( PDF ) Desenvolvimento e avaliação da atividade antiinflamatória de nanocarreadores lipídicos contendo diclofenaco no tratamento da artrite induida por adjuvante completo de Freund em ratas

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TATIANY J. DE FARIA

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA

DE NANOCARREADORES LIPÍDICOS CONTENDO DICLOFENACO NO

TRATAMENTO DA ARTRITE ADUJVANTE INDUZIDA POR CFA EM RATOS

Orientador: Prof. Dr. Carlos Rogério Tonussi

Co-orientadores: Profª Drª Elenara M. T. Lemos Senna

Prof. Dr. Anicleto Poli

FLORIANÓPOLIS - SC

2009

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TATIANY J. DE FARIA

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA

DE NANOCARREADORES LIPÍDICOS CONTENDO DICLOFENACO NO

TRATAMENTO DA ARTRITE ADUJVANTE INDUZIDA POR CFA EM RATOS

Tese apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Farmacologia, Centro

de Ciências Biológicas, Universidade

Federal de Santa Catarina, como

requisito parcial para obtenção do

grau de Doutor em Farmacologia.

FLORIANÓPOLIS - SC

2009

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AGRADECIMENTOS

Nem só de gráficos ou palavras se constroem uma tese. Durante esta trajetória, aprendi muito

além da Farmacologia; momentos que poderei levar comigo para o resto da minha vida pessoal

ou profissional. Agradeço:

Ao Prof. Rogério, por ter me convidado ainda na iniciação científica a fazer parte de sua

equipe. Obrigada por acreditar em mim e por me ensinar coisas valiosas que superaram a

ciência.

A Profª Elenara, por ter me ensinado o mundo da “nanotecnologia”.

Ao Prof. Anicleto, pela infindável paciência e confiança nestes quatro anos juntos do HPLC.

Estendo estas palavras a Tati, sempre prestativa nas análises cromatográficas.

Ao Prof. André Báfica, por ter ensinado a olhar minha tese com outros olhos e pelos

ensinamentos e discussões valiosas.

Ao Prof. Calixto, pelo uso do HPLC durante estes anos.

Á Carine, pela amizade e força, e pelos ensaios de validação.

Ao Thiago, pela amizade e ensaios de permeação.

Aos Colegas do LANEN, por terem me recebido com tanto carinho durante estes anos.

Aos Colegas do LIDI, por se tornarem minha segunda família nesta transição profissional.

Aos Colegas do Laboratório de Farmacotécnica, por dividirem seus conhecimentos e

compartilharem de uma amizade especial.

Aos Funcionários do Departamento de Farmacologia, pela dedicação nos serviços

prestados: Diana, Rita, Pedro e Murilo.

À Geci, simplesmente por ser a “Geci”. Vc é muito especial, nunca se esqueça disso!!

À Cris, que fez parte de momentos de desabafos e alegrias.

À Dé, por ser mais do que uma amiga, uma irmã. Ao Pastor Jota, pelo carinho de tantos anos.

À Tia Jane, por ser minha segunda mãe e por me aturar em momentos tão difíceis.

Ao meu Pai, pelo carinho e preocupação.

Em especial à minha mãe, Jô, que é exemplo de força e serenidade. TE AMO !! Obrigada por

seres minha amiga, irmã e filha. À minha sobrinha Kaká, pelo sorriso doce nas horas difíceis.

Agradeço a Deus, pelo dom da vida e da sobrevivência.

A você minha MÃE....

RESUMO

O tratamento de primeira linha em diversas doenças articulares está baseado

no uso de antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) que agem por inibir a enzima ciclo

oxigenase (COX). Entretanto, devido aos seus efeitos adversos, diclofenaco (DF)

como terapia a longo prazo em inflamação e dor crônicas, como a artrite reumatóide e

osteoartite é freqüentemente desencorajado. É importante ressaltar que estes efeitos

adversos podem ser efetivamente reduzidos pelo alcance da liberação vetorizada a

sítios específicos através de novas formulações. Estas formulações não somente

proporcionam a concentração de fármacos a órgãos específicos, mas também

permitem a redução da dose efetiva. Como resultado, o uso de novos sistemas de

liberação de fármacos como nanopartículas lipídicas e nanoemulsões tem ganho

aplicabilidade no tratamento de doenças crônicas. Uma vez que a administração de

nanocarreadores em articulações tem sido pobremente estudada, a meta deste estudo

foi desenvolver e avaliar a atividade antiinflamatória em modelo de CFA induzido em

ratos, de dois tipos de nanocarreadores. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) e

Nanoemulsões (NE) foram preparadas pela técnica de homogeneização a quente e

emulsificação a quente, respectivamente. NE apresentaram altos valores de teor de

diclofenaco ácido e NLS demonstraram eficiência de encapsulação acima de 90%. O

método cromatográfico demonstrou ser adequado para análise direta dos

nanocarreadores. O tamanho médio de particular para SLN foi de 250 nm e para NE

150 nm, e ambas as preparações apresentaram distribuição monomodal. O potencial

zeta para ambas a formulações foi de -60 mV. Em adição, SLN apresentaram-se mais

estáveis em diferentes condições de estocagem do que NE durante 30 dias. Os

estudos in vivo foram avaliados em artrite induzida por injeção intra-articular de CFA

em fêmeas Wistar e as análises foram realizadas através do teste de incapacitação

articular, aumento do diâmetro articular e migração celular. O animais foram tratados

com PBS, NE brancas ou NLS brancas, NE-DF, NLS-DF ou solução do fármaco.

Quando administradas pela via intravenosa, os nanocarreadores não apresentaram

redução sobre a incapacitação articular e edema articular quando comparado à

solução do fármaco. Entretanto, comparado aos nanocarreadores sem fármaco ou

solução de diclofenaco, NE-DF e SLN-DF inibiram ambos a nocicepção e aumento do

diâmetro articular no modelo de CFA quando administrados pela via intra-articular.

Para investigar os mecanismos na qual nanocarreadores de diclofenaco inibiram a

atividade antiinflamatória em articulações de ratos tratados com CFA, NE- ou SLN-DF

marcadas com DIL, um corante fluorescente, foram desenvolvidas. As análises de

citometria de fluxo indicaram que após injeção local, NE e NLS foram rapidamente

associadas a células fagocíticas. O efeito antiinflamatório observado nos estudos in

vivo quando nanocarreadores foram administradas localmente sugerem que um

aumento do tempo de permanência articular foi alcançado. O estudo ex vivo de

permeção demonstrou que NLS e NE contendo diclofenaco podem permear mais

efetivamente a pele de suínos em modelo de célula de célula de Franz quando

comparado ao fármaco livre. Sendo assim, a encapsulação do diclofenaco em

nanopartículas lipídicas e nanoemulsões podem proporcionar benefícios no aumento

do efeito terapêutico deste fármaco em doenças inflamatórias articulares.

ABSTRACT

The first-line treatment for many inflammatory diseases is based on the use

of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) that act by inhibiting the cyclo-

oxygenase (COX) enzyme. However, because of their adverse effects, diclofenac

(DF) as long-term therapy for chronic inflammation and pain in such diseases as

rheumatoid arthritis and osteoarthritis is often discouraged. It is important to note

that these adverse effects can be effectively reduced by achieving site-specific/

targeted delivery through new formulation approaches. These formulations not only

restrict the drug supply to specific organs but also allow the reduction of the

required dose. As a result, the use of new delivery systems such as nanoparticles

and nanoemulsions, has gained widespread applicability in the management of

chronic diseases. Since the use of nanocarriers administered into joints has not

been well studied, the aims of the present investigation were to development and

evaluate the anti-inflammatory activity in CFA model induced in rats of two kinds of

lipid nanocarriers. Solid Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanoemulsions (NE) were

prepared by hot homogenization and hot emulsification, respectively. NE showed

high values of acid diclofenac and SLN obtained entrapment efficiency higher 90%.

The chromatographic method proved to be adequate for direct analysis of

diclofenac in nanostructured drug carriers. The mean size for SLN was 250 nm and

NE 150 nm and both preparations showed monomodal distribution. The zeta

potencial for both formulations was approximately -60 mV. In addition, SLN showed

more stable in different storage conditions than NE during 30 days. In vivo studies

were evaluated in arthritis induced by intra-articular injection of CFA on female

Wistar rats and the analysis were performed by incapacitation test, articular

diameter and cell migration. The animals were treated with PBS, NE blank or SLN

blank, NE-DF, SLN-DF or drug solution. When administrated by intravenous via the

nanocarriers didn’t show reduction on articular incapacitation and articular edema

when compared to solution drug. However, compared to nanostructured blank or

drug solution, NE-DF and SLN-DF inhibited both nociception and articular diameter

increasing in CFA model when administrated into knee-joint. To gain insight into the

mechanisms in which nanostructured containing diclo inhibited pro-inflammatory

activity in the knee-joints of CFA-treated rats, NE- or SLN-diclo-stained particles

with DIL, a fluorescent probe were developed. Flow cytometry analysis indicated

that, following local injection, NE and SLN were rapidly associated by phagocytic

cells. The anti-inflammatory effect observed in the in vivo studies when

nanocarriers were administrated into knee-joint suggests that an increasing of the

carriers’ permanence time was achieved. The ex vivo permeation studies

demonstrated that SLN and NE containing diclofenac can to permeate more

effectively the pig skin in model of Franz cell when compared to solution drug.

Thus, the encapsulation of diclofenac in lipid nanoparticles and nanoemulsions

proved beneficial for the improvement therapeutic effect of this drug in inflammatory

articular disease.

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1: Revisão de Literatura

Figura 1. Figura ilustrativa de uma articulação de joelho normal (A) e de um

joelho com artrite reumatóide (B)......................................................................53

Figura 2. Estrutura química do diclofenaco de sódio........................................63

Figura 3. Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas: a)

fármaco dissolvido no núcleo oleoso das nanocápsulas; b) fármaco adsorvido à

parede das nanocápsulas; c) fármaco retido na matriz das nanoesferas; d)

fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz das nanoesferas... 69

Figura 4. Representação esquemática de uma nanopartícula lipídica sólida –

NLS....................................................................................................................71

Figura 5. Principais vias de internalização celular de nanocarreadores. A)

Fagocitose é um mecanismo que ocorre em células fagocíticas profissionais

com a participação de actina. B) Endocitose mediada por clatrina é uma ampla

via de internalização de nanopartículas associada com a formação de cristais

de clatrina e dependente de dinamina GTPase. C) Endocitose mediada por

caveolina ocorre em invaginações da membrana coberta por dímeros de

caveolina, também dependente de dinamina. D) Macropinocitose é uma via

baseada em actina que engolfa partículas e o meio extracelular com pouca

seletividade. E) Outras vias de endocitose podem estar envolvidas na

internalização de nanopartículas independentes de clatrina e caveolina..........89

CAPÍTULO 2: Avaliação do Potencial Pró-inflamatório Articular de

Nanocarreadores Poliméricos e Lipídicos

Figura 1. Esquema de preparação das nanocápsulas poliméricas................105

Figura 2. Esquema de preparação das Nanopartículas Lipídicas Sólidas......107

Figura 3. (A) sapatilhas metálicas acopladas na pata traseira do rato; (B)

aparelho para deambulação forçada (esquerda) e sistema de registro da

incapacitação articular (direita)........................................................................110

Figura 4. Esquema do experimento para avaliação do potencial pró-

inflamatório de nanopartículas em articulações naïves e pré-sensibilizadas..110

Figura 5. Avaliação do edema articular das articulações tíbio-femural...........111

Figura 6: Leucócitos mononucleares (MON) e polimorfonucleares (PMN) em

lâmina confeccionada para a contagem diferencial.........................................113

Figura 7. Efeito das nanopartículas na incapacitação, diâmetro articular e

contagem de leucócitos em articulações naive. N-PLA, N-PEG- PLA e NLS

foram injetadas na articulação tíbio-femural direita. Os animais controle

receberam PBS estéril. Incapacitação articular (A) e diâmetro articular (B)

foram tomados até a sexta hora e o leucograma do líquido sinovial foi realizado

após 6 horas (C)..............................................................................................119

Figura 8. Efeito das nanopartículas na incapacitação, diâmetro articular e

contagem de leucócitos em articulações pré-sensibilizada com carragenina. N-

PLA, N-PEG- PLA e NLS foram injetadas na articulação tíbio-femural direita.

