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SELMA ELIAS DE MACEDO
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NOVOS MARCADORES
MICROSSATÉLITES PARA ANÁLISE GENÉTICA EM AMENDOIM.
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação Stricto Senso em Ciência Genômica
e Biotecnologia da Universidade Católica de
Brasília, como requisito parcial para obtenção
do título de Mestre em biotecnologia.
Orientador: David Bertioli.
Co-orientador: Márcio Moretzsohn.
Brasília
2009
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MACEDO, Selma Elias de. Título: Desenvolvimento e Caracterização
de novos marcadores moleculares para análise genética em amendoim.
Selma Elias de Macedo Brasília, 05 de maio de 2009.
Paginação.: 97 folhas.
Dissertação de Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia-
Universidade Católica de Brasília, Brasília, 05 de maio de 2009.
Orientação: David Bertioli
1.Introdução, 2.Objetivos, 3.Material e Métodos, 4.Resultados e 5.
Conclusões, Bertioli David, Selma Elias de Macedo.
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Dedico este trabalho ao Senhor meu Deus, que
me sustenta e guarda, que ilumina os meus
caminhos e leva-me a perseverar.
Aos meus pais, Romildo e Teresinha, por serem
um exemplo a ser seguido, pelo amor, por toda
a dedicação e sacrifícios para que eu tivesse
uma vida repleta de realizações.
Aos meus filhos queridos Gabriel e Mateus.
Ao meu marido Robson, por ter me apoiado me
sustentado e encorajado tantas vezes, e por
nunca reclamar da minha ausência.
A Idelzinete Macedo, Fausta Elias (Tina), Graça
Maria (Madrinha), Dione Mendes, Bruna
Jaqueline, Flávia Ludmila e Adriana Carneiro
por terem uma palavra amiga sempre a me
ofertar e por me sustentarem em oração quando
os momentos eram difíceis de serem suportados
e as lágrimas insistiam em rolar.
A minha amiga Soraya por acreditar que eu
seria capaz, mesmo quando eu duvidava.
A todos os meus amigos, que torceram pelo
meu sucesso.
AGRADECIMENTOS
Ao Senhor meu Deus, que foi, é e sempre será a minha fortaleza e o meu escudo.
À Universidade Católica de Brasília, pelo apoio ao curso de Pós Graduação Stritu Sensu
em Ciência Genômica e Biotecnologia.
Aos meus queridos professores, dos quais, tive o privilégio e a honra de ter usufruído
dos seus conhecimentos e experiência.
Ao pessoal da secretaria e apoio ao aluno.
À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia pela oportunidade de poder executar o
trabalho de mestrado em suas instalações.
Ao Dr. Márcio Moretzsohn, pela amizade, compreensão, paciência, incentivo,
conselhos, orientações e por todo apoio recebido durante a realização do trabalho.
Ao Dr. David Bertioli, pela amizade, compreensão, orientações, sugestões, incentivo e
por todo apoio recebido durante a realização do trabalho.
À Dra. Soraya Bertioli, pela amizade, carinho, compreensão, solidariedade, incentivo,
sugestões e por todo o apoio recebido.
Aos profissionais do grupo Arachis, por todos os ensinamentos, sugestões e apoio
recebidos.
Aos amigos, companheiros Flávia Ludmila, Dione Mendes, Ediene Gouvêa, Rodrigo
Furtado, pelo apoio, cooperação, principalmente na confecção, aplicação e revelação dos géis
de prata.
Às companheiras Aline Elita e Maíra Teixeira Andrade pela cooperação na germinação,
plantio e pelo trabalho de fotógrafas.
À Bruna Vidigal e Fernando Fonseca na obtenção de células competentes.
À todos os pesquisadores e funcionários do Laboratório de Genética Vegetal da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Dra. Ana Ciampi, Dra. Gláucia Buso, Dra. Vânia
Rennó, Marília Pappas, Dr. Dário Grattapaglia, Dr. Márcio Elias, Zilneide Amaral, Marco
Antônio (Marcão), por terem sempre se mostrado receptivos em ajudar em tudo que fosse
necessário.
Às Dras. Danielle Assis de Faria e Marlei de Fátima Pereira por toda a ajuda e o apoio
recebido.
Aos amigos bolsistas e estagiários do Laboratório de Genética Vegetal da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Lílian Mourelli, Bruna Jaqueline, Thaísa, Leandro, Luiz
Henrique, Túlio Lins, Regisley Durão, César Petroli, Camila Gavião, Patrícia, Guilherme
Rennó, Carlinha, Deborah, Driana, Jefferson, Alceu, Rherman, Natália Lamas, Natália Pereira,
Andréa Amaziles, Laís, Andréa Schmidt, Juliana, Leandro Gomide, Leonardo, Liamar, Justino
e Sandra.
Aos funcionários da Plataforma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Mário
Saraiva e Luciana Labuto por terem se mostrado receptivos em ajudar.
Aos amigos e colegas da Universidade Católica de Brasília, Dione Mendes, Bruna
Jaqueline, Cristiane Sousa, Thaísa, Thaís, Aline Ribeiro, Simone Maria, Betty Souza, Daniela
Baccelli, Carla dos Anjos Souza, Adriana, Aline Cabral, Sérgio, Ciro, Camila, por todo apoio e
ajuda.
À minha cunhada Raquel Machado pela ajuda no controle dos géis, ao meu irmão,
Selson Machado, meu plantão de dúvidas em Excell e ao meu marido Robson, sempre
atencioso em sanar minhas dúvidas em informática.
A todos aqueles que mesmo não citados aqui são também muito importantes para mim.
“Há somente duas maneiras de viver a vida.
Uma é como se nada fosse um milagre. A outra
é como se tudo fosse um milagre”.
-Albert Eisnteim
RESUMO
O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma leguminosa de importância econômica mundial,
sendo autógama, alotetraplóide com um genoma AABB e 2n = 40 cromossomos. Embora tenha
substancial diversidade morfológica, fisiológica e agronômica, pouca variação tem sido
detectada quando se usam marcadores baseados em DNA, ou seja, tem baixo polimorfismo
genético. Acredita-se que essa variabilidade genética limitada seja devida ao seu isolamento
reprodutivo em relação às espécies silvestres diplóides, a poliploidização recente, à reprodução
autógama e a pouca utilização de germoplasma silvestre nos programas de melhoramento. Esta
limitação tem dificultado o avanço no melhoramento molecular do amendoim devido à
dificuldade em se desenvolver marcadores polimórficos para esta espécie. Nos últimos anos,
aproximadamente 250 marcadores-microssatélite polimórficos foram publicados para o
amendoim cultivado um numero insuficiente para alguns estudos, incluindo a construção de
mapas genéticos. Para amendoim cultivado repetições de microssatélites AG/TC mostraram-se
mais polimórficas do que as AC/TG e o polimorfismo máximo foi detectado em microssatélites
com 21 a 25 repetições. Visando ao desenvolvimento de novos marcadores microssatélites, uma
biblioteca genômica enriquecida para TC/AG foi construída e 147 marcadores foram
desenvolvidos, destes 139 amplificaram e foram caracterizados em 22 acessos do amendoim
cultivado. O polimorfismo nos acessos do amendoim cultivado foi de 59,7%, sendo que um
número maior de marcadores polimórficos foi encontrado entre 16 e 35 repetições. Os 83
marcadores polimórficos foram utilizados para análise de diversidade alélica, o número de
alelos detectados variou de dois a doze, e para cada um dos 83 locos analisados foi encontrada
uma média de 5,4 alelos por loco. Os valores da diversidade gênica (DG) variaram de 0,08 a
0,885, com uma média de 0,6. Os valores do conteúdo de informação polimórfica (PIC)
variaram de 0,08 a 0,87 e a média foi de 0,56. Um dendrograma baseado em UPGMA foi
construído para os 22 acessos de A. hypogaea, um acesso de A. monticola e um de A. ipaënsis x
A. duranensis (Figura 16). Quatro grupos principais foram formados. O Grupo I incluiu os
acessos de hypogaea/hypogaea, um acesso não identificado e um acesso de hypogaea/hirsuta. O
Grupo II conteve os acessos de fastigiata/peruviana e fastigiata/aequatoriana (com exceção do
acesso Mf2352). O Grupo III foi formado pelos acessos de fastigiata/fastigiata e
fastigiata/vulgaris incluídos. O último grupo (Grupo IV) incluiu o único acesso de A. monticola,
os acessos de A. hypogaea tipo Xingu, um acesso de hypogaea/hirsuta e um acesso de
fastigiata/aequatoriana (Mf 2352). O acesso Mf2534 (hypogaea/hirsuta) e a planta anfidiplóide
(A. ipaënsis x A. duranensis)
c
agruparam externamente aos demais 22 acessos. Os novos
marcadores microssatélites desenvolvidos serão importantes no estabelecimento de relações
genéticas entre os genótipos de amendoim cultivado, na construção de mapas, e na seleção
assistida por marcadores em variedades do amendoim.
Palavras-Chave: Arachis hypogaea, Microssatélite (SSR), Biblioteca genômica, Polimorfismo.
ABSTRACT
Peanut (Arachis hypogaea L.) is a legume of worldwide economic importance, it is
allotetraploid with an AABB genome and 2n = 40 chromosomes. Although cultivated peanut
exhibits substantial morphological, and physiological diversity, little polymorphism has been
detected when using DNA-based markers. It is believed that genetic variability is limited due to
the crops reproductive isolation in relation to the wild diploid species, the recent polyploid
origin of the crop, the high rate of self fertiliation, and very little use of wild germplasm in
improvement programs. The low polymorphism, and consequent low number of polymorphic
markers has hampered the progress in molecular breeding of peanuts. To date about 250
polymorphic microsatellite markers have been published for the peanut crop, however, this is
inadequate for many studies, including the construction of genetic maps. Microsatellites with
motifs of AG/CT have been found to be more polymorphic in cultivated peanut than AC/TG
microsatellites and highest polymorphism was detected in microsatellites with 21 to 25 motif
repetitions. Therefore, with the aim of developing new microsatellite markers with a high rate
of polymorphism, a genomic library enriched for CT/AG microsatellites was built and
sequenced, and 139 markers were developed and characterized in 22 accessions of cultivated
peanut. Polymorphism between these accessions was 59.7%. The 83 polymorphic markers were
used for analysis of allelic diversity, the number of alleles detected ranging from two to 12,
with an average of 5.4 alleles per locus. Values of genetic diversity (GD) ranged from 0.08 to
0885, with an average of 0.6. Values of the polymorphic information content (PIC) ranged from
0.08 to 0.87, with an average of 0.56. A dendrogram based on UPGMA was built for the 22
accessions of A. hypogaea, one accession of A. monticola and one synthetic amphidiploid
hybrid (A. ipaënsis x A. duranensis)
4x
. Four main groups were formed. Group I included the
accessions of hypogaea/hypogaea, and an unidentified accession of hypogaea/hirsuta. Group II
contained the fastigiata/peruviana and fastigiata/aequatoriana accessions (with the exception
of accession Mf2352). Group III was formed by accessions of fastigiata/fastigiata and
fastigiata/ vulgaris. The last group (Group IV) included the only accession of A. monticola, the
accessions of A. hypogaea Xingu type, and one accession each of hypogaea/hirsuta and
fastigiata/ aequatoriana (Mf 2352). One accession of hypogaea/hirsuta (Mf2534) and the
synthetic amphidiploid (A. ipaënsis x A. duranensis )
4x
grouped externally to the other 22
accessions. The new microsatellite markers developed will be important in the establishment of
genetic relationships among genotypes of cultivated and wild peanuts, for the construction of
maps, and for marker assisted selection in peanut breeding programs.
Keywords: Arachis hypogaea, Microsatellite (SSR), Genomic library, Polymorphism.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: A. hypogaea subsp. hypogaea var hirsuta - Fonte: CENARGEN-22/12/2008.
Figura 2: A. hypogaea subsp. fastigiata var. fastigiata (ciclo curto) - Fonte: CENARGEN-
22/12/2008.
Figura 3: A. hypogaea subsp. hypogaea var. hypogaea (ciclo longo) - Fonte: CENARGEN-
22/12/2008.
Figura 4 Subespécies e variedades da espécie Arachis hypogaea L. (KRAPOVICKAS;
GREGORY, 1994).
Figura 5: A. monticola - Fonte: CENARGEN-22/12/2008.
Figura 6: A ferramenta “Pregap4 do programa Staden Package (Staden et al., 2003) com os
módulos”.
Figura 7: Ferramenta GAP 4, Contig Editor do programa Staden Package (Staden et al., 2003),
com parâmetros padrões aplicação masking e utilizando a função find read pairs do
Staden.para o contig Ah3TC13G05.F1.
Figura 8: Arquivo obtido da Ferramenta GAP 4, com parâmetros padrões, do programa Staden
Package (Staden et al., 2003), para o contig Ah3TC24C06.R1.
Figura 9: Géis de agarose a 3,5% corados com brometo etídio, mostrando os primers testados
em quatro variedades de A. hypogaea na seguinte ordem: IAC-Tatu (A. hypogaea subsp.
fastigiata var fastiagiata), BR1 (A. hypogaea subsp. fastigiata var fastigiata), IAC-Caiapó (A.
hypogaea subsp. hypogaea var hypogaea) e IAC-Runner 886 (A. hypogaea subsp. hypogaea var
hypogaea).
Figura 10: Número de repetições (eixo x) e número de SSRs compostos, perfeitos e imperfeitos
(eixo y) que foram identificadas nos 139 primers que amplificaram
Figura 11: Fragmentos gerados utilizando primers microssatélites Ah3TC42A05 e
Ah3TC27H12 respectivamente, amplificados a 58ºC e visualizados em gel de poliacrilamida.
(1) marcador de peso molecular 10 pb. Ordem das amostras (2) IAC5024, (3) Runner886
(4)KG30076xV14167, (5)Tatu, (6)Mf574, (7)Caiapó, (8) Mf788, (9)Mf210, (10)BR1, (11)A.
monticola, (12)Of106, (13)Of107, (14)Mf2534, (15)Mf3911, (16)Mf3618, (17) Mf2517,
(18)Mf2430, (19)Mf3764, (21)Mf3892, (21)Mf2681 (22)Mf2352, (23) Mf3207, (24) Mf1625,
(25) Mf3884.
Figura 12: Fragmentos gerados utilizando primers microssatélites Ah3TC28B01 e
Ah3TC25F03 respectivamente, amplificados a 58ºC e visualizados em gel de poliacrilamida.
(1) marcador de peso molecular 10 pb. Ordem das amostras (2) IAC5024, (3) Runner886
(4)KG30076xV14167, (5)Tatu, (6)Mf574, (7)Caiapó, (8) Mf788, (9)Mf210, (10)BR1, (11)A.
monticola, (12)Of106, (13)Of107, (14)Mf2534, (15)Mf3911, (16)Mf3618, (17) Mf2517,
(18)Mf2430, (19)Mf3764, (21)Mf3892, (21)Mf2681 (22)Mf2352, (23) Mf3207, (24) Mf1625,
(25) Mf3884.
Figura 13: Fragmentos gerados utilizando primers microssatélites Ah3TC42A05 e
Ah3TC27H12 respectivamente, amplificados a 58ºC e visualizados em gel de poliacrilamida.
(1) marcador de peso molecular 10 pb. Ordem das amostras (2) IAC5024, (3) Runner886 (4)
KG30076xV14167, (5)Tatu, (6)Mf574, (7)Caiapó, (8) Mf788, (9)Mf210, (10)BR1, (11)A.
monticola, (12)Of106, (13)Of107, (14)Mf2534, (15)Mf3911, (16)Mf3618, (17) Mf2517,
(18)Mf2430, (19)Mf3764, (21)Mf3892, (21)Mf2681 (22)Mf2352, (23) Mf3207, (24) Mf1625,
(25) Mf3884.
Figura 14: Fragmentos gerados utilizando primer microssatélites Ah3TC28A07
respectivamente, amplificados a 63ºC e visualizados em gel de poliacrilamida. O fragemnto
destacado pertence a uma amostra do anfidiplóide,KG30076xV14167 e bem a direita o
marcador de peso molecular 10 pb .
Figura 15: Relação entre valores de PIC e número de repetições. Eixo X: número de unidades
de repetições polimórficas (somatório de repetições compostas e imperfeitas). Eixo y: os
valores de PIC.
Figura 16: Dendrograma, obtido pelo método UPGMA, baseado nas distâncias de Rogers
(1978), entre os 22 acessos de A. hypogaea, um acesso de A. monticola e um de A. ipaënsis x
A. duranensis (Tabela 1). As letras após cada acesso representam: FF–fastigiata/fastigiata; FV–
fastigiata/vulgaris FA-fastigiata/aequatoriana; FP-fastigiata/peruviana; HH-
hypogaea/hypogaea; HHi- hypogaea/hirsuta; HX- hypogaea tipo Xingu e NI-acesso não
identificado quanto à subespécie e variedade.. (KG30076xV14167)
c
identifica a planta
anfidiplóide resultante do cruzamento
(A. ipaënsis x A. duranensis)
c
.
Figura 17: Matriz das distancia genéticas de Rogers modificado entre 22 acessos de A.
hypogaea, um acesso de A. monticola e um planta andidiplóide A. ipaënsis x A. duranensis. Os
números representam os acessos: 1. IAC5024_HH, 2. Runner886_HH, 3. K30076xV14167, 4.
Tatu_FF, 5. Mf574_HH, 6. Caiapó_HH, 7. Mf788_NI, 8. Mf210_FF, 9. BR1_FF, 10. A.
monticola (V14165), 11. Of106_HX, 12. Of107_HX, 13. Mf2534_HHi, 14. Mf3911_HHi, 15.
Mf3618_HHi,16. Mf2517_FP,17. Mf2517_FP, 18. Mf3764_FP, 19. Mf3892_FA, 20.
Mf2681_FV; 21. Mf2352_FA, 22. Mf3207_FV, 23. Mf1625_FV, 24. Mf3884_FA. As letras
após cada acesso representam: FF–fastigiata/fastigiata; FV–fastigiata/vulgaris FA-
fastigiata/aequatoriana; FP-fastigiata/peruviana; HH-hypogaea/hypogaea; HHi-
hypogaea/hirsuta; HX-hypogaea tipo Xingu e NI-acesso não identificado quanto à subespécie e
variedade.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Lista dos acessos de A. monticola e de A. hypogaea utilizados na análise da
variabilidade genética, representando as duas subespécies (hypogaea e fastigiata) e as seis
variedades descritas para o amendoim (hypogaea, hirsuta, fastigiata, vulgaris, aequatoriana e
peruviana).
Tabela 2: Relação dos contigs dos novos primers que têm similaridade com proteínas preditas
para Arabidopsis e leguminosas e o índice de similaridade (e value).
