( PDF ) Associação de marcadores rapd a locos de resistência em feijoeiro a Colletotrichum lindemuthianum

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RAFAELI RAMOS DE MOURA

ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES RAPD A LOCOS

DE RESISTÊNCIA DE FEIJOEIRO A Colletotrichum

lindemuthianum.

CAMPINAS

ESTADO DE SÃO PAULO

2005

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RAFAELI RAMOS DE MOURA

ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES RAPD A LOCOS

DE RESISTÊNCIA DE FEIJOEIRO A Colletotrichum

lindemuthianum.

Dissertação apresentada à comissão de Pós-

graduação do Instituto Agronômico- IAC, na

área de concentração de Melhoramento

Genético Vegetal, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre.

Orientador: Dr. Carlos Augusto Colombo

Co-0rientador: Dr. Sérgio Augusto Morais

Carbonell.

CAMPINAS

ESTADO DE SÃO PAULO

2005

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RAFAELI RAMOS DE MOURA

ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES RAPD A LOCOS

DE RESISTÊNCIA DE FEIJOEIRO A Colletotrichum

lindemuthianum.

Dissertação apresentada à comissão de Pós-

graduação do Instituto Agronômico- IAC, na

área de concentração de Melhoramento

Genético Vegetal, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre.

COMISSÃO EXAMINADORA

_________________________________________

Dr. Carlos Augusto Colombo

Instituto Agronômico- IAC

_________________________________________

Dra. Margarida Fumiko Ito

Instituto Agronômico- IAC

_________________________________________

Dr. Antonio Carlos Maringoni

Universidade Estadual Paulista- UNESP

Campinas, ___ de__________ de 2005.

Ficha elaborada pela Bibliotecária do Núcleo de Informação e

Documentação - Instituto Agronômico de Campinas

Vangri de Oliveira Camargo

M866a Moura, Rafaeli Ramos de

Associação de marcadores RAPD a locos de resistência

em feijoeiro a Colletotrichum lindemuthianum /, Rafaeli

Ramos Moura. Campinas: Instituto Agronômico, 2005.

94 fls. : il.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Colombo

Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Augusto Moraes

Carbonell

Dissertação (Mestrado em Melhoramento Genético

Vegetal) – Instituto Agronômico de Campinas

1. Colletotrichum lindemuthianum. 2. Antracnose.

3. Phaseolus vulgaris. 4. Feijão. 5. Seleção assistida.

I.Colombo, Carlos Augusto. II. Carbonell, Sérgio Augusto

Moraes. III. Instituto Agronômico de Campinas. IV. Título

CDD – 589.243

Aos meus pais que sempre investiram e contribuíram decisivamente para minha

formação científica deixando, muitas vezes, de lado seus sonhos para que eu

realizasse os meus.

DEDICO

AGRADECIMENTOS

Ao meu pai Eli, minha mãe Eunice e meus irmãos Rimena e Frederico pelo apoio e pela

confiança que depositaram em mim nas horas mais difíceis, mesmo que distantes,

mostrando-me a minha capacidade de superar os desafios.

Às preciosas pessoas que estiveram ao meu lado e puderam comigo, dividir muitos intensos

momentos, que serão lembrados com muito carinho por toda a minha vida: Camila (Camis),

Marília (Maroca) e Tiago (Cabeção) e ao meu amigo Gilvan (Buba), que apesar de distante,

está aqui bem pertinho no meu coração.

Ao Prof. e orientador Dr. Carlos, à Dra Margarida e ao Dr. Sérgio por compartilharem seus

conhecimentos e experiências profissionais, que me foram fundamentais para a realização

deste estudo.

A todos os amigos do curso de mestrado pelos muitos bons momentos que passamos juntos

e pela força que me deram direta e indiretamente para a realização e finalização deste curso.

Ao pessoal dos laboratórios do IAC que sempre estiveram prontos a me ajudar nos mais

diversos problemas que surgiram no decorrer de todo o trabalho e também pela agradável

companhia nos períodos de folga entre uma reação e outra: Paula, Guilherme, Renata,

Áurea, Luciana, Regina, Milene, Roselaine, Natalie e à Marília e ao Alisson que, além da

fundamental participação para a realização desse estudo, são uns amigos muito estimados.

À Coordenadoria do curso de Pós-graduação, pela oportunidade da realização deste

Mestrado e por colocar à disposição dos alunos, profissionais altamente qualificados que

contribuíram para a nossa formação de opinião científica.

“A vontade é um forte elemento na

conquista de uma vida vitoriosa. Ter

vontade é ter iniciativa e poder para

agir após feita a escolha. É discernir o

momento certo de parar e o instante

adequado para avançar”

Tito Oscar

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................... v

LISTA DE TABELAS.......................................................................................................... viii

RESUMO.............................................................................................................................. ix

ABSTRACT......................................................................................................................... x

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................ 01

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................... 04

2.1. Características Gerais do Feijoeiro Comum (Phaseolus vulgaris L.) .......................... 04

2.2. Importância Econômica................................................................................................. 05

2.3. Antracnose..................................................................................................................... 06

2.3.1. Colletotrichum lindemuthianum e raças fisiológicas.................................................. 07

2.3.2. Fontes de resistência a Colletotrichum lindemuthianum............................................ 12

2.4. Seleção Assistida no Melhoramento Genético Vegetal................................................. 16

2.4.1. Marcadores moleculares RAPD (Random amplified polymorphic DNA)................. 16

3. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................. 26

3.1. Avaliação dos genótipos de feijoeiro quanto à resistência às três raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum...........................................................................................

3.1.1. Germoplasma de Feijão.............................................................................................. 26

3.1.2. Obtenção das Raças de Colletotrichum lindemuthianum........................................... 26

3.1.3. Avaliação dos sintomas da antracnose....................................................................... 30

3.2. Marcadores RAPD ligados aos alelos de resistência em feijoeiro às raças de

Colletotrichum lindemuthianum...........................................................................................

3.2.1. Extração de DNA das amostras de Phaseolus vulgaris.............................................. 31

3.2.2. Marcador molecular: RAPD....................................................................................... 32

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 35

4.1. Avaliação dos Genótipos de Feijoeiro quanto à Resistência às Raças 32, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum ..........................................................................................

4.2. Co-evolução entre Phaseolus vulgaris e Colletotrichum lindemuthianum .................. 38

4.3. Associação dos Marcadores RAPD aos Alelos de Resistência às Raças do Patógeno. 41

4.3.1. Gene Co-1................................................................................................................. 43

4.3.2. Gene Co-2................................................................................................................... 45

4.3.3. Gene Co-4................................................................................................................... 49

4.3.3.1. Gene Co-4

............................................................................................................... 56

4.3.4. Gene Co-5................................................................................................................... 59

4.3.5. Gene Co-6................................................................................................................... 61

4.4. Considerações Gerais..................................................................................................... 68

5. CONCLUSÕES................................................................................................................ 74

6. PERSPECTIVAS.............................................................................................................. 76

7. REFERÊNCIAS............................................................................................................... 78

APÊNDICE........................................................................................................................... 90

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Resposta diferenciada dos genótipos à infecção das três raças de

Colletotricum lindemuthianum: 31, 65 e 89........................................................................

Figura 2 - Resposta de acessos de feijoeiro à infecção das três raças de

Colletotrichum lindemuthianum e classificados segundo sua origem

em mesoamericanos, andinos, geneticamente melhorados e desconhecidos.......................

Figura 3 - Análise eletroforética do marcador F10 .............................................................. 43

Figura 4 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador F10

(530)

(Operon Technologies)....................................

Figura 5 - Perfil de amplificação do marcador Q4 e H20..................................................... 47

Figura 6 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador Q4

(1440)

(Operon Technologies)....................................

Figura 7 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador H20

(450)

(Operon Technologies)...................................

Figura 8 - Perfil de amplificação dos marcadores C8_900, B3_1800 e Y20_830............... 50

Figura 9 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador Y20

(830)

(Operon Technologies)...................................

Figura 10 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador B3

(1800)

(Operon Technologies)....................................

Figura 11 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador C8

(900)

(Operon Technologies)......................................

Figura 12 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador J1

(1380)

(Operon Technologies).....................................

Figura 13 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador I16

(850)

(Operon Technologies).....................................

Figura 14 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador A18

(830)

(Operon Technologies)...................................

Figura 15 - Perfil de amplificação dos marcadores AL9

(740)

, AS13

(950)

e L4

(1000)

nas cultivares G2333, TO, WIDUSA e PI 207.26.................................................

Figura 16 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador AL9

(740)

(Operon Technologies)...................................

Figura 17 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador AS13

(950)

(Operon Technologies).................................

Figura 18 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador L4

(1000)

(Operon Technologies).....................................

Figura 19 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador H18

(1100)

(Operon Technologies)..................................

Figura 20 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador AB3

(450)

(Operon Technologies)...................................

Figura 21 - Amplificação dos marcadores Z9

(950)

, Z4

(560)

, AH1

(780)

e AZ20

(940)

.................. 63

Figura 22 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador AK20

(890)

(Operon Technologies).................................

Figura 23 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador AZ20

(940)

(Operon Technologies).................................

Figura 24 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador AH1

(780)

(Operon Technologies)...................................

Figura 25 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador Z4

(560)

(Operon Technologies)......................................

Figura 26 - Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas

raças 31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram

amplificações RAPD do marcador Z9

(950)

(Operon Technologies)......................................

Figura 27 - Amplificação do marcador F10

(530)

associadas à co-evolução

entre Phaseolus vulgaris e Colletotrichum lindemuthianum................................................

Figura 28 - Amplificação do marcador Q4

(1440)

associadas à co-evolução

entre Phaseolus vulgaris e Colletotrichum lindemuthianum................................................

Figura 29 - Amplificação do marcador H20

(450)

associadas à co-evolução

entre Phaseolus vulgaris e Colletotrichum lindemuthianum................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação de raça fisiológica em função da resposta

ao patógeno das doze variedades diferenciadoras do feijoeiro.............................................

Tabela 2 - Principais genes responsáveis por conferir resistência a Colletotrichum

lindemuthianum....................................................................................................................

Tabela 3 - Fontes de resistência às raças de Colletotrichum. lindemuthianum.................... 15

Tabela 4 - Principais genes de resistência a Colletotrichum lindemuthianum, associados

aos marcadores moleculares RAPDs....................................................................................

Tabela 5 - Acessos de feijão do Banco Ativo de Germoplasma (BAG)-IAC

com potencial agronômico para as condições edafoclimáticas do Estado de São Paulo

com ampla e diferenciada reação ao Colletotrichum lindemuthianum....................................

Tabela 6 - Marcadores RAPD ligados a genes de resistência a Colletotrichum

lindemuthianum em feijoeiro indicando se estão em repulsão ou associação, a distância

do gene e em que genótipos se encontram............................................................................

Tabela 7 - Reação dos genótipos de feijoeiro inoculados com as raças 31, 65 e 89

de Colletotrichum lindemuthianum e classificação em resistentes e suscetíveis.................

Tabela 8 - Associação da orientação do marcador RAPD ao fenótipo de cada acesso de

feijoeiro pela infecção de Colletotrichum lindemuthianum o patógeno ..............................

Tabela 9 - Número de acessos de feijoeiro do BAG-IAC, que amplificaram os

marcadores ligados a genes de resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum...........................................................................................

Tabela 10 - Acessos de feijoeiro com possíveis genes de resistência às raças 31, 65 e 89

de Colletotrichum lindemuthianum......................................................................................

MOURA, RAFAELI RAMOS. Associação de marcadores RAPD a locos de feijoeiro a

Colletotrichum lindemuthianum. 2005, 94f. Dissertação (Mestrado em Melhoramento

Vegetal)- Pós Graduação - IAC.

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a associação de locos de resistência às raças

31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum de 248 acessos de feijoeiro, de interesse

agronômico, a marcadores moleculares RAPD ligados aos genes de resistência Co-1, Co-2,

Co-4, Co-4

, Co-5 e Co-6. Os marcadores foram gerados por 19 primers RAPD, cuja

amplificação de fragmentos, de tamanho específico esperado, indicava a presença ou

ausência do gene de resistência no acesso estudado. Os resultados desse estudo indicaram o

gene Co-6 como o mais freqüente no germoplasma analisado, identificado pelos

marcadores AZ20

(940)

, AH1

(780)

, AK20

(890)

, Z9

(950)

e Z4

(560)

, seguido dos genes Co-5

(AB3

(450)

), Co-1 (F10

(530)

), Co-4 (Y20

(830)

, C8

(900)

, B3

(1800)

, J1

(1380)

, I16

(850)

e A18

(830)

), Co-

(H18

(830)

, AS13

(950)

, AL9

(740)

) e, por último, Co-2, identificado pelos marcadores Q4

(1440)

e H20

(450)

. Os seguintes genótipos e respectivos genes de resistência C. lindemuthianum

antracnose foram selecionados para serem empregados na recombinação de linhagens para

fins de melhoramento: Durango-222 (Co-1, Co-4, Co-4

e Co-5), G5207 (Co-1, Co-4, Co-5

e Co-6), CF- 840743 (Co-3, Co-4

e Co-6) e D. Calima (Co-4, Co-5 e Co-6). Alguns

acessos resistentes às raças inoculadas, que não apresentaram nenhuma das marcas RAPD

testadas, podem indicar a ação de novas fontes ou fatores complementares de resistência à

doença e, portanto, merecem a atenção para estudos futuros. Os resultados obtidos no

presente estudo são preliminares e representam o início da aplicação da seleção assistida

para seleção de linhagens de feijoeiro resistentes à antracnose no programa de

melhoramento genético do feijoeiro no IAC.

Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum, antracnose, Phaseolus vulgaris, feijão,

seleção assistida.

MOURA, RAFAELI RAMOS. Association of molecular markers RAPD with locus of

anthracnose resistence of the common bean to Colletotrichum lindemuthianum. 2005. 94f.

Dissertação (Mestrado em Melhoramento Vegetal)- Pós Graduação - IAC.

ABSTRACT

This work was carried out in order to evaluate the association to three races 31, 65 and 89

Colletotrichum lindemuthianum resistance loci of 248 beans, genotypes with agronomic,

interest and RAPD markers linked to resistance genes Co-1, Co-2, Co-4, Co-4

, Co-5 and

Co-6. The markers were obtained by 19 primers RAPD, whose specific fragments,

indicated the presence or absence of the resistance gene in the studied genotype. The results

of this study have shown that the gene Co-6 was the most frequent in the sample identified

by the markers (AZ20

(940)

, AH1

(780)

, AK20

(890)

, Z9

(950)

and Z4

(560)

), and Co-5 (AB3

(450)

Co-1 (F10

(530)

), Co-4 (Y20

(830)

, C8

(900)

, B3

(1800)

, J1

(1380)

, I16

(850)

and A18

(830)

), Co-4

(H18

(830)

, AS13

(950)

, AL9

(740)

) and Co-2, by Q4

(1440)

e H20

(450)

. The following genotypes

and respectives C. lindemuthianum resistance genes were selected with the objective of

being used in breeding programs: Durango-222 (Co-1, Co-4, Co-4

and Co-5), G5207 (Co-

1, Co-4, Co-5 and Co-6), CF- 840743 (Co-3, Co-4

and Co-6) and D. Calima (Co-4, Co-5

and Co-6). Some resistent genotype to the inoculated races that didn t show any marks of

tested, RAPD may indicate the action of new sources and complementary disease resistance

factors and, therefore, may be used in further studies. The results obtained are preliminaries

and represents the beguining of assisted selection aplication in the breeding program of

common bean at IAC.

KEY-WORDS

Colletotrichum lindemuthianum, anthracnosis, Phaseolus vulgaris, common

bean, assisted selection.

1. INTRODUÇÃO

O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é uma planta da família das leguminosas com

valor protéico de cerca de 22% (VIEIRA, 1999), sendo considerado um alimento básico de

grande parte da população americana, especialmente na América Latina e alguns países

africanos (CIAT, 1990).

O Brasil é o maior produtor mundial de feijão, em que é consumido e produzido

praticamente em todos os seus Estados (VOYSEST, 1983; SANDERS & SCHWARTZ,

1999). No entanto, a produtividade média é considerada baixa, em torno de 700 Kg/ha,

quando comparada ao potencial genético apresentado por algumas cultivares melhoradas,

que podem chegar a 4.000Kg /ha. O baixo nível de produção é devido a vários fatores,

dentre os quais, encontra-se a elevada incidência de doenças na cultura.

Existem mais de 200 doenças que afetam a cultura do feijoeiro (BIANCHINI et al.,

1989) e dentre elas, a antracnose, causada por Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. &

Magn.) Scribner, tem-se constituído numa das mais importante pela sua ocorrência, em

várias regiões nas três épocas de cultivo do feijoeiro; das águas com plantios em agosto-

setembro, da seca em janeiro-fevereiro e de inverno em maio-junho e pelo fato de que o

patógeno possui elevada variabilidade patogênica. Essa variabilidade pode dificultar a

obtenção de uma cultivar com ampla resistência ás raças do fungo nos programas de

melhoramento genético (TALAMINI et al., 2002).

Dessa maneira, é necessário monitorar as raças de C. lindemuthianum,

principalmente nas regiões que propiciem maior desenvolvimento da doença, para se

conhecer melhor a dinâmica do patógeno e sua interação com os genes de feijoeiro que

proporcionem resistência a essas raças.

