ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
CRISTIANE OLIVEIRA VALENTE
DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR
A BASE DE HEMINA PARA ANÁLISE DE AMODIAQUINA
EM LEITE MATERNO
São Cristóvão - Sergipe
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR
A BASE DE HEMINA PARA ANÁLISE DE AMODIAQUINA
EM LEITE MATERNO
CRISTIANE OLIVEIRA VALENTE
Dissertação apresentada ao
Núcleo de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal
de Sergipe como um dos
requisitos para obtenção do titulo
de Mestre em Química.
ORIENTADORA: Profª Dra. MARIA de LARA P. de M. A. BEATRIZ
São Cristóvão
2010
ads:
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
V154d
Valente, Cristiane Oliveira
Desenvolvimento de um biossensor a base de hemina para
análise de amodiaquina em leite materno / Cristiane Oliveira
Valente. – São Cristóvão, 2010.
Vii, 66 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Química) – Programa de Pós-
Graduação em Química, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e
Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2010.
Orientador: Profª. Drª. Maria de Lara P. de M. A. Beatriz
1. Biossensor. 2. Analise química. 3. Voltametria. 4. Hemina.
5. Amodiaquina. 4. Leite materno. I. Título.
CDU 543.55:612.664.1
"Aquilo que sabemos é uma gota,
o que ignoramos é um oceano”.
(Isaac Newton)
À minha filha Giovanna e ao meu
marido Daniel pelo apoio e
incentivo.
E aos meus pais Wagner e Maria
pela minha existência.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
• À Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para
superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e me suprir em
todas as minhas necessidades.
• Ao meu marido pela paciência, incentivo e companheirismo.
• Aos meus pais e a minha família, a qual amo muito, pelo carinho e por fazerem
parte da minha vida, em particular a minha mãe que me ajudou a dar
continuidade a esse mestrado.
• À minha orientadora: PROFª DRA. MARIA DE LARA P. DE M. A. BEATRIZ pela
paciência, me mostrar o caminho da ciência, por sua ajuda nos momentos mais
críticos, por acreditar em mim e no futuro deste projeto e contribuir para o meu
crescimento profissional e por ser também um exemplo de profissional e de
pessoa a ser seguido.
• Aos amigos que fizeram parte desses momentos sempre me ajudando e
incentivando.
• Aos meus colegas de laboratório que sempre estiveram do meu lado dando
força e apoio.
• A todos os colegas e professores da pós-graduação em Química pelo convívio
e aprendizado.
• Ao Governo do Estado de Sergipe e a Prefeitura Municipal de Estância pela
liberação para a realização deste curso.
•
Enfim a todos que direta ou indiretamente colaboraram para realização desse
trabalho, os nossos agradecimentos.
Sumário
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. i
LISTA DE TABELAS ........................................................................................... iii
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS ........................................................... iv
LISTA DE SÍMBOLOS ......................................................................................... v
RESUMO ............................................................................................................ vi
ABSTRACT ........................................................................................................ vii
I-INTRODUÇÃO .................................................................................................. 1
1.1- A malária e os antimaláricos ................................................................................... 1
1.2- A interação entre os antimaláricos e a hemina ...................................................... 4
1.3- Amodiaquina, um antimalárico aminoquinolínico ................................................... 7
1.4 - O uso de antimaláricos durante a lactação ......................................................... 11
II-FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ..................................................................... 13
2.1-Voltametria ............................................................................................................. 13
2.1.1- Voltametria cíclica (VC) .................................................................................. 15
2.1.2 -Voltametria de pulso diferencial (DPV) .......................................................... 17
2.1.3- Voltametria de onda quadrada (VOQ) ........................................................... 18
2.2- Eletrodos de pasta de carbono modificados ........................................................ 19
2.3- Uso da hemina como agente modificador. ........................................................... 22
III- OBJETIVO .................................................................................................. 24
3.1- Geral ...................................................................................................................... 24
3.2- Específicos ............................................................................................................ 24
IV- METODOLOGIA .......................................................................................... 25
4.1 - Reagentes e soluções ......................................................................................... 25
4.2 - Instrumentação .................................................................................................... 26
4.3 - Otimização da proporção hemina/grafite............................................................27
4.4-Montagem dos eletrodos ....................................................................................... 27
4.5- Medidas de pH ...................................................................................................... 28
4.6- Medidas espectrofotométricas .............................................................................. 28
4.7- Preparação do biossensor .................................................................................... 28
4.8- Otimização das condições voltamétricas de análise ............................................ 29
4.9- Coleta e preparo da amostra de leite materno ..................................................... 29
V- RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 30
5.1 Voltametria cíclica ................................................................................................. 30
5.2-Desenvolvimento dos métodos eletroanalíticos .................................................... 32
5.2.1 -Estudo da porcentagem de hemina na pasta de carbono ............................ 32
5.2.2 -Influência do pH do meio ............................................................................... 33
5.2.3-Influência da amplitude ................................................................................... 35
5.2.4-Influência da velocidade de varredura ............................................................ 35
5.2.5-Influência da concentração do analito ............................................................ 36
5.3-Voltametria de onda quadrada em biossensor de hemina ................................... 39
5.3.1- Influência da freqüência ................................................................................. 39
5.3.2- Influência da amplitude .................................................................................. 40
5.3.3-Influência do incremento de varredura ........................................................... 41
5.3.4-Influência da concentração do analito ............................................................ 42
5.4- Aplicação da metodologia para determinação de amodiaquina em leite materno
...................................................................................................................................... 45
5.5 - Estudo de interferentes ........................................................................................ 49
5.6- Método comparativo: uv-vis .................................................................................. 50
VI- CONCLUSÃO .............................................................................................. 54
VII-REFERÊNCIAS ........................................................................................... 55
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mapa mundial de ocorrência de malária...............................................2
Figura 2: Estrutura molecular da amodiaquina....................................................7
Figura 3. (a) Sinal de excitação para a voltametria cíclica e, (b) Voltamograma
cíclico para um processo redox reversível.........................................................16
Figura 4. Representação esquemática da aplicação do potencial em função do
tempo em polarografia de pulso diferencial. (a) Em instrumentos analógicos; (b)
Em instrumentos digitais. A corrente é amostrada em S1 e S2 e a diferença
entre eles é que é registrada: I = I
s2
– I
s1
............................................................18
Figura 5. Seqüência potencial vs. Tempo (E vs t) usada em Voltametria de
onda quadrada ...................................................................................................19
Figura 6. Estrutura química da hemina..............................................................22
Figura 7. Célula polarográfica/voltamétrica de três eletrodos. Esquema
mostrando a célula conectada a um sistema potenciostatico............................26
Figura 8. Célula eletroquímica utilizada nos ensaios de voltametria, com o
eletrodo de trabalho, de referência e o auxiliar, imersos no eletrólito
suporte................................................................................................................27
Figura 9. Esquema de construção do biossensor a base de
hemina................................................................................................................28
Figura 10. Voltamogramas cíclicos de uma solução contendo 1,0 x 10-3 mol L
-1
de amodiaquina em solução BR pH 7,0 com velocidade de varredura variando
de 20 a 100mV s
-1
.........................................................................................................30
Figura 11. Variação da resolução de pico da amodiaquina de concentração
1,0 x 10
-3
mol L
-1
em diferentes porcentagens de hemina no eletrodo de pasta
de carbono quimicamente modificado.
∆E
= 40mV, v= 20mV s
-1
..........................33
Figura 12. Voltamogramas de pulso diferencial da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em diferentes pHs em eletrodo modificado com
10% de hemina.
∆E
=40mV, v= 20 mV s
-1
................................................................34
Figura 13. Intensidade de corrente da amodiaquina em função do pH na
concentração de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em soluções BR em eletrodo modificado com
10% de hemina.
∆E
=40mV, v= 20 mV s
-1
................................................................34
ii
Figura 14. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em eletrodo modificado
com 10% de hemina em função da amplitude v= 20 mV s
-1
..................................35
.
Figura 15. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em função da velocidade
de varredura em eletrodo modificado com 10% de hemina.
∆E
=100Mv...........36
Figura 16. Curva analítica da amodiaquina em solução B-R pH 7,0 por
voltametria de pulso diferencial.
∆E
= 100 mV,
v
= 80 mV s
-1
.................................37
Figura 17. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em eletrodo modificado
com 10% de hemina em função da freqüência
∆E
= 100mV v= 80 mV s
-1
.......40
Figura 18. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em eletrodo modificado
com 10% de hemina em função da amplitude v= 80 mV s
-1
..............................41
Figura 19. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em função da velocidade
de varredura em eletrodo modificado com 10% de hemina.
∆E
=200 mV e F =
150 Hz................................................................................................................42
Figura 20. Curva de calibração obtida para amodiaquina em solução BR pH 7,0
por voltametria de onda quadrada. F = 150 Hz
∆E
= 200mV, v= 40 mV s
-1
........43
Figura 21. Voltamogramas de onda quadrada da determinação de amodiaquina
em leite materno em solução BR pH 7,0 com biossensor de hemina. Condições:
F = 150 Hz
∆E
= 200mV, v= 40 mV s
-1
.....................................................................47
Figura 22. Curva analítica da amodiaquina em amostra de leite materno em
solução BR pH 7,0 com biossensor de hemina. Condições: F = 150 Hz
∆E
=
200mV, v= 40 mV s
-1
...................................................................................................48
Figura 23: Espectros de absorção para a determinação de amodiaquina em
leite materno.......................................................................................................51
Figura 24: Curva analítica para determinação da amodiaquina em leite materno
em solução BR pH 6,0 em UV -Vis.....................................................................52
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais antimalariais que atuam na inibição da hemozoína.............6
Tabela 2. Otimização dos parâmetros da análise de amodiaquina em
biossensor de hemina pela técnica de voltametria de pulso diferencial.............38
Tabela 3. Resultado dos valores de limite de detecção e quantificação para a
amodiaquina, utilizando a técnica de pulso diferencial com ECME...................39
Tabela 4. Otimização dos parâmetros da análise de amodiaquina em
biossensor de hemina pela técnica de voltametria de onda quadrada...............44
Tabela 5. Resultado dos valores de limite de detecção e quantificação para a
amodiaquina, utilizando a técnica de onda quadrada........................................44
Tabela 6. Resumo dos resultados analíticos obtidos para cada método
desenvolvido para a determinação de amodiaquina em biossensor de
hemina................................................................................................................44
Tabela 7. Tipos de leite durante a fase de lactação...........................................45
Tabela 8. Composição do leite materno (100mL)..............................................46
Tabela 9. Resultado dos valores de limite de detecção e quantificação para
determinação de amodiaquina em leite materno, utilizando a técnica de onda
quadrada.............................................................................................................49
Tabela 10. Resultados analiticos obtidos para o estudo de interferentes de cada
composto analisado em biossensor de hemina..................................................50
Tabela 11. Resultados para o estudo de comparação da precisão de métodos
usados para a análise de amodiaquina em leite materno..................................53
iv
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS
AAP - Academia Americana de Pediatria
AMQ - amodiaquina
ASV - Anodic Stripping Voltammetry
ASV - voltametria de redissolução anódica
BR - Britton Robinson
CE - Condutividade Elétrica
CLAE-UV - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-ultravioleta
CONAMA - Conselho Nacional do Meio Ambiente
CSV - Cathodic Stripping Voltammetry
CSV - voltametria de redissolução catódica
CV- Coeficiente de variação
DAQ - desetilamodiaquina
DDT - Dicloro Difenil Tricloroetano
DME - Eletrodo gotejante de mercúrio
DP- Desvio padrão
ECME - Eletrodo de carbono modificado com hemina
ECS - Eletrodo de Calomelano Saturado
ECV - Eletrodo de Carbono Vítreo
EPC - Eletrodo de Pasta de Carbono
EPCM - Eletrodos de pasta de carbono modificados
EPCME - Eletrodo de pasta de carbono modificado com hemina
EQM - Eletrodo Quimicamente Modificado
FUNASA - Fundação Nacional da Saúde
GC / MSD - Gas Chromatography / Mass Spectrometry Detector
IPA - incidência parasitária anual
LD - Limite de Detecção
LLE - Liquid / Liquid Extraction
LQ - Limite de Quantificação
MS - Ministério da Saúde
NPV - Voltametria de pulso normal
OMS - Organização Mundial da Saúde
ONU - Organização das Nações Unidas
ppb - Parte por Bilhão
RNA-Ácido ribonucleico
Sb - Desvio padrão
SI - Sistema Internacional
SMDE - Static Mercury Droping Electrode
SNVS - Secretaria Nacional de Vigilância Sanitária
SPE - Solid / Phase Extraction
UV-Vis - ultravioleta - visível
VC . Voltametria Cíclica
VOQ - voltametria de onda quadrada
VPD . Voltametria de Pulso Diferencial
WHO - World Health Organization
v
LISTA DE SÍMBOLOS
A - Área do eletrodo
a - Ordenada na origem da reta de regressão linear
Ag - Prata
AgCl - Cloreto de prata
b - Coeficiente angular da reta
C - Concentração, mmol L
-1
ou mol L
-1
D - Coeficiente de difusão das espécies eletroativas
e- - Elétron
Eº - Potencial padrão
E
1/2
- Potencial de meia onda, mV ou V
E
p
- Potencial de pico, mV ou V
E
pc
- Potencial de pico, mV ou V
F - Constante de Faraday, C mol
-1
f - Frequência (s
-1
)
g - gramas
I
pc
- Corrente de pico, µA ou A
k – Constante
Kcal - quilocalorias
n - Quantidade de matéria de elétrons por mol de substância
N - Número de pontos da curva de calibração
N
2
- Nitrogênio molecular
r - Coeficiente de correlação
t - Intervalo de tempo de queda de uma gota de mercúrio, s
T - Temperatura absoluta, K
v - Velocidade de varredura, mV s
-1
∆E - Amplitude de pulso, mV ou V
% - porcentagem
ºC – graus celsius
vi
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia eletroanalítica
para a determinação de amodiaquina em leite materno, utilizando um
biossensor a base de hemina, uma porfirina presente na hemoglobina e
responável pelo transporte de oxigênio. A amodiaquina, por sua vez, é um
derivado 4-aminoquinoquinolínico amplamente utilizada no tratamento da
malária, com propriedades antiinflamatória e antipirética. Sua transferência
para o leite materno é moderada, porém mesmo em baixas dosagens pode ser
considerada prejudicial ao lactante. A caracterização e a preparo do biossensor
foi a primeira etapa deste trabalho. O comportamento eletroquímico do
biossensor foi explorado pelo emprego da técnica voltametria de pulso
diferencial. As melhores respostas voltamétricas foram obtidas com a
composição da pasta de carbono contendo 10% de hemina em solução-tampão
Britton-Robson de pH 7,0. Para o estudo do comportamento eletródico da
amodiaquina foi utilizada a técnica de voltametria cíclica, que apresentou em
meio neutro um processo de oxidação em 0,054 V vs. Ag/AgCl na velocidade
de 20 mV s
-1
em pH 7,0. As técnicas voltamétricas utilizadas para o
desenvolvimento da metodologia foram a voltametria de pulso diferencial e a
voltametria de onda quadrada. Nesse estudo as condições otimizadas
encontradas foram: pH = 7; velocidade de varredura = 40 mV s
-1
; amplitude =
200 mV e freqüência = 150 Hz, onde os parâmetros indicaram a voltametria de
onda quadrada como a melhor técnica para a determinação voltamétrica da
amodiaquina por apresentar melhor desempenho. Os limites de detecção e
quantificação obtidos na determinação da amodiaquina por voltametria de onda
quadrada foram de 8,7 x 10
-7
mol L
-1
e 2,9 x 10
-6
mol L
-1
, respectivamente. Após
a otimização de todos os parâmetros relevantes, o método analítico
desenvolvido foi aplicado com sucesso em amostras de leite materno. A
concentração de amodiaquina analisada foi de 1,7 x 10
-5
mol L
-1
. O método
desenvolvido mostrou-se eficiente e reprodutível na determinação de
amodiaquina presente no leite materno, não sendo necessário qualquer
tratamento prévio da amostra.
