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UFMG 654
D 400
Patrícia Luísa de Souza Bergo
DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO DE SCREENING PARA
ANFETAMINAS EM URINA EMPREGANDO ESI-MS COM
CONFIRMAÇÃO POR GC-MS
Dissertação apresentada ao Departamento de
Química do Instituto de Ciências Exatas da
Universidade Federal de Minas Gerais, como parte
dos requisitos necessários para obtenção do título de
Mestre em Química - Química Analítica.
Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte
2007
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i
“The intrusion of politics into sports, the increasingly venal attitude towards championship,
the excessive worshipping of sport, which leads to a belief in the wrong values, chauvinis,
brutality, overworking, overtraining, and doping.”
Pierre de Coubertin, 1923, Roma
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ii
Este trabalho é dedicado a Andrei Leitão
iii
Agradecimentos
A Deus.
À minha família, pelo incentivo e apoio em todas as minhas decisões.
À Joane, o meu braço direito no laboratório, sempre.
Ao s professores Clésia, Rodinei e Tanus pela orientação e oportunidade trabalhar com o que
sempre quis.
Aos professores Luiz Carlos de Mário Guerreiro e à Maraísa, pela oportunidade e
receptividade no Laboratório de EC-MS e LC-MS da Universidade Federal de L a v r a s .
A Sergio Lisboa, Juçara Gomes, Allan Lisboa e Cristian Bologa, pela valiosa colaboração
prestada.
Aos meus amigos, em especial, Arlesienne, Rose-Marie e Frank pelo apoio em todas as horas.
Aos professores Cláudio Donnici e Leiliane Amorim, pelos esclarescimentos técnicos
prestados ao longo do trabalho.
Aos peritos Marcelo Lasmar e Washington, pela parceria e pelo enriquecimento do trabalho.
À Renata e Henrique do Laboratório de Controle de Dopagem (LADETEC), pelo material
fornecido.
Ao Laboratório de Cromatografia da Companhia de Saneamento de Minas Gerais (COPASA-
MG), pelo material fornecido.
A todos os colegas de laboratório e de sala de aula, pela troca de experiências.
Aos meus ex-orientadores, pelos ensinamentos e oportunidades dadas.
À Capes, pelo apoio financeiro.
E, em especial, a Andrei, por estar sempre ao meu lado, em todos os momentos.
iv
Sumário
Lista de Figuras.................................................................................................................
vi
L is ta de Tabelas................................................................................................................
viii
Lista de Abreviaturas........................................................................................................
ix
xi
Abstract..............................................................................................................................
xii
1
1.1 Aspectos Gerais dos Estimulantes.........................................................................
1
1.1.1 Definição.........................................................................................................
1
1
1.2 A Dopagem Esportiva.............................................................................................
4
1.2.1 A origem do termo “dopagem”.......................................................................
4
1.2.2 A dopagem por estimulantes ao longo do tempo............................................
6
1.2.3 O uso de estimulantes como agentes dopantes no esporte..............................
8
1.2.3.1 Cafeína.......................................................................................................
9
11
1.2.3.3 Anfetaminas...............................................................................................
12
1.2.4 O Combate Oficial à Dopagem Esportiva.......................................................
14
14
1.2.5 As análises de Controle de Dopagem..............................................................
15
1.2.5.1 As matrizes biológicas ....... ......................................................................
15
1.2.5.2 Os métodos de screening ..........................................................................
17
1.2.5.3 Os métodos confirmatórios ......................................................................
31
2. Objetivos .......................................................................................................................
41
3. Parte Experimental .......................................................................................................
42
3.1 Reagentes e Materiais .............................................................................................
42
3.2 Preparo de Soluções.................................................................................................
43
3.2.1 Síntese do Éster Metílico da Fenilalanina ......................................................
43
3.2.2 Preparo das Soluções Estoque ........................................................................
43
3.3 Amostras ..................................................................................................................
44
3.4 Instrumentação ........................................................................................................
45
3.4.1 Método de screening ......................................................................................
45
45
46
46
47
48
48
48
52
52
v
3.5.2.2 Validação ..................................................................................................
54
3.5.2.3 Confirmação do screening – análise de amostras reais ............................
58
3.6 Estudo de cinética de excreção/ Estudo comportamental ........................................
59
4 Resultados ......................................................................................................................
61
4.1 Método de screening ...............................................................................................
61
4.1.1 Otimização ......................................................................................................
61
67
73
4.2 Método Confirmatório .............................................................................................
80
4.2.1 Otimização ......................................................................................................
80
4.2.1.1 Condições Cromatográficas ......................................................................
80
4.2.1.2 Extração ....................................................................................................
83
4.2.1.3 Derivatização ............................................................................................
84
84
4.2.2.1 Linearidade e Sensibilidade ......................................................................
86
4.2.2.2 Precisão Intra-dia e Precisão Inter-dia ......................................................
89
4.2.2.3 Recuperação .............................................................................................
92
4.2.2.4 Estabilidade da amostra (congelamento / descongelamento) ...................
94
4.2.2.5 Considerações Finais ................................................................................
96
4.2.3 Análise confirmatória do screening: aplicação do método CG-EM para
análises de amostras reais .................................................................................................
96
98
4.3.1 Estudo de cinética de excreção .......................................................................
98
4.3.2 Estudo comportamental ..................................................................................
100
5 Conclusão ......................................................................................................................
101
6 Referências Bibliográficas .............................................................................................
102
vi
Lista de Figuras
Figura 1. Barreira hematoencefálica ..................................................................................
1
Figura 2. Aspecto bastante ampliado da junção de duas células nervosas ........................
2
Figura 3. Estruturas químicas dos neurotransmissores que são influenciados pelos
estimulantes .........................................................................................................................
3
Figura 4. Estruturas químicas dos principais estimulantes que atuam sobre o SNC .........
3
Figura 5. Estrutura química das metilenodioxianfetaminas ...............................................
4
Figura 6. Distribuição dos casos positivos de doping até os Jogos de Inverno de 2002
conforme o tipo de substância encontrada e a modalidade esportiva .................................
8
Figura 7. Estrutura química da cafeína ..............................................................................
10
Figura 8. Estrutura química da cocaína ..............................................................................
11
Figura 9. Estrutura química das efedrinas ..........................................................................
13
Figura 10. Esquema representativo do metabolismo das anfetaminas ...............................
16
Figura 11. Esquema do EMIT ...........................................................................................
19
Figura 12. Conjugados utilizados em imunoensaios para anfetaminas em urina ..............
19
Figura 13. Estruturas químicas de algumas anfetaminas ..................................................
20
Figura 14. Estruturas químicas da quetamina e norquetamina...........................................
23
Figura 15. Esquema representando a formação do eletrospray .........................................
25
Figura 16. Fontes de ionização do tipo eletrospray. ...........................................................
26
Figura 17. Esquema representativo de um espectrômetro de massas com fonte de
ionização eletrospray e analisador ion trap .........................................................................
27
Figura 18. Esquema representativo de um analisador ion trap ..........................................
28
Figura 19. Espectro de varredura completa de amostras de urina contendo a) anfetamina
e b) efedrina. O íon quasi-molecular está indicado para cada uma………………………..
28
Figura 20. Representação esquemática dos diferentes modos de análise sequencial.........
30
Figura 21. Análise de efedrina usando Espectrometria de Massas Seqüencial de 3ª
ordem ..................................................................................................................................
30
Figura 22. Espectro MS/MS para detecção de anfetamina em urina..................................
31
Figura 23. Representação esquemática de uma extração em fase sólida ...........................
33
Figura 24. Espectros de massas da anfetamina não derivatizada (a) e acetilada (b) .........
34
Figura 25. Espectros de massas da efedrina (a), artefato (b) e fenmetrazina (c) ...............
35
Figura 26. Estruturas químicas dos isômeros da metanfetamina e a embalagem do
inalante Vick® ....................................................................................................................
37
Figura 27. Representação esquemática de uma fonte de ionização por impacto por
elétrons ................................................................................................................................
38
Figura 28. Análise cromatográfica de pseudoefedrina em urina (forma acetilada)
realizada nos modos de (a) varredura completa e (b) SIM (íons monitorados: 58, 100,
148). Em (c) é apresentado o espectro de massas associado ao pico cromatográfico com
t
r
= 16,03 ..............................................................................................................................
40
Figura 29. Esquema da montagem utilizada na síntese do éster metílico da fenilalanina .
43
Figura 30. Equipamento LC-MSD Trap series 1100 ......................................................................
45
vii
Figura 31. Equipamento Trace GC Ultra – Polaris Q .....................................................................
46
Figura 32. Software “Gerador de Arquivos Completos” ...................................................
50
Figura 33. Análise de Cluster baseada em espectrometria de massas utilizando distância
euclidiana. ...........................................................................................................................
51
Figura 34. Matriz representativa do conjunto de dados obtidos na simulação do
screening...............................................................................................................................
51
Figura 35. Espectros de massa de uma mistura de anfetaminas considerando a
estabilidade dos íons igual a a) 80% e b) 20%. Concentração de cada analito: 500 ng/mL
em metanol ..........................................................................................................................
62
Figura 36. Efeito da diluição da urina nas análises de anfetaminas por EM (modo full
scan): (a) sem diluição, (b) diluição 1:1, (c) diluição 1:5, (d) diluição 1:10........................
64
Figura 37. Espectros MS/MS de cada um dos padrões de anfetamina em estudo .............
65
Figura 38. Espectros MS/MS/MS para os pares de isômeros: (a) catina e (b)
norefedrina; e (c) pseudoefedrina e (d) efedrina .................................................................
66
Figura 39. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening
para a) anfetamina e b) metanfetamina...............................................................................
68
F ig u ra 40. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening para a)
norefedrina e b) carina. ...................................................................................................................
69
Figura 41. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening
para a) efedrina e b) pseudoefedrina...................................................................................
70
Figura 42. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening
para a) MDA e b) MDMA..................................................................................................
71
Figura 43. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a)
anfetamina e b) metanfetamina....................................................................................................
75
Figura 44. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a)
norefedrina e b) catina..........................................................................................................
76
Figura 45. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a) efedrina
e b) pseudoefedrina.............................................................................................................
77
Figura 46. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a) MDA e
b) MDMA...........................................................................................................................
78
Figura 47. Espectros obtidos em modo full scan para os padrões de anfetaminas
derivatizados com anidrido acético / piridina ....................................................................
81
Figura 48. Cromatogramas obtidos em modo SIM para os padrões de anfetaminas
derivatizados com anidrido acético/piridina ......................................................................
82
Figura 49. Esquema geral da reação do anidrido acético com uma anfetamina ...............
84
Figura 50. Cromatograma obtidos em modo SIM para as amostras de referência
negativa...............................................................................................................................
85
Figura 51. Estudo de linearidade para a) anfetamina, b) metanfetamina, c) norefedrina,
d) catina, e) efedrina, f) pseudoefedrina, g) MDA e h) MDMA .......................................
87
Figura 52. Estudo de estabilidade dos derivados acéticos das anfetaminas......................
95
Figura 53. Estudo de cinética de excreção de pseudoefedrina em urina ..........................
99
viii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Faixa de preços dos espectrômetros mais utilizados .......................................
24
Tabela 2. Valores de pKa de algumas anfetaminas .......................................................
46
47
Tabela 4. Concentração de cada analito nas amostras utilizadas para simulação do
screening ..........................................................................................................................
49
Tabela 5. Condições experimentais otimizadas para o método de confirmação baseado
em CG-EM .......................................................................................................................
53
Tabela 6. Proporções de anidrido acético e piridina testadas como reagente
derivatizante .....................................................................................................................
53
Tabela 7. Quantidade de metanol utilizado como eluente, na extração das
anfetaminas........................................................................................................................
54
Tabela 8. Volumes de solução padrão utilizados no estudo de linearidade.....................
55
Tabela 9. Resultados obtidos para simulação do screening.............................................
72
73
Tabela 11. Resultados obtidos para o screening .............................................................
79
Tabela 12. Tempo de retenção obtido para cada analito .................................................
83
Tabela 13. Linearidade e Sensibilidade para os derivados acéticos das anfetaminas
estudadas............................................................................................................................
88
Tabela 14. Estudos de linearidade para anfetaminas encontrados na literatura..............
88
Tabela 15. Dados de LD e L Q para anfetaminas encontrados na literatura.....................
89
Tabela 16. Precisões intra-dia e inter-dia para os derivados acéticos das anfetaminas
estudadas............................................................................................................................
90
Tabela 17. Dados de precisão intra-dia para anfetaminas encontrados na literatura........
91
Tabela 18. Dados de precisão inter-dia para anfetaminas encontrados na literatura........
91
Tabela 19. Índices de recuperação para os derivados acéticos das anfetaminas
estudadas............................................................................................................................
92
Tabela 20. Dados de recuperação para anfetaminas encontrados na literatura................
93
Tabela 21. Curvas de calibração utilizadas para a quantificação das anfetaminas ..........
96
Tabela 22. Concentrações das anfetaminas encontradas em amostras reais de urina
(em ng/mL) .......................................................................................................................
97
ix
Lista de abreviaturas
AMA, WADA = Agência Mundial Anti-Doping
ANAD = Agência Nacional de Controle de Dopagem
ANF = anfetamina
APCI = ionização química à pressão atmosférica
AVC = Acidente Vascular Cerebral
CAT = catina
CBF = Confederação Brasileira de Futebol
CBV = Confederação Brasileira de Voleibol
CCD = cromatografia em camada delgada
CEDIA = imunoensaio por doação de enzima clonada
CGAR = cromatografia a gás de alta resolução
CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência
CLCD = Comissão Local de Controle de Dopagem
CMCOI = Comissão Médica do Comitê Olímpico Internacional
CNCD = Comissão Nacional de Controle de Dopagem
COB = Comitê Olímpico Brasileiro
COEP = Comitê de Ética em Pesquisa
COI = Comitê Olímpico Internacional
CV = coeficiente de variância
DESI = dessorção por eletrospray
DNP = detector de nitrogênio – fósforo
EC = eletroforese capilar
EFE = efedrina
EFS = extração em fase sólida
ELL = extração líquido-líquido
EM = espectrometria de massas
EMIT = técnica de imunoensaio multiplicada por enzima
ESI = ionização por eletrospray
FIFA = Federação Internacional de Futebol
FNCA = Formulário de Notificação e Coleta de Amostra
FPIA = imunoensaio por fluorescência polarizada
FRM = Formulário de Relação de Medicamentos
x
HFBA = anidrido hexafluorobutírico
HFBCl = cloreto hexafluorobutírico
IE, EI = Ionização por impacto elétrons
IQ, CI = Ionização química
KIMS = interação cinética de micropartículas em solução
LADETEC = Laboratório Nacional de Controle de Dopagem
LD = Limite de Detecção
LMD = Limite Mínimo de Desempenho
LQ = Limite de Quantificação
MALDI = dessorção de matriz assistida por laser
MAO = Monoaminoxidase
MBDB = N-metil-metilenodioxifenilbutanamina
MDA = metilenodioxianfetamina
MDMA = metilenodioximetanfetamina
MEFS = microextração em fase sólida
MET = metanfetamina
MRM = Modo de reação monitorada
MSn = espectrometria de massas seqüencial
MSTFA = N-metil-N(trimetilsili)-trifuoroacetamida
NOR = norefedrina
PCP = propilcolroformato
PMK = Psicodiagnóstico Miocinético
PS = Planilha de Sorteio
PSE = pseudoefedrina
RCD = Regulamento de Controle de Dopagem
RI = radioimunoensaio
SIM = Monitoramento de íon único
SNC = Sistema Nervoso Central
TCLE = Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TECP= 2,2,2, tricloetilcloroformato
TOF = tempo de vôo
TSIM = trimetilsililimidazol
xi
Resumo
Todas as vezes em que duas pessoas se encontram em uma disputa, cada uma
sempre pensará em sair em vantagem em relação a seu adversário. Isso acontece em
qualquer situação: na escola, no trabalho, na política, nos negócios, nas guerras. No
esporte, não é diferente. Hoje o esporte tornou-se uma verdadeira indústria, com
premiações na maioria das vezes bastante valiosas, além de grandes investimentos por
parte de patrocinadores. Na corrida pela superação ao adversário, atletas recorrem a
meios ilegais para melhorar o próprio desempenho. Com o avanço da ciência, esses
meios estão cada vez mais sofisticados. Por causa disso, também há uma exigência de
que os métodos para a triagem de tais fraudes evoluam com igual ou maior velocidade.
Os métodos utilizados com essa finalidade são chamados métodos de screening
e fornecem uma resposta do tipo “sim” ou “não”. Devem apresentar como
características principais a rapidez na análise, baixo custo, fácil operação e acima de
tudo, confiabilidade. Os métodos mais utilizados, principalmente para estimulantes são
os imunoensaios, as cromatografias em camada delgada, líquida ou a gás, e a
eletroforese capilar, esses últimos acoplados ou não à espectrometria de massas. Na
prática, nenhuma técnica analítica consegue atender a todos os requisitos acima. Por
isso, todo método de screening é acompanhado de um método confirmatório. Como tal,
são utilizadas as cromatografias à gás e líquidas acoplada à espectrometria de massas.
Nesse trabalho foram desenvolvidos: um método de screening utilizando
espectrometria de massas com injeção direta e um método confirmatório utilizando
cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas. O primeiro, inédito,
apresentou excelente confiabilidade, alta seletividade, boa sensibilidade, além da
rapidez nas análises e na preparação das amostras. O segundo apresentou alta
sensibilidade, ampla linearidade e bons índices de precisão e recuperação. No entanto, o
seu diferencial está na preparação das amostras. Utilizando extração em fase sólida e
derivatização com anidrido acético em piridina (ambos reagentes de grau analítico), foi
possível obter resultados tão bons quantos os alcançados por métodos descritos na
literatura mais recente que utilizam os reagentes específicos para derivatização.
xii
Abstract
Every time that two people dispute something, each one always thinks about
how get an advantage against the opponent. This occurs in any kind of situation: at
school, at work, in politics, on business, in the war. In the sport, it is not different.
Nowadays, sport has become a real industry, with great prizes and big financial
investments. In the quest to get the better of the opponent, the athletes appeals to illicit
ways to improve their performance. These resources are more and more sophisticated in
the pace of scientific advances. Because of this, there is also a requirement that the
screening methods to unveil “frauds” must be improved in the same speed or even
faster.
A screening method is one that gives only “yes/no” answer. Their principal
characteristics are rapidness, low cost, easiness to handle and, over all, realiability. The
most used ones, especially for stimulants, are (i) immunoassays, (ii) thin-layer, liquid
and gas chromatography and (iii) capilar electrophoresis. The last ones do not have to
be coupled to a mass spectrometer. In practice, there is no technique that can fullfil all
the requirements. Therefore, every screening method has to be followed by a
confirmatory one. For this purpose, gas or liquid chromatography mass spectrometry are
the most used methods.
In this work, two methods were developed, one for screening and the other for
confirmation. The first, not yet described on the literature, was based on mass
spectrometry with direct injection and showed very good reliability, high selectiveness,
good sensitivity, fast and simple sample preparation. The second showed high
sensitivity, wide linearity and good values for precision and recovery. However, its
differential point is in the sample preparation. Using solid phase extraction (SPE) and
derivatization with acetic anhydride / pyridine (both in analytical grade) it was possible
to get results as good as those standard methods described in the recent literature, which
use specific reagents for derivatization.
1
1. Introdução
1.1 Aspectos Gerais dos Estimulantes
1.1.1 Definição
Os estimulantes compreendem uma classe de substâncias capazes de aumentar um
nível inicial baixo de atividade fisiológica (FOYE, 1995). Quando se insere os estimulantes
no contexto esportivo, a definição ganha nova roupagem, como se pode observar na
interpretação do Comitê Olímpico Norte-Americano (U. S. OLYMPIC COMMITTEE,
1989), “estimulantes incluem vários tipos de substâncias que aumentam a vigilância,
reduzem a fadiga e que podem aumentar a competitividade e a hostilidade”.
1.1.2 Mecanismo de ação dos estimulantes
Os estimulantes entram no organismo por meio de ingestão, inalação, aspiração ou
injeção e, independentemente da via de acesso, eles sempre caem na corrente sanguínea. A
partir daí, em um intervalo de 10 a 15 segundos, essas substâncias fluem pela carótida até
alcançar a barreira hemato-encefálica que envolve o sistema nervoso central (SNC) (Figura
1).
F ig u ra 1. Barreira hematoencefálica
Os neurônios, células que constituem o sistema nervoso, são estruturalmente formados
pelos dendritos (receptores dos sinais elétricos), corpo da célula (responsável pela
manutenção da atividade celular) e axônio (responsável pela transmissão dos sinais
2
provenientes dos dendritos e do corpo celular para os dendritos do neurônio seguinte) (Figura
2). A transmissão de sinal entre dois neurônios ocorre quimicamente, por meio de
neurotransmissores, na fenda sináptica, espaço existente entre o terminal do axônio de um
neurônio e os dendritos de outro.
F ig u ra 2. Aspecto bastante ampliado da junção de duas células nervosas
A produção dos neurotransmissores ocorre da seguinte forma: o precursor
correspondente é liberado no sistema nervoso e absorvido pelo neurônio. Ao ser absorvido,
esse precursor inicia a síntese do neurotransmissor, que é armazenado em vesículas no
terminal do axônio. Os neurônios se comunicam por meio da liberação de impulso elétrico, o
qual recebe o nome de potencial de ação, ao longo do axônio. Quando o impulso elétrico
atinge uma freqüência limite no terminal do axônio, as vesículas se deslocam até a superfície
do neurônio. O terminal nervoso torna-se então polarizado, as vesículas que se encontram na
superfície do axônio se rompem e os neurotransmissores são liberados em pequenas
quantidades na fenda sináptica (INABA, 1991). Uma vez na fenda sináptica, a molécula do
neurotransmissor interage com uma proteína transportadora e por meio desta, ela pode (i)
interagir com receptores específicos na terminação do neurônio adjacente (ou em células de
outros tecidos), ou (ii) ser recapturadas pelo mesmo neurônio do qual foram liberadas.
A maioria dos estimulantes influencia o processo de ação de alguns
neurotransmissores específicos: a dopamina, a serotonina e a noradrenalina (Figura 3).
Os principais estimulantes do Sistema Nervoso Central (SNC) são: cafeína,
anfetaminas e cocaína (Figura 4). Os principais mecanismos pelo qual essas substâncias
interferem na ação dos neurotransmissores acima são (i) aumento da liberação do
neurotransmissor no receptor, (ii) estímulo direto dos receptores pós-sinápticos, (iii) inibição
da recapturação do neurotransmissor (BOUCHARD, 2002).
3
Cafeína
N
N
N
N
O
O
Cocaína
N
H
O
O
H
O
O
Anfetaminas
NHR
R
F ig u ra 4. Estruturas químicas dos principais estimulantes que atuam sobre o SNC
Dos estimulantes mencionados, a cafeína é o único que não influencia a ação dos
neurotransmissores mencionados. A cafeína inibe a isoenzima fosfodiesterase, mas como
estimulantes do SNC, atua como antagonista dos receptores A1, A2 e A3 (DALY, 1983). A
cocaína, por sua vez, inibe a recapturação da dopamina e da noradrenalina. Em relação à
dopamina, ela o faz ligando-se fortemente ao transportador desse neurotransmissor, uma
proteína responsável pelo processo de recapturação (WILLIAMS, 2006).
De um modo geral, as anfetaminas podem agir por meio de quatro mecanismos
diferentes: (i) inibição da atividade da monoaminoxidase (MAO), (ii) inibição da recapturação
dos neurotransmissores, (iii) ação direta sobre os receptores dos neurotransmissores e,
principalmente, (iv) liberação dos neurotransmissores dopamina, serotonina e noradrenalina,
sendo que o potencial de ação sobre esse último é maior em relação aos dois primeiros
(ROTHMAN, 2001). A presença de grupos metóxi altera significativamente o mecanismo de
ação das anfetaminas. Quanto maior for a substituição do anel aromático por grupos metóxi,
em especial os metilenodióxi, menor é a atuação dos mesmos sobre a inibição da recapturação
da noradrenalina e sobre a liberação desta nos sítios de ligação. Dessa forma, pode-se dizer
que esses derivados de anfetamina agem principalmente por meio de interação direta com o
receptor. Grupos substituintes metóxi em posições meta do anel aromático (Figura 5) são os
responsáveis pelos efeitos alucinógenos desses compostos (SYKES, 1996).
Dopamina
OH
OH
NH
2
Serotonina
N
H
OH
NH
2
Noradrenalina
OH
OH
NH
2
OH
F ig u ra 3. Estruturas químicas dos neurotransmissores que são influenciados pelos estimulantes.
4
O
O
NHR
R
F ig u ra 5. Estrutura química das metilenodioxianfetaminas
Experimentos pré–clínicos (em animais) e clínicos sugerem que os efeitos das
anfetaminas são mediados pela liberação de noradrenalina e dopamina. Experimentos em
ratos sugerem que a tolerância às anfetaminas está relacionada à liberação de serotonina
(SILVERSTONE, 1985), enquanto a inibição do apetite estaria relacionada com a
neurotransmissão da dopamina e da noradrenalina (CHEN, 2001).
1.2 A Dopagem Esportiva
1.2.1 A origem do termo “dopagem”
Não se sabe ao certo de onde vem o termo doping, ou dopagem. Antigamente, entre os
árabes, o uso de alguma substância por atletas com o intuito de obter vantagens em uma
competição esportiva era chamado cat. Esse termo vem da palavra assíria catina (ou cathine),
uma planta com propriedades estimulantes. Os italianos utilizavam termos como drogaggio,
ergogenia medicamentosa, melassanera ou bombe chimiche. Já os franceses atribuíram vários
termos que ia desde topethe, passando por dynamite, até chegar em dopage, como é conhecido
hoje.
No dialeto africano Kafir, falado na África do Sul, a palavra dop já existia e
significava uma infusão de plantas medicinais com propriedades estimulantes utilizadas em
cerimônias tribais.
No inglês, o verbo to dope há algum tempo é um termo conhecido no mundo do
esporte para indicar administração de drogas a cavalos a fim de melhorar o seu desempenho.
Entretanto, o termo doping apareceu pela primeira vez em dicionários da língua inglesa em
1889 e novamente fazia referência a esportes com participação de eqüinos (VERROKEN,
2000):
“mistura de narcóticos utilizadas para diminuir o rendimento de cavalos de corrida (dos
adversários).”