Neste sentido, a existência de muitos genes específicos na planta hospedeira

responsáveis por conferir resistência às muitas raças fisiológicas do patógeno possibilita

aumentar a vida útil das cultivares, através da incorporação de alelos dos genes de

resistência em uma mesma cultivar (PEDERSEN, 1988; MIKLAS et al., 1996).

Nos programas de melhoramento vegetal, os marcadores moleculares têm sido

amplamente utilizados como ferramentas para auxiliar o processo de introgressão de genes

específicos, no entendimento das relações alélicas entre as fontes de resistência e para

caracterização do germoplasma, visando a conservação dos recursos genéticos ex situ, de

forma a preservar a máxima variabilidade genética, possível de interesse.

Os marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), estreitamente

ligados aos genes de resistência, têm sido usados na seleção de caracteres complexos e na

piramidação de genes numa mesma cultivar, constituindo-se numa eficiente estratégia para

a seleção de plantas, portadoras de alelos de resistência de um ou mais genes, independente

da condição ambiental para expressão do caráter em estudo (FERREIRA &

GRATTAPAGLIA, 1998).

A técnica RAPD é muito utilizada em estudos de genética de plantas pois sua

aplicação é bastante simples e rápida se comparada a outras técnicas de marcadores

moleculares e possui a vantagem de se estudar muitos indivíduos em pequeno espaço de

tempo, com pouca mão-de-obra e recursos limitados.

No caso específico da antracnose, muitos autores marcaram os genes de resistência

através da ligação dos mesmos com marcadores RAPD. Diante disso e visando auxiliar as

seleções finais de plantas resistentes a C. lindemuthianum e oferecer subsídios à introdução

da seleção assistida por marcadores moleculares no programa de melhoramento genético do

feijoeiro do Instituto Agronômico-Campinas (IAC), o presente estudo teve como objetivos:

a) A partir de marcadores RAPD previamente conhecidos e relacionados a locos de

resistência à antracnose, verificar a presença dos mesmos em germoplasma de feijoeiro

do IAC submetidos à infecção pelas raças fisiológicas 31, 65 e 89 de C. lindemuthianum.

b) Oferecer subsídios para iniciar estudos de seleção assistida por marcadores para a

resistência a C. lindemuthianum, e;

c) Organizar as informações existentes e realizar caracterização complementar dos acessos

do banco de germoplasma de feijoeiro do IAC, por marcadores RAPDs.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Características Gerais do Feijoeiro Comum (Phaseolus vulgaris L.)

O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é uma espécie diplóide com 22 cromossomos,

pertencente à ordem Rosales e à família Leguminoseae. É uma planta herbácea de hábito de

crescimento determinado (ereto, terminando em inflorescência) ou indeterminado (nunca

termina em inflorescência). A sua reprodução é por autofecundação, devido ao mecanismo

de cleistogamia, com apenas 5% de fecundação cruzada (CIAT, 1974).

Com base em estudos de padrões eletroforéticos da faseolina, proteína de reserva

das sementes, Gepts (1984) propôs três centros de origem e domesticação para a espécie:

Mesoamericano e Andino, este subdividindo-se em sul e norte.

Os feijoeiros pertencentes ao grupo Mesoamericano estendem-se desde o sudeste de

Estados Unidos até o Panamá, tendo como principais zonas o México e a Guatemala,

possuindo sementes pequenas e faseolina do tipo S. Os Andinos se dividem em sul dos

Andes, região que abrange desde o norte do Peru até as províncias do noroeste da

Argentina; e o norte dos Andes, que abrange desde a Colômbia e a Venezuela, até o norte

do Peru sendo, portanto, preconizado como duas áreas de domesticação. O feijoeiro

originado nestas regiões possui sementes maiores e com faseolina tipos T, C, H e A.

Ao Brasil provavelmente o feijoeiro veio por pelo menos duas rotas distintas, de

acordo com Gepts (1988), pois há a ocorrência tanto de feijões pequenos como grandes. Da

América Central foram introduzidos feijões pequenos, pretos, marrons-claros e mulatinhos

(GEPTS & BLISS, 1986) e, dos Andes, feijões grandes de tipos variados como Jalo,

Pintado e outros.

2.2. Importância Econômica do feijoeiro

Em termos de importância econômica, o feijoeiro comum corresponde a 95% dos

feijões cultivados no mundo (MARIOT, 1989). A sua produção no Brasil tem-se mantido

ao redor de três milhões de toneladas anuais, podendo ocupar uma área aproximada de

2.125 Km

, se considerada a produção simultânea e distribuição imediata (BULISANI,

2003). Apesar disso, é uma planta geneticamente pouco estudada, quando comparada a

outras culturas como o milho, ervilha ou tomate (NODARI et al., 1992).

Apesar da grande área de produção de feijão no Brasil, muitos trabalhos têm

demonstrado que a produtividade nacional é relativamente baixa (500-700 Kg/ha), se

comparada ao potencial genético apresentado pelas cultivares atualmente recomendadas

para cultivo (3.000 a 4.000 Kg/ha), segundo o Sistema Brasileiro de Avaliação e

Recomendação de Cultivares e o Serviço Nacional de Proteção de Cultivares (SNPC/

SDR/ MAPA) (INFORMAÇÕES ECONÔMICAS, 2003).

2.3. Antracnose

Dentre as diversas causas da baixa produtividade estão as doenças no Estado de São

Paulo, destacam-se a antracnose, o crestamento- bacteriano comum, a mancha angular, a

murcha de fusarium, a ferrugem e o mosaico-comum e dourado. A maioria dos agentes

causais dessas doenças apresenta variabilidade patogênica que, podem ser disseminadas

pelas sementes que são uns eficientes meios de disseminação (OLARI et al., 1973;

PARADELA FILHO & POMPEU, 1975; MENEZES,1985; DUDIENAS & POMPEU,

1985).

Das principais doenças, a antracnose, causada pelo fungo C. lindemuthianum, tem-

se constituído nos últimos anos na mais importante pela sua ocorrência nas três épocas de

cultivo do feijoeiro (CANTERI et al., 1999): das águas, da seca e de inverno, com plantios

em agosto-setembro, janeiro-fevereiro e maio-junho, respectivamente, sendo freqüente não

apenas no Estado de São Paulo, mas também nos outros principais Estados produtores de

feijão no Brasil como Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, Minas Gerais, Bahia,

Pernambuco, Espírito Santo, Alagoas, Sergipe e Paraíba (RAVA et al., 1994; ALZATE-

MARIN et al., 2003).

O desenvolvimento dos sintomas da antracnose é favorecido, principalmente, em

regiões de temperaturas moderadas a frias, com alta umidade relativa do ar e quando se

reutilizam sementes infectadas pelo patógeno, chegando a proporcionar perdas de até

100%, como o ocorrido em alguns países da América Central, América do Sul, Ásia e

África (VECHIATO, 1996).

2.3.1. Colletotrichum lindemuthianum e raças fisiológicas

O C. lindemuthianum é o causador da antracnose no feijoeiro comum e sob a forma

imperfeita o pertence à Classe Coelomycetes e à Ordem Melanconiales (MAGALLANES,

1997).

O patógeno infecta a superfície foliar através da germinação dos conídios que, sob

temperaturas entre 13 e 27ºC e alta umidade proporcionam as melhores condições para o

desenvolvimento da doença (VIEIRA, 1967). Temperaturas superiores a 30ºC e inferiores a

13ºC limitam tanto a infecção como o desenvolvimento do fungo sendo que, de um cultivo

a outro, o patógeno sobrevive, pois o micélio fica dormente na semente, nos cotilédones ou

restos culturais, na forma de esporos.

Os sintomas da antracnose podem aparecer em toda a parte aérea da planta. As

lesões da base do caule crescem podendo causar podridão de coloração preta,

enfraquecendo-o e tornando-o incapaz de suportar a copa da planta (ZAUMEYER &

THOMAS, 1957; ZAMBOLIN & CHAVES, 1978). As lesões estão em maior freqüência

na superfície inferior das folhas, nas nervuras, em pecíolos e vagens (CANTERI et al.,

1999).

Segundo Magallanes (1997), os autores Kimati e Galli (1970); Batista e

Chaves (1982); Rava et al. (1993); Rava, Purchio e Satorato (1994) e

Balardin et al. (1997) descrevem que tanto a forma imperfeita quanto a

perfeita, são altamente variáveis e diferenciam-se em tipos fisiológicos e

genéticos que afetam de forma diferenciada as determinadas cultivares de um

mesmo hospedeiro.

Azevedo (1976) ressalta que a mutação não é a única responsável pela variabilidade

patogência. A heterocariose, a recombinação sexual, a recombinação assexual ou

parassexualidade e determinantes citoplasmáticos também são fontes para a diversidade

genética existente entre os fungos. Sendo assim, o estudo de qualquer destes processos já

contribuiria para o melhor conhecimento do comportamento genético do fungo

(MAGALLANES, 1997).

O primeiro estudo sobre a variabilidade de C. lindemuthianum foi realizada por

Barrus (1911), que identificou as raças Alfa e Beta. A raça Gama foi identificada por

Burkholder (1932) e as raças Delta, Epsilon, Kappa e Alfa-Brasil por Andrus & Wade

(1942), Blondet (1963), Krüger et al. (1997) e Fouiloux (1975), respectivamente (Apud:

THOMAZELLA et al. 2000)

Descrita por Dudienas & Pompeu (1985); Kimati (1966), Araújo (1973); Oliveira et

al. (1973); Oliari et al. (1973); Pio-Ribeiro & Chavez (1975a) e (1975b); Menezes (1985);

Menezes et al. (1982), a antiga classificação da variabilidade patogênica de C.

lindemuthianum, antes representada pelos grupos Alfa, Beta, Gama, Delta, Mexicano I,

Mexicano II, Brasileiro I e Brasileiro II e as raças fisiológicas dentro destes grupos Alfa,

Alfa BR, Épsilon, Eta, Gama, Delta, Teta, Lambda, Capa, Mu, Mexicano I, Mexicano II,

Brasileiro I, Zeta, Brasileiro II e Sigma. A partir de 1998 mudou para um novo sistema de

classificação de número binário proposto na primeira Reunião Latino Americana de

Antracnose do Feijoeiro realizada em Cali, Colômbia (CIAT, 1990), deixando a antiga

denominação usada desde 1918 (CARBONELL et al., 1999).

Nesta mesma reunião também foi decidida a padronização de um conjunto de doze

variedades diferenciadoras internacionalmente aceitas para classificar e confirmar as raças

do patógeno de acordo com o sistema binário, que caracteriza as diferentes respostas de

infecção causada pelas variantes (raças ou patótipos) de C. lindemunthianum (CIAT, 1990)

e, diante disso, a questão da variabilidade do número de variedades utilizado por muitos

pesquisadores foi solucionada (PASTOR-CORRALES, 1992), conforme descrito na tabela

A designação das raças é obtida pela soma dos valores binários das variedades

diferenciadoras suscetíveis.

Genótipos Andinos;

Genótipos Mesoamericanos

Ordem Variedade

diferenciadora

Valor

binário

Peru Costa

Rica

Michelite

1 R(0) S(1)

MDRK

2 S(2) R(0)

Perry Marron

4 S(4) R(0)

Cornell 49242

8 R(0) R(8)

Widusa

16 R(0) S(16)

Kaboom

32 R(0) S(0)

Mexico 222

64 R(0) R(64)

PI 207262

128 R(0) S(128)

256 R(0) S(256)

512 R(0) R(0)

AB 136

1024 R(0) S(1024)

G2333

2048 R(0) S(2048)

Raça

6 3545

Exemplo de isolado

Tabela 1

. Exemplo de classificação de raça fisiológica de Colletotrichum lindemuthianum, em

função da reação das doze variedades diferenciadoras do feijoeiro

Segundo os autores Gepts (1988) e Alzate-Marin

et al. (1999a), existe uma co-

evolução na origem das raças de

C. lindemuthianum com a origem de seu hospedeiro P.

vulgaris

, ou seja, os isolados originados de genótipos mesoamericanos tendem a ser

mais agressivos em plantas de origem mesoamericana e isolados andinos mais

agressivos em genótipo andinos. Estudos realizados por Sicard

et al. (1997) também

relatam a existência de uma co-evolução patógeno hospedeiro para

Phaeoisariopis

griseola,

agente causal da mancha-angular em feijoeiro.

A interação entre origem do hospedeiro e origem do patógeno também foi

verificada por diversos autores como Balardin & Kelly (1998), que estudaram 62

genótipos de feijoeiro procedentes do Brasil, República Dominicana, Honduras, México

e Estados Unidos e classificados nos dois conjuntos gênicos Andinos e Mesoamericanos

e algumas raças distintas de

C. lindemuthianum procedentes da Argentina, Brasil,

Colômbia, Costa Rica, República Dominicana, Honduras, México, Peru e Estados

Unidos, observaram que as raças Mesoamericanas eram virulentas nos genótipos

Andinos e Mesoamericanos que as raças Andinas foram virulentas em genótipos

andinos. Melotto & Kelly (2000) relatam que o fato do germoplasma vindo de ambos os

conjuntos ser suscetível às raças Mesoamericanas é porque esse grupo apresenta maior

diversidade patogênica.

Thomazella

et al. (2000) e Alzate-Marin et al. (2003) relataram, em um estudo

feito no Estado no Paraná com as raças 7, 31, 69, 65, 73, 81, 87, 89 e 95 de

lindemuthianum

, que dentre as doze diferenciadoras, apenas seis foram resistentes a

todos os isolados sendo que, das cultivares Mesoamericanas, apenas Michelite, México

222 e Cornell 49-242 foram suscetíveis e, das Andinas, apenas Kabbon foi resistente a

todas as raças estudadas. A raça 31 foi virulenta para Michelite, DarK Red Kidney,

Perry Marron, Cornell 49-242 e Widusa. As raças 65 e 73 foram virulentas em diferentes

cultivares Mesoamericanas, porque foram isoladas de cultivares pertencentes ao

conjunto gênico Mesoamericano, mostrando, dessa maneira, a especialização do

patógeno ao conjunto gênico do hospedeiro

P. vulgaris.

Das 35 raças do patógeno já identificadas no Brasil (1, 7, 8, 23, 31, 55, 64, 65,

67, 69, 71, 72, 73, 75, 79, 81, 83, 86, 87, 89, 95, 97, 101, 102, 117, 119, 121, 137, 217,

249, 320, 339, 343, 453, e 585) (ANDRADE

et al., 1999; THOMAZELLA et al., 2000)

os patótipos mais freqüentes foram os 65, 72, 73, 81, e 89 (ALZATE-MARIN

et al.,

2003). Destes, a raça 89, que estava geograficamente restrita à região sudoeste do Estado

de São Paulo nas proximidades do município de Capão Bonito e Itararé, aparece agora

também em Campinas (CARBONELL

et al., 1999) e as raças 65, 81 e 89 são mais

freqüentes no Estado do Paraná. A ampla distribuição das raças indica a adaptação

destas, facilitada pelo livre comércio de grãos entre os Estados e pela reutilização por

muitos produtores dos mesmos grãos para futuros plantios em uma mesma área,

acarretando aumento no potencial de inóculo do patógeno de uma safra para outra,

segundo Thomazella

et al. (2000).

Neste contexto, há a necessidade de se monitorar as raças de

C. lindemuthianum,

principalmente nas regiões em que a antracnose pode apresentar alta taxa de progresso,

tanto para o conhecimento da genética do fungo e sua interação com os genes de resistência

“raça-específicos”, como para se ter conhecimento básico necessário para condução de

programas de melhoramento de plantas e desenvolvimento de cultivares resistentes por

períodos prolongados de tempo (RAVA

et al., 1994).

2.3.2. Fontes de resistência a Colletotrichum lindemuthianum

O problema da variabilidade de C. lindemuthianum pode ser solucionado devido à

existência de muitos genes “raça-específicos” nos hospedeiros que conferem resistência às

muitas raças do patógeno (FALEIRO

et al., 2003). No caso específico da antracnose, estes

genes eram nomeados por letras como o gene ‘A’ presente na cultivar Michigam Dark Red

Kidney (BURKHOLDER, 1918), o gene ‘Are’ em Cornell 49-242 (MASTENBROEK,

1960), os genes ‘Mex1’, ‘Mex2’ e ‘Mex3’ presente em Mex 222, TO e TU,

respectivamente (FOUILLOUX, 1979), até 1996, quando uma nova nomenclatura foi

proposta pelos pesquisadores Young e Kelly (Apud: YOUNG

et al., 1998).

Os genes dominates passaram a ser representados pelo símbolo Co, que significa

Colletotrichum, seguido de um número que indica a ordem de identificação do gene de

resistência ao patógeno e aos alelos de cada gene, por um número expoente (também

seguindo a ordem de identificação) ao número ordinal do gene (Tabela 2).

Os genes de resistência possuem muitos alelos específicos, proporcionais à

diversidade de genes de avirulência existentes nas raças do patógeno, os quais podem ser

incorporados em uma mesma cultivar possibilitando o aumento da vida útil da cultivar no

campo (MUNDT, 1990; YOUNG & KELLY, 1996; MIKLAS

et al., 1996; ITO et al.,

1996; KELLY & MIKLAS, 1998; CASTANHEIRA

et al., 1999).

Os genes dominantes como

Co-1, Co-2, Co-3, Co-4, Co-5, Co-6 e Co-7 foram

identificados nas cultivares MDRK, Cornell 49-242, México 222, TO, TU, AB136 e G2333

(MASTENBROEK, 1960; FOILLOUX, 1976; SCHWARTZ

et al., 1982; PASTOR-

CORRALES

et al., 1994; YOUNG et al., 1998) e o gene recessivo, co-8, na cultivar

AB136 (ALZATE-MARIN

et al., 1997b).

