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Marcela Galo Teodoro
ESPÉCIES DE Mycosphaerella E Teratosphaeria ASSOCIADAS À
MANCHA FOLIAR E DESFOLHA DE Eucalyptus globulus NO SUL
DO BRASIL
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2010
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia,
para obtenção do título de Magister Scientiae.
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Marcela Galo Teodoro
ESPÉCIES DE Mycosphaerella E Teratosphaeria ASSOCIADAS À
MANCHA FOLIAR E DESFOLHA DE Eucalyptus globulus NO SUL
DO BRASIL
APROVADA:
________________________ _________________________
Prof. Eduardo S. G. Mizubuti Prof. Olinto Liparini Pereira
(Co-Orientador) (Co-Orientador)
________________________ __________________________
Pesq. Maria Alves Ferreira Pesq. Lúcio M. da S. Guimarães
_________________________
Prof. Acelino Couto Alfenas
(Orientador)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia,
para obtenção do título de Magister Scientiae.
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ii
Tudo parece ousado para quem nada se atreve.
Fernando Pessoa
Ousar e fazer
iii
Ao meu pai Pedro Lino Teodoro Neto
À minha mãe Maura Pinto Galo Teodoro
Ao meu querido irmão Pedro Henrique Galo Teodoro
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa, em especial ao Programa de Pós-
Graduação em Fitopatologia pela oportunidade.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -
CNPq, pela concessão da bolsa de estudo durante o curso, a Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - Fapemig e à Fibria pelo apoio
e financiamento do projeto.
À Klabin pelo envio de amostras empregadas neste estudo.
Ao Dr. Reginaldo Mafia pela aprovação do projeto junto a Fibria e envio
de amostras para o estudo.
Ao Prof. Acelino Couto Alfenas, pelos ensinamentos, pela orientação e
pelo apoio durante a realização deste trabalho.
Ao Prof. Eduardo S. G. Mizubuti por muito ter me ensinado, pela
orientação e pelas sugestões.
Ao Prof. Olinto L. Pereira pela orientação e pelas sugestões.
Ao Dr. Lúcio Mauro da Silva Guimarães e à Dra. Maria Alves Ferreira
pela amizade e pelo auxilio além das inúmeras revisões e críticas a este
trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Biologia de Populações – Departamento
de Fitopatologia/UFV, Saulo Alves Santos Oliveira e Robson do Nascimento
pela ajuda e pela paciência durante a realização das análises filogenéticas.
À Márcia Brandão pela amizade e pelo carinho.
Aos amigos do Laboratório de Patologia Florestal – BIOAGRO/UFV pela
ótima convivência e por terem me apoiado e muito me ensinado neste período.
Aos meus queridos amigos do Programa de Pós-graduação em
Fitopatologia, Poly, Gui, Deisoca, Érica, Éder e aos colegas de curso.
Às amigas, Dani, Renatinha, Michele, Rhay e Aninha pela força durante
todo o curso.
Ao meu namorado Rafael Garay por ser uma pessoa tão especial em
minha vida.
E em especial aos meus pais, Pedro e Maura e ao meu irmão Pedro
Henrique pelo amor incondicional.
v
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................ vi
ABSTRACT............................................................................................................................ vii
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 1
MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 4
1.
Isolamento e obtenção das culturas monoascospóricas ........................................ 4
2.
Caracterização das lesões ...................................................................................... 4
3.
Identificação das culturas ........................................................................................ 4
3.1. Padrão de germinação dos ascósporos ............................................................. 5
3.2. Análises de DNA ................................................................................................. 5
3.2.1. Extração e quantificação de DNA ................................................................... 5
3.2.2. Amplificação dos fragmentos ITS (espaço interno transcrito 1, região 5.8S e
espaço interno transcrito 2 do rDNA) e LSU (grande subunidade 28S do rDNA) por
PCR.................. ........................................................................................................... 6
3.2.3. Sequenciamento do DNA e análises .............................................................. 6
3.2.4. Amplificação de fragmentos utilizando primers específicos para T. nubilosa .. 7
3.2.5. Análises filogenéticas ........................................................................................ 7
4.
Crescimento micelial e esporulação em diferentes meios de cultura .................. 12
RESULTADOS ..................................................................................................................... 14
1. Isolamento e obtenção das culturas monoascospóricas ........................................... 14
2. Caracterização das lesões ......................................................................................... 14
3. Padrão de germinação dos ascósporos ..................................................................... 15
4. Análises filogenéticas ................................................................................................. 17
5. Crescimento micelial e esporulação em diferentes meios de cultura ........................ 20
DISCUSSÃO......................................................................................................................... 22
CONCLUSÕES .................................................................................................................... 26
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 27
APÊNDICES ......................................................................................................................... 33
vi
RESUMO
TEODORO, Marcela Galo, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, agosto de
2010. Espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria associadas à mancha
foliar e desfolha de Eucalyptus globulus no Sul do Brasil. Orientador:
Acelino Couto Alfenas. Coorientadores: Olinto Liparini Pereira e Eduardo Seiti
Gomide Mizubuti.
A mancha foliar e desfolha de teratosphaeria é uma das doenças foliares
mais severas de Eucalyptus globulus. Tendo em vista a importância dessa
espécie para a produção de celulose e papel e a recente constatação da
doença no Brasil, procurou-se no presente estudo identificar as espécies do
patógeno associadas à doença em Santa Catarina e no Rio Grande do Sul e
avaliar a influência de meios de cultura sobre o crescimento micelial e a
esporulação das espécies identificadas. As seguintes espécies foram
identificadas: Mycosphaerella scytalidii, M. lateralis, Teratosphaeria ohnowa, T.
pseudafricana, T. flexuosa e T. nubilosa. Baseado no padrão de germinação
dos ascósporos encontraram-se mais de uma espécie do fungo em uma
mesma lesão ou em uma mesma folha. Na segunda fase do estudo, avaliaram-
se o crescimento micelial e a esporulação das culturas identificadas.
Mycosphaerella scytalidii, T. ohnowa e T. flexuosa apresentaram maior área
abaixo da curva de crescimento micelial nos meios água de coco-ágar (ACA),
extrato de malte-ágar (MEA), batata-dextrose-ágar (BDA), micophil-ágar (MIC)
e aveia-sacarose-ágar (AVSA). Teratosphaeria nubilosa apresentou maior
área abaixo da curva de crescimento micelial nos meios BDA, AVSA e MEA.
Nenhum dos meios testados propiciou a esporulação das espécies testadas.
vii
ABSTRACT
TEODORO, Marcela Galo, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, august
2010. Species of Mycosphaerella and Teratosphaeria associated with leaf
spot and e defoliation of Eucalyptus globulus in southern Brazil. Advisor:
Acelino Couto Alfenas. Co-advisors: Olinto Liparini Pereira and Eduardo Seiti
Gomide Mizubuti.
The leaf bligh and defoliation of teratosphaeria is one of the most important
leaf diseases of Eucalyptus globulus. Due to the importance of this specie for
production of pulp and paper and the recent report of the leaf disease in Brazil,
this study was carried out aiming the identification of the pathogen in Santa
Catarina and Rio Grande do Sul and to test the mycelial growth and sporulation
of the fungus under different culture media. The following species were
identified: Mycosphaerella scytalidii, M. lateralis, Teratosphaeria ohnowa, T.
pseudafricana, T. flexuosa and T. nubilosa. Based on ascospore germination
patterns, more than one species of the fungus was found concurrently in a
single lesion or in a single leaf. Slow growth and lack of sporulation of the
fungus species are limiting factors for the production of inoculum to be used in
inoculation under controlled conditions. Thus in the second phase of this study,
we tested the mycelial growth and sporulation of the identified cultures in
several culture media. Mycosphaerella scytaliddi, Teratosphaeria ohnowa and
Teratosphaeria flexuosa presented a higher growth rate in coconut water-agar
(CWA), malt extract-agar (MEA), potato-dextrose-agar (PDA), mycophil-ágar
(MA), and oatmeal-sacarose-agar (OSA); Teratosphaeria nubilosa presented
higher growth rate in PDA, OSA, and MEA. No sporulation was obtained for all
species tested.
1
INTRODUÇÃO
Eucalyptus globulus é uma das espécies mais importantes para a
produção de celulose e papel, sua madeira possui alto teor de celulose, baixo
teor de lignina, densidade elevada e consequentemente baixo consumo
específico e menor consumo de cloro no branqueamento da polpa celulósica
(Fonseca et al. 2010). A espécie exige clima frio e inverno chuvoso, mas não
tolera geadas (Eldridge et al. 1993) por isso não se adapta a climas tropicais e
subtropicais como no Brasil. No entanto, os híbridos de E. globulus com outras
espécies ou com híbridos interespecíficos cultivados no Brasil, como E.
grandis, E. urophylla, E. camaldulensis, E. grandis x E. urophylla dentre outras,
apresentam maior potencial para a produção de celulose e adaptabilidade às
condições brasileiras (Alfenas et al. 2009).
Atualmente, no Brasil, tem-se introduzido E. globulus nos programas de
melhoramento genético, seja como espécie pura ou como genitor em
cruzamentos com E. grandis, E. urophylla dentre outras. Essa estratégia tem
sido denominada de “globulização” da eucaliptocultura nacional e visa à
obtenção de ganhos em rendimento de celulose (Alfenas et al. 2009).
