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DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM FEIJÃO-FAVA (Phaseolus lunatus L.)
JARDEL OLIVEIRA SANTOS
TERESINA
Estado do Piauí - Brasil
Agosto - 2008
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DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM FEIJÃO-FAVA (Phaseolus lunatus L.)
JARDEL OLIVEIRA SANTOS
Dissertação apresentada ao Centro de
Ciências Agrárias da Universidade
Federal do Piauí para obtenção do
Título de Mestre em Agronomia, Área
de Concentração: Produção Vegetal.
TERESINA
Estado do Piauí - Brasil
Agosto - 2008
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DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM FEIJÃO-FAVA (Phaseolus lunatus L.)
JARDEL OLIVEIRA SANTOS
Biólogo
Orientadora: Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes
Co-Orientador: Prof. Dr. Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
Dissertação apresentada ao Centro de
Ciências Agrárias da Universidade
Federal do Piauí para obtenção do
Título de Mestre em Agronomia, Área
de Concentração: Produção Vegetal.
TERESINA
Estado do Piauí - Brasil
Agosto – 2008
S237d Santos, Jardel Oliveira.
Divergência genética em feijão-fava (Phaseolus
lunatus L.). / Jardel Oliveira Santos. – Teresina, 2008.
97f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Piauí,
2008.
Orientadora: Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes
1. Feijão-fava 2. Recursos genéticos. 3. Composição
físico-química 4. Nodulação 5. Análise multivariada.
I. Título.
CDD - 583.79
DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM FEIJÃO-FAVA (Phaseolus lunatus L.)
JARDEL OLIVEIRA SANTOS
Biólogo
Aprovado em 11/08/2008
Comissão julgadora:
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Laboratório de Biologia do Solo/IPA
_____________________________________________________________
Prof. Dr. José Airton Rodrigues Nunes
Departamento de Planejamento e Política Agrícola/CCA/UFPI
_____________________________________________________________
Prof. Dr. Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
Departamento de Engenharia Agrícola e Solos/CCA/UFPI
Co-Orientador
____________________________________________________________
Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes
Departamento de Fitotecnia/CCA/UFPI
Orientadora
“Compreender que há outros pontos de vista é o início da sabedoria”
Thomas Campbell
“Aceita o conselho dos outros, mas nunca
desista da tua opinião”.
William Shakespeare
À minha mãe Maria Helena,
que desde os primeiros anos de vida
semeou em mim o gosto e a importância pelo saber.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me fortalecer nos momentos difíceis e permitir que essa etapa fosse
concluída;
À Universidade Federal do Piauí, pela formação e auxílio para execução da
pesquisa;
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento, pela concessão da bolsa
de estudos e financiamento do projeto de pesquisa com Phaseolus lunatus;
À Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes, pela confiança, amizade e
ensinamentos importantes transmitidos durante o curso e, principalmente, pela
forma vigilante e atenta na orientação desse trabalho;
Ao Prof. Dr. Ademir Sérgio Ferreira de Araújo, pelas orientações e atenção
dispensada;
À Profa. Dra. Ângela Celis de Almeida Lopes, pelas sugestões, ensinamentos e
amizade, que de forma serena e objetiva tem conduzido muitos alunos ao mundo
da pesquisa científica;
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, pelos
ensinamentos transmitidos;
Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Marques da Silva, Chefe do Departamento de
Química, pela concessão do Laboratório para realização de análises;
À Profa. Dra. Maria Marlúcia Gomes Pereira, Coordenadora do Núcleo de
Estudos, Pesquisa e Processamento de Alimentos (NUEPPA) da UFPI, que
gentilmente cedeu o Laboratório de Físico-Química para realização das análises;
Ao Prof. Dr. Zeomar Nitão Diniz e aos demais funcionários do NUEPPA, pelo
auxílio nas determinações físico-químicas;
Ao Prof. Dr. Arnaud Azevedo Alves e aos técnicos do Laboratório de Nutrição
Animal do Departamento de Zootecnia, pela disponibilidade do espaço e auxílio
nas determinações das frações de fibra;
Ao Prof. Dr. Sebastião Barros, pela montagem do sistema utilizado na
determinação do ácido cianídrico e orientação dispensada durante as
determinações;
Ao Engenheiro Agrônomo Júlio César Lopes da Costa, pelo auxílio durante as
coletas do solo no município de Água Branca, PI;
À Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), pela disponibilização
do Laboratório de Biologia do Solo, para o isolamento e caracterização dos
rizóbios;
À Pesquisadora Dra. Márcia do Vale Barreto Figueiredo, pelas sugestões,
orientação e contribuição nas etapas de isolamento e caracterização dos rizóbios;
Aos amigos da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Teresinha
Xavier, Maria Almeida, Marise Caribé e Antônio Junior, que me acolheram em
Recife, durante a fase de isolamento e caracterização dos nódulos;
Aos estagiários, pesquisadores e funcionários do Laboratório de Biologia do Solo
do IPA, Maria do Carmo Barreto, André Sueldo, Marílha Mendes, Eyde Simões e
Sr. Mário, que me auxiliaram durante o isolamento e caracterização dos rizóbios;
Aos amigos e estagiários do Laboratório de Recursos Genéticos Vegetais: Ana
Clara de S. Meireles, Eva Maria Rodrigues Costa, Ethyênne Moraes Bastos, Elton
Markes, Dogival Alves Cavalcante Júnior, Iradênia Sousa, Jocélia Mayra Machado
Alves, Marla Ariane Silva, Paula Verena C. Sobral e Raimundo Nonato Silva, pela
“mão-de-obra barata e qualificada”, que muito contribuíu nas coletas dos dados;
As alunas da Universidade Estadual do Piauí, Carol Melo e Cândida Mendes pela
fundamental contribuição na coleta dos nódulos do experimento piloto;
À todos os colegas da Pós-Graduação, em especial às mais próximas, Eliane
Monteiro, Solranny Silva e Mércia Carvalho, pelas grandiosas contribuições,
sugestões, auxílio e conversas, as quais aluguei por muitas horas com as
famosas “piadas sem graça”;
À minha mãe Maria Helena, pelo exemplo de vida, dedicação e honestidade a ser
seguido;
Aos irmãos Gicélio Oliveira, Gicélia Oliveira e em especial a Gláucia Oliveira, que
sempre acreditou na minha capacidade e me forneceu meios para poder concluir
o curso;
À todos que, com boa intenção, colaboraram para a realização e finalização
desse trabalho, possibilitando alcançar mais um degrau na infinita escada do
conhecimento.
SUMÁRIO
RESUMO......................................................................................................................... x
ABSTRACT....................................................................................................................xii
1. INTRODUÇÃO GERAL.............................................................................................14
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 17
2.1. Gênero Phaseolus.................................................................................................. 17
2.1.1. Classificação botânica......................................................................................... 17
2.1.2. Complexo gênico................................................................................................. 18
2.2. A espécie Phaseolus lunatus L. .............................................................................19
2.2.1. Centro de origem da variabilidade....................................................................... 20
2.2.2. Conservação da espécie.....................................................................................20
2.2.3. Composição físico-química das sementes .......................................................... 21
2.2.3.1. Umidade ........................................................................................................... 22
2.2.3.2. Lipídios.............................................................................................................23
2.2.3.3. Minerais............................................................................................................ 23
2.2.3.4. Proteínas..........................................................................................................24
2.2.3.5. Carboidratos..................................................................................................... 25
2.2.3.6. Ácido cianídrico ................................................................................................ 26
2.3. Fixação biológica de Nitrogênio ............................................................................. 27
2.3.1. Classificação dos rizóbios ................................................................................... 28
2.3.2. Diversidade dos rizóbios ..................................................................................... 30
2.4. Análises multivariadas............................................................................................ 32
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................36
4. CAPÍTULO I .............................................................................................................. 52
Divergência genética para caracteres físicos e químicos de sementes em
feijão-fava (Phaseolus lunatus L.)
4.1. RESUMO................................................................................................................52
4.2. ABSTRACT ............................................................................................................ 53
4.3. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 54
4.4. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 56
4.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................57
4.6. REFERÊNCIAS...................................................................................................... 64
5. CAPÍTULO II .............................................................................................................75
Divergência genética entre isolados nativos noduladores do feijão-fava
(Phaseolus lunatus L.)
5.1. RESUMO................................................................................................................75
5.2. ABSTRACT ............................................................................................................ 76
5.3. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 76
5.4. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................78
5.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................. 80
5.6. REFERÊNCIAS...................................................................................................... 85
6. CONCLUSÕES GERAIS .......................................................................................... 97
x
DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM FEIJÃO-FAVA (Phaseolus lunatus L.)
Autor: Jardel Oliveira Santos
Orientadora: Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes
Co-Orientador: Prof. Dr. Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
RESUMO
Objetivou-se realizar a caracterização física e química de sementes em feijão-fava e
estimar a divergência genética entre sub-amostras e entre rizóbios nativos
noduladores do feijão-fava. Na caracterização, o material genético constou de 27
sub-amostras, provenientes do Banco Ativo de Germoplasma de Feijão-Fava da
Universidade Federal do Piauí, cultivadas no ano agrícola de 2006. As sementes
dessas sub-amostras foram avaliadas com relação aos seguintes caracteres
químicos: umidade (8,26 a 11,25 g/100g), cinzas (2,62 a 3,70 g/100g), extrato etéreo
(0,16 a 0,93 g/100g), proteína bruta (16,85 a 23,41 g/100g), extrato não nitrogenado
(62,24 a 70,07 g/100g), fibra alimentar total (24,21 a 62,42 g/100g), fibra insolúvel
(5,65 a 11,88 g/100g), fibra solúvel (15,82 a 53,11 g/100g) e ácido cianídrico (44,49
a 160,63 mg/kg). Os caracteres físicos avaliados nas sementes foram: comprimento
(9,66 a 18,52 mm), largura (7,41 a 11,83 mm), espessura (5,33 a 6,90 mm) e massa
de 100 sementes (27,60 a 87,79 g), que possibilitaram a classificação quanto à
forma (esférica, elíptica e oblonga / reniforme), perfil (achatado e semi-achatado) e
tamanho (pequeno, médio, normal e grande). A divergência genética entre as sub-
amostras foi estimada pelo método de agrupamento de Tocher, com o emprego da
distância de Mahalanobis, como medida de dissimilaridade, formando-se dez
grupos. O método de Singh, utilizado para estimar a contribuição relativa de cada
caráter na expressão da divergência genética, indicou que a fibra alimentar total
(48,62%) e a fibra solúvel (46,03%) foram os que mais contribuíram para a
divergência total (94,65%) entre as sub-amostras de feijão-fava avaliadas. Na
estimativa da divergência genética entre os rizóbios nativos, os genótipos UFPI-468
(Boca de Moça) e UFPI-491 (Fava Miúda) foram utilizados como planta isca de
rizóbio, em amostras de solos coletadas nos distritos de Nova Esperança
(07º77’10”S e 93º51’58”W) e Santa Rita (07º71’49”S e 93º60’08”W), município de
Água Branca, PI, que funcionaram como fonte de inoculo. Dos nódulos coletados,
foram identificados 79 isolados que, mediante a caracterização morfológica e
fisiológica, foram reunidos em sete grupos de divergência pelos métodos de Tocher
(sete grupos) e cinco grupos pelo método de agrupamento hierárquico UPGMA
(Unweigthed pair group method Average), ambos exibindo concordância na
alocação dos isolados. Entre os grupos, evidenciou-se isolados dos gêneros
Bradyrhizobium, Mesorhizobium e Rhizobium.
Palavras-chave: Semente, caracteres físicos e químicos, nodulação, isolados
nativos, rizóbios.
xii
GENETIC DIVERGENCE OF LIMA BEAN (Phaseolus lunatus L.)
Author: Jardel Oliveira Santos
Adviser: Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes
Co-Adviser: Prof. Dr. Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
ABSTRACT
This study aimed the physical and chemical characterization of lima bean seed and
evaluates the genetic divergence among samples and among native rhizobia
nodulated of the lima bean. In this characterization, the genetic material consisted of
27 samples from the "BAG de Feijão-Fava Universidade Federal do Piauí", cultivated
in the 2006 year crop. The seeds of these samples were evaluated regarding to
chemical characters: moisture (8.26 to 11.25 g/100g), ashes (2.62 to 3.70 g/100g),
ethereal extract (0.16 to 0.93 g/100g), crude protein (16.85 to 23.41 g/100g), non-
nitrogen extract (62.24 to 70.07 g/100g), total dietary fiber (24.21 to 62.42 g/100g),
insoluble fiber (5.65 to 11.88 g/100g), soluble fiber (15.82 to 53.11 g/100g) and
cyanic acid (44.49 to 160.63 mg / kg). The physical characteristics evaluated in the
seeds were: length (9.66 to 18.52 mm), width (7.41 to 11.83 mm), thickness (5.33 to
6.90 mm) and weight of 100 seeds (27. 60 to 87.79 g), which permitted the
classification of the seeds as to form (spherical, elliptical and oblong / reniform),
profile (flat and semi-flat) and size (small, medium, normal and great). The genetic
divergence among the samples was estimated by Tocher grouping method, with the
employment of the Mahalanobis's distance, as a measure of dissimilarity, that
resulted in ten groups. The Singh's method was used to estimate the relative
contribution of each character in the expression of genetic divergence. The total
dietary fiber (48.62%) and soluble fiber (46.03%) were those who most contributed to
total divergence (94.65%) among the samples of lima beans evaluated. In the
genetic divergence estimation among the native rhizobia, the genotypes UFPI-468
(Boca de Moça) and UFPI-491 (Fava Miúda) were used as bait of rhizobium plant,
with samples of soil collected in districts of Nova Esperança (07º77’10”S e
93º51’58”W) and Santa Rita (07º71’49”S e 93º60’08”W), in Água Branca county,
Piauí State who worked as a source of inoculum. From the nodules that were
collected, 79 isolates were identified, and according to the morphological and
physiological characterization, were clustered in groups of divergence by the
Tocher’s method (seven groups) and Unweigthed pair group method Average
(UPGMA) (five groups) agreement with the allocation of strains. It could be observed
among groups, there were strains of the genera Bradyrhizobium, Mesorhizobium and
Rhizobium.
Key words: Seeds, physical and chemical character, nodulation, isolates native,
rhizobia.
1. INTRODUÇÃO GERAL
O feijão-fava, Phaseolus lunatus L., é a segunda leguminosa de maior
importância do gênero, e devido ao conteúdo protéico e paladar característico, é
mundialmente utilizado em pratos, nas mais diferentes culinárias, recebendo várias
denominações, em função da região cultivada ou forma de utilização na
alimentação. Nos Estados Unidos, é conhecida popularmente como lima bean,
butter bean, sieva bean e sugar bean; na França, haricot de lima, haricot du cap e
pois du cap; no México, feijol lima; na Alemanha, limabohne e mondbohne; na
Espanha, frijol de luna, haba lima, judia de lima ou pallar; no Japão, lai mame ou aoi
mame (NIAS, 2008; GRIN, 2008); e no Brasil, fava, feijoal, bonge, mangalô-amargo,
fava-belém, fava-terra, feijão-espadinho, feijão-farinha, feijão-favona, feijão-fígado-
de-galinha, feijão-verde ou feijão-de-lima (OLIVEIRA et al., 2004; GRIN, 2008).
De acordo com Yokoyama et al. (1996), o feijão é cultivado em cerca de 100
países em todo o mundo, e os gêneros Phaseolus e Vigna são os mais utilizados,
apresentando como atrativo a produção de grãos com tamanhos e cores variadas.
Contudo, a produção mundial de feijão está ligada a um grande número de gêneros
e espécies, o que dificulta uma análise comparativa dos índices de produtividade.
Considerando-se apenas o gênero Phaseolus, o Brasil é o maior produtor mundial,
seguido pelo México, sendo que P. lunatus, P. coccineus e P. acutifolius contribuem
com cerca de 5% da produção mundial deste gênero.
Segundo o IBGE (2006), no Brasil foram produzidas 14.951 ton de grãos
secos do feijão-fava, numa área plantada de 37.521 ha. Os Estados da Paraíba, Rio
Grande do Norte, Ceará, Pernambuco, Piauí, Sergipe, Maranhão e Alagoas, em
ordem decrescente, são os maiores produtores, e juntos fazem do Nordeste, a maior
região produtora, com 14.128 ton, em 36.209 ha. Nessa região, o feijão-fava é usado
como fonte alternativa de alimento e renda pela população, principalmente por
pequenos produtores. A região Sudeste tem o Estado de Minas Gerais como único
15
produtor, com 711 ton, e a região Sul produz apenas 112 ton, no Rio Grande do Sul.
O feijão-fava é considerado mais tolerante à seca, ao excesso de umidade e
ao calor (VIEIRA, 1992). Contudo, seu cultivo é relativamente limitado, sendo que as
principais razões são: a maior tradição de consumo dos feijões comum (Phaseolus
vulgaris L.) e caupi (Vigna unguiculata L.), o paladar do feijão-fava e o tempo de
cocção mais longo, além da falta de cultivares recomendadas para as condições
climáticas das regiões produtoras (GUIMARÃES et al., 2007; LEMOS et al, 2004 e
SANTOS et al., 2002).
Dentre os diversos alimentos utilizados pelo homem, os grãos da família das
leguminosas desempenham importante papel na dieta da maioria das populações, e
um aspecto de grande relevância é a disponibilidade de proteína vegetal (PROLLA,
2006). De acordo com as recomendações da FAO/OMS/ONU, as necessidades de
proteína para um indivíduo adulto ficam entre 0,8 a 1,0 g/Kg/dia. Por isso, segundo
Leon et al. (1993), todos os países devem priorizar a busca por novas espécies,
para atender à crescente demanda de proteínas, sendo que as leguminosas
tropicais de grão constituem uma boa alternativa para solucionar o problema da
dependência alimentar.
Além do conteúdo protéico, outras características relacionadas à qualidade do
grão, como as físicas, químicas e culinárias, são consideradas importantes para os
consumidores de feijão, figurando, portanto, como caracteres adicionais na seleção
de genótipos superiores em programas de melhoramento (HERRERA et al., 2002).
Para tais características, temos entre as leguminosas, um grande número de
espécies exibindo substancial variabilidade provocada por fatores como a cultivar,
localização geográfica, condições de crescimento ou até o processo de
melhoramento (MESQUITA et al., 2007; CASTELLÓN et al., 2003).