Tabela 3: Relação entre o número de primers polimórficos e o número total de primers, de
acordo com o número de repetições dos microssatélites para os três tipos observados:
composto, imperfeito e perfeito.
Tabela 4: Pares de primers, freqüência do alelo mais comum (f (a) >, número de genótipos (G),
amplitude de comprimento dos fragmentos, número total de alelos amplificados por loco (A),
diversidade gênica (DG) e conteúdo de informação polimórfica. (PIC) obtido para os 83
marcadores microssatélites polimórficos para A. hypogaea.
ANEXO
Anexo 1: Informações sobre os primers desenvolvidos, indicando o nome, o motivo repetitivo,
o tamanho do fragmento esperado, a seqüência dos primers, a classificação do microssatélite e
da presença ou ausência de polimorfismo (na última coluna o espaço em branco indica que o
primer não amplificou).
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1 Amendoim
1.1.1 Aspectos Botânicos Fisiológicos e Taxonômicos
1.1.2 Origem do amendoim
1.1.3 Melhoramento do amendoim
1.2 Marcadores Moleculares
1.2.1 Marcadores Microssatélites
1.2.2 Desenvolvimento e Caracterização de Microssatélites
1.2.3 Marcadores Microssatélites em Arachis
1.3 Mapeamento Genético e suas aplicações
1.3.1 Mapeamento Genético em Arachis
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
2.2 Objetivos Específicos
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amplificação da Biblioteca Genômica
3.2 Sequenciamento de DNA
3.3 Pré-Processamento das Sequências
3.4 Processamento das Sequências e Desenho de Primers
3.5 Validação e Caracterização dos Primers
3.6 Análise dos Dados
4. RESULTADOS
4.1 Amplificação da Biblioteca Genômica, Transformação e Sequenciamento
dos incertos
4.2 Análise das Sequências e Desenhos dos Primers
4.3 Caracterização das Regiões Repetitivas no Gênero Arachis
4.4 Polimorfismo das Regiões Repetitivas
4.5 Relações Genéticas entre Acessos de A. hypogaea
5. DISCUSSÃO
5.1 Eficiência da Metodologia Utilizada
5.2 Análise do Polimorfismo das regiões Repetitivas
5.3 Análise da Variabilidade Genética Encontrada
5.4 Perspectivas e Importância dos Novos Marcadores
6. CONCLUSÕES
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
8. ANEXO
17
17
18
20
23
25
27
29
31
32
34
37
37
37
38
38
38
39
40
41
43
44
44
44
46
47
54
57
57
59
60
62
64
65
90
17
1-INTRODUÇÃO
1.1 AMENDOIM (Arachis hypogaea)
O amendoim cultivado, Arachis hypogaea L., é um membro da família Leguminosae ou
Fabaceae, é a quinta oleaginosa mais produzida no mundo com cerca de 35 milhões de
toneladas por ano, ocupa uma área de mais de 23 milhões hectares é cultivado principalmente
na China (40%), Índia (20%), Estados Unidos (5,2%), Nigéria (4,84%) e Indonésia (3,9%)
(United States Department of Agriculture - USDA, 2009). O principal produto econômico é o
grão, cerca de 8 milhões de toneladas anuais de grãos de amendoim destinam-se ao consumo
como alimento e 15 a 18 milhões são utilizados para fabricação de óleo comestível (Companhia
Nacional de Abastecimento - CONAB, 2008).
Na alimentação humana, oferece alto valor calórico: cada 100 gramas fornecem 580
calorias, a semente é uma rica fonte de óleo, contendo de 36 a 54%, já de proteína cerca de 36%
e 10 a 20% de carboidratos (AHMED; YOUNG, 1982), bem como micronutrientes como
fósforo e magnésio e vitaminas como riboflavina, niacina, ácido fólico, vitaminas do complexo
B e vitamina E (BORDONI, 1975). A folha pode ser usada como forragem e a torta resultante
da extração do óleo é usada como ração animal. O amendoim fixa nitrogênio simbionticamento
o que exige pouco fertilizante o que facilita a melhoria da qualidade do solo em rotação com
outras culturas.
Na África, a fome e a desnutrição ameaçam a vida de cerca de 240 milhões de pessoas
(Food and Agriculture Organization of United Nations - FAO, 2003). O continente africano é
responsável por 19% da produção mundial de amendoim e aproximadamente 33% da área
cultivada (USDA, 2009). Além do grão, em diversos países da África, a pasta de amendoim,
chamada PlumpyNut, é utilizada no combate a desnutrição infantil (ENSERINK, 2008).
No Brasil o cultivo de amendoim é pequeno, representando aproximadamente 1,1% da
área cultivada e 0,78% da produção mundial (USDA, 2009). A previsão da área plantada para a
safra 2008/2009 está entre 115,4 e 115,6 mil hectares praticamente iguais à safra 2007/2008. A
estimativa de produção de amendoim total na safra 2008/2009 esta entre 295,6 e 296,2 mil
toneladas o que representa uma diminuição em relação à safra 2007/2008 que foi de 304,9 mil
toneladas (Companhia Nacional de Abastecimento – CONAB, 2008).
18
1.1.1- Aspectos botânicos, fisiológicos e taxonômicos.
A planta do amendoim é herbácea, podendo ser ereta ou prostrada, com altura da haste
variando entre 50 e 60 centímetros, com ciclo de 90 a 160 dias e produção anual. Desenvolve,
logo após a germinação, um ramo principal que se origina da gema apical do epicótilo, e dois
ramos laterais originados a partir das gemas axilares aos cotilédones. Apresenta raízes
pivotantes e laterais; as últimas se originam de diversas alturas da raiz principal, ramificando-se
durante os primeiros estágios de desenvolvimento e formando um extenso sistema radicular
(SHOKES; MELOUK, 1995). Na fase de preenchimento ativo dos grãos, as raízes reduzem
sensivelmente o crescimento (GREGORY; REDDY, 1982). As suas folhas são compostas
pinadas com dois pares de folíolos inseridos num pecíolo de quatro a nove centímetros, os
estômatos estão presentes nas duas superfícies. Sob condições normais e em condições de
deficiência hídrica os estômatos da superfície abaxial são mais sensíveis, respondendo mais
rapidamente a variações hídricas da planta (TÁVORA; MELO, 1991; NOGUEIRA et al., 2000).
O amendoim é uma planta essencialmente autógama e sua floração tem início entre 20 e
35 dias após o plantio, dependendo da variedade, da temperatura e da capacidade hídrica do
solo (PALLAS et al., 1979). As flores são em número de dois a seis, são completas,
hermafroditas e com corola papilionácea (Figura 1). Embora as flores estejam agrupadas em
inflorescências aéreas, os frutos e as sementes são produzidos abaixo do solo. Após a
fertilização, a região basal do ovário alonga-se formando o ginóforo ou também chamado
pendão ou peg, que apresenta geotropismo positivo (NOGUEIRA et al., 2005).
Figura 1 -A. hypogaea subsp. hypogaea var hirsuta
Fonte: CENARGEN-22/12/2008
19
A espécie A. hypogaea é classificada em duas subespécies (Figuras 2 e 3): A. hypogaea
subsp. fastigiata (ciclo curto e hábito ereto) e hypogaea (ciclo longo e hábito rasteiro) as
subespécies são divididas em seis variedades botânicas (Figura 4) – subespécie hypogaea:
hypogaea e hirsuta (apresenta vagens com nervuras bem marcadas, com saliência em uma das
extremidades em forma de bico de papagaio e três ou quatro sementes); subespécie fastigiata:
fastigiata (que possui três ou quatro sementes por vagem), vulgaris (apresenta duas sementes
por vagem), aequatoriana (é caracterizada por folíolos pilosos e vagens rugosas, contendo três
ou quatro sementes coloridas) e peruviana (apresentam vagens com reticulação acentuada e
nervuras longitudinais salientes) (KRAPOVICKAS; GREGORY, 1994). O amendoim também
é classificado agronomicamente em grupos: Valência (A. hypogaea subespécie fastigiata
variedade fastigiata); Spanish (A. hypogaea subespécie fastigiata variedade vulgaris) e Virgínia
(A. hypogaea subespécie hypogaea variedade hypogaea) que é rasteira com duas ou três
sementes por vagem (GODOY et al., 1999). As outras variedades não têm denominação
agronômica devido ao seu uso restrito).
Figura 2 - A. hypogaea subsp. fastigiata var. fastigiata
(ciclo curto)
Fonte: CENARGEN-22/12/2008-
Figura 3 - A. hypogaea subsp. hypogaea var. hypogaea
(ciclo longo)
Fonte: CENARGEN-22/12/2008.
20
Espécie Arachis hypogaea
Subespécies hypogaea fastigiata
Variedades hypogaea hirsuta fastigiata vulgaris aequatoriana peruviana
Figura 4 Subespécies e variedades da espécie Arachis hypogaea L. (KRAPOVICKAS; GREGORY, 1994).
No mundo há quatro grandes bancos de germoplasma de amendoim. A maior coleção é
constituída por 14.966 acessos de amendoim cultivado e 453 acessos de 44 espécies silvestres
de Arachis, e está alojado na International Crops Research Institute for o Semi-Árido Tropics
(ICRISAT), Patancheru, India. Outras grandes titulares são o USDA Southern Regional Plant,
Griffin, GA, E.U.A. (9.027 acessos), o Centro Nacional de Pesquisa de Amendoim, Junagadh,
Índia (7.935 acessos), e os nacionais Chineses (5.890 acessos). Coleções (c. 10% de toda a
coleção) germoplasma de grandes coleções foram criadas para uma maior facilidade de rastreio
(BUROW et.al., 2008).
Na Embrapa Recursos Genéticos o Banco Germoplasma apresenta em torno de 1000
acessos de espécies silvestres e 1000 acessos de A. hypogaea.
1.1.2- Origem do amendoim
O gênero Arachis é endêmico da América do Sul (KRAPOVICKAS; GREGORY,
1994). A espécie cultivada teve origem provavelmente no norte da Argentina ou na porção
oriental da Bolívia, havendo também a possibilidade de origem no oeste do Peru (SIMPSON et
al., 2001). Registros arqueológicos indicam que o amendoim foi domesticado pelos índios há
pelo menos 3.500 anos (SINGH; SIMPSON, 1994).
O gênero Arachis contém 80 espécies descritas, distribuídas, de acordo com a
caracterização morfológica, a distribuição geográfica e a capacidade de cruzamento entre as
espécies, em nove seções taxonômicas, que são: Arachis, Caulorrhizae, Erectoides,
Extranervosae, Heteranthae, Procumbentes, Rhizomatosae, Trierectoides e Triseminatae.
21
(KRAPOVICKAS; GREGORY, 1994; VALLS; SIMPSON, 2005). A seção Arachis, à qual
pertence o amendoim cultivado, possui a mais ampla distribuição geográfica, com 31 espécies
coletadas em cinco países; Brasil, Bolívia, Paraguai, Argentina e Uruguai (KRAPOVICKAS;
GREGORY, 1994; SINGH; SIMPSON, 1994; JARVIS et al., 2003). O Brasil é o país que
abriga o maior número de espécies, com representantes de todas as seções, sendo que 46 são
exclusivas do Brasil (KRAPOVICKAS; GREGORY, 1994).
As espécies da seção Arachis são geralmente diplóides com 2n=20 cromossomos e são
agrupadas em três genomas: A, B e D. O genoma A caracteriza-se por apresentar um par de
cromossomos com tamanho reduzido e que apresenta um menor nível de condensação da
eucromatina em relação aos demais cromossomos (HUSTED 1936; SEIJO et al., 2004). As
espécies que não apresentam o par de cromossomos reduzido são consideradas de genoma B. O
genoma D é encontrado em uma única espécie, A. glandulifera, e é constituído por 6 pares de
cromossomos subtelocêntricos (STALKER, 1991). Arachis hypogaea e A. monticola (Figura 5)
são alotetraplóides com 2n=4x=40, resultantes da hibridação entre espécies diplóides de
genomas A e B (LAVIA, 1996; 1998; PEÑALOZA; VALLS, 1997).
Figura 5: A. monticola
Fonte: CENARGEN-22/12/2008
O amendoim surgiu, provavelmente, a partir de uma única hibridização de duas espécies
diplóides, seguida de uma duplicação espontânea de cromossomos (HALWARD et al., 1991;
YOUNG et al., 1996). SEIJO et al. (2007), usando duplo GISH (“genomic in situ
hybridization”) testando entre as combinações possíveis de sete espécies com 2n=2x=20 que
têm sido propostas como progenitoras da espécie A. hypogaea, forneceram evidências sobre a
origem do amendoim e sobre os parentes silvestres envolvidos.
22
O estudo indica que A. duranensis (genoma A) e A. ipaënsis (genoma B) são as mais
prováveis espécies doadoras de genoma para o amendoim, já que produziram o mais uniforme e
intenso padrão de hibridização quando testados contra os cromossomos de A. hypogaea. Um
padrão de GISH semelhante foi observado para todas as variedades do amendoim cultivado e
também para a espécie tetraplóide A. monticola. Hibridização interespecífica e poliploidização
são forças evolutivas que agiram na evolução das plantas e que têm um papel importante na
origem de muitas culturas (HILU, 1993; SINGH, 2003).
Os resultados de Seijo e colaboradores (2007) sugeriram que todas as variedades e
subespécies de A. hypogaea conhecidas atualmente surgiram a partir de uma única população
alotetraplóide, ou a partir de diferentes populações alotetraplóides originadas das mesmas
espécies diplóides.
Apesar da existência de substancial diversidade entre genótipos de amendoim para
várias características morfológicas, fisiológicas e agronômicas, pouca variação tem sido
detectada quando se usam marcadores baseados em DNA, ou seja, o polimorfismo genético é
baixo (HALWARD et al., 1991; KOCHERT et al., 1991; PAIK-RO et al., 1992; HOPKINS et.
al., 1999: STALKER; MOZINGO, 2001; HE et al., 2003; 2005; MORETZSOHN et al., 2004;
2005).
O amendoim é provavelmente derivado de uma ou poucas plantas, o que levou a uma
reduzida variabilidade genética nesta espécie (MORETZSOHN, 2006), Acredita-se que essa
baixa variabilidade genética, em relação às espécies silvestres, seja devida também ao seu
isolamento reprodutivo em relação às espécies silvestres diplóides; a poliploidização recente; à
reprodução autógama e a pouca utilização de germoplasma exótico nos programas de
melhoramento. Esta baixa variabilidade tem dificultado o avanço no melhoramento molecular
do amendoim devido à dificuldade em se desenvolver marcadores polimórficos para esta
espécie (MORETZSOHN, 2006).
23
1.1.3- Melhoramento genético do amendoim
A maior parte da investigação genética no amendoim esta centrada na melhoria varietal.
A investigação de mecanismos de resistência ou tolerância a fatores bióticos e abióticos,
precocidade no ciclo dos cultivares, a qualidade da produção incluindo as vagens e os grãos são
atributos que podem compor em conjunto uma nova variedade de cultivar.
A obtenção de cultivares de A. hypogaea resistentes a pragas e doenças é um importante
objetivo dos programas de melhoramento do amendoim, visto que algumas doenças, como
mancha preta (Cercosporidium personatum), mancha castanha (Cercospora arachidicola)
(SOARES et. al., 1996) e pragas como tripes, Enneothrips flavens, (GABRIEL et al. 1998)
causam grandes prejuízos à cultura do amendoim. Os fungos Aspergillus flavus e A. parasiticus
Speare são de grande relevância, devido as micotoxinas (aflatoxinas) que produzem quando
estão associados a sementes de amendoim. Apesar das aflatoxinas não afetarem a produtividade
da cultura elas são mutagénicas, carcinogénicas, teratogénicas e altamente tóxicas para grande
número de animais, o que influencia significativamente a comercialização do amendoim, pois
aumenta os custos de processamento pós-colheita (GODOY et al., 2001).
Uma boa alternativa para superar esses problemas é o desenvolvimento de programas de
melhoramento que utilizem espécies silvestres, que são geneticamente mais diversas e ricas em
mecanismos de resistência aos agentes patogênicos que atacam a espécie cultivada
(HOLBROOK et al, 2000). Devido à diferença de ploidia, a introgressão de genes de espécies
silvestres no amendoim só é possível através de transformação genética ou de cruzamentos
complexos, um número de diferentes sistemas de cruzamento tem sido utilizado como forma de
superar esses obstáculos, e a melhor forma de se caracterizar espécies hexaplóides e tetraplóides
tem sido a síntese de anfidiplóides (SIMPSON, 1991).
A metodologia da síntese de anfidiplóides envolve o cruzamento de indivíduos com dois
genomas diferentes (A e B) e posterior tratamento com colchicina para a duplicação dos
cromossomos. Alguns anfidiplóides sintetizados com esta metodologia são sexualmente
compatíveis com o amendoim cultivado e tem potencial para introgressão de genes silvestres no
amendoim cultivado.
O melhoramento convencional, inclusive do amendoim, utiliza o conhecimento da
genética mendeliana, associada à genética quantitativa e a métodos estatísticos, mas é um
24
processo lento. A natureza poligênica das características de importância agronômica e a
interação entre genótipo e ambiente constituem um dos maiores desafios no melhoramento.
Marcadores moleculares têm sido utilizado na seleção assistida de amendoim
especialmente na procura de indivíduos resistentes em populações RILs de amendoim como,
por exemplo, o do estudo de Melouk e colaboradores (2008) que foi o primeiro a encontrar
marcadores moleculares associados a resistência a Sclerotina minor em amendoim, eles
utilizaram marcadores desenvolvidos por Ferguson e colaboradores (2004), e examinaram a
diversidade genética entre 39 genótipos selecionados que demonstraram resistência a Sclerotina
em diferentes níveis onde foram identificados 2 primers com tamanhos distintos consistentes
com a resistência a Sclerotina, logo são potenciais marcadores dessa característica.
Outro estudo que encontrou marcador molecular associado à resistência foi o de Chen e
colaboradores (2007) que encontraram um marcador dominante RAPD que se mostrou
confiável na predição da resistência do amendoim a Melogynea arenaria fato que pode acelerar
o desenvolvimento de populações resistentes a esse nematóide. A identificação de marcadores
moleculares associados a resistência abrem a perspectiva de que, uma vez identificados os genes
de resistência em Arachis, estes possam ser transferidos para outras espécies, especialmente
leguminosas como soja, feijão (Phaseolus vulgaris L.) e ervilha (Pisum sativum L.), e que estes
se mantenham ativos (LEAL-BERTIOLI et al., 2005). A identificação de genes associados a
resistência em outras espécies também abrem a perspectiva de que esses possam ter homólogos
em Arachis, um estudo realizado por Chen e colaboradores (2009) identificou fragmentos de
sequências gênicas em amendoim com significativa homologia com sequências candidatas a
resistência a tripe em tomate.