Entretanto, a alta suscetibilidade de E. globulus à desfolha incitada por
Teratosphaeria spp. e Mycosphaerella spp. pode ser limitante ao sucesso
destes programas. A doença foi recentemente relatada em E. globulus no Rio
Grande do Sul e atribuída a Teratosphaeria nubilosa (Perez et al. 2009),
embora outras espécies tenham sido encontradas em Eucalyptus spp. no Brasil
(Alfenas et al. 2009).
Em um recente e detalhado estudo taxonômico, Crous et al. (2007)
transferiram várias espécies de Mycosphaerella para o gênero Teratosphaeria
Syd. & P. Syd., pertencente à família Teratosphaeriaceae Crous & Braun. Mais
de 80 espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria já foram descritas em
Eucalyptus spp., incluindo espécies patogênicas e saprofíticas. Dentre as
espécies descritas, T. cryptica e T. nubilosa são as mais importantes em
virtude da severidade da doença e intensa desfolha em E. globulus em todo o
mundo (Carnegie et al. 2007; Hunter et al. 2008). Teratosphaeria nubilosa pode
causar 95% de desfolha das árvores (Carnegie, 2007).
2
Várias espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria podem infectar
folhas de Eucalyptus e frequentemente mais de uma espécie pode ser
encontrada em uma única folha e até mesmo em uma mesma lesão (Crous &
Wingfield, 1996). As espécies Mycosphaerella lateralis, M. grandis e M. parva
têm sido comumente encontradas em associação com outras espécies de
Mycosphaerella e Teratosphaeria que causam manchas foliares (Milgate et al.
2001; Crous et al. 2006). Desta maneira, infecções múltiplas podem ocorrer, o
que aumenta o impacto da doença e torna complexa a identificação de seu
agente etiológico e o controle da doença (Gezahgne et al. 2006).
A doença caracteriza-se por numerosas lesões inicialmente
arredondadas de cor palha e com o progresso da infecção, as lesões
coalescem, adquirem formatos variáveis e atinge grande área do limbo foliar,
provocando intensa desfolha, o que reduz a capacidade fotossintética da planta
(Crous, 1998; Pinkard & Mohammed, 2006). A intensidade da doença varia
com o estádio fenológico das folhas de E. globulus, incidindo mais
severamente nas folhas juvenis (Alfenas et al. 2009). O fungo produz inúmeros
pseudotécios em ambas as faces do limbo foliar, mas predominantemente na
face abaxial. Em folhas molhadas, os ascósporos são ativamente ejetados dos
pseudotécios e disseminados pelo vento como inóculo primário ou secundário
até as folhas sadias onde germinam, penetram por estômatos e causam
infecção (Park & Keane 1982; Park & Keane 1984).
Estudos sobre o processo infeccioso e o desenvolvimento da doença
são baseados em T. cryptica e T. nubilosa. Ambos, ascósporos e conídios de
espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria são infectivos. Em geral,
ascósporos, constituem inóculo para a doença causada por essas espécies,
embora conídios possam também iniciar a infecção (Park & Keane, 1987). A
fonte de ascósporos é predominantemente a partir de folhas infectadas, onde o
fungo sobrevive por vários meses, produzindo inóculo suficiente para
sucessivos ciclos de infecção (Park & Keane, 1987; Crous et al. 2007).
O plantio de genótipos resistentes constitui a melhor alternativa de
controle de doenças em plantas, principalmente em espécies florestais em
condições de campo. Na seleção de plantas resistentes é fundamental
determinar os protocolos de produção de inóculo, inoculação e quantificação da
doença. Todavia, o crescimento lento de Mycosphaerella spp. e Teratosphaeria
3
spp. e as dificuldades de esporulação do fungo em cultura constituem os
maiores obstáculos para inoculação, visando à seleção de plantas resistentes.
Os objetivos foram identificar as espécies de Mycosphaerella e
Teratosphaeria associadas à mancha foliar e desfolha de E. globulus no sul do
Brasil e determinar as condições ótimas para o crescimento micelial e
esporulação do fungo em cultura.
4
MATERIAL E MÉTODOS
1. Obtenção de isolados monoascospóricos
Amostras de folhas infectadas de E. globulus coletadas no Sul do Brasil
foram empregadas para isolamento e identificação do agente etiológico da
doença. Para o isolamento, empregou-se a técnica de ejeção ativa de
ascósporos (Crous, 1998). Para tal, lesões contendo pseudotécios foram
mantidas em água destilada durante 2h, a fim de estimular a ejeção ativa dos
ascósporos. Após esse período, cada lesão foi aderida à tampa de uma placa
de Petri contendo meio de extrato de malte - ágar (MEA). As placas foram
mantidas a 25°C por 12 h. Culturas monoascospóricas foram obtidas a partir da
transferência de um único ascósporo para placa de Petri contendo meio MEA,
seguindo-se incubação a 15ºC por 15 dias e posteriormente a 20°C durante 30
dias.
2. Caracterização das lesões
Para a caracterização das lesões, as amostras foram analisadas sob
microscópio estereoscópico. Avaliou-se o tamanho, a forma, a cor das lesões
bem como a distribuição dos pseudotécios na lesão. Avaliaram-se 30 lesões
por amostra.
3. Identificação das culturas
Para a identificação das culturas, empregou-se o padrão de germinação
e análises de DNA.
5
3.1. Padrão de germinação dos ascósporos
O padrão de germinação dos ascósporos (Crous, 1998) foi utilizado para
identificação prévia das culturas.
3.2. Análises de DNA
3.2.1. Extração e quantificação de DNA
Discos das culturas monoascospóricas com 45 dias de idade foram
transferidos para placas de Petri contendo meio de batata - dextrose - ágar
(BDA), com um papel celofane estendido sobre o meio e incubados a 20ºC por
60 dias. Após incubação, o micélio foi raspado com o auxílio de uma espátula e
triturado em almofariz, contendo nitrogênio líquido, com o auxílio de pistilo até a
formação de um pó micelial fino. Posteriormente, as amostras foram
individualmente transferidas para tubos de microcentrífuga (1,5 mL), e tratadas
com 750 μL de tampão de extração por grama de micélio (CTAB 2x; NaCl 1,4
M; EDTA 20 mM, pH 8,0; Tris HCl 100 mM, pH 8,3 e PVP), 15 μL de 2-ß-
mercaptoetanol. A seguir, as amostras foram homogeneizadas em agitador do
tipo vortex e incubadas a 65ºC por 30 min. Após incubação, adicionaram-se às
amostras, 500 μL de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1), cuja
homogeneização se deu pela inversão manual e cuidadosa dos tubos por
várias vezes. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 12.000g por 5
min. Após centrifugação, o sobrenadante foi recolhido e transferido para um
novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, foram adicionados 500 μL de
clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 por tubo e as amostras homogeneizadas
mediante inversão manual dos tubos e centrifugadas novamente a 12.000 g por
5 min. O sobrenadante (aproximadamente 500 μL) foi recolhido e transferido
para um novo tubo de microcentrífuga contendo 0,9 volumes (450 μL) de
isopropanol frio. Subsequentemente, as amostras foram novamente
centrifugadas a 12.000 g por 7 min e o pellet foi lavado por duas vezes em 500
μL de etanol 70% frio. Apos cada lavagem, as amostras foram centrifugadas a
12.000 g por 5 min. Após a ultima centrifugação os pellets foram mantidos em
temperatura ambiente para secagem por 30 min. Após a secagem, o pellet de
6
DNA foi ressuspenso em 50 µL de TE (Tris 10mM e EDTA 1mM, pH 8,0) a
37ºC por 2-4 h e armazenados a -20ºC. Posteriormente, o DNA foi diluído em
água destilada esterilizada na proporção de 1:10 e quantificado em
espectrofotômetro.
3.2.2. Amplificação dos fragmentos ITS (espaçador interno transcrito 1, região
5.8S e espaçador interno transcrito 2 do rDNA) e LSU (grande subunidade 28S
do rDNA) por PCR
As reações de PCR foram realizadas em 25 µL de solução contendo 5–
10 ng/µL de DNA genômico, 2 µL a 10 mM de dNTP, 1,5 µL a 0,2 mM de cada
primer, 1,75 U taq polimerase (Promega®), 5 µL de tampão 5x (Promega®), 2
µL de MgCl
2
a 25 mM e água esterilizada para completar o volume final. Os
primers utilizados para amplificação da região ITS foram ITS1-ITS4
(TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC), (White, 1990) e
para a amplificação da região LSU os primers LR0R-LR5
(ACCCGCTGAACTTAAGC/TCCTGAGGGAAACTTCG), (Cheewangkoon et
al.,2008). As amplificações foram realizadas em termociclador nas seguintes
condições: 5 min a 96ºC, seguidos por 30 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 50ºC e
1 min e 30 s a 72ºC, seguidos de 4 min a 72°C de extensão final para os
primers ITS1 e ITS4 e 4min a 95°C, seguidos de 35 ciclos de 1 min a 94°C,
1min e 30 s a 53°C e 2 min a 72°C, seguidos de 4 min a 72°C de extensão final
para os primers LR0R e LR5. Os produtos resultantes foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 2%, contrastados em brometo de etídeo. Os
produtos de PCR foram purificados usando o Kit High Pure PCR Product
Purification-Roche Diagnostics®.
