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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Desenvolvimento de método por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência para diferenciação de
genótipos de Lippia gracilis Schauer
SÃO CRISTÓVÃO - SERGIPE
MAIO/ 2009
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Desenvolvimento de método por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência para diferenciação de
genótipos de Lippia gracilis Schauer
Silvana Vieira Floresta Gomes
Orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes
São Cristóvão
2009
Dissertação apresentada ao
Núcleo de Pós-Graduação em
Química da Universidade
Federal de Sergipe como
parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre
em Química.
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
G633d
Gomes, Silvana Vieira Floresta
Desenvolvimento de método por cromatografia líquida de alta
eficiência para diferenciação de genótipos de Lippia gracilis
Schauer / Silvana Vieira Floresta Gomes. – São Cristóvão, 2009.
139 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de
Sergipe, 2009.
Orientador: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes
1. Lippia gracilis. 2. Genótipos. 3. Fingerprint. 4. Cromatografia -
CLAE. I. Título.
CDU 543.54.5
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Deus, pela vida, fé, força e coragem para realizar este trabalho.
Ao Anderson, meu esposo, pelo amor, compreensão, estímulo, ajuda
e paciência.
À minha mãe e pai, Aurora e Salomão, pelas orações, força e pelo
amor incondicional em todos os momentos de minha vida.
Às minhas irmãs, Fernanda e Luciana, pelo carinho, orações e por ter
torcido por mim. Vocês são demais.
Ao meu amigo, Djalma, pela força e ajuda neste trabalho.
À toda a minha família e amigos, que ficaram felizes por esta vitória.
Muito obrigada por tudo.
A minha amiga, Maria da Paz, pelo apoio e incentivo para fazer o
mestrado.
AGRADECIMENTOS
À profª Drª Valéria Regina de Souza Moraes, pelo companheirismo,
amizade e orientação deste trabalho.
À Universidade Federal de Sergipe pela concessão da bolsa de
estudo e ao Departamento de Química pela oportunidade de execução deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira por sua colaboração no
desenvolvimento deste trabalho.
À Profª Drª Samísia Maria F. Machado pela ajuda e amizade.
Ao prof. Dr. Sandro Navickiene pela contribuição e por disponibilizar
equipamentos e materiais do seu laboratório para o desenvolvimento deste
trabalho.
Ao prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank pela identificação da espécie Lippia
gracilis Schauer.
À prof. Drª Quézia Bezerra Cass do Departamento de Química da
UFSCar, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado e ensinamentos,
durante a minha passagem no seu laboratório.
Ao prof. Dr. Edenir Rodrigues Pereira-Filho do Departamento de
Química da UFSCar, pelos ensinamentos de quimiometria e pelas análises
quimiométricas das minhas amostras.
Ao prof. Dr. Antonio G. Ferreira do Departamento de Química da
UFSCar, pela colaboração e aquisição dos espectros de Ressonância
Magnética Nuclear.
À Drª Lúcia Regina Rocha Martins pelos ensinamentos em
cromatografia líquida de alta eficiência, análise quimiométrica e ajuda em
tudo o que precisei no desenvolvimento deste trabalho.
Ao prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior do Departamento de
Fisologia da UFS, pela ajuda e apoio nas análises farmacológicas deste
trabalho.
Ao prof. Dr. Carlos Alexandre Borges Garcia por disponibilizar o seu
laboratório para as pesagens de todas as minhas amostras.
Ao prof. Dr. Geraldo Humberto Silva pelos ensinamentos e
contribuição deste trabalho.
Ao prof. Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcante do Departamento
de Fisiologia da UFS, pelo incentivo para fazer o mestrado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pelo apoio financeiro através do Projeto Casadinho (Processo nº
620212/2006-3) para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus amigos do laboratório METABIO, Alan, Daniele, Pablo,
Sandra, Wesley e Gilmara, por toda a amizade, apoio em todos os
momentos que precisei e ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
As minhas amigas do laboratório LAPEC, Adriana Gibara e Mônica,
pelo apoio e ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
A todos os amigos e funcionários do Departamento de Química –
UFS, que, direta ou indiretamente, contribuíram e compartilharam a
realização deste trabalho.
CURRICULUM VITAE
1. DADOS PESSOAIS
Nome: Silvana Vieira Floresta Gomes
Nome em citações bibliográficas: Gomes, S. V. F. ou Floresta, S. V.
Naturalidade: Salvador – BA
Data de Nascimento: 13/10/1980
2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO
Mestrado em Química
Universidade Federal de Sergipe, UFS. Ano de conclusão: 2009.
Orientadora: Profª Drª Valéria Regina de S. Moraes.
Nível Superior
Farmácia Habilitação Clínica Industrial, Universidade Federal de
Sergipe, UFS. Ano de conclusão: 2006
3. ÁREA DE ATUAÇÃO
Química Orgânica, Química de Produtos Naturais
Farmácia, Farmacologia
4. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
3.1 – Trabalhos em eventos
1. Machado, S. M. F.; Guimarães, A. G.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V.
R. S.; Nogueira, P. C. L.; Filho, E. R. P.; Viana, M. D.; Blank, A. F. Análise
multivariada dos perfis cromatográficos de genótipos de Lippia gracilis, com
e sem estresse hídrico. 32º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, 2009, PN-66, Fortaleza.
2. Gomes, S. V. F.; Martins, L. R. R.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M.
D.; Nogueira, P. C. L.; Machado, S. M. F.; ALVES, P. B.; Pereira-Filho, E. R.;
Cass, Q. B.; Blank, A. F.; Moraes, V. R. S. Análise Multivariada dos perfis
cromatográficos de amostras vegetais para diferenciação de genótipos de
Lippia gracillis. 31º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química,
2008, PN-056-PN-05, Água de Lindóia.
3. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R.
S.; Nogueira, P. C. L.; Martins, L. R. R.; Cass, Q. B.; Pereira-Filho, E. R.;
Blank, A. F.; ALVES, P. B. Diferenciação de genótipos de Lippia gracillis por
análise multivariada de fingerprints obtidos por CLAE-DAD. XX Simpósio de
Plantas Medicinais do Brasil/ X International Congress of
Ethnopharmacology, 2008. v. 1. p. 05355-05355, São Paulo.
4. Guimarães, A. G.; Machado, S. M. F.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V.
R. S.; Viana, M. D.; Blank, A. F.; Castro, R. D. Influência do estresse hídrico
na composição química (perfil químico cromatográfico) dos extratos das
folhas de Lippia gracillis. 18º. Encontro de Iniciação Científica/4a. Encontro
de Pós-graduação, 2008, Aracaju.
5. Bragança, R. B.; Moraes, V. R. S.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V.
F.; Ferreira, A. G.. Busca por metabólitos secundários em Kielmeyera rugosa
Choisy (Clusiaceae). 18º Encontro de Iniciação Científica / 4º Encontro de
Pós-graduação da UFS, 2008, Aracaju.
6. Santos dos, A. D. C.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V. F.; Moraes,
V. R. S.; Alves, P. B.; Blank, A. F.; Viana, M. D.; Pereira-Filho, E. R.; Martins,
L. R. R.; Cass, Q. B. Determinação do perfil cromatográfico de plantas
medicinais do nordeste: Lippia gracillis. 18º Encontro de Iniciação Científica /
4º Encontro de Pós-graduação da UFS, 2008, Aracaju.
7. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R.
S.; Nogueira, P. C. L.; Martins, L. R. R.; Cass, Q. B.; Pereira-Filho, E. R.;
Blank, A. F.; Alves, Péricles Barreto. Diferenciação de genótipos de Lippia
gracillis por análise multivariada de fingerprints obtidos por CLAE-DAD. II
Whorkshop Bioprospecção de Plantas Nativas do Semi-árido, 2008, Aracaju.
8. Moreno, M. P. N.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.;
Floresta, S. V.; Cavalcanti, S. C. H.; Marçal, R. M.; Fernandes, J. B. Efeito
analgésico do extrato acetato de etila da Hyptis Fruticosa. 29º Reunião
Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006, Água de Lindóia.
9. Moreira, Ítalo; Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Antoniolli, A. R.;
Santos, M. R. V. Efeito vasorrelaxante da fração diclorometano de Hyptis
fruticosa (LAMIACEAE) em artéria mesentérica isolada de rato. XIX
Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 2006, Salvador.
10. Marçal, R. M.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.;
Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Cardoso, G. C.; Cavalcanti, S. C. H.;
Fernandes, J. B. Antinociceptive profile of ethyl acetate extract of Hyptis
fruticosa Salzm ex Benth (Lamiaceae). International Congress and 54th
Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research, 2006, Helsink.
Planta Medica, 2006. v. 72.
11. Moreno, M. P. N.; Floresta, S. V.; Campos, D. A.; Blank, F.; Kava,
C.; Simote, S.; Alves, P. B.; Cavalcanti, S. C. H.; Antoniolli, A. R.; Vieira, P.
C.; Rodrigues Filho, E.; Silva, M. F.; Fernandes, J. B. Avaliação Fitoquímica
e potencial farmacológico da Hyptis fructicosa L. 28º Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas.
12. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Fernandes, J. B.; Cavalcanti, S.
C. H. Estudo químico e biológico da Hyptis fruticosa oriunda do Estado de
Sergipe. VII Congresso de Iniciação Científica/ XV Encontro de Iniciação
Científica, 2005, Aracaju.
13. Doria, G. A. A.; Silva, W. J.; Floresta, S. V.; Alves, P. B.; Marçal,
R. M.; Cavalcanti, S. C. H. Teste larvicida de óleos essenciais de plantas
contra as larvas do mosquito Aedes aegypti. VII Congresso de Iniciação
Científica/ XV Encontro de Iniciação Científica, 2005, Aracaju.
14. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Cavalcanti, S. C. H. Triagem
Fitoquímica da Hyptis fruticosa oriunda do estado de Sergipe. VI Congresso
de Iniciação Científica, 2004, Aracaju.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ..............................................................................
i
LISTA DE ESPECTROS ........................................................................
v
LISTA DE TABELAS .............................................................................
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................
vii
RESUMO ................................................................................................
x
ABSTRACT ............................................................................................
xi
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................
1.1 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......................................
1.1.1 – Parâmetros cromatográficos ............................................
1.1.2 – Otimização da separação ................................................
1.1.3 – Modos de separação .......................................................
1.2 – Extração em Fase Sólida (SPE – Solid Phase Extraction) ............
1.2.1 – Etapas de extração ..........................................................
1.3 – Análise Multivariada ......................................................................
1.3.1 – Análise Exploratória de Dados .........................................
1.3.2 – Análise dos Componentes Principais ..............................
1.4 – Dor e Nocicepção ..........................................................................
1.4.1 – Nociceptores – os receptores da dor ...............................
1
7
9
11
15
16
17
18
19
21
23
25
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..............................................................
2.1 – Gênero Lippia ................................................................................
2.2 – Lippia gracilis Schauer ..................................................................
2.3 – Constituintes químicos do gênero Lippia .......................................
2.3.1 – Óleo essencial .................................................................
2.3.2 – Fitoconstituintes ...............................................................
2.3.2.1 – Flavonóides ...................................................................
2.3.2.2 – Naftoquinonas ...............................................................
2.3.2.3 – Iridóides ........................................................................
29
30
32
33
34
37
38
42
43
3. OBJETIVOS .......................................................................................
3.1 – Objetivo Geral ................................................................................
3.2 – Objetivos Específicos ....................................................................
46
47
47
4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAL ...............................................
4.1 – Equipamentos e materiais .............................................................
4.2 – Técnicas cromatográficas ..............................................................
4.2.1 – Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ....
4.3 – Material vegetal .............................................................................
4.4 – Preparação dos extratos ...............................................................
48
49
50
50
51
53
Páginas
s
4.5 – Preparação das amostras para CLAE analítica ............................
4.5.1 – Extração em fase sólida ...................................................
4.6 – Condições analíticas dos cromatogramas fingerprint ....................
4.7 – Cromatografia com resina amberlite XAD-2 ..................................
4.8 – Análise em CLAE semipreparativa das folhas ..............................
4.9 – Análises por RMN ..........................................................................
4.10 – Análise quimiométrica .................................................................
4.11 – Estudo farmacológico do extrato metanólico das folhas de
Lippia gracilis ..........................................................................................
4.11.1 – Animais ..........................................................................
4.11.2 – Drogas ...........................................................................
4.11.3 – Avaliação da Atividade antinociceptiva ..........................
4.11.3.1 – Teste de contorção abdominal induzida pelo ácido
acético a 0,85% ......................................................................................
4.11.3.2 – Formalina ....................................................................
53
53
55
56
57
59
59
59
60
60
60
60
61
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................................
5.1 – Desenvolvimento dos cromatogramas fingerprint .........................
5.1.1 – Otimização do procedimento de pré-tratamento ..............
5.1.2 – Cromatograma fingerprint das folhas de Lippia gracilis ...
5.1.3 – Cromatograma fingerprint dos caules de Lippia gracilis ..
5.2 – Isolamento dos marcadores químicos ...........................................
5.2.1 – Fracionamento do extrato das folhas do genótipo 107 de
Lippia gracilis com resina amberlite XAD-2 ............................................
5.2.2 – Fracionamento do extrato dos caules do genótipo 107 de
Lippia gracilis com resina amberlite XAD-2 ............................................
5.2.3 – CLAE semipreparativa das frações 50% e 85%
MeOH:H
2
O das folhas de Lippia gracilis ................................................
5.3 – Identificação estrutural ..................................................................
5.3.1 – Identificação da substância LGRA 12 ..............................
5.4 – Análise quimiométrica ...................................................................
5.4.1 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint
das folhas ...............................................................................................
5.4.2 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint
dos caules ..............................................................................................