25
1.2. - MARCADORES MOLECULARES
A tecnologia de marcadores de DNA permitiu que um grande número de marcadores
pudesse ser gerado e associado a características agronômicas relevantes, desde então os
marcadores moleculares têm-se mostrado eficientes na caracterização genética. O
desenvolvimento de marcadores de DNA também proporcionou um grande impulso para a
determinação da variabilidade genética dentro e entre espécies de um mesmo gênero,
determinação da conservação e ordem de genes em espécies de gêneros diferentes e em estudos
genômicos elaborados, como a identificação de genes específicos (PELEMAN; VOORT, 2003).
O primeiro tipo de marcador molecular, que permitiu detectar as diferenças entre os
indivíduos, diretamente no DNA foi o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism;
GRODZICKER, 1975) surgido após a descoberta das enzimas de restrição por Linn e Arber
(1968) e Meselson e Yuan (1968). As variações detectadas por essa técnica entre indivíduos
geneticamente distintos, decorrem da criação ou eliminação de sítios de restrição, devido à
substituição ou modificação de bases (mutações) ou ainda, devido a rearranjos dos segmentos
de DNA (WYMAN; WHITE, 1980). O procedimento para a obtenção de RFLP envolve várias
etapas.
Com o surgimento da técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction; MULLINS;
FALOONA, 1987), aliou-se o poder de informação gerada por marcadores moleculares e a
rapidez da técnica baseada em ciclos contínuos de desnaturação e amplificação das fitas de
DNA, mediados pela enzima DNA polimerase em pontos específicos do genoma, determinados
pelo anelamento de Primers (sequências de nucleotídeos pequenas, variando de 10 a 30 bases)
de sequências complementares a estes pontos. Várias técnicas utilizam o princípio da técnica de
PCR.
Os marcadores RAPD (Random Amplied Polymorphic DNA; WILLIAMS et al., 1990),
são gerados pela amplificação de segmentos espalhados no genoma com o uso de primers
únicos de seqüência arbitrária. Esses primers, com tamanho de aproximadamente 10
nucleotídeos ligam-se a seqüências complementares no genoma, permitindo que, assim, haja
amplificação de segmentos compreendidos entre esses. Os produtos de amplificação gerados
podem ser separados por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida e corados com
brometo de etídium ou prata. Os marcadores RAPD são, geralmente, dominantes, com o
polimorfismo verificado pela presença ou ausência de um determinado fragmento.
26
Os marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; VOS; ZABEAU,
1995) com polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados são baseados na
amplificação seletiva, pela técnica de PCR, de fragmentos de DNA pré-digeridos com duas
enzimas de restrição específicas, uma de corte raro e outra de corte freqüente, no genoma. Em
cada reação de amplificação são gerados múltiplos fragmentos de DNA, distribuídos
aleatoriamente no genoma. Estes fragmentos gerados são visualizados em gel de poliacrilamida
desnaturante. O polimorfismo é verificado pela amplificação ou não de determinado segmento
do genoma, tratando-se, portanto, de um marcador do tipo dominante, embora, em alguns casos
seja possível identificar o heterozigoto pela intensidade das bandas (ABDELNOOR;
ALMEIDA, 1999).
Os marcadores microssatélites ou SSRs (Single Sequence Repeat) são sequências de
nucleotídeos que se repetem em série, sendo tradicionalmente definidos como arranjos
formados pela combinação de duas a seis bases (MORGANTE e OLIVIERI, 1993).
Há marcadores baseados em outras técnicas como ade hibridização por arranjos presente
nos marcadores DArT (Diversity Arrays Technology, JACCOUD et al., 2001) são baseados na
técnica de hibridização por microarranjo DArT. Essa técnica permite a observação simult
ânea de várias centenas de locos polimórficos espalhados pelo genoma e apresentam
potencial para estudos de diversidade genética e de mapeamento, demonstra alta informação de
polimorfismos e revela relações genéticas consistentes entre amostras. Para cada amostra de
DNA individual que é estudada, são desenvolvidas representações genômicas através da
digestão do DNA genômico com enzimas de restrição e posterior ligação de adaptadores aos
fragmentos digeridos, amplificados e os fragmentos são clonados. Os insertos clonados são
novamente amplificados, purificados e arranjados em um suporte sólido (microarranjo),
resultando em um “discovery array”. Representações genômicas preparadas a partir de
genomas individuais alvos de estudo são hibridizados a esse “discovery array” para
identificação de polimorfismos. Os clones polimórficos (marcadores DArT) mostram
intensidade de sinais de hibridização variáveis para diferentes indivíduos conforme os
diferentes genótipos (SEMAGN et al., 2006)
27
1.2.1- Marcadores microssatélites
Os microssatélites, marcadores desenvolvidos nesse esse estudo, são sequências de
nucleotídeos que se repetem em série, sendo tradicionalmente definidos como arranjos
formados pela combinação de duas a seis bases (MORGANTE; OLIVIERI, 1993). Estas
sequências podem ser encontradas abundantemente em genomas de eucariotos, em regiões
codificadoras (exons transcritos e traduzidos), UTRs (exons transcritos e não traduzidos) ou
ainda, em regiões de introns (sequências transcritas, mas rastreadas por processamento antes da
tradução). Os microssatélites têm alta taxa de polimorfismo, têm ampla utilização, que inclui o
mapeamento genético, análise genética de populações, análises filogenéticas (GOLDSTEIN et
al., 1999), porém mais recentemente, a dinâmica mutacional dos microssatélites ganhou um
interesse crescente, uma vez que eles desempenham um importante papel nas doenças
(PEARSON et al., 2005) genéticas humanas e podem participar na regulação da expressão de
genes (MOXON; WILLS, 1999; KASHI; KING, 2006).
Modelos da dinâmica mutacional dos microssatélites são necessários quando os dados
de frequência alélica entre dois grupos de indivíduos estão sendo utilizados para estimar a
distância genética entre eles. A maioria dos modelos deriva do processo de mutação decorrente
do deslizamento ou escorregamento (slippage OHTA; KIMURA, 1973). O modelo postula que
uma mutação altera o comprimento de uma região repetitiva por meio de inserções ou deleções
de uma unidade repetitiva a uma taxa fixa (GOLDSTEIN; SCHLOTTERER, 2001). No entanto,
muitos organismos têm a taxa de mutação superior a esse valor. Outro modelo postula que duas
forças opostas que geram mutações agem em conjunto que são as mutações pontuais e as de
comprimento (BELL; JURKA, 1997). A estimativa para a taxa de mutação para os
microssatélites varia entre 10
-4
e 10
-5
mutações por locu de microssatélites (GOLDSTEIN;
SCHLOTTERER, 2001).
Os microssatélites são classificados de acordo com o tipo de sequência repetida,
podendo ser perfeitos, imperfeitos ou compostos. Em um microssatélite perfeito, a sequência
repetida não é interrompida por bases que não pertençam ao motivo (ex:
TCTCTCTCTCTCTC), enquanto que em um microssatélite imperfeito há uma ou poucas bases
entre os motivos repetidos que não correspondam a sequência motivo
(ex:TCTCTCTCAGTCTCTCTC). No caso de microssatélite composto são encontradas duas
sequências adjacentes distintivas que estão repetidas (TCTCTCTCTCTCGAGAGAGAGAGA).
Os locos de microssatélites homozigotos têm o mesmo número de repetições em cromossomos
28
homólogos, enquanto que em locos heterozigoto têm um número diferente de repetições para
cada alelo (ex: um alelo tem dez, outro onze repetições), sendo que, na população geralmente
podem existir vários alelos, com número de repetições diferentes, para um mesmo loco
(OLIVEIRA et. al., 2006).
As classes de frequência e a distribuição dos microssatélites variam entre os grupos de
organismos. O genoma humano tem como dinucleotídeo mais abundante o CA/GT
(BECKMANN; WEBER, 1992). Em plantas os dinucleotídeos mais comuns são AT/TA,
seguidos por AG/TC, e o menos comum CA/GT (LAGERCRANTZ et al, 2002). No entanto os
dinucleotídeos mais utilizados em estudos genéticos de plantas são os AG/TC, pois os
dinucleotídeos AT/TA são também instáveis em condições de PCR.
Morgante e colaboradores (2002) reportaram em algumas espécies de plantas, incluindo
Arabidopsi, arroz, soja, milho e trigo que, com exceção dos motivos de trinucleotídeos e
tetranucleotídeos, todos os demais tipos de motivos de microssatélites são significativamente
menos frequentes em sequências codificantes comparada a regiões não codificantes do genoma.
Isso pode ser atribuído à seleção negativa sobre mutações em regiões codificantes (METZGAR
et al., 2000).
Os microssatélites têm sido utilizados para ajudar na classificação e identificação de
diferentes espécies (LAWSON; ZHANG, 2006) e, nos últimos anos, têm atraído a atenção por
sua ampla utilização na construção de mapas genéticos de vários tipos de organismos (KNAPIK
et al., 1998, GUPTA;VARSHNEY, 2000; GONG et al., 2008, VARSHNEY et al., 2009). Os
microssatélites são uma ferramenta poderosa para a investigação sobre os animais
(SCHLÖTTERER et al., 1991) e plantas (DAYANANDAN et al., 1997; WHITE; POWELL,
1997; STEINKELLNER et al., 1997; CIPRIANI et al., 1999; ROA et al., 2000; COLLEVATTI
et al., 2001).
A utilização dos microssatélites apresenta várias vantagens quando comparada a outros
marcadores moleculares. Marcadores microssatélites são multialélicos, altamente polimórficos e
codominantes, permitindo distinção entre indivíduos homozigotos e heterozigotos. São
frequentemente conservados entre espécies relacionadas, podendo ser transferidos dentro de
espécies do mesmo gênero ou de gêneros similares filogenicamente. Além disso, não requerem
radioatividade, são detectáveis via PCR necessitando de pouco DNA, facilmente
compartilhados entre diferentes laboratórios, apresentam ampla e aleatória distribuição no
29
genoma (GOLDSTEIN; SCHLOTTERER, 2001). Todas essas características fazem desse
marcador uma ferramenta eficiente para mapeamento genético, estudos de ligação, identificação
de genótipos, proteção de variedades, avaliação de pureza de sementes, utilização e conservação
de germoplasma (HUANG et. al., 2002), estudos de diversidade, análise gênica de locos que
controlam características quantitativas (QTL), uso em seleção assistida por marcadores e estudo
de genética de populações (FREGENE et al., 2003; AZEVEDO et al.,2005; BLAIR et al.,
2005).
A grande limitação dos microssatélites é a necessidade de serem isolados e
desenvolvidos especificamente para cada espécie. Além disso, o desenvolvimento desses
marcadores é um processo demorado, relativamente trabalhoso e de alto custo. Outra restrição
descrita foi seu uso em estudos de evolução, conservação genética de populações, pois como os
microssatélites são marcadores com alta taxa de mutação, sua utilização em estudos evolutivos
pode não corresponder à verdade biológica da população estudada (HEDRICK et. al.,1999).
1.2.2-Desenvolvimento e caracterização de microssatélites
Há várias estratégias para obtenção de microssatélites, tradicionalmente os
microssatélites são isolados a partir da construção de bibliotecas genômicas de uma espécie de
interesse que envolve fragmentação do DNA genômico de alta qualidade, seleção dos
fragmentos conforme o tamanho e ligação dos fragmentos ao plasmídio vetor. No próximo
passo células bacterianas são transformadas e multiplicadas e selecionadas aquelas que
apresentam sequências de microssatélites (RAFALSKY et al.,1996; MAGUIRE et al.,2000). Os
insertos das colônias positivas são sequenciados e analisados para confirmação da presença de
microssatélites. Primers são desenhados flanqueando os microssatélites com ajuda de programas
computacionais. A principal limitação dessa técnica é a baixa frequência de clones contendo
repetições de microssatélites, número este que varia de 12% a menos de 0,04% do total de
clones de DNA genômico randômico analisados (ZANE et al., 2002).
Para superar esta limitação, foi proposto o enriquecimento de biblioteca genômica com
sequências contendo microssatélites (OSTRANDER et al., 1992, PAETKAU, 1999). A
biblioteca é construída e os fragmentos de DNA são hibridizados aos oligonucleotídeos de
interesse. Após a ligação os fragmentos enriquecidos são amplificados por PCR utilizando
primers complementares aos adaptadores. Os fragmentos selecionados são ligados ao plasmídio
30
e transformados em células competentes E.coli. As bactérias portadoras dos fragmentos de
DNA com SSRs podem ser detectadas por hibridização, PCR ou sequenciamento. Primers são
desenhados flanqueando os microssatélites normalmente com ajuda de programas
computacionais.
A busca de sequências em bancos de dados é uma estratégia para a obtenção de
microssatélites que se tornou mais produtiva recentemente com a deposição de maiores números
de sequências em bancos de dados (VARSHNEY et al., 2005). Hoje há vários marcadores
desenvolvidos e caracterizados com esta estratégia, inclusive para o gênero Arachis (ex.
MORETZSOHN et al., 2005).
Uma vez identificados, os primers que flanqueiam microssatélites precisam ser testados
em PCR e caracterizados em acessos da espécie estudada. Há vários sistemas de genotipagem
de microssatélites, dentre eles encontramos os que utilizam géis de poliacrilamida com
revelação em nitrato de prata, que é um método viável pelo baixo custo da PCR e, apesar de ser
trabalhoso a genotipagem é eficiente.
A análise conduzida em sistemas automáticos de detecção, como o sequenciador
automático (AB 3700), e semi-automático (por exemplo, ABI377) de DNA possibilitam uma
precisão à análise genética onde há uma ampla variabilidade alélica esperada permitindo uma
análise de um maior número de lócus microssatélites simultaneamente, o que reduz o tempo
necessário para genotipagem de um grande número de indivíduos. Outra vantagem é a obtenção
de dados mais precisos (resultantes da adição de um marcador; um fluorocromo, para cada
amostra genotipada), e uma maior agilidade no processamento dos dados já que há transferência
direta dos dados gerados para determinação de parâmetros genéticos para o computador
(BRONDANI, 2001).
Oetting e colaboradores (1995) propuseram uma estratégia de PCR para reduzir os
custos de genotipagem dos microssatélites marcados com fluorescência. Esta técnica foi
chamada de multiplexagem com ‘tailed’ iniciadores e utiliza três iniciadores: um “forward
primer” específico com uma seqüência M13 de 18 bases no seu terminal 5’ (tail), um iniciador
“reverse” específico e um iniciador universal M13 marcado com fluorescência. Essa estratégia
baseia-se na detecção de fluorescência, devido à adição de uma sequência, que não tem
homologia com o genoma estudado, à região 5’ de um dos iniciadores. Este iniciador com cauda
possibilita a amplificação de uma sequência complementar ao iniciador fluorescente universal,
31
e, que pode ser detectado por sequenciadores automáticos. Missiagglia e Grattapaglia (2006)
ampliaram as metodologias ‘tailed’, propondo a utilização simultânea de três diferentes
iniciadores universais contendo sequências que amplificam microssatélites humanos, para
genotipagem em espécies vegetais.
1.2.3 - Marcadores microssatélites em Arachis
Nos últimos anos aproximadamente 900 microssatélites foram publicados para
amendoim (CUC et. al., 2008; PROITE et al., 2007; GIMENES et. al., 2007; MORETZSOHN
et al ., 2005;2004; HE et al. 2005;2003; FERGUSON et al., 2004b HOPKINS et al., 1999).
No estudo de He e colaboradores (2003) 56 marcadores microssatélites, desenvolvidos a
partir de uma biblioteca genômica enriquecida, foram avaliados em 24 genótipos que
representam as seis variedades botânicas do amendoim cultivado e só 12 mostraram-se
polimórficos.
No estudo realizado por Moretzsohn e colaboradores (2005), os 271 marcadores
microssatélites foram avaliados para detecção de polimorfismo em amostras das seis variedades
botânicas de amendoim cultivado, A. hypogaea, e em um acesso de A. stenosperma e um de A.
duranensis. Foi encontrado polimorfismo maior entre os dois acessos de espécies diferentes do
que o encontrado para as seis amostras de amendoim cultivado.
Em 2008 em um estudo de Cuc e colaboradores (2008), dos 104 pares de primers
desenvolvidos e amplificados 46 mostraram polimorfismo quando testados em 32 genótipos que
representam as seis variedades botânicas do amendoim cultivado.
Os últimos resultados de estudos com microssatélites para amendoim mostraram ainda
que novas iniciativas de desenvolvimento de marcadores microssatélites para A. hypogaea
devem ser baseadas em bibliotecas genômicas enriquecidas, preferencialmente de
dinucleotídeos, em especial, de TC/AG, com números de repetições superiores a 15 para
aumentar a probabilidade de identificação de marcadores polimórficos (CUC et. al., 2008;
MORETZSOHN et. al., 2005; FERGUSON et al., 2004b).
32
1.3. - MAPEAMENTO GENÉTICO E SUAS APLICAÇÕES
Uma importante aplicação dos microssatélites é a utilização para construção de mapas
genéticos, propiciando o estudo de locus que contribuem para a variação de características de
interesse agronômico. A maioria das características de importância agronômica resulta da ação
conjunta de vários genes (ALLARD, 1999), ou seja, são poligênicas, quantitativas ou de
herança complexa, e os locos que as controlam são chamados de QTLs (Quantitative Trait Loci,
TANKSLEY, 1993).
A ligação entre um marcador genético e um QTL foi primeiramente demonstrada por
Sax (1923). No entanto, os fundamentos da teoria do mapeamento de QTLs foram entendidos a
partir do trabalho de Thoday (1961). Esse autor sugeriu que se um oligogene (herança
complexa) estiver ligado a um monogene (herança simples), os efeitos fenotípicos do oligogene
podem ser indiretamente estudados com base nos efeitos do gene vizinho. Com os marcadores
moleculares, o número de associações entre esses marcadores e caracteres de herança oligênica
de importância econômica foi ampliado significativamente. Um grande número de marcadores
distribuídos pelo genoma permite uma amostragem mais completa na busca de ligação gênica
com locos de interesse (TANKSLEY, 1993).
O mapeamento de QTLs possibilita mensurar o número de locos quantitativos
envolvidos na herança complexa, bem como suas localizações cromossômicas, modo de ação
gênica (aditividade, dominância, heterose e epistasia), além de possibilitar a decomposição da
interação genótipos por ambientes no nível de cada QTL (FERREIRA; GRATTAPAGLIA,
1996; AUSTIN; LEE, 1998). A capacidade de detecção de um QTL é função da magnitude do
seu efeito sobre a característica, do tamanho da população segregante avaliada, da frequência de
recombinação entre o marcador e o QTL, bem como da herdabilidade da característica
(PATERSON et al., 1990; TANKSLEY, 1993).