Os animais controle receberam PBS estéril. Incapacitação articular (A) e

diâmetro articular (B) foram tomados até a sexta hora e o leucograma do

líquido sinovial foi realizado após 6 horas (C).................................................120

CAPÍTULO 3: Desenvolvimento de Nanocarreadores Lipídicos contendo

diclofenaco

Figura 1. Esquema de preparação das Nanopartículas Lipídicas Sólidas......132

Figura 2. Esquema de preparação das Nanopartículas Lipídicas Sólidas......133

Figura 3. Esquema de preparação de Nanoemulsões....................................134

Figura 4. Valores de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial

zeta de NLS. As partículas estão identificadas como P 0,5% poloxamer 188, T

0,05; 0,1; 0,2 e 0,5% de taurocolato de sódio. (A) Tamanho de partícula (nm). *

representa diferença mínima estatística entre as partículas de poloxamer 188 e

as partículas de taurocolato em todas as concentrações, bem como a diferença

mínima estatística entre as partículas de taurocolato de 0,05% e as demais

concentrações. Não houve diferença no tamanho das partículas de poloxamer

188 e as partículas de taurocolato 0,05% (p<0,05). Todos os resultados foram

expressos como média ± S.D. (ANOVA de uma via seguida de post hoc de

Tukey). (B) Índice de polidispersão (i.p.) de NLS. Não houve diferença no

índice de polidispersão entre as partículas de poloxamer 188 e as partículas de

taurocolato. (C) Valores de potencial zeta (mV).............................................142

Figura 5. (A) Valores de teor de fármaco (µg/ml); (B) eficiência de

encapsulação (%); (C) tamanho de partícula (nm); (D) taxa de recuperação (%)

e (E) potencial zeta (mV) obtido para as formulações de NLS. ** representa a

diferença estatística em relação à NE (Dy:OR 0:100) e as demais preparações

0.01)............................................................................................................147

Figura 6. Valores de teor de fármaco, tamanho de partícula e taxa de

recuperação para as formulações de Nanoemulsão. (A) teor de fármaco

(µg/ml); (B) taxa de recuperação (%); (C) tamanho de partícula (nm).

diferença

estatística em relação à NE 2.5 mg (p

0,05)...................................................149

Figura 7. Estudo de estabilidade de NLS a 4°C e 25°C. (A) Teor de diclofenaco

(µg/ml); (B) Eficiência de encapsulação (%); (C) Tamanho de partícula (nm) e

(D) pH..............................................................................................................155

Figura 8. Estudo de estabilidade de NE a 4°C ou 25°C. (A) Teor de diclofenaco

(µg/ml); (B) pH; (C) Tamanho de partícula (nm) e (D) Potencial Zeta (mV)....157

Figura 9. Fotografias de formulações contendo diclofenaco obtidas após 30

dias de preparo e armazenadas a 4°C................ ............................................158

CAPÍTULO 4: Avaliação da Atividade Antiinflamatória de Nanocarreadores

Lipídicos contendo diclofenaco

Figura 1. Esquema do experimento para construção da curva dose-resposta

intraperitoneal de diclofenaco livre em modelo de inflamação articular induzida

por CFA............................................................................................................168

Figura 2. Injeção endovenosa por punção gengival realizada para

administração intravenosa de diclofenaco livre e encapsulado para os estudos

de avaliação da resposta antiinflamatória do fármaco no modelo de

incapacitação articular.....................................................................................169

Figura 3. Esquema do experimento para avaliação da atividade antiinflamatória

de NLS e NE contendo diclofenaco após administração intravenosa em modelo

de inflamação articular induzida por CFA........................................................170

Figura 5. Esquema do experimento para avaliação da atividade antiinflamatória

de NLS e NE contendo diclofenaco após administração intra-articular em

modelo de inflamação articular induzida por CFA...........................................171

Figura 6. Esquema do experimento para avaliação da liberação de TNF após

administração de SLN e NE com ou sem diclofenaco e solução de fármaco

não-encapsulado em modelo de inflamação articular induzida por CFA.........172

Figura 7. Efeito do tratamento intraperitoneal com diclofenaco na incapacitação

(tempo de elevação de pata, TEP) (A); diâmetro articular (B) induzidos por

CFA. Diclofenaco (0,5; 5,0 e 10,0 mg/kg; i.p.) foi administrado 23 h após o CFA.

O grupo controle recebeu PBS no mesmo volume. A contagem total de

leucócitos do fluido sinovial foi realizada no sétimo dia após o tratamento. Cada

ponto / barra representa a média ± E.P.M. de seis animais............................174

Figura 8. Efeito do tratamento intravenoso com diclofenaco livre ou

encapsulado na forma de nanoemulsões (NE) na incapacitação (tempo de

elevação de pata, TEP) (A); diâmetro articular (B) induzidos por CFA.

Diclofenaco (50; 100 e 250 µg/kg; i.v.) foi administrado 23 h após o CFA. O

grupo controle recebeu PBS ou NE sem fármaco no mesmo volume (2 ml). A

contagem total de leucócitos do fluido sinovial foi realizada no sétimo dia após

o tratamento. Cada ponto / barra representa a média ± E.P.M. de seis

animais.............................................................................................................176

Figura 9. Efeito do tratamento intravenoso com diclofenaco livre ou

encapsulado na forma de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) na

incapacitação (tempo de elevação de pata, TEP) (A); diâmetro articular (B)

induzidos por CFA. Diclofenaco livre ou encapsulado (50; 100 e 250 µg, kg; i.v.)

foi administrado 23 h após o CFA. O grupo controle recebeu PBS ou NE sem

fármaco no mesmo volume (2 ml). A contagem total de leucócitos do fluido

sinovial foi realizada no sétimo dia após o tratamento. Cada ponto / barra

representa a média ± E.P.M. de seis animais. ...............................................177

Figura 10. Efeito do tratamento intra-articular com diclofenaco livre ou

encapsulado na forma de nanoemulsões (NE) na incapacitação (tempo de

elevação de pata, TEP) (A); diâmetro articular (B) induzidos por CFA.

Diclofenaco livre ou encapsulado (1,6; 160 ou 400 ng, i.a.) foi administrado 23 h

após o CFA. O grupo controle recebeu PBS ou NE sem fármaco no mesmo

volume (2 ml). A contagem total de leucócitos do fluido sinovial foi realizada no

sétimo dia após o tratamento. Cada ponto / barra representa a média ± E.P.M.

de seis animais................................................................................................179

Figura 11. Efeito do tratamento intra-articular com diclofenaco livre ou

encapsulado na forma de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) na

incapacitação (tempo de elevação de pata, TEP) (A); diâmetro articular (B)

induzidos por CFA. Diclofenaco livre ou encapsulado (1,6; 160 ou 400 ng, i.a.)

foi administrado 23 h após o CFA. O grupo controle recebeu PBS ou NE sem

fármaco no mesmo volume (2 ml). A contagem total de leucócitos do fluido

sinovial foi realizada no sétimo dia após o tratamento. Cada ponto / barra

representa a média ± E.P.M. de seis animais.................................................180

CAPÍTULO 5: Avaliação da Associação de Nanocarreadores Lipídicos

contendo Diclofenaco a Células Fagocíticas Articulares

Figura 1. Esquema do experimento para avaliação da influência da

concentração de nanocarreadores lipídicos na associação de células

fagocíticas articulares após administração intra-articular em modelo de

inflamação articular induzida por CFA.............................................................196

Figura 2. Esquema do experimento para avaliação da associação de

nanocarreadores lipídicos a células fagocíticas articulares em função do pós-

tratamento intra-articular em modelo de inflamação induzido por CFA...........197

Figura 3. Esquema do experimento para avaliação do tipo de associação de

nanocarreadores lipídicos a células fagocíticas articulares em função do tempo,

após administração intra-articular em modelo de inflamação articular induzida

por CFA............................................................................................................200

Figura 4. Esquema do experimento para avaliação da liberação de TNF após

administração de NLS e NE com ou sem diclofenaco em modelo de inflamação

articular induzida por CFA...............................................................................202

Figura 5. Fotomicrografia de nanopartículas contendo marcador lipofílico

Vybrant DIL (Molecular Probes) obtida por microscopia de fluorescência (40x).

Os nanocarreadores foram utilizados na avaliação da associação a células

fagocíticas articulares nos estudos de citometria de fluxo...............................204

Figura 6. Exemplos de dot plots obtidos por citometria de fluxo da avaliação da

associação de nanocarreadores lipídicos fluorescentes contendo diclofenaco

após administração intra-articular. O exemplo se refere ao estudo de

nanoemulsões contendo Vybrant DIL injetadas e diferentes diluições em PBS

estéril. As Figuras da coluna à esquerda se referem aos dot plots de

nanoemulsões não marcadas com o corante. A) população total de células

articulares; B) população de macrófagos; C) população de granulócitos. As

setas vermelhas referem-se à população de macrófagos presente no líquido

sinovial de animais inflamados com CFA........................................................208

Figura 7. Influência na associação de nanocarreadores lipídicos fluorescentes,

a células fagocíticas articulares em função da concentração de partículas

administradas na articulação de animais inflamados com CFA analisado por

citometria de fluxo. A) NLS = nanopartículas lipídicas sólidas sem fármaco;

NLS-DF= nanopartículas lipídicas sólidas contendo diclofenaco; B) NE =

nanoemulsões sem fármaco; NE-DF= nanoemulsões contendo diclofenaco. Os

gráficos foram plotados através da Média ± Desvio Padrão de dois

experimentos independentes (n= 3 animais por grupo)..................................209

Figura 8. Avaliação da associação de nanocarreadores lipídicos fluorescentes,

a células fagocíticas articulares em função do tempo de pós-tratamento de

partículas administradas na articulação de animais inflamados com CFA

analisado por citometria de fluxo. A) NLS = nanopartículas lipídicas sólidas sem

fármaco; NLS-DF= nanopartículas lipídicas sólidas contendo diclofenaco; B)

NE = nanoemulsões sem fármaco; NE-DF= nanoemulsões contendo

diclofenaco (n= 3 animais por grupo)...............................................................211

Figura 9. Avaliação do tipo de associação de nanocarreadores lipídicos

fluorescentes contendo diclofenaco, a células fagocíticas articulares de animais

inflamados com CFA após análise por citometria de fluxo. A) NLS-DF=

nanopartículas lipídicas sólidas contendo diclofenaco; B) NE-DF=

nanoemulsões contendo diclofenaco (n= 3 animais por grupo)......................214

Figura 10. Avaliação da liberação de TNF após administração in vivo de

Nanopartículas Sólidas Lipídicas e Nanoemulsões sem ou contendo

diclofenaco 3h; 12; 24; 48; 72 e 96 horas após o tratamento com os

nanocarreadores ou fármaco livre na mesma dose.........................................215

CAPÍTULO 6: Avaliação da Permeação Cutânea ex vivo de

Nanocarreadores Lipídicos contendo Diclofenaco

Figura 1. Dissecação da pele de orelha suína (à equerda) e tecido pronto para os

experimentos, após descarte da hipoderme (à direita)........................................223

Figura 2. Disposição das células de difusão tipo Franz no equipamento (à

esquerda) e após montagem, para aplicação dos nanocarreadores e da solução

do fármaco não-encapsulado...............................................................................225

Figura 3. Curva de calibração diclofenaco ácido em meio PBS:EtOH (70:30)

obtida após análise por CLAE.........................................................................231

Figura 4. Cinética de permeação ex vivo de NLS e NE..................................233

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1: Revisão de Literatura

CAPÍTULO 2: Avaliação do Potencial Pró-inflamatório Articular de

Nanocarreadores Poliméricos e Lipídicos

Tabela 1. Valores de tamanho de partícula (nm), índice de polidispersão (i.p.) e

potencial zeta (mV) de nanopartículas poliméricas e lipídicas........................117

Capítulo 3: Desenvolvimento de Nanocarreadores Lipídicos contendo

diclofenaco

Tabela 1. Valores obtidos nos ensaios de linearidade, limite de detecção e

limite de quantificação para o diclofenaco ácido.............................................152

Tabela 2. Valores encontrados no teste de repetibilidade de NLS e NE (7,5

µg/ml)...............................................................................................................153

Tabela 3. Valores encontrados no teste de recuperação para NLS e NE.......153

Tabela 4. Valores encontrados na determinação da eficiência de encapsulação

e teor de fármaco para NLS e NE de diclofenaco...........................................154

CAPÍTULO 4: Avaliação da Atividade Antiinflamatória de Nanocarreadores

Lipídicos contendo diclofenaco

CAPÍTULO 5: Avaliação da Associação de Nanocarreadores Lipídicos

contendo Diclofenaco a Células Fagocíticas Articulares

Tabela 1. Valores de teor de diclofenaco (µg/ml) e eficiência de encapsulação

(%) obtidos por CLAE a partir de formulações de NLS e NE fluorescentes

empregadas na avaliação da associação a células fagocíticas articulares no

estudo de citometria de fluxo...........................................................................204

CAPÍTULO 6: Avaliação da Permeação Cutânea ex vivo de

Nanocarreadores Lipídicos contendo Diclofenaco

Tabela 1. Solubilidade do diclofenaco nas soluções de PBS:etanol e

concentração máxima permitida para manutenção de condições sink... .......231

Tabela 2. Permeação do diclofenaco através da pele de orelha de porco: fluxo,

coeficiente de permeabilidade e tempo de latência.........................................233