No cultivo das leguminosas, é importante o conhecimento sobre a eficiência e
a diversidade de grupos-chave de bactérias, como os rizóbios noduladores que
fixam N
2
(BNLFN), uma vez que o nitrogênio é considerado um dos nutrientes mais
limitantes para o crescimento vegetal. Segundo Melloni et al. (2006), a diversidade e
a eficiência de tais bactérias é principalmente estimada a partir da coleta ou cultivo
de plantas-iscas, em solos de determinadas áreas, usadas como fonte de inóculo,
das quais são extraídos os nódulos, que passam pelas etapas de desinfecção e
isolamento, realizado em meio de cultura específico para o crescimento de rizóbios.
16
Obtido os isolados, as colônias de bactérias passam por caracterizações fenotípicas,
genotípicas, bioquímicas e filogenéticas (SILVA et al., 2007; FREITAS et al., 2007).
A eficiência dos rizóbios é verificada através da avaliação da matéria seca da parte
aérea, concentração de nitrogênio, número, matéria fresca e atividade de nódulos
presentes (MELLONI et al., 2006; VIEIRA; TEIXEIRA, 2005).
Os estudos sobre a divergência genética, utilizando as técnicas multivariadas,
realizam-se por meio da avaliação simultânea de vários caracteres, que permitem
inúmeras inferências a partir do conjunto de dados existentes (CRUZ et al., 2004).
Essas técnicas, empregadas tanto para caracteres expressos por dados
quantitativos quanto qualitativos, têm facilitado o estudo sobre a diversidade de
diferentes grupos de organismos e gerado informações importantes para o
melhoramento, manutenção dos recursos genéticos vegetais (RIBEIRO et al., 2005;
BENIN et al., 2002) e identificação de microrganismos (SILVA et al., 2007; FREITAS
et al., 2007).
Assim, objetivou-se realizar a caracterização física e química de sementes em
feijão-fava e estimar a divergência genética entre sub-amostras e entre rizóbios
nativos noduladores do feijão-fava.
A dissertação foi estruturada em dois capítulos, cujos títulos foram:
“Divergência genética para caracteres físicos e químicos de sementes em feijão-fava
(Phaseolus lunatus L.)” e “Divergência genética entre isolados nativos de rizóbio
noduladores do feijão-fava (Phaseolus lunatus L.)”.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Gênero Phaseolus
No gênero Phaseolus, tanto as espécies silvestres como as cultivadas
apresentam-se distribuídas em três centros localizados na América Latina, definidos
como centro Mesoamericano, Norte e Sul Andino. O centro Mesoamericano
compreende mais de 40 espécies, entre as quais estão as cinco cultivadas, P. vulgaris
L., P. lunatus L., P. coccineus L., P. acutifolius A. Gray e P. polyanthus Greeman; o
centro Norte dos Andes, o mais pobre em espécies, contem somente quatro das
cultivadas e algumas espécies silvestres; e o centro Sul Andino, comporta duas
espécies cultivadas, P. vulgaris e P. lunatus, seus respectivos ancestrais silvestres e
poucas espécies silvestres (DEBOUCK, 1991).
2.1.1. Classificação botânica
Segundo Melchior (1964), o gênero Phaseolus pertence à ordem Rosales,
subtribo Phaseolinae, tribo Phaseoleae, subfamília Papilionoideae e família
Leguminosae, no entanto, Cronquist (1988) classifica-o na subclasse Rosidae, ordem
Fabales e família Fabaceae. Broughton et al. (2003) afirmam que essa família é uma
das maiores entre as dicotiledôneas, com 643 gêneros e 18.000 espécies distribuídas
por todo o mundo, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais.
A respeito do número exato de espécies classificadas no gênero Phaseolus, a
literatura apresenta controvérsias de informações. Segundo Silva et al. (2003), revisões
de gênero indicam que esse número pode variar de 31 a 52 espécies, todas originárias
do Continente Americano, no entanto, apenas cinco são cultivadas: P. vulgaris L.
(feijão-comum), P. lunatus L. (feijão-fava), P. coccineus L. (feijão-ayocote), P. acutifolius
181
A. Gray (feijão-tepari) e P. polyanthus Greeman (feijão de toda uma vida) (DEBOUCK,
1991, ZIMMERMANN; TEIXEIRA, 1996).
2.1.2. Complexo gênico
Conforme Zimmermann e Teixeira (1996), as espécies do gênero Phaseolus são
todas diplóides, cujo número cromossômico predominante é 2n=22, no entanto, nesse
gênero, o número cromossômico pode, raramente, variar, ocorrendo 2n=20
(MERCADO-RUARO; DELGADO SALINAS, 1998).
Os trabalhos desenvolvidos por Marechal et al. (1978) estabeleceram distâncias
taxonômicas entre as espécies cultivadas do gênero Phaseolus, que posteriormente
foram confirmadas pelos estudos químicos e moleculares de Gepts (1990), e permitiram
estabelecer, para o gênero, três conjuntos gênicos distintos: o primário, o secundário e
o terciário. No conjunto primário, onde o fluxo gênico é relativamente livre e a fertilidade
é completa (sem barreiras genéticas), os descendentes de cruzamentos entre espécies
cultivadas e silvestres podem ter menor adaptação; são encontradas quatro formas
cultivadas P. vulgaris, P. coccineus, P. acuntifolius e P. lunatus. O conjunto gênico
secundário, em que o fluxo é possível, apresentando, contudo fertilidade reduzida
(barreiras genéticas moderadas) contém P. coccineus e P. vulgaris. Já no conjunto
gênico terciário, que é caracterizado pelo fluxo gênico difícil, apresentando fertilidade
baixíssima (barreiras genéticas fortes), sendo inclusive necessário resgate de embriões
para viabilizar os descendentes, estão as espécies: P. acutifolius/P. filiformis, P. ritensis,
P. acutifolius, P. vulgaris/P. coccineus, P. ritensis, P. metcalfei e P. polystachus
(BAUDOIN; 2001).
Em relação ao P. lunatus, a diversidade das espécies de Phaseolus está
organizada em conjunto gênico primário, formado pelos respectivos parentes silvestres;
conjunto gênico secundário, organizado pelas espécies P. pachyrrhizoides, P. augusti e
P. bolivianus; e conjunto gênico terciário, formado por P. maculatus, P. ritensis, P.
polystachyus e P. salicifolius, sendo que todos os conjuntos são compostos por
espécies silvestres (BALDOIN, 2001). Enquanto que em relação ao feijão comum (P.
vulgaris), a diversidade das espécies de Phaseolus está organizada em conjuntos
191
gênicos primário, secundário, terciário e quaternário (DEBOUCK, 1999), sendo que P.
lunatus junto com as espécies silvestres P. filiformis e P. angustissimus formam o
conjunto gênico quaternário.
Segundo Silva e Costa (2003), o conhecimento sobre o "pool gênico", ou
complexo gênico oferece a possibilidade de estruturar a diversidade genética de forma
a estimular a sua utilização. A determinação desses conjuntos gênicos para as
espécies cultivadas do gênero Phaseolus possibilita ampliar a base genética e
maximizar os ganhos de seleção, melhorando a atuação das espécies no
melhoramento genético (CAMARENA, 2005).
2.2.
A espécie Phaseolus lunatus L.
O feijão-fava, considerada a espécie mais importante do gênero depois do feijão-
comum (Phaseolus vulgaris L.), é uma leguminosa tropical caracterizada por elevada
diversidade genética e elevado potencial de produção, que se adapta às mais
diferentes condições ambientais, mas desenvolve-se melhor nos trópicos úmidos e
quentes (MAQUET et al., 1999). A cultura do feijão-fava se adéqua melhor em solo
areno-argiloso, fértil e bem drenado, tendo bom rendimento com pH entre 5,6 e 6,8
(VIEIRA, 1992).
Segundo Zimmermann e Teixeira (1996), o P. lunatus pode ser identificado como
uma leguminosa de germinação epígena; onde as folhas geralmente apresentam
coloração escura, mais persistente que em outras espécies do gênero, mesmo depois
do amadurecimento das vagens; bractéolas pequenas e pontiagudas; vagens bastante
compridas e de forma geralmente oblonga e recurvada, com duas alturas distintas
(ventral e dorsal) e número de sementes por vagem variando de duas a quatro. Tais
sementes exibem grade variação de tamanho e cor de tegumento (SANTOS et al.,
2002). Uma característica marcante do feijão-fava, que a distingue facilmente de outros
feijões, são as linhas que se irradiam do hilo para a região dorsal das sementes, mas
em algumas variedades essas linhas podem não ser tão facilmente observadas
(VIEIRA, 1992).
202
2.2.1. Centro de origem da variabilidade
Alguns autores consideram o continente asiático como o centro de origem da
variabilidade do P. lunatus (FORNES MANERA, 1983), no entanto, de acordo com a
teoria de Mackie (1943), a origem da variabilidade do feijão-fava encontra-se na
América Central, Guatemala, de onde se dispersou em três direções, possivelmente
seguindo a rota do comércio:
I. Ramificação Hopi, seguindo para o norte, atingindo os Estados Unidos, região de
clima frio. As sementes dessa ramificação são médias e achatadas, definidas
como grupo Sieva;
II. Ramificação Caribe, seguindo para leste, atingindo as Antilhas e, daí, para o norte
da América do Sul, extensão caracterizada por zonas calcáreas e secas (desde
Yucatan até as Antilhas). As sementes são pequenas e globosas, definidas como
grupo Batata;
III. Ramificação Inca, seguindo para o sul, atingindo a América Central pela
Colômbia, Equador e Peru. As sementes são grandes e achatadas, definidas
como grupo Big lima.
As variedades Mesoamericanas de P. lunatus, que compreendem o sudeste dos
Estados Unidos até o Panamá, tendo como zonas principais o México, Guatemala,
Nicarágua, El Salvador, Honduras e Costa Rica, apresentam sementes pequenas de
cor escura (grupo Sieva), todavia, na Europa são mais cultivados variedades com
sementes grandes, achatadas e tegumento branco (grupo Big lima).
2.2.2. Conservação da espécie
A conservação da diversidade genética intra-específica de P. lunatus ocorre nos
Bancos de Germoplasma, principalmente nos Estados Unidos (USDA), México (INIFAP)
e Colômbia (CIAT), que têm coletado germoplasma para resgatar material tradicional
cultivado em várias regiões do trópico americano, onde o desaparecimento tem sido
mais rápido (CAMARENA, 2005).
De acordo com Knudsen (2000), conforme dados do Internacional Institute of
Plant Genetic Resources (IPGRI), as coleções de germoplasma de P. lunatus podem
ser encontradas nas seguintes instituições: Estação Experimental Agropecuária Salta,
212
Argentina; Instituto de Investigação Agrícola El Vallecito e Universidade Autônoma
Gabriel René Moreno, Bolívia; Faculdade de Ciências Agrárias e Universidade Austral
de Chile, Chile; Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Colômbia, com
entradas provenientes de diferentes países (Belice, Brasil, Colômbia, Honduras,
México, Panamá, Filipinas e Venezuela); Centro Agronômico Tropical de Investigação e
Enseñanza (CATIE) e Escola de Biologia, Costa Rica; Instituto de Investigações
Fundamentais em Agricultura Tropical (INIFAT), Cuba; Estação Experimental
Portoviejo, INIAP, Equador; Centro Universitário de Sur Occidente (CUNSUROC) e
Universidade de San Carlos, Guatemala; Ciências Agropecuárias e Instituto de Ecologia
Aplicada de Guerrero (INEAGRO), México; Estação Experimental Agropecuária La
Molina, Universidade Nacional Hermilio Valdizan (UNHEVAL) e Universidade Nacional
Agrária La Molina, Peru.
No Brasil, o Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia
(CENARGEN), localizado em Brasília, DF, conserva uma Coleção de Base de
Phaseolus spp., com 12.488 sub-amostras de 20 espécies, 6 subespécies e 16
variedades, sendo que 32,20 % dessas sub-amostras foram coletados no país; P.
lunatus é a segunda espécie com maior número de sub-amostras presentes na coleção,
perfazendo 7,80 % (WETZEL et al., 2006). Em Viçosa, MG, no Banco de Germoplasma
de Hortaliças, encontram-se 401 variedades tradicionais de feijão-fava do Brasil
(KNUDSEN, 2000). Na região Nordeste, nos Estados de Pernambuco e Piauí,
encontram-se também Coleções de Germoplasma, principalmente de variedades
crioulas, na Universidade Federal Rural de Pernambuco, em Recife, e na Universidade
Federal do Piauí, em Teresina, com sub-amostras, obtidos a partir de coletas efetuadas
na região Meio-Norte do Brasil e intercâmbios com outras instituições (COSTA et al.,
2007).
2.2.3.
Composição físico-química das sementes
Os caracteres físico-químicos das sementes contribuem para a variabilidade das
espécies vegetais, estando presentes nas listas de descritores publicadas pelo IPGRI
(2001), e juntamente com os caracteres morfológicos e agronômicos, contribuem para a
descrição completa dos germoplasmas.
222
Os programas de melhoramento têm incluído as propriedades tecnológicas,
nutricionais e estéticas dos grãos entre os critérios de seleção, procurando associá-las
com características agronômicas relacionadas à produtividade. Segundo Herrera et al.
(2002), a transferência de caracteres dos grãos, que influem em sua aceitação
comercial, possibilita a oferta de melhores cultivares para produtores e consumidores.
Para Bleil (1998), é crescente a preocupação em fornecer alimentos com boa qualidade
nutricional, devido aos novos hábitos criados pela indústria alimentar, marcados pelo
excesso de produtos artificiais.
A avaliação dos alimentos através de caracteres que envolvem análises físicas e
químicas é uma das formas de se detectar problemas relacionados à qualidade do
produto (BASSINELLO et al., 2003). A partir dos resultados obtidos nessas análises,
pode-se conhecer o balanço nutricional dos alimentos, avaliar a disponibilidade dos
nutrientes e verificar a adequação da dieta. Segundo Lima et al. (2007), tal tarefa é
fundamental para os alimentos consumidos tradicionalmente no Brasil, devido
apresentarem composição, com grande diversidade, pouco conhecida.
A distribuição e a qualidade dos componentes químicos dos grãos são os
principais responsáveis pelas diferenças no valor nutritivo, juntamente com a presença
de fatores que afetam o aproveitamento de alguns nutrientes importantes. Para o feijão-
fava, informações sobre a composição dos grãos ainda são escassas (OGUNJI et al.,
2003).
2. 2.3.1. Umidade
O grau de umidade é um fator crítico na determinação da viabilidade e
longevidade das sementes e grãos. Segundo Bragantini (2005), existem dois tipos
principais de água na composição das sementes ou grãos, a água livre, que é
facilmente removida pelo calor; e a água de constituição, que está fortemente fixada
nas células.
Para atingir maiores lucros, alguns produtores de grãos costumam comercializá-
los quando estes, depois de secos, apresentam o máximo de umidade. No entanto,
essa prática pode comprometer a qualidade, pois grãos e sementes com alto conteúdo
de umidade têm o tempo de armazenamento, em condições viáveis, reduzido, devido
232
ao efeito dominante das atividades de insetos e fungos (LUZ, 2002). Para disciplinar a
questão, o Ministério da Agricultura estabelece que a umidade dos grãos a serem
comercializados como seco deve está entre 12 e 14%, e para valores acima, a
percentagem é transformada em um valor que é subtraído da massa final do produto
comercializado.
N
O comércio de grãos tem ocorrido enormes perdas, em virtude da forma
inadequada do armazenamento, sendo a umidade excessiva uma das principais
causas. Segundo
Ribeiro et al. (2007), o elevado teor de umidade em grãos
armazenados provoca alterações nas propriedades químicas, relacionadas ao
cozimento e pode até mesmo comprometer a aceitação comercial dos grãos. O efeito
da temperatura e do tempo de estocagem pode acelerar essa ação.
2.2.3.2. Lipídios
Os lipídios são componentes essenciais das estruturas biológicas, e juntamente
com as proteínas e carboidratos, fazem parte de um grupo conhecido como
biomoléculas. Geralmente são extraídos dos alimentos com auxílio de solventes
orgânicos (éter etílico, éter de petróleo e hexano) (MADRUGA; ALDRIGUE, 2000).
Além da fração lipídica, outras substâncias são também arrastadas com o
solvente durante a extração, dentre estas os álcoois e óleos voláteis, clorofila e resinas
(RECH et al., 2006). Segundo o Instituto Adolfo Lutes (1995), nos alimentos em que as
concentrações dessas outras substâncias extraídas junto com lipídios são
significativamente elevadas, a denominação mais adequada para a determinação é
extrato etéreo. Normalmente, esta denominação ocorre quando se utiliza o éter de
petróleo como solvente na extração (MESQUITA et al., 2007, ANTUNES et al., 1995).
Para o feijão-fava podemos encontrar na literatura relatos da quantificação de
lipídios variando entre 2,0% (BRESSANI e ELIAS, 1980) ou de 0,88 a 1,42%
(AZEVEDO et al., 2003).
242
2.2.3.3. Minerais
Devido à importância que os minerais representam para o funcionamento
metabólico normal de um organismo, o conteúdo mineral dos grãos do feijão-fava não
pode ser desprezado, principalmente pela considerável presença dos minerais potássio,
fósforo, magnésio, cálcio, ferro dentre outros (OLOGHOBO; FETUGA, 1983; APATA;
OLOGHOBO, 1994).
A determinação do conteúdo de cinzas em uma amostra indica a riqueza de
micronutrientes e macronutrientes presentes (SILVA, 1990) e a determinação
fracionada destes nutrientes fornece o balanço entre eles. Porém, segundo Diniz et al.
(2001), o fracionamento não é muito vantajoso, tendo em vista que minerais são muito
variáveis e possuem relação direta com o solo onde a semente foi cultivada.
Dentre os grupos dos minerais normalmente presentes, destacam-se como
macrominerais Ca, K, Mg, Na, P e os microminerais Co, Cr, Cu, Fe Mn, Zn, sendo os
dois últimos citados como minerais ultratraços, ou seja, elementos essenciais ao
organismo em concentrações de nanogramas (MORGANO et al., 2002).
Na literatura, encontram-se trabalhos que estimam herdabilidade e o controle de
genes envolvidos no acúmulo dos minerais (QUINTANA et al., 1996; MIGLIORANZA et
al., 2003).
2.2.3.4.