Palavras-chave: leite materno, amodiaquina, voltametria de onda quadrada,
hemina.
vii
ABSTRACT
This research had as main objective to develop an electroanalytical procedure
for the determination of amodiaquine in human milk, using a carbon paste
electrode modified with hemin, hemoglobin functional group responsible for
transporting oxygen. The amodiaquine (a derivative 4-aminoquinoquinolínico) is
a drug used to treat malaria with anti-inflammatory and antipyretic
properties. The characterization and preparation of carbon paste electrode
modified with hemin was investigated. The electrochemical behavior of modified
electrode was explored using differential pulse voltammetry. The best
voltammetric response was obtained for the composition of carbon paste 10%
hemin solution in Britton-Robson buffer pH 7.0. To study the electrochemical
behavior of amodiaquine was used the technique of cyclic voltammetry, which
presented in a neutral medium oxidation process at 0.054 V vs. Ag / AgCl at a
rate of 20 mV s
-1
. The voltammetric techniques used to develop the
methodology where the differential pulse voltammetry and square wave
voltammetry. In this study the optimized conditions were: pH 7, scan rate = 40
mV s
-1
, amplitude = 200 mV and frequency = 150 Hz, where the parameters
indicated the square wave voltammetry as the best technique for determining
the voltammetric amodiaquine has a minor detection limit. The limits of detection
and quantification were obtained in the determination of 8.7 x 10
-7
mol L
-1
and
2.9 x 10
-6
mol L
-1
, respectively. After optimization of all relevant parameters, the
analytical method developed was successfully applied in samples of breast
milk. The concentration of amodiaquine obtained was 1.7 x 10
-5
mol L
-1
. The
method was efficient and reproducible in the determination of amodiaquine
present in breast milk, there is no need any pretreatment of the sample.
Key words: breastfeeding, amodiaquine, square wave voltammetry, hemin
1
I-INTRODUÇÃO
1.1- A malária e os antimaláricos
A malária é considerada uma das doenças tropicais mais devastadoras,
sendo a causa de morte de 1 milhão de pessoas por ano. No século XX, a
malária foi erradicada de vários países de clima temperado. Entretanto,
atualmente ainda continua sendo um dos problemas de saúde coletiva mais
importante, pois apesar do grande desenvolvimento científico e tecnológico
alcançado pela humanidade, muitos países ainda não conseguiram controlar
essa doença, principalmente os países das regiões tropicais e subtropicais,
onde ainda se encontrar um número considerável de casos.
A doença é causada por protozoários do gênero Plasmodium
transmitidos ao homem por fêmeas dos mosquitos do gênero Anopheles
infectadas. Somente 4 de aproximadamente 100 espécies desses protozoários
são responsáveis por infectar seres humanos: P. falciparum; P. vivax; P. ovale e
P. malariae, sendo o P. falciparum o
mais perigoso de todos os parasitas da
malária por causar a forma mais grave dessa doença, a malária cerebral, que
aniquila os glóbulos vermelhos do sangue, provocando estados anêmicos, na
maioria dos casos levando à morte. É caracterizada por ataques de febre
(temperaturas acima de 40 ºC) acompanhados por severas dores de cabeça,
arrepios, náuseas, algum delírio e dores gástricas (Kasture et al., 1993).
A malária é uma preocupação de dimensões globais, mas com
características locais. No Brasil, mais de 60 % do território é favorável à
transmissão da malária. No país, a doença é causada por Plasmodium
falciparum, P. vivax e, mais raramente, P. malariae. O P. vivax é responsável
pelo maior número de casos e o P. falciparum é responsável pelo maior número
de mortes. No Brasil, os programas de controle da malária instituídos na década
de cinqüenta, foram eficientes e reduziram consideravelmente o número de
casos. Vinte anos depois, devido ao desenvolvimento da Região Amazônica
impulsionada principalmente pela construção de usinas hidroelétricas e pelo
2
desenvolvimento de projetos agropecuários incentivados por órgãos
governamentais, houve um aumento do número de casos de malária em
trabalhadores rurais, garimpeiros e outros tipos de trabalhadores. (Marques,
1987). Nesta época, 97,5% dos casos de malária registrados no Brasil foram
oriundos da Região Amazônica (Marques et al., 1982). Segundo Ministério da
Saúde, no período de 1999 a 2008, observou-se uma redução na incidência
parasitária anual (IPA) nos estados da Região da Amazônia Brasileira. A
letalidade por malária também foi reduzida, assim como a proporção de
internações que passou de 3,3% em 1999 para 1,3% em 2008. Fora da
Amazônia, o maior número de casos foi observado em Goiás, seguindo-se
Paraná, São Paulo e Mato Grosso do Sul. (Marques et al., 1982). Na década
de 90 eram 700 mil novos casos por ano rendendo ao Brasil o título de país das
Américas com o maior risco de contaminação por malária (World Health
Organization, 2005). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), 40 %
da população mundial esta sujeita a contrair malária, A figura abaixo mostra as
regiões onde a malária está mais presente (Figura 1).
Fonte: WHO (2003).
Figura 1. Mapa mundial de ocorrência de malária.
Diante desta gravíssima situação, no ano 2000 o Ministério da Saúde
intensificou suas ações em parceria com os municípios e estados amazônicos.
3
Em 2002, observou-se o maior declínio de casos de malária dos últimos 40
anos. Porém, em 2004 constatou-se um aumento da doença no Brasil, com
459.000 casos e esse número continuou a aumentar em 2005. Em 2006,
embora tenha havido uma pequena redução em relação a 2005, ainda foram
registrados 546.000 casos de malária no Brasil. (World Health Organization,
2005).
A malária passou a chamar a atenção de praticamente todos os países,
após relatos de que muitas cepas do protozoário causador da doença têm se
tornado resistentes aos medicamentos utilizados atualmente, bem como devido
ao aumento do número de casos da doença entre os chamados países de
primeiro mundo (Mendis et al., 2001)
Na década de 1950, grande parte das tentativas mundiais de erradicar
este flagelo falhou, principalmente, devido ao desenvolvimento da resistência
aos agentes antimaláricos (Mendis et al., 2001). Até a 2
a
Guerra Mundial, a
quinina era o único agente antiparasitário eficaz frente à malária. Após a
introdução de derivados sintéticos, a quinina foi descartada. Entretanto, com o
aparecimento de cepas resistentes de Plasmodium, este fármaco foi
reintroduzido. Durante a 2
a
Guerra Mundial, as forças aliadas inauguraram um
programa de pesquisa de antimaláricos, onde foram desenvolvidos vários
fármacos, com destaque para a cloroquina e a primaquina. A cloroquina, uma 4-
aminoquinolina, tornou-se, então, o fármaco mais usado empregado no
combate a malária (Wolf,1995).
Desde 1960, a transmissão da malária aumentou em muitas regiões onde a
infecção é endêmica. Cepas de Plasmodium falciparum resistentes а cloroquina
e а múltiplos agentes disseminaram-se e o grau de resistência medicamentosa
aumentou (Mendis et al., 2001). A incidência de resistência a malária por parte
do Plasmodium falciparum, em relação às drogas antimaláricas, continua a
aumentar em grandes áreas do mundo em desenvolvimento e este aumento da
resistência às drogas limita a escolha de uma quimioterapia eficaz contra a
malária pelo Plasmodium falciparum. A resistência é um fator importante a ser
considerado, porém a segurança e o custo também limitam o uso destes
4
compostos. A completa irradicação do mosquito, que é o transportador do
Plasmodium falciparum, ainda não foi possível. Por conseguinte, a procura de
novas drogas antimaláricas potentes vem sendo levada a cabo em todo mundo
(Khalil et al., 2000).
O tratamento da malária é longo, complexo e muitas vezes ineficaz
devido à reinfecção do paciente, fenômeno muito comum em regiões
endêmicas. Isto acontece porque muitas das estratégias consideradas eficazes
para o combate a esta doença são pouco acessíveis nos países endêmicos,
como a educação da população de risco, a quimioterapia eficiente, o controle
do vetor por meio de inseticidas e o uso de mosquiteiros impregnados com
inseticidas para evitar a infecção (Soares et al.,1998). Somando-se a isso o
rápido surgimento de cepas do Plasmodium falciparum resistentes aos
antimaláricos atualmente disponíveis, a ineficácia das vacinas e o desinteresse
das grandes indústrias farmacêuticas em desenvolver fármacos baratos e
acessíveis contra a doença, não é difícil entender porque a malária ainda é uma
emergência global de saúde pública (Santos Filho, 2000).
1.2- A interação entre os antimaláricos e a hemina
A complexidade do ciclo de vida do parasita explica as dificuldades
enfrentadas, ao longo dos tempos, para o estabelecimento de uma terapia
antimalárica eficaz e segura. O desenvolvimento de um fármaco antimalárico
ideal pressupõe a existência de uma atividade antiparasitária ótima com um
mínimo de efeitos adversos para o hospedeiro. No entanto, os vários fármacos
antimaláricos que vem sendo desenvolvidos e patenteados ao longo dos anos
deram origem a ciclos de esperança seguidos de desilusão, face aos problemas
que foram surgindo, em especial a crescente resistência por parte do parasita.
A quimioterapia adequada e oportuna da malária é hoje fundamental no
controle da doença. Tão importante quanto é o conhecimento das
características químicas e farmacológicas dos antimaláricos, é o entendimento
5
das propriedades farmacocinéticas, eficácia, grau de tolerância e a capacidade
de induzir os efeitos tóxicos do parasita. (Page et al., 1999 ; Wilson et al., 2008).
Os antimaláricos podem ser classificados de acordo com as
características químicas, farmacológicas, locais de ação no ciclo biológico do
parasita. (Wilson et al., 2008).
Os fármacos antimaláricos são eficientes devido ao mecanismo de ação,
pois se ligam fortemente a proteínas presentes no sangue, formando complexos
que são tóxicos ao parasita. (Peters, 1998 ; Wilson et al., 2008). Quando a
forma merozoíta se reproduz assexuadamente dentro das hemácias, os
parasitas necessitam de uma enorme quantidade de nutrientes e, por terem
capacidade limitada de sintetizar aminoácidos, eles suprem suas necessidades
pela degradação da hemoglobina humana. Os parasitas degradam cerca de
75% da hemoglobina dos eritrócitos e a utilizam como fonte alimentar. A
hemoglobina é importada para dentro de um compartimento acídico do parasita,
conhecido como vacúolo alimentar, e é quebrada por enzimas proteolíticas,
chamadas plasmecinas, em peptídeos que, posteriormente, são degradados a
aminoácidos (Egan e Marques, 1999). Mais de 80% das hemoglobinas de uma
célula infectada podem ser degradadas dessa forma. Durante este processo,
que ocorre dentro do vacúolo digestivo do parasita, há também a liberação da
hemina, que é tóxica ao parasita, devido a sua capacidade de gerar espécies
reativas de oxigênio. Para evitar sua toxicidade, a hemina é polimerizada pelo
parasita, formando um pigmento cristalino, insolúvel e não tóxico chamado
hemozoína. (Wilson et al., 2008). Sem dúvida, a ação deste tipo de drogas está
intimamente relacionada à presença de hemina livre que é gerada no interior do
vacúolo alimentar do parasita. Além disso, os antimaláricos aminoquinolínicos
acumulam-se no interior do vacúolo e são capazes de formar complexos com a
hemina e, assim, inibir a formação de hemozoína.
(
Dorn et al.,1995).
Os antimaláricos quinolínicos, aril-alcoóis e derivados da artemisinina
ficam concentrados no vacúolo alimentar (Tabela 1). Existem algumas
evidências que a interação entre esses antimaláricos e a hemina esteja
envolvida na toxicidade desses fármacos ao parasita. Vários experimentos in
6
vitro estabeleceram que fármacos antimaláricos quinolínicos agem por
interferência na cristalização da hemozoína. (Sullivan et al.,1998). Persiste,
entretanto, uma divergência sobre como isso ocorre (Egan e Marques, 1999).
Segundo Slater e Cerami,1992 sugeriram que a reação de formação da
hemozoína no parasita é catalisada por uma enzima, que seria inibida pelos
antimaláricos quinolínicos. Outra hipótese é que os antimaláricos quinolínicos
podem inibir a formação de hemozoína, pela interação direta com a hemina.
Warhurst, 1981 demonstrou espectroscopicamente que antimaláricos
quinolínicos formam, em solução benzênica, complexos com a hemina e que o
epímero inativo da quinina, a 9- epiquinina, não forma o complexo. Egan e
colaboradores,1994 demonstraram que a cloroquina, quinina e amodiaquina
são capazes de inibir a polimerização espontânea da hemina em solução
acídica acética, enquanto a 9-epiquinina e outras substâncias inativas na fase
eritrocítica da malária não são capazes de inibir.
Tabela 1. Principais antimaláricos que atuam na inibição da hemozoína.
Quinolínicos
Quinina; Mefloquina; Amodiaquina ;
Primaquina ; Cloroquina ; Etaquina ;
Hidroxicloroquina; Plasmoquina
Aril-alcoóis
Halofantrina ;Pironaridina ; Lumefantrina
Derivados da Artemisina
Artemeter; Arteeter ;Artemisinina; Artesunato
Fonte:
Rev. Bras. Farm., 89(1), 2008
.
Como a hemina é um dos principais alvos da ação antimalárica. O estudo
da amodiaquina e da sua interação com a hemina reveste-se de interesse
especial, pois além do objetivo químico da pesquisa, este estudo pode vir a
7
contribuir para um maior entendimento do mecanismo de ação antimalárica da
amodiaquina.
1.3- Amodiaquina, um antimalárico aminoquinolínico
A amodiaquina é um antimalárico de baixo custo, de elevada tolerância e
grande eficácia no tratamento da malária vivax, e quando usada em associação
com a tetraciclina mostra-se ainda com maior atividade que a cloroquina no
tratamento da malária falciparum (Rieckmann et al., 1972.).
A amodiaquina surgiu em 1945, quimicamente é um composto 4-
aminoquinolínico que apresenta massa molecular de 267 g mol
-1
(Figura 2) e
característica de base fraca.
Figura 2. Estrutura molecular da amodiaquina.
A investigação de antimaláricos 4-aminoquinolínicos reveste-se de
grande importância, já que a síntese de 4-aminoquinolinas como a cloroquina
ou a amodiaquina é fácil e de baixo custo, e estes compostos são, de forma
geral, bem tolerados e com níveis de toxicidade aceitáveis para o tratamento da
malária aguda.
Adicionalmente, a amodiaquina é eficaz contra determinadas estirpes do
parasita resistentes a cloroquina. Este último aspecto justifica o recente
interesse no desenvolvimento de novos derivados da amodiaquina, com o
intuito conceber novos antimaláricos mais eficientes.
