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Diogo Azevedo Coutinho
Aspectos da toxicocinética do mercúrio em camarões de
cultivo Litopeneaus vannamei (Bonne, 1931).
Dissertação submetida à Universidade Federal do
Rio de Janeiro visando a obtenção do grau de
mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências e Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2008
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ii
Diogo Azevedo Coutinho
Aspectos da toxicocinética do mercúrio em camarões de cultivo Litopeneaus
vannamei (Bonne, 1931).
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Ciências biológicas (Biofísica)
Orientador: Mauro de Freitas Rebelo
Rio de Janeiro (RJ)
2008
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iii
Ficha Catalográfica
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
Aspectos da toxicocinética do mercúrio em camarões de cultivo
Litopeneaus
vannamei (Bonne, 1931).
Teses / Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho; organizado por Diogo Azevedo
Coutinho et al. - Rio de Janeiro : IBCCF, 2008.
120 p.
Inclui bibliografia 103-120.
1. Metalotioneína – 2. Bioacumulação – 3. Metal Pesado
iv
Orientador:
__________________________________
Prof. Dr. Mauro de Freitas Rebelo
Banca Examinadora:
_______________________________
Prof. Dr. João Paulo Machado Torres
_______________________________
Profa. Dra. Maria Risoleta Freire Marques
_______________________________
Prof. Dr. Milton Ozório Moraes
v
Diogo Azevedo Coutinho
Aspectos da toxicocinética do mercúrio em camarões de cultivo Litopeneaus
vannamei (Bonne, 1931).
Rio de Janeiro, ....... de ...... de 2....
________________________
(Nome do orientador, sua titulação e Instituição a que pertence)
________________________
(nome, titulação e instituição a que pertence)
________________________
(nome, titulação e instituição a que pertence)
vi
Agradecimentos
• À Deus, que, apesar dos fracassos iniciais me deu força para alcançar meu objetivo.
• À minha família, principalmente ao meu irmão Sólon pelas conversas intermináveis antes
de dormir, a minha mãe por ter me dado suporte e ter feito propaganda pra todas as
amigas do seu filho “mestrando em biofísica pela UFRJ” e meu pai, que apesar da
distância sempre esteve presente em todos os momentos, e nas coletas em Fortaleza deu
todo o apoio logístico e alimentício. Amo vocês.
• À Milton Moraes, inesquecível primeiro orientador e amigo muito querido.
• Ao meu orientador, por ter me dado força desde o meu início na Fiocruz. Agradeço
também pela paciência e participação nessa fase da minha vida.
• Ao professor Luis Drude de Lacerda que permitiu que fizéssemos parte desse projeto.
• Aos professores que compuseram a banca examinadora- Professores Valéria Magalhães,
João Paulo Torres, Milton Moraes, Risoleta Marques e Jennifer Lowe.
• Aos meus queridos amigos que fiz durante a iniciação científica e mestrado. Galera da
FioCruz: Alejandra, Guilherme (Humberto Martins), Luana, Cynthia, Flávia, Luiz
Afonso, Mara, Konotop, Alexandre Almeida, Xuxu, Diogão, Patrícia, Bart, Sidra,
Milena, Atiná, Amanda, Karina Xuxu, Harrison, Adalgiza, Júlio, Tati Silva, Jô, Taty,
Valcemir, Danielzinho, Daniel Porteiro, Seu Sales, Richard e ao Marcelo pela a ajuda
inicial nas estatísticas.
• Pessoal do Radioiso: Ricardinho, Marianna, Dani Lora, Dani, Andreza, Giselle, Petrus,
Márcio, Cláudio Eduardo, Sérgio, Sávio, Rodrigo Frango, Larissa Mamy, Luciana,
Renata, Rodrigo Lacerda, Lia, Dona Madalena, Maxizinho, Prof. Olaf, Prof. Jean, Prof.
João, Antonio, Milena.
vii
Abreviaturas
ABCC- Associação Brasileira de Criadores de Camarão
ANVISA- Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
ATSDR- Agency for Toxic Substances and Disease Registry
CNPQ- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
COMPESCAL- Comércio de Pescado Aracatiense
CT- Threshold Cycle
DBO- Demanda Biológica de Oxigênio
EMPARN- Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte
EMPRAPA- Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FIEC- Federação das Indústrias do Estado do Ceará
FINEP- Financiadora de Estudos e Projetos
ICRP- International Commission on Radiological Protection
IPA- Instituto Agronômico de Pernambuco
LABOMAR- Laboratório de Biologia Marinha
MAPA- Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MeHg- Metil Mercúrio
MREs- Metal Responsive Elements
MT- Metalotioneína
MT-1/MT-2 - Isoforma 1 e 2 da metalotioneina
SH- Sulfidrila
UESC- Universidade Estadual de Santa Cruz
UFC- Universidade Federal do Ceará
UFERSA- Universidade Federal Rural do Semi-Árido
UFPB- Universidade Federal da Paraíba
viii
UFPE- Universidade Federal de Pernambuco
UFRN- Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UFRPE- Universidade Federal Rural de Pernambuco
UNEP- Universidade Estadual Paulista
ix
Índice Geral
Agradecimentos.........................................................................................................................vi
Abreviaturas..............................................................................................................................vii
Índice Geral ...............................................................................................................................ix
Índice de figuras e tabelas ........................................................................................................xii
Resumo....................................................................................................................................xvi
Abstract...................................................................................................................................xvii
1. Introdução.............................................................................................................................18
1.1 Histórico da Carcinicultura.............................................................................................19
1.2 O Projeto Recarcine........................................................................................................21
1.3 O Cultivo ........................................................................................................................22
1.4 Danos ao Meio Ambiente...............................................................................................25
1.5 A Entrada de Contaminantes no Cultivo ........................................................................29
1.6 Metais traço ....................................................................................................................33
1.6.1 Metais traço e Crustáceos........................................................................................35
1.6.2 Mercúrio ..................................................................................................................38
1.7 Acúmulo de Metais traço nos Tecidos de Crustáceos ....................................................41
1.8 Biomarcadores................................................................................................................42
1.9 Metalotioneínas como Biomarcadores ...........................................................................44
1.9.1 Características Moleculares e Bioquímicas das MTs..............................................45
1.9.2 Metalotioneína em Crustáceos ................................................................................49
1.10 Hipótese de trabalho .....................................................................................................50
2 . Objetivos..............................................................................................................................50
Geral .....................................................................................................................................50
Específico .............................................................................................................................51
x
3. Material e Métodos...............................................................................................................51
3.1 Local de Coleta...............................................................................................................51
3.2 Amostragem nos Viveiros ..............................................................................................52
3.2.1 Indivíduos na Fase de Larvas ......................................................................................53
3.2.2 Coleta nos Viveiros de Engorda ..................................................................................54
3.3 Exposição em Laboratório..............................................................................................56
3.3.1 Aquisição e Armazenamento dos Camarões ...............................................................57
3.3.2 Manutenção do Sistema e Alimentação.......................................................................57
3.3.3 Desenho Experimental e Tipos de Ração....................................................................58
3.4 Extração de RNA e Síntese de cDNA ............................................................................60
3.4.1 Primers.....................................................................................................................61
3.4.2 PCR em Tempo Real...............................................................................................62
3.4.3 Organização das Amostras nas Placas de Tempo Real ...........................................63
3.5 Espectroscopia de Fluorescência Atômica .....................................................................63
3.6 Estatística........................................................................................................................65
4 Resultados..............................................................................................................................66
4.1 Análises das Seqüências .................................................................................................66
4.2 Experimento Intensivo....................................................................................................68
4.2.1 Concentração de Hg
2+
nas rações e nos tecidos ......................................................68
4.2.2 Expressão Gênica ....................................................................................................74
4.3 Experimento Extensivo...................................................................................................75
4.3.1 Concentração de Hg
2+
nas rações e nos tecidos ......................................................75
4.3.2 Expressão Gênica ....................................................................................................80
4.4 Amostragem Viveiros.....................................................................................................81
4.4.1 Concentração de Hg
2+
nos Tecidos .........................................................................81
xi
4.4.2 Expressão Gênica ....................................................................................................86
5. Discussão..............................................................................................................................86
5.1 Aspectos da Toxicocinética do Hg
2+
..............................................................................86
5.1.1 Hepatopâncreas........................................................................................................87
5.1.2 Músculo ...................................................................................................................89
5.1.3 Exoesqueleto............................................................................................................91
5.2 Ração ..............................................................................................................................94
5.3 Crescimento....................................................................................................................95
5.4 Expressão Gênica ...........................................................................................................97
6. Conclusões..........................................................................................................................102
7. Referências .........................................................................................................................103
xii
Índice de figuras e tabelas
Figura 1: Litopeneaus vannamei...............................................................................................20
Figura 2: Locais reservados para cada etapa do desenvolvimento dos indivíduos em cativeiro
..........................................................................................................................................23
Figura 3: Ciclo de cultura de produção de camarões da espécie L. vannamei no Brasil
(Adaptado de Guia Purina, 2002).....................................................................................24
Figura 4: Relação das concentrações dos metais traço nos organismos, suas atividades e ação
tóxica (adaptado de Förstner & Wittman, 1981). .............................................................34
Figura 5: Ciclo do mercúrio e acumulação nas teias alimentares. Adaptado de
http://www.amartorell.com/html/public/entitats?id=35&showContent=NOTICIES&cont
ent=48457.........................................................................................................................41
Figura 6: Esquema da estrutura da proteína metalotioneína. Em destaque as moléculas de
cisteína (vermelho) e ligações tetraédricas formadas com o metal, representado pelo
cádmio (Adaptado de S. J. Lippard & Berg 1994). ..........................................................46
Figura 7: Vista de satélite da fazenda onde foram realizadas as coletas e seu entorno,
destacando-se o Rio Jaguaribe ao lado esquerdo. Fonte: Google Earth...........................52
Figura 8: Viveiros onde foram coletados os indivíduos e respectivas identificações. Fonte:
Google Earth.....................................................................................................................53
Tabela 1: Informações de cada um dos viveiros onde foram realizadas as coletas dos camarões
na fazenda COMPESCAL................................................................................................53
Figura 9 A: Foto de pós-larvas presentes no berçário da fazenda COMPESCAL; B: Berçário
no complexo de cultivo da fazenda COMPESCAL. ........................................................54
Figura 10: Coleta dos indivíduos..............................................................................................55
Figura 11: Retirada dos Tecidos...............................................................................................56
Tabela 2: Características dos experimentos em laboratório. ....................................................59
xiii
Figura 12: Esquematização do experimento intensivo e extensivo, com destaque para alocação
de cada grupo de animais nos tanques..............................................................................60
Figura 13 – Relação entre o peso total do animal e peso dos tecidos (hepatopâncreas, músculo
e exoesqueleto) em camarões L. vannamei. .....................................................................65
Figura 14: Alinhamento do fragmento de β-actina...................................................................66
Figura 15: Alinhamento do fragmento de MT amplificado por QPCR (L.
vannamei_MT_MOS) com as MTs depositadas no GENE BANK (L. vannamei MT_GB;
H. americanus MT_GB)...................................................................................................67
Figura 16: Concentração de Hg
2+
em rações usadas no experimento intensivo.......................68
Figura 17: Concentrações de Hg
2+
encontradas nos diferentes tecidos dos camarões cultivados
em condições intensivas. ..................................................................................................69
Tabela 3: Carga total de Hg2+ nos tecidos dos camarões cultivados em condições intensivas.
..........................................................................................................................................70
Figura 18: Massa ganha (g) dos camarões durante os 70 dias de experimentação em condições
intensivas. .........................................................................................................................70
Figura 19: Correlação entre Hg
2+
nas rações e músculos dos animais submetidos a condições
intensivas de cultivo. ........................................................................................................72
Figura 20: Correlação entre Hg
2+
nas rações e exoesqueletos dos animais submetidos a
condições intensivas de cultivo. .......................................................................................72
Figura 21: Correlação entre Hg
2+
nas rações e hepatopâncreas dos animais submetidos a
condições intensivas de cultivo. .......................................................................................73
Figura 22: Distribuição de Hg
2+
entre o músculo e hepatopâncreas e músculo e exoesqueleto
nos camarões experimento em condições intensivas de cultivo.......................................73
Figura 23: Expressão relativa do gene metalotioneína/β-actina no hepatopâncreas, músculo e
larvas dos camarões submetidos a condições intensivas de cultivo. ................................74
xiv
Figura 24: Concentração de Hg
2+
nas rações usadas no experimento extensivo......................75
Figura 25: Concentrações de Hg
2+
encontradas nos diferentes tecidos dos camarões cultivados
em condições intensivas. ..................................................................................................76
Tabela 4: Carga total de Hg
2+
nos tecidos dos camarões cultivados em condições extensivas.
..........................................................................................................................................76
Figura 26: Massa ganha (g) dos camarões durante os 70 dias de experimentação em condições
extensivas. ........................................................................................................................77
Figura 27: Correlação entre Hg
2+
nas rações e músculos dos animais submetidos a condições
extensivas de cultivo.........................................................................................................78
Figura 28: Correlação entre Hg
2+
nas rações e exoesqueletos dos animais submetidos a
condições extensivas de cultivo........................................................................................78
Figura 29: Correlação entre Hg
2+
nas rações e hepatopâncreas dos animais submetidos a
condições extensivas de cultivo........................................................................................79
Figura 30: Correlação entre Hg2
+
nas rações com o crescimento dos camarões expostos no
experimento intensivo (peso inicial- 0,9 g) e extensivo (peso inicial- 2,4 g)...................79
Figura 31: Distribuição de Hg
2+
entre o músculo e hepatopâncreas e entre músculo e
exoesqueleto nos camarões submetidos a condições extensivas de cultivo. ....................80
Figura 32: Expressão relativa do gene metalotioneína do músculo e hepatopâncreas dos
camarões submetidos a condições extensivas de cultivo. ................................................81
Figura 33: Concentrações de Hg
2+
encontradas nos diferentes tecidos dos camarões coletados
nos viveiros da fazenda COMPESCAL. ..........................................................................82
Tabela 5: Carga total de Hg
2+
nos tecidos dos camarões amostrados na fazenda COMPESCAL
..........................................................................................................................................82
Figura 34: Peso médio dos camarões coletados na fazenda COMPESCAL, em diferentes
estágios de desenvolvimento. ...........................................................................................83
xv
Figura 35: Correlação entre os dias de cultivo e Hg
2+
nos músculos dos camarões retirados
dos viveiros da fazenda COMPESCAL. ..........................................................................83
Figura 36: Correlação entre os dias de cultivo e Hg
2+
nos exoesqueletos dos camarões
retirados dos viveiros da fazenda COMPESCAL. ...........................................................84
Figura 37: Correlação entre os dias de cultivo e o Hg
2+
no hepatopâncreas dos camarões
retirados dos viveiros da fazenda COMPESCAL. ...........................................................84
Figura 38: Correlação entre os dias de cultivo e o Hg
2+
e peso médio dos camarões retirados
dos viveiros da fazenda COMPESCAL. ..........................................................................85
Figura 39: Distribuição de Hg
2+
entre o músculo e hepatopâncreas e músculo e exoesqueleto
nos camarões experimento em moldes extensivos de cultivo. .........................................85
Figura 40: Expressão relativa do gene metalotioneína do músculo e hepatopâncreas dos
camarões coletados nos viveiros da fazenda COMPESCAL. ..........................................86
xvi
Resumo
A carcinicultura vem tomando grandes proporções ao longo dos anos e se tornou a
vertente da aqüicultura que gera maior receita em todo o globo. A própria atividade pode ser
considerada fonte de contaminantes que podem entrar via ração, pelos corpos d’água que
abastecem os viveiros, ou até junto com fertilizantes, algicidas e pesticidas usados
normalmente no cultivo de camarão. Devido ao uso indiscriminado e a má qualidade dessas
substâncias, os metais traço passaram a ser encontrados normalmente nos efluentes, viveiros e
camarões das fazendas produtoras, representando risco ambiental quando se encontram acima
dos seus níveis basais. Como já havia sido evidenciada a presença de metais traço no cultivo,
o nosso objetivo foi medir por absorção atômica mercúrio nas rações e correlacionar as
concentrações no hepatopâncreas, músculo e exoesqueleto. Outro objetivo era verificar a
regulação do gene metalotioneína com o metal encontrado nas rações. Um grupo de
organismos foi coletado nos próprios viveiros, enquanto outros foram submetidos a condições
intensivas e extensivas de cultivo, sendo alimentados durante 70 dias por apenas uma marca
de ração comercial. Todas as marcas de rações analisadas apresentaram contaminação por
Hg
2+
, com concentrações variando em diferentes lotes (15 ng.g
-1
– 121 ng.g
-1
). Foi observado
acúmulo em todos os tecidos e tipos de experimentação, alguns deles correlacionados
significativamente, com as concentrações encontradas nas rações. A metalotioneína não
sofreu variação na expressão relativa em nenhum dos experimentos, sugerindo a atuação de
outros sistemas de destoxificação, que a expressão possa estar sendo regulada nas primeiras
semanas de contato com a ração ou que as concentrações de Hg
2+
não foram suficientes para
ativar a transcrição do gene. O crescimento dos indivíduos não foi influenciado pelas
concentrações de mercúrio nas rações, além dos níveis de Hg
2+
encontrados nos indivíduos
estarem abaixo do permitido pela legislação brasileira (500 ng.g
-1
).
xvii
Abstract
The prawn farming activity has been growing over the years and becoming the branch
of aquaculture which makes one of the most incomes across the globe. The activity itself can
be considered a source of contaminants that may enter through diet, water bodies that create
the pounds, or even fertilizers, and pesticides, and algicidies normally used in the shrimp
culture. Due to the indiscriminate use and poor quality of these insume, trace metals were
recently found in waste waters, pounds, and farmed shrimps which represent environmental
risk when they are above their threshold levels. It was already demonstrated the presence of
trace metals on prawn farming, our aim was to measure mercury by atomic absorption in
feeding samples and correlate its concentrations in hepatopancreas, muscle, and exoskeleton
of the shrimps. The second goal was to verify the regulation of metallothionein gene with the
metal found in feed. A group of organisms was collected in their pounds, while others were
submitted to extensive and intensive cultivation conditions, being fed for 70 days with a
single brand of commercial feed. All brands were contaminated with Hg
2+
, including different
batches (15 ng.g
-1
– 121 ng.g
-1
). The Hg
2+
accumulation was observed in all tissues and types
of experiments and some of them were significantly correlated with the concentrations found
in the ration. The metallothionein suffered no variation in its relative expression in any of the
experiments, suggesting that other detoxification systems were activated, it could have been
regulated in the first weeks of contact with feed or the Hg
2+
concentrations were not sufficient
to activate the gene transcription. Furthermore, the levels of Hg
2+
found in individuals were
below the level established by Brazilian regulation (500 ng.g
-1
).
18
1. Introdução
A carcinicultura é o segmento mais bem sucedido da aqüicultura mundial, fazendo
parte da economia e estabelecida em mais de 50 países. O cultivo de camarões possui um
caráter industrial na maioria das vezes, utilizando recursos encontrados normalmente no meio
ambiente e transformando-os em produtos de alto valor agregado para a sociedade. Assim,
como toda a atividade extrativista o cultivo de camarão acaba por gerar rejeitos que muitas
vezes são lançados no ambiente diretamente sem tratamento adequado. É importante citar a
entrada de nutrientes nos corpos receptores de água, causando a eutrofização dos rios que
alimentam os viveiros devido à alta quantidade de ração provenientes da cultura, e a
contaminação de lençóis freáticos por chorume que aparecem no processo de decomposição
das cabeças dos camarões enterradas sem nenhuma preparação da área. A implantação da
carcinicultura, algumas vezes pode vir a alterar física e funcionalmente as áreas costeiras,
devido às modificações realizadas no curso dos corpos d’água (transposições) e aterramento
de áreas para o estabelecimento dos viveiros. Quando o cultivo é mal gerido, o ambiente é
incapaz de sustentar a própria atividade ficando assim fadada a escassez tanto da produção,
quanto dos recursos que eram disponíveis anteriormente.
Apesar de todos os possíveis transtornos que a atividade criatória de camarão pode vir
a causar nos ecossistemas, a carcinicultura gera uma receita mundial de US$ 6,1 bilhões, que
representa 12% do valor total gerado atualmente pela indústria aquícola (ABCC, 2002).
Com esses fatos, inicia-se então um problema que hoje atinge grandes proporções nas
áreas costeiras, sobretudo nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte, e que se caracteriza
como um conflito de ecossustentabilidade. Este conflito se materializa através de duas
correntes, uma que considera a possibilidade do desenvolvimento sustentável da
carcinicultura, e outra que, comprovada pela histórica destruição de manguezais em países
19
onde o cultivo de camarões marinhos se instalou na década de 70, não acredita na
sustentabilidade desta atividade.