Nos dicionários holandeses mais antigos, as palavras dooper (batizar) e under dooper
5
(uso de drogas) eram usadas para descrever o uso de substâncias no meio esportivo.
Nos compêndios franceses é possível encontrar a palavra duper, que significa trapaça
ou pequena fraude e da qual, provavelmente veio a palavra dopage, utilizada hoje.
Com o passar do tempo, as atividades esportivas foram se desenvolvendo, e com elas,
os meios que os atletas utilizam para obter vantagens em uma competição esportiva também
ficaram cada vez mais sofisticados. Por isso o termo doping (dopagem) hoje não faz uma
alusão apenas às substâncias utilizadas por um atleta para melhorar o seu rendimento, mas
engloba também os métodos utilizados para tal fim.
A primeira definição de dopagem apresentada pelo Comitê Olímpico Internacional
(COI) foi publicada durante os Jogos Olímpicos do México em 1968:
“Administração ou uso de agentes estranhos ao organismo ou de substâncias fisiológicas em
quantidade anormal, capazes de provocar no atleta, no momento da competição, um
comportamento anormal, positivo ou negativo, sem correspondência com a sua real
capacidade orgânica e funcional.”
Na época o COI queria, por meio da definição, algo que abrangesse farmacologia,
toxicologia, clínica, ética, educação e regionalismo (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
ESTUDOS E COMBATE DO DOPING, 2002). Entretanto, a definição proposta era muito
complexa, o que, diante de um resultado positivo, poderia levar muitos atletas a recorrem de
suas sentenças com grandes possibilidades de ganho de causa. No sentido de evitar que isso
acontecesse, os comitês olímpicos nacionais e/ou as federações esportivas individualmente
criaram as suas próprias definições para dopagem.
Somente em 1999, com a criação da Agência Mundial de Combate ao Doping a
Comissão Médica do Comitê Olímpico Internacional pronuncia-se oficialmente no Olympic
Movement Anti-Doping Code (INTERNATIONAL OLYMPIC COMMITTEE MEDICAL
COMISSION, 1990; MOCTAR, 2005):
Entende-se por dopagem:
1 - O uso de um recurso (substância ou método) o qual é potencialmente prejudicial à saúde
do atleta e/ou capacidade de melhorar a sua performance, ou
2 - A presença no corpo do atleta de uma Substância Proibida ou evidência do uso da mesma
ou de um Método Proibido.
Os Métodos e Substâncias Proibidos são aqueles listados pela Agência Mundial de
Controle de Dopagem (WADA) e serão apresentados aqui posteriormente.
6
1.2.2 A dopagem por estimulantes ao longo do tempo
As substâncias estimulantes já são conhecidas da humanidade há muito tempo
(YESALIS, 2002). Há quase 4.800 anos atrás, os chineses mastigavam e faziam extratos e
infusões de plantas que apresentavam efeitos estimulantes como a efedra (de onde é extraída a
efedrina). Um pouco mais tarde, em 1000 a.C., os árabes descobriram tais efeitos em outras
plantas, como a que chamavam de catina
1
e o ginseng (usado para estimular guerreiros).
Caminhando em direção ao ocidente, por volta de 300 a.C., os berserkers, segundo a
mitologia nórdica, faziam uso de bufoteína, uma substância estimulante extraída de um fungo.
Enquanto isso, na África, a cola acuminata e a cola nítida eram usadas como estimulantes em
marchas e corridas. No mesmo período, o ópio e seus derivados eram muito utilizados na
Grécia e na Ásia, principalmente na China e na Turquia. Nesses locais, era muito comum o
uso de opiáceos em batalhas no sentido de amenizar as dores dos ferimentos e ao mesmo
tempo encorajar os atletas para os confrontos (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE ESTUDOS
E COMBATE DO DOPING, 2002).
Na Grécia é possível encontrar registros de que nos Jogos Olímpicos Antigos, de 300
a.C., os atletas preparavam uma cocção de plantas cujo principal produto era um alucinógeno
extraído de cogumelos.
Já em solo americano, um pouco antes de Cristo, os latinos mascavam a coca para
aumentar o desempenho, diminuir o cansaço e fome nos trabalhos forçados e nas marchas.
Nessa mesma época, na América do Norte, os nativos ingeriam uma planta, o peyote, que
contém um alcalóide estimulante bastante conhecido, a mescalina.
Entretanto, o que pode ser dito como ponto de partida (ou marco zero) da dopagem
esportiva aconteceu no século XVI com o surgimento na Europa das drogas à base de cafeína.
Em 1806 foi isolado o primeiro alcalóide do ópio, a morfina, que, uma década depois, estava
sendo utilizada em cavalos na Inglaterra. Na inauguração do Canal do Norte em Amsterdã,
vários nadadores participaram de uma prova após ingerirem drogas estimulantes (cafeína,
cocaína, estriquinina), álcool e éter, sozinhos ou em combinações (GOLDMAN, 1986). Na
Corrida Ciclística dos Seis Dias, em 1879 na França, para fins anestésicos, os franceses
consumiam misturas à base de cafeína e os belgas, cubos de açúcar imersos em bebidas
alcoólicas ou éter. Além desses, outros ciclistas utilizavam a nitroglicerina como um
vasodilatador.
1
trata-se de uma planta na qual se extraía a dextronorisoefedrina. A catina, como é conhecida hoje, é o nome
popular da norpseudoefedrina, a qual é uma droga ilícita e/ou um dos principais metabólitos da pseudoefedrina
(TSENG, 2006)
7
No final do século XIX, o uso indiscriminado de estimulantes já era tal que, em 1896,
era noticiado o primeiro caso de óbito por uso de estimulantes. O ciclista inglês Arthur Linton
faleceu durante a Corrida dos 600 km entre Bordeaux e Paris, depois de usar uma mistura de
cocaína, estriquinina e nitroglicerina.
Por volta de 1900, no boxe, usava-se de tabletes de estriquinina misturados com
cocaína e conhaque, uma vez que era comum debilitar o adversário com drogas dopantes
acondicionadas em garrafas de água.
O crescimento da dopagem esportiva aconteceu mesmo com a primeira síntese de
anfetamina, pelo farmacêutico japonês Ogata em 1919. Durante a Segunda Guerra Mundial, o
medicamento Pervitin (metanfetamina) era usado por soldados para eliminar o sono durante
as marchas e vôos noturnos. Mais tarde, os mesmos soldados passaram a utilizá-lo nos jogos
do exército. Quando a guerra acabou e os jogadores-soldados retornaram a seus países, muitos
já estavam dependentes da anfetamina e continuaram suas práticas desportivas sob efeito do
medicamento, principalmente aqueles que praticavam o futebol americano. Essa foi uma das
principais causas para a disseminação do uso de anfetaminas entre esportistas
(ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE ESTUDOS E COMBATE DO DOPING, 2002).
É da década de 1960, a descrição dos primeiros óbitos por uso abusivo de estimulantes
em Jogos Olímpicos. Foram dois durante os Jogos Olímpicos de Roma: um ciclista
dinamarquês (Knut Enemark Jensen, 15 tabletes de anfetaminas e 8 tabletes de um
vasodilatador coronariano – nitrato de nicotinila, misturados a uma garrafa de café), um
ciclista alemão (Dirck Howard, overdose de heroína). Na mesma década, em 1967, na mais
famosa competição mundial de ciclismo, o Tour de France, o ciclista inglês Tommy Simpson
faleceu após ingerir anfetaminas (metanfetamina, anfetamina e conhaque).
Até então, os métodos para a detecção de dopagem eram bastante limitados. Os
primeiros foram desenvolvidos na Áustria, no início do século XX (décadas de 10 e 20) e
eram baseados em análises de urina. Os métodos de cromatografia a gás e delgada, criados e
desenvolvidos nas décadas de 1940 e 1950, aos poucos foram sendo acoplados a outras
técnicas analíticas, como a espectrometria de massas. Com esses novos métodos, tornou-se
possível detectar e quantificar, nas análises feitas em urina, a maioria das substâncias
proibidas para os atletas (VERROKEN, 2000).
O combate oficial à dopagem começou em 1964, durante os Jogos Olímpicos de
Tóquio, nos quais a UNESCO, junto com o COI, esboçou as primeiras leis, controles e
punições, embora os países participantes não reconhecessem tais deliberações.
8
Essas deliberações e leis só começaram a ser aceitas quatro anos depois, quando uma
comissão de cinco médicos e um químico, formada pelo COI, unificou-as. Durante os Jogos
do México de 1968, o controle foi muito pequeno e sem punições. Nessa época estavam
proibidos os estimulantes do Sistema Nervoso Central, os narcóticos analgésicos e as aminas
simpaticomiméticas. Mais tarde foram acrescentados os hormônios esteróides anabolizantes
(em 1976) e as substâncias mascarantes como diuréticos e a probenecida (em 1984).
Nas décadas de 1960 e 1970, as anfetaminas estavam presentes na maioria dos casos
positivos de dopagem por substâncias estimulantes. Aos poucos elas foram perdendo espaço
para outros estimulantes ilícitos como a cocaína, o crack e o ecstasy (ASSO CIAÇ ÃO
BRASILEIRA DE ESTUDOS E COMBATE DO DOPING, 2002).
1.2.3 O uso de estimulantes como agentes dopantes no esporte
A dopagem no esporte consiste no uso de meios artificiais para a melhoria do
rendimento esportivo e por isso, vai contra um dos princípios fundamentais da competição
esportiva: competir de igual para igual em um jogo limpo (Fair Play) (CONSELHO DA
EUROPA, 1985). Desde o início dos Jogos Olímpicos Modernos de Verão e de Inverno até os
Jogos de Inverno de Salt Lake City em 2002, foram registrados 70 casos positivos de doping.
Segundo um levantamento realizado por Prendergast e colaboradores (PRENDERGAST,
2003), os estimulantes conFiguram a segunda classe de substâncias dopantes mais utilizadas
por atletas em Jogos Olímpicos (Figura 6a). O salto em distância é a segunda modalidade
esportiva em número de casos positivos de doping (Figura 6b). Esses dois fatos não
constituem uma simples coincidência. Há uma relação direta entre essa modalidade e a
dopagem por uso de estimulantes.
(a)
(b)
F ig u ra 6. Distribuição dos casos positivos de doping até os Jogos de Inverno de 2002 conforme a) o
tipo de substância encontrada e b) a modalidade esportiva
esteróides
estimulantes
diuréticos
beta-2 antagonistas
betabloqueadores
levantamento de peso
salto em distância
esqui
luta livre
vô l ei
pentatlon
ciclismo
natação
ginástica
remo
9
Uma pesquisa realizada na França em 2001 com 402 médicos (clínicos gerais)
mostrou que apesar de 73% deles possuírem a lista das substâncias banidas no esporte, apenas
34,5% seguem a legislação francesa de combate ao doping. Durante um ano, 11% dos
médicos entrevistados afirmaram ter sido pagos para prescrever agentes dopantes,
principalmente esteróides anabolizantes, estimulantes e corticoesteróides. No mesmo período,
10% dos médicos disseram ter atendido algum atleta que fez uso de substâncias dopantes
(LAURE, 2003).
Os estimulantes são procurados por atletas para diminuir o cansaço e ao mesmo tempo
aumentar o estado de alerta, a competitividade e a agressividade (SEGURA, 2000). Por isso,
as maiores incidências dessas substâncias aparecem em esportes que exploram a resistência
física e o poder “explosivo”, uma vez que as mesmas propiciam um ganho de energia e
reduzem a sensibilidade à dor. Geralmente, os estimulantes são mais utilizados no dia da
competição, entretanto em alguns casos os atletas os utilizam durante os treinamentos com a
finalidade de suportarem uma carga de treinamento mais pesada, por meio da redução da
fadiga. Como também podem aumentar a agressividade dos atletas, o uso de estimulantes em
esportes de combate, como as lutas, torna-se mais perigoso (VERROKEN, 2000). A escolha
do estimulante varia com a modalidade esportiva (MOCTAR, 2005). A cafeína, a cocaína e as
anfetaminas (incluindo os derivados sintéticos) estão sendo utilizadas de forma abusiva por
atletas do mundo inteiro e são freqüentemente mencionadas pelos laboratórios de controle de
dopagem (CLARKSON, 1997; AVOIS, 2006). Entretanto, quando utilizados de forma
abusiva, os estimulantes podem trazer conseqüências bastante graves para a saúde do atleta.
Muitos óbitos repentinos que ocorrem durante ou após atividades esportivas têm origem
cardiovascular (cardiomiopatias e distúrbios coronarianos, principalmente) ou estão
relacionados ao uso abusivo de estimulantes (JAEGER, 1990).
1.2.3.1 Cafeína
O uso da cafeína (Figura 7) por esportistas está relacionado com o aumento de
resistência física (SPRIET, 2002). Esses efeitos podem aparecer em atividades curtas, que
durem 60 segundos, ou em atividades longas, com duração de 2 horas. Estudos recentes
sugerem que a ação da cafeína no organismo não está relacionada a um aumento na força
física, mas a um aumento na tolerância e na resistência à fadiga (PATON, 2001). Não há
evidências de que a cafeína, quando ingerida antes de exercícios físicos provoque
desidratação ou desequilíbrio iônico (PALUSKA, 2003), mas ela pode, em parte, criar um
10
meio iônico intracelular favorável no músculo ativo. O que já foi comprovado é que a cafeína
pode apresentar uma ação sinérgica com outras substâncias, como a efedrina ou alguns
antiinflamatórios (GRAHAM, 2001). Vários estudos têm sido realizados ao longo dos últimos
quarenta anos no tocante ao efeito da cafeína no organismo de um atleta. Até a década de 80,
muitos deles sugeriam que a cafeína favorecia a liberação e o metabolismo de ácidos graxos e
glicerol, levando assim à conservação do carboidrato (IVY, 1979). Estudos realizados
posteriormente sugeriram que a cafeína é capaz de melhorar o desempenho esportivo por
meio da (i) estimulação do SNC, (ii) liberação aumentada de catecolaminas, (iii) mobilização
dos ácidos graxos livres e (iv) utilização aumentada de triglicérides nos músculos, reduzindo a
utilização do glicogênio muscular (DODD, 1993).
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O
O
F ig u ra 7. Estrutura química da cafeína
Um estudo realizado por Stuart e colaboradores (STUART, 2005) com 9 jogadores de
rugby mostrou que a cafeína, quando ingerida cerca de uma hora antes da competição
aumenta em aproximadamente 3% a velocidade na corrida e 9,5% a exatidão do passe.
Segundo os autores, a melhora no desempenho foi devida em parte à redução da fatiga gerada
durante a prova. Além disso, a cafeína produziu um aumento de 51% na concentração média
de adrenalina. No entanto, ainda não está claro se existe uma correlação entre a adrenalina e
alterações no desempenho dos atletas. Há correlações positivas muito fortes entre a
concentração desse neurotransmissor e a velocidade da corrida. Entretanto, também existem
correlações negativas muito fortes entre tal concentração e a exatidão do passe.
Outro estudo mais recente, realizado por Schneiker e colaboradores (SCHNEIKER,
2006), mostrou que, além da ação ergogênica em esportes de longa duração, a cafeína também
pode apresentar tal efeito em modalidades envolvendo corrida de forma intermitente. Dez
atletas amadores do sexo masculino constituíram um grupo no qual alguns indivíduos
ingeriram 6 mg de cafeína/kg de peso corpóreo, enquanto os demais ingeriram placebo.
Decorridos 60 minutos a contar da ingestão da substância (ou placebo), os atletas foram
submetidos a uma seqüência de exercícios em esteira ergométrica, que foi repetida após um
intervalo de 7 dias. Cada seqüência era dividida em 2 séries de 36 minutos. Cada série
11
consistia de 18 corridas de 4s com intervalos de 2 min. Após a realização de cada série, foram
medidas as concentrações urinárias de cafeína. Em relação ao desempenho, os autores
concluíram que o efeito da cafeína foi 8,5% maior que o do placebo, e 7,6% maior na
primeira série de 36 min em relação à segunda.
Nem só vantagens o uso da cafeína proporciona aos atletas. Esse estimulante também
apresenta vários efeitos colaterais que podem ser bastante prejudiciais não apenas ao
desempenho esportivo, mas também à saúde do atleta (SINCLAIR, 2000): (i) aumento das
secreções gástricas e de pepsina, além de um aumento de secreção no duodeno, (ii) aumento
da freqüência cardíaca e da pressão arterial (essa última quando em repouso), (iii) taquicardia
e outros tipos de arritmia, (iv) aumento da lipólise, (v) aumento da capacidade de contração
dos músculos esqueléticos (vi) aumento do consumo de oxigênio e da taxa metabólica, (vii)
aumento da diurese. Outros efeitos podem aparecer devido ao uso constante ou abusivo:
nervosismo, irritabilidade, insônia, delírio, coma e a mais crônica de todas, elevação da taxa
de colesterol no plasma (GEORGE, 1996).
1.2.3.2 Cocaína
A cocaína (Figura 8) foi utilizada durante muitos anos com finalidades terapêuticas,
principalmente como anestésico de uso local. O seu uso por atletas está relacionado à
sensação de euforia e de diminuição da fadiga. É uma substância bastante perigosa para
atletas de modalidades esportivas envolvendo corrida, uma vez que ela contribui para o
aquecimento corpóreo e formação de ácido láctico, os quais associados com o efeito
vasoconstritor da mesma podem contribuir para o aparecimento de problemas cardíacos fata is
(sobretudo quando é utilizada na forma de crack) (GEORGE, 2000; VERROKEN, 2000).
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H
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H
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F ig u ra 8. Estrutura química da cocaína
De todos os estimulantes, a cocaína é certamente a substância que apresenta o maior
potencial de dependência. Os efeitos psicológicos que surgem devido ao uso abusivo de
cocaína vão desde os sintomas psicóticos (paranóia, delírio e confusão) à irracionalidade,
além daqueles que resultam da sensação de euforia que a mesma provoca. O uso abusivo de
12
cocaína também está associado com acidentes vasculares cerebrais (AVC). Em relação aos
efeitos fisiológicos, a cocaína contribui consideravelmente para o aumento da degradação do
glicogênio, levando a um aumento da concentração de lactato no plasma, sem que isso
provoque uma mudança significativa concentração plasmática de catecolaminas (GEORGE,
2000).
Embora a cocaína apresente tantos efeitos que prejudiquem não apenas o desempenho
esportivo, mas também a saúde do atleta, esse estimulante ainda está presente em muitos
casos positivos de dopagem. Isso pode ser explicado pelo fato de a cocaína apresentar um
efeito positivo em atividades de curta duração, as quais requerem uma “explosão” intensa de
energia, como por exemplo, no basquete, vôlei ou futebol. Nesse caso, os efeitos dessa
substância relacionados à estimulação do SNC (sobretudo o aumento do estado de “alerta”)
tornam-se mais importantes que a ação da mesma sobre o metabolismo periférico (GEORGE,
1996; CONLEE, 2002).
1.2.3.3 Anfetaminas
No Brasil, o consumo de anfetaminas tem aumentado continuamente em academias
(UNITED NATIONS, 2003). As anfetaminas (Figura 10), de uma forma geral, são utilizadas
para “apurar” os reflexos e reduzir o cansaço. Além disso, esses estimulantes aumentam
momentaneamente a velocidade de aprendizagem. Por isso, além dos atletas, são utilizadas
por médicos, estudantes, motoristas de caminhão e pilotos, entre os quais elas são mais
conhecidas como “rebite” (MURAD, 1982; CENTRE FOR ADDICTION AND MENTAL
HEALTH, 2004). Por outro lado, as anfetaminas distorcem ligeiramente a percepção do
tempo, o que pode ser um problema para motoristas e pilotos. As anfetaminas também são
prescritas clinicamente como moderadores de apetite (MARIZ, 2004) e para o tratamento da
narcolepsia (HODOBA, 2005).
Em relação às mudanças comportamentais, esses estimulantes agem positivamente: (i)
aumentam a energia física e a disposição mental, (ii) o usuário torna-se mais falante, agitado,
excitado e bem humorado. Pessoas que utilizam anfetaminas se sentem mais confiantes,
eficientes, com ambições e relatam também que perdem parcialmente o apetite, ingerindo
menor quantidade de alimentos durante as refeições. Quando esse uso passa a ser constante,
os olhos tornam-se lacrimejantes e vermelhos, a vista torna-se embaçada, e o usuário também
apresenta reflexos exagerados e fala distorcida (JONES, 2005). As anfetaminas também
levam à tolerância (consumo crescente) e dependência (consumo constante), de acordo com a
13
dose e a forma de ingestão, e o processo ocorre mais lentamente que para a cocaína. Quando a
dose consumida é muito elevada, o indivíduo pode desenvolver psicose da anfetamina, na
qual comumente apresenta esquizofrenia do tipo paranóica (KIM, 2004).
As anfetaminas atuam principalmente sobre o metabolismo anaeróbico, por isso
favorecem atividades que requerem bastante resistência física, justificando assim o seu uso
abusivo por ciclistas (WYNDHAM, 1971). No entanto, os motivos que levam um atleta a
consumir anfetaminas são variados. Um estudo realizado com jogadores de futebol americano
mostrou que a quantidade consumida variava com a posição de cada uma na equipe. Como os
atletas “passadores” tinham que ficar mais atentos, as doses consumidas por eles eram mais
baixas. Os atletas “defensores”, por sua vez, precisavam ser mais agressivos e, por isso,
utilizavam doses mais altas (MANDELL, 1979).
As metilenodioxianfetaminas, por sua vez, são procuradas principalmente devido ao
efeito alucinógeno que provocam. Por isso, o uso destas por atletas é mais uma questão social,
não tendo relação com a melhora do desempenho esportivo.
Muitos casos de óbitos no esporte estão relacionados ao uso indevido de anfetaminas,
uma vez que a mesma leva a um aumento na pressão arterial. Como o atleta se sente “menos
cansado”, ele intensifica a atividade física, levando a um aumento da temperatura corpórea.
Essa sobrecarga de atividade, juntamente com o aumento da pressão arterial e com ação
vasoconstritora das anfetaminas dificultam o resfriamento do organismo. Se o corpo está
superaquecido, desidrata e a circulação sangüínea diminui. Com isso, o coração e outros
órgãos deixam de funcionar corretamente (VERROKEN, 2000).
As efedrinas (Figura 9) constituem um conjunto de anfetaminas que merecem um
destaque especial. São aminas simpaticomiméticas (mimetizam os efeitos dos
neurotransmissores) utilizadas em tratamentos de sintomas de distúrbios respiratórios, muito
comumente encontradas em formulações de antialérgicos e descongestionantes nasais (DEF
2006/2007, 2006).
NHR
OH
F ig u ra 9. Estrutura química das efedrinas
No início, as efedrinas eram prescritas como broncodilatadores para asma. Hoje são
consideradas menos indicadas para essa finalidade, uma vez que estão associadas com
14
arritmias cardíacas (DABISCH, 2003). No entanto, o que mais tem chamado a atenção da
sociedade é aumento do consumo de efedrinas sem qualquer prescrição médica. Isso acontece
porque esses estimulantes estão presentes em muitas formulações de produtos ditos “naturais”
(nos quais estão incluídos os emagrecedores) (RAWSON, 2002; U.S. DEPARTMENT OF
HEALTH AND HUMAN SERVICES, 2003) ou “suplementos alimentares”, vendidos
principalmente no mercado negro (PIPE, 2002; MAUGHAN, 2005). O uso de suplementos
naturais está crescendo entre os atletas de forma abusiva. Esse hábito, além de causar a
punição do atleta após um resultado positivo em um exame de controle de dopagem, pode
trazer conseqüências ao atleta tão graves quanto àqueles devidas ao uso das substâncias
“puras”. Outras conseqüências graves podem ser a intolerância à substância e a ingestão de
compostos cuja ação no organismo ainda seja desconhecida pela ciência e que podem
provocar sérias reações adversas (CAPRINO, 2005).
1.2.4 O Combate Oficial à Dopagem Esportiva
1.2.4.1 A Lista das Substâncias Banidas
O principal critério para julgar se uma substância deve ser proibida ou permitida na
prática esportiva é a sua influência positiva sobre o desempenho do atleta. Para isso, deve
levar-se em consideração conhecimentos de farmacologia, toxicologia, farmacocinética e
metabolismo das drogas (SEGURA, 1996; GRENIER-LOUTALOT, 1998). Com base nisso,
a Agência Mundial de Controle de Dopagem (AMA, WADA) elaborou uma lista de
substâncias e métodos utilizados com finalidades dopantes, que é revisada anualmente e
sempre leva em consideração as evidências científicas mais recentes. Muitas substâncias de
uso terapêutico também estão incluídas devido aos efeitos ergogênicos. As drogas ilícitas,
como a maconha e a cocaína também fazem parte da lista de substâncias proibidas, não tanto
pelos efeitos sobre o desempenho dos atletas, mas principalmente pelo fato de irem contra o
comportamento desejável para um atleta. No entanto, a explicação para as mesmas estarem
entre as substâncias banidas é o fato de irem contra o comportamento desejável para um
atleta. Por isso quando um esportista é acusado de usar substâncias ilícitas, ele é julgado por
um regulamento que extrapola a lista oficial de substâncias proibidas no esporte
(KINDERMANN, 2004). Na atual legislação vigente, de todas as substâncias banidas pela
Agência Mundial de Controle de Dopagem (AMA, WADA) e pela Agência Nacional de
Controle de Dopagem (ANAD), 60 são classificadas como estimulantes. Além deste, há um
segundo documento, contendo uma lista de substâncias monitoradas, para as quais um
15
resultado positivo em uma análise de dopagem não implica em punição do atleta. Na lista
vigente do programa de monitoramento da AMA, há 7 substâncias estimulantes monitoradas
em competição e 39 monitorados fora da competição. (WORLD ANTI-DOPING AGENCY,
2006).
1.2.5 As análises de Controle de Dopagem
Não existe um método oficial para screening de estimulantes. O que a Agência
Mundial de Controle de Dopagem (WADA) exige é que o Limite Mínimo de Desempenho do
Método seja alcançado. Para os estimulantes esse valor é 500 ng/mL. Os métodos mais
utilizados para esse tipo de análise são o imunoensaio, a eletroforese capilar e as
cromatografias a gás e líquida, acopladas ou não a um espectrômetro de massas. Como
método confirmatório, apenas as cromatrografias a gás e líquida são aceitas e, nesse caso, a
detecção por espectrometria de massas é obrigatória (WORLD ANTI-DOPING AGENCY,
2006).
