( PDF ) Associação da resistência a glicocorticóides com resistência a múltiplas drogas na artrite reumatóide

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Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul

Faculdade de Biociências

Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

Dissertação de Mestrado

ASSOCIAÇÃO DA RESISTÊNCIA A GLICOCORTICÓIDES COM

RESISTÊNCIA A MÚLTIPLAS DROGAS NA

ARTRITE REUMATÓIDE

LUCIANA DA COSTA BOROWSKI

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação

em Biologia Celular e Molecular

como requisito parcial para a ob-

tenção do grau de Mestre

Orientador : Prof. Dr. Moisés E. Bauer

PORTO ALEGRE (RS)

ABRIL de 2006

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AGRADECIMENTOS

A Deus.

Ao professor Moisés Evandro Bauer pela orientação, apoio intelectual e compreensão.

Ao Serviço de Reumatologia do Hospital São Lucas pelo auxílio na busca de pacientes.

Ao pessoal do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, especialmente, Rodrigo

Pestana Lopes, pelo auxílio no desenvolvimento dos experimentos.

As minhas amigas Daniela Borges da Silveira e Daniele Gehlen Klaus pelos momentos de

descontração, consolo e apoio.

As minhas companheiras de apartamento Greice Mattei e Liana Bertolim Rossato pela

companhia, compreensão e apoio nos momentos difíceis.

Ao meu namorado Thiago Ghilardi pela compreensão, apoio e auxílio na área da informáti-

ca.

Aos meus irmãos e cunhadas pelo carinho e compreensão.

Aos meus pais pelo apoio e por acreditarem em mim.

Ao CNPq pelo suporte financeiro.

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iii

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ....................................................................................................................................II

LISTA DE TABELAS .....................................................................................................................................V

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................................... VI

LISTA DE ABREVIATURAS.....................................................................................................................VII

RESUMO........................................................................................................................................................ IX

1. APRESENTAÇÃO DO TEMA...............................................................................................................1

1.1. ARTRITE REUMATÓIDE.......................................................................................................................1

1.2. IMUNOSSENESCÊNCIA – FOCO SOBRE AS CÉLULAS T ..........................................................................4

1.3. GLICOCORTICÓIDES ...........................................................................................................................6

1.4. SENSIBILIDADE AOS GLICOCORTICÓIDES............................................................................................9

1.5. GLICOPROTEÍNA-P E POLIMORFISMOS GENÉTICOS DO GENE ABCB1 ...............................................11

2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................15

3. OBJETIVOS...........................................................................................................................................21

3.1. GERAL..............................................................................................................................................21

3.2. ESPECÍFICOS.....................................................................................................................................21

4. ARTIGO CIENTÍFICO ........................................................................................................................22

SUMMARY .....................................................................................................................................................23

5. INTRODUCTION..................................................................................................................................24

6. MATERIALS AND METHODS...........................................................................................................25

6.1. SUBJECTS .........................................................................................................................................25

6.2. COLLECTION OF PERIPHERAL BLOOD AND ISOLATION OF MONONUCLEAR CELLS .............................26

6.3. CELL CULTURES AND STEROID SENSITIVITY ASSAYS........................................................................26

6.4. CELL PROLIFERATION/VIABILITY ASSAY ..........................................................................................27

6.5. STEROID RESPONSIVENESS ...............................................................................................................27

6.6. RHODAMINE 123-EFFLUX ASSAY .....................................................................................................28

6.7. ABCB1 GENOTYPING.......................................................................................................................28

6.8. STATISTICAL ANALYSIS....................................................................................................................28

7. RESULTS ...............................................................................................................................................29

7.1. DEMOGRAPHIC DATA AND CLINICAL CHARACTERISTICS ..................................................................29

7.2. LYMPHOCYTE PROLIFERATION AND SENSITIVITY TO GLUCOCORTICOIDS .........................................30

7.3. FUNCTIONAL ACTIVITY OF P-GLYCOPROTEIN...................................................................................35

7.4. GENETIC POLYMORPHISMS OF THE ABCB1 DRUG TRANSPORTER ....................................................38

7.5. CLINICAL CORRELATES OF P-GP ACTIVITY .......................................................................................39

8. DISCUSSION .........................................................................................................................................39

9. ACKNOWLEDGMENTS .....................................................................................................................43

10. REFERENCES ..................................................................................................................................43

11. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................................47

LISTA DE TABELAS

Table 1. Demographic and clinical characteristics of the RA patients 30

Table 2. Frequency of DEX and CORT responsiveness of RA patients 35

Table 3. Frequencies of the ABCB-1 polymorphisms 39

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1. Non-stimulated proliferation/viability 31

Fig. 2. Mitogen-induced T-cell proliferation 32

Fig. 3. Non-stimulated PBMC sensitivity to DEX in patients and controls 33

Fig. 4. Peripheral T-cell sensitivities to DEX and CORT 34

Fig. 5. Representative flow cytometric analysis of P-gp function 37

Fig. 6. Analysis of P-gp activity 38

vii

LISTA DE ABREVIATURAS

GCs – glicocorticóides

AR – artrite reumatóide

TNFα - fator de necrose tumoral

HLA – antígeno leucocitário humano

IL – interleucina

PCR – proteína C reativa

FR – fator reumatóide

CCP – autoanticorpos para peptídio cíclico

DMARDs – drogas antireumáticas modificantes da doença

MTX – metotrexate

VHS – taxa de sedimentação eritrocitária

cGCR – receptor de GC da superfície celular ou citoplasma

HSPs – proteína de choque térmico

GREs – elementos responsivos aos GCs

mGCR – receptor de GC ligado à membrana celular

GCRα e β - isoformas de receptores de GCs

CR – resistente aos corticosteróides

CS – sensível aos corticosteróides

IκBα - inibidor de proteínas IκB

NFκB - fator nuclear-κB

PBMCs – células mononucleares de sangue periférico

PHA – fitohemaglutinina

CORT – corticosterona

viii

ABC – família de proteínas dependente de ATP

MDR – resistência a múltiplas drogas

P-gp – glicoproteína-P

ABCB - gene de resistência a múltiplas drogas

HPA – eixo hipotálamo-hipófise-adrenal

RESUMO

A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune associada com inflamação sinovial

crônica caracterizada por infiltração de linfócitos que danifica ossos e cartilagens e eventu-

almente conduzindo para a destruição das articulações. Ambos o envelhecimento e o trata-

mento crônico com glicocorticóides (GCs) freqüentemente conduzem à resistência esteroi-

dal. Aqui, nós investigamos se a resistência aos GCs está associada com resistência a múl-

tiplas drogas (MDR). Setenta e quatro pacientes com AR e 26 controles saudáveis fizeram

parte deste estudo. Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas e a sensibi-

lidade das células T aos GCs foi avaliada in vitro. A atividade funcional da P-gp, uma mo-

lécula bombeadora que diminui as concentrações intracelulares de drogas por aumento do

efluxo das drogas, foi avaliada em linfócitos periféricos bem como os polimorfismos do

gene ABCB1/MDR1. Os pacientes mostraram aumento da proliferação de células T estimu-

ladas e basais comparados com os controles. O envelhecimento significativamente reduziu

a proliferação de células T somente no grupo controle. Pacientes e controles apresentaram

sensibilidades semelhantes aos GCs. As células não estimuladas dos pacientes com meia-

idade foram mais sensíveis a dexametasona que as dos sujeitos jovens ou idosos. Pacientes

apresentaram uma maior porcentagem de linfócitos extruíndo rodamina 123 (Rh123

dim

) que

os controles apesar da semelhante atividade da P-gp. A distribuição dos genótipos ABCB1

nos pacientes não diferiu significativamente dos controles. Estes dados sugerem que as

células mononucleares de pacientes com AR sob tratamento com múltiplas drogas são ple-

namente responsivas aos GCs in vitro e apresentam maior extrusão de drogas apesar da

função normal da P-gp.

1. APRESENTAÇÃO DO TEMA

As alterações do sistema imune durante o envelhecimento (imunossenescência)

são as principais causas que contribuem para a morbidade e mortalidade, principalmente

devido ao aumento na incidência de infecções, doenças auto-imunes e câncer (Bauer et al.