LISTA DE ABREVIATURAS

AINES - Antiinflamatório Não-Esteroidal

AR - Artrite Reumatóide

AUC - Área abaixo da curva

CFA - Complete Freund Adjuvant

DA - Diâmetro Articular

E.P.M. - Erro Padrão da Média

EDTA - Etilenodiaminotetracético

i.a. - Intra-articular

i.p. - Intraperitoneal

i.v. - Intravenoso

IFA - Complete Freund Adjuvant

IL-1 - Interleucina do tipo 1

- Fluxo de Steady State

kDa - quilo dalton

Kp - Coeficiente de Permeabilidade

MON - Mononucleares

NE - Nanoemulsões

NLS - Nanopartículas Lipídicas Sólidas

PBS - Phosphate Buffer Saline

PLA - Polylactic Acid

PLA-PEG - Poly(lactic acid)-poly(ethylene glycol)

PLGA - Poly(lactic-co-glycolic acid)

PMN - Polimorfonucleares

PVA - Álcool Polivinílico

PVP - Polivinilpirrolidona

S.D. - Standard deviation

SLN - Solid Lipid Nanoparticles

SPION - Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

TEP - Tempo de Elevação da Pata

TNF - Tumor Necrosis Factor

ÍNDICE

INTRODUÇÂO...................................................................................................43

OBJETIVOS......................................................................................................48

CAPÍTULO 1: Revisão de Literatura

1. A ARTRITE REUMATÓIDE...........................................................................50

1.1. Dor e Inflamação na Artrite Reumatóide......................................54

2. ARTRITE INDUZIDA POR ADJUVANTE COMPLETO DE FREUND .........55

3. A TERAPIA DA ARTRITE REUMATÓIDE E AS LIMITAÇÕES NO USO DE

FÁRMACOS ANTIINFLAMATÓRIOS NÃO-ESTEROIDAIS (AINES)..............59

4. NOVAS ESTRATÉGIAS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS

ARTICULARES E A UTILIZAÇÃO DE NANOCARREADORES DE

FÁRMACOS......................................................................................................66

4.1. Nanopartículas...............................................................................67

4.1.2. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS)..................................69

4.1.3. Nanoemulsões (NE)................................................................75

4.2. A utilização de sistemas nanocarreadores de fármacos em

doenças articulares.................................................................................79

5. A VIA TÓPICA COMO ALTERNATIVA NO TRATAMENTO DE DOENÇAS

INFLAMATÓRIAS ARTICULARES ATRAVÉS DE NANOCARREADORES

PARA ADMINISTRAÇÃO CUTÂNEA...............................................................83

6. LIBERAÇÃO INTRACELULAR DE FÁRMACOS ATRAVÉS DA

ADMINISTRAÇÃO DE NANOCARREADORES...............................................87

CAPÍTULO 2: Avaliação do Potencial Pró-inflamatório Articular de

Nanocarreadores Poliméricos e Lipídicos

METODOLOGIA

2.1. Preparação das Nanopartículas Poliméricas e Lipídicas.........105

2.2. Determinação do tamanho, índice de polidispersão e potencial

zeta das Nanopartículas.....................................................................107

2.3. Avaliação do potencial pró-inflamatório de nanopartículas em

articulações naïve ou pré-sensibilizadas com carragenina............108

2.3.1. Animais.................................................................................108

2.3.2. Avaliação da incapacitação articular.....................................108

2.3.3. Avaliação do edema articular.................................................110

2.3.4. Avaliação do leucograma do fluido sinovial...........................111

2.3.5. Análise estatística...................................................................113

RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................114

CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES...........................................................124

REFERÊNCIAS...............................................................................................125

CAPÍTULO 3: Desenvolvimento de Nanocarreadores Lipídicos contendo

diclofenaco

METODOLOGIA

3.1. Obtenção do diclofenaco na forma de ácido livre (DF)............130

3.2. Desenvolvimento de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) e

Nanoemulsões (NE)............................................................................130

3.2.1. Estudo das condições de preparação de NLS...................130

3.2.1.1. Determinação da concentração de tensoativo na

preparação das nanopartículas lipídicas sólidas (NLS)........130

3.2.1.2. Determinação da proporção lipídio/óleo na

preparação de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS)

contendo diclofenaco ácido..................................................132

3.2.2. Estudo das condições de preparação de Nanoemulsões (NE)

contendo diclofenaco....................................................................133

3.3. Determinação do tamanho de partícula, índice de polidispersão

e potencial zeta de NLS e NE.............................................................135

3.4. Determinação da eficiência de encapsulação e teor de

diclofenaco nas suspensões por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE).................................................................................135

3.4.1. Condições Cromatográficas...............................................136

3.4.2. Validação do método de doseamento do diclofenaco por

CLAE.............................................................................................136

3.4.2.1. Linearidade.............................................................136

3.4.2.2. Especificidade..........................................................136

3.4.2.3. Precisão...................................................................137

3.4.2.4. Exatidão...................................................................137

3.4.2.5. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação

(LOQ)....................................................................................138

3.4.2.6. Determinação da Eficiência de Encapsulação e Teor

de fármaco............................................................................138

3.5. Estudo de estabilidade de nanopartículas lipídicas sólidas e

nanoemulsões.....................................................................................139

RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................140

CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES...........................................................159

REFERÊNCIAS...............................................................................................162

CAPÍTULO 4: Avaliação da Atividade Antiinflamatória de Nanocarreadores

Lipídicos contendo diclofenaco

METODOLOGIA

4.1. Curva dose-resposta intraperitoneal de diclofenaco em modelo

de inflamação articular induzido por CFA........................................166

4.1.2. Animais...............................................................................166

4.1.3. Administração intraperitoneal de diclofenaco em animais com

inflamação articular induzida por CFA..........................................166

.2. Curva dose-resposta intravenosa de diclofenaco em modelo de

inflamação articular induzido por CFA.............................................168

4.2.1. Animais...............................................................................168

4.2.2. Administração intravenosa de diclofenaco livre e encapsulado

em NLS e NE...................................................................................168

4.3. Curva dose-resposta intra-articular de diclofenaco livre e

encapsulado em NLS e NE em modelo de inflamação articular

induzida por CFA................................................................................170

4.3.1. Animais................................................................................170

4.3.2. Administração intra-articular de diclofenaco livre e

encapsulado em NLS e NE.............................................................170

4.3.3. Avaliação da liberação de TNF após administração in vivo de

Nanopartículas Sólidas Lipídicas e Nanoemulsões.........................171

RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................173

CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES...........................................................187

REFERÊNCIAS...............................................................................................189

CAPÍTULO 5: Avaliação da Associação de Nanocarreadores Lipídicos

contendo Diclofenaco a Células Fagocíticas Articulares

METODOLOGIA

5.1. Preparação e caracterização dos nanocarreadores lipídicos

fluorescentes.......................................................................................193

5.1.2. Determinação do tamanho, índice de polidispersão e

potencial zeta das nanopartículas.................................................193

5.2. Indução da inflamação articular por CFA..................................194

5.3. Avaliação da influência da concentração de nanocarreadores

fluorescentes na associação de células fagocíticas articulares....195

5.4. Avaliação da associação das partículas por células fagocíticas

articulares por citometria de fluxo....................................................198

5.5. Avaliação do tipo de associação dos nanocarreadores a células

fagocíticas articulares........................................................................201

RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................203

CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES...........................................................216

REFERÊNCIAS...............................................................................................217

CAPÍTULO 6: Avaliação da Permeação Cutânea ex vivo de

Nanocarreadores Lipídicos contendo Diclofenaco

METODOLOGIA

6.1. Avaliação da permeação cutânea ex-vivo do diclofenaco ácido

encapsulado em nanocarreadores lipídicos........................................222

6.1.1 Preparação das membranas para difusão...............................222

6.1.2. Cinética de permeação cutânea..............................................223

6.1.2.1. Seleção do meio receptor..........................................223

6.1.2.2 Cinética de permeação cutânea propriamente dita....224

6.1.2.3 Quantificação do diclofenaco ácido por cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE)............................................225

6.1.2.3.1 Condições cromatográficas........................225

6.1.2.3.2 Construção da curva de calibração do

diclofenaco ácido......................................................226

6.1.2.3.3 Determinação do diclofenaco ácido no meio

receptor........................................................................226

6.1.2.4. Determinação dos parâmetros de permeação

cutânea.....................................................................................227

6.2. Análise estatística........................................................................227

RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................228

CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES...........................................................236

REFERÊNCIAS...............................................................................................237

CONCLUSÕES FINAIS...................................................................................238

INTRODUÇÃO

O diclofenaco é um fármaco de ampla utilização pertencente à classe

dos antiinflamatórios não-esteroidais, utilizado em processos reumáticos. O

nível plasmático deste fármaco aumenta rapidamente após a administração

oral, porém o mesmo sofre efeito de primeira passagem hepática quando

administrado por esta via, ficando 50 a 60% biodisponível. Apesar de ser

considerado um fármaco de primeira escolha no tratamento da dor aguda e

crônica em condições inflamatórias (Todd e Sorkin, 1998), apresenta sérios

efeitos adversos (no sistema nervoso central, reações dermatológicas,

alterações na função do fígado e efeitos hematológicos), sendo que os mais

freqüentes são os relacionados ao trato gastrointestinal (Ciucci, 1979;

Ciccolunghi, 1979; Todd e Sorkin, 1998).

Atualmente, uma alternativa acessível para melhorar a seletividade, a

eficiência e a especificidade da substância ativa é associá-la a um sistema

carreador, como as nanopartículas e ou emulsões nanométricas (Andrieu e

col., 1989; Cappel e Kreuter, 1991; Ammoury e col., 1993; Guterres e col.,

1995b; Calvo e col., 1996). As nanopartículas são sistemas coloidais de

tamanho inferior a 1 µm, geralmente de natureza polimérica ou lipídica,

podendo apresentar uma estrutura matricial ou de reservatório, sendo

denominadas nanoesferas e nanocápsulas, respectivamente. O objetivo

principal da nanotecnologia é projetar sistemas de transporte de fármacos

miniaturizados, visando melhorar a estabilidade, diminuir a dose terapêutica e

conseqüentemente os efeitos colaterais, bem como aumentar a eficácia do

tratamento (Legrand e col., 1999; Magalhães e col., 2000).

Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) foram desenvolvidas no início dos

anos 90 como alternativa a outros sistemas de fármacos como as emulsões,

lipossomas e as nanopartículas poliméricas. Na sua produção se somam as

vantagens das partículas sólidas com as das emulsões e dos lipossomas. As

vantagens da utilização de nanopartículas lipídicas sólidas como vetores

incluem: a utilização de lipídios fisiológicos em sua formulação, a ausência de

solventes orgânicos em sua preparação e a possibilidade de serem utilizadas

num amplo espectro pela administração através da via cutânea, oral ou

intravenosa (Garzón e Fernández, 2009). Nanoemulsões podem ser

classificadas como uma dispersão nanométrica de gotículas oleosas em uma

fase aquosa externa, estabilizada por um sistema tensoativo adequado

(Saettone, Giannaccini e Monti, 2000; Vandamme, 2002). Estas apresentam

vantagens em relação ao aumento da solubilidade de fármacos lipofílicos, bem

como, o aumento da permeação cutânea demonstrado em modelos ex vivo e in

vivo.

A utilização de vetores nanoparticulados construídos a partir de diversos

tipos de materiais e contendo diferentes classes de fármacos antiinflamatórios,

anti-reumáticos ou analgésicos, tem apresentado nos últimos 4 anos,

resultados promissores no tratamento da artrite em modelos experimentais. Os

estudos apontam que a melhora do tratamento está principalmente associada

ao efeito de liberação prolongada, aumento da vetorização do fármaco ao

tecido articular e diminuição da toxicidade quer seja pela via local ou sistêmica.

A possibilidade de se obter uma concentração elevada de diclofenaco no local

da lesão e de reduzir os efeitos colaterais gastrointestinais ocasionados pelo

mesmo conduziu o desenvolvimento e o estudo da atividade antiinflamatória de

nanocarreadores lipídicos contendo diclofenaco. Cabe ressaltar que não

existem estudos específicos sobre o assunto que comprovem a estabilidade do

diclofenaco nanoencapsulado, e que avaliem a atividade farmacológica após a

administração intra-articular, o que conFigura a originalidade desta proposta de

desenvolvimento tecnológico desse tipo de preparação. As formulações

desenvolvidas estão em fase de depósito de patente junto ao Departamento de

Propriedade Intelectual da Universidade Federal de Santa Catarina, DPI/UFSC.

REFERÊNCIAS

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PUISIEUX, F.; BENITA, S. Indomethacin-loaded poly(D,L-lactide)

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ANDRIEU, V.; FESSI, H.; DUBRASQUET, M.; DEVISSAGUET, J.P. PUISIEUX,

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Rehabilitation. 2: 116-121, 1979.

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GUTERRES, S.S.; FESSI, H.; BARRATT, G.; PUISIEUX, F.; DEVISSAGUET,

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TODD, P.A.; SORKIN, E.M. Diclofenac sodium: a reappraisal of its

pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy.

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VANDAMME, T.F. Progr. Retinal Eye Res. 21: 15-34, 2002.

OBJETIVOS

1) Objetivo Geral:

Este trabalho tem como principal objetivo, desenvolver e avaliar a atividade

antiinflamatória de nanocarreadores lipídicos contendo diclofenaco em modelo

de artrite adjuvante induzida por CFA m ratos.

