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ASPECTOS MORFOANATÔMICOS, BIOQUÍMICOS E GENÉTICOS
DE HIMATANTHUS SUCUUBA WOOD., EM AMBIENTE DE VÁRZEA
E DE TERRA FIRME DA BACIA AMAZÔNICA
CRISTIANE DA SILVA FERREIRA
Manaus, Amazonas
Outubro, 2006
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Livros Grátis
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CRISTIANE DA SILVA FERREIRA
ASPECTOS MORFOANATÔMICOS, BIOQUÍMICOS E GENÉTICOS
DE HIMATANTHUS SUCUUBA WOOD., EM AMBIENTE DE VÁRZEA
E DE TERRA FIRME DA BACIA AMAZÔNICA
Orientadora: Dra. Maria Teresa Fernandez Piedade
Co-orientador: Dr. Antônio Vargas de Oliveira Figueira
Tese apresentada ao Programa Integrado
de Pós-Graduação em Biologia Tropical e
Recursos Naturais, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Doutor em CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, área
de concentração em BOTÂNICA.
ii
Projeto INPA/Max-Planck de Cooperação Brasil-Alemanha
Manaus, Amazonas
Outubro, 2006
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F383 Ferreira, Cristiane da Silva
Aspectos morfoanatômicos, bioquímicos e genéticos de Himatanthus
Sucuuba Wood., em ambiente de várzea e de terra firme da bacia
Amazônica/
Cristiane da Silva Ferreira-- /Manaus : [s.n.], 2006.
90p. : 7 il.
Tese (Doutorado)--- INPA/UFAM. Programa de Pós-
Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais.
Orientador : Maria Teresa Fernandez Piedade
Co-orientador: Antônio Vargas de Oliveira Figueira
Área de concentração : Botânica
1. Himatanthus sucuuba – Ciclo de vida. 2. Himatanthus sucuuba -
Amazônia. 3. Himatanthus sucuuba – Avaliação genética. I. Título.
Sinopse:
Himatanthus sucuuba Wood. (Apocynaceae), é uma espécie que habita
ecossistemas de várzea e de terra firme na Amazônia Central. Plântulas
obtidas de sementes oriundas dos dois ambientes foram submetidas a
experimentos diferenciados de inundação, durante os quais foram
verificadas as respostas morfoanatômicas e metabólicas da espécie ao
alagamento. Análises de similaridade genética entre as populações dos
dois ambientes, em regiões eqüidistante ao longo do Rio Solimões,
foram realizadas por meio do marcador molecular ITS (internal
transcribed spacer).
Palavras-Chave:
Adaptações ao alagamento, diferença entre populações, metabolismo
de carboidratos, anoxia, biomassa.
iii
A
minha
querida avó,
Maria Furtunata Miranda, que muito antes eu começar a descobrir
a
importância da Amazônia para os outros povos, antes de eu descobrir um mund
o
além de suas matas, me iniciou no conhecimento das plantas e me ensinou
a
respeitar todos os outros elementos da
floresta. Minha primeira professora d
e
Botânica.
Dedic
o
A
Deu
s
e a minha família
Ofereç
o
iv
v
“Não quero ser o grande rio caudaloso
Que figura nos mapas.
Quero ser o cristalino fio d'água
Que canta e murmura na mata silenciosa”
( Helena K.)
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter conseguido concluir mais uma etapa da minha vida
profissional, e a Nossa Senhora, que me iluminou em toda essa caminhada.
Ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos
Naturais INPA/UFAM e a Coordenação do Curso de Botânica pela oportunidade
concedida na realização desse curso.
Agradeço a CAPES pela concessão de minha bolsa de estudos, ao Projeto
Inpa/Max-Planck e PPI nº 3600 que financiaram parte dessa pesquisa.
À minha orientadora, Dra. Maria Teresa Fernandez Piedade pelo apoio e
compreensão demonstrada desde a época do mestrado. Admirável figura como
pesquisadora dos segredos dessa Amazônia, e como amiga para os segredos dessa aprendiz
amazônida.
Agradeço especialmente ao Dr. Antônio Vargas de Oliveira Figueira por ter
aceitado me co-orientar, disponibilizado toda infra-estrutura do laboratório e por ter
dedicado parte de seu tempo para tentar solucionar as perguntas que eu lhe apresentava.
Aos Drs. Marcos Silveira Buckeridge e Marco Aurélio Tiné pela assistência na
parte de bioquímica da tese e pela paciência e atenção dispensada durante a discussão dos
resultados.
Ao Dr. Junk pelo apoio e a confiança depositada em mim nos seis anos no Projeto
INPA/Max-Planck e durante toda a elaboração deste trabalho.
Ao Exército Brasileiro, Comando de Fronteira Solimões / 8º Batalhão de Infantaria
de Selva, na pessoa do Tenente Coronel Francisco José Fonseca de Medeiros, que nos
forneceram o apoio logístico em campo e nos acompanharam nas coletas em Tabatinga e
Benjamin Constant.
Ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP) e de forma
diferenciada ao grupo do Laboratório de Melhoramento de Plantas, em especial a Janaína,
que esteve presente desde meus primeiros dias em Piracicaba, colega de classe, de
laboratório, de apartamento, dos dias alegres e daqueles difíceis; Débora, Lorena, Rachel e
Danielle, queridas amigas, que me fizeram sentir em casa mesmo estando tão distante; a
Jurema, que chegou depois, mas que se tornou igualmente especial; ao Paulo Albuquerque
e José Carlos, pelas nossas conversas científicas ou não no dia-a-dia do laboratório II ao
lado da salinha radioativa; ao Raul, Joni, Vagner, Rogério, Tercílio, Gildemberg (Jupará),
vii
João, Renato e Nebó, que sempre me falaram com otimismo, mesmo quando no 10º gel de
agarose, nada aparecia; a Raquel, Eduardo e Wlamir, sempre prestativos e queridos.
Aos amigos de fora do Laboratório Yuri, Licínia, Isabele, Roberta e Thomas, que
conheci durante minha estada em Piracicaba e por quem aprendi a ter especial carinho.
Ao Instituto de Botânica de São Paulo (IBt), de forma singular ao Laboratório de
Fisiologia e Bioquímica, que forneceu a estrutura para a realização das análises
bioquímicas. Aos colegas de bancada: Aline, Marina, Paty Pinho, Vanessa, Kelly,
Fernanda, Fernandinha, Naira, Amanda Sousa (Amandona), Amanda Sousa (Amandinha),
Amanda Asega, Fabinho, Rodrigo, Rosana e Ludimila pelo carinho e a amizade com que
me receberam. E aos demais colegas, técnicos e pesquisadores da Seção, em especial a
Dra. Maríliia, Dra. Rita, Dra. Márcia e Dr. Marcos Aidar, pela especial atenção, nos
momentos que os procurei.
Aos colegas de alojamento do IBt, com os quais aprendi valores importantes e que
se estenderam além da vida acadêmica. Às colegas de quarto: Angélica, Fernanda,
Cristiane, Andréa e Crosseti; e demais colegas residentes ou passageiros que sempre
encontraram uma forma alegre de passar o tempo e diminuir a saudade de casa. Pelo
companheirismo especial de alguns colegas de “Aloja” nas conversas que se estendiam
pela noite, e parceiros também de futebol, no campo improvisado no estacionamento do
IBt: Patrícia Jungbluth, Priscila, Milton Félix, Adriano e Sandra.
Aos colegas, que ainda estão ou que passaram pelo Inpa: Marcicleide, Kinupp,
Dayson, Helenires, Elen, Valéria, Tânia, Márcio, KK Bonates, Keid e Tony. A amizade de
vocês foi um dos bens mais precioso que adquiri ao longo dessa Pós-Graduação “inpiana”.
A Keillah Mara, Socorro Lira, Josephina Veiga e Carol Schwendener, verdadeiras
amigas-irmãs. Pelos favores, colos, discussão e momentos de muita alegria.
Ao querido casal Cecília & Reinaldo pelas discussões sérias ou simplesmente para
passar o tempo, por todo o apoio e pela amizade que me dedicaram.
Aos colegas pesquisadores, técnicos e estagiários do Projeto INPA/Max-Planck,
obrigada por terem me recebido carinhosamente de volta: a Astrid, que acompanhou mais
de perto os momentos da finalização e muitas vezes de aflição da tese e que sempre me
passou otimismo; ao Florian, Rubens Piedade, Auristela, Maristela, Jomber, Jochen,
Suzana, Aline, Eva, Maria Astrid, Daniel, Liene e de forma especial ao Sinomar, Robson,
Arianna, Sammya e Joneide, sempre dispostos a dar uma força quando foi necessário; a
Araceli e a Nina, que chegaram do outro lado do mundo e souberam de forma rápida se
viii
tornarem queridas; ao Valdeney, Celso, Lúcia, Wallace e Edivaldo que me acompanharam
e apoiaram durante as várias fases deste trabalho.
A Neide que sempre foi mais que a secretária do curso. Pela dedicação e seriedade
com que cuida dos que passam pela Botânica. É uma botânica nata, a verdadeira “alma” do
Programa, por toda essa amizade que nasceu durante meu período de Pós.
À turma da secretaria geral, Charles, Pedrinho, Arnoldo, Elci, Lira e Bia, sempre
prestativos. Por todo o auxílio nas várias fases da minha trajetória na Pós.
Agradeço também aos meus amigos Luis Carneiro e Patrícia Cordeiro, que mesmo
distantes, sempre reforçaram a torcida pelo meu sucesso.
Meus primos Ednaldo Nelson e Veridiana Scudeller, por me ampararem quando eu
mais precisei, no momento fundamental de toda essa jornada, e especialmente por
colocarem na minha vida as pessoinhas que tiveram, sem saber, um papel importantíssimo
nessa hora, o Pedro e a Luisa.
Às minhas primas Édsa, Lucinéia e Moara, além de tudo, minhas grandes e
queridas amigas.
Aos meus irmãos Vera, Cleisiane, Sérgio, Carlos Junio e Rodrigo; meus cunhados
Rayson e Jerry, e ao meu tio Dornélio, sou grata pela segurança e estímulos ao longo da
minha caminhada.
Aos meus sobrinhos Rayssa, Rayanne, Railson, Eduardo, Cayque e Larissa, minhas
preciosidades.
À minha mãe Dalva e minha avó Maria, pelo amor que me dedicaram e que foram
meus exemplos de força e perseverança. Meu pai Carlos Alberto, in memoriam, que de
alguma forma esteve sempre presente.
Ao querido amigo e companheiro Augusto que soube ser tão especial a todo o
momento, tendo um pouquinho de cada personagem importante que atuou nessa fase de
final da tese, e ao mesmo tempo foi único, nas vezes em que se esforçou para compartilhar
comigo sua experência, além da força e a energia que me foram essenciais.
E a todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse realizado.
ix
RESUMO GERAL
As plantas que ocorrem em ambientes sujeitos a ciclos anuais de inundação exibem
uma série das adaptações que permitem a essas espécies sobreviver a longos períodos de
redução ou mesmo ausência de oxigênio em todas as fases do seu ciclo de vida. Por outro
lado, não se espera que uma espécie da terra firme apresente estes tipos de adaptação.
Entretanto, este não parece ser caso de Himatanthus sucuuba, uma árvore que é encontrada
naturalmente colonizando as florestas de terra firme e de várzea ao longo do rio
Amazonas/Solimões. Estudos morfoanatômicos, bioquímicos e genéticos foram realizados
com populações de H. sucuuba que habitam a várzea e a terra firme na tentativa de
compreender os mecanismos que permitem que esta espécie colonize com sucesso estes
dois ecossistemas com características ambientais contrastantes. A síntese do conhecimento
atual (Capítulo I) fornece a fundamentação teórica necessária para a execução deste estudo.
Foi feita análise comparativa da constituição de reservas das sementes nas duas populações
(várzea e terra firme) e, por meio de experimentos independentes de inundação das
plântulas, em condições controladas, foram acompanhados: a) os aspectos do crescimento,
sobrevivência e incremento de biomassa, assim como alterações na morfologia da plântula
e na anatomia das folhas como resposta ao alagamento (Capítulo II). Essas respostas foram
analisadas em termos de suas implicações para o metabolismo e estabelecimento das
plântulas. Esses aspectos foram posteriormente desenvolvidos no Capítulo III, onde as
modificações no metabolismo de carboidratos nas plântulas de várzea e terra firme sujeitas
a anoxia na ausência de luz foram analisadas. Pelo fato de que estudos prévios com
populações desta espécie das regiões próximas a Manaus mostraram diferenças
bioquímicas e morfoanatômicas entre as populações dos dois ambientes, procedeu-se a
avaliação genética, pela análise de polimorfismo, em populações da espécie coletadas em
três regiões eqüidistantes ao longo do rio Solimões: Benjamim Constant, Tefé e Manaus
(Capítulo IV). As diferenças entre as populações se manifestam em níveis bioquímicos,
anatômicos e de incorporação e partição de biomassa nas plântulas em resposta ao
alagamento experimental, assim como na análise das seqüências de ITS (Internal
Transcribed Spacer). Por outro lado, a morfologia externa mostrou-se similar entre as duas
populações. Desta forma, são necessários ainda estudos dos sistemas reprodutivos e coletas
adicionais para confirmar ou não as tendências observadas e discutidas. Entretanto, pode
ser sugerida para a região amazônica uma diversidade florística bem superior àquela
presentemente assumida.
x
ABSTRACT
Plants that occur in environments that are subjected to annual cycles of flooding
have a series of adaptations to survive long periods of oxygen deprivation in all phases of
the life cycle. On the other hand, it is not expected that terra firme species would exhibit
these types of adaptation. However, this should not be the case of Himatanthus sucuuba, a
tree that is naturally found in both the terra firme and varzea forests along the
Amazon/Solimões River. Morphoanatomic, biochemical and genetic studies were
performed in terra firme and the varzea populations of H. sucuuba in an attempt to
understand the mechanisms that allow this species to successfully colonize these two
contrasting environments, the terra firme and the varzea. A synthesis of the current
knowledge is presented in chapter 1, which provides the necessary background for the
performed studies. I compared the seed reserve constitution of both the varzea and terra
firme populations of H. sucuuba. Seedling survival, growth, biomass accumulation,
changes in seedling morphology and in leaf anatomy in response to experimentally
controlled flooding were followed in seedlings from terra firme and varzea populations
subjected to partial and complete submersion (Chapter 2). The seedling response was
analyzed in terms of its implications for plant establishment and plant metabolism. This
was further developed in chapter 3, where the modifications of carbohydrate metabolism of
terra firme and varzea seedlings subjected to anoxia and absence of light was analyzed.
Because previous studies with Manaus populations of this species has suggested that terra
firme and varzea populations differed both in terms of morphoanatomy and biochemistry,
the genetic constitution of terra firme and varzea populations of this species was evaluated
by polymorphism analyses (chapter IV) using plant material collected in three equidistant
regions along the Solimões/Amazonas river: Bejamim Constant, Tefé and Manaus. H.
succuba showed genetic variation both between the terra firme and varzea populations
(variation between habitats) as well as along the Solimões/Amazonas River (latitudinal
difference). In addition there were clear differences at the biochemical level, in anatomy
and in biomass accumulation and partition between terra firme and varzea seedlings in
response to experimental flooding, as well as concerning sequences of the ITS (Internal
Transcribed Spacer). On the other hand external morphology was similar between both
populations. Therefore, additional studies are still necessary especially on the reproductive
systems in order to reinforce the trends observed and discussed. However, so far, we may
suggest for the Amazon region a higher floristic diversity than the currently assumed.
xi
ÍNDICE
RESUMO GERAL....................................................................................................... IX
ABSTRACT................................................................................................................. X
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................. XIV
LISTA DE TABELAS................................................................................................. XVI
CAPÍTULO I: Caracterização dos ambientes e ecofisiologia da vegetação................ 1
INTRODUÇÃO........................................................................................................... 2
1. Características gerais da Amazônia Ocidental......................................................... 2
1.1. Área total e as áreas inundáveis.............................................................................
1.2. Florestas de terra firme da Amazônia....................................................................
1.3. Características das florestas inundáveis: diferenças entre várzea e igapó.............
1.4. Florestas de várzeas na Amazônia.........................................................................
2
2
3
4
1.5. Florestas de várzea versus florestas de terra firme................................................ 5
2. Características das plantas inundadas....................................................................... 6
2.1. Germinação e desenvolvimento inicial: fases críticas na tolerância a inundação. 6
2.2. Alterações metabólicas das plantas sob alagamento............................................. 7
2.3. Sobrevivência de plantas ao alagamento das várzeas na Amazônia Central......... 9
3. Informações botânicas e econômicas da espécie em estudo..................................... 10
3.1. Distribuição geográfica.......................................................................................... 10
3.2. Morfologia e ecologia............................................................................................ 11
3.3. Importância econômica.......................................................................................... 12
OBJETIVO GERAL.................................................................................................... 13
HIPÓTESE................................................................................................................... 13
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 13
CAPÍTULO II: Respostas das plântulas de H. sucuuba ao alagamento: aspectos
morfoanatômicos das folhas, análise de crescimento, biomassa e sobrevivência........
20
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 21
2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 23
2.2. Áreas de estudo e coleta de material vegetal......................................................... 23
2.2.1. Fase da planta em estudo.................................................................................... 24
xii
2.3. Estabelecimento do experimento de alagamento................................................... 24
2.4. Crescimento, avaliação morfológica e sobrevivência das plântulas...................... 25
2.5. Biomassa................................................................................................................ 25
2.6. Número de folhas, área foliar e análise anatômica das folhas............................... 26
2.7. Delineamento experimental e análises estatísticas................................................ 27
3. RESULTADOS........................................................................................................ 27
3.1. Crescimento........................................................................................................... 27
3.2. Alterações na morfologia das plântulas................................................................. 28
3.3. Sobrevivência das plântulas durante os experimentos de submersão.................... 30
3.4. Acumulação de biomassa...................................................................................... 30
3.6. Número de folhas, área foliar total (AFT) e freqüência estomática...................... 32
3.7. Características da epiderme................................................................................... 34
4. DISCUSSÃO............................................................................................................ 35
CONCLUSÃO............................................................................................................. 39
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 39
CAPÍTULO III: Análises bioquímicas das sementes e de raízes de plântulas de
Himatanthus sucuuba...................................................................................................
43
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 44
2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 46
2.1. Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo................................. 46
2.2. Análises da composição das sementes................................................................... 46
2.2.1. Sementes inteiras................................................................................................ 46
2.2.2. Análise das reservas do endosperma.................................................................. 47
2.2.3. Produção de plântulas para o estabelecimento dos experimentos de
alagamento....................................................................................................................
48
2.2.4. Análises bioquímicas das raízes das plântulas................................................... 49
2.2.5. Análise estatísticas dos dados............................................................................ 49
3. RESULTADOS........................................................................................................ 50
3.1. Análise das sementes............................................................................................. 50
3.2. Análise bioquímica das raízes das plântulas sob alagamento............................... 52
4. DISCUSSÃO............................................................................................................ 56
4.1. Análise das reservas nas sementes......................................................................... 56
4.2. Análise do metabolismo das raízes de plântulas de H. sucuuba........................... 59
xiii
5. CONCLUSÕES........................................................................................................ 62
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 63
CAPÍTULO IV: Análise filogenética de Himatanthus sucuuba, baseada na
seqüência de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA..................................................
68
1.INTRODUÇÃO......................................................................................................... 69
2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 71
2.1 Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo.................................. 71
2.2 Análises moleculares..............................................................................................
2.2.1. Extração de DNA genômico total.......................................................................
73
73
2.2.2 Amplificação enzimática de fragmentos (PCR, Polymerase Chain Reaction).... 74
2.2.3 Clonagem e seqüenciamento das regiões de ITS................................................ 74
2.2.4 Análise das seqüências....................................................................................... 75
3.RESULTADOS........................................................................................................ 75
3.1 Eletroforese e seqüenciamento das regiões de ITS................................................ 75
3.2 Análise de similaridade entre as seqüências........................................................... 77
4. DISCUSSÃO............................................................................................................ 79
5. CONCLUSÃO......................................................................................................... 82
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................
Literatura citada........................................................................................................
82
85
90
ANEXOS
xiv
LISTA DE FIGURAS
Capitulo I
Figura 1 – Detalhes da espécie em estudo H. sucuuba: A) árvore com cerca de 20m de
altura; B) disposição das folhas e posição da inflorescência (seta); C) fruto folículo
geminado; e D) sementes aladas....................................................................................12
Capitulo II
Figura 1 – Mapa das áreas de coleta de sementes de H. sucuuba, nas áreas de várzea e terra
firme próximas a Manaus. .............................................................................................23
Figura 2 – Crescimento médio acumulativo das plântulas de H. sucuuba, durante os 90 dias
de experimentação: A) populações da várzea e B) populações da terra firme. Dados
expressos em termos de média + erro padrão, n = 10...................................................28
Figura 3 – Detalhes das raízes de plântulas de H. sucuuba, submetidas ao tratamento de
submersão parcial. A) tratamento VZSP; B) tratamento TFSP. L = lenticelas e R = raízes
adventícias.....................................................................................................................29
Figura 4 – Raízes de plântulas de H. sucuuba aos 90 dias do tratamento de inundação total.
A = várzea e B = terra firme. ........................................................................................30
Figura 5 – Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de
H. sucuuba. pc) parede celulósica; ct) cutícula; e) estômato; cg) células guardas; cs) células
subsidiárias. ..................................................................................................................34
Figura 6 – A) epiderme abaxial com estômatos geminados (eg). B) detalhe da epiderme
abaxial mostrando os estômatos. .................................................................................35
Figura 7 – Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de
H. sucuuba, submetidas ao tratamento de alagamento total. ct) cutícula; e)
estômato.......................................................................................................................35
Capítulo III
Figura 1 – Área dos constituintes do endosperma da semente de H.
sucuuba........................................................................................................................51
xv
Capítulo IV
Figura 1 – Mapa do Estado do Amazonas, com a identificação das regiões dos municípios
de Benjamin Constant, Tefé e Manaus, localizados as margens do Rio
Solimões......................................................................................................................71
Figura 2 – A) Coleta de material vegetal das plantas de sucuúba, para uso nas análises
moleculares. B) a seta indica a região do câmbio (camada esbranquiçada, mais superficial)
retirada e armazenada em sílica gel. I = raio de 1cm..................................................72
Figura 3 – Gel de eletroforese 1% agarose. As bandas visualizadas são: 1 = TFBC1; 2 =
VZBC1; 3 = TFTF1; 4 = VZTF1; 5 = TFMN1 e 6 = VZMN1. MM = marcador molecular -
foi usado λHindIII.......................................................................................................76
Figura 4 – Esquema da região de ITS (ITS1 e ITS2) do gene de ribossomo (rDNA). Os
genes são representados pelos retângulos, com os espaços intergênicos entre eles. A seta
indica a direção dos primers utilizados para amplificação da região intergênica.