Uma utilização do mapeamento no melhoramento é a Seleção Assistida por Marcadores
(SAM). Ela utiliza simultaneamente dados fenotípicos e dados de marcadores moleculares em
ligação gênica próximos a locos controladores de características, sejam elas quantitativas ou
monogênicas (DEKKERS, 2004). A sua utilização é importante quando a característica de
interesse é de avaliação difícil, cara, apresenta baixa herdabilidade, o que pode significar
redução no tempo e nos custos de programas de melhoramento. A utilização de SAM requer a
33
seleção de progenitores, identificação e seleção de marcadores em desequilíbrio de ligação e
avaliação fenotípica. A SAM requer marcadores fortemente ligados aos genes de interesse,
codominantes e dispersos por todo o genoma. Outro requisito é que as técnicas devem ser de
baixo custo e reproduzíveis em laboratório (MOHAN et al., 1997). Uma dificuldade encontrada
na execução de SAM é que se devem ter marcadores disponíveis em especial porque as
informações sobre programas de melhoramento de empresas privadas, que são hoje,
possivelmente, as principais executoras da SAM, não estão disponíveis (MILLACH, 1998). No
entanto, alguns exemplos de SAM têm sido descritos (TANKSLEY et al., 1997; CHU et al.,
2007; CHENAULT et a., 2008).
Outra importante utilização dos mapas é o mapeamento comparativo ou análise de
sintenia. A comparação das estruturas genômicas de diferentes espécies, do ponto de vista de
homologia de genes, conservação de distâncias e da ordem de ligação nos cromossomos
contribui para o entendimento sobre a evolução dos genomas (TANKSLEY et al., 1988;
TANKSLEY, 1993; KELLER; FEUILLET, 2000). O mapeamento comparativo é também
estratégia para obtenção de mapa único de referência para a maioria das espécies vegetais
cultivadas (SEWELL et al., 1999, BERTIOLI et al., 2009).
A clonagem de genes com base em mapas genéticos (map-based cloning e positional
cloning), constitui-se uma das aplicações de mapas genéticos (CARNEIRO; VIEIRA 2002).
Nessa abordagem, o efeito fenotípico do gene é verificado anteriormente avaliando-se a
característica de interesse na progênie, e sua posição cromossômica aproximada é determinada
pelo mapeamento. Esse mapeamento detalhado, de alta resolução, consiste em identificar
marcadores próximos a um gene, sendo essa resolução dependente do número de marcadores e
da disponibilidade de grande número de indivíduos na progênie, o que aumenta a probabilidade
de se encontrar eventos de recombinação no segmento de interesse (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1996; LIU, 1998).
34
1.3.1- Mapeamento genético em Arachis
Mapas de ligação baseados em diferentes tipos de marcadores moleculares têm sido
construídos para as mais diversas espécies de plantas (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1996).
No entanto, poucos mapas genéticos foram publicados para o gênero Arachis. Um dos primeiros
utilizou uma população de 87 indivíduos F
2
(geração filial 2) derivada de um cruzamento entre
duas espécies silvestres diplóides com genoma A, A. stenosperma e A. cardenasii (HALWARD
et al.,1993) para a qual foi desenvolvido um mapa baseado em marcadores RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism). Foram mapeados 117 locos em 11 grupos de ligação, com
uma distância de mapa total de 1063 cM (centiMorgan) e uma distância média de 9,08 cM.
Garcia e colaboradores (1995), com base neste mapa, utilizaram marcadores RFLP dispersos
pelos 11 grupos de ligação, junto a marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
não mapeados, para a análise de linhas de introgressão tetraplóides, resultantes de um
cruzamento entre A. hypogaea (AABB) e A. cardenasii (genoma A). Os autores detectaram
regiões cromossômicas introgredidas em espécie silvestre diplóide no amendoim cultivado. Esta
introgressão mostrou que recombinação, e não substituição cromossômica era o mecanismo de
introgressão, o que é um resultado importante para o uso de espécies silvestres de Arachis nos
programas de melhoramento do amendoim (MORETZSOHN, et al., 2005). Populações
anfidiplóides sintéticas têm sido usadas para a construção de mapas genéticos devido à baixa
variabilidade genética do amendoim cultivado (DWIVEDI et al., 2006). Dessa forma, uma
planta anfidiplóide sintética, obtida pelo cruzamento de A. batizocoi x (A. cardenasii x A.
diogoi) com posterior duplicação de cromossomos com colchicina, foi utilizada como parental
doador em um cruzamento com A. hypogaea, o que gerou uma população RC
1
de 78 indivíduos,
que foi utilizada para a construção de um mapa de ligação (BUROW et al., 2001). A. cardenasii
e A. diogoi possuem genoma A, enquanto A. batizocoi possui genoma B. Esse mapa consistiu de
370 marcadores RFLP, mapeados em 23 grupos de ligação, com uma distância total de 2210 cM
e uma densidade média de 5,97 cM. Esse foi o primeiro mapa tetraplóide publicado para
Arachis.
O primeiro mapa baseado em microssatélites publicado para Arachis foi a partir de uma
população F
2
que foi construída por autopolinização de uma única planta F
1
, derivada do
cruzamento entre A. duranensis usado como progenitor feminino e A. stenosperma usado como
progenitor masculino (MORETZSOHN, et. al., 2005). Estas espécies foram escolhidas por
possuírem genomas relacionados ao do amendoim (KOCHERT et al., 1996), apresentarem alta
35
capacidade de cruzamento (KRAPOVICKAS; GREGORY, 1994), serem molecularmente
contrastantes (MORETZSOHN et al., 2004) e, por serem segregantes para resistência a
nematóides e fungos de parte aérea (LEAL-BERTIOLI et al., 2000).
Recentemente, um mapa baseado em microssatélites foi produzido para o amendoim
cultivado onde 1145 marcadores foram testados para genotipagem de 318 RILs (Linhagens
Recombinantes de Melhoramento), e só 150 amplificaram. O referido estudo ressalta a
importância do desenvolvimento em massa de marcadores microssatélites polimórficos e da
construção de outros mapas para amendoim cultivado (VARSHNEY et al., 2009).
A disponibilidade de mapas genéticos baseados em microssatélites representa um
considerável aumento da capacidade de mapear genes úteis e consequentemente de
implementar a seleção assistida por marcadores nos programas de melhoramento do amendoim.
Essa vantagem torna-se mais evidente já que poucos estudos de mapeamento de genes
individuais ou de QTLs foram publicados em Arachis. Garcia e colaboradores (1996)
identificaram dois genes dominantes, que conferiam resistência ao nematóide-das-galhas
(Meloidogyne arenaria raça 1), usando uma população F
2
tetraplóide, derivada de um
cruzamento entre A. hypogaea e A. cardenasii (tratada com colchicina). Também para
mapeamento de genes de resistência a nematóides, uma população de retrocruzamento (BC
4
F
2
)
entre uma planta anfidiplóide A. hypogaea (TxAG-6) (SIMPSON; STARR, 2001) foi utilizada,
junto à técnica de BSA (BUROW et al., 1996). Três marcadores RAPD foram identificados
ligados a um único gene dominante (RKN – para Root-knot nematode), que confere resistência
a M. arenaria, estando o mais próximo a 5,4 cM desse gene (CHOI et al., 1999). Os dois
marcadores RFLP mais próximos a esse gene de resistência foram utilizados, posteriormente,
na seleção assistida do amendoim (CHURCH et al., 2000). O primeiro relato de marcadores
moleculares associados a genes de resistência em um cruzamento intraespecífico de A.
hypogaea foi o estabelecido por Stalker e Mozingo em 2001. Eles identificaram marcadores
RAPD que explicavam cerca de 35% da variação para resistência à mancha castanha
(Cercospora arachidicola) em uma população de amendoim que tinha A. cardenasii em seu
“pedigree” e 10% da variação em um cruzamento de A. hypogaea x A. hypogaea.
Marcadores AFLP, em conjunto com BSA (Bulked Segregant Analysis), foram também
utilizados para o mapeamento de genes de resistência a um afídeo, vetor do vírus da roseta, que
é a principal doença do amendoim causada por vírus na África do Sul (HERSELMAN et al.,
2004). Foi utilizada uma população segregante F
2
, resultante do cruzamento entre dois acessos
36
de A. hypogaea. Um marcador foi mapeado a 3,9 cM de um único gene recessivo, que
explicava 76,1% da variação para resistência ao afídeo. Leal-Bertioli e colaboradores em 2009
identificaram marcadores com homologia a genes de resistência ligados a QTLs para
resistência à mancha preta, causada por Cercosporidium. personatum. Atualmente com a
obtenção crescente de marcadores moleculares polimórficos associados à caracterização
fenotípica de variedades do amendoim e a obtenção de populações RILs tem-se a perspectiva
de se utilizar a seleção assistida por marcadores em variedades do amendoim.
37
2- OBJETIVOS
2.1 – OBJETIVO GERAL:
• Desenvolver e caracterizar novos microssatélites para análise genética em
amendoim.
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Desenvolver marcadores microssatélites para o amendoim, a partir de uma
biblioteca genômica enriquecida para dinucleotídeos TC/AG.
• Caracterizar os novos marcadores microssatélites em um grupo de acessos
de A. hypogaea.
• Analisar as relações genéticas entre acessos de A. hypogaea, representando
as seis variedades conhecidas de amendoim.
38
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - AMPLIFICAÇÃO DA BIBLIOTECA GENÔMICA E
TRANSFORMAÇÃO
Uma biblioteca de DNA genômico enriquecida para dinucleotídeos TC/AG, com
fragmentos de 200 a 600, bases ligados a adaptadores Sau 3AI foi utilizada (LEOI, 2003). Esta
fração enriquecida foi amplificada por PCR usando o adaptador curto de Sau 3AI como
iniciador. Os produtos de PCR foram separados/observados em gel de agarose 2% e purificados
com o sistema de purificação QIAquick PCR Purification System (Qiagen, CA, EUA) e ligados
em plasmídeos pGEM-T Easy (Promega, Vector System 1, EUA) conforme as recomendações
do fabricante. Os plasmídeos foram transformados em Escherichia coli, cepa XL1-Blue
(Promega, WI, EUA) por eletroporação. As células transformadas foram plaqueadas em meio
sólido LB (com 50 μg/mL de ampicilina/mL), contendo 40 μL de X-Gal e 24μL de IPTG e
incubadas a 37
o
C por 12 horas. Após este período, as placas foram levadas à geladeira por 3
horas, para identificação dos clones positivos (colônias brancas). A eficiência da transformação
foi calculada por meio do quociente de colônias brancas sobre o total de colônias brancas e
azuis presentes. As colônias brancas isoladas foram coletadas e distribuídas numa placa com
fundo em U de 96 poços, contendo 100μL de meio LB líquido com amplicilina (50 μg/mL de
ampicilina/mL) e incubadas por 12 horas a 37ºC sob agitação.
3.2 SEQUENCIAMENTO DE DNA
Para o sequenciamento, o DNA foi obtido por PCR ou por lise alcalina (SAMBROOK et
al., 1989). Os clones positivos identificados e crescidos em meio LB líquido foram diluídos em
80μL de água milli-Q autoclavada e expostos a 95ºC por 5 minutos. Estes foram amplificados
por PCR, usando primers em sentido direto (forward) e reverso (reverse) de T7 e SP6,
respectivamente, ou de M13. Os iniciadores são complementares a sequências do vetor. As
reações constituíram de um volume final de 10μL e foram utilizados 2 ng de DNA plasmidial,
1x de tampão de PCR (10 mM Tris-HCl, pH 8,3 e 50 mM KCl), 2 mM de MgCl
2
, 0,2 mM de
cada dNTP, 0,2 mg x mL
-1
de BSA, 0,2 μM de cada iniciador, 1 U de Taq DNA polimerase e
água ultrapura estéril. Foi utilizado o seguinte programa: 94ºC por 5 min, 30 ciclos a 94°C por
39
1 min, 62ºC por 1 min e 72ºC por 1 min e uma extensão final a 72ºC por 10 min. Dois μL da
reação foram observados em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio (1 mg/mL).
Para remoção do excesso de primers e dNTPs não incorporados para reações de
sequenciamento, os produtos de PCR foram purificados com exonuclease I e SAP (0,25 U de
cada enzima em 5 μL de reação), por 1 hora a 37ºC. Após esse tempo, a atividade enzimática
foi neutralizada a 80ºC por 30 min. As reações de sequenciamento foram realizadas com o kit
BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems) e os primers citados acima. Foram utilizadas
reações de 10 μL, contendo 20 ng de DNA (produto de PCR), 1,6 μM de iniciador "forward" ou
“reverse", 2 μL da solução pré-mix do kit de sequenciamento, 2 μL de tampão "save money"
(Tris-HCl 0,2 mM; MgCl
2
5 mM) e água ultrapura. A reação de sequenciamento foi realizada
de acordo com o programa: 94ºC por 2 min, 30 ciclos a 94ºC por 10 s, 50ºC por 10 s e 60ºC por
4 min. O protocolo de purificação da reação de sequenciamento utilizado foi de precipitação
por Etanol/ EDTA, proposto pelo fabricante (Applied Biosystems BigDye terminator v3.1). A
eletroforese das amostras foi realizada em sequenciador automático de DNA ABI 3700
(Applied Biosystems).
3.3 - PRÉ-PROCESSAMENTO DAS SEQUÊNCIAS
As sequências obtidas foram processadas e analisadas utilizando-se o módulo
desenvolvido por Martins e colaboradores (2006), que é baseado no programa Staden Package
(STADEN et al., 2003). A ferramenta “Pregap4” foi utilizada para o pré-processamento das
amostras, que consistiu do controle da qualidade das sequências, conversão de formatos,
estimativa de qualidade de cada base e busca de microssatélites, utilizando os módulos (Figura
6):
PHRED e QUALITY CLIP que calcula o valor de Phred para cada base e excluiu da
análise as regiões com valores inferiores a 15. SEQUENCING VECTOR CLIP que corta as
seqüências do vetor e dos adaptadores. CROSS_MATCH que é também utilizada para corte da
seqüência do vetor e adaptadores, usando a base de dados UNIVEC BLAST SCREEN uma
busca de similaridade é feita contra todos os microssatélites descritos onde foram considerados
os e.valores iguais ou abaixo de 1x 10
-35
.
TROLL: identificou as seqüências contendo microssatélites com mais de 6 repetições de
di, tri, tetra, penta ou hexanucleotídeos.
40
Figura 6: A ferramenta “Pregap4” do programa Staden Package (Staden et al., 2003) com os módulos.
Após o pré-processamento, todas as colônias com microssatélites foram seqüenciadas no
sentido oposto, sendo processadas da mesma forma.
As sequências únicas foram avaliadas quanto ao conteúdo gênico na busca de sequências
que tenham similaridades com proteínas preditas para Arabidopsis e leguminosas.
3.4 - PROCESSAMENTO DAS SEQUÊNCIAS E DESENHO DOS PRIMERS
As sequências pré-processadas foram alinhadas (assebled) utilizando a ferramenta GAP
4, com os parâmetros padrões do programa e aplicando “masking”, para não considerar
regiões de baixa qualidade e microssatélites no alinhamento das seqüências. o sistema de
nomenclatura foi utilizado para direcionar a sobreposição manual.
Um arquivo foi gerado contendo as sequências, os valores de Phred e a posição do
microssatélite, no formato adequado para o programa Primer 3 (Whitehead Institute of
Biomedical Research), que foi utilizado para desenho dos primers. Primers complementares às
regiões flanqueadoras dos microssatélites foram desenhados, usando as seguintes condições: (1)
temperatura média de anelamento variando entre 45ºC e 68ºC, sendo permitida uma diferença
41
máxima de 1ºC entre os primers forward e reverse; (2) conteúdo de GC entre 30% e 80%; (3)
ausência de complementaridade entre os primers; (4) um tamanho de produto entre 100 e 400
bases; (5) tamanho do primer entre 18 e 27 pb e (6) qualidade mínima de seqüência utilizada
para desenhar primer igual a PHRED 20.
A denominação dos marcadores desenvolvidos foi obtida utilizando a primeira letra do
gênero em maiúsculo (A - para Arachis) em seguida a primeira letra da espécie em minúsculo
(h – para hypogaea), o número da biblioteca (3), o dinucleotídeo de enriquecimento da
biblioteca (TC), seguido do número da placa com os clones em meio de cultura (TC12 a TC42)
e a identificação do clone em cada placa (A01 a H12).
3.5 - VALIDAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PRIMERS
Os novos marcadores microssatélites foram inicialmente testados em quatro cultivares
de A. hypogaea, representadas pelos acessos IAC-Tatu (A. hypogaea subsp. fastigiata var
fastiagiata), BR-1 (A. hypogaea subsp. fastigiata var fastigiata), IAC-Caiapó (A. hypogaea
subsp. hypogaea var hypogaea) e IAC-Runner 886 (A. hypogaea subsp. hypogaea var
hypogaea). O DNA total de cada acesso foi extraído de folhas jovens utilizando o protocolo
descrito por Ferreira e Grattapaglia (1998), acrescido de uma precipitação de polissacarídeos
com NaCl 1,2M. Para obtenção da temperatura de anelamento adequada para cada par de
primers, foram realizados testes em termocicladores com gradiente de temperatura. Os produtos
amplificados foram visualizados em gel de agarose 3,5% corado com brometo de etídio.
Os primers foram caracterizados usando as seis variedades botânicas descritas de A.
hypogaea, sendo elas A. hypogaea subsp. fastigiata var. fastiagiata, A. hypogaea subsp.
fastigiata var. vulgaris, A. hypogaea subsp. fastigiata var. aequatoriana, A. hypogaea subsp.
fastigiata var. peruviana, A. hypogaea subsp. hypogaea var. hypogaea, A. hypogaea subsp.
hypogaea var. hirsuta. Além disso, foram incluídas amostras de A. hypogaea coletadas no
Parque Nacional do Xingu (variedade não definida), um genótipo tetraplóide da seção Arachis
(A. monticola) e um anfidiplóide sintético, que simula as condições da origem do amendoim (A.
ipaënsis x A. duranensis)
4x
(FÁVERO et al., 2006) e que funcionou como um grupo externo. O
DNA total foi extraído de folhas jovens como descrito acima. Essas plantas foram obtidas na
coleção de germoplasma, mantida na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia – Cenargen
(Brasília); na coleção do Instituto Agronômico de Campinas (IAC, Campinas) e na coleção
42
Argentina, mantida na Estación Experimental Agropecuária de Manfredi (EEA-INTA
Manfredi, Córdoba, Argentina). No total, foram analisados 24 genótipos (Tabela 1).
Tabela 1 – Lista dos acessos de A. monticola e de A. hypogaea utilizados na análise da variabilidade genética,
representando as duas subespécies (hypogaea e fastigiata) e as seis variedades descritas para o amendoim
(hypogaea, hirsuta, fastigiata, vulgaris, aequatoriana e peruviana).