2) Objetivos Específicos:

• Avaliar o potencial pró-inflamatório de nanocarreadores lipídicos e

poliméricos em articulações naïve ou pré-sensibilizadas.

• Preparar e caracterizar nanocarreadores lipídicos do tipo nanopartículas

lipídicas sólidas e nanoemulsões contendo diclofenaco.

• Avaliar a estabilidade dos nanocarreadores frente a diferentes condições

de armazenamento.

• Avaliar o potencial antiinflamatório de nanocarreadores lipídicos

contendo diclofenaco em modelo de artrite adjuvante induzida por CFA

em ratos.

• Investigar a associação de nanocarreadores lipídicos a células

fagocíticas articulares.

• Avaliar a permeação cutânea ex vivo de nanocarreadores lipídicos

contendo diclofenaco, empregando célula de difusão de Franz.

CAPÍTULO 1:

REVISÃO DE LITERATURA

1. A ARTRITE REUMATÓIDE

Dentre as várias artropatias, a artrite reumatóide (AR) é uma das

patologias auto-imunes mais recorrentes, que apresenta prevalência mundial

de 1 a 1,5% em diversas etnias, com uma maior incidência em mulheres mas,

em ambos os sexos, a faixa etária encontra-se entre 30 a 50 anos (Carvalho e

col., 2000; Khurana e Berney, 2005; Ministério da Saúde, 2002). O motivo para

esta diferença entre sexos é desconhecido, mas, pressupõe-se estar

relacionado com questões hormonais e funções imunológicas (Khurana e

Berney, 2005). Pesquisas recentes realizadas nos Estados Unidos revelaram

que, entre os indivíduos com artrite, encontram-se principalmente mulheres

idosas, com menor instrução, com peso corporal acima do normal ou obesas,

apresentando freqüentemente ansiedade e depressão. Estas mulheres também

apresentaram limitações funcionais e sociais, comorbidades (cardiopatias e

osteoporose) e não realizavam atividade física (Sihih e col., 2006).

No Brasil, estima-se que a AR atinja 1% da população (Ministério da

Saúde, 2002). Devido ao seu caráter progressivo, os indivíduos que

desenvolvem AR apresentam deformidades e incapacidade funcional. Diante

disto, esta doença provoca importante impacto social e econômico, resultado

do afastamento do trabalho e pelo gasto do serviço de saúde pública com a

terapêutica (Laurindo e col., 2002). Um estudo epidemiológico realizado na

capital mais populosa do Brasil, São Paulo, por Louzada-Júnior e

colaboradores (2007), revelou que dos 1.381 pacientes, 86% eram mulheres,

caucasianas, entre a quarta e quinta década com um tempo médio de doença

de 7,2 anos. Uma minoria (5%) foi classificada como grave, e a maioria

apresentavam classe funcional I e II. As manifestações extra-articulares

ocorreram em 23,3%, e o fator reumatóide era positivo em 71% dos pacientes.

Somente um terço possuía acompanhamento radiológico e estava trabalhando.

Um quarto dos pacientes estava freqüentando programas de reabilitação, e um

terço possuía avaliações de qualidade de vida e de atividade da doença. Este

estudo regional é uma pequena amostra da realidade em nosso país, e faz da

AR uma das principais patologias articulares alvo de estudos, principalmente

no que diz respeito ao controle da doença e à melhora da qualidade de vida

através da descoberta de novas ações terapêuticas.

Doença crônica, sistêmica e inflamatória, cuja etiologia ainda não se

encontra elucidada, a artrite reumatóide apresenta sinovite com presença de

anticorpos e de tecido granulomatoso que invade e destrói as estruturas

periarticulares como cartilagem articular, osso subcondral, tendões e

ligamentos (Firestein, 2003; Khurana e Berney, 2005). De maneira geral, esta

afecção acomete pequenas e grandes articulações de forma simétrica ou não,

com rigidez matinal, fadiga, perda de peso e apresenta um curso clínico

flutuante com períodos de melhora e exacerbação dos sintomas articulares. O

edema da sinóvia e as estruturas periarticulares contribuem para a rigidez por

interferir na mecânica normal da articulação (Gomes, 2008).

O diagnóstico é realizado através de testes clínicos pela atividade da

doença, e laboratorias através de marcadores como a proteína C reativa,

velocidade de eritrossedimentação e estudos radiológicos (Cailliet, 2001;

Laurindo e col., 2002). A inflamação da sinóvia tem uma duração mínima de

seis semanas segundo os critérios do Colégio Americano de Reumatologia

(Macgregor, 1995). O curso da doença pode variar desde acometimento leve e

intermitente, até a forma grave e progressiva, e em 55-65% dos casos, inicia

insidiosamente de semanas a meses. Dos pacientes, 8-15% tem o início agudo

dos sintomas que atingem o ponto máximo em poucos dias (Brandão, Ferraz e

Zerbini, 1997).

A artrite reumatóide envolve a participação do antígeno leucocitário

específico ao gene humano HLA-DR (do inglês, human leukocyte antigens) que

reside no complexo de histocompatibilidade e promove a apresentação de

antígeno. A célula apresentadora de antígeno reconhece o HLA-DR e o

apresenta para os linfócitos T. Estes linfócitos ativados proliferam e dão origem

aos clones de células T. Na membrana sinovial, os linfócitos T CD4+ secretam

mediadores inflamatórios, como a interleucina do tipo 1 (IL-1) e fator de

necrose tumoral (TNF). A reação se amplifica com a produção destas e de

outras citocinas pelos macrófagos, sinoviócitos, fibroblastos e células

endoteliais (Laurindo e col., 2002). A sinóvia apresenta-se edemaciada, com

infiltrado leucocitário proeminente, formando folículos linfóides ricos em

linfócitos T e plasmócitos. Macrófagos induzem a formação de uma rede

extensa de vasos sanguíneos, caracterizada como angiogênese da membrana

sinovial. Linfócitos circulantes, principalmente os linfócitos T, aderem-se ao

endotélio de vênulas pós-capilares e migram através de suas paredes,

alojando-se em vasos abaixo da sinóvia. Os linfócitos T ativam as células B

que se proliferam e se diferenciam em plasmócitos que produzem fatores

reumatóides. Estes formam complexos imunes que aumentam a

permeabilidade vascular e promovem o acúmulo de células polimorfonucleares.

Sob a ação dos fatores de crescimento e proliferação dos fibroblastos e

angiogênese, há formação de um tecido granulomatoso em particular, na

região de contato entre a membrana sinovial, cartilagem e osso com

características tumorais capaz de invadir e destruir a articulação (Gomes,

2008).

Figura 1. Figura ilustrativa de uma articulação de joelho normal (A) e de um

joelho com artrite reumatóide (B).

A etiologia da doença ainda encontra-se obscura, entretanto já se tem

descrito que fatores causais como susceptibilidade genética, artritogênio

exógeno primário, reação auto-imune nas articulações sinoviais e mediadores

do dano articular constituem as principais causas para evolução da doença

(Robins, 1996). Diversos estudos têm sido desenvolvidos na elucidação da

Cápsula Articular

Membrana

Espaço Articular

Cartilagem

Cápsula Articular

Osso

Osteoclasto

Fibroblasto

Macrófago

Célula Dendrítica

Célula T

Plasmócito

Célula B

Angiogênese

Mastócito

Linhagem

Sinovial

Hiperplásica

Neutrófilo

Pannus

Adaptado: www.ff.up.pt/.../artrite_reumatóide.html. (Acesso em 20/06/2009)

origem desta afecção, o que poderá proporcionar contribuições na prevenção,

diagnóstico, e terapia da doença.

1.1. Dor e Inflamação na Artrite Reumatóide

A dor é um dos principais sintomas de articulações acometidas pela

artrite (Schaible e Grubb, 1993). Esta sensação é caracterizada por

hiperalgesia e dor espontânea (dor em repouso). Segundo a IASP

(International Association for the Study of Pain), hiperalgesia é definida como

uma resposta aumentada a um estímulo doloroso e a dor, é definida como um

experiência sensitiva e emocional desagradável, associada a danos reais ou

potenciais do tecido (Meskey e Bogduk, 1994).

Décadas antes de evidências experimentais diretas, postulou-se a

existência de nociceptores, fibras nervosas específicas que agiriam como um

sistema imediato de alerta, capazes de detectar danos teciduais ou estímulos

lesivos (McMahon e Koltzenburg, 1990). A partir desta hipótese, pesquisadores

encontraram neurônios sensoriais primários, não mielinizados ou finamente

mielinizados, inervando a pele de animais e humana (Torebjörk, 1985), os

quais respondiam somente a estímulos mecânicos e térmicos intensos.

Trabalhos subseqüentes identificaram estes mesmos tipos de neurônios

aferentes inervando músculos (Mense, 1986) e articulações (Schaible e

Schimdt, 1984), os quais eram ativados somente por estímulos fora da faixa

normal fisiológica. Assim, tornou-se largamente aceita a idéia de que a dor

aguda e reações associadas, tais como reflexos autonômicos, são evocadas

pela ativação destas fibras específicas, chamadas nociceptores.

Os nociceptores da articulação estão presentes na cápsula articular,

ligamentos, ossos, periósteo e próximo aos vasos. Estas fibras são sensíveis à

pressão e ao movimento articular. Em articulações artríticas, analisadas em

modelos experimentais, estas repostas estão aumentadas e são observadas

em todos os tipos de fibras aferentes (Schaible e Schimidt, 1984). A inflamação

é uma resposta ou reação de proteção crítica à irritação, injúria ou infecção,

caracterizada por rubor, calor, inchaço, perda de função e dor (Levine e

Reichling, 1999). O aumento da sensibilidade à dor resulta de uma

sensibilização do sistema nociceptivo, e está relacionada com a produção de

mediadores inflamatórios como a bradicinina, as prostaglandinas, os

neuropeptídeos e as citocinas, os quais ativam receptores nas fibras nervosas

correspondentes. Além disso, a expressão de receptores, como os da

bradicinina e das neurocininas está aumentada (Shaible e col., 1993). Os

mediadores inflamatórios agem em alvos específicos causando liberação local

de outros mediadores da inflamação, por exemplo, neutrófilos (Levine e

Reichling, 1999).

2. ARTRITE INDUZIDA POR ADJUVANTE COMPLETO DE FREUND (CFA)

O estudo dos mecanismos pelos quais a artrite reumatóide se

desenvolve baseia-se em estudos clínicos (Müller-Ladner e col., 2005) e em

modelos experimentais realizados em animais (Schaible e Grubb, 1993; Bars e

col., 2001). A indução de artrite em animais tem sido realizada através da

administração de agentes artritogênicos como o pristane (Zheng e col., 2002),

zymosan (Guerreiro e col., 2006) o adjuvante completo (Nagakura e col., 2003;

Cai e col., 2006; Whitehouse, 2007) e o adjuvante incompleto de Freund (CFA)

(Zhang e col., 1999).

A primeira descrição de artrite induzida por adjuvante foi realizada por

Pearson em 1956, e definida como uma patologia induzida em ratos com

susceptibilidade genética por uma inoculação simples de micobactéria

suspensa em óleo, substância conhecida como Adjuvante Completo de Freund

(CFA) (Wauben, Wagneaar-Hilers e Wan Eben, 1994). Durante a tentativa de

induzir uma polimiosite através da injeção intramuscular de CFA, Pearson

percebeu o desenvolvimento de uma artrite crônica nos animais e padronizou

um modelo experimental de artrite induzida por CFA. Este modelo reproduzia

sinais e sintomas semelhantes aos da artrite reumatóide em humanos

(Pearson, 1956).

O adjuvante completo e o incompleto de Freund têm sido utilizados para

a indução de artrite em animais por mais de cinqüenta anos. O adjuvante

incompleto de Freund (IFA) é composto por óleo de parafina contendo mono-

oleato de manitol como surfactante. Entretanto, o adjuvante completo de

Freund (CFA) contém os mesmos componentes do IFA com adição de uma

micobactéria morta (Billiau e Matthys, 2001). As micobactérias que usualmente

são utilizadas por pesquisadores para induzir artrite são o Mycobacterium

tuberculosis ou butyricum. Estudos realizados por Whitehouse e colaboradores

(1974), estabeleceram que o desenvolvimento da artrite por adjuvante se deve

tanto pela natureza do óleo utilizado para preparar o adjuvante, como também

pela presença da peptidioglicana na parede celular da micobactéria que,

segundo estes autores, constitui uma combinação que favorece o

desenvolvimento da artrite (Gomes, 2008).

A característica auto-imune da artrite induzida por adjuvante foi

primeiramente descrita por Pearson, quando este retirou clones de células T

dos linfonodos de animais que receberam injeção de CFA e transferiu para

animais naïve, os quais desenvolveram subseqüentemente uma poliartrite

(Carvalho e col., 2002). Estudos posteriores demonstraram que a artrite

induzida por adjuvante envolve a ativação de linfócitos T (Yoshino e Cleland,

1992). Outros estudos têm demonstrado que uma proteína presente na parede

bacteriana seria a responsável por essa ativação das células T.

