( PDF ) Aspectos supressivos da resposta imune pulmonar em portadores de tuberculose ativa

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ASPECTOS SUPRESSIVOS DA RESPOSTA IMUNE EM

PORTADORES DE TUBERCULOSE ATIVA

ALEXANDRE SILVA DE ALMEIDA

RIO DE JANEIRO

2008

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Faculdade de Medicina

Aspectos supressivos da resposta imune pulmonar em portadores de

tuberculose ativa

Alexandre Silva de Almeida

Orientadores:

Dr. José Roberto Lapa e Silva

Dr. John Lap Ho

Dr. Adalberto Rezende Santos

Tese submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Clínica

Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos

necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências.

Rio de Janeiro

Fevereiro de 2008

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Almeida, Alexandre Silva de

Aspectos supressivos da resposta imune pulmonar em portadores de

tuberculose ativa / Alexandre Silva de Almeida. – Rio de Janeiro: UFRJ /

Faculdade de Medicina, 2008.

xviii, 236 f. : il. ; 31 cm.

Orientadores: José Roberto Lapa e Silva , John Lap Ho e Adalberto

Rezende Santos

Tese (doutorado) – UFRJ/Faculdade de Medicina, Programa de Pós-

Graduação em Clínica Médica, Pneumologia, 2008.

Referências bibliográficas: f. 133-153

1. Tuberculose - imunologia. 2. Marcadores biológicos . 3. Reação em

cadeia da polimerase. 4. Infecções por Mycobacterium - imunologia. 5.

Estudos longitudinais . 6. Humano. 7. Pneumologia – Tese. I. Lapa e Silva,

José Roberto. II. Ho, John L. III. Santos, Adalberto Rezende. IV.

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa

de Pós-Graduação em Clínica Médica, Pneumologia. V. Título.

iii

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Faculdade de Medicina

Aspectos supressivos da resposta imune pulmonar em pacientes com tuberculose ativa

Alexandre Silva de Almeida

Orientadores:

Prof. José Roberto Lapa e Silva

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prof. John Lap Ho

Weill Medical College of Cornell University, New York-USA

Dr. Adalberto Rezende Santos

Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro

Tese submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da

Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários a

obtenção do grau de Doutor em Ciências.

Aprovada em

Banca examinadora:

Prof. José Roberto Lapa e Silva

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Dr. Milton Ozório de Moraes

FIOCRUZ- Rio de Janeiro

Prof. Marcelo Torres Bozza

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prof. Heitor Siffert Pereira de Souza

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prof. Geraldo Moura Batista Pereira

Universidade do Estado do Rio de Janeiro e FIOCRUZ

Rio de Janeiro

Fevereiro de 2008

Dedico aos meus pais, Sérgio (in memoriam) e Iliani

A meus irmãos Luciana, Claudia e Alex

Ao amigo, e figura paterna, Almeida

Agradecimentos

Inicialmente à minha família pela presença, suporte e carinho durante o

desenvolvimento deste trabalho. Muitas das dificuldades foram superadas pelo telefone ou por

e-mail mas a verdade é que a distância física nunca nos afastou.

Agradeço especialmente à minha mãe Iliani Almeida por ser “Pãe” e por enxergar

sempre além nas minhas necessidades. Poucas são as palavras de gratidão a você.

Agradeço ao meu pai Sergio Gonçalves, pois sem você nada seria possível e mesmo

ausente você sempre estará presente em minha memória...

Agradeço aos meus orientadores, José Roberto Lapa e Silva, Adalberto Rezende

Santos e John Lap Ho pelo extenuante trabalho de lapidação científica elaborado por vocês,

que espero fazer jus nesta defesa e na minha carreira daqui por diante.

A Sidra Vasconcellos pelo companheirismo, paciência e suporte ao longo desta

jornada de trabalho. Você sabe o quanto este trabalho significou para nós e por isto sou grato

pelo quanto se doou a ele... Obrigado!

Aos meus amigos do Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa, da Unidade de

Pesquisa em Tuberculose e do Laboratório de Biologia Molecular do HUCFF, do

Departamento de Hanseníase e do Departamento de Ultra-Estrutura e Biologia Celular da

Fiocruz. Vocês são muitos, mas lembro de cada um com particularidade e deixo aqui o meu

obrigado a todos pelo incentivo e amizade. Dentre eles destaco alguns que contribuíram de

forma muito importante em diferentes aspectos, alargando as minhas experiências pessoais

(Alessandra Coelho, Alexandre Felipe, Amanda Brum, Carlos Miranda, Diogo Coutinho,

Eliane Barbosa, Elizabeth Sampaio, Guilherme Inocêncio, Helene Barbosa, Jorge Salgado,

Joseane Fonseca, Luís Afonso, Martha Oliveira, Maurício Paiva, Milton Ozório, Neio

Boéchat, Patrícia Lago, Phillip Suffys, Rosane Barbosa, Rosane Telles, Rose Telles e

Walcemir Filho).

A Teresa Gouda pela paciência, bom humor e ajuda nos dias difíceis da burocracia

acadêmica.

Aos meu amigos da Divisão de Medicina Internacional e Doença Infecciosas da

Universidade Cornell de Nova York e a alguns outros especiais (Omar, Richard, Carioca,

Rodrigo, Paul, Janaína Saad, Jee, Luís, Tofol, Pedro, Gladys, Sergio, Ron, Hong-Xia, Bea,

Maria Quintas, Andrea, Richard Huard e a todos do Dynamo de Nova York) que tornaram

bastante agradáveis os dias longe de casa.

À minha prima Karla Dias, Alexandre Maffini, e a futura Sarah pela companhia em

Connecticut com um toque bem brasileiro. Vocês aliviaram o peso da distância familiar...

À Gisele Pequeno pelo apoio, incentivo além das longas noites de conversa e a intensa

divisão que se tornaram uma alavanca muito grande para a finalização desta tese. Devo muito

a você!

Especial agradecimento à minha grande família por todo o pensamento positivo em

particular a Arnaldo Marques, Claudia Kapps, Cláudio Ventura, Francisco da Costa, Gabriel

Rodrigues, Luciano Lucena, Marilia Kapps, Mirian Dias, Nelma Cyrino.

E a tudo e todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento deste

trabalho.

Ao suporte dos projetos Millenium Institute of Science, PRONEX/CNPq, Fogarty NIH

D43 TW000018-16S, NIH, RO1 HL61960, R21 AI063147 e R21 AI62332 e FAPERJ-

Aluno Nota Dez.

vii

E não me esquecer, ao começar o trabalho, de me preparar

para errar. Não esquecer que o erro muitas vezes se havia

tornado o meu caminho. Todas as vezes que não dava certo o

que eu pensava ou sentia, é que se fazia enfim uma brecha, e, se

antes eu tivesse tido coragem, já teria entrado por ela. Mas eu

sempre tivera medo do delírio e erro. Meu erro, no entanto,

devia ser o caminho de uma verdade: pois só quando erro é que

saio do que conheço e do que entendo. Se a 'verdade' fosse

aquilo que posso entender, terminaria sendo apenas uma

verdade pequena, do meu tamanho.

Palavras de Clarice Lispector registradas por Affonso Romano

de Sant'Anna no ensaio O ritual epifânico do texto em “Que

fazer de Ezra Pound?”.

viii

Lista de Figuras

FIGURA 1: ESTIMATIVA DE NOVOS CASOS, 2005 ___________________________________ 11

IGURA 2: MODELO DE AÇÃO DE IRAK _________________________________________ 58

IGURA 3: MODELO DE AÇÃO DE SOCS _________________________________________ 60

FIGURA 4: MODELO DE AÇÃO DE NEMO ________________________________________ 65

IGURA 5: RELAÇÃO DE GENES ANALISADOS POR RT-PCR __________________________ 87

FIGURA 6: CURVAS PADRÃO PARA DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE AMPLIFICAÇÃO POR

RT_PCR ________________________________________________________ 88

FIGURA 7: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS MEDIADORES IMUNOLÓGICOS PULMONARES EM

PACIENTES COM

TB ATIVA, OUTRAS PNEUMOPATIAS (OLD) E VOLUNTÁRIOS

SAUDÁVEIS

(HCW) ANTES DO INÍCIO DO TRATAMENTO ANTI-TB _____________ 97

IGURA 8: AVALIAÇÃO DOS MEDIADORES IMUNOLÓGICOS PULMONARES NO MOMENTO DO

DIAGNÓSTICO

(0) E DURANTE O TRATAMENTO ANTI-TB (15, 30, 60 E 180 DIAS) __ 99

IGURA 9: VARIAÇÕES DA EXPRESSÃO DE RNAM DOS MEDIADORES IMUNOLÓGICOS NOS

PACIENTES COM

TB ATIVA DURANTE O TRATAMENTO ANTI-TB _____________ 101

IGURA 10: EXPRESSÃO DE RNAM DE MEDIADORES IMUNOLÓGICOS DURANTE A RESPOSTA EM

MONÓCITOS IN VITRO INFECTADOS PELO

M. TUBERCULOSIS H37RV ___________ 109

IGURA 11: EXPRESSÃO DE RNAM DE MEDIADORES IMUNOLÓGICOS DURANTEA RESPOSTA DE

PBMC IN VITRO INFECTADAS PELO M. TUBERCULOSIS H37RV _______________ 110

IGURA 12: NÍVEIS DE MEDIADORES IMUNOLÓGICOS DURANTE A RESPOSTA DE PBMCS IN VITRO

INFECTADOS PELO

M. TUBERCULOSIS H37RV POR ELISA __________________ 112

IGURA 13: MODELO ILUSTRATIVO DA MODULAÇÃO IMUNOLÓGICA NEGATIVA NO PULMÃO

ASSOCIADA COM A

TB ATIVA _______________________________________ 117

IGURA 14: CLONAGEM E DIGESTÃO DOS GENES GLCB E MPT-51 DE M.TB _____________ 131

IGURA 15: BLOTS DE HIBRIDAÇÃO DOS DIFERENTES CLUSTERS DE M.TB (IS6110)

COMPARAÇÃO COM A PRESENÇA DO GENE

MPT-51 DE M.TB ________________ 131

IGURA 16: BLOTS DE HIBRIDAÇÃO DOS DIFERENTES CLUSTERS DE M.TB E COMPARAÇÃO COM A

PRESENÇA DO GENE

GLCB DE M.TB ___________________________________ 132

Lista de Tabelas

TABELA 1: ESQUEMAS DE TRATAMENTO PRECONIZADOS PELO MINISTÉRIO DA SAÚDE _____ 17

ABELA 2: PRIMERS UTILIZADOS NAS ANÁLISES POR RT-PCR ________________________ 85

TABELA 3: DADOS DEMOGRÁFICOS, CLÍNICOS E LABORATORIAIS DE TODOS OS INDIVÍDUOS

ENVOLVIDOS NO ESTUDO NO MOMENTO DO DIAGNÓSTICO

___________________ 94

ABELA 4: COMPARAÇÃO DOS GRUPOS L, M E H DOS MEDIADORES IMUNOLÓGICOS POR

MÚLTIPLOS TESTES ESTATÍSTICOS

___________________ _________________ 103

TABELA 5: COMPARAÇÃO DOS MEDIADORES EXPRESSOS EM CASOS DE TB DURANTE O

TRATAMENTO ANTI

-TB COM A EXPRESSÃO EM CONTROLES SAUDÁVEIS HCW E

PORTADORES DE OUTRAS PNEUMOPATIAS

OLD__________________________ 105

TABELA 6: ASPECTOS CLÍNICOS E A CORRELAÇÃO COM OS MEDIADORES IMUNOLÓGICOS EM

PACIENTES COM TB ATIVA__________________________________________ 107

Resumo

Almeida, Alexandre Silva de. Aspectos supressivos da resposta imune em portadores de

tuberculose ativa. Rio de Janeiro, 2008. Tese de Doutorado (Doutorado em Ciências).

UFRJ / Faculdade de Medicina, 2008.

RACIONAL: A Tuberculose (TB) é uma das principais doenças infecciosas que assolam a

humanidade. O Brasil ocupa a 15 posição entre os 22 países com 80% dos casos de TB em

todo o mundo. A infecção por Mycobacterium tuberculosis (M. tb) resulta numa resposta

imune complexa que pode controlar todo o processo infeccioso ou permitir o progresso da

tuberculose latente para a doença ativa. A interação entre células pulmonares, e os mediadores

pró e anti-inflamatórios durante a infecção já foi descrita em inúmeras publicações nas

últimas décadas. Entretanto, pouco se sabe sobre aspectos da imunologia no envolvimento de

células pulmonares humanas durante a infecção primária e a TB ativa. METODOLOGIA:

Usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), a expressão do RNAm

para GAPDH e para 17 genes envolvidos na regulação da resposta imune (TNFα, IL-10, IL-

12p35 & p40, IFNγ, TGFβ-RI & RII, IL-1Rn, CD80, CD86, SOCS3, SOCS1, TLR2, IRAK-

M, NEMO, IDO e IL-23) foi estudada em 30 portadores de TB, 11 portadores de outras

pneumopatias (OLD) e 16 voluntários saudáveis (HCW) antes e após o início da

quimioterapia (Rx) para TB. Amostras de células pulmonares foram coletadas através do

escarro induzido. RESULTADOS: antes do tratamento houve predominância da expressão

das seguintes citocinas anti-inflamatórias, inflamatórias, receptores e genes reguladores de

supressão da resposta imune em TB: IFNγ, IL-12p35, IL-12p40, TLR2, IRAK-M, IL-1Rn,

TGFβRI e TGFβRII, IDO, IL-10, SOCS3 e SOCS1, comparados a OLD e HCW (p<0.05,

Kruskal-Wallis). Dos mediadores imunológicos avaliados a partir de 15° dia de tratamento,

mantiveram-se com expressão significativa ao final do tratamento SOCS1, SOCS3, TLR2,

IRAK-M, IL-12p35, IL-12p40, NEMO e IFNγ, quando comparados aos grupos controles.

CONCLUSÕES: antes do tratamento, a expressão de citocinas inflamatórias e o grau de

ativação das células presentes no meio pulmonar são contrabalançados pela expressão de

fatores desativadores, os quais podem estar envolvidos na supressão da resposta imune,

resultando na TB ativa. Associado a isto, após início do tratamento a redução da carga bacilar,

citocinas anti-inflamatórias, receptores e outros fatores (IL-10, TGFβ-RI, TGFβ-RII, NEMO,

TLR2, IDO, PPARγ) e genes regulatórios supressivos (SOCS1, SOCS3) aumentam sua

expressão. Isto pode contribuir para a contenção da inflamação pulmonar excessiva, limitando

o dano tecidual. Alternativamente, pode facilitar a recidiva da tuberculose em pacientes

suscetíveis.

xiii

Abstract

Almeida, Alexandre Silva de. Suppressive aspects from the host immune response in

active TB patients. Rio de Janeiro, 2008. Graduation in Science. Medical College from

Federal University of Rio de Janeiro, 2008.

RATIONALE: Tuberculosis (TB) is one of the most important contagious diseases. Brazil is

included among the 22 countries with 80% of cases of TB around the world. Infection with

Mycobacterium tuberculosis (M. tb) results in a complex immune response that could control all

the process or progress from latent infection to active disease. A complex interaction among

lung cells, pro and anti-inflammatory mediators during the period of M tb infection has been

published in the last decades. Thereafter, there is scarce data on immune events that indeed

occur in the “milieu” of the lung at the earlier phases of the disease and cytokine pattern

expressed in the human lungs during active TB is still matter of debate. METHODS: Using RT-

PCR, expression of mRNA for GAPDH and for 18 genes involved in immune regulation

(TNFα, IL-10, IL-12p35 & p40, IFNγ, TGFβ-RI & RII, IL-1Rn, CD80, CD86, SOCS3, SOCS1,

TLR2, IRAK-M, NEMO, IDO and IL-23) was studied in 30 Tb patients,11 Other Lung Disease

(OLD) and 16 Healthy Care Workers (HCW) before and after initiation of chemotherapy (Rx)

for TB. Lung cells were recovered by induced sputum. RESULTS: Prior to Rx there is a

predominance of expression of some anti-inflammatory, inflammatory cytokines, signal

transductions proteins, receptors and suppressive regulatory immune genes with p<0.05 by

kruskal-Wallis analysis (IFNγ, IL-12p35, IL-12p40, TLR2, IRAK-M, IL-1Rn, TGFβRI and

TGFβRII, IDO, IL-10, SOCs3 and SOCs1) compared with OLD and HCW. CONCLUSIONS:

Our results are in line with the idea that before therapy the expression of inflammatory

cytokines and the degree of cell activation present in the pulmonary “milieu” is counter-

balanced by a relevant expression of deactivating factors. They could be involved in the

suppression of immune response resulting in active TB. In addition, after starting Rx - and

induction of bacilli clearance, anti-inflammatory cytokines, cytokines receptors and other

factors (IL-10, TGFβ-RI, TGFβ-RII, NEMO, TLR2, IDO, and PPARγ) and suppressive

regulatory genes (SOCS1, SOCS3) were differentially increased. This may contribute to

containment of excessive lung inflammation thus limiting tissue damage. Alternatively, it may

facilitate clinical TB relapse in susceptible patients.

xiv

Lista de Abreviaturas

aa - aminoácidos

AIDS - Síndrome da imunodeficiência adquirida

APC - Células apresentadoras de antígeno

ATP - Adenosina tri-fosfato

BAAR - bacilo álcool-ácido resistente

BAL -Lavado broncoalveolar

BCG - bacilo Calmette-Guérin

BK – Bacilo de Koch

CD - Cluster of differentiation

CEP - Comitê de ética em pesquisa

CF - Filtrado de cultura

CFP - Proteína do filtrado de cultura

CMI - Imunidade mediada por célula

DC - Células dendríticas

dl - decilitro

DNA - Ácido desoxirribonucleico

DNAc - DNA complementar

DOTS - Tratamento diretamente observado de curta duração

DTT - Ditiotreitol

EA - Escarro espontâneo

EI - Escarro induzido

GlcB- Malato sintetase

HCW – Trabalhadores de saúde

HIV - Vírus da imunodeficiência humana

HLA – Antígenos leucocitários humanos

HNTB - O Estudo da história natural da tuberculose

HUCFF - Hospital Universitário Clementino Fraga Filho

ICAM -1 - moléculas de adesão intercelular tipo I

IDO - Indoleamina-pirrol 2,3 dioxigenase

IDT - Instituto de Doenças do Tórax

IFNγ- interferon gama

IL - Interleucina

INH - Isoniazida

Ipr1 – Gene de resistência a patógeno intracelular 1

IRAK-M -Quinase 3 associada ao receptor de interleucina 1

JAK - Janus quinase

KatG - catalase peroxidase

Kd - Quilobase

kDa - Quilodalton

Ko - Knockout

L. monocytoigenes - Listeria monocytogenes

LAM - Lipoarabinomanana

LBP – Proteína ligante de LPS

LPS - lipopolissacarídeos

LRG - IFN-inducible p47GTPase

M. tb - Mycobacterium tuberculosis

mAb – Anticorpo Monoclonal

MAPK - Mitogen-activated protein kinase

MDR – multidroga-resistência

Mf - Monócitos

mg - miligrama

MHC – Complexo de Histocompatibilidade Principal

min - minuto

MOTT - Micobactérias não tuberculosas

MPT-51 - Proteína de ligação a fibronectina C, 85C.

MTC - Complexo Mycobacterium tuberculosis

MyD88 – Gene de resposta primária de diferenciação mielóide (88)

NEMO - IKBKG inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase gamma

NFkB – fator nuclear kappa B

NK - Natural killers

nm - Nanômetros

NOS - Óxido nítrico sintase

NRAMP - natural resistance-associated macrophage protein 1

OMS - Organização Mundial de Saúde

OLD – Outras pneumopatias

PAMP – Padrões moleculares de associação a patógenos

PBMC – Células mononucleares de sangue periférico

PBS – Salina tamponada por fosfato, Phosphate buffered saline

PCTH - Programa de Controle da Tuberculose Hospitalar

pH - Concentração de íons de hidrogênio

PIB Produto interno bruto

PIM - Fosfatidilinositol manosideo

PMN -Células polimorfonucleares

PPD – derivado protéico purificado

PZA - Pirazinamida

RIF - Rifampicina

RNA -Ácido ribonucléico

RNAm -Ácido ribonucléico mensageiro

RNI - Radicais intermediários de nitrogênio

RPM - Rotações por minuto

RT-PCR – Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

SINAM/ MS - Sistema de Informação de Agravos de Notificação da Vigilância Sanitária - Ministério da Saúde

SOCS - Supressor de sinalização de citocinas

SodA - Superóxido dismutase

SP110b - Interferon-induced protein 41, 30kD

sst1 – Gene de Super-susceptibilidade a Tuberculose 1

STAT – Sinal tradutor e ativador de transcrição

TAE - Tris acetato EDTA

TB - Tuberculose

TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TCR - T cell receptor

TGFβ - Fator transformador de crescimento

TGFβ -RI - receptor I do Fator transformador de crescimento

TGFβ - RII - receptor II do Fator transformador de crescimento

Th1 - Células T helper tipo 1

TLR – Receptores tipo Toll

TMB - 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina

TNFα- Fator de necrose tumoral - alfa

TNFR- Receptor para o fator de necrose tumoral

Treg - Células T reguladoras

UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro

UTR – Região não transcrita

WT – Tipo selvagem

°C - Grau Celsius

µl - Microlitro

xvi

Sumário

1.0 INTRODUÇÃO ___________________________________________________________1

2.0 R

EVISÃO DA LITERATURA _________________________________________________6

2.1 T

UBERCULOSE: ASPECTOS GERAIS E ELEMENTOS HISTÓRICOS ______________ 6

2.2 E

PIDEMIOLOGIA DA TUBERCULOSE ___________________________________ 9

2.3 O

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E A PATOGÊNESE DA DOENÇA___________ 11

2.3.1 O ESQUEMA DE TRATAMENTO QUIMIOTERÁPICO A TUBERCULOSE E

OUTROS ASPECTOS

_________________________________________ 15

2.3.2 P

REDISPOSIÇÃO GENÉTICA E EXPRESSÃO GÊNICA NO HOSPEDEIRO

HUMANO ________________________________________________ 19

2.3.3 A

IMUNOPATOGENIA DA TUBERCULOSE E A IMUNIDADE INATA ______ 21

2.3.4 O

GRANULOMA ___________________________________________ 26

2.3.5 I

MUNIDADE ADAPTATIVA OU ADQUIRIDA NA TUBERCULOSE ________ 28

2.3.6 C

ÉLULAS T REGULATÓRIAS CD4+CD25+ NA RESPOSTA IMUNE

ADAPTATIVA _____________________________________________ 33

2.3.7 C

ÉLULAS T γδ ____________________________________________ 34

2.3.8 C

ÉLULAS T CD1+ _________________________________________ 36

2.3.9 I

MUNIDADE ADQUIRIDA HUMORAL E PROTEÍNAS DO M. TB __________ 37

2.4 A

PARTICIPAÇÃO DAS CITOCINAS E OUTROS FATORES MOLECULARES NA

RESPOSTA IMUNE À TUBERCULOSE __________________________________ 40

2.4.1 IFNγ ____________________________________________________ 40

2.4.2 TNFα___________________________________________________ 42

2.4.3 IL-12

P35 E IL-12P40 _______________________________________ 44

2.4.4 IL-23

P19 ________________________________________________ 46

2.4.5 IL-10 ___________________________________________________ 48

2.4.6 R

ECEPTORES _____________________________________________ 50

2.4.6.1 TGFβ-RI

E TGFβ-RII _____________________________ 50

2.4.6.2 CD-80 e CD-86 __________________________________ 52

2.4.6.3 IL-1Rn _________________________________________ 54

2.4.6.4 TLR-2 _________________________________________ 56

2.4.7 M

EDIADORES INTRACELULARES, IMUNOSSUPRESSORES E ENZIMA ____ 58

2.4.7.1 IRAK-M _______________________________________ 58

2.4.7.2 SOCS1

E SOCS3 _________________________________ 60

2.4.7.3 IDO ___________________________________________ 63

2.4.7.4 NEMO _________________________________________ 64

2.5 A

RESPOSTA IMUNE COMPARTIMENTALIZADA NO PULMÃO________________ 66

3.0 H

IPÓTESE____________________________________________________________ 70

4.0 O

BJETIVOS GERAL _____________________________________________________ 70

4.1 O

BJETIVOS ESPECÍFICOS __________________________________________ 70

xvii

5.0 M

ATERIAL E MÉTODOS _________________________________________________ 72

5.1 D

ESENHO DO ESTUDO ____________________________________________ 72

5.2 C

RITÉRIOS DE INCLUSÃO __________________________________________ 72

5.3 C

RITÉRIOS DE EXCLUSÃO _________________________________________ 73

5.4 T

AMANHO AMOSTRAL ____________________________________________ 73

5.5 A

SPECTOS ÉTICOS _______________________________________________ 73

5.6 Q

UESTIONÁRIO PADRONIZADO _____________________________________ 74

5.7 PA

CIENTES ENVOLVIDOS NO ESTUDO ________________________________ 75

5.8 I

NDUÇÃO DO ESCARRO ___________________________________________ 76

5.9 M

ANIPULAÇÃO DO ESCARRO _______________________________________ 77

5.10 S

EPARAÇÃO DO MATERIAL:________________________________________ 77

5.11 C

OLORAÇÃO ___________________________________________________ 80

5.12 O

BTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO E MONÓCITOS

_____________________________________________________________ 81

5.13 E

STÍMULO MYCOBACTERIANO E ELISA ______________________________ 82

5.14 I

SOLAMENTO DO RNA TOTAL E SÍNTESE DE DNA COMPLEMENTAR _________ 83

5.15 I

NICIADORES OU PRIMERS:_________________________________________ 84

5.16 R

EAL TIME PCR ________________________________________________ 86

5.17 E

FICIÊNCIA DE QUANTIFICAÇÃO DOS GENES ALVOS _____________________ 87

5.18 C

URVAS PADRÃO________________________________________________ 87

5.19 A

NÁLISE ESTATÍSTICA____________________________________________ 89

6.0 R

ESULTADOS _________________________________________________________ 91

6.1 D

ADOS DEMOGRÁFICOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS____________________ 91

6.2 E

XPRESSÃO DE MEDIADORES IMUNOLÓGICOS EM CÉLULAS PULMONARES NO

MOMENTO DO DIAGNÓSTICO

_______________________________________ 95

6.3 E

XPRESSÃO DE MEDIADORES IMUNOLÓGICOS EM CÉLULAS PULMONARES DE

PORTADORES DE

TB AO LONGO DO TRATAMENTO _______________________ 98

6.4 E

VOLUÇÃO TEMPORAL DOS MEDIADORES IMUNOLÓGICOS EXPRESSOS POR CÉLULAS

PULMONARES DE PORTADORES DE

TB CORRIGIDOS PELA EXPRESSÃO INICIAL

(TEMPO ZERO) _________________________________________________ 100

6.5 A

NÁLISE ESTATÍSTICA DOS MEDIADORES IMUNOLÓGICOS EM TB AO LONGO DO

TRATAMENTO COMPARADA A EXPRESSÃO INICIAL EM

OLD E HCW ________ 102

6.6 C

OMPARAÇÃO DOS MEDIADORES EXPRESSOS EM CASOS DE TB DURANTE O

TRATAMENTO COMPARADA A EXPRESSÃO INICIAL EM

OLD E HCW ________ 104

6.7 C

ORRELAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA COM CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS EM

PORTADORES DE

TB_____________________________________________ 107

6.8 E

XPRESSÃO DE MEDIADORES PNEUMOLÓGICOS EM CÉLULAS DO SANGUE

PERIFÉRICO

(PBMC) ESTIMULADAS “IN VITRO” POR ANTÍGENOS DO “M.TB” _ 108

7.0 D

ISCUSSÃO _________________________________________________________ 113

8.0 C

ONCLUSÕES ________________________________________________________ 128

9.0 P

ERSPECTIVAS E LIMITAÇÕES DO ESTUDO__________________________________ 129

10.0 R

EFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS __________________________________________ 133

11.0 A

NEXOS ____________________________________________________________ 154

11.1 A

NEXO 1 APROVAÇÃO ORIGINAL DO PROJETO PELO CEP FM/HUCFF ______ 155

xviii

11.2 A

NEXO 2 ULTIMA APROVAÇÃO DO PROJETO PELO CEP FM/HUCFF _______ 156

11.3 A

NEXO 3 APROVAÇÃO ORIGINAL DO PROJETO PELO IRB WMCCU_________ 157

11.4 A

NEXO 4 ULTIMA APROVAÇÃO DO PROJETO PELO IRB WMCCU __________ 159

11.5 A

NEXO 5 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE) _____ 160

11.6 A

NEXO 6 QUESTIONÁRIO DE ENTREVISTA ____________________________ 162

11.7 A

NEXO 7 ARTIGO SUBMETIDO À AVALIAÇÃO DA REVISTA J EXP MED ______ 179

11.8 A

NEXO 8 ARTIGO NO PRELO- PEDIATRICS_____________________________ 216

11.9 A

NEXO 9 ARTIGO PUBLICADO- BRAZ J MED BIOL RES ____________________ 227

Introdução 1

1.0 Introdução

A tuberculose é uma das enfermidades mais antigas e conhecidas do mundo e

representa um problema de saúde pública segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS),

sendo considerada, como uma enfermidade reemergente, desde 1993. Os principais fatores

que contribuem para a manutenção e agravamento do problema são a persistência da pobreza

em nossa sociedade e a ocorrência da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (em inglês

AIDS) nos grandes centros. O aumento da ocorrência da resistência a múltiplas drogas

(MDR) é outro fator agravante. Cerca de 1,2 bilhões de pessoas no mundo vivem abaixo do

limiar da pobreza absoluta (< 1,00 US$ /dia) e os países de baixo e médio/baixo rendimento

econômico (PIB per capita US$ ao ano < 2995,00 – segundo conceito do Banco Mundial)

concentram mais de 95% dos casos de óbtio por tuberculose. As nações de baixos recursos

econômicos (PIB per capita US$ ao ano < 755,00) acolhem 65% dos casos de tuberculose

ativa e 71% de óbitos sendo que aproximadamente 42% da população mundial vivem nessas

nações. A tuberculose (TB) é a doença pragmática da pobreza, sendo amplamente

reconhecido que os mais pobres são os que mais se infectam e desenvolvem a doença ativa.

Associado a isto, o impacto econômico da tuberculose é dramático nos países

subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, no qual se insere o Brasil, o qual apresenta uma

média anual de 90-95 mil casos novos e re-tratados de TB em todo o país (WHO 2007). A

implementação de medidas de intervenção sob o controle operacional da OMS e com o apoio

direto do Banco Mundial, incluem a estratégia do programa denominado de Estratégia de

Tratamento Supervisionado da Tuberculose (DOTS em inglês) para o controle a TB; além da

colaboração associada entre programas TB x HIV na prevenção do HIV e controle da TB, a

investigação e desenvolvimento de novas vacinas anti-TB, testes diagnósticos e

medicamentos específicos (Assessoria de Pneumologia Sanitária, 2005; Programa Nacional

de Controle da Tuberculose 2007; (World Health Organization (WHO) Report, 2007).

Introdução 2

Um segundo aspecto está associado à resposta imune do hospedeiro frente ao

Mycobacterium tuberculosis (M. tb) com a regulação de moléculas imunes que influenciam o

curso da doença no seu hospedeiro natural, o homem. Uma vez infectado, um amplo arsenal

de defesa incluindo barreiras inatas da resposta imune, dá seqüência a uma elaborada ativação

específica da resposta imune adaptativa que entra em ação contrapondo-se ao M. tb. Em

linhas gerais, a resposta adaptativa é provida por células T CD4

e CD8

reguladas por

citocinas e outros mediadores imunológicos, assim como pela produção de anticorpos

específicos, suficientes para eliminar ou conter a progressão da doença ativa (Salgame 2005;

Rook et al. 2005). Conseqüentemente, cerca de 70% dos indivíduos expostos ao bacilo

contêm a infecção na porta de entrada. Dos 30% que desenvolvem a infecção latente, a

imensa maioria não apresenta qualquer conseqüência clínica, e cerca de 10% dos indivíduos

infectados desenvolvem a doença ativa. Segundo a OMS, um terço da população mundial, ou

seja, dois bilhões de pessoas, tem infecção latente por tuberculose (WHO – Report 2007). Os

indivíduos com TB latente representam um reservatório da doença, de onde posteriormente

uma fração desenvolverá a forma ativa. A progressão silenciosa acobertada pelo estado de

latência da TB representa um empecilho estratégico no combate e controle da tuberculose

neste grupo de indivíduos em escala mundial. Complementa-se a isto os diferentes estágios de

progressão da doença, incluindo a já descrita latência e a reativação do Mycobacterium e a

própria doença ativa. Aparentemente, estes estágios de progressão podem estar conectados

primariamente pela presença do M. tb ou pela resposta imune local do pulmão no hospedeiro

humano (Kaufmann et al. 2005). Conseqüentemente, pode haver uma correlação entre ambos

os fatores, resposta imune do hospedeiro e virulência do patógeno, na determinação dos

desfechos do processo infeccioso desencadeado pelo M. tb.

Os estágios de imunodeficiência são os principais fatores de predisposição à

tuberculose, sendo o HIV é um dos principais fatores de risco de progressão da TB ativa em

Introdução 3

adultos (Frieden et al. 2003). Contudo, independentemente da infecção pelo HIV ou da

presença de outros fatores que induzem imunodeficiência, há um estado de deficiência

relativa da resposta imunitária que se caracteriza pela inibição da proliferação de linfócitos T

e pela redução da produção de IL-2 na TB (Ellner 1978; Toosi et al. 1986). Em alguns casos a

anergia tuberculínica é vista em pacientes com TB ativa frente ao teste cutâneo ao PPD

(Ellner 1978; Toosi et al. 1986). Alguns trabalhos tem revisto os aspectos da imunossupressão

na tuberculose, já que uma possível debilidade imunológica do hospedeiro poderia determinar

a viabilidade do M. tb tornar-se metabolicamente predisposto à ativação. Flynn & Chan

(2005) descrevem amplamente os aspectos da regulação do TNFα na formação e manutenção

do granuloma como estrutura de contenção do M. tb e a influência de antígenos do M. tb na

expressão de TNFα como preditor da queda do estado de latência e reativação da doença.

Ainda neste contexto associa-se a presença de células T

reg

CD4

CD25

Foxp3

que contribuem

para a supressão da resposta imune em pacientes ao M. tb pela inibição de IFNγ em células da

PBMC (Chen et al. 2007); condições médicas que comprometam o sistema imune como

diabetes melitus, insuficiência renal, terapia com corticosteróide, má nutrição, deficiência de

vitamina D e A; assim como defeitos na produção de IFNγ, TNFα ou no receptor para IFNγ

estão relacionados à tuberculose. Rook et al. 2005 abordam aspectos da natureza da resposta

imune frente a TB que efetivamente envolvem a resposta celular Th-1 em populações de

países em desenvolvimento na latitude 30° na linha do Equador. Entretanto, há indícios de

que a proteção não está diretamente associada ao tamanho da resposta mas sim à ineficiência

da vacinação pelo BCG, co-infecção, principalmente pelo HIV ou helmínticas, e a produção

paralela de IL-4 e IL-5 associada a estes processos (Rook et al. 2005). A deficiência na

eliminação do M. tb, segundo Toosi & Ellner, 1998, pode estar associada a uma excessiva

secreção de citocinas anti-inflamatórias nos sítios da infecção tuberculosa. Diante deste

cenário, o M. tb poderá determinar a transição da infecção e o estabelecimento da doença

Introdução 4

ativa. Entretanto, o tratamento anti-TB é capaz de reverter este quadro nos pacientes com seis

meses de terapia padrão na eliminação da carga bacilar, com resolução da infecção (Dieli et

al. 2000).

A maioria dos estudos realizados nos últimos anos sobre a patogenia da tuberculose

utilizou modelos animais que, embora muito úteis para a determinação dos fenômenos

biológicos de interação parasito-hospedeiro, nem sempre refletem com precisão o

desenvolvimento da infecção pelo M. tb no seu hospedeiro natural: o homem. Os estudos de

patogenia da tuberculose no homem, e principalmente a detecção de antígenos

micobacterianos tem sido realizados, em geral, através de estudos in vitro com o emprego de

células do sangue periférico (Sable et al. 2007; Schwander et al. 1998; de Jong et al. 1998).

Sabe-se, no entanto, que o sistema imune apresenta características que sugerem

compartimentalização, também na tuberculose (Schwander et al. 2000), daí o fato da

necessidade de um estudo no local da infecção para TB. O padrão ouro para o estudo do

compartimento pulmonar é o lavado broncoalveolar (BAL). Vários grupos, inclusive o nosso,

lançaram mão do método para investigação de questões ligadas à patogenia da tuberculose

(Nicholson et al. 1996; Bonecini-Almeida et al. 2004; Grassi et al. 2006; Ulrichs et al. 2005).

Neste âmbito, iniciamos em nosso grupo um projeto denominado “O Estudo da

História Natural da Tuberculose” (HNTB) e utilizamos o BAL como método para avaliação

de vários aspectos da resposta imune local no pulmão de pacientes com TB ativa (Nicholson

et al. 1996; Lapa e Silva et al. 1996; Bonecini-Almeida 1998 e Bonecini-Almeida et al.

2004). Com este modelo pudemos demonstrar resultados significativos envolvendo a

expressão local dos imunossupressores IL-10 e TGFβ, assim como a co-expressão dos

receptores TGFβRI e RII, atuando como moduladores negativos da resposta anti-TB em

pacientes com tuberculose ativa, se comparado a pacientes com outras pneumopatias ou

controles saudáveis. Em paralelo, foi detectada a expressão de IFNγ e IL-2 nos pacientes com

Introdução 5

TB ativa e pacientes com outras pneumopatias. Concluímos que não seria uma ausência na

sinalização da resposta imune a causa do desenvolvimento da TB ativa, mas a persistência da

resposta imune negativa no sítio da infecção concomitante à resposta imune protetora.

Paralelo a isto vimos a necessidade de estabelecimento de estudos longitudinais, que nos

levou a optar pelo uso de outro método para acesso ao compartimento pulmonar em

portadores de TB, o escarro induzido (EI). Este tipo de amostra é obtida por um processo

menos invasivo, com maior custo-benefício, e uma maior sensibilidade para o diagnóstico da

TB através de baciloscopia (Conde et al. 2000; Conde et al. 2003), bem como para a detecção

de marcadores imunológicos durante o tratamento anti-TB (Ribeiro-Rodrigues et al. 2002).

Utilizando este tipode amostras a presença de uma proteína secretada pelo M. tb, CFP32 e sua

correlação com os níveis de IL-10 (Huard et al. 2003a).

Neste estudo damos seqüência ao trabalho anterior utilizando o escarro induzido (EI),

como ferramenta e acompanhamos pacientes portadores de tuberculose em estudo

longitudinal, antes, durante e ao final do tratamento anti-TB. Esta metodologia possibilitou o

acompanhamento da resposta imunológica paralelamente ao tratamento anti-TB.

