert-Butyl hidroperóxido
(CH
3
)
3
COOH
H
O
Difenilacetaldeído –
(C
6
H
5
)
2
CHCHO
3. MÉTODOS
Pág.65
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
3.9 Espectroscopia de Fluorescência
A fluorescência do triptofano foi medida utilizando-se espectrofotômetro de fluorescência
F-2500 (Hitachi) à temperatura ambiente, utilizando excitação em 292 nm, fenda de 10,0 nm e
intervalo de escaneamento de 300 a 500 nm. Para todos os experimentos foi utilizada cubeta
de cristal de quartzo de caminho óptico 1,0 cm.
3.10 Dicroísmo Circular (CD) e Dicroísmo Circular Magnético (MCD)
As medidas por CD e MCD foram realizadas utilizando espectropolarímetro JASCO J-
720 instalado no Departamento de Biofísica Molecular do Instituto de Física da Universidade
de São Paulo em São Carlos em parceria com o Prof Dr Otaciro Rangel Nascimento. Foram
utilizados como parâmetros fenda de 1,0 nm, resposta em 1 segundo, sensibilidade padrão,
intervalo de 0,1nm e velocidade de escaneamento de 100 nm/min. As medidas foram
realizadas à temperatura ambiente e utilizando-se cubeta de cristal de quartzo de caminho
ótico 0,1 cm.
Para a obtenção dos espectros por MCD, foi utilizado eletroímã de 0,87 Tesla. A
análise dos dados obtidos por MCD requer subtração dos sinais obtidos por CD. Como as
amostras analisadas não apresentaram resultado ao CD, os resultados apresentados são
exclusivamente os obtidos diretamente por MCD.
Foi utilizado o software Jasco Spectrum Analysis para avaliação dos espectros obtidos
e o software Microcal Origin 6.0 para migração, análise e apresentação final dos espectros
obtidos.
3.11 Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR)
As medidas por EPR foram realizadas utilizando o equipamento EPR Bruker
ELEXSYS modelo E-580 (Oxford, U.K.), equipado com criostato de hélio e temperatura
controlada, instalado no Departamento de Biofísica Molecular do Instituto de Física da
Universidade de São Paulo em São Carlos em colaboração com o Prof Dr Otaciro Rangel
Nascimento.
As condições iniciais de leitura foram estabelecidas seguindo-se como base-padrão
campo central em 2400 G, varredura de campo em 4000 G, número de pontos em 2048,
amplitude de modulação em 10 Gauss pico a pico, ganho de 45 dB, constante de tempo em
20,48 ms, tempo de conversão (conversion time) em 81,92 ms, potência em 8 mW e
temperatura em 4K.
3. MÉTODOS
Pág.66
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Os dados foram obtidos a partir do software do próprio analisador e os espectros
tratados utilizando-se o software Microcal Origin 6.0 para migração, análise e apresentação
final dos espectros obtidos.
3.12 Microscopia de Força Atômica – SPM
A microscopia de força atômica, mais especificamente o SPM (scanning probe
microscopy), tem por princípio a varredura da superfície da amostra por uma ponta piramidal
(ponteira) de algumas micra de comprimento (100 a 200 µm) e geralmente com menos de
vinte nanômetros de diâmetro, integrada a um cantilever flexível. A sonda é, portanto,
composta por uma ponta presa ao cantilever, sendo que para alcançar resolução atômica a
ponta tem que terminar em um conjunto de átomos. A força entre a ponta e a superfície da
amostra faz com que o cantilever se aproxime ou se afaste da mesma sendo esta deflexão
proporcional à força de interação. Na parte superior da haste há um espelho que reflete a luz
de um feixe de laser. Após a deflexão, o feixe de laser passa por uma lente e incide sobre um
fotodetector (fotodiodo) de quatro quadrantes, que mede as variações de posição e de
intensidade da luz produzidas pelas deflexões do cantilever. À medida que a ponta varre a
amostra ou a amostra é deslocada sob a ponta, os diferentes tipos de “acidentes geográficos”
encontrados sobre a superfície fazem com que a interação mude. As variações das interações
são os fatores que provocam diferentes deflexões. Essas diferenças, captadas no detector, são
armazenadas e processadas por um computador, que as transformam em imagens topográficas
bi e tridimensionais da superfície. A força mais comumente associada com AFM na deflexão
do cantilever é a força de van der Waals.
No modo contato o cantilever é mantido a poucos ângstrons da superfície da amostra e a
força interatômica entre a ponta e a amostra é repulsiva. A ponta faz um leve “contato físico”
com a amostra produzindo imagens com alta resolução. Entretanto, a compressão e as forças
geradas, entre a ponta e a superfície, podem causar danos à amostra. Já no modo não-contato
o cantilever é mantido mais distante da superfície da amostra e a força interatômica entre a
ponta e a amostra é atrativa. A ponta oscila em alta frequência (de 100 kHz a 1 MHz) a
poucos nanômetros acima da superfície e a força total entre a ponta e a amostra é muito baixa
(10 a 12 N). A oscilação faz com que as forças de van der Waals e forças eletrostáticas
possam ser detectadas. Não há considerável atrito sobre a amostra, causada pela ponta. Há,
entretanto, instabilidade entre a ponta e as forças adesivas da superfície e a resolução é
reduzida pela distância ponta-amostra que é relativamente grande.
3. MÉTODOS
Pág.67
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Para obtenção das imagens por microscopia de força atômica (AFM) apresentadas
neste trabalho foi empregado equipamento SPM-9600, da Shimadzu Corporation (Kyoto,
Japan) em modo contato, à temperatura ambiente (20ºC) e pressão atmosférica (760 mmHg),
utilizando pontas de silício, freqüência de ressonância ajustada para aproximadamente 200
kHz e scanner de 30 m.
3.13 Análise dos dados
Os dados obtidos foram tratados utilizando softwares Microcal Origin 6.0, BioEdit,
Cn3D e Jasco Spectrum Analysis. Para as imagens obtidas por microscopia de força atômica
foi utilizado software da Shimadzu Corporation.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.68
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados serão apresentados numa sequência que permita a caracterização
espectroscópicas e as propriedades catalíticas da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em
diferentes microambientes, homogêneo e heterogêneos, e da protoporfirina IX em condições
similares, visando fornecer subsídios para a interpretação dos fenômenos observados quando
da incorporação destas porfirinas em apohemoproteínas e dos potenciais ligantes envolvidos
na coordenação com o ferro hemínico quando da constituição dos complexos não-covalentes
porfirina/apoproteína.
Para o atendimento a este último, serão também apresentados resultados obtidos a
partir de apohemoproteínas com substituição em resíduos de aminoácidos potencialmente
envolvidos como ligantes axiais do ferro hemínico nesta condição.
4.1. Características espectroscópicas, estados de spin e atividade catalítica
da Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da protoporfirina IX em ambientes
homogêneo e heterogêneo não-proteico
Inicialmente foi realizada a caracterização espectroscópica da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em meio homogêneo de tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 e na
sequência realizada a caracterização em meios heterogêneos, mais especificamente, em
micelas de SDS e de CTAB.
A atividade catalítica da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP foi investigada por
diferentes métodos espectroscópicos utilizando-se t-BuOOH e DPAA como agentes oxidante
e redutor, respectivamente, nos diferentes meios selecionados.
4.1.1. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina IX em meio homogêneo
Em tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
apresenta no espectro no UV-vis banda Soret com máximo em 412 nm e uma banda bem
definida, na região das bandas Q, em 578 nm com outra menos evidente em 525 nm. Como
mostrado na Figura 19, quando a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão fosfato de
sódio 5 mM pH 7,4 é submetida à ação do t-BuOOH ocorrem alterações espectrais no UV-vis
que são compatíveis com o ciclo catalítico das peroxidases
(
117
)
. Após 20 segundos da adição
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.69
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
do peróxido, ocorre desvio acentuado da banda Soret de 412 para 421 nm, com seu retorno à
forma nativa após 1400 segundos de reação.
300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
500 550 600 650 700 750
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Figura 19 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato 5 mM pH 7.4
sob ação de t-BuOOH 1,5 mM. Situação inicial (linha preta), sob ação do t-BuOOH após 20 segundos (linha
vermelha), 320 segundos (linha azul), 560 segundos (linha magenta) e após 1400 segundos (linha laranja).
Além das mudanças observadas na banda Soret, pode-se também perceber alterações
cíclicas na região das bandas Q quando da ação do t-BuOOH sobre a porfirina FeTDC(SO
3
-
Na
+
)PP. Ocorre desvio destas bandas Q para o azul (blue shift) passando as mesmas de 525 e
578 nm para, respectivamente, 522 e 562 nm, com seu retorno à forma nativa após 1400
segundos de reação.
O conjunto destas alterações espectroscópicas permite inferir que ocorre um ciclo
catalítico completo
(
118
,
119
)
, onde a porfirina em sua forma nativa Fe(III) passa a Fe(IV)=O, o
oxoferril, forma característica do que nos ciclos das peroxidases é dito Composto II
(
120
)
. O
red shift observado e o aumento da intensidade da banda representam a formação de
Composto II (Porfirina Fe(IV)=O). A abstração de elétrons do t-BuOOH pelo Composto II
leva ao retorno da porfirina à sua forma nativa.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.70
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
O que se observa também é que não ocorre bleaching significativo na porfirina durante
o ciclo nem tão pouco ao seu término, indicando que a porfirina foi preservada do ataque de
radicais livres.
Uma vez que a ocorrência do ciclo leva à geração de intermediários de alta valência
que podem ser detectados por EPR, o suposto ciclo catalítico promovido pela adição do t-
BuOOH à porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em meio homogêneo foi então investigado
mediante a utilização desta técnica, que permite visualizar também mudanças na simetria da
porfirina. Conforme demonstrado pela Figura 20, a adição de t-BuOOH à porfirina em
solução aquosa tamponada permitiu observar diminuição gradativa do sinal do ferro no
decurso da reação com o peróxido, seguida de recuperação do sinal, o que comprova a
ocorrência de ciclo catalítico. A diminuição do sinal do ferro corresponde à formação de
Composto II (Porfirina Fe(IV)=O), uma forma EPR silenciosa
(
121
)
, e o retorno do sinal indica
a volta da porfirina à sua forma Fe(III). Além disso, o estreitamento do sinal obtido é
indicativo de mudança na simetria da porfirina. Em seu estado nativo a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP apresenta intenso sinal em g = 6,0 o que é indicativo de que se
encontra em estado de alto spin (spin 5/2), pentacoordenada ou hexacoordenada com ligantes
de campo fraco
(
122
,
123
)
. Porém, ocorre o aparecimento gradativo de sinal em g = 4,28,
indicativo de degradação da porfirina em função de ataque radicalar
(
124
)
, sendo que a
formação deste foi constatada pelo aparecimento de sinal com valores de g em 2,0020, 2,0080
e 2,0345, característicos do radical peroxil gerado a partir da reação com o t-BuOOH. A
observação de sinais de EPR em g = 2,0025 ± 0,005 é indicativa da presença de espécies
radicalares
(
125
,
126
)
. Muitos mecanismos têm sido descritos por sua capacidade de geração de
radicais livres a partir da reação de hidroperóxidos com hemoproteínas, sendo que o ciclo das
peroxidases é aceito atualmente como sendo um grande contribuinte para esta produção
radicalar
(
127
,
128
,
129
)
.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.71
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 20 – (A) Espectro de EPR a 4K da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 µM na presença de t-BuOOH
1,5 mM. Sinais de EPR da porfirina antes da adição do peróxido e temperatura em 4,2K (linha a) e após adição t-
BuOOH nos tempos de reação 10, 20, 100, 200, 300 e 600 segundos, todos medidos a 4,2K (linhas b, c, d, e, f, g
respectivamente). O inserto mostra em maior detalhe o sinal do radical peroxil gerado durante a reação. (B)
Sinais sobrepostos obtidos no espectro de EPR dos tempos de reação 0 (linha preta), 10 segundos (linha
vermelha), 100 segundos (linha azul), 200 segundos (linha magenta) e 600 segundos (linha laranja), mesmas
cores representadas nos mesmos tempos da figura (A).
As alterações espectrais observadas por EPR são sugestivas de uma clivagem
homolítica do peróxido, uma vez que não foi possível constatar a presença do Composto I
(oxoferryl -cátion), que possui sinal característico em g = 3,90
(
130
)
. O Composto O, por sua
vez, representado pela coordenação do peróxido com o ferro porfirínico em substituição à
água como ligante, não apresenta sinal por EPR.
Em relação ao radical peroxil observado no decorrer da reação da porfirina com o
peróxido, tem-se que o mesmo já foi previamente detectado e identificado em reações do
citocromo c com o t-BuOOH em condições de reação similares
(128,
131
,
132
)
. Vários trabalhos
vêm descrevendo já há várias décadas o envolvimento do citocromo c no geração
hidroperóxido-dependente de radicais livres, como o peroxil, envolvidos na lipoperoxidação e
no dano a proteínas
(
133
,
134
,
135
,
136
,
137
)
.
A Figura 21 evidencia as mudanças estruturais da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
em meio homogêneo, por meio de Dicroísmo Circular Magnético (MCD), quando da reação
com t-BuOOH. É possível verificar red shift imediatamente após a adição do peróxido
750 1000 1250 1500 1750
-10
-5
0
5
10
15
20
25
B
Intensidade (a.u.)
Campo magnético (Gauss)
1000 2000 3000 4000
-40
-20
0
20
40
60
3200 3300 3400 3500
19,0
19,5
20,0
20,5
g
f
e
d
c
b
Intensidade (a.u.)
Campo magnético (Gauss)
a
A
Radical Peroxil
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.72
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
seguido de retorno da banda à posição original após 25 minutos de reação, compatível com o
que foi observado pela espectroscopia no UV-vis.
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-8
-4
0
4
8
12
16
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
Figura 21 – Espectro de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato de sódio 5mM
pH 7,4 com t-BuOOH 1,5 mM. Porfirina em tampão fosfato (linha preta), sob ação de t-BuOOH imediatamente
após sua adição (linha vermelha) e após 25 minutos de reação (linha azul).
A atividade oxidásica foi investigada utilizando-se DPAA, o qual age como um agente
redutor do ferro porfirínico levando também a alterações espectrais características (Figura
22). A redução da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP leva a alterações do pico da Soret de
412 para 418 nm e as bandas Q passam de 525 e 578 nm para 538 e 614 nm respectivamente.
Durante a reação é possível perceber a existência de um ponto isosbéstico em 360 nm,
compatível com uma reação de primeira ordem e o surgimento de um pico em 258 nm. Em
outros sistemas já foi verificado o aparecimento de uma banda crescente em 260 nm, que foi
atribuído à formação de benzofenona, que é um produto esperado da oxidação do DPAA em
condições aeróbicas, sendo que a obtenção desta foi diretamente proporcional à relação
MP9/micelas de CTAB
(
138
)
. O surgimento deste pico a 258 nm quando da reação do DPAA
com a porfirina FeTDC(SO
3
-
Na
+
)PP em meio homogêneo pode ser atribuído à formação de
algum outro derivado do DPAA.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.73
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
500 550 600 650 700 750
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
360 nm
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 22 - Espectros no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato 5 mM pH 7,4
sob ação de DPAA 100 M. Situação inicial (linha preta), sob ação de DPAA após 500 segundos (linha
vermelha), após 1000 segundos (linha verde clara), após 1500 segundos (linha azul) e após 2500 segundos (linha
magenta).
