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Jaqueline Cristina de Bem
ATIVIDADES DESENVOLVID
DESENVOLVIMENTO GONADAL INICIAL E REVERSÃO
SEXUAL EM Astyanax altiparanae (TELEOSTEI,
CHARACIDAE)
Rio Claro, SP
2009
PROGRAMA DE P
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S-GRADUAÇÃO EM CI
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NCIAS BIOL
Ó
GICAS
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULIST
A
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE RIO CLARO
Jaqueline Cristina de Bem
DESENVOLVIMENTO GONADAL INICIAL E REVERSÃO
SEXUAL EM Astyanax altiparanae (TELEOSTEI,
CHARACIDAE)
Orientadora: Profª.Drª. Patricia Pasquali Parise Maltempi
Co-Orientadora: Profª. Drª. Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti
Rio Claro, SP
2009
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências
do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos para obtenção
do grau de Mestre em Ciências Biológicas na área
de Biologia Celular e Molecular.
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ii
597 Bem, Jaqueline Cristina de
P455d Desenvolvimento gonadal inicial e reversão sexual em
Astyanax altiparanae (Teleostei, Characidae) / Jaqueline
Cristina de Bem. – Rio Claro : [s.n.], 2009
96 f. : il., tabs., gráfs., fots.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista,
Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Patricia Pasquali Parise Maltempi
Co-orientador: Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti
1. Peixes. 2. Lambari. 3. Diferenciação sexual. 4.
Feminização. 5. Estrógeno I. Título.
Ficha catalográfica elaborada pela STATI – Biblioteca da UNESP
Campus de Rio Claro/SP
iii
iv
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Não apenas esse projeto, mas todas as
minhas conquistas profissionais são dedicadas aos
meus pais, Genésio e Silvianita, e minha irmã,
Juliana, que em nenhum momento deixaram de me
apoiar.
v
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A Deus, pela vida, saúde, pelas pessoas que me rodeiam e pela inspiração
espiritual que me tem permitido cumprir minha jornada.
A minha orientadora Profª. Drª. Patricia Pasquali Parise Maltempi, pela
orientação, incentivo, compreensão e, sobretudo, pela convivência amiga.
A Profª. Drª. Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti, pela co-orientação,
atenção e disponibilidade.
Aos professores da banca examinadora pela gentileza da participação e pelas
correções necessárias.
Ao CEPTA/ICMBio, na pessoa do Sr. Chefe Laerte Batista de Oliveira Alves,
por permitir a utilização das instalações e equipamentos da Instituição e ter cedido
os peixes para a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. José Augusto Senhorini mestre e amigo de ontem, hoje e
sempre, que guiou meus passos durante grande parte de minha vida acadêmica, o
meu respeito e eterno agradecimento.
Ao técnico João Caetano dos Santos Neto, pela atenção, amizade e grande
presteza durante a fase experimental.
A Msc. Maria Angélica Rosa Ribeiro e ao Prof. Dr. Paulo Sérgio Ceccarelli
pela amizade e pelas agradáveis conversas que sempre me ajudaram a esclarecer
idéias.
A todos amigos do CEPTA pela forma carinhosa e generosa a qual sempre
me receberam, em especial a Rita de Cássia Gimenez de Alcântara Rocha, Luis
Alberto Gaspar, Sandoval dos Santos Júnior e Saulo dos Reis.
Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga e a todos companheiros da UNESP
de São José do Rio Preto (IBILCE) que me auxiliaram durante a realização do
estudo de desenvolvimento gonadal.
A bióloga Talita Sarah Mazzoni que me ajudou de forma imprescindível no
estudo de desenvolvimento gonadal.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Simões Pião pelo grande auxílio nas análises
estatísticas.
A todos os queridos amigos da graduação e pós-graduação da UNESP-RC.
vi
A todos meus mestres da UNESP que souberam me incentivar e conduzir
meus passos, em especial a Profª. Drª. Ana Maria Costa-Leonardo pela paciência e
pelos ensinamentos transmitidos durante o estágio de docência.
A todos os funcionários da UNESP de Rio Claro, em especial Gerson, Mônika
e Antônio.
A Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior –
(CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
A Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) pelo auxílio
financeiro cedido para realização dos experimentos.
A todas as pessoas que não foram citadas aqui, mas não esquecidas, por
fazerem parte de minha vida acadêmica.
E, em especial, a minha família e meu namorado Lucas que foram o tempo
todo muito pacientes, compartilhando sempre de minhas preocupações.
A todos, meu muito obrigada!!!
vii
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viii
RESUMO
O lambari Astyanax altiparanae Garutti e Britski (2000) vem ganhando a atenção de
pesquisadores e produtores, devido a sua alta taxa de sobrevivência, rápido
crescimento, fácil aceitação de alimento artificial, carne saborosa e grande procura
como isca viva. As fêmeas apresentam taxas de crescimento mais elevadas do que
os machos tornando sua criação mais vantajosa. O processo de diferenciação
sexual pode ser controlado pela administração de hormônios sexuais, em peixes
sexualmente indiferenciados, alterando o curso da diferenciação no sentido do sexo
desejado. Neste trabalho, o desenvolvimento gonadal foi acompanhado nas
primeiras 180 horas pós eclosão – hpe (7,5 dias pós eclosão - dpe) das larvas, na
tentativa de se conhecer o momento da diferenciação sexual e/ou a melhor fase
para aplicação de hormônio feminizante. Foram mantidas 1.000 larvas recém-
eclodidas em tanques de incubadoras sob aeração constante e temperatura
ambiente. Dez exemplares foram diariamente fixados em solução Karnovsky
modificada, incluídos em historesina, e corados com HE. Os resultados revelaram
que as 12 hpe, o cordão gonadal já está alocado permanecendo por todo o período
estudado. Durante o período inicial de aproximadamente 206ºC dias de vida da larva
não observou-se, por meio de análise histológica, diferenciação sexual em A.
altiparanae. Nesta fase foi possível observar, a abertura da boca que se deu às 19
hpe e a transição alimentar que ocorreu entre 43 e 60 hpe. Em um segundo estudo,
a produção de lotes monossexos femininos do lambari foi avaliada, pelo método
direto, utilizando o estrógeno, valerato de estradiol, na tentativa de provocar a
feminização dos machos. Para isto, foram utilizadas 1.000 larvas de lambari que
foram distribuídas em quatro tanques de incubadoras com temperatura média de
21.8 ± 2ºC. Inicialmente, as larvas foram alimentadas por náuplios de Artemia salina
e, 72 hpe, essa alimentação foi substituída por uma dieta contendo 35% de proteína
bruta acrescida de diferentes quantidades de hormônio feminizante, reunidos em
quatro tratamentos: T1=tratamento controle, sem adição de hormônio na ração;
T2=20 mg de valerato de estradiol por quilo de ração; T3=40 mg/kg; T4=80 mg/kg.
Após o período de tratamento hormonal de 30 dias, os animais foram mantidos nos
tanques, sem administração de hormônio, aguardando seu crescimento e facilitando
a observação das gônadas para verificação da eficiência dos tratamentos. Após 161
dias do início do experimento (cerca de 3.864 hpe), foi realizada a biometria de 50
peixes por tratamento, num total de quatro tratamentos, e analisadas as gônadas.
Foram obtidas 44% de fêmeas no tratamento controle, enquanto que o tratamento
utilizando 20 mg apresentou 70%, e os tratamentos com 40 e 80 mg de hormônio
apresentaram um percentual de 76% de fêmeas, resultado este, que se comparado
a outros estudos, apresentou-se eficaz, devido ao grande percentual de fêmeas
obtidas.
Palavras-chave: lambari, desenvolvimento gonadal, feminização, reversão sexual,
estrógeno.
ix
ABSTRACT
The lambari Astyanax altiparanae Garutti and Britski (2000) has been getting
attention of researchers and producers, due to its high rate of survival, fast growth,
easy acceptance of food artificial, tasty meat and high demand as live bait. Females
have higher growth rates than males making its creation more advantageous. The
process of sexual differentiation can be controlled by administration of sex hormones
in fish sexually undifferentiated, altering the course of differentiation towards the
desired sex. In this study, the gonadal development was observed in the first 180
hours post-hatching – hph (7,5 days post-hatching - dph) of the larvae, in attempt to
know the time of sexual differentiation and/or the best stage for the application of
female hormone. 1.000 larvae, which were newly-hatched in tanks of incubators
under constant aeration and ambient temperature, were kept. Ten specimens were
daily fixed in solution Karnovsky modified, included in historesin, and stained with
HE. The results showed that 12 hph, the gonadal cord is already allocated by
remaining throughout the study period. During the initial period of, approximately,
206ºC-day life of the larva, it is not observed, by means of histological analysis,
sexual differentiation in A. altiparanae. At this stage, it was possible to observe the
opening of the mouth, which happened at 19 hph, and the food transition, which
occurred between 43 and 60 hph. In a second study, the production of female
monossex lots of lambari was evaluated by the direct method, using estrogen,
estradiol valerate, in an attempt to cause the feminization of males. For this purpose,
1.000 lambari larvae, which had been distributed in four tanks of incubators, in an
average temperature of 21.8 ± 2ºC, were used. Initially, the larvae were fed by nauplii
of Artemia salina and, 72 hph, their food was replaced by a diet containing 35%
crude protein plus different amounts of female hormone, meeting in four treatments:
T1= control treatment without addition of hormone in the diet; T2=20 mg of valerate
estradiol per kilogram of diet; T3=40 mg/kg; T4=80 mg/kg. After the hormonal
treatment period of 30 days, the animals were maintained in tanks, without
administration of hormone, awaiting their growth and facilitating the observation of
the gonads to verify the efficiency of treatments. After 161 days from the beginning of
the experiment (around 3.864 hph), biometry of 50 fish per treatment was performed,
totalling four treatments, and gonads were analyzed. 44% of females were obtained
in the control treatment, while the treatment using 20 mg showed 70%, and
treatments with 40 and 80 mg of hormone had a percentage of 76% of females,
coming up to a result, which compared to other studies, showed to be effective due
to the large percentage of females obtained.
Keywords: lambari, gonadal development, feminization, sex reversal, estrogen.
x
SUMÁRIO
Página
RESUMO viii
ABSTRACT ix
I. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 12
1. A Importânica de Novas Tecnologias Aplicadas À Piscicultura ................ 13
2. A espécie Astyanax altiparanae ................................................................ 15
II. OBJETIVOS ......................................................................................................... 19
III. RESULTADOS .................................................................................................... 21
Capítulo 1 - Desenvolvimento Gonadal Inicial de Astyanax altiparanae ................. 23
1. Introdução ............................................................................................................ 24
2. Materiais e métodos ............................................................................................. 28
2.1 Propagação semi-artificial do lambari A. altiparanae .............................. 28
2.2 Alimentação das larvas ........................................................................... 29
2.3 Coleta das amostras de larvas para análise ........................................... 29
2.4 Análise dos resultados ............................................................................ 30
3. Resultados ........................................................................................................... 31
4. Discussão ............................................................................................................ 41
Capítulo 2 - Avaliação da Efetividade do Hormônio Valerato de Estradiol na
Produção de Lotes Monossexos Femininos de Astyanax altiparanae .................... 47
1. Introdução ............................................................................................................ 48
1.1 Técnicas de reversão de sexo em peixes ............................................... 49
1.2 Aplicação de hormônio para reversão do sexo ....................................... 51
1.3 O hormonio valerato de estradiol ............................................................ 52
1.4 Aplicabilidade da reversão de sexo em outras espécies de peixes ........ 53
2. Materiais e métodos ............................................................................................. 54
xi
2.1 Propagação semi-artificial do lambari A. altiparanae .............................. 54
2.2 Alimentação das larvas ........................................................................... 55
2.3 Preparação da ração com o hormônio .................................................... 56
2.4 Coleta das amostras de peixes para análise .......................................... 56
2.5 Técnica de coloração pelo carmim acético ............................................. 57
2.6 Análise dos resultados ............................................................................ 57
3. Resultados ........................................................................................................... 57
3.1 Quanto a proporção dos sexos ............................................................... 57
3.2 Quanto ao crescimento dos peixes ......................................................... 58
3.3 Quanto a identificação do sexo ............................................................... 59
3.4 Quanto a variação da temperatura .......................................................... 60
4. Discussão ............................................................................................................. 67
IV. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO .................................................... 73
V. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 75
12
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13
1. A Importânica de Novas Tecnologias Aplicadas À Piscicultura
Segundo a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação
(FAO, 2009) a produção mundial de pescados em 2006 foi da ordem de 143,6
milhões de toneladas. Deste total, 92 milhões tiveram origem na captura e 51,7
milhões na aquicultura.
A produção mundial de capturas em 2006 apresentou uma diminuição de 2,2
milhões de toneladas com relação a 2005, enquanto que a aquicultura continua a
crescer mais rapidamente do que qualquer outro setor de produção de alimentos de
origem animal, e em ritmo mais elevado do que a população humana. De uma
produção de menos de um milhão de toneladas anuais no início da década de 1950,
a aquicultura atingiu uma produção de 51,7 milhões de toneladas em 2006,
representando uma taxa de crescimento anual de quase 7%. Desta forma, espera-se
que a aquicultura possa superar as pescarias como fonte de pescados para a
alimentação (FAO, 2009).
Em 2006, os dez principais países produtores de pescados foram os mesmos
que em 2004. O Brasil ocupando a décima colocação, com a produção de uma
média de 251 mil toneladas anuais, representando 2,5% do total da produção
mundial nos últimos anos (FAO, 2009).
A fauna de peixes de água doce do Brasil está entre as mais ricas e
diversificadas do planeta, contendo aproximadamente 39 famílias, 517 gêneros
válidos e mais de 2.500 espécies (BUCKUP et al., 2007). Além disso, o Brasil possui
grande potencial hídrico e climático destacando-se como um dos países de maior
potencial para a expansão da aquicultura. Contudo, a piscicultura ainda apresenta
resultados modestos de desenvolvimento, devido aos processos de produção
adotados e à falta de informações sobre as espécies nativas com potencial
zootécnico e deficiência de dados científicos acerca de sua biologia, especialmente
a reprodutiva (GODINHO, 2007).