Tabela 2: Principais genes responsáveis por conferir resistência a Colletotrichum

li d thi

Fonte

Co-1

MDRK, Seaferer, Kaboon,

Perry Marrow, Sanilac

Are

Mex 1

Co-3

México 222

Mex 2

Co-4

(2)

G2333, SEL 1308

Mex 3

Co-5

TU, G2333, SEL 1360

Co-7

G2333

co-8

AB136

Gene

Pastor-Corrales et al. (1994);Young et al .(1998)

Referência

Alzate-Marin et al . (1997); (2000)

Young & Kelly, (1996); Alzate-Marin et al . (2000)

Young et al. (1998); Thomazella et al .(2000)

AdamBlondon et al . (1994); Young & Kelly (1996);

Young et al. (1998); Alzate-Marin et al. (2003)

Costa et al . (2000)

Young et al. (1998); Alzate-Marin et al . (1999b);

Costa et al. (2000)

Co-2

Cornell 49-242, Seaforth

Co-6

AB136, Catrachita

Young & Kelly, (1996); Alzate-Marin et al.(2000)

Em 2001, Alzate-Marin identificou um novo gene de resistência à antracnose (Co-

) presente na cultivar de feijoeiro “Ouro Negro”, conferindo resistência a 17 patótipos de

C. lindemuthianum (ALZATE-MARIN et al., 2002) e dois novos alelos nomeados de Co-4

Co-9, na cultivar “PI 207.262” (ALZATE-MARIN et al., 2001e, ALZATE-MARIN et

al., 2002) e um nomeado de Co-1

, na cultivar “AND 277” (ALZATE-MARIN et al.,

2003).

Enquanto a cultivar AB136 possui um gene dominante (

Co-6) e um recessivo (co-

), a cultivar G2333 possui genes independentes duplicados (PASTOR-CORRALES, et al.,

1994). Além do

Co-4

, essa cultivar possui outros dois alelos de resistência, Co-7 e Co-5

(YOUNG et al., 1998). Com relação ao alelo Co-7, as informações sobre ele são reduzidas

se comparadas à grande quantidade de informações disponíveis em literatura sobre os

demais alelos de resistência. Isso ocorre pelo fato desse alelo ter sido originalmente

identificado na cultivar G2333, juntamente com o

Co-4

, que por conferir resistência a um

número muito grande de raças, praticamente encobre o seu efeito (PASTOR-CORRALES

et al., 1994).

A cultivar Cornell 49-242, possuidora do gene

Co-2, é uma das mais antigas fontes

de resistência à antracnose, apresentando resistência a 22 das 35 raças de

lindemuthianum identificadas no Brasil (ALZATE-MARIN et al., 2003). Dentre as raças do

patógeno incompatíveis a essa cultivar estão a 65 (RAVA

et al., 1994; ANDRADE et al.,

1999) e 31 (THOMAZELLA

et al., 2000) e, compatível, a raça 89 (ALZATE-MARIN et

al., 2003; RAVA et al., 1994). Os autores Bonett et al. (2001) concluíram que para as raças

31 e 89 existe dominância completa e dominância parcial para 65, em um estudo com

algumas cultivares, dentre as quais Cornell 49-242. Segundo Young & Kelly (1997), os

genes

Co-1 e Co-2 conferem resistência à raça 65 de C. lindemuthianum (Tabela 3).

Os alelos

Co-1

, Co-1

, Co-3

e Co-4

foram identificados nas cultivares Kabbon,

Perry Marron, México 227 e SEL 1308 (YOUNG

et al., 1998; MELOTTO & KELLY,

2000), respectivamente, sendo que, o alelo

Co-4

é considerado um dos mais importantes

por proporcionar resistência a todas as raças identificadas no Brasil.

Gonçalves-Vidigal

et al. (1997), inocularam as cultivares Michelite, Dark Red

Kidney, Perry Marron, Cornell 49242, AB 136 e PI 207262 com as raças 31 e 69 e

observaram a transmissão independente de seis genes dominantes para a raça 69 (

Co-2, Co-

1, Co-4, um designado B e dois genes dominantes Y e X que se interagem) e que para a

raça 31 a resistência é decorrente da ação de um gene dominante denominado Q e ou da

ação complementar dos genes dominantes O e R.

Tabela 3: Fontes de resistência às ra

as de Colletotrichum lindemuthianum

Fonte: Alzate-Marin et al., 2003; Andrade et al., 1999; Bonett, et al., 2000; Gonçalves-

Vidigal

et al., 1997; Young & Kelly, 1997; Thomazella et al., 2000.

Fonte de

resistência

Co-1 65 73

Co-2 73165

Co-4 65 89 521

Co-4(2) 7 23 64 73 89 521 1545 2047

Co-5 73 89

Co-6 65 89 521

co-8 89

Raças de Colletotrichum lindemuthianum

incompatíveis à fonte

Os símbolos genéticos Q e B utilizados para descrever os genes putativos que

condicionam resistência na cultivar AB136 às raças 31 e 69, respectivamente, foram

assumidos como Co-6 em um estudo realizado por Gonçalves-Vidigal et al. (2001), em

que concluem que apenas um gene controla a resistência nesta cultivar, o qual pode ser

verificado pela ausência de recombinantes entre os dois supostos genes (Q e B) em

população F

2:3.

Neste contexto, Young & Kelly (1997) sugerem a piramidação de genes vindos dos

dois conjuntos gênicos, Mesoamericano e Andino, com a finalidade de prolongar a

resistência à antracnose em uma cultivar. Young et al. (1998) recomendam como melhor

fonte de resistência em genótipos Mesoamericanos o uso do gene Co-5 presente em

SEL1360, TU, G2333 ou G2338. Já Melotto & Kelly (2000) recomendam, como fonte de

resistência Andina, o uso de todos os alelos de Co-1 presente em Perry Marron, Kabbon, e

de Co-4 presente em SEL 1308, G2333 ou G2338, citando também o exemplo do gene Co-

1 (Andino) que confere resistência à raça 73 (Mesoamericana) e o gene Co-2

(Mesoamericano) à raça 7 (Andina).

Estes dados mostram a importância das variedades possuidoras de genes raça-

específicos que, além de serem usadas como diferenciadoras em trabalhos desenvolvidos

para a caracterização de classificação de patótipos de C. lindemuthianum (RAVA et al.,

1994), são também usadas como fontes de alelos de resistência, que auxiliam tanto aos

programas de melhoramento convencionais quanto àqueles que visam a “piramidação” de

genes de resistência (CARBONELL et al., 1999; SHARMA et al., 1999).

2.4. Seleção Assistida no Melhoramento Genético Vegetal

2.4.1. Marcadores moleculares RAPD (

Random amplified polymorphic DNA)

Nos últimos anos, as pesquisas de genética de plantas no exterior têm utilizado com

maior freqüência as ferramentas da biotecnologia, a exemplo daquelas que envolvem o

feijoeiro (ABREU et al., 1996). Tais estudos contemplam vários tipos de marcadores

moleculares, os quais são aplicados em análises de diversidade genética de recursos

genéticos, na construção de mapas genéticos como também para localização de genes e

seleção assistida (BRIAND et al., 1998; JOHNS et al., 1997).

A seleção assistida por marcadores é uma prática que permite a seleção indireta

de caracteres, que tenham os genes responsáveis por eles fortemente ligados aos

marcadores moleculares. Tem sido bastante explorada no melhoramento de

características de herança qualitativa, como por exemplo, os genes de resistência a

doenças e a pragas (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998), eliminando assim as

análises das inoculações, as avaliações e a seleção de plantas portadoras desses ou mais

genes (SILVA & SANTOS, 2001).

Nos programas de melhoramento, os marcadores morfológicos são tradicionalmente

utilizados visando estudar a segregação dos genes a eles ligados e nas análises de

diversidade genética. Em feijoeiro é muito comum o uso de descritores botânicos, tais

como hábito de crescimento, tipo de semente e resistência a doenças e pragas (SINGH et

al., 1991). Sax (1993) verificou em feijão que as diferenças nas médias do peso de grãos

estavam associadas à cor de sementes. Este trabalho foi uma das primeiras tentativas de

caracterização individual dos locos envolvidos na expressão de um caráter quantitativo com

o auxílio de marcadores morfológicos (QTL’s-Quantitative Trait Loci). Mais recentemente

e utilizando 23 descritores agromorfológicos, quantitativos e qualitativos, Chiorato (2004)

realizou estudo sobre a diversidade genética de 1000 acessos de feijoeiro, concluindo serem

alguns descritores mais informativos do que outros para estruturar e quantificar a

diversidade genética do germoplasma estudado.

Entretanto, alguns descritores são fortemente influenciados por fatores como ação

gênica de dominância, efeito ambiental, pleiotropia e epistasia, tornando menos estáveis

suas caracterizações (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Os marcadores

moleculares, além de não serem influenciados pelo ambiente, são transmitidos

mendelianamente, o que permite a sua aplicação na seleção sem que existam certas

interferências de aspectos indesejáveis ocorridas em uma seleção puramente fenotípica,

melhorando dessa forma, a eficiência do processo seletivo (EMYGDIO et al., 2003).

Marcadores moleculares têm sido utilizados não apenas para estudo de diversidade

genética, como também, para mapeamento de características agronômicas de interesse,

ligados a genes de resistência a um determinado patógeno ou à produção. Dessa forma,

estudos procurando associar marcadores com outras características agronômicas de

interesse, como cor do tegumento da semente, pubescência, hábito de crescimento,

arquitetura de planta e outros também podem ser citados em feijão (PARK et al., 1999).

Os marcadores RAPDs (

Randon Amplified Polymorphic DNA) consistem em uma

técnica que identifica polimorfismo molecular, através da amplificação aleatória de

fragmentos de DNA de tamanhos diferentes, a partir de pequenos segmentos de seqüência

arbritrária, de aproximadamente de 9 a 10 pares de base (pb), com um alto conteúdo de GC

(guanina/citosina - de 50% a 80%) e sem seqüências palindrômicas (mesma seqüência de

pares de bases que podem ser lidas em ambas as direções), denominados “primers”, que

dirigem a reação de polimerase em cadeia, (PCR) (FERREIRA &

GRATTAPAGLIA,1998).

Este método possibilitou o desenvolvimento de muitos trabalhos na década de 90 e

que atualmente tem sido amplamente utilizado em estudos de genética de plantas. É uma

técnica que requer muito pouco DNA, sua manipulação é simples, quando comparada com

outras técnicas de marcação molecular que exigem qualquer sistema especial para detecção

de polimorfismo, tais como hibridizações, marcações radioativas ou compostos

quimioluminiscentes e, também, por não necessitar informação prévia sobre a genética do

organismo a ser estudado e ser herdável (CAETANO-ANOLLES et al.,1991; HADRYS et

al., 1992).

No entanto, os RAPDs se comportam como marcadores genéticos de caráter

dominante, não sendo possível distinguir se o loco é homo ou heterozigoto. Apesar da

simplicidade da técnica, pode haver ambigüidade na interpretação de certos fragmentos

amplificados, principalmente se comparados com resultados vindos de diferentes

laboratórios, colocando estes marcadores em condições de desvantagens com relação a

outros (PENNER et al., 1993; WANG et al., 1993).

A identificação de marcas associadas a características agronômicas de interesse em

feijão, com enfoque em genes responsáveis pela resistência à antracnose, foi obtida por

diversos autores e têm sido aplicadas com muito sucesso em estudos que visam

piramidação de genes de resistência em uma mesma cultivar (YOUNG & KELLY, 1997;

KELLY & MIKLAS, 1998; YOUNG et al., 1998; ARRUDA et al., 2000; ALZATE-

MARIN et al., 2000; ALZATE-MARIN et al., 2001a).

Atualmente foram identificados mais de 30 marcadores RAPD ligados a 17 genes

principais, que controlam a resistência a quatro patógenos do feijoeiro, além de outros,

como marcadores associados a QTL’s, que controlam a resistência de efeitos quantitativo

como mosaico dourado, crestamento bacteriano comum e rizoctoniose (KELLY &

MIKLAS, 1996).

Usando marcadores RAPD, Young & Kelly (1997) puderam confirmar

indiretamente a presença do marcador F10

(530pb)

ligado ao gene Co-1 na cultivar Sanilac, o

qual confere resistência à raça 65, e os marcadores AK20

(890)

e AH1(780), para um mesmo

gene; o Co-6, nas populações vindas do cruzamento Raven/Catrachita e

Blackhawk/Catrachita. Ainda com relação ao primer F10, Castanheira et al. (1999),

analisando “Bulks” provenientes de cruzamentos com a cultivar “Ouro Negro”, a qual é

portadora do gene Co-5, também observaram a amplificação de um fragmento ligado ao

gene de resistência. Entretanto, o fragmento tinha cerca de 912 pb e flanqueava o Co-5.

Young et al. (1998) identificaram dois marcadores, AS13

(950)

e o AL9

(740),

fortemente

ligados ao alelo Co-4

, mostrando que este alelo está presente dentre os três genes

independentes que a cultivar G2333.

Na cultivar AB136, a presença dos marcadores Z4

(560)

e Z9

(950)

confirmou a

presença do gene Co-6 (ALZATE-MARIN et al., 1999b; ALZATE-MARIN et al., 1999c).

Os autores Alzate-Marin et al. (2000) e Costa et al. (2001) também mostraram a sua

presença através do marcador AZ20

(940)

e concluíram que, além desse gene dominante, há

também um gene recessivo co-8, quando a cultivar é inoculada com a raça 89 de C.

lindemuthianum.

Adicionalmente aos estudos que relacionam o gene Co-6, Gonçalves-Vidigal et

al. (2001) analisaram a ligação gênica do marcador Z4

(560)

, mapeado a 1,7 cM deste

gene, o que responsabiliza-se pela resistência às raças 31 e 69 e concluíram que o Co-6

deve ser o mesmo responsável pela resistência às raças 89, 73, 81 e 64, previamente

mapeado a 8.5, 2.9, 2.8 e 7.5 cM de distância do gene (s), responsável (eis) por controlar

a resistência a essas raças (ALZATE-MARIN et al., 1999b) ou ainda, que ele (Co-6),

está no mesmo bloco de ligação que controla a resistência a essas raças .

Arruda et al. (2000) confirmaram a presença do gene Co-4 na cultivar TO usando

dois diferentes marcadores, B3

(1800)

e C8

(900)

, anteriormente identificados como ligados ao

gene Co-4 (CASTANHEIRA et al., 1999). O marcador C8

(900)

foi analisado por Costa et al.

(2001). Nas doze variedades diferenciadoras em que a amplificação do fragmento na

maioria delas, tanto nas de origem a Andinas quanto nas Mesoamericanas permite sugerir a

existência de diferentes alelos originados a partir de Co-4.

O marcador

Y20

(830)

foi identificado as cultivares PI 207.262 e G2333, o qual

também é fortemente ligado ao gene Co-4. Nas linhagens Widusa e PI 207.262, o marcador

AS13

(950)

, ligado ao gene Co-4

como previamente relatado por Young et al. (1998),

também foi presente em TO, reforçando as informações obtidas com o marcador Y20

sugerindo que as cultivares Widusa e PI 207.262 carregam um alelo do gene Co-4 (COSTA

et al., 2001).

Em um estudo com as raças fisiológicas 73 e 89 de C. lindemuthianum, os autores

Alzate-Marin et al. (2001b) indicaram, através dos marcadores H18

(1100)

e AS13

(950)

, que

para cada uma das duas raças existem dois locos independentes, presentes em G2333, e que

estes dois marcadores estão localizados próximos de Co-4

. A ausência da banda

amplificada pelos marcadores nas populações de retrocruzamento F

entre Rudá (suscetível)

e G2333 (resistente), quando inoculada com a raça 89, indicou a presença de um gene

diferente de resistência. Essa indicação pode ser verificada através da presença do marcador

AB3

(450)

, anteriormente identificado como ligado ao gene Co-5 (YOUNG & KELLY,

1997). Este estudo incluiu a raça 89 ao conjunto de raças identificadas (7, 23, 64, 73, 521,

1545 e 2047) que são incompatíveis ao gene Co-4

Silva & Santos (2001), com o objetivo de identificar marcadores RAPD que

fossem ligados ao alelo Co-7, verificaram na análise de co-segregação da população F

vinda do cruzamento de G2333 x ESAL 696 e inoculada com a raça 2047 do patógeno,

que o marcador L4

(1000)

está ligado em acoplamento a uma distância de 0,0 cM do alelo

Co-4

e não ao Co-7. A escassez de literatura citando o alelo Co-7 faz com que surjam

ainda muitas dúvidas sobre o mesmo. No entanto, para alguns autores o Co-4

e Co-7

são os mesmos alelos, discordantes de outros que dizem serem distintos. Os autores

Costa et al. (1999) e Alzate-Marin et al. (2003) mostraram que o marcador Q4

(1440)

identificado como ligado ao loco Co-2, pode ser usado em seleção de linhagens

possuidoras de tal loco (Tabela 4).