1.1 Histórico da Carcinicultura
O cultivo do camarão marinho originou-se no sudoeste da Ásia, onde pescadores da
região aprisionavam pós-larvas em viveiros construídos na costa, até estas chegarem à fase
adulta. Somente na década de 30 essa atividade atingiu novo patamar com a obtenção de
desovas e pós-larvas de Penaeus japonicus em laboratório.
Após a obtenção das pós-larvas em laboratório, entre 1930 e 1965 apareceram as
primeiras fazendas de cultivo no Japão, que devido ao crescimento acabou por expandir as
pesquisas na China, Taiwan, França e Estados Unidos até o ano de 1975. Com o avanço das
técnicas que envolviam o cultivo e o aumento da produção, a carcinicultura apresentou
aumento em sua produtividade atraindo investidores nos meados da década de 80. O avanço e
crescimento da atividade tiveram sua primeira crise durante os anos 90, aonde surgiu uma
virose inicialmente em Taiwan, provocando queda de 75% na produção daquele país. O vírus
foi posteriormente identificado como vírus da síndrome da mancha branca (vírus de DNA-
imaviridae; Whispovirus). O vírus atravessou continentes, acredita-se por nauplios (primeiro
estágio após eclosão dos ovos) infectados ou camarões congelados, causando perdas no
Equador, Panamá e Peru até o ano de 2005. Atualmente, realizam-se investimentos pesados
em pesquisas focando a qualidade da água e o melhoramento genético das espécies cultivadas,
visando aumentar sua resistência em cativeiro. Os camarões marinhos cultivados pertencem à
família Penaeidae com duas espécies dominantes, P. monodon, no Oriente e o Litopenaeus
vannamei, no Ocidente.
No Brasil, essa atividade teve início em 1973, no Rio Grande do Norte, com o “Projeto
Camarão” criado pelo governador Cortez Pereira, como o objetivo de tentar repatriar
20
funcionários de diversas salinas, já que o estado estava passando por um das maiores secas de
sua história, gerando prejuízo e desemprego na indústria salineira. A princípio a idéia do
governador foi boa, mas devido ao fracasso das pesquisas nas áreas de reprodução,
produtividade e resistência a doenças, a produção de camarão no Brasil ficou praticamente
estagnada até a década de 90. Após esse primeiro obstáculo, a iniciativa privada nacional
optou por importar um pacote pronto de cultivo e gestão. É quando aparece a espécie
Litopenaeus vannamei (Figura 1), cultivada com sucesso no Equador e adaptável às mais
variadas condições ambientais. A afirmação da carcinicultura como um agronegócio se deu
graças a dois importantes fatores: um nível de rentabilidade capaz de atrair investidores, e a
fundação de laboratórios comerciais de produção de pós-larvas. No Brasil, entre 1997 e 2003,
a área cultivada aumentou 294,6%, a produtividade cresceu 540,4% e a produção deu um
salto de 2.527,7%, transformando o Brasil no maior produtor do continente sul americano. A
taxa de expansão da cultura no Brasil foi de 20% ano, crescimento esse que deu ao país a
liderança em produtividade em cultivos semi-intensivos. 70% da produção das fazendas
brasileiras são destinadas ao mercado externo, atividade que reflete o aumento de divisas para
o país. Os resultados citados atendem as metas traçadas em 2001 pelo Programa Nacional de
Apoio ao Camarão Marinho, especialmente quanto aos quesitos geração de renda, emprego e
divisas para o país.
Figura 1: Litopeneaus vannamei
1 cm1 cm
21
Mas nos últimos anos, o país vem apresentando retrocessos na carcinicultura, devido à
diminuição da produtividade. Em 2005 foram mais de 39 ton, com redução para 29 toneladas
em 2006, e não chegaram a 16 ton em 2007 (ABCC).
1.2 O Projeto Recarcine
Com o objetivo de manter uma rede integrada de conhecimento na área da
carcinicultura foi criada em 2004 a Rede de Carcinicultura do Nordeste – Recarcine
financiada pela FINEP e o CNPq. A proposta das agências de fomento dos projetos foi uma
divisão em sub-redes avaliadas em duas fases. A FINEP propôs as seguintes linhas de
pesquisa: Enfermidades, Nutrição, Manejo e Ecologia de Viveiros, Efluentes,
Sustentabilidade Ambiental, Qualidade de Água e do Solo e Estruturação. As instituições que
ganharam, através de editais, a participação nos projetos foram UFPE, UFRPE, IPA, UFPB,
UFRN, UFERSA, UFC, EMBRAPA, EMPARN e UESC. Levando em conta as áreas
abrangidas por todos os projetos integrantes do Recarcine, o objetivo geral da rede em si é de
articular grupos de pesquisa e setor produtivo, para identificar as necessidades da
carcinicultura, e apoiar projetos de pesquisa que resolvam problemas em curto prazo.
A relevância da carcinicultura como fonte geradora de emprego por unidade de área
trabalhada se fundamenta no estudo realizado por pesquisadores do Departamento de
Economia da Universidade Federal de Pernambuco, o qual demonstrou que essa atividade
supera todas as demais congêneres do setor primário (Sampaio & Costa, 2003). O cultivo de
camarão gera direta e indiretamente 1,89 e 1,86 empregos por hectare respectivamente,
enquanto a cultura da cana-de-açúcar, por exemplo, apresenta 0,35 direta e 0,70
indiretamente. Cerca de 88% do trabalho oferecido pela carcinicultura é ocupado por mão-de-
obra sem qualificação profissional, representada principalmente por pescadores artesanais,
salineiros, trabalhadores rurais, entre outros. Além disso, destaca-se o fato de que a mão-de-
22
obra feminina nas indústrias de beneficiamento do camarão já ocupa 14% das oportunidades
de trabalho geradas pelo setor.
Um outro estudo realizado pelo mesmo grupo (Sampaio et al., 2005), concluiu que a
carcinicultura representa uma contribuição muito positiva para a elevação e estabilidade do
emprego, renda e receita municipal. Foi verificada uma melhoria das condições de vida nesses
municípios, destacando a participação da população economicamente ativa (PEA) no setor.
Em Aracati-CE, local onde foi realizada a coleta das amostras para o desenvolvimento dessa
dissertação, a carcinicultura gera um total de 3.667 empregos, 9,8% do PEA, 38% do PIB e
11,7% da receita tributária.
1.3 O Cultivo
O L. vannamei, também conhecido como camarão branco do Pacífico, é atualmente a
única espécie de camarão marinho cultivada comercialmente no Brasil. Isto se deve a boa
adaptação, rusticidade e crescimento em todas as fases do processo produtivo. O ciclo de
produção é composto por três fases: larvicultura, berçário e engorda (Figura 2). Os melhores
camarões originários das próprias fazendas de engorda são selecionados para servir de
reprodutores, e transferidos para laboratórios especializados na produção de larvas chamados
de larviculturas.
No laboratório leva-se cerca de 11 a 21 dias da eclosão até as pós-larvas (Pl
11
-Pl
21
),
estágio em que os camarões se encontram prontos para engorda. As pós-larvas são cultivadas
em tanques berçários por um curto período, precedendo o início da engorda nos viveiros. Os
tanques berçários intensivos são circulares ou retangulares, dispostos em uma área aberta,
sendo que na sua grande maioria, construídos de alvenaria com uma profundidade de 1 a 2 m,
operando com um volume de água variando entre 30 e 80 mil litros. Os tanques de alvenaria
são pintados internamente com tinta epóxi dotados de um sistema aéreo ou submerso de
23
oxigenação constante e de movimentação vertical e circular de água, sendo preparados 5 dias
antes do recebimento das pós-larvas, consistindo basicamente na limpeza, desinfecção
(solução de cloro ou ácido muriático a 10 %) e enchimento do tanque seguido da fertilização
da água de cultivo (com superfosfato triplo, fosfato monoamônia, calcário dolomítico) para
aumento da produção primária que contribuirá como alimento para os camarões jovens. A
alimentação nessa fase consiste de ração que pode ser ofertada de forma exclusiva ou em
combinação com biomassa de Artemia ou carne triturada de molusco.
Figura 2: Locais reservados para cada etapa do desenvolvimento dos indivíduos em cativeiro
Após essa fase, as pós-larvas são transferidas para viveiros de engorda escavados em
terra com áreas < 2 ha e com profundidades próximas a 1,5 m. Para receber as pós-larvas
provenientes dos berçários, os viveiros de engorda são submetidos à secagem, limpeza e
desinfecção com hipoclorito de cálcio, calcário, cal virgem ou cal hidratada. Em seguida é
feita a adubação ou fertilização com uréia, superfosfato triplo, superfosfato simples e sulfato
de amônia, dentre outros. Aplicações subseqüentes podem ser realizadas ao longo do ciclo de
24
produção visando à manutenção da transparência da água ao nível ideal. Os camarões que
foram submetidos à fase de berçário são povoados nos viveiros de engorda geralmente com
uma idade superior a PL
20
(pós-larva com 20 dias de idade) e peso corporal inferior a 0,5 g,
sendo que nessa fase os indivíduos já são alimentados por ração (Figura 3). Os camarões de
cultivo são em grande parte despescados para comercialização dentro de 90 a 120 dias de
engorda, quando atingem um peso de 12 g, mas na verdade, o momento adequado para
realizar a despesca é às vezes um tanto imprevisível. Durante todo o ciclo, o cultivo deve ser
monitorado em todos os seus aspectos, desde aqueles relacionados à biosegurança até os
associados com o desempenho zootécnico dos camarões e as condições ambientais do cultivo
(Guia Purina, 2002).
Figura 3: Ciclo de cultura de produção de camarões da espécie L. vannamei no Brasil (Adaptado de Guia Purina,
2002).
Tanque
Berçário
PL
11
-PL
21
Tanque de
maturação
PL
20
/ 0,5g
Viveiro de
Engorda
12 – 15 g
Despesca
90 a 120 dias
Larvicultura
16 a 21 dias
Tanque
Berçário
PL
11
-PL
21
Larvicultura
PL
11
-PL
21
Tanque de
maturação
PL
20
/ 0,5g
Tanque de
maturação
Juvenil
0,5g
Viveiro de
Engorda
12 – 15 g
Viveiro de
Engorda
12 – 15 g
Despesca
90 a 120 dias
Despesca e
Beneficiamento
Larvicultura
16 a 21 dias
Tanque Berçário
Náuplio
1 mês
10 a 21 dias
2 a 4 semanas
3 a 6 meses
Tanque
Berçário
PL
11
-PL
21
Tanque
Berçário
PL
11
-PL
21
Tanque de
maturação
PL
20
/ 0,5g
Tanque de
maturação
PL
20
/ 0,5g
Viveiro de
Engorda
12 – 15 g
Viveiro de
Engorda
12 – 15 g
Despesca
90 a 120 dias
Despesca
90 a 120 dias
Larvicultura
16 a 21 dias
Larvicultura
16 a 21 dias
Tanque
Berçário
PL
11
-PL
21
Larvicultura
PL
11
-PL
21
Tanque de
maturação
PL
20
/ 0,5g
Tanque de
maturação
Juvenil
0,5g
Viveiro de
Engorda
12 – 15 g
Viveiro de
Engorda
12 – 15 g
Despesca
90 a 120 dias
Despesca e
Beneficiamento
Larvicultura
16 a 21 dias
Tanque Berçário
Náuplio
1 mês
10 a 21 dias
2 a 4 semanas
3 a 6 meses
25
1.4 Danos ao Meio Ambiente
As fazendas de camarão sempre foram vistas como o maior vilão do desmatamento
dos manguezais, restingas e áreas costeiras protegidas pela legislação ambiental. Países do
terceiro mundo, que sofreram influências significativas de grandes empreendedores, acabaram
por devastar uma considerável parte de seus patrimônios naturais. A Indonésia, por exemplo,
converteu cerca de 34.000 hectares de tambak - sistemas de cultivo de peixes e camarão - em
sistemas intensivos acarretando na perda de nutrientes anteriormente encontrados
naturalmente. Casos como esse também ocorreram nas Filipinas, Taiwan, China e Índia. Mais
próximo de nós, o Equador cortou 57.5% de sua cobertura de bosques de manguezais e
instalou cultivos intensivos de camarão. O Brasil apresentou um padrão de expansão
diferenciado no que se diz respeito às instalações das fazendas. Grande parte dos viveiros
aproveitaram espaços que estavam reservados anteriormente para as indústrias salineiras,
deixando assim de usar áreas de manguezais e restingas.
Lacerda et al., (2006) mapearam detalhadamente as áreas de mangue do Nordeste
brasileiro, com o objetivo de determinar a real situação dessas áreas e fornecer informações
sobre a dinâmica ambiental da área litorânea. A redução na sua distribuição e extensão podem
ter influência negativa na ecologia local, inclusive na produtividade primária e na preservação
pesqueira.
Os manguezais são formações florestais que ocorrem em áreas abrigadas do litoral
tropical, no ponto de contato entre o continente e o mar. Embora sua área seja relativamente
pequena, a interface entre o continente e o mar é um dos ambientes mais dinâmicos do
planeta. A zona costeira é hoje a região de maior densidade populacional do globo,
hospedando grande parte das áreas urbanas e regiões industriais.
26
Para se desenvolver em um ambiente tão dinâmico, os manguezais devem apresentar
elevado grau de resilência (capacidade de retomar rapidamente ao seu ponto original de
equilíbrio após um distúrbio), adaptando-se as características estruturais de acordo com as
feições do litoral e com as forças dominantes em um dado período. As áreas de manguezal
vêm sofrendo alterações significativas ao longo da costa Brasileira, sobretudo em razão de
ações humanas diretas e ilegais, como o desmatamento para desenvolvimento urbano,
atividades turísticas e de maricultura. Outros fatos como a construção de barreiras, barragens,
retirada de água para abastecimento e irrigação alteram o fluxo de água e sedimentos para o
mar.
O avanço dos mangues para o interior é condicionado pela penetração de águas
salinas, que acabam impedindo a colonização das margens dos rios por matas ciliares e outros
tipos de vegetação que não suportam concentrações tão elevadas de sal. No mar, os
manguezais são limitados pela energia erosiva das ondas e pelo soterramento por areias
trazidas por ventos e correntes marinhas. Os manguezais foram mapeados pela primeira vez
na década de 70 pelo oceanógrafo Renato Herz, do Instituto Oceanográfico da Universidade
de São Paulo (USP), que publicou o primeiro Atlas dos manguezais do país que recebeu o
nome de Manguezais do Brasil. Na década de 80 e 90, foram feitos mapeamentos de vários
estados do Nordeste, com diferentes graus de detalhe. Esses estudos foram compilados em
1993 pela Sociedade Internacional para Ecossistemas de Mangue em seu programa de
conservação e uso sustentável de manguezais. Os autores observaram grandes variações nas
áreas de manguezais dos estados nordestinos. Em comparação com valores de 1978, o
aumento da área foi significativo: 36% (152 Km
2
). Os maiores incrementos foram os
registrados em Pernambuco (67%), Paraíba (40%) e Piauí (35%). Mas se a comparação for
feita com levantamentos das décadas de 1980 e 90, nota-se uma redução da área de mangue
em alguns estados, principalmente Ceará (-24%) e Paraíba (-5%). Ainda assim, as áreas
27
registradas nesse período, no que diz respeito à área total, são maiores em ate 13% em relação
ao mapeamento de 1978.
A expansão dos manguezais em alguns trechos do litoral nordestino está longe de
revelar a adequada aplicação das leis de proteção ao ambiente, mas sim é um provável reflexo
das mudanças ocorridas na região. Dentro desse escopo pode-se identificar: redução de até
10% na quantidade anual de chuva e aumento em escala global do nível dos oceanos. Esses
dois fatores acabam resultando em vazões fluviais menores e maior penetração de águas
marinhas nos estuários. Vale também ressaltar que, cerca de 90% do fluxo dos rios no
Nordeste é controlado artificialmente e retido em barragens, açudes e represas. Ficou claro no
estudo que embora os manguezais continuem se expandindo em diversos estuários dessas
áreas, houve uma redução expressiva de mangues para fins de urbanização devido à
especulação imobiliária.
Quando o tema de discussão é direcionado para os danos que a carcinicultura causa ao
meio ambiente, identificamos seis elementos básicos do ecossistema natural afetados pela
implantação/operação de fazendas de camarão marinho. São eles: 1- Impactos sócio-culturais,
resultando modificações no padrão de vida e nas atividades de subsistência das comunidades
(normalmente rurais), localizadas no entorno do empreendimento (Diegues, 1991; Larsson et
al., 1994); 2- Impactos sobre a flora, resultando em supressão e degradação de manguezais e
restinga (Philips et al., 1993; Primavera, 1993, 1994); 3- Impactos sobre o solo, como os
resultantes da salinização (Primavera, 1991; Bhatta & Bhat, 1998); 4- Impactos sobre a água,
podendo resultar em hipernutrificação, eutrofização, aumento de DBO, aumento de sólidos,
totais em suspensão (Chamberlain, 1998), aumento da toxicidade e possibilidade de
bioacumulação ou resistência a substâncias químicas (Björklund et al., 1990; Saitandu et al.,
1994; Srisomboon); 5- Impactos em escala macro, envolvendo ecossistemas vizinhos, tais
como: alterações nos estoques pesqueiros (Folke & Kautsky, 1992; Monaghan, 1992) e no
28
equilíbrio hidrodinâmico dos estuários, alteração do aporte de sedimentos terrígenos e
materiais suspensos e dissolvidos (Boto & Bunt, 1981), assim como a mortandade de bancos
coralinos por aporte de material em suspensão, devido à alteração de correntes costeiras
(Beveridge et al., 1991).
A verdade é que os dados advindos da carcinicultura são relacionados com a instalação
e manejo das fazendas, e muito pouco se tem pesquisado sobre os efeitos ambientais do
processo de beneficiamento. Uma série de modificações como melhoria das rações, sistemas
de oferta e redução de água e planejamento das fazendas estão sendo implementados para que
a atividade carcinicultora possa, cada vez menos, ser fonte efetiva de efeitos deletérios ao
meio ambiente. Por isso medidas compensatórias e mitigadoras são de extrema importância
para a manutenção da atividade propriamente dita.
A própria carcinicultura pode ser fonte de uma série de contaminantes, que entram
principalmente via ração e passam a fazer parte do cultivo. Tradicionalmente, a maioria das
fazendas de camarão, usam águas costeiras ou de corpos d’água continentais, como rios, para
alimentar os viveiros. No entanto, próximos à costa, esses corpos podem estar contaminados
por diversos tipos de poluentes e patógenos devido à atividade antrópica (Chua, 1992; Paez-
Osuna & Mayen, 1996). Os fertilizantes utilizados como suplemento de nutrientes nos
tanques não são suficientemente purificados durante o processo de manufatura e assim podem
conter várias impurezas, dentre elas os metais traço. Além dos fertilizantes, nos pesticidas e
algicidas, os metais traço fazem parte, freqüentemente, de seus compostos ativos (Gimeno-
García et al., 1996, Boyd & Massaut, 1999). O uso indiscriminado desses compostos com o
objetivo de melhorias no cultivo, acabam por deteriorar a cultura em si e contaminar outros
sistemas biológicos. O excesso de metais traço em solos de tanques de aqüicultura pode ser
freqüentemente causado por uso de fertilizantes e metalo-pesticidas (Gimeno-García et al.,
1996). O gerenciamento desses produtos é necessário para prevenir perdas massivas da
29
produção, sendo importante associar o uso dos mesmos com a demanda biológica dos
organismos, caso contrário, a saúde dos camarões, bem como a saúde dos consumidores,
podem ser comprometidas (Bainy, 2000).
1.5 A Entrada de Contaminantes no Cultivo
A carcinicultura é uma atividade que se expandiu consideravelmente nos últimos anos,
sendo que a produção nacional em 2003 foi de 90.190 toneladas, consolidando o Brasil na
posição líder do hemisfério ocidental. A produção do camarão L. vannamei vem crescendo em
ritmo acelerado no Estado do Ceará, sendo o Brasil hoje, o sexto maior exportador em
toneladas naquele período (fonte-FIEC). Vale ressaltar que 95,2 % dessa produção foi gerada
no Nordeste do Brasil, tendo o próprio Estado do Ceará como o segundo maior produtor,
contando com um total de 185 fazendas em operação que produziram 25.915 t (Rocha et al.,
2004). Segundo Gesteira et al. (2003), 43,1 % desses empreendimentos estão localizados na
parte inferior da bacia do Rio Jaguaribe. Os dados do censo de 2003 revelam a tendência que
tem sido registrada nos últimos anos de um crescimento moderado da carcinicultura nacional
em área produtiva e número de produtores (Rocha et al., 2004).