Nos últimos anos vêm aumentando os estudos sobre determinação e
diferenciação do sexo em peixes e segundo Devlin e Nagahama (2002), uma das
razões para isto diz respeito à explosão da população humana nos últimos dois
séculos. A alimentação a partir de sistemas aquáticos é um componente cada vez
mais importante da alimentação humana, e, os peixes ósseos compreendem a maior
parte da biomassa utilizada por ela.
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14
Em 2006, mais de 110 milhões de toneladas (77%) da produção mundial de
pescado se destinaram ao consumo humano direto. Praticamente toda a quantidade
restantes, 33 milhões de toneladas, se destinaram a produtos não-alimentares,
especificamente, para a preparação de farinha e óleo de peixe (FAO, 2009).
O restabelecimento do peixe oceânico como fonte de alimento tem sido
priorizada na última década, obrigando a demanda de “proteínas aquáticas” a ser
cumprida através de sistemas de produção aquícola. Torna-se imprescindível a
compreensão da biologia reprodutiva das espécies capturadas no meio natural para
permitir um manejo eficaz e a predição dos impactos em potencial. Da mesma
forma, nos sistemas de aquicultura, entender e controlar a reprodução é
fundamental para a propagação eficaz de organismos devido as taxas de
crescimento diferenciadas dos sexos e a necessidade de uma maturação
sincronizada e confiável. Como membros integrantes do mesmo ecossistema
habitado pela espécie humana, os peixes também estão se tornando cada vez mais
importantes como indicadores de saúde ambiental no planeta, no que diz respeito à
restrição e degradação de habitat. Nos casos em que a capacidade reprodutiva de
uma população de peixes parece estar comprometida, é necessário compreender a
dinâmica natural da população e as características da história de vida das espécies
envolvidas. Parte dessa compreensão envolve o conhecimento das estratégias e
dos mecanismos envolvidos na reprodução e determinação sexual para facilitar a
melhor investigação sobre pontos de impacto (DEVLIN; NAGAHAMA, 2002).
Para piscicultura, a qualidade e a quantidade dos juvenis disponíveis são
pontos críticos, pois devem ter taxa de sobrevivência e capacidade de crescimento
elevadas para que se obtenha sucesso. Os juvenis podem ser capturados no
ambiente natural, mas a disponibilidade de muitas espécies varia amplamente. Além
disso, a ocorrência também pode ser sazonal, como no caso de várias espécies
comerciais sul-americanas, que migram para reprodução e apresentam seu período
reprodutivo concentrado, principalmente, nos meses de outubro a fevereiro. Uma
técnica amplamente utilizada é a criação de reprodutores em cativeiro com a
finalidade de controlar a reprodução e a obtenção de larvas e juvenis. Na criação de
larvas, os objetivos principais visam à maximização do número e do peso dos
juvenis produzidos durante a larvicultura, assim como à diminuição da mortalidade
(BOCK; PADOVANI, 2000).
,QWURGXomR
____________________________________________________________________
15
Desta forma, o desenvolvimento de sistemas intensivos de criação de peixes
na aquicultura brasileira vem sendo cada vez mais necessário para atender as
exigências impostas pelo mercado consumidor, procurando melhorar tanto a
quantidade quanto a qualidade do produto produzido e comercializado. Dentre as
exigências, destaca-se o estudo de espécies nativas com potencial zootécnico que
apresentam características relacionadas à qualidade da carne e sua capacidade de
adaptação a sistemas de criação (NAVARRO et al., 2002).
O Brasil possui uma vasta diversidade de espécies potencialmente aptas para
criação em cativeiro, dentre elas o lambari Astyanax altiparanae Garutti e Britski
(2000), que vem ganhando a atenção de pesquisadores e produtores, devido a alta
taxa de sobrevivência de larvas e juvenis, rápido crescimento, hábito alimentar
onívoro, fácil aceitação de alimento artificial, carne saborosa, alta procura como isca
viva por parte de pescadores (IHERING; AZEVEDO, 1936; SALES; FIRETTI, 2003;
CEMIG, 2000) e como forrageiro para vários predadores (NOMURA, 1975;
ESTEVES, 1996).
2. A Espécie Astyanax altiparanae
A ictiofauna neotropical apresenta a maior diversidade e riqueza de peixes de
água doce conhecida (LOWE-McCONNELL, 1999; NAKATANI et al., 2001), sendo
que, atualmente, existem mais de 4.000 espécies descritas e há estimativas de que
possa existir cerca de 2.000 espécies ainda desconhecidas (REIS et al., 2003).
A ordem Characiformes é o grupo dominante dentre os peixes de água doce
da América do Sul, sendo a família Characidae a maior e a mais complexa desta
ordem (REIS et al., 2003; BRITSKI et al., 1999; NELSON, 1984; FOWLER, 1948).
A posição taxonômica da família Characidae, segundo FINK e FINK (1981),
é a seguinte:
CLASSE - Osteichthyes
SUBCLASSE - Actinopterigii
INFRACLASSE - Teleostei
SUPERORDEM - Osthariophysi
SÉRIE - Otophysi
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16
SUBSÉRIE - Characiphysi
ORDEM - Characiformes
FAMÍLIA – Characidae
Segundo Nelson (2006), a ordem Characiformes é composta por 18 famílias,
com cerca de 270 gêneros e aproximadamente 1.674 espécies descritas, sendo que
destas, 208 espécies são africanas. Na região tropical, a América do Sul é o local de
distribuição de todas as espécies de Characiformes. Algumas famílias estão
distribuídas até o sul da América Central (Ctenoluciidae, Crenuchidae, Parodontidae,
Gasteropelecidae, Curimatidae, Lebiasinidae e Anostomidae), mas somente
representantes de Characidae estão distribuídos até o México e a região do Texas
nos Estados Unidos (NELSON, 2006). Na família Characidae estão inseridos peixes
de hábitos alimentares muito diversificados (herbívoros, onívoros, carnívoros) e que
exploram uma grande variedade de habitats (BRITSKI et al., 1984).
Dentro da família Characidae encontra-se a subfamília Tetragonopterinae que
é um grupo bastante diversificado, com muitos gêneros e espécies, podendo ser
encontrado ao longo da América do Sul e da América Central. A maioria das
espécies pertencentes a esta subfamília é onívora e com hábitos de forrageamento
muito ativos (BRITSKI et al., 1984).
Os tetragonopteríneos mais frequentes nos riachos do sudeste do Brasil são
espécies dos gêneros Astyanax, Bryconamericus, Deuterodon, Hollandichthys,
Moenkhausia, Piabina, Hemigrammus e Hyphessobrycon (GODOY, 1975; BUCKUP,
1999).
A espécie A. altiparanae (Figura 1), distribui-se pela bacia do alto rio Tibagi
(SHIBATTA et al., 2002) e bacia do alto rio Iguaçu (GRAÇA; PAVANELLI, 2002).
Caracteriza-se por apresentar o corpo prateado, com a região ventral esbranquiçada
e a região dorsal cinzenta. As nadadeiras caudal, anal e pélvicas são amareladas
enquanto as demais são hialinas ou levemente amarelas. Na nadadeira caudal,
ainda, há uma faixa mediana negra estendida à extremidade dos raios medianos,
separando os lobos superior e inferior, e, acima da pupila, há uma mancha amarelo-
ferrugem (GARUTTI; BRITSKI, 2000). Contudo, apesar das marcantes
características, como esta espécie ocorre numa grande diversidade de
microambientes, as populações desse grupo de peixes não são homogêneas quanto
à morfologia (RAMSDORF, 2007).
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17
Figura 1: Lambari A. altiparanae (http://www.pisciculturapaulista.com.br/especie_lambari.html)
O lambari, A. altiparanae, é um peixe de pequeno porte que pode atingir até
20 centímetros de comprimento e 60 gramas de peso, sendo muito comum em
águas interiores brasileiras, habitando riachos, rios, brejos e lagoas. É uma espécie
muito prolífera e de desova parcelada, podendo desovar quase o ano inteiro
excluindo-se apenas o período de temperaturas baixas. Na região sudeste é
conhecido popularmente como lambari, lambari-do-rabo-amarelo, tambiú ou piaba
(IHERING; AZEVEDO, 1936; ANDRADE et al., 1985; CEMIG, 2000; PORTO-
FORESTI et al., 2001).
Do ponto de vista de adequação e otimização, a criação do lambari nas
propriedades rurais constitui-se numa excelente alternativa para pequenos e médios
produtores, que procuram módulos de diversificação de suas atividades nas
propriedades. A produção de lambaris em criações poderia ter diferentes
destinações, entre as quais a sua utilização no consumo direto, sua industrialização
na forma de conservas, utilização como alimento natural ou forragem na criação de
peixes carnívoros ou ainda ser comercializado como isca viva para a pesca
esportiva, entre outras possibilidades (PAIVA, 1997).
A ocorrência do processo de reprodução parcelada constitui um fator de
importância no cultivo do lambari, podendo viabilizar a obtenção de três a quatro
desovas durante o ano e possibilitando um incremento substancial na produção.
Contudo, um melhor controle no manejo da larvicultura também deveria ser
desenvolvido, em decorrência do aparecimento de lotes de indivíduos em diferentes
estágios de crescimento. Do mesmo modo, sabe-se que problemas como as altas
densidades decorrentes da falta de controle na produção de juvenis podem levar ao
crescimento diferenciado dos indivíduos. Há também a possibilidade da ocorrência
,QWURGXomR
____________________________________________________________________
18
de desovas de indivíduos precoces nascidos no mesmo período, que também irão
contribuir para o aparecimento de heterogeneidade no tamanho, além de possíveis
diferenças de tamanho decorrentes de características fisiológicas manifestadas
nesta espécie, diferenciando machos e fêmeas, o dimorfismo sexual (CASTILHO-
ALMEIDA, 2007).
Durante o período reprodutivo de A. altiparanae, diferenças morfológicas
nítidas podem ser evidenciadas entre machos e fêmeas, sendo que as fêmeas, além
de serem maiores e possuírem o corpo mais arredondado, são frequentemente mais
precoces no crescimento do que os machos (PORTO-FORESTI et al., 2005; SATO
et al., 2006). Desta forma, a produção de lotes monossexos femininos de A.
altiparanae apresenta-se mais vantajoso para criadores.
As técnicas de controle da sexualidade em peixes representam um grande
potencial para aumentar a produtividade nas criações, pois permitem obter os
benefícios associados ao sexo que apresenta as características morfológicas,
fisiológicas ou comportamentais de interesse econômico (TABATA, 1995). Para a
aplicação de técnicas efetivas de reversão do sexo em peixes, é de extrema
importância o conhecimento do período de diferenciação sexual destes, visto que,
em geral, o período mais sensível (e indicado para aplicação de hormônios
esteróides) é o tempo imediatamente antes ou concomitante com a diferenciação
histológica inicial da gônada primitiva (HUNTER; DONALDSON, 1983).
Segundo Castilho-Almeida (2007), a criação de A. altiparanae em condições
de alta densidade com a aplicação de metodologias específicas como técnicas de
melhoramento genético, manipulação cromossômica (obtenção de indivíduos
estéreis) e de reversão de sexo, pode certamente resultar na melhoria da produção,
bem como viabilizar a utilização desta espécie em projetos de conservação e
controle ambiental. O interesse na utilização destas técnicas na criação de lambaris
merece destaque pelo fato da espécie apresentar gerações curtas, prole numerosa e
ser de fácil manejo em condições de laboratório e de campo.
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20
II. OBJETIVOS
Diante do exposto sobre a importância da ampliação do conhecimento a
respeito da biologia reprodutiva de espécies nativas e, sobre sua criação e manejo,
o objetivo do presente trabalho foi analisar o ínicio do desenvolvimento gonadal de
A. altiparanae, para se estabelecer o melhor momento para aplicação de hormônios
para reversão de sexo. Este trabalho visou conhecer também, a efetividade do
hormônio valerato de estradiol na produção de lotes monossexos femininos de A.
altiparanae por meio da análise morfológica das gônadas, permitindo quantificar a
proporção de machos e fêmeas, contribuindo para a consolidação de uma técnica de
reversão sexual em lambaris.
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22
III. RESULTADOS
Os resultados do presente trabalho estão apresentados em dois capítulos
que, posteriormente, serão modificados e sintetizados a fim de atender às
exigências para publicação em revistas especializadas.
Capítulo 1 – “Desenvolvimento Gonadal Inicial de Astyanax altiparanae”.
Capítulo 2 – “Avaliação da Efetividade do Hormônio Valerato de Estradiol na
Produção de Lotes Monossexos Femininos de Astyanax altiparanae”.
23
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&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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1. INTRODUÇÃO
Sabe-se que a reprodução em peixes teleósteos é muito diversificada, sendo
as espécies predominantemente dióicas, com ocorrência de hermafroditismo e
ginogênese (NAGAHAMA, 1983). A maioria das espécies tem um ciclo reprodutivo
iniciando o desenvolvimento gonadal em época anterior aquela da reprodução, e
completando sua maturação gonadal no momento em que as condições ambientais
tornam-se adequadas a fecundação e desenvolvimento da prole (VAZZOLER,
1996).
Segundo a classificação de Vazzoler (1996) quanto aos mecanismos de
reprodução sexuada de teleósteos, os lambaris são seres gonocorísticos ou
bissexuados, em que os indivíduos são do sexo feminino ou do masculino e a
reprodução ocorre por ovuliparidade, que é a eliminação dos gametas na água, com
fecundação e desenvolvimento externos.
Nas espécies de teleósteos com fecundação externa, os testículos são órgãos
predominantemente pares e alongados, situados no celoma, ventralmente aos rins e
dorsalmente ao canal alimentar, sustentados por uma camada fina de peritônio, o
mesórquio (SELMAN; WALLACE, 1989; LE GAC; LOIR, 1999). São individualizados
em toda a sua extensão, unindo-se apenas na extremidade caudal para formar o
ducto espermático que se abre na papila urogenital. A superfície externa das
gônadas é lisa, sendo morfologicamente variável de acordo com o desenvolvimento
gonadal (ALEXANDRINO et al.,1985).
