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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIENCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
ASSOCIAÇÃO DE FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS
COM ESPÉCIES FLORESTAIS NATIVAS DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Robson Andreazza
Santa Maria, RS, Brasil
2006
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ii
ASSOCIAÇÃO DE FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS
COM ESPÉCIES FLORESTAIS NATIVAS DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL
por
Robson Andreazza
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciência do Solo, Área
de Concentração em Biodinâmica e Manejo do Solo, da Universidade Federal de
Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciência do Solo
Orientadora: Prof. Dr. Zaida Inês Antoniolli
Santa Maria, RS, Brasil
2006
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iii
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado
ASSOCIAÇÃO DE FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS COM
ESPÉCIES FLORESTAIS NATIVAS DO ESTADO DO RIO
GRANDE DO SUL
elaborada por
Robson Andreazza
Como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciência do Solo
COMISSÃO EXAMINADORA
_______________________
Zaida Inês Antoniolli
(Presidente/Orientadora)
_______________________
Osmar Klauberg Filho
(UDESC)
_______________________
Solon Jonas Longhi
(UFSM)
Santa Maria, 24 de Fevereiro de 2006
iv
A vocês dedico, meus pais, que sempre me deram apoio, incentivo nos
momentos difíceis, e por mais complicados que fossem, nunca deixaram de
acreditar que eu era capaz. Amo vocês pela compreensão e carinho.
A vocês que me deram esta oportunidade.
EU DEDICO
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois a benção da vida é a coisa mais importante, e as
dificuldades são pequenas coisas que diante dela, tornam-se insignificantes.
“O senhor é o meu pastor, e nada me faltará”.
À professora Zaida Inês Antoniolli pela orientação, mas acima de tudo,
pela amizade e ensinamentos diários que me proporcionou durante esses anos
de convivência.
À FEPAGRO (Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária) de Santa
Maria – RS, pelas sementes doadas e auxilio técnico. Principalmente, ao
Diretor Nelson Henrique Abiatti da Silva e Fabio Luíz Fleig Saidelles pelo
suporte a pesquisa e orientações. Especialmente, ao funcionário Paulo
Pedrollo pela ajuda no campo e grande amizade conquistada pela nossa
convivência.
À Professora Vetúria L. de Oliveira pela orientação, apoio e
conhecimento transmitido ao longo deste percurso com toda a paciência e
dedicação.
Ao amigo Luiz Borges pela orientação, hospitalidade, amizade e ajuda
fornecida quando precisei.
Aos bolsistas Carlos Moro Junior e Lineu Leal pela convivência,
amizade, ajuda responsável durante a execução deste trabalho e pelos finais
de semanas e feriados dedicados a pesquisa.
Ao Laboratorista Antônio Bassaco pela amizade e ajuda quando
necessitada, sempre realizada com boa vontade.
Aos colegas de curso Rodrigo Ferreira da Silva e Ricardo Bemfica
Steffen, pelo dia a dia compartilhado juntos, amigos que serão sempre
lembrados como pessoas integras e de bom coração.
A CAPES pela bolsa de estudos e auxílio financeiro.
A minha noiva Simone pela ajuda, apoio, carinho e amor, pois sempre
que precisei foste incondicional.
vi
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................. xi
ABSTRACT ............................................................................................................. xiii
LISTA DE TABELAS............................................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................. x
1 INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................... 15
2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 17
CAPÍTULO I OCORRÊNCIA DE MICORRIZAS EM PLANTIO DE
ESSÊNCIAS FLORESTAIS NATIVAS DO ESTADO DO RIO GRANDE
DO SUL.....................................................................................................................
18
1 RESUMO.............................................................................................................. 18
2 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 19
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 22
3.1 Espécies nativas estudadas................................................................................
3.2 Caracterização das áreas coleta.......................................................................
3.3 Coleta das amostras...........................................................................................
3.4 Coletas de corpos de frutificação dos fungos ectomicorrízicos......................
3.5 Isolamento e multiplicação................................................................................
3.6 Coleta de raízes e solo........................................................................................
3.7 Avaliações das raízes.........................................................................................
3.8 Identificação dos esporocarpos.........................................................................
3.9 Análises químicas do solo..................................................................................
3.10 Análises estatísticas..........................................................................................
22
22
23
23
23
24
24
24
24
25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 26
4.1 Associações micorrízicas................................................................................... 26
4.2 Caracterização química do solo........................................................................ 29
5 CONCLUSÕES.................................................................................................... 38
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 39
CAPÍTULO II. FORMAÇÃO DE ECTOMICORRIZAS EM GRÁPIA
(Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride) E CANAFÍSTULA (Peltophorum
dubium (Sprengel) Taubert) EM CONDIÇÕES in vitro......................................
44
1 RESUMO............................................................................................................... 44
2 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 45
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 49
3.1 Esterilização das sementes.................................................................................
3.2 Germinação das sementes.................................................................................
3.3 Preparação dos erlenmeyers.............................................................................
3.4 Multiplicação dos isolados com meio MNM...................................................
3.5 Inoculação das plântulas...................................................................................
3.6 Condução do experimento.................................................................................
3.7 Parâmetros analisados.......................................................................................
49
49
49
50
50
50
51
3.7.1 Altura de planta................................................................................................. 51
3.7.2 Massa verde da parte aérea e do sistema radicular e massa seca da parte
aérea..........................................................................................................................
51
3.7.3 Colonização micorrízica................................................................................. 51
3.8 Análise estatística............................................................................................... 52
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 53
vii
5 CONCLUSÕES..................................................................................................... 58
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 59
3 CONCLUSÃO GERAL E PERSPECTIVAS FUTURAS ................................
4 ANEXOS................................................................................................................
63
64
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I OCORRÊNCIA DE MICORRIZAS EM PLANTIO DE
ESSÊNCIAS FLORESTAIS NATIVAS DO ESTADO DO RIO GRANDE DO
SUL
Tabela 1 - Presença (+) ou ausência (-) de colonização endomicorrízica (END) e
ectomicorrízica (ECT) encontradas em seis espécies florestais nativas do Estado do
Rio Grande do Sul, Santa Maria, RS, 2006.....................................................................
27
Tabela 2 – Ocorrência de fungos ectomicorrízicos em três diferentes épocas do ano
em seis espécies florestais nativas do Estado do Rio Grande do Sul, Santa Maria, RS,
2006..................................................................................................................................
28
Tabela 3 - Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por
bases (S), saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K) e
alumínio (Al) do solo, em três épocas de coleta, em bosque de Araucária, Santa
Maria, RS, 2006...............................................................................................................
30
Tabela 4 - Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por
bases (S), saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K),
alumínio (Al) cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em
Floresta de Canafístula, Santa Maria, RS, 2006..............................................................
31
Tabela 5 - Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por
bases (S), saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K),
alumínio (Al) cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em
Floresta de Timbaúva, Santa Maria, RS, 2006................................................................
34
Tabela 6 - Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por
bases (S), saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K),
alumínio (Al) cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em
Floresta de Ipê-roxo, Santa Maria, RS, 2006..................................................................
35
Tabela 7 - Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por
bases (S), saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K),
alumínio (Al) cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em
Floresta de Grápia, Santa Maria, RS, 2006......................................................................
36
Tabela 8 - Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por
bases (S), saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K),
ix
alumínio (Al) cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em
Floresta de Ipê-amarelo, Santa Maria, RS, 2006............................................................. 37
CAPÍTULO II. FORMAÇÃO DE ECTOMICORRIZAS EM GRÁPIA (Apuleia
leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride) E CANAFÍSTULA (Peltophorum dubium
(Sprengel) Taubert) in vitro
Tabela 1. Presença (+) ou ausência (-) de associações ectomicorrízicas em plântulas
de grápia e canafístula após serem inoculadas com fungos ectomicorrízicos in vitro,
Santa Maria, RS, 2006.....................................................................................................
53
Tabela 2 - Altura de plântulas, Massa Verde Radicular (MVR), Massa Verde da Parte
Aérea (MVPA) e Massa Seca da Parte Aérea (MSPA), de plântulas de grápia
inoculadas com fungos ectomicorrízicos, Santa Maria, RS, 2006.................................
56
Tabela 3 - Altura de plântulas, Massa Verde Radicular (MVR), Massa Verde da Parte
Aérea (MVPA) e Massa Seca da Parte Aérea (MSPA), em cultivo “in vitro” com
quatro fungos ectomicorrízicos e plântulas de canafístula, Santa Maria, RS,
2006..................................................................................................................................
57
x
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I OCORRÊNCIA DE MICORRIZAS EM PLANTIO DE
ESSÊNCIAS FLORESTAIS NATIVAS DO ESTADO DO RIO GRANDE DO
SUL
Figura 1 - Raízes de araucária (A), canafístula (B), timbaúva (C), grápia (D), ipê-amarelo
(E) e ipê-roxo (F), coletadas na Fepagro - Florestas, Santa Maria, RS,
2006....................................................................................................................................
26
CAPÍTULO II: ASSOCIAÇÕES ECTOMICORRÍZICAS EM GRÁPIA (Apuleia
leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride) E CANAFÍSTULA (Peltophorum dubium
(Sprengel) Taubert) in vitro
Figura 1 - Fungo ectomicorrízico Suilus sp. UFSM RA 2.8 (A); associação
ectomicorrízica entre o isolado UFSM RA 2.8 e plântulas de grápia: cultivo “in vitro”
fungo + plântulas (B); fungo associado com as raízes (C); manto fúngico
ectomicorrízico (D); rede de Hartig (E); Santa Maria, 2006.............................................
54
Figura 2 - Fundo ectomicorrízico Suilus sp. UFSM RA 2.8 (A); associação
ectomicorrízica entre o isolado UFSM RA 2.8 e plântulas de canafístula: cultivo “in
vitro” fungo + plântulas (B); fungo associado com as raízes (C); manto fúngico
ectomicorrízico (D); rede de Hartig (E); Santa Maria, 2006.............................................
54
xi
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
ASSOCIAÇÃO DE FUNGOS ECTOMICORRÍZICOS COM
ESPÉCIES FLORESTAIS NATIVAS DO ESTADO DO RIO
GRANDE DO SUL
Autor: Robson Andreazza
Orientadora: Zaida Inês Antoniolli
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 24 de Fevereiro de 2006.
O trabalho foi desenvolvido na Fepagro Florestas, Santa Maria – RS e no Laboratório de
Microbiologia e Biologia do Solo e do Ambiente Prof. Marcos Rubens Fries, do
Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria. Primeiramente, o objetivo
foi realizar um levantamento da ocorrência bem como a identificação das associações
micorrízicas em seis espécies florestais nativas presentes no Estado do Rio Grande do Sul. O
estudo foi conduzido em 3 épocas do ano com a coleta de amostras de solo, raízes e
esporocarpos dos fungos. As raízes foram processadas e analisadas quanto ao tipo de
colonização micorrízica. Os esporocarpos fungos ectomicorrízicos nativos encontrados foram
identificados, isolados e multiplicados. As espécies estudadas foram o pinheiro-do-paraná
(Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze), timbaúva (Enterolobium contortisiliquum (Vell.)
Morong.), canafístula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.), ipê-amarelo (Tabebuia
chrysotricha (Mart. ex DC.) Standl.), ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa (Mart.) Standl.), grápia
(Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride). As espécies florestais estudadas não apresentaram
colonização ectomicorrízica a campo, entretanto, foram encontrados esporocarpos próximos
de algumas plantas. Observou-se a presença de associações com fungos endomicorrízicos em
todas as espécies. Posteriormente, estudou-se a possibilidade de formar associações com
fungos ectomicorrízicos, grápia e canafístula. Foram utilizados os seguintes isolados: na
grápia os fungos utilizados foram os isolados UFSM RA 2.8 e UFSM RA 3.6 oriundos da
Fepagro Florestas, Santa Maria-RS, classificados como Suillus sp. e Scleroderma sp.,
respectivamente e os isolados UFSC Pt 116 (Pisolithus microcarpus) e UFSC Pt 24
(Pisolithus sp.), oriundos da Universidade Federal de Florianópolis, mais a testemunha sem
fungo. Na canafístula o fungo UFSM RA 3.6 foi substituído pelo fungo UFSC Sc 124
(Scleroderma sp.). As avaliações foram: altura de planta, massa verde da parte aérea, massa
verde radicular, massa seca da parte aérea e colonização micorrízica. Ocorreu a formação de
xii
associação ectomicorrízica nas plântulas de grápia e indícios desta formação com a
canafístula quando inoculadas com o fungo ectomicorrízico Suillus sp. UFSM RA 2.8. Além
disso, os resultados mostram que ocorreu melhor desenvolvimento nas plântulas de grápia
quanto a altura de plantas, massa verde radicular e da parte aérea, e massa seca da parte aérea.
A grápia apresentou associações ectomicorrízicas com o isolado UFSM RA 2.8, “in vitro”. A
canafístula apresentou características morfológicas evidenciando uma possível associação
ectomicorrízicas com o inóculo UFSM RA 2.8 em condições de laboratório.