O rápido crescimento de fazendas de cultivo intensivo e a necessidade de introduzir
grandes quantidades de alimentação artificial, fertilizantes e outros aditivos químicos como
reguladores de acidez e algicidas acabam por contaminar os corpos d’água e os animais com
substâncias nocivas. Muitas vezes, o agente tóxico pode ser parte integrante de um pesticida,
algicida ou até oriundo da ração usada no próprio cultivo. Com o passar dos anos, o
ecossistema aquático vem sendo duramente castigado com contaminação por metais traço,
que podem ser provenientes de fontes naturais, agricultura a nível industrial e de subsistência,
assim como de locais beneficiadores de diversos tipos de minério (Ayas & Kalonkya 1996;
Han et al. 2002). Os metais traço, estão sendo encontrados como impurezas nos fertilizantes,
30
rações e pesticidas (Boyd & Massaut, 1999; Tacon & Forstner, 2003), mas não são
contaminantes encontrados normalmente em efluentes de fazendas de cultivo de camarão.
É de extrema importância que a atividade seja sustentável, e para tanto é necessário o
monitoramento de variáveis que venham a prejudicar o meio ambiente e/ou o
desenvolvimento do cultivo propriamente dito. A preocupação com a contaminação de metais
traço na carcinicultura tem levado a realização de estudos com o propósito de medir a
concentração de metais em espécies comerciais, avaliar níveis potencialmente perigosos para
nutrição humana e fornecer suporte para monitoramento ambiental (Páez-Osuna & Ruiz-
Fernández, 1995a; Páez-Osuna & Tron-Mayen, 1996).
Trabalhos anteriores mediram as concentrações de metal presente nos camarões e rações
usadas nas principais fazendas do Ceará, e mostraram presença relativamente alta de cobre
(Cu
2+
), sugerindo efeitos deletérios na produtividade (Lacerda et al., 2004). O grupo analisou
diferentes marcas de ração que mostraram concentrações de Cu
2+
variando de 13,1 a 79,0
g.g
-1
. Nos fertilizantes, a contaminação ficou entre 0,7 e 2,0 g.g
-1
. Devido à grande
quantidade de ração empregada no cultivo, elas acabam por ser as maiores contribuintes na
introdução desse contaminante na cultura.
Nos fertilizantes, os metais traço encontram-se tanto sob a forma de princípios ativos
quanto como impurezas. Os fertilizantes, na forma de superfosfato e uréia, são as principais
fontes de metais que ocorrem na forma de impurezas. Estas impurezas derivam das rochas
fosfáticas (fosforita) utilizadas na produção dos adubos, as quais possuem teores de metais
associados a fosfatos e incorporados ao insumo durante o processo de produção. No caso do
superfosfato, os teores de metais variam de acordo com a origem da matéria prima utilizada
na sua produção e seu processo de manufatura (Mortvedt, 1996).
31
Existem fazendas que utilizam compostos de Cu
2+
para eliminar protozoários externos e
bactérias filamentosas causadoras de doenças em pós-larva de camarão. Eles também são
utilizados para inibir o crescimento do fitoplâncton (Gräslund & Bengtsson, 2001).
A adição de insumos em viveiros pode ser ajustada para as necessidades reais. Caso isso
não ocorra, o excesso deve ser depositado no fundo dos viveiros e resultar em uma
acumulação de metais traço no solo. Mudanças nas condições físico-químicas do viveiro
podem eventualmente disponibilizar os metais para a coluna d’água e esses se tornarem
disponíveis para serem incorporados pelos camarões. No caso das fazendas estudadas,
entretanto, não foi verificado o uso de sulfato de cobre durante este estudo.
Para minimizar o impacto de metais traço no ecossistema na própria aquacultura e nos
consumidores, estudos vêem sendo desenvolvidos com o objetivo de monitorar e detectar a
distribuição de metais traço em águas costeiras por regiões, tecidos e em animais aquáticos
(Paez-Osuna & Ruiz Fernandez 1995; Montelatto et al., 1999; Turoezy et al., 2001). A
introdução de técnicas de biologia molecular e genômica estão dando alicerce para o aumento
da qualidade e da produção da carcinicultura, além das informações oriundas, principalmente
de projetos genoma, vem acrescentando subsídios para novas linhas de pesquisa e projetos no
ramo da biotecnologia.
Os contaminantes metálicos são potencialmente tóxicos para organismos (inclusive
seres humanos) quando ultrapassarem os limites naturais no ambiente aquático. Mesmo que
os indivíduos naturalmente necessitem de alguns metais como Fe
2+
, Cu
2+
, Zn
2+
, Co
2+
, Se
2+
,
Ni
2+
, Mn
2+
em determinadas concentrações para a manutenção de suas condições fisiológicas
e bioquímicas normais, alguns metais como Hg
2+
, Cr
6+
, Pb
2+
e Cd
2+
impreterivelmente são
tóxicos para o ambiente marinho propriamente dito, assim como aos organismos que habitam
esse ecossistema, apresentando-se dissolvidos na água ou adsorvidos em materiais sólidos em
suspensão.
32
Gosavi et al., (2004) e Wu & Chen (2005) encontraram 45 e 40 mg.g
-1
de cobre em
sedimentos de viveiros na Austrália, sendo que este último associou o nível obtido nos
viveiros com ambientes altamente contaminados, por efluentes urbanos e industriais, e até
mesmo a efluentes de mineração. Trabalhos que relacionem contaminação por metais e
carcinicultura ainda são escassos, mas alguns grupos vêm demonstrando dados que apontam
baixos índices de produtividade relacionados a elevadas concentrações de metais tóxicos nos
cultivos de camarão, sendo que um dos efeitos seria o retardo no crescimento. Analisando os
efeitos da toxicidade do sulfato de cobre em juvenis de Penaeus monodon, Chen & Lin (2001)
relatam que o Cu
2+
provoca a redução de peso mais significativamente que a redução de
comprimento total. Após 75 dias de exposição ao Cu
2+
, os camarões do grupo controle
tiveram o peso 5,5 vezes maior que o inicial e os camarões expostos a concentração de 1,80
mg/L de Cu
2+
tiveram 2,6 vezes o peso maior que o inicial. Como exemplo das complicações
que a exposição a metais traço pode causar aos animais, foi sugerido por Yeh et al., (2004),
que a exposição a concentrações maiores ou iguais a 1 mg/L de Cu
2+
por 24 horas aumenta a
susceptibilidade L. vannamei ao Vibrio alginolyticus, agente etiológico de doenças infecciosas
que atingem viveiros de cultivo de camarão, pela toxicidade do metal ao hospedeiro.
O camarão é um organismo onívoro, e quando em liberdade tem uma dieta complexa e
composta de microalgas e matéria orgânica em decomposição (Dall et al., 1990). Nos
viveiros, os hábitos alimentares não são bem documentados e muitas vezes controversos
(Ogburn et al., 1986), mas a alimentação artificial oferecida aos animais pode constituir um
fator decisivo para o desenvolvimento dos indivíduos, uma vez que é a principal fonte de
nutrientes para os camarões de cativeiro. Rações contendo insumos de má qualidade ou
contaminados por metais traço não irão resultar em camarões de boa qualidade para o
beneficiamento. Devido à competitividade entre os produtores internos e outros países que
estão evoluindo nas áreas da carcinicultura, como a Ásia, são empregados diversos insumos a
33
fim de sustentar altas densidades e grandes produtividades. Estes insumos contém alguns
contaminantes, com destaques para os metais traço, que acabam por afetar diretamente o
desempenho do cultivo propriamente dito. Na mesma fazenda onde foram realizadas nossas
coletas, Lacerda et. al, (2006) observou que as concentrações de Cu
2+
variaram em até 4 vezes
de 13,1 a 79,0 µg.g
-1
e as concentrações de Zn
2+
variaram em até 2 vezes de 63,2 a 145,9
µg.g
-1
nas rações, enquanto nos insumos, concentrações de Cu
2+
variaram de 0,7 a 3,3 µg.g
-1
,
enquanto que as de Zn
2+
variaram de 0,12 a 45,7 µg.g
-1
.
1.6 Metais traço
A classe dos metais compreende o maior grupo da tabela periódica dos elementos
químicos, sendo que o termo “metal” se refere à boa condutividade elétrica e térmica. Os
elementos químicos que estão inseridos na classe de metais traço, apresentam densidade
maior que 5,0 g/cm
3
(m/v) (Förstener & Wittmann, 1981).
Os “microelementos”, que também podem ser chamados de “metais essenciais”
apresentam características fundamentais para a manutenção das atividades biológicas, uma
vez que são parte integrante de proteínas e enzimas. Devido a essa característica, mesmo
quando em concentrações traço, estes são importantes e influenciam diretamente as funções
biológicas de um dado organismo (Wittmann, 1981). São tidos como metais essenciais o
ferro, zinco, cobre, manganês, cobalto, molibdênio, selênio, cromo, níquel, estanho, lítio e
vanádio (ICRP, 1974). Os metais de transição essenciais, como zinco e principalmente o ferro
funcionam como integrantes de reações bioquímicas (ex: carboxipeptidase A e B; anidrase
carbônica; etc.) (Wittmann, 1981).
Os metais traço não-essenciais para as funções biológicas são tolerados pelos
organismos até certo nível de concentração, visto que a partir deste ponto podem causar efeito
tóxico, podendo levar o indivíduo a morte. Os elementos essenciais, são aqueles que em
34
concentrações abaixo das necessárias, podem prejudicar as atividades biológicas normais.
Pode-se notar então, que todo o elemento químico metálico pode passar a ser tóxico, seja ele
da classe dos não-essenciais ou essenciais. O que determina a toxicidade é a dose que o
organismo esta sendo submetido, como ilustrado pela figura seguinte (Figura 4) .
Figura 4: Relação das concentrações dos metais traço nos organismos, suas atividades e ação tóxica (adaptado de
Förstner & Wittman, 1981).
Quando em ambiente, os metais traço, na última parte do ciclo hidrológico tem como
destino os sedimentos oceânicos, que são removidos da coluna d’água e precipitam para o
sedimento, onde permanecerão por alguns milhares de anos antes de retornarem ao ciclo. As
três principais vias de entrada de metais traço no oceano são pelos rios, atmosfera e fontes
hidrotermais (Salomons & Forstner, 1984). Geologicamente, a ação da erosão em rochas com
composições metálicas diferentes, acabou resultando em sedimentos constituídos por metais
traço em diferentes proporções (Leinz & Amaral, 1978), que uma vez depositados no
sedimento também passou a ser um integrador da variação das concentrações ambientais dos
metais traço (Föstner, 1983).
carência saudável tóxico letal
Concentração
Elementos
Essenciais
tolerável tóxico
Concentração
Elementos
Não-essenciais
letal
Manutenção, Crescimento
carência saudável tóxico letal
Concentração
Elementos
Essenciais
tolerável tóxico
Concentração
Elementos
Não-essenciais
letal
carência saudável tóxico letal
Concentração
Elementos
Essenciais
tolerável tóxico
Concentração
Elementos
Não-essenciais
carência saudável tóxico letal
Concentração
Elementos
Essenciais
tolerável tóxico
Concentração
Elementos
Não-essenciais
letal
Manutenção, Crescimento
35
1.6.1 Metais traço e Crustáceos
Espécies de invertebrados estuarinos e costeiros que são submetidos a metais tóxicos
biodisponíveis, como por exemplo, o zinco e cobre, sofrem pressão seletiva para
desenvolverem adaptações fisiológicas com o objetivo de diminuir os danos causados por
esses metais traço. Populações de crustáceos que vivem em ambientes reconhecidos como
recebedores de metais, provavelmente irão apresentar características em seus processos
fisiológicos que irão culminar em uma maior tolerância a esses metais. Uma das mudanças
etológicas seria a redução na ingestão do metal que está dissolvido na água. Hashmi et al.,
(2002), sugeriu complexidade na entrada e retenção do metal pelos organismos, sendo que a
acumulação do metal vista no trabalho foi diretamente proporcional à entrada de Cu
2+
na água
dos viveiros, ou seja, cobre alto no músculo – cobre alto na água dos tanques.
Quando em contato com crustáceos, os metais podem seguir duas rotas, sendo uma delas
passiva e outra dependente de transporte ativo. Na difusão facilitada, eles se ligam a proteínas
de superfície da membrana epitelial e são transportados através de uma cascata
termodinâmica, onde os ligantes apresentam afinidades crescentes pelo metal. Alguns metais
podem seguir rotas de entrada para outros elementos, como é o caso de cádmio que pode
entrar através de Ca
2+
-ATPase localizadas na membrana celular epitelial (Rainbow, 1997). Os
invertebrados possuem uma variedade de vias de destoxificação celular que reduzem a
concentração de metais potencialmente tóxicos na hemolinfa (equivalente ao sangue nos
vertebrados). Essas vias incluem: 1- Mecanismos fisiológicos que regulam os níveis de
excreção com a ingestão oriunda do ambiente; 2- Mecanismos de seqüestros intracelular para
metais envolvendo sítios de ligação com alta afinidade de proteínas com baixo peso
molecular, conhecida como metalotioneínas, seguida a eliminação por sistemas de
lisossomos; 3- Seqüestro intracelular para metais envolvendo vacúolos específicos produzindo
36
compostos fosforados e grânulos sulfúricos, que depois são eliminados por exocitose
(Rainbow, 1997).
Em geral, os crustáceos apresentam mecanismos que regulam as concentrações de
metais traço no organismo, através de armazenamento temporário ou permanente. O objetivo
desse processo é tornar as substâncias inertes quimicamente, para que dessa forma não
prejudiquem os indivíduos (Rainbow et al., 1999).
Grânulos contendo metais traço são encontrados em praticamente todos os filos de
invertebrados (Brown 1982; Mason & Simkiss 1982; Al-Mohanna & Nott 1985; Viarengo
1989). Esses grânulos estão presentes principalmente em células epiteliais e em alguns outros
órgãos como hepatopâncreas e rins de crustáceos. Apesar desses grânulos ocorrerem em
vários invertebrados, os eventos fisiológicos e bioquímicos envolvidos na sua formação ainda
permanecem obscuros (Viarengo, 1989). Análises por microscopia eletrônica mostram que a
composição metálica dos grânulos sugere que eles contenham cálcio ou metais catiônicos,
como zinco, cobre e prata complexados com sulfidrilas e fósforo (Coombs & Gerorge, 1978;
Mauri & Orlando, 1982; Mason et al., 1984; Al-Mohanna & Nott 1985). Como resultado
dessa complexação com ânions, os metais potencialmente tóxicos são removidos do
citoplasma e seqüestrados em um vacúolo “membranado” agora em uma forma insolúvel e
destoxificada. Após a imobilização, eventos de exocitose seguido por mecanismos de
excreção do organismo irão depositar o metal de volta no ambiente (Hopkin, 1989). Viarengo
em 1989 sugeriu que os vacúolos de destoxificação possam possuir um mecanismo similar ao
“calcium-sequestring” para estocar seus cátions divalentes como ocorre no retículo
endoplasmático. Assim, o cálcio e metais que possuem cátions divalentes podem ser
transportados do citoplasma para vacúolos por uma Ca
2+
ATPase. Essa bomba deve estar
acompanhada por um ou mais transportadores de ânions na membrana do vacúolo, para
acumular sulfato, fosfato ou oxalato e promover um complexo negativamente carregado, para
37
assim formar um precipitado insolúvel. Outras proteínas de transporte já foram descritas na
literatura para zinco, cobre e prata, e alguns desses carreadores também podem ocorrer nas
membranas de vacúolos granulares (Gunshin et al., 1977; Vulpe & Packman 1995; McMahon
& Cousins 1998; Bury et al., 2003). Até agora, não está totalmente desvendado o
funcionamento dos processos que envolvem os sistemas de transporte de metal presente nas
membranas, que são responsáveis para a destoxificação de cátions metálicos em crustáceos.
Como resultado, os processos responsáveis pelo seqüestro e destoxificação por formação de
grânulos no epitélio de invertebrados ainda continuam indefinidos. Em lisossomos presentes
no hepatopâncreas de lagosta foram encontrados canais ATPase de cobre estimulados por
cálcio (Chavez-Crooker et al., 2002), mas não é conhecido até que ponto que essa Ca
2+
-
ATPase transporta outros íons, como metais traço nessas organelas quando estão presentes no
citoplasma. O hepatopâncreas dos crustáceos é um órgão multifuncional com propriedades
adsortivas e digestivas para uma variedade de moléculas orgânicas, funcionando também
como local para seqüestro e destoxificação de metais traço. No citoplasma, o metal pode se
complexar com MTs ou glutationa (Viarengo, 1989), entrar na mitocôndria (Klein & Ahearn,
1999; Chavez-Crooker et al., 2002), ser transportado através da membrana basolateral para a
hemolinfa, acumular nos lisossomos, ou ser transferido para o retículo endoplasmático.
Os lisossomos são organelas intracelulares multifuncionais, possuindo como função
principal o desmonte ou inativação de macromoléculas através de digestão enzimática em um
micro ambiente ácido (Chou et al., 1992; Pisoni & Theone, 1991). Em adição a função de
degradar macromoléculas, a membrana do lisossomo possuiu proteínas que transportam íons,
tanto cátions quanto ânions entre o compartimento intralisossomal e o citoplasma
(Dell’Angelica et al., 2000), assim como H
+
e Ca
2+
ATPases já foram descritas nas membranas
dos lisossomos o acúmulo pode então se dar com o auxílio desses mecanismos (Pisoni &
Theone, 1991; Chou et al., 1992). Uma forma sugerida de eliminar os metais traço, é a
38
depuração via ecdise, processo também conhecido como muda, onde os contaminantes seriam
bombeados, através de proteínas na membrana celular epitelial para o exoesqueleto com gasto
de ATP (Keteles & Fleeger 2001). Por ser um processo que necessita de energia, devido ao
bombeamento pelas ATPases nas membranas, os animais acabam por apresentar alterações
nos períodos de muda, crescimento e comportamento alimentar (Chen & Lin, 2001; Wu &
Chen, 2005).
Outras vias são possíveis, mas até o presente momento não é possível classificar por
ordem de importância cada um desses processos em qualquer crustáceo. Parece que cada
espécie emprega cada uma desses processos, e mudanças podem ocorrer durante os ciclos de
vida de cada indivíduo, sugerindo particularidades taxonômicas no emprego desses
mecanismos.
1.6.2 Mercúrio
O mercúrio sempre despertou grande interesse à comunidade científica devido as suas
características exclusivas, principalmente pelo fato de ser o único metal líquido à temperatura
ambiente. Apesar de pertencer ao grupo II B da tabela periódica, seu comportamento químico
é bastante diferente dos demais elementos deste grupo, como o zinco e cádmio (Hawley,
1987).
O Hg
2+
encontrado no meio ambiente, pode ser proveniente de fontes naturais
(atividade vulcânica e da desgaseificação da crosta terrestre) e fontes antropogênicas (queima
de combustíveis fósseis, agricultura, atividade industrial, mineração e etc.) (Berry et al., 1974;
WHO, 1990). O mercúrio é introduzido no meio ambiente, tanto natural quanto
artificialmente, na sua forma inorgânica e as emissões naturais de Hg na atmosfera são
estimadas entre 2.700 e 6.000 toneladas por ano, enquanto a atividade mineradora de Hg
0
mundial está em torno de 10.000 toneladas anuais (WHO, 1990). Estima-se que sejam
39
lançadas aproximadamente 3.000 toneladas por ano de Hg
2+
no meio ambiente como
resultado de atividades humanas (WHO, 1991).
Além do estado elementar (Hg°), o mercúrio existe nos estados 1+ e 2+, nos quais o
átomo deste elemento perdeu um e dois elétrons respectivamente. Os compostos químicos de
mercúrio (II) são mais numerosos do que os de mercúrio (I) (Andren & Nriagu, 1979). Este
metal no meio ambiente pode ocorrer na fase gasosa (mercúrio elementar, dimetilmercúrio),
como líquido (mercúrio elementar), no estado sólido (como cinábrio (HgS)) e em solução, sob
várias formas. O mercúrio (II) pertence a uma classe importante de compostos
organometálicos, e se caracterizam pela ligação de mercúrio a um ou dois átomos de carbono,
para formar compostos do tipo RHgX e RHgR’ onde R e R’ representam um radical orgânico
(aril ou alquil) e X representa qualquer ânion (WHO, 1976; Craig, 1985).
O mercúrio é conhecido por formar compostos de diferentes graus de toxicidade para o
homem, a qual depende das propriedades químicas desses compostos, que determinam a sua
absorção, distribuição e excreção (Winship, 1985).
O Hg
2+
apresenta grande afinidade pelo enxofre, principalmente quando ele está na sua
forma sulfidrílica (SH-), característica que condiciona a maioria das propriedades biológicas
deste metal, e por isso a base para o tratamento de envenenamento por Hg
2+
é a administração
de dimercaprol e penicilamina, que são poderosos agentes quelantes (Winship, 1985).
Fisiologicamente, se combina com outros ligantes, como fosfato, carboxilato, imidazola e
radicais hidroxil de enzimas e outras proteínas biológicas essenciais (Winship, 1985).