Proteínas
As proteínas das leguminosas são fontes potenciais de nutrientes valiosos,
sendo objeto de diversos estudos, a fim de se obter um melhor uso (TINTORÉ et al.,
2004). Segundo Rios et al. (2003), um de seus problemas nutricionais é a baixa
digestibilidade, quando comparadas com as proteínas animais. Por outro lado, a
presença de fatores antinutricionais como os compostos fenólicos e os pigmentos
presentes no tegumento do grão, reduzem o valor biológico das proteínas (CHIARADIA
et al., 1999).
Os feijões, por proporcionarem nutrientes essenciais, são utilizados como
alternativa em substituição a carnes e outros produtos protéicos pela população de
baixa renda. Contudo, Ogunji et al. (2003) avaliando seis espécies de feijão, incluindo o
feijão-fava, observaram que os índices dos aminoácidos sulfurados presentes nas
252
proteínas eram insuficientes, demonstrando que os feijões são inadequados para
consumo individual de proteína, porém se combinado com outros alimentos, que
supram à carência de aminoácidos, mostram-se promissores. No feijão-comum, um dos
maiores problemas é o baixo valor nutricional das principais proteínas, albumina e
globulina, decorrente dos reduzidos teores e biodisponibilidade de aminoácidos
sulfurados (PEREIRA; COSTA, 2002). De acordo com Rios et al. (2003), as condições e
o tempo de armazenamento podem alterar o valor nutricional das proteínas. Em feijão-
fava, Tintoré et. al. (2004) determinaram a quantidade relativa das proteínas:
albuminas, globulinas, prolaminas e glutelinas, bem como dos aminoácidos presentes.
Destas, apenas as prolaminas mostraram-se ricas em aminoácidos sulfurados.
2.2.3.5. Carboidratos
A principal função dos carboidratos é prover um suprimento contínuo de energia
às células do organismo (KOKUSZKA, 2005). Nas leguminosas, esses são constituídos
principalmente de amido, carboidrato complexo; um polissacarídeo formado por várias
unidades de glicose, encontrado na forma de amilose (cadeias retas) e de amilopectina
(cadeias ramificadas) (BRAGA, 2003).
As fibras representam os carboidratos resistentes à digestão enzimática e às
secreções do trato intestinal humano, que desempenham o papel de manter a
integridade funcional do trato gastrintestinal, com reconhecida importância na
prevenção de diversas doenças, como prisão de ventre, hemorróidas e outras (BUENO,
2005). Segundo Diniz et al. (2001), as fibras estão presentes principalmente no
tegumento dos grãos e os seus percentuais dependem do estágio de formação desta
camada. De acordo com Garbelotti e Torres (2005), leguminosas como feijão e grão-de-
bico podem ser consideradas como as principais fontes de fibra alimentar benéfica à
saúde humana.
A fração fibrosa dos alimentos é representada pelos constituintes da parede
celular: hemicelulose, celulose e lignina, que correspondem a Fibra alimentar total
(FAT), sendo celulose e lignina, a Fibra alimentar insolúvel (FAI) e hemicelulose, a Fibra
alimentar solúvel (FAS). No entanto, a maioria das tabelas de composição dos
alimentos ao invés de apresentarem essas frações mostra apenas o valor da fibra bruta.
262
Segundo Giuntini et al. (2003), essa determinação subestima o real valor da fração
alimentar total, que é devidamente quantificada através dos métodos enzímicos-
gravimétricos, por serem os que mais se aproximam da digestão humana.
Os referidos métodos têm sido atualmente empregados em trabalhos sobre a
quantificação da divergência para o conteúdo fibroso de feijões (LONDERO et al., 2006;
LONDERO et al., 2008; RIBEIRO et al., 2008a; RIBEIRO et al., 2008b).
2.2.3.6.
Ácido cianídrico
A produção do ácido cianídrico (HCN) é um fenômeno relativamente comum
entre plantas superiores, encontrado em aproximadamente 3.000 diferentes espécies
de plantas, muitas das quais pertencentes às famílias Rosaceae, Fabaceae, Linaceae,
Compositae e outras (VETTER, 2000; McMAHON et al., 1995; CONN, 1980). Várias
delas produzem quantidades suficientes de compostos cianogênicos, que podem
funcionar como formas de transporte de nitrogênio reduzido ou de moléculas químicas
na defesa contra insetos.
Segundo Roel et al. (2003) considera-se que a dose letal de HCN seja de
aproximadamente 1,0 a 4,0 mg de HCN por kg de peso vivo, sendo a tolerância
estendida para100 mg/kg se a absorção for cutânea.
Os glicosídeos cianogênicos conhecidos como linamarina e lotaustralina, sob a
ação de ácidos ou enzimas, sofrem hidrólise e liberam acetona, açúcar e ácido
cianídrico, o princípio tóxico formado (SANTOS et al., 2005; ROEL et al., 2003;
VETTER, 2000). Frehner et al. (1990) identificaram no feijão-fava a presença desses
dois monoglicosídeos, nas vagens e sementes depois da antese.
Entre as leguminosas que produzem HCN, somente o feijão-fava pode contê-lo
em quantidade elevada, sendo este o responsável pelo seu sabor amargo,
característica ausente em outras espécies de feijão (VIEIRA, 1992). Azevedo et al.
(2003) encontraram o conteúdo tóxico variando de 15-25 ppm a 115-150 ppm, em sete
variedades de feijão-fava comercializadas no CEASA-PI.
O consumo de grãos secos de feijão-fava com paladar amargo deve ser precedido
de cuidados, como deixar os grãos de molho durante uma noite e eliminar a água antes
do cozimento (VIEIRA, 1992). Segundo Azevedo et al. (2003), para eliminar a
272
toxicidade do feijão-fava e utilizar as sementes na alimentação humana, é necessário
submetê-las à cocção por três a cinco vezes, com total substituição da água utilizada.
Ihimire et al. (2004) encontraram maior redução do HCN nos grãos do feijão-fava a
partir da exposição em ácido clorídrico por 30 minutos, além de garantir a permanência
de altos índices de triptofano nos grãos, um aminoácido importante para síntese
protéica e regulação de alguns mecanismos fisiológicos.
2.3. Fixação biológica de Nitrogênio
Em regiões tropicais e subtropicais, espécies vegetais fixadoras de nitrogênio
atmosférico (N
2
) podem contribuir com mais de 80% da dieta protéica humana, sendo
que a fixação de N
2
constitui um dos principais suportes à produção vegetal e manejo
do solo (VALARINI, 2002). Tal fixação ocorre devido ao complexo enzimático
nitrogenase, que converte o N
2
em amônia (NH
4
) e assim disponibiliza nitrogênio para
as plantas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Os rizóbios, como são denominados comumente, são bactérias do solo que
crescem na rizosfera das plantas, sendo responsáveis pela fixação do N
2
e
proporcionando o aumento da disponibilidade de nutrientes que influenciam
positivamente na morfologia e fisiologia da planta (VESSEY, 2003). Contudo, nem
todas as bactérias presentes no solo formam associações especializadas, de forma que
o nitrogênio fixado seja disponibilizado diretamente a planta hospedeira, como as da
família Rhizobiaceae, que estabelecem associações simbióticas em nódulos de raízes
da família Fabaceae (Leguminaceae) (VALARINI, 2002).
Os caracteres utilizados para verificar a eficiência da nodulação são: número,
massa seca ou fresca de nódulos, massa seca da parte aérea e área foliar, que pode
ser estimada através do folíolo central (QUEIROGA et al., 2003).
Segundo Starkanova et al. (1999), a fixação biológica de nitrogênio (FBN) é
considerada um processo chave para o manejo agrícola sustentável, podendo
proporcionar às plantas menor dependência à aplicação de fertilizantes químicos
nitrogenados e fosfatados. Hara e Oliveira (2004) isolaram, em solos da Amazônia,
estirpes de rizóbios tolerantes à acidez do solo e à presença do alumínio tóxico,
capazes de solubilizar e disponibilizar fosfatos em níveis satisfatórios tanto para si como
282
para a planta hospedeira. Soares et al. (2006), avaliando a eficiência agronômica de
estirpes previamente selecionadas de rizóbio, em simbiose com o feijoeiro, no campo,
constataram aumento no rendimento e acúmulo de N
2
nos grãos do feijoeiro.
Outra forma de utilização da eficiência e diversidade de grupos-chave de
bactérias, como as que nodulam leguminosas e fixam N
2
, é em áreas que passaram por
processos de degradação ambiental, como as de mineração, uma vez que essas
bactérias participam dos processos de ciclagem de nutrientes e contribuem para a
sustentabilidade das áreas que passam por processo de revegetação (MELLONI et al.,
2006).
2.3.1. Classificação dos rizóbios
Inicialmente, as bactérias formadoras de nódulos em leguminosas eram todas
classificadas no gênero Rhizobium, apresentando seis espécies R. leguminosarum, R.
meliloti, R. trifolii, R. phaseoli, R. lupini e R. japonicum (FRED et al., 1932). O círculo de
hospedeiros era um fator importante para efeito de classificação, porém esse aspecto
deixou de ser considerado, devido ao grande número de exceções nos grupos, e os
avanços das pesquisas darem maior ênfase às características morfológicas, fisiológicas
e moleculares na classificação das estirpes (WANG et al., 2008).
Jordan (1984) modificou a taxonomia do rizóbio, subdividindo o gênero em
Bradyrhizobium e Rhizobium. O segundo gênero criado, Bradyrhizobium, é
caracterizado por apresentar cepas de crescimento lento, reação básica em meio de
cultura LMA (Levedura Manitol Ágar), com diâmetro menor ou igual a 1 mm e
crescimento em 5 a 7 dias, contendo as espécies R. japonicum e R. lupini, com
características semelhantes. No gênero Rhizobium permaneceram as três espécies: R.
leguminosarum, R. meliloti e R. loti, sendo considerados três biovares da primeira
espécie: R. leguminosarum bv. viciae, bv. trifolli e bv. phaseoli. Segundo Moreira e
Siqueira (2006), atualmente, com o uso das técnicas moleculares, são descritos seis
gêneros: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium e
Allorhizobium.
O gênero Rhizobium apresenta células aeróbias, Gram negativas, com forma de
bacilos, que medem 0,5-1,0 x 1,3-3,0 gm, e a motilidade é realizada por flagelos (1-6),
292
que podem ser perítricos ou subpolares; as colônias geralmente são brancas ou bege,
circulares, concavas, semitranslúcidas ou opacas e mucilaginosas, medindo 2-4 mm de
diâmetro aos 3-5 dias de incubação em meio LMA (WANG et al., 2008; BÉCQUER,
2004). O crescimento em meio de carboidratos geralmente é rápido, reação ácida e
abundante quantidade de polissacárideo extracelular, assim como os demais gêneros.
A temperatura ótima de crescimento ocorre entre 25-30 ºC e pH 6-7, porém, podem
crescer em extremos de temperatura (4,0-42,5 ºC) e pH (4,5-9,5); são
quimiorganotróficas, utilizando uma série de carboidratos e sais de ácidos orgânicos
como fontes de carbono, sem a formação de gás (MARIN et al., 2008). Segundo
Bécquer (2004), dentre as espécies descritas nesse gênero até o ano de 2001,
formando nódulos com Phaseolus vulgaris, encontram-se R. tropici, R. etlii, R. gallicum
e R. giardinii.
O gênero Sinorhizobium, cujas cepas são produtoras de ácido e de crescimento
rápido, como as de Rhizobium, foi segregado das cepas de rizóbios que formam
nódulos na soja (Glicyne max L.), especificamente R. fredii e R. meliloti (MARIN et al.,
2008), devido às diferenças entre as seqüencias do gene 16S rRNA (WANG et al.,
2008). As células bacterianas apresentam a forma de bacilos, que medem 0,5-1,0 x 1,2-
3,0 gm; a temperatura ótima de crescimento varia entre 25 e 30 ºC, mas muitas estirpes
crescem a 35ºC e outras a 10ºC; o pH ótimo está entre 6 e 8, porém algumas estirpes
crescem em pH 5 e outras em pH 10,5; são bactérias quimiorganotróficas, utilizando
uma série de carboidratos (exceto celulose e amido) e sais de ácidos orgânicos como
fonte de carbono (BÉCQUER, 2004).
Devido a existência de cepas com características intermediárias, às típicas
espécies rápidas de Rhizobium e espécies lentas de Bradyrhizobium, ocorreu a
formação do gênero Mesorhizobium. Nesse gênero, as células bacterianas são bacilos,
que medem 0,4-0,9 x 1,2-3,0 gm; as colônias em meio LMA são circulares, convexas,
semitranslúcidas e mucilaginosas, com 2-4 mm de diâmetro, após 5 dias de incubação
a 28ºC, contudo, algumas espécies apresentam menos de 1 mm após 7 dias de
incubação (WANG et al., 2008). Todas as cepas produzem ácido em LMA. Todas as
espécies assimilam glicose, raminose e sacarose metabolizando-os em produtos
ácidos, sendo que o pH ideal para crescimento está entre 4,0 e 10,0 e a temperatura
303
entre 37 a 40 ºC (MARIN et al., 2008).
O gênero Bradyrhizobium apresenta células bacterianas aeróbias, Gram-
negativas, bacilos que medem 0,5-0,9 x 1,2-3,0 gm, com um flagelo polar ou subpolar,
e crescimento pouco e lento, em meio enriquecido com levedura; são pleomórficas e
não formam esporos (WANG et al., 2008; BÉCQUER, 2004). As colônias são circulares,
raramente translúcidas, brancas e convexas, com diâmetro menor que 1 mm após 5-7
dias de incubação. Podem formar colônias do tipo seco, opacas, freqüentemente
punctiformes e produtoras de álcali. Ormenõ- Orrillo et al. (2006) identificaram a espécie
Bradyrhizobium yuanmingense nodulando o feijão-fava, cujos isolados apresentavam
taxa de crescimento lento, atingindo colônias com tamanho de 1-3 mm, entre 5-6 dias.
Entretanto, um grupo de isolados com taxa de crescimento considerado extra-lento,
atingindo colônias de tamanho > 1 mm, entre 7-10 dias, não apresentou similaridade
com nenhuma espécie já descrita no gênero Bradyrhizobium, o que representa uma
grande diversidade desconhecida entre os microrganismos noduladores do feijão-fava.
Segundo Euzéby (2008), existem ainda descritas as espécies B. japonicum, B. elkanii,
B. liaoningense, B. betae e B. canariense, pertencentes a esse gênero.
O gênero Azorhizobium possui uma única espécie descrita, A. caulinodans, que
forma nódulos efetivos em talos e raízes de Sesbania rostrata. Segundo Wang et al.
(2008), as células bacterianas apresentam forma de bacilos que medem 0.5-0.6 x 1.5-
2.5 gm, movendo-se em meio sólido devido a presença de flagelos peritricos e em meio
líquido, com flagelo lateral. As colônias são circulares, translúcidas, gomosas, cor
cremosa e apresentam crescimento tão rápido como as do gênero Rhizobium (medindo
mais de 2 mm de diâmetro, após 2 dias), produzem álcali em meio LMA. Ao contrário de
Rhizobium e Bradyrhizobium, esse gênero não assimila açúcares (exceto glicose)
(MARIN et al., 2008) e segundo Young (1996), quanto à posição filogenética, encontra-
se mais afastado do gênero Rhizobium.
O gênero Allorhizobium também apresenta, até agora, uma única espécie
descrita, A. undicola (LAJUDIE et al., 1998), isolada a partir de nódulos de Neptuna
natans, uma planta aquática africana do Senegal (WANG et al., 2008).
Até recentemente era aceito que as leguminosas eram noduladas
exclusivamente por membros das j-Proteobactérias pertencentes a alguns gêneros
313
relacionados à família Rhizobiaceae, acima descritos. Nós últimos anos, entretanto, um
número de outras j-proteobactérias foram mostradas como noduladoras de
leguminosas incluindo Methylobacterium, (SY et al, 2001), Blastrobacter (VAN BERKUN
e EARDLY, 2002) e Devosia (RIVAS et al., 2002).
Atualmente membros de k-Protobactérias foram descobertas nos nódulos de
leguminosas tropicais incluindo, Burkholderia sp. estirpes (STM 678 e STM 815),
Ralstonia taiwanesis (LMG 19424) isoladas de Mimosa pudica (Chen et al. 2001, 2003
e 2007).
2.3.2. Diversidade dos rizóbios
A utilização da diversidade dos microrganismos ocorre, principalmente, através
do conhecimento das características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas,
fiologenéticas e genéticas, que são aplicadas de forma conjunta ou individual nos
trabalhos sobre rizóbios (ORMENÕ-ORRILLO et al., 2006; ZRIBI et al., 2005; FENG et
al., 2002; ANYANGO et al., 1995; SOARES et al., 2006; STROSCHEIN, 2007).
Atualmente todas essas técnicas são utilizadas para distinção de estirpes de rizóbios,
constituindo a taxonomia polifásica, mantendo o uso dos métodos fenotípicos clássicos,
que nunca entraram em desuso ou tornar-se-ão obsoletos. Segundo Bécquer (2004), a
diversidade genética dos microrganismos nunca poderá ser avaliada por um único
critério, ainda que sejam as técnicas moleculares.
A captura dos microrganismos na rizósfera das plantas é feita com a utilização de
planta-isca, cuja principal característica é a promiscuidade, constituindo um dos
métodos mais utilizados para avaliar a diversidade de bactérias noduladoras de
leguminosas e fixadoras de N
2
(BNLFN) nos solos. Hungria (1994) recomenda a coleta
de nódulos para isolamento ou de solos que serão utilizados como fonte de inóculos,
em um raio de 30 cm da planta-isca, na profundidade de 0 a 20 cm. O isolamento
normalmente é realizado a partir da seleção aleatória dos maiores nódulos, de
coloração intensa avermelhada, firmando a presença de leghemoglobina e conseqüente
fixação ativa de N
2
.
Melloni et al. (2006) avaliaram a eficiência e a diversidade fenotípica de
populações de BNLFN em solos de áreas de mineração de bauxita, nos ambientes de
323
campo e serra, baseados nas seguintes características culturais: tempo de crescimento,
diâmetro da colônia, alteração do meio e produção de goma. Os autores construíram
dois dendrogramas de similaridade, um para os isolados de feijão-caupi e outro para
feijão-comum utilizados como plantas-isca. O feijão-caupi mostrou-se com um maior
número de grupos de diversidade, em ambos os ambientes. De acordo com Santos et
al. (2007) e Melloni et al. (2006), além do número de grupos de diversidade, a
caracterização fenotípica de isolados também pode estimar a diversidade das
populações de rizóbio através dos índices: Shanon e Weaver, riqueza de Margalef e
outros, aplicados quando populações são obtidas de formas diferenciadas, como
isolamento dos microrganismos coletados sob diferentes áreas, coberturas vegetais e
ou diferentes manejos.