8
Estudos recentes sobre o tratamento de malária por P falciparum sem
complicações, realizados durante os últimos dez anos na África, mostrou que a
amodiaquina teve uma eficácia terapêutica mais alta que a cloroquina, com uma
tendência para restabelecimento clínico mais rápido. Esta diferença também foi
observada em zonas com resistência à cloroquina fraca ou moderada (Brasseur
et al., 1999). Contudo, alguns países têm continuado a utilizá-la no tratamento
de malária sem complicações e não tem havido notificações de casos graves.
Recentemente, a amodiaquina foi reclassificada como pró-fármaco, pois
após a administração oral, a amodiaquina é rápida e extensamente
metabolizada dando origem aos derivados farmacologicamente ativos, como a
“desetilamodiaquina” (DAQ), por perda de um grupo N-etila, e ao metabólito
secundário 2-hidroxi-amodiaquina, sendo ambos eliminados por excreção renal
(Gião, 2001), que provavelmente é a responsável pela maior parte do efeito
terapêutico
(Winstanley et al.,1990). Em contraste com outros antimaláricos, a
amodiaquina acumulada nos neutrófilos humanos dá origem a um metabólito
eletrofílico que contribui para a diminuição dos níveis de glutationa
(antioxidante hidrossolúvel), resultando, portanto, numa maior toxicidade
(Naisbitt,1997).
A redução da toxicidade da amodiaquina tem sido estudada nos últimos
anos, objetivando o desenvolvimento de novos derivados da amodiaquina. Uma
outra abordagem, bastante recente, baseia-se na combinação da amodiaquina,
ou do seu metabólito ativo desetilamodiaquina, com outros agentes
antimaláricos, como a artemisinina ou antifolatos (Mariga,,2005; Gupta et
al.,2002).
Pesquisas realizadas revelam a presença de amodiaquina em
medicamentos e em amostras biológicas. A amodiaquina e seus metabólicos
foram detectados em plasma humano, utilizando a técnica de cromatografia
líquida de alta eficiência (Lindegandh et. al. 2002). A presença de amodiaquina
em amostras de sangue capilar, utilizando as técnicas de cromatografia liquida
e extração em fase sólida
em amostras biológicas foi investigada por Minzi et al.
(2003) e em urina por Pussard et al., (1986). Minzi et al., 2003, utilizando a
9
técnica de cromatografia liquida determinou amodiaquina, cloraquina e seus
metabólicos em amostras de sangue, plasma e urina. O limite de quantificação
foi de 10nm para todos os compostos.
O método desenvolvido por Pussard et al., 1986, determinou a
quantidade de amodiaquina e desetilamodiaquina simultaneamente em fluidos
biológicos com um limite de detecção de 1,0 x 10
-8
mol L
-1
. Foi determinada
também a presença da amodiaquina e seus metabólicos em amostras de
sangue utilizando a técnica de cromatografia liquida de alta eficiência com
detecção eletroquímica,
apresentando um limite de determinação de 3,0 x 10
-9
mol L
-1
(Mount, 1986). Em medicamentos o derivado da amodiaquina obtido
pela reação com periodato foi determinado por espectrofotometria de absorção
molecular por Verma et al.,1990.
Vários métodos têm sido descritos para a
quantificação simultânea da amodiaquina e seu principal metabólico em
amostras biológicas utilizando cromatografia liquida de alta eficiência com
detecção espectrofotométrica. O limite de quantificação dos métodos foram de
5,0 ng mL
-1
para amodiaquina e 200,0 ng mL
-1
para desetilamodiaquina(Dua
et al., 2004). No estudo de Mount, 1986, a técnica de cromatografia líquida com
detecção eletroquímica oxidativa foi usada para a quantificação da amodiaquina
em drogas antimaláricas e três dos seus metabólicos no sangue humano. O
método foi constituído por uma etapa de extração e apresentou limites de
detecção de 1,0 ng ml
-1
para amodiaquina e 3,0 ng ml
-1
para seus metabólicos.
Ansari e colaboradores, 2008, desenvolveram um método
espectrofotométrico para a determinação da amodiaquina e sulfadoxina, em sua
forma pura, e em formulações farmacêuticas. Estas espécies apresentaram um
máximo de absorção a 505 nm para a amodiaquina e em 470 nm para a
sulfadoxina com absortividade molar de 6,83 × 10
4
e 3,74 × 10
4
L mol
-1
cm
–1
, respectivamente.
A importância da determinação analítica de pequenas quantidades de
compostos antimaláricos em meio biológico tem proporcionado o
desenvolvimento de técnicas analíticas cada vez mais sensíveis e seletivas.
Dentre estas, as técnicas eletroanalíticas têm mostrado excelentes resultados.
10
Pacheco, 2004, desenvolveu um método eletroanalítico baseado na
voltametria adsortiva de redissolução catódica com varredura de potencial de
onda quadrada e de pulso diferencial para a determinação do ciclofenil em urina
e em formulações farmacêuticas, e na voltametria anódica com varredura de
potencial de onda quadrada e de pulso diferencial para a determinação da
primaquina em formulações farmacêuticas, utilizando eletrodo de carbono vítreo
e a técnica de pulso diferencial. A primaquina foi determinada em formulações
farmacêuticas com recuperação média de 101,7 %, e limite de detecção de
1,0 x 10
-6
mol L
-1
.
Anca et al., (2005) em seu artigo descreveram a determinação voltamétrica
de pulso diferencial da 8- aminoquinolina usando eletrodo de carbono, onde foi
possível determinar a 8- aminoquinolinica na concentração de 2 x 10
-6
mol L
-1
quando em 0,1 mol L
-1
de H
3
PO
4,
e 0,1 mol L
-1
de NaOH, foi alcançado o
limite de determinação de 2 x 10
-8
mol/L
usando voltametria adsortiva.
Zima et al., 2006, realizaram a determinação voltamétrica de
aminoquinolínicos usando eletrodo de pasta de carbono. As condições ótimas
foram encontradas por voltametria de pulso diferencial e voltametria adsortiva
de pulso diferencial. Os menores limites de determinação foram encontrados
para voltametria adsortiva de pulso diferencial em 0,1 mol L
-1
H
3
PO
4
, 5 x 10
-7
mol L
-1
, 1 x 10
-7
mol L
-1
, e 1 x 10
-7
mol L
-1
para 5-aminoquinolina,
6- arninoquinolina e 3-aminoquinolina, respectivamente.
Com o intuito de avaliar a aplicabilidade do método eletroanalítico a ser
desenvolvido neste trabalho, optou-se pelo emprego do leite materno como
matriz biológica.
11
1.4 - O uso de antimaláricos durante a lactação
Os fármacos utilizados durante a lactação podem ser classificados como
seguros, moderadamente seguros e inseguros. Deste modo, publicações sobre
drogas e aleitamento materno são regularmente disponibilizadas pelo Ministério
da Saúde (2000), pela Academia Americana de Pediatria (AAP) (2001) e pela
OMS (2007), entre outros, com o intuito de orientar os profissionais de saúde,
tendo em vista que muitos fármacos podem ser transferidos do plasma para o
leite, podendo chegar ao lactante em concentrações tóxicas. (Chaves et al.,
2004). Porém, face à dinâmica do conhecimento e do surgimento de novas
drogas, as informações necessitam ser atualizadas constantemente para
proporcionar maior segurança para o médico clínico, obstetra e pediatra, que,
em geral, prestam assistência à mulher lactante. Com o avanço do
conhecimento científico e da terapêutica, novos medicamentos surgem a cada
dia no mercado. Novos fármacos são, portanto, prescritos também para
mulheres em amamentação, aumentando o risco de desmame por
desconhecimento do clínico a respeito da segurança do seu emprego. (Ito,
2000).
É imprescindível o conhecimento dos fatores que determinam a
segurança para o seu uso nesse período. Tais fatores podem estar
relacionados com os aspectos metabólicos e fisiológicos do leite humano, com
a mulher, com o lactente ou com o fármaco. A composição do leite materno
varia conforme a fase da lactação (colostro versus leite maduro) ou até mesmo
durante uma mamada (leite anterior versus leite posterior). Tais alterações
influenciam na extensão da transferência de fármacos do plasma para o leite,
causando variações nas concentrações dos mesmos no leite materno (Begg et
al., 2002 ; Hale, 2004).
A via pela qual o fármaco é administrado à mãe tem importância devido
aos níveis alcançados no plasma materno e, posteriormente, no leite humano.
Desta forma, muitos fármacos administrados topicamente ou inalados não
atingem níveis plasmáticos significativos, possuindo níveis lácteos não
12
mensuráveis. Muitos antibióticos, corticosteróides e retinóides, aplicados em
áreas restritas, são pouco absorvidos por via transcutânea e praticamente
indetectáveis no plasma (Hale, 2004).
A idade do lactente tem sido apontada como uma das mais importantes
variáveis a ser
considerada no momento de determinar a segurança do fármaco
para uso durante a lactação. Estudos de revisão sobre efeitos adversos em
lactentes de medicamentos utilizados pelas mães mostraram o risco mais
elevado de reações nos lactantes de dois meses (78%). Apenas 4% das
reações ocorreram em lactentes maiores de seis meses, período de maior
maturidade metabólica hepática e de menor ingestão láctea devido à
alimentação complementar (Anderson et al., 2003). Porém, Hale (2004)
classifica o risco de efeitos adversos para o lactente segundo a idade como:
baixo risco (seis a 18 meses), risco moderado (dois a seis meses) e alto risco
(prematuros, recém-nascidos, lactentes clinicamente instáveis ou com função
renal debilitada).
Em relação aos antimaláricos, ainda que não existam muitos relatos
sobre o seu uso na lactação, a quantidade desta substância excretada no leite
materno é pequena, pelo que os autores entendem que, em geral, antimaláricos
devem ser mantidos durante a amamentação. (Chalumeau et al., 2005 ; Ito et
al., 2000).
Contudo, o uso de algumas drogas antimaláricas como, a amodiaquina
na amamentação deve ser criterioso, por ser excretada no leite materno. A
quimioprofilaxia da amodiaquina foi associada a uma grave toxicidade como
agranulocitose e insuficiência hepática, mas a disponibilidade de informação
sobre a segurança e tolerabilidade de amodiaquina durante a lactação é muito
limitado. Atualmente, a amodiaquina está classificada como fármaco
moderadamente seguro para lactentes.
Segundo Begg et al. 2002, os medicamentos que têm massa molecular
baixa são mais facilmente transferidos para o leite materno do que aqueles com
elevada massa molecular.
13
II-FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1-Voltametria
O desenvolvimento de metodologias analíticas sempre teve um papel de
destaque nas diferentes áreas do conhecimento, sempre com ênfase nas
determinações de espécies químicas em meios “reais”, mais especificamente
em amostras ambientais, alimentícias e biológicas.
A eletroquímica moderna tem sido empregada como uma ferramenta
poderosa na análise de fluidos biológicos como soro sanguíneo, urina, lágrima,
onde podemos destacar exemplos clássicos como a análise voltamétrica de
glucose, glutamato e uma infinidade de fármacos. Uma das características
importantes das técnicas eletroquímicas é a possibilidade de sua aplicação ao
estudo de fármacos que possuam como característica de sua ação biológica o
envolvimento de processos de transferência de carga. Nesse sentido, as
informações obtidas por meio dessas técnicas podem exercer papel relevante
para a compreensão do mecanismo de ação desses fármacos (Abreu et al.,
2002).
Além disso, os métodos eletroquímicos têm se destacado nos últimos
tempos devido à possibilidade de se conferir um alto grau de seletividade às
medidas por meio da utilização de sensores especialmente desenvolvidos
(Kenneth, et al., 2006 e Randhir, et al., 2004). Este tipo de dispositivo pode ser
utilizado diretamente no produto a ser analisado, eliminando-se etapas de
elevado custo e demoradas de tratamento de amostra.Além disso, os métodos
eletroquímicos podem ser classificados como tendo baixo custo, curto tempo de
análise, e alta sensibilidade, quando comparado a outros métodos analíticos.
Dos métodos eletroquímicos disponíveis, a voltametria, nas suas
diversas formas, é talvez a técnica mais versátil e efetiva para estudar sistemas
de oxidação/redução, além de ser bastante útil em eletroanálise.
A voltametria compreende um grupo de métodos eletroquímicos nos
quais as informações sobre o analito são obtidas por meio de medidas de
14
correntes em função do potencial aplicado e em condições que estimulam a
polarização de um eletrodo indicador ou de trabalho. (Skoog ,2002).
As espécies químicas analisadas são colocadas em uma cela
eletroquímica, a qual é constituída por no mínimo dois eletrodos: O
microeletrodo (eletrodo de trabalho: comumente feito de material inerte, como
ouro, platina, carbono, mercúrio (Wang,2000) e o eletrodo de referência: que
apresenta uma grande área superficial. Ao aplicar um potencial de varredura
aos dois eletrodos, o eletrodo de trabalho assume o potencial aplicado a ele (se
polariza) enquanto que o de referência mantém seu potencial constante (não
polariza). Isso ocorre em decorrência dos eletrodos apresentarem áreas
superficiais de tamanhos diferentes.
A voltametria é amplamente utilizada pelos químicos inorgânicos, físico-
quimicos, bioquímicos entre outros, para realizar estudos fundamentais de
processos de oxidação e redução em vários meios, processos de adsorção em
superfícies, mecanismos de transferência de elétrons em superfícies de
eletrodos quimicamente modificados. (Skoog, 2002). Diante de tantas
oportunidades de estudos que podem ser realizados observa-se que as
medidas eletroquímicas podem ser usadas com largos propósitos de
aplicações, incluindo monitoramento ambiental, controle de qualidade industrial
e análises bioquímicas (Wang 2000).
As técnicas voltamétricas apresentam algumas características que
permitem a sua automação a baixos custos, o que permite a realização de
medidas in situ, que podem minimizar algumas mudanças nas amostras quando
estão sendo transportadas para o laboratório. (Buffle e Waeber 2005). Nos
últimos anos, o desenvolvimento e aperfeiçoamento das várias técnicas
voltamétricas tem possibilitado a sua utilização principalmente em análises
ambientais e em fluidos biológicos. Algumas destas características podem-se
citar:
• O desenvolvimento de equipamentos mais resistentes, sensores capazes
e microeletrodos que monitoram por um longo período de tempo;
15
• O desenvolvimento de conceitos específicos que permitem a
interpretação corretamente dos sinais voltamétricos desses sensores em
termos da especiação dos metais;
• O desenvolvimento da eletrônica, com a produção de aparelhos mais
compactos, de baixo custo e de fácil automação. (Buffle e Waeber 2005).
2.1.1- Voltametria cíclica (VC)
A voltametria cíclica é uma das técnicas eletroquímcias mais
empregadas na caracterização de um processo eletródico, nela registra-se a
resposta da corrente de um eletrodo estacionário e pequeno em uma solução
sem agitação quando este é excitado por uma onda triangular de potencial. O
potencial varia linearmente em uma direção até um dado valor, então, a direção
da varredura é invertida e o potencial volta ao valor inicial aplicado, como
mostra a Figura 3 (a). Os potenciais nos quais ocorre a reversão são chamados
potenciais de inversão. O intervalo de potenciais de inversão escolhido para um
dado experimento é aquele no qual ocorre a oxidação ou a redução controlada
por difusão de um ou mais analitos. A direção da varredura inicial pode ser
tanto negativa como positiva, dependendo da composição da amostra (Skoog et
al., 2002).