2003). Embora, uma disfunção generalizada nos linfócitos T seja considerada como princi-

pal fator para a imunossenescência, poucos estudos investigaram as interações medicamen-

tosas nos idosos e seus efeitos sobre a regulação das células T. Além disso, poucas inter-

venções terapêuticas foram realizadas com o intuito de amenizar ou reverter o impacto da

imunossenescência sobre a saúde do idoso.

Estudos recentes realizados pelo nosso grupo de pesquisa sugerem uma importante

desregulação neuroimunoendócrina no envelhecimento saudável. Em particular, foi de-

monstrado que as células T dos idosos saudáveis tornam-se mais resistentes ao tratamento

in vitro com glicocorticóides (GCs). Esta resistência foi relacionada ao aumento da produ-

ção endógena de cortisol ao longo do envelhecimento (Collaziol et al. 2004). Entretanto,

sabe-se muito pouco sobre o impacto do envelhecimento patológico sobre a regulação neu-

roimunológica. Por exemplo, é importante determinar a distribuição da população de paci-

entes resistentes aos GCs para diversas doenças crônico-inflamatórias, incluindo a artrite

reumatóide. Esta informação pode ser útil para uma terapia individual para o paciente

(Hirano et al. 2000).

1.1. Artrite reumatóide

A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune, com sinal de inflamação

sinovial, caracterizada por uma resposta imune celular crônica, isto é, uma infiltração de

linfócitos T no líquido sinovial (Doran et al. 2002), causando danos aos ossos e cartilagens

e eventualmente conduzindo à destruição das articulações (Feldmann et al. 1996). Embora

a etiologia da AR ainda não seja conhecida, é amplamente aceito que o recrutamento dos

linfócitos para áreas da inflamação e a subseqüente destruição da cartilagem e dos ossos

exercem um papel chave na patogênese da doença (Manolios et al. 1991; Postigo et al.

1992).

Diferentes tipos celulares e seus mediadores estão envolvidos na destruição dos

tecidos pela inflamação. Por exemplo, sabe-se que as células T, B, monócitos/macrófagos

bem como as citocinas proinflamatórias (e.g. fator de necrose tumoral (TNFα) e interleuci-

na (IL)-1β) constituem mecanismos imunopatológicos importantes na AR (Thomas et al.

1999; Kim & Weisman 2000; Weyand 2000).

Alguns estudos têm demonstrado a existência de células T regulatórias (Treg:

CD4+CD25+Foxp3+) em humanos, estas células constituem 5-15% das células T CD4+

periféricas (Dieckmann et al. 2001; Jonuleit et al. 2001; Levings et al. 2001; Stephens et

al. 2001; Taams et al. 2001; Taams et al. 2002). As células Treg suprimem as respostas das

células T de uma maneira contato-dependente celular, isto indica que estas células podem

contribuir para a regulação da resposta imune (van Amelsfort et al. 2004). Em pacientes

com AR, pode ser encontrado um aumento na porcentagem e na função supressiva da po-

pulação de células T CD4+CD25+, particularmente nas articulações, sugerindo que um

mecanismo imunoregulatório aumentado está presente na AR devido à existência de um

sistema de feedback negativo no qual as células T regulatórias CD4+CD25+ são geradas

devido a constante inflamação (van Amelsfort et al. 2004). O fato de que o processo infla-

matório na AR é crônico sugere que a regulação imune nas articulações esteja prejudicada.

Esta regulação prejudicada pode ser causada por uma resposta inflamatória excessiva junto

com uma deficiência nos mecanismos de controle da resposta imune (van Amelsfort et al.

2004).

A AR é cerca de duas vezes mais prevalente nas mulheres do que nos homens.

Isso pode ser explicado pela complexa interação de hormônios sexuais femininos com as

células do sistema imune. Existe também uma contribuição genética clara para esta doença

localizada no lócus II da classe HLA (antígeno leucocitário humano), apresentando como

haplótipos suscetíveis à doença DR1 e DR4. Recentemente, outros genes candidatos têm

sido investigados, incluindo os polimorfismos de citocinas (Feldmann et al. 1996).

A inflamação aguda pode ser iniciada por um número de eventos inflamatórios

que são programados em uma seqüência orquestrada de processos fisiológicos os quais

iniciam com a liberação das citocinas proinflamatórias como TNFα, IL-1β e IL-6. Estes

mediadores inflamatórios ativam uma cascata de respostas locais e sistêmicas. Se a infla-

mação aguda não for contida, segue a fase crônica a qual é a característica central de muitas

doenças auto-imunes. Estas desordens são caracterizadas ao nível molecular pela expressão

crônica elevada de múltiplos genes de citocinas proinflamatórias (Chikanza et al. 2003).

Nas doenças crônicas inflamatórias, como a AR, a desregulação dos reflexos ner-

vosos autônomos, a elevação do sinal nervoso simpático sistêmico, o aumento dos neuro-

transmissores simpáticos no plasma e a perda de fibras nervosas simpáticas locais são con-

seqüências da resposta proinflamatória exagerada (Straub et al. 2003). A desregulação da

resposta inflamatória, com um balanço alterado entre a degradação e a síntese de proteínas,

mudanças no humor e comportamento, exercem um papel crítico no declínio da perfor-

mance física e massa muscular nos pacientes com AR (Straub et al. 2003). A circulação de

citocinas proinflamatórias e as células imunes ativadas conduzem para uma deterioração

funcional do sistema nervoso central, sistema nervoso autônomo, hipotálamo, glândula

hipófise, glândulas endócrinas periféricas, trato gastrointestinal, fígado, ossos, músculos,

pele, rins, e outros órgãos e sistemas. Estas mudanças podem acontecer em poucos meses,

dependendo do grau da carga proinflamatória. O paciente com risco de apresentar estas

mudanças deve ser sujeito a procedimentos diagnósticos adequados, pois diagnósticos de

envelhecimento precoce podem conduzir a uma terapia apropriada (Straub et al. 2003).

Existem alguns marcadores prognósticos da doença destrutiva em pacientes com

artrite ativa, incluindo: alto número de articulações inchadas, proteína C reativa (PCR) ele-

vada, presença do fator reumatóide (FR) e/ou autoanticorpos para peptídio cíclico (CCP)

(Smolen et al. 2005).

O tratamento para AR inclui drogas antiinflamatórias, imunossupressores, anti-

maláricos e inibidores de citocinas. A terapia primariamente utilizada baseia-se no uso de

drogas antireumáticas modificantes da doença (DMARDs). A DMARD mais efetiva é o

metotrexate (MTX). Entretanto, terapias combinadas, incluindo altas doses de GCs e com-

binações de MTX, são mais efetivas que as monoterapias (Smolen et al. 2005).

1.2. Imunossenescência – foco sobre as células T

O envelhecimento está associado com alterações em diversos sistemas, incluindo o

sistema imune. Estas alterações incluem disfunções na resposta imune inata, processamento

de antígenos, resposta humoral, ativação celular e proliferação de células T. Contudo, a

grande maioria dos estudos demonstrou que a redução da resposta imune celular no enve-

lhecimento está fortemente associada com disfunções das células T. Uma importante alte-

ração observada nos idosos é a redução da capacidade de expansão clonal das células T. A

conseqüência final da ativação de células T durante uma resposta imune é a expansão clo-

nal, com formação de células efetoras e de memória. Uma das maneiras mais simples de se

avaliar a capacidade de expansão clonal é através do ensaio de proliferação linfocitária.

Mudanças na capacidade de proliferação refletem uma perda importante da resposta imune

adaptativa, acarretando numa maior susceptibilidade às infecções e câncer (Malaguarnera

et al. 2001; Pawelec et al. 2002).

Nas doenças inflamatórias crônicas sugere-se que a carga inicial proinflamatória

tem um impacto geral no envelhecimento prematuro, afetando sistemas orgânicos como os

sistemas endócrino e neuromuscular. Foi recentemente discutido que a reação inflamatória

aguda pode acelerar o processo de envelhecimento e que uma carga proinflamatória crôni-

ca, como na AR, pode acelerar a endocrinossenescência, neurossenescência e senescência

dos sistemas musculares (Straub et al. 2003).

