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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
EFEITO DA FOTOBIOMODULAÇÃO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA
PLACA DE CRESCIMENTO EM RATOS.
PAULO UMENO KOEKE
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
“EFEITO DA FOTOBIOMODULAÇÃO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA
PLACA DE CRESCIMENTO EM RATOS”
Aluno: Paulo Umeno Koeke
Orientador: Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto
São Carlos-SP
2008
Tese de Doutorado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação
em Fisioterapia, da Universidade
Federal de São Carlos, como parte
dos requisitos para obtenção do
título de Doutor em Fisioterapia.
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária/UFSCar
K778ef
Koeke, Paulo Umeno.
Efeito da fotobiomodulação laser de baixa intensidade na
placa de crescimento em ratos / Paulo Umeno Koeke. -- São
Carlos : UFSCar, 2008.
62 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,
2008.
1. Fisioterapia. 2. Laser de baixa potência. 3. Tecido
conjuntivo. 4. AFM. I. Título.
CDD: 615.82 (20
a
)
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA PARA DEFESA DE TESE DE
DOUTORADO DE PAULO UMENO KOEKE APRESENTADA AO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS, EM 09 DE MAIO DE
2008
BANCA EXAMINADORA:
,/,//'; ( /)
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Niyáídó1Anto~ci'}}arit);tto
í (UFSCar)
4?t~
Stela Márcia Mattiello G. Rosa
~/ (UFSCar)
/
~~
Mário Jefferson Quirino Louzada
I (UNESP)
~ (!fiL
Ana Claudia Muniz Renno
(Unifesp)
Raquel C~sgaroto
(USP-SP)
“Os desejos devem ser fortes e definidos”
George S. Clason
DEDICATÓRIA
Dedico à minha família, porque nela o amor é absoluto.
A vocês, todo meu amor.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Agradecimento especial ao meu orientador, Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto,
por ser a minha grande inspiração acadêmica.
Te admiro pelo seu carisma, humildade, competência, generosidade,
tranqüilidade, inteligência e, principalmente, pela compaixão que você têm com
os seus alunos.
Sou eternamente grato a você.
AGRADECIMENTOS
Aos amigos da Pós-Graduação: Patrícia Carrinho, Josi, Ana Cláudia Salate,
Charles Taciro, Wouber, Ana Cláudia Renno, Ana Paula Lirane, Karina,
Renata, Mariana, Flávio, Adriano, Paulo Bossini, Davilene, Olga, Vanessa e
Estela pela ajuda e companhia.
A todos os professores da Pós-Graduação pelo conhecimento transmitido.
Aos meus atuais e ex-alunos pelo reconhecimento.
A todos os professores com os quais eu já tive oportunidade de trabalhar junto.
Ao NEO e a Escola de Osteopatia de Madri por acreditar no meu potencial
científico.
Ao Dr. Rogério Querioz por demonstrar que é possível reinventar uma carreia
profissional.
Ao Pe. Afonso de Castro, Pe. Paulo Fernando Vendrame e Pe. Luigi Favero da
Missão Salesiana do Mato Grosso do Sul pelo incentivo educacional.
Ao Dr. Paulo de Tarso Camilo de Carvalho e Dr. Flávio Piloto Cirillo por ensinar
os primeiros passos científicos.
A vocês, todo o meu carinho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO 1....................................................10
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO 2....................................................11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...............................................12
LISTA DE SÍMBOLOS..........................................................................13
1. CONTEXTUALIZAÇÃO....................................................................14
1.1 Referências....................................................................................17
2. ARTIGO 1:
Alterações estruturais do colágeno da placa de
crescimento irradiado por laser de baixa intensidade: uma investigação
por microscopia de força atômica.........................................................21
2.1 Resumo..........................................................................................22
2.2 Abstract..........................................................................................23
2.3 Introdução......................................................................................24
2.4 Métodos..........................................................................................26
2.5 Resultados.....................................................................................29
2.6 Discussão......................................................................................29
2.7 Conclusão......................................................................................33
2.8 Referências....................................................................................34
3. ARTIGO 2:
Reação histológica na placa de crescimento de rato à
aplicação do laser de baixa intensidade...............................................37
3.1 Resumo..........................................................................................38
3.2 Abstract..........................................................................................39
3.3 Introdução......................................................................................40
3.4 Métodos..........................................................................................41
3.5 Resultados.....................................................................................43
3.6 Discussão......................................................................................49
3.7 Conclusão......................................................................................53
3.8 Referências....................................................................................54
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS..............................................................59
5. ANEXO..............................................................................................61
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO 1
Figura 1: Mensuração da largura do feixe de colágeno na zona de repouso
da placa de crescimento através do programa Image Processing and Data
Analysis – Version 2.0.0 – TermoMicroscopes. Em “1A” imagem da
topografia e em “1B” seção transversa do feixe de
colágeno.....................................................................................................26
Figura 2: Distribuições das medições da espessura dos feixes de
colágenos....................................................................................................27
Figura 3: Imagens topográficas da zona de
repouso.......................................................................................................30
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO 2
Figura 1: Fotomicrografia da placa de crescimento do GC. As setas
indicam em A – células da zona de repouso, B – células da zona
proliferativa, C – células da zona hipertrófica e D – trabéculas ósseas.
H&E, approx. 400X.....................................................................................43
Figura 2: Fotomicrografia da placa de crescimento do G5J. As setas
indicam em A – diversas células da primeira camada em processo de
divisão, B – grande quantidade de camadas de células, C – volume celular
aumentado na zona hipertrófica e D – grande quantidade de trabéculas
ósseas espessas. H&E, approx. 400X........................................................44
Figura 3: Fotomicrografia da placa de crescimento G60J. As setas indicam
em A – grande proliferação de células na zona de repouso, B – várias
colunas de células, C – volume aumentado das células hipertrófica e D –
inúmeras trabéculas ósseas espessas. H&E, approx.
400X............................................................................................................45
Figura 4: AFM à 12X12 µm da topografia da zona de repouso (coluna I)
contendo em A – GC, B – G5J , C – G60J; na coluna II, AFM da topografia
da região entre as zonas de proliferação e hipertrófica contendo os grupos
contendo em D – GC, E – G5J , F – G60J. A Seta branca indica os feixes
de colágeno e o (*) as formações em colméia de abelha...........................47
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µ
µµ
µm - micrômetro
AFM – microscopia de força atômica
CA – colméia de abelha
cm
2
– centímetro quadrado
et al. - colaboradores
H&E – hematoxilina/eosina
Hz - hertz
J/cmº - joules por centímetro quadrado
mm
2
– milímetro quadrado
mW – miliwatts
mW/cm
2
-
miliWatts por centímetro quadrado
LISTA DE SÍMBOLOS
% - porcentagem
λ
λλ
λ - lâmbda (comprimento de onda)
G5J - grupo 5 joules
G5JS - grupo 5 joules sistêmico
G60J - grupo 60 joules
G60JS - grupo 60 joules sistêmico
GC - grupo controle
p – valor ou nível de significância
14
CONTEXTUALIZAÇÃO
Para os profissionais de ciências da saúde que atuam na área da
ortopedia o conhecimento da formação, do crescimento e da maturação do
osso é de fundamental importância (IANNOTTI, 1990).