3.2.3. Sequenciamento do DNA e análises
O sequenciamento do DNA foi realizado em sequenciador (Applied
BioSystems, Foster City, CA). Os primers ITS1-ITS4 e LR0R-LR5 usados para
amplificação do DNA foram usados no sequenciamento. Para o
7
sequenciamento da região LSU foram utilizados também os primers internos
LR3R (GTCTTGAAACACGGACC) e LR16 (TTCCACCCAAACACTCG),
(Cheewangkoon et al., 2008). As sequências foram determinadas usando um
auto-sequenciador ABI PRISM 3100 (AppliedBioSystems) e as sequências de
dados foram analisadas usando o Sequence Navigator version 1.0.1 (Applied
BioSystems). As sequências ITS e LSU dos isolados estudados foram
comparadas com sequências do GenBank de outras regiões e países através
do algoritmo BLASTn.
3.2.4. Amplificação de fragmentos utilizando primers específicos para T.
nubilosa
As reações de PCR foram realizadas em 25 µL de solução contendo 5
µL de tampão para PCR 5X (Promega®), 2 µL de MgCl
2
a 25mM (Promega®),
2 µl dNTP a 10 mM, 1,75 U de taq polimerase (Promega®), 1,5 µL dos primers
específicos a 0,2mM MNF-MNR (CGTCGGAGTAATACAACC/
AGGCTGGAGTGGTGAAATG) (Kularatne et al. 2004) e MN1F-MN1R
(GCGCCAGCCCGACCTCC/ GGTCCCCGTCAGCGAAACAGT) (Maxwell et al.
2005) e 2 µL de DNA genômico (5-10 ng/µL) e água esterilizada suficiente para
completar o volume final. As amplificações foram realizadas em termociclador
nas seguintes condições: desnaturação inicial de 10 min a 94ºC seguida por 35
ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 50ºC, 1 min a 72ºC e extensão final por 10 min a
72ºC para os primers MNF-MNR e 2 min a 85ºC, seguidos de 30 ciclos de 2
min a 96°C, 30 s a 94°C e 30 s a 55°C, 2 min a 72°C e extensão final por 7 min
a 72°C para os primers MN1F-MN1R. Os produtos amplificados (5µL) foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% e contrastados com
brometo de etídeo.
3.2.5. Análises filogenéticas
Sequências de DNA foram alinhadas automaticamente utilizando-se o
programa CLUSTAL W (WWW.ebi.ac.uk/clustalw) (Thompson & Higgins et al.
1994), avaliadas visualmente e corrigidas manualmente usando o programa
MEGA 4.1 (Kumar 2008). As sequências foram analisadas com utilização da
8
função “statistic” do MEGA 4.1 para verificar a composição das sequências,
presença de sítios únicos, número de sítios variáveis e número de sítios de
parcimônia informativa.
Dois conjuntos de sequências foram utilizados nas análises
filogenéticas. O primeiro conjunto continha 65 sequências da região ITS do
rDNA, sendo 13 sequências geradas neste estudo e 52 obtidas no NCBI-
GenBank (Tabela 1), representando espécies dos gêneros Mycosphaerella,
Teratosphaeria e Davidiella, e Dothidea como outgroup. O segundo conjunto de
dados continha 62 sequências da região LSU do rDNA, sendo 15 sequências
geradas neste estudo e 47 obtidas pelo NCBI-GenBank (Tabela 2)
representando espécies dos gêneros Mycosphaerella, Teratosphaeria,
Davidiella e Dothidea, que foi usado como outgroup.
Nas análises filogenéticas, empregaram-se os métodos de Neighbor
Joining (NJ), Máxima Parcimônia (MP), Máxima Verossimilhança (ML) e
Inferência Bayesiana (MB). As análises de NJ foram realizadas no programa
MEGA 4.1, empregando-se o modelo Kimura-2-parâmetros (Kimura, 1980)
para calcular a distância evolutiva e a consistência dos grupos foi analisada por
1.000 pseudo-repetições bootstrap. A MP foi realizada utilizando-se o programa
PAUP versão 4.0b10 (Swofford, 2002) empregando-se busca heurística com
10.000 repetições de sequência aleatória e TBR. Gaps de alinhamento foram
tratados como informação perdida. As análises de ML foram realizadas com o
programa PhyML (Phylogenies by Maximum Likelihood) (Guindon & Gascuel,
2003). Para reconstrução filogenética por ML, o modelo de substituição foi
escolhido com base no critério de informação Akaike (AIC) usando o programa
ModelTest 3.7 (Posada & Crandall 2001). O modelo escolhido foi o GTR + I +
G. A consistência dos ramos foi analisada por 1.000 pseudo-repetições
bootstrap. Análises Bayesianas foram realizadas utilizando MrBayes 3.1.2
(Bayesian Inference of Phylogeny) (Ronquist & Huelsenbeck, 2003). O modelo
de substituição foi escolhido com base no critério de informação Akaike (AIC)
do MrModelTest 3.2 (Nylander, 2004). Análises de Markov e Monte Carlo
(MCMC) de quatro cadeias foram iniciadas a partir de uma árvore ao acaso,
com 5.000.000 gerações executadas. As árvores foram salvas a cada 100
gerações, resultando em 50.000 árvores salvas. Foi utilizado burn-in de 2.500
gerações das quais os valores de verossimilhança foram fixos, deixando
9
12.500 árvores das quais a maioria de 50% determinou a árvore consenso e
valores de probabilidade posterior foram calculados.
As árvores filogenéticas foram construídas e editadas com o programa
Figtree (http://tree.bio.ac.uk/software).
Tabela 1 – Isolados de Mycosphaerella e Teratosphaeria incluídos no estudo
para análises de comparação de seqüência da região ITS.
Espécie
Número de
Acesso
1
Hospedeiro
País
Acesso
Genbank
Referência
Dothidea
hippophaeos
CBS 18658 -
-
-
AF027763
Jacobs,K.A.;
Rehner,S.A. 1998
Dothidea insculpta
CBS 18958
-
-
AF027764
Jacobs,K.A.;
Rehner,S.A. 1998
Dothidea sambuci
AFTOL-ID-274
-
-
DQ491505
James,T.Y., et al,
Unpublished
Kabatiella lini
CBS 125121
Linum
usitatissimum
-
FJ150897
Zalar,P. et al,
Unpublished
Davidiella tassiana
G20
Phalaris
arundinacea
República
Tcheca
GU566258
Bukovska,P. et al,
Unpublished
Davidiella
macrospora
IMI147030
Iris sp
Reino
Unido
AB435067
Kurose,D.,et al,
2009
Cladosporium bruhnei
CPC 12921
Eucalyptus sp
Austrália
EF679352
Schubert,K., et al,
2007
Cladosporium
macrocarpum
CPC 12757
Spinacia oleracea
Estados
Unidos
EF679378
Schubert,K., et al,
2007
Teratosphaeria
destructans
CBS 111370
Eucalyptus sp
Indonésia
GQ852800
Crous,P.W. et al,
2009a
Teratosphaeria
eucalypti
CPC 12552
Eucalyptus nitens
Austrália
GQ852801
Crous,P.W. et al,
2009a
Teratosphaeria
zuluensis
CPC 11962
Eucalyptus sp
África do Sul
DQ303067
Crous,P.W. et al,
2006
Teratosphaeria
microspora
STE-U-1832
-
-
AY260097
Taylor,J.E. et al,
2003
Teratosphaeria parva
CPC 12418
Eucalyptus
globulus
Austrália
EU707878
Crous,P.W. et al,
2008
Teratosphaeria
molleriana
CPC 12056
Eucalyptus sp
Uruguai
DQ302991
Crous,P.W. et al,
2006
Teratosphaeria
cryptica
CPC 12424
Eucalyptus
globulus
Austrália
GQ852794
Crous,P.W. et al,
2009a
Teratosphaeria
hortaea
CPC 15723
Eucalyptus
camaldulensis
Madagascar
FJ790279
Crous,P.W. et al,
2009b
Teratosphaeria
mexicana
CBS 120744
Eucalyptus sp
Hawaii
EF394843
Crous,P.W. et al,
2007b
Teratosphaeria
toledana
CBS 115513
Eucalyptus sp
Espanha
FJ493198
Crous,P.W. et al,
2009c
Teratosphaeria
stellenboschiana
CPC 12059
Eucalyptus sp
Uruguai
DQ303069
Crous,P.W. et al,
2006
Teratosphaeria
fibrillosa
CBS 121707
Protea sp
Africa do Sul
EU707862
Crous,P.W. et al,
2008
Teratosphaeria
ohnowa
CBS 120745
Eucalyptus dunnii
Austrália
EF394845
Crous,P.W. et al,
2007b
Teratosphaeria
flexuosa
CPC 10995
Eucalyptus sp
Colômbia
DQ302958
Crous,P.W. et al,
2006
Teratosphaeria
juvenis
CMW 9103
-
-
AF468881
Hunter,G.C. et al
2004
Teratosphaeria
macowanii
CBS 110756
Protea nitida
África do Sul
AY260095
Taylor,J.E. 2003
Teratosphaeria
CPC12949
Eucalyptus sp
África do Sul
FJ023540
Crous,P.W. et al,
10
verrucosa
2009c
Teratosphaeria
juvenalis
CPC 10941
-
-
AY725516
Crous,P.W. et al,
2004
Teratosphaeria
bellula
CPC 14908
Protea sp
África do Sul
EU707861
Crous,P.W. et al,
2008