Palavras Chaves: Micorrizas, Fungos ectomicorrízicos, espécies florestais nativas do Estado
do Rio Grande do Sul, Araucaria angustifolia, Enterolobium
contortisiliquum, Peltophorum dubium, Tabebuia chrysotricha, Tabebuia
impetiginosa, Apuleia leiocarpa.
xiii
ABSTRACT
Dissertation in Soil Science
Program of Pós-Graduation in Soil Science
Federal University of Santa Maria, RS, Brazil
ASSOCIATION OF ECTOMYCORRHIZAL FUNGI WITH NATIVE
FORESTRY SPECIES OF STATE OF RIO GRADE DO SUL
Author: Robson Andreazza
Advisor: Zaida Inês Antoniolli
Santa Maria, 24 of February of 2006
The work was development in Forestry Fepagro, Santa Maria, RS and in Laboratory of
Biology and Microbiology of Soil and Environment Prof. Marcos Rubens Fries, from
Department of Soil of Federal University of Santa Maria. First, the objective was to identify
mycorrhizal associations in six native forestry species of Rio Grande do Sul State. This
research was conducted in tree seasons of the year, in six native forestry species of State of
Rio Grande do Sul. The roots were processed and analyzed according to mycorrhizal
colonization type. The sporocarps found of native ectomycorrhizal fungi were identified,
isolated and multiplied. The studies species were Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze),
Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong.), Peltophorum dubium (Spreng) Taub.),
Tabebuia chrysotricha (Mart. ex DC.) Standl.), Tabebuia impetiginosa (Mart.) Standl.),
Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride). The forestry species didn’t show ectomycorrhizal
colonization in native conditions, although, it was found in some sporocarps near to some
plants. It was observed the presence of associations with endomycorrhizal fungi in all species.
The following study had the objective to test the possibility to form associations with
ectomycorrhizal fungi and Apuleia leiocarpa and, in the fungi isolated UFSM RA 2.8 and
UFSM RA 3.6 from Fepagro Forestry, respectively. These fungi were classified as Suillus sp.
and Scleroderma sp. respectively. The fungi UFSC Pt 116 (Pisolithus microcarpus) and
UFSC Pt 24 (Pisolithus sp.), were from of Federal University of Florianópolis, including the
treatment without fungi. In Apuleia leiocarpa the fungi UFSM RA 3.6 was substituted by
UFSC Sc 124 (Scleroderma sp.) fungi. It was analyzed seedling length, brash mass of aerial
part and root, dry mass of part aerial, length and root and mycorrhizal colonization. It was
observed the formation of ectomycorrhizal association in little plants of Apuleia leiocarpa and
in Peltophorum dubium when inoculated with the ectomycorrhizal fungi Suillus sp.(UFSM
RA 2.8). Furthermore, the results showed the best development in Apuleia leiocarpa in high
xiv
plants, brash mass of aerial part and root, dry mass of part aerial. The Apuleia leiocarpa
showed ectomycorrhizal association with isolated UFSM RA 2.8, “in vitro”. The
Peltophorum dubium showed evidence that is possible have ectomycorrhizal associations with
the isolate UFSM 2.8 in laboratory conditions.
Key Words: Mycorrhizal, Ectomycorrhizal fungi, natives forestry species of Estado do Rio
Grande do Sul, Araucaria angustifolia, Enterolobium contortisiliquum,
Peltophorum dubium, Tabebuia chrysotricha, Tabebuia impetiginosa, Apuleia
leiocarpa.
15
1. INTRODUÇÃO GERAL
A produção de mudas de essências florestais nativas é de grande importância para o setor
florestal, pois existem grandes dificuldades com seu crescimento e desenvolvimento. Por
estes percalços atrasa todo o ciclo produtivo destas essências, inviabilizando a produção e
estabelecimento destas espécies. Assim, é interessante procurar alternativas para a produção
de mudas, madeira e subprodutos, com alta qualidade e baixo impacto ambiental, como é o
caso dos fungos ectomicorrízicos, para reflorestar aéreas com essências florestais nativas do
estado do Rio Grande do Sul.
CARVALHO, (1998), sugere o reflorestamento de áreas no Sul do Brasil, utilizando
espécies que tenham algum tipo de valor comercial ou utilitário, sendo assim de maior
aceitação pelo agricultor para o reflorestamento e conservação de muitas áreas que são ou
serão problemáticas no futuro.
Alguns microrganismos do solo podem auxiliar no estabelecimento de plantas em áreas
de difícil adaptação, como áreas em processo de arenização. Dentre esses destacam-se os
fungos ectomicorrízicos, que ao associarem-se com as raízes das plantas, desenvolvem
estruturas muito hábeis na absorção de água e nutrientes, os quais são posteriormente
transferidos às plantas (SILVA, 2002; SILVA et al.,2003a; 2003b; ANDREAZZA et al.,
2004). Os fungos ectomicorrízicos formam associações mutualísticas com plantas, e
absorvem nutrientes para o crescimento das plantas. Muitas espécies de fungos
ectomicorrízicos fazem simbiose, e há uma grande importância em identificar e caracterizar
sua função, crescimento e ambiente em que eles ocorrem, sendo que a identificação de
ectomicorrizas seja fundamental para a pesquisa (GOODMAN et al., 2000).
Estas ectomicorrizas são um tipo de fungos micorrízicos em que o seu componente
fúngico localiza-se nos espaços intercelulares do córtex radicular, sem que ocorra penetração
intercelular. Esses fungos, embora ocorram em um grupo restrito de plantas, são muito
importantes economicamente para o setor florestal (BELLEI & CARVALHO, 1992).
Embora haja poucos estudos sobre associações ectomicorrízicas em espécies nativas na
região tropical do sul do Brasil, GIACHINI et al., (2000) observou uma grande diversidade
de fungos ectomicorrízicos, e esta região têm um grande potencial de exploração e
identificação destes fungos, podendo ocorrer associações simbióticas entre essências
florestais nativas e fungos ectomicorrízicos.
16
Sendo assim, estas associações simbióticas entre espécies florestais nativas do Estado do
Rio Grande do Sul e fungos ectomicorrízicos podem ser uma alternativa para o
estabelecimento, sustentabilidade e desenvolvimento de espécies arbóreas das matas no
Estado. Com os desmatamentos e diminuição da diversidade ecológica de nossas florestas, é
imprescindível que a preservação e o estudo das mesmas ocorra quase que simultaneamente.
Assim, há a necessidade de procurar alternativas para a produção de madeira e de mais
subprodutos, com alta qualidade e menor impacto ambiental, com o uso de espécies florestais
nativas. Neste contexto, a associação de espécies florestais com fungos que formem
associações simbióticas mutualísticas, provavelmente sejam uma alternativa promissora
(SILVA, 2002; SILVA et al., 2003a; 2003b; ANDREAZZA et al., 2004). Este trabalho visa
estudar a presença de processos simbióticos de fungos ectomicorrízicos, bem como a
identificação, isolamento e multiplicação destes organismos para melhorar a produção de
mudas nestas espécies florestais nativas de pinheiro-do-paraná (Araucaria angustifolia),
timbaúva (Enterolobium contortisiliquum), canafístula (Peltophorum dubium), ipê-amarelo
(Tabebuia chrysotricha), ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa), grápia (Apuleia leiocarpa) no
Estado do Rio Grande do Sul.
17
2. REFERÊNCIAS BIBLOGRÁFICAS
ANDREAZZA, R.; et al. Espécies de Pisolithus sp. na produção de mudas de Eucaliptus
grandis Hill ex Maiden em solo arenoso. Ciência Florestal, Santa Maria, v.14, n.2, p.51-60,
2004.
BELLEI, M.; CARVALHO, M.S. Ectomicorrizas. In: CARDOSO, E.J.B.N.; TSAI, S.M.;
NEVES, M.C.P. Microbiologia do Solo. Campinas: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo.
1992, p.297-318.
CARVALHO, P.E.R. Espécies alternativas para o reflorestamento e o seu futuro industrial
nos estados do Sul do Brasil. In: SIMPÓSIO FLORESTAL DO RIO GRANDE DO SUL, I
SIMADER - RS. v.1, 1998, Santa Maria - RS. Anais... Santa Maria: UFSM, 1998, p.21-28.
GIACHINI, A.J.; et al. Ectomycorrhizal fungi in Eucalyptus and Pinus plantations in southern
Brazil. Mycological Society of America, Lawrence, v. 92, n.6, p.1166-1177, 2000.
GOODMAN, D.M.; TROFYMOW, J.A.; THOMSON, A.J. Developing an online database of
descriptions of ectomycorrhizae. Journal of Ecosystems and Management. Extension Note,
v.1, n. 1, p.1-8, 2000.
SILVA, R.F. População de fungos micorrízicos e influência de ectomicorrizas na
produção de mudas de Eucalyptus grandis e Pinus elliottii em solo arenoso. 2002. 105p.
Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa
Maria, 2002.
SILVA, R.F; ANTONIOLLI, Z.I; ANDREAZZA, R. Efeito da inoculação com fungos
ectomicorrízicos na produção de mudas de Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden em solo
arenoso. Ciência Florestal, Santa Maria, v.13, n.1, p.33-42, 2003a.
SILVA, R.F.; et al. Fungos ectomicorrízicos no desenvolvimento de mudas de Eucalyptus
grandis Hill ex. Maiden. Bioscience Journal, v.19, n.3, p.9-17, 2003b.
18
CAPÍTULO I. OCORRÊNCIA DE MICORRIZAS EM PLANTIO DE
ESSÊNCIAS FLORESTAIS NATIVAS DO ESTADO DO RIO GRANDE
DO SUL
1. RESUMO
A associação micorrízica pode ser um fator importante para o estabelecimento e
desenvolvimento das essências florestais nativas do Estado do Rio Grande do Sul. O objetivo
deste trabalho foi avaliar a ocorrência de associações micorrízicas em seis espécies florestais:
pinheiro-do-paraná (Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze), timbaúva (Enterolobium
contortisiliquum (Vell.) Morong.), canafístula (Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert.),
ipê-amarelo (Tabebuia chrysotricha (Mart. ex DC.) Standl.), ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa
(Mart.) Standl.), grápia (Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride), presentes no Estado do
Rio Grande do Sul. O local de coleta das amostras foi na Fepagro - Florestas – Boca do
Monte, Santa Maria, em bosques de espécies nativas plantadas. As amostras de solo, raízes e
corpos de frutificação dos fungos, foram analisadas no Laboratório de Biologia e
Microbiologia do Solo e do Ambiente Prof. Marcos Rubens Fries, do Departamento de Solos,
Universidade Federal de Santa Maria. As raízes foram processadas e analisadas quanto à
presença ou ausência de associações com ecto e endomicorrizas. Os fungos ectomicorrízicos
nativos encontrados foram identificados, isolados e multiplicados. As espécies estudadas não
apresentaram colonização ectomicorrízica, embora em algumas espécies florestais como a
araucária, o ipê-amarelo e a grápia, foram encontrados esporocarpos na projeção da copa.
Contudo observou-se a presença de associações com fungos endomicorrízicos em todas as
espécies estudadas.
Palavras Chaves: Araucaria angustifolia, Enterolobium contortisiliquum, Peltophorum
dubium, Tabebuia chrysotricha, Tabebuia impetiginosa, Apuleia Ieiocarpa, fungos
micorrízicos, ectomicorriza, endomicorriza.
19
2. INTRODUÇÃO
O Estado do Rio Grande do Sul apresenta grande diversidade de espécies florestais
nativas e com ampla abrangência em praticamente todo o território regional. O uso excessivo
dos recursos naturais agiliza o processo de esgotamento dos mesmos em uma grande
velocidade. No Estado, problemas ocasionados pelo desequilíbrio dos processos que
sustentam os ecossistemas, como perdas de produção devidas a inundações, esgotamento de
solos e secas, fazem com que se tenha um panorama pouco otimista para as diferentes
atividades econômicas (SCHROEDER, 1991).
Segundo levantamentos florestais, as famílias encontradas no Estado do Rio Grande do
Sul foram as seguintes: Myrtaceae (69 espécies), Lauraceae (25 espécies), Mimosaceae e
Euphorbiaceae (16 espécies), Fabaceae (15 espécies), Asteraceae e Rubiaceae (13 espécies),
Solanaceae (11 espécies), Flacourtiaceae, Rutaceae, Verbenaceae e Bignoniaceae (10
espécies), Meliaceae, e Sapindaceae (9 espécies), Moraceae (8 espécies), Anacardiaceae,
Aquifoliaceae, Caesalpiniaceae, Sapotaceae e Celastraceae (7 espécies), Annonaceae (5
espécies), Myrsinaceae (6 espécies), Apocynaceae, Araliaceae, Melastomataceae,
Monimiaceae, Rhamnaceae e Ulmaceae (4 espécies) (IFCRS, 2006).
No Rio Grande do Sul, embora também tenha ocorrido o desmatamento, têm-se pontos
isolados de matas nativas e algumas propostas de recuperação destas matas (ZACHIA et al.,
2002). Estas matas estão localizadas na região sudoeste, região de Santa Maria e as matas
nativas da metade norte do Rio Grande do Sul. O Estado possuía originalmente, 42% de sua
superfície territorial coberta com florestas. Já no início do século XX, foi reduzida para
aproximadamente 25%, chegando a apenas 4% em 1965. As poucas áreas nativas existentes
restringem-se às áreas de preservação, aos parques, às reservas e aos pequenos porcentuais de
matas em áreas de difícil acesso. Nas propriedades rurais existem pequenos remanescentes,
em sua grande maioria parcialmente explorados (MATTEI & ROSENTHAL, 2002).
Sabe-se que alguns organismos do solo podem auxiliar o estabelecimento de plantas em
áreas de difícil adaptação, como áreas em processo de arenização. Entre esses organismos
destacam-se os fungos micorrízicos, que ao associar-se com as raízes das plantas,
desenvolvem estruturas muito hábeis na absorção de água e nutrientes, que são transferidos
às plantas (SILVA, 2002; SILVA et al., 2003a; 2003b; ANDREAZZA et al., 2003; 2004).