No osso longo há dois sítios de crescimento, localizados nas suas
extremidades (epífises), denominados placa de crescimento, os quais
proporcionam crescimento em comprimento para a metáfise e para a diáfise do
osso longo (IANNOTTI, 1990).
A placa de crescimento possui diversas denominações na literatura
como epífise de crescimento, placa epifisária, cartilagem de conjugação,
cartilagem de crescimento e disco epifisário (GOMES & VOLPON, 1991).
São três os fatores responsáveis pela coordenação do desenvolvimento
e do crescimento em comprimento pós-natal dos ossos longos: influências
ambientais, fatores de crescimento e controle genético (IANNOTTI, 1990).
De 15% a 20% das fraturas em criança ocorrem sobre a placa de
crescimento (SALTER & HARRIS, 1963).
Anatomicamente a placa de crescimento possui relação com outras
estruturas, como tendões, ligamentos e bolsas sinoviais, que constantemente
também sofrem lesões. Ainda não se sabe todas as conseqüências que alguns
recursos terapêuticos, utilizados para tratar essas lesões, podem causar se
atingir a placa de crescimento.
Se porventura, um tratamento que faça uso de um agente físico como
recurso terapêutico, atingir de forma direta ou indireta a placa de crescimento,
devemos considerar esta interação como um fator que poderá afetar o
15
desenvolvimento e o crescimento normal pós-natal. Afinal, alterações (aumento
da divisão celular, fechamento prematuro da placa de crescimento, aumento do
comprimento do osso longo, aumento do número de células nas zonas de
crescimento, diminuição na área da matriz extracelular, deformidade no formato
do osso) na placa de crescimento, quando estimuladas por fatores biofísicos,
como força mecânica (KENWRIGHT & GOODSHIP, 1989; GOODSHIP &
KENWRIGHT, 1985; ARKIN & KATZ, 1956; HAAS, 1948), ultra-som (PESSINA
& VOLPON, 1999; WILTINK et al., 1995; HECKMAN et al., 1994; PILLA et al.,
1990) e campos eletromagnéticos (LOHMANN, 2000; NEPOLA et al., 2000;
IANNACONE et al., 1988; BRIGHTON, 1985), já foram evidenciadas.
Várias são as reações que podem ocorrer na placa de crescimento
durante um tratamento. Exemplo disso ocorre com a utilização de
equipamentos de eletrotermofototerapia.
Um desses métodos, a biomodulação do laser de baixa intensidade, tem
demonstrado produzir sobre diferentes estruturas biológicas modificações
morfológicas (ZELIAK, 1985).
Diversos autores já postularam os efeitos de biomodulação da
laserterapia. A biomodulação diz respeito a irradiação de energia
eletromagnética pelo laser em materiais biológicos, podendo interferir nos
metabolismos celulares, tais como, estimulação ou inibição de atividades
bioquímicas, fisiológicas e proliferativas. A magnitude do efeito é referida sendo
dependente do comprimento de onda, das doses e da dose-intensidade do
laser (BECKERMAN et al., 1992; DE BIE et al., 1998).
16
Das diversas teorias sobre o efeito biomodulador do laser, é a lei de
Arndt-Schultz a base conceitual da fotobiomodulação (KITCHEN & BAZIN,
1998; BAXTER, 1997). Este princípio propõe a dose-dependência, ou seja, os
tecidos biológicos respondem à quantidade de energia absorvida de tal forma
que estímulos fracos excitam a atividade fisiológica, enquanto aqueles muito
fortes vão inibi-la. Porém, a teoria fotoquímica é a mais estudada, dando
explicações que evidenciam a sensibilidade das células à luz laser, referindo-se
a uma possível estimulação de fotorreceptores por energia eletromagnética,
realizando assim, a conversão de energia fotoquímica (KARU, 1998).
Portanto, achou-se necessário investigar a reação histológica da placa
de crescimento, frente ao efeito de biomodulação do laser e assim contribuir
para uma melhor compreensão do uso clínico já que existe um grande receio
na aplicação deste recurso em crianças e adolescentes, especialmente em
áreas próximas da placa de crescimento, por se temer possíveis alterações no
desenvolvimento desta estrutura.
17
REFERÊNCIAS
GOMES, L.S.M; VOLPON, J.B. (1991) Estudo Experimental do Processo de
Reparação das Lesões Epifisárias Tipo III e IV de Salter & Harris. Rev Bras.
Ortop, v. 26, p. 161.
IANNOTTI, J. P. (1990) Growth Plate Physiology and Pathology. Clin Orthop, v.
21, p. 1-17.
SALTER, R.B.; HARRIS, R. (1963) Injuries Involving the Epiphyseal Plate. J
Bone Joint Surg., v. 45 A.
KENWRIGHT, J.; GOODSHIP, A. E. (1989) Controlled Mechanical Stimulation
in the Treatment of Tibial Fratures. Clin Orthop, v. 241, p. 36-47.
GOODSHIP, A. E.; KENWRIGHT, J. (1985) The Influence of Induced
Micromovement upon the Healing of Experimental Tibial Fratures. J Bone Joints
Surg [Br], v. 67, p. 650-655.
ARKIN AM, KATZ JF. (1956) The Effects of Pressure on Epiphyseal Growth. J
Bone and Joint Surg, v.38-A, p. 1056-1076.
18
PESSINA, A. L & VOLPON, J. B. (1999) Aplicação de Ultra-Som Terapêutico
na Cartilagem de Crescimento do Coelho. Revista Brasileira de Ortopedia, v.
34, n. 5, p. 347-54.
WILTINK A, NIJWEIDE PT, OOSTERBAAN WA, HEKKENBERG RT,
HELDERS P JM. (1995) Effect of Therapeutic Ultrasound on Endochondral
Ossification. Ultrasound in Med & Biol, v. 21, p 121-127.
HECKMAN, J. D.; RYABY, J. P.; MCCABE, J.; FREY, J. J.; KILCOYNE, R. F.
(1994) Aceleration of Tibial Frature-Healing by Non-Invasive, Low Intensity
Pulsed Ultrasound. J Bone Joint Surg [Am], v. 76, p. 26-34.
PILLA AA, MOUNT MA, NASSER PR, KHAN SA. (1990) Non-Invasive Low
Intensity Pulsed Ultrasound Accelerates Bone Healing in the Rabbit. J Orthop
Trauma, v. 4, p. 246-253.