Teratosphaeria
nubilosa
CPC 11761
Eucalyptus
globulus
Espanha
DQ302997
Crous,P.W. et al,
2006
Teratosphaeria
pseudafricana
CBS 114782
Eucalyptus
globulus
Zambia
DQ303008
Crous,P.W. et al,
2006
Teratosphaeria
suberosa
CPC 11032
Eucalyptus sp
Colombia
DQ303044
Crous,P.W. et al,
2006
Dissoconium dekkeri
(M.lateralis)
CPC 11706
Eucalyptus
globulus
Espanha
DQ302972
Crous,P.W. et al,
2006
Mycosphaerella
scytalidii
CBS 51693
Eucalyptus
globulus
Brasil
DQ303014
Crous,P.W. et al,
2006
Mycosphaerella
acaciigena
CBS 120740
Eucalyptus sp
Austrália
EF394822
Crous,P.W. et al,
2007b
Mycosphaerella
africana
-
-
AF309602
Crous,P.W. et al,
2001
Mycosphaerella
endophytica
CBS 111519
Eucalyptus sp
África do Sul
DQ302952
Crous,P.W. et al,
2006
Mycosphaerella
heimii
CMW 5718
-
-
AF452517
Crous,P.W. et al,
Unpublished
Mycosphaerella
heimioides
STE-U-1312
-
-
AF309609
Crous,P.W. et al,
2001
Mycosphaerella
holualoana
STE-U-2155
-
-
AY260084
Taylor,J.E , et
al,2003
Mycosphaerella
irregulariramosa
STE-U-1362
-
-
AF309608
Crous,P.W. et al,
2001
Mycosphaerella
keniensis
STE-U-1084
-
-
AF309601
Crous P.W. et al,
2001
Mycosphaerella
konae
STE-U-2123
-
-
AY260086
Taylor,J.E , et al,
2003
Mycosphaerella
marksii
CPC 11795
Vepris reflexa
África do Sul
DQ302984
Crous,P.W. et al,
2006
Mycosphaerella
parkii
STE-U-353
-
-
AF309590
Crous,P.W. et al,
2001
Mycosphaerella pyri
CBS 64072
-
-
AY152592
Verkley,G.J.M. et al,
2004
Mycosphaerella
communis
EFNNX30B
-
-
FJ515739
Silva,M. et al, 2009
Mycosphaerella
musicola
UQMM0005
-
Austrália
AY923755
Thomas-Hall,S.R.,
Unpublished
Mycosphaerella
coffeicola
C2
-
-
AY230799
Rosa,D.D.,
Unpublished
Mycosphaerella
fijiensis
UQMF2612
-
Papua Nova
Guiné
AY923763
Thomas-Hall,S.R.,
Unpublished
Mycosphaerella
fragariae
CBS 29834
-
-
AY152596
Verkley,G.J.M. et al,
2004
Mycosphaerella
ellipsoidea
STE-U-1225
-
-
AF309593
Crous,P.W. et al,
2001
Mycosphaerella
graminicola
CBS 100335
-
-
AY152602
Verkley,G.J.M. et al,
2004
Mycosphaerella
berberidis
CBS 32452
-
-
AF362062
Crous,P.W. et al,
2001
1
AFTOL: Assembling the Fungal Tree of Life; CBS: Centraal bureau voor Schimmel cultures, Utrecht, The Netherlands;
CPC: Culture collection of Pedro Crous, housed at CBS; CMW: Culture collection of Mike Wingfeld, housed at FABI,
Pretoria, South Africa; ENF: Instituto Nacional dos Recursos Biologicos, Edificio da ex-Estacao Florestal Nacional,
Quinta do Marques, Oeiras 2780-159, Portugal; IMI: International Mycological Institute, STEU: Culture collection of
Stellenbosch University, South Africa; The University of Queensland, Australia.
11
Tabela 2 – Isolados de Mycosphaerella e Teratosphaeria incluídos no estudo
para análises de comparação de seqüência da região LSU.
Espécie
Número de
Acesso
1
Hospedeiro
País
Acesso
Genbank
Referência
Dothidea insculpta
CBS 18958
-
-
AY640949
Reeb,V. et al, 2004
Dothidea sambuci
CBS 19858
-
-
AY930109
Shoemaker,R.A.;
Hambleton,S. 2005
Dothidea ribesia
CBS 19558
-
-
AY016360
Lumbsch,H.T.; Lindemuth,R.
2001
Davidiella
tassiana
CBS 72379
Allium porrum
Nova
Zelândia
GU214410
Crous,P.W. et al, 2009d
Davidiella
macrospora
CBS 10720
Iris sp
-
EF679369
Schubert,K. et al, 2007
Cladosporium
bruhnei
CBS 18854
-
-
EU019263
Crous,P.W. et al 2007a
Cladosporium
macrocarpum
CBS 29967
Triticum
aestivum
Turquia
EF679372
Schubert,K. et al 2007
Teratosphaeria
destructans
CBS
111370
Eucalyptus sp
Indonésia
GQ852690
Crous,P.W. et al, 2009e
Teratosphaeria
eucalypti
CPC 12552
Eucalyptus
nitens
Austrália
GQ852691
Crous,P.W. et al, 2009e
Teratosphaeria
zuluensis
CBS
120301
Eucalyptus
grandis
África do Sul
EU019296
Crous,P.W. et al, 2007a
Teratosphaeria
microspora
CBS
101951
-
-
EU343621
Simon,U.K.; Weiss,M. 2008
Teratosphaeria
parva
CPC 12249
Eucalyptus
globulus
Portugal
GQ852708
Crous,P.W. et al, 2009e
Teratosphaeria
molleriana
CBS
116370
Eucalyptus
globulus
Espanha
GU214508
Crous,P.W. et al, 2009d
Teratosphaeria
cryptica
CBS
110975
Eucalyptus
globulus
Austrália
GU214505
Crous,P.W. et al, 2009d
Teratosphaeria
hortaea
CPC 15718
Eucalyptus
camaldulensis
Madagascar
FJ790299
Crous,P.W. et al, 2009b
Teratosphaeria
mexicana
CBS
110502
Eucalyptus
globulus
Austrália
GU214507
Crous,P.W. et al, 2009d
Teratosphaeria
toledana
CBS
113313
Eucalyptus sp
Espanha
GU214513
Crous,P.W. et al, 2009d
Teratosphaeria
stellenboschiana
CBS
116428
Eucalyptus sp
África do Sul
EU019295
Crous,P.W. et al 2007a
Teratosphaeria
fibrillosa
CPC 1876
Protea nitida
África do Sul
GU214506
Crous,P.W. et al, 2009d
Teratosphaeria
ohnowa
CBS
112973
Eucalyptus
grandis
África do Sul
GU214511
Crous,P.W. et al, 2009d
Teratosphaeria
flexuosa
CBS
111048
Eucalyptus
grandis
Colômbia
FJ493216
Crous,P.W. et al, 2009c
Teratosphaeria
juvenis
-
-
África do Sul
AF309586
Crous,P.W. et al, 2001
Teratosphaeria
macowanii
CBS
110756
Protea nitida
África do Sul
EU019254
Crous,P.W. et al, 2007a
Teratosphaeria
verrucosa
CPC 18
Eucalyptus
cladocalyx
África do Sul
-
EU019293
Crous,P.W. et al, 2007a
Teratosphaeria
juvenalis
CBS
111149
Eucalyptus
cladocalyx
África do Sul
EU019294
Crous,P.W. et al, 2007a
Teratosphaeria
bellula
CBS
111700
Protea eximia
África do Sul
EU019301
Crous,P.W. et al, 2007a
Teratosphaeria
nubilosa
CBS
115669
Eucalyptus
nitens
África do Sul
GU214509
Crous,P.W. et al, 2009d
Teratosphaeria
suberosa
CPC 11032
Eucalyptus sp
Colômbia
GU214512
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
lateralis
CBS
111282
Eucalyptus
globulus
Zâmbia
GU214425
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
acaciigena
CBS
112515
Acacia mangium
Venezuela
GU214432
Crous,P.W. et al, 2009d
12
Mycosphaerella
africana
CBS
116154
Eucalyptus
viminalis
-
GU214433
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
endophytica
CBS
114662
Eucalyptus sp
África do Sul
GU214435
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
heimii
CBS
110682
Eucalyptus sp
Madagascar
GU214438
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
heimioides
CBS
111190
Eucalyptus sp
Indonésia
GU214439
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
holualoana
CBS
110699
Leucospermum
sp
Hawaii
GU214440
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
irregulariramosa
CBS
111211
Eucalyptus
saligna
África do Sul
GU214441
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
keniensis
CBS
111001
Eucalyptus
grandis
Kenia
GU214442
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
konae
CPC 10992
Eucalyptus sp
Colômbia
GQ852611
Crous,P.W. et al, 2009e
Mycosphaerella
marksii
CPC 11222
Eucalyptus
grandis
Bolívia
GU214447
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
parkii
CBS 38792
Eucalyptus
grandis
Brasil
GU214448
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
pyri
CBS 22231
Pyrus communis
-
GU214495
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
communis
CBS
114238
-
-
DQ246262
Hunter,G.C., Unpublished
Mycosphaerella
fijiensis
AFTOL-ID-
2021
-
-
DQ678098
Schoch,C.L., Unpublished
Mycosphaerella
fragariae
CBS 71984
-
-
EU167605
Simon,U.K. et al,
Unpublished
Mycosphaerella
ellipsoidea
CBS
110843
Eucalyptus
cladocalyx
África do Sul
GU214434
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
graminicola
CBS
115943
Triticum
aestivum
Holanda
GU214436
Crous,P.W. et al, 2009d
Mycosphaerella
berberidis
CBS 32452
-
-
EU167603
Simon,U.K. et al,
Unpublished
1
AFTOL: Assembling the Fungal Tree of Life; CBS: Centraal bureau voor Schimmel cultures, Utrecht, The
Netherlands; CPC: Culture collection of Pedro Crous, housed at CBS.