As micorrizas são associações simbióticas mutualísticas entre fungos do solo e a maioria
das plantas vasculares. Através desta associação, a planta fornece ao fungo os carboidratos
necessários ao seu crescimento, enquanto que o fungo por meio de suas estruturas externas
20
(hifas), auxilia na absorção dos nutrientes da solução do solo e os transfere para as plantas
(PASCOAL & NAVARRO, 1985; ANTONIOLLI & KAMINSKI, 1991; SMITH & READ,
1997). Dentre as micorrizas, encontram-se as ectomicorrizas, que são um tipo em que o
componente fúngico localiza-se nos espaços intercelulares do córtex radicular, sem que
ocorra penetração intracelular e as endomicorrizas que podem apresentar penetrações
intracelulares, podendo formar estruturas como arbúsculos e vesículas no caso das
arbusculares. Os fungos ectomicorrízicos embora ocorram em um grupo restrito de plantas
(aproximadamente 5%), no entanto, são muito importantes economicamente para o setor
florestal (BELLEI & CARVALHO, 1992).
As endomicorrizas são importantes na fase inicial de desenvolvimento das espécies
florestais. Embora a maioria dessas espécies sejam colonizadas pelos fungos ectomicorrízicos,
na fase de muda são as endomicorrizas que desempenham um importante papel na absorção
de nutrientes (ROJAS & SIQUEIRA, 2000; NOVAIS et al, 2005). Nesse sentido, tem se
observado efeitos benéficos de algumas espécies de fungos micorrízicos arbusculares. Por
exemplo, CHU et al. (2001), observaram um efeito significativo no crescimento de gravioleira
quando inoculada com Scutellospora heterogama e Gigaspora margarita. Aumento de
crescimento na ordem de 800% foi também observado em mudas de Colvillea racemosa Boj.
quando inoculadas com uma mistura de fungos micorrízicos arbusculares, contendo: Glomus
etunicatum, G. margarita e Acaulospora scrobiculata (ROJAS & SIQUEIRA, 2000).
CALDEIRA et al. (1997) observaram maior taxa de sobrevivência de duas leguminosas
arbóreas (Copaifera martii Hayne e Dimorphandra macrostachya Benth.) quando inoculadas
com G. margarita. BOWEN et al. (1974), observaram que no estágio inicial de
desenvolvimento de mudas de araucaria a colonização com endomicorrizas aumenta a
absorção de zinco.
Os fungos micorrízicos arbusculares são de fundamental importância para a maioria das
plantas, pois estas se desenvolvem melhor quando colonizadas por estes fungos devido a um
aumento de sua capacidade em explorar o solo, tanto em área de superfície de contato quanto
em volume, absorvendo, maiores quantidades de nutrientes (NOVAIS et al., 2005). Assim, o
conhecimento da ocorrência dos fungos micorrízicos arbusculares principalmente em áreas
degradadas, é um fator biológico importante para maximizar os efeitos da simbiose destes
fungos com as mudas das espécies florestais usadas no reflorestamento ou revegetação.
O crescimento e o estabelecimento de plantas são alterados com a colonização dos fungos
ectomicorrízicos, isto pelos efeitos morfogenéticos proporcionado ao sistema radicular, como
alteração das raízes e redução da dominância apical (ALEXANDER, 1981). O
21
estabelecimento da simbiose micorrízica é um processo complexo e com muitas etapas, estas
requerem complexação morfogenética, bioquímica, fisiológica e mudanças moleculares
(HILBERT & MARTIN, 1988; HILBERT et al., 1991). Dois isolados com o início do contato
no mesmo período com as raízes do hospedeiro podem ter rotas, estágios e tempos de
colonização diferentes, mesmo que os isolados sejam de mesmo gênero de ectomicorrizas
(MALAJCZUK et al., 1990).
Geralmente a taxa de sobrevivência de espécies arbóreas pode ser significativamente
influenciada pela associação micorrízica (ANDREAZZA et al. 2003; BRUNDRETT et al.,
1996). Em um estudo sobre o comportamento de quatro leguminosas em relação à inoculação
micorrízica, observou-se que plantas inoculadas apresentaram maior percentagem de
colonização micorrízica de raízes finas e maior taxa de sobrevivência das mudas
(CALDEIRA et al.,1997; 1999).
A influência das relações espaciais e temporais entre os fungos ectomicorrízicos e as
plantas influenciam na redução da competição entre plantas de mesma espécie e de espécies
diferentes, aumentando a disponibilidade de nutrientes, água, e reduzindo o efeito de
intempéries e a incidência de fungos patogênicos e pragas, (AMARANTHUS & PERRY,
1994; DODD & THOMSON, 1994). Com a constante mudança dos ecossistemas nas
florestas, os fungos ectomicorrízicos reduzem o efeito da variação dos ecossistemas, como
clima, manejo, ventos, aumentando a resistência das plantas associadas, favorecendo sua
estabilização (AMARANTHUS & PERRY, 1994).
Por isso sabe-se que é de grande importância estudos sobre quais são estas espécies
florestais que podem formar associações simbióticas micorrízicas (FRIONI et al., 1999).
Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar associações micorrízicas em bosque de
essências florestais nativas do Estado do Rio Grande do Sul e avaliar as características
químicas do solo que influenciam o estabelecimento de associações micorrízicas em
condições de campo.
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi desenvolvido na Fepagro - Florestas – Santa Maria – RS e no Departamento
de Solos da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). No centro de Pesquisas em
Recursos Florestais da Fepagro – Florestas, foram realizadas as coletas de corpos de
frutificação dos fungos ectomicorrízicos, raízes das essências florestais e solo.
Posteriormente, o material foi analisado no Laboratório Prof. Marcos Rubens Fries, para
identificação, isolamento dos isolados dos fungos ectomicorrízicos e avaliação morfológica
das raízes das espécies florestais estudadas.
3.1. Espécies nativas estudadas
As espécies nativas estudadas foram: pinheiro-do-paraná (Araucaria angustifolia),
timbaúva (Enterolobium contortisiliquum), canafístula (Peltophorum dubium), ipê-amarelo
(Tabebuia chrysotricha), ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa) e grápia (Apuleia leiocarpa).
3.2. Caracterização das áreas de coleta
A coleta foi realizada na estação experimental da Fepagro com aproximadamente 280 ha,
localizada em Boca do Monte no município de Santa Maria, Rio Grande do Sul.
Na área de araucária o terreno é plano, o bosque tem em torno de 10 ha, com idade
aproximadamente de 40 anos, sendo localizado próximo ao plantio de pinus (Pinus elliottii
Engelm.). A área de mata nativa avaliada está localizada próximo da sede da Fepagro. A
vegetação é arbustiva e com uma camada de serrapilheira (20 cm) e pequenas palmeiras.
As áreas de canafístula, timbaúva, ipê-roxo e grápia estão localizadas próximas e em
terreno ondulado, sendo em ordem da parte mais alta (próximo ao asfalto) até a parte mais
baixa (indo próximo ao centro da estação), em declive. Estas quatro espécies foram plantadas
na mesma época e tem 17 anos de implantação. A vegetação predominante nesta área é de
gramíneas, sendo de alta densidade e tamanho.
A área de ipê-amarelo está localizada em terreno plano e o bosque tem 0,5 ha, e a
vegetação predominante é de gramíneas de porte baixo.
Em todas as áreas das espécies nativas faziam parte de plantios homogêneos instalados
para pesquisa.
Observou-se a ocorrência espontânea de a ocorrência de plantas de pinus como invasoras,
próximas ou dentro das áreas de plantio das espécies estudadas.
23
3.3. Coleta de amostras
Foi marcado cinco plantas por espécie florestal. As plantas marcadas e identificadas
foram escolhidas aleatoriamente e de forma que representasse a população de plantas na área.
As coletas a campo foram efetuadas em três épocas do ano, no Outono, Inverno e
Primavera de 2004. Na mata de araucária, foram realizadas as amostragens nos dias 13/05,
23/08, 25/11/2004. No ipê-amarelo foram realizadas nos dias 24/06, 28/08 e 25/11/2004, e na
canafístula, timbaúva, ipê-roxo e grápia as amostragens ocorreram nos dias, 20/05, 21/10 e
21/11/2004.
3.4. Coleta de corpos de frutificação dos fungos ectomicorrízicos
A identificação das plantas foi feita com tinta óleo para futura localização. Foi realizada
dentro do perímetro da copa da planta a contagem do número de corpos de frutificação dos
fungos ectomicorrízicos e medida a distância entre esporocarpos e o tronco da planta. O local
de emissão dos corpos de frutificação dos fungos, foi marcado com uma estaca de madeira e
enumerado com o número do fungo. Os corpos de frutificação dos fungos foram coletados em
sacos de papel e levados ao laboratório acondicionados em caixa de isopor.
3.5. Isolamento e multiplicação
Os corpos de frutificação foram catalogados e fotografados. Uma parte dos basidiocarpos
foi seca em estufa a 50°C e guardados em local seco. Amostras dos esporocarpos foram
isoladas em laboratório conforme BRUNDRETT et al., (1996). Para isto os esporocarpos
foram desinfetados externamente pincelando solução de álcool 70% com pincel n° 12. Os
esporocarpos foram então, partidos ao meio e foi retirada uma alíquota do interior do micélio
e posto para incubação em placa de Petri contendo meio Hagen (Anexo 1). As placas foram
incubadas e as não contaminadas e apresentaram crescimento micelial, foram transferidas
para placas de Petri com meio MNM (MARX, 1969) (Anexo 2). Após o isolamento os fungos
foram processados em laboratório utilizando-se de técnicas assépticas para a multiplicação
dos fungos ectomicorrízicos (BRUNDRETT et al., 1996). O meio foi preparado, esterilizado
e colocado 20 mL por placa de Petri, em câmara de fluxo. Posteriormente, os fungos
ectomicorrízicos foram incubados a 25°C em incubadora.
24
3.6. Coleta de raízes e solo
O solo coletado foi homogeneizado e separado dos restos vegetais para a análise química
no Laboratório Central de Análises de Solo da Universidade Federal de Santa Maria.
As raízes separadas foram lavadas em água corrente dentro de uma peneira 50 um, e
separada das raízes contaminantes e armazenadas por 20 dias em um recipiente contendo 80
mL de álcool 50%. Após este período foi realizada a visualização e identificação da
morfologia radicular para análise de colonização micorrízica, cortadas em pedaços de 5 cm e
separada uma porção representativa para armazenagem em frascos de vidro com álcool 50%
para posterior caracterização de associação micorrízica.
3.7. Avaliações das raízes
As avaliações das alterações morfológicas foram feitas de três maneiras: a) identificação
visual da raiz, observando as alterações morfológicas, como manto, ramificações e coloração,
que possivelmente teriam sido provocadas por fungos ectomicorrízicos. b) no Laboratório de
Ectomicorrizas do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de
Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, sob o auxílio da Prof. Dra. Vetúria L. de Oliveira,
foram realizados cortes transversais nas raízes com microton para visualização em
microscópio, observando as estruturas e rede de Hartig do fungo ectomicorrízico
(BRUNDRETT et al., 1996). c) as associações endomicorrízicas foram observadas pelo
método de coloração micorrízica (BRUNDRETT et al., 1996).
3.8. Identificação dos esporocarpos
A identificação final dos isolados foi feita no Laboratório de Ectomicorrizas do
Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de Santa Catarina
(UFSC), Florianópolis, sob o auxílio da Prof. Dra. Vetúria de Oliveira, e usados alguns sites
como o BCERN (2004), que possuem fotos ilustrativas e descrição de caracteres
taxonômicos, e morfológicos como cor, tamanho, forma entre outras características.
3.9. Análises químicas do solo
As análises químicas do solo foram realizadas pelo Laboratório Central de Análise de
Solos, no Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria – RS. As variáveis
analisadas foram o teor de argila (%), teor de matéria orgânica (%), saturação por bases (%),
saturação por alumínio (%), pH em água (1:1), teor de fósforo Merlich (mg/L), potássio
25
(mg/L), teor de alumínio (cmol
c
/L), teores de cálcio (cmol
c
/L) e magnésio (cmol
c
/L) do solo
(TEDESCO et al., 1995).
3.10. Análises estatísticas
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com seis repetições.
Os dados em porcentagem foram transformados pelo método da raiz quadrada. Os resultados
obtidos foram submetidos à análise de variância e quando da significância dos efeitos
apontado pela análise de variância, foram submetidos ao teste de comparação de médias (teste
Tukey), tomando como base os níveis de significância maiores que 95% (p< 0,05). Utilizou-
se para a análise o programa estatístico SOC, desenvolvido pelo Núcleo Tecnológico para
Informática NTIA/EMBRAPA (EMBRAPA, 1997).
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Associações micorrízicas
Na análise de colonização micorrízica não foram observadas associações ectomicorrízicas
entre as seis espécies florestais nativas, embora todas as espécies avaliadas apresentaram
associações com fungos endomicorrízicos (Tabela 1 e Figura 1).
Em trabalho realizado por ZANGARO et al., (2002), a canafístula não apresentou
associações endomicorrízicas, mas nas espécies ipê-roxo, ipê-amarelo e timbaúva foi
constatado associações com estes fungos micorrízicos.
A
B C
D
E F
Figura 1. Raízes de araucária (A), canafístula (B), timbaúva (C), grápia (D), ipê-amarelo (E) e
ipê-roxo (F), coletadas na Fepagro - Florestas, Santa Maria, RS, 2006.
Em geral, essências florestais nativas podem formar simbiose com fungos micorrízicos,
como plantas da família das Leguminosas que podem associar-se com dois tipos de fungos
micorrízicos, geralmente endomicorrizas e ectomicorrizas (STURNER & BELLEI, 1994).