Genótipo Subespécie/ Variedade
ou espécie
Origem
cv. BR-1
fastigiata/fastigiata
Embrapa Algodão, Paraíba, Brasil
cv. IAC Caiapó
hypogaea/hypogaea
IAC, São Paulo, Brasil
cv. IAC Runner 886
hypogaea/hypogaea
IAC, São Paulo, Brasil
cv. IAC-Tatu
fastigiata/fastigiata
IAC, São Paulo, Brasil
IAC5024
hypogaea/hypogaea
IAC, São Paulo, Brasil
Mf210
fastigiata/fastigiata
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf2352
fastigiata/aequatoriana
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf2517
fastigiata/peruviana
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf2534
hypogaea/hirsuta
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf2681
fastigiata/vulgaris
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf3207
fastigiata/vulgaris
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf1625
fastigiata/vulgaris
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf3618
hypogaea /hirsuta
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf2430
fastigiata/peruviana
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf3764
fastigiata/peruviana
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf3892
fastigiata/aequatoriana
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf3884
fastigiata/aequatoriana
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf3911
hypogaea/hirsuta
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf574
hypogaea/hypogaea
BAG - Manfredi (Argentina)
Mf788 Não identificado BAG - Manfredi (Argentina)
Of106 hypogaea tipo Xingu Parque Indígena do Xingu
Of107 hypogaea tipo Xingu Parque Indígena do Xingu
V14165
A. monticola
Jujuy, Argentina
(K30076xV14167)
c
A. ipaënsis x A. duranensis Cenargen, Brasília
As PCRs foram realizadas em um volume final de 13μL e foram utilizados 6 ng de
DNA, 1x de tampão de PCR (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl), 2 mM de MgCl
2
, 0,2 mM
de cada dNTP, 0,2 mg mL
-1
de BSA, 0,2 μM de cada iniciador, 1 U de Taq DNA polimerase e
água milli-Q. Para as amplificações, foi utilizado o seguinte programa: 94ºC por 5 min, 30
ciclos a 94°C 1 min, 50-62ºC por 1 min conforme temperatura de anelamento definida para
cada par de iniciadores, 72ºC por 1 min e uma extensão final a 72ºC por 10 min. As detecções
de polimorfismo foram realizadas por eletroforese em géis de poliacrilamida 5% corados com
nitrato de prata (CRESTE et al., 2001), utilizando-se os 24 genótipos de Arachis conforme
tabela 1. Os comprimentos dos fragmentos em pares de bases (pb) foram estimados nos géis
43
tendo como base um marcador de fragmentos de tamanhos conhecidos (10-pb DNA Ladder,
Invitrogen).
3.6 - ANÁLISE DOS DADOS
O número de alelos obtidos por loco, a amplitude de comprimento dos fragmentos e a
diversidade gênica (GD) foram estimados para os primers polimórficos, usando o programa
“Power Marker 3.25” (LIU; MUSE, 2005). Para análise das relações genéticas entre os acessos,
foram estimadas: as frequências alélicas a partir da planilha com os genótipos (comprimento
dos alelos em pares de bases) de cada acesso; o número de alelos; a diversidade genética que é
uma estimativa da probabilidade de que dois genes escolhidos ao acaso em uma população
sejam diferentes (NEI, 1973). e o conteúdo de informação polimórfica (PIC= 1-Σ Pi
2
, onde Pi é
a freqüência dos alelos nos genótipos analisados). Em seguida, as distâncias genéticas entre
pares de acessos foram calculadas, pelo método de Rogers modificado (WRIGHT, 1978),
usando-se o programa bood, desenvolvido pelo Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho da
Universidade Federal de Goiás. A matriz de distâncias resultante foi submetida à análise de
agrupamento usando UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis). A fim de verificar a
consistência dos agrupamentos obtidos a partir dos dados de distâncias genéticas, a correlação
cofenética (r) foi estimada (MANTEL, 1967). Para isso, a matriz de distâncias genéticas foi
comparada com a matriz cofenética, gerada pelo programa MXCOMP. Essas análises foram
realizadas usando-se o programa NTSYS, versão 2.1 (ROHLF, 2000).
44
4- RESULTADOS:
4.1- AMPLIFICAÇÃO DA BIBLIOTECA GENÔMICA,
TRANSFORMAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DOS INSERTOS.
Fragmentos de 200 a 600 pb da biblioteca enriquecida para repetições TC/AG (LEOI,
2004), foram amplificados e separados em gel de agarose 2% e logo depois foram purificados.
A eficiência da incorporação de insertos ao plasmídeo de pGEM-T Easy foi de 98%,
sendo que a relação entre colônias brancas e azuis encontradas foi de aproximadamente 50:1.
2880 colônias brancas foram repicadas em meio LB sólido com ampicilina e conservadas em
glicerol a -80ºC. DNA plasmidial das 2880 colônias foi extraído, purificado e sequenciado.
4.2 - ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS E DESENHO DOS PRIMERS
Das 2880 sequências obtidas, 155 sequências foram retiradas, pois apresentaram
similaridades com microssatélites já publicados para amendoim (5,4% das 2880 sequências).
Das demais 2725 sequências 525 (19,3%) apresentaram microssatélites longos, com seis a 44
repetições TC/AG, sendo 375 insertos sequenciados nos sentidos direto e reverso, para
possibilitar a identificação de grupos de seqüências Iidênticas (contigs) e o desenho de primers
com alta qualidade. Um total de 303 sequências únicas (exemplificado na Figura 7) foi obtido,
sendo 72 (24%) sequências similares entre si (redundantes).
Figura 7: Ferramenta GAP 4, Contig Editor do programa Staden Package (Staden et al., 2003), com parâmetros
padrões aplicação masking e utilizando a função find read pairs do Staden.para o contig Ah3TC13G05.F1.
45
Das 303 sequências obtidas, 291 apresentaram qualidade acima de Phred 20. Para desenho
de primers e as sequências consenso desses 291 sequências únicas (contidos em arquivos obtido
da ferramenta GAP 4 como demonstrado na Figura 8) foram submetidos ao programa
‘Primer3’ pela interface do programa Staden Package (STADEN et al., 2003). Foram obtidos
147 novos pares de primers (Anexo 1). O desenho de primers para os demais 144 contigs não
foi possível devido ao baixo conteúdo de GC nas regiões flanqueadoras ao microssatélite ou à
proximidade do microssatélite ao final do inserto do DNA clonado.
Figura 8: Arquivo obtido da Ferramenta GAP 4, com parâmetros padrões, do programa Staden Package (Staden et
al., 2003), para o contig Ah3TC24C06.R1.
As 301 sequências únicas foram avaliadas quanto ao conteúdo gênico, sendo encontradas
39 (12,9%) sequências com similaridades significativas para predição de proteínas em
Arabidopsis e leguminosas conforme tabela 2. As demais 108 sequências não apresentaram
similaridade com sequências conhecidas (não hits).
Tabela 2: Relação das sequências únicas que têm similaridade com proteínas preditas para Arabidopsis e
leguminosas e o índice de similaridade (e value).
Nome do Contig Relação de Similaridade de predição de Proteínas para Arabidopsis e Leguminosas e value
Ah3TC12B04 gi|92897746|gb|ABE93858.1| FAR1; Zinc finger, SWIM-type; Iron hy .. 1,00E-15
Ah3TC12D08 At5g52590.1 68418.m06530 RabGAP/TBC domain-containing protein co .. 2,00E-19
Ah3TC17F01 gi|29423276|gb|AAO73525.1| gag-pol polyprotein [Glycine max] 1,00E-08
Ah3TC19A02 gi|27261150|gb|AAN87551.1|AF376053_1 gamma-tubulin [Lupinus albus] 2,00E-18
Ah3TC19A02_1 gi|27261150|gb|AAN87551.1|AF376053_1 gamma-tubulin [Lupinus albus] 2,00E-18
Ah3TC19B04 At5g66380.1 68418.m08370 mitochondrial substrate carrier family .. 5,00E-12
Ah3TC19B05 gi|30721696|gb|AAP33664.1| ferredoxin-dependent glutamate syntha .. 1,00E-12
Ah3TC19B07 gi|92897746|gb|ABE93858.1| FAR1; Zinc finger, SWIM-type; Iron hy .. 4,00E-12
Ah3TC19F05 gi|92897746|gb|ABE93858.1| FAR1; Zinc finger, SWIM-type; Iron hy .. 2,00E-17
46
Ah3TC19F06 gi|3695061|gb|AAC62625.1| rac GTPase activating protein 2 [Lotus .. 9,00E-07
Ah3TC19H01 At3g33530.1 68416.m04290 transducin family protein / WD-40 repea .. 3,00E-07
Ah3TC21A09 gi|140068899|gb|ABO83741.1| hypothetical protein MtrDRAFT_AC1574 .. 7,00E-07
Ah3TC21G01 At5g05560.1 68418.m00604 E3 ubiquitin ligase, putative E3, ubiqu .. 8,00E-15
Ah3TC22C01 At5g54260.1 68418.m06759 DNA repair and meiosis protein (Mre11) .. 3,00E-07
Ah3TC22F10 At4g19110.2 68417.m02820 protein kinase, putative contains prote .. 2,00E-18
Ah3TC22H08 gi|27261150|gb|AAN87551.1|AF376053_1 gamma-tubulin [Lupinus albus] 1,00E-18
Ah3TC22H12 gi|77563563|gb|ABB00038.1| reverse transcriptase family member [ .. 8,00E-27
Ah3TC23F09 At4g37300.1 68417.m05281 expressed protein 5,00E-08
Ah3TC25C10 At4g15900.1 68417.m02416 PP1/PP2A phosphatases pleiotropic regul .. 2,00E-17
Ah3TC25F03 gi|92897746|gb|ABE93858.1| FAR1; Zinc finger, SWIM-type; Iron hy .. 8,00E-12
Ah3TC26B12 At2g44980.2 68415.m05601 transcription regulatory protein SNF2, .. 6,00E-16
Ah3TC26E12 At5g52590.1 68418.m06530 RabGAP/TBC domain-containing protein co .. 1,00E-16
Ah3TC27H12 At5g49820.1 68418.m06170 expressed protein contains Pfam domain, .. 5,00E-08
Ah3TC28C01 gi|124360137|gb|ABN08153.1| Transport protein particle (TRAPP) c .. 7,00E-21
Ah3TC28E09 At1g03150.1 68414.m00292 GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) .. 7,00E-18
Ah3TC29C07 At3g08850.1 68416.m01029 transducin family protein / WD-40 repea .. 3,00E-14
Ah3TC29C07_1 At3g08850.1 68416.m01029 transducin family protein / WD-40 repea .. 3,00E-14
Ah3TC30E12 At5g26570.1 68418.m03152 glycoside hydrolase starch-binding doma .. 9,00E-13
Ah3TC31C09 At5g09310.1 68418.m01079 expressed protein 2,00E-26
Ah3TC31F12 gi|156972237|gb|ABU98947.1| dynein light chain [Lupinus albus] 7,00E-21
Ah3TC33D07 At4g34700.1 68417.m04925 complex 1 family protein / LVR family p .. 4,00E-07
Ah3TC35F03 At1g78010.1 68414.m09091 tRNA modification GTPase, putative simi .. 3,00E-18
Ah3TC36E09 At4g03420.1 68417.m00469 expressed protein 6,00E-25
Ah3TC38F01 At1g78800.1 68414.m09184 glycosyl transferase family 1 protein c .. 1,00E-15
Ah3TC38H09 At3g59410.1 68416.m06626 protein kinase family protein low simil .. 4,00E-08
Ah3TC40G04 gi|92897746|gb|ABE93858.1| FAR1; Zinc finger, SWIM-type; Iron hy .. 1,00E-15
Ah3TC41A11 gi|77563563|gb|ABB00038.1| reverse transcriptase family member [ .. 2,00E-15
Ah3TC41A11_1 gi|77563563|gb|ABB00038.1| reverse transcriptase family member [ .. 2,00E-15
Ah3TC41C04 gi|27261150|gb|AAN87551.1|AF376053_1 gamma-tubulin [Lupinus albus] 1,00E-18
4.3- CARACTERÍSTICAS DAS REGIÕES REPETITIVAS NO GÊNERO
Arachis
A maioria das repetições encontradas foi, como esperado, TC/AG (89,8%), 11 (7,5%)
apresentaram repetições TG ou CA e apenas quatro (2,72%) trinucleotídeos (TCT
6
; TTC
12
;
CTC
7,
GGA
7
). As sequências amplificadas pelos 147 primers apresentavam entre seis e 44
repetições de microssatélites (Figura 9).
Dos 147 primers, 139 amplificaram produtos de PCR, quando testados em quatro
variedades de A. hypogaea (Figura 10). Desses 111 primers amplificaram a 58ºC, dois
amplificaram a 50ºC, seis amplificaram a 53ºC, 12 a 61ºC e oito a 63º.C (Anexo 1). Apenas oito
primers (Ah3TC20F08, Ah3TC23H09, Ah3TC24C07, Ah3TC25H06, Ah3TC26E12,
Ah3TC30B03, Ah3TC40H11, Ah3TC41F03) não amplificaram fragmentos visíveis em
nenhuma das temperaturas testadas, que variaram de 48ºC a 62ºC.
47
Figura 9: Gel de agarose a 3,5% corado com brometo etídio, mostrando os primers testados em quatro variedades
de A. hypogaea na seguinte ordem: IAC-Tatu (A. hypogaea subsp. fastigiata var fastiagiata), BR1 (A. hypogaea
subsp. fastigiata var fastigiata), IAC-Caiapó (A. hypogaea subsp. hypogaea var hypogaea) e IAC-Runner 886 (A.
hypogaea subsp. hypogaea var hypogaea).
4.4- POLIMORFISMO DAS REGIÕES REPETITIVAS
As regiões amplificadas pelos novos primers são constituídas por regiões repetitivas
complexas, perfeitas ou imperfeitas, sendo que: 27 (19,4%) são compostas, seis (4,3%) são
imperfeitas e 106 (76,3%) são perfeitas (Figura 10). Diferentes níveis de polimorfismo foram
detectados nos diferentes tipos de repetições: das 27 sequências repetitivas compostas, 19 foram
polimórficas (70,4%), das seis imperfeitas, quatro são polimórficas (66,7%) e das perfeitas, 66
são polimórficas (62,3%), perfazendo um total de 83 primers polimórficos (59,7%) (Anexo I).
48
número de repetições x número de SSR
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
06 a 15 16 a 25 26 a 35 36 a 45 acim 45
número de repetições
número de marcadores
com posto
imperfeito
perfeito
Figura 10: Número de repetições (eixo x) e número de SSRs compostos, perfeitos e imperfeitos (eixo y) que foram
identificadas nos 139 primers que amplificaram.
Todos os primers que propiciaram amplificação de DNA de Arachis foram analisados, em
gel de poliacrilamida corados com nitrato de prata, em 24 indivíduos representando as seis
variedades botânicas do amendoim, possibilitando a detecção de polimorfismo e realização de
genotipagem (Figuras 11,12 e 13).
Figura 11: Fragmentos gerados utilizando primers microssatélites Ah3TC42A05 e Ah3TC27H12
respectivamente, amplificados a 58ºC e visualizados em gel de poliacrilamida. (1) marcador de peso molecular 10
pb. Ordem das amostras (2) IAC5024, (3) Runner886 (4) KG30076xV14167, (5) Tatu, (6) Mf574, (7) Caiapó, (8)
Mf788, (9) Mf210, (10) BR1, (11) A. monticola, (12) Of106, (13) Of107, (14) Mf2534, (15) Mf3911, (16)
Mf3618, (17) Mf2517, (18) Mf2430, (19) Mf3764, (21) Mf3892, (21) Mf2681 (22) Mf2352, (23) Mf3207, (24)
Mf1625, (25) Mf3884.
49
Figura 12: Fragmentos gerados utilizando primers microssatélites Ah3TC28B01 e Ah3TC25F03
respectivamente, amplificados a 58ºC e visualizados em gel de poliacrilamida. (1) marcador de peso molecular 10
pb. Ordem das amostras (2) IAC5024, (3) Runner886 (4) KG30076xV14167, (5) Tatu, (6) Mf574, (7) Caiapó, (8)
Mf788, (9) Mf210, (10) BR1, (11) A. monticola, (12) Of106, (13) Of107, (14) Mf2534, (15) Mf3911, (16)
Mf3618, (17) Mf2517, (18) Mf2430, (19) Mf3764, (20) Mf3892, (21) Mf2681 (22) Mf2352, (23) Mf3207, (24)
Mf1625, (25) Mf3884.
Figura 13: Fragmentos gerados utilizando primers microssatélites Ah3TC42A05 e Ah3TC27H12
respectivamente, amplificados a 58ºC e visualizados em gel de poliacrilamida. (1) marcador de peso molecular 10
pb. Ordem das amostras (2) IAC5024, (3) Runner886 (4) KG30076xV14167, (5) Tatu, (6) Mf574, (7) Caiapó, (8)
Mf788, (9) Mf210, (10) BR1, (11) A. monticola, (12) Of106, (13) Of107, (14) Mf2534, (15) Mf3911, (16)
Mf3618, (17) Mf2517, (18) Mf2430, (19) Mf3764, (20) Mf3892, (21)Mf2681 (22) Mf2352, (23) Mf3207, (24)
Mf1625, (25) Mf3884.
Nos microssatélites perfeitos foram encontradas repetições entre 6 a 15, 16 a 25, 26 a 35
e 36 a 45, com polimorfismo de 42%, 67%, 54% e 100% respectivamente. Os seis
microssatélites imperfeitos apresentaram 16 a 35 repetições, sendo que o polimorfismo para as
repetições entre 16 e 25 foi de 50%, o polimorfismo para os microssatélites com repetições
entre 26 e 35 foi de aproximadamente 67% e o único microssatélite com mais de 45 repetições
50
foi polimórfico. Dos 27 microssatélites compostos o que apresentou repetição entre 6 a 15 foi
polimórfico e os oito que apresentaram repetições acima de 45 foi 100% polimórficos, já os
microssatélites com repetições entre 16 a 25, 26 a 35 e 36 a 45 o polimorfismo foi 70%, 33% e
50% respectivamente (Tabela 3).
Esta relação já foi observada anteriormente em amendoim (CUC et. al., 2008;
MORETZSOHN et. al., 2005; FERGUSON et al., 2004). O polimorfismo detectado por
microssatélites com cinco a 10 repetições foi de 43,6%, o mais baixo encontrado, embora mais
alto do que encontrado previamente: 7,2% por Moretzsohn e colaboradores (2005) e 27,3% por
Cuc e colaboradores (2008).
Tabela 3: Relação entre o número de primers polimórficos e o número total de primers, de acordo com o número
de repetições dos microssatélites para os três tipos observados: composto, imperfeito e perfeito.