.....................................................................................................................................76
Figura 5 – Árvore filogenética mostrando a relação entre as populações de sucuúba da terra
firme e da várzea, nas três regiões geográficas amostradas: Benjamin Constant (VZBC e
TFBC); Tefé (VZTF e TFTF) e Manaus (VZMN e TFMN). Os números nas ramificações
representam o percentual de 1000 bootstrap. .............................................................78
Figura 6 – Fenograma resultante do alinhamento das seqüências de ITS1-58.S – ITS2
rDNA das populações de sucuúba, ao longo da calha do Rio
Solimões/Amazonas....................................................................................................79
Figura 7 – Sobreposição de padrões de endemismo em plantas, borboletas e pássaros do
Neotrópico, identificadas como “refúgios” [Retirado de Haffer & Prance
(2002)].........................................................................................................................81
Considerações Finais
Figura 1. Fluxograma com as principais características demonstradas pelas populações de
Himatanthus sucuuba, durante a fase de germinação e de estabelecimento de plântulas em
ambientes de várzea e de terra firme. * dados complementares de Ferreira (2002)...88
xvi
LISTA DE TABELAS
Capítulo II
Tabela 1 – Presença (S), ausência (N) e intensidade (+) das alterações morfológicas
apresentadas pelas plântulas em função do alagamento...............................................29
Tabela 2 – Taxa de sobrevivência das plântulas após 90 dias do início dos experimentos de
submersão. n = 10.........................................................................................................30
Tabela 3 – Valores médios da biomassa total (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a
partir de sementes das populações de várzea e de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob
diferentes tratamentos de submersão............................................................................31
Tabela 4 – Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas
a partir de sementes das populações de várzea, aos 30 e 90 dias, sob diferentes tratamentos
de submersão................................................................................................................32
Tabela 5 – Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas
a partir de sementes das populações de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob diferentes
tratamentos de submersão. P51..................................................................................32
Tabela 6 – Média dos valores de número de folhas, área foliar total (AFT) da plântula e
freqüência estomática de H. sucuuba, 30 dias após o início dos tratamentos de submersão.
...................................................................................................................................33
Tabela 7 – Influência do alagamento no comprimento e na largura de estômatos; e no
tamanho do poro estomático das folhas de plântulas de H. sucuuba, dos ambientes de
várzea e terra firme....................................................................................................34
Capitulo III
Tabela 1 – Concentração de amido e açúcares solúveis totais em lotes de três sementes de
H. sucuuba de populações da várzea e da terra firme. n = 51..................................50
Tabela 2 – Valores médios da massa seca de lotes com 10 sementes de H. sucuuba: massa
do endosperma, do embrião e total (semente inteira). n = 5...................................50
Tabela 3 – Percentual (área) dos monossacarídeos de reserva de parede, no endosperma de
H. sucuuba............................................................................................................51
xvii
Tabela 4 – Valores médios das concentrações de malato (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme ao 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3 ....................................................................................................52
Tabela 5 – Valores médios das concentrações de citrato (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme ao 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3......................................................................................................53
Tabela 6 – Valores médios das concentrações de frutose (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme ao 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3......................................................................................................54
Tabela 7 – Valores médios das concentrações de glucose (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme ao 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3......................................................................................................54
Tabela 8 – Valores médios das concentrações de mioinositol (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme ao 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3. ....................................................................................................55
Tabela 9 – Valores médios das concentrações de sacarose (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme ao 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3.....................................................................................................56
Capítulo IV
Tabela 1 – Identificação das amostras de sucuúba coletadas de populações que colonizam
áreas ao longo da Bacia Amazônica.....................................................................73
Tabela 2 – Tamanho dos fragmentos amplificados via PCR utilizando os primers ITS1 e
ITS4, nas populações de terra firme (TF) e várzea (VZ) das três regiões geográficas
(municípios de Benjamin Constant, Tefé e Manaus).......................................... 77
1
CAPÍTULO I
Caracterização dos ambientes e ecofisiologia da vegetação
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. Características gerais da Amazônia Ocidental
1.1 - Área total e as áreas inundáveis
A Amazônia é a maior reserva de diversidade biológica do mundo e também o
maior bioma brasileiro em extensão, ocupando quase a metade do território nacional
(49,29%). A bacia amazônica cobre 2/5 da América do Sul e 5% da superfície terrestre.
Sua área, de aproximadamente 6,5 milhões de quilômetros quadrados, abriga a maior rede
hidrográfica do planeta, que escoa cerca de 1/5 do volume de água doce do mundo.
Sessenta por cento da bacia amazônica se encontra em território brasileiro, se estendendo
pela totalidade de cinco unidades da federação (Acre, Amapá, Amazonas, Pará e Roraima),
grande parte de Rondônia (98,8%), mais da metade de Mato Grosso (54%), além de parte
do Maranhão (34%) e Tocantins (9%) (IBGE, 2004).
Apesar de aparentar uniformidade em termos fisionômicos, a observação detalhada
mostra que não só a composição de espécies varia grandemente entre as diversas áreas que
compõem o Bioma, como é muito evidente a correlação entre tipos similares de florestas e
a bacia hidrográfica associada. Foi com base nesse padrão que Pires & Prance, em 1985,
dividiram a vegetação amazônica em dois grupos principais: a vegetação de terra firme e a
vegetação inundável, esta última subdividida em diversos grupos.
A floresta de terra firme é o tipo de formação dominante e ocupa cerca de 80% da
área total da Amazônia brasileira (Pires, 1973; Prance, 1978). Segundo a classificação de
Braga (1979), a área remanescente de 20% corresponde a outros oito tipos de biomas, dos
quais os mais importantes são as florestas inundáveis, classificadas genericamente como
várzeas e igapós. Juntas essas áreas alagáveis somam 6% da área total da Amazônia
brasileira, ou cerca de 300.000 km
2
, sendo 100.000 km
2
áreas de igapó e 200.000 km
2
áreas de várzea, o que corresponde a maior porção de florestas inundáveis do mundo (Junk,
1993).
1.2. Florestas de terra firme na Amazônia
O termo terra firme se aplica a todas as florestas que não são sazonalmente
inundadas pelas cheias dos rios, diferenciadas assim das florestas de várzea e igapó
(Ribeiro et aI., 1999).
A maioria dos solos que compõem esse tipo de formação tem um baixo potencial
para suprir nutrientes como o cálcio e o potássio para as plantas, o que está relacionado a
3
fatores abióticos como altas temperaturas e pesadas chuvas, bem como a história geológica
da região. A exposição a intensas lixiviações durante milhões de anos removeu os
nutrientes dos minerais que formam o solo (Sioli & Klinge, 1962; Jordan, 1985). No
entanto, a despeito da pobreza nutricional dos solos, as florestas de terra firme
caracterizam-se por apresentar uma alta diversidade e elevada biomassa (Pires & Prance,
1985; Moreira & Malavolta, 2002). Isso é o resultado de uma circulação fechada de
nutrientes ou a permanente reciclagem dos mesmos, promovida pelos microorganismos do
solo, tornando-a independente da pobreza de nutrientes no substrato (Jordan, 1982; Sioli,
1985; Dalal, 1998; Moraes et al., 2004).
A floresta de terra firme da Amazônia, embora seja em geral menos conhecida e
menos utilizada que a floresta de várzea, apresenta maior diversidade de espécies e é muito
mais extensa (Prance et al., 1976; Ribeiro et al., 1999; Oliveira & Amaral, 2005). Embora
pareça fisionomicamente única em imagens espaciais, a floresta tropical úmida não é
florística-, nem estruturalmente homogênea (Pires & Prance, 1985; Ribeiro et al., 1999).
Por exemplo, as florestas da Amazônia Ocidental geralmente são consideradas mais ricas
em espécies que as da Amazônia Oriental, devido a maior pluviosidade e qualidade do solo
(Oliveira & Mori, 1999). Por outro lado, na região de Manaus há a ocorrência de uma
estação seca bem definida e o solo apresenta-se pobre. Contudo, nessa área verifica-se um
endemismo muito grande de espécies, explicado pela teoria dos refúgios (Haffer & Prance,
2001; 2002). Essa alta diversidade estaria relacionada também a confluências de regiões
fitogeográficas distintas (Oliveira & Daly, 1999).
1.3. Características das florestas inundáveis: diferenças entre várzea e igapó
Pires & Prance (1985), classificaram os principais tipos de florestas inundáveis na
Amazônia como várzea e igapó. As várzeas são definidas como áreas alagadas por águas
brancas ou lamacentas, enquanto que os igapós associam-se às áreas alagadas por águas
pretas ou claras. Embora esses termos sejam oriundos da terminologia popular e tenham
sido freqüentemente no passado motivo de confusões, após as revisões de Sioli (1950) e
Prance (1979), eles passaram a ser amplamente aceitos pela comunidade científica.
Os rios de águas pretas drenam regiões de solos arenosos, pobres em nutrientes,
intercalados com praias arenosas e pH da água ácido, variando de 4 a 5, enquanto os rios
de águas brancas são nutricionalmente ricos, carregando muitos sedimentos,
freqüentemente originados dos Andes e encostas pré-Andinas, e apresentam pH próximo
4
da neutralidade (Klinge & Ohly, 1964; Prance, 1978; Junk & Fürch, 1980; Fürch, 1984;
Junk, 1984).
Devido a movimentos de deposição e ressurgimento de sedimentos ou mesmo o
represamento de lagos e canais ao longo do ciclo hidrológico, mudanças na coloração das
águas podem ocorrer, sem que estas sejam necessariamente relacionadas à fisico-química
do sistema (Ayres, 1993). Por esse motivo, uma diferenciação mais precisa entre os
ambientes de várzea e igapó, deve considerar além da cor das águas, sua relação com os
solos e as formações geológicas das áreas de captação, que vão influenciar as condições
químicas e fisico-químicas da água (Sioli & Klinge, 1962; Klinge & Ohly, 1964; Junk &
Fürch, 1980), como também a florística desses ambientes (Worbes, 1997).
1.4. Florestas de várzeas na Amazônia
A previsibilidade dos ciclos de inundação e seca, anuais, decorrentes da repetição
desses eventos em tempo geológico, é responsável pela presença de organismos altamente
adaptados a esses ambientes (Junk et al., 1989). Essas peculiaridades têm sido relacionadas
à história geológica de sua formação, que data da época do Pleistoceno, quando ocorreram
flutuações no nível do mar, resultando em mudanças climáticas globais (Irion et al., 1983).
O nível do mar desceu cerca de 100 m abaixo do seu nível atual e o rio Amazonas e seus
tributários formaram largos e profundos vales; os rios fluíam mais rapidamente. Depois do
período glacial, os vales dos rios de águas brancas encheram-se de sedimentos, devido às
reduções na correnteza, e formaram a paisagem plana, hoje existente (Irion, 1976; Junk,
1980; Junk, 1984).
De maneira geral, pode-se dizer que as várzeas amazônicas são submetidas
basicamente a dois regimes de inundação, que são as enchentes periódicas dos rios
resultantes da alta pluviosidade e as enchentes diárias resultantes das marés (Arima & Uhl,
1996; Lima & Tourinho, 1996).
Na Amazônia Central, as florestas de várzea são submetidas todos os anos a
períodos regulares de inundação por aproximadamente sete meses (Junk et al., 1989), em
que a altura da coluna de água pode aumentar em média até 10 m (Junk, 1989). Durante
esse período, as águas que invadem as planícies carregam apreciáveis quantidades de
sedimentos, que são depositados na superfície dos terrenos marginais. A conseqüência
desse fenômeno é uma renovação cíclica desses solos, responsável por sua elevada
fertilidade (Sioli, 1951; Irion et al., 1983).
5
Essa periodicidade do pulso de inundação o transforma em um fator de grande
importância na determinação dos fenômenos fenológicos da vegetação que coloniza as
áreas de várzea. Estudos indicam que nesses ambientes as plantas tendem a ajustar a
dinâmica dos eventos, tais como a queda e o lançamento de folhas, floração e frutificação,
ao hidroperíodo (Junk et al., 1989; Waldhoff et al., 1998; Wittmann & Parolin, 1999;
Parolin, 2000; Piedade et al., 2000).
O estresse por alagamento reduz a diversidade de espécies na várzea (Junk, 1993).
Dessa forma, a composição florística nessas áreas depende do regime de inundação, teor de
sedimentos e intensidade da inundação (Junk, 1980). Entretanto, devemos considerar ainda
o fator genético, pois a tolerância ao estresse ambiental é desencadeada por um pool de
genes que atuam em conjunto na planta, modulando o metabolismo dessas espécies (Way
et al. 2005; Zhang et al., 2005) e cuja eficiência, pode determinar indivíduos com maior ou
menor tolerância aos fatores a que são expostos.
2.5. Florestas de várzea versus florestas de terra firme
De acordo com Klinge et al. (1995), na Amazônia, o alagamento anual pelas águas
brancas do rio Solimões tem duas conseqüências maiores que diferenciam este biótopo
daquele da floresta não alagada ou de terra firme. O primeiro aspecto é o pulso monomodal
de inundação, que exige das plantas a capacidade de se adaptarem e suportarem
anualmente inundações prolongadas, intercaladas por períodos secos. O segundo fator diz
respeito à riqueza nutricional das águas brancas que, ao invadirem as planícies inundáveis,
promovem o acúmulo de camadas de sedimentos e a fertilização natural desses solos.
Assim, enquanto que nas várzeas as características ambientais mais marcantes são o
pulso de inundação e uma elevada fertilidade do solo, nas áreas de terra firme esses fatores
são a sazonalidade da precipitação e a acentuada pobreza nutricional dos solos. Com base
nessas diferenças marcantes, é de se supor a existência de diferenças na flora dos dois
sistemas. De fato, os estudos disponíveis até o momento, mostram que no máximo cerca de
31% de coincidências são encontradas no nível de espécie na Amazônia Central,
particularmente em áreas alagáveis adjacentes às terras altas de maior fertilidade (Piedade
et al., 2000; Wittmann et al., 2006). Similaridades maiores, de até 45%, são relatadas para
as áreas de extremos de bacia, especialmente nos flancos andinos (Campbell et al., 1986).
Uma das espécies que tem populações colonizando naturalmente as duas áreas,
várzea e terra firme, é Himatanthus sucuuba, uma Apocynaceae de hábito arbóreo (Plumel,
1991). A adaptação dessa espécie a ecossistemas tão contrastantes, possivelmente envolve
6
interações morfoanatômicas e metabólicas, capazes de propiciar grande tolerância de suas
populações ao alagamento (Ferreira, 2002). Entretanto, mesmo nesta, as sementes de
populações que colonizam as várzeas, quando comparadas àquelas que colonizam a terra
firme, mostraram de forma significativa maior sucesso germinativo sob condições de
alagamento (Ferreira et al., 2005). Ao ser analisada a produção de plântulas em substrato
alagado, as diferenças tornaram-se marcantes (Ferreira et al., 2005), a ponto de sugerir
algum grau de diferenciação genética entre as populações da várzea e aquelas da terra
firme.
2. Características das plantas inundadas
2.1. Germinação e desenvolvimento inicial: fases críticas na tolerância à inundação.
A saturação periódica do solo é normalmente acompanhada por alterações na
química do solo, que incluem a diminuição de seu potencial redox, traduzido numa
demanda progressiva de oxigênio para o solo e num estresse adicional para as raízes das
plantas (Pezeshki, 2001).
Esse é um dos principais motivos pelo qual o alagamento do solo tem profundo
efeito nos organismos que nele habitam, especialmente nas plantas, por serem sésseis
(Piedade et al., 2001). A maioria das sementes de plantas terrestres que possui alta taxa de
germinação no solo não germina na água, uma vez que estas perdem rapidamente a
viabilidade sob tais condições (Hook, 1984; Parolin, 2001a). A ativação dos processos
fisiológicos necessários para a germinação requer um suprimento adequado de oxigênio e o
alagamento do solo restringe a disponibilidade de oxigênio para o embrião, impedindo a
germinação ou impondo dormência nas sementes de muitas espécies (Kozlowski, 1997;
Kozlowski & Pallardy, 1997).
Depois da germinação, flutuações de diferentes magnitudes no nível da água podem
determinar a sobrevivência das plântulas. A princípio, a sobrevivência depende da
capacidade da plântula em alongar-se rapidamente, de forma a se projetar acima do nível
de água, evitando a submersão total das folhas (Kozlowski, 1997; Parolin, 2001b; Ferreira
& Piedade, 2004).
O alagamento também induz o rápido fechamento dos estômatos nas epidermes
abaxial e adaxial de folhas em várias espécies, diminuindo a atividade fotossintética das
mesmas (Kozlowski, 1997). A redução na atividade fotossintética pode ser atribuída ainda
a diversos fatores, como: redução do potencial hídrico da folha e da condutância
estomática; baixa atividade das enzimas fotossintéticas; interrupções no transporte dos
7
fotoassimilados; e índice mais baixo do teor de clorofila (Liao & Lin, 1994; Pezeshk,
2001).
Claramente, o déficit de oxigênio no solo, devido à redução intensa, exerce uma
profunda influência no transporte do oxigênio e sua liberação para a rizosfera (Pezeshk,
2001). Espécies consideradas bem adaptadas ao estresse de ambientes alagados se
previnem dos danos decorrentes das baixas concentrações de oxigênio acumulando em
suas raízes, ou em outros tecidos, grandes quantidades de açúcar durante o período não
alagado para utilizar como reserva na fase de anoxia (Harborne, 1988; Junk, 1989;
Piedade, 1998).
As plântulas são mais sensíveis às injúrias por alagamento que as plantas mais
velhas, sendo, portanto mais dependentes do desenvolvimento de estratégias eficientes de
sobrevivência durante essa fase crítica. A interação entre essa habilidade espécie-específica
das plântulas em tolerar a inundação, associada à periodicidade do alagamento, duração da
saturação de água no solo, velocidade e qualidade da água, além da taxa de sedimentação,
é que irão determinar a composição e o padrão de zonação de espécies, nas planícies
alagáveis ao longo dos rios (Junk & Piedade, 1997; Kozlowski, 1997).
2.2. Alterações metabólicas das plantas sob alagamento
Alterações exibidas pelas plantas em decorrência do estresse hídrico são mediadas
por mudanças nos processos bioquímicos (Kozlowski & Pallardy, 1984). A capacidade do
sistema radicular em realizar atividades essenciais para a sobrevivência do indivíduo, como
a absorção de água, nutriente e produção de fitohormônios, depende essencialmente de
manter o fornecimento ininterrupto de uma quantidade mínima de energia (Lobo & Joly,
1998).
O alagamento leva a uma redução nas trocas gasosas entre a planta e a atmosfera,
devido à difusão dos gases, em particular o oxigênio, que é cerca de 10.000 vezes menor
na água do que no ar
(Armstrong, 1979). Isto conduz a circunstâncias hipóxicas ou mesmo
anóxicas em torno das raízes, que são os determinantes principais dos efeitos adversos da
inundação. O oxigênio é vital no modelo central que fornece energia para a célula, e a
presença ou a ausência dessa molécula determina a atividade metabólica e a produção de
energia. O oxigênio é o aceptor final de elétron no modelo de fosforilação oxidativa que
gera o ATP, a fonte principal da energia para o metabolismo celular, regenerando o cofator
essencial NAD
+
e o poder redutor do NADH que sustentam modelos bioquímicos, como
por exemplo, a glicólise (Dennis et al., 2000; Taiz & Zeiger, 2004).
8
Sob condições anaeróbicas ocorre o bloqueio do ciclo de Krebs e da cadeia
transportadora de elétrons. Como conseqüência a planta desvia a via metabólica para
formação de outros produtos, com a finalidade de regenerar o NAD
+
. A via alternativa
comumente citada em plantas sob anaerobiose é a fermentativa, com formação de álcool
como produto final (Crawford, 1978; Harbone, 1988; Dennis et al., 2000; Sousa & Sodek,
2002). Essa resposta, no entanto, gera um baixo rendimento energético compensado pela
aceleração da via glicolítica (Crawford, 1978; Ito et al., 1999; Dennis et al., 2000). O
resultado é um aumento da taxa de fermentação alcoólica, que envolve a desidrogenase
alcoólica (ADH) como uma das enzimas chave nesse processo (Ito et al., 1999; Ferreira,
2002), além das enzimas mobilizadoras de sacarose, necessárias à manutenção do
fornecimento de substrato para a produção de energia sob anaerobiose (Fox et al., 1994;
Rivoal & Hanson, 1994; Ellis et al., 1999; Dennis et al., 2000). Entretanto, o acúmulo de
produtos finais do metabolismo anaeróbico nas plantas, em especial o etanol, é tóxico,
podendo ser letal para as espécies não tolerantes (Crawford, 1992; Kozlowski, 1997; Lobo
& Joly, 1998).
Uma das hipóteses formuladas para explicar a tolerância de algumas plantas a
inundação é a “hipótese bioquímica” postulada por Crawford (1978), baseada parcialmente
nas respostas de animais à condições anóxicas. Essa hipótese sugere que sob condições de
depleção de oxigênio, a via glicolítica é desviada, de tal forma que, os compostos
intermediários da quebra de carboidratos, ao contrário de terminarem em compostos
tóxicos, terminam em outros produtos como malato, lactato ou alanina, que podem ser
acumulados em conseqüências menos danosas para a planta. A produção de etanol nesse
caso é pequena, ocorrendo em níveis não tóxicos para a planta (Crawford, 1992; Lobo &
Joly, 1998). Contudo, à exceção de evidencias circunstanciais obtidas com plantas
herbáceas, como a formação de malato nas raízes de Juncus effusus e de glicerol em Alnus
incana (Harbone, 1988), a hipótese de Crawford não pôde ser provada bioquimicamente.
Entretanto, outros estudos (Good & Crosby 1989; Menezes Neto, 1994; Fan et al.,
1997; Gaston et al., 2002) apresentam evidências que levantam a discussão da hipótese de
Crawford, sugerindo que as plantas possuem mecanismos distintos de tolerância à
inundação e que estes variam com a espécie ou até mesmo com o tecido, podendo mais de
um mecanismo atuar concomitantemente (Harborne, 1988; Menezes Neto, 1994; Lobo &
Joly, 1998; Sousa & Sodek, 2002).