Em pacientes com AR, as especificidades dos receptores de células T chegam so-

mente a 10% do repertório esperado em um indivíduo jovem saudável (Weyand & Go-

ronzy 2002). Interessantemente, uma concentração muito semelhante do repertório de célu-

las T é tipicamente encontrada em pessoas idosas, mais provavelmente devido aos contí-

nuos encontros com antígenos estranhos ou possíveis autoantígenos. Em ambas as situa-

ções, a carga oligoantigênica provavelmente leva à centralização do repertório, a qual é

acompanhada pela redução do espaço imunológico em órgãos linfóides periféricos (Straub

et al. 2003).

As células linfóides de pacientes com AR e de idosos têm um fenótipo senescente

com uma diminuição no comprimento dos telômeros paralela à perda de células T naive e

produção tímica (Koetz et al. 2000). Essas alterações do sistema imune, as quais são em

muitos aspectos semelhantes às da imunossenescência de idosos saudáveis, são provavel-

mente úteis para controlar os contínuos ataques agressivos contra um possível antígeno.

Em idosos saudáveis, bem como em pacientes com AR, estas mudanças adaptativas são

paralelas pela ativação contínua de monócitos/macrófagos e pela inflamação sistêmica a

qual é evidente pelo aumento no soro dos níveis de TNFα, IL-6 e muitas outras substâncias

(Straub et al. 2003).

1.3. Glicocorticóides

Os GCs são potentes drogas imunossupressoras e antiinflamatórias e têm sido u-

sados com sucesso no tratamento da AR, asma, lúpus eritematoso sistêmico, leucemias,

linfomas, alergias e na rejeição de órgãos transplantados. Eles representam os medicamen-

tos mais importantes utilizados entre as drogas antiinflamatórias e seu uso terapêutico vem

aumentando continuadamente nos últimos anos (Schacke et al. 2002; Wan & Nordeen

2002). Entretanto, foi observada uma ampla variação na sensibilidade dos linfócitos aos

GCs entre indivíduos saudáveis (Hearing et al. 1999) e, dessa forma, esta droga não repre-

senta sempre uma solução satisfatória (Hirano et al. 2000).

Os GCs são reguladores essenciais do desenvolvimento, homeostasia e funções

efetoras do sistema imune inato e adaptativo (Sternberg 2001; Cancedda et al. 2002; Pit-

zalis et al. 2002; Webster et al. 2002). Eles alteram a ativação, diferenciação e maturação

de muitos tipos de células imunes, bem como exercem múltiplos papéis na regulação da

sensibilidade imune celular a apoptose (Ashwell et al. 2000; Refojo et al. 2001). Os GCs

são hormônios naturais antiinflamatórios produzidos pelas glândulas adrenais segundo o

controle do hipotálamo. Na espécie humana, o cortisol representa o principal GC secretado

pela adrenal. Eles podem reduzir efetivamente os parâmetros de inflamação como a taxa de

sedimentação eritrocitária (VHS) e a PCR, induzindo a remissão da doença (Chikanza et al.

2003). Os mecanismos de ação dos GCs podem ser subdivididos em efeitos genômicos e

não-genômicos (Gold et al. 2001).

A maioria dos efeitos antiinflamatórios e imunomodulatórios dos GCs é mediada

predominantemente por mecanismos genômicos (Buttgereit et al. 2004). Isso acontece após

a ligação do hormônio com seu respectivo receptor na superfície celular ou no citoplasma

(cGCR). O complexo hormônio:cGCR geralmente induz transativação ou inibem a síntese

de proteínas regulatórias (Almawi & Tamim 2001). Os cGCRs constituem um complexo de

multiproteínas consistindo de várias proteínas de choque térmico (HSPs), incluindo as

HSP90, HSP70, HSP56 e HSP40. Após a ligação dos GCs com cGCRs, ocorre a dissocia-

ção das HSPs. A translocação para o núcleo celular é então possível e o complexo

GC/GCR finalmente liga-se em sítios de DNA específicos, nos elementos responsivos aos

GCs (GREs) (Almawi & Tamim 2001). Dependendo do gene alvo, a transcrição é então

ativada (transativação via GRE positivo) ou inibida (GRE negativo) (Buttgereit et al.

2004). A magnitude dos efeitos biológicos é determinada, entre outros fatores, pela densi-

dade de receptores das células-alvo e a afinidade dos receptores aos GCs (Schlaghecke et

al. 1994).

Os mecanismos de ação dos GCs não-genômicos são responsáveis pelos efeitos

rápidos, que ocorrem em poucos segundos ou minutos. Este efeito é refletido por ser medi-

ado pela ocupação do cGCR, mas não pelas mudanças na transcrição do gene (Croxtall et

al. 2000). Estes mecanismos são mediados através de receptores de GCs ligados à mem-

brana (mGCR). Estas descobertas são consistentes com as observações clínicas que em

pacientes com AR: a freqüência de monócitos positivos ao mGCR está elevada e está cor-

relacionada positivamente com a atividade da doença (Buttgereit et al. 2004). Esta obser-

vação pode implicar que os mGCR exercem um papel na patogênese da doença; entretanto,

é mais provável que eles estejam envolvidos na regulação por feedback negativo

(Buttgereit et al. 2004).

Existem duas isoformas de receptores de GCs: GCRα e GCRβ. Somente o GCRα

é capaz de ligar-se aos GCs. O GCRβ pode agir como um inibidor negativo do GCRα

(Encio & Detera-Wadleigh 1991; de Castro et al. 1996). Alguns estudos mostraram que o

GCRβ está super expresso em pacientes com AR que apresentam resistência linfocitária

aos GCs (Chikanza & Grossman 2000).

Os efeitos dos GCs são devido principalmente à inibição da liberação das citocinas

por células imunes. Os GCs, após sua ligação com os receptores intracelulares, induzem a

transcrição do inibidor de proteínas IκB (IκBα) que segura o fator nuclear-κB (NFκB) no

citoplasma, em sua forma inativa, impedindo o NFκB de migrar para o núcleo, se ligar ao

elemento de resposta apropriado no DNA e ativar as citocinas, contribuindo, dessa forma,

para a imunossupressão mediada por esteróides (Auphan et al. 1995; Scheinman et al.

1995). Eles também suprimem a adesão celular, a marginação e migração, ativação dos

macrófagos, apresentação de antígenos, expressão de receptores de células T, ativação dos

linfócitos T, proliferação, diferenciação e função das células maduras, incluindo citotoxici-

dade e função das células B como a produção de anticorpos (Sternberg 2001). Os GCs tam-

bém induzem a apoptose de linfócitos e timócitos, mas estes efeitos podem ser secundários

pela inibição da produção de citocinas e fatores de proliferação (Sternberg 2001). Além da

imunossupressão celular, os GCs também apresentam ações imunoestimulatórias

(Wilckens & De Rijk 1997; Dhabhar & McEwen 1999; Franchimont et al. 1999), eles pa-

recem aumentar a resposta imune inata embora reprimindo parte da resposta imune adapta-

tiva em estado de repouso. Isto sugere que os GCs ajudam antígenos por estimulação do

tráfego celular enquanto param as respostas imunes celulares por inibição da apresentação

de antígenos e ativação das células T (Galon et al. 2002).

1.4. Sensibilidade aos glicocorticóides

Embora muitos pacientes respondam a terapia com GCs, uma pequena subpopula-

ção de indivíduos fracassa para responder aos efeitos terapêuticos desta classe de medica-

mentos e pode ser classificada como resistente aos corticosteróides (CR) ou sensível (CS)

(Corkill et al. 1990; Chikanza & Panayi 1993). Há evidências que indivíduos com asma ou

AR podem ser divididos em subgrupos CR ou CS em estudos in vitro usando a capacidade

dos GCs em inibir a proliferação celular induzida por fitohemaglutinina (PHA) ou conca-

navalina-A (Langhoff et al. 1986; Corkill et al. 1990; Kirkham et al. 1991).

A resposta clínica de pacientes com AR tratados com GCs é afetada pela resistên-

cia celular esteroidal. Isto pode ser notado em muitos pacientes que requerem grandes

quantidades e/ou períodos de administração prolongados de GCs (Hirano et al. 2000). A

resistência aos GCs pode ser uma propriedade intrínseca de cada indivíduo (Chikanza &

Panayi 1993), provavelmente tendo uma base genética (Vingerhoeds et al. 1976).