A atividade catalítica da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP sobre DPAA foi
investigada por EPR e os resultados, conforme demonstrado na Figura 23, revelam aumento
do sinal da porfirina. A ação redutora do DPAA deveria ocasionar perda do sinal de EPR
quando da conversão do ferro à sua forma Fe(II), uma vez que neste estado de oxidação torna-
se uma espécie não-paramagnética. Entretanto, o aumento do sinal de EPR não pode ser
analisado do ponto de vista quantitativo, visto que houve mudança qualitativa do sinal. Pode
ter ocorrido a formação de outra espécie de porfirina devido à coordenação com produtos da
reação e esta pode ter sinal muito mais intenso do que a porfirina original.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.74
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-10
-5
0
5
10
15
20
25
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
Figura 23 – Espectros de EPR à temperatura de 4K da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão
fosfato 5,0 mM pH 7.4 (linha preta) e após 60 minutos da adição de DPAA 100 M (linha vermelha).
A velocidade com que o ciclo catalítico ocorre após adição de t-BuOOH pode ser
aumentada enormemente quando adicionado DPAA após a conversão da porfirina a
Composto II estimulada pelo peróxido. Conforme demonstrado na Figura 24, a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP sob ação de t-BuOOH passa a Composto II e a partir do momento
em que retornaria à sua forma nativa pela abstração de elétrons de outras moléculas de t-
BuOOH presentes no meio, adicionamos DPAA, o qual fornece os elétrons necessários e
permite um retorno muito mais rápido da porfirina à sua forma nativa.
Nesta condição, é possível notar que com a adição do t-BuOOH houve red shift e a
banda Soret passou de 412 para 421 nm. A banda Q exibiu blue shift, compatível com a
formação do Composto II pelo efeito oxidante do peróxido. O DPAA foi adicionado como
agente redutor logo após a formação do Composto II, o que promoveu um retorno à forma
nativa em apenas 10 minutos contra os 25 necessários para o retorno a partir da redução do
Composto II quando presente apenas o peróxido, seguido de alterações compatíveis com a
redução do ferro porfirínico, isto é, red shift da banda Soret que passou de 412 para 418 nm.
As alterações nas bandas Q também seguiram as mesmas alterações de quando adicionado
apenas o DPAA, isto é, passaram para 538 e 614 nm respectivamente.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.75
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
500 550 600 650 700 750
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 24 – Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato de sódio 5
mM pH 744 sob ação de t-BuOOH 1,5mM e DPAA 100 M. Situação inicial (linha preta), sob ação de t-
BuOOH após 164 segundos (linha vermelha), sob ação de t-BuOOH e DPAA após 300 segundos (linha verde),
após 600 segundos (linha azul), após 1000 segundos (linha magenta) e após 2000 segundos (linha laranja).
A protoporfirina IX apresenta um comportamento diferente da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP na presença de t-BuOOH. O espectro no UV-vis revela red shift da
Soret, que passa de 390 para 399 nm, como diminuição da intensidade no decorrer da reação.
Transcorridos 3600 segundos da adição do t-BuOOH, ocorre retorno da banda Soret a 390 nm
e crescimento do seu máximo (Figura 25). Tais alterações, da mesma forma que o
observado para a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP na presença deste hidroperóxido, são
condizentes com a ocorrência de ciclo catalítico, com formação de Composto II (Fe(IV)=O) e
retorno à forma nativa Fe(III).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.76
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
550 600 650 700 750
-0,05
0,00
0,05
0,10
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 25 – Espectro UV-vis da protoporfirina IX 100 M em tampão fosfato 5 mM pH 7,4 sob ação de t-
BuOOH 1,5 mM. Situação inicial (linha preta), imediatamente após a ação do t-BuOOH (linha vermelha), após
2500 segundos (linha verde), após 3600 segundos (linha azul), após 5000 segundos (linha azul claro) e após
6000 segundos (linha magenta).
A protoporfirina IX, quando submetida à ação de t-BuOOH, apresenta espectro de
EPR, mostrado na Figura 26, com queda do sinal da porfirina em g = 6,0 e aparecimento
gradativo de sinal da porfirina degradada, em g = 4,28 condizente com o ataque do anel
porfirínico por espécies radicalares geradas durante a reação, mais especificamente, do radical
peroxil. Surge no decurso da reação entre a protoporfirina IX e o t-BuOOH um sinal de
pequena intensidade em g = 3,9 característico da formação do -cátion spin 3/2, condizente
com a geração de Composto I (Por
+
.
Fe(IV)=O). O aumento do sinal característico da
degradação da protoporfirina IX por radicais livres gerados a partir da reação com o t-BuOOH
é superior ao que foi observado para a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP nas mesmas
condições.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.77
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 26 – (A) Espectros de EPR a 4K da protoporfirina IX 100 M em tampão fosfato 5,0 mM pH 7,4 sob
ação de t-BuOOH 25 mM. Porfirina sem t-BuOOH (linha preta), imediatamente após ação do peróxido (linha
vermelha), após 30 segundos (linha verde), após 1 minuto (linha azul), após 2 minutos (linha azul clara) e após 5
minutos (linha magenta). (B) Sinais sobrepostos obtidos no espectro de EPR nos mesmos tempos de reação e nas
mesmas cores representadas da figura (A).
A reação da protoporfirina IX com peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), em meio
homogêneo, mimetiza a reação da catalase, diferente do que ocorre quando o ciclo catalítico é
desencadeado pelo t-BuOOH
(
139
)
.
80 100 120 140 160 180
-4
-2
0
2
4
6
8
B
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
100 200 300 400
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
A
g = 3,9
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.78
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
4.1.2. Porfirinas Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina IX em meios
heterogêneos
Foram selecionados como meios heterogêneos a serem apresentados nesta sequência
micelas de SDS, micelas de CTAB e lipossomos de DODAB.
4.1.2.1. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina IX em meio heterogêneo de
micelas aniônicas de SDS.
Micelas de SDS oferecem um importante instrumento de análise da interação de
hemoproteínas com ambientes hidrofóbicos, tendo aqui sido utilizadas para demonstrar o
comportamento catalítico da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em ambientes desta natureza.
O SDS oferece uma interface aniônica ao sistema. A concentração micelar crítica (CMC) do
SDS em solução aquosa é estimada em 7 mM e em 1 mM especificamente quando em tampão
fosfato de sódio 5 mM pH 7,4
(
140
,
141
)
. Para os testes da atividade catalítica desta porfirina na
presença de peróxidos e aldeídos foi estipulado o uso de SDS 15 mM. É possível perceber,
conforme demonstrado na Figura 27, que a presença de SDS não promove alterações
espectrais na porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em relação aos resultados obtidos em meio
homogêneo, tanto por espectroscopia no UV-vis quanto por MCD. O espectro no UV-vis
revela que a banda Soret continua com máximo em 412 nm e as bandas Q em 578 e 525 nm.
Figura 27 – (A) Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em SDS preparado em
tampão fosfato 5 mM pH 7,4. Porfirina em tampão fosfato (linha preta) e em SDS 15 mM (linha vermelha). (B)
Espectro de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão fosfato de sódio e mM pH 7,4 (linha preta) e
em SDS 15 mM (linha vermelha).
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-5
0
5
10
B
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
A
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.79
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
A interface oferecida pelas micelas de SDS é aniônica, assim como a própria porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, de modo que pode-se pressupor que não esteja ocorrendo interação
entre a porfirina e as micelas, o que pode explicar a similaridade entre os resultados obtidos
nesta condição e aqueles em que a porfirina se encontrava em meio homogêneo.
Quando a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP é submetida à ação do t-BuOOH estando
em micelas de SDS, conforme mostrado na Figura 28, as alterações espectroscópicas são
muito similares às ocorridas quando em meio homogêneo, havendo entretanto um tempo
maior de resposta à ação do peróxido. Utilizando-se solução de SDS 15 mM, pode-se
perceber o deslocamento da banda Soret de 412 para 421 nm com aumento da intensidade,
compatível novamente com a formação de Composto II, o que ocorre, entretanto, após 80
segundos de reação contra os 20 segundos quando a porfirina se encontrava em solução
aquosa. É possível perceber também blue shift das bandas Q, porém com um desvio superior
ao observado em solução aquosa. As bandas Q passam de 525 e 578 nm para 521 e 563 nm,
desvio superior ao observado para a porfirina em tampão fosfato (522 e 566 nm). O retorno à
forma nativa também ocorre em um maior intervalo de tempo. Em SDS o tempo para retorno
da porfirina à forma Fe(III) após sua conversão a Composto II (Porfirina Fe(IV)=O) foi de 60
minutos contra os 25 minutos necessários quando em tampão fosfato. O bleaching constatado
na presença de SDS também foi maior, indicando maior dano ao anel porfirínico.
A diferença na velocidade do ciclo catalítico pode ser explicada pela partição do t-
BuOOH nas micelas. Sendo um peróxido bastante hidrofóbico, parte dele pode estar
associada à porção hidrofóbica das micelas de SDS enquanto apenas uma parte permanece no
meio aquoso externo às micelas reagindo com a porfirina. Deste modo, a disponibilidade de
t-BuOOH é menor, favorecendo uma reação mais lenta do que quando em um ambiente em
que toda concentração adicionada permanece acessível, como é o caso de um meio
homogêneo.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.80
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
500 550 600 650 700 750
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 28 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em SDS 15 mM preparado em
tampão fosfato 5 mM pH 7,4 (linha preta) e sob ação de t-BuOOH 1,5 mM após 80 segundos (linha vermelha),
após 1000 segundos (linha azul), após 2000 segundos (linha magenta) e após 3600 segundos (linha laranja).
A Figura 29 traz o espectro obtido por EPR. Com o passar do tempo de reação da
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com o t-BuOOH, ocorreram também mudanças de sinal
indicativas da formação de Composto II. Apesar da provável partição do peróxido e a
conseqüente redução na velocidade da reação foram obtidos sinais indicativos da ocorrência
do ciclo catalítico. Após adição do t-BuOOH, ocorre gradativa diminuição do sinal da
porfirina, o que indica perda do sinal de parte do ferro presente no meio, o que é compatível
com a formação de Composto II. Após 3 minutos de reação, é possível perceber que o sinal da
porfirina em g = 6,0, alto spin, aumenta de intensidade, correspondendo ao retorno da
porfirina à sua forma nativa Fe(III). Além disso, os espectros de EPR permitiram visualizar
que imediatamente após adição do peróxido surge sinal do radical peroxil e conseqüente
aumento do sinal da porfirina degradada (g = 4,28). Após 30 segundos de reação, o sinal do
radical peroxil aumenta, diminuindo após 1 minuto de reação. Após 2 minuto de reação, é
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.81
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
possível visualizar um novo sinal próximo ao sinal do radical peroxil, com g = 2,010, que é
compatível com sinal do radical metil.
Figura 29 – (A) Espectros de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em SDS 15mM preparado em
tampão fosfato 5,0 mM pH 7.4 sob ação de t-BuOOH 25mM à temperatura de 4K. Porfirina sem t-BuOOH
(linha preta), imediatamente após adição do peróxido (linha vermelha), após 30 segundos (linha verde), após 1
minuto (linha azul), após 2 minutos (linha azul clara) e após 3 minutos (linha magenta). Abaixo, sinal dos
radicais peroxil e metil (linha preta) acompanhado de simulação computacional (linha vermelha). (B) Detalhes
do espectro por EPR da porfirina sob ação do t-BuOOH. Porfirina sem t-BuOOH (linha preta), imediatamente
após adição do peróxido (linha vermelha), após 1 minuto (linha azul e após 3 minutos (linha magenta). Mantidas
a mesma sequência de cores e nos mesmos tempos indicados na figura (A).
Quando da reação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com DPAA, os resultados em
SDS também foram diferentes daqueles observados para a porfirina em tampão fosfato. Não
ocorre mudança espectral sugestiva de redução do ferro porfirínico, em função do discreto red
shift da banda Soret, de apenas 2 nm, onde o máximo passa de 412 para 414nm, o que pode
ser compatível com a mudança no estado de spin da porfirina ou em sua simetria (Figura 30).
Similar ao que ocorre no decurso da reação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com DPAA
75 100 125 150 175
-4
0
4
8
12
B
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
100 200 300 400
-12
-8
-4
0
4
8
12
16
20
A
330 335 340 345
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
Radical peroxil e metil
Simulação
g= [2.0020 2.0080 2.0345]
g
0
= 2.0148
9.473540 GHz
Intensidade (a.u.)
Campo magnético (Gauss)
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.82
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
em meio homogêneo, na presença de SDS também não ocorre o surgimento do ponto
isosbéstico em 360 nm característico da produção de benzofenona. Em SDS, surge entretanto
um ponto isosbéstico em 312 nm e o crescimento da banda próximo a 258 nm, o que não é,
entretanto, característico da formação de benzofenona derivada da reação com o aldeído.
Pode-se pressupor que na presença de micelas de SDS ocorra a formação de um novo produto
a partir da reação da porfirina com o aldeído, diferente daquele formado na reação da
porfirina em meio homogêneo.
250 300 350 400 450 500
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
500 550 600 650 700 750
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
312 nm
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 30 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em micelas de SDS 15 mM
preparado em tampão fosfato 5 mM pH 7,4 (linha preta) e sob ação de DPAA 100 M após 1200 segundos
(linha azul) e após 3500 segundos (linha vermelha).
Similar ao que ocorre para a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, a protoporfirina IX
também possui carga negativa, assim como as micelas de SDS, o que pode desfavorecer a
associação. Entretanto, as alterações espectrais no UV-vis, mais especificamente o red shift e
o aumento do da Soret, indicam que a porfirina se encontra no core micelar (Figura 31).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.83
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
500 550 600 650 700 750
-0,04
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Figura 31 – Espectro no UV-vis da protoporfirina IX 100 M em tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 (linha
preta) e em SDS 15 mM preparado no mesmo tampão (linha vermelha).
A protoporfirina IX sob ação de t-BuOOH quando em micelas de SDS, apresenta
também alterações espectrais condizentes com a ocorrência de ciclo catalítico No espectro no
UV-vis (Figura 32), a protoporfirina IX associada a micelas de SDS 15 mM apresenta,
quando da adição de t-BuOOH, red shift da Soret de 392 para 396 nm após 300 segundos de
reação, condizente com a formação de Composto II. Ocorreu também bleaching da Soret em
função do ataque radicalar ao anel porfirínico. Entretanto, decorridos 7200 segundos de
reação entre o t-BuOOH e a protoporfirina IX, não ocorreu retorno da Soret, como seria
esperado quando da conversão de Composto II à forma nativa Fe(III). Em função do meio
hidrofóbico fornecido pelas micelas de SDS e pelo particionamento do peróxido, a velocidade
do ciclo catalítico foi consideravelmente aumentada, porém o rápido consumo do peróxido
pode ser o responsável pela falta de doadores de elétrons para retorno do Composto II à forma
nativa.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.84
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 32 – Espectro no UV-vis da protoporfirina IX 100 M em SDS 15 mM preparado em tampão fosfato 5
mM pH 7,4 sob ação de t-BuOOH 1,5 mM. Situação inicial (linha preta), 60 segundos após adição de t-BuOOH
(linha vermelha), após 100 segundos (linha verde), após 300 segundos (linha azul) e após 7200 segundos (linha
magenta).