5.5 – Atividade Antinociceptiva ...............................................................
62
63
63
67
79
87
87
90
93
96
96
105
106
112
118
6. CONCLUSÕES ..................................................................................
122
7. REFERÊNCIAS ..................................................................................
125
Gomes, S. V. F.
2009
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta
eficiência .................................................................................................
Figura 2: Triângulo de seletividade para os solventes preferidos em: -
fase reversa, --- fase normal ..................................................................
8
13
Figura 3: Nomógrafo no modo reverso ..................................................
14
Figura 4: Esquema do procedimento de SPE; A) Condicionamento do
cartucho; B) Aplicação da amostra; C) Lavagem; D) Eluição ................
18
Figura 5: Esquema da seqüência usada na análise multivariada de
dados experimentais ..............................................................................
21
Figura 6: Aferências modulares dos nociceptores: corte transversal da
medula espinhal, mostrando sinapses das fibras C e A .......................
25
Figura 7: Lippia gracilis Schauer ...........................................................
33
Figura 8: Mudas da espécie de Lippia gracilis no DEA .........................
52
Figura 9: Esquema com as etapas da extração em fase sólida ............
54
Figura 10: Dispositivo para extração em fase sólida .............................
55
Figura 11: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100%
MeOH após tratamento por extração em fase sólida (Varian ).
Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN
(B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL ...........................
64
Figura 12: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100%
MeOH após tratamento por extração em fase sólida (Supelco ).
Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN
(B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL ...........................
64
Figura 13: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100%
MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker ).
Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN
Gomes, S. V. F.
2009
ii
(B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL ...........................
65
Figura 14: Cromatograma das frações reunidas de 5%, 10%, 15%,
20%, 30%, 50% e 60% MeOH:H
2
O e 100% MeOH após tratamento
por extração em fase sólida (JT Baker
®
) ................................................
66
Figura 15: Cromatograma das frações reunidas 5% MeOH:água e
100% MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT
Baker
®
). Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100%
de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL .............
67
Figura 16: Cromatograma do extrato metanólico da Lippia gracillis.
Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN
(B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL ...........................
69
Figura 17: Cromatogramas para seleção de condições para o método
em CLAE. Os números correspondem às condições apresentadas na
tabela 3 ...................................................................................................
72
Figura 18: Cromatograma obtido com a condição de eluição
gradiente: 15-40% ACN (B):solução de 0,5% HCOOH (A) em 50 min;
40-70% (B) em 20 min, vazão 0,5 ml/min, =280nm, V
inj.
= 25µL,
coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0x0,46 cm, QC-UFSCar-158) .......
73
Figura 19: Cromatogramas fingerprint das folhas dos sete genótipos
(106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis ..................................................
74
Figura 20: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra
das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis .........................................
75
Figura 21: Cromatograma da amostra do genótipo 108 das folhas de
Lippia gracilis. Numeração referente aos picos identificados no
espectro de UV-Vis (CLAE-DAD) ...........................................................
76
Figura 22: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD)
correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura
20, da amostra do genótipo 108 de Lippia gracilis .................................
77
Figura 23: Cromatogramas dos sete genótipos das folhas de Lippia
gracilis em quintuplicata .........................................................................
78
Figura 24: Cromatograma (a) extrato metanólico dos caules do
genótipo 108 da Lippia gracilis e (b) extrato metanólico das folhas do
genótipo 108 de Lippia gracilis. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v)
em 50 min, 40-70% (B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, V
inj.
=
25µL ........................................................................................................
80
Figura 25: Cromatogramas para seleção de condições
Gomes, S. V. F.
2009
iii
cromatográficos para análise dos extratos dos caules de Lippia
gracilis. Os números correspondem às condições apresentadas na
tabela 8 ...................................................................................................
82
Figura 26: Cromatogramas fingerprint dos sete genótipos (106-110,
201 e 202) de Lippia gracilis ...................................................................
83
Figura 27: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra
dos caules do genótipo 108 de Lippia gracilis ........................................
83
Figura 28: Cromatograma da amostra do genótipo 108 dos caules de
Lippia gracilis. Numeração referente aos picos identificados no
espectro de UV-Vis .................................................................................
84
Figura 29: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD)
correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura
28, da amostra do genótipo 108 de Lippia gracilis .................................
85
Figura 30: Cromatogramas dos sete genótipos dos caules de Lippia
gracilis em quintuplicata .........................................................................
86
Figura 31: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite
XAD-2: a) 5% MeOH:H
2
O; b) 15% MeOH:H
2
O; c) 25% MeOH:H
2
O; d)
35% MeOH:H
2
O; e) 50% MeOH:H
2
O; f) 70% MeOH:H
2
O; g) 85%
MeOH:H
2
O. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a
40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70%
(B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, V
inj.
= 25µL .......................
89
Figura 32: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite
XAD-2: a) 5% MeOH:H
2
O; b) 15% MeOH:H
2
O; c) 25% MeOH:H
2
O; d)
35% MeOH:H
2
O; e) 50% MeOH:H
2
O; f) 70% MeOH:H
2
O; g) 85%
MeOH:H
2
O. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a
40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70%
(B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, V
inj.
= 25µL .......................
92
Figura 33: Cromatograma da fração 50% MeOH:H
2
O para isolamento
dos compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições
cromatográficas: eluição gradiente de 8% a 40% de ACN (B) em 50
min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, V
inj.
= 100 µL, m
inj
= 10 mg ...............
95
Figura 34: Cromatograma da fração 85% MeOH:H
2
O para isolamento
dos compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições
cromatográficas: eluição gradiente de 35% a 53% de ACN (B) em 15
min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, V
inj.
= 200 µL, m
inj
= 10 mg ...............
96
Figura 35: Parte do cromatograma das folhas: a) antes do
alinhamento, b) após o alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation
Optimised Warping’’ (COW) ...................................................................
106
Gomes, S. V. F.
2009
iv
Figura 36: Gráfico de pré-processamento centrado na média ..............
107
Figura 37: Variância explicada (%) para cada componente principal
(PC’s) ......................................................................................................
108
Figura 38: Gráfico de escores (PC1 versus PC2) .................................
109
Figura 39: Gráfico de loading das folhas de Lippia gracilis ...................
110
Figura 40: Cromatogramas fingerprint sobrepostos das folhas dos
sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracillis .........................
111
Figura 41: Parte do cromatograma dos caules: a) antes do
alinhamento, b) após o alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation
Optimised Warping’’ (COW) ...................................................................
112
Figura 42: Gráfico de pré-processamento centrado na média ..............
113
Figura 43: Variância explicada (%) para cada componente principal
(PC’s) ......................................................................................................
114
Figura 44: Gráfico de escores (PC1 versus PC3) .................................
115
Figura 45: Gráfico de loading dos caules de Lippia gracilis ..................
116
Figura 46: Cromatogramas fingerprint sobrepostos dos caules dos
sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis ..........................
117
Figura 47: Efeito do EMLG sobre as contorções abdominais induzidas
por ácido acético. Cada valor representa a média ± D.P.M. Os
asteriscos denotam a significância estatística, * p < 0,05 e ** p < 0,001
(ANOVA e teste de Dunnett), n = 8 ........................................................
119
Figura 48: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da
pata, na 1ª fase do teste da formalina. Cada valor representa a média
± D.P.M. O asterisco denota a significância estatística, * p < 0,05
(ANOVA e teste de Dunnett), n = 8 ........................................................
120
Figura 49: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da
pata, na 2ª fase do teste da formalina. Cada valor representa a média
± D.P.M. O asterisco denota a significância estatística, * p < 0,001
(ANOVA e teste de Dunnett), n = 8 ........................................................
120
Gomes, S. V. F.
2009
v
LISTA DE ESPECTROS
Espectro 1: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz) ....
98
Espectro 2: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz).
Ampliação da região entre 12,45 ppm e 11,7 ppm ................................
99
Espectro 3: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz).
Ampliação da região entre 7,60 ppm e 6,37 ppm ..................................
100
Espectro 4: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz).
Ampliação da região entre 5,95 ppm e 5,34 ppm ..................................
101
Espectro 5: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz).
Ampliação da região entre 3,30 ppm e 2,63 ppm ..................................
102
Espectro 6: Espectro de
13
C da amostra LGRA 12 (400 MHz) ............
103
Gomes, S. V. F.
2009
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Flavonóides isolados de espécies do gênero Lippia .............
39
Tabela 2: Dados dos genótipos da espécie Lippia gracilis ....................
51
Tabela 3: Quantidade de material vegetal seco e triturado ...................
52
Tabela 4: Rendimento dos extratos metanólicos das folhas e caules ...
53
Tabela 5: Rendimento das frações obtidas da coluna Amberlite XAD-2
57
Tabela 6: Rendimento das amostras obtidas por CLAE
semipreparativa ......................................................................................
58
Tabela 7: Condições cromatográficas avaliadas para separação dos
compostos químicos, com detecção em = 280 nm ..............................
70
Tabela 8: Condições cromatográficas para otimização do gradiente
com detecção em = 280 nm .................................................................
81
Tabela 9: Correlação observadas no espectro de RMN
1
H e
13
C da
substância LGRA 12 e dados da naringenina da literatura ....................
104
Tabela 10: Variância percentual das Componentes Principais
calculadas para os dados da matriz original centrados na média .........
108
Tabela 11: Variância percentual das Componentes Principais
calculadas para os dados da matriz original centrados na média .........
114
Gomes, S. V. F.
2009
vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACN Acetonitrila
AS Autoescalonamento
BK Bradicinina
CG Cromatografia Gasosa
CG/EM Cromatografia Gasosa acoplado a espectrometria de massas
CM Centrado na média
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado a
detector de arranjo de diodos
CLAE-DAD-EM ou HPLC-DAD-MS Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos e espectrometria de
massas
CLAE-FR Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa
COBEA Colégio Brasileiro em Experimentação Animal
COW Correlation Optimised Warping
d Dubleto
dd Duplo dubleto
d.i Diâmetro interno
DABC Drug Administration Bureau of China
DEA Departamento de Engenharia Agronômica
DMSO-d
6
Dimetilsulfóxido deuterado
Gomes, S. V. F.
2009
viii
D.P.M. Desvio padrão da média
EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products
EMLG Extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia
gracilis
FDA Food and Drug Administration
HCA Hierarchical Cluster Analysis (Análise de Agrupamentos
Hierárquicos)
HCOOH Ácido fórmico
INPI The International Plant Names Index
J Constante de acoplamento em hertz (Hz)
KNN K-nearest neighbor
LC-DAD-ESI/EM ou LC-DAD-ESI/MSD Cromatografia líquida
acoplado ao detector de arranjo de diodos e ionização por
eletrospray/espectrometria de massas
L
p
Comprimento da coluna preparativa ou semipreparativa
L
a
Comprimento da coluna analítica
m
inj
Massa injetada
MeOH Metanol
NO Óxido nítrico
OMS Organização Mundial de Saúde
PAFs Fibras aferentes primárias
PCA Principal Component Analysis (Análise dos Componentes
Principais)
PC Principal Component (Componentes Principais)
PGs Prostaglandinas
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
Gomes, S. V. F.
2009
ix
RMN
13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono - 13
R
p
diâmetro das coluna preparativa ou semipreparativa
R
a
Diâmetro da coluna analítica
s Singleto
S Fator de escalonamento
SIMCA Soft Independent Modeling by Class Analogy
SPE Solid Phase Extraction (Extração em fase sólida)
t
g
Tempo de gradiente
THF Tetraidrofurano
TMS Tetrametilsilano
UFS Universidade Federal de Sergipe
UFSCar Universidade Federal de São Carlos
v.o. Via oral
V
inj.
Volume de injeção
XAD-2 resina de poliestireno-divinil-benzeno
5-HT Serotonina
Deslocamento químico em ppm
%B/min Variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente)
Δ%B Diferença entre a % de B final e inicial
Gomes, S. V. F.
2009
x
RESUMO
Este trabalho apresenta o desenvolvimento de método por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para diferenciação de sete
genótipos (106-110, 201 e 202) de folhas e caules de Lippia gracilis
Schauer, o isolamento de marcadores químicos e avaliação da atividade
antinociceptiva das folhas. Os extratos metanólicos das folhas e caules dos
sete genótipos foram analisados por CLAE-DAD e após etapas de
otimizações, foram obtidos os cromatogramas fingerprint. Para uma análise
comparativa entre os genótipos, aplicaram-se ferramentas quimiométricas de
análise exploratória (PCA), com as quais foi possível discriminar os
genótipos, inferindo que o método analítico desenvolvido por CLAE-DAD
pode ser utilizado para o controle de qualidade químico desta espécie. Das
frações 50% e 85% MeOH:H
2
O, obtidas da cromatografia em coluna com
resina amberlite XAD-2 do extrato metanólico do genótipo 107 das folhas,
foram isoladas sete substâncias por CLAE semipreparativa. A substância
codificada como LGRA 12 foi identificada através de RMN
1
H,
13
C e por
comparação com dados da literatura como sendo a 5,7,4’-triidroxiflavanona,
conhecida como naringenina. O extrato metanólico das folhas do genótipo
108 foi submetido a dois ensaios farmacológicos, o teste de contorções
abdominais induzidas por ácido acético e formalina, o qual resultou em uma
atividade antinociceptiva provavelmente mediada pela inibição de fatores
pró-inflamatórios (via das ciclooxigenase).
Palavras-chave: Lippia gracilis, genótipos, fingerprint, CLAE-DAD,
quimiometria, naringenina, antinociceptivo.
Gomes, S. V. F.