Revisão da Literatura 6

2.0 Revisão da literatura:

2.1 Tuberculose: aspectos gerais e elementos históricos

A tuberculose humana (TB) é uma doença infecciosa crônica causada principalmente

pelo Mycobacterium tuberculosis, uma bactéria aeróbica patogênica que estabelece a sua

infecção usualmente nos pulmões. Dados da literatura afirmam que o M. tb mata mais

indivíduos que qualquer outro agente infeccioso (Frieden 2003). Em 2006, Daniel et al.

(2006) revendo alguns aspectos históricos, verificaram a existência de uma antiga hipótese

que sugeria que o gênero Mycobacterium teria sido originado há mais de 150 milhões de anos,

ainda no período jurássico, devido à peculiaridades de distribuição geográfica e habitat da

espécie Mycobacterium ulcerans. Segundo Gutierrez et al. (2005) o ancestral progenitor do

M. tuberculosis esteve presente no leste africano há aproximadamente 3 milhões de anos

infectando hominídeos já naquele período. No entanto, outros membros modernos do

complexo M. tuberculosis, como Mycobacterium africanum e Mycobacterium canetti assim

como o Mycobacterium bovis, apresentam um ancestral comum cerca de 15 a 35.000 anos

atrás (Kapur et al. 1994; Brosch et al. 2002).

Assim como no Egito, evidências arqueológicas primárias de tuberculose também

foram documentas em múmias achadas na América. Evidências obtidas através de tipagem

molecular demonstraram a presença do M. tb em tecidos de múmias egípcias de mais de 5.000

anos, as quais apresentavam anormalidades e deformidades da doença em sua forma óssea,

incluindo as características de deformidade de Pott (Ducati et al. 2006). Outras evidências

históricas sugerem que a primeira descrição da doença consta de textos provenientes da Índia,

China e particularmente da Grécia antiga, na qual a tuberculose pulmonar já era conhecida,

sendo referida nos tempos de Hipócrates, como tísica (do grego “phthisikos”, ou seja, que traz

consumpção) (Kritski et al. 2000; Daniel 2006). Hipócrates descreveu ainda em seus

aforismas uma maior incidência da doença ativa em jovens no início da fase adulta, conforme

Revisão da Literatura 7

revisto por Daniel (2006):

“Phthisis faz o seu ataque principalmente entre a idade de 18 e 35 anos de idade”.

A TB foi responsável por milhões de mortes humanas no passado, quando não havia

métodos para tratamento clínico adequado para pacientes infectados, segundo dados históricos

revisto por Ducati et al. (2006). Na segunda metade do século XVII a doença atingiu índices

alarmantes de morte na Europa e prevaleceu assim até a o final do século XIX, e início do

século XX, sendo conhecida como a peste branca. As primeiras especulações com bases

científicas sobre a transmissão da TB foram propostas em 1722 pelo médico britânico

Benjamim Marten, que sugeriu que a tuberculose deveria ser transmitida através da respiração

de um indivíduo doente para um indivíduo sadio através do processo de inalação. Em 1819, o

francês René Laennec, o inventor do estetoscópio e vítima da doença, determinou pela

primeira vez que o “tubérculo” (granuloma) estava presente em todas as manifestações da

doença. Quando a TB tornou-se completamente estabelecida em todas classes sociais na

Europa, afligindo desde as camadas sociais mais desfavorecidas até a realeza do continente na

segunda metade do século XIX, esta foi romantizada e representada em quadros e pinturas

com típicos sintomas apresentando faces pálidas e finas dos infectados, tornando-se um sinal

de beleza de época.

Em 1865, o cirurgião militar Jean-Antoine Villemin demonstrou formalmente que TB

é uma doença contagiosa; seus experimentos puderam ser efetivamente reproduzidos em

coelhos. No entanto seus achados foram ignorados por seus contemporâneos por um longo

tempo. Em 1882, Carlos Forlanini, da Itália, criou a colapsoterapia médica pelo pneumotórax

artificial que disseminou-se amplamente por todos os países, constituindo-se num tratamento

com algum sucesso e presente até o início da década de 1950, quando surgiram as drogas anti-

tuberculosas (Rosemberg et al. 1999). Um dos mais importantes trabalhos em tuberculose de

todos os tempos foi apresentado em 24 de março de 1882 por Hermann Heinrich Robert

Revisão da Literatura 8

Koch. Koch fez a sua famosa apresentação, Die Aetiologie der tuberculose, para a “Berlin

Physiological Society”, aonde descreveu o isolamento do M. tb de tubérculos macerados

(Apud - Daniel 2006). Em seu trabalho experimental o cientista isolou, identificou, cultivou a

bactéria em meio de cultura in vitro, designando a mesma como agente etiológico da TB e

apresentando os postulados de Koch-Henle, a saber:

A) Isolamento do organismo patogênico da lesão produzida pela enfermidade.

B) Propagação deste em meio de cultura in vitro.

C) A inoculação do agente etiológico é capaz de reproduzir a doença em cobaias.

D) Re-isolamento do agente etiológico proveniente das cobaias.

As contribuições de Koch para a bacteriologia foram muitas e em 1905 foi agraciado

com o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia pela sua elucidação da etiologia da tuberculose.

Descobriu ainda a tuberculina em 1890 e posteriormente documentou sua utilidade para o

diagnóstico da TB. O teste tuberculínico de pele descrito por ele, já neste período, tornou-se o

principal ferramenta para o diagnóstico da infecção por TB. Posteriormente, um trabalho

colaborativo entre Koch e o médico alemão e bacteriologista Paul Ehrlich possibilitou ainda

um outro método de detecção do bacilo baseado na coloração de lâminas de esfregaço de

escarro, comumente utilizada ainda hoje, e denominado método de Ziehl-Nielsen.

No Brasil acredita-se que a tuberculose tenha sido introduzida pelos portugueses e

missionários Jesuítas desde 1500. Ruffino-Neto e Pereira (1981) discutem alguns aspectos do

estudo de evolução da mortalidade por TB, particularmente no Rio de Janeiro, no período de

1860 a 1960, aonde analisam os fatores econômicos, demográficos, sociais e as políticas de

saúde aí existentes, desde a chegada da Família Real aqui no Brasil em 1808 até o final da

década de 80 no século XX. Segundo os autores, medidas preventivas para contenção da

doença foram implementadas já no início do século XIX, entretanto a BCG oral foi

administrada pela primeira vez somente em 1927 por Arlindo de Assis a um recém-nascido. A

Revisão da Literatura 9

injeção intra-dérmica do BCG foi implementada em 1973, tornando-se obrigatória para

menores de um ano de idade desde 1976 (Ducati et al. 2006). Os índices de mortalidade

foram drasticamente reduzidos no Brasil pela introdução de drogas tuberculostáticas por volta

de 1940, incluindo a estreptomicina (1948), ácido p-aminosalicílico (1949) e isoniazida

(1952) (Ducati et al. 2006). Na década de 1960 foi instituído o esquema de tratamento

combinado, usando três antibióticos ao mesmo tempo, que conseguem curar cerca de 95% dos

pacientes. Estes antibióticos eram administrados a pacientes internados em sanatórios,

diariamente, por um tempo de 18 a 24 meses. Com a introdução da rifampicina no tratamento

combinado, no início da década de 1970, e posteriormente da pirazinamida, foi possível

encurtar o tratamento para seis meses, e tornar o tratamento ambulatorial, esquema que é

utilizado até os dias de hoje em todo o mundo.

2.2 Epidemiologia da tuberculose:

No Brasil, a tuberculose não é um problema emergente de saúde pública, como a

AIDS, e tampouco re-emergente, como a dengue. Ela é um problema presente há longo

tempo, com profundas raízes sociais, conforme salienta Ruffino-Neto (2002). Está

intimamente ligada à pobreza e à má distribuição de renda, além de provocar um estigma que

implica na não adesão dos portadores e/ou familiares/contactantes aos esquemas de

tratamento ou prevenção. O surgimento da epidemia de AIDS e o aparecimento de focos de

tuberculose multirresistente agravaram ainda mais o problema da doença não somente no

Brasil, como também no mundo.

Segundo estimativas da OMS, a tuberculose é, dentre as doenças infecciosas, a maior

causadora de sofrimento em todo o mundo, com uma taxa de 8.8 milhões de novos casos e 1.6

milhões de óbitos em 2005 e constitui um problema de saúde pública em muitos países (WHO

2007). Estima-se ainda que mais de um terço da população mundial esteja infectada pelo M.

Revisão da Literatura 10

tb, sendo esta população um importante reservatório para a reativação da TB (WHO 2007),

porém a quebra do ciclo de infecção da tuberculose é extremamente difícil devido a sua

progressão extremamente lenta.

O Brasil ocupa o 15º lugar entre os 22 países responsáveis por 80% do total de casos

de tuberculose no mundo (Figura 1). Estima-se uma prevalência de 50 milhões de infectados,

com cerca de 111.000 casos novos e 6.000 óbitos ocorrendo anualmente em decorrência da

doença, segundo dados eletrônicos do Programa Nacional de Controle da Tuberculose do

Ministério da Saúde em 2007. Outros dados do Programa Nacional de Controle da

Tuberculose, em 2006 indicam que são notificados anualmente 85 mil casos novos

(correspondendo a um coeficiente de incidência de 47/100.000 habitantes) no Brasil. As

metas internacionais estabelecidas pela OMS e pactuadas pelo governo brasileiro são de

detectar 70% dos casos de tuberculose estimados e curá-los em 85%. A região Sudeste

apresenta cerca de 48,24% do total de casos e particularmente o Rio de Janeiro, é o estado que

apresenta a mais alta taxa de incidência de tuberculose do país. A cada ano são notificados em

média 16.000 casos de tuberculose, sendo os casos diagnosticados em unidades hospitalares e

emergências correspondente a cerca de 20% do total de casos notificados a cada ano. Os 32

municípios prioritários no Rio de Janeiro concentram 95% dos casos de tuberculose e a região

metropolitana é responsável por 86% dos casos notificados no estado, de acordo com o

boletim informativo da Secretaria do Estado da Saúde (Assessoria de Pneumologia Sanitária

2005).

Revisão da Literatura 11

Figura 1.

2.3 O Mycobacterium tuberculosis e a patogênese da doença

Sem Estimativa

0-999

10 000-99 999

100 000- 999 999

1 000 000 ou mais

1000-9999

timativa do número de novos

casos de TB

(todas as formas clínicas)

Estimativa do número de novos casos, 2005

Adaptado do WHO REPORT 2007 Global Tuberculosis

As espécies do gênero Mycobacterium que causam a TB humana e animal estão

agrupadas no complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). As espécies clássicas do MTC

incluem

Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum (com vários subtipos),

Mycobacterium microti e Mycobacterium bovis [e sua cepa variante, o bacilo M. bovis

bacillus Calmette-Guérin (BCG), utilizada amplamente como vacina] (Brosh et al. 2002;

Huard et al. 2003b; Mostowy, et al. 2002). Novas espécies reconhecidas e adicionadas

recentemente ao MTC incluem o

Mycobacterium caprae e Mycobacterium pinnipedii (Aranaz

et al. 2003; Cousins et al. 2003). E por último existem as raras variantes do MTC

denominadas como bacilos “dassie” e “oryx”, que ainda dependem de definição para inclusão

no MTC (Mostowy et al. 2004; van Soolingen et al. 1994).

O Mycobacterium tuberculosis (M. tb) é uma forma de transição entre as eubactérias e

os actinomicetos. É um bacilo álcool-ácido resistente não formador de esporos, sem flagelos,

não produtor de toxinas, espécie aeróbica restrita e intracelular facultativo. Mede cerca de 0,3

a 0,6 µm de largura. Possui longo período de geração (16 a 20 horas) e de duplicação (18 a 48

Revisão da Literatura 12

horas), dependendo da oferta de oxigênio, nutrientes e de pH do meio. Esta forma de

crescimento lento forma a base para a natureza crônica da infecção e também da doença,

dificulta o diagnóstico microbiológico e exige um longo período para o tratamento.

O M. tuberculosis, em si, não apresenta um fator de virulência característico da

doença, como já descrito em outros patógenos bacterianos, como a produção de toxinas pelo

Corynebacterium diphtheriae, Echerichia coli O157:H7, Shigella dysenteriae e Vibrio

cholerae. Entretanto, elementos como mortalidade (percentagem de animais mortos em um

determinado tempo após infecção), morbidade (extensão do dano causado por determinada

cepa patogênica que pode incidir em morte) e carga bacilar (número de bactérias achadas no

hospedeiro após a infecção) são aspectos mensuráveis nas infecções. Conseqüentemente,

vários genes descritos na literatura são importante na patogenicidade do M. tuberculosis e

podem ser agrupados com a função de suas proteínas e pela notação da seqüência de DNA.

Smith 2003, revendo muitos destes aspectos, descreveu as proteínas do filtrado de

cultura ou CFPs Estas proteínas extremamente imunogênicas, e dentre elas podemos citar o

KatG (catalase peroxidase), SodA (superóxido dismutase) e enzimas que degradam radicais

intermediários de oxigênio (ROIs), importantes na sobrevivência do M. tb durante o processo

de infecção. Outras CFPs, bem como componentes de superfície celular são importantes como

por exemplo o HspX, Esat6, CF-10, proteína de 19kD, glnA1, Erp, Mas, Fas26, FbpA, OmpA

entre outras que apresentam funções amplas para o M. tb, como crescimento atenuado ou

inibição em condições de stress, ativação de citocinas e imunoproteínas, ativação de

metabólitos essenciais de nitrogênio, degradação de ácidos graxos e outros componentes

celulares, síntese de ácidos micólicos para ligação em proteínas de matriz extracelular,

proteína indutora de poros, entre outras já descritas na literatura.

Smith 2003 aborda ainda outros fatores de virulência como genes envolvidos no

metabolismo celular essencial do M. tb, associados à ativação enzimática, metabolismo de

Revisão da Literatura 13

lipídeos e ácidos graxos, ferro, magnésio e triptofano, biosíntese de aminoácidos, respiração

anaeróbica, proteína envolvidas no stress oxidativo como peróxidos de oxigênio e hidrogênio,

e ainda, fatores reguladores de transcrição da micobactéria são alguns exemplos descritos na

literatura da amplitude dos fatores de virulência descritos atualmente.

Recentemente, após o sequenciamento do genoma de M. tb (4.4Mb) e através de

técnicas de microarranjos foram identificados cerca de 2.441 genes com funções atribuídas,

912 genes com funções hipotéticas conservadas, 606 genes com funções desconhecidas e a

ausência de 129 genes, em relação ao M. bovis BCG (Kaufmann 2001). O M. tuberculosis

apresenta uma parede celular composta de ácido graxo de cadeias longas (ácidos micólicos) e

ainda glicolipídeos, entre outros componentes. Aproximadamente 250 genes do M. tb estão

envolvidos na síntese metabólica de compostos da parede celular. Uma vez associados a

peptidoglicanos, os ácidos graxos formam uma parede periférica hidrofóbica que ainda

contribui para aspectos de patogenicidade do M. tb, como a inibição de IFNγ (Banaiee et al.

2006) ou a alteração do estado de latência (Keep et al. 2006). A complexa estrutura da parede

bacteriana do M. tb possui uma alta imunogenicidade, particularmente pela presença de

proteínas específicas da parede de M. tb recentemente descritas, Malato Sintetase (GlcB) e a

proteína de ligação à fibronectina C 85C (MPT51). Anticorpos contra estas proteínas estão

presentes em cerca de 90% de pacientes com infecção latente por tuberculose (Singh et al.

2005). Bactérias recombinantes para MPT-51 e GlcB são capazes de induzir a resposta imune

celular em camundongos via células citotóxicas T e a produção de IFNγ (Suzuki et al. 2004).

Como revisto por Flynn & Chan (2001), o M. tb é um patógeno obrigatoriamente

aeróbico, intracelular e que tem a predileção pelo tecido pulmonar rico em oxigênio. O bacilo

se dissemina a partir do sítio inicial de infecção no pulmão via sistema linfático e ainda por

disseminação hematogênica. Cerca de 15% dos pacientes com tuberculose apresentam formas

extra-pulmonares, como pleural, linfática, óssea, gênito-urinária, meníngea, peritonial ou

Revisão da Literatura 14

cutânea. Como revisto por Lima-Filho (1993), a transmissão ocorre majoritariamente através

de aerossóis produzidos durante a tosse ou outros movimentos expiratórios de uma pessoa

bacilífera. Os bacilos ficam contidos em partículas infectantes denominadas Núcleos de Wells,

que podem ficar suspensas por horas e quando inaladas por indivíduos sadios, inicia-se novo

processo de infecção. A TB pode-se manifestar basicamente em qualquer tipo de tecido,

porém o pulmão é o órgão de predileção para manifestação da doença. Os macrófagos

alveolares caracterizam-se como a primeira linha de defesa do organismo após a infecção,

sendo responsáveis pelo reconhecimento e combate inicial ao M. tb. Células T específicas são

estimuladas no linfonodo periférico de drenagem da lesão inicial e induzidas à contenção

bacteriana em pequenas lesões granulomatosas no pulmão que podem, ou não, levar à

erradicação do M. tb. Na infecção latente, um balanço entre a resposta imune do hospedeiro e

a persistência bacteriana se estabelece e pode ser mantida durante o longo período de

incubação em que o indivíduo infectado não sofre qualquer manifestação clínica da doença.

Segundo estatísticas, cerca de 5 a 10% das pessoas imunocompetentes com infecção latente

sofrem reativação das lesões e desenvolvem a forma ativa da TB (Selwyn et al. 1989). Uma

vez a doença se desenvolvendo, se não for tratada, tem um grande potencial de tornar-se fatal.

A tuberculose pulmonar é a manifestação mais freqüente da doença, contribuindo com

mais de 80% das formas clínicas. Esta localização preferencial tem relevância

epidemiológica, pois o paciente com tuberculose pulmonar é o responsável pela transmissão

do bacilo para pessoas não-contaminadas, permitindo a manutenção do ciclo infeccioso, já

que a doença não tem vetor nem hospedeiro intermediário. Nem todas as pessoas, porém, que

aspiram o bacilo eliminado por portador de tuberculose, desenvolvem a infecção. Nos casos

em que os mecanismos de defesa da árvore respiratória, como a depuração mucociliar, e que a

resposta imune inata seja predominante, há a contenção da infecção na porta de entrada, sem

dano residual para os pulmões nem desenvolvimento da resposta imune adaptativa efetora.

Revisão da Literatura 15

2.3.1 O Esquema de tratamento quimioterápico da tuberculose e outros

aspectos

Após a descoberta em 1944 da primeira droga anti-tuberculose, a estreptomicina,

estudos clínicos revelaram que a resistência a este agente foi prontamente desenvolvida pelo

M. tb. Porém o maior avanço ocorreu no final da década de 60, no século XX, com a

descoberta da rifampicina, que permitiu a redução do tempo de tratamento de 18-24 meses

para 6 meses. O tratamento com combinação de várias drogas anti-TB em longo prazo,

aparentemente, tornou-se a única opção viável para o tratamento das formas ativas de

tuberculose, inclusive das formas resistentes a múltiplas drogas. O tratamento padrão se

baseia em duas etapas:

1) Uma fase inicial intensa desenhada para eliminação de bacilos ativos ou ainda em

baixa atividade metabólica através do uso conjunto de rifampicina (RIF), isoniazida (INH) e

pirazinamida (PZA) por 2 meses.

2) Uma fase de continuação que se estende com o uso de RIF e INH por quatro meses.

A INH e a RIF são as duas drogas anti-TB mais potentes atualmente no mercado,

eliminando mais de 99% dos bacilos num período de dois meses. O principal objetivo do

tratamento não é somente curar o paciente mas também prevenir a sua recidiva, e ainda

prevenir o surgimento de cepas resistentes. No entanto pode haver uma resistência inicial do

M. tb à INH sendo necessária a adição de outras drogas à primeira linha de tratamento anti-

TB. Quando há a resistência a RIF e INH caracteriza-se, neste momento, a tuberculose

resistente a múltiplas drogas (MDR-TB) (Telenti e Iseman 2000). Então, torna-se necessária a

extensão do período de tratamento e a opção pelo uso de uma segunda ou ainda terceira linha

de drogas, mesmo que a toxicidade seja um fator negativo. As drogas utilizadas no tratamento

anti-TB são selecionadas para uma rápida eliminação dos bacilos na cavidade pulmonar,

Revisão da Literatura 16

destruir bacilos metabolicamente menos ativos em lesões fechadas acidificadas ou ainda

anóxicas e bacilos em forma inativa que possam causar futura recidiva (Mitchison 2000).

Revisão da Literatura 17

Tabela 1: Esquemas de tratamento preconizados pelo Ministério da Saúde.

Esquema Indicado: Fase Duração Drogas

2 meses

Rifampicina

Isoniazida

Pirazinamida

Esquema I- 2RHZ/RH

Doentes virgens de tratamento com baciloscopia positiva;

tuberculose miliar; tuberculose extra torácica, exceto os

portadores de formas meningoencefálicas.

4 meses

Rifampicina

Isoniazida

2 meses

Rifampicina

Isoniazida

Pirazinamida

Esquema II- 2RHZ/7RH

Forma meningoencefálica.

7 meses

Rifampicina

Pirazinamida

2 meses

Rifampicina

Isoniazida

Pirazinamida

Estreptomicina

Esquema I reforçado – 2RHZE/4RHE

Recidiva após cura ou retorno após abandono do esquema

4 meses

Rifampicina

Isoniazida

Estreptomicina

3 meses

Estreptomicina

Pirazinamida

Etionamida

Etambutol

Esquema III- 3SEtEZ / 9EtE

Falência do tratamento dos esquemas I e I reforçado.

9 meses

Etambutol

Etionamida

Tabela baseada nos dados do “Guia de Vigilância Epidemiológica da Tuberculose” Publicado no Ministério da

Saúde sobre o Programa Nacional de Controle da Tuberculose 2007.

Revisão da Literatura 18

Segundo a OMS, a cura do paciente com baciloscopia positiva é a melhor medida

preventiva contra a tuberculose. Entretanto, Kritski et al. (2000) chamaram a atenção para um

grupo especial de indivíduos. Segundo os autores os contatos domiciliares representam um

grupo com um elevado risco de infecção e adoecimento por TB. Resultados descritos pelos

autores demonstram que nos contatos intradomiciliares de casos bacilíferos, as taxas de

infecção pelo M. tb, avaliada através do teste tuberculínico, eram cerca de dez vezes

superiores àquelas encontradas na população em geral. Determina-se assim que a avaliação de

contatos de pacientes com TB pulmonar bacilífera por um período mínimo de um ano, com

consultas agendadas para o mais breve possível após o diagnóstico do caso índice deve ser

uma prioridade. O mesmo estudo sugere ainda uma especial observação para os contatos que

apresentam viragem tuberculínica, ou seja, convertores recentes, já que a estes deve ser

oferecida prontamente a quimioprofilaxia preconizada.

Outro aspecto a ser observado é que a infecção pelo HIV é considerada hoje um dos

principais fatores de risco para o desenvolvimento da TB ativa, devido ao comprometimento

da resposta imunológica do paciente (Kerr-Pontes et al. 1997).

Na fase inicial da doença, os

pacientes com HIV que apresentam contagem de células CD4 maior que 200/mm

apresentam

TB com características clínicas semelhantes às dos demais pacientes não infectados pelo HIV.

Já os pacientes em fase avançada da síndrome da imunodeficiência adquirida, que têm

contagem de CD4 menor que 200/mm

, apresentam-se clinicamente de forma diferente, com

teste tuberculínico negativo, exame de escarro também negativo, presença de TB extra-

pulmonar (gânglios, pleura, pericárdio) e nas formas pulmonares ocorre apresentação

radiológica atípica, com presença de infiltrados semelhantes ao visto em outras patologias

pulmonares. Com isso, o diagnóstico torna-se mais difícil, aumentando o risco de transmissão

da TB e conseqüentemente agravando o quadro de morbi-mortalidade a ela associado (Havlir

et al. 1999).

No Brasil, altos índices de associação entre TB e HIV têm sido observados nos

Revisão da Literatura 19

últimos anos em estudos elaborados em diversas regiões, como no Sul (Hijjar 2005) e no

Sudeste (Oliveira et al. 2004) aonde a co-infecção TB/HIV foi observada em 55,1% dos

pacientes que evoluíram para óbito.

Evidências da literatura sugerem que a recidiva de tuberculose, ou seja, a existência de

um segundo episódio de adoecimento em indivíduos previamente tratados corretamente é

maior do que se supunha. Segundo Verver et al. (2005), em uma população da África do Sul

com alta prevalência de casos (313/100.000 habitantes) avaliada num período de cinco anos,

cerca de 14% dos pacientes submetidos ao tratamento completo apresentaram recidiva e 77%

destes pacientes apresentaram reinfecção por uma cepa diferente à apresentada no primeiro

episódio. Estes dados sugerem que indivíduos previamente tratados apresentam alto risco de

re-infecção com desenvolvimento de TB ativa, cerca de quatro vezes superior à da população

geral. Certamente, alguns indivíduos apresentam maior suscetibilidade ao desenvolvimento da

TB, devido provavelmente a fatores genéticos, mas também devem ser observados os

aspectos genéticos da cepa infectante.

2.3.2 Predisposição genética e expressão gênica no hospedeiro humano

Alguns pacientes aparentam uma predisposição genética para a tuberculose. Esta idéia

ganhou espaço na comunidade científica a partir de estudos prévios entre gêmeos

monozigóticos e dizigóticos, demonstrando que há risco ao desenvolvimento da tuberculose

de acordo com o histórico de incidência da infecção na ancestralidade familiar (Comstock

1978). Alguns estudos recentes consideraram a influência genética na suscetibilidade de

diferentes populações à TB, em aspectos envolvidos com a reatividade celular, apresentação

antigênica, fagocitose, cooperação linfócitos T e B ou ainda atividade bactericida com base na

dependência da especificidade do sistema HLA. Os resultados obtidos em populações da

Europa (Dubaniewicz et al. 2007), Coréia (Kim et al. 2005), Índia (Ravikumar et al. 1999)

Revisão da Literatura 20

descrevem aspectos da suscetibilidade ligados à tuberculose, enfatizando a associação com

vários haplótipos do HLA. Dentre eles, o HLA-B51, DQB1∗05 e particularmente o

DRB1∗0803 possuem correlações estatisticamente significativas com resistência a droga,

formação de lesões avançadas e recidiva em populações de pacientes com TB na Coréia (Kim

et al. 2005). Outros estudos de base populacional têm estabelecido correlação entre a

tuberculose e polimorfismos nos genes que codificam para resistência natural associada a

proteínas de macrófagos (NRAMP1), receptor de Vitamina D

, IL-1, IL-10, IFNγ (Awomoyi

et al. 2002; Selvaraj et al. 2000; Selvaraj et al. 2001; Wilkinson et al. 1999; Vidiarani et al.

2006, Amim et al. 2007). A importância funcional da maioria destes polimorfismos ainda não

está completamente descrita; no entanto o polimorfismo para o alelo 2 da extremidade 5’ do

NRAMP1 parece influenciar a suscetibilidade à tuberculose por estar associado ao aumento da

produção de IL-10, de acordo com Awomoyi et al. (2002). Segundo Reuss et al. (2002), cerca

de 50% da produção de IL-10 é determinada geneticamente e os outros 50% são por

determinação de fatores ambientais. Recentemente foi descrito que os genes de citocinas são

regulados via expressão estocástica monoalélica, provavelmente devido ao número de

modificações cumulativas na cromatina e por seleção indireta de células ativadas (Paixão et

al. 2007). Já Calado et al. (2006) particularmente descrevem que o gene de IL-10 apresenta

expressão monoalélica em células T CD4 em modelos murinos. E o início da transcrição

monoalélica depende da força de ligação ao receptor de célula T (TCR) e a subseqüente

capacidade de sobrepor a restrição imposta pela hipoacetilação da cromatina. Outras

associações entre genética e tuberculose implicam ainda a origem étnica. Entretanto, a

extensão que os polimorfismos gênicos contribuem para a extensão da tuberculose

mundialmente ainda são inconclusivas, devido à grande dificuldade de separação das

influências do meio ambiente da predisposição genética ao longo da vida humana.

Revisão da Literatura 21

2.3.3 A Imunopatogenia da tuberculose e a imunidade inata

As pessoas saudáveis se protegem dos microorganismos inaláveis através de barreiras

físicas como pelos nasais, angulação de vias aéreas, secreção traqueobrônquica, depuração

mucociliar; entretanto outros aspectos como a resposta imune inata são essencialmente

importantes na contenção dos processos infecciosos. A fagocitose, por células mononucleares,

é um dos principais componentes formadores da imunidade inata. Contudo, este é um

processo iniciado em ausência da prévia exposição de moléculas antigênica via MHC de

classe II. Outros elementos podem ainda ser citados como a produção de proteína do

macrófago associada a resistência natural (NRAMP), a participação de neutrófilos, células

tipo T CD-1, células T CD8

restritas, células T natural “killer” (células T NK), envolvidas na

produção de IFNγ, que podem ativar os macrófagos para a eliminação de micobactérias

internalizadas. Em paralelo, os macrófagos podem atuar também na fase efetora da resposta

imune específica para contenção dos processos infecciosos. Em conjunto, estes elementos

descritos podem atuar como fatores na primeira linha de defesa que é a resposta imune inata

ao M. tb.

Os receptores tipo Toll (Toll-like receptors, TLRs) estabelecem a ligação da

imunidade inata à imunidade adaptativa. De forma geral, os receptores TLR constituem uma

família de proteínas trans-membrana que reconhecem padrões moleculares de ligantes

microbianos que são capazes de induzir a sinalização de vias inflamatórias e/ou anti-

inflamatórias (Berrington & Hawn et al. 2007). Segundo Raja et al. (2004), na tuberculose as

interações M. tb e TLRs são complexas, pois as moléculas do M. tb podem interagir com

diferentes membros da família dos TLR ao mesmo tempo. Berrington & Hawn et al. (2007),

descrevem ainda que as moléculas do M. tb reconhecíveis por TLR são lipopeptídeos (seja por

TLR2 ou por heteredímero de TLR1 ou TLR6), lipopolissacarídeo (por TLR4), flagelina (por

TLR5) e DNA bacteriano CpG (por TLR9).

Revisão da Literatura 22

Vários aspectos da imunidade inata, no entanto, não podem explicar os diferentes

graus de resistência natural que ocorrem na espécie humana. Entretanto, a maior ou menor

resistência natural parece estar relacionada com o maior ou menor velocidade com que o

hospedeiro infectado é capaz de desenvolver sua resistência adquirida (Kritski et al. 2000). A

exposição de uma molécula “non-self” ao sistema imune humano, via MHC de classe II, é

capaz de deflagrar a expansão clonal de células T antígeno-específico, levando ao início do

processo de formação e desenvolvimento da resposta imune específica. Sendo assim, a

resposta imune pode ser revista como o(s) evento(s) específico(s) de resposta a uma molécula

imunogênica, sendo a imunidade adquirida dividida em fase celular e humoral.

Particularmente na resposta imune a tuberculose os desfechos são: controle da

infecção pelo M. tb através da imunidade inata, latência e TB ativa (Ehrt et al. 1997).

O controle da infecção pelo M. tb no hospedeiro humano pelos mecanismos da

resposta imune inata envolvem elementos já citados como a fagocitose da micobactéria por

células dendríticas e macrófagos alveolares, com subseqüente secreção de IL-12, ou ainda a

produção de NRAMP (Raja et al. 2004). Estes são processos iniciados na ausência de uma

exposição prévia ao agente etiológico, portanto se caracterizam como componentes da

resposta imune inata e que podem determinar as direções que a resposta imune adaptativa,

mediada por células T, seguirão na apresentação de antígenos micobacterianos, expressão de

sinais co-estimulatórios e produção de citocinas (Van Crevel et al. 2002). Outros dados da

literatura indicam que a lisozima, assim como outras enzimas, podem atuar como importante

linha de defesa na imunidade inata associada ao M. tb. (Sevaraj et al. 1997). Recentemente, o

mapeamento de um lócus no cromossomo 1 em cepas de camundongo congênitos

denominado de Super-Suscetibilidade a Tuberculose 1 ou (sst1) descreveu um gene

denominado de Patógeno Intracelular Resistente (Ipr1). Este gene é positivamente regulado

em macrófagos sst1 resistentes após a infecção, porém não é expresso em macrófagos sst1

Revisão da Literatura 23

suscetíveis. Pan et al. (2005) demonstram que a expressão do gene Ipr1 em macrófagos

susceptíveis à infecção por M. tb é capaz de conter não somente a infecção, mas ativar

mecanismos de defesa da imunidade inata nos processos infecciosos. O produto gênico de

Ipr1 aparenta uma função ainda não documentada, gerada pela sinalização intracelular de

cepas virulentas de M. tb e L. monocytogenes no macrófago, que aciona a regulação positiva

dos marcadores de apoptose. O Ipr1 apresenta um homólogo humano com 41% de identidade

que é o SP110b (Block et al. 2000), presente no cromossomo humano 2, podendo ser ativado

via receptores de corticosteróides, ativação de peroxissomos e receptores de vitamina D. A

vitamina D está diretamente relacionada com mecanismos, no macrófago, associados a ciclo

celular, ativação, diferenciação e resposta a patógenos e apoptose.

Caracteristicamente, a rota de entrada do M. tb no organismo é a via respiratória. Ao

conseguir ultrapassar as barreiras naturais, o M. tb alcança os pulmões. Macrófagos alveolares

residentes são os primeiros tipos celulares envolvidos no combate inicial ao patógeno. Após

este primeiro encontro, células dendríticas e macrófagos derivados de monócitos

recentemente recrutados tomam parte neste processo (Henderson et al. 1997; Thurnher et al.

1997). Em seguida a endocitose do M. tb envolve diferentes receptores que podem tanto se

ligar às micobactérias não opsonizadas quanto às opsoninas na superfície parasitária.

Comumente, as micobactérias podem invadir o macrófago, após opsonização com fatores

como o complemento C3, seguida de ligação e internalização através dos receptores do

complemento CR1, CR3 e CR4. A fagocitose não opsonizada pode ocorrer ainda através de

receptores de manose, que reconhecem terminações de resíduos de manose na micobactérias

(Schlesinger et al. 1993; Schlesinger et al. 1996), receptores scavengers (Zimmerli et al.

1996) ou de receptores tipo Fcγ, os quais são menos comumente descritos como vias de

internalização (Armstrong et al. 1975).

Paralelamente à fagocitose, o reconhecimento do M. tb ou de moléculas do

Revisão da Literatura 24

Micobacterium é uma etapa crucial na resposta imune inata do hospedeiro. O reconhecimento

imune da maioria dos componentes micobacterianos de parede celular de origem lipídica,

como lipoarabinomanana (LAM), é aparentemente similar ao reconhecimento de

lipopolissacarídeos (LPS) das bactérias gram-negativas (Zhang et al. 1993). Vários fatores

circulantes e receptores estão envolvidos neste processo. Proteínas séricas ligadas ao LPS,

como a LBP (LPS-binding protein), são capazes de aumentar a resposta de macrófagos a LPS

e LAM via receptor de superfície CD14 (Fenton & Golembock 1998). Em paralelo, as

concentrações de CD14 e proteínas associadas a LPS no soro estão elevadas em pacientes

com tuberculose ativa (

Juffermans et al. 1998).

Por outro lado, temos os receptores Toll-like (TLR), que são filogeneticamente

conservados e participam da imunidade inata e são essenciais para o reconhecimento

microbiano por macrófagos e células dendríticas (Lemaitre et al. 1996; Medzhitov et al. 1997;

Visintin et al. 2001). Até o momento 10 tipos de TLRs foram identificados, dos quais TLR2,

TLR4 e TLR9 parecem ser responsáveis pela resposta celular a peptidoglicanos e

lipopeptídeos bacterianos (Yoshimura et al. 1999), endotoxinas de bactérias gram-negativas

(Schlesinger et al. 1990) e DNA bacteriano respectivamente (Hemmi et al. 2000). Através de

TLRs, lisados de M. tb e ou lipoproteínas solúveis de parede celular micobacteriana induzem

a produção direta de IL-12 (Brightbill et al. 1999). Interessantemente, TLR2 e TLR4 ou ainda

outros TLRs (TLR6 ou TLR1) podem estar envolvidos no reconhecimento de moléculas do

M. tb que traduzem um sinal intracelular por heterodimerização (Bulut et al. 2001; Ozinsky et

al. 2000). TLR9 reconhece dinucleotídeos CG do DNA bacteriano (Hajjar et al. 2001; Hemmi

et al. 2000).

Uma vez o M. tb internalizado no macrófago alveolar, os aspectos de reconhecimento

celular como a interação macrófagos células T e o processamento e apresentação de antígenos

via MHC de classe II, produção de IFNγ, indução da síntese do óxido nítrico 2 (NOS

) e

Revisão da Literatura 25

produção de mediadores como o óxido nítrico e outros radicais intermediários de nitrogênio

(RNIs) são ditos como essenciais na contenção e eliminação do agente patogênico, em

associação com outros aspectos tanto da resposta imune inata como na adaptativa. Um dos

possíveis desfechos deste intrincado mecanismo é a contenção da infecção. No entanto, em

alguns casos mesmo o macrófago alveolar amplamente ativado pode falhar na erradicação de

M. tb residentes. Aparentemente, a micobactéria é capaz de residir no endossoma primário e

subseqüentemente impedir a fusão endossoma-lisossoma devido ao seqüestro de íons de ferro,

que são utilizados amplamente nos mecanismos de defesa da célula hospedeira (Schaible et

al. 1999; Andrews 2000). Como revisto por Salgame (2005), o M. tb persiste no fagossoma

também por interferência no tráfico de membranas e na biogênese do fagolisossoma, exclusão

vacuolar de H

-ATPase (Sturgill-Koszycki et al. 1994; Xu et al. 1994) ou ainda por retenção

de TACO (proteína rica em aspartato de triptofano conhecida como corinina 1) na membrana

do fagossoma de macrófagos J774, que diminuiriam a fusão fagolisossômica e

conseqüentemente eliminação do BCG em ensaios in vitro (Ferrari et al. 1999). Ao que

parece, esta capacidade está correlacionada não somente à presença de lipídeos

micobacterianos mas também à serina/treonina proteína quinase G (Walburguer et al. 2004).

Bhatt & Salgame (2007) estabelecem bem alguns aspectos de ligação entre a imunidade inata

e adaptativa e a sobrevivência do M. tb no macrófago, como os aspectos da biogênese típica

do fagolisossomo que são afetados pelo M. tb. As alterações no tráfico primário do fagossomo

de M. tb são determinantes para a sua sobrevivência como a aquisição de ferro e

glicoesfingolipídeos e o bloqueio de ATPase vacuolar, mas também as hidrolases lisossomais

e fosfatidilinisotol 3 fosfato.

O hospedeiro humano é capaz de conter a replicação micobacteriana principalmente

através da produção de IFNγ, seguida da ativação de macrófagos, produção de moléculas pro-

inflamatórias como IL-8, TNFα e IL-1β. Em contraste as células dendríticas detêm a

Revisão da Literatura 26

capacidade de capturar antígenos da periferia e direcioná-los aos órgãos linfóides secundários.