SSR
REPETIÇÃO
6 a 15 16 a 25 26 a 35 36 a 45 Acima de 45
total
SSR
PERFEITO
16/38
36/54
07/13
01/01
_
60/106
SSR
IMPERFEITO
_
01/02
02/03
_
01/01
04/06
SSR
COMPOSTO
01/01
07/10
02/04
01/04
08/08
19/27
TOTAL
17/39 44/66 11/20 02/05 09/09 83/139
Além dos 83 primers polimórficos para amendoim cultivado, um primer diferenciou
apenas A. monticola dos demais genótipos. Quatro primers diferenciaram apenas o anfidiplóide,
sendo um deles o Ah3TC28A07 (Figura 14) e dois distinguiram A. monticola e o anfidiplóide
dos outros genótipos.
51
Figura 14: Fragmentos gerados utilizando primer microssatélites Ah3TC28A07 respectivamente, amplificados a
63ºC e visualizados em gel de poliacrilamida. O fragemnto destacado pertence a uma amostra do anfidiplóide,
KG30076xV14167 e bem a direita o marcador de peso molecular 10 pb .
Os 83 primers polimórficos foram caracterizados usando acessos pertencentes às seis
variedades botânicas conhecidas de amendoim. Para isso, foram calculados o número de alelos
por loco (A), a amplitude de comprimento dos fragmentos e a diversidade gênica (DG) para
cada marcador (Tabela 4). O número de alelos detectados variou de dois a 12 com uma média
de 5,4 alelos por loco, valor semelhante ao obtido por Moretzsohn e colaboradores (2005). Os
valores da diversidade gênica (DG) variaram de 0,077 (para o loco Ah3TC40E08 polimórfico
apenas para um genótipo) a 0,875 (para o loco Ah3TC41A11_1), com média de 0,6. Os valores
do conteúdo de informação polimórfica (PIC= 1-Σ Pi
2
)
onde Pi é a frequência dos alelos nos
genótipos analisados) variaram de 0,07667 a 0,874. Já quanto à relação entre PIC e o número
de unidades de repetição, o resultado não se mostrou significativa (Figura 14) resultado
também demonstrado por Cuc e outros em 2008.
Tabela 4: Pares de primers, freqüência do alelo mais comum (f (a) >), número de genótipos (G), amplitude de
comprimento dos fragmentos, número total de alelos amplificados por loco (A), diversidade gênica (DG) e
conteúdo de informação polimórfica. (PIC) obtido para os 83 marcadores microssatélites polimórficos para A.
hypogaea.
MARCADOR f (a) > G A DG PIC
Ah3TC13C03
0,47 4 3 0,59 0,50
Ah3TC13E05
0,48 10 8 0,71 0,68
Ah3TC14B08
0,50 4 5 0,66 0,61
Ah3TC14H09
0,96 2 2 0,08 0,08
Ah3TC15F12
0,32 14 12 0,84 0,82
Ah3TC16A10
0,68 6 6 0,51 0,48
Ah3TC16A10_1
0,33 8 5 0,72 0,67
Ah3TC19A02
0,67 3 2 0,44 0,35
210pb
52
Ah3TC19A02_1
0,52 4 4 0,63 0,57
Ah3TC19B07
0,25 8 8 0,85 0,83
Ah3TC19E01
0,67 3 3 0,50 0,45
Ah3TC20B05
0,48 8 7 0,71 0,68
Ah3TC20D05
0,45 8 7 0,64 0,57
Ah3TC20E08
0,42 8 5 0,73 0,69
Ah3TC21A09
0,54 4 4 0,60 0,54
Ah3TC21C03
0,50 8 6 0,68 0,64
Ah3TC21D06
0,93 2 2 0,13 0,12
Ah3TC21D06_1
0,39 3 3 0,66 0,58
Ah3TC21G01
0,24 8 6 0,81 0,78
Ah3TC22B07
0,96 2 2 0,08 0,08
Ah3TC22D09
0,81 4 3 0,31 0,27
Ah3TC22G05
0,48 5 5 0,57 0,48
Ah3TC22H12
0,52 6 6 0,65 0,61
Ah3TC23B10
0,46 5 5 0,64 0,57
Ah3TC23C08
0,82 3 3 0,31 0,29
Ah3TC23C08_1
0,93 3 3 0,12 0,12
Ah3TC23D04
0,30 10 6 0,77 0,74
Ah3TC23E04
0,38 6 6 0,72 0,67
Ah3TC23E04_1
0,50 3 4 0,56 0,46
Ah3TC23F04
0,87 4 4 0,24 0,23
Ah3TC23F09
0,50 2 3 0,55 0,44
Ah3TC23H10
0,23 10 10 0,86 0,85
Ah3TC24A06
0,32 8 7 0,80 0,77
Ah3TC24B05
0,20 14 12 0,89 0,87
Ah3TC24C06
0,32 10 10 0,81 0,78
Ah3TC24D06
0,60 5 5 0,55 0,48
Ah3TC24D12
0,55 3 3 0,60 0,53
Ah3TC24E01
0,96 2 2 0,08 0,08
Ah3TC24G10
0,50 4 5 0,68 0,64
Ah3TC25B04
0,40 7 7 0,70 0,65
Ah3TC25F03
0,58 5 5 0,57 0,52
Ah3TC25G11
0,35 7 7 0,76 0,72
Ah3TC26C07
0,50 3 4 0,63 0,56
Ah3TC27H12
0,60 5 5 0,59 0,55
Ah3TC28A12
0,29 8 8 0,81 0,78
Ah3TC28A12x
0,87 5 4 0,24 0,23
Ah3TC28B01
0,24 8 8 0,83 0,81
Ah3TC28B07
0,48 7 8 0,72 0,70
Ah3TC28C08_2
0,84 4 4 0,28 0,27
Ah3TC28E09
0,83 2 2 0,29 0,25
Ah3TC29C07_1
0,39 5 5 0,69 0,63
Ah3TC29H08
0,59 3 3 0,52 0,42
Ah3TC30D04
0,52 6 6 0,67 0,63
Ah3TC31C09
0,54 3 3 0,58 0,50
Ah3TC31G11
0,40 9 8 0,77 0,74
Ah3TC31G11_1
0,38 4 4 0,70 0,65
53
Ah3TC31H02
0,36 6 6 0,75 0,71
Ah3TC31H03
0,62 4 4 0,55 0,50
Ah3TC31H06
0,45 11 7 0,73 0,70
Ah3TC34E12
0,47 4 4 0,65 0,59
Ah3TC35F05
0,32 7 7 0,79 0,76
Ah3TC36C02
0,58 5 5 0,60 0,56
Ah3TC36C03
0,28 6 6 0,78 0,74
Ah3TC38A07
0,50 3 4 0,57 0,47
Ah3TC38D06_2
0,43 4 4 0,69 0,63
Ah3TC38F01
0,44 7 7 0,71 0,68
Ah3TC38H09
0,27 7 7 0,83 0,80
Ah3TC39A10
0,45 7 9 0,74 0,71
Ah3TC39B04
0,50 4 4 0,64 0,58
Ah3TC39C01
0,52 6 6 0,67 0,64
Ah3TC39E08
0,38 9 9 0,80 0,78
Ah3TC39F01
0,24 8 8 0,84 0,83
Ah3TC39F08
0,48 7 7 0,70 0,66
Ah3TC40D04
0,47 5 5 0,70 0,66
Ah3TC40E08
0,96 2 2 0,08 0,08
Ah3TC41A05
0,47 6 6 0,70 0,66
Ah3TC41A10
0,52 8 8 0,67 0,64
Ah3TC41A11_1
0,19 10 10 0,88 0,86
Ah3TC41C05
0,96 2 2 0,08 0,08
Ah3TC41C11
0,48 7 6 0,69 0,65
Ah3TC42A02
0,46 3 3 0,64 0,57
Ah3TC42A05
0,50 6 7 0,67 0,63
Média
0,52 5,66 5,40 0,60 0,56
PIC
0,00000
0,10000
0,20000
0,30000
0,40000
0,50000
0,60000
0,70000
0,80000
0,90000
1,00000
0 102030405060708090
Figura 15: Relação entre valores de PIC e número de repetições. Eixo X: número de unidades de repetições
polimórficas (somatório de repetições compostas e imperfeitas). Eixo y: os valores de PIC.
54
4.5 - RELAÇÕES GENÉTICAS ENTRE ACESSOS DE A. hypogaea
As distâncias genéticas entre os 22 acessos de A. hypogaea foram estimadas pelo
método de Rogers modificado (WRIGHT, 1978), usando 83 marcadores microssatélites. Uma
distância média de 0,47 foi obtida e todos os acessos puderam ser diferenciados, ou seja,
nenhum par de acessos apresentou todos os alelos em comum. Um dendrograma baseado em
UPGMA foi construído para os 22 acessos de A. hypogaea, um acesso de A. monticola e um de
A. ipaënsis x A. duranensis (Figura 16) com 100 bootstrap e com uma consistência em relação a
matriz obtida de 0,87 (r=0,87). Quatro grupos principais foram formados. O Grupo I incluiu os
acessos de hypogaea/hypogaea, um acesso não identificado e um acesso de hypogaea/hirsuta.
O Grupo II conteve os acessos de fastigiata/peruviana e fastigiata/aequatoriana (com exceção
do acesso Mf2352). O Grupo III foi formado pelos acessos de fastigiata/fastigiata e
fastigiata/vulgaris incluídos. O último grupo (Grupo IV) incluiu o único acesso de A.
monticola, os acessos de A. hypogaea tipo Xingu, um acesso de hypogaea/hirsuta e um acesso
de fastigiata/aequatoriana (Mf 2352). O acesso Mf2534 (hypogaea/hirsuta) e a planta
anfidiplóide (A. ipaënsis x A. duranensis)
c
se agruparam externamente aos demais 22 acessos.
55
G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1 0.000000
2 0.409589 0.000000
3 0.541736 0.551885 0.000000
4 0.469990 0.456435 0.553146 0.000000
5 0.482073 0.455818 0.555719 0.444369 0.000000
6 0.434000 0.399653 0.561442 0.473242 0.421350 0.000000
7 0.360649 0.436795 0.551677 0.471405 0.471405 0.391368 0.000000
8 0.459036 0.458333 0.549762 0.419195 0.488846 0.427751 0.452616 0.000000
9 0.483602 0.439525 0.535061 0.423598 0.468784 0.442531 0.457148 0.392031 0.000000
10 0.511071 0.462910 0.579601 0.486562 0.476731 0.485071 0.492700 0.509525 0.458831 0.000000
11 0.508376 0.456435 0.555813 0.452616 0.457719 0.452769 0.487866 0.491243 0.445435 0.457087 0.000000
12 0.498185 0.447214 0.548496 0.466163 0.447657 0.464095 0.476731 0.491869 0.444665 0.434194 0.345168 0.000000
13 0.506803 0.489618 0.568121 0.483662 0.518056 0.503509 0.505254 0.500000 0.497947 0.501919 0.471405 0.466061 0.000000
14 0.448274 0.411465 0.536967 0.465475 0.449781 0.406281 0.431158 0.470270 0.429769 0.469117 0.428421 0.464835 0.490032 0.000000
15 0.496785 0.455842 0.561310 0.470815 0.452769 0.467284 0.467707 0.498353 0.440716 0.456435 0.427566 0.420459 0.474342 0.452119 0.000000
16 0.493464 0.459390 0.587022 0.473985 0.466803 0.434859 0.474688 0.474342 0.442893 0.496364 0.484972 0.480982 0.481060 0.464515 0.484516 0.000000
17 0.485170 0.431109 0.553631 0.473619 0.476095 0.474688 0.476418 0.511688 0.470270 0.483662 0.445030 0.483421 0.486299 0.470516 0.470145 0.458123 0.000000
18 0.472336 0.447572 0.537449 0.469462 0.477842 0.451790 0.476731 0.506536 0.442601 0.498261 0.454148 0.472855 0.493377 0.454308 0.459081 0.468913 0.450903 0.000000
19 0.480523 0.469559 0.560708 0.457116 0.510910 0.472855 0.491118 0.505485 0.491596 0.468191 0.465349 0.492248 0.454356 0.455842 0.486664 0.505042 0.387734 0.462910 0.000000
20 0.489760 0.484972 0.538974 0.448764 0.513160 0.477536 0.476731 0.480523 0.430752 0.479659 0.458831 0.488678 0.529926 0.464811 0.483919 0.496825 0.451790 0.484123 0.440959 0.000000
21 0.480885 0.482281 0.536497 0.483273 0.524091 0.483919 0.458188 0.486840 0.463198 0.465847 0.455865 0.472855 0.500000 0.479463 0.463806 0.516110 0.477432 0.480959 0.459933 0.437445 0.000000
22 0.489979 0.482382 0.563735 0.476533 0.504219 0.460102 0.462019 0.472141 0.406318 0.458604 0.475191 0.469526 0.481513 0.448060 0.471405 0.473930 0.424918 0.473930 0.473930 0.397748 0.468221 0.000000
23 0.488032 0.479012 0.562296 0.440273 0.501757 0.458333 0.480243 0.420459 0.395285 0.501890 0.475423 0.496310 0.483896 0.452424 0.477037 0.465946 0.490414 0.463886 0.474342 0.445346 0.484322 0.413320 0.000000
24 0.466850 0.449359 0.552771 0.481060 0.472200 0.462402 0.447572 0.496610 0.467707 0.506993 0.482050 0.468661 0.496610 0.459177 0.487652 0.460977 0.360041 0.460814 0.415569 0.475986 0.478714 0.449359 0.487011 0.000000
Figura 16: Matriz das distancia genéticas de Rogers modificado entre 22 acessos de A. hypogaea, um acesso de A. monticola e um planta andidiplóide A. ipaënsis x A.
duranensis. Os números representam os acessos: 1. IAC5024_HH, 2. Runner886_HH, 3. K30076xV14167, 4. Tatu_FF, 5. Mf574_HH, 6. Caiapó_HH, 7. Mf788_NI, 8.
Mf210_FF, 9. BR1_FF, 10. A. monticola (V14165), 11. Of106_HX, 12. Of107_HX, 13. Mf2534_HHi, 14. Mf3911_HHi, 15. Mf3618_HHi,16. Mf2517_FP,17.
Mf2517_FP, 18. Mf3764_FP, 19. Mf3892_FA, 20. Mf2681_FV; 21. Mf2352_FA, 22. Mf3207_FV, 23. Mf1625_FV, 24. Mf3884_FA. As letras após cada acesso
representam: FF–fastigiata/fastigiata; FV–fastigiata/vulgaris FA-fastigiata/aequatoriana; FP-fastigiata/peruviana; HH-hypogaea/hypogaea; HHi-hypogaea/hirsuta;
HX-hypogaea tipo Xingu e NI-acesso não identificado quanto à subespécie e variedade.
56
IAC5024 HH
79
Figura 17- Dendrograma, obtido pelo método UPGMA, baseado nas distâncias de Rogers modificado (Wright,
1978), entre os 22 acessos de A. hypogaea, um acesso de A. monticola e um de A. ipaënsis x A. duranensis
(Tabela 1). As letras após cada acesso representam: FF–fastigiata/fastigiata; FV–fastigiata/vulgaris FA-
fastigiata/aequatoriana; FP-fastigiata/peruviana; HH- hypogaea/hypogaea; HHi- hypogaea/hirsuta; HX-
hypogaea tipo Xingu e NI-acesso não identificado quanto à subespécie e variedade. (KG30076xV14167)
c
identifica a planta anfidiplóide resultante do cruzamento
(A. ipaënsis x A. duranensis)
c
.
Mf788 NI
38,1
Runner886 HH
26,7
23,2
Caiapó HH
9,2
Mf3911 HHi
5,4
Mf574 HH
Mf2517 FP
1,1
Mf3764 FP
18,2
Mf3892 F
A
84,2
Mf2430 FP
75,6
36,8
Mf3884 F
A
T
ATU FF
29,6
Mf210 FF
33
BR1 FF
24,6
23,1
Mf1625 FV
99,5
Mf2681 FV
53,4
Mf3207 FV
A
. monticol
a
26,1
100,0 94,7
Of106 HX
52,9
Of107 HX
9,2
Mf3618 HHi
Mf2352 F
A
Mf2534 HHi
(KG30076xV14167)
c
GrupoI
Grupo II
Grupo III
Grupo IV
0.35
0.40 0.45 0.50
0.55
DISTÂNCIA GENÉTICA
57
5- DISCUSSÃO
5.1- EFICIÊNCIA DA METOLOGIA UTILIZADA
Os resultados obtidos indicam que a utilização de bibliotecas genômicas enriquecidas
para microssatélite TC/AG é um bom método para obtenção de microssatélites no amendoim
cultivado, além dessa repetição ser abundante em plantas (WANG et al., 1994; GUPTA;
VARSHNEY, 2000). A eficiência de aproximadamente 18,2% de microssatélites encontrados
em relação ao número total de insertos sequenciados foi semelhante à encontrada por
Moretzsohn e outros (2005), no entanto foi inferior à encontrada por Cuc e colaboradores
(2008), que foi de 68%. A eficiência encontrada costuma estar relacionada ao tipo de enzima
de restrição utilizada para a construção da biblioteca e à sonda utilizada para o enriquecimento
(CUC et al., 2008) e à inclusão ou não de uma seleção adicional de clones positivos por PCR-
ancorado. Como a biblioteca utilizada foi construída pelo mesmo método de Moretzsohn e
colaboradores (2005), o resultado encontrado foi o esperado já que essa seleção adicional
aumenta a porcentagem de iniciadores desenhados em relação aos clones sequenciados, mas é
lenta e sua omissão acelerou consideravelmente o processo de desenvolvimento de
marcadores.
O pré-processamento das sequências utilizando a ferramenta “Pregap4”, do programa
Staden (STADEN et al., 2003), permitiu que os insertos fossem cortados com uma confiança
maior que 15 e que os sítios da enzima de restrição não fossem incluídos. A etapa de busca de
similaridade em todos os microssatélites já desenvolvidos para amendoim permitiu que todas
as sequências utilizadas para o desenho de primers fossem inéditas, ou seja, das 2880
sequências pré-processadas foram retiradas 155 (5,4%) que apresentaram similaridade com
sequências já publicadas. Isso distingue o presente trabalho dos realizados por outros, como
Wang e colaboradores (2008), que não buscaram redundâncias em sequências já publicadas,
mas apenas dentro da própria biblioteca. Esse processo foi também realizado no presente
estudo, no qual apenas 72 (2,6%) sequências apresentaram similares entre si, diferente dos
26% encontrados por Cuc e colaboradores (2008).