1.2.5.1 As matrizes biológicas
As matrizes mais utilizadas para detecção dos agentes dopantes são urina
(preferencial), sangue e cabelo. Nas análises toxicológicas além destas também existem as
matrizes ditas “alternativas”, que são utilizadas em casos mais específicos: mecônio
(primeiras fezes do recém-nascido) (GARERI, 2006), unha (YONAMINE, 2006), suor
(ABERL, 2005), saliva (SAMYN, 2002), conteúdo gástrico (MELO, 1992), leite materno
(STEINER, 1984), ar expirado (STATHEROPOULOS, 2006) e mais recentemente, humor
vítreo (FUCCI, 2006).
Discutiremos aqui apenas as matrizes que são utilizadas para análises de controle de
dopagem.
a) Urina
A urina é a matriz mais utilizada em análises de controle de dopagem. Sua coleta é
não-invasiva e de fácil execução. Em geral, é possível coletá-la em grandes quantidades e a
sua análise, desde o preparo da amostra, é mais fácil de ser processada quando comparada à
de outras matrizes (GAILLARD, 2000). É considerada uma matriz complexa, uma vez que é
constituída por compostos orgânicos e inorgânicos, principalmente sais. Na urina, as drogas e
os respectivos metabólitos são geralmente encontrados em concentrações relativamente altas.
16
Além disso, os analitos são bastante estáveis em caso de congelamento da amostra, o que
permite o armazenamento das amostras positivas por um período de tempo maior.
Como a maioria dos agentes dopantes, incluindo os estimulantes, utilizados pelos
atletas são metabolizados no fígado em substâncias mais polares, os mesmos são facilmente
eliminados através da urina (EWALD, 2006; SHIMA, 2006; SIPES, 1993) (Figura 10).
O processo é relativamente rápido, por isso, a urina é uma matriz que permite detectar
o uso recente de alguma substância. O tempo de excreção varia conforme a substância,
podendo ser horas (para as efedrinas), ou dias (para as metilenodioxianfetaminas) (ENSSLIN,
1996; OYLER, 2002). Em alguns casos, a concentração dos metabólitos nessa matriz pode
ser mais alta que a das substâncias não biotransformadas. Por isso, a maioria dos métodos de
screening em urina é desenvolvida para detectar tanto os metabólitos, quanto as substâncias
inalteradas (SCHEIDWEILER, 2006).
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R
NH
2
OH
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2
OH
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O
N
H
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OH
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NH
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NH
2
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Metil-anfetamiinas: metanfetamina, (pseudo)efedrina,
metilenodioximetanfetamina (MDMA)
α
desalquilação
Anfetaminas: anfetamina, nor(pseudoefedrina),
metilenodioxianfetamina (MDA)
desaminação oxidativa (N-oxidação)
hidroxilação
do carbono β
hidroxilação do anel aromático
p-hidroxianfetamina
nor(pseudo)efedrina
fenilacetona
ácido benzóico
ácido hipúrico
p-hidroxinor(pseudo)efedrina
hidroxilação do anel aromático
β
a parir dessa são
formados álcoois e
ácidos que conjugam
com o ácido glicurônico
hidroxilação
do carbono β
+
glicina
F ig u ra 10. Esquema representativo do metabolismo das anfetaminas
17
b) Sangue
Diferentemente da urina, o sangue é uma matriz de coleta invasiva. Inicialmente é
necessária a centrifugação do sangue e geralmente se utiliza o soro e o plasma como matrizes
biológicas. Os estimulantes, de um modo geral, apresentam a concentração plasmática
máxima algumas horas após o uso. Por isso, a detecção dessas substâncias, assim como de
seus respectivos metabólitos restringe-se ao uso recente da mesma (ASGHAR, 2003; OGA,
2003). Um resultado positivo em sangue no exame de controle de dopagem “em competição”
indica que o atleta competiu sob o efeito daquela substância.
c) Cabelo
O fio de cabelo também é uma matriz de coleta não invasiva que tem despertado muito
interesse nessa área. A raiz do fio é formada pelo bulbo, que por sua vez é revestido pelo
folículo capilar, o qual está em contato com uma densa rede de vasos capilares. Esses vasos
sangüíneos têm a função de regular a temperatura corpórea e nutrir o folículo. É por meio
desse contato que as substâncias utilizadas pelo indivíduo, assim como os metabólitos, são
transportadas da circulação sangüínea para o folículo, sendo incorporadas então na matriz de
queratina (RIVIER, 2000). O crescimento médio mensal do fio de cabelo é 1 cm. Isso
significa que quanto mais distante do bulbo é encontrada a substância, mais antigo é o uso da
mesma. Dessa forma, pode-se dizer que o cabelo é a matriz é a mais adequada para consumo
freqüente e em longo prazo de alguns agentes dopantes, sobretudo nas análises “fora-de-
competição” (THIEME, 2000).
1.2.5.2 Os métodos de screening
Em uma análise toxicológica (incluindo a análise de controle de dopagem), em geral, o
analista tem que pesquisar, em uma mesma amostra, a presença ou ausência de substâncias de
naturezas diferentes. Inicialmente, faz-se uma triagem sem fins quantitativos apenas para
tentar separar as amostras, conforme as substâncias encontradas inicialmente. A essa triagem
dá-se o nome de “screening sistemático” (MAURER, 1992; LINDEN, 2006).
Métodos de screening são ferramentas analíticas que fornecem respostas do tipo “sim
ou não”. Essas respostas indicam se o analito pesquisado está presente (ou não) e se a sua
concentração é superior ou inferior a um valor de referência pré-determinado (cut-off)
(VALCÁRCEL, 1999).
Um método de screening ideal deve ser rápido, com elevada especificidade, boa
18
sensibilidade e reprodutibilidade, tecnicamente de fácil operação, com baixo custo. Na prática
é muito difícil encontrar uma técnica analítica que atenda a todos esses requisitos. Por isso,
todo método de screening deve estar associado a um método confirmatório (ANDERSON,
2005). O método confirmatório deve ser quantitativo, apresentar alta especificidade e boa
sensibilidade. Como a análise confirmatória requer mais precisão e exatidão, os métodos
utilizados para essa finalidade apresentam maior custo, muitas vezes requerem tratamento
prévio da amostra, demandam um tempo maior para uma análise e nem sempre são de fácil
operação (LOWE, 2006).
A alta sensibilidade é fundamental no método de screening para que sejam evitados
possíveis resultados falso-negativos. Em uma análise de controle de dopagem, tais resultados
são falhas muito graves, uma vez que atletas que usaram alguma substância proibida ficariam
impunes. Por outro lado, uma alta sensibilidade associada a uma baixa especificidade poderia
levar a resultados falso-positivos, embora essa não seja uma falha tão grave quanto a primeira.
Isso porque a amostra passaria pela análise confirmatória que esclareceria o resultado obtido.
No caso de um resultado falso-negativo, a amostra, seguramente, seria descartada após a
triagem inicial (RIVIER, 2000).
As técnicas mais utilizadas nos métodos de screening para detecção de agentes
dopantes são imunoensaios (NIHO, 2003), cromatografia em camada delgada (CCD)
(BECKETT, 1967; MACHATA, 1977), cromatografia a gás (CG) (VIAU, 1990),
cromatografia líquida (CL) (BASKIN, 1997) e eletroforese capilar (EC) (HUDSON, 1999).
Esses últimos podem ser utilizados de forma independentes ou hifenados com outras técnicas,
dentre as quais se destaca a espectrometria de massas (EM) (BOATTO, 2005; STRANO-
ROSSI, 2005). Mais recentemente, alguns métodos têm sido desenvolvidos utilizando a
espectrometria de massas como técnica isolada (SU, 2005).
a) Imunoensaio
Os métodos baseados em imunoensaio são os mais utilizados para screening. No
esporte, foram utilizados como métodos oficiais de triagem nos Jogos Olímpicos de Los
Angeles (CATLIN, 1987). Baseiam-se em interações do tipo antígeno - anticorpo. Nesses
ensaios, o analito compete com outra substância análoga a ele (marcador) pela interação com
o anticorpo (Figura 11). Esses marcadores são o que caracteriza cada técnica de imunoensaio.
Quando o marcador é um isótopo radioativo, fala-se em radioimunoensaio (WARD, 1994;
KUNSMAN, 1996). Quando apresenta fluorescência, fala-se em imunoensaio com
19
polarização fluorescente (FPIA).
Algumas vezes, o marcador é um complexo conjugado de uma enzima com um
hapteno (Figura 12) (MAGGIO, 1988)e se trata da técnica de imunoensaio por multiplicação
de enzima (EMIT) (BOLAND, 2005) ou ao ensaio de imunosorção por ligação enzimática
(ELISA) (KUPIEC, 2002). Além desses, mais recentemente foram desenvolvidos os
imunoensaios baseados em doação de enzima clonada (CEDIA) (LOOR, 2002) e em interação
cinética de micropartículas em solução (KIMS). Os mais utilizados para screening de
estimulantes, em especial anfetaminas, são os imunoensaios EMIT e FPIA e, em geral,
apresentam boa sensibilidade.
Além de apresentarem boa sensibilidade (HINO, 2003), esses métodos dispensam uma
etapa preliminar de extração da amostra, são geralmente semi-quantitativos e permitem
analisar simultaneamente um grande número de amostras e/ou diferentes analitos (KYLE,
2003; STOUT, 2004). Embora os reagentes utilizados têm um custo elevado, o maior ponto
negativo está relacionado a um dos critérios mais importantes para a escolha do método de
screening. A especificidade varia conforme a técnica e o método apresenta falhas
a)
b)
Ant ico rpo
Enzima ligada ao hapteno (análogo à droga)
Substrato da enzima
Droga
Reação enzima-substrato
Produto
F ig u ra 11. Esquema do EMIT
Na ausência da droga (1), o complexo enzima-hapteno liga-se ao anticorpo que produz alterações no mesmo. Com isso, o
complexo não consegue se ligar ao substrato. Na presença da droga (2), essa liga-s e pref en cia lm ent e a o an ti corp o. O
complexo livre permanece na forma inalterada, sendo, portanto, capaz de interagir com o substrato. Quando isso acontece,
forma-se um produto que absorve energia na região do ultravioleta.
a)
NH
OH
O
b)
N
O
O
O
F ig u ra 12. Conjugados utilizados em imunoensaios para anfetaminas em urina.
A N-carboximetilanfetamina (a) é acoplada à lisoenzima e à glicose 6-fosfato-desigrogenasepor meio do anidrido de Leuch
(b), formado a partir do aminoácido, por tratamento com a fosfogenase (MAGGIO, 1988).
20
(VERSTRAETE, 2005; SCHWETTMANN, 2006). Pelo fato de trabalharem com anticorpos
específicos para um determinado tipo de substância, com um método de imunoensaio é
possível separar os analitos em classe, o que significaria boa especificidade. Por outro lado,
dentro de uma mesma classe (por exemplo, a das anfetaminas), há muitas substâncias que
apresentam estruturas químicas com extrema similaridade (Figura 13).
Muitas delas interagem com o anticorpo da mesma forma e, muitas vezes, com a
mesma intensidade (reações cruzadas) (MURA, 1998; STOUT, 2004; WOODWORTH, 2006).
Conseqüentemente, a quantidade de resultados falso-positivos aumenta, caracterizando o
método como pouco específico. Por isso, quando o imunoensaio é utilizado para screening, a
confirmação é fundamental.
b) Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A cromatografia em camada delgada é uma técnica muito utilizada para screening
sistemático (LINDEN, 2006). Para as análises de controle de dopagem ela foi muito utilizada
nas décadas de 60 e 70 (BECKETT, 1967; MACHATA, 1977).
A cromatografia em camada delgada atende a alguns requisitos para um método de
screening: baixo custo, simplicidade de operação, rapidez na análise (SCHUETZ, 1994).
Entretanto, algumas substâncias endógenas interagem fortemente com a sílica, levando à
formação de manchas na superfície e conseqüentemente dificultando a interpretação dos
resultados da análise. Alem disso, alguns compostos, como a cocaína, podem migrar muitas
vezes de forma inadequada, resultando em interpretações equivocadas (falso-positivo ou
falso-negativo) (KELLY, 1988).
c) Cromatografia a Gás de Alta Resolução (CGAR)
A cromatografia a gás começou a ser utilizada em métodos de screening para
NH
2
NH
NH
2
OH
NH
2
OH
NH
OH
NH
2
OH
O
O
NH
O
O
NH
2
anfetamina
metanfetamina
norefedrina
norpseudoefedrina
(catina)
efedrina
pseudoefedrina
metilenodioxianfetamina
(MDA)
metilenodioximetanfetamina
(MDMA)
F ig u ra 13. Estruturas químicas de algumas anfetaminas
21
estimulantes nos anos 40 e 50 (VIAU, 1990). A cromatografia a gás de alta resolução (CGAR)
é, atualmente, uma das técnicas mais sensíveis para detecção de substâncias em fluidos
biológicos (HIDVEGI, 2006). Entretanto, para ser analisado por CGAR, o composto tem que
ser volátil e termicamente estável. Como a grande maioria dos agentes dopantes e seus
metabólitos são compostos polares, a etapa de extração é essencial no screening por CG. A
derivatização, embora não seja imprescindível (CHIA, 1987; PELLEGRINI, 2002; SONG,
2004), é muito utilizada para aumentar a estabilidade do analito (KANKAANPAEAE, 2004).
A sensibilidade e a seletividade do método estão diretamente relacionadas ao detector
utilizado. O mais simples e mais antigo é o detector de ionização por chama (CGAR-DIC),
também chamado detector “universal”, pelo fato de conseguir ionizar compostos com as mais
diferentes estruturas químicas (JAIN, 1975; BURROWS, 2004). Ainda assim é uma técnica
com boa sensibilidade (TSUCHIHASHI, 1990). Quando são utilizados detectores mais
seletivos, como o de captura de elétrons (CGAR-DEC) (SCHWETTMANN, 2006) ou o de
nitrogênio e fósforo (CGAR-DNP) (SORIANO, 2001), a sensibilidade do método aumenta,
tornando-o mais confiável. Em todos esses casos, a identificação dos constituintes da amostra
é feita por comparação com um cromatograma de uma solução padrão daquele analito. De
todos os detectores, o que aumenta consideravelmente a sensibilidade e a seletividade da
técnica de CGAR é o espectrômetro de massas (CGAR-EM). Com o uso da espectrometria de
massas como método de detecção, a identificação dos constituintes da amostra passa a ser
feita a partir da interpretação do espectro de massas, dispensando assim a análise preliminar
de soluções padrões (BATTU, 1998; GENTILI, 2004).
Ainda que sejam sensíveis e seletivas, as técnicas de CGAR não são as mais indicadas
para métodos de screening de estimulantes, pois consomem bastante tempo no preparo e
análise da amostra, além de terem um custo relativamente alto, devido aos reagentes
utilizados em tais etapas (ISHIDA, 2006).
d) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A CLAE começou a ser utilizada para screening de estimulantes no final da década de
70 (TRINLER, 1976). Foi desenvolvida para separar substâncias não-voláteis, tornando
possível a análise de substâncias muito polares e termicamente instáveis (MAURER, 2005;
MUELLER, 2005). Com isso, a derivatização deixa de ser uma etapa fundamental, passando a
ser um recurso a mais no sentido de melhorar a sensibilidade e a seletividade do método (DI
PIETRA, 2001). Dessa forma, a preparação das amostras torna-se muito mais simples (SLAIS,
22
1987; SCHWETNER, 2005).
Assim como na cromatografia a gás, a sensibilidade e a especificidade de um método
de screening baseado em CLAE estão relacionadas ao tipo de detecção utilizado. Muitos
equipamentos utilizam um detector de ultravioleta (HPLC-UV). Esse é considerado um
detector universal, porém é pouco sensível, uma vez que várias substâncias absorvem energia
com um mesmo comprimento de onda (BURROWS, 2005). O detector de arranjo de diodos
(HPL C-DAD) permite a obtenção de um espectro completo de absorbância para o analito
(LAI, 1997). Com esse tipo de detector, a sensibilidade do equipamento aumenta
consideravelmente (SAARINEN, 1995). Outro detector utilizado é o de quimioluminescência
(HPL C-CL). Por ser mais seletivo, o número de substâncias que se consegue detectar
simultaneamente é limitado. No entanto, a sua sensibilidade é muito maior e em alguns casos
consegue superar um CG-EM (TAKAYAMA, 1997). Assim como na cromatografia a gás, um
dos detectores que permitem maior sensibilidade e seletividade para análises toxicológicas e
de controle de dopagem é o Espectrômetro de Massas (HPLC-MS) (STANLEY, 2006).
Quando esta técnica é utilizada, o uso de padrões de referência torna-se muitas vezes
desnecessário, uma vez que existem bancos de dados de espectros de massa correspondentes
às substâncias analisadas (DRESEN, 2006). Quando estes não existem, por meio de uma
análise de massas seqüencial é possível obter o espectro de fragmentação do íon molecular do
composto separado pela cromatografia e a partir dele chegar à estrutura química do composto
(DEVENTER, 2006).
Embora a CLAE seja uma técnica muito sensível (SAVOCA, 2004), ela ainda
apresenta um custo elevado (SKELTON, 1998; BELSON, 1999), nem todos os equipamentos
são de fácil operação e o tempo de análise é relativamente longo (SKELTON, 1998;
DEVENTER, 2006).
e) Eletroforese Capilar
Na década de 90, a eletroforese capilar despontou como uma ferramenta promissora,
efetiva e econômica para a separação de uma gama de diferentes compostos de interesse
toxicológico, incluindo os agentes dopantes (HUDSON, 1995; HYOETYLAEINEN, 1996).
Assim como CGAR e CLAE, a sensibilidade e a seletividade da EC varia conforme o detector.
Os dois mais utilizados são arranjo de diodos (EC-DAD) (LURIE, 2004) e espectrometria de
massas (EC-EM) (TSAI, 2000). Embora não apresente uma seletividade tão alta como as
técnicas cromatográficas, a EC apresenta outras vantagens que a tornam uma técnica
23
adequada para screening de estimulantes: preparação mínima da amostra (BOATTO, 2005),
baixa interferência de matriz (NIEDDU, 2005), baixo custo das colunas capilares, consumo
reduzido de solventes (LURIE, 2001), simples operação e rapidez nas análises (DAHLEN,
2006).
f) Espectrometria de Massas
A espectrometria de massas (EM) é uma técnica analítica que há pouco tempo
começou a ser utilizada em métodos de screening para estimulantes (BAKHTIAR, 1999). As
grandes vantagens da EM relação às outras técnicas, inclusive à CLAE-EM estão relacionadas
ao preparo de amostra e o tempo de análise. Lua e Lin (LUA, 2004) desenvolveram um
método rápido e simples para screening de quetamina e norquetamina (Figura 14) em
amostras de urina utilizando espectrometria de massas com fonte de ionização eletrospray
(ESI). Após adicionar o padrão interno, a preparação constituiu-se apenas de uma extração em
hexano com posterior injeção no espectrômetro de massas. O tempo médio gasto em cada
análise foi de aproximadamente 1 minuto. A sensibilidade e a especificidade do método foram
97,1 e 85, 7% respectivamente.
a)
NH
Cl
O
b)
NH
2
Cl
O
F ig u ra 14. Estruturas químicas da quetamina (a) e norquetamina (b)
Como as amostras biológicas mais utilizadas para screening em controle de dopagem
estão em fase líquida, as fontes mais utilizadas nos espectrômetros de massas são o
eletrospray (ESI) (THEVIS, 2005) e a ionização química à pressão atmosférica (APCI)
(NORDGREN, 2003). Entretanto, outras formas de ionização são utilizadas em caso de matriz
sólida com o objetivo de eliminar a extração da amostra. Su e colaboradores (SU, 2005)
desenvolveram um método de screening para estimulantes presentes em cápsulas
comercializadas no mercado negro, utilizando dessorção em matriz assistida por laser
(MAL DI). Recentemente, Leuthold e colaboradores (LEUTHOLD, 2006) desenvolveram um
método de screening para estimulantes presentes em cápsulas baseada em dessorção por
eletrospray (DESI). Em relação à MALDI, essa última é ainda mais vantajosa, por ser uma
técnica não destrutiva.
Os métodos de screening podem ser baseados em espectrometria de massas simples
24
(MS) ou seqüencial (MSn). Nessa última, os íons de interesse são isolados e, em seguida,
fragmentados. Com isso, cria-se uma “impressão digital” do analito pesquisado. Para se obter
espectros de massa seqüenciais são utilizados os sistemas Tandem, os quais são formados por
dois diferentes analisadores (EICHHORST, 2004) ou um analisador de massas do tipo ion
trap (BALDACCI, 2003). Esse último é um dos poucos analisadores que fazem tanto o
isolamento quanto a fragmentação do íon (KOELLIKER, 2004). O mesmo será descrito
posteriormente em maiores detalhes.
Como a espectrometria de massas é uma técnica relativamente recente, os
equipamentos ainda apresentam um custo bastante elevado (Tabela 1), o que muitas vezes
restringe as suas utilizações.
Tabela 1. Faixa de preços dos espectrômetros mais utilizados
Faixa de preço
(em US$)
Quadrupolo
Ion Trap
MS/MS
MSn
45.000 – 100.000
(triplo quadrupolo)
200.000 –
500.000
200.000 –
900.000
300.000 –
900.000
(fonte: HUESTIS, 2006)
- Espectrometria de Massas com fonte de Ionização Eletrospray
Para que seja analisado por EM, o analito tem que estar ionizado. Na espectrometria
de massas clássica, a ionização ocorre a pressões muito baixas, o que é possível apenas em
fase gasosa, restringindo assim a técnica à análise de moléculas voláteis. Para moléculas não
voláteis, são necessários procedimentos quer possam conferir-lhe tal propriedade (GUNNAR,
2005). Um grande avanço apresentado em relação a essa técnica analítica ocorreu com a
introdução de novas formas de ionização nas quais o analito é ionizado à pressão atmosférica,
o que permitiu a utilização de amostras em fase líquida (soluções). Uma dessas novas formas
de ionização muito utilizada atualmente é Ionização Eletrospray (ESI). Em um espectrômetro
que utiliza fonte ESI, os íons são formados por adsorção ou dessorção de prótons (íons
positivos ou negativos respectivamente). Para favorecer a protonação (ou a desprotonação)
dos analitos, um pequeno volume de um ácido ou uma base fraca é geralmente adicionado à
solução da amostra.
A Figura 15 esquematiza a formação do eletrospray. A amostra é introduzida em um
capilar em um fluxo muito baixo (geralmente 1 - 20μL/min). Entre o capilar e a lente
focalizadora, aplica-se uma diferença de potencial de aproximadamente 3 – 6kV, gerando um
campo elétrico muito forte. Devido à presença desse campo, as gotas formadas na saída do
capilar apresentam excesso de carga (positiva ou negativa) na superfície.
25
F ig u ra 15. Esquema representando a formação do eletrospray (adaptado de DE HOFFMANN, 2002)
Um gás inerte (N
2
) é injetado, em vazão alta, coaxialmente ao capilar e tem como
finalidade reduzir o volume das gotas formadas, por meio da evaporação do solvente. Com o
volume reduzido, a força de repulsão entre íons de mesma carga aumenta substancialmente e,
as gotículas, que tinham um formato esférico inicial, começa a afunilar, formando o “Cone de
Taylor”. Quando isso acontece, devido à alta repulsão entre partículas de mesma carga, os
íons são expelidos da gotícula para a fase gasosa, formando assim o eletrospray. Após passar
pela lente focalizadora, o spray atravessa uma região aquecida, que tem como finalidade
remover as últimas moléculas de solventes que interagem com o íon. Em alguns
equipamentos, essa região consiste em uma “cortina” de um gás inerte (geralmente N
2
ou Ar)
aquecido. Em outros, trata-se de um capilar aquecido (DE HOFFMANN, 2002). Em seguida,
os íons chegam ao analisador de massas. Até aqui todo o processo acontece à pressão
atmosférica. Entretanto, para que não ocorram interações entre os íons durante a análise, os
analisadores de massa operam em pressões muito baixas. Para conduzir os íons durante a
transição da pressão atmosférica para baixa pressão, uma lente focalizadora com abertura
muito pequena, chamada skimmer, é colocada na interface. Além disso, uma bomba de vácuo
controla a baixa pressão no analisador (Figura 16).
26
Uma vez formados, os íons são separados conforme a sua relação massa/carga e a
forma como ocorre a separação varia conforme o analisador de massas utilizado.
Equipamentos com fonte de ionização ESI são geralmente construídos com analisadores de
massa do tipo tempo-de-vôo (TOF), triplo-quadrupolo, armadilha de íons (ion trap), ou ainda
com uma combinação de dois ou mais desses analisadores (Espectrometria Sequencial ou
Tandem) que podem ser iguais (KRONSTRAND, 2004) ou diferentes (JOYCE, 2004). A
espectrometria de massas seqüencial é muito utilizada em estudos de elucidação de estrutura
química e/ou de mecanismo de reação (SPRINGER, 2003).
Em um espectrômetro de massas com um analisador do tipo ion trap, os íons formados
no eletrospray são focalizados pelo skimmer e por dois octopolos, enquanto uma bomba de
vácuo garante a manutenção da baixa pressão no analisador. Uma lente regulável (lente
“reguladora”) controla a quantidade de íons que entra no trap dentro de um intervalo ótimo de
tempo. O excesso de íons pode levar à perda de resolução, enquanto a escassez pode levar à
perda de sensibilidade (Figura 17).
a)
b)
F ig u ra 16. Fontes de ionização do tipo eletrospray.
Em ambas, a focalização dos íons é feita utilizando o skimmer, entretanto, a dessolvatação das gotículas pode ocorrer com o
auxílio de um fluxo de N
2
aquecido (a) ou com um capilar aquecido (b) (adaptado de DE HOFFMANN, 2002)
27
F ig u ra 17. Esquema representativo de um espectrômetro de massas com fonte de ionização
eletrospray e analisador ion trap (adaptado de DE HOFFMANN, 2002)
Quando a finalidade é analisar íons positivos, durante a entrada desses no trap, uma
diferença negativa de potencial de radiofreqüência é aplicada nos eletrodos que formam a
câmara, em um intervalo fixo de tempo (Figura 18). Assim, os íons positivos ficam “presos”
na câmara, enquanto os negativos e eventuais moléculas neutras são eliminados. Quando a
câmara está repleta de íons positivos, uma diferença de potencial de radiofreqüência positiva é
aplicada nos eletrodos. Como esse potencial tem freqüência constante e amplitude variável, os
íons ficam “presos” ao plano xy, movimentando-se apenas ao longo do eixo z. Portanto, uma
pequena variação na amplitude e conseqüentemente no potencial faz com que íons com uma
determinada razão m/z sejam eliminados da câmara, capturados pelo “contador de íons” e
registrados no espectro (DE HOFFMANN, 2002). O mesmo acontece quando a análise é feita
com íons negativos. Porém com uma diferença de potencial aplicada inversamente.