Os efeitos adversos da exposição dependem da forma química do Hg
2+
incorporado, da
via de exposição (inalação, ingestão e contato dérmico) e da intensidade da exposição isto é,
da relação dose - tempo (crônica, sub-crônica, e aguda). O Hg
2+
é convertido em diferentes
formas químicas e estados de oxidação dentro do organismo, e através de processos
enzimáticos o Hg elementar pode ser oxidado a outras formas inorgânicas, assim como os
40
compostos de Hg orgânico podem ser convertidos em Hg inorgânico no organismo (ATSDR,
2005). O MeHg é considerado o composto de mercúrio de maior importância toxicológica,
sendo listado pelo Programa Internacional de Segurança Química, como um dos seis produtos
químicos mais tóxicos ao meio ambiente de uma forma global (Gilbert & Grant-Webster,
1995). Uma característica que deve ser citada e enfatizada é que compostos de Hg
2+
, mesmo
em baixas concentrações, são capazes de inativar enzimas e podem assim interferir com o
metabolismo celular. O mercúrio orgânico, muito solúvel nos lipídios, difunde-se com
facilidade através das membranas biológicas e distribui-se mais facilmente pelo organismo,
ocasionando uma maior bioacumulação pela biota (WHO, 1976; Craig, 1985; Irgolic &
Martell, 1985; WHO, 1989). O MeHg rapidamente penetra nas barreiras hemato-encefálica e
hemato-placentária, inibindo a síntese protéica e podendo causar danos ao desenvolvimento
cerebral (Craig, 1985). Nos seres humanos, por exemplo, os níveis de MeHg no cérebro são
aproximadamente seis vezes maiores do que os níveis no sangue (Magos, 1987; Gilbert &
Grant-Webster, 1995), efeito esse devido à sua alta lipossolubilidade e a rápida incorporação
nos órgãos críticos.
A tendência de bioacumular e biomagnificar ao longo da cadeia alimentar aquática, faz
com que a biota seja prejudicada em eventos de contaminação por mercúrio na forma
orgânica, atingindo peixes predadores e em muitos casos, o próprio homem (figura 5) (Jensen
& Jernelov, 1972; Craig, 1985). Os organismos aquáticos bentônicos e os peixes predadores
de topo de cadeia, acumulam o MeHg, especialmente no fígado, nos rins, no cérebro e nos
músculos e se constituem na principal fonte de exposição para o ser humano (Renzoni et al.,
1998). A baixa velocidade de eliminação do MeHg associada aos efeitos nos organismos faz
com que seja considerado muito tóxico, se comparado com as demais formas de mercúrio. A
meia vida biológica, para eliminação de MeHg, é das maiores entre quaisquer compostos
41
metálicos (Berlin, 1990). Em peixes, verificaram-se valores médios de 1.000 dias, enquanto
no homem estes valores ficam, em geral, em 70 dias (Neathery & Miller, 1975; WHO, 1989).
Em ambientes aquáticos não impactados, os níveis de Hg
2+
são baixos, na faixa de
nanogramas por grama (WHO, 1976 e 1990), porém, descargas pontuais resultantes de fontes
antropogênicas aumentam as concentrações no ecossistema. A dispersão do mercúrio depende
de vários fatores, dentre eles, a solubilidade e a reatividade - estabilidade química e a presença
de organismos. O fator que mais influencia na acumulação de Hg
2+
pelos organismos
aquáticos, é a concentração deste a que estes estão expostos, ou seja, a concentração no meio
ambiente aquático, no sedimento e no alimento (Huchabee et al., 1979).
Figura 5: Ciclo do mercúrio e acumulação nas teias alimentares. Adaptado de
http://www.amartorell.com/html/public/entitats?id=35&showContent=NOTICIES&content=48457.
1.7 Acúmulo de Metais traço nos Tecidos de Crustáceos
Hepatopâncreas, músculo e exoesqueleto são tecidos conhecidos por acumular metais
traço, o hepatopâncreas é reconhecidamente um tecido que acumula metais não-essenciais
como o mercúrio (Páes-Osuna & Ruiz-Fernández, 1995). Além de possuir características de
estocar e acumular metais traço, localiza-se dentro do cefalotórax, sendo um sistema
glandular que tem funções de fígado, de pâncreas e também de estômago. Em L. vannamei,
Deposição
Hg
0
Hg
0
Hg
0
Oxidação fotoquímica
Hg
2+
2+
Deposição
Hg
0
Hg
0
Hg
0
Oxidação fotoquímica
Hg
2+
2+
42
foi demonstrado, que seguido do hepatopâncreas, o músculo é o tecido que mais acumula
Hg
2+
(Ruelas-Inzunza et al (2004). O exoesqueleto é o tecido que menos acumula mercúrio
dos três tecidos citados. Ruelas-Inzunza et al., (2004) e Andersen & Baatrup (1988) mediram
concentrações de Hg
2+
no hepatopâncreas, brânquias e músculo abdominal, após exposição a
Hg
2+
dissolvido na água em condições controladas. Nesse estudo eles concluíram que os
tecidos que mais acumulam Hg
2+
no camarão da espécie Carangon carangon foram
hepatopâncreas e brânquias. Foi documentado também que alguns elementos considerados
não essenciais, como Cd
2+
e Hg
2+
, não são regulados por crustáceos (Frías-Espericueta et al.,
2001), podendo assim acumular em diversos tecidos em grandes quantidades.
1.8 Biomarcadores
A detecção precoce de exposição a uma substância perigosa pode diminuir
significativamente a ocorrência de efeitos adversos à saúde. O monitoramento da exposição é
um procedimento que consiste em uma rotina de avaliação e interpretação de parâmetros
biológicos e/ou ambientais, com a finalidade de detectar os possíveis riscos a saúde. A
exposição pode ser avaliada por medida da concentração do agente químico em amostras
ambientais, ou através de parâmetros biológicos, denominados indicadores biológicos ou
biomarcadores. O monitoramento biológico da exposição aos agentes químicos propriamente
ditos, significa a medida da substância ou seus metabólitos em vários compartimentos
biológicos, como sangue, urina ou ar exalado. A detecção de um efeito adverso indica que a
exposição é ou tem sido excessiva, e além disso tal medida é mais apropriada para ser incluída
num programa de detecção precoce de prejuízo à saúde.
Quando o monitoramento biológico está baseado na determinação da substância
química ou do seu metabólito no meio biológico, torna-se essencial o conhecimento de como
essa substância é absorvida pelas diferentes vias. Não menos importante é como os metais são
43
distribuídos para os diferentes compartimentos do organismo, de como são biotransformados
e finalmente, de como são eliminados. Outro ponto fundamental é saber também se a
substância se acumula ou não no organismo. O acompanhamento de um ambiente que possa
estar sofrendo algum tipo de degradação pode ser feito de diversas formas, cada uma com as
suas respectivas vantagens e limitações. Então, utilizando a nomenclatura correta para cada
estudo; biomonitoração: muitas vezes é substituída por bioacumulação, em particular nos
estudos em que se quantifica acúmulo de elementos por um dado organismo; bioindicação:
conjunto de estudos em que a qualidade do ambiente de estudo é avaliada através da riqueza e
abundância de espécies, segundo a sua diferente sensibilidade a condições ambientais
particulares. Bioindicadores então, são aqueles que indicam a degradação com a sua presença,
medindo apenas o impacto já presente e atuante, enquanto os sentinelas são aqueles que
podem acumular os agentes tóxicos em seus tecidos e os biomarcadores apresentam uma
mensuração a nível celular, demonstrando de um modo mais sensível o aspecto de regulação
de um determinado gene quando estimulado por uma dada substância definido assim por
Depledge (1993): “Uma variação bioquímica, celular, fisiológica, ou etológica que pode ser
mensurada em amostras de tecido ou fluido corporal extrapolando-se para o organismo como
um todo, fornecendo assim evidencias de exposição a um ou mais poluentes químicos”.
Toxicidade ao organismo é precedida por, e resulta em, alterações na expressão
gênica, sendo na maioria das vezes muito mais sensíveis e específicas do que os parâmetros
tradicionais de avaliação de toxicidade (Nuwaysir et al., 1999). Qualquer animal que sofra um
estímulo externo pode respondê-lo de diversas formas, e uma delas é a mudança no padrão de
expressão de determinados genes. No monitoramento de contaminação em ecossistemas
aquáticos, a indução de expressão de uma série de genes que respondem a diferentes produtos
tóxicos tem se mostrado um método sensível de prevenção precoce de efeito. A escolha de
genes candidatos para serem utilizados como marcadores ambientais é de fundamental
44
importância para uma detecção confiável de respostas induzidas através de mecanismos
moleculares a contaminantes presentes no ecossistema. Isso possibilita promover o estudo da
regulação gênica que envolva interação no processo de destoxificação a resposta a estímulos
externos.
1.9 Metalotioneínas como Biomarcadores
As metalotioneínas (MTs) foram descobertas em 1957 por Margoshes e Valee e
identificadas como proteínas ricas em radicais sulfidrilas e baixo peso molecular. Não é de se
surpreender que a maioria dos mamíferos possua tecidos ricos em MTs de acordo com a
idade, uma vez que elas participam em processos regulatórios envolvendo metais, além de
estarem também ligadas ao processo de crescimento e multiplicação celular. As MTs podem
ser induzidas em presença de metais essênciais (Cu
2+
e Zn
2+
) e não essênciais (Cd
2+
, Ag
2+
,
Hg
2+
), tanto em vertebrados como invertebrados, variando intra e inter-específicamente.
Provavelmente, diferentes isoformas de metalotioneínas desempenham diferentes funções
fisiológicas, e a dependência da MT em processos de destoxificação varia de acordo com o
ambiente e grupos taxonômicos.
A indução de metalotioneínas é uma resposta bioquímica a uma alta disponibilidade de
metais no ambiente, característica típica de um biomarcador. Na última década, o uso da MT
como biomarcador ambiental para a poluição por metais traço vem sendo proposta, usando
diferentes organismos vertebrados e invertebrados como modelo experimental (Pedersen et
al., 1997; Avranomova et al., 1999; Cosson, 2000; Rebelo et al., 2003; Geffard, 2002;
Geffard et al., 2005). Na Europa, a MT é reconhecida entre uma série de biomarcadores de
confiança, fazendo parte de um grupo de marcadores moleculares selecionados para monitorar
o ambiente marinho no Plano de Ação do Mediterrâneo do Programa Ambiental das Nações
Unidas (UNEP/ RAMOGE, 1999).
45
Apesar de todas essas virtudes da aplicação das MTs em acompanhamentos de
contaminação, a escolha do melhor modelo experimental, e os limites para interpretação dos
dados obtidos, ainda são pontos que desencadeiam discussões pela presença de isoformas da
proteína e afinidades que cada uma apresenta por cada tipo de metal.
1.9.1 Características Moleculares e Bioquímicas das MTs
Após seu primeiro relato em 1957, tanto a metalotioneína propriamente dita, quando as
MT-Like passaram a ser descritas em diversas espécies de peixe (Olsson et al., 1998),
invertebrados aquáticos (Roesijadi & Fowler, 1991), e principalmente moluscos (Langston et
al., 1998) e crustáceos (Roesijadi, 1992).
As MTs já foram classificadas de diferentes modos.
Fowler et al., (1987) estabeleceram três classes: Classe I, inclui as metalotioneínas que
apresentam homologia com a MT de cavalo; Classe II, compreende todo o resto que não
possui homologia com a metalotioneína do cavalo; Classe III, as phytochelatinas, que são
peptídeos ricos em cisteína sintetizados por enzimas vegetais, que atualmente não são mais
considerados MTs. A segunda classificação foi proposta por Binz & Kagi em 1999, e leva em
consideração parâmetros taxonômicos e o padrão de distribuição dos resíduos de cisteína na
seqüência da MT. Essa nova classificação resultou em 15 famílias de MTs. Nessa recente
classificação, vertebrados foram alocados na classe I, os moluscos se enquadram na classe II,
enquanto os crustáceos na família III.
As metalotioneínas são uma classe de metaloproteínas que apresentam características
particulares: possuem baixo peso molecular, são solúveis e ricas em radicais sulfidrilas, com
uma distribuição característica de resíduos de cisteínas, como Cys-X-Cys, Cys-XY-Cys, onde
XY são aminoácidos diferentes da cisteína (Kagi & Shaffer, 1988) (Figura 6). As
metalotioneínas demonstram grande afinidade com cátions de metais traço (Hg
+2
> Cu
2+
>
Cd
+2
> Zn
+2
) (Viarengo, 1989), que a partir de determinadas doses induzem a transcrição da
46
metalotioneina. Além disso, estas proteínas são responsáveis pela homeostase de metais
essenciais, como o cobre e o zinco, e estão envolvidas em casos específicos de regulação
gênica (Ativação/Desativação das proteínas zinco dependente) (Henchel et al., 1994). Por fim,
as metalotioneínas também desempenham uma função essencial no sistema de defesas
antioxidantes (Sato & Bremmer,1993; Kling & Elsson, 1997), reagindo diretamente com
espécies reativas de oxigênio, incluindo superóxidos, radicais hidroxil e peróxido de
hidrogênio. A presença dos elementos responsivos a metais (MREs) nas seqüências
regulatórias dos genes da metalotioneína representam uma evidência para a especificidade da
transcrição desse gene.
Figura 6: Esquema da estrutura da proteína metalotioneína. Em destaque as moléculas de cisteína (vermelho) e
ligações tetraédricas formadas com o metal, representado pelo cádmio (Adaptado de S. J. Lippard & Berg 1994).
A função biológica das metalotioneínas ainda é alvo de controvérsias, mas sabe-se que o
seu comportamento é determinado pelas características do seu grupamento tiol, assim,
qualquer metal que compartilhar sua estequiometria com cobre ou zinco irá se ligar a MT. Por
apresentar estrutura conservada, as MTs nos levam a concluir que essas proteínas
47
desempenham funções vitais importantes. Mason e Jenkins (1995) propuseram dois papéis
para elas. O primeiro deles foi que essas proteínas seriam reservatórios de metais não tóxicos
(Zn
2+
e Cu
2+
) para síntese de metaloenzimas, promovendo a homeostase de muitos processos
celulares. O segundo papel estaria envolvido na capacidade de reduzir ligações não
específicas de metais não essenciais (Cd
2+
e Hg
2+
) nas células, diminuindo seu potencial
tóxico. Além dessas características, elas também podem trabalhar como protetoras contra
radiações ionizantes (Cai et al., 1999) e na defesa contra antioxidantes (Viarengo et al., 2000).
Diversas isoformas já foram identificadas e parece que o polimorfismo desempenha um
papel importante em invertebrados em comparação aos mamíferos. Além disso, variações na
massa molecular também foram descritas, sugerindo assim que existem formas monoméricas
e díméricas (Langston et al., 1998). Como exemplo, Dallinger et al., (1997) descreveu
evidências para a existência de formas distintas da proteína em caracóis, sendo uma dedicada
a destoxificaçao de Cd
2+
e uma segunda direcionada a regulação de Cu
2+
. Outros grupos
chegaram às mesmas conclusões usando modelos experimentais diferentes, como siris
(Browner et al., 1986) e moscas (Lauverjat et al., 1989). O seqüenciamento do gene que a
transcreve e a quantificação da expressão do RNAm em diferentes órgãos do mexilhão
Mytilus edulis mostraram que exposição a Zn
2+
é responsável por aumento na expressão do
RNAm da isoforma MT-10, enquanto o estímulo induzido por Cd
2+
além de aumentar a
isoforma 10 também induz MT-20 (Lemoine et al., 2000). Avanços na área de biologia
molecular usando amplificação do gene confirmaram funções diferentes para cada isoforma,
sendo uma envolvida com a homeostase de metais essenciais e outra direcionada para
destoxificação dos não-essenciais. A partir dessa conclusão, os genes que codificam MT
passaram a ser identificados em crustáceos e moluscos: Scylla serrata (Otvos et al., 1982),
Callinectes sapidus (Brower et al., 2002), Crassostrea virginica (Butler & Rosejadi, 2001),
48
Homarus americanus (Brower et al., 1989) e Dreissena polymorpha (Englelken &
Hildebrandt, 1999).
Experimentos que utilizam organismos transgênicos envolvendo perda ou ganho de
função vêm sendo realizados com o objetivo de examinar as potenciais funções das MTs. Em
levedura, a deleção causou a perda da tolerância à toxicidade pelo cobre (Hamer et al., 1985)
e em mamíferos, a ruptura dos genes para MT-1 e 2 e anulação da síntese da MT acarretou na
perda de tolerância ao Cd
2+
(Masters et al., 1994).
Em invertebrados, dois mecanismos principais de destoxificação envolvendo ligantes
intracelulares foram bem documentados: Ligação ao metal em componentes do meio
citosólico, incluindo metalotioneínas (ou proteínas metalotioneína-like) e biomineralização,
formando grânulos de metais inertes (Mason & Jenkins, 1995; Marigomez et al., 2002). A
competição entre o mecanismo de seqüestro (ligantes citosólicos não MT, grânulos
biomineralizados) pode interferir na resposta da MT a exposição a metal (George & Olsson,
1994). É possível a formação de produtos lisossomais insolúveis oriundos de complexos
metalotioneína-metal (freqüentemente Cu
2+
- MT). A complexidade dessa relação é maior nas
espécies (crustáceos malacostracos, moluscos gastrópodes) que contém o pigmento
respiratório dependente de cobre hemocianina, e além disso, nos crustáceos o ciclo de muda
também pode ser um fator de confusão no metabolismo do cobre e valores de hemocianina
(Engel & Brouner, 1993). O grupo mostrou que a concentração de hemocianina (pigmento
respiratório de artrópodes e moluscos), cobre e zinco diminuem significativamente durante o
período de muda. A concentração de cobre na glândula digestiva apresentou redução
significante nas fases em que a carapaça se encontra mole. As diferenças foram de 3,4 vezes
menor que no estágio D1 e 6 vezes menores que no estágio da pré-muda. As reduções vistas
no cobre presente na glândula digestiva estão correlacionadas com a redução do mesmo metal
na hemolinfa. Isso significa que o Cu
2+
está sendo perdido ou excretado, além de não estar
49
sendo conservado na glândula digestiva. Na fase inicial do ciclo de muda, no entanto, parece
que ao passar da pré-muda para a muda, existe um aumento de cobre na glândula digestiva,
que pode estar associada com mudanças na síntese e degradação da hemocianina através da
retenção do metal, fato que não persiste. O zinco seguiu o mesmo padrão, tanto na hemolinfa
quanto na glândula digestiva.
1.9.2 Metalotioneína em Crustáceos
As metalotioneínas vêm sendo extensamente estudadas e usadas devido à
característica de biomarcador específico de metais, refletindo a existência desses
contaminantes no ambiente. Uma série de espécies já se demonstraram responsivas a indução
das metalotioneínas após exposição a metais traço. Pan & Zhang (2006) viram que
caranguejos marinhos expostos ao Cd
2+
(concentração final de 0,025 e 0,05 mg/l)
apresentaram expressão significativa de MT após 3 dias, estabelecendo uma relação dose
dependente da concentração de Cd
2+
no hepatopâncreas. Apesar disso, existem relativamente
poucos estudos no campo das MTs e camarões, incluindo o L. vannamei. Wu & Chen, (2005)
demonstraram, através de cromatografia de afinidade a existência de MTs ou proteínas MT-
like nessa espécie, associando a relação entre indução da MT e exposição a cádmio e zinco.
Observou-se claramente que a metalotioneína apresentava comportamento diferenciado
quando estimulada hora por cádmio, hora por zinco. O grupo chinês viu correlação positiva
entre a indução de MT e o Cd
2+
acumulado no hepatopâncreas (r
2
=0,617; P< 0,05) e brânquias
(r
2
=0,41; P< 0,05), mas quando olharam para o Zn
2+
a ordem de correlação foi menor tanto no
hepatopâncreas (r
2
= 0,30; P<0,05) quanto nas brânquias (r
2
= 0.012, P= 0,19).
O passo seguinte que serviu como alavanca para o estudo do nosso grupo, foi à
descrição da seqüência do gene metalotioneína (GenBank gi: 11037992), que serviu como
50
ponto inicial para a construção dos primers utilizados na parte experimental de biologia
molecular.
1.10 Hipótese de trabalho
Os produtores de camarão vêm passando por problemas no cultivo devido à redução
no peso final e tamanho dos indivíduos, prejudicando assim o mercado de importação e
exportação, sendo o último o mais exigente e rentável. É notória a contaminação dos insumos
utilizados nos cultivos por metais traço com transferência para os indivíduos. Com base em
estudos anteriores, foi demonstrado um significativo aporte de metais traço nos viveiros de
camarão da região do baixo Jaguaribe, CE (Lacerda et al, 2006). O acompanhamento da
expressão do gene da metalotioneína durante as etapas do cultivo; associado à determinação
das concentrações de mercúrio nos insumos utilizados no cultivo, pode atuar como um
biomarcador molecular informando o momento em que os organismos estariam desviando
parte do seu potencial energético para a destoxificação, e parando de crescer. Com o fino
ajuste da metodologia proposta, pode ser possível a realização de um despesque precoce,
propondo a redução no prejuízo oriundo da contaminação por metais traço.