Dependendo da informação requerida, pode ser utilizado um ciclo único
ou múltiplos ciclos. Durante a varredura de potencial, o potenciostato mede a
corrente resultante do potencial aplicado. O voltamograma é a corrente versus o
potencial como mostra a Figura 3 (b) (Wang, 2001). Na pratica utilizam-se
velocidades de varredura (ν) que variam desde 10 mV s
-1
até 10 kV s
-1
, sendo
mais comum trabalhar entre 20 e 200 mV s
-1
(Ticianelli e Gonzalez, 1998).
16
Figura 3. (a) Sinal de excitação para a voltametria cíclica e, (b) Voltamograma
cíclico para um processo redox reversível (Skoog et al., 2002, Wang, 2001).
A Figura 3 (b) ilustra a resposta esperada para um par redox reversível
durante um único ciclo de potencial. Inicialmente considera-se que somente a
espécie oxidada (O) está presente. Uma varredura de potencial na direção
negativa é escolhida para o primeiro meio ciclo, começando em um valor onde
não ocorre redução. Conforme o potencial aplicado se aproxima do potencial
padrão (Eº) característico para o processo redox, a corrente catódica começa a
aumentar, até que um pico é alcançado. Após atravessar a região de potencial
em que ocorre o processo de redução, a direção da varredura do potencial é
invertida. Durante a varredura reversa, as moléculas de espécies reduzidas (R)
(geradas no meio ciclo inicial e acumuladas próximo à superfície) são
reoxidadas novamente resultando em um pico anódico (Wang, 2001).
Os parâmetros importantes em um voltamograma cíclico são: o potencial
de pico catódico, o potencial de pico anódico, a corrente de pico catódico e a
corrente de pico anódico. Para uma reação reversível de eletrodo, as correntes
de pico catódico e anódico são aproximadamente iguais em valor absoluto, mas
de sinais opostos e a diferença entre os potenciais de pico é 0,059/n para 25ºC,
onde n é o número de elétrons envolvidos na semi-reação (Skoog et al., 2002).
17
2.1.2 -Voltametria de Pulso Diferencial (DPV)
Uma melhoria instrumental considerável na discriminação entre a
corrente faradaica e a corrente capacitiva viria a ser conquistada com o
desenvolvimento de técnicas de pulso, principalmente a de pulso diferencial.
Neste caso a instrumentação foi desenvolvida de tal modo que as medidas de
corrente e aplicações de potencial e pulsos de potencial sejam realizadas em
intervalos de tempo muito pequenos.
Esta modalidade de medição voltamétrica foi introduzida por Barker e
Jenkin em 1953. Tem como objetivo diminuir o limite de detecção das medidas
voltamétricas pelo substancial aumento da discriminação entre a corrente
faradaica e não faradaica, permitindo uma quantificação em níveis abaixo de
10
-8
mol L
-1
. (Wang; 2000).
Com o desenvolvimento instrumental, a voltametria de pulso diferencial
possibilitou medidas de correntes e aplicações de potencial e pulso de potencial
em intervalos de tempo pequenos.
Na voltametria de pulso diferencial a programação de potencial é feita
aplicando-se um pulso de potencial superposto em uma rampa de potencial
linearmente crescente em instrumentos analógicos (uma rampa DC) e cada
etapa de aplicação de pulso é definida pela varredura de potencial utilizado. O
pulso aplicado é de pequena amplitude (10 a 100 mV) e é imposto durante 50 a
60 ms perto do final da vida da gota. A corrente é amostrada em dois intervalos
de tempo de cerca de 15 ms cada um; o primeiro intervalo imediatamente antes
da aplicação do pulso (S
1
) e o segundo próximo ao final do tempo de vida de
gota (S
2
). O valor final da corrente é a diferença entre esses dois valores
medidos. (Aleixo acesso 2009).
18
Figura 4. Representação esquemática da aplicação do potencial em função do
tempo em voltametria de pulso diferencial. (a) Em instrumentos analógicos;
(b) Em instrumentos digitais. A corrente é amostrada em S1 e S2 e a diferença
entre eles é que é registrada: I = I
s2
– I
s1
. (Aleixo acesso 2009).
Uma vantagem do voltamograma de pulso diferencial é que os máximos
individuais podem ser observados para substâncias com potenciais de meia-
onda que diferem entre si por valores pequenos como 0,04 a 0,05 V. Ao
contrário da voltametria linear e da voltametria de pulso normal que requerem
uma diferença de potencial de cerca de 0,2 V para resolução das ondas. Mais
importante, entretanto, é que a voltametria de pulso diferencial aumenta a
sensibilidade do método voltamétrico. Geralmente os limites de detecção com
voltametria de pulso diferencial são de duas ou três ordens de magnitude mais
baixa do que a voltametria linear e caem no intervalo de 10
-7
a 10
-8
mol L
-1
.
(Skoog et. al., 2002). Com isso observa-se que esta técnica é extremamente
usada para medidas de traços de espécies orgânicas e inorgânicas. (Wang,
2000).
2.1.3- Voltametria de Onda Quadrada (VOQ)
A voltametria de pulso diferencial é a técnica mais usada presentemente
para fins analíticos, devido às vantagens apresentadas em relação à
detectabilidade e a resolução frente as técnicas de corrente contínua. Mas, ao
19
lado dela, uma técnica muito conveniente do ponto de vista analítico tem sido
incorporada em diversos instrumentos comerciais é a voltametria de onda
quadrada de varredura rápida. (Aleixo acesso 2009).
A voltametria de onda quadrada consiste de uma onda quadrada
simétrica, superposta por uma base potencial em forma de escada, quando
aplicadas no eletrodo de trabalho. (Wang, 2000). Os resultados das formas de
pico dos voltamogramas são simétricos aos potenciais de meia-onda, e os picos
de corrente são proporcionais as concentrações. A sua principal vantagem é a
elevada velocidade de varredura de potencial que pode ser empregada
satisfatoriamente (Skoog et. al.,2002 e Wang, 2000).
Figura 5. Seqüência potencial vs. Tempo (E vs t) usada em voltametria de onda
quadrada. (Aleixo acesso 2009).
2.2- Eletrodos de pasta de carbono modificados
Uma das áreas de maior crescimento na Química Analítica é o de
desenvolvimento de sensores eletroquímicos que apresentem melhores
características, tais como alta sensibilidade, seletividade e estabilidade,
principalmente devido aos novos desafios impostos por amostras de diversos
interesses, pois tais dispositivos têm sido empregados na análise de um grande
20
número de substâncias de interesse clínico, biológico, ambiental e industrial
(Suzuki, 2000, Svancara et al, 2001). Uma área que oferece grande potencial
de aplicação e eficiência dos sensores eletroquímicos é a que compreende os
chamados eletrodos quimicamente modificados (EQM). (Pereira et al; 2002).
A modificação química de eletrodos é um campo de interesse crescente
na química analítica. Tendo sido demonstrado ao longo dos tempos, que
eletrodos modificados possuem vantagens distintas em relação aos eletrodos
convencionais em muitas áreas de aplicação.(Luz et al., 2004)
O desenvolvimento de eletrodos modificados é um ramo que envolve
todas as áreas da química, desde o estudo físico-químico do material a ser
utilizado no eletrodo até o estudo sistemático da resposta frente a um analito
escolhido.
O material a ser escolhido para o eletrodo base, cuja superfície sofrerá
modificação, é um aspecto muito importante na preparação de um EQM. Este
substrato deve apresentar características eletroquímicas apropriadas e também
ser adequado para o método de imobilização selecionado. (Luz et al., 2004)
Eletrodos modificados são utilizados numa busca constante por maior
sensibilidade, estabilidade e seletividade. O termo eletrodo quimicamente
modificado (EQM) foi concebido há muito tempo atrás (Moses et al., 1975) e
designa eletrodos com espécies quimicamente ativas adequadamente
imobilizadas na superfície de tais dispositivos. Tem esse procedimento o
objetivo de pré-estabelecer e controlar a natureza físico-química da interface
eletrodo-solução. Sendo assim, a reatividade e/ou seletividade do substrato
são alteradas, possibilitando o desenvolvimento de sensores para vários fins e
aplicações, incluindo eletroanálise, estudos de eletrocatálise, de cinética de
transferência de elétrons, de permeação de membranas, síntese eletroorgânica
e fotoeletroquímica (Luz et al. 2005). A modificação de eletrodos pode ser
conduzida seguindo diversos caminhos (Pereira et al. 2002). Um dos métodos
ainda muito utilizados se baseia na modificação de eletrodos à base de carbono
(pasta de carbono, grafite-epóxi, pastilhas, etc) mediante mistura do agente
modificador com o substrato do eletrodo (grafite, negro de carbono, etc).
21
Quando possível, a mistura do carbono em pó com a solução do modificador é
feita para obter uma distribuição mais homogênea do último, após evaporação
do solvente. Também pode ocorrer perda gradual do modificador para o meio,
prejudicando a reprodutibilidade. Já os biossensores são usualmente definidos
como dispositivos sensíveis que consistem em um elemento biológico que em
contato íntimo com uma espécie emitem um sinal, proveniente de um processo
biológico ou biocatalítico, sendo este sinal em seguida quantificado (Freire et
al., 2003).
Eletrodos de pasta de carbono (EPC) são apropriados para o
desenvolvimento de biossensores, possuindo baixa corrente de fundo mesmo
em grandes variações de potencial quando comparado com outros eletrodos
sólidos. A espécie química imobilizada na pasta de carbono oferece muitas
vantagens sobre os outros eletrodos, pois sua preparação é simples, de baixo
custo, e, além disso, o uso do eletrodo é extremamente fácil (Kalcher et al.,
1995).
No processo eletroquímico o analito de interesse interage com a
superfície eletródica, resultando na transferência de elétrons. Entretanto, se a
transferência é muito lenta, ou não ocorre, ou ocorre em um valor de potencial
fora do intervalo de potencial do eletrodo, é possível realizar uma modificação
na superfície eletródica a fim de melhorar a resposta final, onde o analito irá
interagir diretamente com o agente modificante (Galli et al., 2006).
O emprego de detectores eletroquímicos em voltametria é crescente.
Houve um grande desenvolvimento de sensores baseados em materiais
eletródicos para sistemas de fluxo. Tais sistemas oferecem respostas
voltamétricas rápidas e possibilidade de monitoramento contínuo resultantes
das características hidrodinâmicas ( Stulik,1987; Fleet et al.,1989).
A principal vantagem dos EPCM preparados por adição direta com
relação a eletrodos sólidos, em estudos voltamétricos, é o procedimento
simples de preparação de uma nova superfície, que não é afetada pela “história
prévia” do eletrodo. (Pereira et al., 2002).
22
2.3- Uso da hemina como agente modificador
A hemina, a ser empregada como agente modificador, é um grupo
funcional encontrado na proteína do sangue, hemoglobina; a qual confere a cor
vermelha ao sangue, tem o importante papel da captação de oxigênio pela
molécula de hemoglobina. A hemina apresenta uma parte orgânica e um átomo
de ferro. A parte orgânica, denominada protoporfirina IX, é formada por um anel
tetrapirrólico e o ferro está ligado no centro deste anel (Ponka,1999).
A hemina (Figura 6) desempenha várias funções biológicas determinadas
em parte pelo polipeptídeo associado a ele. A hemina livre induz estresse
oxidativo e tem diversas propriedades pró-inflamatórias (Wagener et al., 2003).
O mecanismo molecular envolvido nos efeitos inflamatórios da hemina é
atribuído à sua natureza anfipática e ao seu efeito pró-oxidante, através da
geração de espécies reativas de oxigênio. (Balla et al., 2000 ; Wagener et al.,
2003).
Figura 6. Estrutura química da hemina
Chen e colaboradores, 1997, fizeram um estudo da redução
eletrocatalítica da artemisinina com a hemina, utilizando um eletrodo de
carbono vítreo. Na presença de concentrações baixas de hemina como 8 × 10
-8
mol/L, a redução ocorre em -0,54 V, com uma diminuição do potencial catódico
igual a 640 mV.
Chen e colaboradores, 1998 investigaram a interação do artesunato com
hemina por métodos eletroquímicos e espectroeletroquímicos ultravioleta. O
Artesunato sofreu uma redução totalmente irreversível a -1,27 V (vs Ag/AgCl),
23
utilizando um eletrodo de carbono vítreo. A hemina pode catalisar a
decomposição do artesunato. Na presença de baixas concentrações de hemina
como 2 × 10
-8
mol/L, o sobrepotencial catódico do artesunato foi reduzido em
680 mV (E
pc
= -0,59 V versus Ag/AgCl). Experimentos de espectrofotometria de
ultravioleta confirmaram o processo catalítico. Estes resultados indicaram que o
artesunato pode seguir por um caminho metabólico similar ao de outros
antimaláricos, mostrando que a hemina desempenha um papel catalisador no
processo de ação em diversos tipos de drogas antimaláricas.
Pesquisas realizadas revelam que o eletrodo modificado com hemina foi
elaborado e aplicado para a determinação eletroquímica de superóxido. A taxa
constante de transferência de elétrons heterogênea de hemina adsorvida foi
determinada por voltametria cíclica (CV) a 15 s
-1
. O eletrodo foi aplicado para
detectar radicais superóxido produzido pela xantina oxidase (XOD) catalisada
pela oxidação da hipoxantina. (Chen et al., 2000).
Nan e seus colaboradores, 2002 investigaram o comportamento
eletroquímico do triptofano e seus derivados, utilizando um eletrodo de carbono
vítreo modificado com hemina. Os resultados desenvolvidos por voltametria de
pulso diferencial mostraram que o eletrodo de hemina catalisa a oxidação
eletroquímica do triptofano e seus derivados. Entretanto, a reação eletroquímica
destes compostos na superfície de um eletrodo modificado com hemina tem
sido investigada e os resultados indicaram que o mecanismo eletródico envolve
a transferência de um elétron e dois prótons.
Zheng e colaboradores, 2002 investigaram a redução eletrocatalítica do
oxigênio utilizando um eletrodo de pasta de carbono modificado com hemina. O
eletrodo foi construído por um método simples, rápido e eficaz. O
comportamento eletroquímico do eletrodo modificado foi caracterizado por
voltametria cíclica. O eletrodo modificado obtido foi muito estável e apresentou
resposta eletrocatalítica para a redução do oxigênio.
24
III- OBJETIVO
3.1- Geral
• O objetivo desta pesquisa foi desenvolver uma metodologia
eletroanalítica para a determinação de amodiaquina utilizando um biossensor a
base de hemina, empregando as técnicas de voltametria de onda quadrada
(VOQ) e voltametria de pulso diferencial (VPD).
3.2- Específicos
• Preparar eletrodos de pasta de carbono modificados com hemina;
• Caracterizar eletroquimicamente o eletrodo de pasta de carbono
modificado com hemina;
• Desenvolver metodologias voltamétricas para análise de
amodiaquina empregando estes eletrodos.
• Verificar a aplicação do biossensor na determinação de
amodiaquina em leite materno.
• Validar o método desenvolvido.
25
IV- METODOLOGIA
A metodologia eletroanalítica empregada segue genericamente o
organograma abaixo.