Por meio de pequenas variações na diferença de potencial, é possível detectar (ou
varrer) diferentes razões massa/carga (m/z) e com isso, obter o espectro de varredura
completa (full scan) para um determinado analito. Como dito anteriormente, na ionização ESI,
os íons positivos são formados pela adsorção de prótons na molécula do analito. Para
moléculas pequenas como as anfetaminas, apenas um próton é adsorvido para cada molécula
(analito monoprotonado).
28
Como a ESI é considerada uma forma branda de ionização, geralmente observa-se um
sinal no espectro de massas correspondente à massa molecular do composto (Figura 19a).
Entretanto o íon que deu origem a esse sinal corresponde à molécula protonada, por isso ele
recebe o nome de íon quasi-molecular. O íon quasi-molecular é representado como [MH]
+
e a
razão m/z associada a ele corresponde à soma da massa de uma molécula do analito com a
massa de um próton. Mesmo a ESI sendo uma técnica de ionização suave, algumas vezes é
possível observar sinais correspondentes a íons-fragmento em um espectro de massas de
varredura completa, principalmente quando os analitos são moléculas pequenas (Figura 19b).
Juntamente com os íons provenientes da fonte de ionização, há também um fluxo contínuo de
gás inerte (He ou N
2
) entrando no trap. Como os íons contêm certa energia interna, essa pode
ser alta o suficiente para que, nas colisões com as moléculas do gás, íons-fragmento sejam
gerados.
F ig u ra 18. Esquema representativo de um analisador ion trap (adaptado de DE HOFFMANN, 2002)
a)
b)
F ig u ra 19. Espectro de varredura completa de amostras de urina contendo a) anfetamina e b) efedrina.
O íon quasi-molecular está indicado para cada uma.
29
Utilizando-se um único analisador ion trap é possível fazer análise seqüencial
(MS/MS ou MS
2
) (FUH, 2006). Esse tipo de análise pode ser feito em diferentes modos
(Figura 20) e o mais comum (Figura 20a) está descrito a seguir.
Uma diferença de potencial é aplicada nos eletrodos de forma a reter na câmara apenas
os íons de uma determinada razão m/z, eliminando todos os demais do espectrômetro.
Aumenta-se ligeiramente o potencial aplicado aos eletrodos o suficiente para aumentar a
energia cinética dos íons, sem que isso faça com que os mesmos sejam expelidos do trap. A
energia cinética é convertida em energia interna e, devido a colisões aleatórias com moléculas
de He, os íons são fragmentados em outros de menor razão m/z. O potencial aplicado aos
eletrodos é agora variado para que esses fragmentos sejam eliminados da câmara conforme as
razões m/z, sendo em seguida capturados pelo “contador” de íons e registrados no espectro.
Um outro modo bastante utilizado também recebe o nome de “múltiplas reações
monitoradas” (MRM) (Figura 20d). A diferença deste para o modo anterior está na detecção
dos íons-fragmentos. Enquanto no primeiro, todos os fragmentos gerados são capturados e
registrados, no MRM, apenas os fragmentos de interesse (geralmente duas ou três razões m/z
distintas) são capturados pelo “contador” e registrados no espectro. Isso é possível ajustando-
se a diferença de potencial aplicada aos eletrodos após as colisões de forma que os fragmentos
de interesse fiquem retidos no trap enquanto os outros sejam eliminados do espectrômetro.
Com um analisador do tipo ion trap, é possível obter espectros de massa seqüenciais
de ordem superior a 2 (MS/MS ou MS
2
), como o ilustrado na Figura 21 (SHPAK, 2005).
Nesse caso, após a primeira fragmentação, uma nova diferença de potencial é aplicada nos
eletrodos, de modo que apenas o íon-fragmento de interesse fique retido no trap e todos os
demais sejam eliminados. Esse íon é novamente fragmentado e os íons gerados são
capturados pelo “contador” de íons e registrados no espectro. O número de fragmentações
utilizadas, acrescido de uma unidade (que corresponde à análise inicial), determina a ordem
da análise seqüencial:
- fragmentações MS/MS/MS ou MS
3
,
- fragmentações MS/MS/MS/MS ou MS
4
,
- fragmentações MS/MS/MS/MS/MS ou MS
5
, ...
Para um método de screening, a espectrometria de massas seqüencial pode ser
bastante útil, principalmente se for utilizada em modo de múltiplas reações monitoradas
(MRM). Por meio de uma análise do tipo MS/MS, monitora-se os principais fragmentos
gerados (geralmente 2 ou 3 íons) para um determinado analito e, conforme o resultado obtido,
30
Figura 21. Análise de efedrina usando Espectrometria de Massas Seqüencial de 3ª ordem
a)
b)
c)
d
d)
Figura 20. Representação esquemática dos diferentes modos de análise sequencial.
Em (a), uma razão m/z é mantida fixa. Essa é fragmentada e faz-se a varredura completa dos íons gerados. Em (b), uma razão
m/z correspondente a um fragmento é fixada. Faz-se a varredura completa no primeiro analisador, mas somente os íons
precursores da razão m/z selecionada no segundo analisador são identificados. Em (c), ambos analisadores operam em modo de
varredura completa, porém com uma diferença de m/z entre as faixas de massas analisadas. Somente serão reconhecidos pelo
segundo analisador os íons que, na fragmentação, apresentarem uma perda em massa igual à diferença pré-estabelecida. Essa
diferença corresponde a um fragmento neutro. Finalmente, em (d), tanto as razões m/z dos íons precursores quanto as dos íons-
fragmentos são fixadas. Apenas os sinais correspondentes às mesmas são detectados. (adaptado de HUESTIS, 2006)
31
é possível afirmar a presença ou ausência do mesmo na amostra. Para exemplificar, considere-
se a detecção de anfetamina em urina, que é muito comum em exames de controle de
dopagem. No espectro de massas de uma amostra “limpa” de urina, ou seja, sem a presença de
anfetaminas, há uma razão m/z igual a 136 (Figura 22a). No entanto, esse é o mesmo valor da
razão m/z atribuído ao íon quasi-molecular da anfetamina ([MH]
+
) (Figura 22b). Na prática
esportiva, a anfetamina é uma substância proibida. Se a análise fosse feita apenas em modo de
varredura completa, haveria uma grande probabilidade de um resultado falso-positivo, se o
atleta não tivesse utilizado anfetamina ou algum de seus muitos derivados.
1.2.5.3 Os métodos confirmatórios
Os métodos confirmatórios são métodos quantitativos de análise. Como o objetivo
principal é confirmar o resultado obtido com o método de screening, alta sensibilidade e alta
especificidade são fundamentais. Por outro lado, a rapidez e o baixo custo da análise deixam
de ser requisitos para a escolha da técnica. Atualmente, a maioria dos métodos confirmatórios
é baseada em cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas.
a)
(b)
Figura 22. Espectro MS/MS para detecção de anfetamina em urina.
Em (a) tem-se uma amostra negativa para anfetamina. Em (b) a amostra é positiva. Em uma análise em MRM, os íons
monitorados para a anfetamina correspondem à m/z 91 e m/z 119
32
Em 2003, Tseng e colaboradores (TSENG, 2003) utilizaram um método de screening baseado
em cromatografia a gás com detector de N/P para estudar a origem de efedrinas utilizadas por
atletas taiwaneses em competições nacionais. Os autores selecionaram 91 medicamentos para
resfriado encontrados no mercado negro. Analisaram também 1803 amostras de urinas de
atletas coletadas em competições entre os anos de 1999 e 2001. Após a triagem por CG-DNP,
as amostras foram submetidas à confirmação por CG-EM. A análise confirmatória mostrou
que 80% dos medicamentos apresentaram em sua composição ao menos uma das efedrinas
banidas no esporte. Enquanto as análises de CG mostravam que a metilefedrina era a efedrina
mais comumente encontrada (52%), as análises de CG-EM apontaram a efedrina como tal
(35,4%). Nas análises realizadas nas amostras de urina, aproximadamente 2,8% apresentaram
resultados positivos para efedrinas, mas somente 1,8% desses casos foram considerados sob
dopagem, uma vez que ultrapassaram o valor máximo permitido (5 μg/mL). Desses últimos,
44% foram por uso de pseudoefedrina, 28% por uso de efedrina, 17% por uso de
fenilpropanolamina e apenas 11% por metilefedrina.
Como dito anteriormente, a técnica de CG-EM é limitada a análises de substâncias
voláteis e termicamente estáveis. Essa técnica será descrita brevemente com maiores detalhes.
Para ampliar a sua aplicabilidade e melhorar a sensibilidade, durante o preparo da amostra,
duas etapas são fundamentais:
a) extração
A extração líquido-líquido (ELL) é a mais antiga forma de extrair substâncias
orgânicas de matrizes biológicas (HUWYLER, 1990; CARABIAS-MARTINEZ, 2005).
Como utiliza reagentes de grau analítico, seu custo é relativamente baixo, mas a quantidade
de resíduos gerados é grande. Além disso, envolve várias etapas, principalmente de filtração,
o que pode levar à perda de analito e conseqüentemente, baixo índice de recuperação
(TAKESHI, 2007).
A microextração em fase sólida (MFES) é uma técnica de extração mais recentemente
desenvolvida. Assim como a EFS, a MEFS também pode ser utilizada para pré-concentração
(CITOVA, 2006). Além disso, é a única técnica que dispensa completamente o uso de
solventes durante o processo (BALAKRISHNAN, 2006), diminuindo significativamente a
quantidade de rejeitos gerados. Com isso, o efeito de matriz torna-se bastante reduzido,
aumentando a sensibilidade e o índice de recuperação do método utilizado (JURADO, 2000).
São ideais para análises em concentrações muito baixas, porém o condicionamento das fibras
33
de MEFS consome um tempo razoável (no mínimo 30 minutos) e requer condições drásticas
de temperatura (SUPELCO, 2006).
- Extração em fase sólida (EFS)
A extração em fase sólida (EFS) que tem como base os princípios da Cromatografia
Líquida Clássica (de baixa pressão). Os dispositivos utilizados para a extração são cartuchos
ou discos contendo uma fase sólida, semelhante à fase estacionária da cromatografia. O
processo é rápido e a amostra é manipulada apenas uma vez. Em todas as etapas, o líquido é
aspirado através da fase sólida por meio de pequeno vácuo (Figura 23). Inicialmente faz-se o
condicionamento da fase, com um solvente, como se fizesse ambiente. Em seguida, adiciona-
se a amostra e, à medida que passa por essa, os analitos interagem com a fase sólida, ficando
retidos. Lava-se então fase para retirar algum resíduo. Após a completa drenagem do líquido,
os analitos que ficaram retidos são eluídos com um pequeno volume de solvente e o eluato já
pode ser analisado imediatamente (LANÇAS, 2004).
Figura 23. Representação esquemática de uma extração em fase sólida
A extração em fase sólida (EFS) é uma boa opção como técnica de extração,
principalmente no que diz respeito ao tempo. Enquanto uma ELL pode levar horas, uma EFS
dura apenas alguns minutos (HUANG, 2003), além de envolver apenas algumas etapas
(TAYLOR, 1989). Os métodos que a utilizam apresentam um índice de recuperação em torno
de 80 a 90% (BUDZINSKI, 2006). O condicionamento, ou pré-tratamento, da fase
estacionária (cartucho ou disco) é rápido e simples, porém as mesmas apresentam um custo
relativamente alto.
34
b) derivatização
A derivatização é um recurso muito utilizado quando se deseja analisar compostos
polares e/ou termicamente instáveis (WILLE, 2004). Também é utilizada quando se deseja
aumentar a detectabilidade de um composto, a fim de obter um espectro de massas com maior
abundância de íons e presença de íons diagnósticos. Um exemplo é apresentado na Figura 24.
a)
b)
F ig u ra 24. Espectros de massas da anfetamina não derivatizada (a) e acetilada (b)
No caso específico de análises de anfetaminas por CG-EM, a derivatização torna-se
obrigatória quando os analitos são efedrinas. Segundo estudos recentemente descritos na
literatura (WILLE, 2004), a efedrina não-derivatizada (Figura 25a), na temperatura em que o
injetor trabalha (geralmente entre 230 e 250ºC) sofre uma reação de ciclização, gerando um
produto cíclico (artefato, Figura 25b). Os bancos de dados de espectros de massas reconhecem
este como sendo fenmetrazina (Figura 25c). Na dopagem esportiva, isso é uma falha grave,
uma vez que a fenmetrazina também é um estimulante que consta na lista das substâncias
banidas do esporte. A efedrina somente é considerada um agente dopante se a sua
concentração na matriz tiver um valor superior a 5 µg/mL (WORLD ANTI-DOPING
AGENCY, 2006).
Para que a derivatização seja eficiente, os reagentes utilizados devem atender a alguns
critérios: (i) um único derivado deve ser formado para cada analito; (ii) as reações de
derivatização devem ser simples, rápidas e feitas em condições brandas; (iii) devem ser
quantitativas (um rendimento alto e reprodutivo) e (iv) os produtos devem termica e
quimicamente estáveis (BLAU, 1993).
As principais reações de derivatização são (i) sililação, (ii) acilação, (iii) alquilação,
(iv) formação de derivados cíclicos e (v) derivatização quiral.
35
A sililação, em especial a (tri)metilsililação, é o procedimento de derivatização mais
utilizado (DUMASIA, 2003). Isso se deve ao alto poder de sililação e alta volatilidade desses
compostos e os derivados formados, além dessa última característica e da facilidade no
preparo, também são química e termicamente estáveis (SEGURA, 1998). Como os reagentes
derivatizantes e os respectivos produtos são sensíveis à umidade, as reações devem ser
conduzidas sob condições anidras. Além disso, a adição de um catalisador aumenta o poder
sililante dos reagentes em relação a uma derivatização de funções com impedimento
esteroquímico (PIRNAY, 2004).
A acilação pode ser obtida usando principalmente haletos de acila (FRISON, 2005) ou
anidridos de ácidos (STAERK, 2000). Os primeiros são os mais reativos, porém, como
durante a reação forma-se um ácido halogenado (HCl, HF ou HBr), é necessária a presença de
um receptor de prótons para neutralizá-lo. Também é importante que se elimine o excesso
desse reagente antes da injeção no cromatógrafo, visto que os haletos podem reagir com a
sílica, danificando a coluna cromatográfica. Os anidridos de ácido, muitas vezes em presença
de um receptor de prótons (piridina), podem ser uma boa opção, pois tais reagentes são
a)
b)
c)
Figura 25. Espectros de massas da efedrina (a), artefato (b) e fenmetrazina (c)
36
facilmente removidos do meio e, caso os mesmos sejam injetados no cromatógrafo, isso não
danificaria a coluna cromatográfica. Entre os derivatizantes acilados, os haloalquilacilados
merecem destaque, por aumentarem a afinidade eletrônica dos derivados, levando a análises
ainda mais sensíveis, principalmente se a ionização por elétrons (IE) for substituída pela
ionização química em modo negativo (IQN) (MARTINS, 2006).
A alquilação, em especial a metilação, é interessante nas análises por CG-EM porque
leva por um lado, a um pequeno acréscimo na massa molecular e por outro, a um significativo
aumento na volatilidade dos derivados (RANZ, 2006), principalmente quando os compostos
apresentam mais de um tipo de função.
Para compostos com mais de uma função, a formação de derivados cíclicos é uma boa
opção. Derivatizantes específicos podem ser utilizados para reagir com dois sítios ativos
simultaneamente. Para que essa reação aconteça, a distância entre os grupos deve ser tal que o
anel formado apresente alta estabilidade (EL-HAJ, 2003).
A maioria dos agentes tóxicos (incluindo os dopantes) contém centros quirais em sua
estrutura química e, portanto apresentam mais de um isômero para um mesmo composto. São
os isômeros que determinam a ação destes agentes no organismo. Tratando-se de substâncias
estimulantes, em alguns casos, apenas um dos enantiômeros apresenta tal efeito no organismo.
Em outros, um dos enantiômeros é utilizado em formulações terapêuticas, enquanto o outro é
usado como entorpecente (droga ilícita). Nos Jogos Olímpicos de Inverno de 2002, realizados
em Salt Lake City (EUA), um esquiador britânico perdeu a medalha de bronze depois que o
seu exame de controle de dopagem apresentou resultado positivo para uma substância
proibida pela ANA: a metanfetamina (Figura 26) (COTTON, 2006). Essa anfetamina
apresenta isomeria óptica. O isômero S-(+)-metanfetamina apresenta maior potencial para
esse efeito. O outro, a R-(-)-metanfetamina, é utilizado em medicamentos descongestionantes
nasais (como o US Vick®) (PROCTER & GAMBLE, 2006) e a sua ação estimulante era
praticamente nula (HOLLER, 2005).
Na atual lista da ANA, ambos isômeros são classificados como proibidos (WORLD
ANTI-DOPING AGENCY, 2006). Os procedimentos utilizados para separação de
enantiômeros seguem basicamente duas direções: (i) por meio de uma reação com um
derivatizante opticamente puro, os enantiômeros são convertidos em diasteroisômeros e então
separados em uma coluna cromatográfica de fase estacionária aquiral; ou (ii) os enantiômeros
são separados diretamente em uma fase estacionária quiral. Para a cromatografia a gás, é
muito difícil encontrar colunas quirais disponíveis no mercado. Já os reagentes quirais,
quando não são comerciais, podem ser sintetizados no laboratório (PETERS, 2002).
37
Além da CG-EM, CLAE e EC também são utilizadas como método confirmatório,
sempre acopladas a um espectrômetro de massas. São métodos de análise simples,
principalmente quando se trata de compostos polares e/ou termicamente instáveis, uma vez
que a etapa de derivatização passa a ser opcional e não mais imprescindível. De forma geral,
essas três técnicas, quando acopladas a um espectrômetro de massas seqüencial (Tandem ou
Ion Trap), aumentam consideravelmente a seletividade e a especificidade da detecção
(BOATTO, 2005; VERSTRAETE, 2005), porém os equipamentos que as utilizam ainda
apresentam custos elevados.
f) Cromatografia a Gás acoplada à Espectrometria de Massas
A cromatografia é uma técnica de separação baseada na partição de compostos entre
duas fases em contato: fase móvel e fase estacionária. Na cromatografia a gás, a fase móvel é
um gás inerte (geralmente He), já a fase estacionária pode ser sólida ou líquida.
Um cromatógrafo a gás é constituído basicamente por 7 componentes: fonte de gás,
controlador de fluxo, injetor, forno, coluna, detector e registrador. Como a separação dos
compostos ocorre em fase gasosa, o injetor, o forno e o detector operam em temperaturas altas,
a amostra tem que ser volatilizada imediatamente após a injeção. Por isso, o injetor de um
cromatógrafo a gás sempre opera em temperaturas altas (200 - 300ºC, geralmente 50ºC acima
da temperatura de ebulição do composto menos volátil). Há dois modos de injeção de amostra:
(i) modo splitless, para análises de traços em amostras muito diluídas (LIU, 2001); e (ii) modo
split muito utilizado quando se têm amostras concentradas, para se evitar a contaminação do
NH
R-(-)-metanfetamina
(Levmetanfetamina)
NH
S-(+)-metanfetamina
F ig u ra 26. Estruturas químicas dos isômeros da metanfetamina e a embalagem do inalante Vick®
38
injetor e o efeito memória nas análises (LUHUA, 2005). Saindo do injetor, a amostra entra na
coluna cromatográfica, onde ocorrerá a separação dos compostos presentes na amostra. A
coluna cromatográfica fica no interior do forno que pode estar a uma temperatura constante
(análise isotérmica) ou sofrer um aquecimento programado. A separação acontece por meio
de interações entre os analitos e a fase estacionária. Quando a fase estacionária é sólida, os
analitos são adsorvidos na mesma. Quando a fase estacionária é líquida, o fenômeno
envolvido é a partição dos analitos pela fase. Como os analitos apresentam pressões de vapor
diferentes, as interações terão intensidades diferentes e, com isso pode se obter a completa
separação dos componentes da amostra. À medida que se aumenta a temperatura do forno, os
compostos menos voláteis (pressões de vapor menores) são dessorvidos da coluna e
arrastados pelo gás até o espectrômetro de massas. O aquecimento do forno e o fluxo do gás
de arraste são os principais responsáveis por uma boa resolução do cromatograma. Nos
espectrômetros de massas acoplados utilizados como detector para cromatografia a gás, as
formas de ionização mais utilizadas são por elétrons (EI) ou ionização química (CI). Na fonte
de ionização EI há um filamento metálico (W ou Re) que, ao ser aquecido, emite elétrons,
formando um feixe. Esse feixe de elétrons é acelerado por uma diferença de potencial
(geralmente 70 eV) aplicada entre o filamento e o anodo. As moléculas em fase gasosa, ao
entrarem no espectrômetro, percorrem uma trajetória perpendicular à do feixe. Por isso,
quando essas trajetórias se interceptam, ocorrem colisões entre os elétrons e as moléculas. Por
repulsão eletrostática, as moléculas perdem elétrons, formando os íons moleculares (Figura 27)
(BERGO, 2005).
F ig u ra 27. Representação esquemática de uma fonte de ionização por impacto por elétrons
39
Como a energia interna desses íons é muito elevada, durante a colisão, eles atingem
estados vibracional e rotacional bastante excitados. Por causa desse excesso de energia, outras
ligações químicas são quebradas e o íon molecular é fragmentado em íons positivos de massas
menores (íons secundários). Em algumas situações, essa energia é alta o suficiente para que o
íon molecular seja completamente fragmentado. Nesse caso, o sinal correspondente ao íon
molecular não é visto no espectro de massas, o que leva a uma perda de informações a
respeito da massa molecular do analito.
Tendo como base os sinais dos íons-fragmento e/ou do íon molecular, é possível
utilizar a CG-EM para análises quantitativas em um modo de análise conhecido como
monitoramento de um único íon (SIM). Inicialmente uma análise da substância de interesse é
feita em modo full scan. No cromatograma, verifica-se o tempo de retenção da mesma. No
espectro de massas, identifica-se o espectro associado ao pico visto no cromatograma. Do
espectro, os íons característicos (geralmente dois ou três íons) com os sinais mais intensos são
selecionados para as análises em modo SIM. Nesse modo, apenas os íons selecionados são
monitorados e identificados no espectro (Figura 28) para casa tempo de retenção no
cromatograma. Tais íons, assim como o tempo de retenção, são específicos para cada analito,
aumentando assim a confiabilidade e a sensibilidade da análise (BERGO, 2005).
40
a)
b)
c)
F ig u ra 28. Análise cromatográfica de pseudoefedrina em urina (forma acetilada) realizada nos modos
de (a) varredura completa e (b) SIM (íons monitorados: 58, 100, 148). Em (c) é apresentado o espectro
de massas associado ao pico cromatográfico com t
r
= 16,03
41
2. Objetivos
O objetivo principal desse trabalho foi desenvolver um método de screening, baseado
em ESI-MS, para estimulantes do tipo anfetaminas encontrados em urina de esportistas.
Também foram objetivos desse estudo a otimização e a validação de um método para
quantificação dos estimulantes por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
(método de confirmação) e a aplicação dos métodos desenvolvidos em estudos de casos de
indivíduos que utilizam anfetaminas regularmente.
42
3. Parte Experimental
3.1 Reagentes e Materiais
Os seguintes reagentes foram utilizados:
- Cloridrato de (-) Norpseudoefedrina (cloridrato de catina), pureza 99% (Sigma-
Aldrich);
- Cloridrato de (+/-) Norefedrina (cloridrato de (+/-) fenilpropanolamina), pureza 99%
(Sigma-Aldrich);
- Cloridrato de Efedrina, pureza 99% (Sigma-Aldrich);
- Cloridrato de metanfetamina, pureza 98% (Sigma-Aldrich);
- L-Fenilalanina, pureza 99% (Sigma-Aldrich);
- Pseudoefedrina ( (+)-Ψ-Efedrina), pureza 98% (Sigma-Aldrich);
- Solução metanólica 1 mg/mL de Metilenodioxianfetamina (MDA) (Radian Inc.);
- Solução metanólica 1 mg/mL de Metilenodioximetanfetamina (MDMA) (Radian
Inc.);
- Solução metanólica 1 mg/mL de N-metil-metilenodioxifenil-2-butanamina (MBDB)
(Radian Inc.);
- Sulfato de Anfetamina, 98% (Sigma-Aldrich);
- Ácido Sulfúrico, grau analítico (Micorquimica);
- Anidrido Acético, grau analítico (FMaia);
- Bicarbonato de sódio, pureza 98% (Synth);
- Carbonato de sódio, pureza 98% (Synth);
- Diclorometano, grau analítico (CRQ);
- Gás Hélio, pureza 99,999% (White Martins);
- Gás Nitrogênio, comercial (95%) e 99,9999% (White Martins);
- Metanol, grau analítico (FMaia);
- Metanol, grau HPLC (JTB, Merck e Vertec);
- Piridina, grau analítico (Merk);
- Cartuchos de Extração em Fase Sólida AccuBond
II
ODS-C18, 500 mg, 6 mL
(Agillent Technologies); e
- Fita indicadora universal Universalindikator pH 0 - 14 (Merck).
43
3.2 Preparo das Soluções
3.2.1 Síntese do Éster Metílico da Fenilalanina
Nas análises por CG-EM foram utilizados como padrões internos o MBDB e o éster
metílico da fenilalanina. Esse último foi sintetizado no laboratório a partir da fenilalanina.
A síntese foi realizada conforme as metodologias descritas por Ajinomoto
(AJINOMOTO, 1993) e Viana (VIANA, 2004) com modificações. A montagem utilizada
para essa síntese está esquematizada na Figura 29.