Especificamente a hsp de 65 kDa (heat shock protein) estaria envolvida na

patogênese desta artrite auto-imune (Gomes, 2008).

A indução da artrite por CFA em animais tem revelado extensas

variações na freqüência e severidade de lesões de acordo com as diferentes

raças. Os camundongos geralmente não são susceptíveis à indução de artrite

por adjuvante (Whitehouse, 1974). Por outro lado, os ratos desenvolvem com

maior facilidade a artrite induzida por CFA. No entanto, também ocorrem

variações entre as diferentes espécies de ratos. Estudos que analisaram a

severidade da artrite por adjuvante em quatro diferentes espécies de ratos,

tanto machos como fêmeas, revelaram que a espécie Holtzmann apresenta

maior susceptibilidade ao desenvolvimento da doença, enquanto que a espécie

Buffalo é a menos susceptível. Esta comparação foi realizada dentre as

espécies Sprague-Dawley, Holtzmann, Charles River e Buffalo (Swingle e col.,

1969).

Banik e colaboradores (2002) compararam a suscetibilidade para a

artrite por adjuvante entre as raças Lewis, Wistar e Sprague-Dawley e

constataram que os animais da raça Lewis desenvolvem os sinais artríticos

mais precocemente e com maior severidade que os animais das demais

espécies, seguido dos animais da raça Wistar e finalmente pelos Sprague-

Dawley (Gomes, 2008). Estudos de Wauben e colaboradores (1994)

demonstraram que não há diferenças significativas na suscetibilidade ao

desenvolvimento de artrite por adjuvante quando comparados ratos machos e

fêmeas. Por outro lado, estudos mais recentes (Cook e Moore, 2006) revelam

diferenças no comportamento nociceptivo entre machos e fêmeas submetidos

à indução de artrite por CFA.

Cai e colaboradores (2006) observaram que machos da raça Sprague-

Dawley desenvolveram uma artrite mais severa, tanto em relação ao escore

artrítico quanto ao desenvolvimento de edema de pata. Em relação à idade, as

diferenças são em relação à indução de artrite. Ratos jovens, de até 7 dias de

nascimento, não são considerados suscetíveis à doença, apenas animais com

mais de 21 dias de vida. Por outro lado, animais mais velhos (com 9 meses ou

mais), foram considerados relativamente resistentes ao desenvolvimento da

artrite por adjuvante (Glenn e Grey, 1965). A idade cuja susceptibilidade é

maior parece ser o período entre 6 e 12 semanas após o nascimento dos

animais (Wauben, 1994).

A justificativa para o uso do modelo de artrite induzida por adjuvante em

animais reside na semelhança que este modelo apresenta com a doença

reumatóide em humanos (Cai e col., 2006; Pearson, 1956; Taurog e col.,

1988). Tais semelhanças incluem as mudanças histopatológicas, a infiltração

celular, a hipersensibilidade e o edema da articulação afetada (Donaldson e

col., 1993; Wilson e col., 2006). O modelo de artrite induzida por adjuvante

permite o estudo da etiopatogenia da artrite auto-imune, o prognóstico da

doença e possibilita o estudo da efetividade do tratamento.

3. A TERAPIA DA ARTRITE REUMATÓIDE E AS LIMITAÇÕES NO USO DE

FÁRMACOS ANTIINFLAMATÓRIOS NÃO-ESTEROIDAIS (AINES)

O diagnóstico e o início imediato do tratamento são fundamentais para o

controle da doença e para a progressão da incapacidade funcional e lesões

articulares irreversíveis. A cura ainda não existe, mas há agentes que

temporariamente diminuem os sintomas e a gravidade da destruição articular.

Desse modo, os objetivos do tratamento são prevenir ou controlar a lesão, bem

como a perda da função e diminuir a dor e assim melhorando a qualidade de

vida do paciente. Sendo assim, o tratamento farmacológico varia de acordo

com o estágio da doença e da severidade (Calliet, 2001; Laurindo e col., 2002).

Reumatologistas comumente prescrevem antiinflamatórios não-

esteroidais (AINES), analgésicos comuns, fármacos modificadores da doença e

fisioterapia. Em alguns casos, o uso de corticosteróide oral e/ou intra-articular

de baixa dose se faz necessário, principalmente quando ocorre pouca

responsividade dos pacientes artríticos aos AINES e quando não há um

acometimento múltiplo das articulações (Palazzi e col., 2004). Injeções intra-

articulares de dexametasona, por exemplo, promovem alívio dos principais

sintomas da artrite reumatóide e osteoartrite (Lashina e col., 2000; Stein e col.,

1999). No entanto, a absorção sistêmica não permite o uso prolongado deste

tipo de medicamento.

O tratamento com fármacos deve ser mantido enquanto se observarem

sinais inflamatórios ou o paciente apresentar dores articulares (Ministério da

Saúde, 2002). Há cerca de sete anos, a clínica reumatológica passou para um

estágio inovador no tratamento da artrite baseado em agentes biológicos. Estes

fármacos inibem de maneira direta e específica as citocinas extremamente

envolvidas no processo inflamatório. Existem três medicamentos

comercializados, que têm apresentado bons resultados, como o etanercept

(receptor solúvel para TNF) (Moreland e col., 1999); infliximab (anticorpo anti-

TNF) (Maini e col., 1999) e adalimumab (Weinblatt e col., 2003). A limitação do

uso se baseia no alto custo médio que se encontra entre 4 a 5 mil reais/mês

por paciente (Ministério da Saúde, 2002).

Outra classe de fármacos empregada são os fármacos modificadores da

doença. Estas moléculas inibem o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina

1 (IL-1), que provocam a inflamação e a dor nas articulações. A inibição destas

citocinas limita o dano articular, o que acarreta na diminuição do curso natural

da doença e reduz os principais sintomas inflamatórios articulares (Goldenberg

e col., 1999). Alguns exemplos utilizados incluem a sulfasalazina, o metotrexato

e leflunomide.

A sulfasalazina está entre os fármacos mais efetivos contra a artrite

reumatóide. Este fármaco é uma combinação entre um antibiótico, a

sulfapiridina, e um agente antiinflamatório, o ácido 5-aminosalicílico e tem sido

utilizado como segunda linha no tratamento combinado com o metotrexato. A

sulfasalazina age ao exercer uma ampla variedade de atividades

antibacterianas, antiinflamatórias e imunossupressivas, afetando populações

celulares alvo como células epteliais, neutrófilos, linfócitos B e T, mastócitos,

células NK (natural killer) e células endoteliais. Os efeitos imunossupressivos

deste fármaco incluem a supressão da produção de citocinas, da quimiotaxia

de células polimorfonucleares, da expressão de moléculas de adesão de

leucócitos, da produção de anticorpos e do seqüestro de radicais livres (Kang e

col., 1999; Hasko e col., 2001).

Entre os fármacos antiinflamatórios, os AINES ainda continuam como os

mais empregados em determinadas fases da doença. Estes inibem a atividade

enzimática da ciclooxigenase resultando no decréscimo da formação dos

precursores de prostaglandinas e tromboxanos a partir do ácido araquidônico.

Embora os exatos mecanismos não tenham sido claramente elucidados, os

AINES exercem atividade antiinflamatória, analgésica e antipirética

principalmente por meio da inibição da isoenzima COX-2. A inibição da COX-1

é provavelmente responsável pelos efeitos indesejáveis destes fármacos sobre

a mucosa gastrointestinal e agregação plaquetária (McEvoy, 2000).

O principal problema associado à terapia oral com AINES reside na

capacidade destes fármacos induzirem lesões na mucosa gastroduodenal com

o possível surgimento de úlcera gástrica, sangramento e perfuração da

mucosa. Ainda sob determinadas condições, a toxicidade renal pode ocorrer,

embora menos freqüente. As prostaglandinas desempenham uma função

protetora da mucosa do estômago e do duodeno, pois estimulam a secreção de

muco e bicarbonato, aumentam a hidrofobicidade na superfície das células

epiteliais e aumentam o fluxo sanguíneo da mucosa. As prostaglandinas são

também protetoras da microvasculatura e podem aumentar o fluxo de água da

camada serosa para a mucosa, o que possibilita a diluição das substâncias

lesivas. A abolição destas propriedades deixa a mucosa mais vulnerável ao

dano (Hawkey, 1994). Por outro lado, o risco individual de toxicidade pelos

AINES é baixo, porém, considerando-se o amplo uso destes fármacos, o

número de casos é grande e com gravidade considerável. Os fatores de risco

para os pacientes são idade superior a 65 anos, doenças associadas, história

prévia de úlcera péptica, uso concomitante de corticosteróides ou

anticoagulantes, doses altas ou o uso múltiplo desta classe farmacológica

(Macneil, 1993). Entre os AINES, o diclofenaco ainda possui atenção

considerável, uma vez que a venda livre do medicamento favorece o seu uso e

conseqüentemente o surgimento dos efeitos colaterais anteriormente já

comentados.

Quimicamente, o diclofenaco corresponde ao ácido 2-[(2’, 6’-

diclorofenil)amino]fenil]acético, um ácido orgânico fraco, derivado do ácido

fenilacético, pertencente ao grupo dos ácidos carboxílicos (Figura 1). Na sua

forma de ácido livre, apresenta pKa de 4,0 e coeficiente de partição em n-

octanol e tampão aquoso (pH 7,0) igual a 13,4. É usado na forma de ácido

livre, de sal de detilamônio, sal potássico, resinato e de sal sódico (Smith e

Reynard, 1995; Korolkovas, 1997). Encontra-se disponível em formas

farmacêuticas que podem ser utilizadas pelas vias oral, retal, intramuscular,

oftálmica e tópica.

A dose usual para adultos, por via oral, recomendada é de 150 a 200 mg,

que pode ser dividida em 3 a 4 vezes ao dia (Smith e Reynard, 1995). O nível

plasmático aumenta rapidamente após a administração oral, porém, o mesmo

sofre efeito de primeira passagem hepática quando administrado por esta via,

ficando somente 50

a 60% biodisponível. A farmacocinética e o metabolismo do

diclofenaco foram investigados em várias espécies animais e no homem,

utilizando o

C radioativo e formas não-radioativas do fármaco (Riess e col.,

1978; John 1979). O diclofenaco é rápida e completamente absorvido após

administração oral, retal e intramuscular, com um máximo de concentração de

fármaco após 2,5 horas (John, 1979).

Figura 2. Estrutura química do diclofenaco de sódio.

O diclofenaco é uma molécula extensivamente metabolizada em animais,

e no homem, por conjugação direta ou por hidroxilação de um ou ambos os

anéis aromáticos seguida de conjugação do derivado. O principal metabólito no

homem é o 4’-hidroxiderivado que possui atividade antiinflamatória fraca (Riess

e col., 1978). É eliminado principalmente por metabolização e

subseqüentemente por excreção urinária ou biliar dos conjugados glucorônicos

ou sulfatos do fármaco (Raz e col., 1988). No homem, a excreção renal excede

a excreção biliar (Riess e col., 1978).

Após sua administração, o diclofenaco fica retido no líquido sinovial por

um período de tempo significativamente maior do que no plasma. Apesar de

concentrações similares do fármaco serem encontradas no plasma e no fluido

sinovial, após 4 horas da administração, a velocidade de declive é

significativamente menor na articulação sinovial, na qual altas concentrações

são mantidas por mais tempo (Fowler, 1986). A sua prolongada retenção no

fluido sinovial diferencia o diclofenaco de outros AINES, persistindo com

concentrações elevadas, acima do nível plasmático, por 24 horas. Este fato,

associado com a meia-vida plasmática de 2 horas e a falta de acumulação do

ácido livre em pacientes com doença renal ou hepática, permite a posologia de

uma a duas doses por dia, embora doses de 3 vezes ao dia sejam usualmente

prescritas. Desta forma, as doses do fármaco não requerem redução em

pacientes com comprometimento da função hepática e renal (Smith e Reynard,

1995).

Apesar de ser considerado um fármaco de primeira escolha no

tratamento da dor aguda e crônica em condições inflamatórias (Todd e Sorkin,

1988), sua limitação de uso é devido a sérios efeitos adversos (no sistema

nervoso central, reações dermatológicas, alterações na função do fígado e

efeitos hematológicos), sendo que os mais freqüentes são os relacionados ao

trato gastrointestinal. (Ciucci, 1979; Ciccolunghi, 1979; Todd e Sorkin, 1988).

Reações adversas relacionadas ao fármaco são responsáveis por

aproximadamente um quarto de todas as reações adversas relatadas ao

Comitê de Segurança de Medicamentos do Reino Unido. Mais de 80% dos

efeitos indesejáveis de todos os casos de interrupção do tratamento por

intolerância ocorrem nas seis primeiras semanas, e a tolerância do diclofenaco

não decaiu com o tempo (Ciccolunghi e col., 1979; Milão, 2001).