Gene de

Marcador resistência Genótipo

F10

(530)

Co-1 MDRK

H20

(450)

Co-2 Cornell 49-242

(1440)

Co-2 Cornell 49-242

A18

(830)

Co-4 TO (5)

(1800)

Co-4 TO

Alzate-Marin et al ., 1999a; Ragagnin et al., 2001;

(900)

Co-4 TO

Alzate-Marin et al ., 1999a; Catanheira et al., 1999;

Y20

(830)

Co-4 TO

Alzate-Marin et al ., 1999a; Costa et al ., 2000;

I16

(850)

Co-4 TO

J01

(1380)

Co-4 TO

AL9

(740)

Co-4(2) G2333

AS13

(950)

Co-4(2) SEL1308

H18

(1100)

Co-4(2) G2333

(1000)

Co-4(2) G2333

AB3

(450)

Co-5 TU, G2333, SEL1360

AH1

(780)

Co-6 AB136

AK20

(890)

Co-6 Catrachita

(560)

Co-6 AB136

Alzate-Marin et al ., 1999c; Ragagnin et al., 2001;

(950)

Co-6 AB136

Alzate-Marin et al ., 1999c; Ragagnin et al., 2001

AZ20

(940)

Co-6 AB136

Alzate-Marin et al ., 1999a, Costa et al., 2000

Arruda et al., 2000

Arruda et al. , 2000

Referência

Young & Kelly, 1997

Arruda et al ., 2000

AdamBlondon et al., 1994; Alzate-Marin et al., 2003

Young & Kelly, 1996; Alzate-Marin et al., 2003

Young et al., 1998

Arruda et al., 2000; Ragagnin et al., 2001

Alzate-Marin et al., 1999b

Young et al., 1998

Golçalves-Vidigal et al., 2001

Young & Kelly, 1997

Silva & Santos, 2001

Young & Kelly, 1996

Young & Kelly, 1997

Tabela 4: Principais genes de resistência a Colletotrichum lindemuthianum, associados aos marcadores

moleculares RAPDs

Outra importante aplicação dos marcadores do tipo RAPD é a sua

utilização para a caracterização molecular de patógenos causadores de

doenças em feijoeiro, como é o caso de Fusarium solani (OLIVEIRA et al.,

1999), Colletotrichum sp. (ALZATE-MARIN et al., 2001c; CHAVES et al.,

1999) e Phaeoisariopsis griseola (ALZATE-MARIN et al., 2001c), pois o uso

de cultivares resistentes aos patógenos requer, além do conhecimento das

raças fisiológicas prevalecentes na região onde se pretende utilizá-las,

conhecer as características genéticas do patógeno.

Os genes raça-específicos, segundo Pryor & Ellis (1993), vêm sendo bastante

estudados para fins de mapeamento e, no caso específico do feijoeiro, para diferentes

patossistemas, em que os genes estão organizados em poucos locos de resistência dentro

das cultivares (FALEIRO et al.,1996; FALEIRO et al., 1999). Estes locos podem ser

constituídos por genes isolados e organizados de forma seqüencial, ou por genes que

possuem diferentes alelos. Um exemplo é o loco M de resistência à ferrugem do linho

causada pelo fungo Melampsora lini (Ehrenb.) Desmag. Neste loco os genes R estão

arranjados em tandem e são relacionados com diferentes especificidades encontradas no

genoma da planta (ELLIS et al., 1988).

Faleiro et al. (2000) estudaram genes de resistência à ferrugem e à antracnose da

cultivar de feijão “Ouro Negro” e identificaram cinco marcadores RAPD no mesmo grupo

de ligação. Após a avaliação para a resistência à ferrugem, as mesmas plantas RC

foram

inoculadas com a raça 89 de C. lindemuthianum. A análise dos sintomas evidenciou que

tanto a resistência à ferrugem quanto a resistência à antracnose são controladas por fatores

dominantes únicos. Foi também observado que os genes de resistência à ferrugem e à

antracnose presentes em “Ouro Negro” estão ligados entre si.

A grande quantidade de marcadores disponíveis possibilitou o desenvolvimento de

muitos mapas de ligação, sendo possível correlacionar a presença de um marcador,

morfológico ou molecular, aos fatores genéticos que controlam determinadas características

agronômicas, podendo ser aplicado em diversas espécies: batata, milho, arroz, soja e feijão

(VALLEJOS et al., 1992). Os autores Nodari et al. (1993), com o auxílio de marcadores

moleculares, mapearam o gene Phs responsável pela produção da faseolina, a principal

proteína de reserva das sementes de feijão, e o gene nts (nodulação tolerante ao nitrato).

Santos et al. (2003), com o objetivo de complementar um mapa genético do

feijoeiro, encontraram 11 grupos de ligação por meio de 143 marcadores moleculares

RAPD, cobrindo 1234,5 cM do genoma. Este mapa foi usado para detectar QTL’s

associados à resistência a Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. em folhas e em vagens.

Em meio a tantas possibilidades que os marcadores moleculares proporcionam,

como relatado anteriormente, Alzate-Marin et al. (1999e) ressaltam a grande

importância da técnica RAPD no mapeamento de genes de resistência a doenças, tendo

em vista que a identificação de marcadores fortemente ligados a esses genes permite a

prática da seleção indireta (marcador molecular como critério de seleção).

A partir da associação de marcadores RAPDs a genes de resistência a

doenças, muitos autores têm relatado com sucesso a conversão desses

marcadores em SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions). Os

trabalhos citam a transformação desses marcadores associados a genes de

resistência a doenças em diversas culturas de importância agronômica, tal

como o feijoeiro a antracnose (ALZATE-MARIN et al., 1997a, YOUNG et al.,

1998, GEFFROY et al., 1998, KELLY et al., 2003). Além da associação às

doenças, o uso de SCARS tem sido bastante eficiente em outras características

de importância agronômica, como seleção de cor de sementes em Brassica

napus (NEGI et al., 2000).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Avaliação dos genótipos de feijoeiro quanto à resistência às três raças

31, 65 e 89 de Colletotrichum lindemuthianum

3.1.1. Germoplasma de feijão

Duzentos e quarenta e dois acessos para a raça 31, duzentos e quarenta e um para a

raça 65 e duzentos e quarenta e quatro para a raça 89 foram escolhidos do Banco de

Germoplasma do IAC pela importância econômica dos mesmos ao melhoramento genético

do feijoeiro para as condições edafoclimáticas do Estado de São Paulo e por apresentarem

ampla e diferenciada resposta a infecção de C. lindemuthianum. Dentre os acessos, há

representantes dos centros de origem Andina e Mesoamericana da espécie, diversas raças

locais de diferentes países sul-americanos e linhagens provenientes de programas de

melhoramento genético de Instituições de pesquisa nacionais e internacionais (Tabela 5).

3.1.2. Obtenção das Raças de Colletotrichum lindemuthianum

Foram utilizadas as raças 31, 65 e 89 de C. lindemuthianum da micoteca do Centro

de Pesquisa e Desenvolvimento de Fitossanidade – IAC.

Tabela 5: Acessos de feijão do Banco Ativo de Germoplasma (BAG)-IAC com potencial

agronômico para as condições edafoclimáticas do Estado de São Paulo com ampla e diferenciada

reação ao Coletotrichum lindemuthianum.

ACESSO NOME SIGLA

CESS

NOME SIGLA

1 Frijol Negro P440-A 316 Mamoninha 2063-N-1892

2 Sanilac 317 Tupi

EP-12080(20860

15 Rosinha IG-1169 319 Preto-196 Col. Neg-658

17 Rosinha 29/Dez 320 Black Turtle Soup Bean

21 Baio da Praia 1927 325 Rosinha G2

24 Rosinha-145-1-1 339 Rim de Porco

25 Leg. Floresta-5 350 Preto-167 CMG

28 Uberabinha CF-830348 354 Preto-146 CMG

32 Rosinha-127 360 MDR

33 Jalo EE-14559 368 Porrillo-1

35 ECU-208 373 México-498

49 Carioca-80 374 Monte Negro-1349 1848

50 Chileno/Branco 385 México-488

56 ECU-311 389 Small White 59 Preto

60 Rim de Porco 392 Perry Marron

71 Vermelhinho CF-840123 393 Feijão Ingá CF-800084

72 Alemão CF-800227 395 Mortiño

73 Rosinha CF-840657 398 Cornell-49242

74 Enxofre (Diacol Mina Pent) CF-840081 405 TIB-3042

75 Bagajo CF-810425 415 73VUL-3205

83 Baetão 30273 416 Rosado-13

89 Venezuela-350 427 Safira

90 B. Turrialba P-709 431 BB Lake

99 México-115 437 A-ICA-TUI P458

107 Guatemala-2226 B-21 439 B-Puebla-40 490

109 Red Kidney 443 Canário-101

112 Baetão N-314-EEAL 445 B. Porrillo-70 P448

113 Sem. Gde. Cor Vinho 449 Copinho Grande Preto EERC-236

114 Bataa

455 Preto Lages EERC

121 S/ Nome Rosinha Leg-13 457 Cavalo Amarelo 2229

125 Chumbinho-63 462 Branco Graúdo CF-840230

138 Leg. Rosinha CIAT-63 465 Porrillo Sintético

149 Baetão 466 Mulatinho 1194

152 STO ROSS 478 México-12

154 60 Dias 481 Carioca MG

159 Aete-2 485 D. Timóteo

160 Uberabinha N1/220 492 G11796

171 Vermelho de Minas CF-830393 494 Bolon Bayo

172 IPA-2 73VUL 497 Terra Velha

179 Manteiguinha CF-830456 499 Feijão Vermelho Graúdo CF-830186

180 Branco-119 515 Preto Dom Feliciano CF-840204

183 Actopan 521 Chileno/Preto

186 Coco Blanchi IG-749 525 Baetão CF-840727

196 HIBC 528 Baetão CF-840856

203 Rosado-14 (mulatinho) 531 PI-310724 CIAT

211 Retinto Santa Rosa 51 533 Puebla-152 CIAT

213 Preto-158 29/162 534 Jamapa CIAT

215 Pirata-1 543 Jalo-110

222 Venezuela-42-5-1 544 IAPAR-80

225 México-309 546 Gordo Branco CF-860112

228 México-44 1820 550 Caeté (preta) CF-860125

236 Preto-208 CMG 556 Rico-23 CF-830248

239 México-435 558 Mulata Gorda CF-840500

249 Preto Uberabinha 559 Iraí

251 Costa Rica 566 Pijão CNF-3444

254 Quarenteno 567 IAPAR-65

257 Preto-184 CMG 568 IAPAR-57

267 Honduras-32 569 IAPAR-72

268 Rico CMG-23 570 MD-806

271 Guatemala-479 571 A-300 CNF-4045

276 IPA-8 572 Jamapa

278 Venezuela 1832-8371 573 Jalo Itararé

279 Ouro Negro 574 Puebla-152 CNF-1807

287 Jamapa CNF-1671 575 RAI-76

288 Rosinha 576 EMP-81

296 Mulatinho H-6-1 577 Jalo EEP-558

297 I-114 578 Tarumã

311 73VUL-3210 580 Conejo G22029

Tabela 5: Acessos de feijão do Banco Ativo de Germoplasma (BAG)-IAC com potencial

agronômico para as condições edafoclimáticas do Estado de São Paulo com ampla e diferenciada

reação ao Colletotrichum lindemuthianum (Continuação).

ACESSO NOME SIGLA ACESSO NOME SIGLA

582 IAPAR-44 647 Bat-477

583 ARC-1 648 IPA-1

584 ARC-2 649 A-211

585 ARC-3 650 Mex-222

586 ARC-4 651 G2338

587 Vermelho Desconhecido 652 Raven

588 Ovo de Codorna Tyunaga Vermelho 653 Michelite

589 Sangre-Toro G5704 654 A-21

590 Real Mexican-34 CNF-0541 655 A-55

592 Cal-153 663 A-322

593 EMP-407 671 PI-165426

595 CNF-86-9 672 IAPAR-81

596 IAPAR-BAC 6 R. Bac. 673 MAM-38

597 IAPAR-31 674 DOR-390

598 EMP-408 675 DOR-391

599 AFR-188 676 DOR-476

600 G4000 677 DOR-482

601 Tenderette 678 Mar/03

602 R.Bac. Hx82-7-3-3-1,CM 679 Turrialba-1

603 R.Bac. GNN-Sel 1(27) 680 Durango-222

604 IAPAR-14 681 Xan-112

605 LP-88-175 682 Xan-159

606 Apetito Branco CNF-1709 683 Xan-251

607 Barbunya CNF-1798 684 AND-279

608 Pompador CNF-1429 685 G5207

610 Oito e Nove 749 Car Marrom L359-1

611 Alemão 815 RAZ-56

612 Bat-93 816 RAZ-49

613 D. Calima 817 RAZ-43

614 Pinto-114 818 RAZ-59

615 A-439 (R.Nem.) 819 RAZ-55

616 A-443 (R.Nem.) 863 Pirapora (CB)

617 Bat-332 905 Rosa Do Guaranésio Tipo B

618 Mex-54 911 Goytacazes

619 Flor de Mayo 921 Batista Brilhante (CB)

620 Pan-72 926 WAF-69

621 A-449 928 WAF-74

622 G2858 930 Rosa Do Guaranésio Tipo C

623 G5686 937 Contender

624 Mar/01 948 WAF-75

625 Mar/02 995 Pompadair

626 FEB-29 1052 A-285

627 Amendoim 1062 PR-733612

628 Cal-143 1081 CF-840743

629 Montcalm 1088 PI-329247

630 HF5465-63-1 1103 PR-733639

631 Frijólica 03-1 1114 México-187 6153

632 Aporé 1116 PI-417660

633 RG1342 CH60 (MA) 1121 Feijão Pintado

634 AND-277 (MA) 1132 Negro Vera Cruz X066-24

635 RIZ-30 1135 Rosada PR-9457-43

636 G916

637 T

638 TO

639 Antioquia-8 G8147

641 AB-136

642 Widusa

643 PI-207262

645 G2333

646 Mex-279

Essas raças foram originalmente classificadas como mesoamericanas. A escolha

dessas três raças foi por serem as três principais raças que ocorrem no Estado de São Paulo

(ITO et al. 2002), sendo que a raça 89 tem sido mais agressiva, apresentando

potencialidade de redução de colheita em até 100%, (CARBONELL, 1999) e a raça 65

pertence ao grupo de raças amplamente disseminadas no Brasil, segundo (TALAMINI et

al., 2002). A classificação das raças foi baseada na resposta de inoculação das 12

variedades diferenciadoras e na utilização do sistema binário de classificação e

caracterização da resposta de infecção pelas variantes (raças ou patótipos) de C.

lindemunthianum (CIAT, 1990).

Para cada acesso foram utilizadas seis plantas, tendo sido utilizada a cultivar

Rosinha G2 como testemunha. Plântulas de cada genótipo foram obtidas após germinação

em papel de pH neutro (Germitest), à temperatura de 25

C, por um período de

aproximadamente três dias. Após este período, as plântulas com aproximadamente 2 cm de

comprimento de radícula foram transplantadas para bandejas plásticas ou copos plásticos

descartáveis de 300 mL, contendo como substrato vermiculita esterilizada. Após cinco dias

do transplante, as plântulas foram inoculadas com uma suspensão de 1,2 x 10

conídios/mL/raça de C. lindemuthianum, em sala climatizada, (temperatura de ± 20

C e

umidade relativa alta).

Para a produção do inóculo, cada isolados das raças 31, 65 e 89 de C.

lindemuthianum foi cultivado em placas de petri contendo o meio de cultura Mathur

(glicose + MgSO

.7H

O+ KH

+ peptona + ágar + H

O destilada). Após a repicagem

dos fungos, as raças foram mantidas em estufa incubadora a 22

C (±1

C), no escuro,

durante 8 dias. Após esse período, foi preparado o inóculo adicionando-se cerca de 10 mL

de água destilada e esterilizada sobre a superfície da colônia e então uma leve raspagem

com auxílio de uma lâmina de vidro. A suspensão de micélio e esporos foi filtrada em gaze

e a concentração do inóculo ajustada para 1,2. 10

esporos/mL.

A inoculação foi efetuada com o auxílio de um ‘DeVilbiss’ acoplado numa bomba

de vácuo e pressão, pulverizando-se o inóculo nas faces inferior e superior das folhas e toda

a superfície das plântulas que foram mantidas em sala climatizada com alta temperatura (20

± 2

C) e umidade relativa do ar proporcionado por aparelho de nebulização, por um

período de 48 horas e, em seguida, mantidas sem nebulização, à mesma

temperatura de 20

± 2ºC.

3.1.3. Avaliação dos sintomas da antracnose

A avaliação foi feita seguindo o sistema padrão de escala de notas de 1 a 9,

conforme as normas propostas pelo CIAT (1990) e também descritas por RAVA et al.

(1993), que utiliza a nota 1 para aquelas resistentes (sem sintomas) e 9 para as suscetíveis

(mortas), aos 10 a 14 dias após a inoculação. O critério adotado para as notas foi 1 para

ausência de sintomas visíveis; 2 e 3 igual menos de 25% de área foliar afetada com

manchas necróticas podendo, em alguns casos, serem visualizadas apenas na parte inferior

das folhas; 4 e 5 igual de 1 a 3% da área foliar afetada; 6 igual quando as manchas

necróticas nas nervuras são perceptíveis em ambas as faces das folhas e as notas 7, 8 e 9

igual 25% ou mais da área afetada. A nota 7 determina quando as manchas necróticas estão

presentes na maioria das nervuras e em grande parte do tecido do mesófilo e presença de

lesões abundantes nos caules, ramos e pecíolos. A nota 8 é quando as manchas necróticas

se encontram em quase todas as nervuras, ocasionando ruptura, desfolha e redução do

crescimento da planta. A nota máxima 9 é dada quando a maioria das plantas está morta. Os

genótipos com notas de 1 a 3 são classificados como resistentes e acima de 3 como

suscetíveis.