Desenvolvimento
do método analítico
Preparo do eletrodo
Área Efetiva
do Eletrodo
VC
Parametrização
VPD
Parametrização
VOQ
Amodiaquina
no leite materno
Amodiaquina
no leite materno
Comportamento
Voltamétrico
Amodiaquina
Parametrização
Uv-vis
Amodiaquina
no leite materno
Desenvolvimento
do método analítico
Preparo do eletrodo
Área Efetiva
do Eletrodo
VC
Parametrização
VPD
Parametrização
VOQ
Amodiaquina
no leite materno
Amodiaquina
no leite materno
Comportamento
Voltamétrico
Amodiaquina
Parametrização
Uv-vis
Amodiaquina
no leite materno
4.1 - Reagentes e soluções
Para desenvolvimento da metodologia eletroanalítica foram preparadas
soluções estoque de amodiaquina na concentração de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em
solução aquosa, as quais foram preparadas diariamente antes de cada análise.
As medidas eletroquímicas foram realizadas utilizando como eletrólito
suporte 5,0 mL de soluções-tampão BR (Britton-Robinson) com pHs variando
entre 2 e 12 e partindo de uma solução-estoque preparada da seguinte forma:
1) Solução ácida: solução 0,01 mol L
-1
de ácido bórico, 0,01 mol L
-1
de ácido
acético e 0,01 mol L
-1
de ácido fosfórico;
2) Solução básica: solução 0,2 mol L
-1
de hidróxido de sódio.
Os valores de pH foram obtidos a partir da mudança na proporção entre
a solução ácida (solução 1) e a solução básica (solução 2), podendo variar
entre 2 e 12.
26
As soluções foram preparadas utilizando água purificada com o sistema
Milli-Q (Millipore Inc.). As soluções de trabalho foram desoxigenadas
borbulhando nitrogênio durante 10 min antes de cada análise na célula
eletrolítica, para remoção do oxigênio molecular eletroativo dissolvido na
solução antes das medidas serem realizadas.
4.2 - Instrumentação
As medidas eletroquímicas foram realizadas em um
potenciostato/galvanostato PGSTAT 30 da Ecochemie, acoplado a um
microcomputador que registra e armazena os dados obtidos, usando o
programa de controle GPES. Os dispositivos instrumentais seguem o arranjo
esquematizado conforme abaixo.
Figura 7. Célula voltamétrica de três eletrodos. Esquema mostrando a célula
conectada a um sistema potenciostático. (Aleixo acesso 2009).
As medidas foram realizadas por técnicas voltamétricas. A figura 8
mostra o sistema utilizado que consiste de uma cela eletroquímica com
capacidade para 5 mL, modelo: VA Stand 663 da Metrohm utilizando o
biossensor de hemina como eletrodo de trabalho, um eletrodo de carbono vítreo
como eletrodo auxiliar e um eletrodo de Ag/AgCl, como referência.
27
Figura 8 – Célula eletroquímica utilizada nos ensaios de voltametria, com o
eletrodo de trabalho, de referência e o auxiliar, imersos no eletrólito suporte.
Soluções contendo amodiaquina foram preparadas com tampão Britton-
Robinson. Além disso, a solução foi purgada com nitrogênio durante alguns
minutos antes de cada análise, para remoção do oxigênio dissolvido.
4.3 – Otimização da proporção hemina/grafite
As pastas de carbono modificadas foram preparadas em diferentes
proporções em massa de 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50% de hemina. A pasta
de carbono foi preparada, pesando-se o carbono e misturando-se com oléo
mineral. Em seguida, a porcentagem de hemina foi acrescentada como
modificador e cada pasta foi homogeneizada em almofariz por cerca de 20
minutos. Estas pastas foram armazenzdas em recipientes ao abrigo da luz.
4.4-Montagem dos eletrodos
Os eletrodos foram confeccionados em laboratório pelo preenchimento
de um tubo plástico com as pastas de carbono modificadas e introduzindo uma
haste de platina para o contato elétrico externo. A figura 9 mostra o esquema de
construção do eletrodo.
28
Figura 9. Esquema de construção do biossensor a base de hemina.
4.5- Medidas de pH
As medidas de pH das soluções foram realizadas utilizando-se um
pHmetro da marca Analion, modelo PM 608.
4.6- Medidas Espectrofotométricas
As medidas espectrofotométricas na região do ultravioleta/visível foram
realizadas com o auxílio de um aparelho da Biochrom modelo Libra S12,
utilizando cubetas de quartzo com caminho óptico de 1,0 cm.
4.7- Preparação do biossensor
Na preparação da pasta de carbono foi empregada uma proporção de
3:1 p/p de grafite e óleo mineral. A pasta foi inicialmente pré-aquecida à 100
o
C
por 12 horas. Após resfriamento, a pasta foi homogeneizada com óleo mineral e
compactada em uma ponteira, sendo o contato elétrico mantido por um fio de
platina. A renovação da superfície foi obtida por substituição da pasta após
cada voltamograma. A altura do depósito foi de 0,3 cm e a área geométrica foi
de 0,1 cm
2
.
Para a determinação eletroanalítica, as técnicas de voltametria de pulso
diferencial e voltametria de onda quadrada foram empregadas. Para tanto,
foram avaliados os parâmetros relativos à estas técnicas, tais como: amplitude
29
e velocidade de varredura de potencial, o efeito do pH do meio e da
concentração do analito.
Os eletrodos de pasta de carbono foram preparados pela mistura
mecânica do aglutinante com grafite em pó e a hemina em um almofariz por 30
min (Kissinger, 1996). A pasta de carbono modificada com hemina foi inserida
em uma das extremidades de um tubo plástico (ø = 0,1 cm) e então
compactada com uma haste de platina formando o contato elétrico. A superfície
do eletrodo foi uniformizada pelo polimento com papel de filtro.
4.8- Otimização das condições voltamétricas de análise
Nas determinações voltamétricas, alíquotas de 5,0 mL de solução
tampão B-R foram adicionadas à célula eletroquímica contendo um sistema
com três eletrodos, sendo aplicado um fluxo de nitrogênio por um intervalo de
10 minutos para a remoção de oxigênio molecular. Vários voltamogramas foram
realizados para a otimização dos parâmetros de análise: velocidade de
varredura, freqüência, amplitude de pulso e pH.
Posteriormente foram realizados estudos da dependência da corrente de
pico catódico em função da concentração de amodiaquina no intervalo de 10
-5
até 10
-4
mol L
-1
.Uma curva de calibração foi construída e a linearidade da faixa
foi avaliada através do coeficiente de correlação linear obtido.
4.9- Coleta e preparo da amostra de leite materno
As amostras de leite materno utilizadas na aplicação do método
desenvolvido foram coletadas diariamente antes de cada análise no período
matutino e armazenadas sob resfriamento a 10
o
C. Para a coleta do leite
materno foi utilizada uma bomba de sucção, previamente descontaminada.
Para a determinação voltamétrica da amodiaquina, as amostras foram
enriquecidas com amodiaquina na concentração de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
.
30
V-RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Voltametria cíclica
A voltametria cíclica é uma ferramenta analítica importante para o estudo
de mecanismos de velocidades de processos de oxidação/redução. Trata-se da
primeira técnica selecionada para investigação de um sistema que pode ser
tratado eletroquimicamente e normalmente revela a presença de intermediários
em reações de oxidação/redução.
A figura 10 apresenta o efeito da velocidade de varredura de potenciais
de 20, 40, 60, 80 e 100 mV s
-1
sobre a resposta voltamétrica do biossensor
contendo 10 % da hemina como agente modificador em solução tampão
BR- pH 7,0 para uma solução contendo 1,0 x 10
-3
mol L
-1
de amodiaquina.
-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3
-1,2
-0,8
-0,4
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
i (
µ
A)
E (V vs Ag/AgCl)
20 mV s-1
40 mV s-1
60 mV s-1
80 mV s-1
100 mV s-1
Figura 10. Voltamogramas cíclicos de uma solução contendo 1,0 x 10
-3
mol L
-1
de amodiaquina em solução BR pH 7,0 com velocidade de varredura variando
de 20 a 100 mV s
-1
.
31
Após sucessivas varreduras de potencial no intervalo de –0,3 a 0,3 V. Os
voltamogramas registrados na figura 10 mostram um aumento e um pequeno
deslocamento dos picos anódicos e catódicos, à medida que a velocidade de
varredura também aumenta.
Usando o eletrodo de hemina, a amodiaquina apresentou um processo
de oxidação e outro de redução em uma concentração de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em
pH 7,0. O pico de oxidação é verificado aproximadamente em 0,054 V e pico de
redução em –0,11 V vs. Ag/AgCl na velocidade de 20 mV s
-1
e tende ao
distanciamento, a separação dos picos é muito maior do que 60 mV que é o
valor esperado para sistemas reversíveis e sem reações homogêneas
acopladas a transferência eletrônica.
O aumento da velocidade de varredura, nos permitie observar que as
correntes de pico anódica e catódica tem uma correspondência linear com a
raiz quadrada da velocidade de varredura (ν
1/2
), indicando que até a velocidade
de 80 mV s
-1
há transferência de massa é controlada por difusão.
Em termos moleculares podemos inferir que o Fe (II) da estrutura da
hemina incorporado a superfície do eletrodo pode ligar-se com a amodiaquina
atrav[es do oxigênio do grupo fenolato, o grupo funcional eletroativo da
estrutura química da amodiaquina. Está hipótese é corroborada por resultados
da literatura em que a técnica de espectroscopia de Mössbauer (Adams et. al.,
1996) foi utilizada para investigar a complexação de amodiaquina e hemina em
solução.
32
5.2-Desenvolvimento dos Métodos Eletroanalíticos
5.2.1 – Estudo da porcentagem de hemina na pasta de carbono
No desenvolvimento de uma metodologia eletroanalítica é de grande
importância a otimização de parâmetros que influenciam na resposta
voltamétrica. Desta forma, o presente estudo foi desenvolvido analisando a
influência de alguns parâmetros nestas respostas, tais como: porcentagem de
hemina na pasta, pH, velocidade de varredura, amplitude, tempo de deposição
e concentração objetivando a obtenção do melhor sinal analítico.
Para a escolha da composição da pasta, e porcentagem do modificante,
uma alíquota de 1,0 mL da solução estoque de amodiaquina de concentração
de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
foram adicionadas em 5 mL da solução-tampão BR de pH
2. Para tanto, diferentes porcentagens (5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50%) de
hemina foram testadas na composição do biossensor, no intuito de verificarmos
qual a porcentagem de hemina que produz maior corrente de pico do analito.
Considerando os resultados obtidos por voltametria de pulso diferencial, nós
obtivemos um sinal analítico e correntes de picos maiores para 10% de hemina
na pasta de carbono (Figura 11), sendo, portanto, a porcentagem selecionada
para composição do eletrodo de pasta de carbono modificado.
33
0 10 20 30 40 50
4
6
8
10
12
14
16
18
0 10 20 30 40 50
4
6
8
10
12
14
16
18
50%
40%
30%
20%
10%
5%
i (10
-8
A)
porcentagem de hem ina na pasta
50%
40%
30%
20%
10%
5%
i (10
-8
A)
porcentagem de hem ina na pasta
Figura 11. Variação da resolução de pico da amodiaquina de concentração
1,0 x 10
-3
mol L
-1
em diferentes porcentagens de hemina no eletrodo de pasta
de carbono quimicamente modificado.
∆E
= 40 mV,
ν
= 20 mV s
-1
.
5.2.2 -Influência do pH do meio
Para estudar a influência do pH nas determinações analíticas, uma
alíquota de 1,0 mL da solução estoque de amodiaquina de concentração de
1,0 x 10
-3
mol L
-1
foi adicionada em cada 5 mL das soluções-tampão BR com
valor de pH variando entre 2 e 12, para verificar a eletroatividade da molécula e
o pH ótimo, ou seja, o valor de pH em que o analito apresenta uma maior
corrente de pico e, conseqüentemente, uma melhor sensibilidade da técnica.
Considerando que as leituras foram realizadas com o eletrodo com 10% de
hemina. Foram então submetidas à análise por voltametria de pulso diferencial
para a identificação de picos anódicos e/ou catódicos. Os resultados revelaram
uma definição de sinal analítico e corrente de picos maiores para o pH 7,0
(Figuras 12 e 13). Portanto, o valor de pH selecionado para o estudo foi 7,0.
34
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
1,0x10
-7
2,0x10
-7
3,0x10
-7
4,0x10
-7
5,0x10
-7
6,0x10
-7
7,0x10
-7
i
pc
(A)
E (V vs Ag/AgCl)
pH 2
pH 3
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
pH 8
Figura 12. Voltamogramas de pulso diferencial da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em diferentes pHs em eletrodo modificado com
10 % de hemina.
∆E
=40 mV,
v
= 20 mV s
-1
.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
i (µA)
pH
Figura 13. Intensidade de corrente da amodiaquina em função do pH na
concentração de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em soluções BR em eletrodo modificado com
10 % de hemina.
∆E
=40 mV,
v
= 20 mV s
-1
.
35
5.2.3-Influência da amplitude
No estudo da influência da amplitude, a velocidade foi ajustada em 20
mV s
-1
e foi realizada uma varredura de amplitude entre 20 e 200 mV.
A Figura 14 mostra o efeito da variação da amplitude na corrente de pico
para a amodiaquina. Observou-se que para valores de amplitude menores do
que 100 mV, o aumento da intensidade de corrente foi linear. Amplitudes
maiores parecem não atuar de modo significativo na sensibilidade para fins
analíticos. Em função disto, optou-se por trabalhar com uma amplitude de 100
mV.
Figura 14. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em eletrodo modificado
com 10 % de hemina em função da amplitude
v
= 20 mV s
-1
.
5.2.4-Influência da velocidade de varredura
No estudo da influência da velocidade de varredura a amplitude foi
ajustada em 100 mV e a velocidade foi avaliada em intervalos de 0,01 a
0,1 V s
-1
. A Figura 15 mostra o efeito da variação da velocidade na corrente de
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
0
5
10
15
20
25
30
i (
µ
A)
Amplitude ( mV)
36
pico para a amodiaquina. Observou-se um aumento seguido de um decréscimo
da corrente de pico com um valor máximo para a velocidade de 80 mV s
-1
.
Velocidades maiores diminuem a resolução, e, conseqüentemente, a
sensibilidade da técnica. Em função disto, optou-se por trabalhar na velocidade
de 80 mV s
-1
.
Figura 15. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em função da velocidade
de varredura em eletrodo modificado com 10 % de hemina.
∆E
=100 mV
5.2.5-Influência da concentração do analito
Para o estudo do efeito da concentração, inicialmente foram ajustadas
as condições ótimas de análise em pH 7,0; amplitude em 100 mV e velocidade
de varredura em 80 mV s
-1
. Uma série de experimentos em triplicata foi
conduzida para construir as curvas de calibração. A linearidade entre os sinais
de corrente e a concentração do analito foi verificada no intervalo de
4,0 x 10
-5
a 2,0 x 10
-4
mol L
-1
, com um coeficiente de correlação de 0,9996,
indicando que há uma correlação forte entre os dados testados e representado
pela equação da reta:
0 20 40 60 80 100
5
6
7
8
9
10
-i
pc
(A)
Velocidade (mV s-1)
37
i = 1,4 x 10
-2
+ 4,3 x 10
-7
[AMQ] (N = 7, r = 0,9996)
A curva analítica foi construída pelo método da adição de padrão,
partindo-se de uma solução estoque de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
, sendo registradas as
curvas voltamétricas por pulso diferencial (Figura 16). Observou-se que a
corrente de pico aumentou proporcionalmente com o aumento da concentração
e que praticamente não ocorreram deslocamentos nos potenciais de pico.