2009
xi
ABSTRACT
This work describes the development of method by High Performance
Liquid Chromatograpy (HPLC) for differentiation of seven genotypes (106-
110, 201 and 202) of Lippia gracilis Schauer, the isolation of chemical
markers and evaluation of antinociceptive activity of leaves. The methanolic
extracts of leaves and stems of seven genotypes were analyzed by HPLC-
DAD and after stages of optimizations, we obtained the fingerprint
chromatograms. For a comparative analysis of the genotypes, were applied
chemometric tools for exploratory analysis (PCA), which it was possible to
discriminate the genotypes, showing that the analytical method developed by
HPLC-DAD can be used for quality control of chemical species. From
fractions of 50% and 85% MeOH: H
2
O obtained in the chromatography
column with amberlite resin XAD-2 of the methanol extract of leaves of
genotype 107 were isolated seven substances by HPLC semipreparative.
The substance named LGRA 12 was identified by
1
H and
13
C NMR and by
comparison with literature data as the 5,7,4 '-trihydroxiflavanone known as
naringenin. The methanolic extract of the leaves was submitted two
pharmacological tests, the abdominal contortion test induced by acetic acid
and formalin, which resulted in an antinociceptive activity probably mediated
by inhibition of pro-inflammatory factors (route of cyclooxygenase).
Keywords: Lippia gracilis, genotypes, fingerprint, HPLC-DAD,
chemometric, naringenin, antinociceptive.
Capítulo
1
Gomes, S. V. F.
2009
2
1. INTRODUÇÃO
Sabe-se que o poder curativo das plantas é tão antigo quanto o
aparecimento da espécie humana na terra, pois, desde cedo as primeiras
civilizações perceberam, que algumas plantas continham em suas essências
princípios ativos, os quais ao serem experimentados no combate às doenças
revelaram empiricamente seu poder curativo.
Conforme Cunha [1], toda informação acumulada sobre o uso de
plantas medicinais, foi inicialmente transmitida oralmente de geração a
geração para só depois, com o advento da escrita, serem compiladas em
livros.
No início do século XIX, com o desenvolvimento da química
farmacêutica, as plantas passaram a representar a primeira fonte de
substâncias para o desenvolvimento de medicamentos. Atualmente, apesar
do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de novos processos
biotecnológicos, 25% dos medicamentos prescritos nos países
industrializados são originários de plantas, obtidos a partir de 90 espécies
que são utilizadas na terapia moderna [2].
Estima-se que no ano de 2000 os produtos a base de plantas
medicinais movimentaram cerca de 30 bilhões de dólares. Aliado a isso, a
Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 65-80% da população
mundial depende da medicina tradicional para atender às suas necessidades
de cuidados primários de saúde e grande parte desta medicina tradicional
envolve o uso de plantas medicinais, seus extratos vegetais ou seus
princípios ativos [3].
Gomes, S. V. F.
2009
3
Com o progresso das técnicas cromatográficas e espectrométricas,
novas substâncias de origem natural vêm sendo descobertas, não só de
plantas, mas também de animais e microrganismos. No período de 1981 a
2002, foram descobertas 877 novas moléculas com atividades biológicas.
Destas, 33 % são de origem natural ou derivadas por semi-síntese,
destacando-se especialmente nas áreas terapêuticas como anticâncer e
anti-hipertensivos [4]. Dos fármacos produzidos a partir de 1995, 244
substâncias têm sido utilizadas como protótipos sendo que, destas, 83% são
provenientes de fontes naturais (animais, plantas e microrganismos) e 17%
são provenientes de síntese química ou observações das atividades
biológicas de compostos já existentes [5].
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) [6], as
plantas medicinais são todas as plantas que contêm em um ou mais de seus
órgãos substâncias que podem ser utilizadas com propósitos terapêuticos ou
que sejam precursores de semi-síntese químico-farmacêutico. Ainda nesse
sentido, Morgan [7] afirma que as plantas que contém princípios ativos em
sua composição que sejam úteis à saúde dos seres humanos são
consideradas plantas medicinais.
A utilização de plantas medicinais tem recebido incentivos da OMS,
mediante a Resolução WHA 31.33 (1978) e 40.33 (1987), que reafirmam a
importância das plantas medicinais nos cuidados da saúde, recomendando,
entre outros aspectos, a criação de programas globais para a identificação,
validação, preparação, cultivo e conservação das plantas medicinais
utilizadas na medicina tradicional, bem como assegurar o controle de
qualidade delas [8].
De uma maneira geral, as plantas podem possuir centenas de
constituintes, alguns deles presentes em concentrações mínimas. Os
constituintes das plantas variam em função de fatores externos como
temperatura, umidade, luminosidade, método de coleta, secagem e
transporte [9]. Sendo assim, se faz necessário determinar vários
constituintes químicos para assegurar a confiabilidade e reprodutibilidade da
Gomes, S. V. F.
2009
4
pesquisa farmacológica e clínica. Nessa perspectiva, o conceito de
fitoequivalência tem sido utilizado. Ele sugere que um cromatograma
fingerprint ou „‟impressão digital‟‟ seja comparado com padrões que poderá
ajudar na identificação de amostras autênticas e auxiliar na identificação de
possíveis compostos utilizados em uma adulteração [10].
Muitas técnicas analíticas modernas têm sido utilizadas para a
determinação da „‟impressão digital‟‟ ou fingerprint de plantas medicinais. Na
última década, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma das
mais utilizadas devido a sua facilidade de manuseio e por não estar limitada
a volatilidade ou estabilidade dos compostos da amostra. No entanto, a
otimização das condições para uma boa separação não são triviais por
envolver fatores como fase móvel, ajuste de pH, pressão de bombas e
tantos outros [10, 11].
Segundo Gan et al. [12], a cromatografia fingerprint tem sido utilizada
para verificar a autenticidade ou fornecer o controle de qualidade de plantas
medicinais. A cromatografia tem a vantagem de separar um sistema
complexo de fitoquímicos em subsistemas relativamente simples e, em
seguida, apresentar o perfil químico da planta medicinal sob a forma de um
cromatograma.
A técnica de cromatografia fingerprint vem atraindo cada vez mais a
atenção da comunidade científica, especialmente por enfatizar a
característica sistêmica dos componentes da amostra focando na
identificação e estabilidade dos constituintes químicos observados. Esta
análise foi introduzida e aceita pela OMS como estratégia para avaliação de
ervas naturais, exigida pelo Drug Administration Bureau of China (DABC)
para padronização das ervas medicinais chinesas e suas matérias primas, e
ainda é recomendado por outras entidades como Food and Drug
Administration dos Estados Unidos (FDA) e a European Agency for the
Evaluation of Medicinal Products (EMEA) [13].
Gomes, S. V. F.
2009
5
Segundo Xu et al. [14], um fingerprint de uma planta medicinal é um
cromatograma representando todos os componentes químicos presentes ou
detectáveis no extrato. Com a ajuda do fingerprint, a autenticação e
identificação de uma planta podem ser fielmente conduzidas até mesmo se a
qualidade e quantidade dos constituintes químicos são desconhecidos.
Assim, para avaliar a qualidade de uma planta medicinal, podemos
considerar os múltiplos constituintes no extrato da planta, em vez de apenas
um ou dois marcadores químicos.
Jiang et al. [15] utilizaram a cromatografia fingerprint para diferenciar
quatro espécies de Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, C. salsa e C.
sinensis), através da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao
detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas (HPLC-DAD-MS).
Duas espécies, Cistanche deserticola e C. tubulosa, são oficiais e utilizadas
tradicionalmente para problemas renais e infertilidade na China, mas devido
à escassez de recursos, nos últimos anos duas espécies, C. salsa e C.
sinensis, também têm sido utilizadas em algumas regiões da China. Para
investigar a possibilidade de utilizar estas duas espécies não-oficiais como
alternativa para as espécies oficiais foi desenvolvido um método fingerprint
para analisar comparativamente os extratos brutos destas quatro espécies.
Os resultados comparativos demonstraram que o fingerprint de C. tubulosa
C. salsa possuem alta similaridade, enquanto que o da C. sinensis possui
baixa similaridade. Desta forma, a cromatografia fingerprint foi uma poderosa
ferramenta para diferenciação destas espécies podendo ser utilizado para o
controle de qualidade.
Em outro estudo, Jin et al. [16] desenvolveram um método fingerprint
por meio de cromatografia líquida acoplado a detector de arranjo de diodos
(CLAE-DAD) para o controle de qualidade da espécie Rheum tanguticum
Maxim. ex Balf. Nesta pesquisa foram comparados quarenta e duas
amostras de Rheum tanguticum de diferentes regiões. Ao comparar os
cromatogramas de todas as amostras, o resultado revelou que o método
Gomes, S. V. F.
2009
6
fingerprint desenvolvido foi eficiente para identificar e distinguir as matérias-
primas de R. tanguticum.
A técnica de cromatografia líquida para obtenção de cromatogramas
fingerprint de plantas medicinais fornece um grande conjunto de dados. No
entanto, para que estes dados sejam convertidos em informação útil deve-se
usar métodos matemáticos e estatísticos sofisticados [17]. A aplicação de
métodos quimiométricos, nestes casos, aumenta consideravelmente a
qualidade da „‟impressão digital‟‟ ou fingerprint obtido. Comparações
avançadas de dados podem ser feitas utilizando a Análise dos Componentes
Principais (PCA). Hoje em dia a quimiometria não é mais uma opção na
análise de matrizes complexas como o fingerprint de plantas medicinais,
mas sim uma ferramenta essencial [18].
Dentre as diversas plantas utilizadas como medicinais no Brasil,
destacam-se as plantas do gênero Lippia. No Brasil, diversas espécies deste
gênero são utilizadas na medicina popular para doenças respiratórias,
gastrointestinais, antivirais, antimaláricos e antifúngicos [19]. Embora muitas
espécies deste gênero sejam bem estudadas, muitas outras ainda são
pouco conhecidas. Dentre elas tem-se a espécie Lippia gracilis, conhecida
popularmente como “alecrim-da-chapada” ou “alecrim-de-serrote” [20].
A espécie Lippia gracilis Schauer é objeto de estudo de um programa
de melhoramento genético desenvolvido pelo Laboratório de Culturas de
Tecidos Vegetais e Melhoramento genético do Departamento de Engenharia
Agronômica (DEA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os genótipos
encontram-se instalados em um Banco de Germoplasma no Horto de
Plantas Medicinais da Fazenda Experimental “Campus Rural da UFS”.
O interesse pelo estudo desta espécie deve-se ao fato de ser uma
planta medicinal muito utilizada na medicina popular e que apresenta poucos
estudos sobre seus constituintes químicos fixos. Além disso, apresenta um
óleo essencial rico em timol e carvacrol que são substâncias de grande
Gomes, S. V. F.
2009
7
importância econômica e industrial, principalmente na farmacologia,
cosméticos e, recentemente, na agricultura.
Este trabalho visou o conhecimento dos constituintes químicos e a
diferenciação de sete genótipos das folhas e caules de Lippia gracilis através
de CLAE-DAD, para obtenção de cromatogramas fingerprint, e posteriores
análises quimiométricas.
1.1- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
A exigência cada vez maior na obtenção de produtos de origem
vegetal com qualidade requer o emprego de técnicas seletivas e eficientes,
que possibilitem com segurança a identificação e quantificação de diferentes
classes de compostos, o que pode ser obtido com a utilização da
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) [21].
Esta técnica tem sido usada de maneira rotineira para análise e
isolamento de produtos naturais a partir de matrizes complexas, como
extratos de plantas, obtendo-se cromatogramas que são usados como
„‟impressão digital‟‟ ou fingerprint, fornecendo informações importantes
quanto ao tipo de constituintes presentes.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma técnica de
separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos
analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões
para esse crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para
determinações quantitativas com boa sensibilidade e a possibilidade de
separar espécies não voláteis e termicamente instáveis [22].
A CLAE é definida como um método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura, realizada através da distribuição entre duas
fases. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se
através dela. Durante o desenvolvimento cromatográfico, os componentes
da mistura são distribuídos entre as duas fases, resultando em migrações
diferenciais destes componentes [23].
Gomes, S. V. F.
2009
8
A representação esquemática de um equipamento de CLAE (Figura
1) é composto por um reservatório de solvente, uma bomba de alta pressão,
injetor da amostra, coluna cromatográfica, detector e registrador de dados,
que são divididos em módulos, que podem ser controlados individualmente
ou por computador [24].
Figura 1: Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência
A bomba de alta pressão empregada em CLAE tem a função de
enviar um fluxo constante e reprodutível de fase móvel para a coluna e
apresenta características totalmente especiais. As principais são: devem
operar a pressões de 0,01 a 35 MPa (0,1 a 350 bar), com a mesma precisão
e exatidão de operações a pressão quase ambiente. Intervalo de vazões
entre 0,01 e 5 mL/min para aplicações analíticas, entre 0,05 e 200 µL/min
para uso com colunas microbore e capilar, e até 100 mL/min para aplicações
preparativas. Repetitividade e constância da vazão de 1%. Elas não devem
ser corroídas pelas fases móveis empregadas. A bomba deve proporcionar
ao sistema uma vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade,
possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado [25, 26].
Gomes, S. V. F.
2009
9
Os detectores mais empregados em CLAE são os espectrofotômetros
no UV/VIS. Eles determinam a diferença de absorvância na região do ultra-
violeta ou no visível, sendo, assim, um detector seletivo para moléculas que
possuem cromóforos. Os detectores por arranjo de fotodiodos fornecem
espectros de varredura do analito no UV-VIS e tem sido utilizado há mais de
uma década para o estudo da química de plantas, o qual vem sendo muito
empregado nos laboratórios de pesquisa [24, 27, 28].
As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável,
com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na
faixa de 2,2cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns
colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas
colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta
resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação
[23].