9
2.3. Sobrevivência de plantas ao alagamento das várzeas na Amazônia Central
A maioria das plantas suporta períodos de anoxia que variam de poucas horas a
alguns dias. Entretanto, quando períodos mais longos de inundação são impostos, injúrias e
morte de raízes têm sido observadas, sendo as mesmas atribuídas ao acúmulo de produtos
finais tóxicos do metabolismo anaeróbico, a queda na energia metabólica ou a falta de
substrato para a respiração (Drew, 1997). Na Amazônia Central a duração da inundação
pode chegar a 210 dias todos os anos (Junk, 1989) e, na maioria das vezes, as adaptações
exibidas pelas espécies sincronizam com o pulso hidrológico (Junk, 1989; Wittmann &
Parolin, 1999; Waldhoff et al., 2002). Estratégias distintas têm sido verificadas para as
espécies que colonizam esses ambientes, relacionadas com local em que a planta está
estabelecida no gradiente do solo e que define a cota de inundação a qual é submetida
(Junk, 1989; Wittmann et al., 2002; Parolin et al., 2004).
A sobrevivência de plantas nas planícies inundáveis da Amazônia, como em outras
florestas que sofrem alagamento, parece ser o resultado da combinação de mais de um
mecanismo de adaptação (Scarano, 1998; Scarano et al., 1998). Espécies que apresentam
bom desempenho em relação ao crescimento e taxa fotossintética quando parcialmente
submersas não necessariamente o fazem quando totalmente submersas. Estes dois tipos de
alagamento eventualmente requerem diferentes adaptações para o crescimento e
sobrevivência das plantas (Parolin, 2001b; Ferreira, 2002; Waldhoff et al., 2002). Além de
existir uma ampla gama de adaptações, as respostas das plantas ao alagamento variam
ainda com a espécie, o genótipo, a idade da planta e o tempo de exposição ao alagamento
(Drew & Lynch, 1980; Kozlowski, 1984; 1997).
Ao contrário da terra firme, onde períodos de anoxia são raros, em geral causados
por fortes chuvas que normalmente duram de algumas horas a poucos dias, as plântulas
que habitam as várzeas da Amazônia precisam ajustar o seu metabolismo em consonância
com as peculiaridades desses ambientes (Junk, 1993; Parolin, 2000; Piedade et al., 2000).
Sob condições de alagamento, a primeira resposta apresentada pelas plantas é fisiológica
(Crawford, 1978; Harborne, 1988), porém, em um segundo momento, o acúmulo de
produtos finais tóxicos provenientes do metabolismo pode induzir o aparecimento de
adaptações anatômicas, como é o caso do tecido aerênquima, resultante da dissolução das
membranas das células, que formam grandes espaços intercelulares e favorecem a
eliminação de produtos tóxicos acumulados para o meio externo, entre outros, através de
adaptações morfológicas como as lenticelas hipertróficas e raízes adventícias (Hook, 1984;
10
Jackson & Drew, 1984; Kozlowski & Pallardy, 1984; Pimenta et al., 1994; Waldhoff &
Fürch, 2002).
A habilidade para modificar o metabolismo sob condições de inundação, de forma
a colonizar com maior ou menor sucesso áreas alagáveis divide as plantas em dois grandes
grupos: espécies consideradas tolerantes e espécies não tolerantes à inundação. Essa
capacidade varia dentro de um mesmo gênero de plantas (Medri, 1979; Botelho, 1996;
Tribuzy, 1998) ou ainda dentro de uma espécie (Harbone, 1988; Ferreira, 2002), definindo
variedades tolerantes ou não tolerantes à inundação (Harbone, 1988).
Nas várzeas amazônicas, as espécies que toleram o alagamento prolongado e
chegam a ficar totalmente submersas (Ex. Symmeria paniculata ou Eschweilera tenuifolia)
se estabelecem nos locais mais baixos, que podem permanecer inundados por cerca de sete
meses no ano. As espécies menos tolerantes (Ex. Mora paraensis ou Pentaclethra
macroloba) são restritas às partes superiores, próximas da terra firme, que são inundadas
por períodos mais curtos (Junk, 1989; Ferreira, 2000; Wittmann et al., 2002). Somente
poucas espécies (Ex. Malouetia furfuracea) são generalistas e podem colonizar tanto os
locais elevados quanto aqueles mais baixos (Worbes, 1997).
Um outro fator que deve ser levado em consideração ao tentar entender a tolerância
das plantas às mudanças das condições ambientais extremas, nos ecossistemas de várzea na
Amazônia Central, é a rota de colonização desses ambientes, uma vez que parece haver
ocorrido pelas espécies da terra firme, que invadiram as planícies fluviais durante os
eventos geológicos recentes (Haffer & Prance, 2001; 2002). O grau de adaptação seria
então dependente do tempo em que essa colonização ocorreu, como também do potencial
de adaptabilidade das diferentes espécies (Kubitzki, 1989; Parolin, 2001b).
3. Informações botânicas e econômicas da espécie em estudo
3.1. Distribuição geográfica
A espécie escolhida para a realização deste estudo foi Himatanthus sucuuba Wood.,
Apocynaceae, cuja ocorrência se dá em áreas de várzea e de terra firme na Amazônia. Nas
áreas de estudo a espécie habita, no ambiente inundável, a várzea baixa, onde pode
permanecer até seis meses sob inundação ininterrupta (Wittmann et al., 2002), enquanto
que na terra firme pode ser encontrada em florestas de vertentes, áreas que não sofrem
nenhum estresse resultante de excesso de água. Este último tipo de floresta é considerado
de transição e o solo apresenta aspecto inclinado, que corresponde a um gradiente
topográfico, semelhante nas partes mais altas às florestas de platô, enquanto que nas mais
11
baixas a vegetação possui características fisionômicas mais parecidas à campinarana
(Prance, 1979), sem no entanto apresentar as espécies que a caracterizam, particularmente
alta densidade de epífitas (Ribeiro et al., 1999).
As apocináceas possuem uma distribuição pantropical, ocorrendo principalmente
em florestas tropicais do velho e novo mundo (Heywood, 1993). A família compreende
cerca de 300 gêneros e 2.000 espécies tropicais e subtropicais, sendo 400 espécies e 41
gêneros registrado na flora brasileira, habitando diversas formações (Barroso et al., 1986;
Ribeiro et al., 1999).
O gênero Himatanthus possui treze espécies e ocorre no continente sul-americano,
dispersas na zona tropical desde a latitude 10º Norte até o Trópico de Capricórnio. No
entanto, seus representantes são encontrados predominantemente na bacia amazônica
(Plumel, 1991). A espécie H. sucuuba, de nome popular, “sucuúba” ou “sucuúba
verdadeira”, distribui-se nas regiões alagadas e não alagadas, em solo arenoso ou argiloso,
da Bacia Amazônica de 0º a 15º latitude Sul: Venezuela, Guiana Inglesa, Guiana Francesa,
Bolívia, Peru e Brasil, onde existem registros de coletas nos Estados do Pará, Amazonas,
Mato Grosso, Rondônia e Acre (Plumel, 1991). Próximas a Manaus, a espécie é encontrada
freqüentemente nas áreas de várzea baixa e na terra firme em ambientes de baixios,
vertentes e capoeiras da região (Plumel, 1991; Ribeiro, 1999).
3.2. Morfologia e ecologia
É uma planta arbórea (Fig. 1A), lactescente de 20 a 30 m de altura. Possui um
tronco ereto e mais ou menos cilíndrico, com casca rugosa. As folhas são simples, alternas
espiraladas, totalmente glabras em ambas as faces, de margens inteiras, coriáceas,
apresentando de 20 a 25 cm de comprimento e 5 a 7 cm de largura. As inflorescências são
em cimeiras terminais, com poucas flores brancas e vistosas. O fruto é folículo geminado,
curvado como um chifre, glabro e anguloso, de 20 a 26 cm de comprimento, com
deiscência ventral, e numerosas sementes elipsóides aladas (Fig. 1B/C/D) (Plumel, 1991;
Albuquerque, 1989; Lorenzi, 1998).
B
A
C
D
c
m
Fig. 1. Detalhes da espécie em estudo H. sucuuba: A) árvore com cerca de 20m de
altura; B) disposição das folhas e posição da inflorescência (seta); C) fruto folículo
geminado; e D) sementes aladas.
A espécie é perenifólia, heliófila e sua floração ocorre durante um longo período do
ano, sendo predominante entre os meses de agosto a outubro. A dispersão é descontínua e
irregular, sendo realizada por meio do vento e/ou água, o que a caracteriza como
anemocórica e hidrocórica (Plumel, 1991; Ferreira et al., 2005). As espécies de
Sphingidae, uma família pequena de mariposas, são relatadas como principais
polinizadores de H. sucuuba, que visitam durante a noite suas flores brancas, tubulosas e
perfumadas (Plumel, 1991; Ribeiro et al., 1999). No entanto, existem poucos estudos de
observações no campo das relações entre as flores de Apocynaceae e seus polinizadores
(Schlindwein et al., 2004). Para as espécies de Himathantus, dados sobre o mecanismo de
polinização são raros ou inexistentes.
3.3. Importância econômica
H. sucuuba possui a madeira leve, indicada para obras internas em construção civil,
para confecção de embalagens, brinquedos e para cabos de ferramentas e instrumentos
12
13
agrícolas, bem como lenha para carvão (Lorenzzi, 1998). A árvore apresenta qualidades
ornamentais que a recomendam para arborização paisagística (Lorenzzi, 1998, Ribeiro et
al., 1999). A látex da planta possui propriedades terapêuticas, tendo recebido atenção na
medicina popular para o tratamento de várias moléstias, é usado principalmente em
emplastos, no tratamento de fraturas e indicado como antireumático, antifúngico e
anticancerígeno (Van den Berg, 1982; Albuquerque, 1989; Silva et al., 1998; Villegas et
al., 1997; Ribeiro et al., 1999). Alguns estudos encontram-se em andamento, tendo sido
identificados e isolados produtos químicos que confirmam suas funções medicinais
(Miranda et al., 2000; Wood et al., 2001).
4. OBJETIVO GERAL
Verificar se as plântulas de Himatanthus sucuuba geradas a partir de sementes de
populações que habitam as áreas de várzea ou de terra firme, apresentam as mesmas
respostas às alterações das condições hídricas ambientais. Os indicadores utilizados serão
os caracteres morfoanatômicos e bioquímicos, associados à anoxia ou hipóxia do sistema
radicular, além de alterações em nível do genótipo.
5. HIPÓTESE
O pulso de inundação, que regularmente alaga grandes áreas ao longo do rio
Solimões/Amazonas, pode ter imposto uma forte pressão seletiva sobre Himatanthus
sucuuba durante o processo de colonização deste tipo de ambiente, levando a diferenciação
na sua morfologia, anatomia, bioquímica, que resultou em uma forte divergência em
relação a população original que se reflete na sua estrutura genética a ponto de sugerir
uma especiação.
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20
CAPÍTULO II
Respostas das plântulas de Himatanthus sucuuba ao
alagamento: aspectos morfoanatômicos das folhas, análise
de crescimento, biomassa e sobrevivência das plântulas
21
INTRODUÇÃO
Muitas espécies de plantas, quando submetidas ao alagamento, sofrem profundas
modificações morfo-anatômicas, inibição do crescimento e mortalidade prematura. As
respostas mais comuns são o retardamento da expansão das folhas e dos entrenós, clorose,
epinastia, indução da abscisão e senescência foliar, decréscimo na taxa de crescimento em
altura, diminuição da área foliar e da freqüência estomática, redução do incremento da
matéria seca de folhas, hastes e raízes, hipertrofia de lenticelas e caules, formação de raízes
adventícias e aerênquimas (Drew & Lynch, 1980; Kawase, 1981; Kozlowski, 1984; 1997;
Waldhoff et al., 1998; Florentine et al.,2006).
Em termos fisiológicos, uma das principais conseqüências do alagamento é a
limitação da respiração aeróbica devido à redução da disponibilidade de oxigênio. Plantas
apresentam modificações morfoanatômicas que facilitam a captação e a difusão do
oxigênio em seu interior, como lenticelas hipertrofiadas, formação de raízes adventícias e
de aerênquima nas raízes (Tsukahara & Kozlowski, 1985; Pimenta et al., 1996; Crawford
& Braendle, 1996; Kozlowski, 1997; Medri et al., 1998; Waldhoff et al., 1998; Dennis et
al., 2000; Mielke et al., 2003).
Como conseqüência dos custos com a manutenção do metabolismo sob hipoxia ou
mesmo circunstâncias anóxicas, as espécies vegetais que habitam as áreas inundáveis
normalmente apresentam baixo incremento de matéria seca. Entre os fatores que levam à
perda ou baixa incorporação de biomassa nessas plantas, destaca-se a diminuição na
atividade fotossintética, alterações do pH e do potencial de oxi-redução do solo, a perda de
carboidratos para a respiração anaeróbica, a perda de partes da planta devido à senescência
prematura e necrose de partes da planta, especialmente do sistema radicular, e as
limitações ambientais ligadas à temperatura e a saturação de água no solo (Kozlowski et
al., 1991; Long & Hällgren, 1993; Pezeshki, 2001). O suprimento de água também mantém
forte relação com os valores de área foliar da planta e, conseqüentemente, com sua
fotossíntese e crescimento (Kozlowski & Pallardy, 1984; Kozlowski et al., 1991).
Pelo fato do excesso de água no solo afetar o funcionamento das raízes e
conseqüêntemente o suprimento de água para a parte aérea (Kozlowski, 1984), é de se
esperar que nas várzeas amazônicas a submersão das raízes ou da planta por inteiro tenha
um forte efeito em seu crescimento, podendo causar reduções severas no mesmo (Menezes
Neto, 1994; Pezeshki, 2001; Ferreira & Piedade, 2004). Esse efeito, no entanto, pode variar
entre as diferentes espécies, uma vez que se conhece que para algumas, o alagamento
apenas do sistema radicular tende a aumentar o crescimento da planta (Parolin, 2001).
22
A inibição do crescimento, senescência e epinastia prematura das folhas nas plantas
jovens sob alagamento, podem ser atribuídas à mudanças no balanço de fitohormônios
produzidos pelas folhas e raízes. Nas folhas, o amarelecimento seguido de necrose é o
sintoma visual mais comum. No entanto, a senescência também pode ocorrer pela
deficiência mineral, em conseqüência da diminuição do transporte de íons dependentes de
energia (Wolffe et al., 1988 apud Ramos, 1999).
Devido as condições extremas de alagamento das planícies amazônicas, a maioria
das espécies é altamente adaptada (Parolin et al., 2004), com distribuição restrita a este
ecossistema particular. Entretanto, algumas espécies ocorrem sobre uma grande escala de
condições ambientais. Estima-se que cerca de 20% das espécies de árvores que crescem
nas áreas inundadas da Amazônia são comuns às florestas não inundadas (florestas de terra
firme) de áreas adjacentes (Piedade et al., 2001). Uma dessas é Himatanthus sucuuba
(Apocynaceae), que tem ampla distribuição geográfica na bacia Amazônica e ao longo da
calha do rio Solimões.
O fato de H. sucuuba ser uma espécie que ocorre naturalmente nos dois
ecossistemas, várzea (sensu Prance, 1979) e terra firme, a torna ideal para estudos que
investiguem as respostas adaptativas das plantas a condições extremas de alagamento
existentes na Amazônia. O transbordamento anual das águas dos rios que compõem a bacia
amazônica e que invade as florestas de várzea deixando as plântulas e muitas árvores
totalmente submersas poderia resultar em pressões seletivas que levassem a uma
divergência acentuada na sua capacidade de suportar a inundação entre as duas populações
dessa espécie, especialmente naquelas que colonizam as florestas de terra firme.
Alternativamente, a ausência de diferenças na sobrevivência e crescimento entre as duas
populações ressaltaria a importância da plasticidade em resposta à inundação.
A compreensão dos mecanismos adaptativos das plantas em habitats diferentes
auxilia o conhecimento dos seus limites de tolerância aos fatores ambientais. Essas
informações são de grande importância, particularmente no estágio de plântulas, que é o
mais suscetível às mudanças ambientais (Kozlowski, 1984; Junk, 1993). Nas planícies
inundáveis essa é a fase que corresponde ao período de maiores taxas de perdas dos
indivíduos em uma população (Piedade et al., 2001). Informações sobre a germinação e
estabelecimento de plantas em ambientes com variações sazonais, tornam-se ferramentas
importantes para fins de manejo e de recolonização desses ecossistemas.
Neste estudo objetivou-se, especificamente, avaliar a influência de diferentes
regimes de inundação (parcial, total) em plântulas oriundas das populações de H. sucuuba
da várzea ou da terra firme. Para comparar o desempenho das plântulas, os caracteres
utilizados como indicadores foram alterações morfoanatômicas relacionadas ao
alagamento, à taxa de sobrevivência das plântulas, crescimento e incremento de biomassa.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.2. Áreas de estudo e coleta do material vegetal
Os sítios de coleta situaram-se nas áreas próximas a Manaus, Estado do Amazonas
(Fig. 1). A área de várzea localizou-se na Ilha de Marchantaria e cercanias (03º 15’ S,
60º 00’ W), enquanto que a de terra firme, às margens da Rodovia Manaus-Itacoatiara
(AM 010), nas proximidades da Reserva Florestal Adolpho Ducke (02º 53’ S, 59º 58’ W).
23
Figura 1. Mapa das áreas de coleta das sementes nas áreas de várzea (Ilha de Marchantaria
e cercanias) e as áreas de terra firme próximas a Manaus (Reserva Ducke). [Escala
1:100.000].
Nas duas áreas, frutos maduros foram coletados diretamente das árvores e
transportados para as instalações do INPA, em Manaus, onde os mesmos foram deixados
ao sol para completar a abertura e liberação das sementes. Estas foram colocadas para
germinar em casa de vegetação, seguindo as instruções descritas por Ferreira et al. (2005).
Os estudos anatômicos foram executados no Laboratório de Anatomia Vegetal, da
Coordenação de Pesquisas em Botânica, no INPA. O experimento de alagamento das
plântulas e as demais análises, morfológicas e biométricas, foram conduzidos nas
dependências do Projeto INPA/Max-Planck.
Manaus
I
I
l
l
h
h
a
a
d
d
e
e
M
M
a
a
r
r
c
c
h
h
a
a
n
n
t
t
a
a
r
r
i
i
a
a
Fonte: Embrapa/2000
R
R
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e
s
s
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e
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r
v
v
a
a
D
D
u
u
c
c
k
k
e
e
24
2.2.1. Fase da planta em estudo
O estudo foi desenvolvido com plântulas das populações da várzea e da terra firme
que apresentavam 17,7 cm e 13,4 cm de altura, respectivamente, e cerca de 90 dias. Porém,
a definição de plântula é bastante discutida entre os pesquisadores da área. No sentido
fisiológico exato, a planta desenvolvida da semente é uma plântula enquanto depende das
reservas desta (Fenner, 1987), sendo o tempo de duração dessa fase bastante questionável
(Kitajima, 1996; Vázquez-Yanes & Orozco-Segovia, 1996). Kitajima (1996) sugere que
uma planta jovem deve ser chamada de plântula até que uma proporção significativa de sua
biomassa seja construída.
Alguns autores consideram plântulas as plantas jovens que se encontram no período
mais susceptível às mudanças ambientais, o que pode variar com o meio e a espécie
considerada (Kozlowski, 1997). Algumas vezes, essa fase pode corresponder ao primeiro
ano de desenvolvimento da planta, após a germinação (Fuchs et al., 2000). Neste estudo,
será adotada esta última definição considerando-se, portanto plântula a fase de um ano, a
partir da germinação das sementes, o que incluiu todo o período dos experimentos de
alagamento.
2.3. Estabelecimento do experimento de alagamento
O experimento foi realizado em viveiro e para simulação do alagamento foram
utilizados quinze tanques de amianto (1000 L), com três tratamentos. Dentro de cada
tanque foram dispostas oito plântulas de H. sucuuba com idade aproximada de três meses,
já transplantadas e estabelecidas em vasos de polietileno medindo 19x16 cm (uma
plântula/vaso), quatro provenientes da várzea e quatro da terra firme, tendo como substrato
solo de várzea. Cada tanque foi considerado uma unidade amostral, com exceção das
análises para o estudo de crescimento e sobrevivência das plântulas, onde a unidade
amostral considerada foi o vaso.
As plântulas foram submetidas durante 90 dias aos tratamentos de alagamento
estabelecidos conforme o que se segue: controle (irrigação diária), submersão parcial
(sistema radicular e parte do caulículo alagado, coluna de água de 25cm) e submersão total
(alagamento total da planta, coluna de água de 70cm). A identificação de cada tratamento
foi feita de acordo com o esquema a seguir:
1- Controle (C)
⇒ VZC
Várzea 2- Submersão parcial (SP)
25
⇒ VZSP
(VZ) 3- Submersão total (ST)
⇒ VZST
Procedência
da semente
1- Controle (C)
⇒ TFC
Terra firme 2- Submersão parcial (SP)
⇒ TFSP
(TF) 3- Submersão total (ST)
⇒ TFST
2.4. Crescimento, avaliação morfológica e sobrevivência das plântulas
Para as avaliações do crescimento acumulativo e sobrevivência foram utilizadas 10
plântulas, sendo duas plântulas por tanque, originárias de cada um dos ambientes (várzea
ou terra firme), que foram acompanhadas durante os 90 dias de duração dos experimentos
de inundação. Em caso de morte da plântula, esta era substituída por outra de igual
tamanho, mantida sob mesmas condições. Para determinar o alongamento do caule, as
plântulas foram medidas desde a região do colo até o ápice caulinar.
As medidas de crescimento foram tomadas quando do estabelecimento dos
experimentos e, posteriormente, em intervalos quinzenais. Na oportunidade em que as
medidas eram tomadas foram avaliadas as alterações morfológicas, por meio de
observações visuais e anotações da presença ou não dos seguintes sintomas: clorose,
epinastia e abscisão das folhas, lenticelas nos caules e formação de raízes adventícias.
2.5. Biomassa
As análises de biomassa foram realizadas em todos os tratamentos aos 30 e 90 dias
do experimento. Foi utilizado o método de coleta destrutiva, descrito por Piedade (1988)
para herbáceas, com adaptação para arbóreas. Para tanto, foram utilizadas três plântulas (1
plântula/tanque) de cada tratamento. No laboratório, as plântulas foram retiradas dos vasos
e cuidadosamente lavadas individualmente. Em seguida foram deixadas para secar em
temperatura ambiente por cerca de uma hora, e divididas nas seguintes categorias: raiz,
caule e folhas. A biomassa total da plântula foi obtida por meio do somatório das médias
dos valores das diferentes categorias de material. Após a determinação da massa fresca, as
plântulas foram levadas para secar em estufa de circulação forçada a 95º C, até massa
constante. Cada parte da plântula foi pesada em balança analítica, modelo Belmarq 210 A,
com precisão de 0,0001g.
26
2.6. Número de folhas, área foliar e análise da epiderme foliar.
Tanto as análises do número de folhas e área foliar, quanto da epiderme foliar,
foram realizadas em cinco plântulas de cada tratamento (1 plântula/tanque) apenas aos 30
dias de indução do alagamento, uma vez que a partir desse período as plântulas do
tratamento de submersão total perderam as folhas.