0,0
4,0x10
-5
8,0x10
-5
1,2x10
-4
1,6x10
-4
2,0x10
-4
5,0x10
-7
1,0x10
-6
1,5x10
-6
2,0x10
-6
2,5x10
-6
3,0x10
-6
i (A)
[AMQ], mol/L
Figura 16. Curva analítica da amodiaquina em solução B-R pH 7,0 por
voltametria de pulso diferencial. ∆E= 100 mV, v= 80 mV s
-1
.
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) são característicos do
desempenho de cada procedimento de análise e dependem do processo em
estudo. Segundo INMETRO (2007), estes parâmetros podem ser calculados
utilizando-se as equações abaixo:
38
LD= 3S
b
/ b e LQ= 10 S
b
/ b
Onde S
b
é o desvio padrão da média aritmética e b o valor do coeficiente
angular da reta de calibração. Já o coeficiente de variação pode ser obtido pela
razão entre o desvio padrão da reta e o valor médio de concentração dentro da
faixa linear, sendo uma das formas mais usuais de expressar a precisão de um
determinado método.
c.v. = S
b
/ X
m
x 100
O limite de detecção obtido foi de 4,8 x 10
-6
mol L
-1
. O limite de
quantificação obtido foi de 1,6 x 10
-5
mol L
-1
.
A tabela 2 mostra os parâmetros que foram analisados e definidos a
partir da melhor resolução dos picos.
Tabela 2. Otimização dos parâmetros da análise de amodiaquina em
biossensor de hemina pela técnica de voltametria de pulso diferencial
Parâmetros Analisados
Otimizados
Composição da pasta ( % do modificante )
5 a 50 10
pH 2 a 12 7
Velocidade de varredura ( mV.s
-
1
)
10 a 100 80
Amplitude (mV) 20 a 200 100
Na Tabela 3 encontram-se os valores de LD e LQ da curva analítica da
amodiaquina obtida por voltametria de pulso diferencial (VPD) usando o
eletrodo modificado com hemina como eletrodo de trabalho.
39
Tabela 3. Resultado dos valores de limite de detecção e quantificação para a
amodiaquina utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial (VPD)
Técnica b (A/mol L
-
1
) r c.v. LD (mol L
-
1
) LQ (mol L
-
1
)
VPD 1,4 x 10
-
2
0,9996 0,02 4,8 x 10
-
6
1,6 x 10
-
5
5.3-Voltametria de onda quadrada em biossensor de hemina
A voltametria de onda quadrada é uma das técnicas voltamétricas de pulso
mais rápidas e sensíveis. Os limites de detecção podem ser comparados aos
das técnicas cromatográficas. Além disso, a análise de parâmetros
característicos desta técnica, como freqüência e a amplitude da onda quadrada
e a velocidade de varredura, permite a aquisição de informações quanto á
cinética e ao mecanismo do processo eletroquímico em questão. A técnica de
voltametria de onda quadrada é mais rápida e há um consumo menor de
espécies eletroativas quando comparada com a voltametria de pulso
diferencial.(Skoog et al., 1992).
5.3.1- Influência da freqüência
Para o estudo da amodiaquina por voltametria de onda quadrada, foi
utilizado uma solução constituída por 5,0 mL de solução tampão B-R pH 7,0 e
por 1,0 mL da solução do analito de 1,0 x 10
-3
mol L
-1
.
Foram inicialmente estudadas as condições ideais para a influência de
parâmetros operacionais de freqüência, velocidade de varredura, amplitude,
tempo de deposição e concentração objetivando com isso o melhor sinal
analítico.
No estudo da influência da freqüência, a velocidade foi ajustada em
80 mV s
-1
, a amplitude em 100 mV e foi realizada uma varredura de freqüência
entre 20 e 200 Hz.
40
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
i (
µ
A)
Frequência(Hz)
Figura 17. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em eletrodo modificado
com 10 % de hemina em função da freqüência
∆E
= 100 mV
v
= 80 mV s
-1
.
A Figura 17 mostra o efeito da variação da freqüência na corrente de pico
para a amodiaquina. Observou-se por meio da variação da freqüência da onda
quadrada para a amodiaquina sobre o eletrodo de pasta de carbono modificado
com 10% de hemina, que um aumento no valor da freqüência causa um
aumento proporcional na intensidade de corrente de pico. Na faixa linear o valor
de freqüência que teve o melhor sinal analítico foi de 150 Hz, uma vez que,
freqüências acima de 150 Hz não influenciarm de maneira significativa na
intensidade do sinal, e, por este motivo, a freqüência de trabalho escolhida foi a
de 150 Hz.
5.3.2- Influência da amplitude
No estudo da influência da amplitude, a velocidade foi ajustada em
80 mV s
-1
e a freqüência em 150 Hz e foi realizada uma varredura de amplitude
entre 20 e 300 mV.
A figura 18 mostra o efeito da variação da amplitude na corrente de pico
para a amodiaquina, fazendo uso da técnica de voltametria de onda quadrada.
41
Verificou-se que para valores de amplitudes até 200 mV, o potencial de pico
permaneceu constante e a corrente de pico foi linearmente dependente da
amplitude. Para valores de amplitudes acima de 200 mV o sinal tornou-se
irregular. Adicionalmente, amplitudes maiores parecem não atuar de modo
significativo na sensibilidade para propósitos analíticos. Em função disto, optou-
se por trabalhar com amplitude da onda quadrada de 200 mV.
0 50 100 150 200 250 300
0
2
4
6
8
10
12
14
16
i (
µ
A)
Amplitude ( mV)
Figura 18. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em eletrodo modificado
com 10 % de hemina em função da amplitude
v
= 80 mV s
-1
.
5.3.3-Influência do incremento de varredura
No estudo da influência do incremento de varredura, a amplitude foi
ajustada em 200 mV e a freqüência em 150 Hz,foi realizada uma varredura de
velocidade entre 20 e 1000 mV s
-1
.
A Figura 19 mostra o efeito da variação da velocidade na corrente de
pico para a amodiaquina. Observou-se por meio da variação da velocidade
utilizando a técnica de onda quadrada, que de 20 até 40 mV s
-1
houve um
42
aumento no potencial de pico, e, após a velocidade de 40 mV s
-1
, a corrente
permanece constante, não apresentando mudança significativa no
comportamento. Em função disto, optou-se por trabalhar com a velocidade da
onda quadrada de 40 mV s
-1
.
0 200 400 600 800 1000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
-ipc (
µ
A)
velocidade (mV s
-1
)
Figura 19. Comportamento da corrente anódica da amodiaquina de
concentração 1,0 x 10
-3
mol L
-1
em solução BR pH 7,0 em função da velocidade
de varredura em eletrodo modificado com 10 % de hemina.
∆E
=200 mV e
F = 150 Hz.
5.3.4-Influência da concentração do analito
Para estudo do efeito da concentração, inicialmente foram ajustadas as
condições ótimas de análise em pH 7,0; freqüência de 150 Hz, amplitude em
200 mV e velocidade de varredura em 40 mV s
-1
. Uma série de experimentos
em triplicata foi conduzida para construir as curvas de calibração. A linearidade
entre os sinais de corrente obtidos e a concentração do analito foi estabelecida
dentro do intervalo de 1 x 10
-6
a 2 x 10
-5
mol L
-1
, obtendo-se a seguinte
equação da reta:
43
i = 7,0 x 10
-8
+ 1,13 [AMQ] (r = 0,9992, N=8)
A curva analítica foi construída pelo método da adição de padrão,
partindo-se de uma solução estoque 1,0 x 10
-3
mol L
-1
, sendo registradas as
curvas voltamétricas por onda quadrada (Figura 20). Observou-se que a
corrente de pico aumenta proporcionalmente com o aumento da concentração e
que praticamente não ocorrem deslocamentos nos potenciais de pico no
intervalo de 5,0 x 10
-6
a 2,0 x 10
-5
mol L
-1
.
O limite de detecção obtido foi de 8,7 x 10
-7
mol L
-1
. O limite de
quantificação obtido foi de 2,9 x 10
-6
mol L
-1
. Na Tabela 4 encontram-se os
valores de LD e LQ da curva analítica da amodiaquina obtida por voltametria de
onda quadrada (VOQ) usando o eletrodo modificado com hemina como eletrodo
de trabalho.
0,0
5,0x10
-6
1,0x10
-5
1,5x10
-5
2,0x10
-5
0,0
5,0x10
-6
1,0x10
-5
1,5x10
-5
2,0x10
-5
2,5x10
-5
i (A)
[AMQ], mol/L
Figura 20. Curva de calibração obtida para amodiaquina em solução BR pH 7,0
por voltametria de onda quadrada. F = 150 Hz
∆E
= 200 mV,
ν
= 40 mV s
-1
.
44
Tabela 4. Otimização dos parâmetros da análise de amodiaquina em
biossensor de hemina pela técnica de voltametria de onda quadrada
Parâmetros Analisados Otimizados
composição da pasta ( % do modificante ) 5 a 50 10
pH 2 a 12 7
velocidade de varredura ( mV.s
-
1
)
20 a 1000 40
amplitude (mV) 20 a 300 200
freqüência (Hz) 20 a 200 150
A tabela 4 mostra os parâmetros que foram analisados e definidos a
partir da melhor resolução dos picos.
Tabela 5. Resultado dos valores de limite de detecção e quantificação para a
amodiaquina, utilizando a técnica de voltametria de onda quadrada
Técnica b (A/mol L
-
1
) r c.v. LD (mol L
-
1
) LQ (mol L
-
1
)
VOQ 1,13 0,9992 3,14 8,7 x 10
-
7
2,9 x 10
-
6
Portanto, no desenvolvimento de um método eletroanalítico há
necessidade de realizar-se a escolha de determinados parâmetros para
otimização do mesmo.O coeficiente de variação, limite de detecção (LD) e de
quantificação (LQ), dependem do processo em estudo, e possuem uma
característica peculiar para cada procedimento analítico e denotam
confiabilidade de precisão e exatidão aceitáveis, para condição de análise.
Tabela 6. Resumo dos resultados analíticos obtidos para cada método
desenvolvido para a determinação de amodiaquina em biossensor de hemina
Técnica b (A/mol L
-
1
) r c.v. LD (mol L
-
1
) LQ (mol L
-
1
)
VPD 1,4 x 10
-
2
0,9996 0,02 4,8 x 10
-
6
1,6 x 10
-
5
VOQ 1,13 0,9992 3,14 8,7 x 10
-
7
2,9 x 10
-
6
45
A tabela 6 mostra de forma concisa os resultados eletroanalíticos dos
dados tratados estatisticamente a partir dos métodos descritos anteriormente e
que servem de parâmetros para a definição da melhor condição analítica.
Portanto, diante do estudo comparativo entre os dois métodos avaliados,
a voltametria de onda quadrada, além de uma técnica mais rápida, quando do
que a voltametria de pulso diferencial, tamb[em apresentou melhor
desempenho para a determinação da amodiaquina principalmente em baixas
concentrações. Sendo, portanto, a técnica escolhida para a determinação da
amodiaquina em amostra real.
5.4- Aplicação da metodologia para determinação de amodiaquina em leite
materno
Em termos de composição química, o leite materno é uma matriz
complexa, pois está sujeito a mudanças significativas nas concentrações de
lipídeos e proteínas, dependentes da fase da lactação (colostro versus leite
maduro) ou até mesmo da fase de mamada (leite anterior versus leite posterior)
ver tabela 7 (Levy, 1994; Woolfolk et al., 1989).
Tabela 7. Tipos de leite durante a fase de lactação
Colostro 1º a 7º dia, produção de 100mL/dia
Leite de transição 8º a 15º
dia, produção de 500ml/dia.
Leite maduro 16º dia em diante.
Leite prematuro Maior teor de gordura, lipídeos e
calorias, menor teor de lactose
Fonte: OMS/CDR/93.6
A composição do leite maduro varia não apenas entre lactantes, mas
também, considerando a mesma lactante entre as mamas, em mamadas
diferentes e até no decurso da mesma amamentação (Gulati et al., 1993).
Vários são os fatores que podem determinar variações na composição do leite
46
materno, como: estágio de lactação, parto prematuro, tempo de gestação,
esvaziamento da mama, hora e intervalo entre as mamadas, grau de pressão
utilizado para extrair o leite, método e horário de coleta das amostras, técnicas
de análise laboratorial, intervalo entre as gestações e a ingestão de álcool ou
drogas. Tais alterações influenciam na extensão da transferência de drogas do
plasma para o leite, causando variações nas concentrações destes compostos
no leite materno (Clark, 1994).
Tabela 8. Composição do leite materno (100mL).
•
Energia - 70 kcal
•
Proteína - 1,1 g
•
Caseína:albumina - 40:60
•
Lipídios - 4,2g
•
Carboidrato - 7g
•
Vitamina A - 190 mcg
•
Vitamina D - 2,2 mcg
•
Vitamina E - 0,18 mg
•
Vitamina K - 1,5 mcg
•
Vitamina C - 4,3 mg
•
Tiamina - 16 mcg
•
Riboflavina - 36 mcg
•
Niacina - 147 mcg
•
Piridoxina - 10 mcg
•
Folato - 5,2 mcg
•
Vitamina B12 - 0,03 mcg
•
Cálcio - 34 mg
•
Fósforo - 14 mg
•
Ferro - 0,05 mg
•
Zinco - 0,3 mg
•
Água - 87,1 mL
•
Sódio - 0,7 mEq
•
Cloro - 1,1 mEq
•
Potássio - 1,3 mEq
Fonte: OMS/CDR/93.6
Com o objetivo de testar a metodologia desenvolvida para determinação
da amodiaquina em amostras de leite materno, a técnica de voltametria de onda
quadrada (VOQ) foi selecionada, utilizando o eletrodo de hemina como eletrodo
de trabalho, uma vez que esta técnica apresentou uma melhor sensibilidade
para baixas concentrações de amodiaquina.
O estudo do efeito matriz indicou que a maior quantidade da matriz que
pode ser utilizada sem alteração do sinal analítico equivale a 100 µL em 5 mL.
Para determinar a amodiaquina em amostras de leite materno, o método de
adição de padrão foi utilizado por apresentar melhores resultados em análises
com matrizes complexas.
47
Inicialmente foi adicionado 5,0 mL da solução tampão B-R pH 7 na célula
eletroquímica. Em seguida, 100 µL do leite materno enriquecido com
amodiaquina na concentração de 1 x10
-3
mol L
-1
foi adicionado para a obtenção
do voltamograma de onda quadrada. Foram adicionados volumes sucessivos
da solução padrão de amodiaquina, para os quais foram obtidos valores
crescentes de corrente em cada voltamograma de onda quadrada. Com estes
valores de correntes de pico construíram-se gráficos que, por extrapolação,
permitiram determinar a concentração da amodiaquina na amostra. A figura 21
apresenta resultados típicos obtidos neste tipo de procedimento.
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6
2,0x10
-5
4,0x10
-5
6,0x10
-5
-i
pc
(A)
E (V vs Ag/AgCl)
Amostra
1,9 x 10
-5
mol L
-1
3,8 x 10
-5
mol L
-1
7,3 x 10
-5
mol L
-1
1,0 x 10
-4
mol L
-1
Figura 21. Voltamogramas de onda quadrada da determinação de amodiaquina
em leite materno em solução BR pH 7,0 com biossensor de hemina. Condições:
F = 150 Hz,
∆E
= 200mV, ν= 40 mV s
-1
.