O espectro de EPR da protoporfirina IX em micelas de SDS submetida à ação de t-
BuOOH, conforme Figura 33, demonstra diminuição da intensidade do sinal da porfirina em g
= 6,0 indicativo da presença de formas EPR silenciosas, como o Composto II e aumento da
intensidade em g = 4,28, indicativo de degradação da porfirina. Existe sinal do radical peroxil,
que confirma que tanto o bleaching observado no espectro UV-vis quanto o aumento do sinal
de porfirina degradada no EPR é decorrente do ataque ao anel porfirínico. Diferentemente do
que ocorre quando a protoporfirina IX se encontra em meio homogêneo, não surge sinal em g
= 3,9 característico da formação de Composto I. Não é possível, entretanto, descartar que se
trate de uma clivagem heterolítica tanto quando a porfirina se encontra em meio homogêneo
quanto quando se encontra em micelas de SDS, uma vez que a velocidade de conversão de
Composto I a Composto II pode estar ocorrendo na escala de microssegundos. A velocidade
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.85
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
de reação da protoporfirina IX com t-BuOOH em micelas de SDS foi observadamente maior
do que em meio homogêneo também no espectro UV-vis (Figura 32).
Figura 33 – (A) Espectros de EPR a 4K da protoporfirina IX 100 M em SDS 15 mM tampão fosfato 5,0 mM
pH 7,4 sob ação de t-BuOOH 25 mM. Porfirina sem t-BuOOH (linha preta), imediatamente após ação do
peróxido (linha vermelha), após 30 segundos (linha verde), após 1 minuto (linha azul), após 2 minutos (linha
azul clara) e após 30 minutos (linha magenta). (B) Sinais sobrepostos obtidos no espectro de EPR nos mesmos
tempos de reação e nas mesmas cores representadas da figura (A).
4.1.2.2. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e protoporfirina IX em meio heterogêneo
de micelas catiônicas de CTAB
As micelas de CTAB fornecem um sistema modelo catiônico que vem sendo
amplamente empregado em estudos tanto no que concerne à própria interface que oferece
quanto às possibilidades nanotecnológicas que abre para o controle de atividade catalítica de
hemoproteínas e, mais especificamente, de hemopeptídeos como as microperoxidases
mediante ação de peróxidos
(
142
,
143
,
144
)
. No estudo da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP , as
micelas de CTAB agem da mesma forma, oferecendo um ambiente bastante adequado para a
observação dos fenômenos catalíticos exercidos por esta porfirina sobre peróxidos e aldeídos.
Ambiente este bem diferente daquele fornecido pelas micelas de SDS.
Foi possível constatar mediante os experimentos realizados que o comportamento da
porfirina e os derivados radicalares formados durante a ação t-BuOOH foram diferentes
80 100 120 140 160 180
-4
0
4
8
12
B
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
100 200 300 400
-12
-8
-4
0
4
8
12
A
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.86
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
daqueles observados quando a porfirina se encontrava em meio homogêneo e mesmo em
micelas de SDS. A interface positiva fornecida pela micela de CTAB permite interação com a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, aniônica, a qual pode, inclusive, estar inserida no core
micelar.
Existem diferenças espectrais no UV-vis e por MCD quando a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP interage com as micelas de CTAB em relação ao meio homogêneo e
também às micelas de SDS (Figura 34). Por MCD foi possível demonstrar que permanece a
simetria da porfirina em ambas as condições, porém a mudança para um ambiente mais
hidrofóbico, representado pela associação com as micelas de CTAB, promove aumento na
intensidade do sinal. A banda positiva passa de 406 para 402 nm, enquanto o desvio da banda
negativa é menor, passando de 420 para 421 nm quando em micelas de CTAB. Já pelo
espectro no UV-vis é possível verificar red shift da banda Soret, compatível com a mudança
para o ambiente mais hidrofóbico, onde o máximo passou de 412 para 418 nm. Houve
também aumento da intensidade da banda em 578 nm. Estas alterações são compatíveis com a
porfirina inserida no core micelar.
Figura 34 – (A) Espectro de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato de sódio 5
mM pH 7,4 (linha preta) e em CTAB 15 mM (linha vermelha). (B) Espectro no UV-vis da mesma porfirina em
tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 (linha preta) e em micelas de CTAB (linha vermelha).
Quanto à atividade catalítica da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP neste novo
ambiente, o comportamento dos espectros obtidos foi distinto do que foi obtido em meio
homogêneo e mesmo na presença de micelas de SDS. Em meio homogêneo, as alterações
espectroscópicas observadas no UV-vis são representativos da formação de Composto II
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
B
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-10
-5
0
5
10
15
A
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.87
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
quando a porfirina está sob a ação do t-BuOOH, enquanto que em micelas de CTAB observa-
se apenas um pequeno bleaching (Figura 35). Tal bleaching está provavelmente relacionado à
geração de radicais livres, o que sugere a ocorrência do ciclo catalítico nas condições
experimentais usadas, o qual, porém, pode ter ocorrido em uma escala de tempo de
microsegundos e assim não ter sido possível sua visualização à espectroscopia no UV-vis.
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
500 550 600 650 700 750
-0,04
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 35 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em CTAB 15 mM preparado em
água (linha preta) e sob ação de t-BuOOH 1,5 mM após 200 segundos (linha azul), após e após 1800 segundos
(linha vermelha).
Comparativamente ao que ocorre nas micelas de SDS, é provável que ocorra
particionamento do t-BuOOH quando este é adicionado a meio contendo micelas de CTAB,
interferindo na velocidade do ciclo catalítico. Entretanto, não é possível descartar que as
micelas de CTAB gerem um ambiente que torne ineficiente a atividade peroxidásica da
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, uma vez que não foram notadas alterações significativas
também quando da reação desta com DPAA nesta condição, como será demonstrado na
sequência.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.88
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Utilizando-se de espectroscopia por EPR, entretanto, e conforme apresentado na
Figura 36, podem ser observadas alterações condizentes com a ocorrência do ciclo catalítico
quando da ação do t-BuOOH sobre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP associada a micelas
de CTAB. Imediatamente após adição do t-BuOOH surge sinal da porfirina degradada em g =
4,28, que aumenta no decorrer do tempo, bem como ocorre o aparecimento do sinal do radical
peroxil. Similarmente ao que foi observado quando a porfirina se encontrava em micelas de
SDS, ocorre no decorrer da reação uma diminuição do sinal da porfirina em g = 6,0 que não é
proporcional ao aumento do sinal da porfirina degradada. Isto sugere que parte do sinal
perdido correspondente ao ferro pode ser decorrente da existência de formas EPR silenciosas
como o Composto II. Após 1 minuto de reação o sinal da porfirina é recuperado, sugerindo
que houve retorno do ferro à sua forma Fe(III). O sinal do radical peroxil persiste durante 30
minutos de reação e parece ter pouco efeito sobre a porfirina, uma vez que o sinal da porfirina
degradada não aumenta significativamente nesse intervalo, o que é compatível ao pequeno
bleaching que foi observado por espectroscopia no UV-vis.
Figura 36 – (A) Espectros de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em CTAB 15 mM preparado
em tampão fosfato 5,0 mM pH 7,4 sob ação de t-BuOOH 25 mM à temperatura de 4K. Porfirina sem t-BuOOH
(linha preta), imediatamente após adição do peróxido (linha vermelha), após 30 segundos (linha verde), após 1
minuto (linha azul), após 2 minutos (linha azul clara), após 5 minutos (linha magenta). (B) Sinais sobrepostos
obtidos no espectro de EPR nos mesmos tempos de reação e nas mesmas cores representadas da figura (A).
75 100 125 150 175
0
4
8
12
16
B
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
100 200 300 400
-12
-8
-4
0
4
8
12
16
A
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.89
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
A ação do DPAA sobre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em micelas de CTAB
também foi diferente do observado em meio homogêneo e do que foi visto em micelas de
SDS. Quando em micelas de CTAB, a reação com DPAA promoveu red shift de apenas 1 nm,
de modo que o máximo da Soret passou de 418 para 419 nm. Pode-se descrever também o
surgimento de um ponto isosbéstico em 302 nm e crescimento da banda em 258 nm (Figura
37), novamente não característico da formação de benzofenona, porém sugestivo de formação
de outros derivados do aldeído. Em meio homogêneo este red shift foi da ordem de 6 nm, com
ponto isosbéstico em 258 nm, enquanto que em SDS o red shift também foi pequeno, de
apenas 2 nm, passando o máximo da Soret de 412 para 414 nm e com ponto isosbéstico em
312 nm.
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
380 390 400 410 420 430 440 450
0,66
0,68
0,70
0,72
0,74
302 nm
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 37 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em CTAB 15 mM preparado em
água (linha preta) e sob ação de DPAA 100 M após 250 segundos (linha vermelha), após 1000 segundos (linha
azul) e após 1800 segundos (linha magenta). O inserto apresenta em maior detalhe os picos observados para a
banda Soret nestas condições e tempos de reação com DPAA.
Experimentos com microperoxidases associadas a micelas de CTAB, mais
especificamente a MP-8, revelaram uma diminuição na eficiência catalítica da enzima. Sabe-
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.90
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
se que os íons H
+
são inibidores competitivos da enzima e que o CTAB oferece uma interface
alcalina que, apesar da baixa oferta de H
+
limitando a inibição competitiva, por um lado
contribui para a afinidade do substrato, mas por outro lado desfavorece a catálise. A falta de
doadores de prótons pode ser sanada pela adição de histidina ao meio
(
145
)
. No caso da
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, a eficiência catalítica deve ser exatamente porque os
ligantes meso da porfirina retém prótons. Por isso, ela se comporta como a MP-8 em água,
onde a eficiência catalítica alta faz com que o ciclo ocorra na escala de microsegundos,
enquanto que a MP-8 em CTAB exibe ciclo na escala de segundos
(
146
)
.
A associação da protoporfirina IX com as micelas de CTAB promove deslocamento da
banda Soret de 390 para 398 nm e com aumento do , fatores indicativos de que a porfirina
está inserida no core micelar. Quando a porfirina associada a estas micelas é submetida à ação
de t-BuOOH, apresenta alterações espectrais que são condizentes com a ocorrência do ciclo
catalítico (Figura 38), porém mais lentamente do que para a protoporfirina IX em meio
homogêneo ou mesmo em micelas de SDS. A ação do t-BuOOH sobre a porfirina IX
associada às micelas de CTAB promove red shift da banda Soret, observável no espectro no
UV-vis, de 398 para 403 nm. Na região das bandas Q ocorre blue shift, com deslocamento de
banda de 593 para 570 nm. A formação do Composto II é acompanhada de bleaching da Soret
decorrente do ataque à porfirina por radicais livres gerados pela clivagem do peróxido.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.91
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
550 600 650 700
-0,08
-0,04
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 38– Espectro no UV-vis da protoporfirina IX 100 M em CTAB 15 mM preparado em tampão fosfato 5
mM pH 7,4 sob ação de t-BuOOH 1,5 mM. Situação inicial (linha preta), 500 segundos após adição de t-
BuOOH (linha vermelha), após 2000 segundos (linha azul) e após 7200 segundos (linha magenta).
Associadas às micelas de CTAB, a protoporfirina IX quando na presença de t-
BuOOH, apresenta diminuição do sinal de EPR em g = 6,0 e aumento do sinal da porfirina
degradada. É possível observar o surgimento do radical decorrente da clivagem do peróxido,
sendo que surge um novo sinal próximo ao do radical peroxil, porém mais largo, com cerca de
35 Gauss, amplitude esta não usual para radicais livres, podendo ser entretanto indicativa do
surgimento de forma -cátion ½. Após 30 segundos de reação, ocorre o aparecimento de sinal
de pequena intensidade em g = 3,9 indicativo da formação de Composto I, -cátion 3/2, como
o que foi observado quando da reação da protoporfirina IX com o t-BuOOH em meio
homogêneo. Após um minuto de reação, ocorre recuperação do sinal em g = 6,0, o que indica
a conversão de Composto I a Composto II e deste à forma nativa Fe(III). Em função da
continuidade de geração de espécies radicalares derivadas da clivagem do peróxido, ocorre
diminuição gradativa do sinal de EPR em g = 6,0 e aumento do sinal da porfirina degradada
(Figura 39).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.92
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 39 – (A) Espectros de EPR a 4K da protoporfirina IX 100 M em CTAB 15 mM preparado em tampão
fosfato 5,0 mM pH 7,4 sob ação de t-BuOOH 25nmM. Porfirina sem t-BuOOH (linha preta), imediatamente
após ação do peróxido (linha vermelha), após 30 segundos (linha verde), após 1 minuto (linha azul), após 90
segundos (linha azul clara), após 2 minutos (linha magenta), após 5 minutos (linha verde oliva) e após 30
minutos (linha laranja). (B) Sinais sobrepostos obtidos no espectro de EPR nos mesmos tempos de reação e nas
mesmas cores representadas da figura (A).
A atividade catalítica da protoporfirina IX em ambiente micelar de CTAB foi
recentemente publicada por nosso grupo e demonstra que a habilidade de clivar peróxidos e
oxidar aldeídos, como o t-BuOOH e o DPAA respectivamente, não é exclusividade de
hemoproteínas ou de hemopeptídeos
(
147
)
. No caso da Fe(III)-microperoxidase (Fe(III)-MP)
associada a micelas de CTAB, da mesma forma que para a protoporfirina IX e para a
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, a interface alcalina e o core hidrofóbico levam a mecanismos e/ou
velocidade de reação com peróxidos diferente do que ocorre em meio homogêneo, e mesmo
em micelas de SDS. A reação de Fe(III)-MP com t-BuOOH possivelmente é uma clivagem do
tipo homolítica, da mesma forma que o foi observado para a Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP. No
caso da protoporfirina IX, entretanto, a associação com as micelas de CTAB leva a uma
clivagem heterolítica do t-BuOOH, o que foi constatado pela presença de sinal de g = 3,9 nos
espectros de EPR quando a reação ocorreu em meio homogêneo e em micelas de CTAB. Na
presença de micelas de SDS, entretanto, não foi possível confirmar esta hipótese, a qual,
entretanto, não pode ser descartada uma vez que a velocidade da reação ocorre em escala de
microssegundos.
80 100 120 140 160 180
-3
0
3
6
9
B
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
100 200 300 400
-16
-12
-8
-4
0
4
8
12
A
g = 3,9
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.93
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
4.1.2.3. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em meio heterogêneo de lipossomos de DODAB
A porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP quando associada a lipossomos de DODAB,
vesículas catiônicas de dupla camada, apresenta alterações no espectro no UV-vis e por MCD
condizentes com a inserção da porfirina na bicamada hidrofóbica (Figura 40). No espectro
UV-vis ocorre red shift da banda Soret com desvio da mesma de 412 para 418 nm, similar ao
que ocorre quando a porfirina se associa a micelas de CTAB. Da mesma forma, ocorre
aumento de intensidade da banda Q, porém com pico máximo em 584 nm. No espectro de
MCD a banda positiva passa de 406 para 408 nm e a banda negativa passa de 420 para 424
nm, estas sim distintas das alterações observadas quando da associação da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com micelas de CTAB.
Figura 40 - (A) Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato de sódio 5
mM pH 7,4 (linha preta) e em lipossomos de DODAB 0,5 mM preparados em água (linha vermelha). (B)
Espectro de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 (linha
preta) e em DODAB 0,5mM preparado no mesmo tampão (linha vermelha).
O espectro obtido por EPR demonstra que a associação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com os lipossomos de DODAB gera modificações no sinal. Mantém-se o sinal em g=
6,0 indicativo de porfirina pentacoordenada ou coordenada com ligantes de campo fraco.
Ocorrem, entretanto, desvio e alterações na intensidade do sinal, o que demonstra alterações
na simetria da porfirina (Figura 41).