Inicialmente as plântulas de cada tratamento foram selecionadas e o número de
folhas de cada uma delas foi anotado. Em seguida as folhas foram destacadas para
obtenção da área foliar total de cada uma das plântulas e, posteriormente, obtenções das
médias de área foliar das plântulas, por tratamento (AFM). As áreas foliares foram
determinadas por meio de um medidor de área foliar (Leaf Area Meter, Delta-T Devices).
Algumas destas folhas, conforme descrito abaixo, foram ainda utilizadas para realizar a
dissociação das epidermes e visualização em microscópio óptico, para descrição das
estruturas anatômicas.
Para os estudos das epidermes da folha, de cada uma das plântulas amostradas
coletou-se a segunda ou terceira folha a partir do ápice, totalmente expandida, e produzida
após o início do experimento de submersão. As folhas foram fixadas em FAA 50%
(Johansen, 1940) e armazenadas em etanol 70%. Do material coletado foram retiradas
secções do ápice, nervura central (região mediana) e base da folha, cujas epidermes foram
dissociadas em solução de Jefrey (Johansen, 1940) para as análises de sua estrutura. As
epidermes foram coradas com azul de astra e fucsina básica, desidratadas em série
alcoólica crescente, para a montagem de lâminas semipermanentes com gelatina
glicerinada (Johansen, 1940). A partir dessas lâminas foi feita a análise da freqüência
estomática por mm
2
, onde foram contados os estômatos presentes em 25 campos
aleatoriamente escolhidos de cada parte da folha, totalizando 75 campos por folha, em cada
tratamento. As observações foram realizadas utilizando um microscópio Kyoa, nos
aumentos 10x e 40x, com fator de correção de 0,46. Foram feitas fotomicrografias com um
microscópio Zeiss MC63 nos aumentos de 10x, 25x e 40x.
O comprimento e a largura dos estômatos foram obtidos em 5 campos de cada
amostra da região mediana das folhas, de cada uma das cinco plântulas, num total de 25
campos por tratamento. Todas as medidas foram obtidas através de uma ocular
micrométrica. Os estômatos foram classificados segundo Apezzato-da-Glória (2003),
enquanto que os tecidos e demais estruturas anatômicas da folha foram descritos conforme
Metcalfe & Chalk (1950) e Fahn (1985).
27
2.7. Delineamento experimental e análises estatísticas
O delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC), com seis tratamentos
(VZC, TFC, VZSP, TFSP, VZST, TFST) e repetições, determinadas de acordo com a
análise efetuada, conforme descrição abaixo:
a) Crescimento e sobrevivência: cada vaso foi considerado uma unidade amostral,
sendo 2 vasos/tanque, num total de 10 repetições. Foi feita a comparação entre as
duas populações (várzea e terra firme) nos tempos: 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias;
b) Biomassa: Cada tanque foi considerado uma unidade amostral, num total de três
repetições, sendo uma planta/tanque. Foi feita a comparação entre as duas
populações (várzea e terra firme) nos tempos: 30 e 90 dias;
c) Número de folhas, área foliar e epiderme foliar: cada tanque foi considerado uma
unidade amostral, com cinco repetições.
Todos os dados foram tratados por meio de análise de variância (ANOVA) e a
comparação entre as médias dos fatores estudados foi realizada com base no teste de
Tukey, a 5% de probabilidade. Para execução das análises estatísticas foi usado o
programa Statistica, versão 8.0.
3. RESULTADOS
3.1. Crescimento
O alagamento reduziu o crescimento das plântulas de H. sucuuba nas populações
provenientes dos dois ambientes (várzea e terra firme), em relação aos controles. O
crescimento médio acumulado das plântulas da várzea submetidas ao tratamento de
submersão parcial (VZSP) diferiu (p≤0,05) em relação aos comprimentos das plântulas do
controle (VZC), a partir da análise realizada aos 30 dias, tendo atingido ao final dos 90 dias
de tratamento, alturas de 31,5 e 35,6 cm, respectivamente. No tratamento de submersão
total (VZST), as plântulas praticamente paralisaram o crescimento, diferenciando
significativamente este tratamento dos outros dois (p≤0,05). Neste último caso, o valor
médio de comprimento da parte aérea ao final do experimento foi de 18,6 cm, enquanto o
valor inicial era de 17,7 cm (Fig. 2A).
O padrão de crescimento das plântulas da terra firme que foram submetidas ao
alagamento parcial (TFSP) foi o mesmo daquele observado nas plântulas da várzea,
mostrando uma diferença significativa (p≤0,05) no crescimento com relação ao controle
(TFC), a partir do 30º dia. Nesse tratamento as plântulas apresentaram, ao final dos 90 dias
de duração do experimento, os valores médios de comprimento da parte aérea de 18,2 cm,
TFSP, e 27,8 cm, TFC. Assim como observado para as plântulas da várzea, o alagamento
total das plântulas da terra firme (TFST) também levou à estagnação do crescimento, tendo
sido atingido ao final do experimento o comprimento de 13,6 cm, valor praticamente igual
àquele obtido no início do tratamento de inundação que foi de 13,4 cm (Fig. 2B).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 153045607590
tempo (dias)
altura das plântulas (cm)
controle submersão parcial submersão total
A B
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 153045607590
tempo (dias)
altura das plântulas (cm)
controle submersão parcial submersão total
Figura 2 – Crescimento médio acumulativo das plântulas de H. sucuuba, durante os 90
dias de experimentação: A) populações da várzea e B) populações da terra firme. Dados
expressos em termos de média + erro padrão, n = 10.
Analisando os padrões dos resultados expressos nas Figuras 2 A/B ao final do
período de 90 dias, observa-se que, embora o crescimento das plântulas oriundas da várzea
e da terra firme, nos tratamentos controle (VZC e TFC) e de submersão parcial (VZSP e
TFSP), tenham sido significativos, os valores diferem (p≤0,05) entre as duas populações ao
longo de todos os períodos avaliados. O tratamento VZC mostrou um crescimento cerca de
20% acima do verificado no TFC e essa diferença foi ainda maior quando em submersão
parcial, onde a média de crescimento do tratamento VZSP (31,5 cm) foi quase o dobro do
TFSP (18,2 cm).
3.2. Alterações na morfologia das plântulas
A Tabela 1 mostra um quadro com as alterações na morfologia observadas nas
plântulas ao longo do período experimental de 90 dias.
28
Tabela 1. Presença (S), ausência (N) e intensidade (+) das alterações morfológicas
apresentadas pelas plântulas em função do alagamento.
Controle Submersão parcial Submersão total
VZ TF VZ TF VZ
TF
Raízes adventícias
N N S S N N
Abscisão das folhas
N N N N S* S*
Clorose
N N N + +++ * +++ *
Epinastia
N N N N N* N*
Lenticelas
N N S S N N
+ = clorose até 30% da folha; ++ = clorose > 30% até 50% da folha; +++ = clorose acima de 50% da folha. *
avaliados até o 30º dia do experimento, quando não mais apresentavam folhas.
A presença de lenticelas hipertróficas e de raízes adventícias (Fig. 3) foi observada
nas plântulas provenientes dos dois ambientes a partir do 15º dia de submersão parcial
(VZSP e TFSP). Outras características morfológicas como a clorose e epinastia das folhas
não foram evidenciadas neste tratamento.
B
A
29
Figura 3 – Detalhes das raízes de plântulas de H. sucuuba, submetidas ao tratamento de
submersão parcial. A) tratamento VZSP; B) tratamento TFSP. L = lenticelas e R = raízes
adventícias.
Após o 15º dia, algumas folhas das plântulas da várzea que foram totalmente
submersas (VZST) apresentaram sintomas de clorose, seguida da abscisão das mesmas.
Esse fenômeno foi observado nas plântulas da terra firme por volta da quarta semana dos
tratamentos de submersão (TFST), período no qual as plântulas da várzea já haviam
perdido todas as folhas, situação que perdurou até o término do experimento. Contudo,
neste tratamento, foi observado também que muitas folhas, tanto de plântulas da várzea
quanto de terra firme, se desprenderam do caule ainda totalmente verdes.
Nos tratamentos VZST e TFST, não foi observada a presença de lenticelas ou raízes
adventícias em nenhuma das plântulas, independente do ambiente de origem. Porém, nas
L
L
R
R
Ferreira, 2002
Ferreira, 2002
plântulas do tratamento VZST, o número de raízes formadas foi visualmente maior que
aquelas do tratamento TFST. Plântulas dos tratamentos controle (VZC e TFC), não
apresentaram nenhuma evidência de alterações morfológicas dos parâmetros avaliados
(Tab. 1).
3.3. Sobrevivência das plântulas durante os experimentos de submersão
O alagamento não influenciou a sobrevivência das plântulas das populações de
várzea, uma vez que em todos os tratamentos 100% das plântulas permaneceram vivas até
o final dos 90 dias (Tab. 2).
Tabela 2 – Taxa de sobrevivência das plântulas após 90 dias do início dos experimentos de
submersão. n = 10.
Tratamentos
Ambiente
Controle Submersão parcial Submersão total
Várzea
100 % 100% 100%
Terra firme
100 % 90% 40%
Por meio de observações visuais, verificou-se que o primeiro órgão da planta a ser
comprometido foi a raiz, que mostrava sinais de decomposição (Fig. 4).
B
A
Ferreira, 2002
Figura 4 – Raízes de plântulas de H. sucuuba aos 90 dias do tratamento de inundação total.
A = várzea e B = terra firme.
3.4. Acumulação de biomassa
O alagamento não alterou de forma significativa (p≤0,05) os valores de biomassa
total nas duas populações (várzea e terra firme) aos 30 dias (Tab. 3), embora tenha sido
30
31
possível verificar uma tendência de diminuição da biomassa nos tratamentos de submersão
total (VZST e TFST). Todavia, aos 90 dias essa diferença apresentava-se significativa,
mostrando que quando o alagamento é prolongado, os valores médios de biomassa
diminuíram significativamente, sendo o efeito maior para as plantas totalmente submersas.
Ao relacionarmos os valores médios de biomassa dos tratamentos de submersão (parcial e
total), entre os diferentes ambientes (várzea e terra firme), verificamos que não existe
diferença significativa entre estes nos dois períodos avaliados (30 e 90 dias). No entanto, a
biomassa total do tratamento controle da várzea (VZC) foi duas vezes o valor verificado no
tratamento controle da terra firme (TFC), sendo este resultado significativo (Tab. 3).
Tabela 3. Valores médios da biomassa total (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a
partir de sementes das populações de várzea e de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob
diferentes tratamentos de submersão.
Biomassa total (g)
Várzea Terra firme
30 dias 90 dias 30 dias 90 dias
Controle
2,06 A 6,52 A* 0,91 A 3,02 A*
Submersão parcial
2,02 A 2,79 B 1,20 A 1,54 B
Submersão total
1,57 A 0,84 C 1,06 A 0,56 C
Na mesma coluna: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si; Na mesma linha: (*) =
diferenças significativas entre as médias dos dois ambientes, no mesmo período (VZ e TF). Tukey
a 5% de probabilidade. n = 3.
Nas análises aos 30 dias não foi encontrada diferença significativa (p≤0,05) na
alocação de biomassa no caule e nas raízes das plântulas dos dois ambientes (Tab. 4 e 5),
em nenhum dos tratamentos. Por outro lado, com o aumento do período de alagamento
para 90 dias, as plântulas da várzea apresentaram uma redução significativa dos valores de
biomassa em todas as partes analisadas (Tab. 4). Já nas plântulas da terra firme essa
tendência não foi confirmada para as análises de raiz aos 90 dias, que não mostraram
diferença significativa nos valores de biomassa após a inundação (Tab. 5).
Ao analisarmos os controles das duas populações (VZC e TFC) verificamos que a
alocação de biomassa ocorre de forma diferente entre as partes das plântulas nesse
tratamento. Enquanto na várzea (VZC) existe um aumento significante nos valores médios
de biomassa na raiz e no caule aos 90 dias (Tab. 4), na terra firme (TFC) esse aumento
acontece no caule e nas folhas (Tab. 5).
32
Devido a abscisão das folhas após 30 dias de indução no alagamento total, não foi
possível realizar a análise dessa parte da planta aos 90 dias, nesse tratamento, e tampouco a
correlação entre os dois ambientes para esse período.
Tabela 4. Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a
partir de sementes das populações de várzea, aos 30 e 90 dias, sob diferentes tratamentos
de submersão.
Raiz (g) Caule (g) Folhas (g)
30 dias 90dias 30 dias 90 dias 30 dias 90 dias
Controle
0,46 A*
2,08 A*
0,80 A* 2,29 A* 0,80 A 1,47 A
Submersão parcial
0,50 A 1,00 B 0,91 A 1,34 B 0,46 AB 0,45 B
Submersão total
0,77 A 0,36 C 0,80 A 0,48 C 0,15 B -
Na mesma coluna: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si; Na mesma linha, para
cada parte da planta: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois períodos (30 e 90
dias). Tukey a 5% de probabilidade. n = 3.
Tabela 5. Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a
partir de sementes das populações de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob diferentes
tratamentos de submersão.
Raiz (g) Caule (g) Folhas (g)
30 dias 90dias 30 dias 90 dias 30 dias 90 dias
Controle
0,31 A 0,77 A 0,18 A* 0,92 A* 0,42 A* 1,33 A*
Submersão parcial
0,38 A 0,61 A 0,37 A 0,58 B 0,44 A 0,34 B
Submersão total
0,46 A 0,44 A 0,20 A 0,13 C 0,40 A -
Na mesma coluna: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si; Na mesma linha, para
cada parte da planta: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois períodos (30 e 90
dias). Tukey a 5% de probabilidade. n = 3.
3.6. Número de folhas, área foliar total (AFT) e freqüência estomática
Sob submersão total, as plântulas de sementes oriundas dos dois ambientes
perderam completamente as folhas no período máximo de cinco semanas. Assim, os
resultados apresentados na Tabela 6 referem-se aos dados coletados das plântulas até os 30
dias de experimentação.
Os valores médios do número de folhas nos tratamentos de submersão parcial
foram significativamente (p≤0,05) maiores entre as plântulas das populações da várzea e
da terra firme (VZSP e TFSP), quando comparados aos tratamentos controle (VZC e TFC),
sem diferença entre os ambientes (Tab. 6). No entanto, neste mesmo tratamento a AFT foi
menos da metade dos valores apresentados pelas plântulas do controle (p≤0,05).
33
O alagamento reduziu significativamente a AFT, da mesma forma que elevou os
valores da freqüência estomática nas plântulas de todos os tratamentos (p≤0,05). Não
houve diferença nos valores médios destes dois parâmetros, entre as plantas de várzea e
terra firme nos tratamentos controles e de submersão (Tab. 6).
Tabela 6. Média dos valores de número de folhas, área foliar total (AFT) da plântula e
freqüência estomática de H. sucuuba, 30 dias após o início dos tratamentos de submersão.
nº de folhas AFT (m
2
) Freq. estomática (mm
2
)
VZ TF VZ TF VZ TF
Controle
08 A* 07 A* 0,38 A* 0,32 A* 64 A* 49 A*
Submersão parcial
09 B 09 B 0,14 B* 0,11 B* 99 B* 68 B*
Submersão total
04 C* 03 C* 0,16 C* 0,11 C* 94 B* 73 B*
Na mesma coluna: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si; Na mesma linha: (*) =
diferenças significativas entre as médias dos dois ambientes (VZ e TF). Tukey a 5% de
probabilidade. n = 5
Nas plântulas oriundas das populações de várzea a submersão (VZSP e VZST) levou a
uma diminuição no tamanho dos estômatos (Tab. 7), o que foi aferido pelas medidas de
comprimento e largura dos mesmos. Contudo, essa redução foi significante (p≤0,05)
apenas no tratamento de submersão total (VZSP), permanecendo uma tendência no
tratamento de submersão parcial (VZST). Esses resultados diferem (p≤0,05) dos
apresentados pelas plântulas da terra firme, nos dois tratamentos (TFSP e TFST), cujos
valores médios foram semelhantes ao do controle (TFC) do mesmo ambiente (Tab. 7). Não
houve diferença significativa entre os tratamentos controle (VZC e TFC), com relação aos
valores médios de comprimento e largura dos estômatos.
Quando se avaliou o tamanho do poro estomático, as plântulas da população de terra
firme mostraram uma redução significante destes, em função do alagamento. Essa
tendência, entretanto, não se confirmou para as plântulas da população de várzea (Tab. 7).
Tabela 7. Influência do alagamento no comprimento e na largura de estômatos; e no
tamanho do poro estomático das folhas de plântulas de H. sucuuba, dos ambientes de
várzea e terra firme.
Comprimento (μm) Largura (μm) Poro (μm)
VZ TF VZ TF VZ
TF
Controle
21,26 A 21,84 A 16,48 A 15,86 A 10,90 A* 12,46 A*
Submersão parcial
20,43 AB* 21,89 A* 13,97 AB* 16,30 A* 11,22 A 10,96 B
Submersão total
19,46 B* 22,83 A* 13,81 B* 16,85 A* 11,38 A 11,36 AB
Na mesma coluna: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si; Na mesma linha, para
cada medida: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois ambientes (VZ e TF). Tukey a
5% de probabilidade. n = 5.
3.7. Características da epiderme
Na descrição das estruturas epidérmicas feita com base nas análises das plântulas
dos tratamentos controles (VZC e TFC), são apontadas as diferenças na anatomia, em
resposta a inundação.
A constituição das epidermes foliares adaxial e abaxial das plântulas de H. sucuuba
não diferiu nos dois ambientes, várzea e terra firme. Em vista frontal, a epiderme adaxial
(Fig. 5 A) é glabra, com as paredes periclinais externas sinuosas, espessadas por celulose,
sem pontuações aparentes. Possui certa uniformidade nos tamanhos das células e apresenta
uma cutícula estriada contínua. Da mesma forma, a epiderme abaxial (Fig. 5 B) é glabra,
porém suas células apresentam sinuosidade das paredes periclinais externas mais
acentuadas que as da epiderme adaxial, com igual espessamento da parede celular. Nesta
superfície é evidente a diferença nas formas e tamanhos das células.
A
B
cs
pc
e
ct ct
cg pc
40
μ
m
40
μ
m
Figura 5. Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de H.
sucuuba. pc) parede celulósica; ct) cutícula; e) estômato; cg) células guardas; cs) células
subsidiárias.
34
A B
eg
40
μ
m
45
μ
m
Figura 6. A) epiderme abaxial com estômatos geminados (eg). B) detalhe da epiderme abaxial
mostrando os estômatos.
A espécie é hipoestomática e os estômatos são do tipo anomocíticos, dispostos nas
regiões intercostais, estando ausentes nas nervuras. Em todos os tratamentos observou-se a
presença de estômatos geminados (Fig. 6 A/B), cujo número aumentou dos tratamentos
controle para os de submersão parcial. No entanto, nas folhas das plântulas submetidas à
submersão total essa tendência não foi observada. Nesse tratamento (VZST e TFST), em
visão frontal, não foi possível distinguir a delimitação das paredes das células, devido a
deformação da cutícula que resultou no seu excessivo estriamento (Fig. 7 A).
A B
e
ct
ct
40
μ
m 45
μ
m
Figura 7. Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de H.
sucuuba, submetidas ao tratamento de alagamento total. ct) cutícula; e) estômato.
4. DISCUSSÃO
Alterações na biometria e morfologia plantas são comumente observadas em
função do alagamento do solo (Joly, 1994; Kozlowski, 1997; Waldhoff et al., 1998; Ito et
al., 1999; Gunawardena et al., 2001; Parolin et al., 2004; Florentine et al., 2006). Em H.
sucuuba, plântulas oriundas das duas populações (várzea e terra firme) tiveram essas
alterações intensificadas pelo aumento da coluna de água e do período de submersão.
35
36
Embora esse efeito tenha sido observado na maioria das avaliações, diferenças
significativas foram verificadas apenas ao final dos 90 dias de submersão.
As plântulas da várzea dos tratamentos VZC e VZSP apresentaram um crescimento
médio superior àquelas de terra firme sob mesmas condições (TFC e TFSP), o que pode
indicar uma adaptação diferenciada entre as duas populações, sugerindo que plântulas
oriundas da várzea, em tais situações, utilizam a estratégia de “escape” (Parolin, 2003), que
consiste em crescer mais rapidamente a fim manter as folhas fora da água e garantir a
continuação do processo fotossintético. Por outro lado, as plântulas sob submersão total
(VZST e TFST), paralisaram o crescimento e perderam as folhas após 30 dias de
submersão.
A paralisação do crescimento é descrita também para plântulas de outras espécies
tolerantes ao alagamento quando sob condições de saturação hídrica do solo, como o açaí
(Euterpe oleracea) e ingá (Inga vera) (Menezes Neto, 1994; Tribuzy, 1998). Tais
evidências corroboram as afirmações de Crawford (1992) em que os pesados custos
impostos pelo metabolismo anaeróbico implicam que, sob prolongados períodos de déficit
de oxigênio, apenas as plantas tolerantes consigam sobreviver. De fato, em experimento
com plântulas de açaí, Menezes Neto (1994) observou que, após a aeração pela retirada da
água, o crescimento foi retomado. Estudos da fluorescência da clorofila em algumas
espécies de áreas alagáveis, sob diferentes períodos e profundidades de inundação,
mostraram a recuperação do fotossistema II (PSII) tão logo a inundação foi suprimida
(Waldhoff et al., 2002). Além de adaptações fisiológicas, adaptações anatômicas e
morfológicas de folhas (Waldhoff, 2003) são importantes coadjuvantes para que as plantas
superem com sucesso as condições de anoxia e as dificuldades de manutenção de um
balanço hídrico adequado sob inundação.
Quando o alagamento foi imposto apenas ao sistema radicular, permanecendo a
parte aérea das plântulas em contato com o ar, seu crescimento nos tratamentos de
submersão parcial (VZSP e TFSP) permaneceu contínuo, mostrando, porém, valores
médios menores do que aqueles apresentados pelos seus respectivos controles (VZC e
TFC), como resultado do efeito negativo do alagamento do solo para o crescimento das
plântulas. Segundo Kozlowski (1997), essa diminuição nas taxas de crescimento é
conseqüência da redução da área fotossintética, verificada em muitas plantas quando
alagadas. De fato, em H. sucuuba a área foliar total, sofreu redução significativa após a
submersão das plântulas.
37
Redução da área foliar, estômatos menores e densidades estomáticas maiores são
características fortemente associadas a folhas xeromórficas (Fahn & Cutler, 1992;
Bosabalidis & Kofidis, 2002), já que o aumento na densidade dos estômatos e o
decréscimo simultâneo em seu tamanho permitem um melhor controle da transpiração,
adaptação favorável em ambientes que induzem a perda excessiva de água pelas plantas ou
cuja disponibilidade de água é restrita (Fahn & Cutler, 1992; Panou-Filotheou et al., 2001).