Os mecanismos de resistência aos GCs relacionam-se em parte por alterações nas

citocinas e hormônios (Chikanza & Kozaci 2004). Ao nível molecular, podemos ressaltar

as anormalidades nas vias de sinalização intracelular, defeitos no complexo proteí-

na/receptor dos GCs e alterações na função do GCRα bem como no balanço e na expressão

celular de CRβ (Chikanza & Kozaci 2004).

Existem dados conflitantes em relação à sensibilidade linfocitária aos esteróides

na AR. Um estudo indicou um aumento da sensibilidade linfocitária periférica aos esterói-

des (Heijnen & Kavelaars 1999), enquanto outro sugere que a exposição crônica a inflama-

ção na AR diminui a sensibilidade aos GCs dos linfócitos periféricos (Onda et al. 2004).

Essas discrepâncias podem ser devido a alguns fatores modificantes da doença incluindo

idade e severidade da doença (del Rincon et al. 2004).

Para avaliar o potencial terapêutico individual para os GCs, é importante conhecer

a farmacodinâmica e farmacocinética dos GCs no organismo. É necessário determinar a

distribuição da população de pacientes resistentes aos GCs para diversas doenças imunoló-

gicas incluindo a AR. Esta informação pode ser útil para levar o paciente a uma terapia

com GCs individualmente apropriada (Hirano et al. 2000). As diferenças na disposição

celular ou tecidual dos GCs podem afetar a farmacodinâmica celular. Pequenas mudanças

na estrutura química dos GCs podem conduzir a grandes diferenças na distribuição da dro-

ga, eliminação e ligação ao receptor (Szefler 1990).

Sabe-se que a produção endógena de GCs é essencial para controlar as respostas

imunológicas e surgimento de doenças auto-imunes. Por exemplo, ratos Lewis são hipo-

reativos ao estresse (produzem pouca corticosterona (CORT) quando estressados) e, por

conseqüência, mais susceptíveis a uma ampla variedade de doenças auto-imunes inflamató-

rias. Os ratos Fisher, no entanto, são hiper-reativos ao estresse, mostram uma resposta hi-

per-ativa do eixo HPA, produzem muita CORT e são relativamente resistentes às mesmas

doenças auto-imunes inflamatórias (Sternberg et al. 1989).

A resistência linfocitária a GCs não é exclusiva das doenças auto-imunes, mas

pode também ser demonstrada em outras patologias importantes incluindo asma, depressão

maior, colite ulcerativa e AIDS (Norbiato et al. 1992; Chan et al. 1998; Bauer et al. 2003;

Travis 2004).

A sensibilidade aos GCs pode estar relacionada a resistência a múltiplas drogas

(MDR). Existem muitos mecanismos de MDR, dentre esses, destaca-se a expressão de um

transportador de membrana conhecido como glicoproteína-P (P-gp) (Beck et al. 1996; Linn

et al. 1996; Advani et al. 1999; List et al. 2002).

1.5. Glicoproteína-P e polimorfismos genéticos do gene ABCB1

A superfamília de proteínas dependente de ATP (ABC) apresenta diferentes trans-

portadores expressados em vários organismos (Tirona & Kim 2002). Em humanos, 48

transportadores ABC têm sido identificados (Dean et al. 2001) e estão localizados na

membrana plasmática ou em membranas intracelulares, transportando uma ampla varieda-

de de substâncias incluindo íons, açúcares, aminoácidos, glicanos, peptídios, proteínas,

fosfolipídios, toxinas e drogas (Tirona & Kim 2002).

Entre os diversos mecanismos de resistência a múltiplas drogas (MDR), a super

expressão da glicoproteína-P (P-gp), um produto com 170-kd do gene de resistência a múl-

tiplas drogas (ABCB1/MDR1), tem sido relatado como a principal molécula envolvida no

fenótipo MDR para várias doenças (Beck et al. 1996; Linn et al. 1996; Advani et al. 1999;

List et al. 2002). Em humanos, existem 2 genes da família MDR (ABCB1 e ABCB4), en-

quanto nos roedores existem 3 genes (mdr1a, mdr1b e mdr2) (Schinkel 1997).

O gene ABCB1 está localizado na região cromossomal 7q21 e produz a P-gp, que

é provavelmente um dos mais importantes transportadores ABC para a cinética de drogas

em humanos, sendo considerada um mecanismo de proteção contra xenobióticos potenci-

almente tóxicos que são ingeridos na alimentação (Juliano & Ling 1976).

A P-gp funciona como uma bomba de fluxo transmembrana dependente de energia

para diminuir a acumulação intracelular de uma variedade de drogas, como antitumorais,

alcalóides, antraciclinas, verapamil, colchicina, antimaláricos, ciclosporina e GCs (Tsuruo

1983; Weinstein et al. 1990; Bourgeois et al. 1993; Higgins et al. 1997). A P-gp está en-

volvida tanto na proteção celular contra essas drogas quanto no desenvolvimento da resis-

tência a elas (Tsujimura et al. 2005). Além disso, existem evidências que sugerem que a P-

gp exerce um papel na atividade citolítica e na secreção de citocinas pelos linfócitos (Gupta

et al. 1992; Drach et al. 1996; Raghu et al. 1996).

A P-gp é expressa por diferentes tecidos normais, sendo encontrada em células

epiteliais, hepatócitos, células pancreáticas, e no tecido hematopoiético. Neste tecido, ela é

expressa principalmente por linfócitos T, B e NK, bem como em células tronco (Chaudhary

& Roninson 1991; Drach et al. 1992; Ludescher et al. 1998). As diferentes células hemato-

poiéticas mostram diferentes atividades da P-gp em função da idade, e estas mudanças po-

dem ser responsáveis pelas características específicas do sistema imune em idosos

(Machado et al. 2003).

As imunidades celular e humoral declinam progressivamente com a idade

(Fernandes & Gupta 1981; Pilarski et al. 1995; Miller 1996). Linfócitos T de indivíduos

idosos apresentam diminuição da proliferação in vitro em resposta a antígenos e mitógenos,

bem como uma resposta citotóxica prejudicada e secreção anormal de citocinas. Já que a P-

gp participa da função linfocitária (Gupta & Gollapudi 1993; Drach et al. 1996; Raghu et

al. 1996), a atividade anormal da P-gp com a idade tem sido implicada na redução da fun-

ção imune observada em indivíduos idosos.

O nível de expressão da proteína e a integridade funcional da P-gp afeta a intera-

ção farmacocinética com a administração terapêutica de drogas e por isso exerce um papel

importante na eficácia e toxicidade do tratamento (Cascorbi et al. 2001). Estudos demons-

tram altos níveis da expressão da P-gp em pacientes com doença ativa, e que a super ex-

pressão da P-gp nos linfócitos está correlacionada com a falta da resposta aos GCs

(Tsujimura et al. 2005). Esses dados sugerem que a atividade da doença e a expressão da P-

gp estão correlacionadas com a resistência aos GCs no lúpus eritematoso sistêmico

(Tsujimura et al. 2005). Outros relatam que a redução das concentrações citoplasmáticas de

GCs são o resultado do aumento do fluxo de GCs mediado pela P-gp de linfócitos e é um

dos mecanismos de resistência aos GCs em doença inflamatória do intestino e asma

(Montano et al. 1996; Farrell & Kelleher 2003).

Quando o número de moléculas da P-gp expresso na superfície celular dos linfóci-

tos aumenta, os GCs não conseguem chegar ao citoplasma, e isto pode resultar em resistên-

cia. Altos níveis da expressão da P-gp em linfócitos podem conduzir ao efluxo ativo de

GCs do citoplasma para o exterior da célula, resultando não só no desenvolvimento da re-

sistência, mas também no fracasso em controlar a atividade da doença em pacientes com

lúpus eritematoso sistêmico com doença altamente ativa (Tsujimura et al. 2005).

O conhecimento do haplótipo do gene ABCB1 em diferentes populações é impor-

tante para elucidar os mecanismos de identificação das associações entre polimorfismos

representados por cada haplótipo, expressão e função da P-gp (Schwab et al. 2003). Dife-

renças individuais no controle transcricional do gene humano ABCB1 (Muller 2000), inclu-

indo variantes gênicos dos fatores de transcrição (Zhang et al. 2001), podem contribuir

para a variabilidade da expressão da P-gp.

Vários estudos tratam a associação dos genótipos ABCB1 com disposição dos

substratos da P-gp em humanos. Estas investigações são baseadas na observação inicial que

o genótipo ABCB1 3435TT está associado com baixa expressão da P-gp intestinal em hu-

manos em comparação com indivíduos de genótipos 3435CT ou CC (Hoffmeyer et al.