Importantes árvores como da subfamília Caesalpinioideae são normalmente ectomicorrizadas
(ALEXANDER, 1989). Arbóreas da subfamília Papilionoideae são associadas normalmente
com fungos micorrízicos arbusculares, Mimosoideae podem associar-se tanto com fungos
ectomicorrízicos quanto endomicorrízicos (GROVE & LE TACON, 1993).
Fatores biológicos também podem ser relacionados com altos níveis de inóculo de fungos
ectomicorrízicos, e a formação de associações (AMARANTHUS & PERRY, 1994). Quanto
maior a quantidade de inóculo no solo, maior será a chance de formar associações
micorrízicas entre plantas e fungos (DODD & THOMSON, 1994). Contudo, o declínio do
27
potencial de colonização em espécies florestais, pode ocorrer devido à remoção de plantas
nativas, perdas de nutrientes, umidade insuficiente, predadores e a degradação da estrutura
física do solo (AMARANTHUS & PERRY, 1994).
Não foi observado variação nas épocas de coleta quanto à presença da colonização
endomicorrízica. Isto também foi observado no trabalho com a influência sazonal da época
do estabelecimento das culturas de fungos micorrízicos arbusculares em Brachiaria
decumbens, que não diferiu estatisticamente entre as épocas utilizadas nas variáveis
estudadas (NOVAIS et al., 2005).
O efeito sobre a altura de plantas, peso seco e absorção de N pela araucária, indicam que
as respostas foram devidas provavelmente ao estabelecimento da simbiose micorrízica, visto
em estudos com inóculos de micorrizas nativas em Araucária, em que o substrato não tinha
sido fumigado, os efeitos da adição de inóculo de micorrízica são pouco acentuados
(OLIVEIRA et al., 1992). Isto evidencia a importância da endomicorriza para esta espécie
florestal.
Tabela 1. Presença (+) ou ausência (-) de colonização endomicorrízica (END) e
ectomicorrízica (ECT) encontradas em seis espécies florestais nativas do Estado
do Rio Grande do Sul, Santa Maria, RS, 2006.
Nome comum Nome científico END ECT
Pinheiro-do-paraná
Araucaria angustifolia
+ -
Timbaúva
Enterolobium contortisiliquum
+ -
Canafístula
Peltophorum dubium
+ -
Ipê-amarelo
Tabebuia chrysotricha
+ -
Ipê-roxo
Tabebuia impetiginosa
+ -
Grápia
Apuleia Ieiocarpa
+ -
De acordo com a Tabela 2, pode-se observar que foram encontrados esporocarpos
somente no outono, evidenciando melhores condições ambientais, como temperatura e
umidade para o desenvolvimento destas frutificações ectomicorrízicas. Embora tenha a
presença de inóculo de fungos ectomicorrízicos, ou seja, esporocarpos presentes em algumas
espécies nativas, não houve a simbiose entre fungos ectomicorrízicos e plantas (Tabela 1).
Isto também foi observado no trabalho de FRIONI et al., (1999), em que foram estudadas
associações de micorrizas arbusculares e ectomicorrizas em leguminosas nativas do Uruguai.
28
A presença dos esporocarpos destes fungos não indica que eles estão realizando simbiose com
estas espécies, pois estes fungos podem ser em algum período de seu ciclo saprófitos, e assim
como o pinus ser um invasor nestas áreas.
Tabela 2. Fungos ectomicorrízicos encontrados em três diferentes épocas do ano em seis
espécies florestais nativas do Estado do Rio Grande do Sul, Santa Maria, RS, 2006.
Nome comum Época n° esporocarpos Fungos * Distância (cm)**
Outono
48 Laccaria sp. 164
Inverno
- - -
Pinheiro-do-paraná
Primavera
- - -
Outono
- - -
Inverno
- - -
Timbaúva
Primavera
- - -
Outono
- - -
Canafístula
Inverno
- - -
Primavera
- - -
2 Suillus sp. 10
Outono
2 Scleroderma sp. 40
Ipê-amarelo
Inverno
- - -
Primavera
- - -
Outono
- - -
Ipê-roxo
Inverno
- - -
Primavera
- - -
Outono
9 Lactarius sp. 177
Grápia
Inverno
- - -
Primavera
- - -
*Fungos ectomicorrízicos encontrados próximos às espécies florestais.
**Distância média entre os fungos ectomicorrízicos encontrados e o tronco da planta.
De acordo com levantamentos sobre micorrizas, realizados em florestas de Araucaria
angustifolia e de Cabrela cangerana no Sul do Brasil na Floresta Atlântica, observou-se
apenas a ocorrência de fungos micorrízicos arbusculares (ANDRADE et al., 2000). Estes
autores reforçam, entretanto, a idéia de que a ausência de ectomicorrizas esta relacionada à
inexistência de propágulos de fungos ectomicorrízicos nas áreas de amostragem. O
29
Peltophorum dubium em levantamentos realizados em florestas nativas no Uruguai, 48% de
colonização com fungos micorrízicos arbusculares, não sendo encontrada colonização
ectomicorrízica, enquanto o Enterolobium sp. não apresentou nenhum tipo de colonização
(FRIONI et al., 1999). Pode-se dizer que a grande maioria das espécies da família das
leguminosas podem formar associações com fungos micorrízicos arbusculares (ZANGARO et
al., 2002; FONSECA et al., 2005), sendo mais um indício que o ambiente é muito importante
para que haja formação das micorrizas. Em estudo com mudas de espécies arbóreas nativas do
sudeste brasileiro, (SAJIN-JUNIOR, 1997) observou que ipê-roxo e ipê-amarelo apresentaram
formação de simbiose com o fungo micorrízicos Glomus etunicatum.
Florestas nativas de araucária podem formar associações endomicorrízicas com maior
porcentagem de colonização que em áreas de reflorestamento, e sua colonização pode ficar na
faixa de 20 a 40% (MOREIRA et al., 2005). A araucária é uma planta micotrófica e forma
associações com fungos endomicorrízicos, podendo ser facilmente influenciado por fatores
ambientais (CARDOSO et al., 2005), não deixando dúvidas sobre este tipo de associação.
Assim, a associação com fungos arbusculares em espécies florestais parece apresentar
uma relação importante para o benefício do vegetal. Entretanto, mais estudos nesta área são
necessários para caracterizar melhor a função e importância dos fungos micorrízicos, tanto
endo como ectomicorrizas.
4.3. Caracterização química do solo
Na área com araucária, as variáveis argila, saturação por bases, saturação por alumínio,
pH, fósforo, potássio, alumínio, cálcio e magnésio não apresentaram diferença significativa
entre as três épocas de coleta no ano (Tabela 3). Neste caso, a saturação por bases, saturação
por alumínio, teores de fósforo, potássio, alumínio, cálcio e magnésio, pode-se atribuir a um
alto coeficiente de variação, devido ao método de coleta por ser pontualizada. Os fatores
químicos podem ser influenciados por processos com a precipitação e temperatura variável
dentro de um ano (SCHUMACHER et al., 2004), entre vários outros fatores ambientais.
30
Tabela 3. Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por bases (S),
saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K) e alumínio
(Al) do solo, em três épocas de coleta, em bosque de Araucária, Santa Maria, RS,
2006.
Época Argila M.O. S SAL pH-água
------------------------------ % ------------------------------ 1:1
Outono
18,60 a* 4,68 a 59,00 a 12,40 a 4,78 a
Inverno
18,00 a 3,60 ab 54,00a 15,20 a 4,72 a
Primavera
18,00 a 3,10 b 30,80a 33,80 a 4,26 a
CV%
10,23 9,63 39,89 60,40 9,35
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
P K Al Ca Mg
---------- mg/L ---------- -------------- cmol
c
/L --------------
Outono
20,52 a 81,20 a 0,70 a 6,02 a 1,22 a
Inverno
13,20 a 86,40 a 0,82 a 4,80 a 0,86 a
Primavera
13,00 a 73,20 a 1,72 a 2,54 a 0,62 a
CV%
47,02 43,24 98,77 46,40 44,76
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
Geralmente, na primavera e verão ocorre uma maior decomposição do material sobre o
solo. DIAS & OLIVEIRA FILHO (1997) relataram que a variação na formação de
serrapilheira é esperada em virtude das diferenças nas condições ambientais, principalmente
de pluviosidade. Na primeira coleta, ou seja, no outono, ocorreu um valor maior no teor de
matéria orgânica, por apresentar neste período uma espessa camada de serrapilheira sobre o
solo. Segundo SCHUMACHER et al., (2004), a serrapilheira é de grande importância para a
reposição química do solo, sendo que, as maiores concentrações de elementos químicos foram
encontradas nas acículas, menos para o potássio, que apresentou concentração superior nos
galhos.
Picos maiores de deposição da serrapilheira ocorreram entre os meses de julho e
setembro, quando se inicia um período de elevação da temperatura. Tal estratégia é
característica das Florestas Estacionais Deciduais do Sul do Brasil, onde uma estagnação do
31
crescimento provocada pelo inverno faz com que ocorra a eliminação da folhagem senescente,
visando o novo período de crescimento, que se inicia com a primavera, com o aparecimento
de folhagem nova, podendo aumentar a liberação de minerais a partir deste período pela
decomposição do material orgânico(KÖNIG et al., 2002).
Na área com canafístula, as variáveis como teor de argila, matéria orgânica, teores de
fósforo, potássio, cálcio e magnésio não apresentaram diferença significativa entre as três
épocas de coleta (Tabela 4). Já, a saturação por bases e o pH tiveram uma redução
significativa na primavera, podendo ser, devido a maior absorção de nutrientes que reduz a
concentração de sais na solução do solo, diminuindo o pH e aumentando a saturação por
alumínio e conseqüentemente a concentração do íon alumínio.
Tabela 4. Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por bases (S),
saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K), alumínio (Al)
cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em Floresta de
Canafístula, Santa Maria, RS, 2006.
Época Argila M.O. S SAL pH-água
------------------------------ % ------------------------------ 1:1
Outono
18,00 a* 2,44 a 47,80 a 19,40 a 4,74 a
Inverno
19,00 a 2,04 ab 40,60 a 24,00 a 4,66 a
Primavera
20,80 a 1,46 b 24,40 b 40,00 a 4,46 b
CV%
5,64 10,94 11,19 22,34 1,74
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
P K Al Ca Mg
---------- mg/L ---------- -------------- cmol
c
/L --------------
Outono
3,86 a 87,20 a 0,66 b 1,72 a 0,78 a
Inverno
5,60 a 86,40 a 0,80 ab 1,96 a 0,80 a
Primavera
3,68 a 83,60 a 1,38 a 1,20 a 0,58 b
CV%
41,73 19,59 38,81 36,88 21,06
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
Os benefícios com fungos micorrízicos pode estar diretamente relacionado aos teores de
fósforo do solo. Por exemplo, quando cultivou-se algodoeiro em solo com deficiência de
32
fósforo, este mostrou uma elevada dependência micorrízica (SIQUEIRA et al.,1986a); em
soja, a associação com fungos micorrízicos arbusculares, mostrou um efeito negativo na
colonização micorrízica com um aumento nas doses de fósforo (NOGUEIRA & CARDOSO,
2000). Assim, é necessário o conhecimento do teor de fósforo disponível no solo, para se
obter o melhor resultado da associação micorrízica, que geralmente caracteriza-se por um
incremento da massa seca, tanto da parte aérea, quanto radicular das plantas em simbiose
(ANTONIOLLI & KAMINSKI, 1991; SMITH & READ, 1997; NOGUEIRA & CARDOSO,
2000; SOUZA & CARDOSO, 2001).
O efeito positivo dos fungos micorrízicos arbusculares na nutrição das plantas, pode estar
relacionado a uma melhora na eficiência de absorção de P pelas plantas inoculadas com
fungos micorrízicos arbusculares (MARX, 1980; CASTELHANO & MOLINA, 1989;
BOUGHER et al., 1990; CARNEIRO et al., 1999; ALVES et al., 2001). Desse modo, a
utilização de fungos micorrízicos arbusculares pode ser uma importante alternativa na
nutrição de espécies florestais nativas do Rio Grande do Sul.
A germinação dos esporos dos fungos endomicorrízicos está relacionada ao pH do meio e
varia entre os gêneros de fungos micorrízicos arbusculares. De uma forma geral, considera-se
que os gêneros Gigaspora, Scutellospora e Acaulospora preferem pH mais ácido de 4,0 a 6,0,
enquanto Glomus, na faixa de 6,0 a 8,0 (SIQUEIRA & FRANCO, 1988; SMITH & READ,
1997; SILVEIRA, 1998).
Para as análises do pH, realizadas neste trabalho com espécies nativas, o pH variou entre
4,0 à 5,0 (Tabelas 3, 4, 5, 6, 7 e 8). A variação no pH pode alterar a solubilidade de elementos
como Al, Fe, Mn e Cu, que em níveis tóxicos podem reduzir a germinação de esporos e o
crescimento do tubo germinativo (LAMBAIS & CARDOSO, 1989; SIQUEIRA et al.,1982).
Embora, os fungos micorrízicos tenham sido encontrados em solos com pH variando de 2,7 a
9,2, ocorrem diferenças entre as espécies e isolados de fungos quanto à capacidade de
germinar e colonizar o hospedeiro em função do pH do solo (MALUF et al., 1988;
SIQUEIRA et al., 1986b). A maior ocorrência de Acaulospora e Scutellospora, encontradas
neste trabalho, pode estar relacionado a habilidade dessas espécies em desenvolver-se no pH
deste solo que variou de 4,4 à 5,0.