1.1.1 – Parâmetros Cromatográficos [24, 29]
1.1.1.1 – Fator de Retenção (K)
O fator de retenção, K, é uma medida de retenção de um soluto e ele
é determinado pela razão dos tempos em que as moléculas do soluto ficam
retidas na fase estacionária ou percorrendo a coluna na fase móvel, como
mostra a equação:
onde, t
R
é o tempo de retenção e t
0
o tempo de retenção de um soluto
não retido.
Os valores ideais para K variam de 2,0 a 10,0. Valores menores que
2,0 indicam pouca interação entre o soluto e a fase estacionária, enquanto
valores maiores que 10 indicam interação muito forte com a fase
estacionária, resultando em análises demoradas.
Gomes, S. V. F.
2009
10
1.1.1.2 – Fator de Separação (α)
Mede a seletividade da separação para duas bandas adjacentes. É
calculado pela razão entre os fatores de separação do soluto mais retido (K
2
)
e do soluto menos retido (K
1
), como mostra a equação:
Pode ser alterado por variação na fase móvel e/ou estacionária,
temperatura, pH e força iônica.
1.1.1.3 – Número de Pratos (N)
Número de pratos, N, é parâmetro relacionado à eficiência
cromatográfica. Um prato equivale a uma etapa de equilíbrio do soluto entre
a fase estacionária e a fase móvel. Quanto maior o número de pratos, mais
equilíbrios existirão, maior será a eficiência e, portanto, melhor a separação.
Na prática, o número de pratos é uma medida do alargamento do pico que
ocorre quando o analito passa através do sistema e pode ser calculado pela
equação:
onde, W
b
é a largura de um pico na linha de base e W
0,5
é a largura
do pico na meia altura.
Qualitativamente, a eficiência pode ser avaliada pelo formato do pico
cromatográfico. Quanto mais estreito for o pico, maior a eficiência da coluna
na separação do soluto a que o pico se refere.
1.1.1.4 – Altura Equivalente a um Prato (H)
Gomes, S. V. F.
2009
11
É a correlação entre o número de pratos teóricos e o tamanho da
coluna. É medido pela razão entre o comprimento da coluna (L) e o número
de pratos, que pode ser calculado pela equação:
1.1.1.5 – Resolução (Rs)
É uma medida quantitativa do grau de separação entre dois picos
adjacentes e pode ser calculado de acordo com a equação:
onde,
t
R1
e t
R2
= tempos de retenção de dois picos adjacentes;
W
b1
e W
b2
= largura dos picos na linha de base;
W
0,5 1
e W
0,5 2
= largura dos picos a meia-altura.
Valores de Rs acima de 1,5 são considerados ideais, indicando uma
boa separação entre os picos.
1.1.2 – Otimização da separação [24, 27, 29]
A otimização de uma separação é feita alterando-se os parâmetros
cromatográficos K, α e N, de acordo com equação básica da resolução:
O primeiro e mais fácil parâmetro a ser alterado é o fator se retenção
(K), seguido pelo fator de separação (α). Em último caso, torna-se
necessária a alteração no número de pratos teóricos (N).
Gomes, S. V. F.
2009
12
A retenção de um componente é controlada pela força do solvente.
Solventes fortes diminuem a retenção e solventes fracos aumentam a
retenção. A força cromatográfica da fase móvel adequada para uma
separação é selecionada através da análise do fator de retenção, K. Um
valor de K baixo significa pouca interação dos solutos com a fase
estacionária. Por outro lado, um valor de K elevado implica forte interação
entre o soluto e a fase estacionária. Nenhum extremo é recomendado, seja
por fornecerem separações pouco eficientes seja por implicarem tempos de
análises longos, com alargamento dos picos. O intervalo ideal de fator de
retenção é 1≤ K ≤ 10; entretanto, para análises de múltiplos componentes,
também se aceita 0,5≤ K ≤ 20.
É importante ressaltar que, em separações de misturas complexas
pelo modo isocrático, raramente serão obtidos valores ideais de K para
todos os componentes da amostra, sendo recomendável o uso da eluição
gradiente.
O fator de retenção no modo reverso pode ser aumentado pelo
aumento do percentual de água e, conseqüentemente, diminuído pelo
acréscimo do percentual do modificador orgânico. A troca de uma fase C
18
por uma C
8
também pode ser feita para alterar o fator de retenção.
No modo normal de eluição, o aumento do fator de retenção é
conseguido pelo aumento do percentual do solvente de maior polaridade.
Fases estacionárias de diferentes polaridades também podem ser usadas
para conseguir a desejada retenção.
Após o ajuste do fator de retenção, a seletividade da separação deve
ajustada e para isso deve-se manter o K conseguido. Alteração em α são
feitas levando-se em consideração as interações do soluto com o solvente,
resultando de suas características, tanto no modo reverso quanto no modo
normal.
Gomes, S. V. F.
2009
13
Para determinar a melhor seletividade da fase móvel, pode ser
empregado o método empírico do modelo dos quatro solventes. Apesar de
haver inúmeros solventes passíveis de utilização como fase móvel, verificou-
se que um número reduzido era escolhido, surgindo então o modelo dos
quatro solventes, esquematizado na figura 2. Esse procedimento está
baseado no triângulo de seletividade. A seletividade em cromatografia no
modo reverso pode ser alcançada variando-se três solventes de
seletividades diferentes – metanol (MeOH), tetraidrofurano (THF) e
acetonitrila (ACN) – e utilizando-se água para ajustar a força cromatográfica
da mistura. Para separações por cromatografia no modo normal, utilizam-se
éter metil terc-butílico (MTBE), clorofórmio (CHCl
3
), ou cloreto de metileno
(CH
2
Cl
2
) com hexano para ajuste da força cromatográfica.
Figura 2: Triângulo de seletividade para os solventes preferidos em: - fase reversa,
---- fase normal.
Para manter a polaridade da mistura praticamente constante, na troca
de solventes de diferentes seletividades, usa-se o nomógrafo mostrado na
figura 3.
Gomes, S. V. F.
2009
14
Figura 3: Nomógrafo no modo reverso
A acetonitrila (ACN) é a primeira alternativa para início dos testes de
escolha da fase móvel. A mistura ACN/H
2
0 pode ser usada na detecção no
UV, pois absorve a baixos comprimentos de onda (185-210 nm). A mistura
possui também baixa viscosidade, resultando em maior número de pratos
teóricos e em pressões mais baixas na coluna. O próximo melhor solvente
orgânico a ser escolhido é o metanol (MeOH), seguido do tetraidrofurano
(THF). O THF possui algumas desvantagens, tais como absorção em maior
comprimento de onda no UV, forma peróxido na presença de oxigênio e gera
um lento desequilíbrio da coluna quando a fase móvel é modificada,
dificultando seu uso em eluição gradiente.
A seletividade pode ainda ser alterada por troca da fase estacionária,
levando-se em consideração as interações específicas, resultantes de cada
tipo de fase: C
18
, sílica, aminopropilsílica, ciano, fenil, diol etc. e/ou por
interações com grupos silanóis residuais nas fases quimicamente derivadas.
A otimização do número de pratos teóricos é feita considerando a
equação:
Na equação o número de pratos teóricos (N) é diretamente
proporcional ao tamanho da coluna (L) e inversamente proporcional à altura
dos pratos teóricos (H). Conseqüentemente, mantendo-se os outros
parâmetros constantes, um aumento de L resulta em um aumento de N, e
quanto menor for H, maior será o valor de N. Os fatores que favorecem a
Gomes, S. V. F.
2009
15
obtenção de baixos valores de H são: utilização de colunas de partículas
pequenas, fluxos de fase móvel baixos, fases móveis pouco viscosas, altas
temperaturas de separação e separação de pequenas concentrações de
amostra.
1.1.3- Modos de Separação
A classificação da cromatografia líquida de acordo com as
modificações químicas realizadas na fase estacionária (sílica gel) levou a
uma grande variedade de tipos. A separação em cromatografia líquida pode
ser encontrada explorando a variedade de processos existentes, dos quais
os mais importantes são: cromatografia no modo normal, no modo reverso,
de compostos iônicos, de troca iônica, cromatografia de exclusão e
cromatografia quiral. Neste trabalho foi utilizada a Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência no modo reverso.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência no modo reverso constitui
a modalidade cromatográfica na qual a fase móvel é mais polar do que a
fase estacionária. Salienta-se ainda que tal processo é o mais utilizado nos
laboratórios de pesquisas industriais e acadêmicas, além do seu amplo
emprego em análises de rotina [30]. A grande utilização desta modalidade
cromatográfica dá-se à existência de uma grande variedade de fases
estacionárias disponíveis comercialmente, que permitem ao usuário alcançar
a seletividade desejada [31]. Ressalta-se ainda que a fase móvel é em
grande parte composta por água, um solvente não tóxico e barato.
O princípio da retenção no modo reverso é a hidrofobia. A separação
no modo reverso se deve principalmente a interações entre a parte não-polar
do soluto e a fase estacionária, isto é, à repulsão desta parte do soluto pela
fase móvel aquosa [24].
Dentro da CLAE no modo reverso, a maioria das fases utilizadas
atualmente são baseados em silanos C
8
ou C
18
quimicamente ligados à
superfície de sílica. Como fase móvel são utilizados solventes com caráter
Gomes, S. V. F.
2009
16
polar, geralmente uma mistura de água e solventes orgânicos miscíveis com
a água [32].
A força da fase móvel na cromatografia no modo reverso depende do
tipo de solvente orgânico escolhido (solvente B) e sua porcentagem em água
(solvente A). Os solventes orgânicos comumente usados são: acetonitrila
(ACN), metanol (MeOH) e tetraidrofurano (THF) [33].
1.2- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE – Solid Phase Extraction)
A extração em fase sólida é uma técnica de extração que tem se
popularizado devido ao fato de ser rápida, consumir menores volumes de
solvente e de amostra e ser de fácil mecanização [34].
Atualmente é muito empregada, sendo utilizada, principalmente, no
pré-tratamento de amostras para análise por CLAE e Cromatografia a Gás
(CG) [35].
A extração em fase sólida emprega sorventes empacotados em
cartuchos, nas formas de barril ou seringa, e os mecanismos de retenção
são idênticos àqueles envolvidos em cromatografia líquida em coluna. Um
cartucho típico é formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de 50
a 500 mg de sorvente, com 40-60 µm de tamanho de partícula, retidos no
tubo através de dois filtros [36].
Os materiais de recheio são muito semelhantes às fases estacionárias
das colunas utilizadas na CLAE, porém com tamanho de partícula maior.
Esses materiais são, na sua maioria, à base de sílica modificada com grupos
octadecil (C
18
), octil (C
8
), amino (NH
2
), ciano (CN) ou à base de resinas
poliméricas, carbono grafitizado e alumina [31].
As características de fase sólida podem diferenciar, dependendo do
fabricante, do suporte, do tamanho de partículas, do tamanho de poros e
área superficial levando a uma imensa variedade de materiais disponíveis
comercialmente [36].
Gomes, S. V. F.
2009
17
Beltrame et al. [37] utilizaram a extração em fase sólida para obter um
composto puro do extrato hidroalcoólico da Catuaba. Nesta pesquisa, a
cinchonaína Ib foi isolada pela passagem do extrato em um cartucho C
18
,
sendo em seguida usado como padrão externo para o desenvolvimento e
validação de um método por CLAE-DAD para quantificação deste composto
em amostras de Catuaba vendidas em todo o Brasil.
Em outro estudo, Genovese et al. [38] relataram a utilização da
extração em fase sólida para a obtenção das isoflavonas, daidzeína e
genisteína, em derivados protéicos de soja e alimentos industrializados.
No nosso trabalho, a extração em fase sólida foi muito útil para o pré-
tratamento dos extratos metanólicos das folhas e caules dos genótipos de
Lippia gracilis para, em seguida, serem analisados por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência.
1.2.1- Etapas da Extração
Existem quatro etapas básicas que devem ser seguidas em um
procedimento de SPE, as quais são descritas abaixo (Figura 4) [34, 39, 40].
1- Condicionamento: esta etapa tem o objetivo de preparar o leito do
sorvente, previamente à extração, para permitir um contato efetivo da
solução líquida da amostra, geralmente polar, com a superfície do sorvente,
geralmente apolar. Esta etapa envolve a passagem de um solvente orgânico
(metanol ou acetonitrila) através do sorvente e depois a remoção do solvente
por um líquido de composição similar a amostra (água);
2- Aplicação da amostra: nesta etapa a amostra é passada através
do sorvente, que é responsável pela extração, com a ajuda de vácuo, no
caso de seringas, cartuchos ou discos. A amostra pode, dependendo de sua
interação com o sorvente, ser constituído de quatro tipos diferentes de
substâncias: o primeiro tipo não tem nenhuma afinidade pelo sorvente e não
interage com este; o segundo tem fraca interação com o sorvente e é
arrastado na etapa de lavagem; o terceiro apresenta uma interação
Gomes, S. V. F.
2009
18
adequada com o sorvente e é eluído na etapa de eluição, o quarto apresenta
uma afinidade muito grande pelo sorvente e permanece retido neste mesmo
após a etapa de eluição;
3- Lavagem: o propósito da lavagem é permitir que algumas
impurezas fracamente retidas sejam eliminadas pela passagem de um
solvente fraco (água);
4- Eluição: na etapa de eluição as espécies de interesse são
removidas do sorvente e retornam para a fase líquida. Normalmente
emprega-se metanol ou acetonitrila.
Figura 4: Esquema do procedimento de SPE; A) Condicionamento do cartucho; B)
Aplicação da amostra; C) Lavagem; D) Eluição.