2000).

A medida dos níveis da expressão de P-gp nos linfócitos é útil para a avaliação da

resistência esteroidal e é um bom marcador para indicar a necessidade de uma terapia imu-

nossupressora intensa em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico altamente ativa

(Tsujimura et al. 2005).

A diferença na interação da P-gp com o cortisol e a CORT é extraordinária, con-

siderando sua ampla similaridade na estrutura molecular. A P-gp apresenta um amplo es-

pectro de substratos, mas a CORT somente difere do cortisol pela falta do grupo 17-

hidroxil (Karssen et al. 2001). Existem indicações de que ambos os grupos 17-hidroxil e

11-hidroxil determinam a habilidade dos esteróides serem transportados pela P-gp

(Bourgeois et al. 1993). A P-gp transporta esteróides tendo ambos estes grupos hidroxil, se

os esteróides perdem um destes grupos estão provavelmente diminuindo seu transporte

(Karssen et al. 2001).

2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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3. OBJETIVOS

3.1. Geral

Avaliar a resposta imune celular de pacientes com artrite reumatóide, controles saudáveis e

sua relação com a sensibilidade linfocitária a glicocorticóides in vitro.

3.2. Específicos

• Analisar a proliferação de células T estimuladas por mitógeno.

• Investigar a sensibilidade das células T a glicocorticóides (DEX e CORT).

• Analisar a atividade funcional da P-gp linfocitária.

• Investigar a relação dos polimorfismos MDR e a expressão da P-gp.

• Comparar todas as variáveis estudadas em relação (a) faixas etárias, (b) diferentes

intervenções terapêuticas.

4. ARTIGO CIENTÍFICO

Este artigo será submetido à Clinical and Experimental Immunology

IS STEROID RESISTANCE ASSOCIATED WITH MULTIDRUG RESISTANCE-I

(MDR-I) IN RHEUMATOID ARTHRITIS?

L.C. BOROWSKI

, R.P. LOPES

T.P. GONZALEZ

, L.A. DUMMER

, J.A.B. CHIES

I.G. SILVEIRA

, M. KEISERMANN

and M.E. BAUER

a,b

Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Instituto de Pesquisas Biomédicas, Hospital São Lucas,

Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS). Av. Ipiranga 6690, 2° andar, Caixa Postal

1429, Porto Alegre, RS 90610-000, Brazil

Faculdade de Biociências, PUCRS, Porto Alegre, Brazil

Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, Brazil

Ambulatório de Reumatologia, Hospital São Lucas, PUCRS, Porto Alegre, Brazil

Corresponding author: Dr Moisés E. Bauer, Laboratório de Imunologia Celular e Mole-

cular, Instituto de Pesquisas Biomédicas, Hospital São Lucas - PUCRS, Av. Ipiranga 6690,

2º andar – P.O. Box 1429. 90.610-000 Porto Alegre, RS. Brazil. Phone: +55 51 3320

00/x27233203312. Email:

[email protected]

Summary

Both aging and rheumatoid arthritis (RA) are frequently associated with acquired steroid

resistance. Here, we investigated if GC resistance is associated with multidrug resistance

(MDR). Seventy-four RA patients and 26 healthy controls took part in this study. Periph-

eral blood mononuclear cells were isolated and T-cell sensitivity to GCs was measured in

vitro. Functional activity of P-glycoprotein, a pump molecule that decreases intracellular

drug concentrations by increasing drug efflux, was assessed in peripheral lymphocytes as

well as ABCB1/MDR-1 gene polymorphism. Patients and controls had similar sensitivities

to GCs. Non-stimulated cells of middle-aged patients were more sensitive to dexa-

methasone than young or elderly subjects. Patients had a higher percentage of lymphocytes

extruding rhodamine 123 (Rh123

dim

) than controls in spite of similar P-glycoprotein activ-

ity. The distribution of ABCB1 genotypes in RA patients did not differ significantly from

that in controls. These data suggest that peripheral lymphocytes of arthritic patients are

fully responsive to GCs in vitro and present higher extrusion of drugs in spite of normal P-

gp function.

Keywords: rheumatoid arthritis, glucocorticoids, P-glycoprotein, lymphocyte proliferation,

polymorphisms, ABCB1/MDR1.

5. Introduction

The rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease associated with synovial

inflammation characterized by lymphocyte infiltration [1] that damages bones and carti-

lages and eventually leads to destruction of joints [2]. The treatment of RA patients in-

cludes anti-inflammatory drugs, immunosuppressors, anti-malarics and cytokine inhibitors

[3]. Of special note, the glucocorticoids (GCs) have been commonly used as powerful anti-

inflammatory drugs for the treatment of RA, asthma, systemic lupus erythematosus, leu-

kemias, lymphomas and transplant rejection [4, 5]. However, chronic GC treatment is asso-

ciated with acquired steroid resistance [6, 7]. There is some data suggesting that RA pa-

tients develop GC resistance, requiring greater drug amounts and/or extended period of

treatment [6, 7]. However, there is considerable debate over this finding since others have

found cells with increased sensitivity to steroids in RA [8]. These discrepancies could be

explained by disease-modifying factors including age and severity of disease [9]. Indeed,

we have recently described that healthy aging is associated with significant T-cell resis-

tance to GC treatment [10]. However, the impact of the pathological aging on this GC im-

munoregulation is largely unknown. This information can be useful for a more individual-

oriented therapy [11].

To date, it is unknown to what extent the steroid resistance is associated with re-

sistance to other drugs. Classic multidrug resistance (MDR) is characterized by the expres-

sion of the ABCB1 gene, which encodes for a transmembrane protein P-glycoprotein (P-

gp). This protein functions as an efflux pump to decrease the intracellular accumulation of

a variety of lipophilic drugs, including chloroquine, immunosuppressors and GCs [12, 13].

Little is known about the possible role of P-gp in inflammatory and autoimmune diseases

that require therapy with drugs actively extruded by this transporter. There is some evi-

dence that increased P-gp activity in lymphocytes from systemic lupus erythematosus [14]

and RA [15] might influence disease outcome or steroid requirements for disease control.

Some genetic polymorphims of the ABCB1 gene have been described and are associated

with disposition of P-gp substrates in humans [16, 17]. However, the association of the

polymorphisms ABCB1 gene and expression and function of P-gp is largely unknown.

In this study, we investigated (i) the potential involvement of steroid resistance

with MDR and (ii) to further explore the age-related effects on lymphocyte sensitivity to

GCs in peripheral blood.

6. Materials and Methods

6.1. Subjects

Seventy-four patients with RA (mean age 53.04 ± 1.79) were recruited from the

Rheumatology Unit (São Lucas Hospital, Porto Alegre, Brazil). Patients were sub grouped

accordingly to the following age ranges: young adults (20-40 yrs; n = 16), middle-aged

(41-60 yrs; n = 31) and elderly (>60 yrs; n = 27). The diagnosis of RA was made according

to the criteria of the American College of Rheumatology [18]. In addition, 26 age-matched

healthy control subjects (20-79 yrs; mean age 45.08 ± 3.32) also took part in this study and

included health care workers, undergraduates and local community dwellers. Exclusion

criteria included infections, heart disease, under nourishment, anemia, leucopoenia, neopla-

sia, major depression, HIV, pathology of tireoid and diabetes. The study protocol was ap-

proved by both scientific and ethics committees (Pontifical Catholic University of Rio

Grande do Sul, PUCRS, Porto Alegre, Brazil) and written informed consent was obtained

from all subjects.

6.2. Collection of peripheral blood and isolation of mononuclear cells

Twenty milliliters of peripheral blood was collected by venepuncture in the morn-

ing (between 9–10 h) and samples stored into lithium-heparin tubes prior to analyses. Sam-

ples were always collected at the same time of day to minimize circadian variations. Pe-

ripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by centrifugation over a Ficoll-

Hypaque (Sigma) gradient (900 g, 30 min). Cells were counted by means of microscopy

(100 x) and viability always exceeded 95%, as judged from their ability to exclude trypan

blue (Sigma).