O diclofenaco provoca lesões na mucosa gastrointestinal por um

mecanismo complexo. As lesões produzidas em animais de laboratório

dependem de dois mecanismos diferentes. O primeiro deles se dá pela ação

local exercida pelo contato com a mucosa gastrointestinal, a qual é referida

como mecanismo de contato direto, pela grande concentração de fármaco na

mucosa, e uma ação sistêmica, que ocorre após absorção (Cioli e col., 1979;

Fara e Myrback, 1990). Localmente, por serem ácidos fracos, os AINES

penetram nas células da mucosa onde se ionizam e originam edema e

hemorragia, o que facilita a lesão da célula parietal e limita o papel protetor do

muco gástrico. Por outro lado, o mecanismo sistêmico de toxicidade

gastrointestinal do diclofenaco parece estar relacionado com sua ação

antiinflamatória, o que é demonstrado pelo fato de que a potência das duas

atividades, tóxica e antiinflamatória, é freqüentemente proporcional. Desta

forma, o diclofenaco induz dano no trato gastrointestinal por múltiplos

mecanismos. A atividade ulcerogênica pode variar em regiões diferentes do

trato gastrointestinal. Essas diferenças são devido a diferentes cinéticas de

absorção nas várias regiões do trato gastrointestinal, distribuição intracelular

nas células mucosas, disponibilidade sistêmica e diferenças quantitativas e

qualitativas nos sistemas bioquímicos e fisiológicos afetados pelos fármacos

(Rainsford, 1989). No trato intestinal, dois outros fatores influenciam a

ulcerogenicidade: sua capacidade de sofrer extensiva circulação entero-

hepática, especialmente na região jejuno-ileal, e a presença de bactérias, as

quais podem contribuir para alterações imuno-inflamatória (Rainsford, 1989).

4. NOVAS ESTRATÉGIAS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS

ARTICULARES E A UTILIZAÇÃO DE NANOCARREADORES DE

FÁRMACOS

A intensidade do efeito farmacológico é diretamente proporcional à

concentração de fármaco no local de ação desejado. Dessa forma, grandes

quantidades são administradas para obtenção de efeito terapêutico desejado, o

que acarreta o aparecimento de toxicidade decorrente da ação da substância

ativa em outros sítios. Alterações na estrutura química molecular por estratégias

sintéticas, visando aumentar a afinidade do fármaco pelo tecido em disfunção,

são algumas vezes propostas para minimizar este problema. No entanto, o

desenvolvimento de novos protótipos pode ser laborioso e dispendioso. Por

outro lado, uma abordagem para contornar esta limitação, constitui-se na

associação do fármaco a um sistema de liberação que permita a

alteração/adequação de suas propriedades físico-químicas, sem alterar seu

mecanismo de ação (Couvreur e col., 1995).

O desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos tem contribuído

para controlar suas velocidades de liberação no organismo, modulando-a de

forma que estas substâncias atravessem as barreiras biológicas, penetrem na

circulação e atinjam o alvo farmacológico. Por sua vez, estes sistemas (Drug

Targetting Systems) permitem direcionar o fármaco no organismo, evitando seu

acúmulo em outros órgãos, onde pode ser potencialmente tóxico, e elevar sua

concentração no local onde deve exercer seu efeito farmacológico. Dentre eles

estão incluídos os sistemas coloidais carreadores de fármacos (Colloidal Drug

Carriers), que envolvem principalmente lipossomas, nanopartículas poliméricas

e lipídicas bem como, emulsões submicrométricas (Schaffazick e col., 2003).

Novos sistemas de liberação de fármacos podem apresentar diversas

vantagens sobre sistemas convencionais. O reduzido tamanho de partícula

possibilita a administração parenteral e por outras vias, e seu direcionamento

ao órgão ou sítio desejado. O direcionamento do fármaco ao seu local pode

não apenas melhorar sua eficácia terapêutica, como também contribuir para a

redução da dose administrada, com conseqüente redução de seus efeitos

colaterais (Couvreur e col., 1995). Além da possibilidade de direcionar o

transporte de fármacos diretamente aos tecidos alvos, a utilização de sistemas

nanoestruturados apresenta outras vantagens, tais como: prolongar a liberação

do fármaco, proteger a molécula contra a degradação in vivo e durante o

armazenamento, aumentar o conforto do paciente devido à redução do número

de administrações, além de permitir a administração de fármacos hidrofóbicos

pela via intravenosa em dispersões aquosas (Gref e col., 1995; Fonseca e col.,

2002; Gupte e Ciftci, 2004).

4.1. Nanopartículas

A nanomedicina é um ramo da nanotecnologia aplicada no campo da

saúde cujo avanço está direcionado ao desenho de partículas, materiais e

dispositivos nanométricos no intuito de penetrarem facilmente na maioria das

células (10 a 20 µm) sem ativar uma resposta imune acentuada e interagir com

os meios biológicos de maneira mais eficiente e mais precisa do que as

tecnologias convencionais. Os possíveis benefícios da nanomedicina parecem

inesgotáveis, proporcionando novos métodos de diagnóstico e cura de

enfermidades, diferentes tipos de ferramentas para o monitoramente de alguns

parâmetros biológicos e melhores sistemas de administração de fármacos mais

eficazes, mais seguros e menos tóxicos. Sem dúvida, o desenvolvimento de

produtos e sistemas cada vez mais sofisticados serão economicamente

inalcançáveis para alguns setores da população. A Fundação Nacional de

Ciência dos Estados Unidos prediz que em 2015 a metade do mercado de

produtos farmacêuticos usará o conhecimento da nanotecnologia, totalizando

um investimento de 10 bilhões de dólares (Garzón e Fernández, 2009).

Nanopartículas são sistemas coloidais submicrônicos (<1µm), nos quais o

fármaco está encapsulado e/ou adsorvido na superfície do carreador. São

constituídos preferencialmente de materiais biodegradáveis e biocompatíveis tais

como os poliésteres alifáticos e/ou lipídios. Segundo a sua estrutura, estes

sistemas se distinguem em matriciais e reservatórios, sendo denominados de

nanoesferas e nanocápsulas, respectivamente (Figura 3). Nas nanoesferas, a

substância ativa encontra-se dispersa na matriz formada, enquanto nas

nanocápsulas, ela se encontra preferencialmente dissolvida em um núcleo interno

oleoso, revestido por um polímero. Os métodos de obtenção das nanopartículas

são vários e sua escolha reside no tipo de material empregado na obtenção das

partículas e nas características físico-químicas do fármaco que deverá ser

encapsulado. Entre aqueles mais empregados na literatura, encontram-se a

nanoprecipitação de materiais poliméricos e homogeneização/dispersão à quente,

quando materiais de natureza lipídica são empregados (Montasser e col., 2000;

Venkateswarlu e Manjunath, 2005).

Adaptado: http://www.scielo.br/img/revistas/qn/v26n5/17209f1.gif. (Acesso em 20/06/2009)

Figura 3. Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas: a)

fármaco dissolvido no núcleo oleoso das nanocápsulas; b) fármaco adsorvido à

parede das nanocápsulas; c) fármaco retido na matriz das nanoesferas; d)

fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz das nanoesferas.

4.1.2. Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS)

Nanopartículas lipídicas sólidas (SLN, do inglês solid lipid nanoparticles),

foram desenvolvidas no início dos anos 90 como alternativa a outros sistemas de

fármacos como as emulsões, lipossomas e as nanopartículas poliméricas. Na sua

produção se somam as vantagens das partículas sólidas com as das emulsões e

dos lipossomas. NLS podem ser produzidas simplesmente pela substituição do

lipídio líquido das emulsões, por um lipídio sólido, o que significa que são sólidas

a temperatura ambiente e também na temperatura coporal. Possuem forma

esférica, com um diâmetro entre 50 e 500 nm dispersas em meio aquoso e

formam um sistema coloidal (com uma proporção de água de 70-95%) que

permitem a administração de medicamentos de maneira controlada e localizada.

As vantagens da utilização de nanopartículas lipídicas sólidas como vetores

incluem: a utilização de lipídios fisiológicos em sua formulação, a ausência de

solventes orgânicos em sua preparação e a possibilidade de serem utilizadas num

amplo espectro pela administração através da via cutânea, oral ou intravenosa

mediante as formas convencionais como pomadas, comprimidos, cápsulas,

suspensões ou soluções injetáveis (Venkateswarlu e Manjunath, 2004; Garzón

col., 2009).

NLS protegem os fármacos susceptíveis à degradação pela influência de

agentes externos como a água e luz, apresentam uma melhor

biodisponibilidade e podem ser desenhadas para alcançarem perfis de

liberação prolongada de substâncias ativas pouco solúveis em água ao

incorporá-las na matriz lipídica sólida. Entre as desvantagens, encontram-se o

possível crescimento das partículas durante seu armazenamento, a tendência

de gelificação, a existência de mudanças inesperadas em suas transições

polimórficas e sua inerente capacidade limitada na incorporação de fármacos

pela estrutura cristalina do lipídio sólido (Garzón e Fernández, 2009).

As nanopartículas lipídicas sólidas possuem um núcleo sólido que

podem solubilizar fármacos lipofílicos. O núcleo se estabiliza com tensoativos e

co-tensoativos que se aderem à superfície do lipídio criando uma barreira

física. Para sua utilização com fins farmacêuticos todos os ingredientes

utilizados em sua preparação devem ser geralmente reconhecidos como

materiais seguros (GRAS - Generally Recognized as Safe). Uma representação

esquemática das NLS se apresenta na Figura 4.

Figura 4. Representação esquemática de uma nanopartícula lipídica sólida -

NLS (Jores, e col., 2003).

As propriedades e a estabilidade das NLS têm melhorado mediante a

adição de lipídios líquidos nos quais o fármaco geralmente é mais solúvel,

dando lugar a novos sistemas nanoparticulados conhecidos como carreadores

lipídicos nanoestruturados (NLC), que consistem em matrizes formadas por um

lipídio solidificado com padrões cristalinos específicos, que incluem

nanocompartimentos de lipídio líquido no qual o fármaco está dissolvido. O

propósito original dos NLC foi evitar a recristalização tanto da fase lipídica

assim como de substâncias ativas encapsuladas para prevenir a separação

dos fármacos.

As nanopartículas lipídicas sólidas podem incorporar diferentes tipos de

fármacos de caráter lipofílico e hidrofílico, ao empregarem-se lipídios como a

triestearina e ácido esteárico, tensoativos como a lecitina e taurocolato de

Fármacos lipofílicos

como o diclofenaco

ácido

Lipídios como a

triestearina e ácido

esteárico

Tensoativos como a

lecitina e taurocolato de

sódio

sódio. A capacidade de incorporação das NLS varia entre 1 e 5%, uma vez que

se têm reportado valores próximos a 50% dependendo do sistema utilizado.

Uma primeira consideração para ter uma capacidade de incorporação elevada

nas NLS é a alta solubilidade do fármaco no lipídio fundido; outras variáveis

que influenciam a incorporação são a estrutura física e química da matriz

lipídica sólida e o estado polimórfico do material lipídico. Em termos gerais, o

estudo das NLS não deverá ser dirigido apenas a capacidade de incorporação

do fármaco, mas também a outras características como tamanho e carga

superficial (potencial zeta) que será determinante na prevenção da agregação

e coalescência (Joshi e Müller, 2009; Garzón e Fernández, 2009).

Muitos investigadores têm desenvolvido e otimizado os processos para

obtenção e escalonamento das NLS, combinando diferentes técnicas de

ruptura e dispersão da fase lipídica, tais como a homogeneização à alta

pressão (a frio ou a quente), a microemulsificação com agitação a alta

velocidade ou por meio de ultrassom, a emulsificação mediante evaporação ou

difusão do solvente na qual se encontra dissolvida a fase oleosa, a dupla

emulsificação (a/o/a) e nanoesferonização a alta velocidade (Pardeike,

Hommos e Müller, 2009).

A liberação de um composto lipofílico a partir destes carreadores

lipídicos é o resultado da combinação de vários mecanismos de partição entre

as fases lipídicas que os constituem, o tensoativo e o meio aquoso que os

rodeia. Os processos de elaboração das NLS incluem a preparação da fase

oleosa mediante a fusão ou dissolução dos lipídios de tal maneira que perdem

sua estrutura cristalina inicial. Os lipídios que formam a matriz devem ser

escolhidos mediante a sua capacidade de dissolver o fármaco, escolhendo

aqueles que apresentam altos coeficientes de partição (o/a). A concentração de

fármaco dispersa na matriz lipídica pode ter um efeito significativo no tamanho

e na estrutura das partículas.

O aumento da capacidade de incorporação de NLS requer o

acomodamento do fármaco dentro das imperfeições da matriz, na qual o lipídio

deve se solidificar com um empacotamento cristalino pouco ordenado e

apresentar grandes distâncias intermoleculares. Esta situação se favorece

utilizando diferentes tipos de ácidos graxos ou adicionando um componente

químico diferente, tal como um óleo. Se durante a etapa de esfriamento do

processo da obtenção, o lipídio cristaliza antes do fármaco, uma separação de

fases devido à expulsão de uma parte do fármaco durante a cristalização da

matriz de lipídios é produzida, dando lugar a um núcleo com um recobrimento

enriquecido com o fármaco, o qual permanece associado com a parte sólida

das nanopartículas. Uma vez as partículas suspensas no meio de dissolução,

uma liberação inicial liberação prolongada não seria possível (Pardeike,

Hommos e Müller, 2009).