Os ovários dos teleósteos são estruturas alongadas, globosas e aos pares
que se situam na porção dorsal da cavidade abdominal, ventralmente ao sistema
néfrico e à vesícula gasosa. Prolongam-se no sentido crânio caudal e fundem-se no
terço posterior, formando uma estrutura tubular curta (oviduto) que se estende até a
abertura urogenital, por onde os óvulos alcançam o meio externo (SANTOS, 1981).
Como em outros vertebrados, a ativação ovular e a fecundação em peixes
são seguidas por repetidas divisões celulares mitóticas para produzir uma blástula
composta de células com grande potencial de desenvolvimento (NILSSON; CLOUD,
1992). De modo geral, peixes possuem óvulos telolécitos, em que clivagens
meroblásticas distribuem células em uma fina camada, formando blastodiscos acima
de uma grande massa de vitelo. Com movimentos celulares subsequentes, o
desenvolvimento avança para a fase de gástrula em que células interagem,
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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induzem, e diferenciam-se em camadas germinativas e células especializadas,
seguindo os tipos de tecidos. A pressuposta região gonadal é então, denominada
como crista germinal (BALINSKY, 1975), e é formada por um espessamento
longitudinal da mesoderme que sobressai na cavidade celomática ventral para o
desenvolvimento renal e do mesentério (DEVLIN; NAGAHAMA, 2002).
A migração das células germinativas primordiais (PGCs) é motivada por
quimioatração e por meio de movimentos amebóides ativos, estas células seguem o
mesentério gonadal em direção a gônada em formação (GILBERT, 2006).
Sabe-se que na espécie de peixe Danio rerio, as PGCs seguem um gradiente
da proteína Sdf1 que é secretada pela gônada em desenvolvimento. O receptor para
essa proteína é a proteína CXCR4 da superfície das PGCs (DOITSIDOU et al.,
2002; KNAUT et al., 2003). Este sistema de orientação quimiotática Sdf1/CXCR4 é
conhecido por ser importante na migração de linfócitos e células progenitoras
hematopoéticas. A perda de CXCR4 das PGCs ou Sdf1 das células somáticas
resulta em migração aleatória de células germinativas primordiais de D. rerio
(GILBERT, 2006).
A expressão do sexo em peixes depende de dois eventos: determinação e
diferenciação sexual. A determinação sexual é dada pelo sexo genético (ou
genotípico), enquanto que a diferenciação sexual é responsável pelo
desenvolvimento das gônadas (sexo gonadal ou fenotípico). A interação desses dois
eventos resulta nos fenótipos macho ou fêmea, que se distinguem seja morfológica,
comportamental, ou funcionalmente (PIFERRER, 2001).
A distinção entre a determinação do sexo e a diferenciação sexual é
frequentemente difícil, uma vez que são utilizados regularmente os critérios de
diferenciação sexual (morfológicos, celulares e moleculares) para inferir relações de
sexo que tenham sido determinadas em uma direção particular. A diferenciação
sexual é definida como o processo do desenvolvimento gonadal após o sexo ter sido
determinado. Este processo influencia, características tais como comportamento, ou
características sexuais secundárias morfológicas ou bioquímicas. A diferenciação
sexual também pode inferir quando o processo de determinação do sexo é instável
ou pode ser invertida, como no caso de algumas espécies de peixes. Desta maneira,
a determinação do sexo é o controle primário (fatores genéticos, ambientais e
algumas variáveis) que influencia o curso da diferenciação sexual, enquanto a
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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diferenciação sexual compreende as realizações físicas desses eventos em termos
de desenvolvimento testicular ou ovariano (DEVLIN; NAGAHAMA, 2002).
De acordo com Yamamoto (1969) e Yamazaki (1983) o sexo fisiológico dos
peixes é determinado na ontogênese pelo processo bioquímico realizado sob
controle genético, e vai depender do tipo primário de gônada, isto é, do sexo
gonadal. O sexo genotípico, então, é estabelecido no momento da fecundação do
óvulo pelo espermatozóide, porém a diferenciação do sexo fenotípico só ocorre em
etapas posteriores do desenvolvimento.
Desta forma, a diferenciação sexual envolve todos os eventos que ocorrem
durante o desenvolvimento, resultando na expressão do sexo genético no sexo
fenotípico. Isto inclui os primeiros eventos que ocorrem desde a gônada primordial
até a diferenciação completa em testículos ou ovários (TABATA, 1995).
Segundo Rutaisire (2008), a diferenciação sexual em Labeo victorianus é
inicialmente seguida de um percurso ovogênico. Este é marcado pela divisão de
gonócitos e a formação de uma estrutura similar ao ovário com ovócitos pré-
vitelogênicos. A diferenciação sexual definitiva, dá-se pela contínua ovogênese ou
por atresia dos ovócitos pré-vitelogênicos com concomitante formação de
espermatogônias. Peixes são conhecidos por apresentar uma vasta gama de
ontogenias sexuais, porém, só podem ser considerados hermafroditas se puderem
produzir machos maturos e gametas femininos em algum momento de suas vidas.
Em seu estudo, Rutaisire (2008) notou a presença de estrutura gonádica, de ambos
os sexos na mesma gônada durante o desenvolvimento, mas ainda não eram as
gônadas funcionais, pois ovogenêses em machos predestinados não progrediram
para além do estágio inicial de desenvolvimento ovocítico. Baseado nesta
classificação e nos resultados obtidos em seu estudo, Rustaisire (2008) inferiu que,
L. victorianus, é um gonocorista indiferenciado.
Segundo Yamazaki (1983), nas espécies gonocóricas, a reversão do sexo
obtida de modo artificial é, provavelmente, permanente, pois a ação dos genes
determinantes do sexo gonadal é restrita ao período da diferenciação, diferente das
espécies hermafroditas, nas quais os genes ligados ao sexo podem se expressar em
estágios mais avançados do desenvolvimento gonadal.
Bruslé e Bruslé (1978) estudando tainhas da espécie Mugil auratus
encontraram gônadas indiferenciadas em peixes tendo entre 100-165 mm de
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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27
comprimento; a diferenciação ovariana inicia-se em cerca de 140 mm e em
testículos a 200 mm.
Yemelyanova (1976) obteve em seus resultados que diferenciações
anatômicas em carpas prateadas (Hypophthalmichthys molitrix) são completadas
com a idade de 60-75 dias (55-67 mm) e precedem diferenciações citológicas.
A diferenciação sexual ocorre cerca de dois meses após a desova em
algumas carpas comuns (Cyprinus carpio), entretanto, o processo não é completado
para muitos peixes até chegar aos quatro meses de vida (DAVIES; TAKASHIMA,
1980). Já Pospisil e Smisek (1971), afirmaram que a diferenciação gonadal em C.
carpio ocorre apenas em sete a 10 meses de vida e depende do tamanho do peixe,
enquanto que Davies e Takashima (1980) relataram que o tempo da diferenciação
sexual em C. carpio não depende do tamanho. Segundo Jensen e Shelton (1983), o
crescimento pode ser afetado pela disponibilidade alimentar ou pela temperatura.
Para a carpa prateada (H. molitrix), Yemelyanova (1976) observou que a
diferenciação citológica ocorreu durante o primeiro ano de vida nas regiões quentes
da Rússia, mas não foi manifestado até o terceiro ano em peixes de regiões frias.
Como os peixes são pecilotérmicos o seu desenvolvimento é estreitamente
relacionado com a temperatura da água, portanto medidas de tempo são dadas em
unidades térmicas acumuladas (UTA) em graus centígrados dias, isto é, a soma das
temperaturas médias diárias da água (SIQUEIRA, 2008).
A importância deste dado pode ser exemplificada com o caso das trutas arco-
íris (Oncorhynchus mykiss), nos quais os primeiros sinais da diferenciação sexual
das gônadas aparecem primeiro nas fêmeas, entre 18 a 28 dias após a eclosão, a
uma temperatura média de incubação de 11,5ºC (VAN DEN HURK; SLOF, 1981), ou
seja, entre 207ºC dias e 322ºC dias (UTAs). Desta forma, por meio das UTAs, pode-
se calcular em quantos dias ou à que temperatura essa espécie se diferencia
sexualmente e assim facilitar a manipulação, caso seja necessária a repetição do
experimento em outras condições de tempo e temperatura.
Com base nos dados citados acima, e a importância da ampliação do
conhecimento a respeito da biologia reprodutiva de espécies nativas, este trabalho
teve como objetivo analisar o desenvolvimento gonadal inicial do lambari Astyanax
altiparanae. O conhecimento do período de diferenciação sexual é importante para
que se conheça o momento mais apropriado para aplicação do hormônio de
reversão de sexo. Estes resultados, aliados aos testes de efetividade do hormônio
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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28
valerato de estradiol, poderão contribuir para a consolidação de uma técnica de
reversão sexual em lambaris.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado no laboratório de Reprodução e Genética de
Peixes do Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais
(CEPTA), do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio),
localizado no Município de Pirassununga, SP (21º 56´ S e 47º 22w) (Figura 1) e nos
laboratórios de Histologia e Citogenética da UNESP - Instituto de Biociências –
campus de Rio Claro, SP.
Foi desenvolvido um experimento de acompanhamento do período inicial do
desenvolvimento das gônadas de A. altiparanae, relacionando com as unidades
térmicas acumuladas (UTA) em graus centígrados/dia.
Inicialmente foram utilizadas 1.000 larvas de A. altiparanae, obtidas por meio
de propagação semi-artificial no CEPTA. As larvas foram distribuídas em quatro
tanques de incubadoras horizontais com capacidade de 35 litros de água cada,
sendo mantidos 25 litros de água e 10 larvas/L com água proveniente de uma
represa, que está localizada nas dependências do CEPTA/ICMBio de Pirassununga,
e que abastece o laboratório de Reprodução e Genética de Peixes.
A água dos tanques foi mantida sob aeração constante com renovação de 10
vezes ao dia. As larvas foram criadas à temperatura ambiente num período
aproximado de oito dias, e, diariamente, foram aferidos valores de: oxigênio
dissolvido= 6 a 7 mg/L, pH= 5,5 a 6,5, e alcalinidade da água= 20 mg/L.
A temperatura média da água durante o experimento, obtida por meio de
coletas diárias as 10:00h e às 17:00h, foi de 27,5ºC e o tempo da realização do
mesmo foi de 7,5 dias pós eclosão (dpe). Desta maneira, tem-se que, o período
estudo foi de, aproximadamente, 206ºC dias (valor em UTA).
2.1 Propagação Semi-Artificial do lambari A. altiparanae
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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29
Foram utilizados 120 exemplares adultos de A. altiparanae, sendo 30 fêmeas
e 90 machos, capturados em viveiros do CEPTA. Cada exemplar recebeu uma dose
de extrato bruto de hipófise de carpa de 3 mg por quilograma de peso vivo. O
hormônio foi dissolvido em solução salina estéril a 0,9%, num volume de 1 ml por
quilograma de peso vivo e, a injeção foi administrada intraperitoniamente, próxima à
base da nadadeira ventral, com seringas graduadas de 1 ml (HARVEY;
CAROLSFELD, 1993; WOYNAROVICH; HÓRVATH, 1983).
Após a aplicação do hormônio hipofisário, os reprodutores foram estocados
em dois tanques de incubadoras horizontais com capacidade de 35 litros de água
cada, sendo mantidos apenas 25 litros de água. Cada tanque de incubadora
continha três caixas (40 X 40 X 25 cm) em que foram distribuidas cinco fêmeas e 15
machos para cada caixa.
A desova dos reprodutores ocorreu sem interferência humana, e, em seguida
a eclosão, as larvas foram contadas e 1.000 foram selecionadas ao acaso e
distribuídas em quatro tanques de incubadoras.
2.2 Alimentação das Larvas
As larvas foram alimentadas nas primeiras horas após a absorção do saco
vitelínico com náuplios de Artemia salina, na densidade de 500 náuplios/larva/dia,
divididos em três refeições ao dia (08:30, 14:30 e 17:30h). Após este período, de
acordo com a aceitação dos indivíduos, estes receberam plâncton selvagem
coletado de tanques do CEPTA/ICMBio, previamente preparado conforme método
descrito por Senhorini (1995).
A captura do plâncton nos tanques do CEPTA foi por meio de uma rede de
coleta de plâncton de 200 micras. O plâncton foi distribuído nas incubadoras de
maneira que, em cada tanque de incubadora, pudesse ser encontrada, no mínimo,
uma densidade de aproximadamente 100 organismos por litro de água. Para a
verificação da densidade de plâncton por litro, foi pipetado da coluna d'água, por
meio de uma pipeta de vidro de 5 mL, o volume da mesma por três vezes e foi tirada
a média do número de plânctons encontrados em cada pipeta. Este procedimento foi
repetido em cada um dos tanques, nos horários da alimentação, e caso a densidade
estimada fosse inferior era administrado mais alimento.
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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30
2.3 Coleta das amostras de larvas para análise
Todas as coletas foram realizadas de maneira aleatória.
Nas primeiras 72 horas de vida pós eclosão (hpe) ou 3 dias pós eclosão (dpe)
das larvas, foram coletados 10 exemplares duas vezes ao dia: às 10:00h e às
17:00h. Nas horas posteriores (cinco dias seguintes), foram coletadas 10 larvas
apenas às 10:00h da manhã. Desta maneira, as coletas das larvas foram realizadas
às 12, 19, 36, 43, 60, 67, 84, 108, 132, 156 e 180 hpe.
Os procedimentos e análises histológicas das gônadas foram realizados no
Laboratório de Histologia do Departamento de Biologia da UNESP – campus de Rio
Claro, SP. Devido ao seu tamanho pequeno, as larvas foram fixadas inteiras em
solução Karnovsky modificada (Glutaraldeído a 2,5% + Paraformaldeído a 4% em
tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,2) por 24 horas.