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-5
0
5
10
B
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
300 350 400 450 500
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
500 550 600 650 700 750
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
A
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.94
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 41 - Espectro de EPR a 4ºK da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato de sódio 5
mM pH 7,4 (linha preta) e em lipossomos de DODAB 0,5 mM preparados em água (linha vermelha).
Os resultados obtidos através da análise dos espectros no UV-vis, MCD e EPR
corroboram a hipótese de que a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP se insere na bicamada
lipídica fornecida pelos lipossomos de DODAB e que exibe atividade catalítica nesta
condição. A porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP na presença de lipossomos de DODAB exibe
reatividade na presença de t-BuOOH, sofrendo desvio da banda Soret condizente com a
formação de Composto II (Figura 42). A banda Soret apresenta red shift indo de 416 para 420
nm e retornando a 416 nm após 750 segundos. Na região das bandas Q observa-se desvio de
584 para 580 nm seguido de retorno ao máximo quando completado o ciclo catalítico. O
retorno de Composto II à forma nativa Fe(III) ocorre em um tempo bastante superior ao que
foi observado quando da reação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com t-BuOOH em meio
homogêneo (20 segundos) e na presença de micelas de aSDS (80 segundos).
1000 2000 3000 4000
-5
0
5
10
15
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.95
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
550 600 650 700 750
-0,06
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 42 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em lipossomos de DODAB
(linha preta) e sob ação de t-BuOOH 1,5 mM após 130 segundos (linha vermelha), após 330 segundos (linha
azul) e após 750 segundos (linha magenta).
Na reação com DPAA, conforme Figura 43, a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP na
presença de lipossomos de DODAB apresenta sinais de redução do ferro porfirínico, uma vez
que ocorre desvio da banda Soret de 416 para 423 nm, similar ao que ocorre quando a
porfirina se encontra na presença de micelas de SDS e em meio homogêneo. Na região das
bandas Q tem-se blue shift de 584 para 542 nm e aparecimento de ponto isosbéstico em 308
nm com surgimento de banda em 260 nm, esta sim característica da formação de benzofenona
(
148
)
.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.96
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
550 600 650 700 750
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
308 nm
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 43 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em lipossomos de DODAB
(linha preta) e sob ação de DPAA 100 M após 300 segundos (linha vermelha) e após 1200 segundos (linha
azul).
Fato interessante quando da associação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com as
vesículas gigantes de DODAB é a formação de agregados que, após terem sido submetidos à
análise por microscopia de força atômica (AFM), demonstraram um grau de organização
bastante promissor para investigações futuras na área da nanotecnologia. A associação
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/DODAB promove aumento da viscosidade do meio,
visualmente perceptível, e a formação de estruturas poliméricas, macroscópicas quando em
maiores concentrações de porfirina (Figura 44), porém presentes mesmo em menores
concentrações, como pode ser visualizado por AFM.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.97
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 44 – Imagem macroscópica das estruturas poliméricas formadas pela associação da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com lipossomos de DODAB. (A) Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 75 M em
lipossomos de DODAB 500 M, (B) Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 25 M associada a DODAB 500 M,
(C) Somente vesículas de DODAB a 500 M e (D) Somente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 75 M em
solução tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4.
Por microscopia de força atômica, as estruturas poliméricas formadas pela associação
da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com os lipossomos de DODAB, aparecem como uma
nanorede (Figura 45), onde se supõe que a porfirina, de carga negativa, esteja intercalada
entre vesículas de DODAB, de carga positiva. Para a observação por AFM, as amostras foram
diluídas previamente à colocação sob a superfície de silício previamente tratada visando
permitir a formação de um filme o mais fino possível e com o mínimo de sobreposições de
estruturas visando favorecer uma melhor observação das nanoestruturas formadas.
Conforme é possível observar na Figura 45A, os lipossomos de DODAB aparecem
inicialmente como estruturas individualizadas, cuja mensuração utilizando o software do
próprio equipamento empregado na obtenção da imagem (Shimadzu) confirma suas
dimensões em torno de 400 nm, medida característica de vesículas gigantes obtidas pelo
método selecionado para preparação destes lipossomos. Na presença da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP os lipossomos passam por um rearranjo, sendo possível observar na
Figura 45B que se posicionam linearmente, fazendo pontes entre si e com lipossomos
vizinhos. Esta estruturação é altamente sugestiva de que a porfirina atue como um elo de
ligação entre os lipossomos de DODAB e que tal condição possa favorecer o emprego destas
estruturas para condução de elétrons e possível aplicação como um nanosensor, umas das
perspectivas futuras de estudo de nosso grupo.
(A) (B) (C) (D)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.98
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 45 – Visualização por Microscopia de Força Atômica (AFM), modo contato, das nanoestruturas
formadas pela associação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e lipossomos de DODAB. (A) Imagens por modo
contato das vesículas de DODAB preparadas em água em concentração igual a 600 m. (B) Imagens das
nanoestruturas formadas a partir de contato de solução a 20 m da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP preparada
em tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 com vesículas de DODAB a 600 m preparadas em água. (C)
Visualização plana da condição da mesma imagem descrita em (B). Para todas as leituras, utilizado scanner de
30 nm e frequência de ressonância ajustada para 200 Hz.
C
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.99
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Imagens similares foram obtidas utilizando-se porfirina de mesma estrutura que a
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, porém com substituição do ferro por zinco. Esta, apesar de não
exibir propriedades catalíticas quando em lipossomos de DODAB (resultados não mostrados),
forma estruturas macroscópicas e microscópicas iguais às observadas para a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP.
A literatura refere que as porfirinas, por controle adequado de seus substituintes, tem
capacidade de associação a outras moléculas por meio de ligações de hidrogênio, interações
dipolo-dipolo ou de van der Walls, ganhando a propriedade de formar estruturas auto-
montadas com potencial nanotecnológico
(
149
)
.
4.1.3. Efeito da histidina como ligante axial do ferro no estado de spin e na atividade
catalítica da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
Sendo a histidina um ligante do ferro porfirínico em hemoproteínas, como no
citocromo c, onde ocupa a quinta posição de coordenação, sua presença em soluções contendo
porfirinas pode favorecer sua coordenação ao centro metálico destas e assim promover
alterações estruturais e funcionais das mesmas.
Conforme mostrado na Figura 46, o espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em meio contendo histidina revela red shift da banda Soret de 412 para 417 nm. Na
região das bandas Q tem-se uma banda bastante evidente com máximo em 548 nm. Na
região da banda N, ocorre desvio de 331 para 321 nm, desvio este que é indicativo de
mudança na coordenação do ferro hemínico.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.100
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 46 – (A) Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato de sódio 5
mM pH 7,4 (linha preta), em histidina 5 mM pH 9,1 (linha vermelha), em histidina 5 mM pH 7,4 (linha azul) em
histidina 5 mM pH 5,5 (linha verde). (B) Espectro de MCD da porfirina nas mesmas condições, em tampão
fosfato (linha preta), em histidina pH 9,1 (linha vermelha), pH 7,4 (linha azul) e pH 5,5 (linha verde), onde os
insertos mostram detalhes das bandas positivas e negativas do espectro de MCD.
A Figura 46 mostra que o máximo da Soret, bem como da banda Q é
significativamente maior quando a porfirina está presente em meios com histidina em pH
mais próximo ao pKa da cadeia lateral, isto é, nos pHs 5,5 e 7,4. O espectro de MCD também
permite verificar grandes mudanças quando a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP encontra-se
em meio contendo histidina. Ocorre aumento significativo na intensidade do sinal, o que
representa mudanças nos ligantes axiais do ferro porfirínico. O espectro de MCD revela que
o sinal aumenta em mais de 5 vezes quando a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP se encontra
em tampão contendo histidina, além do fato de que a banda positiva passa de 406 para 408 nm
e a banda negativa de 419 para 421 nm.
O espectro de EPR da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP quando em meio contendo
histidina (Figura 47) apresenta intenso sinal da porfirina em g = 6,0 quando em meio
homogêneo, indicativo de porfirina no estado alto spin, pentacoordenada ou hexacoordenada
com ligantes de campo fraco. Na presença de histidina, entretanto, em qualquer dos três pHs
testados, percebe-se o desaparecimento deste sinal. Em histidina pH 9,1 e 7,4 não se percebe
sinal algum do ferro, o que poderia ser interpretado como redução do ferro porfirínico a
Fe(II), que não emite sinal ao EPR. Entretanto, esta hipótese parece não ser verdadeira, uma
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
A
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-45
-30
-15
0
15
30
45
60
390 400 410 420 430
32
36
40
44
48
410 420 430 440
-48
-44
-40
-36
-32
-28
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
B
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.101
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
vez que a adição de oxidantes como o t-BuOOH não promoveu o retorno do sinal de EPR, o
que seria de se esperar se a redução realmente houvesse ocorrido.
Figura 47 – Espectros de EPR a 4K da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato 5,0 mM
pH 7,4 (linha preta) e em tampão histidina 5,0 mM nos pHs 9,1 (linha vermelha), 7,4 (linha azul) e 5,5 (linha
verde).
De forma similar, a adição de DPAA como agente redutor, como demonstrado a
seguir, promove alterações espectrais no UV-vis compatíveis com a redução do ferro
porfirínico, o que não foi observado no espectro UV-vis da porfirina na presença unicamente
da histidina. Esta perda do sinal de EPR, portanto, pode ser atribuído à coordenação do ferro
porfirínico com histidinas, formando possivelmente uma forma da porfirina bis-histidina EPR
silenciosa. Em pH 5,5 percebem-se dois pequenos sinais ao EPR, um representativo do spin
5/2 e outro do spin ½, sugerindo a existência de formas mono-histidina.
Na reação com t-BuOOH, a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP apresenta alterações
espectroscópicas similares quando na presença de solução de histidina em pHs 7,4 e 9,1.
Ocorre red shift da banda Soret de 417 para 419 nm imediatamente após a adição do peróxido,
o que indica formação de Composto II. O retorno de Composto II à forma nativa Fe(III)
ocorre rapidamente, seguido de bleaching da banda Soret (Figura 48).
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.102
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
500 550 600 650 700 750
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
FIGURA 48 – Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão histidina 5 mM pH
9,1 (linha preta) e sob ação de t-BuOOH 1,5 mM imediatamente após sua adição (linha vermelha), após 400
segundos (linha verde) e após 800 segundos (linha azul).
Em meio contendo histidina, o ciclo catalítico observado a partir da reação da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com t-BuOOH ocorre muito mais rapidamente do que em meio
homogêneo sem histidina (Figura 49), demonstrando que a presença dos ligantes axiais do
ferro porfirínico, aqui representados pela histidina, têm papel importante na velocidade com
que o ciclo ocorre. Como na presença de micelas de CTAB, o ciclo catalítico observado na
reação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com t-BuOOH ocorre em escala de
microssegundos. Em CTAB propôs-se que os ligantes meso agiriam retendo prótons,
aumentando a eficiência catalítica. Em meio contendo histidina, esta atua de forma similar,
promovendo também aumento da eficiência catalítica.
A clivagem do tipo homolítica, como a provável para a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP nos diferentes microambientes relatados até aqui, é favorecida na presença de
substituintes doadores de elétrons presentes na metaloporfirina ou em função dos seus ligantes
axiais
(
150
)
.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.103
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
0 200 400 600
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
A
428nm
Normalizado
Tempo (segundos)
Figura 49 – Gráfico comparativo da velocidade de retorno do Composto II à forma nativa Fe(III) da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP sob ação de t-BuOOH 1,5 mM acompanhada em absorbância de 428 nm. Porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão histidina 5mM pH 7,4 (linha vermelha) e em tampão fosfato 5 mM
pH 7,4 (linha preta).
O espectro de EPR não revelou alterações quando da reação entre a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e o t-BuOOH em meio contendo histidina (Figura 50), exceto o
surgimento de sinal indicativo da geração de radical peroxil e conseqüente aumento do sinal
de porfirina degradada, condizentes com o bleaching da banda Soret observado no espectro
no UV-vis.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.104
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-5,0
-4,5
-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
Figura 50 – Espectros de EPR obtidos a 4K da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato 5,0
mM pH 7,4 (linha azul clara) e em tampão histidina 5,0 mM pHs 7,4 (linha preta) e sob ação de t-BuOOH 1,5
mM no momento da adição (linha vermelha), após 1 minuto (linha azul) e após 4 minutos de reação (linha
magenta).
Quando a reação com t-BuOOH ocorre sobre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em
meio contendo histidina 5,0 mM pH 5,5 os resultados observados no UV-vis são bastante
distintos daqueles observados em pHs 7,4 e 9,1 (Figura 51). Ocorre red shift da banda Soret
de 417 para 424 nm e o mesmo se mantém mesmo após 8000 segundos de reação. Não há
retorno do Composto II à forma nativa Fe(III). Em pH 5,5 é possível que a histidina se
mantenha protonada, impedindo a circulação de prótons necessária ao retorno do Composto II
à sua forma nativa Fe(III). Além disso, a possível existência de formas mono-histidina devem
comprometer a ocorrência do ciclo catalítico.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.105
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 51 – Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão histidina 5 mM pH
5,5 (linha preta) e sob ação de t-BuOOH 1,5mM após 1000 segundos (linha vermelha), após 3000 segundos
(linha azul) e após 8000 segundos (linha magenta).
Sob a ação de DPAA, a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, tanto em histidina pH 7,4
quanto em pH 9,1 apresenta mudanças espectrais no espectro UV-vis similares às observadas
quando a porfirina foi submetida à ação do DPAA em meio homogêneo e condizentes com a
redução do ferro porfirínico. Nas três condições, isto é, em meio homogêneo sem histidina e
em meio contendo histidina nos pHs 7,4 e 9,1, a adição de DPAA promove red shift da Soret
de 6 nm em relação ao máximo desta banda em cada situação prévia à adição do aldeído.
Em meio homogêneo sem histidina, a ação do DPAA sobre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP levou a desvio da Soret de 412 para 418 nm, enquanto que em meio contendo
histidina o desvio foi de 417 para 425 nm. Na região das bandas Q foi observado blue shift,
passando a banda de 548 para 540 nm e com aumento de intensidade do pico máximo (Figura
52).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.106
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 52 – Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão histidina 5 mM pH
9,1 (linha preta) e sob ação de DPAA 100 M após 250 segundos (linha vermelha), após 1200 segundos (linha
azul) e após 3200 segundos (linha magenta).
O que se observa a partir dos resultados obtidos é que a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, quando colocada em meio homogêneo contendo histidina, apresenta alterações
espectroscópicas no UV-vis, MCD e EPR altamente sugestivas de alteração de seu estado de
alto para baixo spin, condizente com a mudança de uma forma pentacoordenada ou
hexacoordenada com ligantes de campo fraco para uma forma hexacoordenada com ligantes
de campo forte. A distorção do anel porfirínico é comum em hemoproteínas em função das
diferentes interações estéricas do heme com o microambiente hidrofóbico fornecido pela
cadeia proteica, sendo o mesmo fenômeno possível quando a porfirina se encontra na
presença de diferentes ligantes axiais e grupos meso. Especificamente com relação à histidina,
complexos bis-histidina representam um sistema baixo spin, enquanto que a perda de ao
menos um destes ligantes promove blue shift e conversão para uma forma alto spin
(
151
)
.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.107
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
4.2 Características espectroscópicas, estados de spin e atividade catalítica
de porfirinas em ambientes protéicos
Para o estudo deste sistema, foram selecionados o apocitocromo c e a apomigolobina,
respectivamente formas de citocromo c e mioglobina do qual o grupo heme foi extraído, como
modelos para o estudo das características espectroscópicas, estados de spin e atividade
catalítica da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da protoporfirina IX em microambientes
protéicos.