Lipídios líquidos possuem uma maior capacidade de solubilizarem

fármacos do que lipídios sólidos, o que fazem dos NLC estruturas que

apresentam uma maior capacidade de incorporação e melhor controle da

liberação que as NLS. Por outro lado é considerado que as dispersões de NLC

não apresentem vantagens sobre as nanoemulsões convencionais pela

probabilidade de que uma porção do óleo e do fármaco incorporados na matriz

lipídica são expulsos da massa do lipídio fundido durante o esfriamento e a

cristalização.

As características principais das NLS tais como: tamanho de partícula,

grau de dispersão do tamanho de partículas, potencial zeta, eficiência de

encapsulação, e cinética de liberação são determinadas pela natureza da

matriz do lipídio, pela mistura dos tensoativos, a viscosidade fase lipídica e

aquosa no momento da emulsificação e pelos parâmetros de produção.

Triglicerídeos como a tricaprina, trilaurina, trimiristina, tripalmitina e triestearina,

bem como os monoglicerídios (monoestearato de glicerol, behenato de glicerol,

palmitato-estearato de glicerol), ácidos graxos (esteárico, palmítico, decanóico

e behénico), ceras (palmitato de cetila) e óleos (alfa tocoferol e ésteres cáprico-

caprílicos), são os materias mais utilizados (Garzón e Fernández, 2009).

A segunda etapa do processo consiste na preparação da fase aquosa,

na qual é preparada pela dissolução de uma alta concentração de tensoativos.

A natureza e concentração dos tensoativos ou emulsificantes, apresentam

grande impacto nas propriedades físicas das nanopartículas, uma vez que são

adsorvidos na superfície das nanogotículas, formando uma barreira estérica

que afeta a estabilidade física, o tamanho de partícula, potencial zeta,

estabilidade química e propriedades biofarmacêuticas. As misturas dos

tensoativos geralmente têm um efeito sinérgico, produzindo uma película

interfacial com alta capacidade de recobrimento e com viscosidade suficiente

para diminuir a agregação das partículas. Os tensoativos e co-tensoativos

melhoram a estabilidade física das partículas ao aumentar os efeitos estéricos

e a rigidez da película externa e também ao modificar a carga superficial das

partículas. Entre eles, se encontram os fosfolipídios como a lecitina de soja, de

ovo e fosfatidilcolina, copolímeros de óxido de etileno, óxido de propileno como

o poloxâmero 188, poloxâmero 182, poloxâmero 407, poloxamina 908;

copolímeros de óxido de etileno e sorbitano/óxido de propileno como o

polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80; polímeros poliésteres de ácool

alquil-arílico como o tyloxapol; sais biliares como o colato de sódio, glicolato de

sódio, taurocolato de sódio e taurodeoxicolato de sódio e polímeros

estabilizadores como o álcool polivinílico (PVA) e polivinilpirrolidona (PVP)

(Joshi e Müller, 2008, Garzón e Fernández, 2009).

A terceira etapa na elaboração de nanocarreadores lipídicos consiste na

formação de uma pré-emulsão ao misturar a fase oleosa e aquosa a frio ou a

quente, mediante agitação mecânica vigorosa ou ultrassom. A formação de

nanopartículas requer energia suficiente. A última etapa consiste na

concentração e purificação da dispersão aquosa de NLS mediante processos

de evaporação, ultracentrifugação, ultrafiltração, liofilização (mediante a adição

de crioprotetores como a manose, trehalose, maltose, PVP ou PVA), o que

permite a facilitação do manejo e administração (Manjunath, Reddy e

Venkateswarlu, 2005).

4.1.3. Nanoemulsões (NE)

Nos últimos anos, nanoemulsões óleo em água têm sido particularmente

investigadas como um sistema potencial para administração de diversos

fármacos (Ding, Tien e Olejnik, 1995; Calvo e col., 1996a; Calvo, Vila-Jato e

Alonso, 1996b; Abdulrazik e col., 2001). Do ponto de vista farmacêutico, podem

ser classificadas como uma dispersão nanométrica de gotículas oleosas em

uma fase aquosa externa, estabilizada por um sistema tensoativo adequado.

Apresentam-se como líquidos de aspecto leitoso, com reduzido diâmetro de

gotícula e baixa viscosidade, o que possibilita sua administração por diversas

vias. O fármaco veiculado encontra-se preferencialmente disperso e/ou

adsorvido no núcleo oleoso da nanoestrutura (Saettone, Giannaccini e Monti,

2000; Vandamme, 2002).

O núcleo oleoso das nanoemulsões pode apresentar composição e

proporções variáveis. Óleos de origem vegetal ou semi-sintética, constituídos

principalmente de triglicerídeos de cadeia média e longa, têm sido

extensivamente empregados. Triglicerídeos de cadeia longa provenientes de

óleos vegetais, como o de soja, foram empregados isoladamente no preparo de

emulsões contendo pilocarpina (Naveh e col., 2000). Contudo, atualmente se

observa um interesse crescente no uso de triglicerídeos de cadeia média

obtidos da hidrólise do óleo de côco seguida da esterificação dos ácidos graxos

livres, principalmente cáprico e caprílico, com o glicerol (Benita e Levy, 1993;

Naveh e col., 2000). Triglicerídeos de cadeia média são cerca de 100 vezes

mais miscíveis em água que os análogos de cadeia longa e são capazes de

dissolver altas quantidades de fármacos lipossolúveis (Muchtar e Benita, 1994).

Uma ampla variedade de tensoativos pode ser empregada no preparo

de nanoemulsões. A segurança de uso deve ser respeitada, uma vez que estas

substâncias muitas vezes apresentam reações inflamatórias, dor e irritação

local. Lecitinas são tensoativos de origem natural amplamente empregadas no

desenvolvimento de nanoemulsões, devido principalmente à sua

biocompatibilidade. Essas substâncias são misturas complexas de fosfolipídeos

extraídos da gema de ovo ou da soja, cujo maior componente é a

fosfatidilcolina. Lecitinas estão presentes na composição de praticamente todas

as nanoemulsões descritas na literatura, sendo que a composição usual está

compreendida entre 1,2 e 2,4% para emulsões contendo 10 a 20% de fase

interna, respectivamente (Fronza, Campos e Teixeira, 2004).

Devido à composição heterogênea das lecitinas, a estabilidade das

nanoemulsões obtidas pode variar de maneira significativa. Assim, a

combinação de lecitinas com tensoativos sintéticos (co-tensoativos), como o

polissorbato 80 (Zurowska e col., 1999) e principalmente o poloxâmero 188

(Law, Huang e Chiang, 2000) tem sido descrita na preparação de

nanoemulsões. O poloxâmero 188 é um copolímero do óxido de etileno e

propileno, de natureza não iônica, extensivamente utilizado por suas

propriedades de estabilização estérica de estruturas coloidais. Nanoemulsões

contendo o poloxâmero 188 apresentaram uma maior estabilidade em relação

a outros tensoativos, como o polissorbato 80, frente à operação de

esterilização devida provavelmente a uma maior resistência a sua desidratação

durante a autoclavagem. A adição de outros componentes tensoativos na fase

oleosa, como o lipídeo catiônico estearilamina, também tem sido realizada

visando uma melhor estabilidade das nanoemulsões devido à repulsão

eletrostática promovida pela carga de superfície. A estearilamina confere uma

carga positiva ao núcleo oleoso proveniente do seu grupamento amônio

ionizado no pH das formulações (Froza, Campos, Teixeira, 2004).

A técnica mais empregada na preparação de nanoemulsões é a

emulsificação clássica seguida da redução do diâmetro médio através de

métodos físicos (Sznitowska e col., 2001). Este procedimento pode ser dividido

em duas diferentes fases. Na primeira etapa, as fases aquosa e oleosa,

contendo os componentes hidrofílicos ou lipofílicos, respectivamente, são

aquecidas separadamente (~70°C) e emulsionadas atra vés do uso de

homogeneizadores de alta velocidade. A emulsão primária obtida apresenta um

diâmetro de gotícula submicrométrico, influenciado pelo equipamento utilizado

e pelas condições operacionais. Após resfriamento, na segunda etapa, o

diâmetro de gotícula é reduzido até cerca de 100 a 200 nm através da

utilização de homogeneizadores de alta pressão ou microfluidizadores. A

otimização das condições, como pressão e número de ciclos de

homogeneização, é geralmente determinada experimentalmente para cada

sistema desenvolvido e tipo de equipamento utilizado (Teixeira e col., 2002).

A técnica de emulsificação espontânea seguida de deslocamento de

solvente, também foi descrita para a preparação de nanoemulsões. Nesta

técnica, o fármaco lipofílico é dissolvido em um solvente orgânico juntamente

ao óleo, que constitui a fase interna da preparação, e um tensoativo lipofílico. A

fase dispersante é formada por água e freqüentemente adicionada de um

segundo tensoativo de natureza hidrofílica. Após, verte-se a fase orgânica

sobre a aquosa mediante agitação moderada e o solvente orgânico é retirado

por destilação à pressão reduzida. Esse procedimento apresenta como

vantagens a possibilidade de preparação de pequenos volumes de amostra em

baixas temperaturas, o que pode ter interesse para fármacos termolábeis

(Froza, Campos e Teixeira, 2004).

4.2. A utilização de sistemas nanocarreadores de fármacos em doenças

articulares

A utilização de vetores nanoparticulados construídos a partir de diversos

tipos de materiais e contendo diferentes classes de fármacos antiinflamatórios,

anti-reumáticos ou analgésicos, tem apresentado nos últimos 4 anos,

resultados promissores no tratamento da artrite em modelos experimentais. Os

estudos apontam que a melhora do tratamento está principalmente associada

ao efeito de liberação prolongada, aumento da vetorização do fármaco ao

tecido articular e diminuição da toxicidade quer seja pela via local ou sistêmica.

Nanopartículas de PLGA/PLA e PLGA/PLA-PEG (partículas furtivas ou

stealths), contendo fosfato de betametasona, foram preparadas e avaliadas

quanto ao seu potencial antiinflamatório em modelo experimental de artrite

adjuvante, induzida por colágeno do tipo II. Partículas no tamanho entre 45 e

115 nm, foram administradas pela via intravenosa. Nanocarreadores

fluorescentes também foram administrados e avaliados quanto à distribuição in

vivo através de estudos imagem. Nanopartículas contendo PEG exibiram alta

atividade antiinflamatória, com redução da inflamação da pata em 35%,

mantendo o efeito em até nove dias com apenas uma única aplicação,

enquanto nanopartículas não-furtivas apresentaram efeito menor, mas ainda

maior do que o fármaco administrado livremente. Os autores sugerem que o

efeito terapêutico observado após administração de nanopartículas furtivas

pode estar relacionado com a circulação prolongada destes vetores, e com a

liberação sustentada in situ do fármaco (Ishihara e col., 2009).

Nanocarreadores de poli-N-isopropilacrilamida e etilglicinato contendo

indometacina foram avaliados em estudo realizado por Zhang e colaboradores

(2008). Estudos de farmacocinética in vivo após administração subcutânea

demonstraram que os vetores proporcionaram uma liberação prolongada ao

fármaco, e em relação ao fármaco livre na mesma dose, os nanocarreadores

apresentaram prolongada concentração plasmática. Animais inflamados com

carragenina ou adjuvante completo de Freund e tratados com os

nanocarreadores, indicaram efeito terapêutico sustentado após administração

intra-articular dos vetores. Os autores apontam que este tipo de tratamento

apresentou vantagens em relação às terapias convencionais, uma vez que

evita problemas relacionados à toxicidade do trato gastrointestinal induzida

pelo tratamento através da via oral.

Nanopartículas lipídicas sólidas encapusaladas com actarite, um

fármaco anti-reumático pobremente solúvel em água, foram administradas pela

via intravenosa e avaliado a redução da toxicidade como nefrotoxicidade e

efeitos no trato gastrointestinal em coelhos. Carreadores de tamanho de 241 ±

23 nm com potencial zeta de -17,14 ± 1.6 mV e 50,87% de eficiência de

encapsulação, apresentaram maior tempo de meia vida (9,373 horas), quando

comparado a solução do fármaco na mesma dose (0,917 horas). A área

abaixo da curva (AUC) das NLS de actarite foi 1,88 vezes maior do que a

solução do fármaco. A vetorização dos nanocarreadores foi aumentada de

6,31% a 16,29% no baço, enquanto a distribuição renal foi significativamente

reduzida (Ye e col., 2008).

O efeito anti-reumático do metotrexato foi investigado por Zykova e

colaboradores (2007) após administração de nanocarreadores compostos de

fosfolipídeos (Phosphogliv), uma emulsão de 50 nm estabilizada com ácido

glicírrico. Um alto efeito terapêutico foi observado em modelo de artrite

adjuvante em ratos quando comparado à forma livre do fármaco. O aumento da

atividade anti-artrítica pode ter sido influenciado pela associação do

estabilizante que possui atividade antiinflamatória. Nanopartículas de PLA

contendo triptolide, um composto de origem natural, foram semelhantemente

avaliadas quanto à atividade anti-artrítica em artrite adjuvante induzida por CFA

após administração pela via oral. Estes resultados também demonstraram um

efeito antiinflamatório no tratamento com os carreadores (Liu e col., 2005).