1.3- ANÁLISE MULTIVARIADA
Os métodos de análise de dados multivariados foram desenvolvidos
por pesquisadores da área de psicometria. A gênese desse método remete
ao século XIX, porém a sua crescente popularidade só se tornou possível
com o advento do computador [41].
Somente a partir dos anos sessenta do século XX é que os métodos
de análise de dados multivariados foram paulatinamente ganhando espaço
nos diferentes campos de pesquisa que tradicionalmente não os usava, em
uma razão que crescia em ritmo semelhante ao do desenvolvimento de
máquinas de processamento de dados cada vez mais potentes [41].
Gomes, S. V. F.
2009
19
Nesse panorama surgiu a quimiometria, que é considerada uma área
da química destinada à análise de dados de natureza multivariada [35,36].
Embora a quimiometria seja uma área relativamente nova, ela já produz um
impacto de tal modo que existem diversos softwares comerciais disponíveis
para o processamento dos mais diversos métodos quimiométricos [42, 43].
O termo só apareceu na década de 1970, na química analítica, como
decorrência dos progressos na instrumentação (que produz dados) e nos
microcomputadores (que permitem processar esses dados) [44].
A quimiometria pode ser definida como uma área da química que usa
métodos matemáticos, estatísticos e de lógica formal para planejar ou
selecionar procedimentos ótimos de medidas e experimentos e extrair o
máximo da informação química relevante, com a análise de dados [45].
Hoje em dia, muitos químicos passaram a ter como objetivo de estudo
e pesquisa, o desenvolvimento e utilização de ferramentas matemáticas e
estatísticas para extrair maior informação dos dados. Isso acabou por gerar
procedimentos e domínios de informações que não seriam possíveis, ou não
teriam sentido sem o conhecimento dessas ferramentas matemáticas para a
análise de dados [46].
Chen et al. [47] demonstraram as vantagens de se utilizar a
cromatografia fingerprint aliado a métodos quimiométricos para controle de
qualidade de plantas medicinais. Nesta pesquisa, amostras de diferentes
regiões na China de Ganoderma lucidum foram analisadas por CLAE e, em
seguida, submetidas à análise quimiométrica. No estudo foi possível
demonstrar as semelhanças e diferenças das espécies, quantificar os
principais marcadores químicos que influenciam nessa diferenciação e
utilizar o método para o controle de qualidade desta espécie.
1.3.1- Análise Exploratória dos Dados
O principal objetivo de uma análise exploratória é extrair o máximo de
informações dos dados experimentais, estabelecendo relações entre objetos
Gomes, S. V. F.
2009
20
e variáveis. Os objetos químicos típicos são as amostras analíticas ou
compostos químicos. As variáveis são, muitas vezes, derivadas das
quantidades de constituintes químicos nos objetos, tais como a
concentração, a intensidade das bandas em perfis cromatográficos,
comprimento de onda em perfis espectroscópicos, etc [46, 48].
A análise exploratória dos dados é usada para determinar algumas
relações gerais entre os dados, agrupando as amostras com características
semelhantes. Esta técnica também auxilia na identificação de amostras que
não seguem o padrão da maioria [49].
Os métodos multivariados de análise de dados podem ser divididos
em dois grupos; a aprendizagem não supervisionada e a aprendizagem
supervisionada.
Na aprendizagem não supervisionada o objetivo é encontrar
agrupamentos naturais das amostras num espaço bidimensional. Os
métodos mais utilizados são a análise de agrupamentos hierárquicos (HCA)
e análise de componentes principais (PCA). Já na aprendizagem
supervisionada o objetivo é desenvolver modelos baseados nas informações
da origem das amostras, para que estas sejam classificadas corretamente e
então aplicar esta regra para amostras de origem desconhecidas visando
sua classificação. Um método muito utilizado para modelagem é o modelo
independente de similaridade utilizando componentes principais (SIMCA)
[41, 50-52].
A seqüência básica da análise de dados multivariados por métodos
quimiométricos está ilustrada na figura 5.
Gomes, S. V. F.
2009
21
Figura 5: Esquema da seqüência usada na análise multivariada de dados
experimentais.
Neste capítulo trataremos somente da PCA, que foi utilizada no
tratamento dos dados a serem apresentados neste trabalho.
1.3.2- Análise dos Componentes Principais (PCA)
A PCA é a base principal de diversos métodos de análise multivariada
e seu grande objetivo é reduzir a dimensão dos dados originais, permitindo a
fácil visualização das informações mais importantes em um número menor
de fatores, ou componentes principais (PC). Desta forma, as principais
vantagens da PCA estão na simplificação, modelamento, detecção de
amostras anômalas, classificação e previsão [53].
Gomes, S. V. F.
2009
22
Um procedimento básico para melhorar a análise de modo a reduzir a
dimensão dos dados é a escolha do número de componentes principais a
serem utilizadas na descrição do sistema. A escolha do número de
componentes principais permite descrever até mais de 90% da variância dos
dados com um número muito menor de fatores do que das variáveis
originais. A escolha das componentes principais a serem utilizadas na
descrição dos dados é feita levando-se em conta a porcentagem de
variância descrita pelas PC‟s e a variância residual [54, 55].
A primeira componente principal, PC1, é a combinação linear de
máxima variância das variáveis originais, ou seja, os auto vetores, num
determinado eixo. A segunda componente, PC2, de segunda maior
variância, é ortogonal a PC1, isto é, não correlacionada a ela. A terceira
apresenta maior variância e é ortogonal às duas primeiras PC, portanto
também não correlacionadas. Como esses eixos são calculados em ordem
decrescente de importância, a informação relevante fica concentrada nas
duas ou três primeiras PC, que podem ser então confrontadas com padrões
de características conhecidas [46, 56].
A partir dos PC‟s são gerados dois novos conjuntos de dados
chamados de scores e loadings. Os scores fornecem a composição das
PC‟s em relação aos objetos (amostras) enquanto os loadings fornecem
essa mesma composição em relação às variáveis. Como as PC‟s são
ortogonais, é possível examinar as relações entre os objetos através dos
gráficos de scores projetados nas primeiras PC‟s, e entre as variáveis
através dos gráficos de loadings [57].
Utilizando a notação matricial, as componentes principais são obtidas
por meio de transformações lineares conforme a equação:
XP = T
em que X é a matriz original do dados, T é a matriz de escores que
contêm as coordenadas das amostras no novo sistema de eixos e P é a
Gomes, S. V. F.
2009
23
matriz dos pesos (loadings) onde os elementos de cada coluna
correspondem aos coeficientes das combinações lineares das variáveis
originais [53].
Os dados originais podem não ter uma distribuição adequada para a
análise, dificultando a extração de informações úteis e interpretação dos
mesmos. Nestes casos, antes de se aplicar a PCA a dados numéricos, é
necessário efetuar um pré-processamento nos dados originais. Os principais
tipos de pré-processamento são o Centrado na média – CM e o
Autoescalonamento – AS [58].
No CM calcula-se a média dos valores experimentais para cada
variável e subtrai-se cada valor experimental do respectivo valor médio.
Autoescalar significa centrar os dados na média e dividi-los pelo respectivo
desvio-padrão, sendo um para cada variável [48].
Gan et al. [12] relataram com êxito a utilização da PCA para avaliar a
similaridade dos cromatogramas fingerprint de Chuanxiong obtidas de três
regiões diferentes da China. Neste estudo foi possível diferenciar as
amostras pelo gráficos de escores (PC1 versus PC2) de Chuanxiong e o
método desenvolvido será útil para o controle de qualidade destas espécies.
1.4 – DOR E NOCICEPÇÃO
A dor é definida pela Associação Internacional para Estudo da Dor
como uma experiência sensorial e emocional desagradável associada com o
dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de lesão [58]. É
importante salientar que sempre que qualquer tecido estiver lesado, o
organismo reage para desencadear o estímulo doloroso como um
mecanismo de proteção [60, 61].
Entretanto, a dor é uma experiência complexa que não envolve
apenas a transdução do estímulo nociceptivo ambiental, mas também
cognitivo e emocional processado pelo cérebro [62].
Gomes, S. V. F.
2009
24
Em termos de duração, uma sensação dolorosa pode ser transitória,
aguda ou crônica. No tipo transitória, a ativação dos nociceptores é feita na
ausência de qualquer dano tecidual. Na dor aguda, ocorre geralmente lesão
e ativação dos nociceptores no sítio lesado. Já a dor crônica é causada
geralmente por uma lesão ou patologia, sendo que com o passar do tempo,
pode ser perpetuada por fatores que não os causadores iniciais da dor [63-
66].
O componente sensorial da dor denomina-se nocicepção [65]. Assim,
enquanto a dor envolve a percepção de um estímulo aversivo, a nocicepção
refere-se às manifestações neurofisiológicas geradas pelo estímulo nocivo
[65, 66]. A função de alerta da dor reflete a ativação fásica de receptores
denominados nociceptores, os quais são sensibilizados quando o estimulo é
potencialmente perigosos, ou seja, excedem uma determinada faixa
considerada fisiológica [61, 69].
Uma vez que os animais não são capazes de verbalizar os
componentes subjetivos da dor, neles não se avalia dor, mas nocicepção.
Sendo assim, tem sido proposto que os termos dor e analgesia são mais
apropriadamente utilizados para o ser humano, enquanto nocicepção e
antinocicepção são mais adequados para animais [70].
A nocicepção desencadeia no animal comportamentos típicos, como
lamber ou massagear a área lesada, vocalização, ou reflexo de retirar a
parte do corpo agredida do contato com o estímulo nocivo. Tais
comportamentos evidenciam ao experimentar a nocicepção, e são
denominados comportamentos nociceptivos. Portanto, as drogas que
suprimem os comportamentos nociceptivos são denominados
antinociceptivas, e aquelas que induzem o comportamento nociceptivo são
chamada de pró-nociceptivas, ou algogênicas. É importante esclarecer,
contudo, que as drogas antinociceptivas não são, obrigatoriamente,
analgésicas, visto que a supressão do comportamento nociceptivo pode ser
desencadeado por outros fatores, como prejuízo motor e sedação, que
diferem de analgesia [71].
Gomes, S. V. F.
2009
25
1.4.1 – Nociceptores – os receptores da dor
O termo nociceptor é uma abreviatura de „‟nocirreptor‟‟, e denota um
receptor para o estímulo nociceptivo [72]. Os nociceptores estão localizados
na porção distal dos neurônios aferentes sensoriais que estão amplamente
distribuídos na pele, vasos, músculos, articulações e vísceras e são
sensíveis a estímulos térmicos, mecânicos ou químicos [61].
A percepção da dor se inicia na periferia pela estimulação dos
nociceptores, cujos corpos celulares encontram-se nos gânglios das raízes
dorsais e projetam seus axônios até o corno dorsal da medula (Figura 6). Os
nociceptores são inervados pelas fibras aferentes primárias C ou fibras A .
As fibras A são fibras mielinizadas, de condução rápida (2,5 a 36 m/s) e as
fibras C não são mielinizadas e transmitem o estímulo de forma mais lenta
(0,7 a 1,5 m/s) [56, 68-70]. É importante ressaltar que o estímulo, seja ele
térmico, químico ou mecânico, deve exercer um certo limiar para que seja
interpretado pelo sistema sensorial como nociceptivo [76].
Figura 6: Aferências modulares dos nociceptores: corte transversal da medula
espinhal, mostrando sinapses das fibras C e A .
Gomes, S. V. F.
2009
26
As fibras C e A transferem a informação nociceptiva para a lâmina
superficial (lâmina I e II) e para a lâmina profunda (lâmina V e VI) no corno
dorsal, como também para a lâmina circumcanular (lâmina X). Por outro
lado, as fibras A são fibras de maior calibre, mielinizadas e de rápida
conduntância e transmitem a informação de estímulos mecânicos inócuos
para lâmina profunda (III-IV) [77].
As fibras aferentes primárias (PAFs) podem estimular diretamente
neurônios de projeção, os quais retransmitem a mensagem para o cérebro,
ou indiretamente enviam a mensagem para outros neurônios de projeção via
interneurônios excitatórios. Além disso, as PAFs também podem estimular
interneurônios inibitórios os quais interagem com os neurônios de projeção
[77].
Pode-se afirmar que a dor não é uma sensação uniforme, pois o início
das respostas de projeção é determinado por muitos fatores dentro da
medula espinhal e estrutura do cérebro envolvidas na integração e
modificação da sinalização nociceptiva [59].
Neste sentido, existem várias fontes importantes onde os mediadores
que participam da resposta nociceptiva são gerados como: tecido lesado,
sistema vascular, células imunes, tecidos adjacentes, nervos sensoriais e
simpáticos. Esses mediadores atuam em receptores amplamente
distribuídos no organismo. Alguns desses receptores são acoplados a
proteína G e induzem a informação de segundos mensageiros. Outros
receptores são acoplados a canais iônicos que regulam a permeabilidade e
a concentração celular de íons [59].
Alguns desses mediadores que estimulam o tipo químico de dor
incluem: os metabólitos derivados do ácido araquidônico (prostaglandinas -
PGs e leucotrienos), bradicinina (BK), serotonina (5-HT), histamina,
citocinas, íons potássio, óxido nítrico (NO) e enzimas proteolíticas. Além
desses, outros mediadores, tais como os aminoácidos excitatórios
(glutamato, aspartato), acetilcolina e outros que podem ser liberados após a
Gomes, S. V. F.
2009
27
lesão tecidual ou ainda irritantes exógenos (formalina, capsaicina, ácido
acético), são também responsáveis pela multiplicidade de eventos que
ocorrem durante a transmissão da dor, tanto no sistema periférico quanto
central [59, 77].
O modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos é descrito como um modelo típico de nocicepção inflamatória
visceral, sendo amplamente utilizado como ferramenta para detecção e
avaliação de novos agentes com propriedades analgésicas e
antiinflamatórias [85]. Os prótons oriundos da dissociação do ácido acético
podem ativar diretamente canais de cátions não seletivos localizados nas
fibras aferentes primárias [61]. Além disso, a injeção de ácido acético na
cavidade peritoneal de camundongos promove a liberação de diversos
mediadores inflamatórios como, por exemplo, PG, BK, os quais estimulam
neurônios aferentes primários, aumentando a liberação de aspartato e
glutamato no fluido cerebroespinhal. Em função disso, este modelo
apresenta uma boa sensibilidade, embora pouca especificidade. Neste
contexto, a nocicepção induzida por ácido acético pode ser prevenida por
agentes antiinflamatórios, analgésicos, relaxantes musculares e sedativos
[85-89].
O teste de formalina é o modelo de dor mais utilizado e é dividido em
duas fases de sensibilidade dolorosa [66, 78]. A primeira fase ocorre durante
os primeiros cinco minutos após a injeção da formalina, na qual resulta de
estímulo químico direto das fibras aferentes nociceptivas mielinizadas e não
mielinizadas, principalmente a fibra C, a qual pode ser suprimido por drogas
analgésicas opióides como a morfina [79-81]. Estudos demonstram que a
substância P e a bradicinina participam da primeira fase [80].
A segunda fase ocorre entre quinze a trinta minutos após a formalina,
na qual os mediadores formados nos tecidos periféricos, como as
prostaglandinas, serotonina, histamina e bradicinina, induzem mudanças
funcionais nos neurônios, do corno dorsal que, ao longo do tempo promove
a facilitação da transmissão em nível espinhal. Esta evidência sugere que o
Gomes, S. V. F.
2009
28
processo de inflamação periférica está envolvido na segunda fase [78, 83,
84].
O gênero Lippia apresenta um grande número de espécies com
atividades farmacológicas comprovadas. Dentre as espécies, a Lippia alba,
L. geminata, L. citriodora, L. dulcis, L. graveolens, L. javanica e L. nodiflora
apresentaram atividade analgésica, antiinflamatória e antipirética [19].
Um estudo realizado por Soares [90] avaliou as atividades
antinociceptivas das soluções extrativas hidroalcoólicas de L. alba a 40% e a
80% obtidas por maceração, sendo que a solução extrativa a 40%
apresentou melhor ação antinociceptiva.
No nosso trabalho, o extrato metanólico das folhas de Lippia gracilis
Schauer foi analisado quanto ao seu efeito antinociceptivo através dos testes
de contorções abdominais induzidas por ácido acético e formalina.
Capítulo
29
Gomes, S. V. F.
2009
30
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- GÊNERO LIPPIA
O uso de plantas com fins terapêuticos é uma tradição milenar
presente nas culturas de várias nações constituindo, ainda hoje, um recurso
alternativo de grande aceitação [92].
Entre as plantas utilizadas como medicinais, destacam-se as espécies
da Família Verbenaceae pertencente à ordem Lamiales. Esta Família
compreende 35 gêneros e 1.035 espécies, muitos exclusivamente
brasileiros, com distribuição tropical e subtropical. Os gêneros mais
representativos em número de espécies são: Verbena, Lippia, Citharexylum,
Stachytarpheta, Glandularia e Duranta [93].
O gênero Lippia, o segundo maior da família Verbenaceae, possui
aproximadamente 200 espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores,
cujos maiores centros de dispersão se encontram em países das Américas
do Sul e Central, como também em territórios da África tropical [19, 94].
Os principais centros de diversidade específica do gênero Lippia
estão localizados no Brasil e México. No Brasil, o maior número de espécies
se encontra na Cadeia do Espinhaço, localizada nos estados de Minas
Gerais, Bahia e Goiás [95].
No Brasil encontram-se aproximadamente 120 espécies de Lippia
distribuídas no cerrado e caatinga, onde se destacam por seu aspecto
chamativo no período da floração e por seu aroma forte e geralmente
Gomes, S. V. F.
2009
31
agradável. Destas espécies, a L. alba (Mill.) N. E. Brown (erva cidreira) é a
mais conhecida e utilizada devido as suas propriedades medicinais [96].
No nordeste do país as espécies de Lippia são usadas na medicina
popular para o tratamento de resfriados, gripes, bronquites e tosse. Em
muitos casos, as partes usadas são as folhas e flores na forma de infusão ou
decocto administradas oralmente ou através de emplastos [19, 96].
Inúmeras espécies de Lippia são empregadas na medicina tradicional
no tratamento de patologias diversas e como resultado muitas têm sido
investigadas do ponto de vista farmacológico, revelando importantes
propriedades como ação sedativa, antiespamódica, estomáquica,
antiinflamatória e antipirética da L. alba (Mill.) N. E. Brown [97]; efeito
antisséptico, antiinflamatório e cicatrizante do extrato aquoso de L. sidoides
Cham [96]; ação contra a malária, no tratamento de hipertensão e combate à
sarna da L. multiflora Moldenke [99, 100]; tratamento da tosse e bronquite da
L. dulcis Trevir [101].
Além de suas propriedades medicinais, as folhas da maioria das
espécies são utilizadas na preparação de alimentos [102]. Neste aspecto é
interessante ressaltar a importância da L. dulcis Trevir., cujo principal
componente é a hernandulcina (1), uma molécula 1.000 vezes mais doce
que a sacarose [19, 101, 103].
O
H
OH
1
Algumas espécies de Lippia têm sido utilizadas também no
reflorestamento de áreas mineradas. L. origanoides H.B.K., por exemplo,
tem sido usada como espécie pioneira em regiões de minério de ferro que
foram desativadas ou abandonadas na Venezuela [148].
Gomes, S. V. F.
2009
32
Segundo Pascual et al. [19], algumas espécies de Lippia, ao longo
dos anos, tem apresentado problemas de nomenclatura botânica devido à
dificuldade em torno da correta identificação de certas espécies causando a
utilização de diversas sinonímias para uma mesma espécie em artigos
científicos. L. alba (Mill.) N. E. Br., por exemplo, apresenta várias sinonímias
e pode receber o nome de L. geminata, L. microphylla Griseb, L. germinata
H.B.K, L. globiflora Kuntze, L. lantanoides Coult, Lantana alba Mill e Phyla
germinata H.B.K..
Com o propósito de contribuir para uma solução, a sistematização das
informações referentes à denominação botânica de espécies do gênero
Lippia foi realizada pela revisão do registro dessas espécies no INPI (The
International Plant Names Index). Nesta revisão algumas espécies vêm
classificadas, ora como binômio válido, ora como sinonímias. Dentre estas
espécies, a L. gracilis apresentou dois binômios válidos, sendo eles: L.
gracilis Schauer e L. gracilis Phil.
2.2- LIPPIA GRACILIS SCHAUER
Lippia gracilis Schauer é uma planta aromática endêmica do nordeste
brasileiro, próprio da vegetação semi-árido, conhecida popularmente como
‘’alecrim-da-chapada’’ ou ‘’alecrim-de-serrote’’. É encontrada
predominantemente nos estados da Bahia, Sergipe e Piauí [105]. Apresenta-
se como um arbusto de aproximadamente 2,5 cm de altura, bem ramificada,
de folhas pequenas e flores brancas, ambas bastante odoríferas (Figura 7).
Gomes, S. V. F.
2009
33
Figura 7: Lippia gracilis Schauer
As folhas de L. gracilis são ricas em óleo essencial que apresenta
forte atividade antimicrobiana contra fungos e bactérias [106]. Além disso,
elas são bastante usadas nas infecções da garganta e boca, problemas
vaginais, tratamento da acne, panos brancos, impigens, caspa, queimaduras
e feridas [107].
2.3 - CONSTITUINTES QUÍMICOS DO GÊNERO LIPPIA
Os estudos referentes à composição química das espécies de Lippia
evidenciam, principalmente, os constituintes voláteis. Entretanto, outras
substâncias como flavonóides, iridóides e naftoquinonas também são citados
com freqüência [108-111, 112-114].
Alguns alcalóides foram identificados na L. dulcis Trevir, L. geminata
H.B.K., L. nodiflora (L.) Michx e L. turbinata Griseb [115-117] enquanto que
taninos são encontrados na L. alba (Mill.) N.E. Brown [117, 118].
Gomes, S. V. F.
2009
34
Triterpenos e derivados de esteróides, usualmente identificados como
saponinas, foram relatados na L. alba (Mill.) N.E. Brown, L. javanica
(N.L.Burm.) Spreng., L. rehmani H.H.W. Pearson e L. turbinata Griseb [115,
117-120].
Atualmente existe um grande número de estudos fitoquímicos e
farmacológicos da L. alba (Mill.) N.E. Brown e L. multiflora Moldenke, no
entanto para as outras espécies os estudos são poucos no que diz respeito
aos aspectos químicos.
2.3.1 - Óleo essencial
A composição química do óleo essencial de muitas espécies de Lippia
tem sido investigada através de Cromatografia Gasosa e, com base nos
dados publicados, percebe-se que limoneno (2), -cariofileno (3), p-cimeno
(4), cânfora (5), linalool (6), α-pineno (7) e timol (8) são os componentes que
aparecem com maior freqüência [19, 121].
CH
2
CH
3
H
3
C
CH
3
O
2
3
4
5
H
3
C OH
OH
6
7
8
Gomes, S. V. F.
2009
35
Além destes, foi isolado da L. dulcis o (+)-hernandulcina (9), (+)-4- -
hidroxihernandulcina e (-)-epihernandulcina (10) [101, 102]. Outro estudo da
mesma planta relatou a presença de seis novos sesquiterpenos do tipo
bisabolano das partes áreas, o peroxilippidulcinas A-C (11-13),
peroxilippidulcinas B (14), epilippidulcinas B (15) e C (16), lippidulcina A (17)
e epilippidulcina A (18) [122].
H
OH
O
H
OH
O
9
10
O
H
OH
R
O
H
OH
R
1
R
2
11: R = OOH
17: R = OH
12: R
1
= OOH R
2
= H
13: R
1
= H R
2
= OH
O
H
OH
R
1
R
2
H
OH
O
OH
14: R
1
= OOH R
2
= H
15: R
1
= H R
2
= OOH
16: R
1
= H R
2
= OH
18
No gênero Lippia, a secreção de óleos essenciais tem sido associada
à presença de tricomas. Normalmente os tricomas secretores são de formas
variadas entre grupos vegetais, mas em geral uniformes dentro de um
mesmo táxon [123].
Os óleos essenciais são muito instáveis a presença de luz, calor e
umidade, conseqüentemente o horário de colheita do material vegetal pode
influenciar direta ou indiretamente os processos do metabolismo secundário
Gomes, S. V. F.
2009
36
que resultam em variações quantitativas e qualitativas do óleo essencial
[123].
A composição química do óleo de L. gracilis Schauer mostra
flutuações quantitativas dos componentes majoritários, provavelmente
devido a condições genéticas, ao local e condições em que a planta é
cultivada.
Neves et al. [124] realizaram por CG e CG/EM a determinação dos
compostos químicos presentes no óleo essencial de L. gracilis Schauer em
dois locais da caatinga de Pernambuco, Buíque e Ouricuri.
O estudo mostrou a presença de carvacrol (19) e p-cimeno como
constituintes principais em Buíque e em Ouricuri a presença de timol, -
terpineno (20) e 4-metoxi-acetofenona (21) como compostos majoritários.
OH
O
CH
3
O
19
20
21
O óleo essencial de L. gracilis também tem sido investigado em outros
estados do nordeste do Brasil, como Ceará, Piauí e Sergipe. No Ceará o
óleo essencial foi caracterizado por timol (30,6%) e p-cimeno (10,7%) como
componentes majoritários, enquanto que no Piauí tem-se o carvacrol
(47,7%) e o p-cimeno (19,2%) [124] e em Sergipe, carvacrol (23,52%), p-
cimeno (15,82%), -terpineno (14,17%) e mentol (10,97%) (22) [125].
Gomes, S. V. F.
2009
37
OH
22
Os compostos químicos presentes no óleo essencial, principalmente
os monoterpenos carvacrol e timol, das espécies do gênero Lippia tem
apresentado forte ação contra bactérias e fungos. Neste contexto, a L.
origanoides H.B.K. apresentou atividade frente a bactérias como
Staphylococcus aureus meticilino resistente e L. sidoides Cham.contra
Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonela enteritidis, Serratia
marcescens, Candida albicans e Mycobacterium smegmatis [102, 106, 107,
126, 127].
Um estudo realizado por Albuquerque et al. [128] mostrou que o óleo
essencial da L. gracilis Schauer possui atividade antimicrobiana contra
fungos e bactérias endofíticas de helicônias. O óleo apresentou uma inibição
de 100% contra os fungos Geotrichum candidum, Trichoderma viride, Torula
herbarum, Paecillomyces sp, Aspergillus nidulans, Fusicoccum sp,
Aspergillus flavus, Paecillomyces aeruginens; 95,58% contra Curvularia
lunata e de 89,40% contra Aspergillus niger.
As bactérias Salmonela choleraceuis-diarizonae, Enterobacter
asburiae, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Kleibsiella pneumoniae,
Enterobacter hormaechei e Bacillus cereus foram todas inibidas na presença
do óleo essencial. Essa ação foi associada à presença de dois
monoterpenos fenólicos, o carvacrol (41,77%) e o timol (10,13%).
2.3.2 - Fitoconstituintes
Considerando a grande quantidade de trabalhos voltados para a
determinação do óleo essencial das espécies deste gênero, é importante
Gomes, S. V. F.
2009
38
perceber a grande necessidade de trabalhos que enfoquem outras classes
de substâncias.