48
0.0
2.0x10
-5
4.0x10
-5
6.0x10
-5
8.0x10
-5
1.0x10
-4
1.2x10
-4
3.0x10
-6
6.0x10
-6
9.0x10
-6
1.2x10
-5
1.5x10
-5
-i
pc
(A)
Concentracão (mol L
-1
)
Figura 22. Curva analítica da amodiaquina em amostra de leite materno em
solução BR pH 7,0 com biossensor de hemina. Condições: F = 150 Hz,
∆E
= 200 mV, ν= 40 mV s
-1
.
A Figura 22 corresponde à curva analítica para a amodiaquina em leite
materno apresentando linearidade no intervalo descrito na Figura 21 e
representado pela equação:
Y = 2,08 x 10
-6
+ 0,122 X (r = 0,9984, dp = 2,9 x 10
-7
, N=7)
Os limites de detecção e quantificação obtidos foram de
7,1 x 10
-6
mol L
-1
e 2,4 x 10
-5
mol L
-1
respectivamente.
Na Tabela 9 encontram-se os valores de LD e LQ e o resultado da
regressão linear da curva analítica da amodiaquina obtidas por voltametria de
onda quadrada (VOQ).
49
Tabela 9. Resultado dos valores de limite de detecção e quantificação para a
determinação de amodiaquina em leite materno, utilizando a técnica de
voltametria de onda quadrada.
Técnica b (A/mol L
-
1
) r Desvio
padrão
LD (mol L
-
1
) LQ (mol L
-
1
)
VOQ 0,12 0,9984
2,9 x 10
-
7
7,1 x 10
-
6
2,4 x 10
-
5
De acordo com a curva analítica da figura 22, a extrapolação do valor de
x é a concentração da amostra desconhecida. Essa concentração foi de
1,7 x 10
-5
mol L
-1
de amodiaquina, o que corresponde há uma recuperação de
85%.
5.5 - Estudo de interferentes
A fim de investigar a seletividade do método proposto, alguns possíveis
interferentes foram analizados. Visando verificar o grau de interferência de
outros fármacos na resposta voltamétrica da amodiaquina com o eletrodo de
pasta de carbono modificado com hemina, alguns compostos, tais como ácido
ascórbico, primaquina, clonidina, dipirona, minociclina e penicilina G foram
avaliados em diferentes níveis de concentração na solução de pré-
concentração. Estes testes foram feitos pela adição destes possíveis
interferentes à solução de amodiaquina 1,0 × 10
-3
mol L
-1
e os resultados foram
comparados com os resultados obtidos para as medidas feitas somente com a
solução de amodiaquina.
A influência dos interferentes na determinação da amodiaquina foi
avaliada com base na diminuição ou aumento da corrente de pico do sinal
voltamétrico da amodiaquina nas condições de determinação otimizadas.
.
50
Tabela 10. Resultados analiticos obtidos para o estudo de interferentes de cada
composto analisado em biossensor de hemina
composto interferente
ácido ascórbico
sim
conc. > 2,0 x 10
-5
mol L
-1
primaquina
sim
conc. > 2,0 x 10
-5
mol L
-1
clonidina não
dipirona não
minociclina sim
conc. > 2,0 x 10
-5
mol L
-1
penicilina G não
A tabela 10 nos mostra os resultados obtidos nessa avaliação. Os
compostos interferentes foram escolhidos baseados em sua solubilidade em
água. Para dipirona, clonidina e peniciclina G não foram observadas variações
significativas na resposta voltamétrica do biossensor de hemina. Porém, a
minociclina e o ácido ascórbico interferem nas análises diminuindo as correntes
dos picos nos voltamogramas e conseqüentemente a sensibilidade da técnica,
mas não houve surgimento de outro pico, enquanto que a primaquina teve uma
diminuição no valor da corrente devido ao surgimento de outro pico.
5.6- Método comparativo: UV-Vis
Para a comparação do método eletroquímico utilizou-se a
Espectrofotometria na região UV-Vis.
As análises realizadas para determinação de amodiaquina em leite
materno em UV-Vis foram feitas com a solução estoque contendo
51
1 x 10
-4
mol L
-1
de amodiaquina, para comparação dos resultados obtidos com
o método proposto.
Utilizando o método de adição de padrão, foram obtidos valores
crescentes de absorbâncias em função da concentração do padrão de
amodiaquina. Deste comportamento da absorbância foi possível determinar a
concentração de amodiaquina nas amostras.
Os espectros no UV foram obtidos no comprimento de onda de 341,5 nm
para a quantificação. Este valor representa o máximo de absorção do analítico.
Os resultados obtidos são apresentados na figura 23.
200 300 400 500 600
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Absorbância
Comp. de onda (nm)
Amostra
1,9 x 10
-6
mol L
-1
3,8 x 10
-6
mol L
-1
7,3 x 10
-6
mol L
-1
8,9 x 10
-6
mol L
-1
Figura 23: Espectros de absorção para a determinação de amodiaquina em
leite materno.
O comprimento de onda foi ajustado em 341,5 nm, e uma curva analítica
foi construída, com soluções padrão, obtendo-se uma relação linear que pode
ser apresentada pela equação:
Abs. = 0,67 + 2,86 x 10
4
[AMQ] (r = 0,9991; N=7)
52
Os limites de detecção e quantificação obtidos foram de 6,2 x 10
-7
mol L
-1
e 2,0 x 10
-6
mol L
-1
, respectivamente.
De acordo com a curva de adição de padrão obtida, a extrapolação da
reta no eixo x corresponde a concentração da amostra desconhecida. Na Figura
24, essa concentração foi de 2,6 x 10
-5
mol L
-1
de amodiaquina.
3,0x10
-6
6,0x10
-6
9,0x10
-6
1,2x10
-5
1,5x10
-5
0,72
0,80
0,88
0,96
1,04
absorbância
[AMQ], mol/L
Figura 24: Curva analítica para determinação da amodiaquina em leite materno
em solução BR pH 6,0 em UV-Vis.
A comparação entre a precisão dos dois métodos foi realizada pela
aplicação do teste de Snedecor (Teste F), o qual considera a razão entre as
variâncias amostrais dos dois métodos analíticos desenvolvidos. Os resultados
são apresentados na tabela 11.
53
Tabela 11. Resultados para o estudo de comparação da precisão de métodos
usados para a análise de amodiaquina em leite materno
Método analítico
Grau de liberdade
Sb F
Voltametria 7 2,9 x 10
-
7
*F
calculadp
= 4,2 x 10
8
Espectrofotometria
6 5,9 x 10
-
3
F
crítico
=3,866
*F
calculadol
= σ
2
(espectrofotometria)/ σ
2
(voltametria)
Aplicando-se o teste F para comparação entre os dois métodos,
observou-se que, o valor de F calculado é muito maior do que o valor crítico de
F, neste caso pode-se afirmar que há diferença estatisticamente significativa
entre os resultados obtidos a 95% de confiança. Esta diferença é evidente
quando comparamos as faixas lineares de cada uma das técnicas, bem como
seus valores de desvio padrão. É possível concluir que o método
espectrofotométrico apresenta menor sensibilidade para amodiaquina. Este
efeito é acentuado na amostra real devido às características coloidais do leite
materno, havendo neste caso a necessidade de um pré-tratamento para
diminuição do efeito matriz.
54
VI-CONCLUSÃO
O presente trabalho demonstrou a potencialidade do uso de hemina
como agente modificador de eletrodos, apresentando uma resposta
voltametrica simples de ser avaliada quando ao seu comportamento
eletroquímico. A hemina estudada foi fortemente adsorvida sobre a
superfície do eletrodo de pasta de carbono.
A facilidade de preparo do biossensor e a simplicidade de renovação de
sua superfície são aspectos vantajosos do eletrodo desenvolvido.
Os estudos da eletroatividade da amodiaquina em eletrodo de hemina
indicam de um único processo oxidativo com transporte de massa
difusional.
Diante do estudo comparativo dos dados encontrados para cada método,
os parâmetros indicaram que a voltametria de onda quadrada, em
relação a voltametria de pulso diferencial, tem como vantagens a rapidez
na varredura, maior sensibilidade para baixas concentrações e menor
limite de detecção.
O biossensor contendo 10 % de hemina associado à voltametria de onda
quadrada mostrou bom desempenho para a determinação de
amodiaquina em leite materno em baixas concentrações. Nesse estudo
as condições otimizadas encontradas foram: pH = 7; velocidade de
varredura = 40 mV s
-1
; amplitude = 200 mV e freqüência = 150 Hz. A
dependência da corrente de pico com a concentração apresentou
linearidade entre 5,0 x 10
-6
a 2,0 x 10
-5
mol/L, limite de detecção de 8,7
x 10
-7
mol L
-1
, limite de quantificação de 2,9 x 10
-6
mol L
-1
e coeficiente
de variação de 3,14%.
É importante ressaltar que o método desenvolvido mostrou-se eficiente
na determinação de amodiaquina presente no leite materno, sendo
simples, sensível, reprodutível e sem a necessidade de tratamento prévio
da amostra.
55
VII-REFERÊNCIAS
ABREU, F.C.; FERRAZ, P.A.L.; GOULART, M.O.F. Some applications of
electrochemistry in biomedical chemistry. Emphasis on the correlation of
electrochemical and bioactive properties. Journal of the brazilian chemical
society, São Paulo, v. 13, p. 19-35, 2002.
ADAMS, P. A.; BERMAN, P. A. M.; EGAN, T. J.; MARSH, P. J.; SILVER, J.;
Molecular modeling study of complexes between ferriprotoporphyrin IX and
antimalarial 4-quinolinecarbinolamines: a proposal of pharmacophore,J.
Inorganic Chemistry, p. 63,69,1996.
ALEIXO, L. M.. .Voltametria: Conceitos e Técnicas. Disponível em:
www.chemkeys.com, o seu site de química, 2009.
Amamentação e uso de drogas / Secretaria de Políticas de Saúde Área Técnica
de Saúde da Criança - Brasília Ministério da Saúde. 72p. ISBN: 85-334-0241-4,
2000.
American Academy of Pediatrics. Committee on drugs. The transfer of drugs
and other chemicals into human milk. Pediatrics;108:776-89, 2001.
ANCA,I. S., ZIMA J., BAREK J., Differential Pulse Voltammetric Determination
of 8-Aminoquinoline Using Carbon Paste Electrode , Analytical Letters,1532-
236X, Volume 38, Issue 1, Pages 149-156, 2005.
ANDERSON, P.O., POCHOP L.S., MANOGUERRA A.S. Adverse drug
reactions in breastfed infants: less than imagined. Clinical Pediatrics;42:325-
40, 2003.
ANSARI , M. T. ; TARIQ M, A.I ; RAZA,A. ; ASHRAF, M. ; YAR, M. ;
Spectrophotometric Determination of Amodiaquine and Sulfadoxine in
56
Pharmaceutical Preparations. Chemia analityczna, vol. 53, n
o
2, pp. 305-313,
2008.
BALLA, J.; BALLA, G.; JENEY, V.; KAKUK, G.; JACOB H. e VERCELLOTTI,
G.,Fs and endothelium: a – 2. edged. Sword- promotion of oxidation and
induction of cytoprotectantes- Blood v.95, p.3442-3450.2000.
BEGG, E. J.; DUFFULl, S. B.; HACKETT, L. P., ILETT, K. F. Studying drugs in
human milk: Time to unify the approach. Journal of Human Lactation, 18, p.
323-332, 2002.
BRASSEUR P. ET AL. Amodiaquine remains effective for treating
uncomplicated malaria in west and central Africa. Transactions of the Royal
Society of Tropical Medicine and Hygiene, 93(6):645-650, 1999.
BRETT, A. M. O.; BRETT C. M. A. Eletroquímica: princípios, métodos e
aplicações.Coimbra: Livraria Almeida, 444 p., 1993.
BUFFLE J., WAEBER TERCIER M.-L., Análise voltamétrica de metais traço e
especiação ambiental: do laboratório para medidas in situ. (Revisão).
Tendências em Química Analítica, 24, 172-191, 2005.
CHAVES R.G., LAMOUNIER J.A., Uso de medicamentos durante a lactação.
Jornal de Pediatria; 80(5) : 89-98, 2004.
CHEN, J.; WOLLENBERGER, U.; LISDAT, F.; GE, B.; SCHELLER, F.W.
Superoxide sensor based on hemin modified electrode. Sensors and
Actuators, B, Lausanne, v. 70, p. 115-120, 2000.
CHEN, Y.; HE, C.-X.; ZHU, S.-M.; CHEN, H.-Y.; LI, Y. Electrocatalytic reduction
of artemether by hemin. Journal of The Electrochemical Society,
Pennington, v. 144, p. 1891-1894, 1997.
57
CHEN, Y.;, ZHU, S.-M.; CHEN, H.-Y.; LI, Y. Artesunate interaction with hemin.
Bioelectrochemistry and Bioenergetics , v. 44, p. 295-300, 1998.
CLARK, D. C. Trends in the prevalence of dental fluorosis in North America.
Community Dentistry and Oral Epidemiology, 22, p. 148-152, 1994.
COSTEDOAT-CHALUMEAU N.; AMOURA, Z.; HUONG, D. L.T.; LECHAT, P.;
PIETTE, J.C.: Safety of hydroxychloroquine in pregnant patients with connective
tissue diseases. Review of the literature (Segurança de hidroxicloroquina em
pacientes gestantes com doenças do tecido conjuntivo) Autoimmunity Reviews
4: 111-5. Instituição: Service de Medecine Interne, Centre Hospitalier
Universitaire Pitie-Salpetriere, Paris, França, 2005.
COX, J. A.; TESS, M. E.; CUMMINGS, T. E.; Analytical Chemistry, 15, 173,
1996.
DORN, A.; STOFFEL, R.; MATILE, H.; BUBENDORF, A.; RIDLEY, R. G.;
Malarial haemozoin b-haematin supports haem polymerization in the absence of
protein. Nature ,374, 269, 1995.
DUA V.K., GUPTA N.C., SHARMA V.P., SUBBARAO S.K., Liquid
chromatographic determination of amodiaquine in human plasma.Journal of
Chromatography B, 803, 371, 2004.
EGAN, T. J.; ROSS, D. C.; ADAMS, P. A.; Quinoline anti-malarial drugs inhibit.
FEBS Lett. Sep 19;352(1):54–57 , 1994.
EGAN, T. J.; MARQUES, H. M.; Доступ к полному тексту закрыт.
Coordination Chemistry Reviews, 190-192, 493, 1999.
FLEET, B. GUNASINGHAM,H E. “Electroanalytical Chemistry”, ed. A.J. Bard,
Dekker, New Yord, Vol. 16, 1989.
58
FREIRE, S. R; PESSOA, C. A.; KUBOTA, L. T. Emprego de Monocamadas
Auto-Organizadas no Desenvolvimento de Sensores Eletroquímicos. Química
Nova, 26: 381-389, 2003.
GALLI, A.; SOUZA, D.; GARBELLINI, G. S.; COUTINHO, C. F. B.; Mazo, L.
H.;AVACA, L. A.; MACHADO, S. A. S. Utilização de técnicas eletroanalíticas na
determinação de pesticidas em alimentos. Química Nova, v. 29, p. 105–112,
2006.