4.2.1 Características espectroscópicas e atividade catalítica dos complexos não-
covalentes porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c e protoporfirina
IX/apocitocromo c
In vitro, foi possível perceber que a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP apresenta alta
eficiência na associação e na indução do folding do apocitocromo c ao redor de sua estrutura,
o que foi demonstrado por espectroscopia no UV-vis, CD, MCD e EPR e os resultados
comparados aos obtidos quando empregadas condições semelhantes onde a incorporação foi
realizada utilizando-se uma porfirina biológica, a protoporfirina IX.
As mudanças espectrais que ocorreram, mostradas na Figura 53B, são indicativas da
formação de um complexo não-covalente entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e o
apocitocromo c, conforme descrito na literatura
(99)
. Estas alterações ocorreram rapidamente,
de forma espontânea e à temperatura ambiente (25±3º.C). Ocorre red shift da Soret de 412
para 421 nm e alterações também na região das bandas Q, com pico de absorbância passando
de 578 para 556 nm.
Por sua vez, conforme Figura 53A, a incorporação da protoporfirina IX na estrutura
proteica fornecida pelo apocitocromo c promove o surgimento de banda Soret bastante larga
no espectro no UV-vis, com pico em 395 nm, e desaparecimento da banda de transferência de
carga em 650 nm, mudanças compatíveis com a formação do complexo não-covalente
protoporfirina IX/apocitocromo c
(
152
)
e conseqüente formação de uma estrutura terciária pela
cadeia proteica do citocromo c pouco compactada, diferentemente do que ocorre quando a
incorporação se dá com a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP. Aqui se tem o surgimento de
uma banda mais estreita, cujo red shift é de 9 nm em relação à Soret da porfirina em ambiente
homogêneo, compatível com uma estrutura terciária mais compactada.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.108
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
C
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 53 – (A) Espectro no UV-vis da incorporação da protoporfirina IX 4 M em quantidade equimolar de
apocitocromo c, onde protoporfirina IX (linha preta), apocitocromo c (linha azul) e complexo formado (linha
verde). No inserto da figura (A) detalhes do desvio da banda Soret quando da formação do complexo
protoporfirina IX/apocitocromo c. (B) Espectro no UV-vis da incorporação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
100 M em quantidade equimolar de apocitocromo c em tampão fosfato 5 mM pH 7,4, sendo apocitocromo c 80
M (linha azul), porfirina (linha preta) e complexo formado (linha vermelha). No inserto da figura (B) detalhes
do desvio da banda Soret quando da formação do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c. (C)
Diferenças espectrais entre os complexos não-covalentes formados entre o apocitocromo c e a Protoporfirina IX
na sua forma Fe(III)(linha verde) e a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP (linha vermelha).
Em ambos os complexos não-covalentes, protoporfirina IX/apocitocromo c e porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c, ocorre aumento significativo da turbidez e formação
de precipitado, o que sugere a formação de agregados derivados de uma possível estrutura
polimérica.
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
300 350 400 450
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
A
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
350 400 450 500
0,2
0,4
0,6
0,8
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
B
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.109
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
No citocromo c nativo o grupo heme está ligado à cadeia polipeptídica por ligações
covalentes com os resíduos de cisteína 14 e 17, de modo que a retirada deste grupo prostético
para a obtenção do apocitocromo c resulta em que as cadeias laterais destes resíduos de
aminoácidos permanecem na forma SH, porém por pouco tempo. Rapidamente este grupo
pode ser oxidado, passando à forma S
∙
e assim formar ponte dissulfeto com outro resíduo que
também tenha sido oxidado. Tal ligação torna indisponíveis os resíduos de cisteína para
coordenação quando inserido novo grupo heme, seja este a protoporfirina IX e provavelmente
também sendo a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP o grupo prostético presente
(
153
)
. A
formação do complexo não-covalente protoporfirina IX/apocitocromo c é favorecida pela
adição ao meio de butilhidroxitolueno (BHT) seguida de incubação por 5 minutos a 37ºC, o
que sugere que uma cisteína ionizada possa ser o sexto ligante do ferro hemínico. A adição de
BHT na formação do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c não foi necessária.
Estudos anteriores demonstram que a incorporação do grupo heme, especificamente da
Protoporfirina IX, no apocitocromo c é pH dependente. Quando da incorporação da
protoporfirina IX ao apocitocromo c, demonstrou-se que em pH inferior a 4,0 a formação do
complexo não ocorre. Entre pHs 4,0 e 5,5 se a incorporação for realizada utilizando-se a
protoporfirina IX em sua forma reduzida Fe(II), ocorre a formação do complexo e existem
nestas condições aumento da intensidade da banda Soret, perda da banda de transferência de
carga e não aparecem as bandas Q, e , indicando que o ferro hemínico está
pentacoordenado e portanto a porfirina na sua forma alto spin. Em pHs acima de 5,5 as
bandas Q aparecem, indicando a ocorrência da sexta coordenação do ferro hemínico à cadeia
proteica, sendo que elevações do pH até 10,5 ainda promovem aumento da intensidade da
banda Soret e das bandas Q. Acima deste valor as alterações espectrais não são mais
significativas.
A formação do complexo não-covalente entre a porfirina e a apoproteína pode ser
também detectada por espectroscopia de fluorescência, uma vez que o enovelamento da
proteína ao redor do grupo prostético faz com que ocorra supressão da fluorescência do Trp
59 por transferência de energia do tipo Forster. Tal condição foi analisada para o complexo
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c (Figura 54).
A porfirina isoladamente, assim como o citocromo c nativo, foram utilizados como
controle. Algumas porfirinas exibem naturalmente certo grau de fluorescência, mesmo que de
pouca intensidade
(
154
)
, o que não foi observado para a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP. O
citocromo c nativo também não apresentou fluorescência do triptofano após excitação em 292
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.110
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
nm, diferentemente do apocitocromo c, que sem a presença do ferro, apresentou fluorescência
intensa após excitação neste mesmo comprimento de onda. Na forma de complexo não
covalente Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c existe diminuição da intensidade desta
fluorescência, entretanto não ocorre supressão completa, como ocorreria na forma de
complexo covalente totalmente enovelado como a forma nativa do citocromo c.
300 325 350 375 400 425
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Intensidade
Comprimento de onda (nm)
Figura 54 – Espectro de fluorescência da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em tampão fosfato de sódio 5 mM
pH 7,4 (linha preta), do apocitocromo c (linha azul), e do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c (linha vermelha) e do citocromo c Fe(III) também em tampão fosfato de sódio (linha
verde). Excitação em 292 nm.
No citocromo c, assim como em outras hemoproteínas, existe inibição da
fluorescência característica do Triptofano 59 (Trp59) pelo ferro hemínico, dada a proximidade
de ambos em função da estrutura compactada apresentada pela forma nativa da proteína. Em
situações em que essa estrutura sofre modificações e o conseqüente afastamento do ferro do
Trp59 aumenta a intensidade da fluorescência, como ocorre, por exemplo, na presença de
SDS em concentrações que favorecem a troca do sexto ligante do ferro hemínico
(
155
)
. A
supressão da fluorescência da apohemoproteína se dá por transferência de energia do tipo
Forster, sendo que o grau de supressão depende da distância assumida entre o grupo heme e o
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.111
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
triptofano, tendo tal fenômeno aplicação no estudo da interação de apoproteínas com
diferentes classes de porfirinas
(
156
)
.
No caso do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c
pode-se notar, conforme demonstrado na Figura 54, que a fluorescência do apocitocromo c
livre é superior à detectada para o complexo porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo
c, onde o ferro incorporado à estrutura proteica passa a inibir da fluorescência. Isto corrobora
as alterações observadas na espectroscopia no UV-vis e o enovelamento da cadeia proteica
que, mesmo se não estruturalmente tão compactada quanto no citocromo c, é compactada o
suficiente para promover transferência de energia entre o ferro porfirínico e o triptofano e
assim suprimir a fluorescência deste.
O espectro de MCD indica mudanças significativas quando da formação do complexo
não-covalente entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e o apocitocromo c. Ocorre aumento
significativo na intensidade do sinal e o pico da banda positiva passa de 405 quando em
tampão fosfato para 410 nm quando a porfirina está inserida no apocitocromo c, enquanto a
banda negativa passa de 419 para 425 nm nas mesmas condições (Figura 55A). Os espectros
de CD e MCD na região de 400 nm são dependentes da conformação do grupo heme e
providenciam um indicador sensível de pequenas mudanças conformacionais na proteína
(
157
)
.
O complexo protoporfirina IX/apocitocromo c apresenta um sinal de MCD muito
menos intenso do que o observado para o complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c,
ocorrendo inclusive uma redução na intensidade do sinal inclusive em comparação ao da
porfirina IX livre. No complexo protoporfirina IX/apocitocromo c a banda positiva passa de
393 para 404 nm, representando um desvio de 5 nm, similar ao apresentado pelo complexo
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c. Já a banda negativa passa de 415 para 419 nm
(Figura 55B). Neste complexo, a baixa intensidade da banda negativa é sugestiva de que o
complexo protoporfirina IX/apocitocromo c encontra-se pentacoordenado e, portanto, na
forma alto-spin.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.112
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 55 – (A) MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100M incorporada em apocitocromo c 100M em
tampão fosfato 5mM pH 7,4. Porfirina (linha preta), apocitocromo (linha azul), forma incorporada (linha
vermelha). (B) - MCD da Protoporfirina IX 100 M incorporada em Apocitocromo c de mesma concentração,
sendo a porfirina (linha preta), o apocitocromo c (linha azul) e a forma incorporada (linha verde).
O espectro de EPR demonstra que o complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/ apocitocromo
c apresenta a porfirina em sua forma baixo spin (Figura 56A), contrário ao que ocorre com o
complexo protoporfirina IX/apocitocromo c (Figura 56B), que permanece na forma alto spin,
pentacoordenada. Tal fato é corroborado, em ambos os complexos, pelos resultados obtidos
no espectro de MCD.
300 350 400 450 500 550
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
A
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
300 350 400 450 500 550
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
B
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.113
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 56 – (A) Espectros de EPR a 4K da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em tampão fosfato 5,0
mM pH 7.4 (linha preta) e quando incorporada ao apocitocromo c 100 M (linha vermelha), ainda em solução
contendo o mesmo tampão. (B) Espectro de EPR 4ºK do complexo protoporfirina IX/apocitocromo c (linha
verde).
Contrário ao que ocorre com o citocromo c, o complexo não-covalente porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c não apresenta indícios pela espectroscopia no UV-
vis de atividade oxidásica e peroxidásica mediante adição de t-BuOOH e DPAA. Estes
resultados sugerem que o complexo formado não exibe um ligante lábil no ferro porfirínico
para que a sexta posição de coordenação esteja acessível à coordenação com o substrato e
consequentemente permita a ação do mesmo. Entretanto, face aos resultados obtidos quando a
porfirina estava em meio heterogêneo de micelas catiônicas de CTAB, não é possível
descartar que tenha ocorrido um ciclo catalítico tão rápido que não tenha sido possível
detectá-lo pelos métodos espectroscópicos nem tampouco por EPR, como será demonstrado
na sequência.
O complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c na
presença de t-BuOOH não apresenta alterações espectroscópicas no UV-vis (Figura 57). Não
há indícios da ocorrência de ciclo catalítico. Ocorre pequeno bleaching da banda Soret e
discreta turvação do meio com formação de precipitado durante a reação, sugestivo da
formação de polímeros dado o pequeno grau de estruturação do complexo.
100 200 300 400
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
B
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
A
Intensidade (a.u.)
Campo magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.114
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
500 550 600 650 700 750
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 57 - Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M incorporada ao apocitocromo c
100 M em tampão fosfato 5 mM pH 7,4 sob ação de t-BuOOH 1,5 mM. Complexo porfirina/apocitocromo c
(linha preta), complexo sob ação de t-BuOOH 1,5 mM após 500 segundos (linha vermelha) e após 2500
segundos (linha azul).
O espectro obtido por EPR também não demonstra quaisquer alterações quando da
adição de t-BuOOH ao complexo formado entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e o
apocitocromo c. Não são observadas alterações no estado de oxidação, alterações de estado
spin ou mesmo a formação de radicais livres. Não se observa ocorrência de ciclo catalítico e a
porfirina complexada ao apocitocromo c apresenta características compatíveis com a
manutenção de sua hexacoordenação (Figura 58).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.115
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
50 100 150 200 250 300 350 400 450
-1,2
-0,8
-0,4
0,0
0,4
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
Figura 58 – Espectros de EPR a 4K da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em apocitocromo c preparado
em tampão fosfato 5,0 mM pH 7.4 sob ação de t-BuOOH 25 mM. Complexo não-covalente porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c sem t-BuOOH (linha preta), imediatamente após adição do peróxido
(linha vermelha), após 1 minuto (linha verde) e após 6 minutos (linha azul).
O mesmo ocorre para o complexo não-covalente protoporfirina IX/apocitocromo c,
apesar de que nesta condição onde o pH foi mantido em 7,4 o ferro hemínico apresenta-se
pentacoordenado e no estado de alto spin (Figura não mostrada). Este complexo, entretanto,
conforme previamente caracterizado, apresenta reatividade quando a ele é adicionado
peróxido de hidrogênio, onde são observadas mudanças espectrais no UV-vis sugestivas da
conversão para composto II com fechamento de um ciclo catalítico como o das peroxidases
quando da adição de DPAA
(140)
.
A adição de DPAA ao complexo não-covalente porfirina FeTDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c também não promoveu alterações espectrais significativas. A adição
do aldeído a este complexo promove um discreto bleaching e não são observados sinais de
redução do ferro hemínico ou formação de derivados aldeídicos (Figura 59).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.116
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
500 550 600 650 700 750
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 59 – Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M incorporada ao apocitocromo c
100 M em tampão fosfato 5 mM pH 7,4 sob ação do DPAA 100 M. Complexo porfirina/apocitocromo c
(linha preta), complexo sob ação do DPAA após 300 segundos (linha vermelha) e após 2500 segundos (linha
azul).
Tal resultado é similar ao que ocorre para o complexo não-covalente protoporfirina
IX/apocitocromo c, que também não exibe reatividade quando da adição de DPAA (Figura
não mostrada). Trabalhos anteriores referem que neste tipo de complexo não deve ocorrer
stacking dos anéis aromáticos, de forma que não se torna efetivo o poder redutor do DPAA.
No complexo não-covalente protoporfirina IX/apocitocromo c o impedimento do stacking
entre os anéis aromáticos dos resíduos de tirosina e dos grupos fenil do DPAA deve ser
decorrente do fato de que o heme apresenta-se pentacoordenado e com uma estrutura menos
compactada que no citocromo c.
Apesar do fato de que no complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c o grupo heme se encontra hexacoordenado e baixo spin,
possivelmente o arranjo estrutural da proteína também gere impedimentos para a ocorrência
do stacking entre estes anéis aromáticos e consequentemente não seja favorável a ação do
DPAA sobre o ferro hemínico.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.117
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
4.2.2 Investigação dos possíveis ligantes do ferro porfirínico em complexos não-
covalentes porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c e protoporfirina
IX/apocitocromo c utilizando formas mutantes de citocromo c.
Visando investigar os ligantes axiais do ferro porfirínico quando da formação de
complexos não-covalentes porfirina não-biológica Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c e
protoporfirina IX/apocitocromo c, foram empregadas formas mutantes de citocromo c a partir
da expressão do gene para esta hemoproteína inserido no plasmídio PJRhrsN2 e expressa a
proteína com substituições pontuais obtidas por mutação sítio-dirigida em resíduos
selecionados de aminoácidos. A partir da obtenção da proteína recombinante, foi preparado o
apocitocromo c pelo processo descrito anteriormente.