2 . Objetivos
Geral
• Relacionar o ganho de peso dos camarões com o acúmulo de Hg
2+
nos tecidos e a expressão
do gene da MT, proporcionando um marcador de despesque para os camarões que estejam
desviando seu potencial energético para processos de destoxificação.
51
Específico
1.
Determinar a expressão do gene da metalotioneína em camarões alimentados com rações
contaminadas com Hg
2+
em condições experimentais de cultivo intensivo e extensivo e
amostrados em diferentes estágios de vida em uma fazenda carcinicultura.
2.
Determinar a concentração de Hg
2+
nas rações.
3.
Determinar a concentração de Hg
2+
acumulada no hepatopâncreas, músculo e
exoesqueleto dos animais em laboratório e amostrados em diferentes estágios de vida em
uma fazenda de carcinicultura.
4.
Verificar se o ganho de peso dos camarões está relacionado com o acúmulo de Hg
2+
nos
tecidos e a expressão do gene da metalotioneína.
5.
Usar o gene da metalotioneína como um marcador de despesque para os camarões que
estejam desviando seu potencial energético para processos de destoxificação.
3. Material e Métodos
3.1 Local de Coleta
As coletas foram realizadas no complexo de cultivo COMPESCAL (Comércio de
Pescado Aracatiense), situado na cidade de Aracati (CE) 4°33'45.84"S 37°46'8.72", distante
150 Km da capital Fortaleza (CE). A fazenda possui estrutura atrelada ao regime de água do
Rio Jaguaribe (Figura 7) que é o maior curso de águas do Ceará, cortando o estado em toda a
sua extensão. O Jaguaribe tem 610 Km em sua totalidade, com uma bacia de cerca de 72.043
Km
2
que drena as partes meridional e oriental do Estado do Ceará. Seus principais afluentes
são pela margem direita, os rios Carius, Salgado e Figueiredo e pela margem esquerda, os rios
Banabuiú e Palhano.
52
O Rio Jaguaribe divide-se em três sub-bacias: Alto, Médio e Baixo Jaguaribe. Sua
porção inferior, o Baixo Jaguaribe apresenta 137 Km de extensão e deságua no Oceano
Atlântico, no município de Fortim. A Bacia hidrográfica possui uma grande rede de
drenagem. A foz do Rio Jaguaribe apresenta uma extensa zona estuarina (Soares Filho, 1996),
cuja penetração das águas do mar se faz sentir em período de seca até a barragem de Itaiçaba,
cerca de 34 Km da sua desembocadura (Marins et al., 2003). Essa região encontra-se inserida
no litoral Leste do Ceará, cerca de 125 Km da cidade de Fortaleza, com acesso pelas rodovias
CE-040 e BR-116.
Figura 7: Vista de satélite da fazenda onde foram realizadas as coletas e seu entorno, destacando-se o Rio
Jaguaribe ao lado esquerdo. Fonte: Google Earth
3.2 Amostragem nos Viveiros
Em uma fazenda de camarão, os viveiros são separados seguindo critério de tempo de
vida dos indivíduos, que pode chegar até 130 dias, período esse que o animal necessita para
alcançar o peso ideal para o despesque e beneficiamento. Foram selecionados dentro do
complexo de cultivo, viveiros que possuíssem camarões em diferentes estágios de
53
crescimento. No local onde foram realizadas as amostragens, os camarões estavam separados
em berçários (20 dias) e tanques de 40, 90, 105 e 130 dias (Figura 8).
Figura 8: Viveiros onde foram coletados os indivíduos e respectivas identificações. Fonte: Google Earth.
Tabela 1: Informações de cada um dos viveiros onde foram realizadas as coletas dos camarões na fazenda
COMPESCAL
Viveiro Dias
Densidade/m
2
Peso Médio(g)
Data de Coleta
1 40 50 1,93 07/11/2006
2 90 50 6,99 07/11/2006
3 105 45 7,06 06/11/2006
4 130 46,2 11,37 06/11/2006
3.2.1 Indivíduos na Fase de Larvas
Primeiramente, foram coletadas pós-larvas que estavam no berçário da fazenda e
que teriam em torno de 15 dias de vida (Figura 9 A e B). Como os indivíduos nesse
estado de desenvolvimento possuem tamanho reduzido, não foi possível realizar a
separação dos tecidos e os animais foram coletados em sua integridade.
1
2
3
4
54
Figura 9 A: Foto de pós-larvas presentes no berçário da fazenda COMPESCAL; B: Berçário no complexo
de cultivo da fazenda COMPESCAL.
3.2.2 Coleta nos Viveiros de Engorda
Os animais foram retirados do viveiro com o auxílio de uma tarrafa e separados
em uma balde contendo água do próprio tanque, com o objetivo de reduzir ao máximo o
estresse (Figura 10). Logo em seguida foram dissecados com o auxílio de uma pinça o
hepatopâncreas e músculo para análise de biologia molecular e hepatopâncreas,
músculo e exoesqueleto para determinação de Hg
2+
(Figura 11).
Os tecidos destinados aos experimentos de biologia molecular foram
armazenados em tubos eppendorf contendo solução RNA holder® (Bioagency), para
manter preservadas as moléculas de RNA e prevenindo degradação. Os tubos foram
A
B
55
devidamente etiquetados e identificados com o nome do tecido e numeração
correspondente ao viveiro de coleta. Em cada tubo eppendorf foram acondicionados 5
tecidos de indivíduos diferentes para cada viveiro, formando assim 5 pools de 5
indivíduos. Como os tecidos-alvo para esse tipo de experimento foram hepatopâncreas e
músculo, foram amostrados 25 camarões em cada viveiro e 100 no total. Logo após a
coleta, as caixas contendo as amostras foram acondicionadas em isopor com gelo até
chegar ao laboratório, onde foram congeladas em -20ºC até o início dos procedimentos.
Para absorção atômica, além do hepatopâncreas e músculo, o exoesqueleto
também passou a fazer parte da experimentação. Todos os procedimentos com relação à
identificação, retirada de tecidos, n amostral e transporte foram os mesmos realizados
para as amostras direcionadas para biologia molecular. O único ponto que diferiu foi a
substituição da solução preservadora de RNA, por gelo. Foram então coletados um total
de 200 indivíduos nos viveiros do complexo de cultivo COMPESCAL.
Nessa fase, o tamanho, peso, idade dos animais e densidade de cada viveiro
foram fornecidos pela administração da fazenda (Tabela 1).
Figura 10: Coleta dos indivíduos
56
Figura 11: Retirada dos Tecidos
3.3 Exposição em Laboratório
Com o objetivo de realizar um experimento em condições controladas, grupos de
indivíduos foram submetidos durante 70 dias a alimentação com diferentes marcas de
ração. O estudo foi desenvolvido nas dependências do Laboratório de Nutrição de
Camarão
(3
o
50’01.55”S e 38
o
25’22.74”W)
,
localizado na cidade de Eusébio, Estado do
Ceará, Brasil
.
O referido laboratório faz parte do Laboratório de Ciências do Mar
(Labomar) da Universidade Federal do Ceará.
O
objetivo do grupo da UFC foi verificar
como o crescimento e ganho de peso dos camarões estariam relacionados com
diferentes marcas de rações e as características nutricionais de cada uma delas.
Para verificar qual seria a influência de diferentes marcas de rações no
crescimento dos camarões, duas condições para o ensaio foram utilizadas. A
experimentação foi realizada em datas e aeração distintas, usando o camarão da espécie
L. vannamei como modelo experimental. O trabalho foi feito em 40 tanques localizados
na parte externa e 30 na parte interna do laboratório, apresentando uma área total de
1.02m
2
e 0.57m
2
, respectivamente. O sistema externo esteve integralmente associado e
sujeito as variantes naturais de água do corpo d’água que o alimentava, um mangue que
57
fica ao lado do centro de pesquisa da Universidade Federal do Ceará.
Comparativamente, os internos possuíam água filtrada (zero de alimentação natural),
passando também por processos periódicos de limpeza de resíduos sólidos. Ambos os
sistemas eram aerados mecanicamente.
Pelo fato de que trabalhos anteriores já haviam identificado a contaminação das
rações por metais traço (Lacerda et al., 2006), utilizamos as diferentes rações como
fonte de Hg
2+
. O objetivo do experimento em laboratório foi simular dois tipos de
cultivo, sendo o primeiro em moldes intensivos e outro extensivo.
3.3.1 Aquisição e Armazenamento dos Camarões
L. vannamei em estágio juvenil foram adquiridos de duas fazendas no Estado do
Rio Grande do Norte e Ceará. No intensivo, 0.90 ± 0.28 g de camarão (média ± desvio
padrão) foram estocados nos tanques internos com 100 animais/m
2
ou 57
animais/tanque. No experimento extensivo, camarões de 2.40 ± 0.81 g foram
acondicionados com 40 animais/m
2
ou 41 animais/tanque. Os indivíduos foram
transportados em sacos plásticos contendo água do mar e oxigênio. Antes do início do
experimento propriamente dito, os camarões passaram por um período de aclimatação
de 15 dias alimentados com ração contendo 35% de proteína.
3.3.2 Manutenção do Sistema e Alimentação
Os indivíduos foram coletados em cada dia 14 e 24, no intensivo e extensivo,
respectivamente. 25% da população de cada tanque foi pesada em uma base úmida, e
em seguida devolvidos para o tanque de experimentação. Durante o período, apenas
animais encontrados mortos foram removidos e suprimidos do número de população
inicial. Em ambos os sistemas os parâmetros de qualidade de água (i.e., pH, temperatura
e salinidade) foram monitorados uma vez ao dia em cada tanque. No sistema interno, as
58
máquinas que filtravam a areia, trabalhavam apenas no período noturno. Quando a
pressão nas bombas aumentava, a água do tanque era rebombeada, retirando a matéria
orgânica sólida.
No sistema intensivo, os camarões foram alimentados levando em conta o
estoque de biomassa e ajustados seguindo uma tabela de alimentação. Nos primeiros 44
dias de aeração, os animais eram alimentados duas vezes ao dia. A ração foi imersa no
tanque por 2,5 h para cada período de alimentação. A partir do dia 45, os animais
passaram a serem alimentados três vezes ao dia, com uma porção de 25%, 25% e 50%
de ração. Aos domingos, eles eram alimentados apenas uma vez ao dia, de manhã, com
uma oferta de 50% da quantidade diária. A cada oferta, as redes eram checadas para
verificação de possíveis restos de ração, e quando encontradas, eram pesadas e
descartadas.
No experimento extensivo os indivíduos eram alimentados duas vezes durante o
dia. Durante o processo de experimentação, os camarões eram expostos à ração 24 h, e
quando necessários, ajustes nas rações eram feitos respeitando cada período de
alimentação. Aos domingos, não era estimada a quantidade de resquícios de alimentos e
os camarões eram alimentados com 100% do total diário.
3.3.3 Desenho Experimental e Tipos de Ração
Os indivíduos foram cultivados por um período de 10 semanas. Na amostragem,
todos os camarões foram individualmente medidos e pesados para possibilitar assim a
determinação da biomassa final (i.e., número de camarões coletados x média do peso
corpóreo) e sacrificados para a retirada dos tecidos. Assim como no experimento dos
viveiros, os tecidos foram separados tanto para análise por biologia molecular, quanto
para dosagem de metais. O processo de agrupamento e armazenagem se deu da mesma
59
forma, em pools de 5 indivíduos para cada tecido. No sistema intensivo, 11 dietas foram
experimentadas em 44 tanques, e quatro tanques de replicatas foram designados para
cada tratamento. Foram testadas 10 das 11 rações nos tanques extensivos, sendo
alocadas em 30 tanques, incluindo 3 replicatas cada.
Como os dois experimentos foram realizados em moldes diferentes, alguns
parâmetros diferiram. As variações mais significativas para o desenvolvimento da
experimentação estavam relacionadas à água que alimentavam os tanques, a densidade
de animais por tanque e a exposição às rações. Com relação à densidade, nos tanques
extensivos estava em 40 camarões/m
2
e nos intensivos, 100/m
2
(Tabela 2). Outro ponto
importante foi o tempo que cada grupo de animais era exposto às rações. Enquanto os
animais que estavam na parte interna tinham acesso às rações por 5 horas diárias
durante os primeiros 44 dias e por 20 horas do dia 45 até a despesca, os que estavam nos
tanques externos tinham ração à vontade durante 24 horas (Figura 12).
Tabela 2: Características dos experimentos em laboratório.
Particularidades ITESIVO EXTESIVO
Tempo de Experimento 70 Dias 70 Dias
Origem da Água nos
Tanques
Filtrada Manguezal
Fatores Ambientais Protegido Exposto
Alimentação Apenas Ração Ração + Nutrientes
Naturais
Densidade de
animais/tanque
100/m
2
40/m
2
60
Experimento Intensivo
Experimento Extensivo
Figura 12: Esquematização do experimento intensivo e extensivo, com destaque para alocação de cada
grupo de animais nos tanques.
3.4 Extração de RA e Síntese de cDA
Os tecidos foram armazenados em tubos eppendorfs de 1,5 ml devidamente
etiquetados contendo 500 l de solução RNAholder® (BioAgency). Na extração do
RNA total, as amostras foram agrupadas em pools de cinco, com objetivo de aumentar
61
de forma considerável a quantidade de material, para que assim fosse obtida quantidade
suficiente de RNAm a ser usado nos ensaios seguintes. RNA total foi extraído
utilizando 0,5 ml de Trizol Reagent (Invitrogen, Life technology - Carlsbad, CA,
USA.). Primeiramente, uma pequena parte do tecido foi homegenizada com o reagente,
seguido da adição de 200 l de Clorofórmio/Álcool Isoamílico (1:1). A solução foi
então homogeneizada novamente e centrifugada por 15 minutos a uma velocidade de
13.200 g. Após a centrifugação, retiramos o sobrenadante e adicionamos 500 l de
isopropanol e deixamos no freezer a -20ºC por 1 hora. Mais uma centrifugação, agora a
18.000 g por 20 minutos, serviu para precipitar o RNA e descartar o sobrenadante. O
pellet foi então lavado duas vezes com 500 l de etanol absoluto e centrifugado por 8
minutos com uma rotação de 5.200 g, para ser ressuspenso em 20l de H
2
O. As
amostras foram armazenadas em Etanol 70% e Acetato de Amônia 1 M. A análise
espectrofotométrica foi realizada a 260 nm para medição da pureza e concentração das
amostras de RNA, e em seguida foram submetidas à eletroforese em gel de agorose
1,7% para confirmação da integridade dos RNAs, validando os dados obtidos por
espectrofotometria. Cerca de 1 µg de RNAm total foi reversamente transcrito utilizando
M-MLV, Reverse Transcriptase (BioTools) e 50 nM de Oligo (dT)
18-20
(Invitrogen, Life
technology - Carlsbad, CA, USA.).
3.4.1 Primers
Todas as seqüências de primers foram desenhadas utilizando o programa
PRIMER3
®
, respeitando algumas exigências padrão como tamanho dos primers (18-20
pares de base com o máximo de 27 pb) e amplicon entre 100 e 500 bp. Todas as
seqüências foram sintetizadas por Sigma-Genosys, (Sigma-Aldrich - St. Louis, MO,
USA.) e os produtos de amplificação 5’-3’ do PCR resultante foram planejados para
regiões específicas de RNAm que amplificassem no mínimo uma junção exon-exon,
62
prevenindo a amplificação de contaminantes de DNA presentes nas amostras. Controles
negativos para quantificação de possíveis contaminações nos primers ou na água
utilizada na diluição também foram utilizados nas placas de Q-PCR.
3.4.2 PCR em Tempo Real
As reações de Q-PCR foram todas padronizadas com concentração 1x
QuantiTect
TM
SYBR Green (Qiagen - Valencia, CA, USA.), 2,5 mM MgCl
2,
4 µl de
DNA complementar (cDNA) alvo e 0,3 µM iniciadores (primer). Os primers forward e
reverse para MT foram respectivamente, ATGCCAGGCCCCTGCTGCAATGAGA e
GGACAGCACTTGCATGGCTTGGTGC. Para a amplificação da actina os primers
foram CGAGCTGTGTTCCCCTCCAT (forward) e CGATGCCAGGGTACATGGTG
(reverse). As reações respeitaram ciclos de 95° C por 10 minutos seguidos de 40 ciclos
de 94° C por 45 s, 60º C por 40 s, e 72° C por 90 s. Através de experimentos piloto, a
coleta dos dados foi estipulada em 84°C. Ao final de todos os PCRs, com auxílio das
curvas de dissociação, as amostras que apresentaram competição entre os primers,
amplificações inespecíficas e ausência de amplificação, foram excluídas das análises
seguintes. As reações foram todas realizadas em placas ópticas de 96 poços (Applied
Biosystems - Foster City, CA, USA.) em termociclador ABI PRISM 7000 (Applied
Biosystems - Foster City, CA, USA.).
A expressão do gene é calculada com base no ciclo de amplificação limite (CT -
Threshold Cycle) detectado pelo aumento da fluorescência acima da linha de corte
(determinada ao final da reação de PCR). Calculando a diferença entre o ciclo limite do
gene alvo e do gene normatizante, chegamos ao ∆CT (Ct
alvo
−Ct
referência
). que é utilizado
para calcular a expressão relativa através da fórmula 2
-∆Ct
(Stratagene, Real time PCR
system application note). Como trabalhamos em triplicatas, o ∆CT representa a
diferença entre as médias dos valores de expressão do genes alvo e normatizante.
63
O gene de referência (ou expressão constitutiva) foi a β-actina (GeneID:
AF300705). Nesta operação foram normalizadas possíveis diferenças da concentração
inicial de cDNA permitindo assim a comparação, relativa às transcrições do gene entre
diferentes amostras. Aleatoriamente alguns produtos de PCR foram submetidos à
migração eletroforética em gel de agarose 1,5% TBE, para confirmação do
bandeamento. O produto foi enviado para seqüenciamento e submetido à análise por
“Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)” para confirmação da amplificação
específica dos genes alvo.
3.4.3 Organização das Amostras nas Placas de Tempo Real
Em cada experimento as amostras foram organizadas em triplicatas e uma curva
de diluição para os dois pares de primers foi utilizada para que fosse gerada uma curva
de eficiência do PCR em tempo real. O objetivo dessa abordagem foi de minimizar os
erros decorrentes das possíveis variações na amplificação dos genes, e obter valores que
nos dessem à certeza da viabilidade dos resultados adquiridos e que a comparação entre
os experimentos fosse reprodutível.
3.5 Espectroscopia de Fluorescência Atômica
A digestão das amostras dos tecidos direcionadas para as análises de
concentração de Hg
2+
foi realizada segundo Adair & Cobb (1999), diretamente nos
tubos eppendorf com a adição de 1,0 mL de uma solução ácida de H
2
SO
4
:HNO
3
(1:1) e
repouso durante 16 horas à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 50
µL de H
2
O
2
concentrado para evitar a recomplexação do Hg
2+
à gordura existente nas
amostras, permanecendo em repouso por mais uma hora à temperatura ambiente. Após
64
esta etapa, as amostras foram aquecidas em banho-maria por uma hora à temperatura de
70-80º C.
Após o procedimento de extração, as amostras foram diluídas 11 vezes com água
deionizada e a determinação de Hg
2+
foi feita por espectroscopia de fluorescência
atômica, em um equipamento PSA Millennium Merlin 10.025, utilizando a técnica de
geração de vapor a frio através da redução com solução ácida de SnCl
2
2 %.
As curvas de calibração foram feitas na faixa entre 0-1000 ng/L a partir de
diluições sucessivas de um padrão comercial de 1000 ± 1 ppm de Hg
2+
(MERCK). O
limite de detecção alcançado foi de aproximadamente 0,1 ng (0,03 – 0,1 ng), calculado a
partir de 3 vezes o desvio estimado por S
y/x
divido pela inclinação da reta, obtida a partir
da regressão linear da curva de calibração, sendo S
y/x
= { ∑(y
i
-y)
2
. (n-2)
-1
}
1/2
(Miller &
Miller, 1993).
Para determinação da carga total de Hg
2+
nos tecidos, estimamos a relação entre
o peso total dos camarões e o peso dos tecidos dissecando e pesando o hepatopâncreas,
músculo e exoesqueleto de 12 camarões. As equações obtidas com essas correlações
foram então utilizadas para estimar o peso dos tecidos dos camarões dos experimentos
e, pela multiplicação com as concentrações do metal nos tecidos, o cálculo da carga
total.