Entre isolados de rizóbio nativos existe eficiente fixação do N
2
, que pode
contribuir para aumentar a produção de grãos e reduzir os custos com fertilizantes
nitrogenados, entretanto, é necessária a avaliação, de modo a possibilitar a seleção de
estirpes altamente eficientes em condições adversas (SANTOS et al., 2005). Silva et al
(2007) identificaram entre isolados de rizóbios nativos, estirpes resistentes à
temperatura elevada e resistentes aos antibióticos kanamicina e ácido nalidíxico, com
potencial para utilização em regiões semi-áridas. Segundo Vieira et al (2005), as
estirpes nativas de rizóbio podem ser tão eficientes quanto as estirpes selecionadas,
quando condições adequadas de expressão do seu alto potencial de fixação de N
2
são
fornecidas.
Na literatura são encontrados diversos trabalhos sobre fixação biológica de
nitrogênio, em diferentes leguminosas, tais como: amendoin (SANTOS et al., 2005),
feijão-caupi (VIEIRA et al., 2005, ZILLI et al., 2006), feijão-caupi e feijão-comum
(MELLONI et al., 2006), feijão-comum (MOTASSO et al., 2002), que além de identificar
a diversidade dos rizóbios, também avaliam a eficiência dessas bactérias no processo
da FBN.
Considerando-se que a FBN é mediada por uma ampla gama de microrganismos
procariotos, com substancial diversidade morfológica, fisiológica, genética, bioquímica e
filogenética (SILVA et al., 2007), espera-se que estudos envolvendo um simbionte
pouco conhecido como o Phaseolus lunatus, proporcionem o isolamento de novas
333
estirpes de rizóbio, com características importantes para adaptação ecológica e maior
eficiência na fixação biológica de nitrogênio.
2.4. Análises multivariadas
As técnicas multivariadas possibilitam a avaliação simultânea de vários
caracteres e permitem que inúmeras inferências sejam feitas a partir do conjunto de
dados existentes (FONSECA; SILVA, 1999). Essas técnicas podem gerar informações
importantes para manutenção dos recursos genéticos, na simplificação de bancos de
germoplasma e formação de coleções núcleo (ARIEL et al., 2006); além de auxiliar na
escolha de descritores que melhor representem à diversidade presente nos Bancos
Ativos de Germoplasma (BAGs) (FONSECA; SILVA, 1999). Para os programas de
melhoramento, as técnicas multivariadas auxiliam, sobretudo, na identificação de
combinações híbridas de maior heterozigose e de maior efeito heterótico (CARVALHO
et al., 2003), e na indicação de potenciais genitores a serem utilizados (KARASAWA et
al., 2005).
Com relação aos bancos de germoplasma, a própria caracterização das sub-
amostras empregadas nessas análises, possibilita a identificação de duplicatas e o
intercâmbio de germoplasma entre pesquisadores. As duplicatas são presenças
inconvenientes em BAG, por reduzirem o espaço disponível para conservação e
avaliação do material, além de não contribuírem para a variabilidade genética, principal
motivo da conservação (FONSECA; SILVA, 1999).
Em programas de melhoramento, o efeito heterótico pode ser estimado pela
natureza preditiva dos genótipos com o uso das análises multivariadas, que tomam por
base as características agronômicas, morfológicas, moleculares, entre outras, e
dispensam a obtenção das combinações híbridas entre as sub-amostras, tornando-se
vantajosas em relação aos métodos quantitativos, que utilizam as análises dialélicas
(CRUZ et al., 2004).
Entre as análises multivariadas destacam-se os métodos de agrupamento por
otimização e os hierárquicos, que realizam o agrupamento de sub-amostras utilizando
algum critério, mas, geralmente, mantém o princípio de estabelecer maior
homogeneidade dentro do grupo que entre os grupos (CRUZ et al., 2004).
343
O método de otimização mais utilizado é o método de Tocher, que usa o critério
do estabelecimento de grupos, de forma que a distância média intragrupos seja sempre
inferior a qualquer distância intergrupos (RAO, 1952). Os métodos hierárquicos
envolvem a construção de uma hierarquia aglomerativa ou divisiva em forma de um
dendrograma, aonde as observações vão sendo combinadas passo-a-passo e não há
um número pré-definido de grupos que serão formados. Entre os mais utilizados estão
o método de ligação simples (single linkage) ou vizinho mais próximo, ligação completa
(complete linkage) ou vizinho mais distante e ligação média entre grupos (UPGMA)
(CRUZ, 2001).
O método de otimização de Tocher permite a formação de grupos mutuamente
exclusivos, enquanto que os métodos hierárquicos apresentam uma grande
possibilidade de números de grupos, cabendo ao pesquisador adotar àquela que
melhor represente a estrutura de agrupamento esperada, com base no seu conjunto de
dados (BERTAN et al., 2006). Segundo Cruz et al (2004), o estabelecimento de um
exame visual de pontos onde ocorram altas mudanças de níveis possibilita a
delimitação dos grupos.
O agrupamento de Tocher é normalmente utilizado juntamente com o UPGMA,
que revelam correspondência na alocação dos elementos nos grupos (ARIEL et al.,
2006). A concordância com o agrupamento de Tocher permanece mesmo quando outro
agrupamento hierárquico é utilizado ou técnica multivariada. Karasawa et al. (2005),
trabalhando com tomates, encontraram correspondência na formação de grupos pelos
métodos de Tocher e Vizinho Mais Próximo. Abreu et al. (2004), através dos
componentes principais e agrupamento de Tocher, identificaram concordantemente as
mesmas sub-amostras de feijão-de-vagem como as mais distantes. Por isso o
agrupamento de Tocher tem sido eficiente na identificação da diversidade genética em
genótipos de feijão (COIMBRA; CARVALHO, 1998) ou de genitores promissores para o
melhoramento de caracteres nutricionais nos grãos de feijão (RIBEIRO et al., 2005).
O UPGMA, que utiliza a média das distâncias entre todos os pares de genótipos
para formação de cada grupo, é adotado em grande escala no melhoramento vegetal,
na representação das distâncias em estudos multivariados, apresentando superioridade
em relação aos demais hierárquicos, em estudos filogenéticos (BERTAN et al., 2006).
353
Ariel et al. (2006) definiram esse método como o de melhor ajuste, seguido dos
métodos do vizinho mais próximo e do vizinho mais distante, através dos coeficientes
de correlação cofenética, que estima o grau de ajuste entre as matrizes de
dissimilaridade observada e a matriz resultante do agrupamento. Elias et al. (2007)
também utilizaram o método UPGMA para agrupamento de cultivares locais de feijão
preto, do Estado de Santa Catarina, devido a superioridades em relação aos demais
métodos hierárquicos, em fornecer informações genealógicas ou pedigree.
A aplicação dos métodos de agrupamento depende da utilização de uma medida
de dissimilaridade previamente estimada (CRUZ et al.; 2004), entre as quais
encontram-se a distância euclidiana e a distância generalizada de Mahalanobis. Esta
última é uma medida obtida a partir de dados quantitativos, com repetição, que foi
proposta por Mahalanobis, em 1936, sendo amplamente empregada em estudos de
divergência nas mais diferentes culturas, tais como: arroz (ZIMMER et al., 2003),
melancia (SOUZA et al., 2005), aveia (BENIN et al., 2003) e feijão (ELIAS et al., 2007;
ABREU et al., 2004; MACHADO et al., 2002; COIMBRA; CARVALHO, 1998).
O emprego das análises multivariadas a partir das medidas de dissimilaridades
aumenta a probabilidade de se recuperar genótipos superiores nas gerações
segregantes (CARVALHO et al., 2003), sobretudo, quando se realiza o cruzamento
entre indivíduos mais afastados gerados por essas análises (KARASAWA et al., 2005).
Segundo Coimbra e Carvalho (1998), a identificação de genótipos contrastantes através
da distância generalizada de Mahalanobis é relevante para o programa de
melhoramento lograr êxito na seleção. Todavia, a escolha de genótipos deve ser feita
considerando também seus comportamentos per se (ABREU et al., 2004), ou seja, o
mais apropriado é recomendar cruzamentos entre genótipos divergentes, mas que
também evidenciem desempenho superior em relação aos principais caracteres de
importância agronômica (COIMBRA; CARVALHO, 1998).
Para os caracteres qualitativos, também avaliados no melhoramento vegetal e na
caracterização de microrganismos, são utilizados índices ou coeficientes para
transformação dos dados originais em matrizes de dissimilaridade, que são
posteriormente analisadas de forma multivariada. Sudré et al. (2006) e Bento et al.
(2007), em estudos sobre divergência de pimentas e pimentões, utilizaram dados
363
multicategóricos multiclasses e binários, para construção de agrupamento pelos
métodos do vizinho mais próximo e Tocher. Fernandes et al. (2003) caracterizaram
geneticamente estirpes de rizóbios nativos dos tabuleiros costeiros de Sergipe,
empregando o coeficiente de Jacard para construção de dendrograma pelo método
UPGMA. Freitas et al. (2007) utilizaram o coeficiente de Jacard para construir um
dendrograma de similaridade, com base em características fenotípicas de bactérias que
nodularam Jacatupé.
Segundo Ariel et al. (2006), quando não se tem informação sobre a relação
genética entre a maioria dos genótipos, não se pode determinar que método de
agrupamento seja mais acurado. Entretanto, para os estes é importante que diferentes
critérios de agrupamento sejam utilizados, e que se considere como correta a estrutura
resultante da maior parte deles, para se assegurar que o resultado obtido não seja um
artefato da técnica utilizada, tendo em vista que cada técnica multivariada impõe certo
grau de estrutura aos dados no reconhecimento da diversidade genética.
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4. CAPÍTULO I
Divergência genética para caracteres físicos e químicos de sementes em feijão-
fava (Phaseolus lunatus L.)
Genetic divergence for physical and chemical characters of seeds in lima bean
(Phaseolus lunatus L.)
Jardel Oliveira Santos
1
Regina Lucia Ferreira Gomes
2*
Ângela Celis de Almeida
Lopes
3
Solranny Carla Costa Silva
1
Ethyenne Moraes Bastos
4
Eva Maria
Rodrigues Costa
5
RESUMO
Objetivou-se realizar a caracterização física e química de sementes e estimar a
divergência genética entre sub-amostras de feijão-fava. O material genético constou de
27 sub-amostras, provenientes do Banco Ativo de Germoplasma de Feijão-Fava da
Universidade Federal do Piauí, cultivadas no ano agrícola de 2006. As sementes
dessas sub-amostras foram avaliadas com relação aos seguintes caracteres químicos:
umidade (8,26 a 11,25 g/100g), cinzas (2,62 a 3,70 g/100g), extrato etéreo (0,16 a 0,93
g/100g), proteína bruta (16,85 a 23,41 g/100g), extrato não nitrogenado (62,24 a 70,07
1
Mestrado em Agronomia, Centro de Ciências Agrárias (CCA), Universidade Federal do Piauí (UFPI). Campus
Ministro Petrônio Portela, Bairro Ininga, 64.049-550, Teresina, PI, Brasil.
2*
Departamento de Fitotecnia, CCA, UFPI, Teresina, PI, Brasil. E-mail: rlfgomes@ufpi.edu.br. Autor para
correspondência.
3
Departamento de Biologia, Centro de Ciências da Natureza (CCN), UFPI, Teresina, PI, Brasil.
4
Graduação em Ciências Biológicas, CCN, UFPI, Teresina, PI, Brasil.
5
Graduação em Engenharia Agronômica, CCA, UFPI, Teresina, PI, Brasil.
535
g/100g), fibra alimentar total (24,21 a 62,42 g/100g), fibra insolúvel (5,65 a 11,88
g/100g), fibra solúvel (15,82 a 53,11 g/100g) e ácido cianídrico (44,49 a 160,63 mg/kg).
Os caracteres físicos avaliados nas sementes foram: comprimento (9,66 a 18,52 mm),
largura (7,41 a 11,83 mm), espessura (5,33 a 6,90 mm) e massa de 100 sementes
(27,60 a 87,79 g), que possibilitaram a classificação quanto à forma (esférica, elíptica e
oblonga/reniforme), perfil (achatado e semi-achatado) e tamanho (pequeno, médio,
normal e grande). A divergência genética entre as sub-amostras foi estimada pelo
método de agrupamento de Tocher, com emprego da distância de Mahalanobis, como
medida de dissimilaridade, formando-se dez grupos. O método de Singh, utilizado para
estimar a contribuição relativa de cada caráter na expressão da divergência genética,
indicou que fibra alimentar total (48,62 %) e a fibra solúvel (46,03%) foram os
caracteres que mais contribuíram para a divergência total (94,65%) entre as sub-
amostras de feijão-fava avaliadas.
Palavras-chave: Germoplasma, proteína, ácido cianídrico, dissimilaridade.
ABSTRACT
This study aimed the physical and chemical characterization of the lima bean
seeds and to evaluated the genetic divergence among samples. In this characterization,
the genetic material consisted of 27 samples, from the "BAG de Feijão-Fava
Universidade Federal do Piauí", cultivated in the 2006 year crop. The seeds of these
samples were evaluated regarding to chemical characters: moisture (8.26 to 11.25
g/100g), ashes (2.62 to 3.70 g/100g), ethereal extract (0.16 to 0.93 g/100g), crude
protein (16.85 to 23.41 g/100g), non-nitrogen extract (62.24 to 70.07 g/100g), total
dietary fiber (24.21 to 62.42 g/100g), insoluble fiber (5.65 to 11.88 g/100g), soluble fiber
(15.82 to 53.11 g/100g) and cyanic acid (44.49 to 160.63 mg / kg). The physical
characters evaluated in the seeds were: length (9.66 to 18.52 mm), width (7.41 to 11.83
mm), thickness (5.33 to 6.90 mm) and weight of 100 seeds (27. 60 to 87.79 g), which
permitted the classification as to form (spherical, elliptical and oblong / reniform), profile
545
(flat and semi-flat) and size (small, medium, normal and great). The genetic divergence
among the samples was estimated by the Tocher grouping method, with the
employment of the Mahalanobis distance, as a measure of dissimilarity that formed ten
groups. The Singh method, used to estimate the relative contribution of each character
in the expression of genetic divergence, indicated that the total dietary fiber (48.62%)
and soluble fiber (46.03%) were those who most contributed the total divergence
(94.65%) among the samples of lima beans evaluated.
Key words: Germoplasm, protein, cyanic acid, dissimilarity.
INTRODUÇÃO
Das 40 espécies do gênero Phaseolus encontradas nas Américas, somente
cinco são cultivadas: P. vulgaris (feijão-comum), P. lunatus (feijão-fava), P. coccineus
(feijão-ayocote), P. acutifolius (feijão-tapiri) e P. polyanthus (feijão de toda uma vida)
(DEBOUCK, 1991). Dentre essas, a segunda espécie mais importante é o P. lunatus
(MAQUET et al., 1999).
No Brasil, o feijão-fava é cultivado principalmente na região Nordeste, com
exceção da Bahia, recebendo várias outras denominações populares, como: fava, fava-
belém, feijão-espadinho, feijão-farinha, feijão-fígado-de-galinha, feijão-de-lima ou fava-
de-lima. Representa uma fonte potencial de proteína vegetal e de outros compostos
nutricionais em elevados teores, à disposição dos apreciadores dessa leguminosa
(VIEIRA, 1992; AZEVEDO et al., 2003).
As características relacionadas à qualidade do grão, físicas, químicas e
culinárias, são importantes para os consumidores de feijão, sendo consideradas como
critérios adicionais de seleção nos programas de melhoramento (HERRERA et al.,
2002). Em feijão-fava, segundo BRESSANI & ELIAS (1980), a composição química de
grãos secos é de 62,9% de carboidratos; 25,0% de proteína; 6,1% de fibras; 3,9% de
cinzas e 2,0% de extrato etéreo. Já AZEVEDO et al. (2003), em sete cultivares da
mesma espécie, observaram variação de 64,40 a 73,59% de carboidratos; 17,95 a
555
26,70% de proteína bruta; 2,27 a 4,59% de fibra bruta; 3,06 a 4,10% de cinzas e 0,88 a
1,42% de extrato etéreo; e também a presença de conteúdo cianogênico na faixa de
15-25 a 115-150 mg/kg, caracterizando o sabor amargo.
O cultivo do feijão-fava sofre limitações devido principalmente à maior tradição
de consumo do feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.), o paladar amargo e o tempo de
cocção mais longo de seus grãos (LYMMAN, 1983; GUIMARÃES et al., 2007), além da
ausência de cultivares no mercado, que atendam às preferências de cada região.
Em programas de melhoramento, é recomendável evitar cruzamentos entre
genótipos do mesmo padrão de similaridade, para que a variabilidade não seja restrita e
inviabilize os ganhos genéticos a serem obtidos pela seleção (COIMBRA &
CARVALHO, 1998). Segundo CRUZ et al. (2004), o efeito heterótico pode ser estimado
preditivamente entre genótipos pela utilização das análises multivariadas, manuseio
simultâneo de vários caracteres ou diretamente na medida de dissimilaridade requerida
para execução da análise. Assim, tomando-se por base estimativas da divergência
genética entre genótipos, é possível inferir sobre a capacidade específica de
combinação e a heterose, antes de se realizar os cruzamentos no campo, com a maior
chance de identificar e recuperar combinações mais promissoras nas populações
segregantes (OLIVEIRA et al., 2003; ABREU et al., 2004).
Análise multivariada em estudos sobre divergência genética tem sido uma
ferramenta intensivamente utilizada em pesquisas, nas várias culturas, como o quiabo
(MARTINELLO et al., 2001), tomate (KARASAWA et al., 2005) e feijão (COIMBRA &
CARVALHO, 1998, FONSECA & SILVA, 1999; ELIAS et al., 2007). Dentre as
metodologias disponíveis, o uso da distância generalizada de Mahalanobis (D
2
), como
medida de dissimilaridade, e o método de agrupamento de Tocher têm sido eficientes
na identificação da diversidade genética.
A estruturação de grupos de divergência é fundamental para a escolha de
genitores, sendo que cruzamentos a partir de genótipos reunidos em grupos afastados
são considerados mais promissores pelo indicativo de serem mais dissimilares (BENIN
et al., 2002).