LOHMANN, C. H.; SCHWARTZ, Z.; LIU, Y.; GUERKOV, H.; DEAN, D. D.;
SIMON, B.; BOYAN, B. D. (2000) Pulsed electromagnetic field stimulation of
MG63 osteoblast-like cells affects differentiation and local factos production. J
Bone and Joint Surg, v. 18, p. 637-646.
19
NEPOLA, J. V.; FREDERICK, D. C.; BAKER, J. T.; ABBOTT, J, SIMON, B.
(2000) Effects of Pulsed Eletromagnetic Field on Bone Healing in a Rabbit
Tibial Osteotomy Model. J Orthop Trauma, v. 14, p. 93-100.
IANNACONE, W. M.; PIENKOWSKI, D.; POLLACK, S. R.; BRIGHTON, C. T.
(1988) Pulsimg eletromagnetic – field stimulation of the in vitro growth plate. J
Orthop Res, v. 6, n. 2, p. 239-247.
BRIGHTON, C. T.; HOZACK, W, J.; BRAGER, M. D.; WINDSOR, R. E.;
POLLACK, S. R.; VRESLOVIC, E. J.; KOTWICK, J.E. (1985) Frature Healing in
the Rabbit Fibula when Subjected ro Various Capacitively Coupled Eletrical
Fields. J Orthop Res, v. 3, p. 331-340.
ZELIAK, V. (1985) Choice of the optimal irradiation mode in the therapeutic use
of lowe-poser He-Ne laser. Urach. Delo, v. 8, p. 108-110.
BECKERMAN, H.; DE BIE, R.; BOUTER, L.; DE CUYPER, H.; OOSTENDORP,
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A criteria-based meta-analysis of randomized clinical trials. Physical Therapy, v.
72, p. 483-491.
20
DE BIE, R.A.; DE VET, H.; LENSSEN, T.F.; WILDENBERG, F.; KOOTSTRA,
G. (1998) Low-level laser therapy in ankle sprains: a randomized clinical trial.
Arch Phys Med Rehabil, v. 79, p. 1415-1420.
KITCHEN, S. S.; BAZIN, S. (1998) Eletroterapia de Clayton. São Paulo: Ed.
Manole Ltda, p.191-210.
BAXTER, G.D. (1997) Therapeutic lasers: theory and practice. United States of
America: Ed. Churchill Livingstone.
KARU T. (1998) The Science of Low-Power Laser Therapy. Australia: Gordon
and Breach Science Publishers.
21
ARTIGO 1
ALTERAÇÕES ESTRUTURAIS DO COLÁGENO DA PLACA DE
CRESCIMENTO IRRADIADO POR LASER DE BAIXA INTENSIDADE: UMA
INVESTIGAÇÃO POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
STRUCTURAL CHANGES OF COLLAGEN IN THE IRRADIATED GROWTH
PLATE BY LOW INTENSITY LASER: AN INVESTIGATION THROUGH
MICROSCOPY OF ATOMIC FORCE
Paulo Umeno Koeke*, Charles Taciro*, Nivaldo Antonio Parizotto*
*Laboratório de Eletrotermofototerapia, Departamento de Fisioterapia,
Universidade Federal de São Carlos, Estado de São Paulo, Brasil.
Endereço para Correspondência: Nivaldo Antonio Parizotto, Laboratório de
Eletrotermofototerapia, Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de
São Carlos, Via Washington Luís, km 235, CP 676, CEP 13565-905, São
Carlos, SP, Brasil, Tel: (16) 33518630 E-mail: [email protected]
Título Abreviado: Laser sobre Placa de Crescimento
22
RESUMO
Objetivo: O presente estudo investigou através da microscopia de força
atômica o efeito sistêmico e local da radiação laser sobre o colágeno da placa
de crescimento ósseo. Métodos: Foram utilizados ratos Wistar, com 30 dias de
idade, divididos aleatoriamente: Grupo GC (n=5), não irradiados pelo laser;
Grupo G5J (n=10), irradiado por um laser (λ=780 nm, potência de saída = 20
mW, fluência = 5 J/cm
2
, tempo = 10 segundos) e finalmente, o grupo G60J
(n=10) também irradiados por um laser de baixa intensidade (λ=780 nm,
potência de saída = 20 mW, fluência = 60 J/cm
2
, tempo = 120 segundos). Dos
grupos tratados, foi avaliado o efeito sistêmico na placa contralateral, sendo
denominados como G5JS (n=10) a avaliação da placa de crescimento
contralateral à irradiada do grupo G5J e o grupo G60JS (n=10) a avaliação da
placa de crescimento contralateral à irradiada do grupo G60J. O tratamento
consistiu de 06 aplicações de laser pela técnica pontual na pata traseira direita
sobre a região ântero-medial da placa de crescimento proximal da tíbia, com
intervalo de 48 horas entre as irradiações. Resultados: Observamos aumento
na espessura dos feixes de colágeno, alteração do sentido de orientação e
organização destes feixes, principalmente no local. Conclusão: O laser pode
provocar alterações estruturais nos feixes de colágeno, porém os nossos
resultados não são suficientes para afirmar que o crescimento ósseo possa ser
afetado.
Palavras Chaves: Laser, AFM, Placa de Crescimento.
23
ABSTRACT
Objective: This study investigated through the microscopy of the atomic force
the systemic and local effect of the laser radiation on the bone growth plate.
Materials and Methods: 30-day-old Wistar rats, randomly divided, were used
in this experiment: Group GC (n=5), not irradiated by laser; Group G5J (n=10),
irradiated by laser, (λ=780 nm, mean output power = 20 mW, fluency rate = 5
J/cm2 , time = 10 seconds) and finally, the Group G60J (n=10) also irradiated
by low intensity laser (λ=780 nm, mean output power = 20 mW, fluency rate =
60 J/cm2 , Time = 120 seconds). From these groups, we evaluated the
systemic effect on the contra lateral plate and we named them as G5JS (n=10)
– the evaluation of the contra lateral growth plate to the irradiated one of the
Group G5J and the Group G60JS (n=10) – the evaluation of the contra lateral
growth plate to the irradiated one of the Group G60J. The treatment consisted
of six laser applications through the punctual technique on the back right paw
over the antero-medium region of the growth plate near the tibia, with a 48-hour
interval between the irradiations. Results: We observed an increase on the
thickness of the collagen sheaves, changing of orientation sense and
organization of these sheaves, mainly through the local effect. Conclusion:
Laser can cause structural changes on the collagen sheaves, but our results
are not enough to claim that the bone increase can be affected.
Key-works: Laser, AFM, Growth Plate.