Essas características podem ser um indicativo de que, apesar de se encontrarem em meio
com excesso de água, esta não estaria disponível para a planta, podendo dessa maneira,
gerar uma seca fisiológica. Evidências dessa tendência em folhas de várias espécies
arbóreas de áreas alagáveis amazônicas são citadas por Waldhoff & Furch (2002),
notadamente durante os períodos de pico das cheias, quando apenas a copa das árvores
permanece acima da coluna de água. O investimento prioritario em sistema radicular é uma
outra resposta típica em plantas expostas ao déficit hídrico. Enquanto em plantas de várzea
a razão massa de raiz/parte aérea foi 0,55 para os controles e para as que foram expostas à
submersão parcial por 90 dias, houve um aumento considerável para as plantas da terra
firme, em que a razão aumentou de 0,34 para os controles para 0,66 em plantas expostas à
submersão parcial.
O aumento no número de estômatos em plantas de ambientes alagados também foi
observado por Botelho (1996), sugerindo estar relacionado à eficiência da fotossíntese.
Entretanto, essa afirmação é válida apenas para as plantas sob submersão parcial, onde as
folhas permaneceram em contato com a atmosfera aerada que possibilitou as trocas
gasosas. Para as plântulas totalmente submersas, que tiveram a abscisão de todas as folhas
após o primeiro mês de alagamento, esse ajuste, obviamente, não faz sentido. Dessa forma
acredita-se que tais características sejam inerentes ao genótipo, funcionando como uma
resposta da espécie à inundação. Por outro lado, a diminuição observada na área foliar
explicaria, pelo menos em parte, o aumento da freqüência estomática se o número de
estomatos por unidade de lâmina foliar permanecer constante em planta parcialmente
submersa. Contudo, essa análise não pôde ser realizada para essa planta por interferência
do estriamento da cutícula, que impossibilitou a visualização definida da parede celular.
O aumento no número de estômatos geminados nas plântulas sob alagamento pode
ser um indicativo de teratogenia induzida pelo estresse. Já, a presença da cutícula sobre as
epidermes é uma estrutura comum nas plantas (Araújo & Mendonça, 1998; Fahn & Cutler,
1992; Ferreira et al., 2002; Waldhoff & Furch, 2002) e normalmente está relacionada com
38
a prevenção contra perda excessiva de água, o que reforça a evidência de necessidade de
controle da perda de água na planta.
A saturação hídrica altera a constituição química do solo, devido a mudanças em
seu potencial redox (Pezeshki, 2001). Como resultado, podem ocorrer mudanças na
absorção de nutrientes pelas raízes com efeito direto no crescimento da planta e incremento
de biomassa. No presente estudo, o alagamento prolongado reduziu de forma significativa
as taxas de incremento de biomassa nas populações de ambos os ambientes ao longo dos
90 dias de aplicação dos tratamentos. Além disso, a área foliar total teve uma redução
considerável com a imposição dos tratamentos de submersão, reduzindo assim a superfície
fotossintética, ou seja, a sua capacidade de assimilação de carbono.
Com relação ao incremento de biomassa, nas plântulas controle da várzea (VZC) as
médias obtidas foram maior que as plântulas da terra firme (TFC), sob mesmas condições.
O tratamento VZC apresentou quase duas vezes o valor do incremento de massa seca
verificado para o TFC, mesmo tendo sido utilizado solo da várzea, mais fértil (Furch,
1984), para ambos os tratamentos. Esses resultados sugerem que plântulas de populações
que habitam a várzea previnem-se para o alagamento prolongado, acumulando massa e
reservas durante a fase favorável de recuo das águas ou em que a água dos rios retorna ao
seu leito original, para utilizá-las como substrato para a respiração durante a fase de
submersão da planta. Estes aspectos serão discutidos no capítulo III, que trata do
metabolismo das plantas sob alagamento.
Embora em quantidades menores que o controle, houve acúmulo de biomassa entre
as plântulas do tratamento de submersão parcial (VZSP e TFSP). Isso se deve,
provavelmente, ao fato dessas plântulas manterem as folhas e desenvolverem adaptações
morfológicas como lenticelas e raízes adventícias, para suprir a deficiência de oxigênio e
ajudar a restaurar o metabolismo aeróbico. No tratamento de submersão total (VZST e
TFST), foi verificada uma perda de biomassa e paralisação do crescimento, com a planta
entrando em um estágio de dormência, onde o uso das reservas é lento. Esse resultado é
plausível, uma vez que H. sucuuba, quando totalmente submersa perde as folhas, não
desenvolve estruturas adaptativas para a captação de oxigênio atmosférico e mantém o
metabolismo desviando a via glicolítica para formação de etanol (Ferreira, 2002). Devido
às elevadas taxas de ADH, que indicam uma eficiente respiração anaeróbica nas
populações de H. sucuuba da várzea, em comparação às populações de terra firme
(Ferreira, 2002), é possível sugerir que as plântulas do ambiente de várzea não só possuem
mais reservas, mas as utilizam mais eficientemente, alocando-as para o funcionamento de
39
um metabolismo de manutenção, durante o alagamento. Desta forma, plantas oriundas da
várzea com apenas três meses de idade já acumulam reservas suficientes para tolerar pelo
menos 90 dias de submersão total, enquanto que as populações oriundas da terra firme
aparentemente têm uma menor acumulação de reservas, pois tiveram uma diminuição
acentuada da sobrevivência no mesmo período de tempo.
A alocação de biomassa diferiu entre os compartimentos da planta, nas duas
populações. No tratamento VZC a biomassa acumulou nas raízes e caules, no tratamento
TFC os valores mais elevados foram encontrados nas folhas, seguido do caule. Essa
compartimentalização diferenciada da biomassa da planta certamente se relaciona com o
ambiente de origem da mesma, mostrando que as plântulas da várzea tendem a acumular
biomassa nos órgãos como caule e raiz para uso no alongamento da plântula, como
mecanismo de fuga da inundação e para a acumulação de reservas que possam ser
utilizadas nos períodos prolongados de submersão que ficam anualmente expostas durante
o ciclo de inundação que caracteriza a várzea. Por outro lado, as plântulas da terra firme
parecem estar investindo a energia mais em área fotossintética e tecido estrutural. Esta
análise parece plausível, já que diferenças genéticas foram encontradas entre populações de
várzea e terra firme em um gradiente latitudinal na bacia amazônica, conforme será
abordado no capítulo IV.
CONCLUSÃO
Plântulas de H. sucuuba são tolerantes ao alagamento, podendo responder de forma
diferenciada, em função do ambiente de origem das sementes. O estudo da espécie
avaliando diferentes níveis de inundação demonstrou que mais do que o alagamento, a
tolerância da espécie varia com a duração da inundação e com a altura da coluna de água.
Plântulas dos ambientes de várzea apresentam maior capacidade de tolerar períodos
prolongados de alagamento, demonstrado pela elevada sobrevivência em condições de
submersão total.
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43
CAPÍTULO III
Análises bioquímicas de sementes e de raízes
de plântulas de Himatanthus sucuuba
44
1. INTRODUÇÃO
Várias espécies de plantas podem crescer em áreas nas quais seus sistemas
radiculares e as porções mais baixas do caule ou a planta inteira são submetidos mais da
metade do ano à inundação, seguida de períodos de seca variáveis (Harborne, 1988). Dado
o caráter séssil da vegetação lenhosa, esta deve ter a habilidade de conviver com tais
condições ao longo de seu ciclo de vida (Piedade et al., 2001). Para isto, espécies
colonizando esses ambientes devem possuir a capacidade de, regularmente, readaptar seu
metabolismo para sobreviver à alternância entre um ambiente aeróbico, hipóxico ou
mesmo anóxico resultante da inundação (Harborne, 1988; Lobo & Joly, 1998; Crawford &
Braendle, 1996; Menezes Neto et al., 1995; Dennis et al., 2000; Ferreira, 2002; Taiz &
Zeiger, 2004).
A anaerobiose do sistema radicular tem como conseqüência mudanças nos níveis de
intermediários metabólicos e aumento do fluxo glicolítico. Esse aumento é acompanhado
pelo acúmulo de um número variável de produtos, cuja toxidez pode levar à morte da
célula em plantas não tolerantes (Crawford & Braendle, 1996; Ellis et al., 1999; Dennis et
al., 2000; Ferreira, 2002; Felle, 2005).
Devido a aceleração da taxa de fermentação anaeróbica, que resulta na depleção das
reservas de carboidratos, muitas plantas acumulam açúcares em seus tecidos no período
aerado, como forma de se prevenir para situações de anoxia (Albrecht et al., 2004). Uma
vez que a via fermentativa ocorre através da glicólise, a taxa de fermentação é controlada
pelo suprimento de açúcares solúveis disponíveis (Su et al. 1998). Dessa forma, a
disponibilidade de açúcares para uso no metabolismo é que vai definir o nível de tolerância
de uma espécie para a redução de oxigênio no meio (Perata et al., 1997; Schlüter &
Crawford, 2001).
Na Amazônia Central, as florestas alagáveis associadas aos grandes rios são
ambientes nos quais essas condições de alternância entre uma fase aquática e uma fase
terrestre são particularmente extremas (Junk et al., 1989), impondo a algumas árvores e,
principalmente às plântulas, períodos anuais de inundação superiores a 200 dias (Parolin,
2000). Dado que a tolerância ao alagamento difere entre espécies, a composição de
espécies em áreas alagáveis é influenciada pela combinação de fatores como a freqüência e
duração da inundação, a tolerância das plântulas à saturação hídrica do solo e as
características físico-químicas do solo sob tais condições (Kozlowski, 1984; Pezeshk,
2001). Como a distribuição de espécies se dá em um gradiente ascendente de elevação de
terreno, inversamente proporcional à inundação de cada faixa de relevo, é de se esperar que
45
sua composição varie ao longo deste gradiente (Kozlowski, 1984). De fato, a zonação de
espécies arbóreas nos gradientes de inundação das florestas alagáveis amazônicas,
especialmente nas várzeas, é bem documentada (Junk, 1989; Worbes et al., 1992;
Wittmann et al., 2004) mostrando que devido à inundação, a diversidade de espécies na
várzea é reduzida (Junk, 1993; Capon, 2005).
O estabelecimento de plântulas e a regeneração de áreas degrada podem ser
estimulados ou impedidos pela inundação, dependendo de sua duração e da espécie
considerada (Kozlowski, 1997). Embora a importância desse compartimento para a
perpetuação das espécies seja indiscutível, notadamente em ambientes extremos como as
áreas alagáveis amazônicas, as informações disponíveis, especialmente quanto aos
condicionantes para a germinação das sementes e sobrevivência das plântulas, são escassas
(Scarano, 1998; Parolin, 2001, Scarano et al., 2003; Ferreira et al., 2005; Oliveira-
Wittmann et al. no prelo).
Em diversas espécies as reservas contidas no endosperma das sementes contém a
maioria dos nutrientes necessários para o desenvolvimento inicial de plântulas (Perata et
al., 1997). Neste sentido, análises dos compostos de reservas que possam ser utilizados
como fontes de energia e carbono nos processos de germinação e de estabelecimento da
plântula no ambiente são ferramentas importantes para entender as adaptações de plantas a
ambientes inundados (Buckeridge et al., 2004a; b).
Esses estudos devem levar em consideração que a capacidade germinativa e o
desenvolvimento de plântulas podem variar dentro de um mesmo gênero (Medri, 1979;
Botelho, 1996; Tribuzy, 1998) ou espécie (Harbone, 1988; Ferreira et al., 2005). A esse
respeito, embora os determinantes ambientais sejam indicados como indutores da presença
de diferentes floras entre a várzea e terra firme na Amazônia (Piedade et al. 2001;
Wittmann et al., 2006), algumas espécies podem ocorrer em ambos os ambientes, em
condições distintas no que se refere à inundação. Isto implica em possíveis diferenças no
metabolismo, devidos as diferenças nas condições ambientais, às quais estão expostas. Para
verificar esses aspectos, foram feitas análises das reservas metabólicas em sementes das
populações de Himatanthus sucuuba de ecossistemas de várzea e de terra firme, bem como
o acompanhamento de possíveis alterações no metabolismo das raízes de plântulas quando
totalmente submersas, visando responder as seguintes questões:
1) Poderia o pulso de inundação, que anualmente alaga grandes áreas ao longo
do rio Solimões/Amazonas, induzir dentro de uma mesma espécie respostas
46
distintas no metabolismo dessas populações, relacionadas aos ambientes de
origem?
2) Seriam essas diferenças expressas em tal ordem de magnitude a ponto de
segregar as populações dos dois ambientes, em termos do estabelecimento?
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo
As sementes foram coletadas de dez indivíduos nas várzeas da Ilha de Marchantaria
(03º 15’ S, 60º 00’ W) e cercanias, e de dez indivíduos nas áreas de terra firme que
abrangem a Reserva Florestal Adolpho Ducke (02º 53’ S, 59º 58’ W), ao longo da Rodovia
Manaus-Itacoatiara (AM 010). Essas áreas estão cerca de 40km de distância uma da outra,
separadas pelos rios Negro e Solimões. Em ambos os sítios, na várzea e na terra firme,
foram coletadas sementes em no mínimo três populações, com cerca de 1km de distância
entre si. Essas sementes foram então homogeneizadas, para garantir a aleatoridade das
amostras e utilizadas no estudo. O material fértil dessas plantas foi depositado no herbário
do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), sob o registro 210133.
As sementes coletadas foram acondicionadas em sacos de papel e transportadas
para o Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, do Instituto de Botânica de São
Paulo (IBt), São Paulo, SP, para realização das análises bioquímicas e produção de
plântulas para uso nos experimentos de inundação.
2.2. Análises da composição das sementes
2.2.1. Sementes inteiras
Foram analisados os teores de amido, açúcares totais e a composição dos açúcares nas
sementes inteiras de H. sucuuba provenientes de matrizes nas populações da várzea e da
terra firme. Inicialmente foram separados cinco lotes de três sementes para cada um dos
ambientes de origem (várzea ou terra firme), tendo sido cada lote considerado uma
repetição. A seguir, foi feita a retirada manual da casca das sementes que foram
posteriormente liofilizadas e pesadas (em grupos de três) para obtenção da massa seca e,
posteriormente, moídas em moinho de bola (Tecnal Ltda) para a extração de açúcares e
amido.
Para as análises, 50 mg de cada amostra de pó foram submetidas a três extrações
com 500 µL de etanol 80% (v/v), incubada em banho-maria a 80 ºC por 10 minutos. Após
47
cada extração, a mistura foi centrifugada. Em seguida, procedeu-se a coleta do
sobrenadante que foi seco a vácuo e usado na quantificação de açúcares solúveis totais pelo
método colorimétrico a A
498
nm (Buckeridge & Dietrich, 1996). A curva padrão utilizada
foi de glucose. Os açúcares solúveis em álcool foram quantificados por HPLC.
As amostras foram deionizadas através de passagem por resinas Dowex catiônica e
aniônica e em seguida filtradas (Millipore 0,25 μm) para análise da composição dos
açúcares solúveis por Cromatografia de Troca Iônica de Desempenho com Detector de
Pulso Amperométrico (HPAEC/PAD) modelo DX500, em coluna CarboPac PA-1 (Dionex
Corporation, Sunnyvale, CA, EUA) através de eluição isocrática com 200 mM de
hidróxido de sódio em água, com fluxo 1mL/min : 0-15 min 50 % NaOH 200 mM e 50 %
H
2
O, 15-20 min 100 % NaOH 200 mM, 20-25 min 50 % NaOH 200 mM e 50 % H
2
O. As
áreas de cada pico foram corrigidas de acordo com a sensitividade do detector para cada
açúcar.
A análise de amido foi feita com base na metodologia descrita por Santos et al. (2004),
na qual o resíduo da extração etanólica foi seco em liofilizador e após a secagem foram
adicionados 500 µL de α-amilase termoestável (120U.mL
-1
). As amostras foram incubadas
a 75 ºC por 30 minutos (esse procedimento foi repetido mais uma vez). Em seguida foram
adicionados 400 µL de amiloglucosidase (30 U/mL
-1
) e a mistura de incubação foi mantida
por 30 minutos a 50 ºC (esse procedimento foi repetido mais uma vez). A amostra foi
submetida à digestão com ácido perclórico para a quantificação colorimétrica A
490
nm,
com curva padrão de glucose.
2.2.2. Análise das reservas do endosperma
Três lotes de 10 sementes de H. sucuuba das populações da várzea e da terra firme
foram mergulhadas em água por 24 horas. Nessas sementes foi feita a retirada manual do
envoltório alado, para facilitar a embebição (Ferreira et al., 2005). Depois de embebidas,
foi feita a limpeza do restante da casca da semente até a exposição completa do
endosperma, que foi separado do embrião. Essas partes foram mantidas em liofilizador
para a determinação da massa seca. Do endosperma da semente foi obtido o teor de
carboidratos de reserva e de proteínas.
A extração dos carboidratos de reserva foi baseada no método descrito por Buckeridge
& Dietrich (1990), que consistiu em adicionar 100 mL de água destilada em 1g de amostra
do endosperma e em mantê-la em placa aquecida a 80 °C, sob agitação constante, por um
período aproximado de 4 horas. Após a extração, a amostra foi filtrada em tecido e
48
adicionado três volumes de etanol 96 ºGL, permanecendo em repouso a 5
o
C durante a
noite (“overnight”), para a precipitação da amostra. Após esse período a amostra foi lavada
com acetona PA, centrifugada, e o resíduo foi liofilizado. A amostra seca foi ressuspensa
em água. A quantificação dos carboidratos foi feita em espectrofotômetro no comprimento
de onda de A
498
nm pelo método de Dubois et al. (1956), e a de proteínas a A
595
nm pelo
método de Bradford (1976).
A presença de percentuais elevados de carboidratos de reserva constituindo o
endosperma levou à realização da análise de fragmentação destes em monossacarídeos,
quantificados em HPLC, conforme metodologia descrita no tópico anterior (sementes
inteiras).
2.2.3. Produção de plântulas para o estabelecimento dos experimentos de alagamento
As sementes foram colocadas para germinar diretamente em vasos com capacidade
para 2L, em temperatura ambiente (média 20º C). O substrato utilizado para o plantio foi
areia, com cobertura superficial de vermiculita para conservar a umidade. Entretanto, após
14 dias de observação, foi verificado que as sementes embeberam, porém não germinaram,
sendo então transferidas para câmaras a 30 ºC. Sob as novas condições, a germinação
(emissão de radícula geotrópica) ocorreu entre o segundo e o quinto dia, após o qual, foi
feita a transferência destas para a casa de vegetação, onde se acompanhou a produção e o
estabelecimento de plântulas. O critério utilizado para iniciar a indução do alagamento foi
a emissão e completa expansão do segundo par de folhas pelas plântulas.
Para o experimento de alagamento foram utilizados tanques de polietileno (40 L) e
dentro de cada tanque foram dispostos quatro vasos (2 L), com 5 plântulas/vaso, geradas a
partir de sementes da várzea ou da terra firme, com idade aproximada de um mês. Cada
plântula foi considerada uma unidade amostral. O substrato utilizado no experimento foi
areia.
Durante o período de 30 dias as plântulas foram submetidas aos seguintes tratamentos:
Controle (irrigação diária e luz natural); Escuro (irrigação diária com a planta mantida no
escuro); Alagado com luz (submersão total da planta, com coluna de água de 20 cm); e
Alagado no escuro (submersão total da planta, com coluna de água de 20 cm e cobertura
com plástico preto 100% sem luz).
49
2.2.4. Análises bioquímicas das raízes das plântulas
No período de 15 e 30 dias após o início dos experimentos de alagamento, foi
realizada a coleta de três plântulas de H. sucuuba de cada ambiente, por tratamento. As
plântulas foram retiradas do vaso, lavadas com água corrente, separadas em raiz e parte
aérea e acondicionadas dentro de envelopes de alumínio, devidamente identificados,
mantidos em nitrogênio líquido. Posteriormente era feito o armazenamento das mesmas em
freezer a -20ºC.
As análises de carboidratos de baixo peso molecular e de poliálcoois foram
realizadas nas raízes das plântulas, em todos os tratamentos e para os dois períodos
avaliados, utilizando o sistema GC/MS (Cromatógrafo a Gás com Espectrometria de
Massa).
As raízes foram levadas ao liofilizador até peso constante. Depois de secas, foram
maceradas utilizando pistilo e almofariz e transferidas para tubos de Eppendorf. Para as
análises químicas foram utilizados 30 mg de massa seca, de cada amostra coletada nos
diversos tratamentos.
A extração foi feita adicionando às amostras de material liofilizado, 500 µL da
mistura de metanol:clorofórmio:água (12:5:3 v/v), contendo fenil-β-D-glucopiranoside,
como padrão interno. As amostras foram incubadas em banho-maria a 60 ºC por 30
minutos. Para facilitar a separação das fases foi adicionado 500 µL de água deionizada e
foi feita a centrifugação a 10.000 g por 2 minutos. Em um tubo vial de 1,5 mL foi pipetado
50 µL do sobrenadante obtido. A silanização das amostras foi feita adicionando ao tubo
200 µL de pirimidina, 25 µL da mistura de N,O-bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide
(BSTFA) e trimethyl-chlorosilane (TMCS), adicionado ao tubo. Os vials foram incubados
em banho seco a 75 ºC por 60 minutos e a quantificação dos compostos foi efetuada no
GC/MS, de acordo com a metodologia descrita por Roessner et al. (2000).
2.2.5. Análise estatística dos dados
De posse das concentrações de açúcares solúveis, amido, carboidratos e proteínas
presentes na semente inteira ou no seu endosperma, procederam-se aos ajustes das
equações por meio de análise de regressão. O teor de cada composto foi calculado com
base na quantidade de massa seca da semente. Para os experimentos de alagamento o
delineamento experimental foi completamente casualizado com três repetições. A análise
foi em esquema fatorial 2 (épocas de avaliação) x 3 (repetições) x 2 (ambientes, várzea ou
terra firme). Foi feita análise de variância (ANOVA) e a comparação entre as médias dos
50
fatores estudados foi feita com base no teste Tukey a 5% de probabilidade. As análises
estatísticas foram realizadas utilizando o programa Statistic 8.0.
3. RESULTADOS
3.1. Análise das sementes
Em H. sucuuba, cerca de 34 ± 5 mg.g
-1
da massa seca das sementes da população da
várzea e 36 ± 2 mg.g
-1
da população da terra firme, é constituída por açúcares solúveis.