2.3.2.1 – Flavonóides
Compostos flavonoídicos aparecem com relativa freqüência em
espécies deste gênero. Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos
mais importantes e diversificados entre os produtos de origem vegetal.
Possuem a capacidade de modular a atividade de enzimas e afetar o
comportamento de muitos sistemas celulares, sugerindo que muitas
espécies podem possuir efeitos anti-hepatotóxico, antialérgico,
antiinflamatório, antiosteoporótipo e até antitumoral [129].
A maioria dos flavonóides identificados no gênero Lippia são flavonas.
As mais freqüentes são 6-hidroxiflavonas, metoxiflavonas e alguns sulfatos
de flavonas (mono e disulfatos) [19].
Pascual et al. [19] relataram a presença de duas flavanonas,
naringenina (23) e pinocembrina (24), na espécie L. graveolens. Em 2007
Lin et al. [108] identificaram nove novas flavanonas do extrato MeOH:H
2
O
(70:30 v/v) das folhas de L. graveolens por LC-DAD-ESI/MSD.
O
O
HO
OH
OH
O
O
HO
OH
23
24
O estudo a respeito dos flavonóides foi realizado principalmente nas
espécies L. citriodora (Ort.) H.B.K. e L. nodiflora (L.) Michx. São
aproximadamente 56 ocorrências de flavonóides no gênero Lippia, sendo 45
com derivados de flavonas (25) e 11 com derivados de flavanonas (26),
como mostrado na tabela 1.
Gomes, S. V. F.
2009
39
O
O
2
3
4
5
6
7
8
2
'
3
'
4
'
5
'
6
'
O
O
2
3
4
5
6
7
8
2
'
3
'
4
'
5
'
6
'
25
26
Tabela 1: Flavonóides isolados de espécies do gênero Lippia
COMPOSTO
ESPÉCIES
[REFERÊNCIAS]
apigenina
(5,7,4’-OH flavona)
L. citriodora
L. graveolens
108-110, 112
apigenina-7-O-glicosil
L. graveolens
108
apigenina-7-glucoronil-glicosil
L. triphylla
130, 131
apigenina-6-OMe-7-metil éter
L. sidoides
132
cirsiliol
(5,3’,4’-OH-6,7-OMe flavona)
L. citriodora
109, 110, 112
cirsimaritina
(5,4’-OH-6,7-OMe flavona)
L. citriodora
L. sidoides
L. dulcis
109, 110, 112, 122,
132, 133
crisoeriol
(5,7,4’-OH-3-OMe flavona)
L. citriodora
109, 110, 112
diosmetina
(5,7,3’-OH-4’-OMe flavona)
L. citriodora
109, 110, 112
diosmetina-7-glucoronil-glicosil
L. triphylla
130, 131
eupafolina
(5,7,3’,4’-OH-6-OMe flavona)
L. citriodora
109, 110
eupatorina
(5,3’-OH-6,7,4’-OMe flavona)
L. citriodora
L. dulcis
109, 110, 112, 122
eupatilina
(5,7-OH-6,3’,4’-OMe flavona)
L. dulcis
122
galangina
(3,5,7-OH flavona)
L. graveolens
108
Gomes, S. V. F.
2009
40
Tabela 1: continuação
COMPOSTO
ESPÉCIES
[REFERÊNCIAS]
metil-galangina
L. graveolens
108
jaceosidina
(luteolina-6-OMe-3’-metil éter)
L. nodiflora
130
jaceosidina-7-sulfato
L. nodiflora
130
jaceosidina-7,4’-disulfato
L. nodiflora
130
luteolina
(5,7,3’,4’-OH flavona)
L. citriodora
L. graveolens
L. sidoides
108-110, 112, 132-
134,
luteolina 6-OH
L. citriodora
L. graveolens
L. nodiflora
108-110, 112, 130
luteolina-7-O- -glicosil
L. citriodora
L. graveolens
108-110, 112
luteolina-6-OH-6-sulfato
L. citriodora
109, 110, 112
luteolina-6-OH-7-sulfato
L. citriodora
109, 110, 112
luteolina-6-OH-6,7-disulfato
L. citriodora
109, 110, 112
luteolina-6-OH-7-O-hexosil
L. graveolens
108
luteolina-6-OH-7-O-ramminosil
L. graveolens
108
luteolina-glucoronil-glucosil
L. triphylla
130, 131
lippiflorina A
(luteolina-6-OH-7-arabinosil)
L. citriodora
109, 110, 112
lippiflorina B
(luteolina-6-OH-7-arabinosil-4’–
ramnosil)
L. citriodora
109, 110, 112
luteolina-7-glicosil
L. citriodora
109, 110, 112
luteolina-6-OH-7-apiosídeo
L. citriodora
109, 110, 112
nepetina
(luteolina-6-OMe)
L. nodiflora
130
nepetina-3’,4’-disulfato
L. nodiflora
130
nepetina-7-sulfato
L. nodiflora
130
nodifloretina
(luteolina-6-OH-3’-metil éter)
L. nodiflora
130
nodifloretina-7-sulfato
L. nodiflora
130
nodifloretina-6,7-disulfato
L. nodiflora
130
Gomes, S. V. F.
2009
41
Tabela 1: continuação
COMPOSTO
ESPÉCIES
[REFERÊNCIAS]
pectolinarigenina
(5,7-OH-6,4’-OMe flavona
L. citriodora
L. dulcis
109, 110, 112, 122
salvigenina
(5-OH-6,7,4’-OMe flavona)
L. citriodora
L. dulcis
109, 110, 112, 122
scutellarein
(5,6,7,4’-OH flavona)
L. graveolens
108
scutellarein-7-O-hexosil
L. graveolens
108
scutellarein-6-metil
L. graveolens
108
scutellarein-6,7-dimetil
L. graveolens
108
5-4-OH-6,7- OMe flavona
L. sidoides
112, 132, 134
5,3’-OH-6,7,4’,5’-OMe flavona
L. dulcis
122
quercetina
(3,5,7,3’,4’-OH flavona)
L. aff. gracilis
L. dulcis
L. graveolens
L. sidoides
108-110, 113, 122,
132-134
eriodictiol
(5,7,3’,4’-OH flavanona)
L. graveolens
108
eriodictiol-7-O-glicosil
L. graveolens
108
naringenina
(5,7,4’-OH flavanona)
L. graveolens
108, 111
pinocembrina
(5,7-OH flavanona)
L. graveolens
108, 111
sakuranetina
(5,4’-OH-7-OMe flavanona)
L. graveolens
108
5,6,7,3’,4’-OH flavanona
L. graveolens
108
5,6,7,3’,4’-OH-7-O-hexosil flavanona
L. graveolens
108
3,5,6,7,4’-OH flavanona
L. graveolens
108
3,5,6,7,4’-OH-7-O-hexosil flavanona
L. graveolens
108
3,5,6,7,4’-OH-2-O-hexosil flavanona
L. graveolens
108
taxifolina
(3,5,7,3’,4’-OH flavanona)
L. graveolens
L. sidoides
108, 132, 133
Gomes, S. V. F.
2009
42
2.3.2.2 - Naftoquinonas
As naftoquinonas não são freqüentes nas espécies do gênero Lippia.
No entanto, no extrato metanólico das folhas e ramos de L. sidoides foi
isolado o lapachenol (27), isocatalponol e 6-oxo-3,4,4a,5-tetrahidro-3-hidroxi-
2,2-dimetilnafto-1,2-pirano (28) [135]. O lapachenol também foi relatado na
L. graveolans e L. aff. gracilis [111, 113].
OCH
3
O
O
O
H
H H
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
27
28
Na L. sidoides também foi isolado uma nova naftoquinona dimérica
prenilada, a lippidoquinona (29) [134].
O
OH
H
O O
HO
29
Algumas naftoquinonas são antibacterianas e fungicidas, outras
apresentam atividade antiprotozoários e antivirais. Entretanto, nenhuma
Gomes, S. V. F.
2009
43
naftoquinona natural é atualmente utilizada com fins terapêuticos [127, 136,
137].
2.3.2.3 - Iridóides
Outro componente presente em espécies de Lippia são os iridóides
glicosilados. Eles são produtos do metabolismo secundário de alguns grupos
vegetais e desempenham um papel de proteção contra predadores,
principalmente herbívoros, por serem venenosos ou amargos. [19, 138].
Nas plantas os iridóides apresentam uma pronunciada distribuição em
angiospermas notadamente nas Lamiaceae, Verbenaceae,
Scrophulariaceae e Plantataginaceae. Sendo não raro, utilizados como
marcadores taxonômicos a níveis de gênero e subgênero [139].
Inúmeras publicações demonstram as propriedades biológicas dos
iridóides como antiviral, antimicrobiana, antitumoral, hemodinâmica,
vasoconstritora, hepatoprotetora e antiinflamatória [140-144].
Rastrelli et al. [145] investigaram as folhas de L. graveolens da
Guatemala e isolaram dez iridóides, sendo alguns deles secoiridóides
glicosilados. Os menos freqüentes foram secologanina (30), secoxiloganina
(31), dimetilsecologanosida (32), ácido logânico (33), loganina (34), ácido 8-
epi-loganina (35), carioptosida (36) e os majoritários foram 6’-O-caffeoil (37),
6’-O-p-coumaroil (38) e ácido carioptosídico (39).
O
COOCH
3
O_Glu
R
O
HO
COOR
O_Glu
O
HO
COOH
O_Glu
30: R = CHO
31: R = COOH
32: R = COOCH
3
33: R = H
34: R = CH
3
35
Gomes, S. V. F.
2009
44
O
HO
COOH
O_Glu
HO
OHCHCH
OH
CR
O
36
37
OHCHCH
CR
O
O
O
COOH
HO
HO
O
OH
OH
HO
OH
38
39
Os iridóides teviridosídeo (40) e tevesídeo-Na (41) foram isolados das
espécies L. alba, L. javanica, L. turbinata, L. angustifolia, L. arechavaletae, L.
ramboi e L. thymoides [146, 147].
O
O
COOR
2
R
1
H
HO
O
OH
OH
HO
OH
40: R
1
= OH R
2
= Na
41: R
1
= OH R
2
= CH
3
Na L. citriodora e L. nodiflora foram identificados genoposídeo (42),
ácido genoposídeo-Na (43) e mussaenosídeo (44). O genoposídeo também
é relatado na L. alba [19].
Gomes, S. V. F.
2009
45
O
O
COOR
2
R
1
H
HO
O
OH
OH
HO
OH
O
O
COOCH
3
H
HO
H
H
CH
3
H
O
OH
OH
HO
OH
42: R
1
= H R
2
= CH
3
43: R
1
= H R
2
= Na
44
Em 2006, Barbosa et al. [114], isolaram do decocto das folhas de L.
alba um novo iridóide chamado shanzshida (45). Sena Filho et al. [139]
isolaram da mesma planta o teviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo
(46).
O
O
COOH
HO
H
H
HO
H
O
OH
OH
HO
OH
O
O
COOH
H
H
HO
H
3
C
O
OH
OH
HO
OH
45
46
Capítulo
46
Gomes, S. V. F.
2009
47
3. OBJETIVOS
3.1- OBJETIVO GERAL
Controle químico de qualidade de plantas medicinais.
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolvimento de método por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência para diferenciação de genótipos de Lippia gracilis Schauer;
Isolamento e identificação de marcadores químicos;
Capítulo
48
Gomes, S. V. F.
2009
49
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1 - EQUIPAMENTOS E MATERIAIS
As folhas e caules dos genótipos de Lippia gracilis foram secas em
estufa de circulação, modelo FIC. 0.5 – FAMO
®
.
O material vegetal foi triturado em moinho de facas da marca
MARCONI
®
.
Os extratos dos genótipos das folhas foram preparados com metanol
grau P.A. da marca Quimex
®
e os extratos dos genótipos dos caules foram
preparados com metanol grau HPLC da marca Carlo Erba
®
.
Os extratos metanólicos foram concentrados em evaporador rotatório
da marca Heidolph
®
.
As pesagens foram realizadas em balança analítica da marca
OHAUS
®
.
A acetonitrila utilizada nas análises cromatográficas de alta eficiência
foi de pureza analítica e grau HPLC (JT Baker, Philipsburg, PA, EUA).
O metanol utilizado na preparação das amostras para extração em
fase sólida (SPE) foi de pureza analítica e grau HPLC (Carlo Erba, Duque de
Caxias, RJ, Brasil).
O ácido fórmico (88%) foi grau analítico (JT. Baker, Philipsburg, PA,
EUA).
Gomes, S. V. F.
2009
50
Os solventes utilizados nas análises cromatográficas de alta eficiência
foram previamente filtrados utilizando membrana filtrante da marca MFS de
nylon de 47mm (diâmetro da membrana) e 0,45 µm (diâmetro do poro).
A água deionizada utilizada na composição da fase móvel e no
preparo das amostras para extração em fase sólida (SPE) foi obtida em um
sistema MILLI-Q (Millipore, São Paulo, SP, Brasil).
Para realização das extrações em fase sólida (SPE) foram avaliados e
utilizados cartuchos C
18
de 1,0 mL/100 mg de sorvente das marcas Varian
®
,
Supelco
®
e JT Baker
®
.
Nas análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência foram
testadas diferentes colunas analíticas para a otimização da separação dos
constituintes dos extratos de Lippia gracilis, sendo elas: coluna C
18
LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm,
15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158) e coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0 x
0,46 cm, Phenomenex).
Nas análises por CLAE semipreparativa foi utilizada coluna hexil-fenil
LUNA
®
(10 µm, 25,0 x 1,0 cm, Phenomenex).
A cromatografia em coluna foi realizada com resina amberlite XAD-2
da Supelco
®
.