6.3. Cell cultures and steroid sensitivity assays

PBMCs were cultured in flat bottomed 96-well microplates in a final concentra-

tion of 1.5x10

cells/well in complete culture medium (i.e. supplemented with gentamicin

0.5%, glutamine 1%, fungizone 0.1%, HEPES 1% and heat-inactivated fetal calf serum

10%, all from Sigma) for 96h at 37ºC in 5% CO

atmosphere. Stimulation by the selective

T-cell mitogen phytohemagglutinin (PHA 2, 1 and 0.5%; Gibco, USA) was performed in

triplicates (100 µL/well). In non-stimulated cultures (PHA 0), mitogen was substituted by

culture medium. To assess in vitro T-cell sensitivity to steroids, DEX (a synthetic type II

steroid receptor agonist), and corticosterone (CORT, binds to both types of steroid recep-

tors) were added in duplicates (10

-9

to 10

-4

M; all from Sigma) to mitogen-stimulated (PHA

1%) lymphocyte cultures. Glucocorticoid concentrations were used in a range that free en-

dogenous GCs would reach during resting state (10

-9

M), stress (10

-6

M) and under phar-

macological treatment (10

-5

M) in vivo. Data are presented as percentage of basal prolifera-

tion, where 100% (basal) represents cultures of PHA 1% without steroids. The drug con-

centration that provided 50% inhibition (IC50) of lymphocyte proliferation was estimated

by non-linear regression (Prism 4.0, Graphpad software, USA). A sigmoidal dose-response

equation was chosen to fit the data (R

higher than 0.95).

6.4. Cell proliferation/viability assay

The proliferative responses were determined by a modified colorimetric assay [19,

20]. In the last 4 h of culture, 100 µL of the supernatant was gently discarded and 40 µL of

freshly prepared MTT (3-(4,5-diamethyl 2-thiazolyl) 2,5 diphenyl-2H-tetrazolium, Sigma)

solution (5 mg/mL in RPMI-1640) was added to each well. The dehydrogenase enzymes in

metabolically active cells convert this substrate to formazan, producing a dark blue precipi-

tate. The cell cultures were incubated for 4h at 37°C in 5% CO

atmosphere. After com-

pletely removal of the supernatant, 100 µL of dimethyl sulfoxide (Sigma) was added to

each well. The optical density (OD) was determined using Biorad ELISA plate reader at a

wavelength of 570 and 630 nm. Proliferation/viability was expressed as ∆OD (OD of

stimulated – OD of nonstimulated cultures).

6.5. Steroid responsiveness

Glucocorticoid responders and non-responders were identified through analysis of

dose-response curves of control samples cultured with DEX or CORT. The area under the

curve (AUC) was calculated by the trapezoidal rule. Patients with AUC DEX higher than

the median (403.55 for young patients, 396.20 for middle age and 394.70 for aged) were

classified as GC non-responders, while patients with an AUC lower than this value were

considered sensitive to DEX in vitro and were classified as responders. Patients with AUC

CORT higher than the median (437 for young patients, 421 for middle age and 478.60 for

aged) were classified as GC non-responders, while patients with an AUC lower than this

value were considered sensitive to CORT in vitro and were classified as responders.

6.6. Rhodamine 123-efflux assay

The P-gp activity was determined by efflux of Rhodamine 123 (Rh123, Sigma), a

fluorescent dye that is a substrate for P-gp and is pumped out cell. The PBMCs were res-

suspended in complete RPMI-1640 medium in the final concentration 5 x 10

cells/mL and

incubated twice with Rh123 (200 ng/mL) in the presence or absence of 50 mM verapamil

(a P-gp inhibitor; Sigma) for 30 min at 37

C in a humidified atmosphere of 5% CO

. After

each incubation, cells were washed (2X) with PBS. Immunofluorescence was performed

using a flow cytometer (FACScalibur, BD Pharmingen, USA). The Rh123 efflux index

was calculated on the basis of the ratio of mean fluorescence intensity for Rh123 in Rh123

+ verapamil/Rh123, accordingly to previous work [21].

6.7. ABCB1 genotyping

Peripheral blood samples (2 mL) from RA patients and healthy subjects were

colleted for genomic DNA, which was executed using the method described by Lahiri &

Nurnberger [22] and screened for the single nucleotide polymorphisms (SNPs) using po-

lymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assays.

Genotyping of the polymorphisms ABCB1 was performed as previously described for

C1236T and G2677T/A [23] and C3435T [24] polymorphisms.

6.8. Statistical analysis

All variables were tested for normality of distribution by means of the Kolmo-

gorov-Smirnov test. Comparisons between groups and treatments were done by two-way

repeated measures ANOVA that included two between-subjects variables and one within-

subjects variable. Multiple comparisons among levels were checked with Tukey post hoc

test. The differences between independent-samples were analyzed with T test. The propor-

tions differences between groups were analyzed by contingency test χ

. Interrelationships

between variables were analyzed by Pearson’s correlation test. The significance level was

α = 0.05 (two-tailed) and a computer statistics software (SPSS 11.5, USA) was used for

statistical analysis. Data are expressed as mean ± SE.

7. Results

7.1. Demographic data and clinical characteristics

Demographic and clinical characteristics of RA patients are shown in table 1. To

investigate the impact of aging in the RA, patients were sub grouped in three age ranges:

young adults (20-40 yrs), middle-aged (41-60 yrs) and elderly (> 60 yrs). The duration of

disease was found highest in the elderly group (p < 0.001), as expected. All patients were

taken different drugs that included disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs),

glucocorticoids and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Drug regimen as

well as the remaining clinical variables was found similarly distributed among different age

subgroups.

Table 1. Demographic and clinical characteristics of the RA patients

Factors Young

(n = 16)

Middle-aged

(n = 31)

Elderly

(n = 27)

Age (yrs)

30.62

1.64 50.97

1.05 68.70

1.08***

Males/females 1/15 5/26 6/21

BMI

24.96 ± 1.31

26.34 ± 0.79

25.42 ± 0.92

RA duration (yrs)

5.87

1.44 12

1.11 15.56

2.24***

Serum CRP (mg/L)

4.80

3.16 1.61

0.47 0.96

0.15

ESR (mm/h)

34.19

7.83 22.20

4.08 24.54

3.57

No. RF positive 9 20 22

Morning stiffness (n) 11 23 20

Lymphocytes (counts/mL)

2604.00

2.92 2362.00

1.86 2096.00

1.75

Treatment

DMARDs, n (%) 14 (87.5) 27 (87.1) 24 (88.9)

NSAIDs, n (%) 7 (43.8) 14 (45.2) 8 (29.6)

Corticosteroids, n (%) 12 (75) 30 (96.8) 22 (81.5)

BMI = body mass index; RA = rheumatoid arthritis; CRP = C-reactive protein; ESR =

erythrocyte sedimentation rate; RF = rheumatoid factor; DMARDs = disease-modifying

antirheumatic drugs; NSAIDs = nonsteroidal antiinflammatory drugs. Statistical differ-

ences: *** < 0.0001.

7.2. Lymphocyte proliferation and sensitivity to glucocorticoids

We evaluated the spontaneous and mitogen-induced lymphocyte proliferation as

index of cell-mediated immunity. The spontaneous (basal) proliferation/viability of PBMCs

was found increased in RA patients compared to controls (0.39 ± 0.02 vs 0.29 ± 0.01, re-

spectively), F(1,94) = 10.33, p = 0.002. Significant age-related effects were observed in the

control group, F(2,25) = 10.74, p = 0.001. A higher basal proliferation/viability was ob-

served in the middle-aged group when compared to young (p < 0.001) or elders (p < 0.001)

(Fig. 1). This age-related effect was not observed for RA patients.

Fig. 1. Non-stimulated proliferation/viability. Statistically significant differences are indi-

cated: **p < 0.01.

RA patients had significant higher (54%) proliferative responses when compared

to healthy controls, F(1,62) = 7.03, p < 0.01. In addition, we observed significant age-

related changes for the control group, F(1,19) = 11.38, p < 0.001. In particular, elders pre-

sented blunted T-cell responses when compared to middle-aged or young subjects (Fig. 2).

This cogent aging effect was not observed for the RA patients (p = 0.83).

Young Middle-aged Elderly

Controls

Young Middle-aged Elderly

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

RA Patients

OD (570 nm)

2.0 1.0 0.5

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

RA Patients

PHA (%)

∆

OD (570 nm)

Fig. 2. Mitogen-induced T-cell proliferation. Statistically significant differences are indi-

cated: *** p = 0.004 vs. young and # p = 0.001 vs. middle-aged.