Esses valores correspondem a quase 15% da massa seca total das sementes em ambas as
populações (Tab. 1). Do total de açúcares solúveis, as maiores concentrações foram de
rafinose e sacarose. Sementes de H. sucuuba não apresentam amido como carboidrato
principal de reserva, uma vez que apenas traços deste composto foram detectados (Tab. 1).
Tabela 1. Concentração de amido e açúcares solúveis totais em lotes de três sementes de H.
sucuuba de populações da várzea e da terra firme. n = 5.
Composição dos açúcares totais (%) Ambiente Amido
(%)
Açúcares totais
(%)
glucose sacarose rafinose
Várzea traços
14
4 27 69
Terra firme traços
13
2 40 58
Nas duas populações (várzea e terra firme), a semente embebida revelou a presença de
endosperma que contribui com mais da metade (55%) de sua massa seca total (Tab. 2).
Apesar dos valores de massa seca das sementes mostrarem-se maiores entre as populações
da terra firme, em relação às da várzea, estatisticamente não houve diferença.
Tabela 2. Valores médios da massa seca de lotes com 10 sementes de H. sucuuba: massa
do endosperma, do embrião e total (semente inteira). n = 5 lotes.
Várzea Terra Firme
(mg
-1
. g MS) (%) (mg
-1
. g MS) (%)
Eixo 338 45 399 45
Endosperma 413
55
488
55
Total 752 100 887 100
A análise realizada para verificar a composição do endosperma nas sementes das duas
populações mostrou similaridade quanto aos constituintes, mas não entre a partição destes
(Fig. 1). Embora a maior parte do endosperma fosse formada de polissacarídeos de parede
celular, esses valores foram mais elevados na população de várzea. Por outro lado, nas
plântulas da terra firme a porcentagem de açúcares solúveis foi cerca de dez vezes o valor
daqueles medidos nas plântulas da várzea (Fig. 1).
várz ea
4,5%
2,5%
93%
polissacarídeos proteínas açúcares solúveis
terra firme
4%
22%
74%
polissacarídeos proteínas açúcares solúveis
Figura 1. Percentual (área) dos constituintes do endosperma da semente de H. sucuuba.
A hidrólise ácida destes polissacarídeos mostrou diferenças na constituição em
monossacarídeos das sementes das duas populações. Em ambas, o carboidrato de reserva
com maior área é um manano. No entanto, enquanto nas sementes oriundas da várzea cerca
de 94% de sua constituição é formada por manose, nas sementes da terra firme verificou-se
uma razão de manose e galactose de aproximandamente 3:1 (Tab. 3). Isto sugere a
presença de um galactomanano nessas sementes como principal polissacarídeo de reserva
de parede.
Tabela 3. Percentual (área) dos monossacarídeos de reserva de
parede, no endosperma de H. sucuuba.
Várzea
(%)
Terra firme
(%)
fucose traços 0,5
arabnose 1,5 9,7
rhamnose 0,3 2
galactose 3 17,7
glucose 0,5 2,6
xilose 0,4 2,9
manose 94,3 64,6
51
52
3.2. Análise bioquímica das raízes das plântulas sob alagamento
Sementes de H. sucuuba apresentaram comportamento quiescente, uma vez que a
germinação e o início da formação da plântula aconteceu apenas após a transferência das
sementes para câmaras com temperatura semelhante àquela encontrada no ambiente natural
de ocorrência da espécie, a floresta amazônica, onde a temperatura elevada (média de 28º
C) é praticamente constante, com pouca variação.
As análises realizadas aos 15 dias mostraram que as plântulas do controle da várzea
apresentavam em suas raízes concentrações de malato menores (p≤0.05) que aquelas
submetidas aos demais tratamentos (escuro, alagado na luz e alagado no escuro). Nas
plântulas da terra firme não houve diferença significativa entre os tratamentos. Aos 30 dias
foi verificado um decréscimo nas concentrações de malato nas duas populações, em
comparação com o controle, porém, somente no tratamento alagado no escuro essa redução
foi significativa. Plântulas da terra firme aos 30 dias apresentaram valores de concentração
de malato maiores (p≤0.05) que as plântulas da várzea (Tab. 4).
Tabela 4. Valores médios das concentrações de malato (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3.
MALATO (μg.g
-1
MS)
15 dias 30 dias
VZ TF VZ TF
Controle 4,07 2,77 12,52* 27,45*
Escuro 10,73 4,97 7,74 18,93
Alagado luz 10,20 17,51 8,81 10,49
Alagado escuro 11,46 7,69 3,33 6,56
(*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra
firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
O alagamento por 15 dias, em condições de escuro, elevou (p≤0.05) os valores de
citrato nas raízes das plântulas da várzea. O mesmo não foi observado nas plântulas da
terra firme, que não apresentou diferença (p≤0.05). Por outro lado, aos 30 dias, neste
mesmo tratamento, houve redução significativa na concentração de citrato entre as
plântulas da terra firme, quando comparadas ao controle, enquanto as plântulas de várzea
sob as mesmas condições não diferiram do controle. Contudo, os valores apresentados
pelas plântulas da várzea aos 30 dias foram diferentes (p>0.05) daqueles observados aos 15
53
dias, mostrando decréscimo em sua concentração. Para os outros tratamentos, nos dois
períodos analisados as diferenças não foram significativas. Aos 30 dias verificou-se que
sob condições de alagamento, tanto na luz quanto no escuro, as concentrações de citrato
nas raízes de plântulas da várzea foram mais elevadas (p≤0.05) que naquelas da terra firme
(Tab. 5).
Tabela 5. Valores médios das concentrações de citrato (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3.
CITRATO (μg.g
-1
MS)
15 dias 30 dias
VZ TF VZ TF
Controle 18,60* 2,47* 25,87 24,02
Escuro 17,19 6,96 19,96 12,10
Alagado luz 19,06 21,31 18,31* 5,43*
Alagado escuro 44,28* 14,02* 8,83* 3,68*
(*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra
firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
O alagamento levou ao aumento significativo nas concentrações de mioinositol nas
raízes de plântulas da várzea aos 15 dias. Aos 30 dias a diferença se manteve somente nas
plântulas alagadas no escuro. Embora raízes sob alagamento na luz permanecessem com
valores elevados, sem diferença para as análises aos 15 dias, seus valores não foram
diferentes do controle. Nos dois períodos de avaliação das plântulas da terra firme (15 e 30
dias), aumentos significativos foram verificados no tratamento daquelas alagadas na luz.
Nos demais tratamentos, comparados ao controle, as concentrações mantiveram-se
constantes. Diferenças significativas entre as populações dos dois ambientes foram
verificadas aos 15 dias, onde as plântulas da várzea apresentaram valores mais elevados
(p≤0.05) que da terra firme (Tab. 6).
54
Tabela 6. Valores médios das concentrações de mioinositol (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3.
MIOINOSITOL (μg.g
-1
MS)
15 dias 30 dias
VZ TF VZ TF
Controle 0,23 0,14 0,60 0,24
Escuro 0,35 0,08 0,27 0,12
Alagado luz 0,55* 0,30* 0,87 0,70
Alagado escuro 0,76* 0,29* 0,83 0,53
(*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra
firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Não houve diferença (p≥0.05) nas concentrações de frutose entre os tratamentos aos
15 e 30 dias. Entretanto, quando um mesmo tratamento foi comparado nos dois períodos de
avaliação, verificou-se que na população da várzea o tratamento com as plântulas no
escuro e alagadas no escuro levou a um decréscimo significativo nas concentrações de
frutose. Nestes tratamentos, as concentrações desse composto nas raízes das plântulas
permaneceram sempre mais elevadas entre aquelas da várzea (Tab. 7). Nos tratamentos
controles aos 15 e 30 dias, as plântulas da várzea mostraram uma tendência à redução na
concentração de frutose, enquanto as da terra firme elevaram seus valores, mas sem
diferença significativa para ambos (Tab. 7).
Tabela 7. Valores médios das concentrações de frutose (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3.
FRUTOSE (μg.g
-1
MS)
15 dias 30 dias
VZ TF VZ TF
Controle 8,26* 0,66* 3,54 1,65
Escuro 5,53* 0,14* 1,39* 0,28*
Alagado luz 2,13 2,09 2,92 1,34
Alagado escuro 11,47* 0,64* 3,46* 0,93*
(*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra
firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
55
Plântulas da várzea com 15 dias no escuro ou alagadas com luz reduziram de forma
significativa as concentrações de glucose em suas raízes, já o tratamento de alagamento no
escuro manteve constante a concentração desse composto. Aos 30 dias não houve
diferença em relação ao controle, mas verificou-se a elevação na concentração de glucose
(p≤0.05) dos 15 aos 30 dias, nas raízes das plântulas alagadas com luz. Aos 15 dias apenas
o tratamento de alagamento na luz não apresentou diferença (p≥0.05) nas concentrações de
glucose entre as plântulas dos dois ambientes (Tab. 8). Nos três tratamentos restantes
(controle, escuro e alagado no escuro) as plântulas da várzea apresentaram concentrações
de glucose nas suas raízes mais elevadas que nas de terra firme. Aos 30 dias essa diferença
não foi observada (Tab. 8).
Tabela 8. Valores médios das concentrações de glucose (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3.
GLUCOSE (μg.g
-1
MS)
15 dias 30 dias
VZ TF VZ TF
Controle 28,41* 7,05* 20,39 20,64
Escuro 7,73* 1,93* 13,54 16,88
Alagado luz 4,92 11,77 40,93 31,27
Alagado escuro 35,75* 11,88* 42,87 20,15
(*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra
firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
As análises realizadas aos 15 e aos 30 dias mostraram que plântulas de H. sucuuba,
tanto da várzea quanto da terra firme, elevam as concentrações de sacarose (p≤0.05) sob
condições ideais de luz e água (tratamentos controles). Quando submetidas ao escuro as
plântulas reduziram a concentração do composto (p≤0.05). Plântulas sob alagamento em
condições de escuro mantiveram as concentrações de sacarose constantes durante todo o
período experimental, sem diferença (p≥0.05) para os valores apresentados pelo controle
aos 15 dias. Nas plântulas da várzea, após 15 dias no tratamento de alagamento com luz,
ocorreu a redução na concentração de sacarose (p≤0.05), diferente das plântulas da terra
firme, que não apresentaram diferenças em relação ao controle (p≥0.05). Aos 30 dias de
experimento, nas duas populações, os valores apresentados pelos controles foram
superiores (p≤0.05) àqueles dos tratamentos de luz e inundação. Neste tratamento, as
56
plântulas da população de várzea apresentaram valores maiores (p≤0.05) de concentração
de sacarose que aquelas da terra firme (Tab. 9).
Tabela 9. Valores médios das concentrações de sacarose (μg.g
-1
MS) nos diferentes
tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de
avaliação. n = 3.
SACAROSE (μg.g
-1
MS)
15 dias 30 dias
VZ TF VZ TF
Controle 51,04 40,88 167,31* 101,34*
Escuro 3,19 1,27 2,70 2,09
Alagado luz 8,14 25,32 23,12 13,54
Alagado escuro 56,12 35,22 49,56 25,28
(*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra
firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
4. DISCUSSÃO
4.1. Análise das reservas nas sementes
As sementes de H. sucuuba da população da várzea apresentaram a mesma
composição de reservas que aquelas da população da terra firme, no entanto, variações
importantes nas concentrações dessas substâncias foram observadas entre os dois
ambientes.
Independente da população estudada, várzea ou terra firme, as maiores
concentrações de açúcares solúveis nas sementes de H. sucuuba foram verificadas para
sacarose e rafinose. Esses compostos são considerados como principais derivados de
carboidratos que atuam como reserva na semente durante a germinação (Koops &
Groeneveld, 1990; Karner et al., 2004). Em sementes quiescentes, estes costumam ser os
carboidratos de reserva mais abundantes, normalmente associados aos oligossacarídeos da
série rafinósica (rafinose, estaquiose, verbascose) (Berna-Lugo & Leopold, 1992;
Buckeridge et al., 2004a).
A sacarose é excepcionalmente eficaz na proteção da integridade da membrana nos
sistemas expostos a secas, enquanto a rafinose é conhecida por realçar os efeitos protetores
da sacarose, evitando assim a dessecação da semente (Berna-Lugo & Leopold, 1992;
Karner et al., 2004). Esses compostos geralmente têm suas concentrações aumentadas no
57
final do período de maturação das sementes e, por possuírem a característica de reservas de
uso rápido para a produção de energia, sua função principal é servir como fonte de carbono
para a semente durante o processo germinativo (Koops & Groeneveld, 1990; Buckeridge et
al., 2004a). Desta forma, uma vez que H. sucuuba germina em um curto período de tempo
quando em condições ambientais favoráveis (Ferreira et al., 2005), compostos de
degradação rápida são necessários como fonte de energia para o desenvolvimento do
embrião e protrusão da radícula.
Nas sementes das duas populações, grande parte do endosperma é formada por
polissacarídeos de parede celular (93% várzea e 74% terra firme). Estas substâncias são
mobilizadas após a germinação, durante o desenvolvimento da plântula (Buckeridge et al.,
2000b), estágio especialmente sensível do ciclo de vida, em que o crescimento e a
sobrevivência inicial podem ser fortemente influenciados pelas reservas que a semente tem
disponível (Santos & Buckeridge, 2004). Por outro lado, da mesma forma que as maiores
concentrações de polissacarídeos de reserva de parede são verificadas no endosperma da
semente das populações da várzea, a contribuição dos açúcares solúveis na formação do
endosperma é quase dez vezes maior nas sementes de populações da terra firme.
A biossíntese e a deposição dos polissacarídeos na parede celular ocorrem na fase
final de maturação da semente e requerem açúcar-nucleotídeos como doadores de
monossacarídeos (Buckeridge et al., 2000a). Isto pode indicar que no período final da
maturação das sementes de H. sucuuba ocorre um acúmulo de sacarose que, em seguida, é
convertida em um polissacarídeo de reserva de parede. Com base nessas evidências,
podemos sugerir que a população da várzea investe na produção de carboidratos para o
desenvolvimento da plântula, enquanto que a população da terra firme aloca também
grande quantidade de carbono em compostos utilizados na germinação. Esta interpretação
é mais plausível ainda se, na análise, for considerada a importância dessas características
diferenciais no ambiente natural de origem de cada uma dessas populações. Enquanto na
várzea as plantas dispõem de um período de tempo relativamente curto antes da inundação
para o estabelecimento da plântula (cerca de três meses), essa pressão ambiental não é
imposta às plantas que habitam a terra firme.
Nas sementes de H. sucuuba de populações da várzea, mais de 90% dos
polissacarídeos de parede são constituídos por manose, sendo encontrado apenas 3% de
galactose. Da mesma forma, no endosperma das sementes de populações da terra firme,
estes também foram os monossacarídeos mais abundantes, no entanto, a relação entre esses
dois compostos foi cerca de 3:1. De acordo com as características de classificação dos
58
mananos (Buckeridge et al., 2000a;b), as sementes da várzea apresentam um manano puro
e as sementes das populações da terra firme possuem um galactomanano como
polissacarídeo reserva de parede celular.
O galactomanano é um dos polissacarídeos de reserva mais abundantes na natureza,
constituindo o endosperma de sementes de um grande número de espécies (Reid et al.,
2003; Buckeridge et al., 2004a). Pelo fato de que sua distribuição em grupos de plantas é
uma característica bastante específica e robusta, sua presença e concentração se constitui
em uma importante ferramenta do ponto de vista taxonômico. Os galactomananos são
compostos constituídos por uma cadeia principal de manose com ramificações de galactose
(Buckeridge et al., 2004a). A quantidade de ramificações de galactose é que vai determinar
o grau de solubilidade dos galactomananos em água, pois acima de uma razão igual a
quatro os galactomananos se tornam insolúveis (Buckeridge et al., 2004a).
Adicionalmente, estudos realizados até o momento indicam que o galactomanano
tem características de molécula bifuncional, exercendo papel no controle da embebição no
início da germinação, servindo, posteriormente, como reserva de carbono para o
crescimento inicial da plântula (Potomati, 2000). Exemplo dessa natureza do
galactomanano foi documentado para Sesbania virgata (Leguminosae - Faboideae) que
acumula esse polissacarídeo no endosperma, onde o mesmo funciona muito mais como
provedor de reserva de água para as sementes do que de carbono para o embrião (Potomati
& Buckeridge, 2002). Aparentemente esse não é caso de H. sucuuba, uma vez que se
conhecem os aspectos da germinação e produção de plântulas da espécie (Ferreira et al.,
2005). Assim sendo, pode-se concluir que as reservas utilizadas na fase inicial sejam
provenientes do endosperma da semente, que adquirem assim grande importância.
Os resultados de bioquímica das sementes são plenamente compatíveis com os
resultados de biomassa obtidos para H. sucuuba (Capítulo II), indicando que funções
ecológicas distintas parecem estar sendo exercidas pelos polissacarídeos e suas diferentes
concentrações acumuladas nas sementes da espécie em cada um dos ambientes
comparados. Muitas espécies que colonizam a várzea, entre elas H. sucuuba, têm a
capacidade de germinar e iniciar a produção de plântulas em solo saturado de água
(Scarano et al., 2003; Ferreira et al., 2005; Oliveira-Wittmann et al., no prelo) ou, antes da
descida total das águas e exposição do solo. Conseqüentemente, espera-se que na
germinação as sementes da população da várzea mobilizem suas reservas mais
rapidamente do que aquelas da terra firme. Também nessas sementes, os compostos
estruturais da parede da célula, que são necessários para permitir o crescimento inicial
59
rápido da plântula, são de importância fundamental no ecossistema de várzea, onde a
planta pode escapar da submergência total ao crescer em altura antes da elevação do nível
da água, sendo esse um fator essencial da colonização bem sucedida neste ambiente.
4.2. Análise do metabolismo das raízes de plântulas de H. sucuuba
Nas plantas a produção de açúcares por meio da fotossíntese é um processo vital, e
a composição, concentração e localização dos açúcares em seus diferentes compartimentos
modulam e coordenam os reguladores internos e as respostas aos estímulos ambientais, que
governam o crescimento e o desenvolvimento (Koch, 1996; Smeekens, 2000; Koroleva et
al., 2001). A fotossíntese ocorre nas células do mesofilo da folha madura e o fotossintato é
transportado, primeiramente como sacarose, aos meristemas e aos órgãos em
desenvolvimento. A luz e os açúcares regulam as atividades do crescimento por uma
modulação coordenada da expressão de genes e atividades enzimáticas, tanto no tecido que
exporta (fonte) quanto naquele que importa (dreno) o carboidrato. Isto assegura a síntese e
o uso ótimo do carbono e dos recursos de energia, e permite o ajuste do metabolismo de
carboidratos às mudanças nas condições ambientais e disponibilidade de nutrientes
(Coruzzi & Bush, 2001; Grossman & Takahashi, 2001).
Nas várzeas da Amazônia Central, os rios de águas brancas que invadem as
florestas nas épocas de cheia, permitem uma penetração limitada de luz nesses sistemas,
inferior a um metro de profundidade (Junk, 1984). Uma vez que H. sucuuba permanece
inundada em média por cinco meses sob uma coluna de água de cerca de 8 m (Ferreira,
2002), as plântulas dessa espécie sobrevivem em total ausência de luz. Nesse caso, além da
anoxia desses ambientes, a luz também pode ser um limitante, uma vez que ambos,
oxigênio e luz, são essenciais aos processos mais importantes para a sobrevivência da
planta, respiração e fotossíntese (Taiz & Zeiger, 2004).
Quando organismos aeróbicos estão expostos a ambientes com limitação de O
2
(por
exemplo, em solo inundado), a fosforilação oxidativa na mitocondria é inibida, o
metabolismo é desviado para a fermentação, com finalidade de sustentar a glicólise por
regeneração direta do NAD (Tadege et al., 1999; Dennis et al., 2000), conduzindo ao
acúmulo de produtos diversos tais como o etanol, lactato, alanina, succinato e malato (Fan
et al., 1997). O etanol é o principal produto da fermentação na maioria das plantas, e isso
independe do grau de tolerância ao déficit de O
2
.
Himatanthus sucuuba é um exemplo de espécie com metabolismo alcoólico quando
em anaerobiose (Ferreira, 2002). Entretanto, pelo fato do etanol ser um composto tóxico e
60
pelo baixo rendimento energético gerado, hipóteses como a de Crawford (1978), sobre a
diversificação da via metabólica a fim de produzir compostos menos tóxicos para a planta,
foram formuladas para tentar explicar a tolerância das espécies à inundação. Além disso,
acredita-se também que outras vias metabólicas poderiam atuar simultaneamente nos
indivíduos (Lobo & Joly, 1998; Sousa & Sodek, 2002). Contudo, no presente estudo essa
hipótese não pôde ser comprovada como um mecanismo eficiente em longo prazo para
plântulas de H. sucuuba, pois foi verificado que estas acumulam malato, independente da
imposição de estresse, sendo constatada uma elevação significativa na concentração deste
composto nas raízes das plântulas das duas populações, várzea e terra firme, no tratamento
controle.
Nos primeiros 15 dias de tratamento as plântulas da população da várzea tiveram a
concentração de malato elevada de forma significativa em todos os tratamentos (luz e
alagamento), em comparação ao controle, retornando ao valor inicial na análise realizada
aos 30 dias, com exceção das plântulas das duas populações expostas ao tratamento de
alagamento no escuro, em que a concentração de malato foi menor do que o valor medido
nos tratamentos controles. Estes eventos observados aos 30 dias sugerem que as raízes das
plântulas sob alagamento poderiam possuir um mecanismo de aclimatação às condições de
alagamento no escuro, que são as condições encontradas naturalmente na várzea.
Resultados semelhantes foram evidenciados no tecido de raiz de cevada (Hordeum
vulgare), submetida a 24h de anaerobiose, que apresentou níveis de concentração de
malato elevados nas primeiras 12h, depois das quais retornou a valores semelhantes aos
medidos no controle oxigenado. Nesse experimento, que avaliou diversos compostos
resultantes do metabolismo anaeróbico da cevada, apenas o etanol continuou a ser
produzido até o final das 24h (Good & Muench, 1993). Isto sugere que as plântulas podem
apresentar respostas metabólicas diferenciadas de curto e longo período sob circunstâncias
anóxicas, o que parece ser o caso de H. sucuuba.
A presença de citrato foi observada em todos os tratamentos, com diferença apenas
entre as plântulas da várzea do tratamento de alagamento no escuro, que elevou de forma
significativa a concentração do composto nas raízes. Contudo, quando se comparam as
plântulas das duas populações, várzea e terra firme, foi observado que aquelas da várzea
apresentaram maiores concentrações de citrato em suas raízes, especialmente sob
alagamento. Isto pode estar relacionado com a absorção de fósforo (P) pela planta, uma vez
que por causa de sua afinidade elevada para cátions divalentes e trivalentes, o citrato pode
61
deslocar P dos complexos insolúveis e torná-lo disponível para a absorção pela planta
(Marschner, 1995; Zhang et al., 1997; López-Bucio et al., 2000).