Foram obtidos por mutagênese sítio-específica dois plasmídios, ambos com mutações
adicionais às substituições já presentes no próprio PJRhrsN2, isto é, com a substituição do
aminoácido de interesse além das substituições das histidinas 26 e 33 pela aspargina
previamente inseridas no próprio plasmídio. Um dos plasmídios é, portanto
C14A/H26N/H33N e outro C17A/H26N/H33N, enquanto o PJRhrsN2 é H26N/H33N.
A Figura 60 representa o posicionamento dos aminoácidos substituídos nos três
plasmídios citados.
Figura 60 – Representação da estrutura
terciária do citocromo c de coração de
cavalo com destaque para a posição do
resíduos de cisteína 14, cisteína 17,
histidina 26 e histidina 33. (Fonte:
www.pubmed.com)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.118
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Foram realizados os procedimentos para mutação sítio-dirigida guiada por
oligonucleotídeos tendo como molde o plasmídio PJRhrsN2 visando a obtenção das formas
C14A/H26N/H33N e C17A/H26N/H33N. Cumpridas as etapas para mutação sítio-dirigida,
procedeu-se ao cultivo em placa de meio sólido LB Ágar contendo ampicilina e a partir do
crescimento de colônias bacterianas transformadas pelos plasmídios mutados, foram
selecionadas colônias para isolamento e eletroforese do DNA plasmidial, sendo que os
resultados obtidos a partir de imagem dos géis de eletroforese estão apresentados na Figura
61.
Figura 61 – (A) Eletroforese em gel de agarose, revelada por marcação por brometo de etídio e imagem
capturada por sistema Kodak, dos plasmídios obtida a partir de diferentes colônias bacterianas transformadas
contendo gene para expressão de citocromo c com as mutações C14A/H26N/H33N (A) e com as mutações
C17A/H26N/H33N (B).
As colônias selecionadas, foram então submetidas a sequenciamento para seleção dos
plasmídios contendo unicamente as mutações desejadas. Dentre as colônias selecionadas,
algumas apresentaram inserções, deleções e substituições em outros resíduos que não os de
interesse, identificadas pelo seqüenciamento, sendo que estas foram descartadas. As Figura 62
e 63 apresentam os resultados do seqüenciamento das colônias que foram selecionadas para
prosseguimento da transformação em vetores de expressão por apresentarem unicamente as
mutações desejadas.
A
B
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.119
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 62 – Seqüenciamento por método de Sanger e análise através do software BioEdit do plasmídio contendo
gene para expressão de citocromo c C14A/H26N/H33N. Destacada a sequência que foi substituída.
Figura 63 – Seqüenciamento por método de Sanger e análise através do software BioEdit do plasmídio contendo
gene para expressão de citocromo c C17A/H26N/H33N. Destacada a sequência que foi substituída.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.120
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Foram realizados seqüenciamentos em paralelo utilizando diretamente o plasmídio
PJRhrsN2 visando a confirmação de que este realmente possuía substituições apenas nas
Histidinas 26 e 33. Além destes, a própria análise dos seqüenciamentos das formas
C14A/H26N/H33N e C17A/H26N/H33N confirmou este fato, conforme demonstrado na
Tabela 1.
Tabela 1 – Tabela comparativa da sequência de aminoácidos presentes no citocromo c de coração de
cavalo (citc cavalo), no plasmídio PJRhrsN2 (citocromo c H26N/H33N, dito pwt) e nos mutantes
C14A/H26N/H33N e C17A/H26N/H33N.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Citc cavalo
G
D
V
E
K
G
K
K
I
F
V
Q
K
C
A
Q
C
H
T
V
E
K
G
G
K
H
K
PJRhrsN2
G
D
V
E
K
G
K
K
I
F
V
Q
K
C
A
Q
C
H
T
V
E
K
G
G
K
N
K
C14A/H26N/H33N
G
D
V
E
K
G
K
K
I
F
V
Q
K
A
A
Q
C
H
T
V
E
K
G
G
K
N
K
C17A/H26N/H33N
G
D
V
E
K
G
K
K
I
F
V
Q
K
C
A
Q
A
H
T
V
E
K
G
G
K
N
K
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
Citc cavalo
T
G
P
N
L
H
G
L
F
G
R
K
T
G
Q
A
P
G
F
T
Y
T
D
A
N
K
N
PJRhrsN2
T
G
P
N
L
N
G
L
F
G
R
K
T
G
Q
A
P
G
F
T
Y
T
D
A
N
K
N
C14A/H26N/H33N
T
G
P
N
L
N
G
L
F
G
R
K
T
G
Q
A
P
G
F
T
Y
T
D
A
N
K
N
C17A/H26N/H33N
T
G
P
N
L
N
G
L
F
G
R
K
T
G
Q
A
P
G
F
T
Y
T
D
A
N
K
N
55
56
57
56
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
Citc cavalo
K
G
I
T
W
K
E
E
T
L
M
E
Y
L
E
N
P
K
K
Y
I
P
G
T
K
M
I
PJRhrsN2
K
G
I
T
W
K
E
E
T
L
M
E
Y
L
E
N
P
K
K
Y
I
P
G
T
K
M
I
C14A/H26N/H33N
K
G
I
T
W
K
E
E
T
L
M
E
Y
L
E
N
P
K
K
K
I
P
G
T
K
M
I
C17A/H26N/H33N
K
G
I
T
W
K
E
E
T
L
M
E
Y
L
E
N
P
K
K
K
I
P
G
T
K
M
I
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
Citc cavalo
F
A
G
I
K
K
K
T
E
R
E
D
L
I
A
Y
L
K
K
A
T
N
E
PJRhrsN2
F
A
G
I
K
K
K
T
E
R
E
D
L
I
A
Y
L
K
K
A
T
N
E
C14A/H26N/H33N
F
A
G
I
K
K
K
T
E
R
E
D
L
I
A
Y
L
K
K
A
T
N
E
C17A/H26N/H33N
F
A
G
I
K
K
K
T
E
R
E
D
L
I
A
Y
L
K
K
A
T
N
E
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.121
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
A partir da seleção dos plasmídios contendo as mutações desejadas, procedeu-se à
transformação em cepas de Escherichia coli BL21 Star, escolhidas como vetores de expressão
do citocromo c recombinante. Para tanto foram empregados os plasmídios
C14A/H26N/H33N, C17A/H26N/H33N e o PJRhrsN2 (H26N/H33N). Os cultivos em LB
Ágar com ampicilina apresentaram crescimento de colônias bacterianas contendo os
plasmídios mutados, tendo-se a partir de cada uma das formas recombinantes realizado pré-
inóculos em LB Broth seguidos de cultivo em meio Terrific.
A expressão destes plasmídios, entretanto, não foi totalmente satisfatória. Feita a
transformação em cepas de Escherichia coli BL21Star e a expressão de cada um dos
mutantes, obteve-se quantidade muito pequena de citocromo c C14A/H26N/H33N e uma
ainda menor de citocromo c C17A, ambos contendo grande quantidade de proteínas
inespecíficas que não puderam ser separadas por cromatografia de troca iônica. Somente o
citocromo c obtido da expressão direta do plasmídio PJRhrsN2, isto é, a forma H26N/H33N
correspondeu ao rendimento esperado.
Visando confirmar a presença de citocromo c em cada um dos cultivos de expressão,
isto é, das formas C14A/H26N/H33N, C17A/H26N/H33N e H26N/H33N, procedeu-se à
eletroforese em gel de poliacrilamida seguida de técnica de Western-Blot. Para a realização
do Western-Blot, foram utilizadas amostras retiradas do cultivo em Terrific após indução de
expressão com IPTG e incubação total por 72 horas. As amostras foram sonicadas para
rompimento das células e submetidas à dosagem de proteínas pelo método de Bradford para
padronização da concentração a ser aplicada para a eletroforese em gel de poliacrilamida.
Depois de realizada a eletroforese, procedeu-se à realização do Western-blot mediante reação
com anticorpo anti-citocromo c. Os resultados são os apresentados na Figura 64.
Figura 64 – Western-blot dos produtos da expressão de plasmídios contendo mutações sítio-específicas no gene
do citocromo c de coração de cavalo na presença de anticorpo anti-citocromo c. (A) Citocromo c
C14A/H26N/H33N, (B) Citocromo c C17A/H26N/H33N, (C) Citocromo c H26N/H33N e (D) Citocromo c de
coração de cavalo (Sigma-Aldrich). Revelação utilizando-se sistema West Fento da Thermo Scientific.
Dentre as mutações possíveis, especificamente as formas com substituição nas
cisteínas 14 e 17 são particularmente interessantes no estudo da formação do complexo não-
A
B
C
D
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.122
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
covalente porfirina/apocitocromo c em função de seu papel como ligante do ferro hemínico na
forma nativa do citocromo c e de sua fundamental importância na estruturação do mesmo,
conforme referido anteriormente na introdução deste trabalho. O resultado da expressão das
formas mutantes em ambas as cisteínas, entretanto, não foi satisfatório.
Como não há qualquer impedimento à expressão dos plasmídios, cujas mutações
foram devidamente confirmadas pelo seqüenciamento de DNA e o crescimento bacteriano foi
satisfatório, o que se pode inferir é que o insucesso na expressão de citocromo c com mutação
nas cisteínas 14 e 17 se deve ao importante papel que estes resíduos de aminoácidos exercem
na estruturação desta proteína. A substituição de cada um deles possivelmente resultou em
dificuldades na integração do grupo heme pela heme-liase ou a uma instabilidade na ligação
que acabou por levar à degradação da proteína. Reforço a este fato é que a expressão do
plasmídio PJRhrsN2 (H26N/H33N) e de outras formas mutantes que foram construídas no
mesmo momento para atender a outros projetos, porém com substituições em aminoácidos
não ligados diretamente à coordenação com o ferro hemínico, ocorreu de maneira satisfatória
e com um rendimento bastante adequado. Além disto, outros trabalhos que se utilizaram do
mesmo plasmídio submetido a mutações sítio-dirigidas, com substituição das tirosinas 48, 67,
74 e 97 por fenilalanina, resultaram em expressão de proteína mutante
(
158
)
.
A expressão do gene contido no plasmídio mutante C14A/H26N/H33N foi confirmada
pela presença de citocromo c, detectado pelo Western-blot, entretanto a quantidade de
proteína obtida foi muito pequena e insuficiente para o preparo de apocitocromo c. Nesta
condição, tendo sido mantida a cisteína 17, pode-se pressupor que este resíduo tenha
permitido a estabilidade de parte da proteína expressa e portando esta detectada pelo anticorpo
anti-citocromo c. Já a expressão do gene contido no plasmídio mutante C17A/H26N/H33N
apresentou resultado negativo para citocromo c pelo Western-blot, indicando que a
substituição da cisteína 17 pela alanina foi ainda mais comprometedora para a estruturação do
citocromo c do que a substituição da cisteína 14, mesmo este último estando presente nesta
forma modificada. Em ambos os casos, foram realizadas novas tentativas de expressão
alterando-se tempo de incubação, temperatura, velocidade de agitação, quantidade de IPTG e
ainda assim a expressão não foi satisfatória. Em um primeiro momento o meio de cultivo
começa a apresentar uma tonalidade avermelhada característica da expressão do citocromo c,
entretanto, no decorrer da incubação esta tonalidade vai sendo alterada para uma cor
esverdeada, que pode representar a desestruturação da proteína expressa ou mesmo a
formação de compostos originários da degradação do grupo heme, como a bilirrubina. Tal
fato, entretanto, permanece para ser investigado futuramente.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.123
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Face às dificuldades na expressão destas duas formas mutantes de citocromo c,
C14A/H26N/H33N e C17A/H26N/H33N, tomou-se como novo objetivo testar unicamente a
forma mutante proveniente da expressão do próprio plasmídio, isto é, utilizando-se
diretamente o citocromo c pwt (H26N/H33N), dada a grande possibilidade dos ligantes axiais
do ferro hemínico na formação do complexo não-covalente porfirina/apoproteína serem
justamente histidinas.
O rendimento da expressão do plasmídio PJRhrsN2 contendo o gene para citocromo c
associado ao gene da heme-liase e as demais modificações inseridas por ele conforme referido
anteriormente foi bastante satisfatório. Foi possível em uma das expressões, utilizando-se
meio Terrific e IPTG como agente indutor da expressão, obter 12 mg de proteína, quantidade
suficiente para preparo de apocitocromo c pwt seguindo a técnica de Goldberg detalhada
anteriormente.
Figura 65 – (A) Coluna cromatográfica de troca iônica (resina CM32 Whatman) com banda de retenção do
citocromo c mutado nas histidinas 28 e 33 (H26N/H33) durante processo de purificação. (B) Aspecto da solução
obtida após liberação do citocromo c retido na coluna por adição de NaCl 250 mM em tampão fosfato de
potássio 25 mM pH 7,5 (à direita) comparada com solução de NaCl sem citocromo (à esquerda). (C) Espectro de
absorção no UV-vis do citocromo c H26N/H33N liberado da coluna cromatográfica (linha vermelha) comparado
ao citocromo c de coração de cavalo, de origem comercial, reduzido com ditionito de sódio (linha preta).
A Figura 65 traz imagens obtidas da expressão e purificação do citocromo c pwt
(H26N/H33N). O espectro UV-vis obtido indica a presença de citocromo c reduzido
compatível com proteína com alto grau de pureza, uma vez que a relação entre as
absorbâncias a Abs
410nm
/Abs
280nm
foi maior superior a 3,2.
Pode-se dizer que a quantidade de citocromo c endógeno, isto é, citocromo c
produzido a partir do DNA bacteriano original e não pelo plasmídio inserido, é insignificante,
pois, como será demonstrado mais adiante, se este fosse presente em quantidade significativa
resultaria em sinal de EPR, diferentemente da forma mutante, que não apresenta sinal, o que
não ocorreu. Futuramente estarão sendo realizados experimentos por espectro de massa para
A
B
300 350 400 450 500
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
550 600 650 700 750
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
C
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.124
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
verificação do percentual de citocromo c endógeno em relação ao citocromo c obtido por
expressão dos plasmídios mutantes.
A partir do citocromo c obtido pela expressão do plasmídio PJRhrsN2, foi preparado o
apocitocromo c pwt (H26N/H33N) seguindo a técnica descrita anteriormente.
Da mesma forma que para o apocitocromo c obtido da forma nativa comercial de
citocromo c, a incorporação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP ocorreu de forma
espontânea, imediata e à temperatura ambiente (25 ± 3ºC). O espectro no UV-vis do
complexo não-covalente porfirina FeTDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt apresenta
características similares ao que foi observado quando da incorporação da porfirina em
apocitocromo c obtido de proteína nativa, sem mutações, havendo entretanto um menor
desvio da banda Soret No complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt ocorre red
shift da Soret, que passa de 412 para 419 nm e na região das bandas Q tem-se blue shift de
578 para 556 nm (Figura 66A).
Figura 66 – (A) Espectro UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100M em quantidade equimolar de
apocitocromo c preparado a partir de citocromo c com substituição das His 26 e 33 por Asparagina
(apocitocromo c pwt) solubilizado em tampão fosfato de sódio 5mM pH 7,4. Porfirina em tampão fosfato de
sódio 5 mM pH 7,4 (linha preta) e forma incorporada (linha azul). (B) Espectro UV-vis da protoporfirina IX em
tampão fosfato de sódio 5mM pH 7,4 (linha preta) e na presença de apocitocromo c pwt.