24
INTRODUÇÃO
Recentemente alguma atenção tem sido dada a um fator potencialmente
modulatório às células presentes em tecidos em franco desenvolvimento ou em
reparação, a irradiação laser de baixa potência. Resultados promissores têm
sido reportados, como o aumento da atividade de células sanguíneas,
macrófagos, fibroblastos
1
, condrócitos, osteoblastos e osteoclastos na área da
fratura irradiada pelo laser, incremento na vascularização
1, 2, 3
alterações na
síntese de RNA
4
, efeitos positivos na proliferação, diferenciação e calcificação
de clones de células osteoblásticas
5, 6
, aumento na velocidade de
reorganização da estrutura trabecular e canais haversianos
7, 8
.
Porém há poucos estudos que verificam a influência desta radiação
eletromagnética sobre a placa de crescimento ósseo, tecido esse que é o
responsável pelo crescimento em comprimento para a metáfise e para a diáfise
do osso longo. Sabe-se que os fatores responsáveis pela coordenação do
desenvolvimento e do crescimento pós-natal envolvem principalmente as
influências ambientais, fatores de crescimento e o controle genético
9
, os quais
podem ser modulados por ação da laserterapia.
A fotobiomodulação laser é o efeito da radiação eletromagnética do laser de
baixa intensidade em materiais biológicos, através da estimulação ou inibição
de atividades bioquímicas, fisiológicas e proliferativas. A magnitude do efeito é
referida sendo dependente do comprimento de onda, das doses e da dose-
intensidade do laser
10, 11
.
25
Algumas dessas alterações e respostas teciduais podem ser evidenciados
através do estudo estrutural dos feixes de colágeno do tecido em questão.
Essas alterações envolvem dimensão dos feixes de colágeno (espessura),
organização e homogeneidade estrutural.
Neste trabalho nós utilizamos a microscopia de força atômica como técnica
para o estudo da superfície topográfica do corte histológico, com o objetivo de
estudar a morfologia e a influência da irradiação laser de baixa intensidade
sobre o desenvolvimento da placa de crescimento de ratos.
26
MÉTODOS
Foram utilizados 25 ratos Wistar (Rattus novergicus, albinus) machos, com
massa corporal variando de 70 a 90 gramas, com 30 dias de idade, divididos
aleatoriamente: Grupo GC (n=5), não irradiados pelo laser; Grupo G5J (n=10),
irradiado por um laser de λ=780 nm com potência de saída de 20 mW a uma
fluência de 5 J/cm
2
, por 10 segundos e finalmente, o grupo G60J (n=10)
irradiados por um laser de λ=780 nm com potência de saída de 20 mW a uma
fluência de 60 J/cm
2
, por 120 segundos. Dos grupos tratados, foi avaliado o
efeito sistêmico na placa contralateral, sendo demoninados como G5JS (n=10)
a avaliação da placa de crescimento contralateral à irradiada do grupo G5J e o
grupo G60JS (n=10) a avaliação da placa de crescimento contralateral à
irradiada do grupo G60J.
O equipamento laser utilizado foi um laser terapêutico MMOptics, classe 3b,
emissão contínua, potência óptica útil na saída de até 70 mW, divergência do
feixe 50° e a área do spot de saída é de 4,0 mm
2
.
A irradiação laser foi realizada pelo método transcutâneo pontual sobre a face
medial da placa de crescimento proximal da tibia, localizado logo abaixo da
interlinha articular do joelho da pata posterior direita do rato em 06 aplicações,
com um intervalo de 48 entre as irradiações.
As tíbias removidas após 48 horas da última sessão, foram fixadas por 24hs
em solução de Bouin, seguindo-se então o processo de lavagem para a
retirada dos resíduos e então a desmineralização através da solução de Morse
27
(ácido fórmico a 50% e citrato de sódio a 20% em partes iguais), trocada a
cada 3 dias, durante 25 dias.
As peças foram lavadas em água corrente por 24 horas, neutralizadas em
solução de sulfato de sódio a 5% por 24 horas, lavadas novamente em água
corrente por mais 24 horas. Posteriormente conservado em solução de álcool
70% para desidratação (álcool 90%, álcool 95%, álcool absoluto) e na
seqüência a diafanização e inclusão em parafina para confecção de blocos e
realização dos cortes no plano coronal por meio de um micrótomo rotatório.
Foram, então, realizados cortes seriados longitudinais com 6 µm de espessura
padronizada, buscando melhor visão para análise da cartilagem de
crescimento.
Microscopia de Força Atômica
No nosso trabalho a topografia das amostras foi adquirida através de um
microscópio de força atômica (modelo BioProbe da Park Scientific Instruments,
atualmente a Thermo Microscopes - Veeco) em ar, operando no modo de
contato a uma freqüência de varredura de 1.5 Hz por linha, gerando 256 linhas,
num campo de análise de 25X25 µm, em temperatura e condições de pressão
controlados e umidade relativa do ar em 50%.
As lâminas foram hidratadas por cerca de 30 minutos em água destilada. Logo
em seguida, foram obtidas 4 imagens de AFM em pontos aleatórios na zona de
repouso placa de crescimento para cada corte histológico.
28
A análise do aspecto dimensional foi efetuada através da mensuração das
espessuras dos feixes de colágeno da matriz celular da zona de repouso da
placa de crescimento , com o auxílio do software Image Processing and Data
Analysis – Version 2.0.0 – TermoMicroscopes.
Os dados obtidos, segundo os procedimentos já descritos acima, estão
organizados na Figura 2, onde quanto maiores forem os valores numéricos
observados maior a espessura dos feixes de colágeno.
A comparação estatística dos grupos estudados ocorreu através de um teste
paramétrico apropriado como uma análise de variância (ANOVA) paramétrica.
Em seguida, todos os grupos foram comparados pelo teste BONFERRONI.
Também foi avaliado de forma qualitativa o aspecto geral da topografia da zona
de repouso, observando-se os aspectos de organização, sentido de orientação
das fibras e homogeneidade.
Figura 1: Mensuração da largura do feixe de colágeno na zona de repouso da
placa de crescimento através do programa Image Processing and Data
Analysis – Version 2.0.0 – TermoMicroscopes. Em “1A” imagem da topografia e
em “1B” seção transversa do feixe de colágeno.
1A
1B
29
ESPESSURA (
µ
µ
µ
µm)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 2: Distribuições das medições da espessura dos feixes de
colágenos.
No presente estudo, um importante fator a ser destacado foi o aumento da
espessura dos feixes de colágenos da zona de repouso da placa de
crescimento dos ratos tratados com laser quando comparados ao grupo
controle (p≤ 0.05), que não recebeu nenhuma radiação, sendo que o efeito
local nas doses de 60 joules e 5 joules provocou maior alteração quando
comparado com o efeito sistêmico da irradiação (p≤ 0.05).