65
y = 0,0116x + 0,117
R
2
= 0,0929
y = 0,1157x + 0,1024
R
2
= 0,6748
y = 0,6945x - 0,3399
R
2
= 0,8878
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
4 5 6 7 8 9 10 11
peso total (g)
peso dos tecidos (g)
Hepato
Exo
Mus c
Figura 13 – Relação entre o peso total do animal e peso dos tecidos (hepatopâncreas, músculo e
exoesqueleto) em camarões L. vannamei.
3.6 Estatística
Os dados apresentados estão em forma de valores máximos, mínimos e medianas
devido à ausência de normalidade dos grupos de amostras. Foi usado o teste de U
Mann-Whitney para comparar as amostras e correlação de Sperman, sendo consideradas
significativas associações com p< 0,05.
66
4 Resultados
4.1 Análises das Seqüências
Após seqüenciamento automático, os fragmentos foram pareados com as
seqüências depositadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology
Information). O fragmento de β-actina apresentou 93% de identidade com a seqüência
de L. vannamei (Figura 14). Os seqüenciamento dos fragmentos referentes à
metalotioneína não apresentaram boa qualidade, mas por termos enviados seis amostras
desse gene, foi possível através de alinhamentos realizados com auxílio do BioEdit©,
obtermos um mosaico da MT amplificada por QPCR (Figura 15). Com esses resultados
foi possível concluir que, os fragmentos que estavam sendo amplificados durante as
experimentações eram referentes aos genes pré-selecionados para as análises de
expressão gênica.
Figura 14: Alinhamento do fragmento de β-actina.
Litopenaeus vannamei beta-actin mRNA, complete cds
Length=1320
Score = 276 bits (149), Expect = 1e-75
Identities = 178/191 (93%), Gaps = 5/191 (2%)
Strand=Plus/Plus
Query 21
CAGCCCTCATTCCTGGGCATGGAATCCTGCGGCATCCACGAGACCACCTACAACCCCTTC 80
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||
Sbjct 861
CAGCCCTCATTCCTGGGCATGGAATCCTGCGGCATCCACGAGACCACCTACAACTCCATC 920
Query 81
ATGAAGTGCGACGTGGACATCCGTAAGGACCTGTACCCCAACACCGTGCTGTCCGGAGGC 140
|||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||
Sbjct 921
ATGAAGTGCGACGTGGACATCCGTAAGGACCTGTACGCCAACACCGTGCTGTCCGGAGGC 980
Query 141
ACCACCATGTACCCTGGCATCGACC-ATAGGACGTGGAAGGAAAATC--TGCCCTCGCTA 197
|||||||||||||||||||||| || | |||| | |||||||| || ||||||||||
Sbjct 981
ACCACCATGTACCCTGGCATCG-CCGACAGGATGCAGAAGGAAA-TCACTGCCCTCGCTC 1038
Query 198
CCTCCACCATG 208
|||||||||||
Sbjct 1039
CCTCCACCATG 1049
67
Figura 15: Alinhamento do fragmento de MT amplificado por QPCR (L. vannamei_MT_MOS) com as MTs depositadas no GENE BANK (L. vannamei MT_GB; H. americanus
MT_GB)
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
L. vannamei_MT_MOS ------------------------------------------------------------------ATGCCAGGCCCCTGCTGCAATGAGAAATGCGTGT
L. vannamei MT_GB GGGGGAAGCTCACCGAGCTGTACATCCATAACGTGAGATCGTCTTCAACTTGTAATTCCATTCAAGATGCCAGGCCCCTGCTGCAATGAGAAATGCGTGT
H. americanus MT_GB ------------------------------------------------------------------ATGCCGGGTCCCTGTTGTAAAGACAAGTGCGAGT
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
L. vannamei_MT_MOS GTGCCGAGGGWGGCTGCRMRACRGGYTGCMAGTGCAMGAGCTKKCRMTGCGMSCCWTGTGAAAAGTGT--------------------------------
L. vannamei MT_GB GTGCCGAGGGAGGCTGCAAGACAGGTTGCCAGTGCAAGAGCTGCCGCTGCGAGCCATGTGAAAAGTGTACGACGGGGTGCTCTTGTCCCTCAAAGGACGA
H. americanus MT_GB GTGCCGAGGGCGGGTGTAAGACGGGGTGTAAGTGCACATCCTGCCGCTGTGCTCCCTGTGAAAAGTGTACCTCCGGGTGCAAGTGTCCATCCAAGGATGA
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
L. vannamei_MT_MOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------
L. vannamei MT_GB GTGCTCCAAGAAGTGCACCAAGCCATGCAAGTGCTGTCCTTAGGCTGAGCACATCGTGACAGTCGGCAGTGACAGTCTCTCCCGTGCAATGGGGTGAACC
H. americanus MT_GB GTGCGCCAAGACCTGCTCCAAGCCTTGCAAGTGCTGTCCCTAG---------------------------------------------------------
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
L. vannamei_MT_MOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------
L. vannamei MT_GB GGAGGGGGGAGGGGATTGGGAAGATTGGGACCAGNCGTGATAATTGTTTGTAATGATTGTAAAAATATATTATTTCTAAGAGCCAATATTAATCTAAANT
H. americanus MT_GB ----------------------------------------------------------------------------------------------------
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
L. vannamei_MT_MOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------
L. vannamei MT_GB ATTTTGGCGATGTTTTCTTTTTTGTTTATTAGAATTAATTTATAATAATTGACTCTCCTATCTGATTTTTAATGNATTGGAATAAACTTAGGAGTCCAAT
H. americanus MT_GB ----------------------------------------------------------------------------------------------------
....
L. vannamei_MT_MOS ----
L. vannamei MT_GB TTTT
H. americanus MT_GB ----
68
4.2 Experimento Intensivo
4.2.1 Concentração de Hg
2+
nas rações e nos tecidos
A análise do Hg
2+
na ração é importante para determinar a dose de poluente a
que os camarões estavam expostos. Os resultados para as concentrações de Hg
2+
em
cada ração estão apresentados na Figura 16. Cada Box representa a variabilidade da
concentração de Hg
2+
na ração de cada tanque (analisada em triplicatas). Dentre as
rações utilizadas no experimento intensivo, encontramos valores máximo de 154 ng.g
-1
e mínimo de 15 ng.g
-1
, com mediana de 46,5 ng.g
-1
. Apesar de cada tanque ter recebido
ração de um fabricante diferente, podemos perceber que houve um gradiente de
contaminação, com alguns tanques (T1, T4 e T6) recebendo doses maiores que outros
(T3, T5, T9 e T10).
[Hg
2+
] Ração - Intensivo
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Tanques
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
[Hg
2+
] Rações (ng.g
-1
)
Mediana
25%-75%
Máximo e Mínimo
Outliers
Extremos
Figura 16: Concentração de Hg
2+
em rações usadas no experimento intensivo.
As concentrações de mercúrio das amostras em triplicata de hepatopâncreas,
músculo e exoesqueleto foram utilizadas para construção de um gráfico Box-plot para
demonstrar a distribuição do metal nos tecidos (Figura 17). Houve acúmulo de Hg
2+
em
69
todos os tecidos, mas não houve um tecido preferencial para acúmulo em todos os
tanques. As concentrações de Hg
2+
mais elevadas foram no músculo dos camarões do
T1 (máx: 47,45 ng.g
-1
; méd: 36,41 ng.g
-1
) e no hepatopâncreas dos camarões do tanque
T9 (máx: 57,56 ng.g
-1
; méd: 45,30 ng.g
-1
).
Experimento Intensivo
[Hg
2+
] Tecidos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tanque
0
10
20
30
40
50
60
[Hg
2+
] Tecidos (ng.g
-1
)
Músculo
Outliers
Extremos
Hepato
Outliers
Extremos
Exo
Outliers
Extremos
Figura 17: Concentrações de Hg
2+
encontradas nos diferentes tecidos dos camarões cultivados em
condições intensivas.
A Tabela 3 apresenta os valores de carga total de Hg
2+
nos tecidos dos camarões
expostos ao contaminante no experimento intensivo. Apesar das altas concentrações no
hepatopâncreas, devido à pequena massa desse tecido, a carga é baixa, assim como a sua
contribuição para a carga total do organismo. As cargas mais altas foram encontradas no
músculo, que representa o tecido mais abundante do animal. A carga relativa entre o
músculo e o exoesqueleto apresentou valores bastante altos.
70
Tabela 3: Carga total de Hg2+ nos tecidos dos camarões cultivados em condições intensivas.
Tanque
Carga no
Músculo (ng)
Carga no
Hepatopâncreas
(ng)
Carga no
Exoesqueleto (ng)
%
Exo/Mus
%
Hep/Mus
T1 111,8 3,6 NA NA 3,2%
T2 49,2 4,5 NA NA 9,2%
T3 29,2 2,0 12,2 41,8%
6,8%
T4 8,5 3,9 10,9 127,1%
45,9%
T5 10,6 1,4 4,9 46,0%
13,5%
T6 41,7 3,6 9,2 22,1%
8,7%
T7 93,6 2,5 17,7 18,9%
2,7%
T8 58,0 6,3 13,9 23,9%
10,8%
T9 16,1 9,3 8,7 54,0%
57,8%
T10 34,6 2,7 7,8 22,5% 7,7%
A Figura 18 mostra o ganho de massa dos camarões durante o experimento. Com
isso foi possível avaliar se existe associação com a concentração de Hg
2+
nos
compartimentos e rações (ver Figura 30). A escala foi ajustada para comparação com os
outros experimentos.
Figura 18: Massa ganha (g) dos camarões durante os 70 dias de experimentação em condições intensivas.
Os gráficos das Figuras 16 e 17 mostraram grande variabilidade das
concentrações de Hg
2+
nas rações e nos tecidos. A escolha de uma medida de tendência
Massa Ganha
3,24
6,50
4,80
3,77 3,77 3,84
3,06
5,13
4,95
5,96
0
2
4
6
8
10
12
14
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Tanques
Ganho de Massa (g)
Massa Ganha
3,24
6,50
4,80
3,77 3,77 3,84
3,06
5,13
4,95
5,96
0
2
4
6
8
10
12
14
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Tanques
Ganho de Massa (g)
71
central, mediana, como representante de nossos valores, ignoraria essa grande
variabilidade e poderia prejudicar uma posterior discussão. Portanto escolhemos uma
abordagem alternativa onde plotamos todos os resultados das réplicas no gráfico de
dispersão (tanto na variável dependente quanto na independente).
A relação entre as duas varáveis foi então representada por uma elipse, que
variou de tamanho de acordo com a variabilidade dos dados, e que representa o espaço
onde esses valores apresentam probabilidades de serem encontrados. Os dados
apresentados dessa forma possibilitam diferentes interpretações. Podemos desenhar
ajustes escolhendo os cenários mais críticos (com réplicas com maiores valores de Hg
2+
na ração e tecidos) ou mais tolerantes (com as réplicas com menores valores de Hg
2+
na
ração e tecidos) com os dados disponíveis, não há maneira de calcular a probabilidade
que um cenário ou outro seja o verdadeiro, por isso apresentamos a abordagem
tradicional com os ajustes calculados com base na mediana.
Os camarões cultivados em condições intensivas apresentaram correlação
significativa entre a acumulação de Hg
2+
na ração e no músculo, com r: 0,54 e p < 0,05
(Figura 19); e na ração e no exoesqueleto, com r: 0,47 e p < 0,05 (Figura 20). Nenhuma
correlação significativa foi observada entre concentração de Hg
2+
na ração e no
hepatopâncreas (Figura 21).
72
Experimento Intensivo
Ração x Músculo
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
[Hg
2+
] Ração (ng.g
-1
)
0
10
20
30
40
50
60
[Hg
2+
] Músculo (ng.g
-1
)
r = 0,54; p < 0,05
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
Larvas
Figura 19: Correlação entre Hg
2+
nas rações e músculos dos animais submetidos a condições intensivas de
cultivo.
Experimento Intensivo
Ração x Exoesqueleto
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Ração (ng.g
-1
)
0
10
20
30
40
50
60
[Hg] Exoesqueleto (ng.g
-1
)
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
Larvas
r = 0,47; p < 0,05
Figura 20: Correlação entre Hg
2+
nas rações e exoesqueletos dos animais submetidos a condições
intensivas de cultivo.
73
Exp e ri m e nto Inte n si vo
Ra çã o x Hepato p âncreas
0 20 40 60 80 1 00 120 1 40 16 0 180
[Hg
2+
] Ra çã o (n g .g
-1
)
0
10
20
30
40
50
60
[Hg
2+
] Hepatopâncreas
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
Larvas
Figura 21: Correlação entre Hg
2+
nas rações e hepatopâncreas dos animais submetidos a condições
intensivas de cultivo.
Analisamos as correlações das concentrações de Hg
2+
de alguns tecidos para
estudar a transferência do metal entre eles. A concentração de Hg
2+
no músculo e
hepatopâncreas não apresentou correlação significativa, enquanto entre músculo e
exoesqueleto apresentou r: 0,53 e p<0,05 (Figura 22).
Figura 22: Distribuição de Hg
2+
entre o músculo e hepatopâncreas e músculo e exoesqueleto nos
camarões experimento em condições intensivas de cultivo.
T ransfe rên cia
M ú scul o - E xo e sq u e le to
0 5 1 0 15 2 0 25 3 0 35
[Hg
2+
] M úscu lo (n g.g
-1
)
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
[Hg
2+
] Exoesqueleto (ng.g
-1
)
r = 0 ,5 3; p < 0 ,0 5
T ra nsfe rên cia
He p ato pâ ncrea s - M ú scul o
0 1 0 20 3 0 4 0 50 6 0
[Hg
2+
] He pa top ân crea s (ng .g
-1
)
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
[Hg
2+
] Músculo (ng.g
-1
)
r = -0 ,23 22 ; p = 0 ,14 94
74
4.2.2 Expressão Gênica
Os resultados da expressão gênica da metalotioneína são apresentados com
relação à expressão do gene constitutivo β-actina.
A expressão gênica relativa da MT nas larvas, no músculo e no hepatopâncreas
de L. vannamei, em cada tanque (para cada tipo de ração) são apresentados na Figura
23. Não houve diferença significativa entre a expressão de metalotioneína nos animais
alimentados com rações com diferentes concentrações de Hg
2+
. Em todos os tratamentos
a expressão no hepatopâncreas foi maior que no músculo. A expressão nas larvas foi
similar àquela encontrada no músculo. A grande variabilidade aparente no gráfico
(extensão dos Box e presença de pontos extremos) é principalmente devido à escala do
gráfico, já que não alcançam nem mesmo uma ordem de grandeza dos valores (que
começariam a indicar significância biológica). Não foram encontrados valores extremos
de expressão no músculo.
Experi m e n to Intensi vo
Expressã o Re lati va
M e talo tione ína
M e di a na; Box: 2 5%-75% ; Wh i ske r: M ín i m o e M áxim o
T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 T 8 T 9 T 1 0 L a rvas
T a n q u e
-0.01
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Expressão Relativa MT/ACT
2Dct Hep
Outli e rs
Extre m os
2Dct M u s
Outli e rs
Extre m os
La rva s
Outli e rs
Extre m os
Figura 23: Expressão relativa do gene metalotioneína/β-actina no hepatopâncreas, músculo e larvas dos
camarões submetidos a condições intensivas de cultivo.
75
4.3 Experimento Extensivo
4.3.1 Concentração de Hg
2+
nas rações e nos tecidos
As amostras referentes ao segundo lote (mesmas marcas) de rações usadas no
experimento extensivo apresentaram valor máximo de 33,46 ng.g
-1
e mínimo de 5,41
ng.g
-1
(Figura 24). A mediana entre as concentrações de mercúrio foi de 13,06 ng.g
-1
. As
rações utilizadas nesse experimento apresentaram menores concentrações de Hg
2+
e
menor desvio padrão que as utilizadas no experimento intensivo. Portanto, os camarões
foram submetidos a menores concentrações de Hg
2+
. A escala do gráfico foi ajustada as
maiores concentrações encontradas no experimento intensivo, possibilitando a
comparação entre os lotes das rações utilizados nos dois experimentos.
Hg
2+
Ração - Extensivo
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Tanques
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
[Hg
2+
] Ração (ng.g
-1
)
Mediana
25%-75%
Máx. Mín.
Outliers
Extremos
Figura 24: Concentração de Hg
2+
nas rações usadas no experimento extensivo.
As concentrações de mercúrio encontradas no músculo, exoesqueleto e
hepatopâncreas foram medidas em triplicata. As concentrações de Hg
2+
mais elevadas
foram no músculo dos camarões do T3 (15,28 ng.g
-1
; Méd: 10,66 ng.g
-1
) e no
hepatopâncreas do T10 (13,63 ng.g
-1
; Méd: 12,51 ng.g
-1
). A partir desses valores foi
76
gerado um gráfico Box-plot para demonstrar da distribuição do metal em cada tecido,
para cada tratamento (Figura 25).
Experimento Extensivo
[Hg
2+
] Tecidos
Mediana; Box: 25%-75%; Whisker: Variabilidade
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tanques
0
10
20
30
40
50
60
70
[Hg
2+
] ng.g
-1
Músculo
Outliers
Extremos
Hepato
Outliers
Extremos
Exo
Outliers
Extremos
Figura 25: Concentrações de Hg
2+
encontradas nos diferentes tecidos dos camarões cultivados em
condições intensivas.
A Tabela 4 apresenta os valores de carga total de Hg
2+
nos tecidos dos camarões
expostos ao contaminante no experimento extensivo. Os valores são menores que no
experimento intensivo, tanto em termos de carga total, quanto no percentual relativo
entre os tecidos.
Tabela 4: Carga total de Hg
2+
nos tecidos dos camarões cultivados em condições extensivas.
Tanque
Carga no
Músculo (ng)
Carga no
Hepatopâncreas (ng)
Carga no
Exoesqueleto (ng)
%
Exo/Mus
%
Hep/Mus
T1 13,5 0,3 1,6 12,1% 2,4%
T2 32,8 1,2 4,5 13,6% 3,6%
T3 98,9 2,8 10,6 10,8% 2,9%
T4 13,0 0,2 1,2 9,0% 1,9%
T5 28,4 0,8 5,2 18,1% 3,0%
T6 28,6 0,8 3,4 11,9% 3,0%
T7 38,8 0,9 4,4 11,3% 2,3%
T8 28,6 0,9 5,8 20,4% 3,3%
T9 47,6 1,9 6,1 12,8% 3,9%
T10 99,5 3,2 7,6 7,6% 3,3%
77
A Figura 26 mostra o ganho de massa dos camarões durante o experimento. Com
isso foi possível avaliar se existe associação com a concentração de Hg
2+
nos
compartimentos e rações (ver Figura 30).
Figura 26: Massa ganha (g) dos camarões durante os 70 dias de experimentação em condições extensivas.
No experimento em condições de cultivo extensivas, as correlações entre a
concentração de mercúrio na ração e no músculo apresentaram ajuste exponencial com
r: 0,70 e p < 0,05 (Figura 27). O exoesqueleto foi o único que apresentou correlação
linear com a concentração de Hg
2+
na ração, com r: 0,75 e p < 0,05 (Figura 28); e o
hepatopâncreas, assim como o músculo, ajuste exponencial, com r: 0,90 e p < 0,05
(Figura 29).
Massa Ganha
10,64
11,89
12,38
10,88
10,21
12,28
11,72
10,83
11,95
10,63
0
2
4
6
8
10
12
14
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Tanques
Ganho de Massa (g)
Massa Ganha
10,64
11,89
12,38
10,88
10,21
12,28
11,72
10,83
11,95
10,63
0
2
4
6
8
10
12
14
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Tanques
Ganho de Massa (g)
78
Experimento Extensivo
Ração x Músculo
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
[Hg
2+
] Ração
0
10
20
30
40
50
60
[Hg
2+
] Músculo (ng.g
-1
)
r = 0,70; p < 0,05
T 1
T 2
T 3
T 4
T 5
T 6
T 7
T 8
T 9
T 10
Figura 27: Correlação entre Hg
2+
nas rações e músculos dos animais submetidos a condições extensivas
de cultivo.
Experimento Extensivo
Ração x Exoesqueleto
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
[Hg
2+
] Ração
0
10
20
30
40
50
60
[Hg
2+
] Exoesqueleto (ng.g
-1
)
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
r = 0,75; p < 0,05
Figura 28: Correlação entre Hg
2+
nas rações e exoesqueletos dos animais submetidos a condições
extensivas de cultivo.
79
Experimento Extensivo
Ração x Hepatopâncreas
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
[Hg
2+
] Ração
0
10
20
30
40
50
60
[Hg
2+
] Hepatopâncreas (ng.g
-1
)
r = 0,90; p < 0,05
T 1
T 2
T 3
T 4
T 5
T 6
T 7
T 8
T 9
T 10
Figura 29: Correlação entre Hg
2+
nas rações e hepatopâncreas dos animais submetidos a condições
extensivas de cultivo.