3.2. Marcadores RAPD ligados aos Alelos de Resistência em Feijoeiro às Raças de

Colletotrichum lindemuthianum

3.2.1. Extração de DNA das amostras de

Phaseolus vulgaris

Para cada genótipo, não inoculado com C. lindemuthianum, foi feita a extração de

DNA seguindo o protocolo utilizado por CIMMYT (Laboratory Protocols - CIMMYT

Applied Molecular Genetics Laboratory), que vem sendo aplicado no Laboratório de

Genética e Biologia Molecular do IAC. Em um tubo plástico (eppendorf) de volume total

de 2,0

μl foram colocados 0,2g de tecido foliar moído no almofariz com o auxílio de

nitrogênio líquido e depois adicionados 800 mL de tampão de extração (pré-aquecido a

C com 0,2% de mercaptoetanol). As amostras foram incubadas por 60 minutos a 65

em banho-maria e a cada 15 minutos eram agitadas. Decorridos os 60 minutos, os tubos

contendo as amostras foram removidos e deixados por 10 minutos na bancada, para

retornarem à temperatura ambiente, para então adicionar clorofórmio-álcool isoamílico

(24:1) até completar o volume do tubo. As amostram foram agitadas levementes por 1

minuto e centrifugadas por 10 minutos a 10.000 rpm em temperatura ambiente. Após esta

etapa, a fase superior foi transferida para um novo tubo e adicionado o mesmo volume (do

recuperado) de clorofórmio álcool isoamílico (24:1), agitada lentamente por 1 minuto e a

mistura centrifugada por 10 minutos a 10.000 rpm em temperatura ambiente. A fase

superior (líquida) do tubo foi recuperada em outro tubo e adicionados 80% do volume (do

recuperado) de isopropanol (gelado). A mistura foi obtida por inversão dos tubos por cerca

de 10 minutos e a seguir centrifugados por 10 minutos a 5.000 rpm. Após a eliminação do

sobrenadante, o DNA total precipitado foi lavado com 300

μL de etanol 70%, centrifugado

por 5 minutos a 5.000 rpm e, após a eliminação do sobrenadante, foi deixado para secar na

bancada para então suspendê-lo em 200

μL de TE.

Para o teste de quantidade de DNA foram utilizadas duas concentrações de lambda,

de 40 ng e 100

ηg, como comparação. O produto da extração foi visualizado em gel de

agarose a 0,8%, usando um tampão TAE 1X (40mM Tris, 1 mM Ácido acético e 1,8 mM

EDTA dissódico) e tratamento com brometo de etídeo e visualização do produto sob luz

U.V. A imagem foi digitalizada em foto documentador específico.

3.2.2. Marcador molecular: RAPD

Os marcadores utilizados foram os mesmos citados em literatura e ligados a locos de

resistência à antracnose do feijoeiro (Tabela 6). Os protocolos descritos por Rafalski et al.

(1996) foram utilizados para o genoma de feijão. A reação de PCR foi montada utilizando-se

reagentes comercialmente disponíveis tais como MgCl

, enzima, primers (Operon

Technologies, Alameda, CA, EUA) e o DNA a ser estudado. As condições das reações e as

concentrações ótimas dos componentes foram estabelecidas experimentalmente. O volume

final de cada reação foi de 25

μL contendo 5 pmols de cada primer, 1,0 unidade de Taq-

polimerase (Invitrogen), 2,5

μL de Buffer 10X, 1,5μL de dNTP 2,5 mM, 0,75μL de MgCl

50 mM (1,5mM final) e 3,0

μL de DNA (aproximadamente 40ηg), além de água Milli-Q

(q.s.p.). O termociclador utilizado foi o PTC- 100 (MJ Research, Inc) programado para um

ciclo a 95ºC por 5 minutos (temperatura necessária para a desnaturação da cadeia de DNA),

seguido de 43 ciclos a 94ºC por um minuto (desnaturação), 35ºC por um minuto

(pareamento do primer), 72ºC por 1 minuto e 30 segundos (extensão) e, por último, a

temperatura de 72ºC por 7 minutos para extensão final.

Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese (120Volts, 200mA

durante, aproximadamente 2,5 - 3 horas) em géis de agarose a 1,5%, usando um tampão

TAE 1X (40mM Tris, 1 mM Ácido acético e 1,8 mM EDTA dissódico) e revelados através

de tratamento com brometo de etídeo sob luz U.V. e a imagem digitalizada em

fotodocumentador específico. Sendo assim, os registros foram tomados com a presença ou

ausência (1 ou 0, respectivamente) de cada fragmento de DNA reprodutível, comparando o

perfil de bandas amplificadas para cada marcador com um ladder de mesmo peso

molecular (100 pares de bases -pb), no conjunto de acessos de feijão. Um mesmo genótipo

(número 60) foi utilizado como testemunha por reproduzir um bom perfil de bandas em

todas reações com todos os marcadores.

Tabela 6: Marcadores RAPD ligados a genes de resistência a Colletotrichum lindemuthianum em

feijoeiro indicando se estão em repulsão ou associação, a distância do gene e em que genótipos se

Gene de

Marcador resistência Distância (cM) Orientação Genótipo

F10(530)

Co-1 1.9-1.4cM repulsão MDRK

H20

(450)

Co-2 0.5cM associação Cornell 49-242

(1440)

Co-2 5.5cM associação Cornell 49-242

A18

(830)

Co-4 17.4cM repulsão TO (5)

(1800)

Co-4 3.7cM repulsão TO

(900)

Co-4 9.7cM associação TO

Y20

(830)

Co-4 0.0cM sem recombinação TO

I16

(850)

Co-4 14.3cM associação TO

J01

(1380)

Co-4 18.1cM associação TO

AL9

(740)

Co-4(2) 4.5cM associação G2333

AS13

(950)

Co-4(2) 0.0cM sem recombinação SEL1308

H18

(1100)

Co-4(2) 9.2/ 5.6cM associação G2333

(1000)

Co-4(2) 0.0cM associação G2333

AB3

(450)

Co-5 5.9cM associação TU, G2333, SEL1360

AH1

(780)

Co-6 12.3cM associação AB136

AK20

(890)

Co-6 7.3cM repulsão Catrachita

(560)

Co-6 2.5cM associação AB136

(950)

Co-6 20.4cM repulsão AB136

AZ20

(940)

Co-6 7.1cM associação AB136

6; 10

Referência

1; 14

2; 14

6; 12; 9

5; 6; 9

6; 9; 10; 12

8; 11; 12

*- 1- AdamBlondon et al., 1994; 2- Young & Kelly, 1996; 3- Young & Kelly, 1997; 4- Young et al., 1998; 5-

Catanheira

et al., 1999; 6- Alzate-Marin et al., 1999a; 7- Alzate-Marin et al., 1999b; 8- Alzate-Marin et al.,

1999c; 9- Arruda

et al., 2000; 10- Costa et al., 2000; 11- Golçalves-Vidigal et al., 2001; 12- Ragagnin et al.,

2001; 13- Silva & Santos, 2001; 14- Alzate-Marin

et al., 2003.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Avaliação dos Genótipos de Feijoeiro quanto à Resistência às Raças 32, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum

Para a avaliação foi aplicada a escala de notas proposta por Rava et al. (1993) que

foi aplicada por uma mesma pessoa para que não houvesse julgamento diferente na

atribuição das notas (Tabela 7). Foram avaliados 242 genótipos quanto à infecção da raça

31 de C. lindemuthianum e, dentre elas, 108 (44%) mostraram-se resistentes. Para a raça

65, 241 acessos foram avaliadas sendo que 99 (40%) apresentaram incompatibilidade a esse

patótipo. Já a raça 89 mostrou ser a mais virulenta, infectando 157 genótipos do total de

244 (65%), resultado coerente com o descrito por Carbonell et al. (1999), que destacaram a

agressividade da raça 89. A Figura 1 resume os resultados obtidos a partir das inoculações

dos acessos.

R: Resistente; S: Suscetível

Figura 1: Resposta diferenciada dos genótipos à infecção das três raças de Colletotrichum

lindemuthianum: 31

65 e 89.

Raça 31

43%

57%

R S

Raça 65

41%

59%

Raça 89

36%

64%

Acesso Nota Classificação Nota Classificação Nota Classificação Acesso Nota Classificação Nota Classificação Nota Classificação

1 1R1R1R287 9S9S9S

2 9S1R1R288 9S1R9S

15 9S1R9S296 9S9S9S

17 9S9S7S297 9S9S9S

21 9S9S9S311 9S9S9S

24 9S9S9S316 9S9S9S

25 8S7S7S317 9S9S9S

28 1R1R1R319 9S9S9S

32 9S9S9S320 9S9S9S

33 1R1R2R325 9S9S9S

35 2R9S 9 S339 1R1R1R

49 9S1R9S348 7S9S9 S

50 1R1R1R349 9S9S9S

56 9S9S9S350 9S9S9S

60 9S9S2R354 9S1R1R

71 1R1R1R360 9S9S9S

72 1R1R1R368 9S9S9S

73 1R1R1R373 2R9S9S

74 1R1R1R374 1R9S2R

75 9S7S9S385 9S9S9S

83 9S9S9S389 8S9S9S

89 9S9S9S392 1R9S9S

90 9S9S9S393 9S9S9S

99 9S9S9S395 9S1R9S

107

2R9S 9 S398 1R1R9S

109 1R1R1R405 1R7S1R

112 9S1R1R415 9S9S9S

113 9S1R1R416 1R1R1R

114 9S9S9S427 9S9S8S

121 9S9S9S431 9S9S1R

125 1R9S 9 S437 9S9S9S

138 9S9S9S439 1R7S9S

149 9S9S9S443 9S9S9S

152 9S9S9S445 9S8S9S

154 9S9S9S449 9S9S9S

159 9S9S9S455 9S9S9S

160 1R9S 9 S457 1R1R9S

171 1R7S 8 S462 9S8S9S

172 9S9S9S465 9S9S9S

179 9S1R1R478 9S2R9S

180 1R1R8 S481 9S9S9S

183 2R9S 9 S485 8S9S9S

186 9S9S9S492 9S9S9S

196 9S9S9S494 1R1R1R

203 9S9S9S497 1R7S9S

211 9S1R9S499 9S9S7S

213 1R9S 9 S515 1R1R9S

215 1R9S 9 S521 9S9S1R

222 1R9S 9 S525 1R1R1R

225 9S9S9S

528 9S7S9S

228 1R8S 1R531 9S9S9S

236 9S9S9S533 1R2R1R

239 7S7S9S534 9S9S1R

249 1R1R9 S543 9S9S9S

251 9S7S9S544 9S9S9S

254 9S9S9S546 2R1R8S

257 9S9S9S550 9S9S9S

267 9S9S9S556 1R1R9S

268 1R7S 9 S558 1R1R9S

271 9S9S9S559 9S9S1R

276 9S9S9S566 1R1R8S

278 9S9S9S567 9S1R9S

279 0-0-0-568 1R1R2R

65 89

Raças do

Colletotrichum lindemuthianum

Raças do

Colletotrichum lindemuthianum

31 65 89 31

Tabela 7: Reação dos genótipos de feijoeiro inoculados com as raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum e classificação em resistentes e suscetíveis

Acesso Nota Classificação Nota Classificação Nota Classificação Acesso Nota Classificação Nota Classificação Nota Classificação

569 1 R 2 R 2 R 633 9S9S9S

570 1 R 1 R 1 R 634 9S1R1R

571 9 S 2 R 9 S 635 9S9S9S

572 9 S 9 S 9 S 636 9S9S1R

573 9 S 1 R 1 R 637 1R1R1R

574 1 R 1 R 2 R 638 1R1R1R

575 9 S 1 R 2 R 639 9S1R9S

576 1 R 1 R 1 R 641 1R1R1R

577 9 S 9 S 9 S 642 1R7S9S

578 1 R 1 R 2 R 643 1R1R1R

580 9 S 1 R 2 R 645 1R1R1R

582 9 S 1 R 1 R 646 1R1R1R

583 9 S 9 S 9 S 647 1R1R9S

584 9 S 9 S 1 R 648 9S9S9S

585 7 S 9 S 7 S 649 9S7S7S

586 9 S 9 S 9 S 650 1R1R1R

587 8 S 9 S 9 S 651 1R9S9S

588 9 S 1 R 9 S 652 9S1R1R

589 9 S 9 S 9 S 653 9S9S9S

590 1 R 1 R 1 R 654 9S1R7S

592

655 1R7S9S

593

663 1R1R1R

595

671 7S9S9S

596

672 9S1R9S

597

673 1R1R1R

598

674 9S9S9S

599

675 9S9S9S

600

676 7S2R9S

601

677 9S2R9S

602

678 1R1R1R

603 9S9S9S679 1R7S9S

604 9S1R1R680 1R1R1R

605 1R1R2R681 9S8S9S

606 1R7S 9 S682 9S9S9S

607 9S9S9S683 9S9S9S

608 1R1R1R684 9S9S9S

610 1R1R1R685 1R1R1R

611 1R1R1R749 5S1R9S

612 1R1R1R815 1R1R1R

613 1R1R9 S816 1R1R1R

614 9S9S9S817 0-1R9S

615 1R1R9 S818 1R1R1R

616 1R1R9 S819 1R1R1R

617 9S7S9S863 9S7S2R

618 9S9S9S905 0-0-0-

619 8S9S9S911 9S1R9S

620 9S9S9S921 1R2R1R

621 9S1R8S926 1R1R1R

622 1R1R7 S928 1R1R1R

623 1R1R1R930 9S0-0-

624 7S1R9S937 9S9S9S

625 1R1R1R948 1R1R1R

626 9S9S9S995 1R1R1R

627 9S9S9S1052 1R8S9S

628 1R1R7 S1062

0-0-1R

629 9S1R1R1081 7S1R1R

630 1R1R1R1088 1R1R1R

631 9S9S1R1103 1R1R1R

632 1R1R9 S1114 0-0-2R

1116 0-0-0-

1121 2R9S1R

1132 1R1R2R

1135 1R0 -8S

65 8931 65 89 31

Raças do

Colletotrichum lindemuthianum

Raças do

Colletotrichum lindemuthianum

Tabela 7: Reação dos genótipos de feijoeiro inoculados com as raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum e classificação em resistentes e suscetíveis (Continuação)

4.2. Co-evolução entre Phaseolus vulgaris e Colletotrichum lindemuthianum

A diversidade genética desse patógeno e sua co-evolução com o grupo de origem do

feijoeiro Andino e Mesoamericano permitem que, além da classificação binária em raças,

seja feita uma divisão, semelhante ao seu hospedeiro, em Andinos e Mesoamericanos,

dependendo do conjunto gênico da cultivar em que o isolado foi identificado. Genótipos

mesoamericanos são predominantemente mais resistentes a isolados andinos e genótipos

andinos a isolados mesoamericanos, como descrito por Young & Kelly (1997) e Balardin &

Kelly (1998). Dessa maneira, a utilização de fontes de resistência às principais raças do

patógeno, visando a piramidação de genes andinos e mesoamericanos, constitui uma das

estratégias de programas de melhoramento para a obtenção de variedades comerciais de

resistência durável.

O BAG-Feijão do IAC é representado por acessos de origem andina,

mesoamericana, geneticamente melhorado vindo tanto do programa de melhoramento do

IAC como de outras instituições e muitos de origem desconhecida. De todo o material do

estudo, 241 foram avaliados quanto à resposta diferenciada à reação das três raças

fisiológicas do patógeno (31, 65 e 89), originalmente classificadas como mesoamericanas, e

também quanto à associação entre ambos conjuntos gênicos, do P. vulgaris e do C.

lindemuthianum.

Dos 29 acessos de origem andina, 59% apresentaram resistência, enquanto dos 37

mesoamericanos e dos 120 de origem desconhecida, apenas 37% e 31% foram resistentes,

respectivamente (Figura 2). Os resultados confirmaram o esperado, ou seja, a ocorrência de

maior número de genótipos andinos resistentes, devido aos isolados pertencerem ao

conjunto gênico mesoamericano.

No caso dos 55 acessos resultantes de programas de melhoramento genético, 55%

foram resistentes às três raças do patógeno, provavelmente resultado de seleções realizadas

para o caráter resistência a C. lindemuthianum. Dentre os 120 acessos de origem

desconhecida, 69% apresentaram susceptividade, sugerindo que a grande maioria destes

genótipos seja de origem mesoamericana, uma vez que, aliado à esta informação, os

genótipos possuem tegumentos de coloração preta e sementes pequenas, características

típicas de origem mesoamericana, conforme descrição observada no BAG- IAC.

No entanto, apesar desse resultado ter coincidido com a teoria de que genótipos

mesoamericanos são predominantemente mais resistentes a isolados andinos e genótipos

Figura 2. Resposta de acessos de feijoeiro à infecção de três raças de Colletotrichum lindemuthianum: Raça

31; Raça 65 e, Raça 89. Os acessos foram classificados segundo sua origem em mesoamericanos (MA),

andinos (A), geneticamente melhorados (GM) e desconhecidos (D). R e S: genótipos resistentes e suscetíveis,

respectivamente.