Os nossos resultados estão de acordo com diversos pesquisadores que
observaram um incremento dos fibroblastos responsáveis pela produção de
colágeno após a irradiação com laser de baixa intensidade
3, 4, 12, 13
, assim como
a deposição dessas novas fibras de colágenos de forma organizada de tal
modo a se agregarem, aumentando o diâmetro dos feixes de colágeno.
30
Interessante observar que o efeito da radiação laser não se restringiu apenas
ao local irradiado, afetando também a placa de crescimento esquerda, contra-
lateral à irradiada. As alterações foram em menor magnitude, implicando na
possibilidade de efeito sistêmico da laserterapia. Há a hipótese de que
mediadores químicos e fatores de crescimento produzidos no local irradiado
possam, através da corrente sanguínea, atuar sobre outros centros de
crescimento, afetando a estrutura tecidual
15
.
A literatura descreve que preferencialmente os tecidos “lesados”, que em sua
maioria apresentam alterações no seu estado redox, são susceptíveis ao efeito
biomodulatório da radiação laser, possibilitando que os efeitos biomodulatórios
se concentrem predominantemente no foco de lesão. Os nossos resultados
demonstram que esse efeito pode ocorrer na placa de crescimento “saudável”,
talvez pelo fato de ser um tecido com elevada atividade metabólica, ou por
apresentar células em franca divisão celular.
Outro fato importante é que a literatura descreve a placa de crescimento como
uma estrutura na qual suas fibras de colágeno não apresentam uma orientação
definida
9, 16, 17
, porém em nosso estudo observamos através das imagens de
AFM que os feixes de colágenos formam uma estrutura de freqüência
relativamente constante em forma de colméia de abelha (CA).
Observa-se através das imagens topográficas da zona de repouso (figura 3)
que essa estrutura apresenta alteração nos grupos tratados com laser de baixa
intensidade, quando comparados ao GC.
31
Figura 3: Imagens topográficas da zona de repouso.
A imagem 3A representa a topografia da zona de repouso do GC, no qual
observam-se feixes de colágeno com dimensão homogênea mantendo um
padrão de orientação perpendicular ao eixo longitudinal da tíbia.
*
*
*
3A
3B
3C
3D
3E
32
Como demonstrando na análise da espessura dos feixes, o G5J (figura 3B) os
feixes de colágeno são mais espessos que os do GC e formam estruturas mais
circulares com o eixo longitudinal e transversal, sendo que no G60J – figura 3C
– a estrutura geral da amostra há um predomínio da orientação dos feixes mais
espessos no sentido longitudinal. As estruturas em forma de CA são maiores e
apresentam distribuição regular.
O efeito sistêmico do laser parece gerar uma desorganização dos feixes de
colágenos, principalmente no G5JS – figura 3D – no qual as estruturas em CA
são de tamanhos diferentes e feixes de colágeno sem eixos de orientação
definidos, mas o aumento da dose parece ter provocado no G60JS – figura 3E
– uma estrutura relativamente mais homogênia que o G5JS, mas ainda com
estruturas em CA de dimensões diferentes e sem orientação definida, porém
com feixes de colágeno com espessura relativamente constante.
No entanto, mesmo diante das alterações observadas nesse trabalho, não é
possível predizer se o crescimento do osso poderia ser modulado por ação do
laser de baixa intensidade, mas implica sim em uma condição de precaução na
aplicação desta modalidade terapêutica.
Dessa forma, é muito importante que estudos subseqüentes abordem este
tema, pois se comprovado por estudos subseqüentes que a terapia laser possa
estimular o crescimento ósseo, uma importante terapia pode vir a ser uma nova
solução para o tratamento de traumas ou doenças que afetam a placa de
crescimento ósseo.
33
CONCLUSÃO
O laser de baixa intensidade pode provocar alterações estruturais
(dimensão, organização e orientação) nos feixes de colágeno.
34
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37
ARTIGO 2
REAÇÃO HISTOLÓGICA NA PLACA DE CRESCIMENTO DE RATO À
APLICAÇÃO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE.
HISTOLOGICAL REACTION IN RAT’S GROWTH PLATE TO THE
APPLICATION OF LOW LEVEL LASER THERAPY
Paulo Umeno Koeke*, Charles Taciro*, Nivaldo Antonio Parizotto*
*Laboratório de Eletrotermofototerapia, Departamento de Fisioterapia,
Universidade Federal de São Carlos, Estado de São Paulo, Brasil.
Endereço para correspondência: Nivaldo Antonio Parizotto, Laboratório de
Eletrotermofototerapia, Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de
São Carlos, Via Washington Luís, km 235, CP 676, CEP 13565-905, São
Carlos, SP, Brasil, Tel: (16) 33518630 E-mail: [email protected]
Título abreviado: Laser sobre Placa de Crescimento
38
RESUMO
Objetivo: O presente estudo investigou através de microscopia de luz
comum e de força atômica o efeito da radiação laser na morfologia da placa de
crescimento e assim contribuir para uma melhor compreensão do uso clínico.
Métodos: Foram selecionados 25 ratos com 30 dias de idades, divididos
aleatoriamente em grupo controle (n = 5); grupo G5J (n = 10): laser (λ=780 nm,
potência de saída de 20 mW, irradiância 500 mW/cm
2
, fluência 5 j/cm
2
, durante
10 segundos); grupo G60J (n = 10): laser (λ=780 nm, potência de saída de 20
mW, irradiância 500mW/cm
2
, fluência 60 j/cm
2
, durante 120 segundos). Foram
06 aplicações de laser, com intervalo de 48 horas entre as irradiações. A
irradiação foi transcutânea pela técnica pontual na pata traseira direita sobre a
região ântero-medial da placa de crescimento proximal da tíbia. Resultados:
Observamos nos ratos submetidos a irradiação laser aumento do número de
células, diminuição do volume da matriz extracelular, formação de trabéculas
ósseas mais espessas e alteração na disposição e dimensão dos feixes de
colágeno. Conclusão: Os resultados desse experimento demonstram que o
laser provoca alterações da morfologia celular e das fibras de colágeno da
placa de crescimento.
Palavras Chaves: Laser, AFM, Placa de Crescimento.
39
ABSTRACT
Objective: This present study investigated through common light and
atomic force microscopy the effect of laser radiation in the morphology of the
growth plate. It aimed a better understanding of the clinic use. Methods: 25 rats
of 30 days old each were selected and divided randomly in control group (n=5),
G5J group (n = 10): laser (λ=780 nm, 20 mW output power, 500 mW/cm
2
irradiance, 5J/cm
2
fluency, during 10 seconds); G60J (n=10) laser (λ=780 nm,
20 mW output power, 500mW/cm
2
irradiance, 60 J/cm
2
fluency, during 120
seconds). There were 6 laser applications with a 48-hour interval between the
irradiations. It was a transcutaneous irradiation through the accurate technique
in the right hint-foot in the antero-medium region of the growth plate next to the
tibia. Results: We notice an increasing number of cells, a decreasing volume of
the extracellular matrix, a thicker formation of bone trabeculae and a change of
disposition and dimension of the collagen sheaves in the experienced rats.