Assim, objetivou-se realizar a caracterização física e química de sementes e
estimar a divergência genética entre sub-amostras em feijão-fava.
565
MATERIAL E MÉTODOS
O material genético constou de 27 sub-amostras de feijão-fava (Phaseolus
lunatus L.), provenientes do Banco Ativo de Germoplasma de Feijão-Fava (BAG de
Feijão-Fava) da Universidade Federal do Piauí (UFPI), cultivados no ano agrícola de
2006 (Tabela 1).
As análises químicas foram realizadas nos seguintes laboratórios: Controle de
Qualidade Físico-Químico, do Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de
Alimentos, e Nutrição Animal, do Departamento de Zootecnia, ambos do Centro de
Ciências Agrárias da UFPI; e Química, do Departamento de Química, do Centro de
Ciências da Natureza, da UFPI.
As amostras de 200 g de sementes de cada uma das sub-amostras de feijão-
fava foram trituradas, em um multi-processador elétrico, acondicionadas em sacos
plásticos de polietileno e armazenadas em local seco e fresco, entre 19 a 25ºC.
Posteriormente, as amostras foram submetidas às análises químicas, conforme
procedimento da AOAC (1995), sendo avaliados os seguintes caracteres: teor de
umidade (UMD), determinado por secagem em estufa a 105°C, até a obtenção de peso
constante; teor de cinza (CZ), determinado pelo método gravimétrico, baseado na perda
de peso do material submetido ao aquecimento a 550°C; extrato etéreo (EE),
quantificado após extração com éter de petróleo, usando aparelho de Soxhlet; proteína
bruta (PB), determinada pelo método micro-Kjeldahl; extrato não nitrogenado (ENN),
calculado por diferença, de acordo com a expressão: 100 - (umidade + cinzas + extrato
etéreo + proteína bruta); fibra em detergente neutro (FDN) representando a fibra
alimentar total, e fibra em detergente ácido, representando a fibra insolúvel,
determinadas segundo metodologia proposta por Van Soest e Wine, descrita por SILVA
(1990); hemicelulose (HEM), representando a fibra solúvel, obtida por diferença: FDN -
FDA; e ácido cianídrico (HCN), determinado quantitativamente pelo método
argentométrico.
Na caracterização física das sementes foram avaliados: comprimento (C),
575
largura (L) e espessura (E), correspondendo às medidas em milímetros, determinadas
com paquímetro digital, em dez sementes tomadas ao acaso; e a massa de 100
sementes (M100S), referente ao peso, em gramas, de 100 grãos tomados ao acaso.
Mediante essa caracterização, as sementes foram classificadas quanto ao tamanho,
segundo Mateo Box, citado por VILHORDO et al. (1996), em: pequena (massa de 100
sementes menor que 30 g), média (31 a 40 g), normal (41 a 59 g), e grande (massa de
100 sementes maior que 60 g). Quanto à forma, a classificação das sementes foi
realizada em função do indice J, obtido pela relação entre comprimento e largura (C/L),
em: esférica (1,16 a 1,42 mm), elíptica (1,43 a 1,65 mm) e oblonga/reniforme curta (1,66
a 1,85 mm). A classificação quanto ao perfil ocorreu em função do índice H, com base
na relação espessura/largura (E/L), em: achatada (menor que 0,69 mm) e semi-
achatada (0,70 a 0,79 mm), segundo Puerta Romero, citado por VILHORDO et al.
(1996).
As análises de variância de cada caráter foram realizadas de acordo com o
delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições. Para comparação entre
as médias das sub-amostras, utilizou-se o critério de agrupamento de Scott-Knott
(SCOTT & KNOTT, 1974), a 5% de probabilidade.
Na análise multivariada, a divergência genética entre as sub-amostras foi
determinada pelo método de agrupamento de Tocher (RAO, 1952), com o emprego da
distância generalizada de Mahalanobis, como medida de dissimilaridade. A
identificação da importância dos caracteres foi feita com base no método de Singh
(SINGH, 1981), complementada pelo método de descarte de variáveis, conforme a
metodologia de GARCIA (1998).
As análises estatístico-genéticas foram realizadas com auxílio do programa
Genes (CRUZ, 2001).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise univariada
As sub-amostras de feijão-fava diferiram (P<0,05) com relação a todos os
caracteres avaliados (Tabela 2), o que indica a presença de variabilidade genética e,
585
conseqüentemente, a possibilidade de obtenção de ganhos genéticos com a seleção
de genótipos superiores. Quanto aos coeficientes de variação experimental (CV), os
valores mínimo e máximo observados foram de 2,17% (extrato não nitrogenado) e
21,49% (hemicelulose).
A determinação do teor de umidade nas sementes apresentou média de 9,68
g/100g, e em todas as sub-amostras foi inferior ou igual a 11 g/100g, média
recomendada pela Secretaria de Agricultura, Irrigação e Reforma Agrária (SEAGRI,
2008), para armazenamento de sementes e grãos de feijão, a longo prazo. Tais
resultados revelam que as sementes provenientes do BAG de Feijão-Fava da UFPI
encontravam-se devidamente conservadas e, portanto, em condições para realização
de qualquer análise. Segundo LUZ (2002), um alto conteúdo de umidade pode diminuir
o desempenho fisiológico das sementes, além de favorecer a atividade de insetos e
fungos que prejudicam o armazenamento de sementes e grãos.
Com relação ao teor de cinzas, os valores mínimo e máximo observados foram de
2,62 g/100g (UFPI-177) e 3,70 g/100g (UFPI-264), respectivamente, com média geral
de 3,21 g/100g. Segundo MADRUGA & ALDRIGUE (2000), as cinzas de um alimento
correspondem ao resíduo obtido por incineração, em temperaturas de 550 a 570ºC, e a
sua determinação permite a avaliação dos minerais presentes nos alimentos. Esses
minerais são de grande importância nas dietas, uma vez que contribuem para o perfeito
equilíbrio orgânico, fazendo parte de praticamente todos os tecidos do corpo humano,
além de desempenhar papel importante em muitos processos metabólicos.
O conhecimento da fração mineral é necessário, porque os teores dos diferentes
componentes desta fração variam grandemente, não só de um alimento para outro,
como também num mesmo alimento. Tal fração é composta por ferro, cálcio, fósforo,
zinco e cobre, e para cada um destes há variações de porcentagem no alimento
estudado. AZEVEDO et al. (2003) encontraram teores de cinza variando de 3,06% a
4,10%, com médias de cálcio e fósforo de 0,06% e 0,30%, respectivamente, indicando
ser o feijão-fava mais rico em fósforo. As sub-amostras UFPI-264, UFPI-229, UFPI-222
e UFPI-234, que apresentaram os maiores teores de cinza, podem ser bastante
promissoras quanto à presença de fósforo e cálcio.
Quanto ao extrato etéreo, as sub-amostras apresentaram média de 0,50 g/100g,
595
mínimo de 0,16 e máximo de 0,93 g/100g. Destacaram-se as sub-amostras UFPI-177 e
UFPI-491, com valores de 0,93 e 0,88 g/100g, respectivamente. AZEVEDO et al.
(2003) observaram variação de 0,88% a 1,42%.
Para o teor de proteína, a média foi de 20,76 g/100g. As sub-amostras se
agruparam em duas classes, sendo que os valores mais baixos variaram entre 16,85 a
19,68 g/100g e os mais altos, entre 20,25 a 23,41 g/100g. Esses resultados indicam a
possibilidade de seleção de sub-amostras com teores mais elevados de proteína. Os
valores máximo e mínimo observados por Azevedo et al. (2003) foi de 17,95 a 26,70%,
e de 21 a 30%, por McLEESTER (1973).
Na determinação do extrato não nitrogenado, fração correspondente aos
carboidratos, observou-se que os valores mínimo e máximo foram de 62,24 e 70,07
g/100g, respectivamente, com média de 65,85 g/100g. As sub-amostras UFPI-173
(70,07 g/100g) e UFPI-32 (69,54 g/100g) apresentaram as maiores médias.
As fibras possuem um valor nutricional específico em função das diferentes
frações encontradas: a fibra insolúvel e a fibra solúvel. Conforme a revisão apresentada
por GONÇÁLVES et al. (2007), as fibras insolúveis diminuem o tempo do trânsito
intestinal, aumentam o volume do bolo fecal, retardam a absorção de glicose e a
hidrólise do amido; já as fibras solúveis, que auxiliam na normalização da microbiota
intestinal, são eficientes para tratamento da constipação intestinal, diminuem o índice
glicêmico dos alimentos, aumentam o poder de saciedade de uma refeição e auxiliam
no tratamento do colesterol. Para fração de fibra alimentar total, determinada a partir da
fibra em detergente neutro (FDN), observou-se que os valores mais elevados foram
entre 52,62 e 62,42 g/100g, e os mais baixos entre 24,26 a 38,18 g/100g. Na fração
insolúvel, determinada a partir da fibra em detergente ácido (FDA), a sub-amostra UFPI-
220 apresentou a maior média, 11,88 g/100g. As menores médias observadas
situavam-se entre 5,65 a 5,82 g/100g. Na fração solúvel, hemicelulose, as sub-amostras
com as médias mais altas variaram de 45,77 a 53,11 g/100g, e as mais baixas, de
15,82 a 23,33 g/100g.
As sub-amostras UFPI-264, UFPI-134, UFPI-173, UFPI-220, UFPI-274, UFPI-
237, UFPI-251, UFPI-275, UFPI-282, UFPI-491 e UFPI-228 apresentaram os mais
baixos teores de ácido cianídrico. Considerando-se esse caráter, o interesse dos
606
melhoristas é no sentido de selecionar genótipos com as menores médias, tendo em
vista a sua relação com o paladar amargo, característico de algumas variedades do
feijão-fava, que tem de certa forma limitado seu consumo (LYMAN, 1983; AZEVEDO et
al., 2003). Segundo FREHNER et al. (1990), os glicosídeos cianogênicos linamarina e
lotaustralina, que conferem o efeito tóxico do HCN no feijão-fava, são produzidos na
vagem e sementes, desde os primeiros dias após a antese, mas somente sob a ação
de choque mecânico ou ferimento ocorre a liberação das enzimas responsáveis pela
quebra dos glicosídeos (VETTER, 2000).
Para os caracteres físicos da semente, as médias do comprimento, largura,
espessura e massa de 100 sementes foram de 13,23 mm, 9,27 mm, 5,99 mm e 46,74 g,
respectivamente (Tabela 3). O acesso UFPI-276 apresentou as maiores médias, com
valores de 18,52 mm, 11,83 mm, 6,90 mm e 87,79 g, para esses caracteres. Os mais
baixos valores situaram-se entre 9,66 a 11,31 mm, para o comprimento da semente;
7,41 a 8,02 mm, para a largura da semente; 5,33 a 5,84 mm, quanto a espessura da
semente e para massa de 100 sementes, entre 27,60 a 38,49 g. Os CV's, com
amplitude de 4,56% (espessura das sementes) a 18,01% (massa de 100 sementes),
foram considerados satisfatórios para os descritores utilizados.
Considerando os padrões de forma, perfil e tamanho das sementes (Tabela 3) e
cor do tegumento (Tabela 1), verifica-se que o feijão-fava apresenta bastante variação,
constituindo-se numa excelente opção de incremento estético de grãos, entre as
leguminosas usadas para alimentação.
Na classificação das sementes das sub-amostras, prevaleceu a forma esférica
(18 sub-amostras), perfil achatado (19 sub-amostras) e tamanho normal (10 sub-
amostras). MACKIE (1943) identificou, em P. lunatus, três grupos de semente segundo
a forma e o tamanho: o Sieva, com sementes médias e achatadas (na ramificação
Hopi), o Batata, com sementes pequenas e globosas (na ramificação Caribe), e o Big
lima, sementes grandes e achatadas (na ramificação Inca), propondo que os grupos de
diversidade formados teriam sido decorrentes da dispersão vinculada à rota do
comércio. Posteriormente, comprovando a ampla variabilidade das sementes de P.
lunatus, em Cuba, foram encontrados entre 173 sub-amostras, além dos grupos Sieva,
Batata e Big lima, sementes com algumas caracteristicas intermediárias a esses três
616
grupos, capazes de formar novos grupos: o Batata-Sieva e o Sieva-Big lima
(ESQUIVEL, et al., 1990).
Segundo VARGAS et al (2003), as características morfológicas das sementes de
feijão-fava têm sido um dos principais critérios utilizados para explicar a origem e a
diversidade na espécie, e além disso, são os principais parâmetros usados pelos
consumidores durante a escolha do produto na prateleira. Quanto ao feijão-comum,
para o qual existe uma maior definição de preferência no mercado, as variedades mais
procuradas pelo produtor e atacadista, são as que apresentam sementes de formato
elíptico e perfil cheio. O consumidor de feijão-comum tem preferência por semente de
tamanho pequeno, massa de 100 sementes entre 20 e 30 gramas, pois cultivares com
valores acima de 30 gramas apresentam problemas de comercialização (CHIORATO,
2005).
Análise multivariada
As medidas de dissimilaridade entre os pares de sub-amostras, expressas pela
distância generalizada de Mahalanobis (D
2
), indicaram que o valor mínimo ocorreu
entre as sub-amostras UFPI-222 e UFPI-278 (D
2
= 21,50), as menos divergentes e que
as sub-amostras UFPI-282 e UFPI-491 (D
2
= 294,53), foram as mais divergentes
(Tabela 4). O emprego das análises multivariadas, a partir das medidas de
dissimilaridade, aumenta a probabilidade de se recuperar genótipos superiores nas
gerações segregantes (CARVALHO et al., 2003), sobretudo quando se realiza o
cruzamento entre indivíduos de grupos mais afastados, gerados por estas análises
(KARASAWA et al., 2005). De acordo com COIMBRA & CARVALHO (1998), o mais
apropriado é recomendar cruzamentos entre genótipos divergentes, mas que também
apresentem desempenho superior com relação aos principais caracteres de importância
econômica, logo, devem-se considerar também os comportamentos per se na escolha
dos genótipos (ABREU et al., 2004).
Na análise do agrupamento das sub-amostras pelo método de Tocher, observou-
se a formação de dez grupos (Tabela 5). O grupo 1, com seis sub-amostras, reuniu
duas, que se destacaram quanto ao teor de cinzas (UFPI-222 e UFPI-229); quatro,
626
dentre aquelas que apresentaram melhor teor de proteína bruta (UFPI-222, UFPI-229,
UFPI-243 e UFPI-278), em geral com sementes esféricas e semi-achatadas, exceto
UFPI-278 (perfil achatado), prevalecendo o tamanho pequeno em três sub-amostras
(UFPI-222, UFPI-230 e UFPI-237). Por outro lado, esse grupo também contém cinco
sub-amostras com a segunda maior concentração de ácido cianídrico, caráter
indesejável. No grupo 2, contendo sete sub-amostras, prevaleceram aquelas com
caracteres desejáveis, como: alto teor de cinzas (UFPI-234 e UFPI-264), elevado teor
de proteína bruta (UFPI-216, UFPI-234, UFPI-251, UFPI-264, UFPI-275 e UFPI-274),
menores concentrações de ácido cianídrico (UFPI-228, UFPI-251, UFPI-264, UFPI-274
e UFPI-275) e forma elíptica (UFPI-251 e UFPI-275). O grupo 3, quatro sub-amostras,
destacaram-se pelo alto teor de proteína (UFPI-189 e UFPI-468), alto teor de extrato
não nitrogenado (UFPI-177) e forma elíptica (UFPI-272 e UFPI-468). O grupo 4, duas
sub-amostras, destacou-se pelos altos teores de proteína bruta (UFPI-121 e UFPI-280),
fibra em detergente neutro e hemicelulose (UFPI-121).
Em relação ao grupo 5, com duas sub-amostras, verificou-se altos teores de
proteína bruta (UFPI-134) e extrato não nitrogenado (UFPI-173), baixo conteúdo de
ácido cianídrico e sementes de forma elíptica, em ambas; e no grupo 6, com duas sub-
amostras também, observou-se altos teores de extrato etéreo (UFPI-491) e proteína
bruta (UFPI-276 e UFPI-491), baixa concentração de ácido cianídrico (UFPI-491) e
elevada média de massa de 100 sementes (UFPI-276 e UFPI-491). As sub-amostras
UFPI-32 (grupo 7) e UFPI-271 (grupo 8) apresentaram médias altas para teor de fibra
em detergente neutro e hemicelulose, respectivamente, e sementes achatadas de
tamanho normal. Já a sub-amostra UFPI-220, grupo 9, apresentou elevado teor de
proteína. No grupo 10, encontra-se a sub-amostra UFPI-282, caracterizada pelos altos
teores de proteína bruta e hemicelulose. Os genótipos desses dois últimos grupos
apresentaram baixa concentração de ácido cianídrico.
Considerando o desempenho das sub-amostras (Tabelas 2 e 3), as medidas de
dissimilaridade (Tabela 4) e os grupos de sub-amostras estabelecidos pelo método de
Tocher (Tabela 5), verifica-se que os cruzamentos UFPI-491 com UFPI-282, UFPI-121,
UFPI-220 e UFPI-229 constituem boas opções para obtenção de populações
segregantes com altos teores de proteína e fibras e baixo conteúdo de ácido cianídrico.
636
RIBEIRO et al. (2005), também utilizando o método de otimização de Tocher,
encontraram eficiência na identificação de genitores promissores para programas de
hibridação controlada, com vistas ao desenvolvimento de germoplasma com teores de
proteína e de fibra acima da média. Segundo COIMBRA & CARVALHO (1998), a
distância generalizada de Mahalanobis, pode ser utilizada para detecção da diversidade
genética entre genótipos superiores de feijão, em programas de melhoramento
genético. Porém, deve-se ainda considerar o controle gênico, pois a eficiência da
predição está vinculada à existência de efeitos de dominância nos genes envolvidos na
expressão dos caracteres.
Analisando o local de procedência das sub-amostras (Tabela 1), verifica-se que
UFPI-275 e UFPI-274, pertencentes ao grupo 2, são provenientes do Estado da
Paraíba, contudo, UFPI-278 e UFPI-276, com a mesma procedência, encontram-se nos
grupos 1 e 6, respectivamente. Os genótipos oriundos do Piauí: UFPI-189, UFPI-121,
UFPI-491 e UFPI-32, distribuíram-se, respectivamente, nos grupos 3, 4, 6 e 7. Já as
sub-amostras UFPI-468, UFPI-280 e UFPI-282, originárias do Maranhão, encontram-se
nos grupos 3, 4 e 10, respectivamente; enquanto UFPI-177 e UFPI-134, oriundos do
Ceará, fazem parte dos grupos 3 e 5. Esses resultados permitem concluir que não
houve relação entre diversidade genética, baseadas nos caracteres físicos e químicos
das sementes, e a procedência geográfica, conforme já constatado em outros trabalhos
realizados com abóbora (RAMOS et al., 2000), quiabo (MARTNELLO et al., 2001),
feijão-vagem (ABREU et al., 2004) e feijão-fava (GUIMARÃES et al., 2007).