Os fungos micorrízicos arbusculares não ocorrem de maneira generalizada nas essências
florestais, mas são de grande importância na fase inicial de estabelecimento dessas espécies
(BELLEI & CARVALHO, 1992). Algumas espécies como por exemplo o eucalipto, podem
apresentar tanto ectomicorrizas como endomicorrizas (BELLEI & CARVALHO, 1992),
contudo, quando adultos, são sobretudo colonizadas essencialmente por fungos
33
ectomicorrízicos (LETACON et al., 1987). Embora a importância das endomicorrizas não
esteja relacionada ao plantio de espécies florestais adultas, sua importância relaciona-se a fase
inicial de estabelecimento dessas plantas, o que torna interessante o estudo dessas
comunidades de fungos em áreas cultivadas com plantas florestais, como o pinus e o
eucalipto.
Nas parcelas com a canafístula e com a timbaúva, foi observado que as variáveis como
teor de argila, teores de potássio, cálcio e magnésio não apresentaram diferença significativa
entre as três épocas de coleta (Tabela 4 e 5). Sendo que a saturação por alumínio e teores de
íons alumínio no solo também não mostraram diferença significativa entre as três épocas de
coleta (Tabela, 5). Pelos resultados obtidos, pode-se observar que ocorreu uma acidificação do
outono até a primavera e ocorreu um maior acúmulo de material orgânico no inverno, ou seja,
uma menor decomposição dos resíduos vegetais.
No ipê-roxo, foi observado que a porcentagem de argila, matéria orgânica e os teores de
potássio alumínio e cálcio não mostraram diferenças significativas nas três estações do ano
estudas (Tabela 6). Embora, tenha ocorrido uma leve acidificação estatisticamente
significativa do outono até a primavera.
34
Tabela 5. Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por bases (S),
saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K), alumínio (Al)
cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em Floresta de
Timbaúva, Santa Maria, RS, 2006.
Época Argila M.O. S SAL pH-água
------------------------------ % ------------------------------ 1:1
Outono
20,20 a* 1,84 b 34,00 a 42,00 b 4,52 a
Inverno
21,80 a 2,14 a 30,20 a 43,60 b 4,32 b
Primavera
21,60 a 1,48 c 17,80 b 57,40 a 4,30 b
CV%
3,94 8,57 12,93 12,42 2,24
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
P K Al Ca Mg
---------- mg/L ---------- -------------- cmol
c
/L --------------
Outono
3,06 ab 106,80 a 1,48 a 1,32 a 0,58 a
Inverno
4,00 a 98,40 a 1,86 a 1,20 a 0,98 a
Primavera
2,74 b 101,20 a 2,10 a 0,72 a 0,62 a
CV%
20,00 24,81 23,50 45,80 37,77
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
Na floresta estudada com grápia amarela, as porcentagens de argila, matéria orgânica,
saturação por alumínio e nos teores de potássio, cálcio e magnésio, não ocorreu diferenças
significativas (Tabela 7). Mas a saturação por bases e o pH em água apresentou maiores
valores no outono e decresceram até a primavera (Tabela 7).
35
Tabela 6. Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por bases (S),
saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K), alumínio (Al)
cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em Floresta de Ipê-
roxo, Santa Maria, RS, 2006.
Época Argila M.O. S SAL pH-água
------------------------------ % ------------------------------ 1:1
Outono
17,00 a* 1,50 a 31,80 ab 44,60 ab 4,58 a
Inverno
17,00 a 1,68 a 40,80 a 28,80 b 4,50 ab
Primavera
18,60 a 1,52 a 23,40 b 52,40 a 4,38 b
CV%
3,93 9,68 12,94 12,42 2,54
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
P K Al Ca Mg
---------- mg/L ---------- -------------- cmol
c
/L --------------
Outono
2,92 b 61,60 a 1,12 a 0,90 a 0,34 a
Inverno
5,42 a 61,60 a 1,12 a 1,06 a 0,48 a
Primavera
3,84 b 60,00 a 1,62 a 0,94 a 0,36 a
CV%
23,09 26,26 29,28 34,10 16,73
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
36
Tabela 7. Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por bases (S),
saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K), alumínio (Al)
cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em Floresta de
Grápia, Santa Maria, RS, 2006.
Época Argila M.O. S SAL pH-água
------------------------------ % ------------------------------ 1:1
Outono
14,80 a* 1,26 a 32,60 a 49,40 a 4,54 a
Inverno
15,20 a 1,38 a 23,00 ab 52,00 a 4,44 ab
Primavera
15,80 a 1,20 a 18,20 b 62,80 a 4,32 b
CV%
2,63 3,01 16,62 8,53 1,74
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
P K Al Ca Mg
---------- mg/L ---------- -------------- cmol
c
/L --------------
Outono
3,36 b 44,80 b 1,60 b 1,08 a 0,56 a
Inverno
5,86 a 60,00 a 1,54 b 0,84 a 0,52 a
Primavera
4,90 a 41,20 b 1,98 a 0,68 a 0,42 a
CV%
18,71 25,07 9,86 52,11 35,96
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
O solo coletado em plantações com ipê-amarelo obteve juntamente com araucária, a
timbaúva e a grápia, uma menor variação entre as épocas de coleta de solo, mostrando um
solo com menores variações e ou mais estáveis dentro deste período. O solo com ipê-amarelo
mostrou que as porcentagens de material orgânico, saturação por bases, pH e os teores de
fósforo, potássio, alumínio e cálcio não apresentaram diferença significativa entre as estações
do ano avaliado (Tabela 8).
37
Tabela 8. Porcentagem de argila (Argila), matéria orgânica (M.O.), saturação por bases (S),
saturação por alumínio (SAL), pH em água, fósforo (P), potássio (K), alumínio (Al)
cálcio (Ca) e magnésio (Mg) do solo em três épocas de coleta em Floresta de Ipê-
amarelo, Santa Maria, RS, 2006.
Época Argila M.O. S SAL pH-água
------------------------------ % ------------------------------ 1:1
Outono
17,40 ab 1,94 a 29,00 a 30,60 a 4,54 a
Inverno
17,80 a 2,62 a 47,00 a 23,00 a 4,66 a
Primavera
15,80 b 2,24 a 40,00 a 18,20 a 4,72 a
CV%
2,95 7,57 12,06 34,74 5,60
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
P K Al Ca Mg
---------- mg/L ---------- -------------- cmol
c
/L --------------
Outono
4,94 a 53,60 a 1,04 a 2,00 a 0,30 b
Inverno
3,98 ab 80,00 a 0,96 a 2,64 a 0,40 ab
Primavera
6,18 a 79,20 a 0,68 a 2,44 a 0,48 a
CV%
32,79 31,80 54,38 26,70 21,77
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade.
Em geral, pode-se observar que não houve diferenças significativas nas diferentes
estações do ano em relação as características químicas do solo. Isto pode sugerir que não há
necessidade de realizar coletas amostrais de solo em um período relativamente curto, para
verificar sua variabilidade química em espécies florestais nativas.
38
5. CONCLUSÕES
As espécies florestais nativas de araucária, timbaúva, canafístula, ipê-amarelo, ipê-roxo e
grápia apresentaram associação com fungos micorrízicos arbusculares, mas não com fungos
ectomicorrízicos em seu habitat natural.
Não houve relação entre a associações simbióticas entre fungos ectomicorrízicos,
caracterização química e as seis espécies florestais nativas do Estado do Rio Grande do Sul
em seu habitat natural.
39
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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44
CAPÍTULO II. FORMAÇÃO DE ECTOMICORRIZAS EM GRÁPIA
(Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride) E CANAFÍSTULA (Peltophorum
dubium (Sprengel) Taubert) in vitro
1. RESUMO
A associação com fungos ectomicorrízicos com essências florestais nativas pode ser uma
alternativa para melhorar adaptação e desenvolvimento das áreas reflorestadas no com
essências florestais nativas do Estado do Rio Grande do Sul. Em função disso desenvolveu-se
o presente trabalho com o objetivo de verificar a formação de ectomicorrizas em plântulas de
grápia e canafístula com crescimento in vitro. O experimento foi desenvolvido no laboratório
de Biologia e Microbiologia do Solo e Ambiente Prof. Marcos Rubens Fries do CCR, UFSM.
Foram utilizados 4 isolados de fungos para a grápia: UFSM RA 2.8 e UFSM RA 3.6 oriundos
da Fepagro – Florestas, Santa Maria-RS, classificados como Suillus sp. e Scleroderma sp.
Respectivamente, e os fungos UFSC Pt 116 (Pisolithus microcarpus) e UFSC Pt 24
(Pisolithus sp.), oriundos da Universidade Federal de Florianópolis, e a testemunha sem
fungo. Para a canafístula, foram utilizados 4 fungos, o fungo UFSM RA 2.8 oriundo da
estação experimental da FEPAGRO Santa Maria-RS, classificado como Suillus sp. Os fungos
UFSC Pt 116 (Pisolithus microcarpus), UFSC Sc 124 (Scleroderma citrinum Pers.) e UFSC
Pt 24 (Pisolithus sp.). Utilizou-se sete repetições por tratamento. As avaliações foram: altura
de planta, massa verde da parte aérea, massa verde radicular, massa seca da parte aérea e
colonização ectomicorrízica. Observou-se formação de ectomicorrizas nas plantas com o
isolado Suillus sp. 2.8, o qual também favoreceu o desenvolvimento das plântulas de grápia.
As plântulas de canafístula apresentaram fortes indícios de formação ectomicorrízica, como
formação de manto fúngico.
Palavras Chaves: Apuleia leiocarpa; fungos ectomicorrízicos; Suillus sp.; espécie florestal
nativa.
45
2. INTRODUÇÃO
A grápia é uma planta florestal nativa nobre com variada utilidade. É uma espécie que
apresenta ampla distribuição geográfica no território brasileiro. Contudo, devido à devastação
intensa das matas e à falta de reposição através do reflorestamento, houve diminuição da
população da espécie (MATTOS & GUARANHA, 1983).
A grápia (Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride) pertence à família das Leguminosae,
possui vários nomes populares, dentre eles: grapiapunha, garapa, amarelinho, gema-de-ovo,
ibirapina. Esta planta apresenta uma madeira de lei, sem-falhas ou cavidades, dura, pesada e
muito durável (MATTOS, 2002).
Nos últimos anos tem-se alguns estudos sobre a adubação da grápia (MISSIO, 2002;
JUCOSKI, 2005), envolvendo avaliação dos teores de N, P, Ca e Mg nos tecidos da planta. Os
resultados mostram que dependem da presença da adubação conjunta de P e S. O ponto
máximo de eficiência técnica estimada varia de 14 a 31 mg de S kg
-1
de solo e de 165 a 440
mg de P kg
-1
(MISSIO, 2002). A grápia demonstra ser uma planta muito exigente em P e
medianamente exigente em K e N, na sua fase inicial de crescimento (NICOLOSO et al.,
2001). No que se refere a suprimento de P para esta planta a inoculação de fungos
micorrízicos, já que a micorrização favorece a absorção destes nutrientes em outras espécies
florestais (GALLOTTI, 2002; CHAVES et al., 1995; SILVA et al., 2003a; SILVA et al.,
2003b; ANDREAZZA et al., 2004).
A canafístula Peltophorum dubium (Spreng.) Taubert, é uma espécie arbórea pertencente
à ordem Fabales, família Leguminosae, e é uma planta ornamental. Sua madeira é
moderadamente pesada, dura e de longa durabilidade. Esta planta proporciona ótima sombra
quando isolada, podendo ser empregada com sucesso em projetos paisagísticos. É uma
espécie heliófita, pioneira, rústica, de crescimento rápido, ótima para composição de
reflorestamentos mistos de áreas degradadas de preservação permanente (LORENZI, 1992).
A canafístula é uma espécie nativa, com boa resistência ao frio. É considerada promissora
por apresentar valor econômico comprovado, em função da qualidade da madeira e indicado
para produção de madeira no Centro-Sul do Brasil (CARVALHO, 1998). O seu crescimento é
rápido, classificando-a como espécie com aptidão à regeneração artificial (CARVALHO,
1994). A madeira pode ser utilizada na construção civil, indústria de móveis, construção
naval, marcenaria e carpintaria, com regular poder calorífico (4.755 kcal/kg). É viável
também para produção de papel, tendo ainda a presença de tanino na casca com teores de 6 a
8%, também usada como planta medicinal e ornamental (REITZ et al. 1978).
46
As micorrizas são associações simbióticas mutualísticas entre fungos do solo e inúmeras
plantas vasculares. Através desta associação, a planta fornece ao fungo os carboidratos
necessários ao seu crescimento, enquanto que o fungo por meio de suas estruturas externas
(hifas), capta os nutrientes da solução do solo e os transfere para as plantas (PASCOAL &
NAVARRO, 1985).
Dentre as micorrizas, as ectomicorrizas, apresentam componente fúngico localizado nos
espaços intercelulares do córtex radicular, sem que ocorra penetração intracelular e as
endomicorrizas podem apresentar penetrações intracelulares, podendo haver formação de
estruturas como arbúsculos e vesículas. Os fungos ectomicorrízicos embora ocorram em um
grupo restrito de plantas (aproximadamente 5%), no entanto, são muito importantes para o
setor florestal (BELLEI & CARVALHO, 1992).
A associação micorrízica proporciona um efeito benéfico quando associada a essências
florestais (SILVA, 2002; SILVA et al., 2003a; SILVA et al., 2003b; ANDREAZZA et al.,
2003; ANDREAZZA et al., 2004). O benefício da inoculação com fungos micorrízicos
arbusculares foi também encontrado no crescimento de mudas de jacarandá-da-bahia
(Dalbergia nigra (Vell.) Allemão ex. Benth., com promoção da altura de mudas independente
da dose de fósforo aplicada (CHAVES et al., 1995).