GIAO P.T., VRIES P.J. Pharmacokinetic interactions of antimalarial
agents.Clinical Pharmacokinetics, 40, 343, 2001.
GULATI, P.; SINGH, V.; GUPTA, M. K.; VAIDYA, V.; DASS, S.; PRAKASH, S.
Studies on theaching of fluoride in tea infusions. The Science of the total
environment, 138, p. 213-222, 1993.
GUPTA S., THAPAR M.M., MARIGA S.T.,WERSNSDORFER W.H.,
BJÖRKMAN A., Quimioterapia da Malária.Um século no desenvolvimento de
antimaláricos.Exp.Parasit. 100, 28, 2002.
HALE TW. Drug therapy and breastfeeding: pharmacokinetics, risk factors, and
effects on milk production. Neoreviews 2004;5:e164-72. Disponível em:
http://neoreviews.aappublications.org/cgi/reprint/neoreviews;5/4/e164
INMETRO. Orientação sobre validação de métodos de ensaios químicos -DOQ-
CGCRE-008. Rev.02. 2007. 24p.
ITO S. Drug therapy for breastfeeding women.New England Journal of
Medicine;343:118-26, 2000.
KALCHER, K., KAUFFMANN, J.M., WANG, J., SAVANCARA, I., VYTRAS, K.,
NEUHOLD, C., YANG, Z. Sensors based on carbon paste in electrochemical
59
analysis: a review with particular emphasis on the period 1990 -1993.
Electroanalysis, 7(1):5-22, 1995.
KASTURE, A. V.; S. G. WADODKAR; K. M. GOKHALE; Pharmaceutical
chemistry parte II; Nirali prakasha editora; págs. 287,292-301; 1993.
KENNETH, I., O. Anodic Oxidation and Amperometric Sensing of Hydrazine at a
Glassy Carbon Electrode Modified with Cobalt (II) Phthalocyanine-cobalt (II)
Tetraphenylporphyrin (CoPc-(Cotpp)4) Supramolecular Complex. Revista
Sensor, n.6, p.874-891, 2006.
KISSINGER, P. T.; HEINEMAN, W. R.; Laboratories Techniques in
Electroanalytical Chemistry, 2a ed. Marcel Dekker, Inc, New York, 1996, pp. 96.
KHALIL, SHABAN M.; et al.; Spectrophotometric determination of Chloroquina
and Pyrimethamine through ion-pair formation with molybdenum and
thiocyanate; Microchemical Journal 64 ,181-186; Egypt, 2000.
LEVY, S. M. Review of fluoride exposures and ingestion. Community Dentistry
and Oral Epidemiology, 22, p. 173-180, 1994.
LINDEGANDH, N.; FORSLUND, M.; GREEN,M.D.; KANEKO, A.; BERGQUIST,
Y.;Automated solid-phase extraction for determination of amodiaquine,
chloroquine and metabolites in capillary blood on sampling paper by liquid
chromatography, Chromatographia, 55, 5, 2002.
LUZ, R.C.S.; DAMOS,F.S.; OLIVEIRA,A.B.;BECK, J.;KUBOTA, L.T.;
Amperometric sensor for nitrite based on copper tetrasulphonated
phthalocynine immobilized with poly-l-lysine film. Talanta, v.64, p.935, 2004.
LUZ, R.C.S.; DAMOS,F.S.; OLIVEIRA,A.B.;BECK, J.;KUBOTA, L.T.;
Development of a sensor based on tetracyanoethylenide ( LiTCNE) / poly-l-
60
lysine ( PLL) for dopamine determination.Electrochim Acta, v.50, p.2675,
2005.
MARIGA S.T., GIL J.P., WERNSDORFER W.H.,BJÖRKMAN A., Acta Tropica
93,221, 2005.
MARQUES A.C.; PINHEIRO, E. A.; Fluxos de casos de malária no Brasil em
1980. Revista Brasileira de Malariologia e Doenças Tropicais, 34, 1, 1982.
MARQUES, A.C. Human imigration and the spread of malaria in Brazil.
Parasitology Today v. 3, p. 166, 1987
MARQUES A.C. Dados epidemiológicos de malária em todo Brasil, referentes
a 1993. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Brasilia, v.
28, n. 2, p. 141-155, abr/jun., 1995.
MENDIS, K.; SINA, B.J.; MARCHESINI, P.; CARTER, R.: The neglected burden
of Plasmodium vivax malaria. American Society of Tropical Medicine and
Hygiene, (64): 97-106, 2001.
MIHALY, G.W.; NICHOLL, D.D.; EDWARDS, G.; WARD, S.A.; ORME, M.L.;
WARREL,D.A.;BRECKENRIDGE,A.M.;High-performance-liquid hromatographic
analysis of amodiaquine in human plasma, Journal of Chromatography, 337,
166,1985.
Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde. Área técnica de Saúde
da Criança. Amamentação e uso de drogas. Brasília: Ministério da Saúde;
2000.
Ministério da Saúde. Vigilância em saúde. Situação epidemiológica da malária
no Brasil, 2005. http://www.saude.gov.br/svs (acessado em 06/04/2010).
61
MINZI, O.M.S., MAIS, M., SVENSSON,J.O., GUSTAFSSON,L.L.,
ERICSSON,O., High performance liquid chromatographic method for
determination of amodiaquine, chloroquine and their monodesethyl metabolites
in biological samples, Journal of Chromatography B, 783, 473, 2003.
MOSES, P.R. , P.WIER E R.W. MURRAY, A Chemically Modified Tin Oxide
Electrode.Analytical Chemistry, 47, 1882, 1975.
MOUNT, D.L.; PATCHEN, L.C.; DINH, P.N.; BARBER, A.M.; SCHWARTZ,
I.K.; CHURCHILL, F.C.; Sensitive analysis of blood for amodiaquine and three
metabolites by high performance liquid chromatography with electrochemical
detection, Journal of Chromatography, 383, 375, 1986.
NAISBITT D.J., RUSCOE J.E., WILLIAMS D., O' NEILL P.M., PIRMOHAMED
M.,PARK B.K., Disposition of amodiaquine and related antimalarial agents in
human neutrophils.Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics. 280, 884, 1997
NAN, C.G.; FENG, Z.Z.; LI, W.X.; PING, D.J.; QIN, C.H.Electrochemical
behavior of tryptophan and its derivatives at a glassy carbon electrode modified
with hemin. Analytica Chimica Acta , v. 452, p. 245-254,2002.
OLLIARO P.,NEVILL C., LEBRAS J., RINGWALD P., MUSSANO P.,GARNER
P., BRASSEUR P., Systematic review of amodiaquine treatment in
uncomplicated malaria, Lancet 348, 1196, 1996.
PACHECO, W., Desenvolvimento e comparação de métodos voltamétricos para
a determinação de ciclofenil e primaquina em medicamentos e em urina. Rio de
Janeiro,111 pgs. Dissertação de Mestrado - Departamento de Química,
Pontifícia Universidade Católica doRio de Janeiro, 2004.
PAGE, CLIVE P. ET AL. Infecções Parasitárias.Farmacologia Integrada. São
Paulo:Manoele, p.461 - 66. cap. 25, 1999.
62
PETERS, W.; Drug resistance in malaria parasites of animals and man.
Advances in Parasitology 41,pp 1-62, 1998.
PEREIRA, A. C.; SANTOS, A. D.; KUBOTA, L. T. Tendências em modificação
de eletrodos amperométricos para aplicações eletroanalíticas. Química Nova,
v. 25, n. 6, p.1012-1021, 2002.
PONKA, P. Cell biology of heme. American Journal of the Medical Sciences,
V.318, p.241-256.1999.
PUSSARD, E.; VERDIER, F.; BLAYO, M.C.; BERNARD, H.C.; Simultaneous
determination of chloroquine, amodiaquine and their metabolites in human
plasma, red blood cells, whole blood and urine by column liquid
chromatography, Journal of Chromatography. 374,111, 1986.
RANDHIR, P., D.; NATHAN, S., L.; JOSEPH,W. Eletrochemical detection of
amino at carbon nanotube and nickel-carbon nanotube modified electrodes.
The Analyst, n.129, p. 1076-1081, 2004.
RIECKMANN KH, WILLERSON JR., WD, CARSON PE, AND FRISCHER H.
Effects of tetracycline against drugresistant falciparum malaria. Proceedings of
The Helminthological Society of Washington, v. 39, p. 339 -347, Nov, 1972.
RODRIGUEZ-PALMERO, M.; KOLETZKO, B.; KUNZ, C. Nutritional and
biochemical properties of human milk, part II: lipids, micronutrients and bioactive
factors. Clinics in Perinatology, 26, p. 335-359, 1999.
Roll Back Malaria; W. H. O., UNICEF. World Malaria Report 2005. Capturado
em 07 Out. 2006. Online. Disponível na Internet
http://www.globalpolicy.org/socecon/develop/africa/2005/05malariareport.pdf
Roll , B., http://www.rbm.who.int, OMS, 1998 (Geneva).
63
SANTOS FILHO, O. A;
Modelagem de proteínas por homologia. Tese de
Doutorado, Instituto Militar de Engenharia, Brasil, 2000.
SILVA, T.H.A; OLIVEIRA, M.T.; DOS SANTOS, H.F.; DE OLIVEIRA, A B.; DE
ALMEIDA, W.B.,SOUZA,M.F.B.; Química Nova, 20, 191, 1997.
SKOOG, D. A. E LEARY, J.J., "Principles of Instrumental Analysis", 4
th
ed.,
Saunders College Publishing, Philadelphia, 1992.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de análise
Instrumental.5. ed. Porto Alegre: Bookman, 836 p, 2002.
SLATER, A.; CERAMI, A.; Inhibition by chloroquine of a novel haem polymerase
enzyme activity in malaria trophozoites. Nature , 355, 167, 1992.
SOARES, I. S. ; RODRIGUES, M. M. . Malaria Vaccine: Roadblocks And
Possible Solutions. Brazilian Journal of Medical and Biological Research,
BRASIL, v. 31, p. 317-332, 1998.
STULIK, K. E PACAKOVA, V. “Electroanalytical measurements in Flowing
liquids”, Ellis Horwood, Chichester, 1987.
SOUZA, D.; MACHADO, S. A. S.; AVACA, L. A. Voltametria de onda quadrada.
Aspectos teóricos. Química Nova, v. 1, p. 81–89, 2003.
SOUZA, M. F. B. Eletrodos quimicamente modificados aplicados à
eletroanálise:uma breve abordagem. Química Nova, v. 20, p. 191–195, 1997.
SULLIVAN, D. J.; MATILE, H.; RIDLEY, R. G.; GOLDBERG, D. E. A common
mechanism for blockade of heme polymerization by antimalarial quinolinas.
Journal of Biological Chemistry, (273): 31103-7, 1998.
SUZUKI, H.; Advances in the microfabrication of electrochemical sensors and
systems.Electroanalysis, 12, 703, 2000.
64
SVANCARA, I.; VYTRAS, K. I.; BAREK, J.; ZIMA, J.; Carbon paste electrodes
in modern electroanalysis. Critical Reviews in Analytical Chemistry,31, 311-
345, 2001.
The comprehensive resource for physicians, drug and illness information;
Fansidar; antimalarial;Baixado do web site:
http://www.rxmed.com/b.main/b2.pharmaceutical/b2.1.monographs/CPS%20Mo
nographs/CPS-%20(General%20Monographs%20F)/FANSIDAR.html em
23/07/07.
TICIANELLI, E. A.; GONZALEZ, E. R. Eletroquímica: princípios e aplicações.
São Paulo: Universidade de São Paulo, 225 p, 1998.
VERMA, A.; VERMA,K.K.; Determination of amodiaquine in pharmaceuticals
by reaction with periodate and spectrophotometry or by high-performance liquid
chromatography, Analyst 115, 333, 1990.
WAGENER, F,H-D VOLK, D WILLIS, N ABRAHAM, M SOARES, G ADEMA E
C FIGDOR. Different faces of the heme-heme oxygenase system in inflamation,
Pharmacological Reviews, V.55, P.551-571.2003.
WANG, J., Stripping Analysis - Principles, Instrumentation and Applications,
VCH Publishers, 1985, Deerfield Beach, 1985.
WANG, J.; LU, J.; HOCEVAR, S. B.; FARIAS, P. A. M. Bismuth-coated carbon
electrodes for anodic stripping voltammetry. Analytical Chemistry, v. 72, p.
3218–3222, 2000.
WANG, J. Analytical electrochemistry. 2. ed. New York: Wiley-VCH, 222 p,
2001.
65
WANG, J.; LU, D.; THONGNGAMDEE, S.; LIN, Y.; SADIK, O. A. Catalytic
adsorptive stripping voltammetric measurements of trace vanadium at bismuth
film electrodes.Talanta, v. 69, p. 914–917, 2006.
WARHURST, D. C.; The quinine-haemin interaction and its relationship to
antimalarial activity. Biochemical Pharmacology, 30, 3323, 1981.
WHITE, N. J.; OLLIARO, P. L.; Strategies for the prevention of antimalarial drug
resistance: Rationale for combination chemotherapy for malaria.Parasitology
Today, 12, 399-401, 1996.
WHO (World Health Organization). Disponível em: http://www.who.int/en/
.Acessado em: 15/12/2003.
WILSON CUNICO; SAMIR A. CARVALHO; CLAUDIA R. B. GOMES &
GABRIELA H. MARQUES. Antimalarials drugs. History and new approaches.
Revista Brasileira de Farmácia, 89(1): 49-55, 2008
WINSTANLEY P.A.,SIMOOYA O.,KOFI-EKUE J.M.,WALKER O., SALAKO
L.A.,EDWARDS G., ORME M.L., BRECKENRIDGE A.M., Br. The disposition of
amodiaquine in Zambians and Nigerians with malaria. Journal of Clinical
Pharmacology, 29, 695-701, 1990.
WOLF, M. E.; Burger's Medicinal Chemistry: The Basis of Medicinal Chemistry,
Wiley: New York, 1980; Greenwood, D.; Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 36, 857, 1995.
WOOLFOLK, M. W. Relations of sources of systemic fluoride to prevalence of
dental fluorosis. Journal of Public Health Dentistry, 49, p. 78-81,1989.
World Health Organization, 2005; Brazil: Overivew of malaria control activities
and programme progress; <http://rbm.who.int/wmr2005/profiles/brazil.pdf>
acessado em 01/09/2009.
66
World Health Organization/Unicef. Breastfeeding and maternal medication.
Recommedations for drugs in the eleventh WHO model list of essential drugs.
[documento na Internet]. Genebra: WHO/Unicef; 2002 [citado em 2 de fevereiro
de 2007]. Disponível em: http://www.who.int/child-adolescent-ealth/NewPubli-
cations/NUTRITION/BF_Maternal_Medication.pdf
ZHENG N.
; ZENG Y. ; OSBORNE P. G. ; LI Y.
; CHANG W.
; WANG Z. ;
Electrocatalytic reduction of dioxygen on hemin based carbon paste electrode,
Journal of applied electrochemistry, vol. 32, n
o
2, pp. 129-133 (30 ref.), 2002
ZIMA J., C., STOICA AL, ZITOVA A., BAREK J. Voltammetric determination of
selected aminoquinolines using carbon paste electrode.Electroanalysis, 18 (2):
158-162, 2006.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