Em solos alcalinos a exudação de ácidos orgânicos por algumas espécies de plantas
desempenha um importante papel na absorção de P (López-Bucio et al., 2000). Se for
considerado o fato de que os solos de várzea (alcalinos) apresentam uma depleção de P nas
camadas menos superficiais, tornando-os mais deficientes nesse mineral do que as
reconhecidamente pobres áreas alagáveis por águas pretas ou claras (igapós) da região
amazônica (Furch, 1984), pode-se inferir que nas áreas de várzea, plantas com a
capacidade de concentrar citrato podem ter favorecida a absorção de P pelas raízes,
adaptação positiva que demonstraria a forte adaptabilidade a esses ambientes.
Outro composto que sofreu influencia do alagamento foi o mioinositol, que elevou
seus níveis de concentração em relação ao controle nos primeiros 15 dias de tratamento,
especialmente nas plântulas das populações da várzea. Na análise realizada aos 30 dias, os
níveis mantiveram-se elevados, no entanto foram semelhantes ao verificados para o
controle no mesmo período. O mioinositol é um poliálcool e seu papel está relacionado
à síntese de fosfolipídios e, portanto, na biogênese e na integridade da membrana (Nelson
et al., 1998). É um composto normalmente presente em plantas sob condições de estresse e
suas funções incluem a mediação de respostas celulares a estímulos externos. Em plantas
tolerantes à salinidade, atua como um sinalizador da folha-à-raiz para que a planta capture
sódio (Nelson et al., 1999). Entretanto, recentemente, Lorence et al. (2004) apresentaram
evidencias bioquímicas e moleculares de que o mioinositol é um possível precursor de
antioxidantes, como o ácido ascórbico. Em raízes de plântulas de H. sucuuba a função
desse composto não pôde ser esclarecida, mas parece plausível que esteja relacionado com
a manutenção da integridade da membrana celular. Tendo em vista que a via alternativa do
metabolismo anaeróbico é a etanólica, e o acúmulo de álcool, em qualquer quantidade,
pode levar a danos nas membranas. Contudo, sua possível função na rota para produção de
antioxidantes não pode ser descartada nas plantas sob alagamento.
As raízes são relativamente sensíveis ao déficit de oxigênio e postula-se que a
tolerância de uma planta a anoxia causada por inundação do solo é determinada pelo nível
de reservas de açúcar disponíveis na raiz (Su et al., 1998; Schlüter & Crawford, 2001).
Para sustentar um metabolismo fermentativo ativo, a planta necessita da disponibilidade de
carboidratos prontamente fermentáveis (Guglielminetti et al., 1995). Os açúcares solúveis,
especialmente a sacarose, glucose e frutose, executam um papel importante na estrutura e
na manutenção das funções de todas as células vivas. Eles estão envolvidos nas respostas a
62
vários estresses e agem como nutrientes e sinalizadores metabólicos de moléculas que
ativam modelos específicos de transdução de sinais de hormônios (Couée et al., 2006).
As plântulas de H. sucuuba da população da várzea, quando alagadas, apresentaram
em suas raízes concentrações maiores de frutose e glucose do que as plântulas da
população da terra firme. Entretanto, em ambas as populações o açúcar em maior
quantidade nos tratamentos controles foi a sacarose, com valores significantemente mais
altos nas raízes de populações da várzea. De uma maneira geral, as concentrações de
sacarose diminuíram em resposta ao alagamento, no entanto, a diminuição foi menor no
tratamento de alagamento no escuro. Estes resultados sugerem que a sacarose seja
acumulada pela planta para uso no metabolismo anaeróbico, uma vez que se sabe que as
plântulas da população da várzea apresentam melhor desempenho no desvio da via
metabólica em resposta à inundação (Ferreira, 2002). Esses resultados também reforçam a
hipótese de que H. sucuuba seja uma planta que apresenta estratégias preventivas ao
estresse causado pelas pressões ambientais sofridas nesse ambiente, principalmente o
alagamento por um longo período de tempo.
No caso das plântulas do tratamento controle, os resultados mostram um acúmulo
de reservas que podem ser rapidamente utilizadas em resposta ao alagamento. Por outro
lado, quando em alagamento no escuro, típico das condições de várzea, há uma utilização
lenta dessas reservas, evidenciada pela paralisação do crescimento, como observado no
Capítulo II, com as plântulas sob submersão total.
5. CONCLUSÕES
Himatanthus sucuuba mostrou diferenças nas reservas presentes em suas sementes
entre as populações da várzea e da terra firme, notadamente quando uma análise mais
detalhada dessas reservas foi realizada. Essas diferenças podem ser explicadas diante dos
condicionantes impostos pela periodicidade e recorrência do pulso de inundação anual ao
qual as plantas desses ambientes estão sujeitas. Embora classificada como uma mesma
espécie, independente de ocorrer na várzea ou na terra firme, as diferenças se manifestam
também na análise das reservas presentes nas raízes das plântulas, parecendo ser de grande
importância ecológica para assegurar o sucesso no estabelecimento das mesmas em cada
um dos ambientes.
Enquanto nas plantas da terra firme o processo germinativo é mais lento e
energeticamente custoso, nas populações da várzea, o alongamento das plantas parece ser o
63
fator determinante para o sucesso na colonização. Estas evidências associadas a trabalhos
anteriores com a bioquímica da espécie (Ferreira, 2002), como também os resultados dos
capítulos I e III do presente estudo, suportam a hipótese de que as diferenças entre as
populações dos dois ambientes são suficientes para segregá-las no que diz respeito aos seus
mecanismos de estabelecimento.
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68
CAPÍTULO IV
Análise filogenética de Himatanthus sucuuba,
baseada na seqüência de nucleotídeos da
região ITS-5.8S rDNA
69
1. INTRODUÇÃO
Himatanthus sucuuba Wood., ou sucuúba, é uma Apocynaceae arbórea que na
Amazônia Central coloniza naturalmente dois dos mais importantes ecossistemas da
região, a terra firme e a várzea. Esses ecossistemas apresentam características ambientais
peculiares e contrastantes. Enquanto as áreas de terra firme são caracterizadas por não
apresentarem suas planícies inundadas por águas aluviais (Veloso et al., 1991), as áreas de
várzea são submetidas a uma inundação anual que dura cerca de seis meses, seguido de um
período de seca quando as águas retornam ao leito normal dos rios. Durante a cheia, a
coluna de água pode chegar a atingir a altura média de 10 m (Junk, 1989), inundando
grandes áreas de florestas marginais.
Se por um lado na terra firme as condições climáticas e hidrológicas são
praticamente constantes, sendo a pluviosidade o principal fator influenciando a
fenodinâmica das espécies nesses ambientes (Araújo, 1970; Alencar et al., 1979; Reich &
Bordechert,1984), na várzea as plantas precisam se adaptar periodicamente a essa
alternância entre uma fase aquática e outra terrestre (Piedade et al., 2000), que muitas
vezes envolve interações entre a morfologia, anatomia e fisiologia das mesmas, como
estratégias de sobrevivência a tais condições (Kozlowski, 1997; Piedade et al.,2001;
Parolin, 2001; Ferreira, 2002). As respostas das plantas ao alagamento variam ainda com a
espécie, o genótipo, a idade do indivíduo e o tempo de exposição ao alagamento (Drew &
Lynch, 1980; Kozlowski, 1984; Kozlowski, 1997). De forma que, como padrão geral, o
estresse por inundação reduz a diversidade de espécies na várzea (Junk, 1993).
A diferença entre os dois ecossistemas se reflete na composição florística, uma vez
que é a similaridade entre a flora da várzea e da terra firme na Amazônia Central são
estimadas em no máximo 30% (Piedade et al., 2000; Wittmann et al., 2006). Porém, a
existência de algumas espécies arbóreas ocorrendo naturalmente nos dois ambientes é
peculiar e deve ser investigada. Caso essa distribuição reflita, de fato, uma grande
plasticidade fenotípica das espécies, que lhes confere a capacidade de se adaptarem
temporariamente ao estresse de inundação, esses estudos tornam-se relevantes para o
entendimento dos limites de tolerância das plantas a fatores ambientais, como a seca e o
alagamento. Estudos dessa natureza são importantes por fornecer subsídios para o manejo
e recolonização desses ecossistemas. Por outro lado, embora estejam sendo classificadas
como a mesma espécie, as populações da terra firme podem não tolerar ou apresentar
respostas adaptativas à inundação, diferentes daquelas das populações da várzea, sugerindo
algum grau de separação genética entre elas (Ferreira et al., 2005).
70
No caso de sucuúba, Ferreira (2002) e Ferreira & Piedade (2004) verificaram que
plântulas dessa espécie, produzidas de sementes de populações que habitam a várzea ou a
terra firme, quando submetidas a um período prolongado de submersão total, apresentam
respostas fisiológicas distintas, relacionadas ao ambiente de origem das sementes. Para
essa espécie, diferenças na tolerância à inundação entre as duas populações foram
verificadas ainda durante a germinação, onde apenas aquelas sementes oriundas das
populações da várzea conseguiram produzir plântulas sob condições de submersão
(Ferreira et al., 2005).
Esses estudos levaram à formulação da hipótese de que o rio poderia estar atuando
como uma barreira geográfica promovendo o isolamento das populações que sofrem
inundações prolongadas e aquelas da mesma espécie que habitam as planícies não
alagadas. Neste caso o “pulso de inundação” (Junk, 1989) e as grandes dimensões dos rios
amazônicos que banham as florestas de várzea, poderiam servir como barreiras naturais de
fluxo gênico entre os dois ambientes (várzea e terra firme). Essa confirmação revelaria a
Amazônia como um ecossistema ainda mais diverso do que percebemos atualmente.
Para testar essa hipótese, optou-se pela realização de análises moleculares de
indivíduos de sucuúba, pertencentes a populações que ocorrem nos dois ecossistemas ao
longo da calha do principal rio da Bacia Amazônica, o Rio Solimões/Amazonas, em
regiões eqüidistantes geograficamente, afim de verificar se o padrão encontrado se
repetiria. Para tanto, foi utilizada a técnica baseada na análise de polimorfismo do rDNA,
que é o DNA que codifica os genes RNA ribossomais e a região não codificadora IGS
(Intergenic spacers) ou ITS (internal transcribed spacer). Atualmente o marcador rDNA
tem sido amplamente utilizado na identificação e diferenciação de espécies (Förster et al.,
2000; Rosa et al., 2003; Podoplelova & Ryzhakov, 2005). O rDNA possui uma região
codificadora para os genes rRNA 18S, 5.8S e 28S, e dois espaçadores internos (ITS 1 e
ITS 2) que separam essas regiões. As regiões rDNA 18S e 28S são muito conservadas e
podem ser utilizadas para diferenciação em nível de gênero e espécies (Rosa et al., 2003;
Jansen et al., 2006), enquanto que as regiões espaçadores de ITS acumulam mais
variabilidade e são utilizadas de forma eficiente na diferenciação de espécies ou entre
linhagens da mesma espécie por serem transcritos mas não codificadores (Andreasen et al.,
1999; Foster et al., 2000; Podoplelova & Ryzhakov, 2005). Esse trabalho objetivou
determinar as similaridades entre as populações de sucuúba que habitam as áreas de várzea
e de terra firme, ao longo da calha do rio Amazonas, por meio de análise de topologias das
árvores filogenéticas. Essas árvores foram construídas a partir de seqüências de
nucleotídeos da região de ITS das populações estudadas.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo
As coletas foram realizadas em populações de sucuúba que colonizam as áreas
localizadas ao longo da calha do rio Solimões, em ecossistemas de várzea e de terra firme
(Licença do IBAMA nº 02005.000906/04-34) dos municípios de Benjamin Constant
(4°38’ S, 70°0,3’ W), Tefé (3º35’ S, 64º71’ W) e Manaus (3º10’ S, 60º02’ W), no
Amazonas (Fig. 1).
Manaus
Tefé
Benjamin
Constant
Fonte: Embrapa/2000
Figura 1. Mapa do Estado do Amazonas, com a identificação das regiões dos municípios
de Benjamin Constant, Tefé e Manaus, localizados as margens do Rio Solimões.
Em cada uma das três regiões (Benjamin Constant, Tefé e Manaus) foram realizadas
coletas em dois ambientes (ecossistema de várzea e de terra firme), sendo duas populações
por ambiente, totalizando 12 sítios de coleta. Em Benjamin Constant (parte da região
denominada Alto Solimões), as coletas ocorreram nas populações de sucuúba nas margens
do Rio Javari (afluente do Rio Solimões) e em áreas de terra firme adjacentes à sede do
município. Em Tefé (Médio Solimões) as coletas foram nas várzeas da Reserva de
Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, e em terra firme da Reserva de Desenvolvimento
Sustentável Amanã; e em Manaus, nas várzeas próximas a Ilha de Marchantaria (Baixo
71
Solimões), situada às margens do Rio Solimões, e nas florestas de terra firme ao longo da
AM 010, que liga Manaus ao Município de Itacoatiara, AM.
Inicialmente, dez indivíduos foram marcados de forma aleatória, na várzea e na terra
firme, e serviram de matrizes para a coleta de material vegetal utilizado nas análises
moleculares. Esses indivíduos estavam distribuídos em duas populações diferentes em cada
ambiente (Tab. 1), a fim de evitar a coleta em progênies de um mesmo parental. O material
vegetal constou de folhas e amostras de tecido vascular (câmbio). As folhas, depois de
coletadas, foram secadas em estufa de campo a 40 ºC e transportadas em exsicatas, para o
laboratório do INPA em Manaus. Enquanto que as amostras de câmbio foram obtidas com
auxílio de um coletor, medindo 1 cm de raio (Fig. 2 A/B), e o armazenamento foi feito em
sílica gel, cerca de 10g por grama de tecido fresco.
B
A
Figura 2. A) Coleta de material vegetal das plantas de sucuúba, para uso nas análises
moleculares. B) a seta indica a região do câmbio (camada esbranquiçada, mais superficial)
retirada e armazenada em sílica gel. I = raio de 1cm.
A partir do INPA as amostras foram transportadas para o Laboratório de
Melhoramento de Plantas do Centro de Energia Nuclear na Agricultura – CENA da
Universidade de São Paulo, em Piracicaba, São Paulo, para a realização das análises
moleculares.
A identificação das amostras (Tab. 1) foi feita com base na combinação entre o
ambiente de origem da planta: várzea (VZ) ou terra firme (TF); área geográfica: Benjamin
Constant (BC), Tefé (TF) e Manaus (MN); e seqüência da amostra (população 1 ou 2).
72
73
Tabela 1. Identificação das amostras de sucuúba coletadas de populações que colonizam
áreas ao longo da Bacia Amazônica.
Ambiente Município População Identificação
Terra firme (TF) Benjamin Constant (BC) 1 e 2 TFBC1 e TFBC2
Várzea (VZ) Benjamin Constant (BC) 1 e 2 VZBC1 e VZBC2
Terra firme (TF) Tefé (TF) 1 e 2 TFTF1 e TFTF2
Várzea (VZ) Tefé (TF) 1 e 2 VZTF1 e VZTF2
Terra firme (TF) Manaus (MN) 1 e 2 TFMN1 e TFMN2
Várzea (VZ) Manaus (MN) 1 e 2 VZMN1 e VZMN2
2.2. Análises moleculares
Inicialmente foram realizadas diversas tentativas de adequação do método de extração
do DNA genômico, descrito abaixo, a partir de amostras da folha de sucuúba. No entanto,
a presença de grande quantidade de compostos fenólicos impossibilitou sua análise.
Apenas da extração utilizando o tecido do câmbio foi possível obter um DNA de boa
qualidade para uso neste estudo.
2.2.1. Extração de DNA genômico total
Para extração do DNA foi utilizado como base o protocolo de CTAB (brometo de
hexadeciltetrametilamônio), modificado por Doyle & Doyle (l990). Amostras de 50 mg de
material vegetal (câmbio) foram maceradas em nitrogênio líquido e a extração foi realizada
em tampão 2% CTAB, 1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 20 mM EDTA
(ethilenodiamonotetraacetato) pH 8,0, 1% PVP (polivinilpirrolidona) MW 10,000. Foi
incorporado a uma alíquota do tampão 5% β-mercaptoethanol, a fim de evitar a oxidação.
Para ajudar na remoção dos compostos fenólicos foi adicionado fenol:clorofórmio:álcool
isoamíl (25:24:1). O DNA foi ressuspendido em tampão TE (Tris-HCl pH 8,0, Na
2
EDTA
pH 8.0) contendo ribonuclease [RNAse] (10 µg.ml
-l
). A qualidade do DNA foi analisada
em gel eletroforese 1% agarose TAE (Tris, Acetato, EDTA), corado com Sybr green,
visualizado sob luz ultravioleta no transiluminador. A quantificação foi realizada por meio
de fluorômetro. Para o uso nas análises moleculares, as amostras foram diluídas na
concentração de 1ng/μL e estocadas a - 20 °C.
74
2.2.2. Amplificação via reação da polimerase em cadeia (PCR)
O DNA genômico foi usado na amplificação de região de ITS (Internal
Transcribed Spacer) por reação da polimerase em cadeia (PCR), com primers universais
de ITS1-18S (5’ CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG 3’) e ITS4 (5’ TCC TCC GCT TAT
TGA TAT GC 3’), que amplifica ITS1 + 5.8S + ITS2 e possui um tamanho aproximado de
700 pb (pares de base) (White et al., 1990). Cada 25 μL da reação de amplificação
continha 5 ng de DNA genômico, tampão da enzima (50 mM KCl; 0,1% Triton X-100; 10
mM Tris-HCl pH 8.0), 2 mM MgCl
2
, 0,2 mM dNTPs (de cada um dATP, dGTP, dCTP, e
TTP), 0,2 μm de cada primer ITS1 e ITS4, 1 unidade de Taq polymerase (Invitrogen). Para
a amplificação foi usado um programa de termociclador de 3 min a 94
o
C (1x para
desnaturar); 30 s a 94
o
C; 60 s a 58
o
C, adicionando 60 s a 72
o
C por ciclo, para extensão,
de um total de 35 ciclos, e uma extensão final de 7 min 72
o
C. Uma alíquota do produto da
amplificação foi separada para visualização em gel 1% agarose, corado com Sybr green,
usando λ HindIII como marcador, o restante foi mantido a – 20
o
C para posterior clonagem
dos fragmentos.
2.2.3. Clonagem e seqüenciamento das regiões de ITS
Ligação: inicialmente, foi feita a ligação do fragmento (produto da amplificação por PCR
das regiões de ITS) ao vetor pGEM-T Easy (Promega), por adição do tampão e da enzima
T4 DNA ligase (Invitrogen). A reação de ligação foi incubada por toda a noite a 4
o
C. Após
esse período, a reação de ligação foi usada para transformação de células de bactérias.
Transformação de bactérias e clonagem dos fragmentos: células competentes de
Escherichia coli DH10B (Invitrogen), previamente preparadas, foram transformadas por
eletroporação. A reação de eletroporação (40 μL de células de DH10B, 1 μL de reação de
ligação) foi colocada em cubeta 0.1 cm e em seguida, submetida a um pulso elétrico. Após
o tratamento, as células foram colocadas em meio SOC (Sambrook & Russell, 2001) por
uma hora a 37
o
C. Destas, 100 μL da cultura foi plaqueada em meio LB sólido (bacto
triptona, extrato de levedura, NaCl) contendo 100 mg/mL de Ampicilina, solução de IPTG
(Isopropiltio-β-D-galactosídeo) 100 mM e X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactosidase). As placas foram incubadas, invertidas, por toda a noite a 37
o
C. A
identificação das colônias contendo os plasmídeos recombinantes foi realizada por
“screening” azul/branco. A coloração branca das colônias indicava que as bactérias
continham o inserto clonado. A cultura de bactérias transformadas foi feita inoculando as
75
colônias brancas em 5 mL de meio LB líquido com 100 mg/mL de Ampicilina e incubada
por toda a noite a 37
o
C, sob agitação.
Purificação e quantificação: para o isolamento e a purificação de DNA de plasmídeos das
células transformadas, foi utilizado como base o método de lise alcalina, proposto
originalmente por Birnboim & Doly (1979). O DNA foi isolado de 3 mL da cultura de
bactérias, utilizando o procedimento de mini-preparação de DNA de plasmídeos usando
lise alcalina e ressuspendido em 50 μL de TE, contendo 50 μg/mL de RNAse. A presença
do inserto clonado, antes do seqüenciamento, foi verificada por meio de PCR usando os
primes universais T7 e SP6 (Invitrogen). O produto da amplificação foi observado em gel
1% agarose e quantificado por comparação usando padrão Lambda HindIII. Os produtos
purificados e quantificados foram seqüenciados em um analisador automático de DNA 377
ABI (Applied Biosystems).
2.2.4. Análise das seqüências
Após o seqüenciamento, foi feita análise do cromatogramas nos programas Phred-
Phrap-Crossmatch-Consed (Ewing & Green, 1998; Ewing et al., 1998) e as seqüências
resultantes foram submetidas à busca por similaridade entre aquelas disponíveis na base de
dados do GenBank <http://www.ncbi.nih.gov>, usando BLASTn (Altschul et al., 1997).
As seqüências foram traduzidas conceitualmente nos aminoácidos usando EXPASY
Translate tool <http://www.expasy.ch/tools/dna.html>. A identificação da substituição do
aminoácido funcional foi conduzido usando PSI-BLAST (Altschul et al., 1997). As
seqüências do nucleotídeo foram alinhadas usando ClustalX 1.8 (Thompson et al., 1997) e
visualizadas. As análises de Parcimônia das seqüências de nucleotídeos e dos aminoácidos
foram conduzidas usando o software PAUP 4.0b10 (Swofford, 1998).
3. RESULTADOS
3.1. Eletroforese e seqüenciamento das regiões de ITS
A primeira análise constou de apenas uma das duas populações amostradas em cada
ambiente, várzea e terra firme, nas três regiões de coleta, num total de seis populações. Os
produtos purificados e quantificados foram visualizados em gel de eletroforese 1% agarose
(Fig. 3), que mostrou as bandas com valores aproximados de 700 pb. Entretanto, foi
detectada, visualmente, diferença entre os produtos amplificados da região de ITS nas
populações analisadas.
MM 1 2 3 4 5 6
≅ 700pb
Figura 3. Gel de eletroforese 1% agarose. As bandas visualizadas são: 1 = TFBC1; 2 =
VZBC1; 3 = TFTF1; 4 = VZTF1; 5 = TFMN1 e 6 = VZMN1. MM = marcador molecular -
foi usado λ-HindIII.