O método de SINGH (1981), utilizado para estimar a contribuição relativa de
cada caráter na expressão da divergência genética, indicou que fibra insolúvel (48,62%)
e fibra solúvel (46,03%), foram os caracteres que mais contribuíram para a divergência
total (94,65%) entre as 27 sub-amostras de feijão-fava (Tabela 6). A retirada dos
caracteres com mais baixa contribuição, espessura da semente, massa de 100
sementes, teor de ácido cianídrico, largura da semente, extrato não nitrogenado e
extrato etéreo, provocou alteração na formação original dos grupos, logo, mesmo
apresentando baixa contribuição, estes caracteres foram importantes no
estabelecimento dos grupos de divergência, conforme o método de GARCIA (1998).
ABREU et al. (2004), utilizando a mesma metodologia, em sub-amostras de feijão-
646
vagem (P. vulgaris), consideraram oito caracteres sem importância para divergência
genética, devido a não alteração no formato do grupo original, porém, o peso de 100
sementes, de baixa magnitude, foi mantido, pois a sua retirada causou alteração nos
grupos. Segundo COELHO et al. (2007), em trabalhos desenvolvidos com sub-amostras
de feijão, caracteres relacionados à produtividade, como a massa de 100 sementes,
são mais discriminantes em populações mais uniformes, contudo, entre genótipos
crioulos, devido à alta heterogeneidade na produção, apresentam uma baixa
discriminação. FONSECA & SILVA (1999) também apontam a massa de 100 sementes
como um caráter importante para efeito de separação de sub-amostras de feijão.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pelo financiamento do Projeto de Pesquisa com P. Lunatus e a concessão de bolsas de
mestrado e iniciação científica.
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686
Tabela 1 Relação das 27 sub-amostras de feijão-fava avaliadas, provenientes do Banco
Ativo de Germoplasma da Universidade Federal do Piauí, segundo local de origem e
cor do tegumento da semente. Teresina, PI, 2008.
Código do BAG Local de origem Cor do tegumento
UFPI-32 Várzea Grande - PI marrom
UFPI-121 Bom Jesus - PI bege
UFPI-134 Ceasa - CE branco
UFPI-173 origem desconhecida rajado com branco e bege
UFPI-177 Ceasa - CE bege
UFPI-189 Inhuma - PI branco
UFPI-216 Itapiraquan - GO roxo
UFPI-220 Ipamari - GO marrom
UFPI-222 Ipameri - GO roxo
UFPI-228 Porto Firme - MG roxo
UFPI-229 Rio Casca - MG roxo
UFPI-230 Porto Firme - MG roxo
UFPI-234 Coimbra - MG roxo
UFPI-237 Bom Sucesso - MG marrom pintado
UFPI-243 Rio Casca - MG marrom
UFPI-251 Cácere - MT rajado com bege e preto
UFPI-264 Ipanema - MG preto
UFPI-271 Paraguai branco
UFPI-272 origem desconhecida creme
UFPI-274 Cajazeiras - PB branco
UFPI-275 Cajazeiras - PB preto rajado
UFPI-276 Cajazeiras - PB rajado com roxo e branco
UFPI-278 Cajazeiras - PB bege
UFPI-280 Maranhão branco
UFPI-282 Fazenda Santa Fé - MA roxo
UFPI-468 São Domingos - MA creme
UFPI-491 Várzea Grande - PI creme com hilo diferente
69
Tabela 2 Médias
1
dos teores (g/100g) de umidade (UMD), cinzas (CZ), extrato etéreo
(EE), proteína bruta (PB), extrato não nitrogenado (ENN), fibra em detergente neutro
(FDN), fibra em detergente ácido (FDA), hemicelulose (HEM) e ácido cianídrico (HCN,
mg/kg) em sementes das 27 sub-amostras de feijão-fava. UFPI, Teresina, PI, 2008.
Sub-amostra
UMD CZ EE PB ENN FDN FDA HEM HCN
UFPI-32
8,94e 3,22d
0,67c 17,84b 69,54a 56,43a 10,42b 46,01a 104,42b
UFPI-121
10,41b 3,05e
0,56c 21,34a 64,89c 54,43a 7,08e 47,35a 87,68b
UFPI-134
10,54b 3,39b
0,55c 22,28a 63,38c 33,42c 5,65f 27,77c 47,22c
UFPI-173
9,48d 3,16d
0,60c 16,85b 70,07a 29,83c 6,50e 23,33d 50,54c
UFPI-177 10,39b 2,62g 0,93a 18,55b 68,05b 35,86c 7,37e 28,50c 87,52b
UFPI-189
9,76c 3,03e
0,47d 20,25a 66,33b 45,32b 9,50c 35,82b 92,33b
UFPI-216
8,57f 3,10e
0,54c 20,90a 66,89b 30,27c 8,36d 21,92d 97,08b
UFPI-220
9,81c 3,09e
0,33d 20,67a 65,96b 39,35b 11,88a 27,47c 53,26c
UFPI-222
10,06c 3,57a
0,24e 20,66a 65,19c 45,85b 8,81d 37,04b 82,83b
UFPI-228
9,37d 3,12e
0,63c 19,52b 67,32b 33,13c 10,31b 22,83d 75,38c
UFPI-229
10,79b 3,63a
0,41d 22,98a 62,24c 38,18c 8,59d 29,59c 83,76b
UFPI-230
10,37b 3,16d
0,76b 18,63b 67,18b 40,89b 8,42d 32,46b 117,38b
UFPI-234
8,52f 3,54a
0,59c 21,32a 66,12b 40,57b 10,53b 30,04c 96,64b
UFPI-237
9,80c 3,44b
0,71c 19,68b 66,58b 24,26c 8,44d 15,82d 62,59c
UFPI-243
11,25a 3,15d
0,37d 21,57a 63,58c 41,75b 8,33d 33,43b 84,30b
UFPI-251
9,03e 3,46b
0,34d 20,56a 66,32b 42,10b 8,59d 33,51b 64,60c
UFPI-264
9,42d 3,70a
0,21e 22,27a 64,34c 43,57b 8,36d 35,21b 44,49c
UFPI-271
10,61b 3,40b
0,38d 21,63a 64,00c 52,62a 6,85e 45,77a 160,63a
UFPI-272
9,79c 2,68g
0,47d 19,20b 67,83b 46,52b 9,51c 37,02b 88,96b
UFPI-274
10,16c 3,25d
0,45d 21,26a 64,77c 40,54b 8,54d 32,00b 58,00c
UFPI-275
8,26f 3,48b
0,62c 21,84a 65,68c 29,98c 8,45d 21,53d 66,02c
UFPI-276
9,09e 3,29c
0,32d 22,65a 64,52c 46,88b 6,64e 40,24b 116,68b
UFPI-278
9,86c 3,49b
0,43d 21,86a 64,11c 27,95c 9,42c 18,53d 98,22b
UFPI-280
9,34d 3,06e
0,46d 20,82a 66,49b 26,60c 5,82f 20,79d 100,94b
UFPI-282
9,66c 2,85f
0,41d 21,14a 65,59c 62,42a 9,31c 53,11a 66,58c
UFPI-468
9,04e 3,14d
0,16e 23,41a 63,94c 31,08c 9,91b 21,17d 102,01b
UFPI-491
9,13e 3,34c
0,88a 20,77a 66,46b 35,55c 8,39d 27,15c 71,88c
Média Geral 9,68 3,21 0,50 20,76 65,85 39,82 8,52 31,31 83,77
CV % 2,83 8,13 20,26 6,50 2,17 16,67 8,27 21,49 19,90
1
Médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, pertencem a uma mesma classe,
de acordo com o teste de Scott-Knott (P<0,05).
70
Tabela 3 Médias
1
dos caracteres físicos (mm) comprimento (C), largura (L) e
espessura (E) das sementes e massa de 100 sementes (M100S) em g; e classificação
das sementes quanto à forma, perfil e tamanho, em sementes das 27 sub-amostras de
feijão-fava. UFPI, Teresina, PI, 2008.
Sub-amostra C L E M100S Forma
Perfil Tamanho
UFPI-32 15,80b 10,30b 5,97c 54,00b ELP AC N
UFPI-121 10,90e 8,88d 6,29b 38,49d ESF SAC M
UFPI-134 14,00c 9,72c 5,45d 47,84c ELP AC N
UFPI-173 15,40b 9,88c 6,06c 56,81b ELP AC N
UFPI-177 13,70c 9,87c 5,94c 45,82c ESF AC N
UFPI-189 14,10c 10,50b 6,39b 60,25b ESF AC G
FPI-216 12,00d 8,58d 5,45d 34,29d ESF AC M
UFPI-220 9,66e 7,48e 5,94c 28,01d ESF SAC P
UFPI-222 9,94e 7,68e 5,95c 29,41d ESF SAC P
UFPI-228 11,10e 8,02e 5,42d 30,94d ESF SAC M
UFPI-229 10,50e 8,16e 5,95c 33,11d ESF SAC M
UFPI-230 10,50e 7,42e 5,58d 27,60d ESF SAC P
UFPI-234 11,31e 8,21e 5,84d 34,47d ESF SAC M
UFPI-237 10,60e 7,77e 5,61d 28,51d ESF SAC P
UFPI-243 10,50e 7,94e 5,99c 30,69d ESF SAC M
UFPI-251 12,50d 8,62d 5,33d 35,48d ELP AC M
UFPI-264 12,40d 8,71d 5,37d 34,71d ESF AC M
UFPI-271 13,40c 9,51c 5,91c 48,92c ESF AC N
UFPI-272 15,50b 10,00b 6,21c 57,99b ELP AC N
UFPI-274 15,70b 10,30b 6,12c 61,14b ESF AC G
UFPI-275 14,90b 10,20b 6,10c 63,52b ELP AC G
UFPI-276 18,50a 11,80a 6,91a 87,79a ELP AC G
UFPI-278 12,20d 9,25c 6,31b 47,40c ESF AC N
UFPI-280 14,00c 10,10b 6,47b 56,46b ESF AC N
UFPI-282 14,50c 10,30b 6,53b 55,57b ESF AC N
UFPI-468 14,70b 10,10b 6,47b 47,71c ELP AC N
UFPI-491 18,10a 10,60b 6,31b 85,17a ORC AC G
Médias 13,23 9,27 5,99 46,74
CV% 7,68 5,96 4,56 18,01
1
Médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, pertencem a uma mesma classe,
de acordo com o teste de Scott-Knott (P<0,05). Forma (ESF: esférica, ELP: elíptica,
ORC: oblonga/reniforme curta); Perfil (AC: achatada, SAC: semi-achatada); Tamanho
(P: pequeno, M: médio, N: normal e G: grande)
71
Tabela 4 Medidas de dissimilaridade entre 27 sub-amostras do feijão-fava com base na distância generalizada de Mahalanobis.
Teresina, PI, 2008.
Continuação...
Sub-amostra 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
UFPI-32=1 171,63 156,46 99,01 138,65 82,32 66,63 163,96 165,12 89,61 226,20 129,61 95,13 160,34
UFPI-121=2 99,72 121,04 63,92 59,89 112,44 103,10 87,78 125,27 76,48 77,73 160,50 104,07
UFPI-134=3 56,32 119,75
114,83 90,14 178,28 106,09 119,84 90,11 97,66 149,21 72,60
UFPI-173=4 121,16
119,71 50,97 164,50 133,74 106,30 141,06 109,69 119,02 73,43
UFPI-177=5 46,11 105,80 150,97
183,24 112,97 205,40 98,48 224,80 171,20
UFPI-189=6 68,00 80,65
93,78 53,24 139,77 66,24 105,97 110,06
UFPI-216=7 99,02
100,04 39,43 144,29 73,50 49,20 63,27
UFPI-220=8 54,30 38,23 100,50 58,75
75,33 65,50
UFPI-222=9 60,50 34,22 38,24
51,01 24,74
UFPI-228=10 134,18 35,52
49,68 54,39
UFPI-229=11 82,55
108,48 42,02
UFPI-230=12 86,93 49,81
UFPI-234=13 48,86
UFPI-237=14
UFPI-243=15
UFPI-251=16
UFPI-264=17
UFPI-271=18
UFPI-272=19
UFPI-274=20
UFPI-275=21
UFPI-276=22
UFPI-278=23
UFPI-280=24
UFPI-282=25
UFPI-468=26
UFPI-469 =27
72
Tabela 4 Medidas de dissimilaridade entre 27 sub-amostras do feijão-fava com base na distância generalizada de Mahalanobis.
Teresina, PI, 2008. (Continuação)
Sub-amostra 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
UFPI-32=1 207,66 63,96 107,62 129,88 67,92 66,04 114,14 92,58 162,11 147,93 106,29 63,73 137,64
UFPI-121=2 33,54 153,45 144,15 62,73 108,90 86,71 217,28 137,23 95,87 55,51 134,24 96,70 241,81
UFPI-134=3 95,98 74,88 56,92 71,05 147,06 39,52 125,17 98,13 108,04 76,92 198,60 125,22 126,67
UFPI-173=4 138,79 67,81 69,05 117,86 100,35 52,79 108,54 71,87 136,54 59,51 203,96 102,,00 69,66
UFPI-177=5 101,75 165,72 213,82 109,82 44,43 79,54 220,18 145,97 161,83 75,10 79,64 96,54 248,85
UFPI-189=6 92,12 93,47 137,90 84,14 58,74 45,26 112,29 106,56 65,57 70,27 45,17 41,01 202,21
UFPI-216=7 136,63 33,54 69,96 111,37 77,91 53,33 53,79 80,54 87,89 59,18 133,17 43,33 102,49
UFPI-220=8 70,20 106,69 133,28 178,94 125,19 95,82 151,89 227,35 65,13 157,29 129,36 84,68 230,86
UFPI-222=9 56,72 69,12 68,62 97,90 187,40 78,56 112,99 178,44 21,50 124,94 170,96 97,80 211,06
UFPI-228=10 104,56 35,74 92,21 141,22 86,35 50,02 69,62 160,60 60,20 124,53 87,97 57,52 168,89
UFPI-229=11 40,43 129,83 79,65 82,44 226,18 102,06 189,29 182,26 50,39 120,12 264,87 135,51 210,40
UFPI-230=12 43,10 71,64 112,05 73,82 99,09 56,56 131,40 156,84 54,21 108,79 116,88 87,35 188,83
UFPI-234=13 155,21 36,74 54,78 144,86 170,20 88,58 47,20 137,55 51,40 134,31 182,46 63,91 140,71
UFPI-237=14 71,93 52,41 46,97 115,62 174,04 68,39 88,46 158,64 33,98 93,42 212,69 96,07 149,51
UFPI-243=15 147,65 136,49 76,15 131,07 80,18 228,65 186,68 76,18 107,12 165,78 116,82 237,26
UFPI-251=16 28,16 123,11 123,99 40,25 37,86 111,55 81,46 123,53 137,09 72,26 112,62
UFPI-264=17 115,54 180,30 57,35 80,58 115,69 90,97 124,98 220,37 101,22 108,27
UFPI-271=18 130,18 69,85 179,47 78,83 94,92 75,03 177,54 104,33 173,38
UFPI-272=19 57,73 179,37 103,31 178,77 110,80 66,12 68,02 150,32
UFPI-274=20 80,30 66,28 73,22 77,13 87,47 47,52 96,35
UFPI-275=21 108,01 83,57 126,99 174,62 86,75 115,79
UFPI-276=22 150,43 60,68 182,16 81,57 62,18
UFPI-278=23 93,42 163,09 69,00 201,36
UFPI-280=24 174,81 70,87 145,83
UFPI-282=25 83,26 294,53
UFPI-468=26 153,56
UFPI-469=27
73
Tabela 5 Grupos de sub-amostras de feijão-fava estabelecidos pelo método de
Tocher, com base na dissimilaridade expressa pela distância generalizada de
Mahalanobis. Teresina, PI, 2008.
Grupo Sub-amostra
1 UFPI-222, UFPI-278, UFPI-237, UFPI-229, UFPI-230, UFPI-243
2 UFPI-251, UFPI-264, UFPI-234, UFPI-216, UFPI-228, UFPI-275, UFPI-274
3
UFPI-189, UFPI-468, UFPI-272, UFPI-177
4 UFPI-121, UFPI-280
5 UFPI-173, UFPI-134
6 UFPI-276, UFPI-491
7 UFPI-32
8 UFPI-271
9 UFPI-220
10 UFPI-282
74
Tabela 6 Contribuição relativa dos caracteres físicos e químicos para a divergência
genética entre as 27 sub-amostras de feijão-fava, pelo método proposto por SINGH
(1981). Teresina, PI, 2008.
Caráter Valor (%) Valor acumulado (%)
Fibra insolúvel 48,62 48,62
Fibra solúvel 46,03
94,65
Fibra alimentar total 2,96 97,61
Comprimento da semente 0,48 98,09
Cinzas 0,45 98,54
Umidade 0,41 98,95
Proteína bruta 0,23 99,18
Extrato etéreo 0,19 99,37
Extrato não nitrogenado 0,17 99,54
Largura da semente 0,14 99,68
Ácido cianídrico 0,12 99,80
Massa de 100 sementes 0,12 99,92
Espessura da semente 0,08 100,00
5. CAPÍTULO II
Diversidade genética entre isolados nativos de rizóbios noduladores do feijão-
fava (Phaseolus lunatus L.)
Genetic diversity among isolates native of rhizobia nodulated of Lima bean
(Phaseolus lunatus L.)