4. Crescimento micelial e esporulação em diferentes meios de cultura
O crescimento micelial de cinco isolados (PM01, PM02, PM06, PM08 e
PM10) foi avaliado em diferentes meios de cultura, a 20ºC. Testaram-se os
meios V8 ágar [30 mL de V8 (Campbell Soup Company), 6 g de ágar e 300 mL
de água destilada], V8 CaCO
3
(30 mL de V8, 0,6 g de CaCO
3
, 6 g de ágar e
300 mL de água destilada), MEA (6 g de extrato de malte, 6 g de ágar e 300
mL de água destilada), BDA [11,7 g de batata dextrose ágar (Acumedia®) e
300 mL de água destilada], BCA (extrato de 6 g de batata, extrato de 6 g de
cenoura, 6 g de ágar e 300 mL de água destilada), MIC (3 g de farinha de soja,
3 g de dextrose, 6 g de ágar e 300 mL de água destilada), CLA (6 g de ágar e
300 mL de água destilada – adição de 4 fragmentos de folhas de cravo por
placa), MEG (macerado de 60 g de folhas de E. globulus, 6 g de ágar e 300 mL
13
de água destilada), FEG (filtrado de 60 g de folhas de E. globulus, 6 g de ágar
e 300 mL de água destilada), ACA (300 mL de água de coco e 6 g de ágar),
CVA (200 mL de caldo de vegetais, 6 g de ágar e 100 mL de água destilada),
(Pereira et al. 2003) e AVSA (6 g de aveia, 4,5 g de sacarose, 6 g de ágar e
300 mL de água destilada). Realizaram-se dois ensaios, o primeiro com os
isolados PM01, PM02 e PM06 e o segundo com os isolados PM06, PM08 e
PM10. Discos de cultivo de 5 mm (primeiro ensaio) ou 3 mm (segundo ensaio)
de diâmetro foram retirados das bordas de colônias crescidas em meio BDA
por 20 a 40 dias e transferidos para placas de Petri (6 mm), contendo 5 ml dos
respectivos meios de cultura (um disco por placa). As placas foram mantidas a
20°C no escuro em delineamento inteiramente casualizado no esquema fatorial
(meio x isolado) com cinco repetições de cada meio de cultura-isolado testado.
A cada sete dias avaliou-se o diâmetro da colônia. Aos 14 dias de incubação,
as culturas foram submetidas à luz negra contínua a fim de estimular a
esporulação. A cada sete dias, avaliou-se a presença de esporulação das
colônias sob microscópio estereoscópico.
Os dados de diâmetro em função do tempo foram utilizados para
calcular a área abaixo da curva de crescimento micelial (AACCM) empregando-
se a formula: AACCM = ∑ [ ( Y i + 1 + Y i ) / 2 ] [ X i + 1 - X i ] onde,
Yi = média do crescimento micelial (por unidade de tempo) na i - ésima
observação;
X i = tempo em (dias) na i - ésima observação e,
n = número total de observações
Realizou-se a análise de variância e compararam-se as médias pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, utilizando-se o software SAS
(SAS/STAT. 1989).
14
RESULTADOS
1. Isolamento e obtenção das culturas monoascospóricas
Foram obtidos 15 isolados monoascospóricos, sendo nove provenientes
de amostras de Santa Catarina e seis do Rio Grande do Sul (Tabela 3).
Tabela 3 – Relação dos isolados obtidos
Isolado
Identificação
Clone
Hospedeiro
Empresa
Local de coleta
Coletor
PM01
M. scytalidii
Anselmo
Rama
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM02
T. ohnowa
Anselmo
Rama
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM03
T.
pseudafricana
Anselmo
Rama
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM04
T. ohnowa
Batman
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM05
M. lateralis
Batman
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM06
T. flexuosa
Batman
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM07
T. ohnowa
Batman
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM08
T. nubilosa
Batman
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
PM09
T. nubilosa
-
E. globulus
Aracruz
Rio Grande do
Sul
Reginaldo Mafia
PM10
T. nubilosa
-
E. globulus
Aracruz
Rio Grande do
Sul
Reginaldo Mafia
PM11
T. nubilosa
-
E. globulus
Aracruz
Rio Grande do
Sul
Reginaldo Mafia
PM12
T. nubilosa
-
E. globulus
Aracruz
Rio Grande do
Sul
Reginaldo Mafia
PM13
T. nubilosa
-
E. globulus
Aracruz
Rio Grande do
Sul
Reginaldo Mafia
PM14
T. nubilosa
-
E. globulus
Aracruz
Rio Grande do
Sul
Reginaldo Mafia
PM15
T. ohnowa
Rivera
E. globulus
Klabin
Santa Catarina
Gleison dos
Santos
2. Caracterização das lesões
As amostras de folhas apresentaram lesões de tamanhos variáveis (1 x
2 a 7 x 8 mm no clone Anselmo Rama; 0,5 x 0,5 a 8 x 9 mm no clone Batman;
1 x 1 a 7 x 10 mm no clone Rivera; 2 x 2 a 7 x 9 mm no material da Aracruz),
de coloração predominantemente palha, com presença de pseudotécios nas
superfícies adaxial e abaxial das folhas, bordas irregulares ou não (Figura 1).
Cortes histológicos revelaram a presença de pseudotécios, contendo ascas
15
bitunicadas com oito ascósporos uniseptados, característica das famílias
Mycosphaerellaceae e Teratosphaeriaceae.
Figura 1 – Lesões foliares causadas por Mycosphaerella sp e Teratosphaeria sp. A) Clone
Anselmo Rama; B) Clone Batman; C) Clone Rivera; D) Material Aracruz.
3. Padrão de germinação dos ascósporos
Os padrões de germinação dos ascósporos observados (Figura 2)
foram o C, D, F, G, I, K e L (Figura 3) para T. nubilosa, T. parkii, T. africana, T.
juvenis, M. lateralis, T. flexuosa e T. suttoniae.
16
Figura 2 – Padrões de germinação dos ascósporos ejetados.A, G, H e I - padrão F, típico de
Mycosphaerella juvenis . B – padrão L, típico de Mycosphaerella suttoniae. C – padrão G, típico
de Mycosphaerella africana e padrão K, típico de Mycosphaerella flexuosa. D – padrão F e
padrão K. E – padrão D, típico de Mycosphaerella parkii. F – padrão I, típico de Mycosphaerella
lateralis.
Figura 3: Padrões de germinação observados nas culturas identificadas. Padrão D, típico de
Mycosphaerella parkii, padrão F, típico de Mycosphaerella juvenis, padrão G, típico de
Mycosphaerella africana padrão H, típico de Mycosphaerella mexicana, padrão J, típico de
Mycosphaerella colombiensis, padrão K, típico de Mycosphaerella flexuosa, padrão M, típico de
Mycosphaerella suttoniae e padrão N, típico de Mycosphaerella parva.
17
4. Análises filogenéticas
A amplificação da região ITS resultou em produtos de aproximadamente
600pb para 13 dos 15 isolados analisados. Os isolados foram alinhados com
52 sequências de quatro gêneros (Mycospharella, Teratosphaeria, Davidiella e
Dothidea), obtidas no GenBank. Dos 763 caracteres analisados, 389 foram
constantes e 285 foram de parcimônia informativa. Clados bem suportados
obtidos com valores de bootstrap significativos foram detectados para as
sequências ITS. O isolado PM01 agrupou em um clado de M. scytalidii. Os
isolados PM02, PM04, PM07 e PM15, agruparam em um clado de T. ohnowa,
PM06 agrupou com T. flexuosa, PM03 com T. pseudafricana, PM05 com M.
lateralis e os isolados PM08, PM09, PM10, PM13 e PM14 agruparam com o
isolado de T. nubilosa (Figura 4).
Os produtos amplificados com os primers LR0R/LR5, para a região LSU,
apresentaram aproximadamente 900pb para 14 dos 15 isolados testados. Os
isolados foram alinhados com 47 sequências de quatro gêneros
(Mycospharella, Teratosphaeria, Davidiella e Dothidea), obtidas no GenBank.