Foram pesados 5,0002g de L-fenilalanina e transferidos para um balão 3 bocas de
fundo redondo de 125 mL, ao qual foram acrescentados 9,70 mL de metanol e 1,81 mL de
H
2
SO
4
. Ao balão foi acoplado um funil de adição do qual 44,18 mL de metanol foram
gotejados continuamente à mistura reacional. Essa, por sua vez, foi mantida em banho-maria a
85C
o
, durante 4 horas, sob agitação constante. Simultaneamente o excesso de metanol era
destilado. Ao término desse período formou-se uma fase oleosa, à qual adicionou-se a solução
tampão Na
2
CO
3
/ N aHC O
3
até que o pH da mistura fosse aproximadamente 10. A mesma foi
lavada 3 vezes com 20 mL de diclorometano. Após a separação das fases, descartou-se a fase
aquosa e adicionou-se Na
2
SO
4
à fração orgânica para remover possíveis traços de água e em
seguida, filtrou-se. O diclorometano foi evaporado à pressão reduzida. Foram obtidos 3,4675g
do éster metílico da fenilalanina, o qual solubilizado em metanol de forma que a solução final
tivesse a concentração aproximada de 500 μg/mL.
F ig u ra 29. Esquema da montagem utilizada na síntese do éster metílico da fenilalanina
3.2.2 Preparo das soluções estoque
Para cada analito (anfetamina, metanfetamina, norefedrina, catina, efedrina,
44
pseudoefedrina, MDA, MDMA) e para os padrões internos (MBDB e éster netílico da
fenilalanina) foram preparadas soluções estoque na concentração de 500 μg/mL em metanol.
A partir dessas soluções estoque, foram preparadas, para cada um dos analitos, também em
metanol, soluções padrão nas concentrações 0,5 (exceto padrões internos) e 5 μg/m L. Todas
as soluções foram mantidas sob congelamento a -20
o
C até o momento da análise.
Durante o preparo das amostras para análise por CG-EM foi utilizada uma solução
tampão em pH 11. Para se obter esse tampão, 8,426g de NaHCO
3
e 53,2615g de Na
2
CO
3
foram dissolvidos em 1 L de água deionizada.
3.3 Amostras
Nos estudos de otimização e validação dos métodos de screening e de confirmação,
amostras de urina sem a presença de drogas foram utilizadas como referência negativa
(brancos). Essas amostras foram fornecidas por 31 voluntários sadios (16 homens e 15
mulheres) com idade entre 20 e 35 anos, residentes na Grande Belo Horizonte. Os voluntários
foram selecionados após uma entrevista em que cada indivíduo foi questionado sobre o uso de
medicamentos. Somente aqueles que não faziam uso de qualquer medicamento (exceto
anticoncepcionais) foram selecionados para o estudo.
Os métodos desenvolvidos foram utilizados para análises de casos reais que foram
divididos em dois grupos:
a) indivíduos usuários:
Para compor o grupo, amostras de urina foram obtidas de indivíduos que fazem uso
contínuo de algum estimulante do tipo anfetamina com ou sem fins terapêuticos. Esse
estimulante pode ser uma das substâncias estudadas ou um derivado de anfetamina que
apresente no mínimo uma dessas substâncias como metabólito (MUSSHOFF, 2000; CODY,
2001; RODRIGUEZ, 2004; TAKAYAMA, 2005; BEYER, 2006; YASAR, 2005). Também
foram incluídas amostras de urina fornecidas pelo Instituto de Medicina Legal (IML) da
Polícia Civil do Estado de Minas Gerais, em que se suspeitava uso abusivo de anfetaminas.
Todas as amostras foram mantidas refrigeradas a -20
o
C até o momento da análise.
b) indivíduos voluntários:
Esse grupo foi formado por dez voluntários sadios (5 homens e 5 mulheres). A seis
deles foram administradas cápsulas de Dimetapp Gelcápsula (DIMETAPP, 2006), Esse
45
medicamento contém 60 mg de cloridrato de pseudoefedrina, um dos estimulantes estudados.
Aos outros 4 voluntários, foram administradas cápsulas de placebo à base de amido. Cada
voluntário recebeu uma única cápsula de estimulante ou placebo. Amostras de urina foram
coletadas de cada voluntário em intervalos de 2 horas, sendo a primeira colhida
imediatamente após a ingestão da cápsula e a última, 10 horas após a ingestão. Todas as
amostras foram mantidas refrigeradas a -20
o
C até o momento da análise.
Como o trabalho envolveu estudos com amostras humanas, foi obtido previamente o
parecer favorável junto ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas
Gerais (COEP – UFMG, processo número 0233.0.203.000-06). Além disso, cada voluntário
assinou o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) requerido pelo mesmo
Comitê.
3.4 Instrumentação
3.4.1 Método de screening
O método de screening desenvolvido neste trabalho foi baseado na técnica de
espectrometria de massas com fonte de ionização eletrospray (ESI-MS). Foi utilizado um
espectrômetro de massas, modelo LC-MSD Trap series 1100 de fabricação da Agilent (Figura
30). Embora esse equipamento permitisse um acoplamento a um HPLC, ele foi utilizado no
modo de injeção direta em fluxo (FIA). As análises foram realizadas nos modos de varredura
completa (full scan) e de reação monitorada (MRM). Essa etapa foi desenvolvida no
laboratório de LC-MS e EC-MS da Universidade Federal de Lavras, em parceria com os
professores Mário César Guerreiro e Luiz Carlos Oliveira.
F ig u ra 30. Equipamento LC-MSD Trap series 1100
3.4.2 Método de Confirmação
No desenvolvimento do método de confirmação realizado nesse trabalho foi utilizado
um cromatógrafo a gás, modelo Trace GC Ultra acoplado a um espectrômetro de massas com
46
analisador Ion Trap, modelo Polaris Q, com injetor automático de amostras, modelo AI 3000
(Figura 31) de fabricação da Finnigam (Thermoelectron Corporation). Em todos os
experimentos foi utilizada uma coluna cromatográfica capilar RTx-5MS, com 30 m de
comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno. A fase estacionária tinha 0,25 μm de espessura
e era composta na seguinte proporção: 95 % dimetil e 5 % difenilsiloxano, em ligação cruzada.
Figura 31. Equipamento Trace GC Ultra – Polaris Q
3.5 Desenvolvimento dos métodos de screening e de confirmação
3.5.1 Método de screening
Quando as análises de espectrometria de massas são realizadas utilizando-se matrizes
biológicas, como a urina, o ajuste do pH das amostras torna-se um recurso opcional, uma vez
que em condições fisiológicas, a maioria dos analitos já se apresenta na forma de íons. Nesse
estudo, a acidificação da amostra foi dispensada em todas as etapas de desenvolvimento do
método de screening, uma vez que todas as amostras de urina foram utilizadas em condições
fisiológicas (pH ~5,5), nas quais todas as anfetaminas estão na forma protonada (Tabela 2).
Tabela 2. Valores de pKa de algumas anfetaminas
Substância
pKa
Condição em meio fisiológico (5 < pH < 7)
Anfetamina
9.94±0.10
Protonada
Metanfetamina
10.38±0.10
Protonada
Norefedrina
8.47±0.10
Protonada
Catina
8.47±0.10
Protonada
Pseudoefedrina
9.38±0.10
Protonada
Efedrina
9.38±0.10
Protonada
MDA
9.94±0.10
Protonada
MDMA
10.32±0.10
Protonada
Fonte: SciFinder Scholar 2006
47
3.5.1.1 Otimização
Nessa etapa foram otimizadas as condições experimentais: (i) parâmetros de ajuste do
equipamento; (ii) fluxo de injeção; e (iii) diluição da amostra.
A otimização de (i) foi feita com soluções padrão em metanol de cada analito na
concentração de 5 μg/m L. Para a otimização de (ii), foi preparado um pool (mistura) com
amostras de urina de referência negativa (brancos). Esse pool foi contaminado com soluções
padrões dos analitos em estudo, de forma que a concentração de cada um na urina fosse 500
ng/mL. Na otimização de (iii), alíquotas do pool contaminado foram diluídas 0, 1, 5 e 10
vezes em metanol. Todas as análises foram feitas em modos de full scan, usando um intervalo
de m/z de 50 a 220 Da, e reação monitorada (MRM).
Otimizadas as condições do equipamento, uma análise MS/MS foi realizada para cada
analito individualmente a fim de selecionar os íons utilizados nas análises em MRM. As
melhores condições obtidas com a otimização estão apresentadas na Tabela 3 e foram
utilizadas nos experimentos descritos a seguir.
Tabela 3. Condições experimentais do Espectrômetro de Massas LC-MSD Trap series 1100
Parâmetros otimizados
Condições obtidas
Fluxo de injeção de amostra
20 μL/min
Modo de ionização
P o sit iv o
Temperatura do gás secante
200ºC
Fluxo do gás secante
5.00 L/min
Pressão do gás nebulizador
15.00 psi
Potencial aplicado na entrada do capilar
3500 V
Potencial aplicado na saída do capilar
72.9 V
Potencial aplicado nos skimmers
100.0 V (skimmer 1)
300.0 V (skimmer 2)
m/z de referência
130
Estabilidade dos compostos
20%
Trap drive level
100%
Tempo de acúmulo de íons no trap
300 ms
Potencial aplicado no detector
1686 V (multiplicador de íons)
7.0 kV (diodo)
Número médio de espectros por análise
5 espectros
Faixa de m/z selecionada para as análises em modo de full scan
50 - 220 m/z
Tempo para fragmentação
40 ms
Amplitude utilizada na fragmentação
1.0 V
Razões m/z selecionadas para fragmentação nas análises em modo MRM
136 (anfetamina)
150 (metanfetamina)
152 (norefedrina e catina)
166 (efedrina e pseudoefedrina)
180 ( MDA)
194 (MDMA)
Software utilizado: LC/MSD Trap Software Versão 4.2
48
3.5.1.2 Simulação de um screening
Dez amostras de urina de referência negativa (5 masculinas e 5 femininas) foram
subdivididas, cada uma, em 10 partes, totalizando 100 novas amostras. Estas foram então
contaminadas aleatoriamente com quantidades conhecidas de alguns dos analitos estudados.
Cada amostra poderia conter entre 1 e 5 analitos diferentes ou poderia continuar sendo um
branco. A concentração de cada analito variava de 1 a 100 ng/mL, como especificado na
Tabela 4.
Alíquotas de 1 mL de amostra contaminada foram diluídas 10 vezes em metanol.
Volumes de 25 µL foram injetados no espectrômetro e analisados nos modos full scan e
MRM.
3.5.1.3 Estudo com amostras reais
Nesse experimento foram utilizadas as amostras dos grupos de indivíduos usuários
(item a da seção 3.3) e de indivíduos voluntários (item b da seção 3.3). De cada amostra, uma
alíquota de 1mL foi diluída 10 vezes em metanol e 25 μL dessa solução diluída foram
injetados no espectrômetro. As análises foram feitas nos modos de full scan e MRM.
3.5.1.4 Tratamento dos dados
Para tratar os dados experimentais obtidos nas análises por espectrometria de massas,
foram utilizados os aplicativos descritos abaixo. O primeiro, em linguagem Delphi, foi
desenvolvido pelo estudante Allan Lisboa, aluno do curso de Engenharia de Controle e
Automação da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais (PUC-MG). O segundo, uma
ferramente de análise quimiométrica, é parte integrante do software Statistica versão 6.0. Em
ambos, foi necessário, inicialmente, converter os conjuntos de dados para um arquivo do tipo
texto (*.txt, *.csv, *.asc, ...), no qual a primeira coluna corresponde às razões m/z e a segunda
corresponde às respectivas intensidades relativas. Para o screening, foram utilizados apenas os
conjuntos de dados obtidos nas análises em modo MRM.
a) “Gerador de Arquivos Completos”
Os arquivos texto gerados pelo software do espectrômetro de massas não
correspondem a espectros contínuos (m/z 50, 51, 52, 53, ...). Para se utilizar uma ferramenta
quimiométrica no tratamento dos dados experimentais, é necessário uniformizar as Tabelas de
Tabela 4. Concentração de cada analito nas amostras utilizadas para simulação do screening
A m o s t r a
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
A m o s t r a
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
1
-
100
100
-
-
25
-
-
51
-
-
-
-
-
-
25
50
2
100
-
-
5
25
-
1
-
52
50
-
-
10
-
50
-
-
3
-
-
-
-
-
-
-
-
53
-
-
-
-
-
-
-
-
4
100
-
-
25
100
-
10
-
54
5
-
-
-
1
-
-
25
5
-
-
-
-
10
-
-
-
55
-
100
1
25
-
-
10
-
6
-
-
10
-
1
10
100
-
56
-
-
-
-
1
10
-
-
7
25
10
-
-
-
-
-
-
57
10
10
-
-
1
1
-
-
8
50
-
100
-
25
-
100
10
58
50
25
-
-
-
-
-
-
9
-
-
5
1
5
-
-
-
59
-
100
-
-
50
-
5
-
10
-
-
-
-
-
-
-
-
60
-
-
-
-
-
-
25
-
11
25
25
-
-
-
-
5
-
61
-
-
10
1
-
-
-
-
12
5
-
-
1
-
25
50
-
62
-
50
25
-
-
-
50
-
13
-
-
-
-
-
-
-
-
63
100
-
-
-
5
-
-
5
14
-
-
-
50
-
-
25
-
64
-
-
10
10
50
-
-
1
15
-
25
5
-
-
-
-
-
65
-
100
-
-
-
-
-
-
16
-
10
-
25
100
-
-
5
66
-
-
-
-
-
10
100
50
17
-
-
-
-
5
50
50
1
67
-
50
25
-
100
25
-
25
18
-
-
10
-
50
-
-
-
68
-
10
-
10
-
-
-
10
19
-
25
10
5
50
50
-
-
69
-
-
10
5
-
1
-
5
20
1
1
-
25
-
100
-
-
70
50
-
100
-
-
-
-
5
21
10
-
-
-
-
-
10
-
71
-
-
-
-
-
-
-
-
22
-
-
-
10
-
-
-
-
72
100
-
-
-
25
25
-
-
23
-
-
-
-
-
-
-
-
73
-
-
-
-
-
-
-
100
24
-
-
-
-
-
25
-
-
74
-
25
-
50
25
-
-
1
25
-
-
-
-
-
-
-
-
75
10
-
25
10
50
-
-
-
26
50
-
-
-
-
-
-
-
76
-
-
-
-
100
100
1
-
27
-
5
-
5
-
5
-
-
77
50
-
-
5
1
-
25
-
28
-
-
-
-
-
-
5
-
78
5
-
25
1
-
-
5
-
29
25
-
-
-
10
50
-
-
79
25
-
-
25
100
-
-
-
30
1
-
-
-
10
10
-
-
80
-
-
1
-
-
-
-
-
31
-
-
100
1
-
100
-
-
81
1
-
25
50
5
-
-
-
32
1
5
-
1
-
-
-
-
82
10
-
5
-
-
-
10
100
33
-
-
1
-
-
1
-
10
83
-
50
5
-
100
-
50
25
34
-
-
1
100
5
100
100
-
84
-
-
-
-
-
-
-
-
35
100
-
-
25
-
5
-
-
85
-
-
-
1
-
-
-
-
36
-
-
-
-
-
-
25
25
86
-
25
50
-
-
1
-
-
37
-
25
-
-
-
-
-
-
87
25
-
-
100
-
-
1
100
38
-
1
-
-
-
-
-
-
88
-
-
100
100
-
-
5
10
39
-
-
10
-
-
5
-
-
89
-
-
50
-
-
-
-
100
40
-
-
-
-
25
-
-
-
90
10
5
-
25
1
-
10
-
41
5
-
50
-
-
-
-
1
91
1
-
-
-
10
-
100
50
42
-
-
1
-
-
50
1
-
92
-
-
-
5
-
1
1
-
43
-
5
-
-
25
-
-
-
93
5
1
100
50
-
-
-
-
44
-
10
-
-
-
5
-
-
94
-
-
-
-
-
-
-
-
45
-
-
5
1
-
-
50
-
95
-
1
25
100
-
-
-
-
46
25
-
-
10
10
25
-
-
96
-
-
-
50
5
10
-
-
47
1
-
5
-
-
1
-
-
97
-
-
1
-
-
-
-
-
48
-
-
-
50
-
5
25
100
98
5
50
50
-
-
-
-
-
49
10
-
-
100
-
50
-
-
99
-
1
-
10
-
-
-
-
50
1
-
-
5
10
-
-
-
100
-
-
-
50
-
-
-
-
ANF = anfetamina; MET = metanfetamina; NOR = norefedrina; CAT = catina; EFE = efedrina; PSE = pseudoefedrina; MDA = metilenodioxianfetamina; MDMA = metilenodioximetanfetamina.
50
Dados. Para isso, foi desenvolvido o programa mostrado na Figura 32.
Figura 32. Software “Gerador de Arquivos Completos”
Inicialmente abre-se o arquivo contendo os dados do espectro. Cabe ressaltar aqui que
o arquivo deve conter apenas algarismos e, em caso de decimais, deve-se utilizar apenas “.”.
Em seguida, determina a faixa de razões m/z na qual o espectro deverá estar contido. No caso,
optou-se por manter o mesmo intervalo utilizado no espectrômetro: m/z de 50 a 220 Da. O
aplicativo gera, então, uma Tabela, na qual a primeira coluna corresponde às razões m/z e a
segunda, às intensidades. À medida que a Tabela é preenchida, com intervalos de m/z de 0.1
Da, os dados do arquivo relativos à intensidade são analisados. Caso seja encontrado um valor
para a intensidade associada à razão m/z, o mesmo é mantido. Caso contrário, é atribuído o
valor “0” àquela razão m/z. Gerado o conjunto completo de dados, o aplicativo o salva no
formato *.txt.
b) Análise quimiométrica de agrupamento (cluster)
Os métodos quimiométricos (supervisionados ou não) são de grande valia à química
analítica, sendo aplicados em diversos contextos, inclusive na interpretação dos resultados de
um screening. A análise de agrupamento (cluster), por ser um método não supervisionado,
pode fornecer informações importantes a partir do agrupamento das amostras (objetos)
conforme os analitos presentes. Como o agrupamento é baseado em dados experimentais, os
espectros de massas destacam-se como uma boa opção, principalmente quando se utiliza
fragmentação (TOUE, 2006).
O agrupamento dos objetos (amostras) pode ser efetuado usando: (i) a distância média
entre os pontos, (ii) a distância entre os pontos mais próximos, ou ainda (iii) a distância entre
os pontos mais distantes. Entretanto, o agrupamento também é dependente do tipo de
algoritmo utilizado para detectar o grau de proximidade entre os pontos, sendo neste caso
muito usada a distância Euclidiana ou Manhatan. O procedimento de agrupamento (também
denominado amalgamento) no esquema aglomerativo parte dos pontos próximos, agrupados
inicialmente, que leva a formação de grupos a partir de subconjuntos de objetos, até alcançar
51
os pontos considerados mais distantes, de forma que todos os elementos sejam enfim
classificados em um único grupo (Figura 33) (EVERITT, 2001).
Neste trabalho, a análise de cluster foi estabelecida a partir de uma coleção de 10
espectros MS/MS obtidos em modo MRM para cada analito. A abundância relativa média foi
calculada para cada razão m/z em cada coleção. Para as análises de agrupamento, uma matriz
foi construída com os valores de abundância relativa dos espectros de todas as 100 amostras
(Tabela 4), na qual cada linha corresponde a uma amostra e cada coluna a uma razão m/z
(Figura 34).
Figura 34. Matriz representativa do conjunto de dados obtidos na simulação do screening.
Uma matriz como essa foi obtida para cada anfetamina estudada. A partir dessa matriz foi realizada a análise de agrupamento
(cl us ter)
Um vetor foi então criado para representar o conjunto de variáveis para cada objeto e
as amostras foram agrupadas de acordo com a distância entre esses vetores (distância de
amalgamento) (Figura 33c-d). O modo de associação utilizado nesse trabalho foi complete
linkage, que usa o conceito do vizinho mais distante e tem como referência a distância
Euclidiana.
Nas análises de screening, tomou-se como referência o vetor que representa o padrão
da anfetamina em estudo. O agrupamento das demais amostras foi feito de acordo com a
Figura 33. Análise de Cluster baseada em espectrometria de massas utilizando distância euclidiana.
A) representação dos vetores para cada objeto (amostra). B) Representação do primeiro agrupamento hierárquico identificado
pela distância euclidiana. C) e D) Representações do segundo e terceiro agrupamentos hierárquicos identificados pela
distância euclidiana. E) Dendograma completo do agrupamento dos objetos mostrados em B). Adaptado de JANES, 2006.
52
distância de amalgamento entre o vetor de referência e o vetor da amostra. Essa distância
também pode ser entendida como uma medida da similaridade entre duas amostras. Quanto
menor a distância de amalgamento, mais similares são as amostras. Em outras palavras,
quanto menor a distância de amalgamento, maior a probabilidade de a amostra conter aquela
anfetamina. Isso significa que amostras com os conjuntos de dados mais semelhantes foram
agrupadas inicialmente (menor distância de amalgamento). Esses grupos (clusters) foram
então consecutivamente associados, até que o vetor da última amostra fosse associado ao de
referência (maior distância de amalgamento).
3.5.2 Método confirmatório
3.5.2.1 Otimização
a) Condições do CG-EM
Para realizar a otimização das condições do equipamento, 200 μL de cada solução
padrão na concentração de 5 μg/mL, incluindo os padrões internos, foram secos sob atmosfera
de N
2
, a 40
o
C. Para a derivatização, 200 μL de mistura anidrido acético/piridina foram
adicionados na proporção de 3:2 a cada resíduo. As misturas foram sonicadas por 30 minutos
a 50
o
C. Em seguida, o reagente derivatizante foi evaporado sob atmosfera de N
2
a 40
o
C. Ao
resíduo final foram adicionados 200 μL de metanol. Após agitação vigorosa em vórtex, 1 μL
foi injetado no cromatógrafo em duplicata, por meio de injeção automática.
Inicialmente cada espécie derivatizada foi analisada individualmente. Em seguida foi
analisada uma mistura contendo todas as espécies derivatizadas. Todas as amostras foram
preparadas em duplicata. As análises foram feitas inicialmente do modo full scan e depois,
otimizadas no modo SIM. As melhores condições experimentais obtidas estão apresentadas
na Tabelas 5 e foram utilizadas nas análises.
b) Derivatização
Estabelecidas as melhores condições cromatográficas, diferentes proporções de
reagentes derivatizantes foram avaliadas. Para tal, a partir das soluções padrões, foram
preparadas misturas contendo 1 μg de cada analito e dos padrões internos. Essas misturas
foram secas até resíduo sob atmosfera de N
2
. A cada um desses foram adicionados 200 μL de
alguma das proporções de reagentes derivatizantes estudadas, as quais são apresentadas na
Tabela 6.
53
As misturas foram sonicadas a 50
o
C por 30 minutos e completamente secas sob
atmosfera de N
2
a 40
o
C. Os resíduos foram solubilizados em 200 μL de metanol. Todas as
amostras foram preparadas em duplicata. Volumes de 1 μL foram injetados também em
duplicata e analisados nos modos de full scan e SIM.
Tabela 5. Condições experimentais otimizadas para o método de confirmação baseado em CG-EM
Parâmetro otimizado
Condições obtidas
Temperatura do injetor
250ºC
Modo de injeção
Splitless (5 min)
Gás e fluxo de arraste
He, 1,0 mL.min-1
Programação do forno
70ºC (4 min)
70 - 160ºC, 20ºC.min-1
160 - 185ºC, 5ºC.min-1
185 - 198ºC, 1ºC.min-1
198 - 220ºC, 5ºC.min-1
220ºC (5 min)
Temperatura da interface
275ºC
Temperatura da fonte de ionização
200ºC
Tempo de delay
9 min
Faixa de m/z selecionada para as análises em modo de full scan
50 - 400 m/z
Íons selecionados para as análises em modo (SIM)
86, 91, 134 (anfetamina)
58, 91, 133 (metanfetamina)
120, 131, 162 (éster da fenilalanina)
44, 134, 175 (norefedrina e catina)
58, 100, 146 (efedrina)
58, 100, 148 (pseudoefedrina)
135, 162, 221 ( MDA)
58, 162, 235 (MDMA)
72, 135, 176 (MBDB)
Software utilizado: Xcalibur versão 1.4
Tabela 6. Proporções de anidrido acético e piridina testadas como reagente derivatizante
Anidrido Acético
Piridina
100 %
0 %
50 %
50 %
60 %
40 %
80 %
20 %
c) Extração
Para a otimização do processo de extração. O efeito do volume de solvente na eluição
dos analitos foi avaliado. Para tal, volumes de 1 mL do pool de urina de referência negativa
foram contaminados com as soluções padrão de forma que a concentração de cada espécie
estudada, assim como a dos padrões internos, fosse igual a 500 μg/m L. O procedimento de
extração foi baseado no trabalho desenvolvido por Boatto e colaboradores (BOATTO, 2005),
com adaptações.
Os cartuchos de EFS foram condicionados com 1 mL de metanol e 1 mL do tampão
pH 11. As amostras contaminadas foram tamponadas em pH 11 (1 mL da solução tampão),
54
fortemente agitadas em vórtex e adicionadas aos cartuchos. Após completa drenagem das
mesmas, os cartuchos foram lavados 2 vezes com 1 mL de água deionizada e secos durante 5
minutos sob vácuo (~20 mmHg). Os analitos foram eluídos com metanol, cuja quantidade
variou conforme mostrado na Tabela 7.
Tabela 7. Quantidade de metanol utilizado como eluente, na extração das anfetaminas.
Experimento
Volume de Metanol
1
1 x 1 mL
2
2 x 1 mL
3
3 x 1 mL
Uma vez extraídos, os analitos foram secos sob atmosfera de N
2
a 40
o
C. A cada
resíduo foram adicionados 200 μL da mistura anidrido acético/piridina na proporção 3:2.
Após breve agitação, as misturas foram sonicadas a 50
o
C por 30 minutos e completamente
secas sob atmosfera de N
2
a 40
o
C. Os resíduos foram solubilizados em 200μL de metanol.
Todo esse procedimento foi realizado em duplicata. Volumes de 1μL foram injetados e
analisados também em duplicata.
3.5.2.2 Validação
Em todos os ensaios relativos à validação do método confirmatório desenvolvido foi
utilizado um pool de urina, o qual foi preparado com 10 “brancos” de urinas, sendo 5
masculinas e 5 femininas. Todas as amostras de urina utilizadas apresentaram pH
aproximadamente 6,0.
a) Linearidade
Volumes de 1 mL do pool de urina foram contaminados com soluções padrão dos
analitos e padrões internos. As concentrações dos analitos na urina variaram de 1 a 2000
ng/mL e a dos padrões internos foram fixadas em 250 ng/mL . Para cada concentração foram
preparadas 5 replicatas e os volumes de solução padrão adicionados em cada uma estão
mostrados na Tabela 8.