A incorporação da protoporfirina IX no apocitocromo c pwt, entretanto, parece não ter
ocorrido, uma vez que a banda Soret permanece em 390 nm, não ocorrendo o red shift
esperado da banda Soret para 395 nm, como característico da formação do complexo não-
covalente protoporfirina IX/apocitocromo c. Mesmo após incubação prolongada e sob
aquecimento, não ocorreram quaisquer alterações espectrais (Figura 66B). Apesar do
complexo formado entre a protoporfirina IX e o apocitocromo c nativo demonstrar baixo grau
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
500 550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
A
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
550 600 650 700 750
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
B
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.125
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
de estruturação e indícios de que a porfirina se mantém pentacoordenada, pode-se supor que a
ausência das histidinas também tenha papel na estruturação deste complexo.
Quando da formação do complexo não-covalente Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c nativo, foi observado um red shift da Soret da ordem de 9 nm em
relação à mesma banda da porfirina livre, alterando-se os valores do máximo de 412 para
421 nm. Já na incorporação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em apocitocromo c pwt o
red shift da Soret foi ligeiramente menor, da ordem de 7 nm, passando a banda Soret de 412
para 419 nm. Há também diferenças no máximo da banda Soret em cada uma destas
condições bem como na região das bandas Q. No complexo não-covalente porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt a banda Q de maior intensidade passa de 578
para 566 nm. Apesar do desvio ser o mesmo em relação à porfirina em tampão fosfato, a
banda Q quando o complexo não-covalente é formado entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e o apocitocromo c nativo é bem mais intensa e definida do que quando o complexo
não-covalente se dá com o apocitocromo c pwt (Figura 67).
250 300 350 400 450 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
500 550 600 650 700 750
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 67 – Espectro no UV-vis do complexo formado entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100M em
quantidade equimolar de apocitocromo c preparado a partir de citocromo c H26N/H33N preparado em tampão
fosfato de sódio 5mM pH 7,4 (linha azul) em comparação ao complexo formado entre a mesma porfirina e
quantidade equimolar de apocitocromo c obtido da porfirina nativa (linha vermelha). Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP livre em tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 (linha preta).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.126
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Estas diferenças demonstram que no complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo
c nativo a porfirina se encontra em um ambiente mais hidrofóbico do que no complexo
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt, o que pode ser devido ao menor grau de
estruturação do complexo neste último sistema. Como o que muda de uma condição para a
outra é a ausência das histidinas no apocitocromo c pwt, é possível supor que estes tenham um
papel importante na formação do complexo não-covalente, mais especificamente como
ligantes do ferro porfirínico.
De maneira similar ao que ocorreu quando se comparam as alterações espectrais no
UV-vis entre os complexos não-covalentes porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c
e protoporfirina IX/apocitocromo c, a observação de uma banda mais estreita, de maior
intensidade, quando da formação de complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt também indica um nível de compactação superior ao ocorrido
quando do complexo com a protoporfirina IX, entretanto, dadas as diferenças entre os
complexos formados entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e os apocitocromo c nativo e
mutante, pode-se inferir que o nível de compactação neste último seja um pouco menor do
que no complexo onde as histidinas estão presentes como potenciais ligantes do ferro
porfirínico.
Conforme apresentado na Figura 68 o complexo porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c nativo apresenta sinais de MCD de maior intensidade quando
comparados aos da porfirina complexada com o apocitocromo c pwt, estando as bandas
positiva e negativa respectivamente em 410 e 425 nm. No complexo não-covalente porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt, o sinal é menor, porém superior ao da porfirina
livre, e com bandas positiva e negativa em 403 e 422 nm respectivamente. Estas diferenças
corroboram que a estrutura assumida pelo complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c nativo é mais compactada, mais bem estruturada, do que na presença
de apocitocromo c pwt. O sinal de MCD mais intenso nas bandas positiva e negativa é indício
de que o complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c nativo realmente se encontra
hexacoordenado com ligantes de campo forte, estes representados pela histidina. Já o
complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt possivelmente permanece
pentacoordenado, na forma alto spin.
Tal fato também é corroborado pelas alterações no espectro de MCD obtido para a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em microambiente contendo histidina, onde se apresentava
intenso sinal de MCD quando comparado à porfirina em ambiente homogêneo, esta alto spin,
petacoordenada ou hexacoordenada com ligantes de campo fraco.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.127
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
Figura 68 – Espectro de MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP incorporada em apocitocromo c pwt em
comparação com a porfirina incorporada em citocromo c nativo, ambos em tampão fosfato de sódio 5mM pH
7,4. Porfirina incorporada em apocitocromo c nativo (linha vermelha) e em apocitocromo c mutante (linha azul).
No espectro obtido por EPR também são observadas diferenças significativas entre o
complexo formado entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e as duas formas de
apocitocromo c, nativo e pwt. No complexo não-covalente Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c a porfirina perde o sinal de EPR após sua incorporação à estrutura
proteica (Figura 56A). Já quando o complexo se forma entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e o apocitocromo c pwt, a ausência das histidinas como ligantes potenciais do ferro
hemínico resultou em manutenção do sinal de EPR, confirmando a suposição de que neste
complexo o ferro porfirínico apresenta-se pentacoordenado e no estado alto spin (Figura 70A,
linha preta). Isso corrobora também a suposição de que no complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP
/apocitocromo c nativo deva realmente ocorrer coordenação com as histidinas, formando uma
estrutura hexacoordenada bis-histidina que perde o sinal de EPR. Isso confirma que a perda
do sinal de EPR nesta condição deve-se a alterações no estado de spin da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP de alto para baixo spin.
Com relação à atividade catalítica do complexo não-covalente porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt, observada à espectroscopia no UV-vis
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.128
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
conforme demonstrado na Figura 69, em reação com t-BuOOH ocorre desvio da banda Soret
compatível com a formação de Composto II. A banda Soret sofre red shift passando de 419
para 428 nm após 3600 segundos, retornando a 419 nm após 400 segundos e apresentando um
pequeno bleaching. Os resultados sugerem a formação de Composto II seguido de retorno da
porfirina à sua forma nativa Fe(III), completando-se o ciclo catalítico.
300 350 400 450 500
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
550 600 650 700 750
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 69 – Espectro no UV-vis da ação de t-BuOOH 1,5 mM sobre o complexo formado entre a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M e concentração equimolar de apocitocromo c pwt (H26N/H33N) preparado em
tampão fosfato de sódio 5mM pH 7,4. Complexo porfirina/apocitocromo c pwt (linha preta) e sob ação de t-
BuOOH após 200 seg (linha vermelha), 3600 segundos (linha azul) e após 4000 seg (linha magenta).
O espectro de EPR do complexo porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c
pwt sob a ação do t-BuOOH, mostrado na figura 70, demonstra manutenção do sinal em g =
6,0 característico do estado alto spin. O sinal, entretanto, aumenta um pouco de intensidade no
decorrer da reação, sendo porém mais estreito, o que pode ser indicativo da presença de duas
populações de porfirina, uma das quais reage primeiro com o peróxido adicionado. Não há
formação de radical livre, apesar de que o sinal de porfirina degradada em g = 4,28 aumenta
ligeiramente após 1 minuto de reação. Após o sutil aumento da intensidade do sinal da
porfirina, ocorre uma diminuição temporária do sinal do ferro porfirínico no curso da reação
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.129
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
com o peróxido, que pode ser atribuído à formação de Composto II, forma EPR silenciosa. O
sinal é posteriormente recuperado, indicando conversão do Composto II à forma nativa
Fe(III). Tais variações são compatíveis com a ocorrência do ciclo catalítico com formação de
Composto II e retorno à forma nativa, corroborando os resultados observados por
espectroscopia no UV-vis.
Figura 70 – (A) Espectros de EPR a 4K da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em apocitocromo c pwt
(H26A/H33A) preparado em tampão fosfato 5,0 mM pH 7.4 sob ação de t-BuOOH 25 mM. Complexo porfirina/
apocitocromo c pwt sem t-BuOOH (linha preta), imediatamente após adição do peróxido (linha vermelha), após
1 minuto (linha verde) e após 3 minutos (linha azul). (B) Em detalhes as alterações no sinal de EPR nas mesmas
condições e tempos de reação. Mantidas a mesma sequência de cores e nos mesmos tempos indicados na figura
(A).
Diferentemente do que ocorreu com o complexo não-covalente FeTDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c, o complexo formado entre esta porfirina e o apocitocromo c pwt
apresentou alterações espectrais no UV-vis quando da adição de DPAA. Houve red shift da
banda Soret, que passou de 419 para 429 nm, com aumento do , resultado compatível com a
redução do ferro hemínico (Figura 71).
75 100 125 150 175
-4
0
4
8
B
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
100 200 300 400
-16
-12
-8
-4
0
4
8
A
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.130
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
550 600 650 700 750
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 71 – Espectro no UV-vis da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP 100 M em quantidade equimolar de
apocitocromo c pwt (H26N/H33N), preparado em tampão fosfato de sódio 5mM pH 7,4, sob ação de DPAA 100
M. Complexo porfirina/apocitocromo c pwt (linha preta), 220 segundos após adição do DPAA (linha
vermelha), após 500 segundos (linha vermelha) e após 2000 segundos (linha azul).
A forma nativa de citocromo c exibe reatividade com DPAA e com t-BuOOH
(
159
,
160
)
,
o que reforça a observação de que no complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c
nativo, os ligantes do ferro hemínico não devem ser realmente os mesmos presentes na
estrutura da proteína nativa, isto é, a histidina 18 e a metionina 80. Por sua vez, a
indisponibilidade das histidinas 26 e 33 no apocitocromo c mutante, demonstra que as
mesmas exerceram papel fundamental na perda da reatividade por parte do complexo não-
covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c nativo, o que novamente reflete a
grande probabilidade de que nesta forma o complexo formado seja do tipo bis-histidina,
similar à estrutura do citocromo a
(
161
)
.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.131
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
4.2.3 Características espectroscópicas, atividade catalítica e estado de spin dos
complexos Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina e protoporfirina
IX/apomioglobina
A incorporação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP pela apomioglobina também
ocorreu de forma espontânea, à temperatura ambiente (25 ± 2ºC), por adição direta da solução
da porfirina preparada em tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,4 à solução de apomioglobina
preparada conforme técnica descrita em materiais e métodos. Foram utilizadas concentrações
equimolares de porfirina e apomioglobina, estipuladas em 100 M.
Conforme Figura 72A é possível verificar que, da mesma forma que a porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP é capaz de se incorporar à estrutura do apocitocromo c, a mesma é
capaz de compor um complexo com a apomioglobina. O complexo porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomiogolobina, por espectroscopia no UV-vis, apresenta red shift da Soret de 409
para 421 nm, compatível com a inserção da porfirina em ambiente mais hidrofóbico, e blue
shift da banda Q, que passa de 636 para 552 nm.
O espectro por MCD (Figura 72B) demonstra aumento na intensidade do sinal e
também desvios das bandas positiva e negativa quando da composição do complexo
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina em comparação à porfirina livre. A banda positiva
passa de 406 para 412 nm e a banda negativa de 419 para 425 nm, desvios estes similares aos
assumidos pelo complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c.
Tal fato demonstra uma maior estruturação do complexo.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.132
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Figura 72 – (A) Espectro no UV-vis da incorporação de 100M da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em
quantidade equimolar de apomioglobina. Porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP livre (linha preta), apomioglobina
(linha vermelha), complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina (linha vermelha).
(B) Espectro MCD da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP livre (linha preta), da apomioglobina (linha azul) e do
complexo (linha vermelha).
A comparação dos sinais obtidos por MCD entre os complexos porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c e porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina,
conforme apresentado na Figura 73, demonstram diferenças na estrutura assumida pelo
complexo em cada um dos sistemas. O complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP /apocitocromo c
apresenta sinal de maior intensidade e de melhor equivalência entre as bandas positiva e
negativa, indicando maior simetria. Já no complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina,
o nível de estruturação demonstra ser menor, sendo que a própria técnica empregada para
extração do grupo heme da mioglobina pode fazer com que a estrutura da apomioglobina se
mantenha mais fechada, menos acessível à porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, do que no
apocitocromo c.
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
B
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
500 550 600 650 700 750
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
A
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.133
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
Figura 73 - Espectro por MCD do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina
(linha vermelha) e do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c (linha preta).
O espectro de EPR do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina também indica que a porfirina assume estado de baixo spin, estando
assim hexacoordenada (Figura 74). Pode-se observar pequeno sinal em spin 5/2. A
composição do complexo, assim como quando se dá com apocitocromo c, apresenta a
formação de discreto precipitado, que sugere também a formação de estruturas poliméricas.
Figura 74 - Espectro por EPR a 4K do
complexo não-covalente porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina.
100 200 300 400
-0,8
-0,4
0,0
0,4
0,8
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.134
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Quanto à reatividade do complexo porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina,
similar ao que ocorre no complexo formado com o apocitocromo c, não há reação mediante
adição de t-BuOOH. Ocorre discreto bleaching, não há desvios, nem quaisquer indícios da
ocorrência de ciclo catalítico (Figura 75). Tal fato corrobora a incorporação da porfirina à
estrutura proteica, tornando-se inacessível à ação do peróxido.
Com DPAA, entretanto, por espectroscopia no UV-vis, é possível constatar que no
complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina ocorre red shift da
banda Soret, que passa de 421 para 427 nm. A banda Soret apresenta menor intensidade no
decorrer do tempo de reação, o que não é característico de redução do ferro porfirínico,
podendo sugerir que nesta condição ocorra conversão da porfirina para uma forma alto spin,
pentacoordenada (Figura 76).
300 350 400 450 500
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
500 550 600 650 700 750
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 75 – Espectro no UV-vis do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina
(linha preta) e sob ação de t-BuOOH 1,5 mM por 200 segundos (linha vermelha) e após 1000 segundos (linha
azul).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.135
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
500 550 600 650 700 750
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 76 - Espectro no UV-vis do complexo não-covalente porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina
(linha preta) e sob ação de DPAA 100 M por 200 segundos (linha vermelha) e após 1000 segundos (linha azul).
Os resultados obtidos para a atividade catalítica do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina frente a t-BuOOH e DPAA, se comparados aos obtidos para a
mioglobina, demonstram que a forma com que a porfirina se associa à apomioglobina difere
do complexo não-covalente formado naturalmente entre o grupo heme e a fração proteica que
dá origem à mioglobina. Na presença de t-BuOOH, a mioglobina apresenta alterações
espectroscópicas no UV-vis que podem indicar a ocorrência de um ciclo catalítico, porém não
ocorrem desvios da banda Soret, apenas uma queda no imediatamente após a adição do
peróxido, seguido de novo crescimento do sinal e na sequência ocorre bleaching da Soret.
(Figura 77). Ocorrem, entretanto, alterações na região das bandas Q, com diminuição do da
banda a 633 e blue shift da banda em 583 que passa para 580.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.136
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
500 550 600 650 700 750
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 77 – Espectro no UV-vis da mioglobina sob ação de t-BuOOH 1,5 mM. Mioglobina antes da adição do
peróxido (linha preta), 100 segundos após adição do t-BuOOH (linha vermelha), após 500 segundos (linha
verde), após 1500 segundos (linha azul) e após 3600 segundos (linha magenta).