Contudo, células DC’s precursoras, ao encontrar organismos patogênicos, são capazes de

induzir o aumento e a produção de citocinas e quimiocinas e em contra-partida podem atrair

e/ou ativar outros tipos celulares como eosinófilos, macrófagos e células NK ou ainda conter a

infecção através do desenvolvimento e formação do granuloma no pulmão. Experimentos in

vitro indicam que IFNγ opõe-se à sobrevivência do M. tb e leva à modificação do nicho

fagossômico pela promoção da acidificação do fagossoma e promoção da fusão

fagolisossômica (Schaible et al. 1998; Via et al. 1998). O IFNγ induz autofagia por diferentes

sinais, incluindo a produção de LRG-47, uma GTPase anti-microbiana e que atua

independentemente da expressão de NOS2 (MacMicking et al. 2003). Este aumenta a

aquisição da proteína autofágica beclin-1 pelo fagossomo de M. tb e incapacita o andamento

da biogênese normal do fagossomo, resultando assim na supressão da replicação

micobacteriana (Gutierrez et al. 2004).

Outros aspectos indicam ainda que uma vez detectada uma anomalia na resposta

imune, devido ao aumento da intensidade de resposta do hospedeiro, o M. tb é capaz de

reprogramar os seus genes e entrar numa fase dita de latência para posterior ativação em

ambientes mais favoráveis no organismo humano. Isto foi observado via assinatura de

marcação de mutagênese por transposons: três genes de M. tb foram aparentemente

identificados e demonstram ser essenciais para o crescimento in vivo, especialmente sob a

pressão imune do IFNγ (Hisert et al. 2004). Estes genes reconhecem uma poliquetidina

sintase 6 e uma glicosil transferase putativa. Entretanto como o M. tb regula estes genes para a

adaptação ao ambiente intracelular ainda precisa ser esclarecido.

2.3.4 O Granuloma

A formação do granuloma, principalmente quando acompanhado de necrose caseosa,

Revisão da Literatura 27

caracteriza-se como marca registrada da tuberculose e está diretamente associada à resposta

crônica local e a estimulação antigênica. Esta estrutura pode ainda ser identificada em outras

doenças infecciosas, incluindo a esquistomossomose, hanseníase e malária (Boros 1999;

Palma & Saraiva 1997; Modlin & Rea 1988). A estrutura e composição do granuloma

tuberculoso variam de organismo para organismo e é observada em concomitância com uma

alta atividade celular. O granuloma é composto por diferentes tipos celulares, incluindo

macrófagos, linfócitos CD4 e CD8 e células B (Gonzalez-Juarrero et al. 2001). Em

granulomas humanos, os macrófagos são espacialmente localizados na área central da

estrutura e totalmente rodeados por linfócitos. Alguns dos macrófagos estão infectados e

outros apresentam sinais de ativação. Segundo dados revistos por Raja (2004), o primeiro

passo importante para a formação da estrutura do granuloma é o recrutamento intravascular de

células imunes para a proximidade do foco de infecção e posterior localização nas regiões

infectadas. Células T CD4

são predominantes na camada linfocítica ao redor do granuloma,

assim como foi também detectada a presença de células T CD8

. Granulomas maduros em

humanos geram uma grande proporção de células em processo de apoptose e a proliferação

bacteriana in situ ocorre tanto em linfócitos quanto em macrófagos derivados desta estrutura

biológica (Spector e Lykke 1966), indicando que a persistência e o isolamento das

micobactérias na lesão granulomatosa pode se dar anos após a primo-infecção (Flynn & Chan

2001). Outra característica de composição é o envolvimento do granuloma por tecido

conjuntivo, que no caso da tuberculose humana é promovido pela presença de TGF-β,

induzindo síntese de colágeno pelos fibroblastos (

Marshall et al. 1996). A fibrose é

minimamente expressa nos estágios primários, porém com alta detecção de fibroblastos

ativados em granuloma em estágios mais avançados (Wangoo et al. 2005). Uma das funções

do granuloma é o controle da infecção pela interferência na comunicação entre as células

imunocompetentes. No granuloma em desenvolvimento, há células de adesão homotípicas e

Revisão da Literatura 28

heterotípicas que utilizam moléculas de adesão intracelular tipo I ICAM-1 e que são

efetivamente induzidas por M. tb ou por LAM (Lopez Ramirez 1994). Células epitelióides

diferenciadas produzem proteínas de matriz extracelular (fibronectina e osteopontina), que

promovem o ancoramento celular através de moléculas de integrinas (Nau 1997). Alguns

autores ainda subdividem a organização dos granulomas com base nos tipos e números de

células e a natureza da necrose (Raja 2004). Flynn & Chan (2003) reavaliaram a contribuição

da produção do fator de necrose tumoral-alfa (TNFα) na manutenção da função do granuloma

durante o estado de latência da infecção. Em linhas gerais, o granuloma permite a infecção

persistente do hospedeiro e a estimulação crônica das células forma a base para as lesões

tuberculosas, ao mesmo tempo que o isolamento físico do M. tb. sustenta a contenção da

infecção, em um equilíbrio instável que pode se romper por falha dos mecanismos imunes.

No centro do granuloma, uma alta taxa de fagócitos infiltrados e células do

parênquima do pulmão também morrem, produzindo assim caracteristicamente uma necrose

sólida, chamada cáseo. Caso a infecção não seja controlada, o cáseo poderá se liquefazer e

induzir a uma maior replicação extracelular do M. tb. Os granulomas caseosos podem ou não

progredir para formação de cavitação dentro do pulmão. E em um nível mais elementar, a

tuberculose latente pode ser vista como uma relação harmônica de parasitismo entre o bacilo e

o hospedeiro.

2.3.5 Imunidade adaptativa ou adquirida na tuberculose

É fato que a imunidade inata e adaptativa estão claramente conectadas. Macrófagos e

células dendríticas, são os tipos celulares primários envolvidos na resposta imune inata a

micobactérias e desempenham uma via crucial na iniciação da imunidade adaptativa. A

principio alguns processos contribuem para iniciação da imunidade adaptativa: apresentação

antigênica, co-estimulação, e a produção de citocinas. Em paralelo, ainda podemos citar a

Revisão da Literatura 29

ativação clonal de células T e os mecanismos de resolução da infecção associados à produção

de radicais de nitrogênio e oxigênio. Contudo, pacientes com TB ativa podem sofrer de

anergia ou a não responsividade das células T (Hirsch et al. 1999), o que pode ser causada

pela inibição dinâmica de um dos processos acima citados.

Entretanto, a apresentação de antígenos micobacterianos por macrófagos e células

dendríticas envolvem mecanismos distintos. Primeiro, estes antígenos precisam ser

processados em um compartimento fagolisossomal na célula apresentadora de antígeno

profissional. Segundo, moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de

classe I, expressos em todas as células nucleadas, são capazes de apresentar proteínas

micobacterianas para células T CD8

antígeno específicas. Este mecanismo permite a

apresentação de antígenos citosólicos do M. tb que eventualmente escapem da fagossoma

(Mazzacaro et al. 1996). A importância da apresentação de antígenos via MHC de classe I foi

demonstrada em modelos murinos (Souza et al. 2000) e em células da PBMC de paciente com

tuberculose pulmonar indicando populações distintas de células T CD8

com epítopos

dominantes para os antígenos leucocitários humanos (HLA) HLA-A*0301, A*2402, B*0801

e B*1501 ou ainda co-dominates para antígenos de TB apresentados via HLA-B*0702 ou

ainda com reconhecimento amplo de antígenos apresentados via HLA-A*0201. Em terceiro,

as moléculas do MHC de classe I não polimórficos como as CD1 (-a, -b, e –c) que são

expressas em macrófagos e células dendríticas, são capazes de apresentar lipoproteínas

micobacterianas para células T CD1-restritas. Este mecanismo de apresentação antigênica

permite a ativação de uma grande fração de células T em um ponto primário do processo de

infecção, antes da especificidade antigênica ter se desenvolvido. E uma quarta via pode

envolver moléculas de MHC de classe Ib não polimórficas. Recentemente Rajeswari et al.

(2007), descreveram que certas variantes alélicas do HLA, especificamente a HLA-DR2, foi

associada a baixa produção de perforina por linfócitos T citotóxicos e linfócitos NK em

Revisão da Literatura 30

pacientes com tuberculose pulmonar. Em um outro contexto, Sousa et al. (1997), citam que

polimorfismos no HLA podem explicar a vulnerabilidade de certos grupos populacionais

como de índios Yanomamis da Amazônia que apenas recentemente se expuseram a

tuberculose e apresentaram extrema susceptibilidade ao M. tb e anergia ao teste tuberculínico.

A resposta bem sucedida de células T frente a infecções bacterianas é induzida pela

maturação de moléculas do MHC de classe II antígeno-específicas na superfície de células

apresentadoras de antígenos profissionais. Tanto que a infecção pelo M. tb, moléculas do

MHC de classe II são reguladas positivamente nos macrófagos e particularmente nas células

dendríticas nas primeiras 48 horas (Henderson et al. 1997; Bodnar et al. 2001). Entretanto,

lipoproteínas de M. tb e outros componentes do envelope celular da micobactéria, atuando

como agonista de TLR2, são capazes de inibir a indução de IFNγ via regulação negativa de

MHC de classe II em macrófagos (Kincaid et al. 2007).

Já está bem estabelecido que a apresentação antigênica depende da presença de sinais

co-estimulatórios para ativação de células T. Os sinais co-estimulatórios estão bem descritos

na literatura: B-7.1 (CD80) e B-7.2 (CD86) estão expressos na superfície de macrófagos e

células dendríticas e ligam-se a CD28 e CTLA-4 em células T. Interessantemente, infecções

in vitro de monócitos com o M. tb determinam a diminuição da expressão de B-7.1 (Saha et

al. 1994). Por outro lado, a infecção de células dendríticas com o M. tb induziria a expressão

de B7.1, CD40 e ICAM-1, segundo revisto por van Crevel et al. (2002). E ainda a indução do

aumento de CD86, IL-10 e TGFβ por CFP10 de M. tb (Latchumanan et al. 2005). Contudo, a

expressão de moléculas apresentadoras de antígeno e ativação celular é um processo dinâmico

que também é regulado pela presença de citocinas. Muitas citocinas produzidas por monócitos

e células dendríticas ativadas são essenciais para a estimulação de linfócitos T, tanto que para

o controle da infecção necessitam da resposta imune Th-1. A IL-12 é induzida, seguida da

fagocitose do M. tb por macrófagos e DCs (Flynn 2004), que direcionam o desenvolvimento

Revisão da Literatura 31

da resposta imune Th-1 com a produção de IFNγ para o controle da infecção pelo M. tb. IFN é

uma citocina importante na ativação de macrófagos, produção de iNOS. Ainda neste contexto,

citamos o TNFα como uma molécula com múltiplas funções na resposta imune patológica na

tuberculose (Flynn 2004). TNFα é essencialmente produzida por macrófagos e está envolvida

no controle da infecção, morte bacteriana, produção de moléculas de adesão, quimiocinas e

receptores para quimiocinas, controle e formação do granuloma e migração celular para os

tecidos infectados pelo M. tb.

Em função de prever a super-expressão de citocinas inflamatórias capazes de induzir o

dano tecidual, moléculas do M. tb, como o LAM e o CFP32 (Flynn & Chan 2005; Bonecini-

Almeida et al. 2004), parecem promover também a expressão de citocinas do eixo Th-2 como

TGFβ e IL-10 (Martino et al. 2004). Entretanto, a produção prematura ou a secreção

desproporcional de citocinas anti-inflamatórias podem beneficiar o M. tb. Altos níveis de IL-

10 foram também associados à ineficiência na resolução de processos infecciosos por agentes

patogênicos como o rinovírus humano, Leishmania spp. e Mycobacterium leprae ou

progressão da doença pelo HIV (Kane & Mosser 2001; Sieling et al. 1993; Stockl et al. 1999;

Stylianou et al. 1999). Estudos recentes têm sugerido que este deve ser o caso na infecção

pelo M. tb (Huard et al. 2003a; Bonecini-Almeida et al. 2004 e Mason et al. 2007).

Células dendríticas e macrófagos alveolares iniciam eficientemente a resposta de

células T in vitro frente a antígenos do M. tb (Serbina et al. 2001). Evidência da migração de

uma resposta imune robusta do pulmão para os linfonodos pela ação de células dendríticas foi

detectada, levando ao estabelecimento de uma resposta imune Th-1 efetiva. Esta migração é

proporcionada principalmente por moléculas tipo CCR7 (Bhatt et al. 2004) e CCR5 (Algood

et al. 2004). A eficiência de ativação imune depende de moléculas co-estimulatórias (Soler et

al. 1999) e o reconhecimento celular é principalmente direcionado pela família dos receptores

TLR, que proporcionam uma das principais ligações entre aspectos da imunidade inata e

Revisão da Literatura 32

adaptativa (Fremond et al. 2004).

M. tb reside primariamente nos vacúolos alveolares e a apresentação de antígenos

micobacterianos via MHC de classe II a células T CD4

gera um dos principais desfechos da

infecção. Estas células são umas das mais importantes na resposta imune protetora frente ao

M. tb. Estudos em modelos murinos utilizando anticorpos para depleção de células T

CD4

(Muller et al. 1987), transferência adotiva (Orme et al. 1984) ou camundongos

“knockout” (Caruso et al. 1999) demonstram que as células T CD4

são necessárias para o

reconhecimento e controle da infecção pelo M. tb. Acosta-Rodriguez et al. (2007) descrevem

um perfil populacional de linfócitos T produtores de IL-17 (Th-17 T cells) que caracterizam

células efetoras e também de memória na resposta imune ao M. tb. Em humanos, a patogênese

da infecção pelo HIV demonstra que a perda de células T CD4

aumenta drasticamente a

suscetibilidade tanto aguda quanto de reativação da TB (Selwyn et al. 1989). Camundongos

“knockout” para MHC classe II ou CD4

apresentam níveis mais baixos de IFNγ durante a

infecção experimental por micobactérias (Caruso et al. 1999). A expressão de NOS2 em

macrófagos é essencialmente retardada em camundongos que apresentam deficiência em

células T CD4

, contudo retornam a níveis comparáveis aos camundongos selvagens com a

expressão de IFNγ (Caruso et al. 1999). Células do lavado broncoalveolar de pacientes com

tuberculose não cavitária exibem um significativo aumento de células T CD4

e uma paralela

redução da população de células T CD8

se comparadas a indivíduos sadios (Mazzarella et al.

2003). A sinergia entre as populações de células T CD4+ e CD8+ T é importante. Estudos

avaliando moléculas do M. tb que deflagrem a ativação da resposta imune de ambos os tipos

celulares apresentam melhores chances de combater a tuberculose (Behar et al. 2007).

Células CD8

são também capazes de secretar citocinas como IFNγ e IL-4 e podem ter

importância na regulação celular de perfis Th-1 e Th-2 em pacientes com tuberculose

pulmonar. Mazzarella et al. (2003) descreveram um aumento da população de células CD8

Revisão da Literatura 33

em lavado broncoalveolar de pacientes com TB cavitária, se comparado a outros pacientes

com tuberculose não cavitária ou ainda indivíduos sadios. Similarmente, células T CD8

assim como as células T CD4

, podem produzir IFNγ, porém sua principal função associada à

TB é a morte de células alvo (Mazzarella et al. 2003). Através deste processo de lise das

células infectadas do hospedeiro por células T CD8

, pode-se facilitar a translocação do M. tb

de células já incapacitadas para células efetoras mais eficientes. A produção de granulisina e

perforina, por células T CD8

, seria responsável diretamente pela morte do M. tb (Kaufmann

et al. 1999; Stenger et al. 1997). Granulisina é responsável pela morte bacteriana

presumivelmente através do acesso ao M. tb residente no interior do macrófago, através da

formação de poros pela perforina. Maglione et al. (2007) descrevem que camundongos

“knockout” para células B (-/-) infectados via aerosol com 100 CFU de M. tb cepa Erdman

apresentam uma imunopatologia exacerbada, com recrutamento de neutrófilos para o sítio

pulmonar, paralelo ao aumento dos níveis de IL-10, indicando desta forma que as células B

representam uma via significativa na resposta imune pulmonar frente à tuberculose.

2.3.6 Células T regulatórias CD4+CD25+ na resposta imune adaptativa

Células ditas não convencionais, as células regulatórias T (T

reg

CD4

CD25

) atuam

no sistema imune na prevenção ou minimização da reatividade, contenção da super-expressão

da resposta imune a um determinado patógeno e apresentam duas populações majoritárias,

designadas de Natural T

reg

e T

reg

IL-10 secretora. Estas são células responsáveis tanto pela

imunidade inata quanto adaptativa (Sakaguchi et al. 2001; Shevach et al. 2002). Dados

recentes descrevem que as T

reg

são produtoras de IL-10 e secretoras de TGF-β e apresentam

expressão do fator de transcrição Foxp3 (Oida et al. 2003), o qual é especificamente expresso

em células T CD25

e são responsáveis pelo aumento da produção de IL-10 (Fontenot et al.

2003). Células T

reg

produtoras de IL-10 e TGF-β têm demonstrado serem importantes

Revisão da Literatura 34

mediadoras na supressão de doenças auto-imunes e patologias alérgicas (Barrat et al. 2002;

Green et al. 2003; Zhang et al. 2004). Estudos recentes em pacientes indicam que há um

aumento de número de células T

reg

CD4

FoxP3

tanto no sangue quanto no sítio de

infecção nos pacientes com TB ativa. A freqüência destas células é inversamente proporcional

à imunidade local contra a micobactéria e os linfócitos T

reg

CD4

FoxP3

são capazes de

suprimir a indução de IFNγ em pacientes com TB ativa (Chen et al. 2007). Entretanto,

Barcelos et al. (2006) descrevem que são baixos os níveis de células CD4

CD25

high

pacientes com TB ativa. Modelos animais indicam que na tuberculose pulmonar não há

alteração da expressão de IFNγ e IL-2 em células T CD4

mesmo que se iniba a expressão de

células T

reg

(CD4

FoxP3

) por anticorpo monoclonal anti CD25 (PC61), após infecção

local no pulmão de camundongos infectados com M. bovis BCG (Quinn et al. 2006). Porém

um dos elementos que efetivamente podem alterar a expressão de IFNγ, segundo o autor, é o

bloqueio do receptor II de TGFβ (TGFβ-RII) por anticorpo anti-TGFβ-RII nas culturas de

células T CD4

, levando a um significativo aumento da expressão de IFNγ nos linfócitos in

vitro (Mason et al. 2007).

2.3.7 Células T

γδ

Todos os vertebrados contêm uma segunda linha de células T TCR positivas dotadas

de cadeias γδ. É um tipo celular distinto primeiramente pela ontogenia. Elas deixam o timo

ainda na fase embrionária ou após o nascimento periodicamente e em ondas de expansão

clonal, que persistem até a fase adulta, como uma população periférica autoreplicante.

Ocupam diferentes nichos teciduais diferentes das células T αβ. E são células raras no sistema

sangüíneo mas ocupam o intestino, as mucosas, inclusive as vias aéreas (Curtis 2005). E

também aparentam importante função na resposta imune contra a tuberculose (Kaufmann

Revisão da Literatura 35

2001), tanto em humanos quanto em modelos animais (Chen 2005), e ainda encontram-se

envolvidas na regulação e formação dos granulomas. A presença destas células no interior do

granuloma está intimamente relacionada a estágios avançados de necrose e mineralização

durante o desenvolvimento do granuloma de M. bovis (Wangoo et al. 2005). Muito se deve ao

fato de que as células T γδ serem uma das principais fontes de produção de IL-17, e estarem

possivelmente relacionadas à resposta inflamatória e influxo de neutrófilos para sítios de

infecção (Shibata et al. 2007). É considerada uma célula essencialmente envolvida na resposta

imune primária, tornando-se uma ponte entre a imunidade inata e adaptativa e na regulação de

neutrófilos (Shibata et al. 2007).

As células T γδ (Vγ2Vδ2) são direcionadas para a expansão clonal e adaptativa

durante infecção micobacteriana de forma ainda não claramente descrita. Primariamente, em

infecções com M. bovis BCG as células T γδ (Vγ2Vδ2) reconhecem fosfoantígenos

micobacterianos específicos. Surpreendentemente, existem células T γδ antígeno-específicas

de memória capazes de montar uma resposta rápida, robusta e prolongada após a re-infecção

por BCG ou infecção por M. tb em macacos previamente expostos e vacinados com BCG (Lai

et al. 2003). O mesmo perfil também é descrito em humanos, principalmente quando

estimulados por via aérea, quando se detecta ampla expansão de células T CD4

, CD8

e γδ

(Chen et al. 2005). E ao que parece estas células atuam na via imuno-regulatória mediada por

citólise (Curtis 2005), tanto que camundongos desprovidos de células T γδ apresentam

sensibilidade exagerada a múltiplos patógenos, incluindo M. tuberculosis (D’Sousa et al.

1997). Durante a tuberculose crônica aparentemente há uma regulação negativa da resposta

nas células γδ, tanto no sangue quanto no fluido broncoalveolar, quando comparados a

indivíduos normais (Li et al. 1996; Carvalho et al. 2002). Foi também demonstrado que

durante a TB ativa induz-se em células γδ uma baixa na produção de citocinas e na resposta

proliferativa in vitro, quando estimulados com fosfoantígenos (Li et al. 1996; Gioia et al.

Revisão da Literatura 36

2002). A regulação negativa das células T γδ parece ser relacionada ao estado de anergia ou

ausência de resposta das células T CD4 no teste de reatividade ao PPD identificado em

pacientes com tuberculose ativa (Toosi et al. 2002; Delgado et al. 2002).

2.3.8 As células CD1+

Outro tipo celular não convencional são as células T expressando moléculas CD1, que

caracteristicamente apresentam especificidade para glicolipídeos bacterianos e apresentam

importante papel na geração ou manutenção da resposta imune à tuberculose (Schaible &

Kaufmann 2000).

Estudos em células humanas T CD1+ identificaram esta família de moléculas

apresentadoras de antígeno relacionadas do ponto de vista estrutural e evolutivo às moléculas

do MHC de classe I e II, sendo considerado um terceiro sistema de apresentação antigênica

(Porcelli et al. 1999). Em humanos, a família das moléculas CD1 consiste de cinco isoformas

(CD1a, -b, -c, -d, e -e), que são codificadas em um cluster gênico minimamente polimórfico e

mapeado fora do MHC. Segundo Ulrichs et al. (2003), foram detectadas células T CD1-

restritas em indivíduos imunes ao M. tb que secretavam altos níveis de IFNγ, mediante

estimulação por antígeno lipídico purificado. Elas estavam presentes na fração de células T

CD4

. Roura-mir et al. (2005), utilizando o isolamento de lipídeos de M. tb CD1 específicos

por cromatografia de fase, demonstrou que este tipo de lipídeos polares da parede celular

sinaliza via TLR2 no macrófago. Já Fischer et al. (2004), analisando determinantes estruturais

de M. tb com ligação via CD1d e reconhecidos por células T, identificaram o fosfatidilinositol

manosídeo (PIM) de parede bacteriana, capaz de induzir a produção de IFNγ em células T NK

murina e humana na regulação imune antimicobacteriana, resultando em aumento de

citotoxicidade.

Revisão da Literatura 37

2.3.9 Imunidade adquirida humoral e proteínas do M. tb

A imunidade adquirida humoral é mediada por moléculas capazes de efetuar o

reconhecimento específico e a eliminação de antígenos, podendo ser transferida a indivíduos

não imunizados por frações do sangue que não contenham células, como, por exemplo o

plasma e o soro. Anticorpos IgG específicos, via expressão de receptor CD16 (FcγRIIIb), na

superfície de células polimorfonucleares (PMN) podem desempenhar um importante papel na

indução de apoptose nestas células frente a infecção pelo M. tb (Alemán et al. 2007). Estudos

in vitro demonstram que os PMN têm importância na infecção pelo M. tb., principalmente

quando em presença de baixa produção de IFNγ (Feng et al. 2006). Entretanto, Pierrot et al.

(2007), descreveram em modelos de malária, por análise de transcriptoma de transferência

adotiva imune de células do baço em ratos infectados, que os neutrófilos apresentam efeito

protetor contra a infecção parasitária através do uso, ao menos parcial, da proteína 1 defensina

de neutrófilos. Já Appelberg et al. (2002) indicam que a infecção intra-peritoneal de M. bovis

BCG (Cepa Pasteur) em camundongos C57BL/6 é capaz de recrutar significativamente

neutrófilos via células CD4

e CD8

. Por outro lado as células B estão presentes em grande

número tanto no granuloma tuberculoso de humanos quanto de camundongos (Randhawa et

al. 1990; Bosio et al. 2000) e são essenciais na formação do granuloma e controle da infecção

micobacteriana através da produção de citocinas e quimiocinas (Bosio et al. 2000).

A presença da imunidade humoral na infecção por micobactérias pode ter importância

no estabelecimento de métodos diagnósticos rápidos e na identificação de antígenos de

micobactérias que podem ter importância no desenvolvimento de novas vacinas. Em pacientes

com TB latente, cerca de 90% das amostras de soro de pacientes TB/HIV positivos

apresentaram anticorpos específicos anti-MPT-51 e anti-GlcB de M. tb, não estando presente

entre os controles do estudo (Singh et al. 2005). Antígeno MPT-51 de M. tb é capaz de ativar

a expansão clonal de linfócitos T citotóxicos produtores de IFNγ (Miki et al. 2004). Os

Revisão da Literatura 38

autores de Melo Cardoso Almeida, et al.(2008) descrevem que IgM contra MPT51 e IgG

contra GlcB estão aumentadas entre pacientes com TB ativa se comparadas com controles

individuais. E combinando a sensibilidade de detecção para MPT51 e GlcB estes representam

90.8% de especificidade e 75.5% de sensibilidade de detecção entre os pacientes com TB

ativa na população brasileira. Uma tendência recente é o direcionamento de estudos na

imunidade humoral e a infecção recente pelo M. tb via dosagem do soro ou no escarro de

pacientes com TB ativa e subclínica. Kaisermann et al. (2005) descrevem que a análise do

fluído pleural de pacientes com pleurisia tuberculínica foi capaz de detectar IgA específica

contra MPT64 e MT-10.3, sugerindo que estes testes sejam usados no diagnóstico de TB

pleural no Brasil. Rabahi et al. (2007) indicaram um aumento dos níveis de IgM contra as

HsPX em funcionários de laboratório com infecção latente para TB. Demkow et al. (2005),

demonstraram variações significativas da IgG e IgA, para 38kDA+ LAM, no BAL de

pacientes com TB ativa se comparados a grupos de indivíduos ausentes de TB.

Muito destes fatores de virulência putativos do M. tb que estão implicados no “stress”

oxidativo e na imunidade ativa foram identificados por serem encontrados no filtrado de

cultura (CF) e posicionados estrategicamente como moléculas efetoras para detrimento do

hospedeiro e/ou benefício do patógeno (Harth et al. 1999; Sonnenberg & Belisle 1997). Os

mecanismos pelos quais as CFPs são secretadas ainda são desconhecidos, mas cerca de

aproximadamente 200 já foram descritas (Sonnenberg & Belisle 1997). As CFPs são

ativamente estudadas por vários pesquisadores na área de tuberculose, pois muitas são

reconhecidas no soro dos pacientes com TB. Foi também postulado que as vacinas do M. tb

vivo e atenuado são mais eficazes comparadas as das micobactérias mortas por aquecimento,

devido ao fato de que durante o crescimento no hospedeiro, o M. tuberculosis libera as CFPs

que estimulam os mecanismos imunes do hospedeiro (Andersen 1994). Interessantemente,

KatG (catalase peroxidase) e SodA (superóxido dismutase), enzimas que degradam radicais

Revisão da Literatura 39

intermediários de oxigênio (ROI) e são importantes na sobrevivência do M. tb durante a

infecção são achados no filtrado de cultura. A significância desta localização não é bem

conhecida, mas especula-se que permitam uma maior detoxificação de moléculas prejudiciais

produzidas pelo hospedeiro no fagossomo (Braunstien & Belisle et al. 2000). Outros

antígenos micobacterianos, como antígeno 85b, ESAT-6, proteínas antigênicas do filtrado de

cultura 10 (CFP-10) (Ravn et al. (2005); Chee et al. 2007) e ainda os antígenos lipídicos, que

representam cerca de 40% do peso seco do organismo, são responsáveis pela ativação da

resposta imunológica não somente via linfócito T (Mendelson et al. 2005).

As proteínas do CF apresentam uma alta capacidade imunoestimulatória e podem

contribuir para o controle imune da infecção, em vários aspectos (Smith 2003). Recentemente,

Huard et al. (2003a) descreveram um produto denominado de CFP32 (originalmente descrito

como Rv0577) como um biofator exclusivamente relacionado ao complexo micobacteriano

(MTC) e ausente em MOTT. O autor aborda a hipótese de que o biofator CFP32 atuaria de

forma precoce durante o estabelecimento da infecção, levando à secreção desproporcional de

citocinas imunosupressoras e favorecendo o patógeno no processo de infecção. Os resultados

demonstraram funções relacionadas à estrutura da proteína, como hidrolases e a conservação

de alguns aminoácidos de tirosina e ácido aspártico do CFP32, que podem ser importantes nos

mecanismos catalíticos nas células infectadas. Anticorpos contra CFP32 foram detectados em

56% dos pacientes com TB mas não nos controles saudáveis e 59% dos pacientes com

tuberculose cavitária foram positivos para detecção do CFP32 no escarro. Outra correlação

significativa foi detectada entre o CFP32 e a presença de IL-10 no escarro de pacientes com

TB, mas não de IFNγ nas mesmas amostras (Huard et al. 2003a). Segundo Benabdesselem et

al. (2006) o uso potencial do CFP32 recombinante (rCFP32), sintetizado de diversos

hospedeiros heterólogos, abre novas possibilidades para o sorodiagnóstico em TB. Estudos

preliminares daquele grupo apresentaram uma sensibilidade de 85% e especificidade de 98%

Revisão da Literatura 40

nos testes para o rCFP32 em levedura em portadores de TB ativa.

2.4 A participação das citocinas e outros fatores moleculares na resposta

imune à tuberculose.

A resposta imune protetora desencadeada pelo hospedeiro contra o M. tb regula

eventos complexos e multifacetados. Devido a esta complexidade, descreveremos aqui alguns

componentes desta vasta rede de fatores moleculares que atuam em conjunto no desfecho das

infecções pelo M. tb.

2.4.1 IFN

Está amplamente estabelecido que o interferon gama (IFNγ) regula vias

essencialmente importantes na imunidade inata e adquirida protetora contra vários agentes

patogênicos intracelulares.

IFNγ humano situa-se no braço longo do cromossomo 12, na região q14 (Human

GeneID 3458 - Pubmed). O gene humano compõe-se de quatro exons e três introns, com um

tamanho de 4.9 Kb. Esta seqüência genômica origina um transcrito primário de 1.2 Kb,

incluindo regiões 3´ e 5´ não traduzidas (UTR), que determinam uma proteína de 166

aminoácidos (aa).

É uma citocina chave no controle da infecção pelo M. tb e é produzida principalmente

por células CD4

e CD8

e células NK. Células T γδ e T CD1 restritas também podem

produzir IFNγ durante a fase primaria de infecção por M. tb (van Crevel et al. 2002). As

moléculas de IFNγ se ligam aos receptores IFNγR1/R2 nos fagócitos mononucleares. A

sinalização pelo receptor é transmitida pelas vias JANUS e STAT quinases, particularmente

via Jak1, Jak2, e Stat1. IFNγ e TNFα são capazes de ativar radicais intermediários de

Revisão da Literatura 41

nitrogênio (RNI) nos fagócitos mononucleares em combinação com outros fatores como a

Vitamina D e a presença de linfócitos (Flynn et al. 1993). Este é um dos principais

mecanismos pelo qual o macrófago pode eliminar intracelularmente o M. tb. Entretanto, o

IFNγ pode também induzir LRG-47, que é uma GTPase que trabalha independente de NOS2.

E pode induzir autofagia como uma outra atividade anti-bactericida induzida pelo IFNγ em

fagossomas infectados pelo M. tb (MacMicking et al. 2003; Gutierrez et al. 2004).

Recentemente, Grassi et al. (2006) detectaram a regulação positiva de citocinas, incluindo

IFNγ, e genes envolvidos na ativação de IFNγ no lavado broncoalveolar de pacientes com TB

ativa, se comparados aos controles. Já Ribeiro-Rodrigues et al. (2002) demonstraram que o

IFNγ detectado no escarro induzido (EI) de pacientes com TB ativa sugere que esta molécula

é um potencial marcador da resposta imunológica efetiva durante o período de tratamento da

tuberculose.

Em macrófagos infectados com patógenos intracelulares, a ativação por IFNγ em

combinação com o TNFα resulta em um mecanismo imunitário de grande impacto biológico.

Indivíduos com deficiência completa no receptor do gene para IFNγ apresentam uma

suscetibilidade aumentada à infecção micobacteriana (M. bovis BCG ou micobactérias

atípicas) ou ao desenvolvimento de TB ativa, ainda que mais raramente. Em paralelo, estes

indivíduos estão associados a tipo grave, até mesmo fatal, de infecção por agente viral,

podendo resultar numa infecção generalizada (Ottenhoff et al. 2005; Mansouri et al. 2005).

Em contrapartida, pacientes com defeito no receptor de IL-12 continuam a produzir baixos

níveis de IFNγ e sobrevivem (Altare e et al. 1998). A inibição das vias de sinalização para

transcrição de genes de citocinas seria um mecanismo de escape do M. tb no processo da

infecção por M. tb (Ting e et al. 1999; Kincaid et al. 2003). Sendo o M. tb. um parasito

intracelular, que se replica nos macrófagos a despeito da existência de uma resposta imune

mediada por célula, sobreviveria à fagocitose dos macrófagos através da inibição da produção

Revisão da Literatura 42

de IFNγ, exercida ao nível da transcrição gênica. Alguns indícios já apontam a influência da

regulação do IFNγ em outras doenças, como leishmaniose por Leishmania donovani, onde o

agente etiológico inibe a produção de IFNγ em resposta a inibição de fosforilação de tirosina

de STAT1 por JAK1 e JAK2 (Nandan et al. 1995), ou ainda a infecção pelo citomegalovírus

(CMV), que inibe a expressão de IFNγ em fibroblastos e células endoteliais infectadas, por

depleção das JAK quinases através da degradação por proteossomas (Miller e et al. 1998).

2.4.2 TNF

O Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFα) ou caquetina é um gene que codifica uma

citocina pró-inflamatória multifuncional que pertence à superfamília do Fator de Necrose

Tumoral. É uma citocina principalmente secretada por macrófagos, que pode se ligar ou

ainda ativar suas funções via receptores TNFRSF1A/TNFR1 e TNFRSF1B/TNFBR. Esta

citocina está envolvida na regulação de um amplo espectro de processos biológicos,

incluindo proliferação celular, diferenciação, apoptose, metabolismo de lipídeos e

coagulação (Chouaib et al. 1992) e possui uma atividade imunoestimulatória. O TNFα é

também um importante mediador contra infecções de diferentes etiologias, podendo

exercer efeitos benéficos ou deletérios ao organismo dependendo da quantidade de

proteína que é secretada in vivo.

A molécula de TNFα pode existir sob duas formas: uma forma membranar de 26 kDa,

e uma forma secretada de 17 kDa. A forma secretada nada mais é do que a forma membranar

com o domínio hidrofóbico transmembranar clivado, que foi inicialmente identificada na

urina de pacientes febris, no soro e na urina de pacientes com insuficiência renal e de

pacientes com câncer em estágios avançados (Fiers 1995).

O gene humano que codifica para TNFα localiza-se no braço curto do cromossomo 6

Revisão da Literatura 43

na região p21.3, consiste de quatro exons e três introns e abrange 2.7 Kb. (Gene ID: 7124 -

Pubmed) Esta seqüência genômica dá origem a um RNA mensageiro (RNAm) de 1.6 Kb,

incluindo regiões 5’ e 3’ UTR (180 e 793 bp, respectivamente). TNFα é produzido como um

pró-hormônio de 233 aa que é processado em uma proteína madura (não glicosilada), com

157 aa, por clivagem de um peptídeo de 76 aa. A seqüência N-terminal contém domínios

hidrofílicos e hidrofóbicos, o que resulta na presença de TNFα na sua forma de membrana, da

qual a proteína madura é liberada por clivagem proteolítica.

Como amplamente revisto por Flynn (2004) e Flynn & Chan (2001; 2005), o maior

mecanismo efetor responsável pela atividade anti-bactericida de IFNγ e TNFα é a indução da

produção de óxido nítrico e de produção de radicais intermediários de nitrogênio (RNI) por

macrófagos via a ativação da forma induzida de sintase do óxido nítrico (NOS2). De fato,

ambas as citocinas, atuando sinergisticamente, são necessárias para a indução da expressão de

vias geradoras de RNI.

Em paralelo, os mecanismos regulatórios de formação do granuloma na tuberculose

ainda são indefinidos, entretanto o TNFα é uma molécula essencial na formação e

manutenção desta estrutura tanto no camundongo quanto no humano. E de forma ainda

paradoxal, o TNFα também contribui para a imunopatologia da TB (Flynn & Chan 2005).

Claramente o TNFα afeta a migração celular e a co-localização dentro de tecidos infectados

pelo M. tb e capaz de influenciar a expressão de moléculas de adesão bem como de

quimiocinas, e seus receptores para quimiocinas (Flynn 2004). Já a ausência completa de

TNFα ou do receptor para TNFα (TNFR), em camundongos, gera infecção crônica,

desorganização do granuloma, patologia aberrante e morte subseqüente (Mohan et al. 2001).

Foi ainda demonstrado que o bloqueio do TNF utilizando anticorpo anti-TNFα em paciente

com desordens inflamatórias, como artrite reumatóide e doenças de Crohn, resultam no

aumento da suscetibilidade à tuberculose (Keane et al. 2001). Amostras histológicas

Revisão da Literatura 44

pulmonares de pacientes demonstram que o bloqueio de TNFα induz aumento do infiltrado

linfocítico e ampla desorganização do granuloma de pacientes tuberculosos (Flynn & Chan

2005). Em um estudo in vitro realizado por Rhoades et al. (2005) foi demonstrado que vários

lipídeos micobacterianos conjugados com esferas induzem a migração celular e formação de

um granuloma rudimentar, sem a necessidade de presença de qualquer micobactéria viva. Em

paralelo foi observada a presença significativa de citocinas inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNFα)

no sobrenadante de cultura destes pacientes. Estas observações suportam a teoria que o TNFα

é essencial nas vias de contenção da tuberculose latente e a manutenção da estrutura do

granuloma de pacientes com TB (Flynn 2004; Flynn & Chan 2005).