O crescimento e o estabelecimento de plantas são alterados com a colonização com
fungos ectomicorrízicos, isto pelos fortes efeitos morfogenéticos proporcionado ao sistema
radicular, como deformação das raízes e redução da dominância apical (ALEXANDER,
1981). O estabelecimento da simbiose micorrízica é um processo complexo e com muitas
etapas, estas requerem complexação morfogenética, bioquímica, fisiológica e mudanças
moleculares (HILBERT & MARTIN, 1988; HILBERT et al., 1991). Sendo que dois isolados
de Pisolithus tinctorius, com o início do contato no mesmo período com as raízes do
hospedeiro (Eucalyptus urophylla S.T. Blake), tiveram tempos de colonização diferentes
(MALAJCZUK et al., 1990). Assim isolados de mesmo gênero podem ter rotas, estágios e
tempos de colonização diferentes, como pode ocorrer com espécies de hospedeiros diferentes.
Este benefício foi encontrado em várias espécies florestais como Eucalyptus grandis W.
Hill ex. Maiden aumentando a produção de massa seca da parte aérea, altura de plantas
(SILVA, 2002; SILVA et al., 2003a; 2003b; ANDREAZZA et al., 2004), e Pinus elliottii
Englem. em algumas variáveis como altura e massa seca (SILVA, 2002; SILVA et al.,
2003c;), e em Pinus sp. em desenvolvimento e porcentagem de mudas sobreviventes no
campo (KUEK, 1994), melhoria na estabilidade de mudas de Eucalyptus grandis no campo
em condições de solo em processo de arenização (ANDREAZZA et al., 2003).
47
A inoculação com fungos micorrízicos arbusculares favorecem o crescimento de mudas
de jacarandá-da-bahia, no qual, as mudas inoculadas obtiveram maior crescimento em altura
independente da dose de fósforo aplicada (CHAVES et al, 1995). Além disto, a inoculação
com fungos ectomicorrízicos pode ser economicamente viável, aumentando o potencial
produtivo florestal como em plantas de Pinus (KUEK, 1994). Em outros levantamentos
florestais com fungos micorrízicos arbusculares, não foi encontrado associações micorrízicas
com a canafístula (Peltophorum dubium) na bacia do Rio Tabagi no Paraná (ZANGARO et
al., 2002).
A inoculação com fungos ectomicorrízicos pode afetar diretamente o crescimento pós-
transplante, das espécies florestais. No açoita cavalo, verificou-se resposta linear do
crescimento à inoculação com fungos micorrízicos arbusculares. Este comportamento foi
observado também, para cássia – verrugosa, sesbânia e tamboril, que mostraram diferença no
crescimento já aos 30 dias após o transplante e para colvílea que mostrou diferença aos 60 e
90 dias (ROJAS & SIQUEIRA, 2000). Estes mesmos autores verificaram ainda que a
inoculação no transplante de mudas pode ser uma alternativa para garantir o desenvolvimento
de mudas sem inoculação ou com baixa formação de micorrizas durante a formação da muda.
Este efeito benéfico da inoculação micorrízica foi também encontrado no crescimento de
mudas de jacarandá-da-bahia, no qual, as mudas inoculadas obtiveram maior crescimento em
altura independente da dose de fósforo aplicada (CHAVES et al, 1995). Além disto, a
inoculação com fungos ectomicorrízicos pode ser economicamente viável, aumentando o
potencial produtivo florestal como acontece em plantas de pinus (KUEK, 1994).
Em virtude disso, alguns países vêm desenvolvendo com êxito programas de
micorrização controlada, propiciando aumentos significativos na produção de biomassa
florestal, além de poder contribuir para que as plantas desenvolvam-se em locais onde
isoladamente, não teriam produção viável do ponto de vista econômico. O controle da
micorrização permitiria, assim, um aumento das áreas utilizáveis para silvicultura, pela
incorporação de áreas marginais, cujos solos impossibilitariam o crescimento das plantas sem
ajuda das micorrizas (BELLEI & CARVALHO, 1992).
As essências florestais possuem a característica de formarem associações simbióticas com
fungos micorrízicos. Por exemplo, o eucalipto pode associar-se tanto a fungos
ectomicorrízicos quanto aos micorrízicos arbusculares (COELHO et al., 1997). Geralmente,
constata-se, que a idade da planta tem influência sobre o tipo de associação micorrízica
predominante, pois inicialmente há uma alta colonização por fungos micorrízicos
48
arbusculares, que decresce com a idade da planta, sendo substituída progressivamente por
associações ectomicorrízicas (BELLEI, 1987).
Contudo, pode haver uma certa especificidade entre isolados e hospedeiros, pois alguns
fungos ectomicorrízicos não conseguem ou tem dificuldades de formar associações
simbióticas com seus hospedeiros, como Rhizopogon nigrescens (UFSC-Rh95) que não
colonizou plantas de Eucalyptus dunnii Maiden, mostrando alta especificidade ao Pinus sp.
(VOIGT, 1996; VOIGT et al., 2000). Por isso faz-se necessário estudos avaliando a
associação micorrízica com diferentes isolados para cada hospedeiro.
Tendo em vista que pouco se conhece a respeito da associação micorrízica em grápia e
canafístula, o objetivo deste estudo foi caracterizar e identificar associações ectomicorrízicas
em plântulas destas espécies em condições de laboratório, visando à produção de mudas
colonizadas com fungos desta espécie florestal para usá-las em reflorestamento.
49
3. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Biologia e Microbiologia do Solo e do
Ambiente Prof. Marcos Rubens Fries, do Departamento de Solos da Universidade Federal de
Santa Maria (UFSM).
3.1. Esterilização das sementes
As sementes foram obtidas junto a Fepagro - Florestas – Boca do Monte, Santa Maria/RS.
As sementes de grápia foram esterilizadas com hipoclorito de sódio 10% por 30 min. e
lavadas em água esterilizada, por três vezes consecutivas. Posteriormente, as sementes foram
novamente esterilizadas, mas em álcool 70% por mais 30 min.
Já as sementes de canafístula foram esterilizadas com hipoclorito de sódio 10% por 20
min. e lavadas em água esterilizada, por três vezes consecutivas. Posteriormente, as sementes
foram novamente desinfestadas, mas em álcool 70% por mais 20 min.
Após a esterilização, estas foram lavadas novamente por três vezes em água esterilizada.
Para a lavagem das sementes foi utilizado um infusor de chá metálico de Marca Tee-la-Spoon
1 (Tee Gschwendner). Após a esterilização as sementes foram colocadas para a germinação.
3.2. Germinação das sementes
Para a germinação das sementes, três das sementes previamente esterilizadas foram
colocadas em cada placa de Petri em meio de germinação (Anexo 3). Em seguida, as sementes
foram incubadas a 25°C por 7 dias. Quando as sementes germinaram e atingiram a fase de
plântula, foram transferidas para os erlenmeyers com capacidade de 250 mL, com meio.
As sementes de grápia apresentaram um índice de germinação de 44% e as sementes de
canafístula foram obtidas através de estudo metodológico (Anexo 4).
3.3. Preparação dos erlenmeyers
Os erlenmeyers foram lavados e secado em estufa. Posteriormente, foi colocado 60 mL de
meio MNM sólido (Merlin Norkrans Modificado (MARX, 1969)) (Anexo 2). Após a
solidificação do meio, foi colocado papel celofane transparente na superfície do meio
(Adaptado de CHILVERS et al., 1986). O papel celofane foi fervido durante oito horas para
retira o excesso de celulose. Após esta preparação o frasco foi fechado com papel alumínio e
plástico parafilme de PVC transparente, para esterilização em autoclave a 1 atm., durante
50
20min. Após a autoclavagem, os erlenmeyers estavam prontos para realizar a inoculação das
plântulas de grápia com fungos ectomicorrízicos.
3.4. Multiplicação dos isolados com meio MNM
Os fungos com as identificações UFSM RA 2.8 e UFSM RA 3.6 foram coletados na
estação experimental da FEPAGRO Santa Maria-RS na área de ipê-amarelo, como pode ser
visto no Capítulo I. Estes fungos foram classificados como Suillus sp. e Scleroderma sp.,
respectivamente. Os fungos ectomicorrízicos UFSC Pt 116, UFSC Pt 24 e UFSC Sc 124
utilizados no experimento foram oriundos da Universidade Federal de Florianópolis com a
Prof. Dr. Vetúria L. de Oliveira. O isolamento e multiplicação destes fungos seguiram
metodologias de BRUNDRETT et al. (1996). Os fungos foram isolados a partir de uma
desinfecção com álcool na superfície externa da frutificação. Abrindo a frutificação ao meio,
retirou-se da parte interna, pequenos pedaços. Estes pedaços da frutificação foram colocados
em placas de Petri contendo o meio Hagen (Anexo 1). Depois de quatro dias, foram
transferidos os pedaços dos micélios, que cresceram, não contaminaram e obtiveram
crescimento micelial, para o meio de cultivo MNM. Após, repicou-se pequenas porções deste
para outra placa de Petri contendo meio de cultivo MNM. Esse processo foi repetido várias
vezes, com a finalidade de isolar o fungo micorrízico de contaminantes e favorecer a
multiplicação. Todo o material utilizado foi previamente esterilizado. Após, incubou-se à
28ºC durante 20 dias.
3.5. Inoculação das plântulas
As plântulas de grápia estéreis e sem contaminantes foram transferidas aos erlenmeyers
devidamente preparados e esterilizados. Colocou-se três discos de inóculo com diâmetro de
10 mm de cada isolado (BRUNDRETT et al., 1996). Os fungos utilizados foram o Pisolithus
sp. Alb. & Schewein (PT 24) e o Pisolithus microcarpum (Cooke & Massee) Cunn. (Pt 116),
Suillus sp. (UFSM RA 2.8), Scleroderma sp. (UFSM RA 3.6) e a testemunha sem fungo.
Posteriormente as plântulas sem contaminação foram transferidas aos erlenmeyers. Já para
canafístula, foi substituído o isolado UFSM RA 3.6, pelo Scleroderma citrinum Pers.(UFSC
Sc 124). Os tratamentos especificados anteriormente foram dispostos em um delineamento
inteiramente casualizado, com sete repetições.
51
3.6. Condução do experimento
O experimento com grápia teve duração de 33 dias e 39 dias com a canafístula, e foi
conduzido em câmara de fotoperíodo de 12h com temperatura constante a 24°C. Após 19 dias
da implantação do experimento foi realizada uma reinoculação dos fungos ectomicorrízicos.
Novamente foram colocados três discos de 10 mm de diâmetro de cada isolado. Esta etapa foi
realizada para tentar aumentar a quantidade de inóculo e aproximar o fungo ectomicorrízico
das raízes.
Durante o experimento foi realizado um rodízio dos erlenmeyers, duas vezes por semana,
atendendo as exigências do delineamento experimental. Este visou eliminar possíveis
diferenças quanto à incidência de luz, temperatura e sombreamento.
3.7. Parâmetros analisados
3.7.1. Altura de planta
A altura de planta foi medida utilizando-se uma régua graduada de 20 cm de
comprimento. Esta variável foi obtida com a distância do colo da planta até a extremidade das
últimas axilas foliares.
3.7.2. Massa verde da parte aérea e do sistema radicular e massa seca da parte aérea
As plantas foram cortadas no colo da planta e em seguida, pesadas a parte aérea,
caracterizando o peso da massa verde da parte aérea. Após, a parte aérea das plantas foram
colocadas em sacos de papel, identificadas e levadas à estufa a 65ºC, onde permaneceram até
atingirem peso constante. Após pesou-se novamente, obtendo-se a massa seca da parte aérea.
As raízes foram separadas do resto da planta, limpas de restos de meio e fungos
ectomicorrízicos, e então determinado o peso da massa verde radicular. Após as raízes foram
armazenadas em álcool 50% para a realização da análise de colonização ectomicorrízica.
3.7.3. Colonização ectomicorrízica
As avaliações da colonização ectomicorrízica foram efetuadas em duas etapas. A primeira
etapa foi através de uma identificação visual da raiz, sendo observado a morfologia radicular
para a observação de alterações morfológicas, que possivelmente teriam sido provocadas por
fungos ectomicorrízicos, conforme BRUNDRETT et al. (1996).
Na segunda etapa, foram realizados cortes histológicos transversais nas raízes com lâmina
de corte de marca GILLETE em lupa, para visualização em microscópio. Observou-se as
52
estruturas como manto fúngico e rede de Hartig do fungo ectomicorrízico (BRUNDRETT et
al., 1996).
3.8. Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com sete repetições.
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e quando da significância dos
mesmos, foram submetidos ao teste de comparação de médias (Teste de Tukey), tomando
como base os níveis de significância maiores que 95% (p< 0,05), utilizando o programa
estatístico SOC, desenvolvido pelo Núcleo Tecnológico para Informática NTIA/EMBRAPA,
(EMBRAPA, 1997).
53
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pelo teste de formação de ectomicorrizas em grápia e canafístula, foi observado que
somente o isolado UFSM RA 2.8 conseguiu formar ectomicorrizas com a grápia e a
canafístula dentre todos os outros inóculos utilizados (Tabela 1).
Tabela 1. Presença (+) ou ausência (-) de associações ectomicorrízicas em plântulas de grápia
e canafístula após serem inoculadas com fungos ectomicorrízicos in vitro, Santa
Maria, RS, 2006.
INÓCULO GRÁPIA CANAFÍSTULA
Testemunha sem fungo
- -
UFSM RA 2.8
+ +
UFSC Pt 116
- -
UFSM RA 3.6
- *
UFSC Pt 24
- -
UFSC Sc 124
* -
* Fungos não inoculados com a espécies florestal.