Após a análise dos resultados preliminares, um novo PCR foi realizado com
indivíduos diferentes para obter a confirmação da tendência. Esse material foi purificado,
quantificado e reunido ao anterior para ser seqüenciado. Os dados das seqüências obtidas
encontram-se no Anexo 1.
As regiões de ITS foram analisadas nessas seqüências com o objetivo de verificar
de forma clara, a existência ou não de uma diferenciação entre as populações de sucuúba
que habitam os ecossistemas de várzea ou de terra firme na Amazônia. Ao utilizar os
primers ITS-18S e o ITS4 obteve-se o fragmento das regiões englobando ITS1+5.8S+IT2
(Fig. 4) de todas as populações amostradas.
ITS-18S
76
Figura 4. Esquema da região de ITS (ITS1 e ITS2) do gene de ribossomo (rDNA). Os
genes são representados pelos retângulos, com os espaços intergênicos entre eles. A seta
indica a direção dos primers utilizados para amplificação da região intergênica.
Os fragmentos amplificados variaram de 592 a 754 pb (Tab. 2). A confirmação da
identidade das seqüências de nucleotídeos dos fragmentos clonados foi feita por meio da
comparação com seqüências de ITS1-18S e ITS2 do rDNA de outras espécies, inclusive de
indivíduos da família Apocynaceae, disponíveis no GenBank (Anexo 2).
18S 28S
5.8S
ITS 1 ITS 2
ITS-4
77
Tabela 2. Tamanho dos fragmentos amplificados via PCR utilizando os primers ITS-18S e
ITS-4, nas populações de terra firme (TF) e várzea (VZ) das três regiões geográficas
(municípios de Benjamin Constant, Tefé e Manaus).
Localização População Tamanho do fragmento
(em pb)
TF – Benjamin Constant 1
2
690
691
VZ – Benjamin Constant 1
2
692
690
TF – Tefé 1
2
690
692
VZ – Tefé 1
2
592
597
TF – Manaus 1
2
754
754
VZ – Manaus 1
2
677
687
3.2. Análise de similaridade entre as seqüências
A análise filogenética usando PAUP (Anexo 3) gerou, através do método do
agrupamento do vizinho mais próximo “Neighbor-joining” (Saitou & Nei, 1987), uma
árvore filogenética entre as 12 seqüências (Fig. 5). A árvore consensual resultante dessa
análise teve o suporte de seus clados avaliados por bootstrap (Felsenstein, 1995) e foi
visualizada no programa Treeview (Page, 1996). A árvore consenso foi gerada no
programa MEGA (Kumar et al., 2004). O método de bootstrap faz uma reamostragem
aleatória dos caracteres, repetindo-a “n” vezes, e computa a freqüência em que os nós
aparecem nos resultados combinados. Para este estudo foram feitas 1000 repetições.
A análise da topologia da árvore (Fig. 5) mostra que existe diferença detectada em
nível genético entre as populações de sucuúba que habitam os ambientes de terra firme e
de várzea, em todas as regiões de coleta. Essa diferença varia com a área geográfica, sendo
menor nos extremos da bacia (região de Benjamin Constant).
Ao analisar a Fig. 5 e a Tabela 2, verifica-se que apesar de algumas das populações
que habitam a terra firme ou aquelas da várzea, diferirem entre si no tamanho da seqüência
de nucleotídeos, essa diferença não é suficiente para separá-las, uma vez que os ramos
agrupam consistentemente com indivíduos da mesma população (bootstrap 100%).
As populações da terra firme de Manaus (TFMN1, TFMN2), várzea de Manaus
(VZMN1, VZMN2) e várzea de Tefé (VZTF1, VZTF2) foram as que apresentaram valores
mais elevados de bootstrap (100%), quando a análise considerou cada região amostrada.
Figura 5. Árvore filogenética mostrando a relação entre as populações de sucuúba da terra
firme e da várzea, nas três regiões geográficas amostradas: Benjamin Constant (VZBC e
TFBC); Tefé (VZTF e TFTF) e Manaus (VZMN e TFMN). Os números nas ramificações
representam o percentual de 1000 bootstrap.
As populações de sucuúba de Benjamin Constant das áreas de terra firme (TFBC1,
TFBC2), áreas de várzea (VZBC1, VZBC2) e as populações de terra firme de Tefé
(TFTF1, TFTF2), tiveram seus valores de bootstrap variando em 60, 72 e 77%,
respectivamente, quando da análise por região. Entretanto, essas seis populações
agruparam fortemente (bootstrap de 100%), em relação às demais (várzea de Tefé, terra
firme e várzea de Manaus). Populações da várzea de Benjamin Constant (VZBC1,
VZBC2) foram as únicas que apresentaram os ramos em nós diferentes, entretanto essas
populações agruparam robustamente na análise da árvore consenso (Fig. 6).
78
T
F
B
C
1
T
F
B
C
2
V
Z
B
C2
T
F
T
F
1
T
F
T
F
2
V
Z
B
C1
V
Z
T
F
1
V
Z
T
F
2
T
F
M
N1
T
F
M
N
2
V
Z
M
N
1
V
Z
MN
2
0.1
Figura 6. Fenograma resultante do alinhamento das seqüências de ITS1-58.S – ITS2 rDNA
das populações de sucuúba, ao longo da calha do rio Solimões.
A árvore consenso mostrou claramente a separação de três ramos (Fig. 6), com as
populações da várzea e terra firme de Benjamin Constant agrupadas com a terra firme de
Tefé. Estas, no entanto, separaram-se da várzea de Tefé, que ficou isolada, separada
também da várzea e da terra firme de Manaus, que por sua vez formaram um grupo distinto
das demais.
4. DISCUSSÃO
Os valores altos de bootstrap deixam evidente a diferença entre as populações de H.
sucuuba da terra firme e da várzea nas três regiões geográficas amostradas (Benjamin
Constant, Tefé e Manaus), uma vez que em nenhuma das subamostragens realizadas essas
populações apresentaram forte relação umas com as outras. Esses resultados, inicialmente,
parecem corroborar o que foi proposto por Ferreira (2002), que nas áreas de várzea da
Amazônia Central, as características ambientais extremas de inundação e/ou as grandes
dimensões dos rios podem induzir a especiação em árvores.
Estudos germinativos e fisiológicos realizados previamente com H. sucuuba
(Ferreira & Piedade, 2003; Ferreira et al., 2005), que utilizaram sementes de populações
naturais da várzea e da terra firme de áreas adjacentes a Manaus, mostraram respostas
distintas ao alagamento para as duas populações. Ao acompanhar o ciclo de vida da
79
80
espécie, desde a germinação até o estabelecimento das plântulas (Ferreira, 2002), foi
observado que, quando submetidas experimentalmente a um período prolongado de 120
dias de submersão total as plântulas da terra firme não sobreviveram, ao contrário daquelas
da várzea que apresentaram a taxa de sobrevivência elevada (70%). Naquele estudo, as
respostas quanto às taxas de germinação e alterações do metabolismo anaeróbico
mostraram relações com os ambientes de origem das sementes. Da mesma forma, no
presente estudo, verifica-se que na região de Manaus a seqüência do gene ITS1-58.S –
ITS2 rDNA da população de terra firme possui cerca de 70 pb a mais que as de várzea, e
que estas estão fortemente separadas (bootstrap de 100%). Essa tendência foi observada
entre os dois ecossistemas, nas três áreas, ao longo da bacia, o que reforça a idéia de que o
rio pode atuar como barreira reprodutiva, que leva à divergência das populações entre os
ambientes.
Por outro lado, a análise consenso separou as populações em três agrupamentos
diferentes, seguindo um padrão peculiar. As populações de terra firme e várzea de
Benjamin Constant terem, conjuntamente, se agrupado com a população da terra firme de
Tefé, mostra a existência de uma maior similaridade entre elas, indicando uma maior
diversidade nessa região, possivelmente resultante de um maior fluxo gênico entre essas
populações, decorrente da menor distância entre as margens do rio e, conseqüentemente,
maior contigüidade dos ambientes. Estes resultados são compatíveis com os estudos de
Campbell et al. (1986) e Wittmann et al. (2006) que mostram que na Amazônia os
extremos da bacia, especialmente nas proximidades dos Andes, são mais diversos e a
similaridade entre a flora dos dois sistemas é de aproximadamente 45%.
As mais robustas teorias sobre a evolução da flora amazônica na análise de Haffer
& Prance (2002) suportam que, tanto no Pleistoceno quanto em períodos geológicos
anteriores a ele, mudanças em larga escala na vegetação da Amazônia ocorreram devido a
mudanças climáticas (precipitação, temperatura, gás carbônico) como também de variações
no nível do mar e rios, levando à expansão de vegetações florestais e não-florestais
adaptadas à seca. Sob tais circunstâncias, as vegetações típicas de florestas úmidas ficaram
restritas a áreas com precipitação mais elevada ou maior disponibilidade de água, nos
períodos mais secos, ou maiores elevações, nos períodos inundados, os refúgios (Prance,
1985). Essas ilhas de vegetação florestal foram intercaladas por vários tipos de florestas
secas e outros tipos intermediários de vegetações que atuaram como barreiras. Nas ilhas
vegetadas, processos de extinção e especiação foram intensos.
A análise dos resultados da árvore consenso à luz dessas teorias sobre a evolução
geológica e da vegetação da Amazônia, inclusive suas várzeas, parece suportar a idéia de
que, após o último evento de recolonização da região a partir dos refúgios (Figura 7),
espécies como H. sucuuba se estabeleceram nas áreas alagáveis a partir das áreas de terra
firme adjacentes.
Essa suposição torna-se mais plausível quando são comparadas as análises da
região de Benjamin Constant e de Manaus, uma vez que estas correspondem a áreas
refúgios distintos (Figura 7). Os resultados mostram que em cada uma dessas regiões a
relação entre as populações de terra firme e de várzea foi consistente (bootstrap de 100%).
Contudo, não se verificou qualquer relação entre as duas áreas geográficas. Uma vez que
não há relação entre as populações de Benjamin Constant e Manaus, pode-se sugerir que a
colonização em cada uma dessas localidades nas áreas alagáveis é mais dependente da
terra firme próxima.
Figura 7. Sobreposição de padrões de endemismo em plantas, borboletas e pássaros do
Neotrópico, identificadas como “refúgios” [Retirado de Haffer & Prance (2002)].
Por outro lado, os resultados deste estudo diferem do que recentemente tem sido
encontrado para animais (Farias et al., 2004; Cantanhede et al., 2005) onde se observa um
contínuo de similaridade entre os organismos da várzea ao longo da bacia do Solimões.
Isto certamente reflete os processos diferenciados de colonização entre animais e plantas,
provavelmente devido à motilidade dos primeiros vesus o caráter séssil dos últimos.
Contudo, dado que o fluxo gênico entre as plantas depende grandemente de sua biologia e
dos sistemas reprodutivos, que envolvem polinizadores e dispersores de sementes e seus
81
82
movimentos e eficiência, um estudo detalhado considerando esses aspectos para H.
sucuuba é fundamental.
Confirmando essa necessidade, observou-se que na região de Tefé as populações da
várzea encontram-se isoladas das de terra firme e demais populações estudadas (Manaus e
Benjamin Constant). Se aplicarmos o conceito postulado acima de que as populações da
várzea derivaram daquelas das terras firmes adjacentes, esperar-se-ia que na análise
consenso essa população agrupasse de forma mais consistente com a terra firme de Tefé ou
que ambas se mantivessem próximas a Benjamin Constant, o que não ocorreu. Isto pode
indicar que essas populações evoluíram de forma independente, a partir de alguma área de
refúgio mais ao norte da bacia (Prance, 1985). Contudo, isso pode apenas estar refletindo o
fato de que as populações de terra firme que colonizaram as várzeas dessa região provêm
de sítios que não foram amostrados, merecedores de novas coletas e análises posteriores a
fim de entender a história filogenética das populações de H. sucuuba nesses ambientes.
5. CONCLUSÃO
Populações de H. sucuuba que habitam as áreas de várzea são diferentes em sua
constituição genética das populações dessa espécie que habitam a terra firme. Entretanto,
as diferenças encontradas para as espécies mostram padrões complexos, onde somente a
barreira do rio e o pulso de inundação, como também a colonização da várzea a partir das
populações das terras firmes adjacentes, não conseguem explicar a complexidade genética
evidenciada para a espécie no presente trabalho. Estudos dos sistemas reprodutivos e
coletas adicionais são necessários para corroborar as tendências e cenários discutidos.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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85
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Plantas ocorrendo em ambientes sujeitos a inundações periódicas anuais são
reconhecidamente detentoras de adaptações para sobreviver períodos de redução extrema
ou mesmo ausência de oxigênio, em todas as fases de seu ciclo de vida. Assim, seria de se
esperar que espécies que colonizam os ambientes não inundados da terra firme não
ocorressem nos ambientes inundados, por esses exigirem das plantas tais tipos de
adaptação. Entretanto, algumas espécies ocorrem naturalmente tanto nas terras firmes,
quanto nas várzeas, ao longo de toda a bacia do rio Solimões/Amazonas.
O fato de haver espécies que colonizam áreas sob uma grande escala de condições
ambientais, especialmente aquelas consideradas extremas à sobrevivência de uma planta,
desperta a atenção e a curiosidade para tentarmos entender quais são e como a planta
utiliza os mecanismos adaptativos de forma a garantir o sucesso de sua colonização nos
diversos ecossistemas. Esses foram os motivos que levaram à elaboração desse estudo,
cujos objetivos derivam dos questionamentos levantados durante a elaboração da
dissertação de mestrado da autora (Ferreira, 2002).
A escolha da espécie ocorreu após um trabalho de revisão de literatura, que utilizou
listas de espécies em inventários realizados nas áreas de várzea e terra firme da Amazônia
e em coleções de herbário, de forma a identificar plantas que ocorriam nos dois
ecossistemas. Himatanthus sucuuba foi eleita por ser encontrada em áreas não perturbadas
e, portanto, estar colonizando naturalmente os sítios de coleta na várzea e na terra firme
nas proximidades de Manaus. Os primeiros estudos (Ferreira, 2002), analisaram a
germinação em diferentes substratos e o crescimento de plântulas em situações que
simularam as condições de campo (solo alagado e não-alagado). Os resultados revelaram
estratégias distintas de tolerância às condições ambientais existentes para cada população
(Fig. 1), relacionadas, em grande parte, ao ambiente de ocorrência natural das populações
analisadas. As plântulas da população da terra firme não sobreviveram ao prolongado
período de alagamento, ao contrário daquelas da população da várzea.
No presente trabalho, buscou-se novas evidências baseadas em caracteres
morfológicos, biométricos, anatômicos e metabólicos, para corroborar, ou não, as
tendências e diferenças anteriormente evidenciadas, visando responder a seguinte questão:
- Quais os mecanismos exibidos pelas populações da várzea que propiciam a sobrevivência
de suas plântulas por longos períodos (superiores a 5 meses) sob uma coluna de água
86
elevada (até 8 metros) em condições de total ausência de luz, de forma a garantir a
perenização da espécie nesse ecossistema?
As respostas para esta questão começam a se configurar já no capítulo II deste
trabalho. As plântulas apresentam estratégias adaptativas distintas para sobreviver aos
diferentes níveis de alagamento ao qual são expostas. Alterações em sua morfoanatomia,
como a manutenção das folhas com redução da área foliar, formação de raízes adventícias,
lenticelas e aerênquima nas raízes, são verificadas quando o alagamento acontece apenas
nas raízes e parte inferior do caule. Porém, quando ocorre a submersão total da plântula,
verifica-se a abscisão das folhas, paralisação do crescimento e formação de aerênquima nas
raízes, sem qualquer outra alteração morfológica aparente.
Nos tratamentos controles e de submersão parcial, as plântulas das populações de
várzea apresentam crescimento rápido, com valores significativamente maiores do que os
exibidos pelas plântulas das populações de terra firme, confirmando os resultados já
obtidos no trabalho de Ferreira (2002). Entretanto, naquele experimento, os solos utilizados
para a produção das plântulas foram obtidos nas áreas de coleta de cada população (várzea
ou terra firme) e estes poderiam ter influência no crescimento em altura das diferentes
populações, enquanto que nesse trabalho ambas populações foram plantadas num único
tipo de solo, o de várzea, reconhecido como o mais rico em nutrientes. Contudo, os
resultados obtidos no presente estudo vêm mostrar que o crescimento da plântula não está
relacionado com o tipo de solo, mas às condições hídricas do ambiente, que levam à
depleção do oxigênio.
O capítulo III revelou que existe uma predisposição para que a planta cresça e se
estabeleça com maior rapidez no ambiente de várzea, verificado por meio dos tipos de
compostos armazenados como reservas nas sementes. As sementes da várzea apresentaram
uma quantidade maior de galactomanano no endosperma, um polissacarídeo de reserva de
parede celular que é degradado após a germinação da semente e cujos produtos da
degradação são utilizados pela plântula em crescimento.
A tolerância das plântulas à anoxia foi relacionada com a disponibilidade de
açúcares nos tecidos da raiz para uso no metabolismo anaeróbico. Os resultados mostraram
que, como padrão geral, as plântulas das populações de várzea foram as que exibiram os
maiores valores de concentração de açúcares solúveis, entre esses, a sacarose, que é o
açúcar que chega aos demais tecidos da planta, transportado como produto da fotossíntese
para ser prontamente utilizado ou armazenado. Nessas plântulas, concentrações elevadas
de sacarose foram encontradas nas raízes do tratamento controle, enquanto que
87
concentrações elevadas de glucose foram observadas nas raízes de plântulas alagadas. Uma
vez que a glucose é um dos açúcares utilizado como substrato para a via glicolítica, sua
maior concentração nas raízes das plântulas das populações da várzea pode estar indicando
a aceleração da glicólise devido à fermentação, o que explicaria os níveis elevados de
ADH nas raízes de H. sucuuba da várzea, medidos por Ferreira (2002).
O fluxograma a seguir (Fig. 1) destaca as principais características evidenciadas
para populações de H. sucuuba dos ecossistemas de várzea ou de terra firme, quando
submetidas experimentalmente a alterações nas condições hídricas similares àquelas
observadas naturalmente no ambiente de várzea.
↑ Germinação sob
alagamento*
Produz plântulas
sob alagamento *
88
Figura 1. Fluxograma com as principais características demonstradas pelas populações de
Himatanthus sucuuba, durante a fase de germinação e de estabelecimento de plântulas em
ambientes de várzea e de terra firme. * dados complementares de Ferreira (2002).
Sementes
22% açúcares
74% galactomanano
93% galactomanano
Não produz plânt
b ala
ulas
so
g
amento
↓ Germinação sob
alagamento *
*
↑ Concentração de
açúcares solúveis
nas raízes
Estabelecimento de plântulas
↓ Concentração de
açúcares solúveis nas
raízes
Crescimento lento
> Biomassa em
folhas e caule
Crescimento rápido
> Biomassa em
caule e raiz
Submersão parcial:
Plântulas sob alagamento
Aerênquima
lisígeno*
Aerênquima
esquizógeno*
Lenticelas;
Raízes adventícias;
↓ Área foliar
Morte das
raízes
↑ Concentração de
compostos para a
manutenção da
integridade da
membrana
Submersão total:
Paralisação do crescimento;
Abscisão das folhas
↓ Atividade da ADH*
↑ Atividade da ADH*
Legenda:
Comum às duas populações
População da várzea
↓ Sobrevivência
↑ Sobrevivência
População da terra firme
89
A análise detalhada dos Capítulos II e III, em conjunto com o que foi verificado por
Ferreira (2002) para a espécie, conforme sintetizado no fluxograma apresentado na figura
1, leva à formulação das seguintes questões: Porque plântulas de H. sucuuba, estabelecidas
em regiões de terra firme na Amazônia Central, demonstram não possuir as mesmas
características adaptativas ao alagamento verificadas para populações da mesma espécie
encontradas na várzea? Poderia a pressão ambiental, devido, especialmente, ao pulso de
inundação ao qual essas populações são expostas periodicamente, desencadear um
processo de especiação induzindo a separação entre as populações que colonizam os
ambientes de várzea e populações da terra firme?
O Capítulo IV foi elaborado com o propósito de responder essa pergunta. Nesse
capítulo, por meio de análises das seqüências de nucleotídeos da região de ITS (Internal
Transcribed Spacer) do gene ribossomal (rDNA), objetivou-se determinar as similaridades
entre as populações de sucuúba que habitam as áreas de várzea e de terra firme, não apenas
das cercanias de Manaus, como também daquelas ao longo da calha do rio Amazonas.
A análise filogenética permitiu constatar a nítida separação (bootstrap 100%) entre
as populações de H. sucuuba que habitam várzea, daquelas que habitam a terra firme, nas
proximidades de Manaus, sendo que esse padrão se repetiu para as populações amostradas
ao longo do Rio Solimões, para os dois ambientes, nos municípios de Benjamim Constant
e Tefé, áreas geográficas eqüidistantes no Estado do Amazonas. Entretanto, as diferenças
filogenéticas encontradas entre as populações da espécie mostram padrões complexos,
onde somente a barreira do rio e o pulso de inundação, como também a colonização da
várzea a partir das populações das terras firmes adjacentes, não conseguem explicar a
complexidade genética evidenciada no presente trabalho. Estudos dos sistemas
reprodutivos e coletas adicionais são necessários para corroborar as tendências e cenários
discutidos.
Este trabalho vem mostrar que, embora possa existir uma grande similaridade entre
as espécies nos diferentes ecossistemas amazônicos, a elaboração de planos de manejo e de
recuperação de áreas degradadas bem sucedidos, deve levar em consideração não apenas a
lista de espécies encontradas no local, mas o ambiente de coleta das matrizes. Diante das
dimensões e magnitude da região Amazônica, é natural que esta ainda seja pouco
conhecida, especialmente no que diz respeito a trabalhos que analisam diferenças em
níveis específicos, como os verificados nos estudos de fisiologia e genética desenvolvidos
no corpo do presente estudo. Este problema de abordagem e integração pode estar
contribuindo para que, em muitos casos, a diversidade da região esteja sendo subestimada.
90
Nesse sentido, estudos ecofisiológicos associados a observações botânicas de fenologia,
biologia floral e análises genéticas, são indicados para a elaboração de projetos que visem
o conhecimento da diversidade, de forma a subsidiar políticas públicas sólidas para traçar
estratégias de manutenção dos recursos genéticos da vegetação da região.
LITERATURA CITADA
Ferreira, C.S. 2002. Germinação e adaptações metabólicas e morfo-anatômicas em
plântulas de Himatanthus sucuuba (Spruce) Wood., de ambientes de várzea e terra
firme na Amazônia Central. Dissertação de Mestrado, Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia / Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas. 78p.
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