Raça 65

120

MA A GM D

R S

Raça 31

120

MA A GM D

R S

Raça 89

26 12

120

MA A GM D

R S

andinos a isolados mesoamericanos, MAHUKU e RIASCOS (2004) a partir de 200 isolados

vindos dos dois conjuntos gênicos coletados em regiões do mundo inteiro e mantidos na

coleção do CIAT, mostraram, recentemente, por meio de Rep-PCR (DNA sequence of

repetitive-elements) e RAMS (Random Amplified Microssatellites), não haver diferenças

genéticas marcantes entre isolados andinos e mesoamericanos, para serem classificados em

grupos distintos. Os dados obtidos por esses autores vão contra os obtidos pelos autores

ALARDIN e KELLY (1998) e SICARD et al. (1997), que dizem existir uma co-evolução

patógeno hospedeiro possibilitando os mesmos serem classificados em dois conjuntos

gênicos. No entanto, estão de acordo com proposta de B

ALARDIN et al. (1997); BALARDIN

et al. (1999) e F

ABRE et al. (1995), que reportam à falta de diferenças geográficas entre os

patógenos e que, portanto não se pode, conclusivamente, estabelecer que houve uma co-

evolução dentro dos conjuntos gênicos de P. vulgaris e C. lindemuthianum.

Adicionalmente, os autores M

AHUKU e RIASCOS (2004) também observaram que

dentre os isolados selecionados, a maioria era mesoamericano ainda que tenham se

originado a partir de genótipos Mesoamericanos assim como em Andinos. Essa observação

era esperada pois as raças mesoamericanas tem mostrado uma ampla virulência

MELOTTO e

KELLY (2000), e pode ser explicada pela sugestão de que o patógeno pode ter-se originado

e disseminado a partir da região mesoamericana, ou seja, a sua população ancestral é

Mesoamericana. Essa hipótese também foi suportada pelos autores Sicard et al. (1997), que

usando marcadores RAPDs e RFLP analisaram isolados do C. Lindemthianum e

observaram que os alelos encontrados nas raças vindas do Equador e Argentina também

foram observados nas raças vindas do México entranto, mais alelos foram encontrados em

populações mexicana do patógeno levando aos autores a mesma hipótese de MAHUKU e

RIASCOS (2004).

4.3. Associação dos Marcadores RAPD aos Alelos de Resistência às Raças do Patógeno

No presente estudo dentre os 248 separados, apenas 16 genótipos foram

anteriormente estudados por diversos autores, associando genes de resistência à

antracnose aos marcadores RAPDs e permitindo, dessa maneira, se fazer um

paralelo entre os resultados. Destas, 11 fazem parte do conjunto das

diferenciadoras, sendo que apenas Kabbon não foi caracterizada molecularmente

nas avaliações do IAC. Já as cultivares Sanilac, Montcalm, Raven e Pinto 114,

apesar de não fazerem parte do conjunto internacional de diferenciadoras, foram

previamente analisadas por meio dos marcadores estreitamente ligados ao loco

Co.

Os marcadores RAPDs podem estar ligados ao gene de interesse de duas

maneiras, acoplamento ou repulsão. Quando os sítios de amplificação estão

extremamente próximos um do outro em cromossomos homólogos operando

funcionalmente como alelos co-dominantes de um mesmo loco estão em repulsão ou

quando os sítios estão no mesmo cromossomo estão em acoplamento.

Um marcador em fase de acoplamento ligado ao loco Co amplifica a banda

enquanto que o marcador em fase de repulsão amplifica a banda quando ligada ao coco.

Assim, para o marcador em acoplamento a banda é

presente quando o genótipo é resistente

e homozigoto dominante (CoCo) ou heterozigoto (Coco) e ausente quando as plantas são

suscetíveis e homozigotas recessivas (coco).

Já para o marcador em repulsão, o gene CoCo ou Coco é representado pela

ausência da banda em genótipos resistentes e coco pela presença da banda em genótipos

suscetíveis. As plantas que apresentam associações diferentes dessas possivelmente

correspondem aos genótipos recombinantes. A orientação do marcador relacionada ao

genótipo da planta e ao fenótipo produzido a partir da infecção do patógeno pode ser

resumida na tabela 8.

Os marcadores RAPD são dominantes e, portanto, quando se objetiva identificar

regiões heterozigotas, utiliza-se os marcadores aos pares, ou seja, dois marcadores do tipo

RAPD ligados, cada um amplificando para um dos parentais. Por exemplo, a amplificação

de ambos marcadores do par é diagnóstico para uma região genômica heterozigota. O uso

de marcadores RAPD como codominantes mostram a importância na identificação de

genótipos em populações segregantes.

Tabela 8: Associação da orientação do marcador RAPD ao fenótipo de cada acesso de feijoeiro

lif ãd

Cll ih lid hi

acoplamento (+) repulsão (-)

Plantas resistentes CoCo

CoCo (+) CoCo (-)

Co_

Co_ (+) Co_ (+)

Plantas recombinantes

Co_ (-)

Plantas suscetíveis coco

coco (-) coco (+)

Orientação do marcador

Fenótipo Genótipo

4.3.1. Gene Co-1

O Co-1 é um gene andino que confere resistência à raça fisiológica 65 de

C. lindemuthianum. O marcador F10

foi identificado como ligado a esse gene em

fase repulsão a 1,9 cM de distância, através do qual puderam confirmar

indiretamente a presença de

Co-1 em alguns genótipos quando inoculadas com a

raça 65 do patógeno, através da ausência do fragmento de tamanho de 530 pares

de bases (pb)(YOUNG & KELLY, 1997).

Entre as cultivares do presente estudo, portadoras deste gene, estão

MDKR, Montcalm, Ravem, Sanilac, as quais não amplificaram o fragmento. Já em

Pinto 114 e AB 136 (conhecidas por não possuírem o alelo) a banda foi presente e

nos genótipos G2333 e Perry Marron, apesar de não se ter determinado a

existência do gene

Co-1, o marcador foi ausente (Figura 3). Estes resultados

foram coerentes com os descritos por Young & Kelly (1997).

Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8

(100pb)

F10

Figura 3: Amplificação do marcador F10

(530pb)

Seqüência dos indivíduos resistentes à raça 65: 1:

MDKR (

Co-1), 2: Montcalm (Co-1), 3: Sanilcac (Co-1),

4: Raven (

Co-1), 5: Pinto 114, 6: AB 136, 7: G2333 e 8:

Perry Marron (

Co-1

F10

(

530

)

A cultivar Perry Marron não amplificou o segmento, indicando a possível

presença do gene e ainda, nas avaliações quanto à infecção as três raças do

lindemuthianum, foi resistente às raças 65 e 89. Segundo Melotto & Kelly (2000),

um alelo identificado nesta cultivar é o

Co-1

e este resultado corrobora aqueles

obtidos por Pastor-Corrales

et al. (1994) e Del Peloso et al. (1989), que dizem ser

mais de um fator genético que condiciona resistência à raça 65 em Perry Marron e

em G2333. Dessa maneira, sugere-se que o marcador ligou-se a algum alelo

presente em Perry Marron.

A insuficiência de dados, da literatura, a respeito da ausência ou da presença do

gene Co-1 em genótipos dificultou as análises de associação desse marcador com o gene de

resistência. Por isso é necessário cuidado ao usar esse marcador, pois em alguns genótipos

portadores do gene a banda não é amplificada, como citado pelos autores Young & Kelly

(1997), em que a cultivar Seafearer, que possui o gene Co-1, amplificou o fragmento

correspondente ao marcador.

Ao considerar que a ausência do marcador indicou a presença deste gene, sugere-se

que a maioria dos acessos não o possui, pois grande parte deles foi suscetível e apresentou a

banda, assim como, uma pequena quantidade de acessos resistentes não amplificou o

fragmento associado à presença de Co-1. No entanto, de todos os marcadores, esse foi o

segundo que mais revelou genótipos com provável associação entre a orientação do

marcador com a presença do gene (82 genótipos). Porém, o marcador F10

(530)

é considerado

“gene-não específico”.

Nos acessos com ausência do marcador e que houve reação de compatibilidade com

o patótipo, supõe-se que existam diferentes alelos ou então, que a resistência as três raças

de C. lindemuthianum seja condicionada por outros fatores genéticos, além do alelo Co-1

(Figura 4).

4.3.2. Gene

Co-2

A cultivar Cornell 49-242, portadora do gene Co-2, é uma das mais antigas fontes

de resistência à antracnose apresentando resistência a 22 dos 35 patótipos identificados no

Brasil, entre os anos 1994 e 2000. Dentre as raças de C. lindemuthianum incompatíveis a

essa cultivar estão as raças 65 (RAVA et al., 1994; ANDRADE et al., 1999) e 31

(THOMAZELLA et al., 2000) e, compatível, a raça 89 (ALZATE-MARIN et al., 2003;

RAVA et al., 1994).

Figura 4: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador F10

(530)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

125

RSRaSa

Raça 89

100

125

RSRaSa

Raça 65

100

125

RSRaSa

Os marcadores Q4

(1440)

e H20

(450)

, identificados como ligados ao gene Co-2, estão em

fase de acoplamento e a uma distância de 5.5 e 0.5 cM do gene, respectivamente. Os

autores Costa et al. (1999) relataram a presença do gene Co-2 em populações derivadas a

partir do cruzamento entre Rudá (suscetível à raça 81) e Cornell 49-242 (resistente), a uma

distância de 33,4 cM do marcador Q4

(1440)

. Esse marcador é muito importante em programas

de melhoramento que utilizam o gene Co-2 como fonte de resistência.

Esses marcadores foram presentes na cultivar Cornell 49-242. As cultivares Perry

Marron, TU, TO e Mex 222, que possuem os genes Co-1, Co-5, Co-4 e Co-3,

respectivamente, não amplificaram o segmento associado ao Co-2 (Figuras 5a e 5b). Ao

analisar as bandas geradas em todos os acessos, verificarou-se a ausência das mesmas na

maioria dos acessos suscetíveis às infecções, permitindo inferir a ausência do gene Co-2

nesses genótipos.

Dentre os genótipos com ausência de ambos marcadores, aqueles resistentes

provavelmente possuem outros genes de resistência diferentes de Co-2 e que,

supostamente, ainda não foram identificados ou ainda pode ter ocorrido quebra de ligação.

As plantas suscetíveis que amplificaram a banda indicam que o marcador pode ter se

associado a algum fator complementar, ou ainda a algum alelo do gene. Além disso,

também supõe-se que seja um fragmento de tamanho idêntico, mas proveniente de outra

região do genoma.

As figuras 6 e 7 resumem o resultados das amplificações dos marcadores Q4

(1440)

H20

(450)

, respectivamente, nos conjuntos de acessos analisados, que foram agrupados em

função da origem dos mesmos. Considerando que isolados mesoamericanos são menos

agressivos em genótipos andinos, nota-se que os genótipos de origem andina são mais

resistentes. Essas observações foram feitas tanto nos genótipos andinos com a presença da

banda, quanto nos com a ausência da mesma. Sugere-se, dessa maneira, que não apenas o

gene Co-2 confere resistência as três raças mesoamericanas nesses acessos, mas também

que outros genes, andinos ou meoamericanos, incompatíveis ao patógeno, estariam

presentes nestes genótipos.

Essa sugestão pode ser suportada pela quantidade de genótipos geneticamente

melhorados que foram resistentes. Essas cultivares melhoradas, vindas tanto do programa

de melhoramento do IAC como de outras instituições, foram desenvolvidas para muitos

H20

Figura 5

: a) Amplificação do marcador

(1440)

. Seqüência dos genótipos: 1: Cornell

49242 (

Co-2), 2: Perry Marron (Co-1), 3: TU

(

Co-5), 4: TO (Co-4) e 5: Mex 222 (Co-3).

Figura 5: b) Amplificação do marcador

H20

(450)

. Seqüência dos genótipos: 1: Cornell

49242 (

Co-2), 2: Perry Marron (Co-1), 3: TU

(

Co-5), 4: TO (Co-4) e 5: Mex 222 (Co-3).

Ladder 1 2 3 4 5

(100pb)

Ladder 1 2 3 4 5

(

100

)

a) b)

H20

(450pb)

(1440pb)

caracteres agronômicos desejáveis, dentre os quais, resistência a C. lindemuthianum.

Portanto, essas cultivares podem conter genes vindos dos dois conjuntos gênicos.

Figura 6: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador Q4

(1440)

(Operon

Technologies).

Figura 7: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador H20

(450)

(Operon

Technologies).

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

4.3.3. Gene Co-4

O Co-4 é responsável pela resistência a muitas raças de C. lindemuthianum

e está presente na cultivar TO. Dessa maneira, a identificação desta fonte de

resistência nos acessos do BAG-IAC é muito importante para o programa de

melhoramento do feijoeiro.

Seis marcadores ligados a esse gene foram identificados em populações quando

inoculadas com a raça 65 do patógeno. Quatro deles estão em fase de acoplamento:

Y20

(800)

, C8

(900)

, I16

(830)

e J1

(1380)

, a uma distância do gene de 0,0; 9,7; 14,3 e 18,1 cM,

respectivamente, e dois em repulsão: B3

(1800)

e A18

(830)

, a 3,7 e 17,4 cM distância do gene,

respectivamente. Para selecionar os genótipos que provavelmente possuem o gene Co-4,

considerou-se pelos menos quatro marcas dos seis marcadores que apresentassem

amplificações simultâneas para o mesmo acesso.

Os marcadores B3

(1800)

e Y20

(830)

, em trabalhos anteriormente realizados (Arruda et

al., 2000), foram utilizados como par codominante. Os autores mostraram que a eficiência

do primer B3 para selecionar plantas homozigotas (CoCo) resistentes foi de 95%.

Entretanto, esse marcador não pode ser usado para plantas heterozigotas e homozigotas

suscetíveis, por não serem facilmente distinguíveis e que deveria ser usado em população

segregante com grande quantidade de heterozigotos.

As amplificações dos marcadores C8

(900)

e Y20

(830)

e B3

(1800)

nos acessos TO

(portador do gene Co-4), Montcalm (Co-1) e PI 207.262 (algum alelo de Co-4)

confirmaram o esperado. Em TO o fragmento foi presente para os marcadores C8

(900)

Y20

(830)

e, em Montcalm e PI 207.262, ausentes. Já o marcador B03 não amplificou a banda

no acesso TO e nas demais a banda foi presente (Figura 8).

A ausência da associação de orientação dos três marcadores à presença do gene Co-

4 ou ao seu alelo Co-4

em Montcalm permite inferir que a cultivar não possui este gene.

Esta hipótese é também reforçada pela ausência no mesmo genótipo dos demais marcadores

ligados ao alelo Co-4

(H18

(1100)

, L4

(1000)

, AL9

(740)

e AS13

(950)

Esses mesmos marcadores, quando testados nos acessos de feijoeiro do IAC,

revelaram perfis de amplificações bastante coerentes com orientações de cada qual, ou seja,

Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9

(100pb)

Figura 8

: Amplificação dos marcadores C8

(900)

, B3

(1800)

e Y20

(830)

. Seqüência: 1, 4 e

7: TO (

Co-4), 2, 5 e 8: Montcam (Co-1), 3, 6 e 9: PI 207.262 (Co-4

Y20

(

800pb)

(900pb)

Y20

(830pb)

opostas para o mesmo gene. O marcador Y20

(800)

na maioria dos genótipos não amplificou

a banda, assim como o marcador B3

(1800)

amplificou o fragmento em grande parte dos

acessos. Esse resultado permitem sugerir que aproximadamente 86% dos acessos não

possui tal gene (Figuras 9 e 10).

As amplificações obtidas a partir do marcador B3

(1800)

foram acentuadamente

representadas pelos acessos suscetíveis (60%), mostrando assim que a grande maioria

não possui o gene Co-4. Dentre os genótipos que amplificaram a banda, nota-se que

apenas para a raça 65 a quantidade de plantas suscetíveis foi maior (72%) que a de

resistentes. Da mesma maneira, para os marcadores C8

(900)

e Y20

(830)

, em acoplamento,

uma maior quantidade de acessos suscetíveis (67%) não amplificou o fragmento

correspondente para esses marcadores (Figuras 9, 10 e 11). Esses três marcadores foram

originalmente identificados em população inoculadas, com a raça 65 de C.

lindemuthianum (ARRUDA et al., 2000).

Entretanto, o marcador C8

(900)

não apresentou resultado tão marcante quanto o

marcador Y20

(830)

, que está ligado a 0,0 cM, enquanto que C8

(900)

está a 9,7 cM, ou seja,

numa condição mais favorável para a ocorrência de recombinação entre o marcador e o

gene. Segundo Ragagnin et al. (2001), marcadores mais próximos dos genes ligados a

uma distância inferior a 7,1 cM mantêm-se ligados enquanto que, aqueles com distância

maior podem sofrer recombinação.

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Figura 10: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador B3

(1800)

(Operon

Technologies).

Figura 9: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador Y20

(830)

(Operon

Technologies).

Figura 11: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador C8

(900)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

O resultado obtido a partir desses marcadores mostrou que dentre os acessos

resistentes com associação à orientação dos marcadores (indicando a presença do gene),

a resistência à raça 65 de C. lindemuthianum foi de 51%, enquanto que para as raças 31

e 89 foram de 42% e 30%, respectivamente.

Os marcadores J1

(1380)

e I16

(850)

, previamente identificados como ligados ao gene

Co-4 (ARRUDA et al., 2000), comportaram-se de maneira similar, ou seja, revelaram

que a maioria dos acessos (86%) não possui esse gene. Os acessos suscetíveis, às raças

31 e 89 foram em maior quantidade (61%) quando comparados com os acessos

suscetíveis à raça 65 (39%) (Figuras 12 e 13).