Conclusion: The results of this experiment show that the laser changes in
cellular morphological and in the collagen fibers of growth plate.
Keywords: Laser, AFM, Growth Plate.
40
INTRODUÇÃO
No osso longo há dois sítios de crescimento, localizados nas suas
extremidades, denominados placa de crescimento, os quais proporcionam
crescimento em comprimento do osso longo.
Segundo Salter & Harris
1
as lesões sobre a placa de crescimento
representam 15% a 20% das fraturas de criança. Além disso, a placa de
crescimento relaciona-se anatomicamente com outras estruturas como
tendões, bursas e ligamentos, as quais podem ser afetadas, como
freqüentemente acontece, por distensões e esforços repetidos, dando origem a
processos inflamatórios localizados. Quando esses processos inflamatórios
ocorrem, é necessário um tratamento correto. Porém, não há um consenso
esclarecido dos efeitos que algumas abordagens terapêuticas físicas, utilizadas
nestes casos, podem causar sobre a placa de crescimento.
Estudos demonstraram alterações da placa de crescimento estimuladas
por agentes físicos, como força mecânica
2, 3
, ultra-som
4, 5
e campos
eletromagnéticos
6, 7
.
No entanto, não há informações suficientes sobre os efeitos do laser na
placa de crescimento, portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a reação
morfológica da placa de crescimento irradiada por laser e assim contribuir para
uma melhor compreensão do uso clínico.
41
MÉTODOS
Neste trabalho experimental foram selecionados 25 ratos Wistar (Rattus
Novergicus, Albinus) machos, com massa corporal variando de 70 a 90
gramas, com 30 dias de idade, de forma que se incluiu o período de
crescimento, que corresponde ao animal a fase de puberdade
8
. Estes animais
foram mantidos em condições ambientais controladas (12 horas de ciclo
claro/escuro, água e alimentação ad libitum).
Os 25 animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos:
GRUPO CONTROLE (CG): (n = 5) os animais deste grupo não
receberam irradiação laser.
GRUPO 5 JOULES (G5J): (n = 10) os animais deste grupo foram irradiados na
pata traseira direita por um laser Ga-Al-As infravermelho, λ=780 nm, potência
de saída de 20 mW, irradiância 500 mW/cm
2
, fluência 5 j/cm
2
, durante 10
segundos e a área do spot de 4,0 mm
2
.
GRUPO 60 JOULES (G60J): (n = 10) os animais deste grupo foram irradiados
na pata traseira direita por um laser Ga-Al-As infravermelho, λ=780 nm,
potência de saída de 20 mW, irradiância 500mW/cm
2
, fluência 60 j/cm
2
, durante
120 segundos e a área do spot de 4,0 mm
2
.
Foram realizadas 06 aplicações transcutânea de laser, com intervalo de
48 horas entre as irradiações, em um único ponto na pata traseira direita sobre
a região ântero-medial da placa de crescimento proximal da tíbia através da
técnica pontual.
42
Após 48 horas da última aplicação do laser os animais sofreram
eutanásia através da inalação excessiva de éter etílico e na seqüência as tíbias
foram retiradas cirurgicamente para preparação de lâminas histológicas em
cortes longitudinais com 6 µm de espessura e coradas com
hematoxilina/eosina (H&E).
Essas lâminas foram analisadas de forma qualitativa descritiva ao
microscópio de luz comum e de força atômica, observando as características
morfológicas da placa de crescimento.
Foi utilizado um microscópio de luz comum OLYMPUS BX41 utilizado
com aproximadamente 40X de aumento para as seguintes características:
aspectos das células matriz extracelular e indícios da mineralização.
O Microscópio de Força Atômica (AFM) - Bioprobe, Park Scientific
Instruments, Thermo Microscopes, Veeco - foi programado para obter imagens
no modo de contato, em meio aéreo, utilizando pontas de varredura
microfabricadas de silício (PARK SCIENTIFIC INSTRUMENTS - MICROLEVER
0, 6 µm, 0, 03 N/m constante elástica), freqüência de varredura de 1.5 Hz num
campo de análise de 12X12 µm. Todas as imagens apresentadas neste artigo
mostram a vista superior do corte histológico na região da placa de
crescimento.
A análise por AFM objetiva observar a estrutura e a disposição dos
feixes de colágeno na zona de repouso e na transição da zona proliterativa
com a zona hipertrófica.
43
RESULTADOS
Microscopia de luz comum
Os nossos resultados demonstram que na zona de repouso da placa de
crescimento do GC há poucas células em divisão (Figura 1A). Abaixo da zona
de repouso encontramos a zona proliferativa com presença de camadas de
células achatadas (Figura 1B).
A zona hipertrófica é a continuação da zona proliferativa. Esta área de
cartilagem apresenta células em degeneração, núcleos completamente
alterados e citoplasmas quase inexistentes rodeados da matriz mineralizada
(Figura 1C).
Na Figura 1D observamos as trabéculas ósseas que invadem a
cartilagem degenerada.
44
Figura 1: Fotomicrografia da placa de crescimento do GC. As
setas indicam em A – células da zona de repouso, B – células da zona
proliferativa, C – células da zona hipertrófica e D – trabéculas ósseas. H&E,
approx. 40X.
Na placa de crescimento do G5J, observamos muitas células em
processo de divisão na zona de repouso (Figura 2A). Na cartilagem da zona
proliferativa, há muitas camadas de condrócitos (Figura 2B). O volume das
células da cartilagem da zona hipertrófica está aumentado se comparado ao
GC (Figura 2C). Presença de muitas trabéculas espessas (Figura 2D).
45
Figura 2: Fotomicrografia da placa de crescimento do G5J. As
setas indicam em A – diversas células da primeira camada em processo de
divisão, B – grande quantidade de camadas de células, C – volume celular
aumentado na zona hipertrófica e D – grande quantidade de trabéculas ósseas
espessas. H&E, approx. 40X.
Nos animais G60J, verificamos um número muito grande de células em
proliferação na zona de repouso (Figura 3A). Seguida de cartilagem da zona
proliferativa com uma quantidade exuberante de células (Figura 3B). Nota-se
um grande volume celular na cartilagem da zona hipertrófica (Figura 3C).
Presença de grande número de trabéculas ósseas espessas (Figura 3D).