Cada amostra foi brevemente agitada em vórtex e extraída em fase sólida, conforme
procedimento descrito no item c da seção 3.5.2.1. Os analitos foram eluídos com 2 mL de
metanol (1 mL, 2 vezes). Os eluatos foram secos completamente sob atmosfera de N
2
, a 40
o
C
e derivatizados de acordo com o procedimento otimizado. Volumes de 1 μL foram injetados
no CG-EM e analisados em duplicata. Os resultados foram analisados utilizando-se um
55
modelo de regressão linear, ajustado com base no método dos mínimos quadrados ordinário.
As razões área
analito
/área
padrão interno
correspondiam ao eixo das coordenadas (y) e as
concentrações ao eixo das abscissas (x).
Tabela 8. Volumes de solução padrão utilizados no estudo de linearidade.
Concentração
(ng/mL)
Volume de cada analito adicionado (μL)
Volume de cada padrão interno adicionado
(μL)
Solução Padrão
Co nc. 0,5 μg/mL
Solução Padrão
Conc. 5,0 μg/mL
Éster metílico da
fenilalanina
MBDB
0
-
-
50
50
1
2
-
50
50
5
10
-
50
50
10
20
-
50
50
25
50
-
50
50
50
100
-
50
50
100
-
20
50
50
250
-
50
50
50
500
-
100
50
50
1000
-
200
50
50
2000
-
400
50
50
b) Se ns i bi li da de
Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) foram calculados a partir dos
resultados obtidos com as análises dos brancos preparados no estudo de linearidade (item a
dessa seção). Para tanto, as 5 replicatas de cada branco foram analisadas 3 vezes (3 replicatas
de injeção) cada uma. Os cálculos foram feitos tendo como base os valores de desvio-padrão
obtidos para as razões área
analito
/área
padrão interno
correspondentes ao branco nas análises de
linearidade. As equações utilizadas nos cálculos de LD e LQ foram respectivamente
3 x s
e
10 x s
,
a
a
Onde,
s = desvio-padrão absoluto para todas replicatas
a = inclinação da reta, coeficiente angular da equação de ajuste do modelo linear (y = ax + b)
c) Precisão intra-di a
Esse estudo foi realizado em três níveis de concentração: 25, 100 e 250 ng/mL de
urina. Volumes de 1 mL do pool de urina foram contaminados com as soluções padrão de
forma que as concentrações dos analitos na matriz correspondessem a esses valores. A
56
concentração de cada padrão interno foi 250 ng/mL. Ao longo de um dia, foram preparadas 7
replicatas para cada nível de concentração acima. O intervalo médio entre as replicatas de
cada nível foi aproximadamente duas horas. Os procedimentos de extração e derivatização
foram os mesmos descritos no item c da seção 3.5.2.1. Os resíduos foram solubilizados em
200 μL de metanol. Uma alíquota de 1 μL de cada replicata foi injetada em duplicata e
analisada por CG-EM. Os resultados foram expressos em porcentagem, como Coeficiente de
Variação (CV), calculado a partir da equação:
% CV =
s
x 100
,
|
x
Onde,
s = desvio-padrão absoluto para as razões área
analito
/área
padrão interno
de cada replicata, e
x = valor médio das áreas áreas sob os picos
d) Precisão inter-di a
Esse estudo também foi realizado em três níveis de concentração: 25, 100 e 250
ng/mL de urina. Volumes de 1 mL do pool de urina foram contaminados com as soluções
padrão de forma que as concentrações dos analitos na matriz correspondessem a esses valores.
A concentração de cada padrão interno foi 250 ng/mL. Uma vez por dia, ao longo de 7 dias
consecutivos, cinco replicatas foram preparadas para cada nível acima. Os procedimentos de
extração e derivatização foram os mesmos descritos no item c da seção 3.5.2.1. Os resíduos
foram solubilizados em 200 μL de metanol. Uma alíquota de 1 μL de cada replicata foi
injetada em duplicata e analisada por CG-EM. Os resultados foram expressos em
porcentagem, como Coeficiente de Variação (CV), calculado a partir da equação:
% CV =
s
x 100
,
|
x
Onde,
s = desvio-padrão absoluto para as razões área
analito
/área
padrão interno
de cada replicata, e
x = valor médio das áreas sob os picos
e) Recuperação
Esse estudo também foi realizado em três níveis de concentração: 25, 100 e 250
ng/mL de urina. Volumes de 1 mL do pool de urina foram contaminados com as soluções
57
padrão de forma que as concentrações dos analitos na matriz correspondessem a esses valores.
A concentração de cada padrão interno foi 250 ng/mL. Para cada nível, foram preparadas 7
replicatas. O procedimento de extração foi o mesmo descrito no item a dessa seção.
Volumes de 1mL de soluções metanólicas contendo todos os analitos, além dos
padrões internos, também foram preparadas em 7 replicatas. Tanto os eluatos quanto as
soluções metanólicas foram completamente secas sob atmosfera de N
2
. Os procedimentos de
extração e derivatização foram os mesmos descritos no item c da seção 3.5.2.1. Os resíduos
foram solubilizados em 200 μL de metanol. Uma alíquota de 1 μL de cada replicata (tanto
extraída quanto solução em metanol) foi injetada em duplicata e analisada por CG-EM.
Quando as replicatas do “branco” (item a dessa seção) foram analisadas, nenhum
registro proveniente da matriz foi detectado em qualquer um dos tempos de retenção
associados aos analitos estudados. Uma vez que não houve interferência da matriz, a
recuperação, expressa em porcentagem, foi calculado a partir da proporção entre as razões
área
analito
/ área
padrão interno
para a solução em metanol e para a amostra extraída:
% recuperação =
(área
analito
/área
padrão interno)
extraído
x 100
,
(área
analito
/área
padrão interno)
metanol
Onde,
área
extraído
= área sob o pico correspodente à replicata extraída por EFS, e
área
metanol
= área sob o pico correspodente à replicata preparada em solução metanólica.
f) Estabilidade da amostra (congelamento / descongelamento)
Esse estudo também foi realizado em três níveis de concentração: 25, 100 e 250
ng/mL de urina. Volumes de 5 mL do pool de urina foram contaminados com as soluções
padrão de forma que as concentrações dos analitos na matriz correspondessem a esses valores.
A concentração de cada padrão interno foi 250 ng/mL. Para cada nível, foram preparadas 5
replicatas.
Após a preparação, uma alíquota de 1 mL foi retirada de cada replicata. Essas
alíquotas foram extraídas e derivatizadas de acordo com os procedimentos descritos
anteriormente. Após a solubilização em 200 μL de metanol, volumes de 1 μL foram injetados
e analisados em duplicata. O restante das amostras foi guardado no congelador.
Após um período de 21 horas de congelamento e 3 horas de estabilização térmica, uma
nova alíquota de 1 mL foi retirada de cada replicata. O tratamento e a análise dessas novas
amostras foi exatamente como antes da etapa de congelamento. O restante das amostras foi
58
novamente guardado no congelador. Essa rotina foi executada mais duas vezes, após outros
dois ciclos de 21 horas de congelamento e 3 horas de estabilização.
Os resultados foram expressos como uma curva das razões área
analito
/área
padrão interno
em
função do número de ciclos. O Coeficiente de Variação (CV), expresso em porcentagem foi
obtido a partir da equação:
% CV =
s
x 100
,
|
x
Onde,
s = desvio-padrão absoluto para as razões área
analito
/área
padrão interno
de cada replicata, e
x = valor médio das áreas sob os picos
Esse coeficiente foi calculado para cada concentração após cada ciclo. Para avaliar a
estabilidade geral, um coeficiente de variação total (%CV
total
) foi calculado para cada
concentração após todos os ciclos.
3.5.2.3 Confirmação do screening – análise de amostras reais
Todas as amostras analisadas pelo método de screening foram submetidas à
confirmação e quantificação pelo método de CG-EM desenvolvido. Antes da análise
quantitativa, uma curva de calibração foi construída na faixa de concentração de 50 a 500
ng/mL. Na construção dessa curva, volumes de soluções padrão foram adicionados a alíquotas
do pool de urina, de forma que a concentração final dos analitos fosse aquela mencionada
acima.
De cada amostra real, foi retirada uma alíquota de 1 mL. A cada alíquota, foram
adicionados 50 μL de cada padrão interno. O tratamento e a análise das amostras foram
realizados exatamente como descrito anteriormente (item a, seção 3.5.2.2).
Para a análise quantitativa, foi utilizado um modelo de regressão linear, ajustado com
base no método dos mínimos quadrados ordinário. A razão área
analito
/área
padrão interno
estava fora
da curva de calibração, uma nova alíquota da amostra era diluída, extraída, derivatizada e
analisada novamente. Esse procedimento se repetia até que razão das áreas estivesse dentro da
faixa de trabalho do modelo.
59
3.6 Estudo de cinética de excreção / Estudo comportamental
Utilizando-se os resultados das análises quantitativas (seção 3.5.2.3) realizadas com as
amostras coletadas junto ao grupo de voluntários que ingeriram o medicamento/placebo (item
b, seção 3.3), foram construídas curvas das razões área
analito
/área
padrão interno
em função do
tempo em que as amostras foram coletadas. Como essa razão está diretamente relacionada
com a quantidade de composto eliminado pela urina, foi possível realizar um estudo simples
de cinética da excreção de pseudoefedrina. Nesse estudo foram monitoradas não apenas a
pseudoefedrina, mas também a norefedrina (metabólito majoritário), efedrina e catina.
Paralelamente, foi realizado um estudo no qual procurou-se identificar alterações
comportamentais em decorrência do uso da pseudoefedrina. Para tal, utilizou-se a técnica de
diagnóstico miocinético que é descrita a seguir. Esse estudo foi desenvolvido em parceria com
o psicólogo Neivaldo Sérgio dos Santos (CRP-04 17.365 MG).
Em local que oferecia condições adequadas de isolamento acústico e luminosidade,
foram recebidos 8 colaboradores voluntários que ingeriram o medicamento/placebo. Cada
voluntário, depois de submetido à anamnese – que valorizou condições físicas atuais e
históricas do colaborador – ingeriu o medicamento, realizou a primeira avaliação e, após o
intervalo de 2 horas e 30 minutos da ingestão (período de concentração máxima da substância
no organismo), participou de uma nova avaliação, que contou com a mesma técnica utilizada
na primeira aplicação. Todos os tempos foram adequadamente computados, dentre os quais
constam o início da anamnese, horário de ingestão do medicamento, início do exame e início
(após intervalo de 2:30 h) do reexame.
a) Psicodiagnóstico Miocinético (PMK)
O Exame Psicodiagnóstico Miocinético é uma prova de expressão que propõe explorar
a personalidade, estudando sua fórmula atitudinal, mediante a análise das tensões musculares
involuntárias que revelam as tendências fundamentais de reação, constituída por suas
peculiaridades temperamentais e caracterológicas.
Trata-se de uma prova psicomotora baseada na simbiose dos músculos (Mio, de
origem latina) com os movimentos (Kinesão, de origem grega). Daí a sigla PMK.
Técnica vastamente utilizada nas clínicas de exames psicológicos, empresas,
DETRAN e serviços de saúde, o PMK realiza a medição dos níveis de elação, depressão,
tensão, ansiedade, nível ideomotor, equilíbrio, coerência, controle, estes lidos tanto em suas
60
características genotípicas (estruturais, permanentes e imutáveis) quanto fenotípicas
(situacionais, mutáveis) (MIRA, 2004).
61
4 Resultados
4.1 Método de screening
4.1.1 Otimização
Na otimização das condições do equipamento, as variáveis mais importantes foram a
temperatura e o fluxo do gás secante, a pressão do gás nebulizador, a estabilidade dos analitos
e a janela de análise. Essa última, apenas no modo de MRM.
O gás secante é injetado coaxialmente à amostra e tem como função, reduzir o volume
das gotículas provenientes da mesma. Ele o faz por meio da evaporação do solvente, a qual,
por sua vez, acontece a partir de colisões entre moléculas do gás e do solvente. Se o gás é
injetado em um fluxo e/ou temperatura baixos, as moléculas não terão energia suficiente para
colidir eficientemente com as do solvente, pois a energia da interação das partículas do
solvente com as do analito é consideravelmente alta. A pressão no gás nebulizador é uma
variável importante, pois é esse gás o responsável por remover as últimas moléculas de
solvente que estiverem interagindo com o analito.
A estabilidade dos analitos foi uma variável muito importante para o desenvolvimento
desse método. Quando se analisou uma mistura de padrões, utilizando-se valores de 100% ou
80% para esse parâmetro, não foi possível observar as razões m/z dos íons quasi-moleculares
dos compostos (Figura 35a). Isso acontece porque as moléculas das anfetaminas e efedrinas
estudadas apresentam massa molecular relativamente baixas e energia interna relativamente
alta, o que favorece a fragmentação da molécula. É por isso que no espectro mostrado na
Figura 34a, estão presentes apenas íons fragmentos como, por exemplo, as razões m/z 148,
principal íon-fragmento para efedrina/pseudoefedrina (perda de uma molécula de água de
m/z 18), e m/z 163, principais íons-fragmento para MDA (perda de uma molécula de amônia
de m/z 17) e MDMA (perda de uma molécula de metilamina de m/z 31). A observações dos
sinais correspondentes aos íons quasi-moleculares apenas tornou-se possível quando utilizou-
se 20% de estabilidade (Figura 35b). Por outro lado, valores baixos como esse propiciam a
detecção de íons provenientes de outras fontes que não os analitos de interesse. É o caso por
exemplo da razão m/z 114, que está associada a um interferente presente no metanol que foi
utilizado na diluição das amostras. No entanto, como nenhum dos analitos apresenta um íon
com razão m/z próxima a desse interferente, a confiabilidade das análises não foi
comprometida e o valor de 20% foi utilizado para os demais experimentos.
62
a)
b)
F ig u ra 35. Espectros de massa de uma mistura de anfetaminas considerando a estabilidade dos íons
igual a a) 80% e b) 20%. Concentração de cada analito: 500 ng/mL em metanol
Nas análises em modo MRM, além dos parâmetros acima, também foi muito
importante definir qual seria a janela de análise utilizada. A janela de análise está associada
com a precisão do instrumento durante o isolamento do íon. Nesse método, trabalhou-se com
a menor variação que o equipamento permite: m/z de ± 1,0, visto que, entre as anfetaminas
estudadas, 3 delas (metanfetamina, norefedrina e catina) apresentam íons quasi-moleculares
com uma diferença entre as razões m/z de apenas 2.0 Da. Se uma janela maior fosse utilizada,
durante o isolamento dos íons da metanfetamina (m/z 150), parte dos íons da norefedrina e da
catina (ambas com m/z 152) também seria incluída. Com isso, o método perderia seletividade
e a análise ficaria prejudicada.
Outro parâmetro otimizado para o método de screening foi o fluxo de injeção de
amostra. Um fluxo de injeção baixo (5–10 μL/min) é especialmente interessante para um
estudo mais complexo da amostra, como uma determinação estrutural. As vantagens de se
trabalhar dessa forma são a menor quantidade de íons chegando simultaneamente na fonte e a
maior quantidade de varreduras que o equipamento faz para uma mesma amostra. Para um
método de screening, um fluxo baixo, torna-se bastante indesejável, por tornar a análise mais
lenta. A utilização de um fluxo mais alto, como o que foi utilizado neste trabalho, além da
rapidez na análise, permite que mais moléculas atinjam a fonte ao mesmo tempo. Em outras
palavras, permite uma “pré-concentração” na fonte. Utilizando um fluxo de 20 μL/min, o
tempo médio necessário para cada análise era de 1 minuto e meio. Embora não fosse possível
fazer tantas varreduras como quando se utiliza o fluxo mais baixo, para cada amostra
analisada, uma coleção de 10 espectros em MRM foi obtida para cada íon monitorado, o
suficiente para uma análise bastante satisfatória. Vale ressaltar que a análise de matrizes mais
complexas como a urina também apresenta inconvenientes. Como as amostras foram injetadas
63
sem qualquer tratamento prévio, salvo a diluição, parte dos sais e conteúdo protéico presente
na urina também eram injetados no espectrômetro. Em relação aos espectros obtidos, esse
material não causou nenhuma interferência. Por outro lado, a quantidade de sal presente na
urina, muitas vezes, foi suficiente para obstruir o capilar e conseqüentemente interromper as
análises. Quando isso acontecia, geralmente após 30 análises consecutivas, passava-se um
solvente (geralmente metanol) pelo capilar em um fluxo alto (maior que o utilizado nas
análises) até o eletrospray ser novamente visualizado.
Para reduzir a freqüência com que essa manutenção era realizada, diferentes diluições
para as amostras foram testadas: 0, 1, 5 e 10 vezes em metanol (Figura 36). A diluição de 10
vezes foi a que apresentou o resultado mais satisfatório, com sinais bastante intensos para
todos os íons quasi-moleculares, embora tenha apresentado sinais com intensidade
significativa para alguns íons-fragmento (m/z 119 e 163) (Figura 36d). Embora a diluição de 5
vezes tenha resultado em um espectro mais limpo, com sinais intensos e sem a presença de
fragmento, durante as análises foi possível observar um “efeito memória”, principalmente
devido aos interferentes presentes na urina. Para as outras diluições (Figuras 36a e 36b), a
obstrução do capilar devido à injeção de sais em excesso ocorria mais freqüentemente. Por
outro lado, diluições maiores (superiores a 10 vezes) favoreceriam os interferentes presentes
na urina, os quais teriam um efeito dominante em relação à resposta dos analitos. Como o ion
trap é um analisador que opera no tempo, uma vez atingida a quantidade máxima de íons
armazenados, o restante da amostra (o que inclui parte dos analitos”- os que não foram
“capturados”) seria descartado do equipamento, levando à perda de sensibilidade na análise.
Sendo assim, durante o desenvolvimento e aplicação do método de screening, foi utilizada a
diluição de 10 vezes.
Nas análises MS/MS dos padrões, observou-se que a fragmentação do íon quasi-
molecular produzia espectros com poucos íons-fragmento, por sua vez muito estáveis (Figura
37). Embora esses íons fossem comuns a mais de uma anfetamina, os íons precursores não o
eram. Por isso, os íons-fragmento, bem como seus íons precursores foram monitorados nas
análises para o método de screening. A maior dificuldade encontrada nessas análises se
referia aos pares de isômeros efedrina/pseudoefedrina e catina/norefedrina. Sendo
estruturalmente muito semelhantes, distinguir dois diasteroisômeros em uma análise de
espectrometria de massas apenas com a primeira fragmentação torna-se praticamente
impossível (Figura 37c-f). Esse problema pode ser contornado se uma segunda (ou sucessivas)
fragmentação(ões) (MS
3
, MS
4
, ...) forem utilizadas (Figura 38). Entretanto, o modo de MRM
limita-se à primeira fragmentação somente, o que restringe a confiabilidade do método de
64
screening para casos de diasteroisômeros. Nesse caso, um método confirmatório capaz
identificar ambos isômeros, como a CG-EM torna-se fundamental.
a)
b)
c)
d)
F ig u ra 36. Efeito da diluição da urina nas análises de anfetaminas por EM (modo full scan): (a) sem
diluição, (b) diluição 1:1, (c) diluição 1:5, (d) diluição 1:10.
m/ z 136: [M-H]
+
anfetamina
; m/z 150:[M-H]
+
metanfetamina
; m / z 152:[M-H]
+
norefedrina e catina
;
m/ z 166: [M-H]
+
efedrina e pseudoefedrina
; m/z 180: [M-H]
+
MDA
; m/z 194: [M-H]
+
MDMA
65
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
F ig u ra 37. Espectros MS/MS de cada um dos padrões de anfetamina em estudo.
a) anfetamina, b) metanfetamina, c) norefedrina, d) catina, e) efedrina, f) pseudoefedrina; g) MDA, h) MDMA. A partir desses
resultados foram selecionados os íons para as análises em modo MRM
66
d)
Figura 38. Espectros MS/MS/MS para os pares de isômeros: (a) catina e (b) norefedrina; e (c) pseudoefedrina e (d) efedrina
c)
b)
a)
67
4.1.2 Simulação de um screening
Os dendogramas contendo os resultados das análises de agrupamento são apresentados
nas Figuras 40, 41, 42 e 43. A análise de agrupamento foi baseada no espetro de massas
contínuo, de m/z 50 até m/z 220, considerandos assim tantos os íons presentes (e a respectiva
intensidade), como os íons ausentes (Figura 34).
Na Figura 39a, as amostras am58, am04, am08, am72, am63, am35 e am02 foram
agrupadas juntamente com o padrão de anfetamina. Isso significa que tais amostras
apresentaram um perfil de fragmentação bastante similaridade ao da anfetamina padrão, não
apenas em relação à presença, mas também intensidade dos sinais dos íons característicos. As
demais amostras apresentaram um perfil de fragmentação com íons e/ou intensidade que não
correspondem aos da anfetamina padrão e, portanto, foram classificadas em outros grupos.
Conforme apresentado na Tabela 4, todas as amostras mencionadas continham anfetamina,
demonstrando assim que a análise foi capaz de formar adequadamente um grupo apenas com
“casos positivos”. As amostras am79 e am96 seriam as próximas associadas ao padrão de
anfetamina na análise de agrupamento. Entretanto, é conhecido que não havia anfetamina na
amostra am96, o que conFiguraria um caso “falso-positivo” na análise. Por isso, determinou-
se a distância de amalgamento igual a 100 como critério para separar o grupo de “casos
positivos” das demais amostras na análise de screening para anfetamina.
Analogamente podem-se explicar os agrupamentos observados nas análises de
screening para os outros analitos (Figuras 39b, 40, 41 e 42). Nesses casos, as distâncias de
amalgamento utilizadas como critério de separação dos “casos positivos” foram 100 para
norefedrina, pseudoefedrina e MDMA, e 150 para metanfetamina, catina, efedrina e MDA.
Uma análise interessante que se pode fazer a partir das análises de agrupamento está
relacionada com os resultados obtidos para os pares de isômeros. Embora eles apresentem as
mesmas razões m/z para os fragmentos, as abundâncias relativas dos mesmos variam
discretamente. Ainda sim, essa variação é suficiente para que a maioria das amostras seja
agrupada corretamente conforme o isômero presente. Apenas algumas amostras foram
classificadas como “casos positivos” mesmo não contendo qualquer quantidade do analito de
referência: am95 para norefedrina; am08 e am70 para catina; am20 e am31 para efedrina;
am04, am16, am64 e am79 para pseudoefedrina.
A partir dos resultados mostrados nos dendogramas e associando-os com os dados
apresentados na Tabela 4, foi possível classificar as 100 amostras utilizadas para simular um
screening como “casos positivos” (+) ou “casos negativos” (-) (Tabela 9).
68
Figura 39. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening para a) anfetamina e b) metanfetamina.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
69
Figura 40. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening para a) norefedrina e b) carina.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
70
Figura 41. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening para a) efedrina e b) pseudoefedrina.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
71
Figura 42. Dendogramas com os resultados das análises de simulação do screening para a) MDA e b) MDMA.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
Tabela 9. Resultados obtidos para simulação do screening
A m o s t r a
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
A m o s t r a
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
1
- (0)
+ (100)
+ (100)
+ (0)
- (0)
- (25)
- (0)
- (0)
51
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (25)
+ (50)
2
+ (100)
- (0)
- (0)
- (5)
- (25)
- (0)
-(1)
- (0)
52
- (50)
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
- (50)
- (0)
- (0)
3
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
53
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
4
+ (100)
- (0)
- (0)
- (25)
+ (100)
+ (0)
- (10)
- (0)
54
- (5)
- (0)
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (25)
5
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
- (0)
- (0)
55
- (0)
+ (100)
- (1)
- (25)
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
6
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
- (1)
- (10)
+ (100)
- (0)
56
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (1)
- (10)
- (0)
- (0)
7
- (25)
- (10)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
57
- (10)
- (10)
- (0)
- (0)
- (1)
- (1)
- (0)
- (0)
8
+ (50)
- (0)
+ (100)
+ (0)
- (25)
- (0)
+ (100)
+ (10)
58
+ (50)
- (25)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
9
- (0)
- (0)
- (5)
- (1)
- (5)
- (0)
- (0)
- (0)
59
- (0)
+ (100)
- (0)
- (0)
+ (50)
- (0)
+ (5)
- (0)
10
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
60
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (25)
- (0)
11
- (25)
- (25)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (5)
- (0)
61
- (0)
- (0)
- (10)
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
12
- (5)
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (25)
+(50)
- (0)
62
- (0)
- (50)
- (25)
- (0)
- (0)
- (0)
+ (50)
- (0)
13
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
63
+ (100)
- (0)
- (0)
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
- (5)
14
- (0)
- (0)
- (0)
- (50)
- (0)
- (0)
- (25)
- (0)
64
- (0)
- (0)
- (10)
- (10)
+ (50)
+ (0)
- (0)
- (1)
15
- (0)
- (25)
- (5)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
65
- (0)
+ (100)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
16
- (0)
- (10)
- (0)
- (25)
+ (100)
+ (0)
- (0)
- (5)
66
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
+ (100)
+ (50)
17
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
+ (5)
+ (50)
+ (50)
- (1)
67
- (0)
- (50)
- (25)
- (0)
+ (100)
+ (25)
- (0)
- (25)
18
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
- (50)
- (0)
- (0)
- (0)
68
- (0)
- (10)
- (0)
- (10)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
19
- (0)
- (25)
- (10)
- (5)
- (50)
- (50)
- (0)
- (0)
69
- (0)
- (0)
- (10)
- (5)
- (0)
- (1)
- (0)
- (5)
20
- (1)
- (1)
- (0)
- (25)
+ (0)
+ (100)
- (0)
- (0)
70
- (50)
- (0)
+ (100)
+ (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (5)
21
- (10)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
71
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
22
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
72
+ (100)
- (0)
- (0)
- (0)
+ (25)
+ (25)
- (0)
- (0)
23
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
73
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
+ (100)
24
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (25)
- (0)
- (0)
74
- (0)
- (25)
- (0)
- (50)
- (25)
- (0)
- (0)
- (1)
25
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
75
- (10)
- (0)
- (25)
- (10)
- (50)
- (0)
- (0)
- (0)
26
- (50)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
76
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
+ (100)
+ (100)
- (1)
- (0)
27
- (0)
- (5)
- (0)
- (5)
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
77
- (50)
- (0)
- (0)
- (5)
- (1)
- (0)
- (25)
- (0)
28
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (5)
- (0)
78
- (5)
- (0)
- (25)
- (1)
- (0)
- (0)
- (5)
- (0)
29
- (25)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
- (50)
- (0)
- (0)
79
- (25)
- (0)
- (0)
- (25)
+ (100)
+ (0)
- (0)
- (0)
30
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
- (10)
- (0)
- (0)
80
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
31
- (0)
- (0)
+ (100)
+ (1)
+ (0)
+ (100)
- (0)
- (0)
81
- (1)
- (0)
- (25)
- (50)
- (5)
- (0)
- (0)
- (0)
32
- (1)
- (5)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
82
- (10)
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
+ (100)
33
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (10)
83
- (0)
- (50)
- (5)
- (0)
+ (100)
- (0)
+ (50)
- (25)
34
- (0)
- (0)
+ (1)
+ (100)
+ (5)
+ (100)
+ (100)
- (0)
84
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
35
+ (100)
- (0)
- (0)
+ (25)
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
85
- (0)
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
36
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (25)
- (25)
86
- (0)
- (25)
- (50)
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
37
- (0)
- (25)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
87
- (25)
- (0)
+ (0)
+ (100)
- (0)
- (0)
- (1)
+ (100)
38
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
88
- (0)
- (0)
+ (100)
+ (100)
- (0)
- (0)
- (5)
- (10)
39
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
89
- (0)
- (0)
- (50)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
+ (100)
40
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (25)
- (0)
- (0)
- (0)
90
- (10)
- (5)
- (0)
- (25)
- (1)
- (0)
- (10)
- (0)
41
- (5)
- (0)
- (50)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (1)
91
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (10)
- (0)
+ (100)
+ (50)
42
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (50)
- (1)
- (0)
92
- (0)
- (0)
- (0)
- (5)
- (0)
- (1)
- (1)
- (0)
43
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
- (25)
- (0)
- (0)
- (0)
93
- (5)
- (1)
+ (100)
+ (50)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
44
- (0)
- (10)
- (0)
- (0)
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
94
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
45
- (0)
- (0)
- (5)
- (1)
- (0)
- (0)
+ (50)
- (0)
95
- (0)
- (1)
+ (25)
+ (100)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
46
- (25)
- (0)
- (0)
- (10)
- (10)
- (25)
- (0)
- (0)
96
- (0)
- (0)
- (0)
- (50)
- (5)
- (10)
- (0)
- (0)
47
- (1)
- (0)
- (5)
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
97
- (0)
- (0)
- (1)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
48
- (0)
- (0)
- (0)
- (50)
- (0)
- (5)
- (25)
+ (100)
98
- (5)
- (50)
- (50)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
49
- (10)
- (0)
- (0)
+ (100)
- (0)
- (50)
- (0)
- (0)
99
- (0)
- (1)
- (0)
- (10)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
50
- (1)
- (0)
- (0)
- (5)
-(10)
- (0)
- (0)
- (0)
100
- (0)
- (0)
- (0)
- (50)
- (0)
- (0)
- (0)
- (0)
ANF = anfetamina; MET = metanfetamina; NOR = norefedrina; CAT = catina; EFE = efedrina; PSE = pseudoefedrina; MDA = metilenodioxianfetamina; MDMA = metilenodioximetanfetamina.