Figura 12: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador J1

(1380)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

O marcador A18

(830)

apresentou um resultado diferente dos demais, esperava-se

que a presença indicasse a ausência do Co-4. Por estar em fase de repulsão, como o B03,

a maioria dos acessos deveria amplificar o fragmento. No entanto, não foi o que se

observou. A banda foi ausente numa acentuada quantidade de acessos. Contrário ao

demais marcadores, caso seja considerado apenas a orientação desse marcador A18,

mostra que 217 genótipos dentre 244 possuem o Co-4. Contudo, é importante considerar

a distância desse marcador, que está a 17,4 cM do gene, possibilitando a ocorrência de

recombinações (Figura 14).

4.3.3.1. Gene

Co-4

Figura 13: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador I16

(850)

(Operon

Technologies).

Figura 14: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador A18

(830)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

O alelo Co-4

foi localizado no mesmo loco do gene Co-4 da cultivar TO,

identificado na seleção 1308 de G2333 (SEL 1308) e é responsável pela resistência à raça

2047 de C. lindemuthianum. Os marcadores identificados como ligados a esse alelo foram

AS13

(950)

, AL9

(740)

e L4

(1000)

, em fase de acoplamento e a uma distância de 0,0 e 4,5 e 0,0

cM, respectivamente.

Ao analisar as amplificações desses marcadores nas 11 variedades diferenciadoras

existentes no BAG-feijoeiro, notou-se reprodutibilidade dos resultados obtidos quando

comparados aos trabalhos realizados anteriormente com as mesmas cultivares (COSTA et

al., 2000). Os marcadores AS13

(950)

e AL9

(740)

foram presentes em G2333, TO, Widusa e

em PI 207.262 (Figura 15).

AL9

Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

(100pb)

Figura 15

: Amplificação dos marcadores AL9

(740)

, AS13

(950)

e L4

(1000)

. Seqüência dos acessos: 1, 5 e 9: G2333,

6 e 10: TO

e 11: Widusa e 4

8 e 12: PI 207.262.

AL9

0pb)

AS13

(1000pb)

AS13

(950pb)

O marcador H18

(1100)

também foi identificado como ligado em acoplamento ao alelo

Co-4

a uma distância de 5,6 cM do gene, em populações inoculadas com a raça 73 de C.

lindemuthianum. Esse marcador, assim como os anteriormente citados ligados ao Co-4

comportou-se de maneira similar, quando testado no conjunto dos acessos, cuja maioria

(74%) não amplificou o fragmento esperado podendo, dessa maneira, supor a inexistência

desse gene.

O grupo dos genótipos em que a banda foi ausente é composto, em grande parte, de

acessos suscetíveis. Para os genótipos resistentes sem a banda supõe-se que os marcadores

tenham se ligado a algum outro alelo ou que a resistência seja condicionada por fatores

complementares (Figuras 16, 17, 18 e 19).

Figura 16: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador AL9

(740)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Figura 17: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador AS13

(950)

(Operon

Technologies).

Figura 18: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador L4

(1000)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

4.3.4. Gene

Co-5

O gene Co-5 está entre os três presentes na cultivar G2333 e que são responsáveis

pela resistência a todos patótipos de C. lindemuthianum identificados no Brasil, sendo que,

os genes envolvidos na resistência às raças 73 e 89 seriam os Co-5 e Co-4

. Este gene

também está presente na cultivar TU (YOUNG & KELLY, 1996).

O marcador AB3

(450)

foi identificado como ligado ao Co-5 em fase de acoplamento,

a uma distância 5,9 cM em populações inoculadas com a raça 65 (YOUNG & KELLY,

1997).

Adicionalmente aos estudos que envolvem este gene, alguns autores tentaram

associar outros marcadores ao gene Co-5. Castanheira et al. (1999) identificaram o

marcador F10

(912)

pb em populações provenientes dos cruzamentos Carioca 300V x Ouro e

P24 x Ouro. No presente estudo, esse marcador foi considerado ligado apenas ao gene Co-

Figura 19: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador H18

(1100)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

1. Alzate-Marin et al. (1999d), estudaram populações de retrocruzamentos derivadas de

G2333 x Rudá com a finalidade de se encontrar o alelo Co-4

através do marcador H18

(1100)

e sugeriram que, estas populações continham o gene Co-5, com base na ausência desse

marcador, quando inoculadas com a raça 89 do C. lindemuthianum.

Os resultados das amplificações do marcador AB3

(530)

mostraram que 66% dos

acessos não produziram o fragmento esperado. Apesar desse resultado, este marcador foi

o que mais apresentou associação com o gene mostrando que 82 genótipos são

candidatos a possuírem o Co-5. Entretanto, no presente estudo, apenas um marcador foi

utilizado para esse gene (AB3

(450)

). Portanto, deve-se levar em consideração os possíveis

problemas existentes quando se utiliza um marcador em condições diferentes daquelas

em que ele foi originalmente identificado, como por exemplo a mudança do genótipo e o

grau de ligação entre o gene e o marcador.

Dentre os acessos que amplificaram o fragmento de 450pb para as raças 31 e 89,

os genótipos suscetíveis apareceram em maior quantidade (57%). Já para a raça 65,

dentre os genótipos que amplificaram a banda, os resistentes foram em maior quantidade

(56%) (Figura 20).

Figura 20: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidos à infecção das raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador AB3

(450)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

4.3.5. Gene

Co-6

A variedade AB136 é geralmente utilizada no Brasil como parental doador do gene

Co-6 em retrocruzamentos, visando a criação de cultivares resistentes à antracnose, por

mostrar-se incompatível a todas as raças de C. lindemuthianum identificadas no país.

O marcador AZ20

(940)

foi identificado originalmente ligado a esse gene em

acoplamento e à distância de 7,1 cM em populações inoculadas com a raça 89 de C.

lindemuthianum. O marcador AH1

(780)

foi identificado em acoplamento ao Co-6 e o

AK20

(890)

em repulsão, distantes a 12,3 cM e a 7,3 cM do gene, respectivamente (YOUNG

& KELLY, 1997).

Alzate-Marin et al. (1999c) também identificaram na cultivar AB136 outros dois

marcadores ligados em fases opostas ao mesmo gene: Z4

(560)

e Z9

(950).

O marcador Z4

(560)

está ligado em acoplamento a uma distância de 8,5 cM do gene enquanto que o Z9

(950)

está

em repulsão a 20.4 cM de distância. Complementando estudos relacionados ao gene Co-6,

Gonçalves-Vidigal et al. (2001) identificaram o marcador Z4

(560)

ligado a 1,7 cM de

distância de Co-6 na cultivar AB136, conferindo resistência às raças 31 e 69. Os autores

concluíram que este gene é o mesmo anteriormente identificado como responsável pela

resistência às raças 89, 73, 81 e 64 ou, então, que este gene está no mesmo bloco de ligação

que controla a resistência a essas raças.

Os marcadores Z9

(950)

, Z4

(560)

, AH1

(780)

e AZ20

(940)

foram testados nas cultivares

AB136 (fonte do Co-6) e na Perry Marron fonte do Co-1

. Na cultivar AB136 o marcador

(950)

não amplificou o segmento, pois este está ligado em repulsão ao gene enquanto que

na cultivar Perry Marron produziu a banda de 950pb, confirmando a ausência do gene. O

marcador AH1

(780)

não produziu o fragmento e o marcador AZ20

(940)

apresentou a banda

quando testado em AB136. Embora as amplificações desses três marcadores sejam

coerentes, o marcador Z4

(560)

mostrou resultado contrário ao esperado. Esperava-se

ausência do mesmo em Perry Marron e presença em AB136.

Ladder 1 2 3 4 5 6

(250pb)

AH1 AZ20

AH1

(780pb)

AZ20

0pb)

(950pb)

(560pb)

Figura 21:

Amplificação dos marcadores Z9

(950)

, Z4

(560)

, AH1

(780)

e AZ20

(940)

. Seqüência dos

acessos: 1, 3 e 5: Perry Marron, 2, 4 e 6: AB136.

Os resultados das amplificações obtidas com os marcadores AK20

(890)

, AZ20

(940)

com o AH1

(780)

indicaram que 77% dos genótipos possuem o gene Co-6. Apesar desses

acessos mostrarem associação entre o marcador e a presença do gene, cerca de 66% deles

são suscetíveis. Essa diferença entre os resultados das análises moleculares com os das

inoculações permite sugerir que a resistência, nesses genótipos, não seja conferida por

apenas Co-6. Possivelmente existam outros alelos ou fatores complementares atuando na

resistência (Figuras 22, 23 e 24).

Figura 22: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador AK20

(890)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Figura 23: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador AZ20

(940)

(Operon

Technologies).

Figura 24: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador AH1

(780)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Com as amplificações com os marcadores Z9

(950)

e Z4

(560)

foi possível classificar os

acessos em quantidades praticamente iguais em relação à presença ou ausência destes

marcadores. No entanto, ambos marcadores estão em orientações opostas para o mesmo

gene e, por isso, esperava-se resultados semelhantes aos demais marcadores usados como

pares codominantes, como B3

(1800)

com Y20

(830)

ou AK20

(890)

, AZ20

(940)

e AH1

(780)

, que

indicaram resultados concordantes, apesar de terem revelado quantidade de bandas com

valores opostos.

O primer Z4 amplificou o fragmento esperado (560pb), tanto para os genótipos

resistentes quanto para os suscetíveis. Dentre os acessos suscetíveis (com a presença da

banda) as raças 89 e 31 mostraram-se pouco mais agressivas (58%) se comparadas à raça

65, em que a banda foi presente em praticamente 50% dos acessos, tanto resistentes quanto

suscetíveis. Esse marcador foi identificado como ligado ao gene Co-6, responsável por

conferir resistência a muitas raças do patógeno, inclusive às raças 89 e 31. Sendo assim, o

que se nota é que apesar do marcador estar presente para estas duas raças, indicando a

presença do gene, ele não é suficiente para proporcionar a resistência total em alguns

genótipos.

Resultado similar se observa para o marcador Z9

(950)

, em que sua ausência foi

observada tanto para os genótipos resistentes quanto para os suscetíveis. Para as raças 31 e

89 os genótipos resistentes apresentaram-se em menor quantidade, 40% e 26%,

respectivamente. Já para a raça 65, 44% dos acessos sem a banda são resistentes. Tanto o

primer Z4 quanto o Z9, produziram resultados coerentes com a resistência dos genótipos,

quando submetidos à infecção pela raça 65, embora não seja a mesma originalmente

avaliada para esses marcadores (Figuras 25 e 26).

O marcador Z4

(560)

foi mapeado como ligado ao gene Co-6 para as raças 89, 73, 81

e 64, nas distâncias de 8,5; 2,9; 2.8 e 7,5 cM do loco, respectivamente (ALZATE-MARIN

et al., 1999b). No caso dos resultados obtidos com a raça 65, o marcador poderia estar

ligado mais próximo ao gene ou a algum outro alelo responsável pela resistência a esta

raça. Para a raça 89, podemos supor que a distância entre o marcador e o gene tenha

interferido no resultado, pois foi originalmente mapeado a uma distância maior que 7,1 cM,

permitindo possíveis recombinações.

Figura 25: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador Z4

(560)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

4.4. Considerações Gerais

Alguns marcadores mostram-se mais eficientes do que outros, produzindo bandas

mais intensas e de melhor visualização. A reprodutibilidade dos experimentos baseados em

RAPD pode ser baixa, se alguns cuidados básicos não forem tomados, como a otimização

da condição de reação para a espécie e condução adequada e padronizada dos experimentos

como descrito por Penner et al. (1993) e Wang et al. (1993).

Figura 26: Acessos de feijoeiro de diferentes origens submetidas à infecção pelas raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum, em que ocorreram amplificações RAPD do marcador Z9

(950)

(Operon

Technologies).

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Ra e Sa: Acessos resistentes e suscetíveis, com a ausência da banda, respectivamente

Raça 31

100

150

RSRaSa

Raça 65

100

150

RSRaSa

Raça 89

100

150

RSRaSa

Embora cuidados necessários para se realizar as reações tenham sido adotados,

ainda assim alguns marcadores apresentaram perfis de amplificações melhores que outros.

Dentre os que apresentaram melhores amplificações destacam-se F10

(530)

, AS13

(950)

H18

(1100)

, A18

(830)

, C8

(900)

, AL9

(740)

, L4

(1000)

, Z9

(950)

e I16

(850)

(Tabela 9).

O resultado obtido neste trabalho foi inesperado. Era esperado encontrar marcadores

que pudessem ser padronizados para seleção de fontes de resistência nos genótipos, bem

como apontar marcadores ainda não identificados ligados a genes de resistência, e isso não

aconteceu.

No caso dos resultados inesperados, tanto para presença como ausência do

marcador, deve-se considerar que tanto as raças de C. lindemuthianum inoculadas quanto os

genótipos do BAG de feijão utilizados no presente estudo não coincidem totalmente com o

Tabela 9: Número de acessos de feijoeiro do BAG-IAC, que amplificaram os marcadores ligados a

genes de resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum.

65 31 89 Q4 AK20 F10 AS13 AZ2

J01 Z9 H20 H18 Z4 A18 C8 B3 L4 AL9 I16 AB3 Y20 AH1

RRR12 35 28 15 43 732 4 10 22 4626172120 10 24 6 7

S S S 10 63 36 35 78 10 64 4 13 36 82 31 18 25 15 15 27 14 13

R S S 0 16 9 6 20 1 14 0 2 10 24 11 4 6 5 2 10 1 4

SRS2159922013121222103731642

SSR3134412240341471213510

RRS31668152121081453364762

SRR0301 302022410000030

RSR3105513172481470422631

R: acesso resistente; S: acesso suscetível

Marcadores

Reação em

Laboratório

Locos em repulsão cuja presença de banda foi invertida para ausëncia indicando a presença do gene

material utilizado nos estudos anteriormente realizados, a partir dos quais os marcadores

foram identificados.

Os genótipos resistentes, em que houve coincidência com uma das orientações do

marcador possivelmente possuem o gene ou genes compatíveis as três raças de C.

lindemuthianum avaliadas no estudo. Entretanto, muitos deles mesmo sendo resistentes não

revelaram associação com o marcador. Neste caso, sugere-se que tenha ocorrido quebra da

ligação por recombinação ou que se trata de um outro gene de resistência não identificado,

como ligado a algum dos marcadores relacionados neste estudo.

As plantas suscetíveis que amplificaram marcadores ligados a genes de resistência

indicam que, apesar da existência de algum gene de resistência, este não foi suficiente para

condicionar a resistência total as três raças, ressaltando a interação gene “raça-específico".

Deve-se ainda citar a possibilidade da ocorrência de quebra de ligação entre o marcador e o

loco ou que o fragmento amplificado, apesar de ter o mesmo tamanho esperado, conforme

literatura, seja proveniente de outra região do genoma.

Os marcadores RAPDs previamente associados aos genes de resistência à

antracnose mostraram-se bastante eficientes quando aplicados nas mesmas cultivares em

que foram originalmente identificados. No entanto, quando utilizados em todos os acessos,

muitos dos quais desconhecidos, notou-se que para alguns marcadores a mudança do

genótipo e ou da raça do patógeno comprometeu a utilidade dos mesmos.

Com isso, se por um lado os marcadores têm se mostrado como uma forte

ferramenta em auxílio ao programas de melhoramento genético, que visam a identificação

de genes de resistência e o desenvolvimento de variedades melhoradas, por outro, as

diferenças nas condições ideais para a sua utilização podem limitar o impacto esperado no

melhoramento assistido pelos mesmos. Assim, tendo em vista as observações nas análises

moleculares obtidas em relação à literatura citada dos mesmos e com o objetivo de inferir

sobre os possíveis genes presentes nos acessos analisados, encontram-se na tabela 10

aqueles que apresentaram as melhores associações com os marcadores e que são sugeridos

como possíveis fontes de genes de resistência as três raças de C. lindemuthianum.

Os resultados obtidos no presente estudo permitem estabelecer uma

associação de co-evolução entre o hospedeiro

P. vulgaris e o patógeno C.

lindemuthianum

. Os acessos cujas marcas identificaram a presença de um dos

Tabela 10: Acessos de feijoeiro com possíveis genes de resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum.