2.4.3 IL-12p35 e IL-12p40

A IL-12 é uma citocina que atua principalmente nas células T e nas células NK e

possui também um amplo espectro de atividades biológicas. Segundo Seder et al. (1993) “a

interleucina 12 (IL-12) é um fator determinístico na regulação dos padrões Th-1 e Th-2 em

modelos de infecção". É primariamente produzida por monócitos ativados, sua unidade

biologicamente ativa, IL-12p70 é um heterodímero dissulfídico composto de duas sub-

unidades covalentemente associadas, p35 e p40, sendo altamente expressa (cerca de dez

vezes) na resolução das infecções intracelulares (Sieling e et al. 1994).

Os genes que codificam para cada sub-unidade da IL-12 localizam-se em

cromossomos distintos em humanos. O gene da subunidade p40 (IL-12B) está localizado no

braço longo do cromossomo 5 entre a região q31.1 - 33.1 (GeneID: 3593 - Pubmed) e

apresenta seis exons e cinco introns, incluindo regiões 5’ e 3’ UTR. O gene apresenta 15 Kb,

transcreve um RNAm linear de 2.3 Kb e traduz uma proteína de 328 aa. Já o gene que

codifica para a subunidade p35 (IL-12A) está localizado no braço longo do cromossomo 3

entre a região q25.33 – q26 (GeneID 3592 - Pubmed) apresenta sete exons e seis introns,

Revisão da Literatura 45

incluindo regiões 5’ e 3’ UTR. O gene apresenta 7.2 Kb e transcreve um RNAm linear de 1.4

Kb e traduz uma proteína madura de 253 aa. A subunidade maior é uma proteína de 40 kDa

(p40) que está associada a uma família de receptores de citocinas, e a subunidade menor é

composta por uma proteína de 35 kDa (p35) (Sieburth et al. 1992). A junção das subunidades

determina uma proteína ativa de 70 kDa e uma das vias fundamentais da IL-12 provém da sua

participação na imunidade inata, que é exemplificada em alguns estudos experimentais em

camundongos infectados com M. tb (Cooper et al. 1997). Alguns indícios sugerem claramente

a importância da regulação de citocinas e a participação de IL-12 no desenvolvimento de

formas graves da TB.

O eixo de ativação da IL-12 parece desempenhar um papel crucial no desenvolvimento

e manutenção da resposta imune frente ao M. tb (Flynn et al. 1993). IL-12 é produzida

principalmente por células fagocíticas e a fagocitose do M. tb aparentemente parece

necessária para sua produção (Flynn et al. 2004). IL-12 tem uma participação especial na

produção de IFNγ e ativação de células T CD4+ primárias, (CD4+CD45RA+ ou naive T

cells), e células de memória (CD4+CD45RA+ Memory T cells) na resposta imune juntamente

com o outro membro da família da IL-12, a IL-27 (Beadling & Slifka 2006). Em pacientes

com tuberculose, IL-12 foi detectada em infiltrados pulmonares, granuloma (Fenhalls et al.

2002), pleurisia (Okamoto et al. 2005) e na linfodenite (Serour et al. 2006).

Taha et al. (1997) descreveram um significativo aumento da expressão do RNAm de

IL-12 em células do BAL de pacientes com tuberculose pulmonar, como também um aumento

da expressão do RNAm do receptor (β1 e β2) em pacientes com TB pulmonar ativa (Taha et

al. 1999). Já em modelos de estudo de Paracoccidioides brasiliensis observa-se que a

deficiência da subunidade β1 do receptor de IL-12 representa uma alteração drástica no eixo

de expressão para IL-12, IL-23 e IFNγ, com presença da forma disseminada da doença e

aumento da produção de IL-4, IL-5 e IL-10 (Moraes-Vasconcelos et al. 2005). Estudos em

Revisão da Literatura 46

camundongos “knockout” para IL-12, com ausência da sub-unidade p40, verificaram maior

suscetibilidade à infecções pelo M. tb (Cooper et al. 2002). Há também aumento do

crescimento micobacteriano e produção reduzida de IFNγ. Aparentemente, segundo Verreck

et al.(2004), estudos in vitro e a polarização de populações de macrófagos do tipo 1 (Th-1

indutoras) na resposta imune e demonstram a produção tardia de IL-12 se comparado a IL-23

(dependente de IFNγ) após a estimulação com M. tb H37Rv. Entretanto há indícios de que a

molécula de TNFα poderia afetar os níveis de RNAm de IL-12p40 (Ma et al. 2000). Outros

estudos in vitro em células dendríticas transfectadas com plasmídios geneticamente

modificados expressando citocinas heterodiméricas da família da IL-12 e submetidos a

infecção com antígeno 85 de M. bovis BCG correlacionam a expressão principalmente de IL-

12 e IL-23 no envolvimento como coadjuvantes no aumento na resposta imune protetora anti-

TB (Wozniak et al. 2006). Em linhas gerais, evidências colocam a IL-12 como essencial à

ativação e diferenciação de células T CD4+ produtoras de IFNγ (Beadling & Slifika 2006).

Outros estudos ainda confirmam a importância da sub-unidade p40 como essencial na

resposta imune, assim como marcador de suscetibilidade à infecções pelo M. tb,

principalmente na expansão de células T antígeno-específicas secretoras de IFNγ em modelos

de vacinas de DNA.

2.4.4 IL-23p19

A IL-23 é um citocina que recentemente foi identificada como um membro da família

da IL-12 e também está envolvida nos mecanismos de defesa contra o M. tb. A IL-23 é uma

molécula do grupo das citocinas heterodiméricas dissulfídicas, que compartilha a sub-unidade

p40 com a IL-12, mas que apresenta uma única cadeia p19, que se assemelha a p35

(Oppmann et al. 2000). É produzida principalmente por células dendríticas, monócitos e

Revisão da Literatura 47

macrófagos, estimulando a produção de IFNγ e proliferação por células T (CD4+ e CD8+)

ativas/memória, CD4

CD45RO

, mas não as células primárias, “naive”, CD4

CD45RA

Tanto a IL-12 quanto a IL-23 dividem a mesma ligação de afinidade para sub-unidade do

receptor IL-12Rβ1; no entanto, IL-23 liga-se a um receptor distinto IL-23 específico (IL-

23R), enquanto IL-12 utiliza IL-12Rβ2 como seu co-receptor (Parham et al. 2002).

O gene que codifica para a cadeia p19 específica da IL-23 localiza-se no braço longo

do cromossomo 12 região q13.2 (GeneID: 51561 - Pubmed) e apresenta quatro exons e três

introns incluindo regiões 5’ e 3’ UTR. O gene apresenta 1,5 Kb, transcreve um RNAm linear

de 1,0 Kb e traduz uma proteína de 189 aa. Já o gene que codifica para a subunidade p40

apresenta-se como anteriormente descrito para IL-12.

Estudos prévios indicaram maior importância da expressão intacta de IL-12/23 p40, se

comparada à expressão vista pela sub-unidade IL-12 p35, indicando relevância na resposta

imune ao M. tb em modelos animais “knockout” para estas subunidades (Cooper et al. 2002).

Estudo in vitro com células monocíticas demonstram que a IL-23 parece ter significativa

expressão em monócitos tipo 1 após ativação com componentes micobacterianos, M.bovis

BCG ou M. tb (Verreck et al. 2004). IL-23p19 está presente localmente no pulmão de

camundongos infectados com M. tb H37Rv e observa-se a expressão associada de IL-17 e

IFNγ em células T pulmonares ativadas. A expressão localizada destas moléculas sugere o

controle da infecção pelo M. tb e uma menor reação inflamatória local, com um aumento do

número de células T CD4

CD25

expressando IL-23 e IFNγ, que subseqüentemente

aumentam a fagocitose e a morte bacteriana nos camundongos infectados com o M. tb H37Rv

(Happel et al. 2005). Outro estudo feito em camundongos C57BL/6 KO para IL-23 p19

infectados por M. tb H37Rv via aerosol demonstrou efetivamente que mesmo na ausência de

IL-23p19 o crescimento micobacteriano foi controlado, e não há diminuição de células T

CD4

antígeno-específicas produtoras de IFNγ ou da expressão local de RNAm para IFNγ. No

Revisão da Literatura 48

entanto houve uma redução quase total da produção de IL-17 ou expressão de RNAm por

células T CD4

. Observa-se também nestes camundongos “knockout” infectados a expressão

inalterada de genes micobactericidas como NOS2 e a LRG-47. A ausência simultânea de IL-

23 e IL-17 implica diretamente na presença de mediadores inflamatórios que afetam

substancialmente a resposta granulomatosa na infecção pulmonar local na resposta ao M. tb

(Khader et al. 2005).

McKenzie et al. (2006) descreveram o potente eixo pró-inflamatório (Th-17), que é

estimulado pela produção de IL-23, a qual irá induzir a expansão de células T produtoras de

IL-17, de forma distinta do eixo Th-1 e Th-2, com produção de IFNγ e IL-4. Aparentemente,

citocinas do eixo da família IL-12 (IL-12, IL-23 e IL-27) estão implicadas na resposta imune

Th-1 frente a patógenos intracelulares, mas as três citocinas não são inteiramente redundantes

na resposta imune, apesar da deficiência seletiva de uma das citocinas do hospedeiro poder ser

compensada pela presença das outras. Entretanto, em alguns casos uma citocina pode ser

requerida primariamente na geração de uma resposta antimicrobicida, enquanto que outra

citocina pode estar envolvida numa fase mais tardia da resposta após a eliminação do

patógeno (Beadling & Slifka 2006).

2.4.5 IL-10

É uma citocina regulatória anti-inflamatória produzida primariamente por macrófagos

e monócitos, mas também podem ser induzidas em células T, B e eosinófilos. É uma citocina

com efeito pleiotrópico e que in vivo é capaz de limitar a resposta inflamatória assim como

induzir imunoregulação. Regula negativamente a expressão de citocinas Th-1, a apresentação

de antígenos via MHC de classe II e a expressão de moléculas co-estimulatórias no

macrófago. Em células B, é capaz de influenciar a meia-vida destas células, afetar a

proliferação e a produção de anticorpos.

Revisão da Literatura 49

O gene para IL-10 localiza-se no braço longo do cromossomo 1 entre a região q31-q32

(GeneID: 3586 PubMed) e apresenta cinco exons e quatro introns incluindo regiões 5’ e 3’

UTR. O gene possui um tamanho de 4.9 Kb, transcreve um RNAm linear de 1.6 Kb e traduz

uma proteína de 178 aa.

A IL-10 é produzida inicialmente após a fagocitose do M. tb por macrófagos (Shaw et

al. 2000) e em pacientes com TB a expressão de RNAm foi demonstrada em células

mononucleares circulantes, no sítio da infecção pleural e no lavado broncoalveolar (Aubert-

Pivert et al. 2000). Como revisto por van Crevel et al. (2002), a IL-10 antagoniza a resposta

de citocinas pró-inflamatórias através da regulação negativa de IFNγ, TNFα e IL-12. A

participação destas citocinas, como anteriormente descrito, é essencial à resposta imune

protetora contra a TB, sendo a IL-10 não somente capaz de restringir a resposta imune

protetora do hospedeiro como a participação do macrófago na contenção primária da infecção

in vitro do M. bovis BCG (Murray & Young 1999). Os camundongos transgênicos que

expressam altos níveis de IL-10 são mais susceptíveis à infecção micobacteriana, mesmo que

estes camundongos continuem a produzir IFNγ em níveis normais semelhantes aos detectados

nos controles (Murray et al. 1997). Resultados similares demonstram que a presença de IL-10,

juntamente com TNFα e IFNγ, estão aumentadas no soro de pacientes com TB ativa antes do

tratamento, se comparado a seus respectivos controles. Uma redução significativa é observada

para IL-10 e TNFα após quatro meses de terapia e IFNγ após dois meses de tratamento anti-

TB (Deveci et al. 2005). Segundo Salgame et al. (2005) a presença de IL-10 seria induzida

através da sinalização de TLR2, em resposta à infecção pelo M. tb, como parte de mecanismo

regulatório negativo da resposta imune, que inibiria a resposta inflamatória para limitar o

dano colateral. Em trabalho recente a participação de células T regulatórias

(CD4

CD25

FoxP3

Treg) também foi relacionada à supressão da resposta imune local em

pacientes infectados com M. tb, através da regulação direta de IL-10 e IFNγ por estas células

Revisão da Literatura 50

(Chen et al. 2007). Porém Jang et al. (2006), avaliando células mononucleares do sangue

periférico (PBMCs) de pacientes com tuberculose ativa, mas negativos para reação

tuberculínica, verificou que apresentaram altos níveis de IL-10, além de correlação positiva

entre IL-10 e IFNγ na resposta imune da TB. Outros trabalhos identificaram que o perfil

imunossupressor da IL-10 por células apresentadoras de antígenos se estende à inibição de

resolução de infecções virais persistentes, devido a mecanismos que induzem a inatividade de

células T. A administração terapêutica de anticorpos que bloqueiam o receptor de IL-10 é

capaz de induzir o retorno das funções das células T e levar à eliminação da infecção viral

(Brooks et al. 2006). Bonecini-Almeida et al. (2004) descreveram a presença combinada de

citocinas imunossupressoras como IL-10 e TGF-β e a co-expressão de seus receptores

(TGFβ-RI e TGFβ-RII) no fluido broncoalveolar de portadores de TB ativa, que podem atuar

localmente no pulmão na regulação negativa da resposta imune, permitindo a replicação do

M. tb.

2.4.6 Receptores

2.4.6.1 TGF

-RI e TGF

-RII

O fator transformador de crescimento β ou superfamília TGF-β

é um amplo grupo de

ligantes estruturais relacionados que regulam vários processos celulares, incluindo progressão

de ciclo celular, diferenciação celular, funções reprodutoras, desenvolvimento, motilidade,

adesão, atividade neuronal, morfogênese óssea, cicatrização e vigilância imunológica (Lin et

al. 2006). As respostas celulares aos ligantes de TGF-β são traduzidas através de interações

com dois receptores distintos serina-treonina quinase de membrana, denominados receptores

tipo I e tipo II e são glicoproteínas de aproximadamente 55 e 70 kDa respectivamente, que

interagem com a respectiva molécula de TGF-β (Lin et al. 2006).

Revisão da Literatura 51

O gene que codifica para TGFβ-RI localiza-se no braço longo do cromossomo 9

região q22 (GeneID: 7046 - Pubmed) e apresenta nove exons e oito introns, incluindo regiões

5’ e 3’ UTR. O gene apresenta 49 Kb, transcreve um RNAm linear de 6.4 Kb e traduz uma

proteína de 503 aa.

O gene que codifica para TGFβ-RII localiza-se no braço curto do cromossomo 3

região p22 (GeneID: 7048 - Pubmed) e devido ao “splicing” alternativo, o gene de TGFβ-RII

apresenta duas isoformas, A e B. A isoforma precursora A é a maior, com oito exons e sete

introns, incluindo regiões 5’ e 3’ UTR. Esta apresenta um gene de 87 Kb, transcreve um

RNAm linear de 4.7 Kb e traduz uma proteína de 592 aa, já a isoforma B determina uma

proteína de 567 aa.

A molécula de TGF-β parece agir na contenção da imunidade protetora à tuberculose.

Componentes micobacterianos induzem a produção de TGF-β em macrófagos, monócitos e

células dendríticas, regulando negativamente a resposta inflamatória (Latchumanan et al.

2005; Toosi et al. 1997). Assim como a IL-10, a produção de TGF-β encontra-se aumentada

no sítio da infecção durante a tuberculose, entretanto sua atuação em conjunto não significa

um efeito aditivo ou inibição sinergística pois, assim como provocado pela IL-10, o TGF-β

também inibiria diretamente as funções de células T CD4+ e células T γδ (Rojas et al. 1999).

Mas isto leva a uma supressão da produção de IL-2, da expressão de receptores para IFNγ e

de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal II (MHC de classe II) (Tada et

al. 1991; Pinson et al. 1992; Geiser et al. 1993) e com o bloqueio da ativação induzida por

IFNγ, em macrófagos (Tsunawaki et al. 1988), causaria baixa da produção de IL-1, TNFα e

iNOS (Chantry et al. 1989; Ding et al. 1990). Othieno et al. (1999) descrevem o sinergismo

entre a IL-10 e o TGF-β na supressão da produção de IFNγ por células T estimuladas com

PPD. Em paralelo, Maeda & Shiraishi (1996), através de experimentos in vivo em células de

Revisão da Literatura 52

linhagem tímica de camundongo EL4, indicam que a presença de TGFβ e IL-10 seria capaz

de promover o direcionamento da resposta imune para um perfil Th-2.

Um aspecto interessante é demonstrado por Dahl et al. (1996) referente a uma

variação na produção específica de TGF-β em monócitos de sangue periférico através da

indução por lipoarabinomanana (LAM) de cepas virulentas Erdman e H37Rv de M. tb.

Resultados clínicos indicam ainda que TGF-β é capaz de induzir o dano tecidual e fibrose

durante a tuberculose ativa, pela síntese de colágeno (van Crevel et al. 2002; Hernandes-

Pando et al. 2006). Contudo, McCaffrey et al. (1995) descrevem a importância dos receptores

TGFβ-RI e TGFβ-RII como pré-requisito na regulação da molécula bioativa de TGF-β1 nas

lesões em doenças fibroproliferativas, que resultam em efeitos distintos mediante a exposição

da molécula ao receptor, confirmando a importância da resposta antiproliferativa do receptor

TGFβ-RII no seu modelo de estudo. Aparentemente, o receptor TGFβ-RII estaria mais

associado a alterações referentes à indução da proliferação celular, enquanto que o receptor

TGFβ-RI está envolvido na indução da síntese protéica em resposta à molécula de TGFβ1

(Apud McCaffrey 1995). Bonecini-Almeida et al. (2004), descreveram que a presença da

molécula bioativa assim como os receptores TGFβ-RI e TGFβ-RII são significativamente co-

expressos em células do BAL de pacientes com tuberculose ativa, se comparado aos

respectivos controles, indicando assim a participação dos receptores da molécula bioativa de

TGF-β no processo da tuberculose ativa.

2.4.6.2 CD80 e CD86

CD80 e CD86 são membros da super-famílias das imunoglobulinas (Ig) e são

expressos principalmente em células apresentadoras de antígeno (APCs) como macrófagos,

Revisão da Literatura 53

monócitos e células dendríticas (Freeman et al. 1991; Freeman et al. 1993). Estas moléculas

se ligam a duas proteínas de superfície celular, CD28 ou à proteína associada a linfócito T

citotóxico 4 (CTLA-4), constitutivamente expressas em células CD4

e CD8

, e são

responsáveis por atividades de co-estimulação, indução de proliferação celular, expressão de

citocinas ou ainda regulação positiva/negativa da resposta imunológica (Green 2000).

O gene humano que codifica para CD80 localiza-se no braço longo do cromossomo 3

na região q13.3-q21, consiste de cinco exons e quatro introns e abrange 3.5 Kb (GeneID: 941

- Pubmed). Esta seqüência genômica dá origem a um RNAm linear de 2.8 Kb, incluindo

regiões 5’ e 3’ UTR e sintetiza uma proteína de 288 aa.

O gene humano que codifica para CD86 localiza-se no braço longo do cromossomo 3

região q21, consiste de 65 Kb e por “splicing” alternativo o gene de CD86 apresenta duas

isoformas precursoras, 1 e 2 (GeneID: 942 – Pubmed). A isoforma precursora 1, a maior entre

ambas, com sete exons e seis introns, incluindo regiões 5’ e 3’ UTR, origina um RNAm linear

de 2.8 Kb e sintetiza uma proteína de 329 aa, enquanto a isoforma 2 determina uma proteína

final de 323 aa.

A densidade relativa na superfície celular de CD80 e CD86 em células B ativadas seria

capaz de influenciar a natureza da resposta “T helper” (Vijayakrishnan et al. 2000). Em

paralelo há uma regulação distinta entre as duas moléculas: em células B ativadas, uma vez

estimuladas, a presença de anti-CD86 induziria uma regulação positiva de CD80 na superfície

celular (Sahoo et al. 2002). Resultados similares em camundongos BALB/c foram obtidos em

células dendríticas (DCs) quando estimuladas com anti-CD80. Este foi capaz de induzir

aumento específico da densidade da expressão de CD86, na superfície de células dendríticas

maduras isoladas. A regulação positiva de CD86, em DCs maduras, induziria ainda um

aumento da expressão dos níveis de IL-10 e TGF-β. Entretanto, a presença de CD80

promoveria majoritariamente a produção de IFNγ e IL-12p40. Estes resultados indicam que a

Revisão da Literatura 54

estimulação de CD80 seria capaz de modular o perfil de secreção de citocinas e a densidade

da expressão de CD86 em DCs, com direcionamento qualitativo da resposta de células T

(Balkhi et al. 2004). A predominância dos antígenos de M. tb leva à regulação negativa da

resposta imune, com aumento em cerca de dez vezes da densidade de CD86 na superfície

celular de células dendríticas maduras, levando concomitantemente ao aumento da expressão

de IL-10 e TGF-β. O tratamento das células com IL-12p70 e/ou IFNγ leva à reversão do perfil

Th-2 (Balkhi et al. 2004a). Outros dados indicam que a vacinação de animais com M.bovis

BCG associado a CD80/CD86 diminuiria a patologia da tuberculose bovina no pulmão e

também nos linfonodos associados (Maue et al. 2004). Um dado interessante descrito por Kai

et al. (2006) indicam que a expressão de moléculas co-estimulatórias CD80, CD86, CD40 e

MHC de classe II estão positivamente regulada em DCs após estimulação com altas doses de

M. tb in vitro. Nosso grupo ainda demonstrou em trabalho recente que há uma menor

expressão da molécula co-estimulatória CD80 e de HLA-DR em macrófagos obtidos por

escarro induzido em pacientes com TB ativa se comparados aos controles (Flores Batista et al.

2007).

2.4.6.3 IL-1Rn

A proteína codificada por este gene é um membro da família das interleucinas 1. Esta

proteína inibe a atividade de IL-1α e IL-1β. Três são as formas protéicas resultantes do gene

para antagonista do receptor de IL-1 (IL-1Rn), duas intracelulares e uma terceira secretora

(sIL-1Rn) (Nambu et al. 2006; Dinarello 2003). IL-1Rn é responsável pela variabilidade da

ação da IL-1 na resposta imune e inflamatória e está elevada no soro de pacientes com

diversas condições, como sepsis, doenças auto-imunes e doenças inflamatórias (Brown et al.

1996) ou ainda na adipogênese e homeostase de energia, como visto em modelos de

camundongos por Somm et al. (2005).

Revisão da Literatura 55

O gene humano que codifica para IL-1RN localiza-se no braço longo do cromossomo

2 região q14.2, consiste de 16 Kb e por “splicing” alternativo o gene de IL-1RN apresenta

quatro isoformas (GeneID: 3557 – Pubmed). A isoforma precursora 1, a menor de todas, com

quatro exons e três introns incluindo regiões 5’ e 3’ UTR, origina um RNAm linear de 1,7 Kb

e sintetiza uma proteína de 177 aa. Já a isoforma 2, a maior de todas, determina uma proteína

final de 180 aa.

Resultados indicam que IL-4 induz ao aumento de IL-1Rn em células da PBMC in

vitro estimuladas com M. tb, em contrapartida altos níveis de IFNγ e o decréscimo da

expressão de IL-10 diminua efetivamente a produção de IL-1β, sendo este um indício de

desregulação de IL-1Rn/IL-1β (Wilkinson et al. 1999). Outros resultados descrevem que o

IL-1Rn é um gene de expressão imediata e que é ativado pela via IFNβ em monócitos

humanos in vitro independente de STAT1 (Molnarfi et al. 2005). A desregulação da

expressão de IL-1/IL-1Ra, que é vista em doenças inflamatórias, determina que a produção de

IFNγ e IL-17 esteja aumentada em células T de camundongo IL-1Rn

(Matsuki et al. 2005;

Nakae et al. 2003). Avaliando aspectos da indução local da inflamação na hipersensibilidade

tardia (DTH), Nambu et al. (2006) demonstraram que camundongos “knockout” IL-1Rn

-/-

apresentam resposta DTH parcialmente reduzida. Entretanto, outros fatores contribuem para a

resposta inflamatória, como a presença de TNFα, sustentando a produção e mediando vários

efeitos da ação da IL-1. A expressão de IL-23p19, IL-12p40, IL-17 e IL-1β é aumentada em

camundongos IL-1Ra

, e o excesso de IL-1β livre levaria à indução significativa da produção

de IL-23 (Cho et al. 2006). Parece existir uma alça regulatória na produção de altos níveis de

IL-23, IL-17 e IL-1 no processo inflamatório quando em ausência de IL-1Rn.

Dinarello (2003) descreve que paciente com sepsis em risco de morte que foram

tratados com bloqueadores de TNFα ou com IL-1Rα, suprimindo a atividade de IL-1α e IL-

Revisão da Literatura 56

1β, apresentaram melhora e aumento da sobrevida. Similarmente, resultados descritos por

Juffermans et al. (1998b) indicam níveis aumentados de IL-1Rn e TNFαRI e TNFαRII em

pacientes com tuberculose ativa associado com quadros graves de anorexia ou febre, se

comparados a seus contatos e controles saudáveis analisados, desta forma descrevendo estas

moléculas como marcadores de doença ativa grave. A deficiência de IL-1R (

), em

camundongos estimulados por LAM de M. tb, promove a diminuição do influxo de

granulócitos no BAL e a diminuição da presença de TNFα localmente no pulmão (Juffermans

et al. 2000). A inativação da IL-1 em camundongos afetaria a resposta inflamatória diante de

antígenos do M. tb, com maior ênfase na organização do granuloma e na resposta inicial

inflamatória com influxo da população de células T.

2.4.6.4 TLR2

A proteína codificada por este gene é um membro dos receptores Toll-like (TLR). Esta

família é fundamental no reconhecimento de patógenos e ativação da imunidade inata. Os

TLRs são altamente conservados, desde drosófila até humanos, e dividem similaridades

funcionais e estruturais. Estes grupo de receptores reconhecem padrões moleculares

associados a patógenos (pathogen associated molecular patterns, PAMPs) que são expressos

em agentes infecciosos e mediam a produção de citocinas necessárias para o desenvolvimento

da imunidade inata. Os vários TLR exibem diferentes padrões de expressão. TLR2 é expresso

mais abundantemente em leucócitos de sangue periférico e media a resposta do hospedeiro a

bactérias Gram-positivas e leveduras via estimulação por NF-κB.

O gene humano que codifica para TLR2 localiza-se no braço longo do cromossomo 4

região q32, e consiste de 21 Kb com apenas uma região codificante (GeneID:7097– Pubmed).

Esta seqüência genômica dá origem a um RNAm linear de 3.4 Kb, incluindo regiões 5’ e 3’

UTR e sintetiza uma proteína de 784 aa.

Revisão da Literatura 57

A literatura ainda é muito contraditória sobre a atuação dos receptores TLR2 na

resposta imune frente à tuberculose. Mas Drennnan et al.(2004) descreve que camundongos

TLR2

-/-

são mais susceptíveis à infecção pelo M. tb e apresentam aumento na carga bacilar,

principalmente no baço, fígado e no pulmão. Estes animais geneticamente deficientes

apresentam ainda redução da produção de IL-12p40 e TNFα e são incapazes de formar um

granuloma de contenção da infecção. Já Bafica et al. (2005), baseado na teoria de cooperação

entre receptores TLR na resposta imune inata a diferentes patógenos, descreve que

camundongos duplamente “knockout” TLR2

-/-

e TLR9

-/-

apresentam maior suscetibilidade à

infecções in vivo pelo M. tb, e somente neste grupo de camundongos foi observada uma baixa

de produção concomitante de IL-12p40 e IFNγ. Soma-se a isto a significativa redução de

IFNγ em células CD4

, porém o mesmo não é visto na população de células CD8

. Brightbill

et al. (1999) demonstram que o M. tb induz a expressão de um amplo repertório de ligantes a

TLR2. A lipoproteína 19-kDa (LpqH), um antígeno secretado de M. tb, foi descrito como o

primeiro ligante de M. tb a interagir especificamente com TLR2 para induzir TNFα e produzir

óxido nítrico, tanto em macrófagos murinos quanto em humanos. Re et al. (2004) verificaram

que a estimulação de TLR2 através de agonistas aparentemente dá maior suporte à

polarização da resposta Th-2, com maior expressão de IL-10; e a estimulação de TLR2,

induzindo expressão de IL-10, é capaz de silenciar a indução de IP-10 e IL-12p35 frente à

estimulação com agonistas para TLR3 e TLR4. A exposição à lipoproteína de M. tb (19-kDa)

em estudos in vitro em macrófagos murinos indica que a inibição da produção de IFNγ está

relacionada a vários genes no macrófago, particularmente envolvidos no processamento de

MHC Classe II e recrutamento de células T. Foi observado também que a via de ativação de

macrófagos por IFNγ é dependente de MyD88 (Pai et al. 2004) assim como a mesma via de

sinalização de TLR2. Entretanto, Banaiee et al. (2006) descrevem que a desativação de IFNγ

está diretamente relacionada à expressão de TLR2 em células fagocíticas HEK293. Já Curry

Revisão da Literatura 58

et al. (2004) citam que a redução da estimulação de TLR2 por agonista específico ou

estimulação com M. avium (10:1 CFU) em células macrofágicas RAW264.7 demonstra uma

redução da expressão (RNAm) do receptor para IFNγ (IFNGR-1) sugerindo uma possível

regulação transcricional ou pós-transcricional do gene, reduzindo assim paralelamente a

presença de IFNγ como proteína final.

2.4.7 Mediadores intracelulares, imunossupressores e enzima

2.4.7.1 IRAK-M

A Quinase 3 Associada ao Receptor de Interleucina 1 (IRAK-M) faz parte de um

grupo de moléculas mediadoras da transdução de sinal para citocina pró-inflamatória 1, IL-1,

que foi posteriormente implicado na transdução de sinais para outros membros da família de

TLR/IL-1R. Quatro tipos de moléculas

foram identificadas na família IRAK sendo

duas quinases ativas (IRAK-1 e IRAK-4) e

duas quinases inativas (IRAK-2 e IRAK-

M). Todas as moléculas de IRAK estão

situadas na cascata de ativação abaixo de

MyD88 e são capazes de se ligar a

TRAF6, causando a ativação de NFκB e

MAPK (Janssens et al. 2003; Wesche et

al. 1999; Li et al. 2002; Medzhitov et al.

1998; Wesche et al. 1997). Entretanto,

dentre os receptores da família IRAK, o IRAK-M é o único expresso somente em

monócitos/macrófagos.

Figura 2: Modelo de ação de IRAK

Adaptada de Kobayashi et al. (2002)

Revisão da Literatura 59

O gene humano que codifica para IRAK-M localiza-se no braço longo do cromossomo

12 região q14.3, e consiste de 12 exons e 11 introns, apresentando um tamanho de 59 Kb

(GeneID: 11213 - Pubmed). Esta seqüência genômica dá origem a um RNAm linear de 2.3

Kb, incluindo regiões 5’ e 3’ UTR e sintetiza uma proteína de 596 aa.

Segundo Kobayashi et al. (2002), a presença de IRAK-M intracelular exerce um papel

crítico na regulação negativa de citocinas pró-inflamatórias. Consistentemente, camundongos

IRAK-M

-/-

, quando infectados por bactérias gram-negativas mortas ou vivas (Salmonella

typhimurium ou Escherichia coli) apresentam um aumento na expressão de citocinas pró-

inflamatórias. Adicionalmente, os autores propõem um modelo de funcionamento para IRAK-

M conforme Figura 2. A ativação por dimerização dos receptores TLRs em reconhecimento

dos Padrões Moleculares de Associação a Patógenos (PAMPs) é seguida da associação de

IRAK e IRAK-4 e o recrutamento de MyD88, que resultam em subseqüente ativação e

fosforilação (Figura 2A). A fosforilação de IRAK ou IRAK4 resulta na alteração

conformacional, causando perda de afinidade do complexo de sinalização TLR ativado a

cascata de sinalização IRAK-TRAF6. IRAK-M atua neste processo por inibição de

dissociação de IRAK e IRAK-4 ou estabilização do complexo TLR/MyD88/IRAK-4 de

acordo com a Figura 2B. Em paralelo Nakayama et al. (2004) confirma a atuação de IRAK-

M como importante modulador da ativação de receptores TLR.

Poucos trabalhos na literatura avaliam esta molécula utilizando a tuberculose como

modelo. Recentemente, Pathak et al. (2005) descreveram que o efeito da lipoarabinomanana

recoberta por manose (Manose-capped Lipoarabimanan Man-LAM), um membro do grupo

de modulinas de M. tb que o bacilo utiliza para subverter a resposta imune inata, induz a

produção de IRAK-M em macrófagos in vitro, levando à inibição de IL-12 em vários níveis.

Sobre esta via sugere-se que Man-LAM inibe a transcrição e síntese protéica do gene de IL-

12p40, influenciando diretamente a translocação de NFκB para o núcleo. Além disso, a

Revisão da Literatura 60

inibição de NFκB está associada ao aumento direto da expressão de IRAK-M, como

demonstrado em ensaios de gene reporter (Reporter Gene).

2.4.7.2 SOCS1 e SOCS3

Os Supressores de sinalização de citocinas (SOCS) pertencem a uma família de

proteínas que regulam, em intensidade e duração, a cascata de sinalização de citocinas. Foram

inicialmente descritos como SH2 (Cytokine-inducible Ser homology 2) por Yoshimura et al.

(1995). Esta família é composta por oito fatores identificados até o momento como CIS e

SOCS1-7 (Yoshimura et al. 1995; Naka et al. 1997; Starr et al. 1997; Endo et al. 1997);

Hilton et al. 1998). As proteínas desta família contêm o domínio SH2 e o segmento chamado

de SOCs-box, localizado próximo da região C terminal. Fisiologicamente, SOCS1 é o maior

inibidor de IFNγ e outras citocinas envolvidas na homeostase linfocítica, enquanto que

SOCS3 inibe a família de IL-6-LIF de citocinas e

exerce outras funções gerais como regulador

negativo de inflamação. Em linhas gerais a

expressão dos genes SOCS1 e SOCS3 ocorre em

estado basal, mas é rapidamente estimulada por

citocinas, hormônios, fatores de estimulação de

colônia e fatores de crescimento via sinalização de

JAK-STAT. Por outro lado, a ativação desta

molécula direciona a inibição da própria via

indutora STAT, constituindo uma alça negativa de

regulação (Tan & Rabkin 2005) como ilustrado

pela Figura 3.

Figura 3: Modelo de ação de SOCS

Adaptado de Heeg & Dalpke (2003)

O gene humano que codifica para SOCS1 localiza-se no braço curto do cromossomo

Revisão da Literatura 61

16 na região p13.13, possui um tamanho de aproximadamente 1.7 Kb com apenas uma região

codificante (CDs) (GeneID:8651– Pubmed). Esta seqüência genômica dá origem a um RNAm

linear de 1.2 Kb, incluindo regiões 5’ e 3’ UTR e traduz uma proteína de 211 aa. O gene

humano que codifica para SOCS3 localiza-se no braço longo do cromossomo 17, região q25.3

e consiste de 3.3 Kb com apenas uma região codificante (CDs) (GeneID:9021– Pubmed). Esta

seqüência genômica dá origem a um RNAm linear de 2.7 Kb, incluindo regiões 5’ e 3’ UTR e

traduz uma proteína de 225 aa.

Uma das principais características do M. tb é a capacidade de replicar

intracelularmente em macrófagos humanos. Estudos in vitro, especificamente em modelos

analisando o M. bovis BCG e o 6,6’ dimicolato/ fator corda, o maior componente celular da

parede do M. tuberculosis, demonstram induzir a produção de SOCS1 e paralelamente de

SOCS3 em macrófagos murinos J774 e inibir a produção de IFNγ via inibição de fosforilação

de STAT1. O M.bovis BCG também é capaz de reduzir a ativação e translocação de STAT1,

mas não de STAT3, para o núcleo e fosforilação de JAK 1 e JAK2. Isto sugere que o M.bovis

BCG e fatores componentes do M. tb são capazes de interferir também na sinalização

intracelular de macrófagos, inibindo desta forma a produção de IFNγ (Imai et al. 2003). M. tb

é capaz de suprimir a expressão de MHC Classe II (Pai et al. 2003). Outros aspectos se

estendem ainda ao balanço entre a ativação da resposta imune Th-1 com o tipo de cepa

infectante e a produção de IFNγ como molécula imuno-reguladora da resposta imune.

Seguindo esta linha, Manca et al. (2005) descreveram que a infecção com isolados clínicos de

M. tb da cepa W/Beijing em camundongos induzem a maior expressão do RNAm de SOCS1,

4 e 5 e outros reguladores negativos da sinalização JAK/STAT (Pai et al. 2003). Blumenthal

et al.(2005) descrevem que diferentes cepas de M. avium tendem a induzir a maior expressão

de IL-12p40, SOCS-1 e IL-10 como forma de manipulação específica de genes do hospedeiro.

Camundongos SOCS1

-/-

apresentam morte neonatal prematura mas alguns trabalhos

Revisão da Literatura 62

descrevem que a deficiência de SOCS1 é capaz de induzir aumento da expressão de IL-12,

TNF e IFNγ em células T e NK podendo até levar a reações inflamatórias agudas e

indiretamente ao aumento da produção de fatores de inibição de resposta imune local, como

IDO, e sistêmica, como a IL-10 (Eyles et al. 2002; Chong et al. 2005; Tsukada et al. 2005).

Ainda sobre a atividade de moléculas da família de supressores, podemos descrever

que a expressão primária e aumentada de SOCS3 e IL-10 induz a inibição da expressão de IL-

12 e TNFα em monócitos de vacas com infecção sub-clínica por M. avium subespécie

paratuberculosis, sugerindo uma atenuação da capacidade de monócitos em iniciar a resposta

imune inflamatória adaptativa (Weiss et al. 2005). Chen et al. (2005) descrevem que a

deficiência de SOCS3 em células T estaria diretamente relacionada à produção de IL-23 e que

este supressor é essencial na regulação negativa da sinalização de IL-23 via STAT3. A

proteína SOCS3 aparentemente também é um regulador da expressão de TGF-β1 e IL-10 via

regulação positiva de STAT3, em modelos de estudos in vitro com células T de camundongos

infectados por Leishmania major, segundo Kinjyo et al. (2006). SOCS3 é também

predominantemente expressa em células com perfil Th-2 via redução da IL-12 por inibição de

STAT4 (Seki et al. 2003; Kinjyo et al. 2006).

Os mediadores intracelulares SOCS são importantes reguladores de sinalização de

receptores TLR. Inicialmente, evidências experimentais sugeriram que os receptores TLR são

capazes de induzir IFNs tipo I (Alfa e Beta), os quais seriam fortes indutores de moléculas

SOCS, particularmente SOCS1 (Heeg & Dalpke et al. 2003). Baetz et al. (2004) descreveram

uma regulação indireta de SOCS1 na via de ativação de genes induzidos por TLR2, 3, 4 e 9

por inativação de STAT1. Entretanto Mansell et al. (2006) descreve que SOCS1 pode

diretamente suprimir a resposta imune por degradação de uma proteína adaptadora Mal, um

mediador chave de sinalização de TLR4 e TLR2, regulando, assim, aspectos da resposta pró-

inflamatória. A descrição prévia de que ligantes de TLR influenciam rapidamente a indução

Revisão da Literatura 63

de proteínas SOCS, combinado com a demonstração de SOCS1 mediando a degradação de

Mal, revela um rápido mecanismo de feedback no controle da sinalização de receptores TLR.