A mioglobina, sob ação de DPAA, sofre redução, que pode ser verificada pelo desvio
da banda Soret de 410 para 415 nm e alterações nas bandas Q. Surge ponto isosbéstico em
360 nm e desvio da banda de 280 para 269 nm, com aumento da intensidade desta no decurso
da reação, novamente indicando a formação de derivados aldeídos, porém não de
benzofenona (Figura 78).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.137
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
250 300 350 400 450 500
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
500 550 600 650 700 750
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
360 nm
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
Figura 78 – Espectro no UV-vis da mioglobina sob ação de DPAA 100 M. Mioglobina antes da adição do
DPAA (linha preta), 300 segundos após adição do DPAA (linha vermelha), após 1500 segundos (linha azul) e
após 3000 segundos (linha magenta).
A literatura refere que a mioglobina catalisa reações de oxidação com peróxido de
hidrogênio nos moldes do ciclo catalítico das peroxidases
(
162
)
, e que possivelmente os
resíduos de cisteína 100 e de tirosina 103 estão envolvidos no processo por serem altamente
oxidáveis, sendo que na mioglobina nativa, estruturada, o ferro hemínico se liga à histidina 93
da cadeia proteica, permanecendo a sexta coordenadação livre, como ocorre na hemoglobina.
(
163
)
.
A incorporação da protoporfirina IX pela apomioglobina também ocorreu de forma
espontânea, à temperatura ambiente (25 ± 2ºC) pela adição de solução da protoporfirina IX,
preparada inicialmente como solução estoque em NaOH 0,1 N e depois diluída em tampão
fosfato de sódio 5 mM pH 7,4, à apomioglobina preparada conforme protocolo descrito
anteriormente.
Da mesma forma que quando da formação do complexo não-covalente protoporfirina
IX/apocitocromo c, a formação do complexo protoporfirina IX/apomioglobina promove red
shift da banda Soret observável à espectroscopia no UV-vis (Figura 79A). Nesta última
condição, a banda Soret sofre um desvio de 390 para 404 nm, contra o desvio de 390 para 395
quando a incorporação se deu pelo apocitocromo c. A banda Soret observada quando da
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.138
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
formação do complexo protoporfirina IX/apomioglobina ainda é bastante larga, indicando da
mesma forma uma estrutura terciária pouco compactada quando comparada à incorporação da
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP pelo apocitocromo c e pela apomioglobina. A banda
presente em 609 nm desaparece quando da composição do complexo não-covalente
protoporfirina IX/apomioglobina.
Conforme Figuras 79B e 80 é possível verificar também diferenças consideráveis
quando da incorporação da protoporfirina IX em apomioglobina em comparação à
incorporação pelo apocitocromo c. No complexo protoporfirina IX/apomioglobina pode-se
observar que os sinais por MCD são muito mais definidos, de maior intensidade e são maiores
desvios. A banda positiva passa de 393 para 399 nm e agora está presente uma banda
negativa, que apresenta desvio de 415 para 417 nm. Tal fato indica que o ambiente fornecido
pela apomioglobina permite uma melhor estruturação e uma condição que favorece uma
maior simetria da porfirina quando comparado ao ambiente fornecido pelo apocitocromo c.
Figura 79 – (A) Espectro UV-vis da incorporação da protoporfirina IX 100M em quantidade equimolar de
apomioglobina. Protoporfirina IX livre (linha preta), apomioglobina (linha vermelha), complexo não-covalente
protoporfirina IX/apomioglobina (linha vermelha). (B) Espectro por MCD da protoporfirina IX livre (linha
preta), da apomioglobina (linha azul) e do complexo (linha vermelha).
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
250 300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
500 550 600 650 700 750
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.139
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
300 350 400 450 500 550 600 650 700
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
/H (M
-1
.cm
-1
.T
-1
)
Comprimento de onda (nm)
Figura 80 – Espectro de MCD do complexo não-covalente protoporfirina IX/apocitocromo c (linha preta) e do
complexo não-covalente protoporfirina IX/apomioglobina (linha vermelha).
50 100 150 200 250 300 350 400 450
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Intensidade (a.u.)
Campo Magnético (Gauss)
Figura 81 – Espectro de EPR a 4K do complexo não-covalente protoporfirina IX/apocitocromo c (linha preta) e
do complexo não-covalente protoporfirina IX/apomioglobina (linha vermelha).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pág.140
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
O espectro por EPR do complexo não-covalente protoporfirina IX/apomioglobina,
conforme Figura 79, revela que nesta condição a porfirina permanece em seu estado nativo,
alto spin, da mesma forma que quando incorporada pelo apocitocromo c.
As análises espectroscópicas para determinação da atividade catalítica do complexo
protoporfirina IX/apomioglobina foram prejudicadas em função da presença de grande
quantidade de agregados. A turbidez do meio e o aumento na quantidade de precipitados no
decurso das reações impossibilitou qualquer interpretação dos resultados.
Os possíveis ligantes do ferro porfirínico no complexo não-covalente formado entre a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e a apomioglobina ainda permanecem em estudo. A
possibilidade de produzir formas da proteína com mutações sítio-específicas e a partir destas
produzir apomioglobina pode vir a permitir uma melhor avaliação dos possíveis ligantes nas
condições experimentais aqui utilizadas.
5. CONCLUSÕES
Pág.141
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
5. CONCLUSÕES
A associação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com apoproteínas, em especial,
com o apocitocromo c mostrou todas as características inerentes à formação de um complexo
não-covalente que envolve coordenação com o centro metálico e interações hidrofóbicas. Os
resultados obtidos com a porfirina em meio hidrofóbico de micelas de SDS, CTAB e
lipossomos de DODAB corroboram que as alterações espectroscópicas observadas quando a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP se associa ao apocitocromo c, mais especificamente o red
shift e o aumento do sinal de MCD, são condizentes com sua inserção em ambiente
hidrofóbico, assim como a supressão da fluorescência do triptofano 59 também reforça a
hipótese de que tenha ocorrido uma estruturação da cadeia proteica ao redor da porfirina.
As características do espectro no UV-vis do complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c sugere uma maior estruturação da cadeia proteica ao redor desta
porfirina do que da própria protoporfirina IX, porfirina biológica que compõe o grupo
prostético do citocromo c e da mioglobina.
Por sua vez, o complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c revela alterações no
estado de spin quando em comparação com a porfirina livre. Esta, na espectroscopia de EPR,
apresenta sinal característico de alto-spin, forma pentacoordenada ou hexacoordenada com
ligantes de campo fraco. A composição do complexo, entretanto, apresenta sinal de baixo
spin, indicando que a porfirina passou a estar hexacoordenada com ligantes de campo forte,
sendo a histidina uma das possibilidades, esta condizente com os resultados obtidos quando
histidina foi adicionada ao meio contendo a porfirina livre. O que se apresentou é que a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP em meio homogêneo contendo histidina, nos pHs 7,4 e 9,1,
apresenta sinal de EPR característico de forma baixo spin, hexacoordenada. Nesta condição,
entretanto, a porfirina exibe atividade catalítica sobre t-BuOOH e DPAA, o que não ocorre,
entretanto, para o complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c.
A possibilidade de que no complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c as
histidinas atuem como ligantes axiais do ferro foi confirmada quando a associação da
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com apocitocromo c pwt (H26N/H33N) não promoveu alterações no
estado de spin e nem tampouco a perda da reatividade sobre t-BuOOH e DPAA, apesar de que
a comparação com os sistemas-modelo de micelas de SDS, CTAB e lipossomos de DODAB
confirma que houve alterações no microambiente da porfirina, da mesma forma que quando
da associação com apocitocromo c nativo. Desta forma, o complexo Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c pwt manteve-se baixo spin e pentacoordenado ou hexacoordenado
5. CONCLUSÕES
Pág.142
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
com ligantes de campo fraco, uma vez que não estavam disponíveis as histidinas como
ligantes de campo forte.
Não é possível precisar, entretanto, se a histidina 18 se mantém como quinto ligante do
ferro porfirínico, como ocorre no citocromo c, e que uma das demais, seja a histidina 26 ou
33, representem o sexto ligante no complexo não-covalente ou se ambas exercem o papel
como quinto e sexto ligantes.
Os resultados obtidos, portanto, corroboram a hipótese de que o complexo não-
covalente Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c é do tipo bis-histidina e não exibe
atividade catalítica sobre peróxidos e aldeídos.
O mesmo não pode ser dito do complexo formado entre a protoporfirina IX e o
apocitocromo c. Este complexo não-covalente, entretanto, permanece alto spin e apresenta
reatividade com t-BuOOH e DPAA, similar ao que ocorre quando a porfirina IX se encontra
em meios homogêneo e também em meios heterogêneos de micelas e lipossomos. As
alterações espectrais observadas e sua comparação ao que foi observado para os sistemas-
modelo empregados sugerem que ocorra sim a formação do complexo não-covalente
protoporfirina IX/apocitocromo c, mas que a estrutura final seja menos compacta, com menor
grau de enovelamente protéico, favorecendo o acesso de peróxidos e aldeídos ao grupo heme
incorporado.
A formação do complexo não-covalente Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina
apresentou resultados similares aos observados para o apocitocromo c nativo. Tudo indica que
a incorporação realmente tenha ocorrido, sendo que a perda do sinal de EPR também condiz
com a hipótese de que a porfirina tenha passado à sua forma hexacoordenada, com ligantes de
campo forte, possivelmente aqui também histidinas, e também perdeu sua capacidade de
clivar peróxido.
Infelizmente, a associação da protoporfirina IX/apomioglobina não resultou
satisfatória em função da formação de agregados que impediram a realização de maiores
experimentos e consequentemente de maiores conclusões. Foi possível, entretanto, concluir
que a apomioglobina ofereceu ambiente mais estruturado à protoporfirina IX do que o
apocitocromo c, o que pode ser decorrente justamente do fato de que na mioglobina a ligação
heme-proteína é naturalmente do tipo não-covalente, enquanto que no citocromo c requer a
ação da heme-liase para promover a ligação heme-proteína de forma covalente e assim tornar
a proteína funcional.
Os resultados revelaram também que a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP exibe
atividade catalítica, cumprindo o ciclo das peroxidases na presença de t-BuOOH e sendo
5. CONCLUSÕES
Pág.143
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
capaz de ser reduzida na presença de DPAA, aldeído este capaz também de aumentar a
velocidade do ciclo catalítico como doador de elétrons. Foi possível evidenciar nos espectros
no UV-vis e no EPR a formação de Composto II e a geração de radicais livres, sem,
entretanto, ser constatada a presença de Composto I, o que é condizente com a teoria de que
tal porfirina realize clivagem homolítica do peróxido. A reatividade com DPAA, por sua vez,
leva a geração de derivados aldeídicos, porém que não a benzofenona.
Foi interessante observar a modulação da atividade catalítica da porfirina
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e da protoporfirina IX em diferentes ambientes. Micelas de CTAB,
como observado anteriormente para microperoxidases, oferecem um ambiente hidrofóbico
peculiar ao desenrolar de reações com peróxidos. Especificamente para a protoporfirina IX,
foi possível neste ambiente constatar com segurança a formação de Composto I a partir da
reação da porfirina com t-BuOOH, demonstrando que, diferente do que foi observado para a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, a clivagem neste caso é do tipo heterolítica. Já para a
porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, o CTAB forneceu ambiente que aumenta muito a
velocidade do ciclo, desfavorecendo a observação pela espectroscopia no UV-vis da geração
dos compostos de alta valência, o que só foi possível confirmar mediante espectros de EPR.
Já a associação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP com lipossomos de DODAB
promoveu a formação de nanoestruturas que poderão ter aplicações nanotecnológicas bastante
interessantes.
A condução deste trabalho permitiu, portanto, atender aos objetivos que foram
propostos e favorecer a compressão de vários mecanismos que podem ter aplicação direta não
só no conhecimento dos processos envolvidos na biogênese do citocromo c e das propriedades
catalíticas das porfirinas, quanto para o entendimento e a manipulação das propriedades vitais
atribuídas a estas moléculas, sejam elas de origem biológica, modificadas por manipulação
genética ou mesmo de origem sintética. Sendo as hemoproteínas no geral e as porfirinas por si
só agentes de tantos eventos essenciais à vida e com um potencial tecnológico cada vez mais
evidente, existe a proposta de continuidade e aprimoramento dos estudos aqui apresentados.
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Pág.144
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
A partir dos resultados obtidos e das conclusões decorrentes destes, pretende-se dar
prosseguimento ao tema visando utilizar de novos artifícios para confirmar os ligantes axiais
do ferro porfirínico em complexos não covalentes formados entre a porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e o apocitocromo c. Para tanto, pretende-se efetuar nova tentativa de expressão das
formas mutantes de citocromo c C14A/H26N/H33N e C17A/H26N/H33N empregando-se
novas condições de cultivo e adição de anti-oxidantes que atuem como agentes de proteção
das formas expressas de citocromo c e posteriormente realizar mutação sítio-dirigida no gene
de citocromo c presente no plasmídio PJRhrsN2 visando manter apenas a mutação nas
cisteínas 14 e 17, substituindo-se os resíduos de asparagina aqui presentes pelas histidinas
originais nas posições 26 e 33.
Além destas formas mutantes, pretende-se efetuar modificações químicas no
apocitocromo c nativo utilizando-se de bloqueadores de cisteína visando também determinar a
influência destes resíduos de aminoácidos como ligantes axiais do ferro porfirínico em
complexos não-covalentes.
Outra condição em perspectiva é a expressão da forma mutante de citocromo c na
histidina 18, uma vez que seu papel é fundamental como quinto ligante na coordenação do
ferro hemínico à cadeia proteica e pode favorecer a definição se a mesma se mantém como
ligante do ferro porfirínico no complexo não-covalente Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c ou se são somente as histidinas 26 e 33 as responsáveis pelas
características assumidas por este complexo.
Visando confirmar o percentual presente de citocromo c endógeno a partir da expressão
dos plasmídios com cada uma das mutações sítio-dirigidas pretende-se realizar espectro de
massa.
Novos experimentos para a caracterização estrutural dos complexos não-covalentes
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c nativo, Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apocitocromo c
mutante e Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP/apomioglobina estão previstos, incluindo-se aqui às
técnicas espectroscópicas utilizadas, o dicroísmo circular no far-UV para estudo do conteúdo
de -hélices e grau de estruturação proteica, bem como o consumo de oxigênio e testes
funcionais in vivo empregando mitocôndrias e culturas celulares e testes fotoquímicos visando
possível aplicação desta porfirina em terapia fotodinâmica, a exemplo de outras similares que
tiveram sua ação determinada sobre linhagem Hep-2 de carcinoma humano
(
164
)
.
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Pág.145
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
Para a associação da porfirina Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP a vesículas de DODAB, estão
previstos experimentos utilizando-se de microscopia de força atômica no modo Kelvin, que
permite verificar a condução eletrônica por nanoestruturas como as que se formaram nesta
condição. Para tanto serão empregadas também formas metal-substituídas da
Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP, com troca do ferro por zinco e manganês.
No que diz respeito à atividade catalítica das porfirinas Fe(III)TDC(SO
3
-
Na
+
)PP e
protoporfirina IX, pretende-se investigar com mais clareza os radicais gerados durante a
clivagem de peróxidos e sua ação como potenciais agentes de contenção do crescimento
tumoral e realizar a identificação por espectrometria de massa dos compostos aldeídicos
gerados a partir da reação das porfirinas com DPAA.
Pretende-se também dar continuidade ao estudo da interação da protoporfirina IX com a
apomioglobina visando melhor compreensão da biogênese desta a partir da interação grupo
prostético-proteína.
REFERÊNCIAS
Pág.146
Katia Cristina Ugolini Mugnol
2009
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