Em negrito: amostras classificadas como “positivas” embora não contivessem o analito de interesse. Os valores em itálico indicam qual a concentração (em ng/mL) do analito na amostra (seção 3.5.1.2)
73
Analisando-se os dados apresentados na Tabela 9, nota-se que, para algumas anfetaminas
(metanfetamina, norefedrina e catina,), apenas os analitos que estavam na concentração de
100 ng/mL foram detectados. Outros analitos (anfetamina, efedrina e pseudoefedrina) também
foram detectados algumas vezes na concentração de 50 ng/mL. No entanto, apenas as
metilenodioxianfetaminas (MDA e MDMA) foram detectadas em ambas concentrações em
todas
as amostras nas quais estavam presentes. Portanto, a partir desses resultados, foi
possível estabelecer o Limite Mínimo de Desempenho (cut-off) para o método desenvolvido
(Tabela 10).
Tabela 10. Limite Mínimo de Desempenho obtido para o método desenvolvido
Analito
Limite Mínimo de Desempenho
Anfetamina
100 ng/mL
Metanfetamina
100 ng/mL
Norefedrina
100 ng/mL
Catina
100 ng/mL
Efedrina
100 ng/mL
Pseudoefedrina
100 ng/mL
MDA
50 ng/mL
MDMA
50 ng/mL
A Agência Mundial de Controle de Dopagem (AMA, WADA) exige que o método
utilizado para screening tenha um Limite Mínimo de Desempenho igual a 500 ng/mL. Logo,
o método de screening baseado em espectrometria de massas aqui desenvolvido atenderia
satisfatoriamente como um método para triagem de estimulantes nas análises de controle de
dopagem. Esse método também cumpre outros requisitos para um método de screening:
rapidez da análise, boa sensibilidade, boa especificidade e, reprodutivo. Além disso, o
espectrômetro de massas é tecnicamente de fácil operação e dispensa quase por completo a
preparação da amostra. Entretanto, essa técnica ainda apresenta um ponto negativo: o custo de
um equipamento como o utilizado aqui ainda é elevado.
4.1.3 Estudo com amostras reais
Assim como na simulação de um screening (seção 4.1.2), as análises de agrupamento
realizadas para as amostras reais (objetos) também foram baseadas na abundância relativa de
cada razão m/z (variáveis) apresentada nos espectros MS/MS, usando como referência os
espectros dos padrões. As distâncias de amalgamento, utilizadas como critério para a
74
formação do grupo de “casos positivos” foram mantidas em 100 (anfetamina, norefedrina,
pseudoefedrina e MDMA) ou 150 (metanfetamina, catina, efedrina e MDA).
Analisando-se os dendogramas obtidos para as análises das amostras reais, observa-se
um grupo de amostras associado à anfetamina de referência por uma distância de
amalgamento inferior à distância-limite estabelecida (Figuras 43, 44, 45 e 46), o que indica
que tais amostras apresentam uma “alta similaridade” em relação ao analito padrão. Tendo
como base os dados apresentados, foi possível classificar as amostras reais analisadas como
“casos positivos” (+, contem alguma anfetamina) ou “casos negativos” (-, não contem a
substância ou a mesma encontra-se abaixo do Limite Mínimo de Desempenho da técnica)
(Tabela 11).
Quando se analisam especificamente os dados obtidos para o screening das efedrinas,
observa-se que os dendogramas são idênticos para os pares de isômeros (Figuras 44 e 45),
levando a um resultado inconclusivo sobre qual é o isômero presente na amostra. Nesse caso,
um bom método confirmatório capaz de reconhecer e diferenciar diasteroisômeros torna-se
essencial.
Embora as análises de cluster, de forma geral, sugerissem uma boa classificação,
somente com os resultados apresentados, nada se pode predizer a respeito da confiabilidade
do método (falsos-positivos, falsos-negativos) sem o suporte de uma análise confirmatória.
Por isso, todas as 58 amostras foram submetidas à análise confirmatória por CG-EM.
75
Figura 43. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a) anfetamina e b) metanfetamina.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
76
Figura 44. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a) norefedrina e b) catina.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
77
Figura 45. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a) efedrina e b) pseudoefedrina.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
78
Figura 46. Dendogramas com os resultados das análises do screening para a) MDA e b) MDMA.
As amostras destacadas correspondem aos “casos positivos”.
b)
a)
Tabela 11. Resultados obtidos para o screening
Amostra
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
Amostra
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
1
+
-
-
-
-
-
-
-
30
-
-
-
-
-
-
-
-
2
-
-
+
+
+
+
-
-
31
-
-
+
+
+
+
-
-
3
-
-
+
+
+
+
-
-
32
+
-
-
-
+
+
+
+
4
-
-
+
+
+
+
-
-
33
-
-
-
-
-
-
-
+
5
-
-
+
+
+
+
-
-
34
-
-
+
+
+
+
-
+
6
-
-
+
+
+
+
-
-
35
-
-
+
+
+
+
-
-
7
-
-
-
-
-
-
-
-
36
-
-
+
+
+
+
-
-
8
-
-
-
-
-
-
-
-
37
-
-
-
-
+
+
-
-
9
-
-
-
-
-
-
-
-
38
-
-
-
-
+
+
-
-
10
-
-
-
-
-
-
-
-
39
-
-
+
+
+
+
-
-
11
-
-
+
+
+
+
-
-
40
-
-
+
+
+
+
-
-
12
-
-
-
-
-
-
-
-
41
-
-
+
+
+
+
-
-
13
-
-
-
-
-
-
-
-
42
-
-
+
+
+
+
-
-
14
-
-
-
-
-
-
-
-
43
-
-
+
+
+
+
-
-
15
-
-
-
-
-
-
-
-
44
-
-
+
+
+
+
-
-
16
-
-
+
+
+
+
-
-
45
-
-
+
+
+
+
-
-
17
-
-
-
-
-
-
-
-
46
-
-
-
-
-
-
-
-
18
-
-
+
+
+
+
-
-
47
-
-
+
+
+
+
-
-
19
-
-
+
+
+
+
-
-
48
+
-
-
-
+
+
+
+
20
-
+
+
+
+
+
-
-
49
-
-
-
-
+
-
-
-
21
-
-
+
+
+
+
-
-
50
-
-
-
-
-
-
-
+
22
-
-
-
-
-
-
-
-
51
-
-
+
+
+
-
-
-
23
-
-
+
+
+
+
-
-
52
-
-
-
-
+
-
-
-
24
-
-
-
-
-
-
-
-
53
-
-
+
+
+
+
-
-
25
-
-
-
-
-
-
-
-
54
-
-
+
+
+
+
-
+
26
-
-
+
+
+
+
-
-
55
-
-
+
+
+
+
-
-
27
-
-
-
-
-
-
-
-
56
-
-
+
+
+
+
-
-
28
-
-
+
+
+
+
-
-
57
-
-
-
-
-
-
-
-
29
-
-
+
+
+
+
-
-
58
-
-
+
+
+
+
-
-
ANF = anfetamina; MET = metanfetamina; NOR = norefedrina; CAT = catina; EFE = efedrina; PSE = pseudoefedrina; MDA = metilenodioxianfetamina; MDMA =
metilenodioximetanfetamina
80
4.2 Método Confirmatório
4.2.1 Otimização
4.2.1.1 Condições Cromatográficas
O ponto chave na otimização das condições cromatográficas foi a escolha dos íons
monitorados. Nas análises dos espectros obtidos no modo full scan, observou-se que, em
quase todos, o sinal correspondente ao íon molecular estava ausente ou apresentava baixa
intensidade. Como o analisador de massas utilizado no experimento do tipo Ion Trap, não foi
possível correlacionar diretamente os espectros de massa obtidos com os bancos de dados do
software, visto que esses foram adquiridos com o uso de um detector do tipo quadrupolo. Por
isso, a partir dos espectros obtidos, foram propostas fragmentações, as quais justificassem as
principais atribuições feitas aos sinais apresentados (Figura 47).
A partir das atribuições mostradas, não é possível observar substancialmente íons que
sejam específicos para uma ou outra anfetamina (íons diagnósticos). Por se tratar de derivados
estruturais, na maioria das vezes o processo de fragmentação leva a quebras de ligações nos
mesmos pontos, gerando, assim, os mesmos fragmentos. Nesse caso, selecionar íons
diagnósticos para análises em modo SIM, torna-se bastante complexo e a análise pode perder
em sensibilidade. Uma alternativa consiste em escolher íons que, embora comuns a (quase)
todas, apresentem abundâncias relativas diferentes. Por isso, nesse estudo, a escolha dos íons
para o modo SIM foi baseada na abundância relativa.
Com a otimização das condições do equipamento foi possível obter o perfil
cromatográfico mostrado na Figura 48. O tempo de retenção para cada anfetamina está
apresentado na Tabela 12.
81
F ig u ra 47. Espectros obtidos em modo full scan para os padrões de anfetaminas derivatizados com
anidrido acético / piridina
82
F ig u ra 48. Cromatogramas obtidos em modo SIM para os padrões de anfetaminas derivatizados com
anidrido acético/piridina
83
Tabela 12. Tempo de retenção obtido para cada analito
Analito
Tempo de retenção (min)
Resolução
Anfetamina
11,44
9,18
Metanfetamina
12,32
4,69
Éster da fenilalanina
14,01
-
Norefedrina
14,59
-1,90
Catina
14,79
-1,70
Efedrina
15,73
-5,64
Pseudoefedrina
16,03
-4,64
MDA
17,68
5,56
MDMA
19,31
2,57
MBDB
21,07
-
Uma corrida cromatográfica que consuma um tempo superior a 30 minutos para uma
análise de controle de dopagem não é muito satisfatória. Na tentativa reduzir o tempo da
análise, aumentando a taxa de aquecimento, observou-se que ocorria a sobreposição dos sinais
correspondentes aos pares de isômeros, sobretudo norefedrina/catina. Como os íons
monitorados foram os mesmos para ambas, a análise, nesse caso, tornou-se inconclusiva. Por
isso, optou-se por manter a análise com o tempo total de 35,9 minutos, uma vez que os
cromatogramas apresentaram boa resolução. No modo SIM, limitou-se a trabalhar com apenas
3 íons por analito, uma vez que o tempo de isolamento é proporcional ao número de íons. Se
esse tempo aumenta, enquanto os íons de uma substância ficam retidos, os de outra são
eliminados e, portanto, a sensibilidade do equipamento fica reduzida.
4.2.1.2 Extração
Quando os compostos foram eluídos com 1,0 mL de metanol, verificou-se que nem
todos os analitos (MDA e norfedrina) apresentaram sinais no cromatograma. Isso sugere que
o volume de metanol era insuficiente para interagir com os analitos e retirá-los da fase
estacionária. Quando foram utilizados volumes de 2,0 mL e 3,0 mL observou-se que os sinais
nos cromatogramas eram bons e bastante próximos para ambos volumes. No entanto, 3,0 mL
de metanol é um volume relativamente grande para secar sob atmosfera de N
2
e esse processo
levaria um tempo considerável para terminar. Por isso, optou-se por trabalhar como o volume
de 2,0 mL, que levava em média 15 minutos para a evaporação completa.
84
4.2.1.3 Derivatização
Quando somente o anidrido acético foi utilizado como reagente derivatizante (Figura
50) observou-se que os pares de isômeros norefedrina/catina e pseudoefedrina/efedrina foram
coeluidos. Quando a derivatização foi conduzida em presença de piridina, a resolução dos
cromatogramas para cada um dos analitos melhorou significativamente, sendo possível
observar 4 sinais cromatográficos independentes, que puderam se atribuídos para cada
isômero. A piridina é um composto de caráter básico e por isso, interage preferencialmente
com hidrogênio amínico das anfetaminas (Figura 49a). A posição desse átomo varia de acordo
com o isômero em questão e pode favorecer ou dificultar a interação da molécula com a
piridina. Por isso, durante a reação de derivatização (Figura 49b), o ataque nucleofílico da
anfetamina fica condicionado a interação entre o isômero e a piridina.
N
R2
R1
O
O
O
RN
R
O
O
O
N
N
H
R1
R2
+
+
H
a)
b)
F ig u ra 49. Esquema geral da reação do anidrido acético com uma anfetamina
Nesse estudo, procurou-se avaliar ainda como a quantidade de piridina no meio
reacional influenciava na derivatização. Utilizando-se uma mistura 20% piridina, 80%
anidrido, foram obtidos cromatogramas com boa resolução, porem com picos de baixa
intensidade. Cromatogramas com boa resolução e
sinais com boa intensidade e baixo valor
para a razão sinal-ruído (do inglês signal-to-noise ratio, ou S/N) foram obtidos utilizando-se
tanto uma mistura 60% anidrido, 40% piridina, quanto uma mistura 50% anidrido, 50%
piridina. No entanto, optou-se pela primeira (60%, 40%), devido à menor quantidade de
piridina envolvida, que é uma substância bastante tóxica.
4.2.2 Validação
Nesse trabalho, optou-se por utilizar amostras de pool de urina ao invés de amostras
individuais no sentido de reduzir ou eliminar qualquer efeito da matriz. As análises das
85
amostras de referência negativa (os “brancos”) não revelaram a presença de qualquer
composto interferente co-eluindo com os analitos em estudo e/ou padrões internos (Figura 51).
F ig u ra 50. Cromatograma obtidos em modo SIM para as amostras de referência negativa. As
marcações em pontilhado indicam os tempos de retenção para cada analito
86
4.2.2.1 Linearidade e Sensibilidade
A partir das análises feitas com as concentrações descritas anteriormente, notou-se um
comportamento cromatográfico bastante similar para as anfetaminas (Figura 51). Quando a
faixa de concentração é muito baixa (1–5 ng/mL), observa-se uma diminuição na intensidade
do sinal cromatográfico. No entanto, à medida que a concentração dos analitos aumenta, a
intensidade dos picos aumenta significativamente. Esse aumento é linear para uma ampla
faixa de concentração, aproximadamente 50 a 1000 ng/mL. Para concentrações mais elevadas
(acima de 1000 ng/mL), com exceção das metilenodioxianfetaminas, a intensidade dos sinais
apresenta um aumento bastante discreto. Essa queda na linearidade sugere que tais
concentrações já estariam extrapolando a faixa óptima de trabalho para os analitos em questão.
Além disso, trabalhar com concentração na ordem de ppm como modo de injeção splitless
pode não ser muito aconselhável, principalmente quando se trata de matrizes complexas como
a urina. Um dos principais motivos para isso é o aparecimento de um efeito memória, devido
a um acúmulo de material proveniente da matriz, que ocorre principalmente no injetor do
equipamento. Quando há muito material acumulado no injetor, a entrada dos analitos na
coluna cromatográfica fica comprometida, levando à perda de resposta nas análises, que por
sua vez terão de ser interrompidas para uma manutenção no equipamento.
Nas análises em matrizes biológicas, para um método quantitativo apresentar boa
linearidade, é necessário que o valor do coeficiente de correlação (R
2
) seja superior a 0,99
(HARTMANN, 1998). Nesse trabalho, os valores obtidos para esses coeficientes são muito
superiores a esse mínimo, indicando que os modelos lineares estão bem ajustados (Tabela 13).
O método aqui desenvolvido apresentou uma ampla faixa linear para todos os analitos
estudados. Comparando essa com algumas já publicadas na literatura (Tabela 14), nota-se que
o método aqui desenvolvido apresentou uma linearidade tão boa (ou até melhor) quanto a de
outros métodos que utilizam outras técnicas de extração e/ou derivatização. Dessa forma,
pode-se dizer que o método proposto torna-se uma alternativa muito interessante para análise
de anfetaminas, principalmente devido ao menor custo dos reagentes utilizados.
A sensibilidade do método foi avaliada, baseando-se nos valores de Limite de
Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) calculados a partir das análises realizadas com
as amostras de referência negativa. Em relação a esse parâmetro, pode-se se dizer que o
método apresentou uma sensibilidade muito boa para todos os analitos estudados, como
limites de detecção e de quantificação variando de 0,0140 mg/mL a 15,33 ng/mL, e 0, 0466
ng/mL a 51,10 ng/mL, respectivamente (Tabela 13). Em relação a outros trabalhos publicados
87
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Figura 51. Estudo de linearidade para a) anfetamina, b) metanfetamina, c) norefedrina, d) catina, e)
efedrina, f) pseudoefedrina, g) MDA e h) MDMA
88
na literatura, o método desenvolvido aqui se apresentou tão ou, para alguns casos, ainda mais
sensível que outros já consagrados, o que o coloca como uma boa alternativa para análises
quantitativas, principalmente em controle de dopagem (Tabela 15).
Tabela 13. Linearidade e Sensibilidade para os derivados acéticos das anfetaminas estudadas.
Analito
Linearidade
(ng/ mL)
Equação de ajuste
para o modelo linear
R
2
LD
(ng/ mL)
LQ
(ng/ mL)
Anfetamina
25-1000
y=(0.00408±0.0001)x + (0.95±0.05)
0.99777
6.14
20.45
Metanfetamina
50-1000
y=(0.00152±0.00004)x + (0.50±0.02)
0.99827
10.05
33.49
Norefedrina
10-1000
y=(0.00455±0.00007)x - (0.07±0.03)
0.99896
2.45
8.17
Catina
10-1000
y=(0.00258±0.00005)x + (0.54±0.02)
0.99828
3.01
10.05
Efedrina
50-2000
y=(0.00087±0.00001)x + (0.3±0.01)
0.99928
15.33
51.10
Pseudoefedrina
10-1000
y=(0.044±0.001)x – (1.4±0.5)
0.99712
0.0140
0.0466
MDA
5-2000
y=(0,00459±0,00004)x + (0,11±0,03)
0,99955
0.411
1.37
MDMA
10-2000
y=(0.00465±0.00005)x + (0.06±0.04)
0.99923
2.23
7.45
y= á rea
analito
/ ár ea
padrão interno
e x= concentração do analito
Tabela 14. Estudos de linearidade para anfetaminas encontrados na literatura
Referência
SPYRIDAKI,
2001
HUANG,
2002
NISHIDA,
2003
FORSDAHL,
2004
KANKAANPAEAE,
2004
FRISON,
2005
PIRNAY,
2006
Extração
ELL
SPME
SPE
SPE
ELL
SPE
SPE
Derivatização
MSTFA /
TSIM
HFBCl /
HFBA
PCP
MSTFA
HFBA
TECP
HFBA
Anfetamina
Não
analisa
1,0–1700
ng/mL
12,5–2000
ng/mL
Não
analisa
20–5000 ng/mL
10–2000
ng/mL
Não
analisa
Metanfetamina
Não
analisa
1,0–1700
ng/mL
12,5–2000
ng/mL
Não
analisa
20–5000 ng/mL
10–2000
ng/mL
Não
analisa
Norefedrina
10000–50000
ng/mL
Não
analisa
Não analisa
750–50000
ng/mL
Não
analisa
Não
analisa
Não
analisa
Catina
3000–20000
ng/mL
Não
analisa
Não analisa
250–10000
ng/mL
20–5000 ng/mL
10–2000
ng/mL
Não
analisa
Efedrina
10000–50000
ng/mL
Não
analisa
Não analisa
5000–20000
ng/mL
20–5000 ng/mL
10–2000
ng/mL
Não
analisa
Pseudoefedrina
5000–30000
ng/mL
Não
analisa
Não analisa
750–50000
ng/mL
20–5000 ng/mL
10–2000
ng/mL
Não
analisa
MDA
Não
analisa
Não
analisa
Não analisa
Não
analisa
20–5000 ng/mL
10–2000
ng/mL
25–5000
ng/mL
MDMA
Não
analisa
Não
analisa
Não analisa
Não
analisa
20–5000 ng/mL
10–2000
ng/mL
25–5000
ng/mL
MSTFA = N-metil-N(trimetilsili)-trifuoroacetamida; TSIM = trimetilsililimidazol; PCP = propilcolroformato; TECP= 2,2,2,
tricloetilcloroformato; HFBCl = cloreto hexafluorobutírico; HFBA = anidrido hexafluorobutírico .
89
Tabela 15. Dados de LD e LQ para anfetaminas encontrados na literatura
Referência
HUANG,
2002
NISHIDA,
2003
FORSDAHL,
2004
KANKAANPAEAE,
2004
FRISON,
2005
PIRNAY,
2006
Extração
SPME
SPE
SPE
ELL
SPE
SPE
Derivatização
HFBCl /
HFBA
PCP
MSTFA
HFBA
TECP
HFBA
Anfetamina
0,3 ng/mL
(LD)
1,0 ng/mL
(LQ)
5,0 ng/mL
(LD)
12,5 ng/mL
(LQ)
Não analisa
20 ng/mL
(LQ)
2,0 – 5,0
ng/mL
(LD)
Não
analisa
Metanfetamina
0,3 ng/mL
(LD)
1,0 ng/mL
(LQ)
5,0 ng/mL
(LD)
12,5 ng/mL
(LQ)
Não analisa
20 ng/mL
(LQ)
Não
analisa
Norefedrina
Não analisa
Não analisa
7400 ng/mL
(LQ)
Não analisa
Não analisa
Não
analisa
Catina
Não analisa
Não analisa
1100 ng/mL
(LQ)
20 ng/mL
(LQ)
2,0 – 5,0
ng/mL
(LD)
Não
analisa
Efedrina
Não analisa
Não analisa
1700 ng/mL
(LQ)
20 ng/mL
(LQ)
Não
analisa
Pseudoefedrina
Não analisa
Não analisa
6900 ng/mL
(LQ)
20 ng/mL
(LQ)
Não
analisa
MDA
Não analisa
Não analisa
Não
analisa
20 ng/mL
(LQ)
10 ng/mL
(LD)
25 ng/mL
(LQ)
MDMA
Não analisa
Não analisa
Não
analisa
20 ng/mL
(LQ)
10 ng/mL
(LD)
25 ng/mL
(LQ)
MSTFA = N-met il-N(trimetilsili)-trifuoroacetamida; TSIM = trimetilsililimidazol; PCP = propilcolroformato; TECP= 2,2,2,
tricloetilcloroformato; HFBCl = cloreto hexafluorobutírico; HFBA = anidrido hexafluorobutírico .
4.2.2.2 Precisão Intra-di a e Precisão Inter-di a
A precisão intra-dia está relacionada principalmente com o cuidado no preparo das
amostras e com a estabilidade do equipamento. Os resultados apresentados na Tabela 16
indicam uma precisão intra-dia média superior a 95% (CV inferior a 5%) com poucas
exceções, o que é bastante satisfatório para análises realizadas em matrizes biológicas. Isso
sugere que as amostras foram cuidadosamente preparadas, minimizando o erro experimental.
A precisão inter-dia reflete a variabilidade de um método de um dia para outro. Por
isso, está associada com a preparação das amostras de a flutuação da resposta do equipamento.
Nesse estudo, o método apresentou uma precisão inter-dia média de 95% também com poucas
exceções (Tabela 16). Uma variação de aproximadamente 5% no inter-ensaio para análises
biológicas é considerada muito baixa (até 10% é aceitável) e está associada ao erro
sistemático.
Comparando os coeficientes obtidos tanto para a precisão intra-dia como para precisão
inter-dia com alguns encontrados na literatura mais recente (Tabelas 17 e 18), pode-se dizer
90
que o método desenvolvido aqui apresentou resultados tão satisfatórios quanto outros já
validados. Isso faz do método desenvolvido nesse trabalho uma boa opção para análises em
urina.