2.4.7.3 IDO

“Indoleamine-Pyrrole 2,3 dioxygenase” ou IDO é uma enzima envolvida no

catabolismo de triptofano em diferentes metabólitos (ácido 3-hidroxiantranílico, picolínico e

ácido quinolínico), dos quais os principais produtos são as quinurenina. IDO é expresso

primariamente por monócitos, macrófagos e células dendríticas e por depleção local de

triptofano, compostos reativos de oxigênio (ROS) e a produção das quinureninas podem inibir

a ativação celular de linfócitos T. Estas células são extremamente sensíveis à baixa de

triptofano ou à presença de quinurenina e outros metabólitos gerados por IDO. A ativação de

IDO pode causar o aprisionamento dos linfócitos T na fase G1 do ciclo celular ou ainda sua

baixa responsividade. Outros resultados indicam que as quinureninas e outros metabólitos de

triptofano podem promover a apoptose e influenciar o balanço entre a função de células T nas

células Th-1 e Th-2, devido ao fato das células Th-1 serem sensíveis a metabólitos de IDO

(Munn et al. 2006; Mellor et al. 2005).

O gene humano que codifica para IDO localiza-se no braço longo do cromossomo 8

região p12-p11, e consiste de dez exons e nove introns com um tamanho de aproximadamente

14 Kb (GeneID: 3620 - Pubmed). Esta seqüência genômica dá origem a um RNAm linear de

aproximadamente 1,6 Kb, incluindo regiões 5’ e 3’ UTR e traduz uma proteína de 403 aa.

Poucos trabalhos descrevem a relação existente entre este supressor local da resposta

imune e a tuberculose. Entretanto, alguns indícios de atuação desta molécula em outros

modelos, principalmente em câncer e tolerância imunológica, demonstram que IFNγ induz

significativa ativação de IDO em células dendríticas CD8

, as quais são células de alta

produção de IL-10 (Grohmann et al. 2000). Outros indícios sugerem ainda que tanto as

Revisão da Literatura 64

células T CD4

quanto as células T CD8

são inibidas pela ativação de IDO. Uma hipótese

recente é a de que a ativação de IDO no processo de inibição celular é dependente do

engajamento de moléculas B7.1 / B7.2 no processo de apresentação das DCs junto às células

T e que na ausência deste sinal as células dendríticas seriam incapazes de regular

positivamente a atividade funcional de IDO. O autor descreve ainda que a expressão de

CTLA-4 em células T CD4

atua como regulador fisiológico na resposta de células T in vivo

(Munn et al. 2004). Van der Sluijs et al. (2006) sugerem que IDO é um importante modulador

da resposta inflamatória local, no pulmão, em infecções por vírus da influenza seguidas de

infecção secundária com pneumococos (S. pneumoniae) em camundongos. Resultados

indicam que a atividade de IDO está associada ao aumento da produção de IL-10, por

mecanismo ainda não completamente elucidado, levando a um estado imunosupressivo.

Contraditoriamente, Hayashi et al. (2001) descreveram que a inibição do crescimento de M.

avium tanto no baço como no pulmão em macrófagos e monócitos murinos seria mediada por

IDO. O aumento da expressão de IDO levanta alguns aspectos a serem considerados já que o

crescimento micobacteriano necessita da síntese de alguns aminoácidos, incluindo triptofano,

que é catabolizado por IDO. Esta inibição também está associada ao crescimento de

metabólitos tóxicos derivados do catabolismo de IDO como L-quineurinina, ácido 3-

hidroxiantranilico, picolínico e ácido quinolínico que são localmente induzidos.

2.4.7.4 NEMO

IκB complexo quinase (IKK) regula a fosforilação de IκB por promoção de

ubiquitinação e degradação proteossômica para a via de liberação de NFκB. IKK é composto

de três subunidades: IKKα e IKKβ, que servem como componentes catalíticos, e NEMO ou

IKKγ (

IKBKG inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase gama)

que é um componente sem função catalítica mas apresenta-se como um modulador essencial

Revisão da Literatura 65

na regulação de NFκB (Uzel et al. 2005).

NEMO centraliza várias vias de

sinalização intracelular, sendo este fator

essencial na formação do complexo

funcional IKK e uma vez livre deste

complexo a molécula de NFκB é capaz de

migrar para o núcleo e iniciar a transcrição

de vários genes envolvidos na imunidade,

inflamação, apoptose, adesão celular e

crescimento (Uzel et al. 2005), como

ilustrado pela Figura 4.

O gene humano que codifica para

NEMO localiza-se no braço longo do cromossomo X região q28, e consiste de nove exons e

oito introns e possui aproximadamente 17 Kb (GeneID: 8517 - Pubmed). Esta seqüência

genômica dá origem a um RNAm linear de aproximadamente 2.1 Kb, incluindo regiões 5’ e

3’ UTR traduzindo uma proteína de 419 aa.

Figura 4: Modelo de ação de NEMO

Adaptado de Uzel et al. (2005).

Poucos trabalhos na literatura realmente abrangem a relação entre NEMO e as

infecções com M. tb. Ottenhoff et al.(2005) descreveram que pacientes com defeitos em

NEMO parecem ter maior suscetibilidade à TB, sendo ele um importante regulador NFκB. Os

autores sugeriram uma drástica alteração na ligação entre a resposta imune inata e adaptativa

em paciente com alterações de expressão no eixo IL-12/IL-23-IFNγ. Outros estudos em busca

de biomarcadores de proteção contra doenças identificaram casos de infecções por bactérias

não usuais [Mycobacterium não-tuberculosa (MOTT) ou M. bovis Bacille Calmette-Guérin

(BCG) ou espécies de Salmonella] em pacientes com alterações nos genes de citocinas

(TNFα, IL-12 IFNγ) essenciais na resposta imune à micobactérias e que são regulados via

Revisão da Literatura 66

NFκB. Algumas destas alterações foram associadas à deficiência genética na molécula de

NEMO (Ottenhoff et al. 2005). Camundongos “knockout” para NEMO sem atividade de

NFκB morrem de apoptose maciça no fígado em torno de 13 dias de vida (Schmidt-Supprian

et al. 2000). Defeitos que levam ao bloqueio da produção ou alteração na expressão de

NEMO, e diretamente a regulação de NFκB causam implicações severas como osteopatia e

mosaicismo desencadeando uma resposta inflamatória extremamente tardia e insuficiente, a

despeito de uma infecção grave (von Bernuth et al. 2005).

2.5 A Resposta imune compartimentalizada no pulmão

De forma geral o pulmão maduro possui regiões anatômicas distintas cobertas por

diferentes tipos de células epiteliais. A traquéia e o brônquio principal estão cobertos por um

epitélio pseudo-estratificado ciliado. Os bronquíolos possuem um revestimento por células

ciliadas e por células não ciliadas chamadas de células de Clara. O alvéolo é revestido por

células escamosas horizontais (pneumócito tipo 1) e cubóides (pneumócitos tipo 2). Alguns

aspectos de resposta imune contra o Mycobacterium tuberculosis, com relação a resposta local

no sítio de infecção, como no pulmão, são ainda amplamente desconhecidos. Os principais

estudos envolvendo a análise imunológica e a investigação da patogenia de doenças que

acometem o sítio pulmonar, particularmente a tuberculose, descrevem o lavado

broncoalveolar (BAL) como uma ferramenta de comprovada validade. Células

broncoalveolares obtidas do fluido do BAL de pacientes com tuberculose ativa caracterizam-

se por apresentarem cerca de 20% de macrófagos alveolares imaturos recentemente recrutados

da corrente sangüínea (Schwander et al. 1996), um percentual aumentado de linfócitos

alveolares T expressando receptores αβ e marcadores de ativação (Schwander et al. 1996;

Hoheisel et al. 1994), assim como um aumento variável do número de neutrófilos (Schwander

et al. 1996; Zhang et al. 1995) e células T alveolares de memória CD4 responsivas ao PPD

Revisão da Literatura 67

(Barnes et al. 1989; Fujiwara et al. 1986).

O Trabalho desenvolvido por Schwander (1998), avaliando o perfil de resposta de

células broncoalveolares do BAL, demonstrou a compartimentalização de células antígeno-

específicas em áreas afetadas do pulmão durante a tuberculose ativa, fato este não observado,

no mesmo estudo, em amostras de BAL de indivíduos saudáveis (Schwander et al. 1998;

Schwander et al. 2000). A alta concentração de IFNγ no compartimento broncoalveolar estava

diretamente relacionada à presença de células linfocíticas alveolares em pacientes com

tuberculose ativa. Destacava-se também a co-participação de macrófagos e neutrófilos

alveolares destes pacientes. Mais recentemente, Mazzarella (2003) relatou que a polarização

da imunidade local pode ter correlação clínica, tendo sido observada a predominância Th-1,

com aumento de células CD4

e produção de IFNγ, em pacientes com TB pulmonar não

cavitária, enquanto que o perfil linfocítico Th-2 estaria presente em pacientes com cavitação e

necrose extensa do tecido pulmonar. Já Grassi et al. (2006) utilizando a tecnologia de

microarranjos e reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real-Time PCR), analisou o

BAL de pacientes com tuberculose ativa e detectou a variação de 847 genes codificados para

a mediação da resposta imune pró-inflamatória. Foi demonstrada a existência de uma rede

complexa para a ativação gênica com regulação positiva de citocinas, que incluíam genes na

cascata de ativação de IFNγ e vários genes pró-apoptóticos e potentes ativadores de

transcrição.

A despeito dos resultados significativos obtidos através do BAL, este procedimento

caracteriza-se por ser invasivo, caro e causador de grande desconforto ao paciente, o que

inviabiliza sua utilização como ferramenta para acompanhamento de pacientes em estudos

longitudinais durante o tratamento. Sendo assim, muito avanços foram obtidos através de

modelos animais ou ainda por avaliação de compartimentos longínquos, em relação ao

pulmão, como o sangue periférico.

Revisão da Literatura 68

Evidências recentes de outros estudos pulmonares em asma e doença pulmonar crônica

obstrutiva indicaram que amostras de escarro induzido (EI) podem prover uma pronta

alternativa ao BAL nos estudos longitudinais, com excelente tolerância e baixo custo, o que

permite que seja repetido várias vezes, além de não ser um método invasivo na avaliação de

fatores envolvidos na imunologia pulmonar (Fahy 1995; Keatings et al. 1996). Através do

método do EI, as amostras podem ser obtidas das vias aéreas inferiores e fornecem parâmetros

tão bons ou melhores se comparado aos dados obtidos através do BAL (Bhowmik et al. 1998;

D’Ippolito et al. 1999). Scheicher et al.(2003) indicam que durante o procedimento do EI o

método é capaz de obter amostras de vias aéreas centrais inicialmente, enquanto amostras de

vias aéreas periféricas e alveolares poderão ser obtidas posteriormente com o procedimento.

O perfil celular presente nas amostras de EI define-se pela grande presença de células

escamosas, sendo 25 a 50% de presença de células epiteliais. Relatos indicam que, excluindo-

se as epiteliais, obtém-se de 50-75% neutrófilos, 25-50% macrófagos e cerca de 1% linfócitos

(Scheicher et al. 2003; Ribeiro-Rodrigues 2002). Trabalhos neste campo de avaliação

demonstram que o total diferencial de células tanto quanto o conteúdo de citocinas são

relativamente comparáveis no escarro espontâneo, escarro induzido e no lavado

broncoalveolar (D’Ippolito et al. 1999; Henig et al. 2001). Ribeiro-Rodrigues (2002)

descreveu que, através do EI, é possível observar a presença de células T reativas no sítio da

infecção e variação da produção de marcadores, como o IFNγ, refletindo a intensidade da

infecção pelo M. tb. e inflamação pulmonar correspondente à evolução do tratamento, sendo

portanto uma ferramenta útil para avaliação seqüencial da resposta imune do hospedeiro e

para a avaliação microbiológica no acompanhamento durante o período de tratamento anti-

TB. Algumas desvantagens estão presentes nesta metodologia, pois o EI apresenta relativa

diluição do material, já que o material se obtém não somente da área da lesão, como também

de outras regiões pulmonares não afetadas. Além disso há um risco de contaminação do

Revisão da Literatura 69

médico que está responsável pela condução do exame. Sendo assim, medidas de proteção

devem ser utilizadas a fim de prevenir o risco de transmissão da doença (McWilliams 2002).

Hipótese e Objetivos 70

3.0 Hipótese

Nossa hipótese é que o Mycobacterium tuberculosis, pela excessiva atividade

regulatória através da expressão de proteínas micobacterianas, como por exemplo o CFP32,

seria capaz de desestruturar aspectos da resposta imune, associados à produção, por células

imunocompetentes, de mediadores imunológicos, imunossupressores e outros mediadores

intracelulares da ação microbicida dos macrófagos, permitindo-lhes evadir os mecanismos de

defesa, mesmo na presença de quantidades adequadas de citocinas estimuladoras,

principalmente as do eixo IL-12/IL-23 - IFNγ. A esterilização progressiva da lesão

tuberculosa por meio da quimioterapia eficaz suprimiria o estímulo a tal indução de citocinas

desativadoras, permitindo a retomada do equilíbrio entre o hospedeiro e o parasita na

resolução do processo de infecção.

4.0 Objetivos geral

1-Avaliar a expressão de mediadores imunológicos na resposta imune na tuberculose humana

utilizando modelos in vivo e in vitro.

4.1 Objetivos específicos

1 Avaliar a expressão de TNFα, IL-10, IL-12p35, IL-12p40, IFNγ, TGFβ-RI, TGFβ-RII, IL-

1Rn, CD80, CD86, SOCS1, SOCS3, TLR2, IRAK-3, NEMO e IDO como mediadores

imunológicos por PCR em Tempo Real na resposta imunológica em pacientes com

tuberculose, outras pneumopatias e voluntários saudáveis antes e durante o tratamento.

2 Avaliar a expressão de TNFα, IL-10, IL-12p35, IL-12p40, IFNγ, TGFβ-RI, TGFβ-RII, IL-

1Rn, CD80, CD86, SOCS1, SOCS3, TLR2, IRAK-3, NEMO e IDO como mediadores

imunológicos por PCR em Tempo Real na resposta imunológica em células da PBMC e em

monócitos humanos frente ao M. tb H37Rv:

Hipótese e Objetivos 71

2.1 M. tb H37Rv WT - cepa selvagem

2.2 M. tb H37Rv KoCFP32 - knockout para o gene CFP32

2.3 SN M. tb H37Rv - filtrado de cultura para o WT

2.4 SN M. tb H37Rv KoCFP32 - filtrado de cultura para o gene CFP32

Materiais e Métodos 72

5.0 Materiais e Métodos:

5.1 Desenho do estudo

Realizou-se de um estudo longitudinal, clínico-experimental, de grupos de indivíduos

que se apresentaram aos ambulatórios do Instituto de Doenças do Tórax (IDT) e do Hospital

Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF), da Universidade Federal do Rio de Janeiro

(UFRJ) com suspeita clínica de tuberculose e que necessitaram de indução de escarro para

comprovação diagnóstica. Após o esclarecimento diagnóstico, os indivíduos foram

convidados a participar do estudo, e foi explicada a necessidade de novas induções de escarro

nos seguintes tempos após a introdução da quimioterapia: 15, 30, 60 e 180 dias. O estudo foi

realizado na Divisão de Pneumologia e Tisiologia (DPT) do IDT e no Programa de Controle

da Tuberculose Hospitalar (PCTH) do IDT/HUCFF, que possuem experiência em

acompanhar estes pacientes, contando com instalações adequadas para a coleta do escarro

induzido, inclusive equipamentos de biossegurança. A parte experimental foi realizada no

Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa do HUCFF e na Divisão de Doenças Infecciosas da

Universidade Cornell (Nova York-EUA), equipado com o instrumental necessário para a

realização dos experimentos.

5.2 Critérios de inclusão

Foram incluídos no estudo pacientes com idade de 18 a 70 anos que procuraram a

UPT/IDT e PCTH com queixas de febre, tosse, perda de peso e imagem radiológica

compatível com tuberculose, sem escarro ou com exame direto negativo para bacilo álcool-

ácido resistente. Destes casos foram incluídos os que se confirmaram como portadores de

tuberculose (TB e os que apresentavam outras pneumopatias não tuberculosas (OLD, Other

Lung Diseases). Funcionários e estudantes do HUCFF saudáveis foram voluntários (VOL).

Materiais e Métodos 73

5.3 Critérios de exclusão

Foram excluídos do estudo aqueles pacientes com uso empírico de esquema anti-

tuberculose por 15 dias ou mais, doenças crônicas como insuficiência hepática, renal

(creatinina > 1,5 mg/dl), diabetes melito tipo I e II (glicose > 110 mg/dl), alcoolismo (Critério

de Cage), usuários de drogas injetáveis, problemas sócio-econômicos que impedissem a

aderência ao tratamento ou localização em caso de falta às consultas ambulatoriais.

5.4 Tamanho amostral

Em uma fase inicial do projeto foi descrita variação significativa na dosagem de IL-10

ao longo de cinco avaliações (seis meses de acompanhamento). Estes dados foram utilizados

para o cálculo do tamanho amostral, aonde foram consideradas as seguintes suposições: nível

de significância de 5% ou p < 0,05, poder do teste estatístico de 80% e queda esperada da

expressão de IL-10 após o tratamento em aproximadamente 40% dos pacientes. Utilizando-se

a metodologia previamente descrita por Cohen (1969), o número de casos necessários no

estudo foi de 23 pacientes com tuberculose ativa que completaram o tratamento.

Considerando-se que em torno de 50% dos pacientes incluídos nos estudos anteriores

conduzidos pelo PCTH tinham tuberculose e que haveria uma perda amostral de 20% para um

estudo com seis meses de acompanhamento, foram incluídos no recrutamento inicial 70

pacientes.

5.5 Aspectos éticos

Pacientes com indicação clínica inicial de procedimentos como escarro induzido para

esclarecimento diagnóstico foram convidados a participar do estudo. Sorologia para HIV foi

realizada em todos os participantes, precedida e seguida de aconselhamento. Foi explicada a

Materiais e Métodos 74

necessidade de retornar quinze dias após o início do tratamento para nova coleta de escarro

induzido, assim como 30, 60 e 180 dias após o início. Foram explicados os riscos do

procedimento, assim como a relevância do projeto. A partir do momento que o paciente se

sentiu esclarecido, foi convidado a assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(TCLE) (Anexos). As amostras colhidas nos exames foram primeiramente destinadas aos

exames diagnósticos e o excesso foi destinado ao estudo. Os pacientes foram acompanhados

nos ambulatórios da UPT/IDT e PCTH do HUCFF e toda a medicação fornecida

gratuitamente. Não houve retribuição financeira pela participação no projeto, que foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Medicina/HUCFF/UFRJ

(028/98), legalmente constituído nos termos da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de

Saúde e pelo Institutional Review Board, Weill Medical College of Cornell University número

0759-926 (Anexos). Ficaram assegurados os mesmos direitos aos pacientes que se recusaram

a participar do projeto. Todos os pacientes diagnosticados com tuberculose realizaram o

tratamento com Esquema I (rifampicina, isoniazida e pirazinamida) preconizado pelo

Ministério da Saúde para tratamento não-supervisionado, com consulta mensal e dispensação

de medicação. Nos anexos estão o TCLE e as aprovações pelo CEP.

5.6 Questionário padronizado

Todos os pacientes responderam a um questionário que incluiu os aspectos sócio-

demográficos, clínicos e laboratoriais, além de terem assinado o TCLE. Além do questionário,

foram anotados pela equipe do estudo os dados clínicos e radiológicos: apresentação

radiológica, com número de lobos envolvidos, carga bacilar inicial, tempo de negativação do

escarro. O questionário conta dos Anexos.

Materiais e Métodos 75

5.7 Pacientes envolvidos no estudo.

Pacientes recentemente diagnosticados com episódios de tuberculose pulmonar foram

identificados no Programa de Controle da Tuberculose Hospitalar (PCTH) do Hospital

Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF), um hospital referência para o tratamento da

tuberculose no estado do Rio de Janeiro, entre abril de 1998 e junho de 2001.

Foram incluídos neste estudo trinta (30) pacientes com tuberculose ativa confirmada,

de ambos os gêneros, com apresentação clínica variada (grave a não grave), independente de

cor que: a) apresentaram cultura positiva para micobactéria e subseqüente confirmação

bioquímica da espécie como M. tuberculosis em amostras clínicas respiratórias ou não; b)

aceitaram participar do estudo e assinarem o TCLE.

Foram excluídos os pacientes: a) cujos materiais clínicos não tenham sido

submetidos aos exames constantes do protocolo de rotina de investigação diagnóstica; b) que

não aceitaram participar do estudo.

Os paciente elegíveis foram em seguida submetidos a entrevista padronizada e

assinatura de termo de consentimento para participação do estudo científico aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ - Brasil) e da

Weill Medical College of Cornell University (New York-EUA). Os paciente em seguida

foram submetidos ainda a teste de avaliação para detecção de HIV, via Western Blot, e ainda

a coleta de material biológico. Todos os participantes em potencial tiveram avaliação médica,

exame físico, tele-radiografia de tórax, escarro induzido (EI), baciloscopia, cultura

micobacteriana e hemograma completo avaliados. Todos os paciente incluídos neste estudo

foram submetidos a esquema de tratamento quimioterápico padrão por seis meses

(rifampicina, isoniazida e pirazinamida por dois meses seguido por rifampicina e isoniazida

por outros quatro meses). Foram acompanhados por cinco a seis anos após o término do

tratamento. Dos trinta pacientes com TB ativa arrolados no estudo, 22 foram reavaliados em

Materiais e Métodos 76

agosto de 2005. A média de acompanhamento para estes pacientes foi de cinco anos, variando

de quatro a sete anos, após o final do tratamento. Em oito pacientes não foi possível

acompanhamento devido à perda de contato, principalmente por motivo de mudança de

residência. Quatro pacientes apresentaram diagnóstico positivo para infecção por HIV-1

durante o tratamento ou após o final do tratamento, devido à demora ao consentimento à

testagem para a sorologia para HIV. No entanto nenhum dos pacientes HIV/AIDS fazia

terapia anti-retroviral no momento do diagnóstico ou nas fases iniciais do tratamento.

Pacientes em avaliação pela Divisão de Pneumologia do IDT que apresentaram

sintomas respiratórios, mas sem aspectos clínicos ou evidências laboratoriais de tuberculose

ativa, onze (11), foram arrolados como controles (pacientes com outras pneumopatias ou

“other lung disease” - OLD). Dezesseis (16) adultos voluntários que trabalharam no HUCFF

(health care workers - HCW) assintomáticos, não tabagistas e soro-negativos para HIV foram

incluídos como controles saudáveis.

5.8 Indução do escarro

Os pacientes em jejum lavaram a boca, escovaram os dentes, a língua e a superfície

gengival com uma escova de dentes macia e solução salina, seguida de gargarejo repetido

com água, com a finalidade de minimizar a contaminação com saliva. Foi iniciada então a

inalação de solução salina hipertônica (pois é mais eficiente do que a isotônica) estéril a 3%

através de nebulizador ultrassônico conectado a tubo com alta saída de solução salina, em

média de 2,5 ml/min (UltraNeb 99; DeVilbis-Sunrise Medical – Carlsbad, CA USA). (É

recomendado o uso de nebulizador ultrassônico para a indução de escarro pelo fato de que os

outros nebulizadores não possuem uma suficiente saída de solução salina inalada). Após 20

minutos de inalação o paciente assoou o nariz, lavou a boca e foi encorajado a respirar

profundamente, tossir e expectorar utilizando manobras expiratórias forçadas. Os espécimes

Materiais e Métodos 77

de escarro foram colhidos em frasco estéril. Durante todo o procedimento, os pacientes foram

acompanhados por pessoal médico e o exame foi interrompido quando houve desconforto

respiratório ou sinais clínicos ou funcionais de broncoespasmo. O material colhido foi

dividido igualmente em dois frascos estéreis, um deles foi levado ao Laboratório de

Micobacteriologia para posterior confirmação de tuberculose, através de coloração

denominada Ziehl-Nielsen para BAAR (bacilo álcool-ácido resistente) e cultura de 60 dias

para BK, e o outro frasco foi imediatamente enviado ao laboratório para processamento.

5.9 Manipulação do escarro

O escarro coletado foi conduzido ao Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa sob

refrigeração e imediatamente processado em câmara de fluxo (Labconco Purifier Class II

Biosafety Cabinet – Kansas, MO USA). Metade do escarro foi separada e enviada para o

Laboratório de Micobactérias do IDT e processada para baciloscopia para bacilos álcool-ácido

resistente (BAAR) pela coloração de Ziehl-Nielsen e para cultura para micobactérias, em

meio enriquecido de Löwenstein-Jensen, seguindo as normas recomendadas pelo Ministério

da Saúde.

5.10 Separação do material

A parte mucóide do escarro foi separada da saliva em uma placa de Petri com o auxílio

de uma pipeta Pasteur estéril (Standard bulb pipet, Fisher Scientific – New Hampshire USA) .

Utilizou-se esta parte viscosa para processamento do escarro descrito logo abaixo. Dois tipos

de processamento foram empregados, a separação de uma alíquota de escarro sem tratamento

com ditiotreitol (DTT, Sigma Chemical CO - St. Louis, MO USA) e o tratamento do restante

do escarro com DTT.

a) A Alíquota:

Materiais e Métodos 78

- 0,5 ml ou 500 µl de escarro + 2,5 ml ou 2500 µl de água para injeção (ou água destilada).

Esta alíquota foi colocada em um tubo siliconizado (Nalgene centrifuge ware - Rochester, NY

USA) capacidade 10 ml) e passada no vórtex.

- Após este procedimento inicial, a alíquota foi então centrifugada em centrífuga refrigerada

Beckman J2-21 (Beckman Coulter, Inc. Fullerton, CA USA) por 30 minutos, a 15.000 rpm, à

temperatura de 4°C. Finalizada a centrifugação, o tubo foi retirado cuidadosamente para não

haver mistura do “pellet” celular com o sobrenadante;

- Na câmara de fluxo, foi retirado o sobrenadante da alíquota e colocado em tubos tipo

eppendorf com capacidade para 1,5 ml (Axygen Scientific, Inc. - Union City, CA USA). Estes

foram fechados, etiquetados e selados com parafilm. Os sobrenadantes foram colocados em

isopor com gelo para mantê-los sempre resfriados. No fim do processamento, os mesmos

foram estocados em freezer -80°C para posterior análise das citocinas IL-10 e IFN-γ em outro

estudo.

b) O escarro tratado com DTT.

(O DTT 0,1% é mais eficiente do que o PBS para dispersar as células, e não apresenta

nenhum efeito adverso na contagem celular).

- Após ter sido retirado 0,5 ml de escarro para a alíquota, foi colocado o restante do material

em um tubo Falcon de 15 ml;

- A quantidade de DTT que foi colocada juntamente ao material estava diretamente ligada à

viscosidade e à quantidade do mesmo. A solução estoque de DTT correspondia a 0,010g de

pó + 650 µl de PBS estéril (do inglês, Phosphate Buffered Saline). Desta solução estoque, foi

retirado o necessário para a diluição realizada, como descrito abaixo. A quantidade de solução

de DTT adicionada ao escarro foi devidamente anotada.

- Após ter colocado o DTT juntamente com o escarro, o tubo Falcon foi agitado no vórtex

com a finalidade de homogeneizá-lo e, finalmente conduzido ao banho-maria a 37°C agitado

Materiais e Métodos 79

por 20 minutos com a finalidade de permitir a mucólise;

- O “pellet” da alíquota que sobrou foi acrescentado ao tubo Falcon que continha o escarro

propriamente dito. Novamente, este tubo foi ressuspenso no vórtex;

- O escarro foi então centrifugado em centrífuga refrigerada à 1500 rpm, por 10 minutos, à

temperatura de 5°C, para separação do sobrenadante;

- Após esta primeira centrifugação, foi retirado o sobrenadante do escarro e aliquotado em

eppendorfs devidamente etiquetados e vedados com parafilm. Estes foram mantidos em

isopor com gelo para que, ao final do processamento, fossem estocados em freezer -80°C;

- O “pellet” celular foi ressuspenso em 1 mL de PBS e o tubo foi então agitado no vórtex;

- O material foi centrifugado pela segunda vez seguindo o mesmo procedimento descrito

acima, com a finalidade de lavar as células. O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” celular

foi ressuspenso novamente em 1 mL de PBS. O tubo foi agitado no vórtex;

- O escarro foi centrifugado pela terceira e última vez seguindo o mesmo procedimento acima.

O sobrenadante foi retirado e desprezado. Finalmente, o “pellet” celular foi ressuspenso em 1

mL de PBS. O tubo foi agitado com o auxílio de uma pipeta Pasteur. Neste estágio do

processamento não foi utilizado o vórtex para homogeneizar o tubo com o objetivo de não

romper as células para a contagem em Câmara de Neubauer;

- Contagem global celular: foram colocados 20 µl do corante Azul de Tripan (Sigma-Aldrich -

St. Louis, MO USA) com 20 µl de células em um eppendorf. O mesmo foi homogeneizado e

colocado, por capilaridade, na Câmara de Neubauer.

- A contagem das células viáveis foi realizada em microscópio óptico (Nikon – Melville, NY

USA), sendo a contagem realizada em quatro quadrantes, usando-se a fórmula: N° de células

contadas

÷ 4 (nº de quadrantes contados) × 2 (fator de diluição) × 10

- Uma parte das células obtidas com este procedimento foram direcionadas para estudos com

cito-centrifugados e o restante das células obtidas foram armazenadas em 0,5mL de Trizol®

Materiais e Métodos 80

(Invitrogen, Life technology - Carlsbad, CA USA) em tubos eppendorf RNAse free para

posterior estudo da expressão gênica.

5.11 Coloração:

- Foi selecionada a melhor lâmina das 12 dos citocentrifugados e realizada a coloração

denominada May-Grunwald-Giemsa (Kit Panótico Rápido LB, Laborclin, Pinhais, PR Brasil),

cujas etapas encontram-se descritas logo abaixo:

a) 5 imersões em “buffer” (solução tampão, fixadora): corante azul claro; compõe-se de uma

solução de triarilmetano a 0,1% (Panótico Rápido n° 1);

b) 10 imersões em eosina: corante alaranjado; compõe-se de uma solução de xantenos a 0,1%

(Panótico Rápido n° 2);

c) 10 imersões em hematoxilina: corante roxo; compõe-se de uma solução de tiazinas a 0,1%

(Panótico Rápido n° 3);

d) 10 imersões em água corrente;

e) Secar bem a lâmina;

f) 5 imersões em xilol, com a finalidade de clarear as células;

g) Montar a lâmina com solução de Permount (Fisher Scientific – New Hampshire USA).

(Macroscopicamente a coloração deve apresentar uma tonalidade rosa-mate. Lâminas muito

vermelhas indicam acidez excessiva, e muito azuladas, alcalinidade excessiva.)

- As demais lâminas (n=11) foram imersas em clorofórmio-acetona preparado em diluição 1:1

(utilizado exclusivamente para material contaminado) por, no mínimo, 10 minutos para obter

uma boa fixação do material. As lâminas foram secas em temperatura ambiente e

embrulhadas, com suas faces opostas, em um filme plástico (PVC). Este foi identificado com

um esparadrapo contendo o nome do paciente, o nome do projeto, a data e a quantidade de

lâminas que foram feitas. Por fim, foram estocadas em freezer -20°C.

Materiais e Métodos 81

- Após o término do processamento, todos os materiais utilizados foram tratados com

hipoclorito de sódio à 5% e álcool à 70%.

5.12 Obtenção de células mononucleares de sangue periférico e

monócitos.

Amostras de “Buffy coat” obtidas do centro de coleta de Nova York, NY (NY-USA)

foram utilizadas para obtenção de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e

células monocíticas (Mφ). O volume total de “buffy coat” foi dividido em duas partes no

laboratório e seguidamente direcionado para a obtenção da PBMC e dos Mφ.

As PBMC foi isolada inicialmente por centrifugação em Ficoll-Paque (Amersham

Pharmacia Biotech - Piscataway, NJ USA) e seguindo instruções do fabricante as amostras de

sangue foram diluídas em solução salina tamponada de Hanks (HBSS) (Fisher Scientific - Bio

Whithakker - New Hampshire USA) , assentadas sobre um gradiente de Ficoll em tubo Falcon

de 50 mL (BD, Franklin Lakes, New Jersey USA) e centrifugadas por 25 minutos. As células

foram coletadas e novamente submetidas a uma centrifugação para lavagem em HBSS no

total de duas vezes. Posteriormente, as células foram contadas em câmara de Neubauer e

ressuspensas em meio X-VIVO 20 (Fisher Scientific -Bio Whithakker - New Hampshire

USA). Cerca de 3x10

células da PBMC foram plaqueadas em placas de cultura Corning de

60 mm (Corning Internacional. New York USA) e incubadas a 37°C com 0,05% CO

até o

momento da infecção.

Os Mφ foram obtidos usando o protocolo comercial RosetteSep, para “Human

Monocytes Enrichment Cocktail” (Steam Cell Technologies - Vancouver, BC Canada) e os

procedimentos de obtenção celular seguidos de acordo com instruções do fabricante. Em

resumo: para cada 2 ml da buffy-coat 100 µL de RosetteSep foi adicionado. O volume total

Materiais e Métodos 82

existente foi mantido a temperatura ambiente por 20 minutos em garrafas Corning de 500mL

(Corning International, New York USA) e centrifugados em gradiente de Ficoll- Ficoll-Paque

(Amershan, Pharmacia Biotech - Piscataway, NJ USA) por 25 minutos. O procedimento a

partir deste momento foi idêntico ao desenvolvido para obtenção de células da PBMC.

5.13 Estímulo micobacteriano e ELISA.

Experimentos celulares in vitro com cinética foram elaborados e as PBMCs e Mφ em

ausência ou em presença de micobactérias vivas, ou “single cells colonies”, numa razão de 0.1

CFUs, por monócito, foram infectadas com H37Rv ou diferentes construções

micobacterianas: 0.577 knockout do CFP32 (M. tb H37RvKocfp32), 0.577 Complemento do

gene CFP32 (M. tb H37RvKocfp32compl) (Richard C. Huard, comunicação pessoal) ou ainda

com 50µg/poço com proteínas do filtrado de cultura das proteínas do filtrado de cultura de

H37Rv selvagem (SN H37Rv WT) e proteína do filtrado de cultura do knockout CFP32 (SN

H37RvKocfp32). As culturas foram estimuladas entre 4 horas e 24 horas e os sobrenadantes

coletados e congelados para posterior avaliação. As células que foram coletadas após cultura,

foram centrifugadas e ressuspensas em 1 mL de reagente de T

RIzol® (Invitrogen, Life

technology - Carlsbad, CA USA.) e congeladas a -70°C para posterior utilização.

A detecção de IL-10 e IFNγ por ELISA no sobrenadante de cultura foi realizada

utilizando protocolo do próprio laboratório com anticorpo monoclonal humano produzido em

camundongo [Hu-mAb anti-mouse IL-10 e IFNγ, isotipo IgG

(Santa Cruz Biotechnology Inc.

Califórnia USA) de acordo com o descrito por Huard et al. (2003a). Em linhas gerais, 2 µg

de Hu-mAb anti-mouse (1:10

em salina de tampão fosfato [PBS], 50µL por poço) foi

adicionado em placas de 96 poços para ELISA (Corning International, New York USA) e

incubado “overnight” a 4°C. PBSt (PBS com 0.1% Tween 20) foi utilizado para lavar as

Materiais e Métodos 83

placas, no total de três vezes, e seguida de 2,5 horas de incubação com 100 µL de tampão de

bloqueio (PBS com 10% Soro Fetal Bovino [SFB]) por 1 hora à temperatura ambiente e

agitação seguida de lavagem quatro vezes com PBSt. Amostras duplicadas de cada

sobrenadante teste foram utilizadas para um volume de 50 µL por poço e foram então

incubadas por 2 horas com agitação lenta, à temperatura ambiente e subseqüentemente

lavadas três vezes em PBSt. O anticorpo secundário biotinilado humano (0,5 µg/mL, 100 µL

por poço) e conjugado com streptavidina-horseadish peroxidase (Amersham, Pharmacia

Biotech - Piscataway, NJ USA) foi adicionado à placa e incubado por 2 horas com agitação

lenta, à temperatura ambiente, e em seguida lavado três vezes em PBSt. O conjugado

extravidina-peroxidase (1:2 x 10

em PBS, 10 µl por poço) (Sigma-Aldrich St. Louis, MO

USA) foi então adicionado à placa sob agitação lenta por 30 minutos e subseqüentemente

lavado três vezes com PBSt. 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-Aldrich St. Louis,

MO USA) atuou como substrato cromogênico (100 µL por poço) e uma vez a cor azul tenha

sido suficientemente detectada a olho nu a reação foi interrompida utilizando 0,5 M H

(50µL) e a placa imediatamente submetida à leitura a 450 nm em leitor de ELISA – EL 340

Biokinetics Reader (BioTek Instruments Inc., Winooski, Vt. USA).

5.14 Isolamento do RNA total e síntese de DNA complementar.

RNA total extraído das células pulmonares e células restantes dos estudos in vitro

usando 0,5 ml de T

RIzol® Reagent (Invitrogen, Life technology - Carlsbad, CA, USA) foram

processados de acordo com instruções do fabricante e armazenadas a -70°C. A análise

espectofotométrica foi realizada a 260 nm para medição da pureza e concentração das

amostras de RNA. Em seguida, as amostras foram submetidas à eletroforese usando um gel

desnaturante para confirmação da integridade dos RNA estudados para validação dos dados

Materiais e Métodos 84

obtidos por espectrofotometria. Cerca de 1µg de material usando 50 nM de Oligo (dT)

18-20

(Invitrogen, Life technology - Carlsbad, CA USA) foi reversamente transcrito utilizando

SuperScrip

II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Life technology - Carlsbad, CA USA) de

acordo com instruções do fabricante e todas as amostras de DNAc foram levadas ao volume

de 100 µl em água estéril.

5.15 Iniciadores ou primers:

Todas as seqüências de “primers” foram desenhadas utilizando o programa Primer 3

software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi), respeitando algumas

exigências padrão como tamanho dos “primers” (18-20 pares de base (pb) com o máximo de

27 pb) e amplicom entre 100 e 500 bp. Todas as seqüências foram sintetizadas por Sigma-

Genosys (Sigma-Aldrich - St. Louis, MO USA.) e os produtos de amplificação 5’-3’ do PCR

resultante foram desenhados para regiões específicas de RNAm que amplifiquem no mínimo

uma junção exon-exon, prevenindo desta forma a amplificação de contaminantes de DNA

presentes nas amostras. Controles positivos e negativos para quantificação de DNAs por RT-

PCR foram também utilizados independentemente dos controles de reação da placas conforme

a Tabela 2.