Posteriormente, as larvas foram processadas em historesina, com
desidratação em série crescente de concentração de álcool, iniciando-se com 24
horas em álcool 70%, seguidas de quatro horas em álcool 95%. Após, foi realizada a
infiltração em solução 1:1 de mistura de álcool 95% e resina de infiltração por cinco
horas, seguida de infiltração em solução de resina de infiltração por 12 horas,
finalizando com a inclusão em metacrilato glicol (JB-4 Embedding Kit Polysciences).
Secções de 4 ȝm foram obtidas em micrótomo, distendidas em água destilada
e colocadas sobre lâminas de vidro. Após isto foram mantidas em estufa a 37ºC por
24 horas. Foram realizadas secções seriadas a fim de melhor compreensão da
disposição e localização das gônadas.
As lâminas obtidas com o material em questão foram submetidas à coloração
com hematoxilina e eosina (HE). O procedimento de coloração iniciou-se com a
hidratação dos cortes em 1 minuto de banho em água destilada e coloração em
hematoxilina de Harris por 10 minutos. As lâminas reagiram com água por 4 minutos
e foram lavadas em água corrente. Foram então banhadas por 6 minutos em eosina
e novamente lavadas em água corrente. Depois de coradas, as lâminas foram
desidratadas em estufa e montadas com Bálsamo do Canadá.
2.4 Análise dos resultados
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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31
Ao final deste experimento o material foi fotodocumentado e analisado por
microscopia de luz, utilizando microscópio Olympus BX51 e câmera Olympus DP71
do Laboratório de Citogenética do Departamento de Biologia da UNESP - campus
de Rio Claro, SP.
3- RESULTADOS
Os resultados revelam que as gônadas das larvas de A. altiparanae
apresentam-se como estruturas pares, em forma de um cordão filiforme (Figuras 2 e
3) que se estende desde a porção inicial do intestino médio, acima do saco
vitelínico, até a abertura anal, local de terminação dos ductos urinários e
reprodutivos. Este cordão gonadal está localizado na região celomática, entre o rim
e o mesoderma, acima do intestino e paralelo ao fígado. Às 12 hpe, os cordões
gonadais já estão alocados (Figura 2), e esta localização inicial permanece a mesma
durante os oito primeiros dias de vida da larva, ou seja, até 180 hpe o cordão não
muda de posição.
O cordão gonadal é composto principalmente por células somáticas (Figuras
2 e 3) e algumas células germinativas primordiais, os gonócitos (Figuras 2, 4 e 5).
Durante as fases estudadas não se observou células específicas de ovários ou
testículos.
As células germinativas possuem núcleo ocupando uma parte considerável do
seu volume. A cromatina nuclear apresenta-se completamente descondensada, e os
núcleos apresentam um ou dois nucléolos. O citoplasma apresenta grânulos
intensamente corados por HE, que agrupados formam a chamada “nuage” (na
Figura 5D - inset).
Observou-se células pigmentares que se apresentavam como grânulos
escuros, no tom de marrom (Figuras 3, 4A, 4B, 4E, 4F e 5B), dispersos ou
agregados nos prolongamentos da região do mesentério gonadal.
Desta forma, das 12 hpe as 180 hpe foram observadas somente células
somáticas, células germinativas primordiais e tecido conjuntivo formando um cordão
gonadal, demonstrando que histologicamente não há características que diferenciem
machos e fêmeas na fase inicial do período larval analisada no presente estudo.
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Como as larvas eram de tamanho muito pequeno, foram processadas inteiras,
e este fato possibilitou a observação do desenvolvimento inicial da larva como um
todo (Figuras 6, 7 e 8).
Resumindo-se ao interesse deste trabalho, atentou-se a alguns fatos
importantes em relação a transição alimentar das larvas. A abertura da boca das
larvas se deu às 19 hpe (Figura 6B), porém a presença de alimento no tubo
digestivo do peixe só foi observado às 60 hpe (Figuras 3 e 7A), juntamente com a
absorção total do saco vitelínico (Figura 7A). O intestino apresentou-se como um
tubo retilíneo às 12 hpe (Figura 6A), iniciando seu enovelamento a partir de 36 hpe
(Figura 6C).
Nas últimas coletas, as larvas já se apresentavam bem desenvolvidas, com
seus principais órgãos formados (Figura 8).
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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Figura 1: CEPTA/ICMBio – Pirassununga, SP.
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CG
M
R
R
I
SV
M
N
Figura 2: Secção longitudinal de larva de A. altiparanae com 12 hpe, coradas com HE. As cabeças
de setas (
) indicam as células somáticas e a seta comprida ( ) indica um gonócito. N=
notocorda, M= musculatura, R= rim, CG= cordão gonadal, SV= saco vitelínico e I= intestino.
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35
R
CG
M
I
VS
R
F
BN
Figura 3: Secção longitudinal de larva de A. altiparanae com 60 hpe, coradas com HE. As cabeças
de setas (
) indicam as células somáticas, a seta ( ) indica a pigmentação do mesentério e o
asterisco (
) indica o alimento presente dentro do lúmen intestinal. M= musculatura, R= rim, CG=
cordão gonadal, BN= bexiga natatória, F= fígado, VS= vaso sanguíneo e I= intestino.
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AB
D
C
I
I
I
I
R
R
R
CG
CG
CG
CG
M
VS
EF
R
R
CG
I
I
M
M
Figura 4: Secções longitudinais de gônadas de A. altiparanae coradas com HE, com 12 (A), 19 (B),
36 (C), 43 (D), 60 (E), 67 (F) hpe. As setas compridas (
) indicam os gonócitos e as outras setas
(
) indicam a pigmentação do mesentério. M= musculatura, R= rim, CG= cordão gonadal, I=
intestino, VS= vaso sanguíneo.
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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A
B
C
DE
I
I
I
I
R
R
CG
CG
BN
M
M
M
M
M
I
Figura 5: Secções longitudinais de gônadas de A. altiparanae coradas com HE, com 84 (A), 108 (B),
132 (C), 156 (D) e 180 (E) hpe. As setas compridas (
) indicam os gonócitos, as setas mais curtas
(
) indicam a pigmentação do mesentério, e as pequenas cabeças de seta ( ), no detalhe (D),
indicam a nuage. M= musculatura, R= rim, CG= cordão gonadal, I= intestino e BN= bexiga natatória.
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A
B
D
C
SV
I
N
BA
R
BA
BA
SV
SV
SV
N
N
BN
R
R
R
I
I
I
BN
M
M
M
M
SN
SN
SN
RO
SN
RO
RO
Figura 6: Secções longitudinais de larvas de A. altiparanae coradas com HE, com 12 (A), 19 (B), 36
(C) e 43 (D) hpe. Nota-se a abertura da boca com 19 hpe (B). I= intestino, R= rim, N= notocorda, BN=
bexiga natatória, SV= saco vitelínico, M= musculatura, BA= boca aberta, SN= sistema nervoso e RO=
região ocular.
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A
B
C
I
N
BA
BA
BA
N
BN
R
I
I
BN
M
M
M
SN
SN
SN
RO
BN
Figura 7: Secções longitudinais de larvas de A. altiparanae coradas com HE, com 60 (A), 67 (B) e 84
(C) hpe. Nota-se a absorção completa do saco vitelínico às 60 hpe (A) e a presença de alimento (
)
no tubo digestório. I= intestino, R= rim, N= notocorda, BN= bexiga natatória, M= musculatura, BA=
boca aberta, SN= sistema nervoso e RO= região ocular.
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A
B
D
C
I
N
R
BA
BA
N
BN
R
I
I
I
BN
M
M
M
M
SN
SN
SN
RO
SN
RO
RO
BN
BN
N
N
Figura 8: Secções longitudinais de larvas de A. altiparanae coradas com HE, com 108 (A), 132 (B),
156 (C) e 180 (D) hpe. I= intestino, R= rim, N= notocorda, BN= bexiga natatória, M= musculatura,
BA= boca aberta, SN= sistema nervoso e RO= região ocular.
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4- DISCUSSÃO
Dentro de ambos ovários e testículos dos teleósteos, uma clara distinção
entre as células germinativas e somáticas pode ser feita, as primeiras têm potencial
para divisões mitóticas e meióticas, enquanto as últimas diferenciam-se em
estruturas associadas e tipos de células endócrinas. Como é o caso de muitos
organismos vertebrados e não vertebrados, a origem do desenvolvimento destes
dois tipos de células também difere em peixes (DEVLIN; NAGAHAMA, 2002).
A distinção entre as células germinativas primordiais das células somáticas no
presente estudo é observada logo no início da vida larval, as 12 hpe. Com células
germinativas primordiais sendo gradualmente envoltas por células somáticas
achatadas durante o crescimento do peixe, disposição esta, semelhante às descritas
por Yamamoto e Onozato (1965), Combs (1969), Forberg (1982) e Alves e Godinho
(1987).
A morfologia das células germinativas primordiais de A. altiparanae são
semelhantes as já descritas para outros peixes teleósteos (SATOH; EGAMI, 1972;
VAN DEN HURK; SLOF, 1981; LEBRUN et al., 1982; ROBLIN; BRUSLÉ, 1983;
ALVES; GODINHO, 1987).
A ocupação das gônadas por células germinativas primordiais se fez logo no
incío do desenvolvimento de A. altiparanae, com 12 hpe foi possível observar a
presença destas células (PGCs) ocupando os cordões gonadais. Resultado este
semellhante ao obtido por.
Já Bruslé e Bruslé (1978) estudando tainhas da espécie Mugil auratus
obtiveram como resultados que a colonização de tecidos somáticos por PGCs em M.
auratus é tardia, sendo que não encontraram células germinativas em gônadas de
peixes com até oito meses de vida e 90 a 100 mm de comprimento.
Alves e Godinho (1987) estudando a diferenciação gonádica de Schizodon
Knerii observaram que no início da prófase meiótica, o citoplasma dos ovócitos de S.
Knerii construiram agregações de um denso material basofílico. De acordo com
Toury et al. (1979) e Wallace e Selman (1981), esse material (“nuage”) atinge o
citoplasma através dos poros do envelope nuclear e é constituído por partículas
ribonucleoproteicas.
A espécie A. altiparanae apresentou “nuage” que apresenta forma irregular e
está presente como densas manchas ou "nuvens" em determinadas regiões do
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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citoplasma das células germinativas primordiais. A sua função ou destino permanece
desconhecida, porém, há indicações de que no ovócito este material forme o
germoplasma responsável pela linha germinal da próxima geração (CRUZ-LANDIM;
CRUZ-HOFLING, 1979; EDDY, 1975). A “nuage” está sempre presente nas células
germinativas primordiais de todos animais (EDDY, 1975) e apresenta-se bem
desenvolvida em ovócitos de teleósteos (YAMAMOTO, 1964; DROLLER; ROTH,
1966; ANDERSON, 1968; BEAMS; KESSEL, 1973; BRUSLÉ, 1980; WALLACE;
SELMAN, 1981; DE VLAMING, 1983; NAGAHAMA, 1983). Em Piaractus
mesopotamicus, a “nuage” aparece nas espermatogônias, apresentando-se fixada a
cavidade do envoltório nuclear ou dispersa no citoplasma, sempre associada com
mitocôndrias, sendo que lhe foi atribuída, por Clérot (1979), função em replicação
mitocondrial (CRUZ-LANDIM et al., 2003). Além das espécies P. mesopotamicus
(ABDALLA; CRUZ-LANDIM, 2004) e S. Knerii (ALVES; GODINHO, 1987), a
ocorrência de “nuage" foi descrita também em Serrasalmus spilopleura
(GUIMARÃES; QUAGIO-GRASSIOTTO, 2001), Oryzias latipes (HAMAGUCHI, 1987;
1993) e Barbus conchonius (GEVERS et al., 1992).
As células pigmentares presentes no mesentério gonadal de A. altiparanae
possuem pigmento de natureza melânica e segundo Oliveira e Zieri (2005) a
nomenclatura mais apropriada para essas células é melanócito.
O grau de diferenciação da larva recém-eclodida depende, entre outros
fatores, da espécie e do tamanho do ovo (BLAXTER, 1969; WOYNAROVICH;
HÓRVATH, 1983). A maioria das larvas de peixes de água doce eclode com boca e
mandíbulas ainda não formadas, olhos despigmentados e saco vitelínico grande
(NAKATANI et al., 2001). Poucas espécies, como o peixe-lobo, Anarhichas lupus,
eclodem com características externas semelhantes aos juvenis, com os órgãos
internos já diferenciados, apresentando poucas características larvais, como a
presença do saco vitelínico (FALK-PETERSEN; HANSEN, 2001). No caso de A.
altiparanae, as 12 hpe as larvas apresentam-se com boca e mandíbulas ainda não
formadas, olhos pouco pigmentados e saco vitelínico grande.
A morfogênese e a diferenciação são processos rápidos e complexos durante
a ontogenia inicial dos peixes. As larvas recém-eclodidas sofrem mudanças
drásticas em sua forma de corpo, morfologia, metabolismo, habilidades natatórias e
comportamentais, normalmente em curto período (MACIEL, 2006). Antes da
abertura da boca, as larvas nutrem-se do vitelo, que é reabsorvido constantemente
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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através de endocitose via camada sincicial vitelínica (SHAHSAVARANI et al., 2002).
A camada sincicial é uma camada citoplasmática contínua localizada entre o disco
da blastoderme e o vitelo, resultando de uma divisão incompleta dos blastômeros
(NINHAUS-SILVEIRA et al., 2007).
O tamanho do saco vitelínico e seu tempo de absorção também são espécies-
específicos e quanto maior for a quantidade de reservas endógenas disponíveis,
mais longo será o período que as larvas de peixes possuem para se adaptar a
captura de alimentos externos, enquanto são sustentados pelas reservas do saco
vitelínico (BLAXTER, 1969; WOYNAROVICH; HÓRVATH, 1983; BONILAWSKA et
al., 2000; GISBERT et al., 2000). Para espécies reofílicas, que produzem ovos
pequenos, com pouca reserva endógena e nenhum cuidado parental, o tempo de
adaptação para enfrentar condições ambientais adversas é curto, sendo
imprescindível que as larvas cheguem rapidamente a forma juvenil e adquiram
características mínimas necessárias para sobreviver às duras condições ambientais
e aos predadores (VANDERWALLE et al., 2005).