46
Figura 3: Fotomicrografia da placa de crescimento G60J. As setas
indicam em A – grande proliferação de células na zona de repouso, B – várias
colunas de células, C – volume aumentado das células hipertrófica e D –
inúmeras trabéculas ósseas espessas. H&E, approx. 40X.
Microscopia de Força Atômica (AFM)
As imagens da Figura 4 são resultados da AFM sobre as zonas de
repouso (coluna I) e da região entre as zonas de proliferação e hipertrófica
(coluna II), mostrando a organização e forma dos feixes de colágeno na matriz
celular da placa de crescimento.
47
Observa-se que a topografia da zona de repouso do GC (imagem 4A),
os feixes de colágeno com dimensão homogênea mantém um padrão de
orientação perpendicular ao eixo longitudinal da tíbia e formam uma estrutura
semelhante a uma colméia de abelha (CA) (∗).
A radiação laser no G5J (FIG. 4B) promoveu a formação de feixes de
colágeno mais espessos que formam estruturas mais circular com o eixo
longitudinal e transversal e com dimensão equivalente (seta). Observa-se que
aumento da dose de radiação laser no G60J ( FIG. 4C) promoveu uma geral
estrutura mais homogênea que o G5J, com predomínio da orientação dos
feixes mais espessos no sentido do eixo longitudinal (seta). As estruturas em
forma de CA (∗), são maiores e apresentam distribuição regular.
Na região de transição entre as zonas de proliferação e hipertrófica
(coluna II), o GC (FIG. 4D) apresenta feixes de colágeno com dimensão
homogênea mantendo um padrão de orientação com tendência ao eixo
longitudinal, apresentando formação de CA maiores e com feixes mais
espessos.
Diversas alterações são observadas nessa região quando comparamos
os grupos G5J e G60J com o GC, neles observa-se perda de homogeneidade,
com formação de feixes irregulares de colágeno mais espesso (seta)
orientados no sentido longitudinal e diminuição do aspecto de CA (*) (FIG. 4E,
4F,).
48
Figura 4: AFM a 12X12 µm da topografia da zona de repouso (coluna I)
contendo em A – GC, B – G5J , C – G60J; na coluna II, AFM da topografia da
região entre as zonas de proliferação e hipertrófica contendo os grupos em D –
GC, E – G5J , F – G60J. A Seta branca indica os feixes de colágeno e o (*) as
formações em colméia de abelha.
49
DISCUSSÃO
Nos resultados da microscopia de luz comum do CG, quando
comparado com os demais grupos, verificamos que a divisão celular, a matriz
extracelular e formação de trabéculas ósseas seguem os padrões histológicos
normais. Os aspectos histológicos deste grupo estão condizentes com o
trabalho de Iannotti
9
, Brighton
10
e Buckwalter et al.
11
, os quais demonstraram
acuracidade das medidas.
Nos G5J e G60J foi observado na zona de repouso um processo de
divisão celular mais intenso que o normal. Para Brighton
10
é geralmente nesta
zona que ocorrem as anormalidades da placa de crescimento. Por isso, a nota
é que este aumento da divisão celular pode reforçar ainda mais a possibilidade
de anormalidades na placa de crescimento.
A histologia da zona de proliferação do GC possui os mesmos aspectos
observados por Kirkwood
12
. Já nos grupos irradiados com laser se percebe
uma quantidade superior ao normal de células, o que segundo Vanky
13
pode
causar uma maior mineralização.
A cartilagem da zona hipertrófica do GC corrobora com os relatos de
Iannotti
9
. Nos grupos G5J e G60J ocorreu uma hipertrofia maior das células
desta camada, conseqüentemente, diminuindo o volume extracelular. Segundo
Brighton
14
a intensidade da hipertrofia envolve o ritmo de mineralização da
matriz.
A área das trabéculas ósseas do GC possui as características descritas
por Iannotti
9
, Brighton
10
e Brighton
14
. Essas trabéculas ósseas invadem a
cartilagem degenerada.
50
Nos grupos irradiados observamos a presença mais robusta de
trabéculas ósseas. De acordo com Stevens & Williams
15
os osteoblastos
produzem osso trabecular na faixa de cartilagem calcificada da placa de
crescimento. Portanto, esses dados indicam que a produção de osso foi
estimulada.
O aumento dimensional dos feixes de colágeno e a alteração estrutural
observado nas imagens obtidas na AFM, sugere um incremento na produção
de colágeno pelas células da placa de crescimento, como por exemplo
condroblastos. Diversos estudos têm demonstrado que a radiação laser tem
influência no aumento da produção de colágeno no tecido tendíneo
16, 17
.
Parizotto & Baranauskas
18
verificaram melhora da organização molecular das
fibrilas e feixes de colágeno através de AFM em ratos com tenotomia total
tratados com laser terapêutico, fato este confirmado com as alterações
morfológicas encontradas nos animais irradiados do nosso trabalho.
Na placa de crescimento as fibras de colágeno não possuem uma
orientação definida
9, 10, 19
, mas em nosso trabalho aquelas que sofreram
irradiação laser tiveram uma predominância em relação ao eixo longo da tíbia
além de um aumento relativo na espessura dos feixes de colágeno. Esse novo
arranjo estrutural pode ter afetado as propriedades mecânicas da placa de
crescimento, pois são também dependentes da quantidade, tipo e orientação
espacial de suas fibras.
Segundo Parrish et al.
20
quando a energia eletromagnética atravessa os
tecidos ocorre interação biomolecular. Neste processo de dissipação da
energia luminosa essa interação pode causar modificações mensuráveis nas
51
moléculas de modo reversível ou irreversível. Nesse sentido, Charman
21
discute a possibilidade da energia eletromagnética causar formação de dipolos
magnéticos na estrutura molecular de tecidos alvo. Sabe-se que as alterações
das configurações sobre estruturas piezoelétricas (piezoelectrics) (como o
colágeno) provocam no tecido modificações no seu meio elétrico, criando
potenciais elétricos de baixa amplitude o que deixa as fibras polarizadas
22, 23
. A
polarização das fibras pode ter favorecido o posicionamento destas no eixo
longitudinal da tíbia.
Segundo Vilarta & Vidal
24
; Vidal & Carvalho
25
e Enwemeka & Spielholz
16
,
são de grande importância as microcorrentes geradas nas regiões moleculares,
que parecem funcionar como uma sinalização para a síntese e organização
das moléculas de colágeno.
Através dos G5J e G60J vimos que a interação dos fótons com as
células e a moléculas de colágeno provoca uma reação estimulante na placa
de crescimento, o que pode ser correlacionado com o trabalho de Manzanares
et al.
26
.
Os nossos resultados demonstram que um tecido “normal” (sem lesão)
também pode ter a sua atividade metabólica alterada pelo uso do laser.
Ainda não é possível afirmar que o laser vai alterar o crescimento em
comprimento de um osso, porém, através dos nossos resultados e dos
resultados de Manzanares et al.