As análises de BlastN das sequências obtidas mostrou 26,5% de similaridades
significativas (E<10
-7
) a sequências para proteínas em Arabidopsis e leguminosas. Esse valor
foi superior ao encontrado (16,7%) por Moretzsohn e colaboradores (2005) para bibliotecas
58
enriquecidas para TC e pode ser justificado pela metodologia usada no pré-processamento das
sequências que, ao eliminar um grande número de sequências pertencentes a regiões
repetitivas do genoma, pode selecionar regiões com um maior conteúdo gênico, ou ainda
aumento no depósito de sequências nos bancos de dados.
A utilização do módulo TROLL do programa Staden (STADEN et al., 2003)
possibilitou a seleção de microssatélites grandes, ou seja, com seis ou mais repetições, sendo
mais de cem acima de 15 repetições, pois o objetivo do presente estudo foi encontrar
marcadores polimórficos em variedades de A. hypogaea. Os últimos estudos com
microssatélites para amendoim têm mostrado que marcadores devem ser baseados em
bibliotecas genômicas enriquecidas, preferencialmente de dinucleotídeos, tipo TC/AG, com
números de repetições iguais ou superiores a 15 para aumentar a probabilidade de
identificação de marcadores polimórficos (CUC et. al., 2008; MORETZSOHN et. al., 2005;
FERGUSON et al. ,2004).
A identificação de trinucleotídeos provavelmente ocorreu devido à hibridização de
nucleotídeos com o oligonucleotídeo (TC/AG) durante o enriquecimento Já os dinucleotídeos
(TG e CA) devem ter sido detectados ao acaso, pois mesmo em uma porção selecionada
aleatoriamente do genoma poderão ser encontradas repetições formadas por dinucleotídeos, ou
seja, mesmo em regiões do genoma onde não houve enriquecimento podemos encontrar
microssatélites formados por dinucleotídeos (PROITE et al., 2007).
O sequenciamento dos 375 insertos inéditos nos sentidos direto e reverso permitiu,
após a retirada da redundância interna da biblioteca, a obtenção de 301 contigs e apenas estes
foram processados. Com isso, 147 primers foram desenhados, porcentagem que, em relação
ao número de clones sequenciados (5,1%), é menor que à encontrada (10,5%) para amendoim
por Moretzsohn e colaboradores (2005).
Dos 147 primers sintetizados, 94,6% produziram produtos amplificados, fato que pode
ser explicado pelo processamento utilizado que possibilitou a identificação precisa dos sítios
de inserção da sequência no vetor, a exclusão de sítios da enzima de restrição e,
principalmente, o desenho de primers somente em regiões com valores de Phred maiores que
20. Além disso, a metodologia utilizada para obtenção da temperatura ideal de amplificação
dos novos marcadores microssatélites possibilitou identificar marcadores que amplificavam
desde 50ºC até 63ºC, sendo que a maioria amplificou os fragmentos a 58ºC.
59
Os primers foram sintetizados utilizando uma sequência tailed (SCHUELKE, 2000;
MISSIAGGIA; GRATTAPAGLIA, 2006) para caracterização e detecção de polimorfismo em
sequenciadores automáticos, entretanto esta metodologia não foi utilizada, devido a problemas
de ordem técnica (sequenciadores automáticos ABI3700 com problemas no capilar no
momento da análise). O método utilizado, géis de poliacrilamida corados com nitrato de prata,
permitiu identificar os locos polimórficos. Por outro lado, a visualização dos fragmentos nem
sempre é fácil. Baseado nisso, o polimorfismo e o número de alelos encontrados poderia ser
maior, caso esses novos marcadores fossem testados em um analisador automático de
fragmentos com detecção de fluorescência.
A eficiência do desenvolvimento de marcadores inéditos e informativos (polimórficos)
para variedades do amendoim cultivado foi de 2,9% dos 2880 insertos sequenciados, valor
superior ao encontrado (1,5%) por Cuc e colaboradores (2008), sendo que os marcadores
foram testados em 22 acessos do amendoim cultivado, enquanto que no estudo de Cuc e
colaboradores (2008) os marcadores foram testados em 32 acessos do amendoim.
5.2- ANÁLISE DO POLIMORFISMO DAS REGIÕES REPETITIVAS
Dos 139 fragmentos que amplificaram, 89 (64%) foram polimórficos, em relação aos
genótipos utilizadas para a validação dos primers (A. hypogaea, A. monticola e a planta
anfidiplóide) e 83 (59,7%) foram polimórficos para o amendoim cultivado, resultado superior
ao encontrado em outros estudos: 51% de Ferguson e colaboradores (2004), 28,2% de
Moretzsohn e colaboradores (2005), 33% de Gimenes e colaboradores (2007) e 44,2% de Cuc
e colaboradores (2008), este resultado mostra a eficiência dos critérios utilizados para o
desenho dos primers. Um número maior de polimorfismo poderá ser encontrado, caso esses
primers sejam transferídos para espécies silvestres, visto que repetições AG/TC são bastante
polimórficas para o amendoim cultivado e espécies silvestres (FERGUSON et al., 2004;
MORETZSOHN et al., 2005).
O presente estudo selecionou primers com um número maior de repetições e como era
esperada a relação entre o número de repetições e a porcentagem de polimorfismo foi similar
aos observados em outros estudos, nos quais se obteve uma porcentagem alta de polimorfismo
60
para marcadores com mais de 15 repetições (CUC et. al., 2008; MORETZSOHN et al., 2005;
FERGUSON et al. ,2004).
A variação do número de alelos por loco (2 a 12) e a média desses números (5,4) foi
similar à encontrada por Moretzsohn e colaboradores (2005) e maior que a encontrada (2 a 5 e
média de 2,44 por loco) por Cuc e colaboradores (2008). Os 83 primers polimórficos foram
utilizados para análise de diversidade gênica e o e valor médio de GD (diversidade gênica)
obtido nesse estudo (0,6) é similar aos valores detectados com marcadores microssatélites para
o amendoim (MORETZSOHN et. al., 2005; FERGUSON et al., 2004), pois por ser tetraplóide
gera dificuldade em detectar de qual genoma é o fragmento amplificado, de fato os resultados
encontrados não podem ser comparados com os obtidos para espécies diplóides, pois
provavelmente estão superestimados, uma vez que alguns marcadores podem ter amplificado
alelos de locos duplicados ou de genomas diferentes. O valor médio de PIC obtido nesse
estudo (0,56) é maior que o encontrado nos marcadores obtidos (0,50) por Cuc e
colaboradores (2008). O resultado da relação entre PIC e o número de unidades de repetição
não se mostrou significativa, provavelmente porque a maioria dos marcadores desenvolvidos
tenha um número alto de repetições.
5.3 – ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENCONTRADA
Os resultados obtidos nas análises das relações genéticas entre os 22 acessos de A.
hypogaea mostraram agrupamentos como o agrupamento dos acessos pertencentes à mesma
variedade e dos dois acessos coletados no Parque Indígena do Xingu. Quatro acessos não
agruparam junto aos demais acessos das variedades às quais pertencem: Mf2517
(fastigiata/peruviana), Mf2352 (fastigiata/aequatoriana), Mf3618 e Mf2534
(hypogaea/hirsuta). Esses quatro acessos são provenientes do Banco de Germoplasma de
Manfredi, na Argentina, havendo pouca informação sobre a origem ou o “pedigree” desse
material. Dessa forma, é possível que alguns desses acessos sejam resultantes de cruzamentos
com outras variedades de A. hypogaea, o que explicaria seu agrupamento com acessos de
outras variedades.
61
Todos os acessos de hypogaea/hypogaea e um acesso de hypogaea/hirsuta formaram o
Grupo I, de acordo com a classificação taxonômica atual. Da mesma forma, os acessos das
variedades fastigiata e vulgaris mostraram-se bastante similares, formando o Grupo III. No
entanto, acessos das variedades peruviana e aequatoriana, que formaram o Grupo II,
apresentaram maior similaridade com acessos de hypogaea/hypogaea e hypogaea/hirsuta do
que com os acessos de fastigiata/fastigiata e fastigiata/vulgaris. Resultados similares foram
obtidos em outros estudos, baseados em marcadores microssatélites (FERGUSON et al., 2004;
HE et al., 2005; MORETZSOHN et al., 2006), AFLP (HE; PRAKASH, 2001; TALLURY et
al., 2005) e RAPD e ISSR (RAINA et al., 2001). Esses autores sugeriram que a variedade
peruviana, que se mostrou mais distante das demais variedades de fastigiata em alguns desses
estudos, fosse classificada como uma terceira subespécie.
O material coletado no Parque Indígena do Xingu apresenta características
morfológicas que não se enquadram em nenhuma das seis variedades descritas e sua
classificação ainda não pôde ser definida. Recentemente, Freitas e colaboradores (2007)
mostraram que esse material agrupava junto aos acessos das variedades hypogaea/hypogaea e
hypogaea/hirsuta. No presente trabalho, que incluiu um número menor de acessos e um
número consideravelmente maior de marcadores microssatélites (83 contra 13 do trabalho
anterior), o material do Xingu agrupou junto a acessos de hypogaea/hirsuta,
fastigiata/aequatoriana e A. monticola, mas ficou distante do grupo de acessos de
hypogaea/hypogaea.
Os resultados mostraram, ainda, a alta similaridade genética entre A. monticola
(V14165), a outra espécie tetraplóide da seção Arachis, e A. hypogaea, também observada em
outros estudos (HALWARD et al., 1991; KOCHERT et al., 1991; MORETZSOHN et al.,
2004). Além disso, híbridos entre as duas espécies são férteis (KRAPOVICKAS; GREGORY,
1994).
A curta distância genética entre os genótipos analisados neste e em outros estudos
podem sugerir que A. hypogaea sofreu uma evolução rápida após a sua origem.
Uma sugestão para uma análise genética mais precisa de diversos acessos de A.
hypogaea, seria a utilização de cDNA plastidial (são mais conservados) ou mesmo marcadores
DarT (possibilitam uma maior precisão).
62
5.4 – PERSPECTIVAS E IMPORTÂNCIA DOS NOVOS MARCADORES
Os melhoristas e fitopatologistas que trabalham com o amendoim, no mundo inteiro
têm realizado grandes esforços para aumentar a resistência a pragas e o rendimento da cultura
sob condições de déficit hídrico, entre outras características de qualidade da cultura
(VARSHNEY et al., 2009). A solução mais eficiente para isso é o desenvolvimento de
cultivares resistentes, que pode ser facilitado por seleção assistida por marcadores moleculares.
Tais ferramentas são utilizadas para acelerar o processo de introgressão de características
benéficas em variedades de amendoim cultivado (VARSHNEY et al., 2005, 2006). Apesar de
haver centenas de marcadores microssatélites publicados, só recentemente foi construído o
primeiro mapa para o amendoim cultivado por Varshney e colaboradores (2009), que citaram a
importância de se desenvolver marcadores moleculares polimórficos para o amendoim, para
que sejam construídos mapas genéticos com um número razoável de marcadores. Os novos
primers desenvolvidos por este estudo mostraram 59,7% de polimorfismo, trazem uma
pespectiva de dectação maior de polimorfismo, quando testados em outros genótipos, o que
pode trazer uma boa perspectiva para a construção de mapas genéticos para o amendoim
cultivado, para o qual existe uma escassez de marcadores.
Os novos primers também poderão ser utilizados, quando mapeados, em estudos de
sintenia e integração de mapas de leguminosas-modelo, como os de Lotus e Medicago, com
Arachis, o que poderá auxiliar na identificação e clonagem de genes candidatos, bem como na
compreensão do processo evolutivo do genoma de Arachis. Estudo recente de integração de
mapas entre estas leguminosas sugeriu que os espaços gênicos têm dois componentes: as
regiões mais conservadas que apresentam baixa densidade de retrotransposons e as regiões
variáveis que tendem a ser rica em transposons e cuja reestruturação frequente pode
impulsionar a evolução de genes de resistência a doenças e, possivelmente, de outras famílias
multigênicas (BERTIOLI et al., 2009).
Em resumo, apesar da estreita base genética do amendoim cultivado, o presente estudo
mostrou a utilidade dos marcadores microssatélites na detecção de polimorfismo em acessos
de A. hypogaea o que permitirá a identificação de marcadores ligados a QTLs de interesse e a
implementação de seleção assistida nos programas de melhoramento genético do amendoim e
a redução do tempo para obtenção de uma cultivar.
63
6- CONCLUSÕES:
Diante dos resultados encontrados nesse estudo a perspectiva de utilização desses
novos marcadores é ampla, já que poderão ser usados em mapeamento para seleção assistida
por marcadores, na procura de genes associados à resistência a fatores abióticos como a seca e
a fatores bióticos como às doenças causadas pela Sclerotina e Meloidogyne arenaria entre
outras. Além disto, os novos marcadores também podem ser utilizados para análise de
germoplasma, e relações filogenéticas.
A análise genética descrita nesse estudo sugere que os resultados podem ser
melhorados caso se utilize um número maior de acessos de cada variedade provenientes de