Dos 758 caracteres analisados, 504 foram constantes, 197 foram de
parcimônia informativa. O isolado PM01 agrupou com M. scytalidii. Os isolados
PM02, PM03, PM04, PM07 e PM15 agruparam no clado de T. ohnowa, PM06
agrupou com T. flexuosa, PM05 com M. lateralis PM08 e PM16 agruparam com
M. fijiensis, e os isolados PM09, PM10, PM11, PM12 e PM13 agruparam no
clado de T. nubilosa, cuja sequência foi obtida no GenBank (Figura 5).
Os primers específicos para T. nubilosa amplificaram fragmentos de
aproximadamente 200pb (MNF-MNR) e 400pb (MN1F-MN1R) apenas para os
isolados PM08, PM09, PM10, PM11, PM12, PM13 e PM14, o que reforça os
resultados obtidos nas análises filogenéticas para esta espécie.
18
Figura 4: Árvore gerada por análise de máxima parcimônia para região ITS.
19
Figura 5: Árvore gerada por análise de máxima parcimônia para região LSU.
20
5. Crescimento micelial e esporulação em diferentes meios de cultura
Houve interação significativa entre isolados e meios de cultura
(P<0,0001), ou seja, o crescimento micelial dos isolados variou de acordo com
o meio de cultura (Tabela 4).
Tabela 4 – Área abaixo da curva do crescimento micelial (AACCM) de isolados
de M. scytalidii, T. ohnowa, T.flexuosa, T. nubilosa
1
e T. nubilosa
2
Ensaio I
Ensaio II
M. scytalidii
T. ohnowa
T. flexuosa
T. nubilosa
1
T. nubilosa
2
T. flexuosa
94,4 A**b*
ACA
102,31 Ab
ACA
114,52 Aa
ACA
55.16 Ab
BDA
56.84 Ab
BDA
123.76 Aa
ACA
84,67 ABb
MEA
84,07 Bb
MEA
98,28 Ba
MEA
54,25 Ab
AVSA
51.59 Ab
AVSA
101.92 ABa
V8
78,26 BCb
BDA
83,72 Bb
AVSA
94,99 BCa
AVSA
47.04 Ab
MEA
50.61 ABb
MEA
101.43 ABa
AVSA
77,53 BCb
AVSA
79,56 Bb
MIC
94,50 BCa
V8
46.69 ABb
MIC
47.74 Bb
MIC
100.06 ABa
MEA
70,53 CDb
CLA
75,78 BCb
BDA
91,42 BCa
MIC
41.09 Bb
CVA
45.43 BCb
BCA
98.7 ABa
MIC
70,21 CDb
CVA
69,61 CDb
V8
87,99 DEa
BDA
37.66 BCb
V8CaCO3
45.15 BCb
CVA
93.87 Ba
BDA
69,37 CDb
MIC
65,84 DEb
CVA
84,35 Ea
V8CaCO3
37.03 BCb
V8
42.35 BCb
CLA
89.81 Ba
FEG
68,50 CDb
V8CaCO3
65,73 DEa
FEG
83,16 EFa
CVA
36.61 EFb
BCA
39.62 Cb
ACA
88.34 BCa
CVA
64,51 DEab
BCA
64,30 DEab
CLA
83,16 EFa
BDA
35.42 BCb
ACA
39.41 Cb
V8CaCO3
87.78 BCa
V8CaCO3
59,92 EDb
V8
58,98 EFb
V8CaCO3
77,98 Fa
CLA
32.83 Cb
MEG
38.92 Cb
V8
86.17 BCa
BCA
52,85 EFb
FEG
54,47 Fb
BCA
62,09 Gab
FEG
31.71 Bb
CLA
32.90 Db
FEG
83.89 BCa
CLA
42,14 Fb
MEG
53,34 Fa
MEG
47,04 Hab
MEG
30.73 Cb
FEG
31.99 Db
MEG
51.73 Da
MEG
**Médias seguidas por letras maiúsculas equivalem a comparações na vertical e * médias seguidas por letras
minúsculas equivalem a comparações na horizontal. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de significância. CV (%): 5,62 para ensaio I e 6,06 para ensaio II.
1
– isolado PM10
2
– isolado PM08
No primeiro ensaio, o meio que proporcionou maior crescimento micelial
foi o ACA para os isolados PM01, PM02 e PM06, seguido por MEA para os
isolados de PM01, PM02 e PM06 e BDA foi o terceiro melhor meio para o
isolado PM01, MIC para o isolado PM02 e AVSA para o isolado PM06. No meio
MEG o crescimento foi inferior aos demais para os isolados avaliados. Já no
segundo ensaio, os melhores meios para os isolados PM10 e PM08 foram
BDA, seguido de AVSA e MEA e para o isolado PM06 foram ACA, V8 e AVSA.
O meio FEG foi o menos eficiente para o crescimento do isolado PM10 e o
meio MEG para os isolados PM08 e PM06 (Figuras 6 e 7).
21
Nenhum dos meios testados induziu a esporulação, sob as condições de
incubação testadas.
Figura 6 – Ensaio de crescimento micelial em diferente meios de cultura. 1 – BDA; 2 – BCA; 3 –
V8; 4 – V8CaCO
3
; 5 –
MEG; 6 – FEG; 7 – ACA; 8 – AVSA; 9 – CVA; 10 – CLA; 11 – MEA e 12 – MIC. A –
Mycosphaerella scytalidii (PM01). B – Teratosphaeria ohnowa (PM02). C – Teratosphaeria flexuosa
(PM06).
Figura 7 – Ensaio de crescimento micelial em diferente meios de cultura. 1 – BDA; 2 – BCA; 3
– V8; 4 – V8CaCO
3
; 5 –
MEG; 6 – FEG; 7 – ACA; 8 – AVSA; 9 – CVA; 10 – CLA; 11 – MEA e
12 – MIC. A – Teratosphaeria nubilosa (PM10). B – Teratosphaeria nubilosa (PM08). C –
Teratosphaeria flexuosa (PM06).
22
DISCUSSÃO
As lesões em E. globulus incitadas por Mycosphaerella e Teratosphaeria
podem variar de acordo com a espécie do patógeno e hospedeiro (Hunter et al.
2004). Neste trabalho, observaram-se diferenças na forma, na coloração, no
tamanho, na quantidade e na distribuição de pseudotécios nas lesões que
podem estar relacionadas à espécie do fungo presente. Não raro, patógenos
secundários e oportunistas colonizam tecidos necróticos resultantes de
infecção de patógenos primários, injúrias por insetos ou senescência natural
das folhas (Crous et al. 2006). Acredita-se que M. marksii, M. parkii, T.
nubilosa, T. suberosa e T. suttonii sejam as espécies mais comuns no Brasil
(Alfenas et al. 2009), associadas à Eucalyptus spp. Patógenos primários como
T. nubilosa e T. cryptica colonizam o tecido foliar vivo e adquirem nutrientes de
forma hemibiotrófica (Hunter et al. 2009).
A identificação de espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria
baseada em características morfológicas é complexa. Em geral é baseada em
pequenas diferenças nas dimensões, na forma, no padrão de germinação dos
ascósporos e na associação com a espécie hospedeira (Crous, 1998). Os
padrões de germinação dos ascósporos observados, neste estudo, foram C, D,
F, G, I, K e L típicos respectivamente de T. nubilosa, T. parkii, T. africana, T.
juvenis, M. lateralis, T. flexuosa e T. suttoniae. Contudo, somente foram
isoladas as espécies T. nubilosa, T. lateralis e T. flexuosa. O padrão de
germinação parece não ser um bom critério para diferenciação de espécies,
uma vez que pode variar dependendo do meio de germinação (água ou meio
de cultura) (Crous,1998), e com o estádio fenológico da folha. Perez et al.
(2009a) ao examinarem o padrão de germinação de ascósporos de T. nubilosa
ejetados de lesões de E. globulus verificaram padrão de germinação F a partir
de folhas juvenis e intermediárias, diferentemente do observado em
ascósporos ejetados de lesões de folhas adultas. Analogamente Carnegie
(2007a), ao estudar T. nubilosa observou ascósporos germinados com
múltiplos tubos germinativos.
Neste trabalho, não foi realizado um monitoramento entre a lesão e a
espécie de Mycosphaerella e Teratosphaeria isolada, porém observou-se a
23
presença de diferentes padrões de germinação de ascósporos advindos de
uma mesma lesão. Diferentes espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria
podem ser encontradas em uma única folha e até mesmo em uma mesma
lesão (Crous & Wingfield, 1996). Mycosphaerella lateralis, M. grandis e M.
parva tem sido frequentemente associadas secundariamente a lesões
causadas por outras espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria (Milgate et
al. 2001; Crous et al. 2006)
A co-ocorrência de mais de uma espécie em uma mesma lesão, a
necessidade de empregar culturas monoascospóricas, o lento crescimento
micelial e a ausência de esporulação do fungo em cultura dificultam sua
identificação (Crous et al. 2004). Crous et al. (2006) concluiram ser impossível
identificar espécies de Mycosphaerella e Teratosphaeria de Eucalyptus sem a
utilização de análises de seqüências de DNA.