26
observamos que alguns aspectos da placa
de crescimento sofrem modificações ao serem irradiados com o laser.
52
A nosso ver, os resultados do presente estudo estabelecem a
possibilidade de precauções ao irradiar o laser sobre uma placa de
crescimento.
53
CONCLUSÃO
Os resultados desse experimento demonstram que a irradiação do laser
na placa de crescimento provoca alterações na morfologia celular e nas fibras
de colágeno desse tecido.
54
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55-61.
25. Vidal, B.C., and Carvalho, H.F. (1990). Agregational state on
molecular order of tendons as a function of age. Matrix. 10, 48-57.
26. Manzanares, M.T.L., Vega, J.M.P., and Portero, F. S., et al. (1992).
Morfometría del cartílago de crecimiento de ratas Wistar irradiadas
com láser de baja potencia (He-Ne). Rehabilitación. 26, 68-73.
59
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Fundamentado nos dados dos dois trabalhos expostos, algumas
considerações pertinentes puderam ser relatadas.
Os resultados destes estudos indicam um efeito biomodulatório do laser
de baixa intensidade no desenvolvimento da placa de crescimento.
No primeiro estudo, foram corroboradas as hipóteses demonstradas nos
estudos anteriores. Dentre os principais resultados destacam-se as alterações
estruturais nos feixes de colágeno das placas de crescimento que sofreram
radiação laser de baixa intensidade. Para evidenciar estes resultados, foi
proposto um segundo estudo.
No segundo estudo, os resultados demonstraram que a irradiação do
laser na placa de crescimento provoca alterações não somente nas fibras de
colágeno desse tecido como também na morfologia celular. Assim, através de
microscopias diferentes, verificamos reações histológicas importantes quando
células e fibras de colágeno são atingidas por ondas eletromagnéticas de um
laser de baixa intensidade.
Como exposto anteriormente, a falta de consenso na utilização do laser
de baixa intensidade sobre a placa de crescimento, permite a importância
desse tipo de pesquisa.
60
O conhecimento das alterações histológicas que o laser de baixa
intensidade pode provocar na placa de crescimento é importante, para que as
elaborações do tratamento de fisioterapia sejam sempre benéficas.
Futuros estudos precisam ser executados com o propósito de se
investigar os efeitos de diferentes doses e comprimentos de onda, assim como,
diferentes métodos de avaliar a reação da placa de crescimento quando
exposta a uma irradiação laser.
Dentre as possibilidades identificadas, indicamos a necessidade de
contemplar os nossos achados, e realizar ensaios biomecânicos deste material
biológico, já que as orientações das fibras de colágeno demonstraram
alteradas.
61
ANEXO
ctl 60 sist 5 sist 60 local 5 local
3,094
1,969
6,073
3,656
3,75
2,672
1,969
4,922
3,656
2,344
2,625
1,828
4,406
3,516
2,309
2,33
1,828
2,344
2,859
2,203
1,923
1,547
1,969
2,813
2,203
1,828
1,547
1,875
2,625
2,156
1,641
1,5
1,828
2,531
2,063
1,641
1,5
1,734
2,438
2,016
1,135
1,5
1,734
2,438
1,922
1,108
1,453
1,688
2,297
1,922
0,9888
1,406
1,688
2,25
1,922
0,8057
1,406
1,599
2,25
1,828
0,7416
1,359
1,547
2,203
1,828
0,7379
1,359
1,5
2,016
1,734
0,7022
1,359
1,5
1,969
1,641
0,7004
1,313
1,453
1,969
1,594
0,6848
1,313
1,453
1,969
1,547
0,6848
1,313
1,406
1,969
1,547
0,6823
1,313
1,406
1,922
1,547
0,6674
1,266
1,359
1,875
1,453
0,6592
1,263
1,359
1,828
1,453
0,6572
1,236
1,313
1,828
1,453
0,6262
1,236
1,313
1,781
1,359
0,6244
1,219
1,313
1,734
1,359
0,6244
1,181
1,266
1,734
1,345
0,6216
1,172
1,266
1,734
1,292
0,607
1,125
1,219
1,734
1,266
0,5759
1,078
1,219
1,688
1,219
0,5706
1,078
1,219
1,688
1,219
0,5447
1,069
1,172
1,641
1,172
0,5438
1,044
1,162
1,594
1,172
0,5288
1,031
1,125
1,594
1,172
0,5288
1,015
1,125
1,5
1,172
0,5118
0,9844
1,125
1,5
1,172
0,501
0,976
1,057
1,5
1,126
0,4834
0,9613
1,036
1,453
1,125
0,4746
0,9459
1,031
1,453
1,078
0,4731
0,9064
1,003
1,453
1,02
0,4642
0,8767
0,9855
1,359
0,8906
0,4633
0,8399
0,9756
1,359
0,8284
0,4618
0,8203
0,9097
1,313
0,7927
0,3375
0,8198
0,8943
1,313
0,7646
0,2801
0,7927
0,8844
1,313
0,7317
0,2227
0,789
0,8844
1,313
0,7186
0,7844
0,8438
1,266
0,6301
0,7723
0,813
1,266
0,6301
62
0,7379
0,7859
1,219
0,616
0,6797
0,6504
1,219
0,5735
0,6189
1,172
0,5488
0,6094
1,031
0,5894
0,8906
0,5475
0,75
0,5345
0,5281
0,497
0,497
0,4815
0,4659
0,4504
TESTE ANOVA 1
CRITÉRIO
FONTES DE VARIAÇÃO GL SQ QM
Tratamentos 4
27,299
6,825
Erro 247
116,605
0,472
--- --- ---
F = 14,4568
--- ---
(p) = 0
--- ---
Média (ctl = Coluna 1) 0,9041
--- ---
Média (60j Sist = Coluna
2) 1,0729
--- ---
Média (5j sist = Coluna 3) 1,5299
--- ---
Média (60 local = Coluna
4) 1,8354
--- ---
Média (5j local = Coluna
5) 1,4169
--- ---
--- --- ---
Bonferroni: B (p) ---
Médias ( 1 e 2) = 0,2251
> 0.05 ---
Médias ( 1 e 3) = 0,2359
< 0.05 ---
Médias ( 1 e 4) = 0,2315
< 0.05 ---
Médias ( 1 e 5) = 0,2347
< 0.05 ---
Médias ( 2 e 3) = 0,2197
< 0.05 ---
Médias ( 2 e 4) = 0,215
< 0.05 ---
Médias ( 2 e 5) = 0,2185
< 0.05 ---
Médias ( 3 e 4) = 0,2262
< 0.05 ---
Médias ( 3 e 5) = 0,2295
> 0.05 ---
Médias ( 4 e 5) = 0,225
< 0.05 ---
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