Estudo realizado por Thakkar e colaboradores (2007), avaliou a retenção

de nanopartículas lipídicas sólidas contendo celecoxibe em articulações de

ratos artríticos. Estudos in vitro revelaram que as nanopartículas exibiram um

perfil de liberação prolongado. As nanopartículas não apresentaram infiltrado

inflamatório de 3 a 7 dia após administração intra-articular, demonstrando sua

biocompatibilidade para uso articular. O fármaco não encapsulado apresentou

rápido clearance da articulação inflamada para a circulação sanguínea,

enquanto NLS foram associadas a baixos níveis sanguíneos. A concentração

articular do fármaco encapsulado foi 16 vezes maior em 4 horas, e 15 vezes

maior em 24 horas após a administração intra-articular.

Nanopartículas de quitosana foram administradas em articulações de

coelhos como vetores para terapia gênica. Este estudo demonstrou que genes

podem ser transferidos a condrócitos articulares em cultura de células

primárias. Nanopartículas de quitosana-DNA contendo genes para interleucina

1RA (1L-1RA) ou interleucina 10 (IL-10) foram injetadas diretamente nas

articulações de joelho de coelhos com osteoartrite induzida, para se avaliar a

transferência in vivo dos vetores de quitosana. A expressão de IL-1Ra foi

detectada no fluido sinovial articular nos grupos tratados com os vetores.

Entretanto, nenhuma expressão de IL-10 foi demonstrada para o vetor

contendo o respectivo gene, demonstrando que a eficiência de transfecção de

nanopartículas quitosana-DNA está intimamente relacionada ao tipo de produto

gênico. Além da transfecção, observou-se que nanopartículas de IL-1Ra

reduziram as lesões quando a histologia da cartilagem foi avaliada (Zhang e

col., 2006).

Em estudo semelhante, Zhao e colaboradores (2006) desenvolveram

nanopartículas de quitosana-pEGFP na ordem de examinar o potencial da

quitosana como um vetor não-viral na transfecção de genes exógenos a

condrócitos de cultura primária, para o tratamento de doenças articulares.

Partículas catiônicas na faixa de tamanho entre 100-300 nm foram incubadas e

sua resposta analisada por citometria de fluxo, demonstrando que uma

transfecção eficiente foi alcançada com porcentagem de células positivas

acima de 50%. Estes resultados indicam que nanopartículas podem ampliar a

terapêutica em doenças articulares através da administração de biofármacos

importantes no controle da doença.

Nanopartículas superparamagnéticas compostas de óxido de ferro

(SPION, do inglês, superparamagnetic iron oxide nanoparticles) foram

recobertas com álcool polivinílico (PVA) ou o copolímero álcool vinílico/amino

vinílico e funcionalizadas com os fluorocromos Cy3.5 ou Texas Red. As

suspensões foram incubadas in vitro com células sinoviais de ovelhas por 3,

24, 72 e 120 horas. A internalização nos sinoviócitos bem como a

biocompatibilidade foram visualizadas por microscopia confocal de

fluorescência e através da análise de células marcadas com fluorocromos por

citometria de fluxo.

SPION-amino-PVA foram detectados em estruturas

citoplasmáticas como os lisossomos após 3 horas de incubação. SPION-PVA-

Cy3.5 e SPION PVA-Texas Red foram encontrados em 80% das células e não

alteraram a morfologia e a viabilidade durante o estudo quando comparado ao

grupo controle (Shulze e col., 2006).

5. A VIA TÓPICA COMO ALTERNATIVA NO TRATAMENTO DE DOENÇAS

INFLAMATÓRIAS ARTICULARES ATRAVÉS DE NANOCARREADORES

PARA ADMINISTRAÇÃO CUTÂNEA

Os graves efeitos colaterais apresentados pelos AINES, administrados

pela via oral, conduziram a uma revisão das potencialidades de outras vias de

administração para esta classe terapêutica.

A utilização da via tópica para

administração deste fármaco tem sido investigada com o objetivo de evitar o

metabolismo de primeira passagem, reduzir a toxicidade associada com a

terapia sistêmica e, concomitantemente, manter seu efeito local (Radermacher e

col., 1991; Takahashi e col., 1995; Müller e col., 1998). Esta perspectiva oferece

um desafio especial em desenvolver uma formulação adequada que possibilite a

penetração do fármaco através da barreira constituída pelo estrato córneo,

permeações através das mais profundas camadas da pele e que garanta a

atividade e efetividade terapêutica (Seth, 1992). Diversas estratégias

farmacotécnicas têm sido adotadas no que diz respeito à alteração de

componentes de distintas formulações que permitam uma maior penetração do

fármaco no tecido cutâneo. Entretanto, os estudos ainda não apresentam um

medicamento efetivo, mas há diversas perspectivas na melhora terapêutica do

diclofenaco quando aplicado topicamente.

A concepção de impermeabilidade relativa da pele limitou, durante muito

tempo, a utilização da administração através desta via aos tratamentos

puramente dermatológicos (Brandau e Lippold, 1982). Hoje, sabe-se que esta

barreira não é absoluta e que a penetração cutânea de um fármaco,

condicionada, principalmente por suas características físico-químicas, pode

viabilizar sua absorção e, conseqüentemente, a concentração terapêutica no

local de ação (Hielsh, 1994). Essa penetração está relacionada com um

processo de difusão passiva através das diferentes camadas da pele, que por

sua vez, é extremamente dependente de um fenômeno de partição na interface

pele/forma farmacêutica (Hiesh, 1994; Walker e Smith, 1996).

Em relação ao diclofenaco de sódio, foi demonstrado que o mesmo

apresenta fraca penetração através da pele (Nishihata e col., 1987), é

relativamente retido pelo tecido cutâneo para uma terapia localizada (Nishihata e

col., 1987; Seth, 1992; El-Hadidi e El-Garf, 1991), fica retido no líquido sinovial

por um período de tempo significativamente maior que no plasma (Todd e

Sorkin, 1988; Smith e Reynard, 1995) e possui como único efeito adverso, após

aplicação tópica, sinais de irritação localizada, segundo estudo realizado em 120

pacientes por El-Hadidi e El-Garf (1991). A baixa concentração encontrada no

plasma, em estudo realizado por Seth (1992), é um indicativo que, depois da

aplicação cutânea, uma menor incidência de efeitos adversos pode ocorrer, ao

contrário do que é relatado para altos níveis plasmáticos de fármacos

encontrados depois da administração oral ou parenteral. Embora amplamente

utilizado, atualmente ainda não é possível um tratamento tópico efetivo com

diclofenaco que atinja altas concentrações nos tecidos articulares mais

profundos e que diminua a dor e os efeitos inflamatórios recorrentes da

instalação do processo auto-imune.

Nos últimos anos, a tecnologia farmacêutica tem contribuído para

contornar os obstáculos pertinentes à penetração através da pele,

desenvolvendo novas formas farmacêuticas. Nanopartículas já demonstraram

que são capazes de aumentar a permeabilidade de algumas substâncias

através de membrana de Cellotape

, como em estudo realizado por Kreuter e

colaboradores (1983). Rolland e colaboradores dez anos depois observaram

uma influência direta do tamanho das partículas na penetração da pele.

Partículas menores que 3 µm se distribuem ao acaso no estrato córneo e nos

folículos pilosos. O principal caminho de penetração das partículas avaliadas

foi através da rota transepidermal, visto que a superfície externa dos orifícios

transfoliculares representa somente 0.1% da superfície total da pele.

Micropartículas maiores (10-20 µm) não penetram na pele e ficam retidas na

superfície externa do extrato córneo.

A utilização da via cutânea como via de entrada de fármacos

antiinflamatórios no tratamento da artrite reumatóide entre outras doenças

articulares, somada às vantagens de sistemas carreadores de fármacos, podem

conferir uma melhora substancial na terapêutica deste tipo de processo patológico

uma vez que o medicamento seja aplicado de forma não-invasiva topicamente.

Desta forma, acredita-se que o estudo através do desenvolvimento e avaliação de

vetores nanoestruturados contendo AINES descreva um promissor protótipo no

tratamento de doenças inflamatórias articulares que permitirá a aplicação deste e

de outros fármacos com características similares, através do aumento da

permeabilidade cutânea, diminuição da dose terapêutica e conseqüentemente dos

efeitos colaterais indesejáveis.

Em estudo realizado por Baboota e colaboradores (2007), foi investigado o

potencial de nanomeulsões na liberação transdermal de celecoxibe. O estudo de

permeação in vitro através da pele foi comparado com o gel convencional do

fármaco. Um aumento significativo do fluxo de steady state (J

), coeficiente de

permeabilidade (Kp) e de outros parâmetros de permeação, foram observados

nas nanoemulsões. O efeito antiinflamatório das formulações foi demonstrado

através da inibição significativa do edema de pata induzido por carragenina logo

após 24 horas de aplicação dos géis. Semelhantemente, nanoemulsões de

aceclofenaco foram preparadas e avaliadas quanto à permeabilidade e resposta

terapêutica. As nanoemulsões foram avaliadas ex vivo através de célula de Franz

em pele abdominal de ratos, e um aumento expressivo da permeação foi

observado em relação ao gel convencional do fármaco. Após 24 horas de

administração das formulações uma significativa redução do edema de pata

induzido por carragenina foi observado quando comparado ao fármaco não-

encapsulado.

6. LIBERAÇÃO INTRACELULAR DE FÁRMACOS ATRAVÉS DA

ADMINISTRAÇÃO DE NANOCARREADORES.

Fármacos podem agir através de muitos mecanismos e vias específicas.

Em alguns casos, a passagem através da membrana celular a um tipo de

célula ou tecido específico é essencial, principalmente quando o alvo

farmacológico está localizado no interior da célula. Neste caso, uma série

complexa de interações celulares é necessária. Por exemplo, a molécula

terapêutica geralmente deve: (1) atravessar uma ou várias membranas

biológicas (mucosa, epitélio, endotélio); (2) difundir-se através da membrana

plasmática; e (3) ter acesso a organelas apropriadas onde o alvo farmacológico

está localizado. Para os fármacos cujo alvo é localizado intracelularmente, o

desvio destas vias pode não somente diminuir a eficiência terapêutica, mas

também acarretar efeitos colaterais e toxicidade. Há quase 30 anos atrás, a

idéia de que pequenos carreadores possuíam características ideais para a

liberação intracelular de fármacos foi demonstrada através da concentração

aumentada de lipossomas e nanopartículas encapsuladas com fármacos que

não podiam ser difundidos intracelularmente. Estes estudos apontam que

nanocarreadores possuem grande potencial para liberação intracelular de

pequenas moléculas, bem como, de macromoléculas como ácidos nucléicos,

peptídeos ou proteínas que são instáveis em condições fisiológicas e

geralmente incapazes de atravessarem membranas celulares.

De acordo com as características físico-químicas dos nanocarreadores e

a natureza das células-alvo, dois principais mecanismos de internalização

podem ocorrer: a fagocitose ou endocitose (por exemplo, clatrina, caveolina-

dependente) (Figura 5). Após a internalização, a liberação do fármaco dentro

do ambiente enzimático dos lisossomos ou diretamente no citoplasma, por

exemplo, tem importante impacto na atividade farmacológica. A fagocitose

ocorre primeiramente em células especializadas como macrófagos, monócitos,

neutrófilos e células dendríticas. A via mediada por fagocitose pode ser descrita

através de três distintas maneiras: reconhecimento por opsonização na

corrente sanguínea; adesão de nanopartículas opsonizadas aos macrófagos e

ingestão das partículas (Aderem e Underhill, 1999).

A opsonização é um importante processo que ocorre antes da

fagocitose, que consiste no reconhecimento de partículas estranhas através da

adsorção de proteínas chamadas de opsoninas, deixando as partículas

passíveis de reconhecimento por células fagocíticas. A partir de receptores

específicos (receptores Fc, complemento, manose, frutose ou scavenger)

nanopartículas são internalizadas através da ação de enzimas GTPases, e pela

ação da actina formando extensões de superfície celular (pseudópodos) que

englobam as partículas (Caron e Hall, 1998; Hillaireau e Couvreur, 2009).

Como a actina é despolimerizada a partir dos fagossomos, o vácuolo torna-se

acessível aos endossomos primários. Através de uma série de fusões, o

conteúdo vacuolar irá maturar, fundindo-se com endossomos tardios e

lisossomos para formar o fagolisossomo. A taxa de eventos depende das

propriedades superficiais dos carreadores, e os fagolisossomos tornam-se

ácidos devido a bombas de prótons ATPase localizadas na membrana e

adquirem muitas enzimas, incluindo estearases e catepsinas (Claus e col.,

1998).

Adaptado de Hillaireau e Couvreur, 2009.