As maiores alterações do aparelho digestório de peixes acontecem durante o
período larval, resultando em um aparelho funcional que pode, em algumas
espécies, ser estruturado antes mesmo do vitelo ser totalmente consumido
(MACIEL, 2006). Neste estudo foi observado que a espécie A. altiparane apresenta
tubo digestório em desenvolvimento e presença de saco vitelínico às 43 hpe; já às
60 hpe não há mais vestígios do saco vitelínico e pode ser notado alimento na luz do
intestino. Desta forma, o período de transição alimentar ocorreu entre 43 hpe e 60
hpe, sendo que não foi observado, concomitantemente, um aparelho digestório
funcional e presença de saco vitelínico, porém, há de se considerar a possibilidade
de ocorrer um período de alimentação mista entre 43 hpe e 60 hpe.
O desenvolvimento das estruturas corporais das larvas de peixes, juntamente
com o início da alimentação exógena, são eventos importantes que garantem sua
sobrevivência (BALON, 1986).
A abertura da boca das larvas, no presente trabalho, ocorreu às 19 hpe. Já
para a espécie Salminus brasiliensis, a uma temperatura entre 23 e 26
ºC, a
abertura da boca e o início da ingestão começam de 25 a 28 hpe (ZANIBONI
FILHO, 1997; SANTOS; GODINHO, 2002).
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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Reynalte-Tataje et al. (2004) notaram a abertura da boca de Brycon
orbignyanus com 10,5 hpe; Pereira et al. (2006) observaram essa fase em larvas de
jundiá (Rhamdia quelen) às 24 hpe e Pérez et al. (2001) notaram a abertura da boca
em Pseudoplatystoma fasciatum às 48 hpe.
A ausência de saco vitelínico em A. altiparanae foi observada com 2,5 dpe (60
hpe), resultado próximo ao obtido por Santos e Godinho (2002), que estudando
larvas de S. brasiliensis cultivadas numa temperatura de 23 a 25ºC, observaram que
estas absorveram totalmente o saco vitelínico com 3 dpe.
O resultado de absorção total do vitelo em 2,5 dpe pode ser considerado
como sendo um desenvolvimento larval rápido como o das demais espécies de
teleósteos de água doce. Porém, Romagosa et al. (2001), observaram em larvas de
matrinxã (Brycon cephalus), um desenvolvimento mais rápido, com absorção total do
saco vitelínico em 1,5 dpe (36 hpe).
Nas larvas de curimatá-pioa (Prochilodus costatus), curimatá-pacu
(Prochilodus argenteus) e duas espécies de surubins (Pseudoplatystoma corruscans
e P. fasciatum), a absorção quase total ou total do vitelo foi registrada com 4 dpe
(GODINHO et al., 2003; PÉREZ et al., 2001). Enquanto que nas larvas de piau-
verdadeiro (Leporinus obtusidens) o saco vitelínico permanece até 5 dpe (GODINHO
et al., 2003).
O processo natural de diferenciação gonadal tem sido descrito de maneira
diferente entre algumas espécies de teleósteos. Segundo Yamamoto (1969), em
trutas arco-íris (O. mykiss), o período de diferenciação sexual corresponde ao final
da absorção do saco vitelínico e início da alimentação (período da transição entre a
alimentação endógena e exógena). Nesses estágios iniciais do desenvolvimento, a
diferenciação sexual é bastante lábil e a reversão completa e funcional dos sexos
pode ser facilmente obtida pela administração de hormônios esteroidais.
Apesar da diferenciação sexual ocorrer durante a transição alimentar para a
espécie O. mykiss, esse período não corresponde ao da espécie A. altiparanae, em
que a transição alimentar ocorreu entre 43 e 60 hpe, e nesta fase não foi observada
a diferenciação sexual desta espécie, mesmo durante um período maior, de 180
hpe, está diferenciação não foi observada.
Em várias espécies de tilápias, a distinção de sexos é primeiramente
reconhecível pela formação de uma cavidade ou ranhuras no tecido estromal
(ECKSTEIN; SPIRA, 1965; NAKAMURA; TAKAHASHI, 1973; YOSHIKAWA; OGURI,
&DStWXOR'HVHQYROYLPHQWR*RQDGDO,QLFLDOGH$DOWLSDUDQDH
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1978). Em medaka, Oryzias latipes, características morfológicas associadas com
atividades das células germinativas marcam o início da diferenciação sexual gonadal
(SATOH; EGAMI, 1972; ONITAKE, 1972).
Em Oreochromis niloticus (NAKAMURA; NAGAHAMA, 1989; NAKAMURA et
al., 1998), a diferenciação dos tecidos conjuntivos – ducto eferente e células de
Leydig – tem sido relatado como o primeiro passo em direção a diferenciação
testicular inicial (ANTONELI, 2006).
Estudos têm proposto que as células-tronco de Leydig, primeiro surgem no
mesonefro, ou rins primitivos, e depois migram para o testículo para ocupar o tecido
intersticial (WARTENBERG, 1978). Na verdade, durante o desenvolvimento e
diferenciação sexual gonadal, células de Leydig estão restritas, ou são encontradas
principalmente, perto dos vasos sanguíneos (NAKAMURA; NAGAHAMA, 1989;
GRANDI; COLOMBO, 1997). De acordo com Antoneli (2006) as células de Leydig
são especialmente encontradas próximas aos capilares sanguíneos, mas também
são vistas perto de estruturas femininas, células germinativas masculinas imaturas, e
espermatócitos ou lóbulos seminíferos em desenvolvimento.
Grandi e Colombo (1997), estudando as células germinativas primordiais,
observaram em enguias européias, que as células de Sertoli se originam das células
somáticas que envolvem as células germinativas primordiais, que são as mesmas
que dão origem também às células foliculares, e ainda sugerem contribuição para a
formação da lâmina basal, assim como observado por Flores e Burns (1993), que
também consideram como a origem da célula de Sertoli as células que amparam as
células germinativas, mostrando uma similaridade com as células de suporte das
ovogônias. Esses autores ainda sugerem que a direção do desenvolvimento de tal
célula germinativa pode, por sua vez, depender do destino da célula de suporte que
a envolve e se esta vai desenvolver-se em célula folicular ou de Sertoli (MITSUIKI,
2002).
Apesar da existência de fatores que indiquem o início da diferenciação sexual
em determinadas espécies de peixes, nenhum deste fatores foi observado para a
espécie A. altiparanae durante o primeiros 206ºC dias de vida. Ou seja, durante as
180 hpe estudadas, somente foram observadas células somáticas, células
germinativas primordiais e tecido conjuntivo formando um cordão gonadal,
demonstrando que histologicamente não há características que diferenciem machos
e fêmeas nesta fase inicial de vida da larva.
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Reinboth (1972), declarou que a distinção de espermatogônias, ovogônias
primárias e ovócitos antes da prófase meiótica é algo arbitrário e frequentemente é
baseado em recursos somáticos da gônada. Harrington (1974) enfatizou que o sexo
gonadal é reconhecível primeiramente em tecidos não germinativos de algumas
espécies de peixes.
A determinação morfológica precoce da diferenciação testicular, até mesmo
na ontogênese dos peixes, é muito difícil porque as células germinativas estão em
repouso por um tempo maior nos testículos do que nos ovários (NAKAMURA;
NAGAHAMA, 1989; HENDRY et al., 2002; PARK et al., 2004; MEIJIDE et al., 2005).
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1. INTRODUÇÃO
As técnicas de controle da sexualidade em peixes representam um grande
potencial para aumentar a produtividade nas criações, pois permitem obter os
benefícios associados ao sexo que apresenta as características morfológicas,
fisiológicas ou comportamentais de interesse econômico (TABATA, 1995). Alguns
grupos de peixes apresentam fêmeas com taxas de crescimento mais elevadas do
que os machos, alcançando tamanhos maiores, como é o caso, por exemplo, de
alguns salmonídeos, particularmente a truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), e
também da maioria das espécies nativas aptas a criação em cativeiro, destacando-
se muitos characiformes e siluriformes.
Nas criações comerciais, esta marcada superioridade na taxa de crescimento
de um dos sexos em relação ao outro é uma das principais vantagens obtidas pela
criação de monossexos. Além disso, dependendo da espécie, as técnicas de
controle dos sexos podem ainda trazer outros benefícios, tais como: supressão da
reprodução (evitando o problema de superpopulação), contenção de gastos
energéticos com a atividade reprodutiva, uniformidade de tamanho na colheita,
diminuição dos riscos de impacto ambiental decorrente do escape de peixes para os
sistemas naturais e aumento da produtividade (BEARDMORE et al., 2001).
As técnicas de reversão de sexo podem também reduzir os efeitos da
maturação sexual na aparência e na qualidade da carne em algumas espécies de
peixes (BEARDMORE et al., 2001). Para os salmonídeos, por exemplo, a
esterilidade seria desejável para evitar a degradação física e a susceptibilidade às
doenças que estão relacionadas com a maturação sexual (TABATA, 1995).
De acordo com Piferrer (2001), a esterilização é alcançada quando são
utilizadas doses mais elevadas e maior duração de tempo (normalmente meses) do
que as exigidas para masculinização ou feminização de determinada espécie de
peixe.
A maturação sexual é um dos processos biológicos que mais afetam a
produtividade, pois durante este período, a energia para o crescimento somático é
canalizada para a produção de gametas, resultando na diminuição do crescimento,
da eficiência alimentar, da sobrevivência e da qualidade do pescado (BYE;
LINCOLN, 1986). Além disso, após atingirem a maturação sexual, os machos de
alguns grupos de peixes, desenvolvem determinadas características sexuais
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secundárias que consistem, principalmente, na projeção da mandíbula em forma de
gancho e no espessamento e escurecimento da pele, que são indesejáveis sob o
ponto de vista comercial. Estas alterações associadas à queda da resistência e ao
aumento do comportamento agressivo os predispõem a infecções por fungos e
bactérias, que além de comprometerem a comercialização podem provocar a morte
dos animais (BROWN; ROBERTS, 1982).
1.1 Técnicas de Reversão de Sexo em Peixes
São vários os estudos sobre diferentes métodos para a realização da
reversão do sexo em peixes, destacando-se entre essas metodologias as que
seguem abaixo:
- Reversão de Sexo pela Adição de Hormônios na Dieta
Segundo Tabata (1995), a produção de lotes femininos de peixes pela técnica
hormonal pode ser obtida de duas formas:
A: DIRETA: através da administração de estrógenos provocando a
feminização dos machos genotípicos.
B: INDIRETA: através da masculinização de fêmeas genotípicas com
andrógenos e posterior fecundação de ovócitos normais com o sêmen de fêmeas
masculinizadas.
A via indireta, embora mais demorada pelo fato de envolver duas gerações,
possui um número reduzido de peixes submetidos ao tratamento hormonal e
utilizados apenas como reprodutores. As fêmeas masculinizadas, embora
apresentem fenótipo masculino, são geneticamente femininas, produzindo
espermatozóides que carregam apenas o cromossomo sexual que determina o sexo
feminino, que fecundando ovócitos de fêmeas normais irão produzir descendentes
somente do sexo feminino sem contato prévio com hormônios.
São várias as espécies em que o acasalamento de fêmeas masculinizadas
com fêmeas normais produz uma progênie totalmente feminina, entre elas pode-se
citar a truta arco-íris, o salmão do Atlântico, a tilápia do Nilo, a medaka e o “goldfish”
(PIFERRER, 2001).
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A feminização direta pode ser aplicada em qualquer espécie,
independentemente do sistema de determinação sexual, ou qual é o sexo
homogamético ou heterogamético, enquanto que, a feminização indireta é indicada
para aquelas espécies em que as fêmeas são homogaméticas com relação ao
sistema de determinação sexual (PIFERRER, 2001).
Estes tratamentos são conduzidos nas fases iniciais do desenvolvimento,
muitos meses antes da comercialização e os resíduos desses esteróides
desaparecem em menos de um mês depois de finalizado o tratamento (PIFERRER,
2001), não havendo portanto, riscos de contaminação da carne por hormônios. Este
fato já foi confirmado por vários autores, que afirmaram que os hormônios esteróides
(estrógenos e andrógenos) pesquisados por eles são rapidamente metabolizados e
excretados (JOHNSTONE et al., 1983; PILLAY, 1990; HENDRY et al., 2003;
SPECKER; CHANDLEE, 2003).
- Reversão de Sexo por Banhos de Imersão
A técnica de banhos de imersão envolve exposições periódicas ou contínuas
das larvas em solução contendo o agente alterador da diferenciação de sexo, sendo
um método alternativo à suplementação dietética (PANDIAN; SHEELA, 1995).
De acordo com alguns autores, a técnica de imersão tem sido mais eficiente
do que a administração oral em espécies de climas temperados (BAKER et al.,
1988; BEARDMORE et al., 2001). Entretanto a técnica de imersão não é empregada
comercialmente em razão da inexistência de protocolo efetivo para nível de
intervenção, idade das larvas, densidade de estocagem e outros, precisando ainda
ser otimizada antes de ser utilizada para produção comercial, pois os resultados são
inconstantes e o gasto de hormônio é superior ao da técnica de adição à ração
(BOMBARDELLI; HAYASHI, 2005; WASSERMANN; AFONSO, 2003).
Em salmonídeos já foi observado que, os banhos de imersão aplicados
próximos à eclosão, são eficientes para veicular os esteróides, pois, essas espécies
possuem grande volume de vitelo, que serve como reservatório para o hormônio,
que é absorvido durante a fase de diferenciação sexual (PIFERRER, 2001).
- Reversão de Sexo pela Temperatura
A temperatura pode afetar a diferenciação sexual ao longo do
desenvolvimento dos peixes. Um choque ambiental, tal como uma alta temperatura,
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pode romper o processo de desenvolvimento normal durante a diferenciação sexual,
causando a mudança de machos para fêmeas e/ou de fêmeas para machos. Ou
também, temperaturas elevadas podem ter efeito sobre a estrutura e ação de
hormônios durante a diferenciação sexual (HUNTER; DONALDSON, 1983). De
acordo com D´Cotta et al. (2001) a temperatura influencia o mecanismo de ação da
enzima aromatase, que catalisa a transformação de andrógenos em estrógenos.