Tabela 16. Precisões intra-dia e inter-dia para os derivados acéticos das anfetaminas estudadas
Analito
Concentração
(ng/mL)
Precisão Intra-dia
(% CV)
Precisão Inter-dia
(% CV)
Anfetamina
25
5.87
3.15
100
4.64
4.66
250
2.52
2.77
Metanfetamina
25
n.a.
n.a.
100
3.43
3.92
250
2.51
2.55
Norefedrina
25
5.43
1.96
100
3.99
5.02
250
3.21
1.78
Catina
25
5.95
5.24
100
3.42
2.28
250
2.82
3.99
Efedrina
25
n.a.
n.a.
100
5.11
5.34
250
3.57
5.67
Pseudoefedrina
25
5.49
5.29
100
2.29
3.64
250
1.61
1.76
MDA
25
5.22
6.19
100
3.63
3.63
250
3.15
4.94
MDMA
25
4.34
4.69
100
4.78
4.07
250
3.10
4.77
n.a. = não se aplica
91
Tabela 17. Dados de precisão intra-dia para anfetaminas encontrados na literatura
Referência
SPYRIDAKI,
2001
HUANG,
2002
NISHIDA,
2003
FORSDAHL,
2004
PIRNAY,
2006
Extração
ELL
SPME
SPE
SPE
SPE
Derivatização
MSTFA / TSIM
HFBCl /
HFBA
PCP
MSTFA
HFBA
Anfetamina
Não
analisa
4,55% (50)
2,27% (500)
0,68% (200)
1,84% (1000)
Não
analisa
Não analisa
Metanfetamina
Não
analisa
2,29% (50)
1,56% (500)
3,60% (200)
1,28% (1000)
Não
analisa
Não analisa
Norefedrina
2,0-7,0% (10000)
Não analisa
Não analisa
3,2%
(2500, 5000, 10000)
Não analisa
Catina
2,0-7,0% (10000)
Não analisa
Não analisa
1,2%
(2500, 5000, 10000)
Não analisa
Efedrina
2,0-7,0% (10000)
Não analisa
Não analisa
2,3%
(2500, 5000, 10000)
Não analisa
Pseudoefedrina
2,0-7,0% (10000)
Não analisa
Não analisa
4,1%
(2500, 5000, 10000)
Não analisa
MDA
Não
analisa
Não analisa
Não analisa
Não
analisa
< 6%
MDMA
Não
analisa
Não analisa
Não analisa
Não
analisa
MSTFA = N-m et il-N(trimetilsili)-trifuoroacetamida; TSIM = trimetilsililimidazol; PCP = propilcloroformato; TECP= 2,2,2,
tricloetilcloroformato; HFBCl = cloreto hexafluorobutírico; HFBA = anidrido hexafluorobutírico . As demais referências
foram omitdas pois não informam os valores da precisão intra-dia. Entre parênteses está(ao) especificado(s) a(s)
concentração(ões), em ng/mL na(s) qual(is) o estudo foi realizado.
Tabela 18. Dados de precisão inter-dia para anfetaminas encontrados na literatura
Referência
SPYRIDAKI,
2001
HUANG,
2002
NISHIDA,
2003
KANKAANPAEAE,
2004
FORSDAHL,
2004
PIRNAY,
2006
Extração
ELL
SPME
SPE
ELL
SPE
SPE
Derivatização
MSTFA /
TSIM
HFBCl /
HFBA
PCP
HFBA
MSTFA
HFBA
Anfetamina
Não
analisa
3,76%
(50)
2,38%
(500)
1,35%
(200)
1,11%
(1000)
5,4%
(200)
9,1%
(500)
Não
analisa
Não
analisa
Metanfetamina
Não
analisa
2,44%
(50)
2,83%
(500)
1,85%
(200)
2,91%
(1000)
6,3%
(200)
10,5%
(500)
Não
analisa
Não
analisa
Norefedrina
3,3-9,4%
(10000)
Não
analisa
Não analisa
8,2% (200)
9,7% (500)
10,7% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
Catina
4,0-14%
(10000)
Não
analisa
Não analisa
Não
analisa
10,6% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
Efedrina
1,6-2,9%
(10000)
Não
analisa
Não analisa
10,1% (200)
16,1% (500)
5,7% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
Pseudoefedrina
2,1-3,8%
(10000)
Não
analisa
Não analisa
9,2% (200)
14,13% (500)
7,6% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
MDA
Não
analisa
Não
analisa
Não analisa
5,3% (200)
12,8% (500)
Não
analisa
3,5 -
12,9%
MDMA
Não
analisa
Não
analisa
Não analisa
7,9% (200)
7,6% (500)
Não
analisa
MSTFA = N-m et il-N(trimetilsili)-trifuoroacetamida; TSIM = trimetilsililimidazol; PCP = propilcloroformato; TECP= 2,2,2,
tricloetilcloroformato; HFBCl = cloreto hexafluorobutírico; HFBA = anidrido hexafluorobutírico. Entre parênteses está(ão)
especificado(s) a(s) concentração(ões), em ng/mL na(s) qual(is) o estudo foi realizado.
92
4.2.2.3 Recuperação
O método desenvolvido nesse trabalho também apresentou excelentes índices de
recuperação (Tabela 19). Um dos pontos fundamentais para isso foi a etapa de extração dos
compostos. Os cartuchos de EFS continham uma quantidade de fase estacionária
relativamente alta (100 mg), resultando em uma maior área superficial em contato com a
amostra, o que permitiu uma maior interação entre a fase e os analitos. Com isso, a retenção
dos compostos de interesse foi maior. Outro ponto importante na etapa de extração foi a
otimização da velocidade do eluente. O fluxo para a aspiração dos solventes e da amostra
também foi essencial para um bom índice de recuperação. Se um vácuo mais forte fosse
utilizado, a amostra seria aspirada muito rapidamente, dificultando as interações dos analitos
com a fase estacionária. O mesmo aconteceria durante a passagem do eluente. Esse seria
aspirado muito rapidamente e interagiria pouco (ou não interagiria) com os compostos,
deixando os mesmos retidos no cartucho. Se fosse aplicado um vácuo mais fraco, a eficiência
da extração poderia ser também muito boa. Entretanto, o processo de extração se tornaria
mais lento, o que o inviabilizaria em casos de grandes quantidades de amostras.
Tabela 19. Índices de recuperação para os derivados acéticos das anfetaminas estudadas
Analito
Concentração
(ng/mL)
Recuperação
(%)
Anfetamina
25
92.24
100
93.30
250
94.66
Metanfetamina
25
n.a.
100
91.87
250
92.47
Norefedrina
25
90.51
100
91.50
250
92.40
Catina
25
90.76
100
91.09
250
93.46
Efedrina
25
n.a.
100
89.44
250
90.20
Pseudoefedrina
25
87.39
100
88.76
250
89.14
MDA
25
89.37
100
91.67
250
94.98
MDMA
25
90.49
100
93.00
250
95.89
n.a. = não se aplica
93
Um outro ponto que pode interferir no índice de recuperação de método está
relacionado às condições de operação do equipamento. Quando ocorre acúmulo de material
contaminante (geralmente proveniente da matriz) no equipamento, os ensaios de recuperação
podem ser facilmente comprometidos. Se esse acúmulo de material ocorre na fonte de
ionização, a ionização dos analitos torna-se menos eficiente e, conseqüentemente, a detecção
fica prejudicada. Se o acúmulo ocorre no injetor no cromatógrafo, a entrada dos analitos na
coluna cromatográfica e, conseqüentemente, a separação fica prejudicada. Para evitar que
essas situações interferissem negativamente na validação do método, procurou-se fazer a
manutenção do equipamento periodicamente. O liner (tubo de vidro presente no injetor,
responsável por “conduzir” a amostra até a entrada da coluna) era trocado após 150 injeções,
aproximadamente, e, o íon volume (onde ocorre a ionização dos compostos provenientes do
cromatógrafo), após um mês de uso ininterrupto.
Comparando os resultados obtidos com aqueles da literatura (Tabela 20), pode-se
dizer que o método desenvolvido apresentou índices de recuperação tão bons ou ainda
melhores que aqueles obtidos por outros métodos validados recentemente.
Tabela 20. Dados de recuperação para anfetaminas encontrados na literatura
Referência
SPYRIDAKI,
2001
HUANG,
2002
NISHIDA,
2003
FORSDAHL,
2004
KANKAANPAEAE,
2004
FRISON,
2005
PIRNAY,
2006
Extração
ELL
SPME
SPE
SPE
ELL
SPE
SPE
Derivatização
MSTFA /
TSIM
HFBCl /
HFBA
PCP
MSTFA
HFBA
TECP
HFBA
Anfetamima
Não
analisa
7,87%
(50)
10,39%
(500)
88,2%
(1000)
Não
analisa
99% (500)
80-87%
(100)
Não
analisa
Metanfetamina
Não
analisa
8,61%
(50)
11,56%
(500)
92,5%
(1000)
Não
analisa
90% (500)
80-87%
(100)
Não
analisa
Catina
86-119%
(10000)
Não
analisa
Não analisa
91% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
Não
analisa
Não
analisa
Norefedrina
Não
analisa
Não analisa
93% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
80-87%
(100)
Não
analisa
Pseudoefedrina
Não
analisa
Não analisa
84% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
80-87%
(100)
Não
analisa
Efedrina
Não
analisa
Não analisa
85% (2500,
5000, 10000)
Não
analisa
80-87%
(100)
Não
analisa
MDA
Não
analisa
Não
analisa
Não analisa
Não
analisa
98% (500)
80-87%
(100)
90-117%
MDMA
Não
analisa
Não
analisa
Não analisa
Não
analisa
89% (500)
80-87%
(100)
MSTFA = N-met il-N(trimetilsili)-trifuoroacetamida; TSIM = trimetilsililimidazol; PCP = propilcolroformato; TECP= 2,2,2,
tricloetilcloroformato; HFBCl = cloreto hexafluorobutírico; HFBA = anidrido hexafluorobutírico . Entre parênteses está(ao)
especificado(s) a(s) concentração(ões), em ng/mL na(s) qual(is) o estudo foi realizado.
94
4.2.2.4 Estabilidade da amostra (congelamento / descongelamento)
No estudo de estabilidade da amostra, observou-se que, após o primeiro
descongelamento das amostras, houve uma redução significativa na concentração dos analitos
(Figura 52). Isso se deve principalmente ao fato de que, quando uma amostra de urina é
descongelada, parte do muco e das proteínas presentes na mesma precipitam e, possivelmente,
parte dos analitos presentes na matriz precipitam junto com esse material. Isso justificaria a
queda da concentração após o primeiro descongelamento. Após o segundo e o terceiro
descongelamentos, como há pouca precipitação de material biológico, a quantidade de analito
que precipitaria seria insignificante, o que explicaria a pequena variação após os demais ciclos.
Embora tenha ocorrido uma redução inicial significativa na concentração dos analitos
(refletida na razão área
analito
/área
padrão interno
), analisando-se a variação total da concentração de
cada um ao final do ensaio, observa-se que tal variação encontra-se dentro do limite aceitável
de trabalho (inferior a 20%) (HARTMANN, 1998). Portanto, pode-se dizer que mesmo
quando as amostras já foram congeladas mais de uma vez, ainda é possível realizar as análises,
embora esse não seja o procedimento mais aconselhável.
Na literatura, apenas o trabalho realizado por Pirnay e colaboradores (PIRNAY, 2006)
apresentou um estudo de estabilidade da amostra e nesse, o valor encontrado foi inferior a
20%.
95
Figura 52. Estudo de estabilidade dos derivados acéticos das anfetaminas
96
4.2.2.4 Considerações Finais
1- Nos estudos de precisão intra- e inter-dia, recuperação e estabilidade das amostras,
as amostras cobriram apenas concentrações baixas e médias (relativas à faixa de linearidade).
Isso aconteceu porque, durante as análises das replicatas em concentrações mais elevadas
(500 ou 1000 ng/mL), observou-se um alargamento do sinal cromatográfico e, ao mesmo
tempo, uma redução na razão sinal/ruído correspondente a esse pico. Sempre que isso
acontecia, a bateria de análises tinha que ser interrompida para que se fizesse uma
manutenção preventiva no equipamento. Esse procedimento de “emergência” prejudicava
muito os estudos como o de Precisão Intra-dia e de Recuperação, os quais envolviam um
número maior de replicatas.
2 - Os resultados obtidos com o método apresentado nesse trabalho são coerentes com
aqueles obtidos por outros métodos descritos na literatura recente. Isso sugere que o novo
método proposto é tão eficiente como outros já publicados. Entretanto, ele ainda apresenta
uma grande vantagem no que se refere à redução de custos relacionados com a etapa de
preparação de amostra, uma vez que usa reagentes comuns em grau analítico como
derivatizantes.
4.2.3 Análise confirmatória do screening: aplicação do método de CG-EM para análises
de amostras reais
Todas as amostras analisadas pelo método de screening foram submetidas à
confirmação e quantificação por CG-EM. As curvas de calibração, na faixa de 50 a 500
ng/mL, utilizadas para os cálculos de quantificação apresentaram as equações mostradas na
Tabela 21.
Tabela 21. Curvas de calibração utilizadas para a quantificação das anfetaminas
Analito
Equação da reta
R
2
Anfetamina
(0,0041±0,0001)x + (1,01±0,03)
0,99862
Metanfetamina
(0,00148±0,00009)x + (0,50±0,03)
0,99237
Norefedrina
(0,0046±0.0002)x - (0,07±0.03)
0,99476
Catina
(0,00268±0.00005)x + (0,54±0.02)
0,99197
Efedrina
(0,00082±0.00001)x + (0,310±0.003)
0,99961
Pseudoefedrina
(0.042±0.002)x – (1.54±0.7)
0,99408
MDA
(0,00437±0,00008)x + (0,14±0,02)
0,99930
MDMA
(0,0044±0.0002)x + (0,08±0.07)
0,99422
Com os resultados obtidos nas análises e, utilizando as equações acima, as
concentrações de cada anfetamina nas amostras foram calculadas (Tabela 22). Confrontando
os valores obtidos aqui com os resultados apresentados na Tabela 11, foi possível avaliar a
confiabilidade do método de screening proposto nesse trabalho.
Tabela 22. Concentrações das anfetaminas encontradas em amostras reais de urina (em ng/mL)
Amostra
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
Amostra
ANF
MET
NOR
CAT
EFE
PSE
MDA
MDMA
1
0 (+)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
30
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
2
0 (-)
0 (-)
0 (+)
401 (+)
352 (+)
10735 (+)
0 (-)
0 (-)
31
0 (-)
0 (-)
0 (+)
395 (+)
2668 (+)
8638 (+)
0 (-)
0 (-)
3
0 (-)
0 (-)
0 (+)
0 (+)
0 (+)
0 (+)
0 (-)
0 (-)
32
110000 (+)
0 (-)
0 (-)
89 (-)
25292 (+)
447 (+)
198000 (+)
436700 (+)
4
0 (-)
0 (-)
0 (+)
358 (+)
944 (+)
4928 (+)
0 (-)
0 (-)
33
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
5
0 (-)
0 (-)
0 (+)
620 (+)
3821 (+)
17496 (+)
0 (-)
0 (-)
34
0 (-)
0 (-)
0 (+)
125 (+)
844 (+)
4921 (+)
0 (-)
0 (+)
6
0 (-)
0 (-)
0 (+)
413 (+)
1229 (+)
13313 (+)
0 (-)
0 (-)
35
0 (-)
0 (-)
0 (+)
512 (+)
4657 (+)
33703 (+)
0 (-)
0 (-)
7
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
36
0 (-)
0 (-)
0 (+)
963 (+)
4307 (+)
14495 (+)
0 (-)
0 (-)
8
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
37
0 (-)
0 (-)
0 (-)
82 (-)
1917 (+)
5186 (+)
0 (-)
0 (-)
9
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
38
0 (-)
0 (-)
0 (-)
90 (+)
837 ( + )
509 (+)
0 (-)
0 (-)
10
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
39
0 (-)
0 (-)
0 (+)
2967 (+)
3746 (+)
18529 (+)
0 (-)
0 (-)
11
0 (-)
0 (-)
0 (+)
412 (+)
1917 (+)
5186 (+)
0 (-)
0 (-)
40
0 (-)
0 (-)
0 (+)
2761 (+)
4512 (+)
13085 (+)
0 (-)
0 (-)
12
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
41
0 (-)
0 (-)
0 (+)
469 (+)
485 (+)
4580 (+)
0 (-)
0 (-)
13
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
42
0 (-)
0 (-)
0 (+)
150 (+)
516 (+)
389 (+)
0 (-)
0 (-)
14
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
43
0 (-)
0 (-)
0 (+)
997 (+)
189 (+)
10340 (+)
0 (-)
0 (-)
15
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
44
0 (-)
0 (-)
0 (+)
496 (+)
216 (+)
4921 (+)
0 (-)
0 (-)
16
0 (-)
0 (-)
0 (+)
0 (+)
533 (+)
2460 (+)
0 (-)
0 (-)
45
0 (-)
0 (-)
0 (+)
125 (+)
1817 (+)
8270 (+)
0 (-)
0 (-)
17
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
46
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
18
0 (-)
0 (-)
0 (+)
2083 (+)
13681 (+)
16 750 ( + )
0 (-)
0 (-)
47
0 (-)
0 (-)
0 (+)
725 (+)
584 (+)
14851 (+)
0 (-)
0 (-)
19
0 (-)
0 (-)
0 (+)
2547 (+)
11809 (+)
28757 (+)
0 (-)
0 (-)
48
126000 (+)
0 (-)
0 (-)
73 (-)
20522 (+)
406 (+)
193200 (+)
501600 (+)
20
0 (-)
0 (+)
0 (+)
640 (+)
384 (+)
1854 (+)
0 (-)
0 (-)
49
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
298 (+)
0(-)
0 (-)
0 (-)
21
0 (-)
0 (-)
0 (+)
1292 (+)
4210 (+)
6795 (+)
0 (-)
0 (-)
50
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
16548(-)
22
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
51
0 (-)
0 (-)
0 (+)
670(+)
1565 (+)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
23
0 (-)
0 (-)
0 (+)
640 (+)
384 (+)
1854 (+)
0 (-)
0 (-)
52
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (+)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
24
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
53
0 (-)
0 (-)
0 (+)
515 (+)
1785 (+)
19650 (+)
0 (-)
0 (-)
25
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
54
0 (-)
0 (-)
0 (+)
3279 (+)
1167 (+)
8485 (+)
0 (-)
0 (-)
26
0 (-)
0 (-)
0 (+)
111 (+)
356 (+)
5575 (+)
0 (-)
0 (-)
55
0 (-)
0 (-)
0 (+)
5127 (+)
1411 (+)
4169 (+)
0 (-)
0 (-)
27
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
56
0 (-)
0 (-)
0 (+)
327 (+)
1173 (+)
6582 (+)
0 (-)
0 (-)
28
0 (-)
0 (-)
0 (+)
162 (+)
199 (+)
10202 (+)
0 (-)
0 (-)
57
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
0 (-)
29
0 (-)
0 (-)
0 (+)
1395 (+)
922(+)
16437 (+)
0 (-)
0 (-)
58
0 (-)
0 (-)
0 (+)
145 (+)
216 (+)
7795 (+)
0 (-)
0 (-)
ANF = anfetamina; MET = metanfetamina; NOR = norefedrina; CAT = catina; EFE = efedrina; PSE = pseudoefedrina; MDA = metilenodioxianfetamina; MDMA = metilenodioximetanfetamina
Em negrito: amostras classificadas como “positivas”embora não contivesse o analito de interesse. Os valores entre parênteses indicam o resultado do screening. Em negrito itálico: amostras que
foram confirmadas como negativas porque a concentração encontrada foi inferior ao limite mínimo de desempenho. Em itálico, a única amostra que foi considerada um “falso-positivo”porque a
concentração encontrada está abaixo do limite mínimo d e des emp en ho .
98
Enquanto para a norefedrina, muitos casos foram considerados falso-positivos, para a
catina foram poucos, sendo apenas um devido ao valor de corte do método. Isso aconteceu
porque o método de screening baseado em espectrometria de massas MS/MS não é seletivo o
suficiente para distinguir diasteroisômeros. Para anfetamina, metanfetamina e catina, o
método se mostrou bastante confiável, uma vez que apresentou apenas um resultado falso-
positivo. Em relação às efedrinas, ele também o foi: apenas dois casos falsos-positivos para a
efedrina e três para a pseudoefedrina. Em relação às metanfetaminas, o método de screening
tamém apresentou boa cofiabilidade, pois houve apenas um caso falso-positivo para MDMA.
De forma geral, pode-se dizer que o método de screening desenvolvido apresentou
uma confiabilidade muito boa, uma vez que, apesar da quantidade relativamente alta de
resultados falso-positivos, não houve nenhum caso de resultado falso-negativo.
4.3 Estudo de cinética de excreção / Estudo comportamental
4.3.1 Estudo de cinética de excreção
As análises das amostras dos voluntários que ingeriram placebo não apresentaram
traços de anfetaminas. Com os resultados das análises quantitativas das amostras obtidas de
voluntários que ingeriram placebo, construiu-se uma curva da excreção de pseudoefedrina
e/ou metabólitos em função do tempo (Figura 53). Entretanto, deve-se ressaltar aqui que o
número de amostras utilizadas para se fazer esse estudo de cinética de excreção não é
suficiente para permitir um estudo conclusivo quanto ao metabolismo de efedrinas (TSENG,
2006).
A pseudoefedrina é eliminada na urina principalmente na forma ativa e não
metabolizada (a própria pseudoefedrina). O nível mais alto de pseudoefedrina na urina
aconteceu 6 horas após a ingestão do medicamento, exceto em um caso (voluntário 2), no qual
a maior quantidade de pseudoefedrina foi encontrada 2 horas mais tarde. Esses resultados
estão de acordo com dados já consagrados na literatura (BENEZRA, 1979). A catina, o
metabólito majoritário da pseudoefedrina, apresentou um comportamento diferente quanto à
excreção: uma curva ligeiramente ascendente para todos os voluntários.
99
Figura 53. Estudo de cinética de excreção de pseudoefedrina em urina
100
Em algumas situações em particular (voluntários 3 e 7), a concentração de efedrina foi
relativamente alta. Na presença de quantidades catalíticas de anidrido acético glacial e
piridina, a pseudoefedrina pode ser facilmente convertida em efedrina, especialmente em altas
condições de temperatura (BENTLEY, 2003). Dessa forma, esse “excesso” de efedrina deve
ser classificado como um artefato, formado durante a etapa de preparação e injeção da
amostra no cromatógrafo.
4.3.2 Estudo Comportamental
Após minuciosa análise quantitativa, qualitativa, interpretação global de cada exame e,
subseqüentemente, a análise comparativa dos exames de cada voluntário que ingeriu
pseudoefedrina em relação àqueles que ingeriram placebo, foi verificado que todos aqueles
que fizeram uso do medicamento sofreram alterações em seus níveis de tônus vital,
agressividade e emotividade:
• tônus vital: os níveis endógenos e reacionais subiram em níveis consideráveis e, ao final
do teste, evidenciaram uma tendência à fadiga, uma vez que sofreram quedas bruscas em seus
escores.
• agressividade: os níveis endógenos e reacionais diminuíram notadamente e mantiveram
seus escores do início ao fim do teste.
• emotividade: os níveis endógenos e reacionais subiram de maneira expressiva e mais
evidente em relação às duas mensurações anteriores. Tal emotividade deve ser compreendida
não na ordem de vivência de sentimentos, mas como a capacidade do sujeito de sentir com
profundidade as impressões e, quando percebidas intensamente, ocasionam o choque emotivo
que desencadeia uma reação global, tanto orgânica quanto psíquica.
Assim, a partir da análise conjunta desses dados, pode-se inferir que a pseudoefedrina
promove um aumento importante do tônus postural do indivíduo e tem sua ação
potencializada graças à captação dos níveis de agressividade (por isso seus escores
diminuídos) e o aumento considerável dos níveis de emotividade, que dão ao indivíduo mais
“vitalidade” para a ação. Entretanto, após essa “explosão energética”, tem-se uma queda
rápida desse tônus e subseqüente fadiga.
101
5 Conclusões
Em relação ao método de screening, baseado em espectrometria de massas e
desenvolvido nesse trabalho, pode-se dizer que o mesmo é uma boa opção para triagem
sistemática em análises de controle de dopagem, pois atende aos principais requisitos. O
tempo de análise é curto (aproximadamente 2 minutos), o que torna possível a sua aplicação a
uma grande quantidade de amostra, como acontece em procedimentos de rotina. A preparação
das amostras limita-se a um simples processo de diluição, o que reduz consideravelmente, não
apenas o tempo gasto nessa etapa como também a quantidade de solventes a serem
descartados. E o mais importante, esse método apresentou uma boa confiabilidade (exceto
para o par de isômeros norefedrina/catina), haja vista a baixa incidência de resultados “falso-
positivos” e “falso-negativos”. Por outro lado, a utilização da espectrometria de massas como
técnica para screening ainda está longe de se tornar uma realidade, porque os bons
equipamentos ainda apresentam um custo elevado.
Em relação ao método confirmatório baseado em cromatografia a gás, acoplada à
espectrometria de massas, conclui-se que o mesmo consiste em uma ótima opção para
análises de controle de dopagem. As etapas de preparação de amostra foram bastante simples.
A extração em fase sólida (EFS) é eficiente, rápida (necessita de apenas alguns minutos),
dispensa muitas etapas (evitando, assim, a manipulação excessiva das amostras), e utiliza
pequena quantidade de solvente, reduzindo a quantidade de material a ser descartado. A
derivatização com anidrido acético em piridina, além de eficiente, apresenta custo reduzido,
por utilizar reagentes em grau analítico, que podem ser encontrados na maioria dos
laboratórios de pesquisa e análises de rotina. A análise, por sua vez, não é um processo
considerado rápido para cromatografia. Entretanto, o método desenvolvido apresentou
elevada sensibilidade, além de bons índices de precisão e recuperação. Embora não tenha sido
feito qualquer estudo de seletividade, pode-se dizer que, nas condições de trabalho em que foi
desenvolvido (utilizando pool de urina e analisando em modo SIM), o mesmo foi bastante
seletivo, pois apresentou pouco ou quase nenhum interferente.
Finalizando, pode-ser dizer que tanto o método de screening quanto o método
confirmatório que foram desenvolvidos nesse trabalho se equiparam aqueles apresentados
recentemente na literatura.
102
6 Referências Bibliográficas
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