Jardel Oliveira Santos
1
Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
2*
Regina Lucia Ferreira
Gomes
3
Ângela Célis de Almeida Lopes
4
Márcia do Vale Barreto Figueiredo
5
RESUMO
Objetivou-se caracterizar a diversidade genética entre rizóbios nativos
noduladores do feijão-fava em solos do Estado do Piauí. Os genótipos do feijão-
fava, UFPI-468 (Boca de Moça) e UFPI-491 (Fava Miúda), foram usados como
planta isca de rizóbio, em amostras de solos coletadas nos distritos de Nova
Esperança (07º77’10”S e 93º51’58”W) e Santa Rita (07º71’49”S e 93º60’08”W), do
município de Água Branca, PI, que funcionaram como fonte de inóculo. No
isolamento, utilizou-se nódulos coletados aos 45 dias após a emergência das
plântulas, período que apresentou os maiores valores para o número e a biomassa
1
Mestrado em Agronomia, Centro de Ciências Agrárias (CCA), Universidade Federal do Piauí (UFPI).
Campus Ministro Petrônio Portela, Bairro Ininga, 64.049-550, Teresina, PI, Brasil.
2
*
Departamento de Departamento de Engenharia Agrícola e Solos. CCA, UFPI, Teresina, PI, Brasil. E-mail:
asfaruaj@yahoo.com.br
. Autor para correspondência.
3
Departamento de Fitotecnia, CCA, UFPI, Teresina, PI, Brasil.
4
Departamento de Biologia, Centro de Ciências da Natureza (CCN), UFPI, Teresina, PI, Brasil.
5
Laboratório de Biologia do Solo, Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária, Av. San Martin, Recife,
PE.
76
dos nódulos. Foram identificados 79 isolados que a partir da caracterização
morfológica e fisiológica reuniram-se em sete grupos de divergência pelo método de
Tocher e em cinco grupos pelo método UPGMA, com concordância na alocação dos
isolados entre os métodos. Entre os grupos, identificou-se isolados dos gêneros
Bradyrhizobium, Mesorhizobium e Rhizobium.
Palavras-chave: divergência fenotípica, fixação biológica de N
2
, nodulação.
ABSTRACT
The genetic diversity among native rhizobia nodulated of Lima bean in soil
the State of Piaui was characterized and evaluated. The genotypes lima bean, UFPI-
468 (Boca de Moça) and UFPI-491 (Fava Miúda), were used as bait to rhizobium
plant, with samples of soil collected in the districts of Nova Esperança (07º77’10”S e
93º51’58”W) and Santa Rita (07º71’49”S e 93º60’08”W), in Água Branca county,
State of Piauí who worked as a source of inoculum. For isolation, the nodules were
collected at 45 days after the emergence of seedlings, a period that showed higher
figures for the number of nodules and biomass. In total 79 isolates were obtained that
characterization of morphological and physiological gathered in groups of divergence
by the methods of Tocher (seven groups) and UPGMA (five groups) agreement with
the allocation of strains. It could be observed that the among groups, there were
strains of the genera Bradryhizobium, Mesorhizobium and Rhizobium.
Key words: phenotypic divergence, biological N
2
fixation, nodulation
INTRODUÇÃO
Dentre os sistemas biológicos envolvendo plantas e microrganismos, a
simbiose rizóbio-leguminosa é a de maior expressão econômica (Franco et al.,
2002), trazendo benefícios para a sustentabilidade agrícola, devido ao processo de
fixação biológica do N
2
(FBN) (Xavier et al., 2006). Durante o processo, as bactérias
comumente conhecidas por rizóbios quebram a tripla ligação do N
2
atmosférico,
77
através do complexo enzimático conhecido por nitrogenase (Hungria & Araújo,
1994), liberando NH
3
para assimilação pela planta. Em troca, a planta fornece
fotossintatos para a bactéria, mantendo-se um equilíbrio biológico. Embora a FBN
apresente gastos energéticos para a planta, em comparação com o uso de adubos
nitrogenados, o processo apresenta vantagens tanto para a planta e o ambiente
quanto para o produtor.
Dentre as leguminosas cultivadas no mundo, as espécies do gênero
Phaseolus (P. vulgaris, P. lunatus, P. coccineus, P. accutifolius, P. polianthus) têm
grande importância e apresentam a capacidade de realizar a FBN. No Brasil, os
estudos sobre FBN nesse gênero têm enfocado principalmente o P. vulgaris,
havendo estirpes de rizóbio recomendadas para uso comercial. Para o P. lunatus
não há isolados ou estirpes selecionadas para a inoculação, devido, principalmente,
a inexistência de trabalhos com isolamento, caracterização e seleção das bactérias
nativas capazes de nodular esta espécie.
Os trabalhos sobre isolamento, caracterização e seleção de rizóbios buscam
entender suas relações ecológicas e evolutivas, visando encontrar isolados que
apresentem eficiência simbiótica e tolerância aos fatores bióticos e abióticos
(Straliotto & Rumjanek, 1999). Esses estudos têm revelado alto grau de diversidade
nas populações destas bactérias nos solos, devido às diferentes características
morfológica, fisiológica, genética, bioquímica e filogenética (Silva et al., 2007).
Atualmente, as ferramentas da biologia molecular vêm sendo utilizadas para
estudos da diversidade das bactérias nativas do solo. Entretanto, os métodos
clássicos para caracterização dos rizóbios, através das variáveis morfológicas,
fisiológicas e bioquímicas, são bastante úteis e necessários para estudos iniciais e
complementares da diversidade destes microrganismos. Além disso, o uso de
técnicas biométricas e processos preditivos, como as análises multivariadas,
auxiliam no entendimento da diversidade, por considerarem simultaneamente essas
diferenças morfológicas, fisiológicas, agronômicas e bioquímicas (Cruz et al., 2004).
Vários estudos já foram realizados visando à avaliação da diversidade
genética de rizóbios noduladores de leguminosas herbáceas (Aguilar et al., 2001;
Fernandes et al., 2003; Freitas et al., 2007) e arbóreas (Lammel et al., 2007; Vargas
et al., 2007). Entretanto, no Brasil, existe carência de estudos sobre a diversidade de
isolados de rizóbios noduladores do feijão-fava. Neste sentido objetivou-se
78
caracterizar a diversidade genética entre rizóbios nativos noduladores do feijão-fava
em solos do Estado do Piauí.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em casa de vegetação do Departamento de
Fitotecnia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí (UFPI),
Campus da Socopo, em Teresina, PI, no período de 24 de março a 06 de junho de
2007.
As sub-amostras de feijão-fava utilizadas foram UFPI-491 (Boca de Moça) e
UFPI-468 (Fava Miúda), oriundas do Banco Ativo de Germoplasma de Feijão-Fava
(BAG de Feijão-Fava) da UFPI. Esses genótipos foram selecionados por serem
bastante cultivados nos Estados do Piauí e Maranhão, e segundo os dados de
procedência, UFPI-491, originário do município de Várzea Grande, PI, apresenta
sementes com tegumento creme e médias de comprimento e largura de 17,53 e
18,18 mm, respectivamente, enquanto UFPI-468 é originário do município de São
Domingos, MA, com sementes de tegumento creme e médias de comprimento e
largura de 11,77 e 9,26 mm, respectivamente.
Os genótipos foram cultivados em sacos plásticos, contendo 5 kg de solo,
Latossolo Argissolo, coletado na profundidade de 0,0 a 0,2 m, em áreas que
apresentavam histórico de mais de um ano de cultivo do feijão-fava. As áreas
selecionadas localizam-se nos distritos de Nova Esperança (07º77’10”S e
93º51’58”W) e Santa Rita (07º71’49”S e 93º60’08”W), no município de Água Branca,
PI, cujas análises químicas e físicas foram realizadas no Laboratório de Solos da
Embrapa Meio-Norte (Tabelas 1 e 2). Utilizou-se o delineamento inteiramente ao
acaso, no arranjo fatorial 2 (tipo de solo) x 2 (genótipo) x 3 (período de avaliação),
com quatro repetições.
Na semeadura, foram colocadas quatro sementes por saco e, após 15 dias da
emergência, foi realizado o desbaste, deixando-se uma planta por saco. A adubação
mineral isenta de N, foi aplicada no plantio, conforme as recomendações técnicas
para a cultura (Vieira, 1992). Os sacos foram irrigados diariamente, para manter a
umidade do solo próxima à capacidade de campo (método gravimétrico).
79
A capacidade de nodulação foi avaliada aos 30, 45 e 60 dias após a
emergência das plântulas, a partir do número, biomassa e tamanho dos nódulos e
massa seca da parte aérea. Tais avaliações foram realizadas em cada planta,
individualmente, após separar a parte aérea do sistema radicular, na altura no colo.
A determinação da massa seca da parte aérea ocorreu em estufa a 60°C. Para
determinação do número e biomassa dos nódulos, procedeu-se a lavagem do
sistema radicular. O tamanho dos nódulos foi calculado a partir da relação entre a
massa úmida e o número dos nódulos. Os dez nódulos maiores e viáveis foram
reservados para dessecar em tubos de ensaio, com sílica gel e uma fina camada de
algodão e vedados com tampa de rosca.
O isolamento e a caracterização morfológica, fisiológica e bioquímica dos
isolados foram realizados no Laboratório de Biologia do Solo da Empresa
Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), segundo a metodologia proposta
por Hungria (1994). Os nódulos utilizados nessas etapas foram coletados aos 45
dias após a emergência das plântulas, período em que se observaram os maiores
valores para o número e biomassa dos nódulos.
O isolamento foi efetuado em placas de Petri contendo meio de cultura LMA,
pH 6,8, acrescido de indicador vermelho congo e incubados a 28ºC, por período
necessário para se evidenciar o crescimento das colônias (Vincent, 1970). As
características morfológicas observadas foram: forma da colônia (FC: R - redonda, E
- elipsóide), elevação (EL: C - convexa, A - achatada) e cor (CC: BL - branca/leitosa,
T - transparente).
As características fisiológicas foram avaliadas em isolados crescidos em meio
de azul de bromotimol observando-se: tempo de crescimento (TC: R - rápido, 1 a 3
dias, I - intermediário, 4 a 5 dias); formação de ácidos e álcalis (FAA: AC - ácida, AL
- alcalina), formação de muco (FM: A - ausente, P - presente); volume do muco (VM:
UM - muito, M - médio, P - pouco e S - seco) (Melloni, 2006); elasticidade do muco
(EM: P - presença de fio, A - ausência de fio) e produção de bolhas (PB: P -
presente, A - ausente). Em todos os isolados foram efetuados teste de Gram e estes
apresentaram coloração rósea (Gram -: negativo).
As comparações de médias foram realizadas pelo teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
80
Na análise da divergência genética entre os isolados, a moda dos dados
referentes às características morfológicas e fisiológicas, sem repetição, foi utilizada
para obtenção da matriz de dissimilaridade, que posteriormente foi submetida às
técnicas de análises multivariadas: método de Tocher e método hierárquico UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). O corte no dendrograma
gerado pelo método UPGMA foi efetuado no ponto em que se observou a mudança
brusca de nível, conforme a recomendação de Cruz et al. (2004). Essas análises e a
construção do dendrograma foram realizadas com auxílio do programa GENES
(Cruz, 2001).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nodulação
O efeito do período de avaliação (30, 45 e 60 dias) dos nódulos foi
significativo (P<0,01) para todos os caracteres (Tabelas 3 e 4). A biomassa e o
número dos nódulos avaliados aos 45 dias foram mais que o dobro dos avaliados
aos 30 dias, porém não se observou diferença significativa entre 45 e 60 dias. Xavier
et al. (2006) observaram diferenças significativas entre amostras de Latossolo
Amarelo, oriundas da região Nordeste do Brasil, para o número e a biomassa de
nódulos, usando como planta-isca o feijão-caupi. Informações relacionadas ao
número e massa de nódulos são critérios freqüentemente utilizados pela RELARE
(Rede de laboratórios para recomendação, padronização e difusão de tecnologia de
inoculantes microbiológicos de interesse agrícola) para avaliação da eficiência na
simbiose entre rizóbios e leguminosas.
Quanto ao tamanho dos nódulos, os menores e os maiores foram
observados, respectivamente, nas avaliações aos 30 e 60 dias, sendo que aos 45
dias, os nódulos não diferiram dos demais. Com relação à massa seca da parte
aérea, verificou-se que a quantidade obtida foi diretamente proporcional ao tempo
para avaliação, portanto, aos 60 dias de emergência, que corresponde ao início do
florescimento dos genótipos de feijão-fava usados como planta-isca, estimou-se a
maior média. A matéria seca também pode ser utilizada como critério de avaliação
da eficiência de uma estirpe. Zilli et al. (2006) indicaram estirpes com potencial como
81
inoculantes a partir da produção de matéria seca da parte aérea e do acúmulo de N.
Os resultados da produção de matéria seca da parte aérea dos genótipos UFPI-491
e UFPI-468 revelaram que a população nativa de rizóbios presente nas amostras de
solo nos distritos de Nova Esperança e Santa Rita tem potencial para o isolamento
de estirpes eficientes e, sobretudo competitivas.
A interação entre solos e genótipos foi significativa para o número de nódulos.
O genótipo UFPI-491 destacou-se tanto nas amostras de solo de Nova Esperança
quanto de Santa Rita, contudo a maior quantidade de nódulos do referido genótipo
foi contabilizada nas amostras de Nova Esperança. Essa maior nodulação
apresentada pelo genótipo UFPI-491, que segundo os dados de procedência
apresenta maior tamanho de semente, está de acordo com os resultados obtidos por
Dobert & Blevins (1993), que estimou correlação positiva entre o tamanho da
semente, a massa e o número de nódulos produzidos, em cinco variedades de feijão
de lima.
Isolamento
No cultivo dos genótipos de P. lunatus, em solos de Santa Rita e Nova
Esperança foram obtidos 79 isolados puros com diferentes características
fenotípicas das colônias bacterianas (Tabelas 5 e 6). As características
morfológicas, em geral, apresentaram pequena variação, para a forma das colônias,
entre os isolados. Todos os isolados apresentaram formato arredondado, exceto o
ISO-SRB02 e o ISO-SRM13 com formato elipsóide, oriundos do solo de Santa Rita.
Os isolados obtidos, tanto do solo de Santa Rita quanto de Nova Esperança,
apresentaram colônias dos tipos convexa (21 e 46 isolados, respectivamente) e
achatada (seis isolados em cada tipo de solo). Entretanto, no genótipo UFPI-491,
todos os isolados apresentaram colônias com elevação do tipo convexa. A maioria
dos isolados apresentaram colônias com cor branca e aspecto leitoso, enquanto que
apenas nove isolados apresentaram colônias transparentes. Segundo Jordan
(1984), as colorações encontradas nas colônias de rizóbios podem ser branca,
amarela ou rósea, sendo incomum encontrar rizóbios formando colônias de cor
amarela ou rosada (Hungria, 1994), embora alguns estudos encontraram isolados
com colônias de coloração amarela (Soares et al., 2006; Santos et al., 2007).
82
A observação dos resultados indica que há uma diversidade morfológica entre
rizóbios nativos noduladores de feijão-fava nos solos do Piauí. Diversidade
morfológica entre outros grupos de rizóbios também foi verificada por Silva et al.
(2007) e Martins et al. (1997a) para isolados obtidos em solo de Pernambuco e Mato
Grosso do Sul, respectivamente.
Os isolados oriundos do solo de Nova Esperança e Santa Rita apresentaram
crescimento rápido (31 e 10 isolados, respectivamente) e intermediário (21 e 17
isolados, respectivamente). Os padrões de crescimento observados indicam que os
isolados podem estar mais adaptados às condições edafoclimáticas da região, uma
vez que o crescimento rápido e intermediário favorece maior capacidade de
sobrevivência no solo, se comparada aos isolados de crescimento lento (Medeiros et
al., 2007).
Em relação à produção de ácido e álcali, observou-se, nos isolados oriundos
do solo de Nova Esperança, a prevalência de reação ácida (38 isolados). Por outro
lado, os isolados oriundos do solo de Santa Rita apresentaram reação alcalina (16
isolados) e ácida (11 isolados). A presença de isolados de crescimento intermediário
e com produção de álcali, características que distinguem o gênero Bradyrhizobium
(Vargas et al., 2007), sugere que este gênero realiza simbiose com P. lunatus.
Resultados semelhantes foram observados por Ormeno-Orrillo et al. (2006), em
isolados obtidos em nódulos de feijão-fava cultivado em solos do Peru, nos quais o
gênero Bradyrhizobium foi o simbionte predominante. As bactérias do gênero
Bradyrhizobium são capazes de formar simbiose com inúmeras espécies, tais como
Phaseolus vulgaris (Parker, 2002), Glycine max (Hungria, 1993), Vigna unguiculata
(Zilli et al., 2006), e Arachis hypogaea (Gerin et al., 1996).
Seguindo a classificação proposta por Melloni (2006), a maioria dos isolados
apresentou colônias com elevada produção de muco (49 isolados). Entretanto, foram
encontrados isolados com colônias de moderada (19 isolados), baixa (10 isolados) e
sem (1) produção de muco. A produção de muco (exopolissacarídeo), encontrada na
maioria dos isolados, é uma característica importante relacionada com o processo
inicial de infecção nas raízes (Freitas et al., 2007). Desta forma, isolados que
apresentam essa característica tem maior vantagem competitiva na infecção,
colonização e formação de nódulos.
83
O método de agrupamento de Tocher possibilitou formar sete grupos distintos,
baseados nas características morfológicas e fisiológicas das colônias (Tabela 7). A
maioria dos isolados (62 isolados) foram reunidos no grupo 1, predominantemente
oriundos do solo de Nova Esperança. Entretanto, para se obter mais informações a
respeito da seletividade dos isolados, conforme o solo e o genótipo, realizou-se um
novo agrupamento com os isolados presentes no grupo 1. Desta forma, foram
formados quinze subgrupos de divergência a partir do reagrupamento, encontrando-
se subgrupos compostos por isolados seletivos para os solos (subgrupos 01 e 02),
genótipos (subgrupos 04 e 06) e ambos (subgrupos 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14 e 15).
Assim, embora que os solos não apresentem grandes diferenças quanto à
composição química e localização geográfica, as características fenotípicas
observadas pelos isolados aludem que estes passaram por diferente pressão
ambiental seletiva, pelo fato de que apenas seis subgrupos (02, 03, 04, 05, 06 e 07)
apresentaram isolados dos solos de Nova Esperança e Santa Rita.
O grupo 2 foi formado por isolados oriundos dos solos de Nova Esperança e
Santa Rita, noduladores do genótipo UFPI-491. Os isolados desse grupo
caracterizam-se por apresentar colônias de formato arredondado, cor transparente,
ou branca, aspecto leitoso, elevação convexa, com crescimento rápido ou
intermediário, reação ácida no meio, baixo volume de muco com formação de fio e
bolhas. Já o grupo 3 foi formado predominante por isolados noduladores do genótipo
UFPI-468, que apresentaram colônias de formato arredondado, elevação convexa,
cor transparente, crescimento rápido, com reação alcalina, médio volume de muco
com ausência de fio e formação de bolhas.