Materiais e Métodos 85

Tabela 2. Primers utilizados nas análises por RT-PCR

Primer Sequences 5´-3´ PCR size Observations

GAPDH

For: GAGTCAACGGATTTGGTCGT

Rev: AAATGAGCCCCAGCCTTCT

316 bp Exon-Exon junction covered on both sides:

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 4º-5º exons

TNFα

For: CCCCCAGAGGGAAGAGTTC

Rev: GAGGGTTTGCTACAACATGG

119 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 3º-4º exons

IL-10

For: GAGAACAGCTGCACCCACTT

Rev: ACAGCGCCGTAGCCTCAG

300 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 4º-5º exons

IL-12 p35

For: ATGCTCCAGAAGGCCAGAC

Rev: TCTGGAATTTAGGCAACTCTCA

150 bp Exon-Exon Junction on one side

Forward: 2º-3º exons

Reverse: 4º exon

IFNγ

For: GCATCGTTTTGGGTTCTCTT

Rev: CAGTTACCGAATAATTAGTCAGCTTTT

336 bp Exon-Exon Junction on one side

Forward: 1º exon

Reverse: 3º-4º exons

TGFβRI

For: CGACGGCGTTACAGTGTTT

Rev: AAACCTGAGCCAGAACCTGA

487 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 3º-4º exons

TGFβRII

For: GCACGTTCAGAAGTCGGTTA

Rev: CGTCATTCTTTCTCCATACAGC

200 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 2º-3º exons

IL-1RN

For: GCCTTCAGAATCTGGGATGT

Rev: CAGCTGGAGTCTGGTCTCATC

207 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 3º-4º exons

Reverse: 5º-6º exons

CD80

For: CACCTCTCCTGGTTGGAAAA

Rev: AGCAGTAGGTCAGGCAGCAT

286 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 3º exon

Reverse: 4º-5º exons

SOCs3

For: GCCACCTACTGAACCCTCCT

Rev: ACGGTCTTCCGACAGAGATG

177 bp Only inside the Exon region

Forward: 1º exon

Reverse: 1º exon

SOCs1

For: AGAGCTTCGACTGCCTCTTC

Rev: AGGGGAAGGAGCTCAGGTAG

201 bp Only inside the Exon region

Forward: 1º exon

Reverse: 1º exon

TLR2

For: GTCTTGGGGGTCATCATCAG

Rev: TCCTGTTGTTGGACAGGTCA

163 bp Only inside the Exon region

Forward: 1º exon

Reverse: 1º exon

IRAK-3

For: GGCCTGGCAGAGAGACTTT

Rev: TGAATAGCTCGACGATGTCC

173 bp Exon-Exon Junction on one side

Forward :1-2 exons

Reverse: 2 exon

CD-86

For: CTGCTCTCTGGTGCTGCTC

Rev: CGGCCCATATACTTGGAATG

200 bp Exon-Exon Junction on one side

Forward :2-3 exons

Reverse: 3 exon

IL-12p40

For: CCTGGAGAAATGGTGGTCCT

Rev: GCTTAGAACCTCGCCTCCTT

171 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 2º-3º exons

NEMO

For: AAGGCCCAGGCGGATATCTA

Rev: ATCCTGGCCGACTCCTGAC

155 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 6º-7º exons

Reverse: 7º-8º exons

IDO

For: GCCAAATCCACAGGAAAATC

Rev: GGCAAGACCTTACGGACATC

237 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 3º-4º exons

IL-23p19

For: TGGGACACATGGATCTAAGAGA

Rev: TGCAAGCAGAACTGACTGTTG

121 bp Exon-Exon Junction covered on both sides

Forward: 1º-2º exons

Reverse: 2º-3º exons

DNA

sequence

For: GCCCCTCCCAGTTCTAGTTC

Rev: CTTCTGGGCCACTGACTGAT

170 bp

DNA sequence for TNFα promoter

Materiais e Métodos 86

5.16 Real time PCR

As reações de RT-PCR foram todas elaboradas com concentração 1x QuantiTect

SYBR® Green (Qiagen - Valencia, CA, USA.), 2.5 mM MgCl

2 µl of DNA complementar

(DNAc) alvo e 0,3 µM iniciadores “primer” de junção exon-exon (Tabela 2) e controles

específicos: gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenase (GADPH, positivo), o controle negativo

sem o “template” e o controle para contaminação de DNA (TNF-α intron primers). As

reações respeitaram ciclos de 95°C por 10 minutos (min) seguidos de 40 ciclos de 94°C por

45’, 62ºC por 45’, e 72°C por 90’, sendo todas realizadas em placas óticas de 384 poços

(Applied Biosystems - Foster City, CA USA) em sistema de sequenciamento ABI PRISM

7900 (Applied Biosystems - Foster City, CA USA). Para verificar se os “amplicons”

específicos do PCR quantitativo produzem um produto único de amplificação foi ainda

adicionado um protocolo de curva de dissociação ao final da reação de RT-PCR para algumas

amostras. Logo em seguida o “amplicon” foi carreado em um gel de agarose 1.5%, corado

com brometo de etídio (Figura 5) e posteriormente seqüenciado no centro de instalações

laboratoriais da Cornell University e o “BLAST database” das seqüências efetuado através do

endereço eletrônico (

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) confirmando a amplificação do

produto específico único para os genes alvo.

A quantificação relativa dos níveis de expressão gênica foram validadas utilizando a

curvas padrão seguindo o protocolo comercial QuantiFast

SYBR® PCR Handbook (Qiagen

- Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante como descritas nos itens

5.17 e 5.18).

Materiais e Métodos 87

Figura 5: Relação de Genes analisados por RT-PCR.

10 11

Parte Superior

1- 100pb Marcador DNA

2- GAPDH (316pb)

3- TNF-α (119pb)

4- IL-10 (300pb)

5- IFNγ (336pb)

6- IL-12p35 (150pb)

7- IL-12p40 (171pb)

8- TGFβ-RI (487pb)

9- TGFβ-RII (200pb)

10- IL-1Ra (207pb)

11- CD-80 (286pb)

Parte Inferior

1-100pb Marcador DNA

2- CD-86 (200pb)

3- SOCS1 (201pb)

4- SOCS3 (177pb)

5-TLR2 (163pb)

6- IRAK-M (173pb)

7- NEMO (155pb)

8- IDO (237pb)

9- IL-23p19 (121pb)

10-TNF-α promoter (170pb)

Amostra de DNA

11-TNF-α promoter - Amostra

de DNAc

Gel de agarose 1.5% TAE

100pb

600pb

100pb

600pb

5.17 Eficiência de quantificação dos genes alvo:

A amplificação por RT-PCR de cada diluição em série das amostras de DNAc

determinou que a diferença entre as curvas Slopes resultantes entre todos os iniciadores

utilizados foi >0,1. Sendo assim, foi utilizada a curva padrão, como sendo o método de

análise para quantificação relativa das amostras (Figura 6).

5.18 Curvas padrão:

As curvas padrão geradas para a quantificação relativa de cada “primer” foram

elaboradas utilizando amostra de DNAc referência de PBMC de doadores sadios e

estimuladas com PHA 10µg por 72 horas. Os DNAc foram diluídos serialmente 1:6 em água

trídestilada três vezes e submetidas ao RT-PCR com os “primers” específicos de amplificação

para cada molécula estudada. As curvas padrão foram plotadas com os valores de C

de cada

Materiais e Métodos 88

diluição seriada 1:6 obtidos versus o logarítimo de base 2 (Log

) do fator de diluição.

Figura 6: Curvas Padrão para determinação da eficiência de amplificação por RT-

PCR dos genes alvo.

IFN gamma

-202468

TLR2

-202468

IRAK-M

-202468

IL-12p40

-202468

NEMO

-202468

IDO

-202468

GAPDH

-2-1012345678

TGFB RI

01 23 45 67

TGFB RII

-2-1012345678

IL-1 Rn

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8

CD-80

-2-1012345678

SOCS3

-2-1012345678

SOCS1

-2-1012345678

Promoter TNF

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8

TNF alpha

-2-1012345678

IL-23

-2-10 12345678

IL-10

-2-10 12345678

CD86

-202468

IL-12p35

01234567

Mediadores Slope Intercept Mediadores Slope Intercept

GAPDH -1.008704751 25.619454 SOCS3 -1.041 28.409

TNF -0.950 34.376 SOCS1 -1.031 30.889

IL-10 -1.042 30.705 TLR2 -0.836136436 29.212397

IL-12p35 -0.874 36.004 IRAK-M -0.877208018 29.439171

IFN -0.787 31.598 CD86 -1.065766133 36.884214

TGFβ-RI -0.934 38.653 IL-12p40 -0.837772832 28.651085

TGFβ-RII -1.008 37.034 NEMO -0.959124822 28.783171

IL-1-Rn -0.894 27.395 IDO -0.900706313 30.79896

CD80 -1.087 40.023 TNFα promoter -0.951165699 26.472

Desta forma obtivemos os valores dos Slopes e Interceps por ponto de diluição para a

geração da curva padrão em si (Figura 6). Em seguida, foram estabelecidas as eficiências de

amplificação dos “primers” pela diferença entre os Slopes das curvas dos genes estudados e

Materiais e Métodos 89

pudemos confirmar visualmente que a diferença entre as curvas Slopes resultantes entre todos

os iniciadores utilizados foi >0,1. As fórmulas utilizadas para derivação dos valores

quantitativos e números de cópias relativas para cada gene em estudo estão de acordo com as

instruções do fabricante. A quantificação relativa final dos níveis de expressão gênica foi

validada utilizando a equação linear na qual:

y = mx +b m = Slope

x = Ct individual

b= intercept

A derivação do número de cópias de GAPDH foi utilizada como gene referência e a

seguinte formula foi utilizada para cálculo da expressão do gene alvo:

Expressão final = [anti-log

y (gene alvo)/anti-log y

(GADPH)]

Todos os cálculos foram gerados utilizando Microsoft Excell, e as figuras foram

geradas e compiladas em GraphPad Prism version 4.03 (GraphPad Software Inc. – San Diego,

CA USA.).

5.19 Análise estatística:

As análises estatísticas empregadas neste estudo foram realizadas no programa

estatístico GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software Inc. – San Diego, CA USA).

Teste de Kruskal-Wallis e correção pós-teste de Dunn foram aplicados para avaliação

de variáveis contínuas e teste exato de Fisher para variáveis categóricas nos três grupos de

comparação e estes critérios foram usados para geração da Figura 7 e Tabela 5. O teste de

Wilcoxon foi utilizado para a comparação e duração dos sintomas entre pacientes TB e OLD

(Tabela 3). Para a Figura 8 os mediadores em que os valores foram segregados como ≤

0.00001; ou > 0.00001 como detecção mínima do RT-PCR foi feita análise pelo teste de

Fischer, representados como *P.

Materiais e Métodos 90

Para comparar as diferenças dos valores das medianas na Figura 9 e Tabela 5 três

diferentes métodos foram empregados na avaliação de variáveis contínuas, análise de

variância (ANOVA), Equação das Estimativas Generalizadas (GEE) e os modelos mistos.

Esta abordagem foi utilizada devido ao fato de não haver método estatístico capaz de avaliar a

informação longitudinal dos nossos dados.

Resultados 91

6.0 Resultados

6.1 Dados demográficos clínicos e laboratoriais

No período de março de 1998 a março de 2001 foram submetidos a indução de escarro

172 pessoas que se apresentaram aos ambulatórios do serviço de Pneumologia do HUCFF

com os sinais e sintomas sugestivos de tuberculose, descritos anteriormente. Destas, 69

apresentaram confirmação diagnóstica por métodos bacteriológicos ou foram submetidas a

tratamento quimioterápico anti-tuberculose baseado em critérios clínico-radiológicos

empíricos. Vinte e dois casos foram excluídos do estudo por terem diagnóstico prévio de

soropositividade ao HIV. Dezessete pacientes foram convidados a participar do estudo, mas

se recusaram a assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e não foram

incluídos. Trinta indivíduos portadores de tuberculose aceitaram participar e foram incluídos

no estudo longitudinal, após assinarem o TCLE. Destes, quatro (pacientes códigos 12, 13, 14,

e 23) foram mantidos no presente estudo mesmo após ter-se determinado soropositividade

para o HIV após a sua inclusão. Como houve uma certa demora na constatação da

positividade destes indivíduos, nenhum dos pacientes HIV/AIDS positivos foi tratado com

anti-retrovirais no momento do diagnóstico ou na fase primária do tratamento anti-TB. O

paciente (código número 14, HIV+) apresentou contagem de linfócitos de 32% (2464) dos

leucócitos e as células T CD4 representam 14% (344µL

-1

) e CD4/CD8 =0,2 do total de

linfócitos após seis meses após o final do tratamento anti-TB. Já o paciente (código número

12, HIV+) apresentou contagem total de linfócitos de 43% (3.723) dos leucócitos e as células

T CD4 representam 19% (707µL

-1

) (CD4/CD8= 0,3) e ainda episódio de recidiva confirmado

após seis anos do final do tratamento.

Constitui-se então o objeto do presente trabalho 30 portadores de tuberculose que

completaram o protocolo de estudo e apresentaram material broncopulmonar à indução de

escarro nos pontos pré-determinados. Em agosto de 2005, todos os 30 indivíduos foram

Resultados 92

contatados pela equipe de estudo, sendo que 22 foram encontrados e responderam a novo

questionário, visando determinar que tipos de eventos sanitários eles apresentaram neste

período de evolução após o tratamento para tuberculose. Destes, seis apresentaram um

segundo episódio de tuberculose, sendo que desses, três apresentavam história de tuberculose

no passado, um desses, teve um outro episódio após o fim do acompanhamento de 180 dias do

protocolo. O tempo médio de seguimento foi de 69,8 ± 1,3 meses.

O grupo de pacientes com outras pneumopatias (OLD) e voluntários (HCW) foram

arrolados no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF) nos mesmo período

inicial do estudo, preencheram o TCLE, aceitaram participar do estudo e foram

diagnosticados pela rotina clínica do HUCFF.

A Tabela 3 apresenta as características demográficas e clínicas da casuística no

momento de diagnóstico (T0). Os portadores de tuberculose apresentaram uma idade média

de 34,7 ± 11.1 (p<0,0001). Uma proporção maior de homens (67%) foi detectada entre

pacientes com TB ativa, similar à média nacional no Brasil descrita pela Secretaria de

Vigilância Sanitária em 2005. No grupo de pacientes com outras pneumopatias detectamos

proporções de homens de 46%, com idade média de 57,1 ± 4,7 e duração dos sintomas 5,2 ±

1,9 semanas. Já nos voluntários a idade média foi de 24,4 ± 1,3 com equilíbrio na distribuição

dos sexos na população analisada.

Neste estudo, não foram observados fumantes no grupo de voluntários (HCW), no

entanto uma grande proporção de casos de TB era tabagista, se comparado aos grupos

controles de pacientes com OLD (p<0,0001). Cerca de 36,7% dos pacientes com tuberculose

apresentavam lesão radiológica confinada em menos de um lobo pulmonar, enquanto 63,3%

tinham lesão radiológica extensa, configurada pela ocupação de mais de um lobo. Uma grande

proporção (56,7%) tinha lesão não-cavitária ao RX de tórax. Vinte um (≅2/3) dos portadores

de tuberculose apresentaram pesquisa de bacilos álcool-ácido resistente no escarro positiva e

Resultados 93

28/30 apresentaram cultura para Mycobacterium tuberculosis positiva na cultura do escarro

em meio de Löwenstein-Jensen, sendo que dois indivíduos com sintomatologia e achados

radiológicos compatíveis com tuberculose foram tratados e acompanhados baseados em

diagnóstico empírico da doença, porque tanto o exame direto do escarro quanto a cultura em

meio sólido para Mycobacterium tuberculosis foram negativas (critério clínico-radiológico de

diagnóstico da tuberculose).

A contagem diferencial dos citocentrifugados no momento do diagnóstico demonstrou

prevalência dos macrófagos como células majoritárias no EI. As diferenças entre pacientes

com TB e OLD ou HCW não foram estatisticamente significantes, entretanto os pacientes

com TB apresentaram uma percentagem um pouco maior de macrófagos se comparados a

OLD. Uma baixa percentagem de neutrófilos foram detectadas nos pacientes com OLD ou

HCW. Eosinófilos e linfócitos foram similarmente baixos em todos os três grupos estudados.

Resultados 94

Tabela 3. Dados demográficos, clínicos e laboratoriais de todos os indivíduos envolvidos

no estudo no momento do diagnóstico

Características Clínicas TB (n=30) OLD (n=11) HCW

(n=16)

Valor de P

Idade em anos, mediana

(media ±SD)

(34,7 ± 11,1)

(57,1 ± 15,6)

(24,4 ± 5,1)

<0,0001

Homens ( %)

67 46 50 0,36

Fumantes (%)

46,7 18,2 0 <0,0001

Envolvimento pulmonar:

< 1 lobo (%)

≥ 1 lobo (%)

36,7

63,3

81,8

18,2

0,015

Cavitação (%)

56,7 0 NA <0,001

Baciloscopia Positiva BAAR

(%)

70 0 NA <0,0001

Cultura Micobacteriana

Positiva (%)

83,3

<0,0001

BAAR e/ ou Cultura

Mycobacteriana Positiva %

93,3

<0,0001

Duração dos sintomas,

semanas, mediana (média

±SD)

(10,5 ± 7,0)

(5,2 ± 6,4)

0,25

Escarro Induzido células x 10

/ml (media ±SD):

Total

7,32 ± 15,7 3,33 ± 5,4 1,43 ± 1,3 0,22

Macrófagos

3,71 ± 6,6 2,19 ± 4,9 0,95 ± 0,98 0,052

Linfócitos

0,02 ± 0,08 0,005 ± 0,014 0,017 ± 0,04 0,004

Neutrófilos

3,51 ± 9,15 0,94 ± 1,85 0,44 ± 0,5 0,63

Eosinófilos

0,05 ± 0,19 0,017 ± 0,027 0,003 ±

0,005

0,19

Células Epiteliais

0,05 ± 0,08 0,01 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,21

TB clínica (n=2) foi definida por presença de clínica compatível e parâmetros radiológicos e sua

resolução após o tratamento anti-TB, entretanto os demais casos de TB foram diagnosticados por

baciloscopia e/ou cultura micobacteriana. Todos os pacientes com outras pneumopatias (OLD) tiveram

baciloscopia ou cultura micobacteriana negativa e foram diagnosticados como apresentando infecção

inespecífica do trato respiratório (n=9) por definição radiológica e/ou resposta ao tratamento com

antibióticos não-quinolônicos; um indivíduo apresentou pneumopatia por Paracoccidioides

brasiliensis e 01 paciente tinha câncer pulmonar. Profissionais do HUCFF e estudantes de medicina

foram voluntários (HCW). Todos indivíduos foram arrolados após assinatura do termo de

consentimento. Para comparação estatística foram utilizados: Kruskal-Wallis (três grupos) ou teste de

Wilcoxon para variáveis contínuas e teste exato de Fisher para varáveis categóricas. Abreviaturas: NA,

não aplicado; SD, desvio padrão.

Resultados 95

6.2 Expressão de mediadores imunológicos em células pulmonares no

momento do diagnóstico

A expressão dos mediadores imunológicos nas células obtidas do escarro induzido dos

pacientes com TB ativa diagnosticados (TB), pacientes com outras pneumopatias (OLD) e

voluntários saudáveis (HCW) foram avaliados por RT-PCR após transcrição reversa do

RNAm. A quantificação relativa do produto de PCR foi gerado via curva padrão e

normalizado pela expressão de gene constitutivo GAPDH como referência antes do início do

tratamento anti-tuberculose (T0). A Figura 7 ilustra os resultados antes do inicio do

tratamento anti-TB, em três painéis, nos quais os mediadores são agrupados como inibidores

da resposta Th1 (painel A: IL-10, TGFβ RI, TGFβ RII, IRAK-M, SOCS1, SOCS3, IL-1Rn e

IDO), indutores da resposta Th1 (painel B: IFN-γ, IL-12p35, IL-12p40, IL-23p19, TNFα e

NEMO) e fatores que promovem efeitos variáveis na resposta imunológica em células Th1 e

Th2 (painel C: CD80, CD86 and TLR2). No total dos dezessete (17) mediadores ilustrados,

treze (13) deles apresentaram significância estatística nos pacientes com TB quando

comparados a pacientes OLD e HCW (representados por **); e 14 na comparação TB versus

HCW (TGFβ-RI). Quatro dos mediadores avaliados (TNFα, IL-23p19, TGFβ-RI e a molécula

co-estimulatória CD80) apresentaram expressões muito similares nos pacientes com TB ativa

e controles OLD e HCW (p≤ 0.05, Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn ou teste

exato de Fisher). A expressão de RNAm dos mediadores foi segregada como negativa

arbitrariamente (≤ 0.001; ou positivos > 0.001) para minimizar as variações dos achados

descritos nas Figuras, em função da não representação da expressão do zero na escala

logarítmica.

Nos portadores de TB houve expressão significativa de altos níveis dos mediadores

com atividade anti-inflamatórias e/ou mediadores que podem subverter a resposta imune Th1

(IL-10, TGFβ-RII, IRAK-M, IL-1Rn, SOCS1, SOCS3 e IDO), quando comparados aos

Resultados 96

grupos controles (pacientes OLD e HCW) de acordo com a Figura 7A. Nos pacientes com

TB foi possível também detectar a alta expressão de mediadores indutores da resposta Th1

como IL-12p35, IL-12p40, NEMO e em destaque a alta de IFNγ, quando comparados aos

grupos controles (Figura 7B).

Resultados 97

Figura 7. Avaliação da expressão dos mediadores imunológicos pulmonares em

pacientes com TB ativa, outras pneumopatias (OLD) e voluntários saudáveis (HCW)

antes do início do tratamento anti-TB

IFN

0.1

100

1000

HCW

OLD

P<0.05

P<0.01

p35**

HCW

OLD

P=0.0006

P<0.01

p40**

0.01

0.1

100

1000

10000

100000

HCW

OLD

P<0.05

P=0.0009

p19

0.00001

0.0001

0.001

0.01

0.1

HCW

OLD

TNF

100

1000

HCW

OLD

NEMO**

0.1

100

1000

10000

100000

1000000

HCW

OLD



P=0.0006



P<0.0001

0.1

100

HCW

OLD

86**

HCW

OLD

P=0.02

TLR2**

0.1

100

1000

HCW

OLD



P<0.003

P<0.01

10**

0.001

0.01

0.1

100

1000

10000

HCW

OLD



P<0.02

P<0.01

TGF

100

1000

10000

HCW

OLD

P<0.01

HCW

OLD

P<0.05

P<0.001

IRAK

M**

0.01

0.1

100

1000

HCW

OLD

P<0.05

P<0.001

SOCS1**

HCW

OLD

P<0.01

P<0.001

SOCS3**

0.1

100

1000

HCW

OLD

P<0.001

IL1

Rn**

HCW

OLD

P=0.05

P<0.001

IDO**

0.01

0.1

100

1000

10000

100000

HCW

OLD



P=0.002

P<0.001

TGF

RII**



100

1000

10000

0.01

0.1

100

1000

10000

0.01

0.1

100

1000

10000

100000

1000000

0.01

0.1

100

Número de Cópias do Gene Relativos a GAPDH

Expressão dos níveis de RNAm, em escala de Log

representada pelo número de cópias dos genes

relativos ao gene referência GAPDH em células pulmonares de pacientes com TB, outras

pneumopatias (OLD) e voluntários saudáveis (HCW). A quantificação relativa de cada produto foi

realizada através de método utilizando a curva padrão de análise. Fig 7A. Expressão dos mediadores

de inibição da resposta imunológica Th1. Fig 7B. Mediadores que promovem a resposta imune Th1.

Fig 7C. Fatores que promovem efeitos variáveis na resposta imunológica em células Th1 e Th2. O

símbolo representa o resultado de cada indivíduo e os símbolos em vermelho representam pacientes

co-infectados pelo HIV-1. Os símbolos (**) sobre os mediadores indicam significância estatística

entre os casos de TB e OLD e HCW (Kruskal-Wallis e pós teste de Dunn ou *Teste exato de Fisher).

Os valores de p para comparação dos grupos estão abaixo do eixo horizontal.

Resultados 98

6.3 Expressão de mediadores imunológicos em células pulmonares de

portadores de TB ao longo do tratamento

Em seguida, avaliamos a expressão dos mediadores pulmonares no momento do

diagnóstico e em resposta ao tratamento anti-TB como ilustrado na Figura 8. Observamos

uma ampla variação dos níveis relativos dos mediadores estudados, que parecem segregar em

dois ou três padrões de expressão. Se considerarmos a mediana de expressão destas moléculas

no decorrer da terapia anti-TB, aparentemente há uma tendência de diminuição de alguns

fatores, como pode ser observada visualmente para TGFβ-RII, SOCS3, IL-1Rn e IDO.

Detectamos ainda que outros mediadores apresentam uma tendência ao aumento como IL-

12p35 e IL-12p40 enquanto que outros apresentam uma tendência de expressão inalterada

como IL-10, IRAK-M, IL-23p19, SOCS1. Pudemos confirmar na Figura 8 a presença

indicativa de clusters de expressão de dois mediadores, alta e baixa expressão, IDO e NEMO,

que foram inicialmente detectadas antes do início do tratamento nos pacientes com TB ativa, e

apresentam as mesma tendências ao longo e ao final da terapia anti-TB. Paralelamente, os

pacientes com tuberculose ativa / HIV positivos (pontos vermelhos) destacam-se por

apresentarem uma expressão dos mediadores imunológicos variável ao longo de todo

tratamento específico anti-TB.

Resultados 99

Figura 8. Avaliação dos mediadores imunológicos pulmonares no momento do

diagnóstico (0) e durante o tratamento anti-TB (15, 30, 60 e 180 dias)

SOCS1

0 15 30 60 180

0.01

0.1

100

1000

10000

100000

Tratamento anti-TB (dias)

SOCS3

0 15 30 60 180

0.01

0.1

100

1000

10000

100000

IL1-Rn

0 15 30 60 180

0.1

100

IRAK-M

0 15 30 60 180

0.01

0.1

100

1000

IDO

0 15 30 60 180

0.001

0.01

0.1

100

1000

10000

IL-10

0 15 30 60 180

0.001

0.01

0.1

100

TGF

-RI

0 15 30 60 180

0.1

100

1000

0 15 30 60 180

0.1

100

1000

TGF

-RII

IL-12-p35

0 15 30 60 180

100

1000

10000

100000

1000000

IFNγ

0 15 30 60 180

0.1

100

1000

10000

TNF

0 15 30 60 180

100

1000

IL-12-p40

0 15 30 60 180

0.01

100

10000

1000000

1.0×10

NEMO

0 15 30 60 180

0.01

0.1

100

1000

10000

100000

1000000

IL-23p19

0 15 30 60 180

0.00001

0.0001

0.001

0.01

0.1

CD80

0 15 30 60 180

0.01

0.1

100

1000

Tratamento anti-TB (dias)

CD-86

0 15 30 60 180

0.001

0.01

0.1

100

1000

TLR2

0 15 30 60 180

0.1

100

1000

10000

Número de Cópias do Gene Relativos a GAPDH

Tratamento anti-TB (dias) Tratamento anti-TB (dias)

Tratamento anti-TB (dias)

A expressão das células pulmonares dos pacientes com TB ativa foi quantificado por RT-PCR no

momento do diagnóstico (dia 0) e durante o tratamento anti-TB (15, 30, 60 e 180 dias). Estes achados

foram segregados como mediadores que inibem a resposta imune Th1 (A), promovem a imunidade

Th1 (B) ou são fatores que promovem efeitos variáveis na resposta imunológica em células Th1 e Th2

(C). Os casos de TB co-infectados por HIV ( ) são indistinguíveis dos pacientes com TB ativa ao

longo do tratamento. As barras transversais representam a mediana de expressão dos pacientes

avaliados.

Resultados 100

6.4 Evolução temporal dos mediadores imunológicos expressos por células

pulmonares de portadores de TB corrigidos pela expressão inicial (tempo zero)

Para avaliar a tendência temporal destes mediadores, dividimos o número de cópias de

cada gene de cada paciente portador de TB nos tempos 15, 30, 60, 180 dias de tratamento

anti-TB pelos valores obtidos no dia zero, antes do tratamento. Após a transformação, foram

calculadas as medianas para cada mediador, em cada tempo. Três padrões emergiram no

tempo de 15 dias: mediadores que sofreram decréscimo igual ou superior a duas vezes a

expressão inicial (Figura 9A); mediadores que variaram menos de duas vezes a expressão

inicial (Figura 9B); medidores que sofreram acréscimo igual ou superior a duas vezes a

expressão inicial (Figura 9C). A aplicação da diferença de variação em vezes dos genes está

de acordo com a convenção usada para microarranjos, que presume que a diferença de duas

vezes na expressão gênica apresenta impacto biológico (Chaussabel et al. 2003). Alguns

mediadores que são inibidores das imunidade tipo Th1 declinaram ≥ 2 vezes (TGFβ-RII,

SOCS3, IL-1Rn e IDO) outros apresentaram variação < 2 vezes a expressão inicial (IL-10,

SOCS1 ou IRAK-M) sendo que destes IL-10 e IRAK-M apresentaram as maiores tendências

decrescentes. Em contraste, os mediadores que promovem imunidade Th1 majoritariamente

apresentaram aumento ≥ 2 vezes (Figura 9C) durante o tratamento anti-TB (IFNγ, IL-12p40,

IL-12p35, NEMO e TLR2).

Resultados 101

Figura 9. Variações da expressão de RNAm dos mediadores imunológicos nos

pacientes com TB ativa durante o tratamento anti-TB

0 15 30 60 180

-1000

-500

-7

-5

-3

-1

0 15 30 60 180

-3

-1

0 15 30 60 180

Tratamento

anti

TB (

dias

)

Varia

ão

Expressão

RNAm

SOCs3

1Rn

IDO

TGF

RII

TNF

SOCs1

IRAK

CD80

CD86

23p19

TGF

NEMO

IFN

p35

TLR2

p40

A variação em vezes descrita para cada mediador imunológico foi baseada na mediana de expressão de

cada gene durante o período de tratamento anti-TB (15, 30, 60 e 180) comparada ao tempo zero (0)

dos portadores de TB. Os resultados foram separados em três painéis, de acordo com as tendências

observadas aos 15 dias de tratamento anti-TB (T15); declínio da expressão ≥ 2-vezes em relação ‘a

vista no momento do diagnostico (A), alteração <2-vezes (B), ou aumento ≥ 2-vezes (C). Dados

iniciais de grupamento determinados por Kruskal-Wallis e pós teste de Dunn’s.

Resultados 102

6.5 Análise estatística dos mediadores imunológicos em TB ao longo do

tratamento comparada à expressão inicial em OLD e HCW

Realizamos em seguida a comparação estatística entre os grupos representados na

Figura 9 como A (decréscimo em T15 igual ou superior a duas vezes a expressão gênica

inicial), B (variações menor de duas vezes a expressão gênica inicial), C (aumento superior a

duas vezes a expressão gênica inicial) A Tabela 4 descreve os resultados da análise utilizando

o teste ANOVA (Tabela 4A), GEE (Tabela 4B), e o teste de Modelos Mistos (Tabela 4C).

Observamos que a comparação entre grupos (p<0.05), sem modelagem de ajuste de curva ou

slope, demonstra existirem grupos distintos na expressão destes mediadores imunológicos em

paciente com TB, podendo ser segregados e agrupados de acordo com o seu nível de

expressão ao longo do tratamento anti–TB como inicialmente descrito na Figura 9.

Resultados 103

Tabela 4. Comparação dos grupos L, M e H dos mediadores imunológicos por múltiplos

testes estatísticos

A. Comparação múltipla dos grupos L, M e H dos mediadores imunológicos através da

media de expressão utilizando teste ANOVA multivariado.

Parâmetro Estimativa Erro Padrão Valor de t Pr >valor de T

L vs M

0.88832913 0.42602430 2.09

0.0402

H vs M

1.18463673 0.40619824 2.92

0.0046

H vs L

2.07296586 0.42602430 4.87

<.0001

B. Comparação múltipla dos grupos L, M e H dos mediadores imunológicos através da

media de expressão utilizando teste GEE.

Parâmetro Estimativa Erro

Padrão

Alfa Confidência Limites Qui-

Quadrado

Pr > Qui-

Quadrado

L vs M

0.8883291 0.5109 0.05 -0.1130 1.8896 3.02

0.0821

H vs M

1.1846367 0.4832 0.05 0.2376 2.1316 6.01

0.0142

H vs L

2.0729658 0.5603 0.05 0.9748 3.1711 13.69

0.0002

C: Comparação múltipla dos grupos L, M e H dos mediadores imunológicos através da

media de expressão utilizando teste Modelos Mistos (Mixed Models).

Parâmetro Estimativa Erro Padrão DF T value Pr > valor de T

L vs M

0.8883291 0.5109 14 2.09

0.05

H vs M

1.1846367 0.4832 14 2.92

0.01

H vs L

2.0729658 0.5603 14 4.87

0.0002

Foram utilizados os testes ANOVA, GEE e Modelos Mistos para avaliação dos estudos longitudinais

aonde estatisticamente p

≤

0.05 representa a distinção dos grupos de expressão. Altos produtores (H)

(IL-12-p40; 'TLR2; TGFβRI; NEMO; IFNγ; IL-12p35 – Grupo representativo da Figura 9C),

Médios produtores (M) ('SOCS1; IL-23; CD80; CD86; IL10; IRAK-M – Grupo representativo da

Figura 9B) e Baixos produtores (L) (TGFβ-RII; TNFα; SOCS3; IL-1Rn; IDO – Grupo

representativo da Figura 9A).

Resultados 104

6.6 Comparação dos mediadores expressos em casos de TB durante o

tratamento com a expressão inicial em OLD e HCW

Para investigar se o tratamento anti-TB estava associado com a normalização dos

mediadores pulmonares, os valores quantificados de cada mediador relativos a GAPDH,

testados para os casos de TB durante o tratamento nos tempos de 15, 30, 60, 180 dias (Figura

8), foram comparados com o grupos controle (HCW e OLD Figura 7). Dos quatorze (14)

mediadores que apresentaram resultados estatisticamente significantes no momento do

diagnóstico, comparados com HCW (Figura 7), seis (TGFβ-RI, TGFβ-RII, IL-1Rn, IDO,

CD86, IL-10) demonstraram um declínio sustentado em resposta às drogas anti-TB para os

níveis similares aos dos HCW. Os oito mediadores restantes (SOCS3, SOCS1, IRAK-M, IL-

12p35, IL-12p40 TLR2, NEMO, IFNγ) não normalizaram quando comparados a HCW e aos

pacientes com OLD. Particularmente, SOCS3 apresenta declínio sustentável somente após 30

dias de tratamento anti-TB. Cinco dos sete mediadores (IL-12p35, IL-12p40, TLR2, NEMO e

IFNγ) que promovem a imunidade tipo Th1 aumentam em duas vezes na resposta ao

tratamento anti-TB (Figura 9) e sustentam níveis significativos durante todo o tratamento

quando comparado aos pacientes com OLD e HCW (Tabela 3). Contudo, os dois mediadores

restantes, SOCS1 e IRAK-M, importantes na subversão da ativação de macrófagos, mantêm-

se persistentemente elevados frente ao tratamento anti-TB e foram significativamente maiores

em OLD e HCW, inclusive mostrando-se presentes até o final do tratamento (Tabela 5).

Resultados 105

Tabela 5. Comparação dos mediadores expressos em casos de TB durante o tratamento anti-TB com a expressão em controles saudáveis

HCW e portadores de outras pneumopatias OLD.

Mediadores Número de Cópias normalizados por GAPDH durante os Dias de Tratamento Anti-TB

15 dias 30 dias 60 dias 180 dias

Diminuição > 2-vezes

TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value

TGF

-RII 5.240 1.000 1.000 ns 4.790 1.000 1.000 Ns 3.370 1.000 1.000 ns 7.110 1.000 1.000 ns

TNF-α 4.950 1.000 12.60 ns 7.205 1.000 12.60 Ns 3.455 1.000 12.60 ns 7.825 1.000 12.60 ns

SOCs3 4.535 0.10 0.10

0.0011

3.925 0.10 0.10

0.0011

4.815 0.10 0.10 ns 3.055 0.10 0.10 ns

IL-1Rn 0.9400 0.6400 0.0100 ns 1.410 0.6400 0.0100 Ns 0.8400 0.6400 0.0100 ns 0.9750 0.6400 0.0100 ns

IDO 0.18 0.01 0.01 ns 0.155 0.01 0.01 Ns 0.055 0.01 0.01 ns 0.075 0.01 0.01 ns

15 dias 30 dias 60 dias 180 dias

Alteração < 2-vezes

TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value

SOCS1 85.09 0.1000 1.222

0.0001

36.08 0.10 1.222

0.000

86.95 0.1000 1.222

0.0001

41.58 0.10 1.222

0.0003

IL-23

19 0.0089 0.01 0.0001 ns 0.0023 0.0100 0.0001 Ns 0.0023 0.0100 0.0001 ns 0.0012 0.0100 0.0001 ns

CD80 0.10 0.10 0.10 ns 0.69 0.10 0.10 Ns 0.10 0.10 0.10 ns 0.875 0.10 0.10 ns

CD86 0.39 3.63 0.6178 ns 0.4857 3.630 0.6178 Ns 0.1600 3.630 0.6178 ns 1.110 3.630 0.6178 ns

IL-10 0.0400 0.0010 0.0010 ns 0.0600 0.0010 0.0010 Ns 0.0500 0.0010 0.0010 ns 0.0600 0.0010 0.0010

0.022*

IRA

-M 0.6700 0.0100 0.0100

0.002

0.7700 0.0100 0.0100

0.0002

0.3750 0.0100 0.0100

0.0009

0.6350 0.0100 0.0100

0.0005

15 dias 30 dias 60 dias 180 dias

Aumento < 2-vezes

TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value TB OLD HCW P value

IL-12

40 3223 0.170 49.76

0.0006

2754 0.170 49.76

0.000

1409 0.1700 49.76 ns 2704 0.1700 49.76

0.0003

TLR2 23.56 0.6600 0.10

0.0006

17.87 0.6600 0.1000

0.0003

19.72 0.6600 0.1000

0.001

28.08 0.6600 0.1000

0.0002

TGF

RI 6.005 1.000 1.000 ns 1.000 1.000 1.000 Ns 1.000 1.000 1.000 ns 1.000 1.000 1.000 ns

NEMO 8.620 0.5200 0.6061

0.005*

2.720 0.5200 0.6061

0.002*

1.585 0.5200 0.6061

0.002*

2.395 0.5200 0.6061

0.001*

IFN

2.530 0.1000 0.1000

0.0003

0.1000 0.1000 0.1000

0.001

0.1000 0.1000 0.1000 ns 1.070 0.1000 0.1000

0.001

IL-12

4097 9.730 85.55 0.006* 3062 9.730 85.55 0.003* 1765 9.730 85.55 0.003* 1523 9.730 85.55 0.002*

Resultados

106

Para validar que o tratamento normalizou a expressão dos mediadores imunológicos para o nível dos

controles. O número de cópias dos mediadores é relativa à expressão constitutiva de GAPDH

registrada durante o tratamento (15, 30, 60, 180 dias) dos casos de TB (ilustrado na Figura 8) foram

comparadas aos valores do grupo controle HCW e OLD (apresentados na Figura 7), utilizando-se os

testes de Kruskal-Wallis com correção pelo teste de Dunn e o teste exato de Fisher [*]. A tabela

mostra as medianas das cópias gênicas relativas a GAPDH para cada grupo e para cada mediador

(expressas nas Figuras 7 e 8 como barras longitudinais). Para comparação associada com a Figura 9,

os mediadores foram agrupados em três grupos (decréscimo ≥ 2 vezes, variação estável < 2 vezes,

aumento ≥ 2 vezes). Em resposta ao tratamento anti-TB, a maioria dos mediadores pulmonares em

casos de TB retornaram a níveis semelhantes aos quantificados para pacientes com outras

pneumopatias (OLD) e voluntários saudáveis (HCW). Os mediadores indicam significância estatística,

p<0.05, entre os casos de TB e OLD e HCW (Kruskal-Wallis e pós teste de Dunn ou *Teste exato de

Fisher).