Portanto, a temperatura pode ser utilizada como uma outra forma de reversão
de sexo, e a grande vantagem da utilização deste método para manipulação do sexo
nos peixes utilizados no consumo alimentar é a não utilização de hormônios. Porém,
é possível que a resposta na diferenciação sexual, através de variações na
temperatura, varie entre linhagens diferentes dentro da mesma espécie, podendo
não ser eficiente para todas as espécies (PATIÑO, 1997).
Para que se obtenha sucesso na alteração da proporção sexual pela
manipulação da temperatura, o tratamento deve ser aplicado antes do início da
diferenciação sexual das gônadas, as quais parecem apresentar sensibilidade à
alteração de temperatura no mesmo momento em que apresentam sensibilidade aos
tratamentos hormonais (BAROILLER; D´COTTA, 2001).
- Reversão de Sexo pelo PH
Pouco se encontra na literatura sobre reversão sexual pelo pH, sendo que
Romer e Beisenherz (1996) observaram que a proporção de machos é mais alta em
pH ácido (4,5) do que em valores mais neutros (6,5) nas espécies de Apistogramma
e em Poecilia melanogaster.
1.2 Aplicação de Hormônio para Reversão do Sexo
O controle artificial do sexo em peixes, pela administração hormonal, iniciou-
se com trabalhos realizados no final de 1930 e princípio de 1940 (YAMAMOTO,
1969). Os resultados obtidos nesses trabalhos proporcionaram não somente
informações sobre os mecanismos genéticos da diferenciação sexual, mas também
demonstraram as potencialidades de suas aplicações em espécies economicamente
importantes, nos quais os cultivos monossexos são vantajosos (TABATA, 1995).
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Uma vez que os esteróides sexuais estão envolvidos no processo natural de
diferenciação sexual, esse processo pode ser controlado pela administração de
hormônios sexuais, em peixes sexualmente indiferenciados, alterando o curso da
diferenciação no sentido do sexo desejado (TABATA, 1995). Porém, a administração
de hormônios deve ser feita com cautela, pois concentrações baixas podem não
surtir efeito enquanto que doses excessivas podem causar efeitos negativos
(MYLONAS et al., 1994).
À exemplo desses efeitos negativos, tratamentos com doses excessivas de
estrógenos ou andrógenos podem levar ao não desenvolvimento gonadal ou à
esterilidade. Estes efeitos podem refletir incompatibilidades entre o esteróide
exógeno e processos genéticos e fisiológicos internos, ou efeitos patológicos no
desenvolvimento gonadal. Além disso, tratamentos com doses excessivas de
andrógenos podem também levar a uma redução na masculinização e, em alguns
casos, induzir feminização paradoxal (PIFERRER et al., 1993).
Os resultados citados acima foram observados por Hackman e Reinboth
(1974), que constataram o efeito feminizante em tratamentos com altas doses de 17-
Į-metiltestosterona e afirmaram que este hormônio exógeno, em excesso, é
metabolizado para estrógeno, provocando feminização de indivíduos geneticamente
machos, sugerindo assim uma diminuição nas doses administradas, ou até mesmo
no tempo de alimentação com as dietas contendo este hormônio.
O início do tratamento e a sua duração são de importância crítica para a
indução da reversão sexual em peixes. Em geral, o período mais sensível é o tempo
imediatamente antes ou concomitante com a diferenciação histológica inicial da
gônada primitiva (HUNTER; DONALDSON, 1983).
As evidências da existência de um período de maior sensibilidade aos
tratamentos hormonais com estrógenos e andrógenos, foram constatadas em
diferentes espécies como Oncorhynchus kisutch (PIFERRER; DONALDSON, 1989),
O. mykiss (KRISFALUSI; NAGLER, 2000), Oryzias latipes (KOGER et al., 2000) e
Oreochromis niloticus (APPLE; LEBOUTE, 1995).
1.3 O Hormonio Valerato de Estradiol
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O estradiol (17ȕ-estradiol) é um hormônio sexual feminizante que pode ser
encontrado sob diversas formas: valerato de estradiol, benzoato de estradiol,
etinilestradiol.
O etinilestradiol, forma sintética mais potente do hormônio, é o estradiol
alquilado semi-sintético com uma substituição 17-alfa-etinil (PDAMED, 2009). Já o
benzoato de estradiol é uma forma esterificada do estradiol na posição CɡOH
(VYNCKIER, 1990) e o valerato de estradiol é um éster do 17ȕ-estradiol, modificado
na posição 17, particularidade que lhe confere uma meia-vida mais longa quando
comparado ao benzoato de estradiol (WILLIAMS; STANCEL, 1996).
1.4 Aplicabilidade da Reversão de Sexo em Outras Espécies de Peixes
A grande maioria das espécies fluviais brasileiras, entre outros condicionantes
para a reprodução, necessita de longas migrações rumo às nascentes dos rios. A
dificuldade que se apresenta à criação destas espécies é a de produção de juvenis,
uma vez que não se reproduzem naturalmente em tanques ou viveiros; por esta
razão, torna-se necessário proceder a reprodução induzida com a incubação dos
ovos e a criação de larvas em laboratório (BOCK; PADOVANI, 2000).
Para uma melhor produtividade na criação dessas espécies, é interessante a
aplicação da técnica de reversão sexual, pois em contrapartida à dificuldade de
criação da espécie em cativeiro, tem-se a produção de lotes com indívíduos do sexo
de interesse comercial.
Desta maneira, o presente estudo sobre reversão sexual em A. altiparanae
poderá ampliar a oportunidade da aplicação da técnica de reversão de sexo em
outras espécies nativas de interesse econômico. Dentre essas espécies, destaca-se
um grande número de espécies que apresentam fêmeas com taxas de crescimento
superiores aos machos, atingindo tamanhos maiores, como por exemplo a cachara
(Pseudoplatystoma fasciatum), o pintado (P. corruscans), o mandi (Pimelodus
maculatus), a matrinxã (Brycon amazonicus), a piraputanga (B. insignis), a
piracanjuba (B. orbignyanus), o tambaqui (Colossoma macropomum), o pacu
(Piaractus mesopotamicus), a pirapitinga (P. braquipomum), o curimbatá
(Prochilodus lineatus), a tabarana (S. hilarii) e o dourado (Salminus brasiliensis). A
exemplo desta última, S. brasiliensis, é uma espécie de grande porte, que realiza
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longas migrações reprodutivas e cujos machos podem atingir até cinco quilos de
peso, enquanto as fêmeas atingem até 26 kg na natureza (MORAIS FILHO;
SCHUBART, 1955).
Estes fatores enaltecem a necessidade de novos estudos que ampliem os
conhecimentos da biologia reprodutiva dos peixes nativos, visando melhorias na
conservação das espécies e aumento da produtividade na aquicultura brasileira.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado no laboratório de Reprodução e Genética de
Peixes do CEPTA/ICMBio – Pirassununga, SP e nos laboratórios de Histologia e
Citogenética da UNESP - Instituto de Biociências – campus de Rio Claro, SP. Foi
desenvolvido um experimento de reversão sexual de lambaris (A. altiparanae),
realizando um delineamento experimental inteiramente casualizado, com quatro
tratamentos da seguinte forma: (T1) tratamento controle – sem adição de hormônio
na ração; (T2) ração com 20 mg de valerato de estradiol por quilo de ração; (T3)
ração com 40 mg/kg e (T4) ração com 80 mg/kg.
Foram utilizadas 1.000 larvas de lambaris obtidas através de propagação
semi-artificial no CEPTA. No início do experimento, as larvas com 48 horas pós
eclosão (hpe), foram contadas e distribuídas em quatro tanques de incubadoras
horizontais, com capacidade de 35 litros de água cada, sendo mantidos 25 litros de
água e 10 larvas/litro. A água dos tanques foi mantida sob aeração constante com
renovação de 10 vezes ao dia, com água proveniente de uma represa, localizada
nas dependências do CEPTA/ICMBio de Pirassununga que abastece o pavilhão do
laboratório de reprodução. Diariamente foram aferidos os valores de oxigênio
dissolvido, pH, alcalinidade e temperatura da água.
2.1 Propagação Semi-Artificial do lambari A. altiparanae
Foram utilizados 120 exemplares adultos de A. altiparanae, sendo 30 fêmeas
e 90 machos, capturados em viveiros do CEPTA. Cada exemplar recebeu uma dose
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de extrato bruto de hipófise de carpa de 3 mg por quilograma de peso vivo. O
hormônio foi dissolvido em solução salina estéril a 0,9%, num volume de 1 ml por
quilograma de peso vivo e, a injeção foi administrada intraperitoniamente, próxima à
base da nadadeira ventral, com seringas graduadas de 1 ml (HARVEY;
CAROLSFELD, 1993; WOYNAROVICH; HÓRVATH, 1983).
Após a aplicação do hormônio hipofisário, os reprodutoras foram estocados
em dois tanques de incubadoras horizontais com capacidade de 35 litros de água
cada, sendo mantidos apenas 25 litros de água. Cada tanque de incubadora
continha três caixas (40 X 40 X 25 cm) em que foram distribuidas cinco fêmeas e 15
machos para cada caixa.
A desova dos reprodutores foi realizada sem interferência humana, e, cerca
de 48 horas pós eclosão (hpe), as larvas foram contadas e 1.000 foram
selecionadas ao acaso e distribuídas em quatro tanques de incubadoras.
2.2 Alimentação das Larvas
Nas primeiras 72 hpe ou três dias pós eclosão (dpe) as larvas foram
alimentadas com náuplios de Artemia salina na densidade de 500 náuplios/larva/dia,
divididos em três refeições (08:30, 14:30 e 17:30h).
Após este período, as larvas dos lambaris receberam uma dieta artificial com
35% de proteína bruta, contendo as quantidades de hormônio feminizante respectivo
a cada tratamento, com exceção da dieta controle, fornecidas “ad libitum”, seis
vezes ao dia. A ração não foi aplicada em um período anterior a este pois as larvas
não estavam suficientemente desenvolvidas para a ingestão deste tipo de alimento.
Depois de 30 dias recebendo os tratamentos hormonais ou tratamento
controle, os juvenis já estavam com 792 hpe (33 dpe). O experimento se extendeu
para aguardar o crescimento dos juvenis, até as 3.864 hpe (161 dpe), possibilitando
a retirada das gônadas para verificação da eficiência do tratamento hormonal. Nesta
fase os peixes receberam a dieta controle “ad libitum”, sendo que a dieta controle
consistia em ração balanceada com 30% de proteína bruta.
2.3 Preparação da ração com o hormônio
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O hormônio valerato de estradiol em quantidades de 20 mg, 40 mg ou 80 mg,
foi dissolvido em 500 mL de álcool etílico e misturados em um quilo de ração em pó.
Após seca, a ração foi dividida em porções, embalada em sacos plásticos e mantida
em congelador, retirando-se porções para consumo imediato.
2.4 Coleta das amostras de peixes para análise
Peixes com 96, 720 e 3.864 hpe (4, 30 e 161 dpe) foram coletados para
biometria inicial, intermediária e final, respectivamente.
Após o crescimento dos juvenis, apresentando 3.864 hpe (161 dpe), 50
peixes de cada um dos quatro tratamentos, num total de 200 indivíduos, foram
sacrificados através de choque térmico e necropsiados através de incisão na região
ventral, a partir do ânus até o opérculo, para exposição dos órgãos e identificação do
sexo dos indivíduos.
Para determinar o sexo dos lambaris foram analisadas a presença de
características sexuais secundárias (fêmeas com ventre abaulado e maior irrigação
por vasos sanguíneos nesta região do corpo, e machos com a nadadeira anal
áspera ao toque) e avaliados alguns parâmetros das gônadas, como cor,
transparência, vascularização e visualização de ovócitos a olho nu. Além disso, o
sexo dos lambaris submetidos à reversão foi determinado e/ou constatado em todos
os indivíduos, pelo método do carmim acético de Guerrero e Shelton (1974), e
validada para juvenis de tilápia do Nilo por Wassermann e Afonso (2002). Para este
exame microscópico das gônadas foi utilizado microscópio de luz modelo Nova 107.
Após a biometria final (3.864 hpe ou 161 dpe), as gônadas de um casal de
exemplares de A. altiparanae de cada tratamento foram selecionados
aleatoriamente, dissecados e suas gônadas foram coradas com carmim acético.
Preparadas as lâminas com o material, este foi fotodocumentado em microscópio de
luz (Olympus BX51 e câmera Olympus DP71 do Laboratório de Citogenética do
Departamento de Biologia da UNESP) para simples ilustração das diferenças do
sexo gonadal entre fêmeas e machos.
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2.5 Técnica de coloração pelo Carmim Acético
Inicialmente, 0,5 g de índigo carmim foi adicionada a 100 mL de ácido
acético (45%) e fervida por 5 minutos. Após o resfriamento, a solução foi filtrada
utilizando papel filtro, e transferida para um frasco escuro. A solução de carmim
acético foi gotejada sobre o tecido gonadal colocado sobre uma lâmina e coberto
com uma lamínula, e então esmagado sob leve pressão. Em seguida, o material foi
levado ao microscópio e observado.
2.6 Análise dos resultados
Foi realizado um delineamento experimental em que, as variáveis peso,
comprimento e proporção de macho e fêmea, foram elaboradas em tabelas e
analisadas estatisticamente, de acordo com Sokal e Rohlf (1995). Os procedimento
da análise da variância fatorial e teste de Tukey foram analisados utilizando o
programa estatístico SAS, versão 9.1 (SAS, 1996). Estas análises estatísticas foram
realizadas no Departamento de Estatística, Matemática Aplicada e Computação do
Instituto de Geociências e Ciências Exatas de Rio Claro, UNESP, sob a supervisão
do Prof. Dr. Antonio Carlos Simões Pião.