In view of evidence that healthy aging [10] and RA [6, 7] are associated with GC

resistance, we also evaluated the peripheral lymphocyte sensitivity to steroids across differ-

ent age groups. This was explored by analyzing the ability of GCs in suppressing T-cell

proliferation/viability in vitro. First, we analyzed the sensitivity of non-stimulated PBMCs

to DEX, a synthetic GC that is actively extruded by P-gp. Non-stimulated PBMCs are

largely refractory to GC treatment. PBMCs of RA patients and controls responded simi-

larly to DEX treatment (Fig. 3), F(1,84) = 0.67, p = 0.41. There was an age effect for the

group of RA patients, although this only approached statistical significance, F(2,62) = 2.77,

p = 0.07. In particular, non-stimulated PBMCs of middle-aged patients (~26.14% of sup-

pression) were more sensitive than young (~14.28% of suppression) or elderly subjects

(~19.37% of suppression). This was not observed for the healthy controls, F(2,22) = 0.47, p

= 0.63.

2.0 1.0 0.5

PHA (%)

Controls

***

Young

Middle-aged

Elderly

Fig. 3. Non-stimulated PBMCs sensitivity to DEX in patients and controls.

We also evaluated the stimulated T-cell sensitivity to DEX and CORT (i.e. a natu-

ral GC that is not extruded by P-gp). These GCs produced significant dose-dependent sup-

pression of T-cell proliferation (both p < 0.0001). These data highlight the efficacy of these

steroids in suppressing in vitro proliferation. We found similar T-cell sensitivities to DEX

and CORT between RA patients and controls, p = 0.72 and p = 0.14 respectively. Age pro-

duced no changes on cellular sensitivities to DEX and CORT, p = 0.57 and p = 0.16 respec-

tively (Fig. 4).

-9

-8

-7

-6

-5

-4

Middle-aged

Young

Elderly

Controls

Dexamethasone (mol/l)

-9

-8

-7

-6

-5

-4

100

120

RA Patients

Dexamethasone (mol/l)

% basal proliferation

-9

-8

-7

-6

-5

-4

100

120

RA Patients

Dexamethasone (mol/l)

% basal proliferation

-9

-8

-7

-6

-5

-4

Young

Middle-aged

Elderly

Controls

Dexamethasone (mol/l)

Fig. 4. Peripheral T-cell sensitivities to DEX and CORT. Glucocorticoid sensitivity was

assessed by incubating PBMCs with PHA 1% and increasing concentrations of GCs. Data

are shown as percentage of basal proliferation (100% = PHA 1% without steroids).

We then investigated the frequency of GC responders and non-responders of

DEX/CORT within RA patients. We found no significant differences between the fre-

quency of GC responders/non-responders to DEX (χ

= 3.83, p = 0.15) or CORT (χ

1.53, p = 0.47) across age groups (Table 2). We have also compared the T-cell sensitivity

to GCs in vitro between patients under or not GC treatment in vivo. However, we found no

significant differences between these groups (data not shown).

-9

-8

-7

-6

-5

-4

Young

Middle-aged

Elderly

Controls

Corticosterone (mol/l)

-9

-8

-7

-6

-5

-4

100

120

140

RA Patients

Corticosterone (mol/l)

% basal proliferation

Table 2. Frequency of DEX and CORT responsiveness of RA patients

Young Middle-aged Elderly

DEX responders

Frequency

Percent 62.5 51.6 33.3

DEX non-responders

Frequency 6 15 18

Percent 37.5 48.4 66.7

CORT responders

Frequency 7 10 12

Percent 43.8 32.3 48

CORT non

responders

Frequency

Percent

56.3

67.7

7.3. Functional activity of P-glycoprotein

In order to address the basal drug extrusion activity of P-gp, we analyzed the per-

centage of lymphocytes extruding Rh123. Representative flow cytometry data are shown in

Fig. 5. Lymphocytes were gated and separated into two distinct cell populations based on

the ability to extrude Rh123: (a) Rh123

dim

+ cells that are actively extruding Rh123 and (b)

Rh123

bright

+ cells that are not extruding the stain. The region of Rh123

bright

+ cells was de-

fined by cultures treated with verapamil that blocks P-gp extrusion and increase fluores-

cence (Fig. 5D).

Interestingly, RA patients (71.81% ± 2.79) had a significantly higher percentage

of Rh123

dim

+ lymphocytes than controls (59.22% ± 3.31), t = 2.73, p = 0.008 (Fig. 6A). In

line with this observation, lymphocytes of patients had a significantly lower mean fluores-

cence intensity of Rh123 compared to controls, 202.64 ± 12.04 vs. 300.50 ± 20.02 respec-

tively, t = 4.41, p = 0.0001.

Furthermore, DEX non-responders patients had a higher percentage of Rh123

dim

lymphocytes compared to DEX responders, 75.78% ± 3.37 vs. 66.53% ± 4.56 respectively,

t = 1.67, p = 0.10. In contrast, we found no significant differences in the P-gp activity be-

tween patients and controls, p = 0.43 (Fig. 6B). In addition, there were no age-related ef-

fects in P-gp activity.

Fig. 5. Representative flow cytometry analysis of P-gp function. (A) Shows the cellular

gates. The P-gp activity was evaluated in the lymphocyte gate. (B) Dot plot of cells incu-

bated with Rh123 in healthy control. (C) Dot plot of cells incubated with Rh123 in RA

patient. (D) Lymphocyte incubated with Rh123 and the verapamil in control. (E) Histo-

gram shows the overlap of lymphocyte incubated with Rh123 in the absence or presence of

verapamil.

Fig. 6. Analysis of P-gp activity. (A) Percentage of Rh123

dim

lymphocytes. (B) P-gp activ-

ity shown as efflux index of Rh123. Statistically significant differences are shown, **p <

0.01.

7.4. Genetic polymorphisms of the ABCB1 drug transporter

To investigate the possible relation of the genetic ABCB1 polymorphisms with

functional P-gp activity, we evaluated the frequencies of the polymorphisms in three exons

ABCB1 gene in RA patients and controls (Table 3). We found no significant differences in

the frequencies of the exon 12 (χ² = 1.83, p = 0.40) and exon 26 (χ² = 3.92, p = 0.14) be-

tween RA patients and controls, independently of age. RA patients and controls with dif-

ferent ABCB1 genotypes showed similar activity of P-gp (data not shown). There were no

associations between ABCB1 polymorphisms and clinical features including rheumatoid

factor, morning stiffness, duration of disease and use of medication.

RA Patients Controls

% Lymphocytes Rh123+

dim

RA Patients Controls

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Rh123 efflux index

Table 3. Frequencies of the ABCB1 polymorphisms

RA patients Controls

ABCB1 C1236T (exon 12)

7/34 (20.6%)

1/6 (16.7%)

CT 19/34 (55.9%) 2/6 (33.3%)

TT 8/34 (23.5%) 3/6 (50%)

ABCB1 G2677T/A (exon 21)

GG-AA 6/40 (15%) -

G-AT 27/40 (67.5%) -

TT 7/40 (17.5%) -

ABCB1 C3435T (exon 26)

6/46 (13%)

5/14 (35.7%)

26/46 (56.5%)

5/14 (35.7%)

14/46 (30.4%)

4/14 (28.6%)

7.5. Clinical correlates of P-gp activity

Here, we investigated the possible association of P-gp with clinical characteristics

of RA patients. We found no significant correlation (r = -0.094, p = 0.53) between the P-gp

efflux and age of patients. P-gp activity was not correlated to clinical markers or sensitivity

to GCs.

8. Discussion

The treatment of RA includes anti-inflammatory drugs, immunosuppressors, anti-

malarics and cytokine inhibitors [3]. Of special note, the GCs have been commonly used as

powerful drugs for the treatment of inflammatory diseases, neoplasias and transplants [4,

5]. However, chronic GC treatment is frequently associated with acquired steroid resistance

[6, 7]. Indeed, there is some data suggesting that RA patients may develop GC resistance

[6, 7]. Steroid resistance could be influenced by several factors including age, severity of

disease and genetic polymorphisms of the GC receptor and/or P-gp. In this study, we inves-

tigated the impact of age on lymphocyte sensitivity to steroids and the potential involve-

ment of steroid resistance with ABCB1 polymorphisms and function.