Não foi observada relação entre Hg
2+
e o peso ganho dos camarões (Figura 30).
Crescimento
Experimento Intensivo e Extensivo
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
[Hg
2+
] Ração ng.g
-1
2
4
6
8
10
12
14
Peso Ganho (g)
Intensivo
Extensivo
Figura 30: Correlação entre Hg2
+
nas rações com o crescimento dos camarões expostos no experimento
intensivo (peso inicial- 0,9 g) e extensivo (peso inicial- 2,4 g).
80
As correlações entre as concentrações de Hg
2+
no músculo e no hepatopâncreas
foram significativas, com r: 0,88 e p<0,05; assim como entre o músculo e o
exoesqueleto, com r: 0,78 p<0,05 (Figura 31).
Figura 31: Distribuição de Hg
2+
entre o músculo e hepatopâncreas e entre músculo e exoesqueleto nos
camarões submetidos a condições extensivas de cultivo.
4.3.2 Expressão Gênica
A expressão gênica relativa da MT, no músculo e no hepatopâncreas de L.
vannamei, em cada tanque (para cada tipo de ração), no experimento extensivo são
apresentados na Figura 32. Novamente, não houve diferença significativa entre a
expressão de metalotioneína nos animais alimentados com rações com diferentes
concentrações de Hg
2+
. Em todos os tratamentos a expressão no hepatopâncreas foi
maior que no músculo, com variabilidade menor que no experimento em condições
intensivas.
T ra n sfe rê n ci a
Hep ato pâ ncre as - M ú scu l o
0 1 0 2 0 30 40 50 6 0
[Hg
2+
] He pa to p â n cre as (n g.g
-1
)
0
10
20
30
40
50
[Hg
2+
] Músculo (ng.g
-1
)
r = 0,89; p < 0,05
T ra n sfe rê n ci a
M ú scu lo - E xoe squ el e to
0 10 20 30 40 50
[Hg
2+
] M ú scu lo (n g .g
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
[Hg
2+
] Exoesqueleto (ng.g
-1
)
r = 0,79; p < 0,05
81
Expressão Relativa
Metalotioneína
Experimento Extensivo
Mediana; Box: 25%-75%; Whisker: Mínimo e Máximo
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
Tanques
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Expressão Relativa MT/ACT
2Dct Hep
Outliers
Extremos
2Dct Mus
Outliers
Extremos
Figura 32: Expressão relativa do gene metalotioneína do músculo e hepatopâncreas dos camarões
submetidos a condições extensivas de cultivo.
4.4 Amostragem Viveiros
4.4.1 Concentração de Hg
2+
nos Tecidos
As concentrações de mercúrio encontradas no músculo, hepatopâncreas,
exoesqueleto e larvas foram medidas em triplicata. A partir desses valores, foi gerado
um gráfico Box-plot (Figura 33) para demonstrar a distribuição do metal em cada tecido
nos diferentes estágios de desenvolvimento (representado pelo dia de vida) dos
camarões coletados nos viveiros da fazenda COMPESCAL.
82
Viveiros
[Hg
2+
] Tecidos
-20 0 20 40 60 80 100 120 140
Dias
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
[Hg
2+
] ng.g
-1
Musculo
Outliers
Extremos
Hepato
Outliers
Extremos
Exo
Outliers
Extremos
Larvas
Outliers
Extremos
Figura 33: Concentrações de Hg
2+
encontradas nos diferentes tecidos dos camarões coletados nos viveiros
da fazenda COMPESCAL.
A Tabela 5 apresenta os valores de carga total de Hg
2+
nos tecidos dos camarões
expostos amostrados nos viveiros. Os valores foram proporcionais ao tamanho dos
indivíduos nas diferentes fases do cultivo. Porém podemos observar uma relação inversa
entre o tempo de cultivo, a carga no tecido e a carga relativa entre músculo e
exoesqueleto.
Tabela 5: Carga total de Hg
2+
nos tecidos dos camarões amostrados na fazenda COMPESCAL
Dias
Carga no
Músculo (ng)
Carga no
Hepatopâncreas (ng)
Carga no
Exoesqueleto (ng)
%
Exo/Mus
%
Hep/Mus
40 8,4 1,8 3,9 47% 22%
90 82,0 2,3 18,3 22% 3%
105 72,3 3,9 23,0 32% 5%
130 119,1 2,8 21,0 18% 2%
83
Não foi possível calcular o ganho de peso, mas pudemos avaliar o peso médio
com relação ao tempo de vida no cultivo (Figura 34).
Figura 34: Peso médio dos camarões coletados na fazenda COMPESCAL, em diferentes estágios de
desenvolvimento.
Como não há dados de Hg
2+
na ração dos animais amostrados nos viveiros,
decidimos utilizar o número de dias de cultivo como variável independente para avaliar
a cinética do acúmulo do metal. Houve correlação logarítmica entre tempo de cultivo e a
concentração de Hg
2+
no músculo, com r: 0,67 e p<0,05 (Figura 35); e no exoesqueleto
com r: 0,46 p<0,05 (Figura 36). Já no hepatopâncreas não houve correlação significativa
(Figura 37).
Vi ve i ros
M ú scul o x Dias
0 20 40 6 0 80 10 0 1 2 0 140
Di a s
6
8
10
12
14
16
18
20
22
[Hg
2+
] Músculo (ng.g
-1
)
r = 0 ,57; p < 0 ,0 5
40
90
105
130
Larva s
Figura 35: Correlação entre os dias de cultivo e Hg
2+
nos músculos dos camarões retirados dos viveiros da
fazenda COMPESCAL.
Peso Médio - Viveiros
0
2
4
6
8
10
12
40 Dias 90 Dias 105 Dias 130 Dias
Tempo de Vida
Peso M
édio (g)
Peso Médio - Viveiros
0
2
4
6
8
10
12
40 Dias 90 Dias 105 Dias 130 Dias
Tempo de Vida
Peso M
édio (g)
Peso Médio - Viveiros
0
2
4
6
8
10
12
40 Dias 90 Dias 105 Dias 130 Dias
Tempo de Vida
Peso M
édio (g)
Peso Médio - Viveiros
0
2
4
6
8
10
12
40 Dias 90 Dias 105 Dias 130 Dias
Tempo de Vida
Peso M
édio (g)
84
Vive i ro s
Exoesq ueleto x Di a s
0 20 40 60 80 10 0 120 1 40
Di a s
10
12
14
16
18
20
22
24
26
[Hg
2+
] Exoesqueleto (ng.g
-1
)
4 0
9 0
1 0 5
1 3 0
Larva s
r = 0 ,46; p < 0,0 5
Figura 36: Correlação entre os dias de cultivo e Hg
2+
nos exoesqueletos dos camarões retirados dos
viveiros da fazenda COMPESCAL.
Viveiro s
He p a top âncre a s x Dia s
0 20 40 60 8 0 1 00 12 0 140
Di a s
8
10
12
14
16
18
20
22
[Hg
2+
] Hepatopâncreas (ng.g
-1
)
4 0
9 0
1 0 5
1 3 0
L a rvas
Figura 37: Correlação entre os dias de cultivo e o Hg
2+
no hepatopâncreas dos camarões retirados dos
viveiros da fazenda COMPESCAL.
85
Foi verificada correlação significativa (r= 0,97 e p<0,05) entre o peso e o tempo
de cultivo, apesar da ausência de ganho de peso no período de 90 e 105 dias (Figura 38).
Viveiros
Peso Médio x Dias de Cultivo
20 40 60 80 100 120 140
Dias de Cultivo
0
2
4
6
8
10
12
Peso Médio (g)
Peso Médio
r = 0,97; p < 0,05
Figura 38
:
Correlação entre os dias de cultivo e o Hg
2+
e peso médio dos camarões retirados dos viveiros
da fazenda COMPESCAL.
A correlação entre as concentrações de Hg
2+
entre os tecidos foram significativas
entre o tecido muscular e exoesqueleto (r= 0,54) nos indivíduos coletados nos viveiros.
A correlação músculo e hepatopâncreas apresentaram r: 0,05 (Figura 39).
Figura 39: Distribuição de Hg
2+
entre o músculo e hepatopâncreas e músculo e exoesqueleto nos
camarões experimento em moldes extensivos de cultivo.
T ra nsfe rên cia
He p ato pâ ncrea s - M ú scul o
0 1 0 20 3 0 4 0 50 6 0
[Hg
2+
] He pa top ân crea s (ng .g
-1
)
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
[Hg
2+
] Músculo (ng.g
-1
)
r = 0,056
T ra n sfe rê n ci a
M ú scu lo - E xoe squ el e to
0 10 20 30 40 50
[Hg
2+
] M ú scu lo (n g .g
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
[Hg
2+
] Exoesqueleto (ng.g
-1
)
r = 0,54; p < 0,05
86
4.4.2 Expressão Gênica
Novamente o hepatopâncreas foi o tecido com maior expressão relativa do gene
metalotioneína com valores entre 0,006 e 0,013. Já o músculo, como nos outros
experimentos, foi verificado um padrão mais estável de expressão, com expressão
relativa do gene entre 0,002 e 0,003 (Figura 40). Não houve diferença significativa entre
a expressão de metalotioneína nos animais em diferentes fases do ciclo de cultivo
(incluindo as larvas).
Expressão Relativa
Metalotioneína
Viveiros
Mediana; Box: 25%-75%; Whisker: Máximo e Mínimo
Viv1 Viv2 Viv3 Viv4 Larvas
Viveiros
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Expressão Relativa MT/ACT
2Dct Hep
Outliers
Extremos
2Dct Mus
Outliers
Extremos
2Dct Lar
Outliers
Extremos
Figura 40: Expressão relativa do gene metalotioneína do músculo e hepatopâncreas dos camarões
coletados nos viveiros da fazenda COMPESCAL.
5. Discussão
5.1 Aspectos da Toxicocinética do Hg
2+
A toxicocinética compreende todas as etapas desde o momento em que o
organismo entra em contato com o contaminante no ambiente. Esse contaminante passa
por etapas de biotransformação e distribuição no organismo, até que por fim é
87
eliminado, ou alcança uma molécula alvo, podendo ser acumulado ou acarretando um
efeito tóxico. A biodisponibilidade de um contaminante vai depender da espécie
química em que ele se apresenta no ambiente, mas é principalmente dependente desses
processos toxicocinéticos que são específicos de uma espécie e de um indivíduo.
Neste trabalho, o acúmulo de contaminantes nos tecidos é visto como um
processo toxicocinético, dependente da concentração do contaminante no ambiente e do
tempo de exposição (dose), e também da via de exposição. Os mecanismos de
distribuição, biotransformação, eliminação e acúmulo, incluindo a destoxificação por
proteínas metalotioneínas, acontecem de maneira diferente em cada tecido. Por isso,
vamos discutir os resultados a partir dessas unidades de organização.
5.1.1 Hepatopâncreas
Por possuir função de fígado, estômago e intestino e ainda ser o primeiro órgão a
ser exposto a quaisquer substâncias obtidas pela dieta, o hepatopâncreas sempre
apresenta altas concentrações de contaminantes, e não é diferente com o mercúrio.
O hepatopâncreas foi o tecido que apresentou maior variabilidade no acúmulo,
especialmente nos animais expostos a concentrações mais altas de mercúrio.
As concentrações de Hg
2+
encontradas no hepatopâncreas de animais do
experimento extensivo, mostraram que os camarões são capazes de acumular o metal
exponencialmente quando submetidos a concentrações de até 40 ng.g
-1
de Hg
2+
no
alimento. Por outro lado, quando expostos a concentrações mais elevadas, ou ao longo
de um período de exposição maior, não foi observada correlação significativa. No
experimento intensivo, a ração que possuía a maior concentração de Hg
2+
(124 ng.g
-1
),
levou ao acúmulo de 25,6 ng.g
-1
de Hg
2+
, enquanto outra marca com 21 ng.g
-1
, levou à
concentrações maiores (39,1 ng.g
-1
). Essa alta variabilidade e concentrações de Hg
2+
menores que nos músculos nos surpreenderam, já que é descrito na literatura que o
hepatopâncreas é o principal tecido para acúmulo de Hg
2+
. Ruelas-Inzunza et al., (2004)
88
demonstraram que além do músculo, o hepatopâncreas dos camarões peneídeos também
é considerado alvo para acumulação de metais. No mesmo artigo, em comparação com
outras espécies, o L. vannamei foi à espécie que acumulou concentrações mais altas de
Hg
2+
no hepatopâncreas (720 ng.g
-1
).
Sem um estudo desenhando especialmente para avaliar os principais
mecanismos de destoxificação nesse órgão, a versatilidade do hepatopâncreas acaba
sendo a melhor explicação para as amplitude das concentrações. Andrés et al., (2002),
mostram que no siri azul, Callinectes sapidus, a ação de bombas dependentes de ATP
nos intestinos, órgão similar aos hepatopâncreas dos camarões, favorece o acúmulo de
mercúrio nesse órgão. Esse tipo de atividade apresenta maior variação de um indivíduo
para outro, podendo levar a variabilidade observada.
Alguns autores sugerem que uma exposição anterior a metais traço, pode
influenciar na subseqüente exposição, tanto na parte de ingestão quanto na
bioacumulação (Boisson et al., 1998; Rainbow et al., 1999; Wang, 2002). Wang &
Rainbow (2005) revisaram estudos recentes na influência do histórico de exposição a
metal pesado numa subseqüente assimilação de metais em invertebrados marinhos. Os
autores verificaram que geralmente, a absorção de mercúrio dissolvido é reduzida após
exposição a outros metais como Ag
2+
, Cd
2+
, Cu
2+
e Zn
2+
. Rosijadi & Fellingham, (1987)
indicam que a exposição do mexilhão M. edulis a Cu
2+
aumenta a tolerância a Hg
2+
, que
pode ser causada pela redução de absorção de Hg
2+
da solução, assim como
destoxificação do Hg
2+
que está se associando a metalotioneínas.
Além do mercúrio, outros metais aparecem como contaminantes nas rações
comerciais para camarões. Lacerda et al., (2004) verificaram concentrações de Cu
2+
e
Zn
2+
consideradas elevadas nas rações (Cu
2+
- 13 a 79 g.g
-1
; Zn
2+
- 63 a 45 g.g
-1
) e
insumos (Cu
2+
- 0,7 a 3 g.g
-1
; Zn
2+
- 0,7 a 3 g.g
-1
) usados normalmente por produtores
de camarão da Bacia do rio Jaguaribe, sujeitando os camarões a longos períodos de
89
exposição a esses metais, podendo então estar influenciando os sistemas de acúmulo no
hepatopâncreas desses indivíduos. Santos et al., (2005) mostraram que L. vananmei
coletados nas mesmas fazendas utilizadas nesse estudo estavam contaminados com
Cu
2+
, um metal que pode competir com sítios de ligação e vias de entrada com o Hg
2+
,
resultando em alta variabilidade.
Pelo fato de não ter apresentado correlações com as concentrações de Hg
2+
,
provavelmente o hepatopâncreas não seria o tecido adequado para ser utilizado como
um sentinela da contaminação por mercúrio.
A análise de regressão considerando as concentrações de mercúrio no
hepatopâncreas como variável independente e as concentrações no músculo como
variável dependente, foi significativa, sugerindo que há transferência entre os dois
tecidos, e o que é acumulado no músculo, teve origem no hepatopâncreas.
5.1.2 Músculo
Em todas as amostras, dos experimentos em laboratório e das amostras
provenientes dos viveiros, observou-se um acúmulo proporcional de Hg
2+
no músculo.
Foram encontradas correlações significativas com o Hg
2+
presente nas rações e no
tecido muscular no experimento intensivo. As correlações exponenciais no experimento
extensivo sugerem que os camarões submetidos às rações com menores concentrações
de Hg
2+
, de até 33 ng.g
-1
ainda não saturaram o sistema de acúmulo desse metal no
tecido muscular. Já os que foram expostos a rações com concentrações mais altas de
mercúrio (até 154 ng.g
-1
) no experimento intensivo, apresentaram correlação
logarítmica, sugerindo um limite para o acúmulo para esse metal no músculo. Nos
viveiros de cultivo, o acúmulo de Hg
2+
foi correlacionado com o tempo de cultivo.
Apesar de não termos valores de Hg
2+
na ração dos viveiros, as fontes são as mesmas
das rações utilizadas nos experimentos e não há razão para crer que não possuem
contaminação por Hg
2+
. Os dados sugerem que, independente da concentração de
90
mercúrio que estão submetidos, provavelmente os camarões acumulam mercúrio no
tecido muscular ao longo de todo ciclo de engorda.
Evans et al., (2000) observaram que camarões e siris expostos a ração com
1g.g
-1
de Hg
2+
durante 28 dias também apresentaram acúmulo no músculo da ordem de
72% e 76% do encontrado na ração. Mas esses valores ainda estão muito abaixo
daqueles encontrados para camarões selvagens. Ruelaz-Inzunza et al. (2004)
encontraram concentrações de Hg
2+
no músculo de L. vannamei selvagem da ordem de
0,2 µg.g
-1
.
O tecido muscular é um dos principais alvos das espécies orgânicas de mercúrio
em muitos organismos, especialmente em peixes (Amlund et al., 2007). A grande
afinidade do Hg
2+
pela bomba de sódio potássio não é necessariamente a razão para esse
grande acúmulo, mas representa um grande risco para a homeostase do organismo, já
que pode prejudicar a transmissão do impulso nervoso e a contração muscular. De fato,
esse é um dos principais sintomas da intoxicação por Hg
2+
, por exemplo, em humanos.
Não há referência de como o Hg
2+
chega até esse tecido. Gordon et al., (1987)
mostraram que raramente os metais são encontrados em solução no sangue (ou na
hemolinfa), estando sempre associados a proteínas, como a albumina. Em invertebrados,
os hemócitos são notórios por transportarem metais dos locais onde eles são absorvidos
(como as brânquias) até a glândula digestiva (Marigomez et al., 2002), mas não
diretamente para o músculo. Com a ração como principal via de exposição, podemos
supor que o metal está sendo absorvido via trato digestivo e a partir do hepatopâncreas
sendo re-distribuído pelas vias sistêmicas e alcançando os outros tecidos, e o músculo.
As correlações significativas com as concentrações de Hg
2+
na ração
(compartimento ambiental) indicam que esse tecido é capaz de representar a situação
ambiental, podendo funcionar como sentinela da contaminação ambiental.
91
5.1.3 Exoesqueleto
No experimento extensivo, o exoesqueleto apresentou as menores concentrações
de Hg
2+
e foi o único que acumulou o metal de forma linear. Quando submetidos às
rações com maiores concentrações de mercúrio no experimento intensivo, o
exoesqueleto mostrou saturação no acúmulo. Já nos viveiros, as concentrações mais
elevadas foram encontradas nos camarões com idade intermediária de 105 dias ao invés
dos camarões mais velhos (e conseqüentemente expostos ao contaminante por mais
tempo). Neste estudo, a maior concentração no exoesqueleto de L. Vannamei foi 27
ng.g
-1
de Hg
2+
, abaixo daquelas encontradas por Ruelas-Inzunza et al., (2004) em L.
vananmei selvagens que apresentavam até 90 ng.g
-1
de Hg
2+
no exoesqueleto,
concentrações essas que ainda foram consideradas baixas pelos autores (já que os
camarões haviam sido coletados em locais reconhecidamente contaminados por
efluentes residuais de agricultura intensiva e esgoto urbano).
Já Khan et al., (1995), quantificaram a concentração de vários metais traço em
exoesqueleto de lagostins, mas não conseguiram encontrar concentrações detectáveis de
Hg
2+
. Paez-Osuna et al., (1996), ao analisar as concentrações de alguns metais traço
(Fe
2+
, Mn
2+
, Ni
2+
, Cu
2+
, Cd
2+
, Zn
2+
) em diferentes tecidos, incluindo o exoesqueleto de
camarões L. vannamei selvagens e de cultivo, encontraram concentrações detectáveis de
todos os metais essênciais em todos os tecidos, porém o metal não essencial Cd
2+
não
foi detectado no músculo e exoesqueleto.
Isso nos leva a questionar a capacidade do exoesqueleto de funcionar como
mecanismo de destoxificação do mercúrio. Na literatura, as informações referentes à
capacidade do exoesqueleto estar atuando como acumulador no período pré-muda e
contribuir na destoxificação na muda propriamente dita, são ambíguas. Reinfelder &
Fisher, (1994); Bertine & Goldberg, (1972); Khan et al., (1989) e Smokorowski et al.,
(1998), propuseram que o exoesqueleto dos crustáceos pode seqüestrar metais e
92
contribuir para a depuração pelo mecanismo da muda. Weeks et al., (1992) propuseram
que a muda seria uma etapa preponderante na transferência do metal pesado dos tecidos
moles para o exoesqueleto, com um papel importante na destoxificação dos crustáceos.