3. RESULTADOS
3.1 Quanto a Proporção dos Sexos
Observou-se uma diferença significativa na proporção de machos e fêmeas
nos diferentes tratamentos, sendo que o tratamento 1 (controle) apresentou 44% de
fêmeas, enquanto o tratamento 2 (20mg/kg) apresentou 70% de fêmeas e os
tratamentos 3 e 4, que receberam dosagens de 40 mg e 80 mg, respectivamente, do
hormônio valerato de estradiol por quilo de ração apresentaram uma porcentagem
de 76% de fêmeas (Tabela 1).
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Por meio do teste de comparação binominal, entre duas amostras
independentes, foi possível comparar a proporção de fêmeas entre os quatro
tratamentos. A proporção de fêmeas nos tratamentos 2, 3 e 4 foram significativas
quando comparadas ao tratamento controle. Entre os tratamentos 2, 3 e 4 não
houve diferenças significativas (Tabela 1).
3.2 Quanto ao Crescimento dos Peixes
A fim de se conhecer se houve alteração no tamanho e peso dos animais
durante a realização do experimento, foram feitas biometrias em todos os
tratamentos, sendo que às 96 e 720 hpe (4 e 30 dpe) foram coletadas 100 larvas
para realização da biometria inicial e intermediária, respectivamente.
Tanto o peso individual quanto o peso de todas as larvas juntas, com 96 hpe,
não foram mensurados por serem muito pequenos, e, o comprimento médio das
larvas neste estágio foi de aproximadamente 4,3 mm (dp= 0,003).
Na biometria intermediária (Tabela 2), as larvas já estavam recebendo ração
com diferentes dosagens de hormônio e nesta fase do experimento foram
detectadas diferenças significativas de médias de comprimento e peso obtidas entre
os quatro tratamentos.
Para verificar a variável peso, em relação aos diferentes tratamentos, da
biometria intermediária, utilizou-se o modelo do tipo fatorial, considerando como fator
o tratamento (T1; T2; T3; T4). Observou-se evidência ao nível de 5% de significância
que houve diferença entre os tratamentos para a variável peso (Tabela 2).
Aplicando o teste de Tukey para a variável peso, observou-se diferença
significativa em relação aos tratamentos, sendo que o tratamento controle
apresentou valor maior, seguido pelos tratamentos 3 e 4, e por útlimo observou-se o
tratamento 2, com a menor média (Tabela 2).
Para verificar o comportamento do comprimento em relação aos diferentes
tratamentos, utilizou-se o modelo do tipo fatorial, considerando como fator o
tratamento (T1; T2; T3; T4). Obteve-se evidência ao nível de 5% de significância que
houve diferença entre os tratamentos em relação a variável comprimento (Tabela 2).
Aplicando o teste de Tukey para a variável comprimento, tem-se a diferença
significativa em relação aos tratamentos, sendo que o tratamento controle
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apresentou valores maiores, seguido pelos tratamentos 3 e 4, e por útlimo obteve-se
o tratamento 2, com os menores valores de comprimento (Tabela 2).
Após 3.864 hpe (161 dpe) foram coletados 50 peixes de cada tratamento e
obtidos os valores de comprimento e o peso total dos indivíduos para a verificação
dos dados das biometrias finais dos indivíduos (Tabela 3).
Para verificar o comportamento do peso em relação aos diferentes
tratamentos e sexo, utilizou-se o modelo do tipo fatorial, considerando como fatores
o tratamento (T1; T2; T3; T4) e o sexo (macho/fêmea). Para o fator peso houve uma
evidência ao nível de 5% de significância que demonstrou haver diferença entre os
sexos, fato este já esperado, devido ao conhecimento de que as fêmeas
normalmente apresentam tamanhos maiores do que os machos. Não houve
diferenças significativas entre os quatro tratamentos quanto a variável peso (Tabela
3).
Aplicando o teste de Tukey para a variável peso, tem-se a diferença
significativa do peso em relação aos sexos (Tabela 4).
Para verificar o comportamento do comprimento em relação aos diferentes
tratamentos e sexo, utilizou-se o modelo do tipo fatorial, considerando como fatores
o tratamento (T1; T2; T3; T4) e o sexo (macho/fêmea). Para o fator comprimento
houve evidência ao nível de 5% de significância que demonstrou haver diferença
entre os sexos, fato também esperado, devido ao conhecimento das diferenças de
tamanhos entre fêmeas e machos, em que as fêmeas são geralmente maiores
(Tabela 3).
Aplicando o teste de Tukey para a variável comprimento, tem-se a diferença
significativa do comprimento em relação aos sexos (Tabela 5).
3.3 Quanto a Identificação do Sexo
Durante a realização das análises dos experimentos do presente trabalho de
reversão de sexo, foram observadas gônadas de fêmeas em diferentes fases de
desenvolvimento ovariano, embora algumas fases observadas com mais
frenquências que outras.
Nas gônadas das fêmeas de lambaris (Figura 1), foram observados
agrupamentos de células com citoplasma escasso e núcleo grande. São células
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arredondadas com raras distinções de tamanho (Figura 3A). Identificou-se outros
tipos celulares, com semelhanças quanto ao tamanho das primeiras células citadas,
citoplasma denso e vesícula germinativa bem evidente (Figuras 3B-F). Todos estes
grupos celulares citados acima, são ovócitos em diferentes fases do
desenvolvimento.
Em poucas gônadas de fêmeas de lambaris, foi possível observar a olho nú, a
presença de ovócitos maduros, grandes e amarelados. Analisando
microscopicamente (Figura 3C), ficou evidente a presença de grânulos de vitelo
acinzentados preenchendo estes ovócitos.
Alguns ovócitos em atresia puderam ser identificados (Figuras 3D-E).
As gônadas apresentavam vasos sanguíneos, de grande calibre, espessos e
densos, percorrendo e se ramificando em porções mais delgadas por toda a
extensão da gônada (Figura 3F). Aparentemente, ramificações de vasos sanguíneos
circundam todos os ovócitos.
Notou-se também, a presença de uma membrana que envolvia os ovários,
possivelmente a túnica albugínea (Figura 3G).
Em algumas regiões da periferia das gônadas, foram observados
agrupamentos de células de tamanho reduzido, semelhantes às estruturas
observadas nas gônadas dos machos (Figura 3H).
Os testículos (Figura 2) são estruturas maciças e compactas, formadas por
pequenas células, filiformes, com aparência típica de espermatozóides (Figura 4A).
Foram observadas a presença de vasos sanguíneos e de uma fina cápsula
envolvendo os testículos, possivelmente a túnica albugínea (Figura 4B).
3.4 Quanto a Variação da Temperatura
Durante a realização deste estudo, as médias de temperaturas diárias
sofreram grandes oscilações, sendo a média de 21,8°C ± dp=2.
As variações de temperatura encontradas durante os meses em que foi
realizado o experimento (março à setembro) encontra-se na Figura 5.
A água apresentou as seguintes características durante o experimento:
oxigênio dissolvido=6 a 7 mg/L, pH=5,5 a 6,5, e alcalinidade da água=20 mg/L.
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Tabela 1: Proporção dos sexos de A. altiparanae e aplicação do teste
binominal para cada tratamento de reversão sexual.
Tratamento Fêmea Macho Total de indivíduos % de fêmeas
1 (controle) 22 ª 28 ª 50 44 ª
2 (20 mg/kg) 35
b
15
b
50 70
b
3 (40 mg/kg) 38
b
12
b
50 76
b
4 (80 mg/kg) 38
b
12
b
50 76
b
Valores com letras diferentes, nas colunas, indicam diferença significativa ao nível de 5%.
Tabela 2: Biometria intermediária de A. altiparanae dos quatro tratamentos de
reversão de sexo, realizada com 720 hpe (30 dpe), e, submetidas a análise da
variância fatorial e aplicação do teste de Tukey, considerando como fator o
tratamento (T1; T2; T3; T4).
Tratamento
Peso (g)
Média ± Desvio Padrão
Comprimento (cm)
Média ± Desvio Padrão
1 (controle) 0,137 ± 0,064 ª 1,972 ± 0,282 ª
2 (20 mg/kg) 0,064 ± 0,034
c
1,587 ± 0,239
c
3 (40 mg/kg) 0,082 ± 0,040
b
1,718 ± 0,237
b
4 (80 mg/kg) 0,085 ± 0,058
b
1,713 ± 0,286
b
Valores com letras diferentes, nas colunas, indicam diferença significativa ao nível de 5%.
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Tabela 3: Biometria final de A. altiparanae dos quatro tratamentos de
reversão de sexo, realizada com 3.864 hpe (161 dpe), e, submetidas a análise da
variância fatorial, considerando como fatores o tratamento (T1; T2; T3; T4) e o sexo
(macho/fêmea).
Tratamento
Peso (g)
Média ± Desvio Padrão
Comprimento (cm)
Média ± Desvio Padrão
1 2,425 ± 1,138 5,610 ± 0,730
2 2,872 ± 1,238 5,812 ± 0,775
3 2,972 ± 1,445 5,844 ± 0,874
4 2,672 ± 0,989 5,660 ± 0,710
Não houveram diferenças significativas, ao nível de 5%, entre os quatro tratamentos de
reversão sexual. Houveram diferenças significavas apenas entre os sexos.
Tabela 4: Teste de Tukey aplicado à variável peso durante a biometria final
(3.864 hpe ou 161 dpe) de A. altiparanae dos quatro tratamentos, considerando o
fator sexo.
Tukey Média (g) N Sexo
A
3.0244 ª 133 ª 1 ª
B
2.1621
b
67
b
2
b
Valores com letras diferentes, nas colunas, indicam diferença significativa ao nível de 5%.
Sexo 1 = Fêmea; Sexo 2 = Macho; N = Número de indivíduos.
Tabela 5: Teste de Tukey aplicado à variável comprimento durante a
biometria final (3.864 hpe ou 161 dpe) de A. altiparanae dos quatro tratamentos,
considerando o fator sexo.
Tukey Média (cm) N Sexo
A
5.9030 ª 133 ª 1 ª
B
5.3910
b
67
b
2
b
Valores com letras diferentes, nas colunas, indicam diferença significativa ao nível de 5%.
Sexo 1 = Fêmea; Sexo 2 = Macho; N = Número de indivíduos.
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Figura 1: Fêmea adulta de A. altiparanae (A) e em destaque sua gônada (B) indicada por asteriscos
( ), onde pode-se notar uma extensa ramificação de vasos sanguíneos ( ).
Figura 2: Macho adulto de A. altiparanae. A seta indica a gônada do peixe.
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A
B
CD
E
F
G
H
Figura 3: Gônadas de fêmeas de A. altiparanae (A - H) coradas pelo carmim acético, em que foram
observados ovócitos imaturos (A), regiões povoadas por ovócitos em diferentes fases de
desenvolvimento ( em B – F), sendo possível destacar ovócitos em estádio mais avançado, de
vitelogênese ( em C), e presença de células em estádio de atresia ( em D - E). Evidencia-se a
presença de vasos sanguíneos ( em F) e uma fina membrana que envolve os ovócitos ( em
G). Observou-se uma estrutura diferenciada (H), assemelhando-se as estruturas das gônadas dos
machos. A=T1; C, D, E=T2; B, F, H=T3 e G=T4.
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AB
Figura 4: Gônadas de machos de A. altiparanae (A - B) coradas pelo carmim acético, onde são
observadas estruturas compactas com células pequenas (A) e uma membrana que envolve os
testículos, possivelmente a túnica albugínea ( em B). A=T2 e B=T4.
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17,0
18,0
19,0
20,0
21,0
22,0
23,0
24,0
25,0
26,0
27,0
março abril maio junho julho agosto
MESES
TEMPERATURA (Cº
)
MÉDIAS DIÁRIAS
Figura 5: Médias diárias de temperatura durante o desenvolvimento do estudo de reversão sexual
em lambaris.
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4. DISCUSSÃO
Segundo Bogart (1987), a diferenciação sexual nos vertebrados, e, inclusive a
indução do processo de reversão de sexo nos peixes é controlada pela
aromatização dos andrógenos a estrógenos, através de um mecanismo molecular
interno de controle enzimático da esteroidogênese (BAROILLER et al., 1999;
GOVOROUN et al., 2001; LEE et al., 2001, 2002; ROWELL et al., 2002;
GONZÁLEZ; PIFERRER, 2003; BHANDARI et al., 2005, 2006; SUNOBE et al., 2005;
IWAMATSU et al., 2006).
Os esteróides sexuais são principalmente sintetizados pelas células
somáticas gonadais (as células foliculares e as células da teca, nas fêmeas, e as
células de Leydig e as células de Sertoli, nos machos) (FOSTIER et al., 1983;
GURAYA, 2001), e sua concentração plasmática apresenta variações com relação à
diferenciação e maturação gonadais e durante o ciclo reprodutivo (LILEY; STACEY,
1983; FEIST et al., 1990; KIME et al., 1991; GUIGUEN et al., 1993; YEUNG et al.,
1993; SNELSON et al., 1997; JOHNSON et al., 1998).
São raros estudos que se tem na literatura quanto ao estudo da reversão
sexual em espécies nativas, e a proporção de fêmeas obtidas com o presente
estudo em A. altiparanae, se faz importante por ser significativa quanto à reversão,
se comparada aos trabalhos de Veregue e Orsi (2003), em que a distribuição das
frequências percentuais agrupadas mensalmente para proporção sexual de lambaris
em ambientes naturais, demonstra que os machos predominaram na maioria dos
meses do período estudado, com exceção de abril. Artioli et al. (2003) em estudo
sobre o período reprodutivo e alimentação de A. alburnus no canal Cornélios, no Rio
Grande do Sul, obteve uma proporção sexual de 0,77 fêmea para cada macho em
ambiente natural.
Quanto a espécies nativas, Amaral et al. (2008) obtiveram eficácia na
feminização do jundiá, Rhamdia quelen, utilizando o hormônio 17 ȕ-estradiol. Os
autores testaram três diferentes concentrações de hormônio (90, 100 e 110 mg/kg)
incorporadas à ração, e todas apresentaram-se eficientes, sendo que a dosagem de
100 mg de hormônio mostrou-se mais eficiente com 88,2% de fêmeas.