Spontaneous and mitogen-induced proliferation/viability of T-cells were found

significantly increased in patients compared to controls. This could be explained by the

chronic inflammatory condition in RA characterized by lymphocyte infiltration and tissue

damage [1]. Local immunoregulation in the joints is disturbed, producing dysregulated

systemic proliferation and/or increasing viability by selecting cells less susceptible to apop-

tosis [25, 26]. Previous data are conflicting in RA. Some investigators observed no changes

in cell proliferation [27] and others reported increased proliferative responses [28]. These

discrepancies could be due to differences in clinical features of RA patients such as treat-

ments, severity and/or duration of the disease.

There is some data suggesting that RA patients develop acquired GC resistance,

requiring greater drug amounts and/or extended period of treatment [6, 7]. However, there

is considerable debate over this finding since others have found cells with increased sensi-

tivity to steroids in RA [8]. These discrepancies could be due to disease-modifying factors

including age, severity of disease and genetic background [9]. In this study, we investigated

peripheral T-cell sensitivity to GCs that are differentially mobilized by P-gp: DEX (syn-

thetic GC that is extruded by P-gp) and CORT (natural hormone that is not extruded by P-

gp). Accordingly to previous studies [11, 27], we observed that cells of patients and con-

trols responded similarly to both compounds in vitro. Based on previous work suggesting

that steroid sensitivity maybe tissue-specific [29], we speculate that non-activated periph-

eral lymphocytes are fully responsive to steroids compared to synovial lymphocytes. We

have previously observed that peripheral T-cell subsets (CD4 and CD8) of RA patients are

essentially inactive, as judged by the capacity to express early activation markers CD25

and CD69 (unpublished data). The chronic local (joint) inflammation may be important in

modulating steroid responsiveness in vivo. For instance, there is some evidence suggesting

that pro-inflammatory cytokines may change cellular sensitivity to GCs [30, 31]. In future

studies, it would be thus interesting to compare cellular sensitivity to GCs between syno-

vial tissue and peripheral blood. Nevertheless, it is remarkable that cells of RA patients

under a mixed drug regimen (steroidal and non-steroidal) are still fully responsive to GCs

in vitro. Additionally, we observed some age-related effects for steroid sensitivity. In par-

ticular, non-stimulated PBMCs of middle-aged patients were found more sensitive to DEX.

It is tempting to speculate that this age group will benefit from steroidal treatments.

To date, it is unknown to what extent the steroid resistance is associated with re-

sistance to other drugs. One important mode of drug resistance can be due to enhanced cel-

lular extrusion of drugs, a process that can be mediated by specific members of a super-

family of ATP-binding cassette (ABC) proteins [32]. Since these proteins can mediate the

efflux of a wide range of structurally unrelated drugs, they are also referred to as MDR

proteins [33]. Normal peripheral blood lymphocytes (but not macrophages) express P-gp

and show significant efflux of the P-gp substrates doxorubicin and rhodamine 123 [34, 35].

Since lymphocytes are not involved in detoxification or hormone secretion, the physiologi-

cal role of P-gp in these cells are still obscure. It has been shown that P-gp may be involved

in the transport of cytotoxic substrates that play a role in cellular immune mechanisms such

as NK function [36], CD8+ mediated cytotoxicity [37, 38] and TNF-α secretion [36, 39].

In this study, we observed an increased basal percentage of Rh123

dim

lymphocytes

in patients than in controls in spite of similar functional P-gp activity. In order to explain

this apparent contradiction, we speculate that cells of patients would display a higher num-

ber of P-gp molecules and, consequently, extruded more Rh123. Based on our data, cells of

RA patients are likely to over express ~12.6% more P-gp molecules than cells of controls.

To confirm the existence of MDR in RA, further studies are required to evaluate both the

cell-surface density of P-gp molecules as well as functional activity. These data is in con-

trast with previous work reporting increased P-gp activity in PBMCs from RA patients

with active disease [15]. Enhanced P-gp activity was associated with unfavorable clinical

course and a poor response to treatment. This discrepancy could be due to differences in

the methodology used to evaluate P-gp activity. In this study, we used a common P-gp an-

tagonist that enabled us to directly measure P-gp activity by inhibiting extrusion of Rh123.

Previous work that evaluated the cellular efflux of daunorubicin without P-gp antagonist

should be taken with caution [15]. Additional studies relating to substrate especificity,

regulation and function of P-gp are needed.

The pharmacodynamics is influenced by individual’s genetic background. Some

genetic polymorphisms of the ABCB1 gene have been described and are associated with

disposition of P-gp substrates in humans [16, 17]. Here, we investigated the association of

the ABCB1 gene polymorphisms in RA and the expression and function of P-gp. It was

observed a similar distribution of C3435T ABCB1 genotypes between RA patients and

healthy controls. Previous data have suggested that C3435T ABCB1 polymorphism is not

an important genetic risk factor for RA susceptibility, but it might influence the disease

activity as well as playing a role in patients who are refractory to drug treatment [15, 40,

41]. It was also demonstrated that the probability of remission of RA symptoms was

greater in patients with the 3435TT genotype compared to patients with the genotypes

3435CC and 3435CT [40]. In this study, ABCB1 polymorphisms were not associated to P-

gp function. This is in contrast to previous study that associated the C3435T polymorphism

with decreased P-gp function in NK lymphocytes [42]. Further studies should include a

larger sample size to better address the associations of ABCB1 polymorphisms with RA

susceptibility and clinical course. Pharmacogenetic testing achieves an increasing impact in

the individualization of drug treatment and could therefore contribute significantly to en-

hanced drug safety and efficacy [43].

In summary, we demonstrated here that PBMCs of RA patients under multiple

drug treatments are fully responsive to GCs in vitro and present higher extrusion of drugs

by peripheral lymphocytes in spite of normal P-gp function. More studies comparing the

synovial tissue with PBMCs are necessary to better understand general responsiveness to

GCs. In addition, it would be valuable to compare sensitivity to GCs and P-gp function

between patients with active and inactive, well-controlled disease.

9. Acknowledgments

This study was supported by grants from CNPq (551180/01-3, M.E.B.).

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11. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nesse estudo, avaliamos o impacto da idade na sensibilidade linfocitária aos GCs

e o possível envolvimento da resistência esteroidal com polimorfismos ABCB1 e a ativida-

de funcional da P-gp.

Encontramos que a proliferação espontânea ou induzida por mitógeno de células

T estava mais elevada nos pacientes com AR, sendo possivelmente relacionada à inflama-

ção crônica que é caracterizada pela infiltração de linfócitos no líquido sinovial, causando

danos aos ossos e cartilagens e eventualmente conduzindo à destruição das articulações.

Alguns estudos sugerem o desenvolvimento de uma resistência adquirida aos GCs

em pacientes com AR, mostrando que os pacientes necessitam de altas dosagens dos medi-

camentos por longos períodos de tratamento. Porém, neste estudo, não encontramos dife-

rença na sensibilidade periférica aos GCs entre pacientes e controles. Seria interessante,

portanto, comparar a sensibilidade aos GCs em linfócitos do líquido sinovial bem como nas

células periféricas. Todos os pacientes do nosso estudo eram medicados e isto pode ter sido

uma variável de influência nos resultados. Desta forma, considero importante analisar um

grupo de pacientes livre de quaisquer medicamentos. Embora isso seja extremamente difí-

cil na realidade.

Além do papel farmacológico dos transportadores MDR na expulsão celular de

compostos tóxicos e drogas, há evidências que os transportadores MDR podem exercer um

importante papel fisiológico nos processos imunológicos. A função fisiológica de muitos

destes transportadores ABC e seu possível papel na resistência a drogas permanece por ser

elucidado. Nós observamos atividades semelhantes da P-gp entre pacientes e controles,

enquanto outros estudos sugerem uma atividade aumentada da P-gp e o seu envolvimento

com a pobre resposta ao tratamento. Mais estudos são necessários para avaliar a regulação

e função da P-gp linfocitária. Seria necessário um maior número de pacientes para verificar

as associações dos polimorfismos ABCB1 com a resposta clínica e susceptibilidade à AR,

podendo dessa forma determinar a individualização do tratamento.

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