Resultados

107

6.7 Correlação da expressão gênica com características clínicas em

portadores de TB

Analisamos as correlações associadas destes mediadores com o estado clínico ou a

incidência de segundo episódio de TB. A Tabela 6 apresenta alguns dos mediadores

associados com as característica clínicas. Foi observado que em pacientes com TB ativa

houve uma associação (Wilcoxon, P < 0.05) da presença de cavitação com altos níveis de IL-

23 e IRAK-M. A disseminação da doença para mais de um lobo estava ligada a altos níveis de

SOCS3, enquanto que a incidência de um segundo episódio de TB ativa estava associada a

baixos níveis de NEMO e altos níveis de CD80.

Tabela 6: Aspectos clínicos e a correlação com os mediadores imunológicos em pacientes

com TB ativa

Características Clínicas Mediador Nível médio

(Sim versus Não)

Tratamento

Dia

Valor de P

Cavitação

IL-23 (36.2 ; 24.9) 15 até 180

0.047

IL-23 (36.7 ; 20.5) 180

0.016

IRAK-M (7.8 ; 0.97) 15

0.02

Doença em mais de um lobo

SOCS3 (226.3 ; 44.4) 60

0.023

Segundo episódio de TB

CD80 (0.82 ; 0.11) 60

0.011

NEMO (1746 ; 5904) 30

0.048

No estudo de manifestação clínica ou desfecho do tratamento, vinte (20) dos trinta (30) pacientes e/ou

suas famílias foram localizados ≥ 4 anos após o final do tratamento. Dos vinte pacientes, cinco (5)

apresentaram um segundo episódio dos dois anos de pós-tratamento anti-TB. Estas informações foram

obtidas através dos prontuários médicos e entrevistas com os pacientes. A avaliação clínica foi

realizada por clínicos sem o conhecimento dos níveis dos mediadores e a análise estatística foi

efetuada por teste de Wilcoxon, p<0.05. Os valores de Nível médio representam as médias de

expressão baseado nos valores de Ct das amostras entre os pacientes analisados.

Resultados

108

6.8 Expressão de mediadores imunológicos em células do sangue periférico

(PBMC) estimuladas “in vitro” por antígenos de Mycobacterium tuberculosis

Na tentativa de confirmar a indução de alguns mediadores imunológicos na resposta

imune celular por componentes do M. tb, realizamos estudos com modelos in vitro, utilizando

os mediadores imunológicos descritos anteriormente. Avaliamos a sua expressão por RT-PCR

em PBMCs humanas estimuladas por M. tb e por uma proteínas do filtrado de cultura, o

CFP32, já descrito em nosso grupo por Huard et al. (2003a). A Figura 10 representa a

expressão de RNAm de mediadores imunológicos em monócitos infectados in vitro por M.

tb H37Rv. Nossos resultados demonstraram que o M. tuberculosis H37Rv (Wild type)

promove aumento da expressão de SOCS1, SOCS3, TGFβ-RII e TLR2, um leve aumento de

IRAK-M e IL-10, bem como da expressão de TNFα, IL-12p35, IL-12p40 e NEMO em

monócitos humanos cultivados in vitro. Em contraste, nos monócitos infectados com M. tb

mutante sem CFP32 (H37Rv KoCFP32) nota-se uma redução dos níveis de expressão,

similares aos observados nos monócitos não infectados. Surpreendentemente, monócitos

estimulados com o sobrenadante de cultura (SN) de M. tb, mas não os do H37Rv KoCFP32,

são capazes de induzir a expressão de mediadores supressores da resposta imune Th1 como

SOCS1, SOCS3, TGFβ-RII, TLR2, IL-10, IRAK-M e ainda TNFα, mas não a expressão de

IL-12p35, IL-12p40 e NEMO.

Resultados

109

Figura 10. Expressão de RNAm de mediadores imunológicos durante a resposta em

monócitos in vitro infectados pelo M. tuberculosis H37Rv

TNF

0.1

100

IL-12p35

0.1

100

IL-12p40

0.1

100

NEMO

0.1

IL-10

0.01

0.1

IRAK-M

0.1

TLR2

0.1

100

TGF

-RII

0.1

100

SOCS1

0.1

100

SOCS3

0.1

100

Monocitos

Monócitos + H37Rv WT

Monócitos + H37Rv KoCFP32

Monócitos + SN H37Rv WT

Monócitos + SN H37Rv KoCFP32

Número de Cópias Relativas

a GAPDH

Número de Cópias Relativas

a GAPDH

Número de Cópias Relativas

a GAPDH

Tempo de Cultura (Horas) Tempo de Cultura (Horas) Tempo de Cultura (Horas) Tempo de Cultura (Horas)

Tempo de Cultura (Horas)

M. tuberculosis induz vários mediadores capazes de inibir a ativação da resposta imune Th1.

Monócitos humanos não estimulados (Monócitos) ou após estimulo com bacilo vivo M. tuberculosis

H37Rv Wild Type (Selvagem) ou o mutante 0577Null M. tb H37RvKocfp32 (sem o CFP32) (Inoculo

padrão estocado a -80

C) ou filtrado de cultura (SN) derivado do sobrenadante de cultura destes

bacilos foram avaliados in vitro através da expressão gênica em tempos (hora) de cultura distintos. As

culturas de monócitos, derivados de seleção negativa foram infectados com WT ou 577Null mutante

M. tb H37Rv na razão de 0.1 unidades formadoras de colônia (CFU) per monócito ou tratada com 50

µg of CF (derivados dos WT ou o mutante M. tb H37Rv) por 10

células por poço. As células foram

estimuladas, RNAm extraído, RT-PCR realizado usando Syber Green (ABI Prism 7900HT). A figura

é representativa de dois experimentos independentes.

Resultados

110

Em seguida verificamos a expressão dos mediadores imunológicos nas PBMC

infectadas com M. tb H37Rv e no M. tb mutante sem CFP32 (H37Rv KoCFP32). A infecção

pelo M. tb aumenta a expressão de SOCS1, SOCS3, IL-10, IRAK-M, TLR2 e IDO, bem como

TNFα, IL-12, CD-80 e NEMO, acima da linha basal de expressão vista nos mutantes H37Rv

KoCFP32 na qual estas moléculas foram menos expressas de acordo com a Figura 11.

Figura 11: Expressão de RNAm de mediadores imunológicos durante a resposta de

PBMC in vitro infectadas pelo M. tuberculosis H37Rv

TNF

100

1000

IL-12p35

100

1000

10000

CD-80

NEMO

100

IL-10

0.01

0.1

IRAK-M

100

TLR2

100

1000

INDO

0.001

0.01

0.1

SOCS1

100

SOCS3

0.1

100

PBMC

PBMC + H37 Rv WT

PBMC + H37 Rv KoCFP32

Número de Cópias Relativas

a GAPDH

Número de Cópias Relativas

a GAPDH

Número de Cópias Relativas

a GAPDH

Tempo de Cultura (Horas) Tempo de Cultura (Horas) Tempo de Cultura (Horas) Tempo de Cultura (Horas)

Tempo de Cultura (Horas)

A expressão de mediadores capazes de inibir a resposta imune Th1 é observadas também em culturas

in vitro de PBMC. PBMC não estimuladas (PBMC) ou após estimulo com bacilo vivo M. tuberculosis

H37Rv WT (selvagem) e o mutante 0577Null H37RvKocfp32 (sem CFP32). Os estímulos in vitro

obedeceram a razão de 0.1 unidades formadoras de colônia (CFU) por monócito. A figura é

representativa de dois experimentos independentes.

Resultados

111

A Figura 12 ilustra as concentrações protéicas de IL-10 no sobrenadante das culturas

de PBMCs por M. tb e o componente moleculares micobacteriano CFP32. Dados

anteriormente publicados pelo nosso grupo já descreveram a influência do Mycobacterium

tuberculosis na indução de IL-10 (Bonecini-Almeida et al 2004). Observamos que houve a

indução de IL-10, confirmando que tanto o monócito quanto as PBMCs foram diretamente

afetados pelo M. tb H37Rv, influenciando o aumento da sua produção em ambas condições

experimentais estimuladas. Entretanto, nas micobactérias mutantes H37Rv KoCFP32

observou-se uma baixa protéica da concentração de IL-10, indicando a participação efetiva do

componente antigênico CFP32 de M. tb H37Rv na indução de IL-10. Interessantemente,

pudemos observar que a indução de IFNγ parecem ser similares à expressão basal, como visto

tanto em PBMCs quanto nos monócito estimulados com M. tb H37Rv. Com a retirada

específica do gene CFP32 da M. tb (H37RV KoCPF32) podemos observar um aumento da

indução final de IFNγ tanto em PBMCs quanto em monócitos, como demonstrado na Figura

12.

Resultados

112

Figura 12: Concentração dos mediadores imunológicos durante a resposta de

PBMCs in vitro infectados pelo M. tuberculosis H37Rv por ELISA

PBMC

150

300

450

600

Tempo de Cultura (Horas)

IL-10 (pg/mL)

PBMC

120

160

200

PBMC

PBMC + H37Rv WT

PBMC + H37RV KoCFP32

Tempo de Cultura (Horas)

Monócitos

200

400

600

800

1000

1200

1400

Tempo de Cultura (Horas)

IL-10 (pg/mL)

Monócitos

120

Monocytes

Monócitos + H37Rv WT

Monócitos + H37RV KoCFP32

Tempo de Cultura (Horas)

IFNγ (pg/mL)

A produção de IL-10 e IFNγ, mensurados por ELISA, em sobrenadantes de cultura de monócitos ou

PBMCs estimuladas por M. tb H37Rv WT (selvagem) e o 0577Null H37Rv KoCFP32 (mutante sem o

CFP32). CFP32 de M. tb H37Rv é capaz de promover a produção de IL-10 e inibir a produção de

IFNγ. A indução de proteínas no sobrenadante de cultura detectada por ELISA demonstra que há

variações na produção de IL-10 e IFNγ tanto em PBMCs quanto nos monócitos humanos. A figura é

representativa de 02 experimentos independentes.

Discusssão 113

7.0 Discussão

No presente estudo foram utilizadas células do escarro induzido para responder a

questões associadas à resposta imune no ambiente pulmonar durante a TB ativa e ainda

ensaios in vitro comparativos em células mononucleares sanguíneas. O escarro induzido (EI)

demonstrou ser um bom modelo ex vivo para avaliação da expressão de marcadores

imunológicos em células pulmonares de pacientes com tuberculose ativa numa perspectiva

longitudinal, mesmo em função da baixa quantidade total de células pulmonares. Ribeiro

Rodrigues et al. (2002), descreveram a detecção de marcadores imunológicos no EI que se

compararam às amostras obtidas em lavado broncoalveolar. Em paralelo, outros estudos em

células do sangue periférico descreveram alterações no perfil populacional de leucócitos, se

comparados antes e após tratamento anti-TB (Lee et al. 2003). O perfil de celularidade do EI

em nosso estudo demonstrou algumas diferenças entre os pacientes com TB ativa, pacientes

com outras pneumopatias ou voluntários saudáveis. Observou-se a presença de menos de 1%

de linfócitos presentes na população de células pulmonares. Entretanto, houve uma tendência

de aumento na população de macrófagos nos pacientes com TB ativa. Esta observação quanto

à população linfocítica, ao que parece, é um fato inerente ao método, visto que foi

anteriormente descrita por Ribeiro-Rodrigues et al. (2002) em células do EI e do escarro

espontâneo (EA). Baseados nestes dados não podemos descrever a participação majoritária de

um perfil clássico Th-1 versus Th-2 já que temos cerca de 1% de linfócitos no EI. Podemos

supor através de nossos dados que os aspectos imunossupressivos poderiam estar sendo um

reflexo do ambiente pulmonar revisto principalmente pela população majoritária de

macrófagos alveolares no EI.

No presente estudo confirmamos e ampliamos a análise de mediadores imunológicos

que influenciam a resposta ao M. tb, indicando a ativação de várias moléculas

imunoreguladoras em células pulmonares. Nos pacientes com TB ativa, se comparados aos

Discusssão 114

controles (OLD e HCW), detectamos um aumento tanto de moléculas envolvidas na resposta

celular ativa Th1 (IFNγ, IL-12p35, IL-12p40 e NEMO) quanto na resposta supressora Th2

(IL-10, TGFβ-RII, IL-1Rn, IRAK-M, SOCS1, SOCS3 e IDO) e algumas moléculas que

promovem efeitos variáveis na resposta imunológicas em células Th-1 e Th-2 (CD86 e

TLR2), antes do tratamento anti-TB. Estes resultados parecem contraditórios pela presença de

moléculas antagônicas, expressas simultaneamente no sítio da lesão. Entretanto, nossas

observações estão de acordo com alguns estudos da literatura, que detectaram o aumento da

expressão de IFNγ, TNFα ou IL-12 no soro e sangue total (Marchant et al. 2001; Deveci et al.

2005), assim como na avaliação por “microarray” em células do BAL de pacientes com TB

ativa (Grassi et al. 2006). Ao que tudo indica o aumento da expressão de mediadores Th1, em

pacientes com TB, se acompanha de altos níveis de vários mediadores extracelulares anti-

inflamatórios e/ou imunosupressores (como IL-10, TGFβ-RI e TGFβ-RII, IL-1Rn e IDO),

frente aos controles OLD e HCW demonstrados na Figura 7. A expressão de IL-10, TGFβ-RI

e TGFβ-RII por células pulmonares durante a TB ativa confirma os resultados prévios

obtidos em nosso estudo com células do BAL (Bonecini-Almeida et al. 2004), assim como

também foi demonstrado o aumento da expressão de TGFβ no BAL de pacientes com TB

ativa (Grassi et al. 2006). Mediante este resultado interpretamos que a expressão sustentada

de um amplo perfil de moléculas imunossupressores, antes do quimioterapia anti–TB, podem

afetar várias etapas da ativação e sinalização da resposta imune inata e adaptativa, ou o

recrutamento de leucócitos no sítio pulmonar afetados pelo M. tb. Detectamos um paralelo

entre os nossos resultados e a literatura que descreve uma significativa alteração na resposta

imune, levando à sustentação da viabilidade bacteriana no hospedeiro humano e permitindo a

sobrevivência e disseminação do Mycobacterium. Rook et al. (2005) descreveram que a

vacinação com BCG recombinante seria capaz de induzir a resposta Th1, que é um importante

fator para a proteção contra a infecção por M. tb, devido à produção final de IFNγ em

Discusssão 115

camundongos. No entanto, mesmo baixos números de colônias vivas de M. tb necessárias

para alavancar a infecção resulta na produção de citocinas do perfil Th2 (IL-4), que

perturbaria a resposta imune protetora, sustentaria o estabelecimento da infecção pelo M. tb e

conseqüentemente aumentaria a disseminação para outras células e a transmissão para outros

organismos susceptíveis (Rook et al. 2005; Marchant et al. 2001).

Um outro aspecto a ser abordado é o momento em que os pacientes com diagnóstico

de TB ativa foram arrolados. Nós não sabemos quando a predominância de um perfil

imunossupressor, descrito através das moléculas estudadas, ocorreu antes do início da

sintomatologia da doença ativa. É concebível que fatores genéticos possam favorecer o

estabelecimento deste tipo de resposta frente ao M. tb, os quais podem influenciar diretamente

a susceptibilidade à doença. Isto se reflete na expressão variável e sustentada demonstrada

pelas moléculas antes e durante o tratamento anti-TB, conforme ilustrado nas Figuras 7, 8 e

9. Resultados recentes descritos por Wakeham et al. (2000) demonstraram que a resposta

imune específica tardia (no 43° dia) é deficiente nos camundongos susceptíveis BALB/c

frente à infecção por M. bovis BCG. Entretanto, o aumento da neutrofilia pulmonar e citocinas

(IL-12, IFNγ e TNFα) in vivo em células pulmonares de camundongos C57BL/6 (resistentes)

e BALB/c (susceptíveis) em etapas primárias de infecção demonstraram ser similares. Isto

sugere que a heterogeneidade genética pode ser crucial no estabelecimento da resposta imune

inata e especialmente crítica na resposta adaptativa em infecções micobacterianas. Este dado

apóia os resultados obtidos nos pacientes com TB ativa ao longo do tratamento em que vimos

a regulação positiva de inibidores da resposta imune Th1, possivelmente promovendo a

desativação da resposta específica como será discutido à frente.

Pacientes com TB ativa analisados neste estudo apresentaram um perfil heterogêneo

de expressão dos mediadores imunológicos. A expressão polarizada de IDO e NEMO,

segregados em duas populações que ora apresentaram alta, ora baixa expressão do RNAm

Discusssão 116

(Figuras 7 e 8) pode ser um reflexo de aspectos genéticos ou fisiológicos. Alguns estudos

analisaram os aspectos genéticos de atividade funcional de triptofano e indicaram que há uma

baixa significativa desta molécula nos estados de depressão, relacionadas a alterações de

humor, diminuição dos níveis de IL-1 e IL-6 e principalmente inibição celular (Ravindran et

al. 1999). Paralelamente, a literatura descreve que a presença do polimorfismo no gene de

IFNγ, posição +874 genótipo T/A, aonde o alelo T está relacionado à alta produção de IFNγ, é

capaz de afetar diretamente o aumento da atividade de IDO na população de mulheres

envolvidas no estudo (Raitala et al. 2005). Em paralelo, algumas doenças genéticas tem sido

relacionadas a disfunções na via de ativação de NFκB, com associação a polimorfismos no

gene de NEMO. A incontinência pigmenti, ou IP, letal ao sexo masculino, é uma desordem

imunológica dominante ligada ao cromossomo X, é uma delas (Smahi et al. 2000). Descreve-

se ainda a displasia ectodermal anidrótica ligada ao cromossomo X com imunodeficiência

(EDA-ID), que em homens apresentam susceptibilidade em múltiplos sítios como digestivo,

pele e respiratório, combinados à susceptibilidade a agentes infecciosos como bactérias

piogênicas gram-positivas e gram-negativas e micobactérias (Döfinger et al 2001).

Recentemente foram descritos polimorfismos em um cluster do gene de IL-1Rn que estão

associados à susceptibilidade a infecções micobacterianas na população da Gâmbia (Bellamy

et al. 1998). De forma mais ampla, outros estudos descrevem a participação de polimorfismos

em genes associados à regulação da resposta imune, como as citocinas, receptores e

mediadores intracelulares em várias doenças. Há uma tendência recente de estudos genéticos

em doenças infecciosas destacarem a associação entre prevalência, susceptibilidade e

gravidade como já descrito na AIDS (Opdal 2004), hanseníase (Moraes et al. 2004),

leishmaniose (Salih et al. 2007) ou tuberculose (Gomez et al. 2006). Células T PPD

específicas isoladas de derrame pleural de pacientes com TB pulmonar, antes do tratamento e

de voluntários saudáveis, na Itália e Gâmbia, apresentaram diferenças significativas no perfil

Discusssão 117

de polarização da resposta Th entre estas duas populações, sugerindo fortemente que o fator

genético tem uma via importante na regulação da resposta imune do hospedeiro contra a

tuberculose (Marchant et al. 2001).

Como descrevemos em nosso estudo anterior (Bonecini-Almeida et al. 2004) e

confirmamos em nossos dados recentes, o aumento da expressão de IL-10 e TGFβ nos

pulmões dos pacientes com TB ativa poderia estar induzindo supressores extracelulares (IL-

1Rn e IDO) ou ainda reguladores negativos intracelulares (IRAK-M e SOCS) que podem

inibir a imunidade Th1. De forma especulativa demonstramos a inter-regulação destes

mediadores imunológicos na Figura 13 como um modelo proposto de participação de

moléculas no ambiente imune pulmonar durante a TB ativa.

Figura 13: Modelo ilustrativo da modulação imunológica negativa no pulmão

associada com a TB ativa

Th1

Th0

IFN-γ

-1

TGF-βRI

Th2

M∅

CD80

CD86

Macrófagos

Linfócitos

IFN-γ

TGF-βRII

IL-23

TGF-β

Proliferação / Expansão

Ativação

IL-10

TNF-α

IL-17

IL-10

IFN-γ

IFN-γR

M.tb

Discusssão 118

Ilustramos na Figura 13 um modelo especulativo que propõe a participação de alguns

mediadores pulmonares durante a TB ativa abordados neste estudo. O aumento significativo

de IL-10 e TGFβ-RII no grupo de pacientes com TB ativa sugere que aspectos

imunossupressores já estão modulados ativamente no sítio infectado. IL-10 e TGFβ

apresentam secreção aumentada in vitro tanto em PBMC quanto em monócitos de pacientes

estimulados com antígenos do M. tb (Fulton et al. 1998). IL-10 e TGFβ1 apresentam indução

de hiporresponsividade (anergia) em células do compartimento pulmonar com baixa ativação

de células T CD4 in vitro (Weiner 2001). Foi ainda descrito que a expressão de IL-10 também

está associada a imunossupressão em infecções crônicas como leishmaniose visceral e HIV,

segundo revisto por Nylén & Sacks (2007). Tanto que a capacidade de monócitos/macrófagos

humanos em restringir o crescimento do M. tb é inversamente proporcional à quantidade

secretada de IL-10 e TGFβ (Hirsch et al. 1994; Bonecini-Almeida et al. 1998). De acordo

com o descrito por McCaffrey et al. (1995) a expressão dos receptores tipo I e Tipo II de

TGFβ são pré-requisitos para atuação de TGFβ1 em modelos de doenças fibroproliferativas.

Particularmente o aumento da expressão de TGFβRII está relacionado à baixa indução de

proliferação celular. Soma-se a isto a observação de que células do tipo T

reg

CD4

CD25

são

produtoras de IL-10 e TGFβ no pulmão de camundongos infectados pelo M. tb. E que o

bloqueio de TGFβ-RII incide num significativo aumento de IFNγ em linfócitos in vitro

(Mason et al 2007).

Altos níveis de IL-1Rn podem inibir o direcionamento da resposta em células Th0 para

Th1, quando IL-1 promove a inflamação tipo Th1 em algumas condições clínicas graves

como sepsis e doenças auto-imunes (Nambu et al. 2006). Não detectamos a expressão de

TNFα em nosso estudo, o que poderia estar ligado ao aumento da expressão de vários fatores,

como os mediadores anti-inflamatórios descritos. Particularmente, citamos o exemplo do

Discusssão 119

aumento da expressão de IL-1RN, que poderia resultar na redução endógena de IL-1 e no

influxo de neutrófilos via TNFα (Juffermans et al. 2000) antes do tratamento. A estrutura e

composição do granuloma poderia estar sendo afetada, já que é TNFα dependente (Flynn &

Chan 2005), facilitando desta forma o estabelecimento da infecção. Conforme Cho et al.

(2006) há indícios que o aumento da expressão de IL-1RN é capaz de afetar negativamente a

alça regulatória inflamatória entre IL-23 e IL-17 via IL-1 em células de camundongo BALB/c

em um modelo de artrite espontânea. Isto poderia indicar resultados obtidos com a ausência

de IL-23 no grupo de pacientes com TB ativa, se comparado aos controles. O decréscimo de

IL-1 levaria também à diminuição da proliferação celular e desenvolvimento funcional

(Matsuki et al. 2006).

A expressão conjunta aumentada de IL-1RN e IDO na infecção pelo M. tb poderia

resultar em interferência direta na população de células T, via produção metabólica tóxica de

quinureninas (KYN), que afetam o perfil de células Th1, como demonstrado pela indução de

apoptose via IDO produzida por células dendríticas em células T CD8

de memória (Liu et al.

2007). Outros dados ainda indicam que parasitas intracelulares como Toxoplasma,

Leishmania e M. tuberculosis são capazes de induzir a expressão de IDO em macrófagos e

células dendríticas (Chaussabel et al. 2003).

As moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 são capazes de afetar diretamente a

resposta Th1 e Th2 respectivamente, no entanto, o efeito co-estimulatório das moléculas

CD80 e CD86 em células Th0 é bastante complexo, pois estes receptores apresentam aspectos

funcionais dependentes da densidade na superfície celular e ainda da seqüência temporal dos

eventos de ativação (Balkhi et al. 2004a e 2004b). No presente verificamos que os níveis de

expressão de CD80 nos pacientes com TB ativa foram similares aos pacientes com OLD e os

HCW. Nossos achados sugerem que a expressão aparentemente sustentável de CD80 no

contexto da baixa expressão de CD86 seria capaz de afetar a imunidade Th2 nos pacientes

Discusssão 120

com TB ativa. Em estudo recente de nosso grupo (Anexo 9), avaliando moléculas co-

estimulatórias (CD86, CD40, CD40L CD28 e CD152) e moléculas apresentadoras de

antígenos (MHC de classe II e CD1) em células pulmonares obtidas do EI, observamos uma

disfunção na presença e no percentual de moléculas envolvidas no processo de ativação e

apresentação antigênica a células T entre os casos com TB ativa (10/22), se comparados aos

controles (16/17). Neste contexto, foi possível demonstrar uma baixa percentagem de células

HLA-DR

(P<0.001) como também um baixo percentual de células expressando CD86

(P=0.04) em pacientes com TB. O baixo percentual de células expressando CD86

se estende

ainda aos pacientes com doença (TB) limitada (≤ 1 lobo), se comparados a pacientes com

doença (TB) avançada (> 1 lobo).

Os dois painéis inferiores na Figura 13 ilustram que a expressão de SOCS1 e SOCS3

foi significativamente aumentada nos casos de TB comparadas aos controles. Estes achados

sugerem que, a despeito da expressão aumentada dos mediadores Th1 em TB, o ambiente

pulmonar na TB torna-se permissivo para a proliferação descontrolada do M. tuberculosis

durante a doença ativa. A expressão constante de SOCS1 e SOCS3 descrita nos pacientes com

TB confirma observações anteriores: 1) a infecção in vitro de macrófagos murinos J774 com

M. bovis BCG induz aumento da expressão de SOCS1 e SOCS3 (Imai et al. 2003) e 2)

SOCS1, 4 e 5 são preferencialmente regulados nos pulmões de camundongos infectados com

cepas W/Beijing se comparados à cepa menos virulenta CDC1551 (Manca et al. 2005).

Como ilustrado pelos linfócitos (à direita na figura 13) Th1, SOCS1 e SOCS3 em

conjunto podem interferir em um ou mais passos da cascata de sinalização, iniciada por IFNγ,

IL-12 e IL-23, através da ligação direta ao receptor e/ou a proteína transdutora de sinalização

STAT (Tan & Rabkin 2005). A conseqüência pode ser a menor proliferação e expansão de

células Th1. Em apoio a este conceito, nossos resultados indicam que há um aumento da

produção de IFNγ em reposta ao tratamento se comparado aos níveis produzidos no pré-

Discusssão 121

tratamento (Figura 9C e Tabela 4). A expressão direta de SOCS3 foi descrita como

predominante em células com perfil Th2 (Seki et al. 2003), paralelo ao fato de que a indução

de SOCS3 pelo M. tb poderia estar influenciando a resposta em células T secretoras de IL-17,

como descrito por Chen et al. (2006), principalmente via a regulação negativa de IL-23 e

inibição da fosforilação de STAT3.

Como ilustrado nos macrófagos (à esquerda na figura 13), o aumento de SOCS1 pode

inibir a ativação celular por IFNγ, resultando em uma baixa ou nenhuma atividade anti-

micobacteriana capaz de permitir uma proliferação intracelular e extracelular descontrolada

do M. tb (Heeg & Dalpke 2003). Dados recentes demonstram que SOCS1 participa da

regulação indireta de receptores TLR via indução positiva da expressão de CD40 em células

RAW (Baetz et al. 2004). assim como da regulação descrita por Mansell et al. (2006)

indicando que SOCS1 é capaz de regular a resposta imune inata negativamente via Mal, que é

um mediador chave na sinalização de TLR2 e TLR4. A via normal de sinalização por Mal é

capaz de ativar a fostorilação de p65 e transativação de NFκB para indução de genes

inflamatórios envolvidos nesta cascata de sinalização. Entretanto, SOCS1 é capaz de modular

a resposta inflamatória diretamente via degradação proteossômica de Mal, que é induzida pela

poliubiquitinização via ação da ligase de E3 associada à fosforilação de tirosinas quinases

desta proteína. Estes aspectos são relativamente importantes se formos considerar os longos

períodos em que o M. tb está restrito ao granuloma. O principal mecanismo de sobrevivência

da micobactéria é a inibição das vias de sinalização induzidas e geradoras de IFNγ, ou ainda a

ativação do estado de latência do Mycobacterium tuberculosis em caso de pressão

imunológica seletiva, conforme descrito por Salgame (2005). Soma-se ainda o fato de que o

aumento da expressão de SOCS1 em células do sistema imune inato é capaz de inibir a

aquisição da imunidade adaptativa por células T CD4 e CD8 contra agentes virais (Song et al.

2006). Nós observamos neste estudo altos níveis de expressão de SOCS1, IRAK-M e TLR2 e

Discusssão 122

estes se mantêm aumentados independentemente do tratamento anti-TB (Tabela 5). Nenhum

destes mediadores atinge os níveis de expressão dos OLDs e HCWs mesmo ao final do

tratamento, com cura clinica e radiológica. A super-expressão de IRAK-M nos casos de TB

seria capaz de inibir a ativação máxima dos macrófagos por PAMPs do M. tuberculosis.

IRAK-M normalmente atua como um regulador negativo dos receptores TLR, após conexão

com os ligantes microbianos (Kobayashi et al. 2002). A expressão sustentada de IRAK-M

durante o tratamento de pacientes com TB pode no entanto alterar a sensibilidade dos ligantes

micobacteriano à família de receptores TLRs, em particular TLR2, TLR4, TLR9, que são

considerados essenciais no controle do M. tuberculosis (Bafica et al. 2005; Krutzik & Modlin

2004).

Em paralelo, foi detectado um aumento de expressão de TLR2 nos pacientes com TB

se comparado aos controles. O aumento da expressão de TLR2 pode prover informações

significativas para explorar outros aspectos associados à subversão imune ligados aos PAMPs

de M. tb em células da imunidade inata aparentemente sensíveis a TLR2. Isto inclui as

lipoproteínas e ESAT6, que inibem a ativação imune via NFκB, e fatores reguladores de IFN

(IRFs), após sinalização específica por TLR2, favorecendo a resposta imune anti-inflamatória

(Pathak et al. 2007). Já Re & Strominger et al. (2004), em análise comparativa com agonistas

específicos de TLR2, 3, 4, 5 e TLR7 em DCs detectaram que a estimulação específica em

TLR2 determina um bloqueio na indução de IP10, IL-12p35 e IFNγ. Foi observado ainda

indício de uma polarização para a resposta anti-inflamatória Th2 com aumento primário de

IL-10. O aumento da expressão de IL-10 via indução por TLR2 nos macrófagos seria talvez

uma forma de evasão ao reconhecimento imune celular como descrito também por Netea et al

(2004). À luz destes achados in vitro, especulamos que a via preferencial de sinalização por

TLR2 em pacientes com TB ativa resulta na ampliação de uma rede anti-inflamatória, que é

Discusssão 123

capaz de desativar o macrófago e resguardar o M. tuberculosis, permitindo assim uma

proliferação irrestrita e ativação da tuberculose.

As variações temporais observadas para cada mediador pulmonar em resposta ao

tratamento anti-TB apóiam nossas hipóteses de que as alterações são especificamente ativadas

pela presença do M. tuberculosis (Figura 9 e Tabela 5). Especificamente, observamos que os

mediadores imunes tipo Th1 estão majoritariamente aumentados (≥ 2 vezes) após 15 dias de

tratamento e parcialmente elevados durante a seqüência de tratamento anti-TB, inclusive ao

final, enquanto que a maioria dos supressores Th2 declina (≥ 2 vezes) a níveis comparáveis

aos controles. Seqüencialmente, evidências de que estes mediadores estão relacionados à

resposta ao M. tb estão refletidas na estatística entre os grupos de expressão durante o

tratamento anti-TB, comparados aos paciente com OLD e HCW. A interpretação a respeito

destas mudanças de expressão ao longo do tratamento anti-TB é que a remoção do M.

tuberculosis promova a retomada do padrão normal na resposta imune. No entanto, nosso

grupo não exclui a possibilidade de que as alterações no influxo de células no ambiente

pulmonar na resposta imune inata e o desenvolvimento da resposta adaptativa contribuíram

para os nossos achados. Mesmo independentemente da cura clínica pelas drogas anti-TB,

IRAK-M e SOCS1 (um supressor intracelular de TLR e IFNγ) ainda se mantêm expressos de

forma significativa ao final do tratamento anti-TB. A presença residual destes mediadores

intracelulares da imunidade inata e de ativação celular pode-se refletir na reparação do dano

tecidual pulmonar e/ou numa modulação residual de antígenos e/ou bacilos dormentes

existentes. Sugere-se ainda que a persistência do estado de regulação negativa pode aumentar

o risco de re-infecção por novas cepas de M. tb. Similarmente, um estado associado de

supressão foi demonstrado em pacientes com infecção por influenza e sarampo (Moss et al.

2004; van der Sluijs et al. 2006). Ambas as infecções virais implicam em aumento do risco de

infecção bacteriana. Um trabalho recente descrito por Verver et al. (2005) observou risco

Discusssão 124

aumentado de sete vezes de recidiva em pacientes tratados por TB em população da África do

Sul. Sendo assim, especula-se que o M. tb pode modificar o ambiente pulmonar, de modo a

torná-lo mais permissivo à re-infecção, o que de fato corrobora os dados obtidos neste estudo.

Nosso estudo abordou a relação de dados clínicos com a expressão de alguns

mediadores imunológicos. Apesar da pertinência biológica estatisticamente

significativa(p≤0.05), (cavitação e baixa de IRAK-M e altos níveis de SOCS3 e doença em

mais de um lobo) não creditamos valor estatístico ao dado devido ao fato de nenhuma das

associações apresentar valor de p≤0.001. Este estudo não foi desenhado para análise de

correlação clinica e associado a isto não dispúnhamos de uma população suficiente para

análise (“n” baixo de 30 pacientes). Tal justificativa baseia-se no trabalho descrito por Jamil

et al. (2007) avaliando aspectos da gravidade da tuberculose extra-pulmonar com a produção

de IL-10/IFNγ, aonde obteve-se uma alta correlação no estudo. Sobretudo, ficamos atentos à

expressão dos mediadores imunes de quatro pacientes HIV positivos dos 30 TB, conforme a

Figura 8. Estes pacientes foram diagnosticados no decorrer do tratamento e apresentaram

uma resposta imune variável em intensidade e expressão, comparada aos pacientes com

tuberculose ativa ao longo do tratamento. Porém, nenhum dos pacientes HIV

apresentou

segundo episódio de TB, apesar dos três apresentarem TB avançada.

Em nossos resultados dos estudos in vitro observamos que o padrão de expressão

destes mediadores imunes é também detectável em células da cultura in vitro. Vimos

essencialmente que a expressão do RNAm de vários mediadores nos ensaios utilizando

monócitos com 24 horas de cultura [TNFα (pico em 4 horas), IL-12p35 e p40, NEMO, IL-10,

IRAK-M, TLR2 TGFβ-RII, SOCS1 e SOCS3] e em PBMCs a partir de 4 horas de cultura

[TNFα, IL-12p35, CD80, NEMO, IL-10, IRAK-M, TGFβ-RII, IDO (pico em 24 horas de

expressão), SOCS1 e SOCS3]. Confirmamos que o Mycobacterium tuberculosis, seja a

bactéria viva, seja proteínas do filtrado de cultura, pode direcionar estes mediadores

Discusssão 125

imunológicos na resposta imune celular em células sanguíneas (PBMC e em monócitos) no

estudo in vitro. Algumas das variações observadas são parcialmente influenciadas pela

presença da proteína imunogênica, CFP32, que é um antígeno do M. tb específico do MTC

(Figura 11). Esta pode ser detectada no escarro induzido de pacientes com TB ativa com

100% de especificidade e foi também demonstrada uma associação direta com a produção de

IL-10 (Huard et al. 2003a). Este dado reforça os achados descritos nos estudos in vivo neste

trabalho com referência a especificidade da expressão de medidores imunológicos induzidas

exclusivamente pelo M. tb. PBMCs, monócitos e células dendríticas humanas são capazes de

produzir IL-10 quando estimuladas com M. tb (Barnes et al. 1992; Henderson et al. 1997) ou

ainda IFN tipo I (Giacomini et al. 2001; Prabhakar et al. 2005). Os dados sugerem que há

uma ação imunossupressiva envolvendo a indução de IL-10 e outros mediadores

imunológicos. Destaca-se nos experimentos com PBMC o aumento da expressão de IDO,

responsável pela supressão local de linfócitos T, o que aparentemente indica haver a real

necessidade de interação de monócitos e linfócitos para expressão bioativa destas moléculas

como já descrito por Munn et al. (2004) e majoritariamente de supressores de citocinas como

SOCS1 e SOCS3 nos monócitos. Sabemos que a indução de IL-10 é multifatorial e envolve

tanto a contribuição do hospedeiro quanto do patógeno. Já foi descrito na literatura que entre

as estratégias de evasão o M. tb pode induzir a produção de IL-10, suprimir a resposta celular

para IFNγ e promover a sobrevivência dentro do macrófago (Bonecini-Almeida et al. 1998).

O aumento de IL-10 incidiria na indução de células T CD4 regulatórias 1 (Tr1) (Akbari et al.

2001). De fato a maioria dos clones de célula T CD4

do lavado broncoalveolar são células

tipo Th-1 (Gerosa et al. 1999), que produzem IFNγ, e que contraditoriamente também estão

implicadas na anergia em resposta ao PPD em pacientes com TB ativa. Neste âmbito podemos

descrever os pacientes anérgicos com TB, que respondem negativamente ao teste contra a

proteína tuberculínica e que secretam IL-10, também secretam pouca IL-2 ou IFNγ em

Discusssão 126

resposta ao M. tb (Boussiotis et al. 2000; Delgado et al. 2002). Estas células poderiam ser as

recentemente descritas como célula T regulatórias tipo CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) (Chen et al.

2007).