A utilização de técnicas moleculares tem contribuído para o aumento do
número de espécies descritas nos últimos anos (Silva et al. 2009). Seqüências
de nucleotídeos de DNA podem diferir entre espécies de Mycosphaerella e
Teratosphaeria e por isso tem sido amplamente utilizadas em estudos de
taxonomia e filogenia destes gêneros (White et al. 1990; Crous et al. 2001).
Crous et al. (2006) e Hunter et al. (2006), ao empregarem várias seqüências de
DNA de Mycosphaerella spp., verificaram que a região ITS oferece resolução
suficiente para distinguir espécies. No presente estudo, foram empregadas
seqüências de DNA das regiões ITS e LSU para as comparações filogenéticas
e conseqüentemente identificação dos isolados obtidos. Foram identificadas
duas espécies de Mycosphaerella e quatro de Teratosphaeria. Os isolados de
Mycosphaerella foram identificados como M. scytalidii e M. lateralis e quando
comparadas com outras seqüências, foram agrupadas em diferentes clados,
conforme foi encontrado por Crous et al. (2006). Existem três relatos de M.
scytalidii, sendo o primeiro na Colômbia e o segundo no Brasil em E. globulus
(Crous et al. 2006) e recentemente no Uruguai em E. grandis, E. dunni e E.
globulus (Pérez et al. 2009b). M. lateralis primeiramente descrito como
hiperparasita de T. nubilosa e T. cryptica (De Hoog et al. 1991; Jackson et al.
2005) teve sua patogenicidade confirmada por Jackson et al.(2005). M. lateralis
já foi relatada na Austrália, África do Sul, Zâmbia, Bolívia, Espanha, Portugal e
no Uruguai em E. grandis, E. globulus, E. saligna, E. nitens, E. maidenii e
24
híbridos de E. grandis x E. saligna (Crous, 1998; Maxwell, 1999; Crous et al.
2006; Perez et al. 2009b).
Das quatro espécies identificadas como Teratosphaeria, somente T.
nubilosa foi relatada no Brasil (Perez et al. 2009c). Teratosphaeria ohnowa foi
relatada na África do Sul e Austrália em E. grandis e no Uruguai em E. viminalis
(Crous et al, 2004; Crous et al. 2007b; Perez et al. 2009b), T. pseudafricana foi
relatada em Zâmbia em E. globulus (Crous et al. 2006) e T. flexuosa na
Colômbia em E. globulus (Crous 1998). Porém a patogenicidade de T.
pseudafricana e T. flexuosa ainda não foi comprovada.
Dentre as espécies identificadas neste estudo, T. nubilosa é a mais
importante por incitar intensa desfolha em Eucalyptus globulus em vários
países. Recentemente foi identificada em plantios de E. globulus e E. dunnii no
Uruguai e E. globulus no Brasil (Perez et al. 2009c). Neste estudo, T. nubilosa
foi constatada no Rio Grande do Sul e em Santa Catarina, onde tem causado
intensa desfolha em E. globulus.
Em um estudo de genética de população no Uruguai, Perez et al.
(2009a) encontraram um único haplótipo do patógeno idêntico ao haplotipo
encontrado na Espanha e em Portugal, onde a população de T. nubilosa é
também monoclonal (Hunter et al, 2008). Os autores sugeriram que o patógeno
foi introduzido no Uruguai a partir material vegetativo desses países. É possível
que este patógeno tenha sido introduzido no Brasil a partir do Uruguai em
virtude da proximidade das áreas de plantio e intercambio de material genético
entre os dois países.
O plantio de materiais resistentes é a única estratégia de controle da
doença (Alfenas et al. 2009). Recentes estudos têm mostrado a existência de
variabilidade genética para resistência à mancha foliar e desfolha em E.
globulus, causadas por Mycosphaerella spp. e Teratosphaeria spp., tornando a
resistência genética um método factível no controle da doença (Freeman,
2008).
Para a seleção de materiais resistentes a partir de inoculação sob
condições controladas é fundamental desenvolver métodos de produção
massal e esporulação do patógeno em cultura bem como estabelecer
protocolos de inoculação e quantificação da doença. Neste estudo,
compararam-se meios de cultura para o crescimento e esporulação do fungo,
25
uma vez que a composição do meio determina a quantidade e qualidade do
crescimento micelial e esporulação (Dhingra & Sinclair, 1995). Espécies de
Mycosphaerella e Teratosphaeria apresentam crescimento lento e geralmente
não esporulam em meios de cultura (Crous, 1998). Neste estudo nenhum dos
meios testados proporcionou esporulação dos fungos testados, entretanto os
meios ACA e MEA proporcionaram melhores taxas de crescimento para T.
nubilosa, T. flexuosa, T. pseudafricana e M. scytalidii, enquanto V8-ágar foi
eficiente apenas para T. flexuosa. Os meios MEA, BDA e AVSA são
comumente utilizados em estudos com espécies de Mycosphaerella e
Teratosphaeria (Crous et al. 2009a). Neste estudo esses meios estão entre os
melhores para crescimento micelial, porém não induziram esporulação das
espécies testadas. Estes resultados dão suporte a estudos futuros para a
produção massal de inóculo.
Neste trabalho foram encontradas seis espécies de Mycosphaerella e
Teratosphaeria em apenas quatro materiais de E. globulus, o que sugere que
podem existir muitas outras espécies associadas a Eucalyptus no Brasil.
Comparação de seqüências de DNA baseada em múltiplos genes deve ser
realizada para o levantamento das espécies que ocorrem no Brasil. Além
disso, são necessários estudos sobre a patogenicidade dessas espécies em
Eucalyptus, visto que muitos autores focam apenas na identificação e
descrição de novas espécies.
26
CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo permitiram concluir que:
Mais de uma espécie de Mycosphaerella e/ou Teratosphaeria está
associada à mancha foliar e desfolha de E. globulus no Brasil.
Diferentes espécies podem co-ocorrer em uma mesma folha ou lesão.
As espécies T. pseudafricana, T. flexuosa, T. ohnowa e M. lateralis
foram identificadas pela primeira vez no Brasil.
Os meios ACA, MEA, BDA, MIC e AVSA foram os mais favoráveis para
o crescimento micelial de M. scytalidii, T. ohnowa e T. flexuosa.
Teratosphaeria nubilosa apresentou melhor crescimento nos meios BDA,
seguido de AVSA e MEA.
Nenhum dos meios de cultura testados propiciou a esporulação das
espécies testadas.
27
REFERÊNCIAS
Alfenas AC, Zauza EAV, Mafia RG, Assis, TF. 2009. Clonagem e doenças do
eucalipto. 2ª edição. Viçosa, MG, Brasil: Editora UFV, 500p.
Carnegie AJ, Burgess T, Beilharz V, Wingfield MJ. 2007. New species of
Mycosphaerella from Myrtaceae in plantations and native forests in
eastern Australia. Mycologia 99: 461-74.
Carnegie, AJ. 2007. Forest health in New South Wales, Australia, 1996–2005.
II. Fungal damage recorded in eucalypt plantations during forest health
surveys and their management. Australasian Plant Pathology 36: 225-
239.
Cheewangkoon R, Crous PW, Hyde KD, Groenewald JZ, To-anan C. 2008.
Species of Mycosphaerella and related anamorphs on Eucalyptus leaves
from Thailand. Persoonia 21: 77-91.
Crous PW. 1998. Mycosphaerella spp. and their anamorphs associated with
leaf spot diseases of Eucalyptus. Mycologia Memoir 21: 1-170.
Crous PW, Braun U, Groenewald JZ. 2007a. Mycosphaerella is polyphyletic.
Studies in Mycology 58: 1-32.
Crous PW, Groenewald JZ, Mansilla JP, Hunter GC, Wingfield MJ. 2004.
Phylogenetic reassessment of Mycosphaerella spp. and their anamorphs
occurring on Eucalyptus. Studies in Mycology 50: 195-214.
Crous PW, Groenewald JZ, Summerell BA, Wingfield BD, Wingfield MJ. 2009c
Co-occurring species of Teratosphaeria on Eucalyptus. Persoonia 22:
38-48.
Crous PW, Hong L, Wingfield BD, Wingfield MJ. 2001. ITS rDNA phylogeny of
selected Mycosphaerella species and their anamorphs occurring on
Myrtaceae. Mycological Research 105: 425-431.
28
Crous PW, Summerell BA, Carnegie AJ, Mohammed C, Himaman W,
Groenewald JZ. 2007b. Foliicolous Mycosphaerella spp. and their
anamorphs on Corymbia and Eucalyptus. Fungal Diversity 26: 143-185.
Crous PW, Schoch CL, Hyde KD, Wood AR, Gueidan C, de Hoog GS,
Groenewald JZ. 2009d. Phylogenetic lineages in the Capnodiales.
Studies in Mycology 64: 17-47S7.
Crous PW, Summerell BA, Carnegie AJ, Wingfield MJ, Hunter GC, Burgess TI,
Andjic V, Barber PA, Groenewald JZ. 2009e. Unravelling
Mycosphaerella: do you believe in genera? Persoonia 23: 99-118.
Crous PW, Summerell BA, Carnegie AJ, Wingfield MJ, Groenewald JZ. 2009a.
Novel species of Mycosphaerellaceae and Teratosphaeriaceae.
Persoonia 23: 119-146.