A divergência observada entre os isolados dos grupos 2 e 3 indicam
seletividade dos isolados em relação aos genótipos utilizados. Segundo Hartwig
(1998), além das condições edafoclimáticas, as características genotípicas do
macrossimbionte influenciam na especificidade simbiótica. Alguns trabalhos, no
Brasil, têm mostrado variabilidade quanto à nodulação, por estirpes de rizóbios, em
genótipos de soja (Bohrer & Hungria, 1998), feijão-comum (Franco et al., 2002) e
feijão-caupi (Xavier et al., 2006).
No grupo 4 foram reunidos os isolados que apresentaram colônias de formato
arredondado, com elevação convexa ou achatada, cor branca, aspecto leitoso,
crescimento intermediário, reação ácida e média produção de muco. Os isolados
84
ISO-SRM20, ISO-NEB20 e ISO-NEB01 destacaram-se dos demais formando grupos
unitários. O ISO-SRM20 apresentou colônia de formato arredondado, achatada, cor
branca, aspecto leitoso, crescimento intermediário, reação alcalina e elevada
produção de muco (grupo 5); ISO-NEB20 com colônia de formato arredondado,
elevação côncava, cor transparente, crescimento rápido, reação ácida e elevada
produção de muco com presença de fios (grupo 6) e ISO-NEB01 por possuir colônia
de formato arredondado, elevação côncava, cor branca, aspecto leitoso, crescimento
intermediário, reação ácida e sem produção de muco (colônia seca) (grupo 7).
Segundo a classificação proposta por Wang et al. (2008), as características
apresentadas pelos isolados dos grupos formados identificam espécies dos gêneros
Bradyrhizobium (grupo 1 e subgrupos 03, 04, 06, 09; grupo 5), Mesorhizobium
(grupo 1 e subgrupos 01, 02, 03, 04, 06, 07, 10, 11, 12, 13, 14; grupo 2, 3, 4, e 7) e
Rhizobium (grupo 1 e subgrupos 01, 02, 05 e 14; grupo 2 e 6), indicando que o P.
lunatus apresenta simbiose com uma ampla faixa de rizóbios. Segundo Santos et al.
(2007), em geral, as leguminosas tropicais são capazes de formar nódulos com
ampla faixa de rizóbios.
A observação do dendrograma a 64,06% de similaridade, evidenciou-se a
formação de cinco grupos (Figura 1), com características semelhantes aos grupos
obtidos pelo método de Tocher, obedecendo, em geral, a mesma a relação de
similaridade entre os isolados. O UPGMA é bastante utilizado no estudo de
diversidade com características fenotípicas, por ser uma ferramenta mais restritiva
que o método de Tocher (Fernandes et al., 2003; Freitas et al., 2007; Silva et al.,
2007). Houve a formação de 42 perfis fenotípicos baseados nas características
analisadas e este número foi inferior ao total de isolados observados, sugerindo a
presença de duplicidade entre os isolados. Desta forma, há necessidade de estudos
futuros para se obter uma classificação mais detalhada desses isolados, utilizando-
se ferramentas de biologia molecular. Segundo Martins et al. (1997b), a
caracterização morfológica e fisiológica das espécies bacterianas pertencentes à
família Rhizobiaceae permitiu uma análise prévia da diversidade, possibilitando a
identificação e agrupamento que normalmente costuma estar relacionado com os
estudos a nível de DNA.
85
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pela concessão de bolsa de mestrado do primeiro autor e financiamento do projeto
de pesquisa com P. lunatus.
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Comunicado Técnico 19.
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níveis crescentes de NaCl e altas temperaturas de isolados de rizóbio de nódulos de
raiz e caule de Discolobium spp. nativas do Pantanal Mato-Grossense. Revista
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MEDEIROS, E.V. DE. et al. Tolerância de bactérias fixadoras de nitrogênio
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Revista de Biologia e Ciências da Terra, v.7, n.2, p.160-168, 2007.
MELLONI, R. et al. Eficiência e diversidade fenotípica de bactériasdiazotróficas que
nodulam caupi [Vigna unguiculata(L.) Walp] e feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em
solos de mineração de bauxita em reabilitação. Revista Brasileira de Ciência do
Solo, v.30, n.2, p.235-246, 2006.
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87
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solo da região semi-árida de Pernambuco. Pesquisa Agropecuária Tropical, v.37,
n.1, p.16-21, 2007.
SOARES, A.L.L. et al. Agronomic efficiency of selected rhizobia strains and diversity
of native nodulating populations in Perdões (MG - Brazil): I - cowpea. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, v.30, n.5, p.795-802, 2006.
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VARGAS, L. K. et al. Diversidade genética e eficiência simbiótica de rizóbios
noduladores de acácia-negra de solos do Rio Grande do Sul. Revista Brasileira de
Ciência do Solo, v. 31, p. 647-654, 2007.
VIEIRA, R.F. A cultura do feijão-fava. Informe Agropecuário, v.16, n.174, p.30-37,
1992.
VINCENT, J.M. A manual for practical study of the root-nodule bacteria. Oxford.
Scientific Puplications, 1970. 164 p.
WANG, E.T.; MARTÍNEZ-ROMERO, J.; LÓPEZ, I. Rhizobium y su destacada
simbiosis con plantas. Microbios en linea. Disponível em:
<www.biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap8/>. Acesso em: 05 jan. 2008.
XAVIER, G.R. et al. Especificidade simbiótica entre rizóbios e acessos de caupi de
diferentes nacionalidades. Caatinga, v.19, n.1, p.25-33, 2006.
ZILLI, J.E. et al. Eficiência simbiótica de estirpes de Bradyrhizobium isoladas do solo
de cerrado em caupi. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.41, n.5, p. 811-818,
2006.
88
Tabela 1 Caracterização química dos solos de Nova Esperança e Santa Rita,
município de Água Branca, PI, usados como fonte de inoculo em feijão-fava.
Teresina, PI, 2008.
pH MO P K Ca Mg H + Al Distrito
(H
2
O) (g dm
-3
) (mg dm
-3
) (cmol
c
dm
-3
)
Nova Esperança 6,45 58,63 67,40 1,40 6,73 7,26 1,75
Santa Rita 7,20 24,98 95,90 1,80 4,61 2,91 0,89
MO: matéria orgânica.
89
Tabela 2 Caracterização física dos solos de Nova Esperança e Santa Rita, município
de Água Branca, PI, usados como fonte de inoculo em feijão-fava. Teresina, PI,
2008.
Granulometria (%) Distrito
Areia fina
Areia grossa Silte Argila
Classificação textural
Nova Esperança 16,95 26,50 30,95 25,60 Franco
Santa Rita 43,45 31,30 15,65 9,60 Franco Arenoso
90
Tabela 3 Estimativas dos quadrados médios obtidos nas análises de variância dos
caracteres: biomassa (BN), número (NN) e tamanho dos nódulos (TN) e massa seca
da parte aérea (MS), avaliados em feijão -fava. Teresina, PI, 2008.
Quadrados Médios Fontes de Variação GL
BN NN TN MS
Solos (S) 1 0,00 2133,33 19.10
-6
28,34
Genótipos (G) 1 0,12 936,33 1.10
-6
2,89
Período (P) 2 22,13* 174044,33* 63.10
-6
* 182,68*
S*G 1 3,06 81840,08** 7,33E-0007 3,43
S*P 2 1,00 14259,08 1.10
-6
6,26
G*P 1 3,86 33417,58 10.10
-6
11,86
Resíduo 38 1,44 15610,63 8.10
-6
9,74
* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste F.
91
Tabela 4 Médias
1
dos caracteres: biomassa (BN), número (NN), tamanho dos
nódulos (TN) e massa seca da parte aérea (MS), avaliados em feijão-fava aos 30, 45
e 60 dias após a emergência. Teresina, PI, 2008.
Tempo (dias) Caracteres avaliados
BN NN TN MS
30 1,03b 188,87b 0,005b 11,52c
45 2,40a 371,12a 0,007ab 15,29b
60 3,37a 367,87a 0,009a 18,26a
1
Médias seguidas pela mesma letra, em cada coluna, não diferem entre si pelo
teste de de Tukey (P<0,05).
92
Tabela 5 Características morfológicas e fisiológicas dos isolados de rizóbios
noduladores de feijão-fava, oriundos do solo de Santa Rita, município de Água
Branca, PI.
Características
Isolados Morfológicas
1
Fisiológicas
2
G1 FC EL CC TC FAA FM VM EM PB
ISO-SRB01 R C BL I Ac P MU A P
ISO-SRB02 E C BL I Ac P MU A P
ISO-SRB03 R C T I Ac P MU P P
ISO-SRB04 R C T I Ac P MU P P
G2 FC EL CC TC FAA FM VM EM PB
ISO-SRM01 R C BL I Al P P A P
ISO-SRM02 R C T I Al P MU A P
ISO-SRM03 R C BL I Al P M A P
ISO-SRM04 R C T I Al P M A P
ISO-SRM05 R C BL R Ac P MU P P
ISO-SRM06 R C BL I Ac P MU A P
ISO-SRM07 R C BL I Al P MU A P
ISO-SRM08 R C BL I Al P M A P
ISO-SRM09 R C BL I Al P MU A P
ISO-SRM10 R C BL R Al P P A P
ISO-SRM11 R A BL R Ac P MU A P
ISO-SRM12 R A BL R Ac P MU A P
ISO-SRM13 E C BL I Ac P MU A P
ISO-SRM14 R A BL I Ac P M A A
ISO-SRM15 R A BL R Al P MU A P
ISO-SRM16 R C BL R Al P MU A A
ISO-SRM17 R C BL R Al P M A P
ISO-SRM18 R C BL R Al P M A P
ISO-SRM19 R C BL I Al P M A P
ISO-SRM20 R A BL I Al P MU A A
ISO-SRM21 R C BL R Al P M A P
ISO-SRM22 R A BL R Al P M A P
ISO-SRM23 R C BL I Ac P M A A
1
Morfológicas: FC - forma da colônia (R: redondas, E: elipsóide), EL - elevação da
colônia (C: convexa, A: achatada) e CC - cor (BL: Branca/leitosa, T: transparente).
2
Fisiológicas: TC - tempo de crescimento (R: rápido, I: intermediário), FAA -
formação de ácido e álcalis (Ac: ácida, Al: alcalina), FM - formação de muco (A:
ausente, P: presente), VM - volume do muco (S: seca, P: pouco, M: médio e MU:
muito), EM - elasticidade do muco (P: presença de fio, A: ausência de fio), PB -
produção de bolhas (A: ausente, P: presente).
G1 - Isolados de rizóbios noduladores dos genótipos do feijão-fava UFPI-491 (Boca
de Moça); G2- isolados de rizóbios noduladores dos genótipos do feijão-fava UFPI-
468 (Fava Miúda).
93
Tabela 6 Características morfológicas e fisiológicas dos isolados de rizóbios,
oriundos do solo de Nova Esperança, município de Água Branca, PI noduladores de
feijão-fava.
Características
Isolados Morfológicas
1
Fisiológicas
2
G1 FC EL CC TC FAA FM VM EM PB
ISO-NEB01 R C BL I Ac A S 0 P
ISO-NEB02 R C BL R Ac P MU A A
ISO-NEB03 R C T R Ac P P P A
ISO-NEB04 R C T R Ac P MU P P
ISO-NEB05 R C BL R Ac P M A P
ISO-NEB06 R C BL I Ac P MU A P
ISO-NEB07 R C BL R Ac P MU A P
ISO-NEB08 R C BL I Al P M A P
ISO-NEB09 R C BL I Ac P M P P
ISO-NEB10 R C BL R Ac P MU P P
ISO-NEB11 R C BL R Ac P M A P
ISO-NEB12 R C BL I Al P MU A P
ISO-NEB13 R C BL R Al P P P P
ISO-NEB14 R C BL R Ac P MU A P
ISO-NEB15 R C BL R Al P MU A P
ISO-NEB16 R C BL R Ac P P P P
ISO-NEB17 R C BL R Ac P MU A A
ISO-NEB18 R C BL R Ac P MU A P
ISO-NEB19 R C BL I Ac P MU A P
ISO-NEB20 R C T R Ac P MU P A
ISO-NEB21 R C T R Ac P M P P
ISO-NEB22 R C BL I Al P MU A P
ISO-NEB23 R C BL I Al P P P P
ISO-NEB24 R C T R Al P P A P
ISO-NEB25 R C BL R Ac P P A P
ISO-NEB26 R C BL R Ac P P A P
ISO-NEB27 R C BL R Ac P MU A P
G2 FC EL CC TC FAA FM VM EM PB
ISO-NEM01 R C BL I Al P MU A P
ISO-NEM02 R C BL I Ac P MU A P
ISO-NEM03 R C BL I Ac P M A P
ISO-NEM04 R C BL I Al P MU A P
ISO-NEM05 R C BL R Ac P M A P
ISO-NEM06 R A BL R Ac P MU A P
ISO-NEM07 R C BL I Al P MU A P
ISO-NEM08 R A BL R Ac P MU A P
ISO-NEM09 R C BL R Ac P MU A P
ISO-NEM10 R A BL R Ac P MU A P
Continuação...
94
Tabela 6
Características morfológicas e fisiológicas dos isolados de rizóbios,
oriundos do solo de Nova Esperança, município de Água Branca, PI noduladores de
feijão-fava (Continuação).
G2 FC EL CC TC FAA FM VM EM PB
ISO-NEM11 R C BL R Ac P MU A P
ISO-NEM12 R C BL R Ac P MU A P
ISO-NEM13 R C BL R Al P MU A P
ISO-NEM14
R C BL R Al P P A P
ISO-NEM15
R C BL R Ac P MU A P
ISO-NEM16 R A BL I Ac P MU A A
ISO-NEM17 R A BL I Ac P MU A P
ISO-NEM18 R C BL I Ac P MU A A
ISO-NEM19 R C BL R Al P M A P
ISO-NEM20 R C BL I Al P M A P
ISO-NEM21 R C BL I Ac P MU A A
ISO-NEM22 R C BL I Ac P MU A A
ISO-NEM23 R C BL R Ac P MU A P
ISO
-
NEM24
R
A
BL
I
Ac
P
MU
A
A
ISO
-
NEM25
R
C
BL
I
Ac
P
UM
A
P
1
Morfológicas forma (R: redondas, E: elipsóide), elevação (C: convexa, A: achatada)
e cor (BL: Branca/leitosa, T: transparente);
2
Fisiológicas: tempo de crescimento (R:
rápido, I: intermediário), formação de ácido e álcalis (Ac: ácida, Al: alcalina),
formação de muco (A: ausente, P: presente), volume do muco (S: seca, P: pouco,
M: médio e MU: muito), elasticidade do muco (P: presença de fio, A: ausência de
fio), produção de bolhas (A: ausente, P: presente); G1 - Isolados de rizóbios
noduladores dos genótipos do feijão-fava UFPI-491 (Boca de Moça); G2- isolados
de rizóbios noduladores dos genótipos do feijão-fava UFPI-468 (Fava Miúda).
95
Tabela 7 Grupos e subgrupos de isolados noduladores do feijão-fava, estabelecidos
pelo método de Tocher, com base na matriz de dissimilaridade das características
morfológicas e fisiológicas.
Grupo Sub-grupo Isolados N
o
1 1 ISO-NEB02, ISO-NEB17, ISO-NEM18, ISO-NEM21,
ISO-NEM22, ISO-NEB14, ISO-NEB27, ISO-NEM11,
ISO-NEM12
62
2 ISO-NEB05, ISO-NEB11, ISO-NEM05, ISO-NEB07,
ISO-NEB18, ISO-SRM06, ISO-NEM15, ISO-NEB25
3 ISO-NEB06, ISO-NEB19, ISO-NEM02, ISO-NEM09,
ISO-NEM23, ISO-NEM25, ISO-NEB12, ISO-NEB22,
ISO-SRM07, ISO-NEM01, ISO-NEM04, ISO-NEM07,
ISO-NEM13, ISO-SRB01
4 ISO-NEB08, ISO-SRM03, ISO-SRM17, ISO-SRM18,
ISO-SRM21, ISO-NEM19, ISO-NEM20, ISO-SRM01,
ISO-NEM14
5 ISO-NEB10, ISO-SRM05
6 ISO-NEB15, ISO-SRM09, ISO-SRM08, ISO-SRM19,
ISO-SRM10
7 ISO-SRM11, ISO-SRM12, ISO-NEM10, ISO-NEM17,
ISO-SRM15
8 ISO-NEM16, ISO-NEM24
9 ISO-NEM06, ISO-NEM08
10 ISO-SRB02
11 ISO-NEM03
12 ISO-SRM02
13 ISO-SRM16
14 ISO-NEB26
15 ISO-SRM13
2 ISO-NEB04, ISO-NEB21, ISO-SRB04, ISO-SRB03,
ISO-NEB09, ISO-NEB16, ISO-NEB03, ISO-NEB13,
ISO-NEB23
9
3 ISO-NEB24, ISO-SRM04, ISO-SRM22 3
4 ISO-SRM14, ISO-SRM23 2
5 ISO-SRM20 1
6 ISO-NEB20 1
7 ISO-NEB01 1
96
FIGURA 1 Dendrograma da similaridade genética entre 79 isolados, obtido por
UPGMA, com base na matriz de dissimilaridade dos dados morfológicos e
fisiológicos.
6. CONCLUSÕES GERAIS
As sub-amostras de feijão-fava do Banco Ativo de Germoplasma da UFPI
avaliadas apresentam expressiva divergência genética para os caracteres físicos e
químicos da semente.
As distâncias de Mahalanobis e o método de agrupamento de Tocher
possibilitam a discriminação de sub-amostras divergentes com relação a caracteres
físicos e químicos de semente de feijão-fava.
Os caracteres fibra insolúvel e fibra solúvel são os que mais contribuem para
a divergência total entre as sub-amostras de feijão-fava.
O tempo de avaliação da biomassa e número de nódulos é um fator
importante na nodulação do feijão-fava.
Os isolados de rizóbio noduladores de fava encontrados nos solos do Estado
do Piauí apresentam grande variabilidade morfológica e fisiológica, com a
identificação de, pelo menos, quatro grupos de diversidade, pertencentes aos
gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium e Mesorhizobium.
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