diferentes localidades, e de vários acessos coletados no Parque Indígena do Xingu.
64
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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p.1131-1139, 2004.
89
ANEXO
90
Marcador microssatelite tamanho FWD primer REV primer
tipo de
repetição
polimorfismo
Ah3TC12A01 (TC)20 396 ATTCAACGTCGATGGTTATTGG ACATTAGGCTCCAGCATGTGAC
perfeita
M
Ah3TC12B04 (TC)16 (TC)9 284 TTGGACTTCCCTAAACTTCTCG GGTCAGAATGAGAAGCACACAA
imperfeita
M
Ah3TC12D08 (TC)7 (CT)11 (CA)14 204 TTTTGGTGTTTTGTTGCTCTA GCGGGACAAAGATTACATT
composta
M
Ah3TC13C03 (GA)11 (GA)7 (GA)12 280 AGATGGTACCTGGAGAGTGGAA TGTTGAGTTCACACCAAAACCT
imperfeita
P
Ah3TC13E05 (TC)23 105 TCCTCTGCTTCCTCTGTTTCTT TGGCTGTGGCTTTAGGGTATAG
perfeita
P
Ah3TC13G05 (CT)21 (TC)24 342 GACACAACGTTATCGAACCAAA CAAGAGGAGACAGGGAAGAAGA
composta
M
Ah3TC14B08 (AG)9 (GA)7 (AG)17 (AG)26 189 CACCAGCACAAACTTCTGAATC CGCTTTTCTGTGTTTTGTGTTT
composta
P
Ah3TC14H09 (CT)6 (CA)9 (CT)7 130 GAATCTTTGCGCTCTTTCTCAC AAAACCCGATTCACAAACTGAC
composta
P
Ah3TC15D11 (CT)8 238 TAGATGCACAGTTCAATG GAAACCTACAAATTACCAGT
perfeita
M
Ah3TC15F12 (CT)12 108 ACCCTGAAATCGTGTCTCTGTC GGGCATAGAGGAGATCGAAGAC
perfeita
P
Ah3TC16A10 (AG)9 (AG)7 (GT)9 (GA)6 (GA)21 255 TATCGGAGAACAAGCACACATC CTCCAAAGTCCAAACACAAACA
composta
P
Ah3TC16A10_1 (AG)8 303 AGCAGAGAGCAGAGTGGAAAAC CTCCAAAGTCCAAACACAAACA
perfeita
P
Ah3TC17F01 (TC)6 158 CAATTGAGAAACTGCCATTTGA TGGAGGTATATTCTTGCACCCT
perfeita
M
Ah3TC19A02 (CT)29 (TG)7 (TG)7 374 CGTCTTGTTTCCTGAACATCTG TGTCGGATGCTAGTATGGTTTG
composta
P
Ah3TC19A02_1 (TG)6 138 CAAACCATACTAGCATCCGACA AGATTGTACACATGAAATTGGCA
perfeita
P
Ah3TC19B03 (AG)27 259 ACCTGGCTGGATCAACACTCTA AGAAGAGAAGTGACGGAAGCAG
perfeita
M
Ah3TC19B04 (AG)9 (AG)26 333 GGAATGACCAATTTTCCAATGT TATGAAGGTGTCCGAGGATTTT
imperfeita
M
Ah3TC19B05 (CT)25 398 TTTTGACGAGGTCAGGAAGAAT AGTCTCTCTCGCTAACTGCACC
perfeita
M
Ah3TC19B07 (TC)29 (CT)38 160 ACATGGTATCACGGTGTGAAAT ACACAGAACAGCTCCTTGATTC
composta
P
Ah3TC19B11 (CT)16 196 TTTTCAATTCCTTGCATGCTTA CAATCAACACAAAATAACCGGA
perfeita
M
Ah3TC19B11 (TC)18 232 ATCTCTTCCAACAGTTTGGGG ATGCATCGCAAACATCACTCT
perfeita
M
Ah3TC19D09 (CT)20 252 AAATCCAACGATTTCGGTAAGA CATGCATAGTGAGAATCAAGGAA
perfeita
M
Ah3TC19E01 (TC)34 348 ATCAGAAACAGAACCCTGGAGA GGGGAAGAAGAAAGCGGA
perfeita
P
Ah3TC19F05 (TC)20 309 TAAATTGTGCTTGGACTTCCCT TTCCAGTTTATCTCGATCACCA
perfeita
M
Ah3TC19F06 (TTC)12 175 ATCTACTTGACCCTCCTCCTCC TCTTGCAGACTCGTAGATTCCA
perfeita
M
Ah3TC19H01 (CT)24 204 AAAATCCCGTCATGGTAAGTTG TATGAAGGCACTTGAAGCAAAA
perfeita
P
Ah3TC20B02 (CA)6 140 CTCACCATCTCTCACTCAGCC CCCTCTCCCTCTCTCAACATTA
perfeita
P
Ah3TC20B05 (GA)28 (TA)7 138 GCATGTAAACTATGCAATCGCT CAACAACTTATTCCACCAAATATCA
composta
P
Ah3TC20D05 (CT)20 205 CAGCACCACATGATTGTCTTTA GATCAAACCCTCCATAATCGTA
perfeita
P
Ah3TC20E08 (GT)14 (GA)24 (TG)15 235 AGGCGGGACAAAGATTACATTA AAACTGGTGGCCAAAGCTATAA
composta
P
Ah3TC20F08 (CT)20 211 TTGGGTGCGTTACTGTTCATAG ACGGCGACTAAATGATGAGTCT
perfeita
Ah3TC21A09 (TC)19 272 AGCATGGATATTTGGAGGAAGA TTAGCATTTCCCACATCACTTG
perfeita
P
Ah3TC21C03 (TC)11 168 TAAAGTTTCCGTCGTTTTGTCA AAAGATGAACAAGGTTGCAGAA
perfeita
P
91
Ah3TC21C10 (GA)18 165 ACAGGATTGGGAAAATGTTGAG CCGCCTCAATAACAATAACCTT
perfeita
P
Ah3TC21D06 (CT)12 170 ATCCTTACCCCAAAGCAACG TGGTGATGGAGTTGAATGAATG
perfeita
P
Ah3TC21D06_1 (TC)21 119 AACACCATTTGTTTTCCTCAGC ATCTGGCATAGGAACGTTGAAA
perfeita
P
Ah3TC21G01 (GA)27 367 TGATCGCACCTAGTGGAATTAG AACATGCCTTCATCTGATTGTG
perfeita
P
Ah3TC22B07 (AG)26 (AG)11 (AG)32 172 AGTGTGAATCAACCGACAAATG CGTCATTCATTTTCACGTATGG
imperfeita
P
Ah3TC22C01 (CT)21 364 AGACCCTCAACTTCCAGAACTC CAATGAAGGGCAAACATTATCA
perfeita
M
Ah3TC22D09 (GA)19 208 CCCATGAAACAGAACAAGACAA GTCACCTGCAACCAGAACAAC
perfeita
P
Ah3TC22E01 (TC)26 343 GATCCTTTTACCCTTGCCTTTT TATTTTGATGTGGTGGCATTGT
perfeita
M
Ah3TC22F05 (TC)15 218 GTGAGAAGCAGGTGCATAACAG ATTAAGGGGCCAAAATGAAAAT
perfeita
M
Ah3TC22F10 (TC)23 151 CTCATTTAGACATGTGGGCAGT CTTCGACGGAAGATCGTATTT
perfeita
M
Ah3TC22F11 (CT)7 122 CTGCTTTAGCTTCTGTGCTTCA GTCAAATCATGGCATCAGAAAA
perfeita
M
Ah3TC22G05 (TC)14 (CT)7 160 TATACTCTGATTTTCCCGCCAT GAGCCATTCGATTAAGCTGTG
composta
P
Ah3TC22H08 (CT)19 268 CACCGGGTATGACCTCTTTAAT TGTCGGATGCTAGTATGGTTTG
perfeita
M
Ah3TC22H12 (TC)23 225 TTCTAGGTCTTCCTCTGCCTTG ACGCGATTGGATAGAATAAGGA
perfeita
P
Ah3TC23A11 (CT)27 338 GCCATACAAGAGAAACCCAGTC AGACTCAGATGAAACTGCAACG
perfeita
M
Ah3TC23B09 (CT)21 164 CAACAACACCTCTCTTCAAA TTTTCTCTTCGTTCTTCTCA
perfeita
P
Ah3TC23B10 (AG)44 186 GTTCGGGTGAACAAGCACTAA AAGTCACCTTCACTGGATATTGC
perfeita
P
Ah3TC23C08 (GA)22 163 AGCAGAGTGGAAAACGAAGAAG GTCAGTTTGTGAATCGGGTTTT
perfeita
P
Ah3TC23C08_1 (AG)7 (GT)7 (GA)8 128 AAAACCCGATTCACAAACTGAC GAATCTTTGCGCTCTTTCTCAC
composta
P
Ah3TC23C08_2 (GA)12 270 AGCAGAGTGGAAAACGAAGAAG CGAATCTTTGCGCTCTTTCT
perfeita
P
Ah3TC23D04 (CT)7 (TC)30 (TG)7 (CT)37 313 TGTTCTCGTTCAGTACCTCCCT GTAGCAAGCGTTAAGGACCTGT
composta
P
Ah3TC23E04 (GA)24 272 TGGGTATCAAACAAAACAAGAGG TCAAAGACAAACACCAAAACCTT
perfeita
P
Ah3TC23E04_1 (GA)15 178 GAGAGAAAAGAGGGTAGCTTTGC TCAAAGACAAACACCAAAACCTT
perfeita
P
Ah3TC23F04 (GA)20 131 CACGTGTAATAGTTGCTCAAAAT TATATGCATCAGACTCTCCAGC
perfeita
P
Ah3TC23F05 (TC)13 105 CCAAAACATCTGAAGTGCTTCTC TTTTCAGGCACGTTCTCCTTT
perfeita
M
Ah3TC23F09 (CT)15 107 ATTCTCTCCAGTCTCAATCCCA CCAATAGTGAAAGGCATCATCA
perfeita
P
Ah3TC23H09 (TC)17 (CT)14 (TC)20 381 GGAACCAGCTTCACTTTCATCT TATTCTAATTCCGGTTTCCCTG
composta
Ah3TC23H10 (GA)19 140 TCCCTTTGAGTCATTCATTGTG CATCAGAGCTCCTTTTCCCTAA
perfeita
P
Ah3TC24A06 (CT)25 (TC)24 226 CTGCACAATTAATCCTGGTGAA AATGAAGTTTGGTGGTCTGCTT
composta
P
Ah3TC24B05 (TC)30 176 ATTGATACCTCTTTGCTCTCGC TGAAACCCTAACTAGCTCGGAA
perfeita
P
Ah3TC24C06 (TC)20 263 TCAACGCTAAAGGTGGTGTAAA TGAGAAGGGCAAAAGAAGAAAG
perfeita
P
Ah3TC24C07 (AG)20 (GA)19 174 AGCAGAGTGGAAAACGAAGAAG AAATAATCTCAGCCAAGGCGTA
composta
Ah3TC24D06 (GA)14 138 TCCCTTCTACACAGACATCCAA TTTCGCAGGAACTACTCATCTG
perfeita
P
Ah3TC24D12 (CT)25 162 TGGATTTGATTTCATTAACCCC TGGTGATGGAAGTTTCAATGG
perfeita
P
Ah3TC24E01 (TG)9 (GA)18 248 AAAATCTACACCATCCAGCTCC CCTTGCAACCTAGCACTGATAA
composta
P
92
Ah3TC24E12 (CT)17 101 TCTCCTCTCCTCTCCTCTCCTC ATGCTTTTGCAATCTGAAGCTC
perfeita
M
Ah3TC24G10 (AG)32 297 AAGCTCATAACATTACCACGGG GAGGGTGAGAACTTGTTGGTTC
perfeita
P
Ah3TC25B04 (CT)22 337 TGCTTGTGTATTGAGCTGTCCT CATCTGCCAAGGTCCTAAAATC
perfeita
P
Ah3TC25C10 (AG)10 (GA)23 297 GGCATCCATCTAATGTGTCAAC GATCTTGAACAGAATAAGGTAAGGAA
composta
M
Ah3TC25F03 (GA)22 275 AGATCGAGATGAGAAGCACACA AATTATGCTTGGACTTTCCTGC
perfeita
P
Ah3TC25G11 (CT)20 180 GCATCAGCTCCCATCAGTATCT AATTGTTTGCAAGTATCATGCG
perfeita
P
Ah3TC25H06 (GA)21 (GA)25 356 GGACATCAGGGATCCTAGACAG ATTGGGACAAGACCTTCTGTTG
imperfeita
Ah3TC25H07 (CA)6 255 AAATCACCAATCAAGCTCCAAT TGTTCGAAATCTCAGCCCTTAT
perfeita
M
Ah3TC26B12 (TC)8 205 TTTTCTGTTTTGTTTCGGTCCT AGGATTCCAATCTTGCTCGTAG
perfeita
M
Ah3TC26E12 (AG)30 187 AAATTGGAGGATGACCATAAGC CGTCTTGGACCGAACTTTAATC
perfeita
Ah3TC26G12 (TCT)6 110 TTCCATTCACCACTTACATCCA CAAACTTAGAATGTTGCTCGCC
perfeita
M
Ah3TC27H12 (AG)21 151 TAACGAATGACATCAATCCCTG TCTCACTTTGCACTCTCCTCAA
perfeita
P
Ah3TC28A07 (GA)15 203 TTTCATTGTCTTCACTGTCGCT TAGAATCTGCTTATGCTGGCAA
perfeita
P
Ah3TC28A12 (AG)21 199 GTTCTTGGGATGTGAGCAATTT CTCTCAGTTTCTTTGTCGCTCA
perfeita
P
Ah3TC28A12 (AG)21 105 TTGAAAGCGAGAGTTTTGAGAA TCTCAGTTTCTTTGTCGCTCAT
perfeita
P
Ah3TC28A12_1 (AG)6 195 CGGGGTCCTTGGGATGTG CTCAGTTTCTTTGTCGCTCATTGACT
perfeita
P
Ah3TC28B01 (AG)31 (GA)6 (AG)24 232 ATTTATTGCCAAATCTGTCGCT CATTGCCAACTGTTACTACCCA
composta
P
Ah3TC28B07 (TC)30 142 CTTCCTGAACTTTACAAGGTAT GATCCTGTAGAAAGAAGGTCTA
perfeita
P
Ah3TC28C01 (GA)10 (AG)8 136 GAGCCAGTGAACAGTGATTCTG ACCATCTCCGTCAACAAGCTAT
composta
P
Ah3TC28E09 (TC)21 240 CTCCGTCAACCTAGACCATCTT CCGAAGAACAACACAAAACAAA
perfeita
M
Ah3TC29C07 (AG)9 192 CTCTTCTGAGCTGGAGACAA CTTAATTTCCACCCATACCA
perfeita
M
Ah3TC29C07_1 (GA)13 181 TGGAGACAACCAATGAAATC CTTAATTTCCACCCATACCA
perfeita
P
Ah3TC29H08 (CT)20 106 ATAGAGTGCTCCACACACACCC TAATCGGAAGACCTTTACGACG
perfeita
P
Ah3TC30B02 (CT)12 338 ATCGAACTCTTAGGATGGAAGA AACTCAGACACAGGGTCCA
perfeita
P
Ah3TC30B03 (TC)21 210 TATCTCGAAGTCTCTCTCTTTG GAGTCGAAGAAGTATGAGGTT
perfeita
Ah3TC30D04 (GT)12 (GA)12 185 TCCATGAAGTCAAGGTTCTGGT TGTTCATCAACCAATTTGCATC
composta
P
Ah3TC30E12 (CT)8 271 CAGAGTTGACGACTAAGACACACA TTCATCGACTTGGATTTCATTG
perfeita
M
Ah3TC31C09 (AG)21 215 TCAAACAGTTCATGAGCAATAACA AGGAAGAATCAGTGAGCTACGC
perfeita
P
Ah3TC31E08 (CT)23 (CA)7 (CA)12 247 AGACGAAGAGGAAGACGACAAC TGGGTGAGAACAAAAGTCATTG
composta
M
Ah3TC31F12 (GA)19 163 CACTTCTCAAATGCCTGAATGA ATCATCATCAAGAGTGCCGATA
perfeita
M
Ah3TC31G11 (AG)18 170 TTTTGAGACTGTTGGTGGTGTC CACTCTGATCACGTGCAATACA
perfeita
P
Ah3TC31G11_1 (GA)8 (AG)11 286 ATCCTTTTGAGACTGTTG ATCACGTGCAATACATTA
composta
P
Ah3TC31H02 (GA)20 168 AGTCATGTCCATTTCATATACAG TTTTGGACTTACACCCTCTA
perfeita
P
Ah3TC31H03 (CT)22 193 TGTAAGTTGACTCTAATCCAGTG GATCCATACACATTCAACATAAA
perfeita
P
Ah3TC31H06 (CT)21 121 CATGTGGATATCTTTATTTCCT CAGAAGATTCAAACTGGTAAA
perfeita
P
93
Ah3TC32B09 (GA)6 297 TGTTTGCCTATTTCACCATGAG TTGAGAGGTACATGCATTTTGG
perfeita
M
Ah3TC32C11 (CT)7 (CA)7 (CT)7 161 CTCCAAAGTCCAAACACAAACA AAAACCCGATTCACAAACTGAC
composta
M
Ah3TC33D07 (CT)8 158 CGTCCATCGTCACCTCTTCTAC GTCTGTGTTGCTCGAACCTTTC
perfeita
M
Ah3TC33G10 (AG)11 (GA)13 212 CAACATAAACAACAACAATCTGAGAG TTTCTTGGGAACTGATGCTTTT
composta
M
Ah3TC34E12 (CT)7 127 GTTACGGATGCTTACACATTAT TCCTACTATACCAAACATAACATAAC
perfeita
P
Ah3TC35F03 (GA)10 240 GACCATTTAGAAACGCACGAAG CATGGAAGTGAAGTGTGTCTGC
perfeita
M
Ah3TC35F05 (AG)17 215 GATCAGCGAGAGAGAGGG CTACTCAACTTCTCCAAATATGC
perfeita
P
Ah3TC36C02 (CTC)7 228 TCCTTGGTGCTCCTAAAGTCAT TACTGTCTGATCCACTGGTTGG
perfeita
P
Ah3TC36C03 (CT)18 101 TGGCGAAGTAGTTTGAAAGGTT AGCGAGAGAGCAAGAGAGAGAA
perfeita
P
Ah3TC36D11 (AG)21 230 AGAGGCTTAGAGAAGTCTTATGAAAT CGATCTCTATCCTTGGACAATC
perfeita
M
Ah3TC36E09 (TC)10 273 GCTATGATGAATGGAGTGCGTA CACTCCCCTGTCTCAAACTCTT
perfeita
M
Ah3TC38A07 (AG)21 133 CAAAGCAAAAGATTTCACTGAG AGTGCTCTTTCTGCATATGTTT
perfeita
P
Ah3TC38C01 (TC)20 242 GACAGGTGGAGAGGGTATTCAG GCTTGTTCATGTTCCTGCATTA
perfeita
M
Ah3TC38D06 (AG)12 (AG)18 224 GGTTGTTGGAAGAAGACAAAGG AGACTCCTCCTTCCCTGCAT
imperfeita
P
Ah3TC38F01 (GA)27 258 TTTATGCATCACTTCAAGCAGG AGCTGTTGAGCTTGCATCCTAT
perfeita
P
Ah3TC38G04 (TC)18 (CT)14 (TC)7 348 TGAAGTGTTGAAGACAGTGCAA AAAACCTTGTTGCTAATGATGGA
composta
M
Ah3TC38H09 (TC)27 235 CCAGGTAAGATTTTCAGTTATT AGAGAATTTAGAAGATAAGGTGA
perfeita
P
Ah3TC39A10 (AG)12 (GA)9 136 GCTGCTAATCGAGATGCAAGTA TTTGTTTCACGCCAGTAGATTTT
composta
P
Ah3TC39B04 (CT)10 (CT)11 144 ATCTCGTTCATGCACACGTTAG ACAGTACTTGGCGTTAAGAGGG
imperfeita
P
Ah3TC39C01 (GA)19 180 AGGCGCGGTGATAGAAAAC GTTTTGCTGTTCGTCCCTAAAC
perfeita
P
Ah3TC39D01 (CT)9 111 AAGCCAAGCATATTAGGTTCCA ACCTGCAAAATATACTCCGACG
perfeita
M
Ah3TC39E08 (CT)21 130 AACAGAAAACGTTGAGTTGGCT AGAAGAAGAAGGAGGATGAGGAA
perfeita
P
Ah3TC39F01 (AG)34 (GA)7 (AG)16 171 ATCTATAAATTGGAGGATGAC CAAGATGAAAGCTCAAAA
composta
P
Ah3TC39F08 (CT)15 173 TATGAGGTGTTTCCAGTTTCCA GCAATCACAAGAAGATGGTTGA
perfeita
P
Ah3TC40A02 (CT)20 155 AAAATAACGACCACCTCCTTAAC GTTGTTGGCGAAAGAATAAGAA
perfeita
P
Ah3TC40B12 (AG)11 193 GTTCTTATCCGGGTGACTGAAA AGCACAGAATGCTAATGCTTCA
perfeita
M
Ah3TC40C03 (GA)26 116 TTGTTTGCTTTGTAAAATAGGTTGAC AAATAATCTCAGCCAAGGCGTA
perfeita
M
Ah3TC40D04 (CT)27 (TC)31 188 TTCCTTCCTCATATTCCTTCCA ATACTATCTCCGCCTTCAACCA
composta
P
Ah3TC40E08 (GA)22 127 TAGCAACAATAAATCGCAATGG TTGCTCATCATTTCGTGATTTC
perfeita
P
Ah3TC40E08_1 (GGA)7 124 AGAAATCACGAAATGATGAGCA GTGTTCACGATTCATGTCAATG
perfeita
M
Ah3TC40G04 (AG)10 (GA)15 284 GGTCAGAATGAGAAGCACACAA TTGGACTTCCCTAAACTTCTCG
composta
M
Ah3TC40H11 (AG)18 398 AATAATGTTGCAGGCCAAACTT GCATGCAAATGGAAATAAATCA
perfeita
Ah3TC41A05 (CT)20 163 TTTTCCATTACAAACGTTGCAC GGCAAGTGAAGTAAATTGTTGCT
perfeita
P
Ah3TC41A10 (GA)24 101 GTTTTGCTTCCTAATAATAAAGG ATTCCCAAACTCTCTTCTCTC
perfeita
P
Ah3TC41A11 (GA)31 142 CGATTGGATAGAATAAGGGACG GGTCCAAACTACCTAAGATGCG
perfeita
M
94
Ah3TC41A11_1 (AG)23 348 GATCCAAGCAGTTGGTCAAAAT GGTCCAAACTACCTAAGATGCG
perfeita
P
Ah3TC41C04 (CT)17 264 CACCGGGTATGACCTCTTTAAT TGTCGGATGCTAGTATGGTTTG
perfeita
M
Ah3TC41C05 (CT)6 281 TGTCCGTATTATTTGTGTTTCTTTG GGGATATGCGAACAGGAAAATA
perfeita
P
Ah3TC41C05_1 (TC)21 278 CCGTATTATTTGTGTTTCTTTGGA GGGATATGCGAACAGGAAAATA
perfeita
M
Ah3TC41C11 (AG)25 128 CACCAGAAAACATGAGAGCAAA CATCCACCTTCGTGTTAACCTC
perfeita
P
Ah3TC41E09 (CT)28 298 TTTAATTTTGACACGTTGGGTG ACACAGCAAAGCAACAGATGAT
perfeita
M
Ah3TC41F03 (AG)26 233 CCCTCAAATCGAAGCTAGAAAA CAGTGTCTCTGGCATCACTGTT
perfeita
Ah3TC42A02 (AG)21 107 AGAAATTGTGGAAATGAAGGGA CACTTACAGAGCTGTTTTCGCT
perfeita
P
Ah3TC42A02 (AG)21 107 AGAAATTGTGGAAATGAAGGGA CACTTACAGAGCTGTTTTCGCT
perfeita
P
Ah3TC42A05 (AG)13 169 GAACATGAAGGGACACACACAT AGAGAAGCTGGTTGGGTTGTAA
perfeita
P
Anexo 1:Informações sobre os primers desenvolvidos, indicando o nome, o motivo repetitivo, o tamanho do fragmento esperado, a seqüência dos primers, a classificação do
microssatélite e da presença ou ausência de polimorfismo (na última coluna o espaço em branco indica que o primer não amplificou).
.
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