No entanto, Fowler et al., (1971) mostraram que apesar de camarões
destoxificarem pela muda 41% do Zn
2+
corpóreo acumulado após exposição na fase
dissolvida, o contaminante estava na verdade aprisionado nos espaços intersticiais do
exoesqueleto. Quando o Zn
2+
era acumulado através da dieta, era depositado na camada
mais interna do exoesqueleto e, em experimentos longos, apenas 1% do que foi
acumulado pela alimentação foi eliminado pela muda. Essa baixa depuração é
corroborada por autores que encontram quantidades irrisórias de Cu
2+
e Zn
2+
na exúvia
(exoesqueleto liberado) de anfípodas (Weeks et al., 1992) e do siri C. sapidus (Engle,
1987).
Keatles & Flegger (2001) mostraram que as concentrações de Cu
2+
no corpo
eram maiores do que no exoesqueleto de indivíduos no período “intermolt” (antes da
muda), em comparação com aqueles indivíduos que já haviam mudado. Já os valores
encontrados nas exúvias foram significativamente menores do que no exoesqueleto dos
animais no período pós-muda. Esses dados sugerem que o que vai para o exoesqueleto
no período pré-muda é reincorporado pelo corpo antes de ocorrer à ecdise, voltando
depois para o exoesqueleto. Ou seja, o exoesqueleto funcionaria mais como um
reservatório dos metais essenciais.
Esse mecanismo não seria o mesmo para os metais não essenciais (categoria do
mercúrio). Para cádmio, por exemplo, os resultados sugerem que o exoesqueleto
seqüestra uma grande parte (40%) da carga total do organismo. O total de Cd
2+
corpóreo
encontrado foi significativamente menor (26%) nos animais pós-ecdise do que naqueles
que estão no período pré-muda. Esses dados sugerem que ao menos para o Cd
2+
, a
exúvia contribuiu substancialmente para a depuração.
93
Outro aspecto importante na determinação da importância da muda como
mecanismo de destoxificação, é a definição do período exato da ocorrência da muda e
da quantidade de vezes que um organismo muda ao longo da vida, uma vez que esse
fenômeno é afetado por uma série de características do ambiente, como salinidade,
temperatura e pH. Apesar dessa dificuldade, a ABCC (2002), sugere que no primeiro
ano de vida os camarões sofrem muda em torno de 25 vezes. Com o cálculo de carga
total de metal nos tecidos, esse número já seria suficiente para estimar se poderia haver
depuração através do exoesqueleto.
Nos nossos experimentos, os valores de Hg
2+
encontrados para exoesqueleto
estiveram sempre mais baixos do que nos outros tecidos, sugerindo que a destoxificação
via muda era dispensável. Já nos viveiros, o exoesqueleto foi o tecido que apresentou as
concentrações de mercúrio mais altas (24,29 ng.g
-1
) nos camarões que se encontravam
em torno de 105 dias de vida.
Apenas nos viveiros poderíamos estimar o acúmulo e a depuração ao longo do
tempo. De fato, observamos que enquanto as concentrações no músculo subiram
progressivamente da primeira (40 dias) à última etapa do cultivo (130 dias), no
exoesqueleto as concentração na última etapa caíram para (14 ng.g
-1
), que pode ser
resultado de processos de desintoxicação. Porém, sem o acompanhamento da
concentração de mercúrio nas rações que eram fornecidas a esses animais essa
possibilidade fica reduzida a especulação.
O grande interesse da muda como mecanismo de destoxificação passa pela
forma de como esses metais estariam sendo transportados de um compartimento a outro
por ATPases transportadoras de metais. O gasto energético dessas proteínas, que
consomem ATP para transportar cátions contra gradientes químicos ou elétricos,
poderiam inclusive afetar o crescimento dos animais. Mas segundo Baeta et al., (2005)
94
nenhum efeito da muda nas concentrações de outros tecidos podem ser testados, uma
vez que os períodos de muda são considerados difusos e ocorrerem durante o ano todo.
A análise de regressão dessa vez considerando as concentrações de mercúrio no
músculo como variável independente e as concentrações no exoesqueleto como variável
dependente, também foram significativas, sugerindo que há transferência entre os dois
tecidos, e o que chega ao exoesqueleto teve origem no músculo.
5.2 Ração
Existem rações específicas para cada etapa do desenvolvimento dos camarões
criados em cativeiro, desde a fase de náuplio até a fase final de engorda. As rações
podem ser produzidas por diferente fabricantes, que usam farinha de peixe como
principal insumo. A farinha de peixe é um produto seco, moído, obtido pela cocção do
peixe integral, de seus cortes ou de ambos, com ou sem extração de parte do óleo. A
legislação nacional diz que a farinha deve ser “Isenta de materiais estranhos à sua
composição, bem como microorganismos patogênicos”. Nas rações utilizadas nesse
estudo, verificamos que, entre diferentes marcas ou entre diferentes lotes de uma mesma
marca, as concentrações de mercúrio chegaram a variar até 10 vezes.
Uma das marcas apresentou 15 ng.g
-1
de Hg
2+
em um lote, enquanto em outro a
concentração era de 124 ng.g
-1
de Hg
2+
. Outras marcas apresentaram diferenças entre os
lotes de 1, 3 e 4 vezes. Entre as marcas de ração utilizadas nos experimentos, a variação
na concentração de mercúrio foi de 6 a 8 vezes no intensivo e até seis vezes na segunda
bateria de trabalho.
A portaria n
o
07 de 9 de novembro de 1988 do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA) determina que é obrigatória a informação das
matérias primas empregadas na alimentação animal. A Instrução Normativa n
o
04 de 23
de fevereiro de 2007 do MAPA obriga a utilização de boas práticas na fabricação das
95
rações. Entretanto, não há obrigatoriedade da informação da presença de substâncias
contaminantes nas rações. A autoridade européia de segurança alimentar (EFSA -
European Food Safety Authority), estabeleceu limites para a concentração de Hg
2+
em
rações utilizadas na alimentação de animais criados em cativeiro. Nas rações que são
produzidas com farinha de peixe em sua composição, o limite é de 100 ng.g
-1
. Já os
peixes, ou outro animal marinho utilizado para a fabricação de farinha de peixe, não
podem apresentar mais de 500 ng.g
-1
. Dentro das amostras de ração utilizadas em nossos
experimentos, apenas uma ração apresentou concentração fora do limite máximo
permitido pela EFSA. No entanto, a variabilidade nos lotes mostra a importância de
monitorar a concentração de Hg
2+
e outros metais tanto na ração, quanto no principal
insumo (farinha de peixe) com base nos parâmetros Europeus até que tenhamos
parâmetros estabelecidos pelo MAPA.
5.3 Crescimento
No experimento extensivo, não foi verificada nenhuma associação entre as
concentrações de mercúrio encontrados nas rações com o ganho de peso dos camarões.
Provavelmente a contaminação de mercúrio nas rações não foi suficiente para afetar o
desenvolvimento dos camarões. Rações com 35 ng.g-
1
e 30 ng.g
-1
de Hg
2+
, promoveram
ganho de massa elevados de 10,6 g e 12,4 g, respectivamente. Esses dados sugerem que
no experimento extensivo, o valor nutricional da ração pode estar compensando efeitos
adversos da presença do Hg
2+
no balanço energético do animal e contribuindo
efetivamente para o crescimento dos camarões. Além disso, nesse experimento, durante
todos os 70 dias, os camarões tiveram acesso ao alimento integralmente, não ocorrendo
limpeza dos tanques ou retirada das sobras da ração que era oferecida diariamente. E os
animais podiam fazer uso de outras fontes nutricionais, como fitoplâncton e nutrientes
96
dissolvidos, já que a água que alimentava os tanques era bombeada diretamente de um
mangue localizado atrás do complexo onde foram realizados os experimentos.
Os indivíduos do experimento em condições de cultivo intensivo, apresentaram
ganho de massa significativamente menor do que os que foram submetidos às condições
extensivas. Ainda que a massa dos animais no início do experimento intensivo fosse
menor que a massa dos camarões do extensivo, os primeiros apresentaram ganho de
peso máximo de 6,2 g, enquanto os do extensivo chegaram a dobrar esse valor ao final
dos 70 dias. É possível que as maiores concentrações de mercúrio nas rações desse
experimento (55, 60 e 122 ng.g
-1
) tenham sido um fator complementar para esse
pequeno ganho de peso, mas certamente o contato com a ração por apenas 2,5 h e a
ausência de outras fontes de alimento, foram os fatores decisivos para o ganho de massa
inferior aos dos animais do experimento extensivo.
Nos viveiros, os camarões apresentaram ganho de peso importante até o
nonagésimo dia, onde praticamente estacionaram até o centésimo quinto dia, ganhando
peso novamente até o 130
o
dia.
Durante os primeiros 50 dias nos viveiros, os animais apresentaram um aumento
na concentração de mercúrio no músculo. É possível que eles tenham sido submetidos a
altas concentrações de Hg
2+
, mas como não sabemos o quanto de mercúrio existia nas
rações utilizadas nessa etapa de cultivo, só podemos especular. Nos 15 dias em que os
camarões não apresentaram crescimento, notamos, decréscimo na concentração de
mercúrio no exoesqueleto e tecido muscular. É possível que o desvio de energia para
ativação de ATPases como tentativa de destoxificação, indicada pela redução do
mercúrio no músculo, tenha alterado o balanço energético dos animais e causado essa
redução súbita e conseqüente retardo no desenvolvimento dos indivíduos.
A redução da concentração de Hg
2+
no músculo também pode ser atribuída ao
fenômeno de diluição biológica (Nimmi, 1983). O aumento da massa muscular é
97
superior ao aumento da contaminação, que acaba por diluir o contaminante presente no
tecido. Dessa forma, uma ração com grande valor nutricional, poderia influenciar na
concentração de Hg
2+
nos tecidos, por promover grande aumento de massa. Karimi et
al., (2007) viram que quando o microcrustáceo Daphnia pulex era alimentado com algas
contaminadas com mesmas concentrações de metil mercúrio (MeHg), mas um grupo
com alto e outro com baixo valor nutricional, os animais apresentavam concentrações de
Hg
2+
diferentes nos tecidos. As que se alimentaram das algas com melhor qualidade
nutricional apresentavam menores concentrações de mercúrio, justamente porque
cresceram 3,5 vezes mais, resultando no fenômeno diluição biológica. Essa é a provável
explicação para as menores concentrações mercúrio na última fase de engorda nos
viveiros (130 dias), quando os animais apresentam o maior peso.
5.4 Expressão Gênica
A expressão de um gene em resposta a uma variação ambiental é um aspecto de
toxicodinâmica. Como vimos, a MT é capaz de responder a presença de metal,
funcionando como um biomarcador de exposição em muitos organismos. A MT
também pode ser a primeira linha de defesa contra a intoxicação. Nesse caso, os metais
que vão atingir as moléculas “alvos” dentro da célula poderão ser influenciados por
essas defesas. E essa será a nossa principal linha de discussão, o papel toxicocinético da
expressão da MT, influenciando na disponibilidade dos metais traço para os alvos
celulares. Dessa forma a toxicidade ocorreria quando a capacidade dessas MTs de se
ligarem ao metal se excedesse (Hogstrand & Haux, 1991; Klessen, 2001).
O primeiro ponto a ser discutido é se a expressão da MT em L. vannamei é basal
e constitutiva. Em ambos os tecidos analisados observamos pequenas quantidades de
MTs sendo expressa. A expressão da metalotioneína foi significativamente menor que a
expressão do gene constitutivo actina em todas as amostras analisadas. Isso sugere que
98
se existe expressão constitutiva da metalotioneína no camarão L. Vannamei os valores
são bastante baixos.
Ao quantificarmos a expressão relativa durante o ciclo de cultivo, incluindo a
fase larval, também encontramos expressão de MT em todas as amostras. Isso sugere
que, independente da presença de um mecanismo de indução, a MT tem uma expressão
basal/constitutiva em todos os estágios de vida e tecidos.
A indução é a base para um mecanismo de destoxificação eficiente. Sem
indução, um sistema de destoxificação dependente apenas da expressão basal. Mesmo
que haja indução, o sistema pode alcançar um equilíbrio após um primeiro instante. L.
vannamei não apresenta indução mesmo quando submetidos a concentrações de Hg
2+
de
até 140 ng.g
-1
.
A literatura é escassa quanto à contaminação por Hg
2+
e a expressão de
metalotioneína em camarões, por isso seguiremos a discussão tentando associar nossos
resultados com o que já foi visto para outros metais não essenciais.
O Cd
2+
é o mais notório indutor de MT, apesar da maior toxicidade do Hg
2+
e da
maior afinidade do Hg
2+
pelas MTs. Quando comparamos a indução das
metalotioneínas em outros organismos, o cádmio é capaz de induzir uma maior
expressão sempre em concentrações menores que o mercúrio. Em bivalves Mytilus
galloprovincialis expostos a 200 g.L
-1
de Cd
2+
e 0,15 g.L
-1
de Hg
2+
, o cádmio foi
capaz de induzir a expressão da isoforma de MT20 em até 10 vezes mais que o mercúrio
(Dondero et al., 2004). Em peixes (Dicentrarchus labrax) submetidos à injeção
intraperitoneal de Cd
2+
(100 ng.g
-1
) e Hg
2+
(250 ng.g
-1
) o aumento na expressão foi de
5,3 e 5,1 vezes respectivamente (Jamel et al., 2008).
Wu & Chen (2005) dosaram concentração de MTs (MTs-like) por cromatografia
líquida em L. vannamei estimulados por Cd
2+
e Zn
2+
, observando que nos camarões que
foram expostos a Cd
2+
0,1 mg.L
-1
, houve dose-resposta até o 56º dia de exposição, onde
99
se deu o pico de acúmulo de MT. Mas ao fim do experimento (86 dias) essa
concentração havia diminuído significativamente. Nos camarões que foram estimulados
com 0,2 mg.L
-1
de Cd
2+
, a concentração de MT aumentou mais rapidamente até o dia 28
e se estabilizou até o fim do experimento. Nos nossos experimentos, L. vannamei foram
expostos a concentrações de Hg
2+
(140 ng.g
-1
) da mesma ordem de grandeza das
concentrações de Cd
2+
utilizadas pelo grupo Chinês (100 e 200 ng.g
-1
), por isso,
poderíamos esperar uma indução de MT no nosso experimento menor do que a
observada por esses autores.
Portanto, assim como Wu & Chen (2005) encontraram baixas concentrações de
MT ao final de 86 dias, é mais que razoável que tenhamos encontrado baixa indução do
gene da MT ao final de 70 dias de exposição.
É provável que as concentrações de Hg
2+
as quais os camarões foram
submetidos, não tenham sido suficientes para ativar a indução de metalotioneínas.
Gonzáles et al. (2005) observaram em peixes (D. rerio) alimentados com ração
contaminada por 5 e 13,5 g.g
-1
Hg
2+
por 63 dias, um aumento de 3 a 10 vezes na
expressão de MT. Essas concentração de mercúrio são de 10 a 100 vezes maiores que as
determinadas nas rações utilizadas nos nossos experimentos (140 ng.g
-1
).
As metalotioneínas são a primeira barreira protetora dos eucariotos contra os
metais não essenciais. Além de funcionarem como quelantes, os processos de indução
das metaloproteínas demandam pouco gasto energético, sendo assim uma estratégia
eficiente e “rentável” para a célula. Porém, como todo sistema de expressão gênica e
síntese de proteínas, as próprias metalotioneínas podem ser afetadas por elevadas
concentrações de metais traço. Existe uma relação direta entre a quantidade de Cd
2+
e a
redução da síntese de proteínas pelas células. Din & Frazier, (1985) constataram que em
culturas primárias de hepatócitos de ratos, o estímulo a 35,7 M de Cd
2+
por 15 min,
resultou em uma redução dose dependente na síntese de proteínas. Wu & Cheng (2005)
100
viram que quanto maior a dose de Cd
2+
a qual camarões L. vannamei são expostos, mais
sérios são os danos causados à expressão gênica, diminuindo em duas vezes os níveis de
MT e causando outros efeitos como descoordenação motora e até morte dos indivíduos,
após longo período de exposição.
Ao mesmo tempo em que a MT afeta a disponibilidade dos metais para outros alvos
celulares, ela depende dos metais traço no citoplasma para sua indução e pode ser
afetada por outros mecanismos que interfiram nas concentrações de metais antes deles
alcançarem os mecanismos de indução. As proteínas carreadoras e transportadoras de
metais (ATPases e Canais iônicos) poderiam estar retirando o Hg
2+
das células antes da
indução do gene se concretizar. Trabalhos que mostram a ação de ATPases são feitos
principalmente com exposição à metais dissolvidos, enquanto nossos camarões foram
expostos ao mercúrio via dieta. Dentre as várias rotas de transporte de metais traço pela
membrana plasmática foram propostas (Williams, 1981; Luoma, 1983; Simkiss &
Taylor, 1989; 1995; Rainbow & Dallinger, 1993; Tessier et al., 1994), mas apenas duas
são reconhecidamente usadas pelos crustáceos:
1-
Transporte mediado por carreadores, onde o íon do metálico se liga à proteína da
membrana e é transportado por ela. No lado do citosol, o metal se liga a
proteínas e se liga cineticamente a célula. Os metais traço continuam a entrar na
célula passivamente até que a concentração interna na célula for maior do que a
externa;
2-
Transporte através de proteínas-canal onde os íons metálicos são transportados a
favor do gradiente de concentração por estas proteínas que apresentam
características hidrofílicas.
A maioria dos metais traço, entram nas células passivamente, transportados através
da membrana celular por sistemas carreadores (proteínas carreadoras) que possuem
sítios de alta afinidade. Genericamente, é aceito que existem canais específicos para
101
cada tipo de metal essencial, mas existe a possibilidade de um metal não essencial entrar
via canal de outro metal dependendo das características que esses metais compartilham.
Um desses elementos, e talvez o mais importante, é o cálcio. O cálcio é um cátion
divalente, que possui raio atômico semelhante ao de muitos metais traço e por isso,
muitos transportadores de membrana acabam transportando metais traço que também
são cátions divalentes, no lugar do cálcio. A concentração do cálcio na água do mar fica
entre 10 mM, enquanto que no citossol, a concentração é sub-micromolar. A entrada de
cálcio via canais de cálcio se dá por difusão passiva seguindo seu gradiente
eletroquímico. A baixa concentração citossóloca é mantida através de bombeamento
ativo através da membrana basal dos ionócitos das brânquias no sangue, provavelmente
com auxilio de uma Ca
2+
-ATPase (Bottcher e Siebers, 1993). Metais não essenciais
também entram nas células e é sugerido que eles entrem pelos mesmos sistemas citados
anteriormente, como os de cálcio. Por exemplo, o íon do cádmio, Cd
2+
, tem raio atômico
de 1,71
Å
, valor próximo ao do Ca
2+
(1,97
Å
), podendo assim entrar pelos mesmos
canais (Rainbow, 1995). Da mesma forma que essas proteínas transportam metais para
dentro da célula, elas também fazem o movimento contrário, transportando metais para
fora. Dessa forma os metais não estariam disponíveis para ativar as MTs.
102
6. Conclusões
1.
(objetivo 1) Não foi verificada alteração na expressão das metalotioneínas tanto
nos experimentos em laboratório (intensivo e extensivos) quanto nos animais
coletados nos viveiros.
2.
(objetivo 2) As rações apresentaram concentrações variáveis de mercúrio, de 5 a
140 ng.g-1. As concentrações variaram até 8 vezes entre diferentes marcas e até
10 vezes entre lotes de uma mesma marca. Apenas uma ração apresentou
concentração de Hg
2+
acima dos valores sugeridos pela legislação internacional.
3.
(objetivo 3) A contaminação dos indivíduos se correlacionou diretamente com a
concentração de mercúrio nas rações oferecidas durante o experimento. As
concentrações de mercúrio encontradas nos camarões estão bem abaixo dos
limites determinados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (500 ng.g
-1
)
para consumo humano.
4.
(objetivo 4) O crescimento dos camarões nos experimentos em laboratório,
parece não ter sido influenciado apesar das contaminações nas rações. Não foi
possível concluir se houve influência do Hg
2+
na variação de crescimento
apresentada nos camarões amostrados em viveiros ao longo do ciclo de cultivo.
5.
(objetivo 5) A falta de indução da MT não permitiu propor uma forma de utilizar
a expressão de metalotioneínas como um biomarcador da contaminação por
mercúrio. No entanto, a variação das concentrações de Hg
2+
nas rações e a direta
relação com a concentração de Hg
2+
nos tecidos dos camarões, precisam ser
investigadas com maior atenção. Portanto, sugerimos o monitoramento periódico
das rações e dos insumos utilizados na sua fabricação até que sejam
determinados os limites seguros para presença desses contaminantes nas rações
animais pelo Ministério da Agricultura e Pecuária e Abastecimento, garantindo
assim, a boa qualidade do camarão produzido no Brasil.
103
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