Na formação de ectomicorrizas nas raízes de grápia inoculadas com UFSM RA 2.8, com
presença de manto fúngico (Figura 1 D) e rede de Hartig (Figura 1 E). A literatura não
apresenta relatos de ocorrência de ectomicorrizas em grápia em ambiente natural (FRIONI et
al., 1999, ZANGARO et al., 2002), o que pode estar associado por alguns fatores ambientais,
como fatores de solo, pouco inóculo no ambiente, temperatura e microrganismos, entre
outros. Outros pesquisadores como VOIGT, (1996); VOIGT et al. (2000) defendem a idéia
que há uma especificidade entre os fungos ectomicorrízicos e seus hospedeiros.
O isolado UFSM RA 2.8 (Figura 1 A) é um fungo de crescimento rápido, levando 15 dias
para alcançar o ponto de repicagem, o que favoreceu a condução do experimento, pois quando
as plântulas foram inoculadas com os fungos ectomicorrízicos (Figura 1 B), os isolados com
crescimento mais rápido teriam melhores probabilidades de se associarem com as plântulas,
como pode ser visto na Figura 1 C.
54
A
B
C D E
Figura 1. Fundo ectomicorrízico Suilus sp. UFSM RA 2.8 (A); associação ectomicorrízica do
isolado UFSM RA 2.8 e plântulas de grápia: cultivo “in vitro” fungo + plântulas
(B); fungo associado com as raízes (C); manto fúngico ectomicorrízico (D); rede de
Hartig (E); Santa Maria, 2006.
Não houve diferença significativa em nenhuma das variáveis analisadas, quanto à altura
de plantas, massa verde radicular e da parte aérea, e massa seca da parte aérea (Tabela 3).
Embora, tenha sido encontrada evidência de colonização ectomicorrízica em plântulas de
canafístula (Figura, 2 D e E).
As observações evidenciam associações ectomicorrízicas entre a canafístula e o isolado
UFSM RA 2.8, pela formação do manto fúngico (Figura 2 D) e a rede de Hartig (Figura 2 E).
Estas estruturas caracterizam os fungos ectomicorrízicos quando colonizam os seus
hospedeiros (BELLEI & CARVALHO, 1992). Também foi encontrada, esta associação com
este mesmo fungo em plântulas de grápia.
A
B
C D E
Figura 2. Fungo ectomicorrízico Suilus sp. UFSM RA 2.8 (A); associação ectomicorrízica do
isolado UFSM RA 2.8 e plântulas de canafístula: cultivo “in vitro” fungo + plântulas
(B); fungo associado com as raízes (C); manto fúngico ectomicorrízico (D); rede de
Hartig (E); Santa Maria, 2006.
55
Em estudo realizado no Capítulo I deste trabalho, em levantamento em condições
naturais, não foram encontradas associações com ectomicorrizas em canafístula. Mesmo que a
literatura não tenha tido evidências da ocorrência destas associações em ambiente natural em
canafístula (FRIONI et al., 1999; ZANGARO et al., 2002). Isto pode ocorrer por inúmeros
fatores ambientais, fatores de solo, pouco inóculo, temperatura, e não ter ocorrido a presença
de inóculo compatível ou viável junto às raízes das plantas e em quantidade suficientes para
ocorrer associações ectomicorrízicas (GIACHINI et al., 2000). Outros pesquisadores
(VOIGT, 1996; VOIGT et al., 2000) defendem a idéia que há uma especificidade entre os
fungos ectomicorrízicos e seus hospedeiros, e que alguns isolados não podem formar
associações não colonizando algumas plantas. Contudo estas associações são de grande
importância para essências florestas quando presentes.
Sabe-se que a inoculação com fungos ectomicorrízicos pode ser uma alternativa para
melhorar a produção vegetal, tanto quantitativamente como massa verde ou seca da parte
aérea, altura, entre outras (SILVA, 2002; SILVA et al., 2003a; 2003b; ANDREAZZA et al.,
2004), como qualitativamente como porcentagem de sobrevivência de mudas no campo como
Eucalyptus grandis (ANDREAZZA et al., 2003) e Pinus sp. (GALLOTTI, 2002).
O isolado UFSM RA 2.8 (Figura 2 A) é um fungo de crescimento rápido, que em torno de
15 dias está no ponto de repicagem, favorecendo a condução do experimento. Quando as
plântulas foram inoculadas com os fungos ectomicorrízicos (Figura 2 B), os isolados com
crescimento mais rápido tiveram melhores chances de se associarem com as plântulas, como
pode ser visto na Figura 2 C, onde o micélio do fungo está intimamente ligado à raiz da
planta.
Hoje se sabe que a inoculação com fungos ectomicorrízicos pode ser uma alternativa para
melhorar a produção vegetal, tanto quantitativamente como massa verde ou seca da parte
aérea, altura, entre outras (SILVA, 2002; SILVA et al., 2003a; SILVA et al., 2003b;
ANDREAZZA et al., 2004), como qualitativamente como porcentagem do índice de pega no
campo (ANDREAZZA et al., 2003; GALLOTTI, 2002). Como pode ser visto (Tabela 2) a
inoculação de fungos ectomicorrízicos pode ter aumentado algumas variáveis analisadas
como altura, massa verde da parte aérea e massa seca da parte aérea. Contudo, evidenciando a
associação ectomicorrízica da planta de grápia e o fungo, as melhores médias de todos os
parâmetros foram encontradas em todos os parâmetros avaliados no tratamento com fungo
UFSM RA 2.8.
Estatisticamente não houve diferença significativa entre o fungo UFSM RA 2.8 e os
demais isolados na variável altura. Para a massa verde radicular não houve diferença
56
significativa nem com a testemunha. Já, na massa verde da parte aérea, o isolado UFSM RA
2.8 não se diferenciou dos isolado UFSC Pt 116 e UFSC Pt 24. Como a variável massa seca
da parte aérea os isolados UFSM RA 3.6, UFSC Pt 116 e UFSC Pt 24 não se diferenciaram da
testemunha que não havia fungo ectomicorrízico (Tabela 2).
Embora alguns autores comprovaram que a colonização das plantas pode levar algumas
horas e estar atuando simbioticamente por alguns dias (MALAJCZUK et al., 1990; HORAN
et al., 1988), os efeitos na produção e desenvolvimento das plantas de grápia podem ainda não
está tão explícito, pelo experimento ser conduzido em um tempo relativamente curto (33
dias), por isso a não diferenciação significativa entre a maioria das variáveis analisadas em
comparação com o tratamento com o fungo UFSM RA 2.8 (Tabela 2).
Tabela 2. Altura de plântulas, Massa Verde Radicular (MVR), Massa Verde da Parte Aérea
(MVPA) e Massa Seca da Parte Aérea (MSPA), de plântulas de grápia inoculadas
com fungos ectomicorrízicos, Santa Maria, RS, 2006.
Altura MVR MVPA MSPA
Fungos
----- cm ----- ----------------------------- g -----------------------------
Testemunha
4,53 b* 0,1194 a 0,4642 b 0,1128 b
UFSM RA 2.8
6,48 a 0,1653 a 0,5998 a 0,1435 a
UFSC Pt 116
6,20 ab 0,1286 a 0,4898 ab 0,1208 ab
UFSM RA 3.6
5,94 ab 0,1298 a 0,4609 b 0,1057 b
UFSC Pt 24
5,88 ab 0,1617 a 0,5067 ab 0,1102 b
CV%
16,26 27,33 12,52 11,69
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
Embora alguns autores comprovaram que a colonização das plantas pode levar algumas
horas e estar atuando simbioticamente por alguns dias (MALAJCZUK et al., 1990; HORAN
et al., 1988), os efeitos na produção e desenvolvimento das plantas de canafístula podem
ainda não estar expressos, isto porque o experimento foi conduzido durante um curto período
de tempo (39 dias). Por isso, não ocorreu diferenciação significativa entre as variáveis
analisadas em comparação com os diferentes fungos ectomicorrízicos (Tabela 3).
As plântulas de canafístula já aos 35 dias começaram a mostrar deficiência nutricional,
talvez por dificuldades na absorção de água e conseqüentemente nutrientes. Pelas observações
feitas, o papel celofane pode ter sido o maior impedimento para o desenvolvimento das
plantas, e devido ao tempo de execução deste experimento, a repetição do mesmo tornou-se
57
impossibilitado, mas na continuidade dos estudos pelo grupo de pesquisa do setor de Biologia
do Solo da UFSM, isto será realizado.
Tabela 3. Altura de plântulas, Massa Verde Radicular (MVR), Massa Verde da Parte Aérea
(MVPA) e Massa Seca da Parte Aérea (MSPA), em cultivo “in vitro” com quatro
fungos ectomicorrízicos e plântulas de canafístula, Santa Maria, RS, 2006.
Altura MVR MVPA MSPA
Fungos
------- cm ------- -------------------------------- g -------------------------------
Testemunha
3,22 a* 0,0173 a 0,1813 a 0,0401 a
UFSM RA 2.8
3,50 a 0,0288 a 0,1922 a 0,0488 a
UFSC Pt 24
3,92 a 0,0417 a 0,2026 a 0,0634 a
UFSC Pt 116
4,25 a 0,0389 a 0,2194 a 0,0580 a
UFSC Sc 124
3,04 a 0,0431 a 0,1697 a 0,0422 a
CV%
22,88 37,89 39,92 48,49
*Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
Assim, uma alternativa para visualizar melhor estas associações em plântulas de
canafístula, pode ser a retirada do papel celofane, e diminuição da quantidade do meio nas
unidades experimentais, podendo aumentar o tempo de condução do experimento e, se houver
colonização, fungo terá um maior tempo para expressar o seu potencial, sendo mais visível
seu benefício com respeito as variáveis estudadas. Pois na grápia pode ser observada a
formação de ectomicorrizas com o período estudado.
58
5. CONCLUSÕES
O isolado de fungo ectomicorrízico caracterizado como Suilus sp. UFSM RA 2.8, formou
associações mutualísticas com a grápia e mostrou fortes indícios de formação de
ectomicorrizas com plântulas de canafístula em cultivo “in vitro”.
A inoculação com o isolado UFSM RA 2.8, promoveu o crescimento das plantas de
grápia.
59
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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63
3. CONCLUSÃO GERAL E PERSPECTIVAS FUTURAS
O conhecimento das associações micorrízicas em essências florestais nativas do Estado
do Rio Grande do Sul é de grande importância para o setor florestal, pois pode ser uma
alternativa viável para a manutenção e instalação de plantações florestais nativas, pelos
inúmeros fatores benéficos que estas associações podem potencializar em seus hospedeiros.
O estudo destas associações tanto em ambiente natural, quanto em ambientes controlados,
abre uma visão de pesquisa para a exploração mais biológica dessas espécies.
Apesar de não ter sido encontrado associações ectomicorrízicas no ambiente natural
estudado, em laboratório houver associação em duas espécies, a grápia e a canafístula, com
um isolado natural da área em estudo, coletado em condições naturais.
Além disso, podem ser sugeridos os seguintes tópicos para estudos futuros:
- isolamento e multiplicação de fungos ectomicorrízicos nativos que possam realizas
associações micorrízicas com estas essências estudadas.
- avaliação da eficiência de colonização ectomicorrízica em grápia e canafístula.
- inoculação com outros tipos de fungos ectomicorrízicos nas espécies estudadas Araucaria
angustifolia, Enterolobium contortisiliquum, Peltophorum dubium, iTabebuia chrysotricha,
Tabebuia impetiginosa, Apuleia leiocarpa.
- ocorrência de espécies de fungos ectomicorrízicos em outros tipos de solo e clima das
mesmas espécies estudadas.
- produção de inóculo do fungo Suillos sp. Para testar em casa de vegetação e a campo em
grápia e canafístula.
64
4. ANEXOS
Anexo 1. Composição do meio Hagen modificado com antibióticos para isolamento de
fungos ectomicorrízicos a partir de carpóforos.
Ingredientes Quantidade
NH
4
Cl 0,5 g
KH
2
PO
4
0,5 g
MgSO
4
. 7 H
2
O 0,5 g
Glicose 5,0 g
Tiamina 50 ug
FeCl
3
0,5 mL
Agar 10 g
Água destilada 1000 mL
• Autoclavar a 120°C durante 20 minutos. O pH após autoclavagem deverá estar
entre 4,5 e 4,8.
• Logo que o meio se resfriar, mas antes que solidifique, colocar em banho-
maria a 55°C enquanto se prepara as seguintes soluções de antibióticos.
Cloranfenicol – 100 mg/1mL de etanol – esta dose de 100 ml pode ser aumentada para se
fazer a diluição.
Rifampicina – 100 mg/1mL de metanol.
OBS. O preparo das soluções de antibiótico deve ser feito no momento de colocar no meio de
cultura, caso contrário poderá ocorrer precipitação.
65
Anexo 2. Composição do meio de cultura Melin-Norkrans Modificado (MNM) (MARX,
1969).
Solução estoque: para facilitar a preparação do meio fazer antecipadamente as seguintes
soluções e conservar na geladeira:
Ingredientes Quantidade
CaCl
2
50 mg
NaCl 25 mg
KH
2
PO
4
50 mg
(NH
4
)
2
HPO
4
25 mg
MgSO
4
.7H
2
O 15 mg
FeCl
3
1,2 mg
Tiamina-HCl 100 ug
Água destilada (q.s.p.) 1000 mL
- usar 10 mL de cada solução acima por litro de meio de cultura, exceto de FeCl
3
que
deverá ser 1,2 mL por litro de meio.