Os resultados de feminização, ao contrário dos tratamentos com andrógenos,
mostram uma melhor resposta nas larvas mais jovens (BOMBARDELLI; HAYASHI,
2005) indicando que, mesmo sem a definição do período da diferenciação sexual, se
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fez importante a aplicação do hormônio em A. altiparanae em etapas iniciais do
desenvolvimento larval, para garantir a eficácia do tratamento. Porém, se faz
necessário o conhecimento do período da diferenciação sexual para que não seja
feita a utilização indiscriminada de hormônio sexual.
Em Oncorhynchus kisutch, a sensibilidade ao 17 ȕ-estradiol ocorre alguns
dias antes (aproximadamente 12 dias) que para a 17 Į-metiltestosterona
(PIFERRER; DONALDSON, 1989). Para a espécie Oreochromis niloticus, também
houve melhor efetividade aos tratamentos com estrógeno para larvas mais jovens
(BOMBARDELLI; HAYASHI, 2005). Estes resultados podem ser comprovados por
evidências histológicas de que, a completa diferenciação sexual nas fêmeas, ocorre
antes que nos machos (STRUSSMANN et al., 1996; PIFERRER, 2001).
Ao contrário dos andrógenos, a obtenção do sucesso dos tratamentos com
estrógenos parece ser mais difícil de ser alcançado (MCANDREW, 1993), porque os
andrógenos são agentes alteradores de sexo mais potentes que os estrógenos, fato
que leva à necessidade da utilização de maiores dosagens hormonais para feminizar
efetivamente os peixes (HENDRY et al., 2003). Em A. altiparanae a utilização de
uma quantia maior de hormônio feminizante (40 e 80 mg/kg de ração) apresentou
maior eficácia nos resultados de reversão sexual (76% de fêmeas) com relação a
uma quantidade menor do hormônio (20 mg/kg de ração) que resultou em um
número menor de fêmeas (70%).
Contudo, mesmo utilizando altas dosagens, em algumas espécies como as
carpas, o emprego de 17 ȕ-estradiol foi completamente ineficiente (KOMEN;
RICHTER, 1993). Esta dificuldade em obter a feminização parece se agravar em
procedimentos que utilizem banhos de imersão, chegando a não serem efetivos
(PHELPS; POPMA, 2000).
Bombardelli e Hayashi em 2005, obtiveram de 24,05% a 39,20% de
feminização de O. niloticus, a partir de banhos de imersão com valerato de estradiol,
confirmando as afirmações referentes à ineficiência dos tratamentos.
Os resultados de feminização obtidos pelos autores citados acima, tornam-se
ineficientes, principalmente, quando comparados com resultados de outros autores
como Mélard (1995), que obteve 100% de feminização utilizando suplementação
dietética de 200 mg de 17 a-etinilestradiol.kg-1 na dieta, em O. aureus. Scott et al.
(1989) obtiveram bons resultados de feminização em proles de O. niloticus,
geneticamente monossexuais masculinas. Estes autores alcançaram resultados de
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51,6 e 83,9% em fêmeas, em dois ensaios, utilizando 100 mg de dietilstilbestrol.kg-1
de dieta. A incorporação de estrógenos na ração também foi eficiente na
feminização de Odontesthes bonariensis (STRUSSMANN et al., 1996).
A temperatura dominante durante a fase inicial de desenvolvimento tem sido
considerada como sendo um determinante ambiental para o sexo em muitos peixes
gonocorísticos (BAROILLER et al., 1999). Embora a maioria dos estudos sobre os
efeitos da temperatura na determinação do sexo concentrarem-se em répteis e
anfíbios (CREWS, 1996; PIEAU, 1996; DEVLIN; NAGAHAMA, 2002), a
termossensibilidade da diferenciação gonadal em peixes também tem sido
descoberta em um crescente número de espécies (NAKAMURA et al., 1998;
BAROILLER et al., 1999; DEVLIN; NAGAHAMA, 2002) desde a primeira
constatação da ação da temperatura na determinação do sexo em “Atlantic
silverside”, Menidia menidia (CONOVER; KYNARD, 1981).
As periodicidades ambientais são expressas nos peixes sob diversas
atividades fisiológicas. No caso da reprodução, as condições do ambiente
representam o impulso para desencadear o início dos eventos reprodutivos. Existem
constatações de que fatores como temperatura da água, chuvas e fotoperíodo
influenciam no ciclo reprodutivo do lambari. O estudo de reversão sexual realizado
no presente trabalho, que perdurou de março a setembro de 2008, sofreu grandes
oscilações de temperatura que apresentaram médias diárias em torno de 21,8ºC ± 2.
Sabendo-se que a temperatura ideal para a reprodução desta espécie é entre 26 e
28°C, os lambaris se desenvolveram em temperaturas que desfavorecem seu
crescimento, afetando extremamente o desenvolvimento das gônadas.
O desenvolvimento tardio das gônadas, causado provavelmente pelas
temperaturas baixas e oscilatórias, tornou necessária a extensão do presente
trabalho até que fosse possível a visualização do sexo gonadal do peixe, tanto de
forma macroscópica como microscópica.
Baixas temperaturas são conhecidas por induzir a produção de machos
primários em Rivulus marmoratus. Estudos morfogênicos gonadais mostram que
baixas temperaturas atrasam a sexualização e diminuem o índice mitótico das
células germinativas. Baixa temperatura também induz um alargamento do estroma
da região hilar da gônada em desenvolvimento antes da sexualização das células
germinativas (HARRINGTON, 1975).
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70
De acordo com Chan e Yeung (1983), tem sido sugerido que a indução de
baixa temperatura em machos primários possa induzir a redução da taxa mitótica
das células germinativas e do desenvolvimento do estroma da região hilar; estes
efeitos podem retardar o processo das células germinativas masculinas ou suprimir a
diferenciação normal das células femininas.
Em oposto às baixas temperaturas, Van den Hurk e Lambert (1982)
verificaram utilizando truta arco-íris, Oncorhynchus mykiss, que a alta temperatura
no tratamento (22-29°C), aplicada logo após a eclosão e por várias durações, não
afeta a proporção sexual. Posteriormente, tratamentos de alta temperatura por um
período mais longo foram aplicados na mesma espécie por Baroiller et al. (1999),
mas nenhuma reversão de sexo foi obtida. Goto (2000) demonstrou que nenhuma
reversão para o sexo masculino ocorreu em salmão masu, O. masou, e em truta
arco-íris, O. mykiss, através de tratamentos de alta temperatura. Por outro lado,
Craig et al. (1996) observaram tendência a fêmeas em uma proporção de sexo em
peixes criados em alta temperatura durante o desenvolvimento embrionário nas
incubadoras, sugerindo que a temperatura de incubação é provavelmente o fator
responsável pela mudança na proporção sexual no salmão vermelho, O. nerka.
Na maioria dos peixes em que a desova ocorre durante o primeiro ano de
vida, a gametogênese é completada em um tempo relativamente curto (JENSEN;
SHELTON, 1983); este perfil se enquadra nas características de A. altiparanae, uma
espécie de crescimento rápido, que segundo Porto-Foresti e colaborados (2001),
chegam à maturidade sexual com cerca de quatro meses de idade em condições de
cultivo, normalmente com 7 a 9 cm de comprimento para os machos e 12 a 15 cm de
comprimento para as fêmeas.
Em um estudo sobre a influência do sexo na morfometria e nos índices
somáticos de lambari em condições de cultivo, Navarro e colaboradores (2006)
chegaram ao resultado de que os índices morfométricos analisados revelaram que
as fêmeas criadas separadas dos machos obtiveram melhor crescimento em relação
a outros tratamentos em que estão na presença deles. Para desempenho
reprodutivo, as fêmeas criadas separadas dos machos apresentaram resultado
superior a outros tratamentos. Para machos, a criação na presença das fêmeas
apresentou melhor desempenho reprodutivo.
Nikolsky (1963) referiu-se às diferenças sexuais no tamanho corporal e
relação peso-comprimento como a forma mais frequente de dimorfismo sexual entre
&DStWXOR$YDOLDomRGDHIHWLYLGDGHGRKRUP{QLRYDOHUDWRGHHVWUDGLROQDSURGXomRGHORWHVPRQRVVH[RVGH$DOWLSDUDQDH
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71
os peixes. Entre as fêmeas, o tamanho maior é favorecido porque aumenta a
fecundidade, enquanto que o tamanho dos machos é afetado pela seleção sexual,
sendo que machos maiores desfrutam de certa vantagem reprodutiva
(GREENWOOD; WHEELER, 1985; PARKER, 1982; SHINE, 1990).
Durante o período reprodutivo de A. altiparanae, diferenças morfológicas
nítidas podem ser evidenciadas entre machos e fêmeas, sendo que as fêmeas, além
de serem maiores e possuírem o corpo mais arredondado, são frequentemente mais
precoces no crescimento do que os machos (PORTO-FORESTI et al., 2005; SATO
et al., 2006). Neste período, observa-se melhor nas fêmeas maior irrigação por
vasos sanguíneos na região ventral do corpo, principalmente nas bases de inserção
das nadadeiras peitorais e ventrais. Os machos são menores, possuem o corpo
alongado e no período reprodutivo apresentam a nadadeira anal áspera ao toque
devido a presença de espículas, sendo tal característica importante para a sua
identificação (PORTO-FORESTI et al., 2005; ANDRADE et al., 1984;
BOMBARDELLI et al., 2000). Estas características auxiliaram na identificação do
sexo dos peixes após o final do experimento de reversão de sexo realizado no
presente estudo.
As gônadas da espécie A. altiparanae apresentam-se semelhantes a
morfologia descrita por Veregue e Orsi (2003), para A. scabripinnis paranae.
No que se refere à morfologia das gônadas, A. scabripinnis paranae
apresenta estruturas pares e saculiformes e as gônadas situadas dorsalmente na
cavidade geral do corpo, posicionadas lateralmente a bexiga natatória e separadas
entre si, fundindo-se em sua parte caudal, nas proximidades do poro genital.
Externamente, as gônadas são revestidas pelo peritônio visceral e estão ligadas ao
dorso da cavidade abdominal através do mesovário (VEREGUE; ORSI, 2003).
As gônadas de A. altiparanae assemelham-se também, em seu padrão geral,
às demais espécies da família Characidae (NOMURA, 1975; BARBIERI, 1992;
BAZZOLI et al., 1998), e as características mais específicas são semelhantes a
outras espécies do gênero (BAZZOLI et al., 1998), o que pode ser indicativo de que
ocorram padrões reprodutivos semelhantes nesse grupo de peixes, e que
provavelmente, estejam envolvidas no sucesso dos lambaris em ocupar os mais
diversos habitats, como citado por Garutti e Britski (2000) e Winemiller (1989).
Os ovários de teleósteos foram classificados por Wallace e Selman (1981) e
De Vlaming (1983), em três tipos, seguindo o padrão de desenvolvimento ovocitário:
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a) “sincrônico total” onde todos os ovócitos encontram-se no mesmo estádio de
desenvolvimento, ocorrendo em espécies que desovam uma única vez e morrem; b)
“sincrônico por grupos”, onde encontram-se no mínimo duas populações de ovócitos
em diferentes estádios de desenvolvimento, característicos de teleósteos que
desovam uma vez ao ano e têm curta estação reprodutiva; e c) “assincrônico”, que
apresenta ovários contendo todos os estádios de desenvolvimento, característico de
espécies que desovam muitas vezes durante o ano e possuem prolongado período
reprodutivo (SANTIAGO, 2006). De acordo com o descrito acima, evidenciou-se em
A. altiparanae, a presença de ovócitos em diferentes estádios de desenvolvimento,
podendo sugerir uma assincronia deste processo para a espécie.
Nesta espécie, cuja desova é parcelada, nem todos os ovócitos vitelogênicos
presentes nos ovários são, obrigatoriamente, eliminados; muitos deles podem sofrer
atresia e serem absorvidos, além de existir a possibilidade de ocorrerem casos de
dinâmica diferenciada de desenvolvimento (VAZZOLER, 1996).
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IV. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO
O Brasil já dispõe de razoável tecnologia de criação de espécies nativas,
ainda sim, há a necessidade de se conhecer melhor a biologia de algumas que
apresentam grande potencial para a piscicultura (CASTAGNOLLI, 1992). A criação
de novas espécies de peixes em cativeiro será uma opção importante, pois permitirá
um aumento sobre os estoques pesqueiros. Isto indica a necessidade e prioridade
de resguardar o setor, requerendo o conhecimento científico da biologia e ecologia
de peixes de água doce. É cada vez mais urgente que órgãos públicos e
universidades, estudem e selecionem novas espécies que possam contribuir para o
desenvolvimento de uma piscicultura sustentável (VAL; HONCZARIK, 1995; VAL et
al., 2000).
Desta forma, este trabalho foi realizado na tentativa de contribuir com a
ampliação do conhecimento científico quanto ao desenvolvimento gonadal inicial e a
efetividade do hormônio, valerato de estradiol, na reversão do sexo de uma espécie
nativa, o A. altiparanae.
Diante dos resultados concluimos que:
1. Não foi observada a diferenciação sexual da espécie A. altiparanae,
durante a fase inicial do desenvolvimento, correspondente a 206ºC dias.
2. Durante a observação do desenvolvimento inicial de A. altiparanae, foi
possível detectar que a abertura da boca se deu às 19 hpe; a transição da
alimentação endógena para a exógena ocorreu entre 43 e 60 hpe.
3. As análises indicaram que o hormônio valerato de estradiol não apresentou
influência sobre o crescimento e ganho de peso final dos lambaris, visto que não
foram notadas diferenças significativas entre os tratamentos nas biometrias finais.
4. O hormônio valerato de estradiol apresentou-se efetivo para produção de
lotes monossexos de A. altiparanae. Porém, ainda se faz necessário o estudo de
novas dosagens e controles de fatores ambientais para o estabelecimento de uma
reversão maior de fêmeas.
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