Uberabinha

Co-1 Co-4(2)

A-ICA-TUI

Co-4(2) Co-5 Co-6

Baetão-30273

Co-5 Co-6

Red Kidney Co-1 Co-5 Jamapa Co-1 Co-5 México-115 Co-1 Co-6

Puebla-152 Co-5 Co-6 A-211 Co-1 Co-5 Co-6 73VU-3210 Co-1 Co-6

IAPAR-57 Co-1 Co-5 Co-6 Tupi Co-1 Co-4(2) Co-6

IAPAR-72 Co-1 Co-6 Preto-196 Co-1 Co-4(2) Co-6

MD-806

Co-1 Co-6

ECU-208

Co-1 Co-6

Pato de Minas

Co-1 Co-5 Co-6

EMP-81

Co-1 Co-6

TIB-3042

Co-5 Co-6

Porrillo-1

Co-1 Co-5 Co-6

Tarumã

Co-1 Co-6

Widusa

Co-1 Co-4(2) Co-5

Small White 59 Preto

Co-1 Co-6

Pompador Co-1 Co-5 G2338 Co-1 Co-5 BB Lake Co-4(2) Co-5 Co-6

Oito e Nove Co-5 Co-6 Turrialba-1 Co-1 Co-5 Copinho Grande Preto Co-4(2) Co-6

Alemão Co-1 Co-6 Carioca MG Co-5 Co-6

mar/02 Co-4 Co-5 Co-6 Baetão-CF-840856 Co-1 Co-6

HF5465-63-1

Co-1 Co-5 Co-6

Preto-146

Co-1 Co-6

PI-310724

Co-4(2) Co-5

Co-1 Co-6 Co-5

México-12

Co-4(2) Co-5 Co-6

Jalo-110

Co-1 Co-5

Co-1 Co-4 Co-4(2) Co-5

Tenderete

Co-1 Co-5

Jamapa

Co-1 Co-4

G2333 Co-1 Co-4(2) Co-5 A-449 Co-4(2) Co-5 Jalo Co-2 Co-4(2)

Mex-279 Co-4(2) Co-6 Mare/01 Co-5 Co-6 EMP-408 Co-1 Co-5

Mex-222 Co-4(2) Co-5 Co-6 Antioquia-8 Co-5 Co-6 Barbunya Co-1 Co-5

mar/03 Co-4 Co-4(2) Co-5 A-21 Co-5 Co-6 Mex-54 Co-1 Co-5

Durango-222 Co-1 Co-4 Co-4(2) Co-5 IAPAR-81 Co-4(2) Co-5 Amendoin FEB-29 Co-1 Co-5

G5207 Co-1 Co-4 Co-5 Co-6 DOR-391 Co-1 Co-5 RIZ-30 Co-1 Co-5

RAZ-49 Co-4(2) Co-6 DOR-482 Co-1 Co-4(2) Co-5 PI-165426 Co-1 Co-5

RAZ-59 Co-4(2) Co-6 RAZ-43 Co-5 Co-6 DOR-390 Co-4(2) Co-5

RAZ-55 Co-1 Co-4(2) Co-6 Cavalo Amarelo Co-5 Co-6 DOR-391 Co-1 Co-5

Batista Brilhante(CB) Co-1 Co-6 Xan-112 Co-1 Co-4(2) Co-5

G11796

Co-1 Co-5

Mulata Gorda Co-1 Co-5 Xan 251 Co-5 Co-6

Baetão-N314-EEAL

Co-1 Co-5

D. Calina

Co-4 Co-5 Co-6

Sem. Gde. Cor Vinho

Co-5 Co-6

G2858

Co-1 Co-4(2)

Jalo Itararé

Co-2 Co-4

Cal-143

Co-1 Co-5

Montcalm Co-1 Co-5 Bat-477 Co-5 Co-6

PI-329247 Co-2 Co-4(2) Co-6 Contender Co-1 Co-6

Cornell-49242 Co-1 Co-2 Co-5

Co-1: Co-4(2):

Co-2 : Co-5 :

Co-4 : Co-6 :

Z4(560pb); Z9(950pb)

AK20(890pb); AZ20(940pb); AH1(780pb);

Marcadores associados aos principais genes de resistência a C. lindemuthianum

J1(1380pb); A18(830pb); C8(900pb);

B3(1800pb); I16(850pb); Y20(830pb)

Q4(1440pb); H20(450pb)

F10(530pb) AS13(950pb); L4(1000pb); AL9(740pb);

AB3(450pb)

Resistente às raças 65 e 89

Resistente às raças 31 e 65

Resistente às raças 31, 65 e 89 Suscetível às raças 31, 65 e 89

Resistente à raça 65

Resistente à raça 31

Resistente à raça 89

genes de resistência foram grupados em resistentes e não resistentes e, dentro de

cada grupo, subdivididos em função do local de origem dos mesmos. O marcador

F10

(530)

foi identificado como ligado ao gene andino Co-1 em fase repulsão a 1,9

cM de distância do gene (Y

OUNG e KELLY, 1997), através do qual pode-se

confirmar indiretamente a presença do gene em algumas cultivares. Os

marcadores Q4

(1440)

e H20

(450)

foram identificados como ligados ao gene

mesoamericano

Co-2, à distância de 5,5 (YOUNG e KELLY, 1996) e 0,5 cM

DAMBLONDON et al., 1994) do gene, respectivamente.

O marcador F10

(530)

foi observado majoritariamente naqueles acessos de origem

andina que apresentaram incompatibilidade às raças do patógeno, enquanto que os acessos

suscetíveis foram mais representados por mesoamericanos (Figura 27).

Resultados similares podem ser observados para os marcadores Q4

(1440)

e H20

(450)

ambos ligados ao gene mesoamericano Co-2. As amplificações obtidas a partir desses

marcadores mostram que dentre os acessos apresentando com a banda, os de origem andina

Raça 31

100

Mesoamericano Andino

Geneticamente Melhorado Desconhecido

Raça 89

100

Raça 65

100

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Figura 27: Amplificações do marcador F10

(530)

associadas à co-evolução entre Phaseolus vulgaris e

Colletotrichum lindemuthianum, raças 31, 65 e 89.

foram mais resistentes se comparado aos mesoamericanos. Esses resultados reforçam a

teoria de que, genótipos andinos tendem a ser mais resistentes a isolados mesoamericanos,

como preconizado por B

ALARDIN e KELLY (1998) e MELOTTO & KELLY (2000) (Figuras 28

e 29).

Raça 89

100

Raça 65

100

Raça 31

100

Mesoamericano Andino

Geneticamente Melhorado Desconhecido

Raça 89

100

Raça 65

100

R e S: acessos resistentes e suscetíveis com a presença da banda, respectivamente.

Figura 28: Amplificações do marcador Q4

(1440)

associadas à co-evolução entre Phaseolus vulgaris e

Colletotrichum lindemuthianum, raças 31, 65 e 89.

Figura 29: Amplificações do marcador H20

(450)

associadas à co-evolução entre Phaseolus vulgaris e

Colletotrichum lindemuthianum, raças 31, 65 e 89.

Raça 31

100

Mesoamericano Andino

Genticamente Melhorado Desconhecidos

5. CONCLUSÕES

O presente estudo conclui que:

a) As análises moleculares realizadas sugerem que o gene Co-6 é o mais

freqüente entre os 248 acessos, com 64 genótipos candidatos a portadores do gene. Os

melhores marcadores para este gene foram: AZ20

(940)

, AK20

(890)

e AH1

(780)

. Os genes

Co-1 e Co-5 estão presentes em 91 e 82 acessos, apresentando associação com os

marcadores F10

(530)

e AB3

(450)

, respectivamente. Ao contrário do gene Co-6, que possui

vários marcadores, o grau de confiança sobre a presença deste gene nos acessos é menor

por possuir apenas um marcador. Para o alelo Co-4

as amplificações dos marcadores

(1000)

, AS13

(950)

e AL9

(740)

indicaram 35 acessos portadores deste alelo. Já para o gene

Co-4, apenas 13 genótipos devem possuir este gene, cujos marcadores são B3

(1800)

(900)

. O gene Co-2 apresentou menor freqüência de ocorrência, com somente quatro

possíveis cultivares candidatas a portadoras desse gene.

b) Dentre os 248 acessos, os mais indicados como melhores fontes de genes de

resistência as três raças 31, 65 e 89 de C. lindemuthianum seriam os genótipos Durango-

222 (Co-1, Co-4, Co-4

e Co-5) e G5207 (Co-1, Co-4, Co-5 e Co-6), contendo cada um

quatro genes; para resistência às raças 65 e 89 pode-se indicar o acesso PI-329247 (Co-

2, Co-4

e Co-6), enquanto que para a resistência às raças 31 e 65 seria indicado o

genótipo D. calima (Co-4, Co-5 e Co-6).

c) A identificação da presença e ausência dos marcadores nos acessos resistentes

à antracnose e, conseqüentemente, de um ou mais genes de resistência a C.

lindemuthianum, abre novas perspectivas de utilização dos marcadores moleculares na

seleção assistida, que futuramente poderá ser associada a outros caracteres de

importância agronômica.

d) No caso dos acessos resistentes à antracnose, em que não foi possível associar

qualquer marcador, evidencia-se que novas fontes de resistência a C. lindemuthianum

podem estar presentes nesses acessos.

6. PERSPECTIVAS

Uma das principais atividades do Instituto Agronômico-IAC é o

desenvolvimento de variedades e cultivares de feijoeiro melhoradas, sendo que muitas

cultivares já foram disponibilizadas aos agricultores. Praticamente todas as cultivares e

ou variedades de plantas existentes foram obtidas por meio de procedimentos

convencionais de melhoramento genético.

Não diminuindo a importância e a eficiência do melhoramento convencional,

tem-se observado uma participação cada vez maior de técnicas de marcadores

moleculares no apoio a programas de melhoramento genético de plantas em outros

países. Com isso, o presente estudo se apresenta como uma aplicação dos marcadores

moleculares em apoio a um importante programa de melhoramento genético do IAC,

como é o do feijoeiro, com praticamente 70 anos de existência, sendo que, os benefícios

proporcionados por essa ferramenta poderão ser observados de imediato. A confirmação

dos marcadores, associados a alguns genes de resistência à antracnose, possibilitará a

realização da piramidação dos genes de forma rápida e segura, por meio da seleção

assistida por marcadores.

Numa fase seguinte, as bandas de RAPD de cada gene poderão ser purificadas e

clonadas, para posterior seqüenciamento e obtenção de novos SCARs (Sequence

Characterized Amplified Regions), para os genes de resistência à antracnose que ainda

não foram feitos. A conversão de marcadores do tipo RAPDs em marcadores SCARs,

associados a genes de resistência a doenças, tem propiciado ao melhorista rapidez e

praticidade na identificação de plantas com fontes de resistência à doença.

Os SCARs, assim como os RAPDs, são técnicas simples de serem

implementadas e poderão ser incorporadas como rotina na aplicação da seleção assistida

por marcadores, em programas de melhoramento. Ainda, os genes identificados poderão

ser mapeados e clonados para transformação genética.

7. REFERÊNCIAS

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APÊNDICE

Acesso

Q4 AK20 F10 AS13 AZ20 J1 Z9 H20 H18 Z4 A18 C8 B3 L4 AL9 I16 AB3 Y20 AH1

65 31 89

1RRR

11 1 ?1 1

28 R R R 11 1 1 11 1 1

33 R R R

11 1 1 11111 ?

50 R R R 1111 111 ?

71 R R R 11 1 1 11 1 11 ? 1

72 R R R

111?

73 R R R 111 11 ?

74 R R R 11 1 1 111 1

109 R R R 11 1 1 1 1 1 1 1 1

339 R R R

1111 1 1

494 R R R 1111 1

525 R R R 11 111

533 R R R

111 1 11 1

568 R R R 11 1 1 1 111 1 1

569 R R R 11 1111 1

570 R R R

11 1 11 1 1

574 R R R

11 11 1 1

576 R R R 11 1 111 1 1

578 R R R 11 1 1 1 1

590 R R R

111 11 1

593 R R R 1111111

597 R R R 11111111 1

605 R R R

11111111

608 R R R 11 1 1 1 1 11 1 1

610 R R R 11 111 1

611 R R R 111 1 1 111 1 1

612 R R R

11 111 1111

623 R R R 11 111 1

625 R R R 111111 1?

630 R R R

11 1 1 1 1 1?

637 R R R 11 111 1 ?

638 R R R 11 1 11 11 1 ?

641 R R R 11 111111?

643 R R R

11 1 1 111 11 1 1

645 R R R 11 1 1 ? 1 1 1 1 ?

646 R R R 111?111?

663 R R R

1111111111?

673 R R R 11 111?

678 R R R 11 1 1 1 1 1 1 1 1 ? ?

680 R R R

111 1 11 1 1 1 11

685 R R R 111 1 11111 1 1 1

815 R R R ?111 1? 1??

816 R R R 111 1 1 ?

818 R R R

11 1 1 1 1 11 1 ? ? ?

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921 R R R 111 11111 ? ?

926 R R R

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948 R R R ?1 11 ?1?

1088 R R R ?1 1 1 1 1 1 ? ?

1103 R R R 1 1 1 1 11 11 ? ?

1132 R R R

11 111111?

Raças

Acessos de feijoeiro do BAG-IAC, que amplificaram os marcadores RAPD ligados a genes de

resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum.

Acesso

Q4 AK20 F10 AS13 AZ20 J1 Z9 H20 H18 Z4 A18 C8 B3 L4 AL9 I16 AB3 Y20 AH1

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17 S S S 11 1 1

21 S S S 11 1 1

24 S S S 11 11

25 S S S

11 1 1 1 1

32 S S S 11 1 1 1 1 ?

56 S S S 111 1 1 1 ? 1

75 S S S 1111111 1

83 S S S 11 111 1

89 S S S

11 1 1 1

90 S S S 11 1 ? 1 1 ?

99 S S S 11 111 1

114 S S S 11 1

121 S S S 111

138 S S S

11 1 1

149 S S S 1111111 1

152 S S S

111 111

154 S S S 11 1 1 11 1 1

172 S S S 111 111

186 S S S 11 1 1 1 11

196 S S S 11 111 1

203 S S S

11 11111

225 S S S 11 111

236 S S S 11 111

239 S S S 11 11

251 S S S 11 1 11 11

254 S S S

11 111 1

257 S S S 111 111 ?

267 S S S 11 11 1

271 S S S 111 111

276 S S S 11 1 11 1

278 S S S

11 1 111 1

287 S S S 111 11

296 S S S 11 1 1

297 S S S 11 1 1 1 1

311 S S S 11 1 11 1

316 S S S

1111 111111

317 S S S 111 1 11 1

319 S S S 11 1 1 1

320 S S S 11 1 11 1

325 S S S 111 11 1 1

348 S S S

1111 11

349 S S S 11 1 111 1 1

350 S S S

11 111

368 S S S 1111111 ?

389 S S S 111 1 1111

393 S S S 111 ?11

431 S S S 111 1 11 11

443 S S S

1111111

445 S S S 1111 1111 1

449 S S S 111 11 11 11

455 S S S 111111

Raças

Acessos de feijoeiro do BAG-IAC, que amplificaram os marcadores RAPD ligados a genes de

resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum.

Acesso

Q4 AK20 F10 AS13 AZ20 J1 Z9 H20 H18 Z4 A18 C8 B3 L4 AL9 I16 AB3 Y20 AH1

65 31 89

462 S S S

1111111 1

465 S S S 11 1111 11

481 S S S 111 1 1 1 1 1

485 S S S

111 1 1 1

492 S S S 11 1 11 11 1

499 S S S 11 1111 1

528 S S S

11 11111

531 S S S 11 1 1 11 1

543 S S S 111 11 1111 1 11

544 S S S 11 1 1 1 1

550 S S S 111111111

572 S S S

11 1 1 11 1

577 S S S 11 1 1 1111 11

583 S S S 11 111

585 S S S 1111111 1

586 S S S 11 1111

587 S S S

11 111

589 S S S 111111

596 S S S 111

598 S S S 11 1 1 1

603 S S S 111 1 111 1

607 S S S

11 1 11 1

614 S S S 111 11 1 ?

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11 1 111

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620 S S S 11 111

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681 S S S 11 1 11 1111 1

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683 S S S 11 111111

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11 1111

930 S S - 11 1 11 1 1 ?

427 S S R 111 11

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1111 1111 ?

385 S S R 11 11

415 S S R 111111111 1

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521 S S R 11 11 1 1111 ?

534 S S R

11 1 1 1 1 1

559 S S R 11 1 1 11 11

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631 S S R ?1111?

Raças

Acessos de feijoeiro do BAG-IAC, que amplificaram os marcadores RAPD ligados a genes de

resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum

Acesso

Q4 AK20 F10 AS13 AZ20 J1 Z9 H20 H18 Z4 A18 C8 B3 L4 AL9 I16 AB3 Y20 AH1

65 31 89

636 S S R

11?1 ?11 1 ?

649 S S R 11 1 1 1 1 1 1 ?

863 S S R 11 1 1 1 ? 1

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567 R S S

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588 R S S 111 1 111 1 1

595 R S S 111 1111 11

600 R S S 11 11111 1

601 R S S

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621 R S S 111111 1

624 R S S 11 111 1?

639 R S S 11 11 1?

Raças

Acessos de feijoeiro do BAG-IAC, que amplificaram os marcadores RAPD ligados a genes de

resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum.

Acesso

Q4 AK20 F10 AS13 AZ20 J1 Z9 H20 H18 Z4 A18 C8 B3 L4 AL9 I16 AB3 Y20 AH1

65 31 89

642 R S S

111 1 11 1 1 1

654 R S S 11 111111?

672 R S S 11 1 1 1 1 1??

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573 R S R 11 1 1111 11 1 1 1

575 R S R 11 1 11 11 1

580 R S R

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111 1 1 1 1 1 1

566 R R S 11 111 1

592 R R S 11 1 1 1 1 11 1

613 R R S 11 11 11?

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616 R R S

11 1 11 1 1

622 R R S 111 1 1 1111 1

628 R R S 11 11111

632 R R S 1 111 ?

647 R R S 11 1 11?

911 R R S

1111111?

937 R R S 111 11 1 1 ? ?

Locos em repulsão cuja a presença de banda foi invertida para a ausência indicando a presença do gene.

Raças

Resistente à 31 Resitente à 31 e 89

Resistente à 65 Resistente à 31 e 65

Genótipos com a presença da banda

Suscetível às três raças Resistente à 89

Resistente às três raças Resistente à 65 e 89

Acessos de feijoeiro do BAG-IAC, que amplificaram os marcadores RAPD ligados a genes de

resistência às raças 31, 65 e 89 de

Colletotrichum lindemuthianum.

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