- Solução de micronutrientes: 2mL por litro de meio
- Acrescentar : 10 g de Glicose; 15 g de Agar e 3,0 de Extrato de Malte.
- pH = 5,8 antes de autopclavar.
Soplução de micronutrientes estoque
QUANTIDADE INGREDIENTE OBS
0,200 g Na
2
MoO
4
.2H
2
O Molibdato de Sódio
0,1414 g ou 0,235 g MnSO
4
.H
2
O ou MnSO
4
.7H
2
O Sulfato de Manganês
0,280 g H
3
BO
3
Ácido Bórico
0,008 g CuSO
4
.5H
2
O Sulfato de Cobre
0,024 g ZnSO
4
.7H
2
O Sulfato de Zinco
200 mL Água destilada
OBS. Estas quantias são para fazer 200 mL de solução nutritiva. Se fizer 1 L faça as devidas
correções.
66
Anexo 3. Composição do meio de germinação.
CaSO
4
. 2H
2
O 500 uM de
H
3
BO
3
3uM
Ágar 7,5g
Glicose 2g/L
Completar com água da torneira até 1L.
Ajustar a pH 5,7.
Esterilizar em autoclave.
67
Anexo 4. Estudos metodológicos para germinação de sementes de canafístula
(Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert) in vitro
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi verificar o potencial de germinação e contaminação das
sementes de canafístula “in vitro”. O experimento foi desenvolvido no laboratório de Biologia
e Microbiologia do Solo e Ambiente Prof. Marcos Rubens Fries da UFSM. As sementes
foram oriundas da Fepagro – Florestas, Santa Maria. As sementes foram desinfestadas com
hipoclorito 10% e álcool 70% por 20 min. Após a desinfestação foram colocadas para
germinação em meio de germinação. Os tratamentos foram quanto ao número de sementes
por placa de Petri: T1) uma semente; T2) duas sementes; T3) três sementes; T4) quatro
sementes; T5) cinco sementes, todos com 15 repetições. As sementes foram avaliadas quanto
à germinação, contaminação, e número de sementes por placas de Petri. Os fungos
ectomicorrízicos foram inoculados após a obtenção das plântulas do teste de germinação. No
tratamento com quatro sementes por placa de Petri, foi encontrado um maior número de
sementes germinadas e não contaminadas, tendo um melhor aproveitamento no número final
de plântulas.
Palavras Chaves: fungos ectomicorrízicos; Suillus sp.; espécie florestal nativa.
INTRODUÇÃO
A canafístula Peltophorum dubium (Spreng.) Taubert, é uma espécie arbórea pertencente
à ordem Fabales, família Leguminosae, e é uma planta ornamental. Sua madeira é
moderadamente pesada, dura e de longa durabilidade. Esta planta proporciona ótima sombra
quando isolada, podendo ser empregada com sucesso em projetos paisagísticos. É uma
espécie heliófita, pioneira, rústica, de crescimento rápido, ótima para composição de
reflorestamentos mistos de áreas degradadas de preservação permanente (LORENZI, 1992).
A canafístula é uma espécie nativa, com boa resistência ao frio. É considerada promissora
por apresentar valor econômico comprovado, em função da qualidade da madeira e indicado
para produção de madeira no Centro-Sul do Brasil (CARVALHO, 1998). O seu crescimento é
rápido, classificando-a como espécie com aptidão à regeneração artificial (CARVALHO,
1994). A madeira pode ser utilizada na construção civil, indústria de móveis, construção
68
naval, marcenaria e carpintaria, com regular poder calorífico (4.755 kcal/kg). É viável
também para produção de papel, tendo ainda a presença de tanino na casca com teores de 6 a
8%, também usada como planta medicinal e ornamental (REITZ et al. 1978).
A germinação das sementes de canafístula ocorre numa seqüência de eventos fisiológicos
influenciados por fatores ambientais, como a luz, temperatura, disponibilidade de água e de
oxigênio e a presença de inibidores e promotores da germinação nas sementes, que podem
atuar por si ou em interação com os demais. Cerca de um terço das espécies germinam
imediatamente em condições favoráveis, mas as demais apresentam algum grau de dormência
(FLORIANO, 2004). A dormência das sementes é um processo, que distribui a germinação no
tempo como resultado da estratégia evolutiva das espécies para garantir que algumas
encontrem condições ambientais favoráveis para desenvolver plantas adultas, bloqueando a
germinação sob condições favoráveis imediatas em diferentes graus dentro de uma população,
protegendo as sementes da deterioração e sendo superada ao longo do tempo e sob condições
naturais de clima ou de alterações climáticas (FLORIANO, 2004).
As sementes de canafístula apresentam capacidades adaptativas que lhes permitem a
sobrevivência, pelo menos em número suficiente para assegurar a perpetuação das espécies,
diante dos fatores temporais e ambientais. Em função das várias interações entre as sementes,
seus progenitores e o ambiente constituem material excepcional para o estudo dos
mecanismos de adaptação das populações de plantas nos mais diversos ambientes (LEITE,
1993).
Em estudos com influência da luz na germinação de sementes de canafístula submetidas
ao estresse hídrico estas foram resistentes ao estresse simulado com PEG (polietileno glicol) e
manitol, pois o limite máximo de tolerância variou de -1,4 MPa a -1,6 MPa, tanto na luz
quanto no escuro. A porcentagem de germinação foi nula quando as sementes de canafístula
foram submetidas a um potencial osmótico de -1,8 e -2,0 MPa. Na presença de luz contínua,
houve redução significativa da germinação com o uso de manitol (PEREZ et al., 2001).
Assim, é importante se estudar a germinação de sementes desta espécie.
Em estudo com a germinação de canafístula (PEREZ et al., 1999), com 45 dias de
armazenamento, os valores obtidos não diferiram estatisticamente, nas sementes recém-
colhidas, armazenadas em vidro e em embalagem de papel a 10°C, também, em embalagem
de Vidro e papel a ambiente natural. Após 90 dias, os valores de porcentagem foram
estatisticamente semelhantes entre si, com exceção das sementes mantidas em embalagem de
papel, sob temperatura de ambiente de laboratório. Após 150 dias de armazenamento,
69
verificou-se redução da porcentagem de germinação, das sementes mantidas sob temperatura
ambiente, em relação ao grupo com sementes recém-colhidas.
Devido a grande diversidade de dificuldades de reprodução de essências florestais nativas
como a canafístula, deste o processo de colheita, armazenamento e germinação de sementes,
até a produção de mudas viáveis, é necessário procurar alternativas de produção. Uma das
alternativas de produção pode ser a inoculação das mudas com fungos micorrízico.
Tendo em vista o pouco conhecimento sobre a germinação de sementes de canafístula, o
objetivo deste estudo foi avaliar a germinação de sementes de canafístula em laboratório in
vitro.
MATERIAL E MÉTODOS
Esterilização das sementes
As sementes de canafístula foram obtidas junto a Fepagro - Florestas – Boca do Monte,
Santa Maria/RS.
As mesmas foram esterilizadas com hipoclorito de sódio 10% por 20 min. e lavadas em
água esterilizada, por três vezes consecutivas. Posteriormente, as sementes foram novamente
esterilizadas, mas em álcool 70% por mais 20 min. Após a esterilização, as sementes foram
lavadas novamente por três vezes em água esterilizada. Para a lavagem das sementes foi
utilizado um infusor de chá metálico de Marca Tee-la-Spoon 1 (Tee Gschwendner). Após a
esterilização as sementes foram colocadas para a germinação.
Germinação das sementes
Para a germinação das sementes, foi realizado um teste de germinação, sendo que a
unidade experimental foram placas de Petri e colocadas em meio de germinação (Anexo 3).
Os tratamentos variaram com o número de sementes, T1) uma semente; T2) duas sementes;
T3) três sementes; T4) quatro sementes; T5) cinco sementes, com 15 repetições.
Condução e análise do experimento
Posteriormente, as sementes foram incubadas a 25°C por 7 dias em incubadora. Após este
período, foram avaliadas quanto ao número de sementes germinadas (SG), sementes não
germinadas (SNG), sementes contaminadas (SC), sementes não contaminadas (SNC),
unidades experimentais contaminadas (UEC), unidades experimentais não contaminadas
(UENC), unidades experimentais germinadas (UEG) e unidades experimentais não
70
germinadas (UENG). A partir destes dados foi realizado teste de regressão e teste de
correlações. Quando as sementes germinaram e atingiram a fase de plântula, foram
transferidas para os erlenmeyers com capacidade de 250 mL, com meio MNM (Anexo 2) para
realizar a inoculação com fungos ectomicorrízicos.
Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 15 repetições.
Os resultados obtidos foram submetidos à transformação arco cosseno, e a análise de
regressão e correlação, tomando como base os níveis de significância maiores que 95%
(p<0,05), utilizando o programa estatístico SOC, desenvolvido pelo Núcleo Tecnológico para
Informática NTIA/EMBRAPA (EMBRAPA, 1997).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os resultados mostraram que o maior número de sementes germinadas, foram os
tratamentos com quatro e cinco sementes por unidade experimental. Contudo, os menores
níveis de contaminação foram encontrados no tratamento com três sementes por unidade
experimental, cerca de 4,4% (Tabela 1). Os números baixos de germinação, podem ter
ocorrido devido o método de desinfestação das sementes (OLIVEIRA et al., 2003), destacam
a possibilidade de morte de sementes por exposição a produtos tóxicos por até mesmo um
curto período de tempo.
Pode-se observar que, em geral, baixa porcentagem de germinação, variando de 14 a
43%. Contudo, a porcentagem de contaminação das sementes foi relativamente baixa,
variando de 4,4 a 26,7% (Tabela 1), indicando que o processo de desinfestação das sementes
com hipoclorito foi eficiente, embora as sementes podem ter sido expostas excessivamente ao
hipoclorito, aumentando a morte das sementes (OLIVEIRA et al., 2003).
O uso de quatro sementes por unidade experimental se sobressaiu aos demais pela
combinação dos tratamentos, pois obteve a melhor porcentagem de germinação, uma baixa
contaminação das sementes, um alto aproveitamento das placas, pois estas 80% não
contaminaram, a mais alta porcentagem de placas germinadas e um número de sementes por
placa de petri alto, pois o segundo maior número de sementes por placa (Tabela 1).
71
Tabela 1: Porcentagem de sementes germinadas (SG), sementes não germinadas (SNG),
sementes contaminadas (SC), sementes não contaminadas (SNC), unidades
experimentais contaminadas (UEC), unidades experimentais não contaminadas
(UENC), unidades experimentais germinadas (UEG) e unidades experimentais não
germinadas (UENG) de Canafístula em placas de petri após o método de
esterilização, Santa Maria, RS, 2006.
SG SNG SC SNC UEC UENC UEG UENG
Tratamentos
--------------------------------------- % ---------------------------------------
T1) Uma Semente
28,6 71,4 7,1 92,9 7,1 92,9 28,6 71,4
T2) Duas Sementes
14,3 85,7 17,9 82,1 28,6 71,4 28,6 71,4
T3) Três Sementes
38,6 61,4 4,4 95,6 13,3 86,7 80,0 20,0
T4) Quatro Sementes
43,3 56,7 8,3 91,7 20,0 80,0 93,3 6,7
T5) Cinco Sementes
30,7 69,3 26,7 73,3 66,7 33,3 86,7 13,3
A análise de correlações mostra que há uma correlação de 77% entre o número de
sementes contaminadas e o número de placas contaminadas, sendo que é aumentada a
probabilidade de contaminação da unidade experimental quando há um maior número de
sementes por unidade experimental. Observou-se também uma correlação de 74% entre o
número de sementes germinadas com o número de placas germinadas (Tabela 2).
As sementes germinadas estão a um nível de 55% correlacionadas com o número de
sementes contaminadas (Tabela 2), ou seja, aumenta a probabilidade de contaminação das
sementes quando estas sementes germinam.
Há uma probabilidade maior, cerca de 55%, do numero de placas germinadas estarem
correlacionadas com o número de sementes não contaminadas, ou seja, é necessário aumentar
o número de placas para diminuir a contaminação das sementes, pois neste trabalho quando
uma semente contaminava em uma unidade experimental, esta unidade não era aproveitada
para o passo subseqüente, avaliações de associações ectomicorrízicas.
72
Tabela 2. Análise de correlações entre número de sementes germinadas (SG), sementes não
germinadas (SNG), sementes contaminadas (SC), sementes não contaminadas
(SNC), unidades experimentais contaminadas (UEC), unidades experimentais não
contaminadas (UENC), unidades experimentais germinadas (UEG) e unidades
experimentais não germinadas (UENG) em Canafístula, Santa Maria, RS, 2006.
SG SNG SC SNC UEC UENC UEG UENG
SG
1
SNG
- 0,20 1
SC
0,01 0,44 1
SC
0,55 0,44 - 0,30 1
UEC
- 0,01 0,43 0,77 - 0,16 1
UENC
0,01 - 0,43 - 0,77 0,16 - 1 1
UEG
0,74 - 0,03 - 0,04 0,55 -0,06 0,06 1
UENG
- 0,74 0,03 0,04 - 0,55 0,06 - 0,06 - 1 1
Foi observado neste teste de germinação, diferentes tipos de contaminação das sementes,
pois sementes que germinaram, a contaminação foi maior por fungos, e quando não ocorreu
germinação a contaminação foi maior por bactérias. Assim, o número de sementes de
canafístula por placa de petri mais indicado para estas condições de multiplicação “in vitro” e
com este método de desinfestação de sementes, é de quatro por unidade experimental.
CONCLUSÕES
A germinação de sementes de canafístula foi favorecida na unidade experimental com quatro
sementes.
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