De fato, é bem possível que a excessiva atividade regulatória principalmente das

células T, mediante a intensa presença de mediadores imunológicos, venha a contribuir para o

bloqueio da resposta imune protetora contra o M. tb. Em trabalho revisto por Rook et al.

(2005) os autores observam que não é a intensidade da resposta Th1 o fator crucial de

proteção contra o M. tb em estudos com vacina. O que se observa é que, ao invés de tentar

evitar a elaboração de uma resposta imune celular Th1, o M. tb provavelmente precisa induzir

tal resposta. No entanto, é também necessário corromper esta resposta imune para que haja a

morte ineficiente de micobactérias, induzindo o aumento do dano tecidual pulmonar e

permitindo a disseminação das M. tb existentes, talvez como forma de exaurir o sistema

imune para o estabelecimento da infecção (Figura 13).

Uma outra interpretação sugere ainda que o próprio M. tb, pela promoção destes vários

mediadores, representados na Figura 13, interferiria nas vias normais de ativação

imunológica resultando na:

1) Subversão da resposta inflamatória, uma vez que a inflamação foi ativada via

receptores TLRs pela indução de IRAK-M, que alimentaria o bloqueio de sinalização de TLR;

2) Facilitação do dano tecidual (TGFβ, IRAK-M e receptores), que também teria

efeito anti-inflamatório, em paralelo à queda de eficiência na resposta imune Th-1 pela

promoção de imunossupressores (IL-10, ligantes de TGFβ e receptores);

3) Interferência de ativação do eixo IFNγ-IL-12 em macrófagos pulmonares ativos e

inibição do desenvolvimento de células T via ativação de moléculas SOCS. Inativação celular

via IL-1R respectivamente; e/ou deleção de células Th1 e promoção de um perfil Th-2 através

das quinureninas, subproduto de IDO na conversão de triptofano, que é biologicamente

Discusssão 127

ativado pela ligação de moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86.

Em suma, os nossos achados sugerem que o M. tuberculosis promove a regulação

negativa dos mediadores imunes pulmonares que se contrapõem à resposta imune Th1 e à

imunidade inata, como uma estratégia patológica na tuberculose ativa. As alterações

temporais de certos mediadores imunes durante o tratamento anti-TB substanciam que estes

mediadores são modulados pelo M. tuberculosis. Diferenças nos níveis de expressão dos

mediadores pulmonares imunes entre os casos com TB e os pacientes com OLD ou HCW, e

nas alterações temporais em resposta para a terapia anti-TB, sugerem que certos mediadores

têm o potencial para serem marcadores imunológicos para diagnóstico de TB e de resposta ao

tratamento. Marcadores imunológicos são criticamente necessários para monitorar a resposta

ao tratamento para drogas anti-TB, especialmente em locais de poucos recursos de pessoal

e/ou equipamento para realização de cultura micobacteriana (Perrin et al. 2007; Wallis et al.

2007).

Conclusões 128

8.0 Conclusões

1) O escarro induzido é capaz de prover informações relevantes referentes à

celularidade e imunologia pulmonar nos portadores de tuberculose ativa, principalmente sob o

aspecto da análise de um estudo longitudinal.

2) A expressão dos mediadores imunossupressores como IL-10, TGFβ-RII, IRAK-M,

IL-1Rn, SOCS1, SOCS3 e IDO) está aumentada antes do tratamento nos pacientes com TB

ativa, em relação aos controles. Tal aumento possivelmente resulta em inibição tanto da

imunidade inata quanto da adaptativa, induzindo o estabelecimento e progressão do processo

infeccioso por M. tuberculosis.

3) M. tuberculosis parece influenciar diretamente a regulação da resposta imune nos

pacientes com tuberculose ativa, tendo em vista o modulação da resposta inflamatória e anti-

inflamatória antes e durante o estabelecimento do processo de infecção pelo M. tb.

4) Algumas alterações seletivas na expressão dos mediadores imunes em resposta ao

tratamento anti-TB, refletidas na sustentabilidade da expressão dos supressores SOCS1 e

IRAK-M, proviram evidências de que há uma “resistência” residual à normalização da

resposta imune associada diretamente ao M. tb ou à presença de antígenos viáveis do

Mycobacterium ainda persistentes.

5) Os achados da expressão de supressores imunológicos também se estendem às

análises in vitro em PBMCs e monócitos estimulados por M. tb H37RV e pelo componente

micobacteriano CFP32. O CFP32 parece ter importância direta na regulação da expressão de

IL-10.

Perspectivas e Limitações 129

9.0 Perspectivas e limitações do estudo

Esta analise foi elaborada no intuito de avaliar aspectos da resposta imunológica em

pacientes com tuberculose ativa em um estudo longitudinal. Entretanto, algumas limitações

foram observadas ao longo deste trabalho:

Nós reconhecemos que o RT-PCR não é uma ferramenta prática para utilização em

ampla escala em regiões de poucos recursos. No entanto, o teste de ELISA apresenta boa

relação custo-benefício, forma rápida e sensível. Já utilizamos ELISA de captura de antígeno

para diagnóstico de TB, utilizando a presença de proteínas do M. tuberculosis, CFP32, no

escarro induzido (Huard et al. 2003a). Efetivamente, na mesma amostra de escarro induzido,

os níveis de CFP32 se correlacionaram positivamente com os níveis de IL-10, mas não de

IFNγ. Seria necessária ainda a ampliação do número amostral em função da necessidade de

confirmar nossos achados destas proteínas do hospedeiro poderem atuar realmente como

marcadores para o diagnóstico da TB e resposta ao tratamento, especialmente em casos

emergentes de multidroga resistência.

Nossos resultados não respondem se as diferenças entre os grupo de mediadores

descritos neste estudo estão associadas a variáveis genéticas do hospedeiro, que estariam

influenciando a sua expressão, ou se estariam associadas a diferentes tipos de cepas de M.

tuberculosis. Estas podem efetivamente diferir no potencial de indução de alguns mediadores

imunológicos, como já descrito na literatura para diferentes tipos de cepas M. bovis BCG (Wu

et al. 2007). Seguindo esta linha de análise, para estudos futuros seriam necessários o

aumento do número de pacientes arrolados, de modo a se fazer as correlações clínicas. Uma

análise específica da influência de diferentes cepas de M. tb poderia ser desenvolvida em um

estudo conjunto in vitro e in vivo, aonde as correlações com as células pulmonares e PBMCs

indicariam padrões ou assinaturas imunológicas das diferentes cepas de M. tb com o processo

de infecção primário, tardio, antes e ao longo do tratamento.

Perspectivas e Limitações 130

Uma análise dos perfis de produção protéica no sobrenadante das amostras de escarro

induzido poderia sugerir a indução de outros mediadores na resposta imunológica antes e

durante o tratamento. Entretanto, nenhuma informação relevante foi obtida com esta

abordagem devido às baixas titulações de IFNγ e TNFα das amostras dosadas dos pacientes

arrolados (dados não demonstrados).

Uma nova linha de análise abordando o estudo a partir da presença de proteínas

imunogênicas do M. tb, assim como descrita para o CFP32, vem em andamento na Divisão de

Doenças Infecciosas da Cornell University, com caracterização e análise imunobiológica dos

genes MPT-51 (Rv3803) e o GlcB (Rv1837) de M. tb. Anteriormente descritas como Proteína

de Ligação a Fibronectina

C - 85C e Malato Sintetase, são moléculas imunomodulatórias que

foram detectadas em cerca de 90% dos soros de pacientes com TB subclínica (Sing et al

2005). Estes genes já foram clonados em sistema utilizando TOPO-TA Cloning System

(Invitrogen, Life technology - Carlsbad, CA, USA), confirmados por sequenciamento e

digeridos duplamente utilizando Bam-HI e Hind-III e analisados em gel de agarose TAE, de

acordo com a Figura 14. Neste momento apresentam-se em fase de expressão da proteína em

vetor de expressão (pQE - Invitrogen, Life technology - Carlsbad, CA, USA) para futuros

testes imunológicos. Resultados preliminares de nosso grupo destacam que esta é uma

proteína que está presente em outros clusters bacterianos do complexo M. tb, de acordo com a

Figura 15 (MPT-51) e Figura 16 (GlcB), e também será avaliado em MOTT.

Perspectivas e Limitações 131

Figura 14. Clonagem e Digestão dos genes GlcB e MPT-51 de M. tb

1 2 3

Parte Superior

1- 1kb Marcador DNA

2- GlcB-TOPO TA Clone

(Digerido por BamHI e HindIII)

3- Vetor pQE-30 (3.5kb)

Parte Inferior

1- 1Kb Marcador DNA

2- MPT-51 – TOPO-TA Clone

(Digerido por BamHI e HindIII)

3- Vetor pQE-30 (3.5kb)

0.5kb

Gel de Agarose 1.5% TAE

1kb

2kb

0.5kb

GlcB - 2.2kb

TA Clone Vector

3.9kb

MPT-51 - 900kb

TA Clone Vector

3.9kb

Figura 15. Blots de Hibridização dos diferentes clusters de M. tb (IS6110)

comparação com a presença do gene MPT-51 de M. tb

Blots de hibridixação. Clusters de M. tb (I-VIII) marcados com sondas

específicas para IS6110 (A) e Probes para o gene MPT51 (B). Produto digerido

por PvuII.

Perspectivas e Limitações 132

Figura 16. Blots de Hibridização dos diferentes clusters de M. tb e comparação

com a presença do gene GlcB de M. tb

Blots de hibridixação. Clusters de M. tb (I-VIII) marcados com sondas

específicas para IS6110 (A) e Probes para o gene GlcB (B). Produto

digerido por PvuII.

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Anexos 154

11.0 Anexos:

11.1- Anexo 1

Aprovação original do projeto pelo CEP FM/HUCFF

11.2- Anexo 2 Última aprovação do projeto pelo CEP FM/HUCFF

11.3- Anexo 3 Aprovação original do projeto pelo IRB WMCCU

11.4- Anexo 4 Ultima aprovação do Projeto pelo IRB WMCCU

11.5- Anexo 5 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)

11.6- Anexo 6 Questionário de entrevista

11.7- Anexo 7

Artigo submetido à avaliação da revista Journal

Experimental Medicine

11.8- Anexo 8 artigo no PRELO- Pediatrics

11.9- Anexo 9 artigo publicado- Braz J Med Biol Res

Anexos 155

11.1- Anexo 1 Aprovação original do projeto pelo CEP FM/HUCFF

Anexos 156

11.2- Anexo 2 Última aprovação do projeto pelo CEP FM/HUCFF

Anexos 157

11.3- Anexo 3 Aprovação original do projeto pelo IRB WMCCU

Anexos 158

Anexos 159

11.4- Anexo 4 Ultima aprovação do Projeto pelo IRB WMCCU

Anexos 160

11.5- Anexo 5 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)

Título do projeto: História natural da tuberculose: investigação através do escarro induzido seriado

antes, durante e após a introdução da quimioterapia.

Os Drs. José Roberto Lapa e Silva e Afrânio Lineu Kritski, do serviço de pneumologia do

HUCFF/UFRJ, estão realizando uma pesquisa sobre como as pessoas adoecem por tuberculose. Como o(a) Sr.

(a) sabe, a tuberculose é uma doença que ataca vez mais pessoas. São 10 milhões de pessoas no mundo inteiro

todo ano. Só no Rio de Janeiro 10.000 pessoas adoecem por ano. Ainda não se conhecem as razões porque

algumas pessoas que se contaminam com o bacilo da tuberculose adoecem e a grande maioria não. Este estudo

vai procurar razões para esta diferença tanto no sistema de defesa do organismo contra as infecções como no

próprio bacilo da tuberculose. Se estas dúvidas ficarem esclarecidas, novas vacinas ou novos remédios contra a

tuberculose poderão ser encontrados.

Os exames que serão realizados são bastante simples e seguros e são também necessários para provar

se o(a) Sr.(a) está doente ou não. Se estiver doente, o(a) Sr. (a) ficará em acompanhamento no ambulatório de

Pneumologia e receberá os remédios de graça, e precisará voltar todo mês para a consulta. No primeiro mês de

tratamento, voltará de quinze em quinze dias para repetir a nebulização para colher catarro. Nos outros meses,

voltará apenas para consulta. A nebulização será então repetida na consulta do segundo e do sexto mês. Se o(a)

Sr. (a) não quiser participar do estudo, continuará sendo tratado no hospital da mesma maneira.

Os exames são necessários para confirmar se o(a) Sr. (a) tem ou não tuberculose. Os exames durante o

tratamento ajudarão a ver se as drogas estão sendo capazes de matar o bacilo. Todo exame tem algum risco,

geralmente muito pequeno. No início, o(a) Sr. (a) responderá a um questionário sobre a doença que o trouxe ao

hospital. Os seguintes exames serão feitos:

1- Coleta de escarro: o escarro será colhido após nebulização com soro durante 20 minutos. A nebulização

poderá provocar tosse e pequena falta de ar, que somem ao fim do exame. A nebulização será repetida mais

quatro vezes se ficar, provado que o(a) Sr. (a) está com tuberculose;

2- Lavado broncoalveolar: o exame consiste em introduzir um aparelho, o broncoscópio, pela boca até o

pulmão, onde vai colher secreções. O exame é feito com anestesia local e sedação com tranqüilizante. Pode

provocar tosse, dor de garganta e um pouco de escarro com sangue que desaparecem algumas horas após o

exame. Este exame será feito apenas na primeira vez.

3- Coleta de sangue: o(a) Sr. (a) fará exame para HIV. Este exame é importante porque algumas pessoas com

tuberculose também têm o vírus da AIDS. A coleta de sangue poderá dar pequena dor local e hematoma, que

desaparecerá ao fim de alguns dias. Os médicos estão prontos a lhe explicar tudo o que o(a) Sr. (a) queira saber

sobre o HIV.

Peça mais alguns esclarecimentos aos médicos do projeto. Se o(a) Sr. (a) não tiver mais dúvidas e

quiser participar do estudo, por favor assine a declaração abaixo.

Declaro, de livre e espontânea vontade, que me sinto esclarecido sobre o projeto “História natural da

tuberculose, investigação através do escarro induzido seriado antes, durante e após introdução da

quimioterapia” e concordo em participar.

Rio de Janeiro, de de

Anexos 161

__________________________

_______________________

Participante Representante legal

CPF

__________________________

________________________

Testemunha Testemunha

CPF

Anexos 162

11.6- Anexo 6 Questionário de entrevista

DIAGNÓSTICO FINAL:_________________________ CÓDIGO: _____

PROJETO: ESTABELECIMENTO DE “SCORE” CLÍNICO-RADIOLÓGICO

PARA PACIENTES COM SUSPEITA DE TUBERCULOSE PULMONAR. (versão

junho/99)

Ficha número_________ Data ___/___/___ Pront.___________________ REC ________

IDENTIFICAÇÃO

1. Nome__________________________________________________

2. Nasc___/___/___ idade____

3. Sexo (___) 1. M 2. F

4. Cor (___) 1. Branco 2. Negro 3. Pardo 4. Amarelo

5. Naturalidade (Estado) _________________

6. Estado Civil (___) 1. Casado 2. Não Casado

7. Profissão__________________________

7.1. Ocupação Atual __________________________

7.2. Ocupação(ões) Anterior(es) ______________________

8. Endereço_______________________________________________________

Referência______________________________________________________

9. Tel___________________________

Tipo de contato___________________________

10. Serviço de origem ____________________________

10.1. Paciente do HUCFF: (___) 0 N 1S

Anexos 163

11. Internado no momento (___) 0 N 1S

Onde?_______________________________________

QUESTIONÁRIO

12.

PERFIL SÓCIO-ECONÔMICO

12.1. O sr. sabe ler e escrever? (___) 0 N 1 S

12.1.2. O sr. estudou ? (___) 0 N 1 S

12.1.3. O sr. estudou até o (___)

A. primeiro grau incompleto C. segundo grau incompleto E. superior incompleto

B. primeiro grau completo. D. segundo grau completo F. superior completo

12.2. A sua renda familiar é proveniente de fonte fixa e regular (salário, mesada,

rendimentos): (___) 0 N 1 S

12.3. Qual o valor médio da sua renda e de seus familiares, em salários mínimos, seja ela

regular ou irregular: (___)

A. até 1 sal/mês C. de 2-3 sal/mês E. de 4-5 sal/mês

B. de 1-2 sal/mês D. de 3-4 sal/mês F. > 5 sal/mês

12.4. Qual o número de pessoas sustentadas com essa renda familiar? (incluíndo-se o

próprio) _____

13.

CONDIÇÕES DE MORADIA

13.1. O sr. mora em (___)

Apartamento

B.casa C.quarto D.

vaga

E.barraco na

favela

F.barraco na

rua

G.na rua sem

barraco

H. outro

Anexos 164

13.2. Qual o n° de cômodos da residência (___)

13.3. Quantas pessoas moram com o sr. (excluíndo-se o próprio) (___)

13.4. Possui água encanada (___) 0 N 1 S

13.5. Possui luz elétrica (___) 0 N 1 S

13.6. Possui rede de esgoto (___) 0 N 1 S

13.7. Possui coleta regular de lixo (___) 0 N 1 S

14. RISCO PARA TUBERCULOSE

14.1. O sr. já teve algum problema no pulmão (tuberculose, mancha no pulmão, água na

pleura, pneumonia e etc...) que tivesse sido tratado em posto de saúde ou hospital por

mais de 3 meses? (___) 0 N 1 S. Caso a resposta seja

SIM, responda as próximas

questões assinalando no campo específico o evento mais recente, porém registrando na

frente (nos espaços em branco) os outros que possam ter ocorrido. Se NÃO, pule para a

questão 14.1.3 respondendo dessa mesma forma.

14.1.1. Há quanto tempo? ___________ meses

14.1.2. O sr. recebeu alta como curado pelo médico do posto de saúde ou do hospital?

(___) 0 N 1 S

14.1.3. O sr. já teve tuberculose em algum outro lugar fora do pulmão?

(___) 0 N 1 S

Caso a resposta seja SIM, responda as próximas questões. Se NÃO, pule para a questão

14.2.

14.1.4. Em que local do corpo o sr. teve essa tuberculose?__________________

14.1.5. Há quanto tempo? ___________ meses

14.1.6. O sr. recebeu alta como curado pelo médico do posto de saúde ou do hospital?

(___) 0 N 1 S

Anexos 165

14.2. O sr. já teve contato com alguma pessoa que estivesse com tuberculose ou em

tratamento para tuberculose? (___) 0 N 1 S. Caso a resposta seja SIM, responda as

próximas três questões assinalando no campo específico o contato mais recente, porém

registrando na frente (nos espaços em branco) os outros que possam ter ocorrido. Se

NÃO, pule para a questão 14.3.

14.2.1. Há quanto tempo isto ocorreu? _____ anos

14.2.2. Em que ambiente isto ocorreu? (___)

A. domiciliar B. trabalho C. hospitalar D. social

14.2.3. Qual era a intensidade do contato ? (___)

A. diário contínuo (5 a 7 dias/semana, > 6 h/dia)

B. diário intermitente (5 a 7 dias/semana, < 6 h/dia )

C. entre 2 a 4 dias/semana

D. semanal

E. quinzenal

F. não sabe

14.3.

FATORES DE RISCO PARA CONTAMINAÇÃO

14.3.1. sabe ter diabetes ou usa insulina ou remédio para baixar a glicose

(___) 0 N 1 S

14.3.2. tratamento de câncer até 6 meses atrás (___) 0 N 1 S

14.3.3. cirurgia de estômago (___) 0 N 1 S

14.3.4. usa meticorten ou decadron (corticóides) (___) 0 N 1 S

14.3.5. passado de hepatite ou icterícia ou ter ficado amarelo (___) 0 N 1 S

15. FUMO

15.1. Atualmente o sr. fuma? (___) 0 N 1 S.

Caso a resposta seja

SIM, responda as questões 15.2, 15.3 e 15.8. Se não, pule para 15.4.

15.2. Quantos cigarros por dia? _____

Anexos 166

15.3. Quantos anos tinha quando começou a fumar? _____

15.4. Já fumou alguma vez? (___) 0 N 1 S. Caso a resposta seja SIM, responda as

próximas questões. Se não, pule para a questão 16.

15.5. Quantos cigarros por dia o senhor fumava? _____

15.6. Quantos anos tinha quando começou a fumar? _____

15.7. Há quanto tempo parou de fumar? _____ anos

15.8. Quantos maços/ano: _____

16.

ALCOOLISMO

Qual tipo de bebida o senhor prefere? (___)

A. cachaça B. cerveja C. vinho D. whisky E. outros F. nenhum

Caso o paciente admita o uso de qualquer das bebidas, passe ao item seguinte.

Caso o paciente escolha o item F, passe direto a questão 16.1 e marque 0 (NÃO).

a) O sr. tem facilidade de fazer amizades? (pergunta preparatória)

b) Alguma vez sentiu que deveria diminuir a quantidade de bebida?

(___) 0 N 1 S

c) Alguém critica ou já criticou o seu modo de beber? (___) 0 N 1 S

d) O sr. costuma beber pela manhã para diminuir o nervosismo ou a ressaca? (___) 0 N 1

e) O sr. se sente culpado pela maneira que costuma beber? (___) 0 N 1 S

Caso o paciente tenha respondido

SIM a pelo menos DUAS das questões (b, c, d, e),

considere o item

16.1 (ALCOOLISMO) como positivo, e marque a opção 1 ( SIM ).

Anexos 167

16.1. Alcoolismo (___) 0 N 1 S

SINTOMAS

17. TOSSE

17.1. Nos últimos meses o sr. teve algum tipo de tosse? (___) 0 N 1 S

Se a resposta for

NÃO, pule direto para o item 18.1. Se a resposta for SIM,

responda os próximos itens:

17.2. Há quanto tempo? ___________ semanas. Para ajudar o paciente, pode perguntar:

janeiro (ano novo) abril (páscoa) julho (férias)

outubro (dia das crianças)

fevereiro (carnaval) maio (dia das mães) agosto (dia dos pais)

novembro (finados)

março (começo das aulas) junho (São João) setembro (7 de

setembro) dezembro (natal)

17.3. Nos últimos 7 dias o sr. tem tido tosse : (___)

A. todo dia C. pelo menos uma vez por

semana

B. Duas a três vezes por semana D. não teve tosse nos últimos 7 dias

17.4. Quando o sr. respira fundo, a sua tosse: (___)

A. piora muito B. piora só um pouco C. não muda nada

D. não sabe informar

18.

ESCARRO

18.1. O sr. escarrou ou teve catarro no pulmão nos últimos meses?

(___) 0 N 1 S

Se a resposta for

NÃO, pule direto para o item 18.7. Se a resposta for SIM,

responda os próximos itens:

Anexos 168

18.2. Há quanto tempo? ___________semanas. Para ajudar o paciente, pode perguntar:

janeiro (ano novo) abril (páscoa) julho (férias)

outubro (dia das crianças)

fevereiro (carnaval) maio (dia das mães) agosto (dia

dos pais) novembro (finados)

março (começo das aulas) junho (São João) setembro (7 de

setembro)

dezembro (natal)

18.3. Nos últimos 7 dias o sr. tem escarrado ou tido catarro no pulmão? (___)

A. Todo dia C. Pelo menos uma vez por semana

B. Duas a três vezes por semana D. Não teve escarro nos últimos 7 dias

18.4. O volume de catarro que o sr. coloca(va) para fora em um dia é(era) capaz de

encher: (___)

A. Menos de uma colher de café D. Uma colher de sopa G. Um copo

ou mais de escarro

B. Uma colher de café E. Mais de uma colher de sopa H. Ignora

C. Duas colheres de café F. Meio copo

18.5. O seu catarro é(era) na maioria das vezes:

(___) A. Espesso ou grosso B. Fino ou fluido

18.6. O seu catarro tem (tinha) na maioria das vezes uma coloração? (___)

A. Branco ou claro B. Amarelado C. Esverdeado D.

Cinza

18.7. Alguma vez o sr. já escarrou sangue ou teve sangue misturado em seu catarro?

(___) 0 N 1 S

Caso a resposta seja

SIM, responda as próximas questões. Se não, pule para a

questão 19.1.

Anexos 169

18.8. Há quanto tempo? ___________ semanas

18.9. O sangue em seu catarro é (era): (____)

A. Em raias B. Em coágulos C. Líquido ou

sangue puro

19.

FEBRE

19.1 Nos últimos meses o sr. teve febre? (___) 0 N 1 S

Se a resposta for

NÃO, pule direto para o item 20.1. Se a resposta for SIM, responda

os próximos itens:

19.2. Há quanto tempo? ___________ semanas. Para ajudar o paciente, pode perguntar:

janeiro (ano novo) abril (páscoa) julho (férias)

outubro (dia das crianças)

fevereiro (carnaval) maio (dia das mães) agosto (dia dos pais)

novembro (finados)

março (começo das aulas) junho (São João) setembro (7

de setembro)

dezembro (natal)

19.3. Nos últimos 7 dias o sr. teve febre? (___)

A. todo dia C. pelo menos uma vez por semana

B. Duas a três vezes por semana D. não teve tosse nos últimos 7 dias

19.4. A que horas a febre aparece na maioria das vezes? (___)

A. manhã (6h às 12h) C. de tardinha (17h às 19h) E. madrugada (24h às 6h)

B. tarde (12h às 17h) D. noite (19h às 24h) F. sem relação com horário

20.

SUDORESE

20.1. Nos últimos meses o sr. tem apresentado suor em quantidade superior a que

costumava ter normalmente, antes da doença? (sem relação com atividade física) (___) 0

N 1 S

Anexos 170

Se a resposta for NÃO, pule direto para o item 21.1. Se a resposta for SIM,

responda os próximos itens:

20.2. Há quanto tempo? ___________ semanas. Para ajudar o paciente, pode perguntar:

janeiro (ano novo) abril (páscoa) julho (férias)

outubro (dia das crianças)

fevereiro (carnaval) maio (dia das mães) agosto (dia dos pais)

novembro (finados)

março (começo das aulas) junho (São João) setembro (7

de setembro)

dezembro (natal)

20.3. Nos últimos 7 dias o sr. teve este tipo de suor? (___)

A. todos os dias. C. pelo menos uma vez por semana

B. duas a três vezes por semana D. não teve sudorese nos últimos 7 dias

21.

DOR TORÁCICA

21.1. Nos últimos meses o sr. teve dor no peito ou nas costas? (___) 0 N 1 S

Se a resposta for

NÃO, pule direto para o item 22. Se a resposta for SIM, responda

os próximos itens:

21.2. Há quanto tempo? ___________ semanas. Para ajudar o paciente, pode perguntar:

janeiro (ano novo) abril (páscoa) julho (férias)

outubro (dia das crianças)

fevereiro (carnaval) maio (dia das mães) agosto (dia dos pais)

novembro (finados)

março (começo das aulas) junho (São João) setembro (7

de setembro)

dezembro (natal)

21.3. Nos últimos 7 dias o sr. teve dor no peito ou nas costas? (___)

Anexos 171

A. todos os dias. C. pelo menos uma vez por semana

B. duas a três vezes por semana D. não teve dor nos últimos 7 dias

21.4. Esta dor piora(va) com o esforço? (___) 0 N 1 S

21.5. Qual o tipo dessa dor? (___)

A. Pleurítica B. Não Pleurítica (ex: contínua, constritiva, s/ relação c/

respiração, outras)

21.6. Qual a localização onde essa dor mais lhe incomoda(va)?

21.6.1. Retroesternal (___) 0 N 1 S

21.6.2. Qual o hemitórax? (___) A. Direito B. Esquerdo C. Bilateral

21.6.3. Qual a localização? (___)

A. 1/3 superior B. 1/3 médio C. 1/3 inferior

D. 2/3 superior E. 2/3 inferior F. Difusa

21.6.4. Qual o tipo? (___) A. Superficial B. Profunda

22. TEMPO DE INÍCIO DO PRIMEIRO SINTOMA: ______ semanas

QUAL? ____________

23. BAAR ANTERIOR DE ESCARRO ESPONTÂNEO: (___) 0 N 1 S

LOCAL DE REALIZAÇÃO? ______________________________________

23.1. PPD: (___) 0 N 1 S ______ mm Data: ___/___/___

24. EMAGRECIMENTO (+ de 10% do peso habitual): (___) 0 N 1 S

25. FALTA DE AR (distinguir de astenia ou cansaço): (___) 0 N 1 S

26. PERDA DE APETITE: (___) 0 N

1 S

27. USO PRÉVIO DE ANTIBIÓTICO (para a doença atual): (___) 0 N 1 S

QUAL? _________________________

Anexos 172

28. FATORES PREDITIVOS NEGATIVOS

Nos últimos trinta dias o sr. teve?

28.1. dor de cabeça na região da testa: (___) 0 N 1 S

28.2. dor na face: (___) 0 N 1 S

28.3. dor de garganta: (___) 0 N 1 S

28.4. frio maior que as outras pessoas: (___) 0 N 1 S

28.5. tremores incontroláveis (calafrio): (___) 0 N 1 S

28.6. dor muscular: (___) 0 N 1 S

28.7. diarréia aquosa: (___) 0 N 1 S

28.8. vômitos: (___) 0 N 1 S

28.9. Eu vou dizer alguns problemas de saúde para o senhor. Por favor diga quais são os

dois que mais o incomodaram nos últimos dias, a ponto de fazê-lo procurar o médico

(___) (___)

A. falta de ar E. tosse com

sangue

I. dor na face M.outro_____________

B. dor torácica F. febre J.

emagrecimento

C. tosse G. sudorese K. diarréia

D. tosse produtiva H. cefaléia na

testa

L. vômito

29. RISCO PARA HIV

29.1. De 1983 até agora o sr. teve relações sexuais? (___) 0 N 1 S

Em caso de

NÃO ou recusa em responder, pule para a questão 29.6. Em caso de

SIM, responda as próximas perguntas:

Anexos 173

29.2. O sr. durante toda a sua vida teve relações sexuais somente com homens? Somente

com mulheres? Com homens e mulheres? (___) (marcar o comportamento sexual do

entrevistado)

A. homem heterossexual C. homem homossexual E. homem bissexual

B. mulher heterossexual D. mulher homossexual F. mulher bissexual

29.3. O sr. já teve algum parceiro sexual que em seu conhecimento fosse: (____)

A. usuário de drogas na veia C. que exercia a prostituição E. ignora

B. hemofílico D. portador de HIV

29.4. Aproximadamente com quantas pessoas o sr. teve relações sexuais nos últimos 12

meses? (___)

29.5. O sr. usa camisinha? (___) 0 N 1 S

29.5.1. Caso SIM, responda: (___)

A. sempre B. na maioria das vezes C. raramente

29.6. O sr. é hemofílico? (___) 0 N 1 S

29.7. Já tomou sangue ou foi submetido a transfusão sanguínea? (___) 0 N 1 S

29.8. Quando? _______ (ANO)

29.9. Já fez uso de drogas na veia? (___) 0 N 1 S

29.10. Já foi submetido a alguma cirurgia ("operação")? (___) 0 N 1 S

QUANDO? ______ (ANO)

QUAL? __________________________________

30.

PESQUISA DE ANTI-HIV

30.1. O sr. já realizou exame de sangue para pesquisa de anti-HIV (AIDS)? (___) 0 N 1

S Data ___ /___ /___

30.1.1. Resultado (__)

1. POSITIVO 2. NEGATIVO 3. IGNORADO

Anexos 174

31.

COMORBIDADE

31.1. Rinite/Asma (___) 0 N 1 S

31.2. DPOC (___) 0 N 1 S

31.3. Insuficiência Renal (___) 0 N 1 S

31.4. ICC (___) 0 N 1 S

31.5. Insuficiência Hepática (___) 0 N 1 S

31.6. Outras: _________________________________________

EXAME CLÍNICO

32.

INSPEÇÃO

32.1. Performance status - índice de Karnofisky (____)

DEFINIÇÃO % CRITÉRIO

Capaz de manter atividades físicas e

de trabalho normais. Não necessita

cuidados especiais

100 Normal e sem queixas. Sem evidências de doença

90 Capaz de levar vida normal. Sinais e sintomas minor

de doença.

80 Atividade normal com esforço. Alguns sinais e

sintomas de doença.

Incapaz de trabalhar. Capaz de viver

em casa e resolver suas necessidades

pessoais. Uma quantidade variável de

cuidados é necessário

70 Cuidados pessoais. Incapaz de ter atividades normais

ou trabalhar ativamente

60 Necessita ocasionalmente de ajuda, mas é capaz de

suprir a maioria das próprias necessidades

50 Necessita de ajuda considerável e freqüentes cuidados

médicos

Anexos 175

Incapaz de cuidar de si mesmo.

Necessita do equivalente aos

cuidados hospitalares. Doença

progride rapidamente

40 Incapacitado. Necessita de cuidados especiais e

assistência

30 Severamente incapacitado. A hospitalização é

indicada, embora o óbito seja iminente

20 Muito doente. A hospitalização é necessária. Suporte

ativo de tratamento é necessário

10 Moribundo

32.2. Freqüência respiratória: _____ irpm

32.3. Temperatura Axilar _____ °C

32.4. Cianose (___) 0 N 1 S

32.5. Icterícia (___) 0 N 1 S

32.6. Hipohidratado (___) 0 N 1 S

32.7. Hipocorado (___) 0 N 1 S

32.8. Dispnéico (___) 0 N 1 S

32.9. Tiragem intercostal (___) 0 N 1 S

32.10. Cicatriz de vacinação com BCG (___) 0 N 1 S (inserção inferior do músculo

deltóide direito)

33.

EXAME FÍSICO

33.1. Adenomegalia (___) 0 N 1 S

33.2. Localização (___)

A. no pescoço

B. na axila

C. na virilha

D. em dois locais (pescoço/axila/virilha)

Anexos 176

E. generalizada

F. outras: __________

33.3. Ausculta pulmonar I (___) A. Normal B. Anormal

Caso o item marcado na questão anterior tenha sido o A, pule a próxima questão:

33.3.1. Ausculta pulmonar II (___/___/___) (___/___/___) (___/___/___)

A. ester.

Crepitante

E. MV

diminuído

1. direita Y. 1/3 médio V. difuso

B. ester.

Subcrepitante

F. MV

abolido

2. esquerda Z. 1/3

inferior

C. roncos G. atrito

pleural

3. bilateral W. 2/3

superior

D. sibilos H. sopro

tubário

X. 1/3

superior

K. 2/3

inferior

33.4. Hepatomegalia (___) 0 N 1 S

33.5. Esplenomegalia ou traube ocupado (___) 0 N 1 S

33.6. Ascite (___) 0 N 1 S

33.7. Massa abdominal palpável (___) 0 N 1 S

33.8. Edema em membros inferiores (___) 0 N 1 S

33.9. Panturrilhas (___) A. Livres B. Empastadas

33.10. CRITÉRIO DE CARACAS/RIO DE JANEIRO

1- ( ) 10 Sarcoma de Kaposi

2- ( ) 10 TB disseminada/extrapulmonar/pulmonar não cavitária

3- ( ) 5 Candidíase oral ou leucoplasia pilosa

4- ( ) 5 TB pulmonar cavitária ou não especificada

5- ( ) 5 Herpes zoster em indivíduos com até 60 anos de idade

6- ( ) 5 Disfunção do SNC

Anexos 177

7- ( ) 2 Diarréia ≥ 1 mês

8- ( ) 2 Febre ≥ 1 mês

9- ( ) 2 Caquexia ou perda de peso corporal > 10%

10-( ) 2 Astenia ≥ 1 mês

11-( ) 2 Dermatite persistente

12-( ) 2 Anemia e/ou linfopenia e/ou trombocitopenia

13-( ) 2 Tosse persistente ou qualquer pneumonia (exceto TB)

14-( ) 2 Linfadenopatia ≥ 1cm, ≥ 2 sítios extra-inguinais, por período ≥ 1 mês

CARACAS ( ) 0 < 10 1 ≥ 10

33.11. Escrever o valor do somatório: _______

34.

TRATAMENTO ASSOCIADO

34.1. O paciente está usando alguma medicação no momento? (___) 0 N 1 S

34.2. Quais e há quanto tempo ? (___/___) (___/___ ) (___/___) (___/___) (___/___)

isoniazida

D. pentamidina G. DDI J. Antibiótico

Qual?____________________

B. esquema

tríplice

(RIP)

E. nizoral H. AZT K. Outros

Qual?____________________

C. bactrin F. fluconazol I. DDS 1. há 1 semana ou menos

2. entre 7 e

14 dias

3. entre 14 e 21

dias

4. entre 21 e

28 dias

5. há mais de 28 dias

36.1. Quantas alíquotas (20 ml) de solução salina foram necessárias p/ a

obtenção do material: _____.

37. Tempo gasto para indução do escarro? ______ minutos

38. Qualidade do material obtido?

(___) A. Bom B. Ruim C. Insuficiente

38.1. Apresentou alguma intercorrência durante o exame? (___) 0 N 1 S

Anexos 178

QUAL? ______________

38.2. Necessitou interromper o exame? (___) 0 N 1 S

40. RADIOGRAMA TORÁCICO

40.1. Data ___/___/___ (___) 0 Normal 1 Anormal

40.2. Alterações: (___/____/___) (___/____/___) (___/____/___) (___/____/___)

(___/____/___)

A. Direito B. Esquerdo C. Bilateral

1. Consolidação homogêneo 2. Consolidação heterogêneo 4.Infiltradointersticial

nodular

5. Infiltrado intersticial reticular 6. Infiltrado intersticial retículo-nodular

7. Infiltrado intersticial micronodular 8. Cavidade ≤ 2 cm 9. Cavidade > 2

11. Calcificação 12. Derrame pleural 13. Espessamento

pleural

14. Adenomegalia hilar 15. Adenomegalia mediastinal 16. Nódulo

17. Massa 20. Trave fibrótica 21. Outros:

____________

X. Superior Y. Médio W. Inferior V. Difuso

Quem preencheu? NOME:_______________________________

ASS: ________________________________

Quem revisou? NOME:__________________________

ASS: _______________________DATA: ___/___/___

Anexos 179

11.7- Anexo 7 Artigo submetido à avaliação

da revista J Exp Medicine

Anexos 180

Anexos 181

Anexos 182

Anexos 183

Anexos 184

Anexos 185

Anexos 186

Anexos 187

Anexos 188

Anexos 189

Anexos 190

Anexos 191

Anexos 192

Anexos 193

Anexos 194

Anexos 195

Anexos 196

Anexos 197

Anexos 198

Anexos 199

Anexos 200

Anexos 201

Anexos 202

Anexos 203

Anexos 204

Anexos 205

Anexos 206

Anexos 207

Anexos 208

Anexos 209

Anexos 210

Anexos 211

Anexos 212

Anexos 213

Anexos 214

Anexos 215

Anexos 216

11.8- Anexo 8 artigo no PRELO- Pediatrics

Anexos 217

Anexos 218

Anexos 219

Anexos 220

Anexos 221

Anexos 222

Anexos 223

Anexos 224

Anexos 225

Anexos 226

Anexos 227

11.9- Anexo 9 artigo publicado- Braz J Med Biol Res

Anexos 228

Anexos 229

Anexos 230

Anexos 231

Anexos 232

Anexos 233

Anexos 234

Anexos 235

Anexos 236

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