Crous PW, Summerell BA, Mostert L, Groenewald JZ. 2008. Host specificity
and speciation of Mycosphaerella and Teratosphaeria species
associated with leaf spots of Proteaceae. Persoonia 20: 59-86.
Crous PW, Wingfield, MJ. 1996. Species of Mycosphaerella and their
anamorphs associated with leaf blotch disease of Eucalyptus in South
Africa. Mycologia 88: 441-458. 1996.
Crous PW, Wingfield MJ, Groenewald,J.Z. 2009b. Niche sharing reflects a
poorly understood biodiversity phenomenon. Persoonia 22: 83-94.
Crous PW, Wingfield MJ, Mansilha JP, Alfenas AC, Groenewald JZ. 2006.
Phylogenetic reassessment of Mycosphaerella spp. and their anamorphs
occurring on Eucalyptus. II. Studies in Mycology 55: 99-131.
Dhingra OD, Sinclair JB. 1995. Basic Plant Pathology Methods. Florida: CRC
Press. 91-97.
Eldridge KG, Davidson J, Harwood CE, van Wyk, G. 1993. Eucalypt
domestication and breeding. Clarendon Press; Oxford University Press,
Oxford : New York ; Melbourne.
29
Fonsceca
SM, Resende MDV, Alfenas AC, Guimarães LMS, Assis TF,
Grattapaglia D. 2010. Manual prático de melhoramento genético do
eucalipto. Viçosa, MG, Brasil: Editora UFV, 200p.
Freeman JS, Potts BM, Vaillancourt RE. 2008. Few Mendelian genes underlie
the quantitative response of a forest tree, Eucalyptus globulus, to a
natural fungal epidemic. Genetics 178: 563-571.
Gezahgne A, Roux J, Hunter GC. 2006. Mycosphaerella species associated
with leaf disease of Eucalyptus globulus in Ethiopia. Forest Pathology 36:
253-263.
Guindon S, Gascuel O. 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate
large phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology 52: 696-
704.
Hoog GS de, Hijwegen T, Batenburg-van der Vegte WH. 1991. A new species
of Dissoconium. Mycological Research 95: 679-682.
Hunter GC, Crous PW, Carnegie AJ, Wingfield MJ. 2009.Teratosphaeria
nubilosa, a serious leaf disease pathogen of Eucalyptus spp. in native
and introduced areas. Molecular Plant Pathology 10: 1-14.
Hunter GC, van der Merwe NA, Burgess TI, Carnegie A J, Wingfield BD, Crous
PW, Wingfield MJ. 2008. Global movement and population biology of
Mycosphaerella nubilosa infecting leaves of cold-tolerant Eucalyptus
globulus and E. nitens. Plant Pathology 57: 235-242.
Hunter GC, Wingfield BD, Crous PW, Wingfield MJ. 2006. A multi-gene
phylogeny for species of Mycosphaerella occurring on Eucalyptus leaves.
Studies in Mycology 55: 147-161.
Hunter GC, Roux J, Wingfield MJ, Wingfield BD, Crous PW. 2004.
Mycosphaerella species causing Mycosphaerella leaf disease (MLD) on
eucalypts in South African Eucalyptus plantations. Mycological Research
108:672-681.
30
Jacobs KA, Rehner SA. 1998. Comparison of cultural and morphological and
ITS sequences in Botryosphaeria and related taxa. Mycologia 90: 601-
610.
Jackson SL, Maxwell A, Neumeister-Kemp HG, Dell B, Hardy GE St J. 2005.
Infection, hyperparasitism and conidiogenesis of Mycosphaerella lateralis
on Eucalyptus in Western Australia. Australasian Plant Pathology 33: 49-
53.
Kimura M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rate of base
substitution through comparative studies of nucleotide sequences.
Journal of Molecular Evolution 16: 111-112.
Kurose D, Evans HC, Djeddour DH., Cannon PF, Furuya N, Tsuchiya K. 2009.
Systematics of Mycosphaerella species associated with the invasive
weed Fallopia japonica, including the potential biological control agent M.
polygoni-cuspidati. Mycoscience 50: 179-189.
Lumbsch HT, Lindemuth R. 2001. Major lineages of Dothideomycetes
(Ascomycota) inferred from SSU and LSU rDNA sequences. Mycological
Research 105: 901-908.
Maxwell A, Hardy GE St J, Wingfield MJ, Dell B. 2000. First record of
Mycosphaerella lateralis on Eucalyptus in Australia. Australasian Plant
Pathology 29: 279.
Milgate AW, Yuan ZQ, Vaillancourt RE, Mohammed C. 2001.Mycosphaerella
species occurring on Eucalyptus globulus and Eucalyptus nitens
plantations of Tasmania, Australia. Forest Pathology 31: 53-63.
NCBI – www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank
Nylander JAA. 2004. MrModeltest v2. Program distributed by the author.
Evolutionary Biology Centre, Uppsala University.
Park RF, Keane PJ. 1984. Further Mycosphaerella species causing leaf
diseases of Eucalyptus. Transactions of the British Mycological Society
83 93-105.
31
Park RF, Keane PJ. 1987. Spore production by Mycosphaerella species
causing leaf diseases of Eucalyptus. Transactions of the British
Mycological Society 89 461-470.
Park RF, Keane PJ. 1982. Three Mycosphaerella species from leaf disease of
Eucalyptus. Transactions of the British Mycological Society 79: 95-100.
Pereira JM, Barreto RW, Ellison CA, Maffia LA. 2003. Corynespora cassiicola f.
sp lantanae: a potential biocontrol agent from Brazil for Lantana camara.
Biological Control 26: 21-31.
Pérez CA, Wingfield MJ, Altier NA, Blachette RA. 2009b. Mycosphaerella and
Teratosphaeria associated with Eucalyptus leaf diseases and stem
cankers in Uruguai. Forest Pathology 39: 349-360.
Pérez G, Hunter GC, Slippers G, Pérez C, Wingfield BD, Wingfield MJ. 2009a.
Teratosphaeria (Mycosphaerella) nubilosa, the causal agent of
Mycosphaerella Leaf Disease (MLD), recently introduced into Uruguay.
European Journal of Plant Pathology 125: 109-118.
Pérez G, Slippers B, Wingfield BD, Finkenauer E, Wingfield MJ. 2009c.
Mycosphaerella leaf disease (MLD) outbreak on Eucalyptus globulus in
Brazil caused by Teratosphaeria (Mycosphaerella) nubilosa.
Phytopathology Mediterranea 48: 302-306.
Pinkard EA, Mohammed CL. 2006. Photosynthesis of Eucalyptus globulus with
Mycosphaerella leaf disease. New Phytologist 170: 119-27.
Reeb V, Lutzoni F, Roux C. 2004. Contribution of RPB2 to multilocus
phylogenetic studies of the euascomycetes (Pezizomycotina, Fungi) with
special emphasis on the lichen-forming Acarosporaceae and evolution of
polyspory. Molecular Phylogenetics and Evolution 32: 1036-1060.
Ronquist F, Huelsenbeck JP. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic
inference under mixed models. Bioinformatics 19: 1572-1574.
Schubert K, Groenewald JZ, Braun U, Dijksterhuis J, Starink M, Hill CF, Zalar P,
de Hoog GS, Crous PW. 2007. Biodiversity in the Cladosporium
32
herbarum complex (Davidiellaceae,Capnodiales), with standardisation of
methods for Cladosporium taxonomy and diagnostics. Studies in
Mycology 58: 105-156.
Shoemaker RA, Hambleton S. 2005. Dothidea sambuci and Diaporthe
spiculosa. Canadian Journal of Botany 83: 484-490.
Silva M, Machado H, Phillips AJL. 2009. Mycosphaerella species occurring on
Eucalyptus globulus in Portugal. European Journal Plant Pathology 125:
425-433.
Simon UK, Weiss M. 2008. Intragenomic variation of fungal ribosomal genes is
higher than previously thought. Molecular Biology and Evolution 25:
2251-2254.
Swofford DL. 2002. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and
Other Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland,
Massachusetts.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: molecular evolutionary
genetic analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and
Evolution 24: 1596-1599.
Taylor JE, Groenewald,JZ, Crous PW. 2003. A phylogenetic analysis of
Mycosphaerellaceae leaf spot pathogens of Proteaceae. Mycological
Research 107: 653-658.
Verkley GJM, Starink-Willemse M, van Iperen A, Abeln ECA. 2004.
Phylogenetic analyses of Septoria species based on the ITS and LSU-D2
regions of nuclear ribosomal DNA Mycologia 96: 558-57.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing
of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand
DH, Sninsky JJ, White TJ (eds), PCR Protocols: a Guide to Methods and
Applications: 315-322. Academic Press, San Diego, California, USA.
33
APÊNDICES
34
Apêndice 1: Árvore gerada por análise de neighbor-joining para região ITS.
35
Apêndice 2: Árvore gerada por análise de neighbor-joining para região LSU.
36
Apêndice 3: Árvore gerada por análise de máxima verossimilhança para região ITS.
37
Apêndice 4: Árvore gerada por análise de máxima verossimilhança para região LSU.
38
Apêndice 5: Árvore gerada por análise de inferência bayesiana para região ITS.
39
Apêndice 6: Árvore gerada por análise de inferência bayesiana para região LSU.
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