4.2 - TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
4.2.1 - Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Sistema 1: Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto,
Japão), modelo Prominence, para eluição gradiente, composto de uma
bomba LC-20AT, com válvula solenóide de quatro linhas, degaseificador
DGU-20A5, auto injetor SIL-10A, detector UV com arranjo de diodos SPD-
M10Avp ligado a uma interface CBM 20A. O equipamento foi gerenciado
pelo software LC Solution. Aparelho pertencente ao Laboratório de Síntese
Orgânica e CLAE do Departamento de Química da UFSCar.
Gomes, S. V. F.
2009
51
Sistema 2: Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto,
Japão), modelo Prominence, para eluição gradiente, composto de duas
bombas LC-6A, degaseificador DGU-20A
3
, auto injetor SIL-10A, detector UV
com arranjo de diodos SPD-M20Avp conectado a uma interface CBM 20A. O
equipamento foi gerenciado pelo software LC Solution. Aparelho pertencente
ao Departamento de Química da UFS.
4.3 - MATERIAL VEGETAL
As folhas e caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) da
espécie de Lippia gracilis foram coletados no mês de maio de 2007 no
Campus Rural da Universidade Federal de Sergipe (UFS) e exemplares
foram depositados no herbário da UFS (Tabela 2).
Tabela 2: Dados dos genótipos da espécie Lippia gracilis
CÓDIGO
LOCAL
DE
ORIGEM
ESTADO
ESPÉCIE
DADOS
GEOGRÁFICOS
(lat; long; alt.)
NÚMERO DO
HERBÁRIO
UFS
106
Tomar do
Geru
SE
Lippia
gracilis
11 19' 16,7'' S; 37
55' 09,2'' W; 215 (m)
9205
107
Tomar do
Geru
SE
Lippia
gracilis
11 19' 20,1" S; 37
55' 13,5" W; 214 (m)
9203
108
Tomar do
Geru
SE
Lippia
gracilis
11 19' 22,4" S; 37
55' 12,6" W; 209 (m)
9404
109
Tomar do
Geru
SE
Lippia
gracilis
11 19' 0,7" S; 37 55'
16,9" W; 207 (m)
9207
110
Tomar do
Geru
SE
Lippia
gracilis
11 19' 1,1" S; 37 55'
14,9" W; 205 (m)
9208
201
Rio Real
BA
Lippia
gracilis
11 23' 38,7" S; 38
00' 54,1" W; 200 (m)
9206
202
Rio Real
BA
Lippia
gracilis
11 23' 45,3" S; 38
00' 51,3" W; 197 (m)
9209
Após a coleta, as folhas e caules foram separados, secos em estufa
de circulação de ar e, posteriormente, triturados em moinho de facas,
obtendo-se as quantidades descritas na tabela 3.
Gomes, S. V. F.
2009
52
Tabela 3: Quantidade de material vegetal seco e triturado
GENÓTIPO
FOLHAS (g)
CAULES (g)
106
350,12
645,02
107
557,21
972,39
108
180,37
577,05
109
397,62
1070,66
110
262,57
887,37
201
255,28
801,31
202
478,07
718,63
Os genótipos 106-110 são provenientes do estado de Sergipe,
município de Tomár do Geru, e os genótipos 201 e 202 são provenientes do
estado da Bahia, município de Rio Real. Essas amostras foram coletadas
nestes municípios e cultivadas no Campus Rural da UFS, onde estão sendo
supervisionadas pelo laboratório de Culturas de Tecidos Vegetais e
Melhoramento Vegetal do Departamento de Engenharia Agronômica (DEA)
da UFS, sob coordenação do Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank (Figura 8).
Figura 8: Mudas da espécie de Lippia gracilis no DEA
Gomes, S. V. F.
2009
53
4.4 - PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
O procedimento de obtenção dos extratos das folhas e caules foi
padronizado. Sobre o material vegetal moído foi adicionado metanol (1:5
p/v), o qual ficou sob maceração por uma semana.
Após este tempo, a mistura foi filtrada a pressão ambiente em papel-
filtro, concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida a 30°C, até
a completa remoção do solvente, resultando nos respectivos extratos brutos
(Tabela 4). Depois da primeira extração, o procedimento foi repetido por
mais três vezes.
Para a preparação dos extratos das folhas foram utilizadas as
quantidades descritas na tabela 3 e para os caules foram utilizados 200 g.
Tabela 4: Rendimento dos extratos metanólicos das folhas e caules
GENÓTIPO
FOLHAS (g)
CAULES (g)
106
15,831
6,356
107
18,749
6,740
108
12,146
7,766
109
27,844
6,816
110
19,625
5,597
201
19,356
5,316
202
20,764
5,137
4.5 - PREPARO DAS AMOSTRAS PARA CLAE ANALÍTICA
4.5.1 - Extração em Fase Sólida
A análise cromatográfica de extratos de plantas, em geral, requer um
pré-tratamento da amostra. A extração em fase sólida é umas das
ferramentas mais empregadas para o pré-tratamento de analitos presentes
em matrizes complexas, como extratos de plantas. Essa técnica permite que
a análise dos componentes de interesse se torne possível de forma que se
obtenha uma separação cromatográfica livre de interferentes [149].
Gomes, S. V. F.
2009
54
Visando coletar as amostras dos genótipos de Lippia gracilis isentas
de clorofilas para posterior análise cromatográfica, dois métodos de extração
foram estudados com três marcas de cartuchos C
18
(Varian
®
, Supelco
®
, JT
Baker
®
). Todos os passos de otimização foram realizados no extrato
metanólico do genótipo 108 das folhas.
A amostra a ser aplicada no cartucho foi preparada solubilizando 15
mg do extrato metanólico do genótipo 108 em 1 mL de metanol.
No primeiro método, o cartucho foi condicionado com 3 mL de
metanol, seguido de 1mL de água. Posteriormente, foi aplicado 100µL da
amostra a qual foi eluída seqüencialmente com 1 mL de : 5%, 10%, 15%,
20%, 30%, 50%, 60% de MeOH:H
2
O e 3 mL de 100% MeOH.
No segundo método, o cartucho foi condicionado com 3 mL de
metanol, seguido por 1 mL de água. Posteriormente foi aplicado 100µL da
amostra a qual foi eluída seqüencialmente com 1 mL de solução a 5%
MeOH:H
2
O e 3 mL de 100% MeOH (Figura 9).
Figura 9: Esquema com as etapas da extração em fase sólida
É importante mencionar que as três marcas de cartuchos testadas
foram submetidas igualmente aos dois métodos de extração.
Gomes, S. V. F.
2009
55
Após análise por CLAE de todas as amostras (discutidas no item 5.1)
foi observado que as melhores condições foram obtidas com a utilização do
segundo método sobre o cartucho da marca JT Baker
®
, as quais foram
também aplicadas para preparação das amostras oriundas dos outros
genótipos das folhas e caules (106-110, 201 e 202).
Para cada genótipo das folhas e caules foram preparadas
quintuplicatas a partir dos extratos metanólicos, com a repetição completa do
processo de pré-tratamento acima descrito.
Os experimentos foram realizados com o auxílio de um dispositivo de
extração acoplado a uma bomba de vácuo (Figura 10).
Figura 10: Dispositivo para extração em fase sólida
4.6 - CONDIÇÕES ANALÍTICAS DOS CROMATOGRAMAS
FINGERPRINT
As frações obtidas por extração em fase sólida (SPE) foram reunidas,
concentradas em evaporador rotatório e dissolvidas em 500 µL de metanol
para serem, posteriormente, utilizadas nas análises por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência.
Os genótipos das folhas foram analisadas usando um sistema de
eluição que empregou um gradiente de solvente no qual a porcentagem de
acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%(v/v) (A) variaram de 15% a 40% (B)
em 50 min, 40% a 70% (B) em 20 min e mantida constante em 70% (B) até
Gomes, S. V. F.
2009
56
75 min. Ao término da corrida cromatográfica empregou-se um gradiente de
volta de 70% a 15% (B) em 5 min e o tempo de espera para
recondicionamento da coluna foi de 30 min. A vazão empregada foi de 0,5
mL/min e em cada análise foram injetados 25 µL da amostra.
Para a análise dos genótipos dos caules, o sistema de eluição
empregou um gradiente de solvente no qual a porcentagem de acetonitrila
(B) e de ácido fórmico 0,5% (v/v) (A) variaram de 15% a 20% (B) em 25 min,
20% a 40% (B) em 45 min e mantida constante em 40% (B) até 75 min. Ao
término da corrida empregou-se um gradiente de volta de 40% a 15% (B) em
5 min e o tempo de espera para recondicionamento da coluna foi de 30 min.
A vazão empregada foi de 0,5 mL/min e em cada análise foram injetados 25
µL da amostra.
4.7 - CROMATOGRAFIA COM RESINA AMBERLITE XAD-2
A resina amberlite XAD-2 (poliestireno-divinil-benzeno) é utilizada em
procedimentos de separação devido às suas propriedades, tais como:
porosidade, alta área superficial, durabilidade e pureza [149]. São muito
úteis na purificação de compostos químicos de origem vegetal,
principalmente flavonóides [150].
Os extratos metanólicos do genótipo 107 das folhas (6,0 g) e caules
(6,0 g) foram submetidos à cromatografia em coluna (35,0 cm x 3,50 cm de
d.i) com resina amberlite XAD-2 (170,0 g).
A resina foi deixada em repouso com metanol e, em seguida, a coluna
foi empacotada cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar que
interferissem o fluxo da fase móvel na coluna.
A eluição foi feita com 500 mL de MeOH:H
2
O nas proporções: 5%,
15%, 25%, 35%, 50%, 70%, 85% de MeOH:H
2
O e 100% MeOH. Foram
coletadas oito frações num volume de 500mL. Todas as frações eluídas da
coluna amberlite XAD-2 foram secas a temperatura ambiente, obtendo-se as
quantidades descritas na tabela 5. Em seguida, as frações foram
Gomes, S. V. F.
2009
57
submetidas à análise por CLAE utilizando as mesmas condições analíticas
dos cromatogramas fingerprint das folhas e caules (item 4.6).
Tabela 5: Rendimento das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2
FRAÇÕES
FOLHAS (mg)
CAULES (mg)
5% MeOH:H
2
O
450,00
122,90
15% MeOH:H
2
O
268,70
36,90
25% MeOH:H
2
O
358,40
60,70
35% MeOH:H
2
O
365,70
23,70
50% MeOH:H
2
O
712,10
39,00
70% MeOH:H
2
O
382,90
48,50
85% MeOH:H
2
O
133,60
38,50
100% MeOH
162,40
96,90
4.8 - ANÁLISE EM CLAE SEMIPREPARATIVA DAS FOLHAS
Após a obtenção dos cromatogramas fingerprint de todas as frações
obtidas da coluna cromatográfica em resina amberlite XAD-2, foram
selecionadas as frações 50% e 85% MeOH:H
2
O para o isolamento dos
compostos químicos por CLAE semipreparativa.
Para isso foi usada uma coluna semipreparativa hexil-fenil LUNA
®
(25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), vazão de 4 mL/min e detecção em 280 nm.
1. Fração 50% MeOH:H
2
O: Parte da fração 50% MeOH:H
2
O (200
mg) foi dissolvida em 2 mL de ACN/HCOOH 0,5% 25:75 (v/v) e adicionado
em um vial de 2mL para ser utilizado na análise por CLAE semipreparativa.
O isolamento dos compostos foi obtido utilizando um gradiente de
solvente na qual a porcentagem de acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%
(v/v) (A) variaram de 8% a 40% (B) em 50 min. Em cada análise foram
injetadas amostras na concentração de 10 mg/100 µL.
Da análise em CLAE semipreparativa foram obtidas dez amostras
denominadas LGRA 1, LGRA 2, LGRA 3, LGRA 4, LGRA 5, LGRA 6, LGRA
Gomes, S. V. F.
2009
58
7, LGRA 8, LGRA 9 e LGRA 10. Destas amostras, somente a LGRA 1,
LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9 e LGRA 10 foram enviadas para análises por
RMN.
2. Fração 85% MeOH:H
2
O: Parte da fração 85% MeOH:H
2
O (100
mg) foi dissolvida em 2 mL de ACN/HCOOH 0,5% 35:65 (v/v) e adicionado
em um vial de 2mL para ser utilizado na análise por CLAE semipreparativa.
O isolamento dos compostos foi obtido utilizando um gradiente de
solvente na qual a porcentagem de acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%
(v/v) (A) variaram de 35% a 53% (B) em 15 min. Em cada análise foram
injetadas amostras na concentração de 10 mg/200 µL.
Da análise em CLAE semipreparativa foram obtidas cinco amostras
denominadas LGRA 11, LGRA 12, LGRA 13, LGRA 14, LGRA 15. Destas
amostras, a LGRA 12 e 13 foram enviadas para análise por RMN.
Todas as amostras foram secas a temperatura ambiente, obtendo-se
as quantidades descritas na tabela 6.
Tabela 6: Rendimento das amostras obtidas por CLAE
semipreparativa
AMOSTRAS
MASSA (mg)
LGRA 1
7,6
LGRA 2
9,2
LGRA 3
28,2
LGRA 4
3,1
LGRA 5
1,9
LGRA 6
8,0
LGRA 7
3,3
LGRA 8
3,3
LGRA 9
4,3
LGRA 10
7,5
LGRA 11
0,5
LGRA 12
4,9
Gomes, S. V. F.
2009
59
Tabela 6: continuação
AMOSTRAS
MASSA (mg)
LGRA 13
4,8
LGRA 14
2,2
LGRA 15
0,4
4.9 - ANÁLISES POR RMN
A identificação estrutural dos compostos isolados foi realizada através
do uso da técnica de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e
Carbono-13 e por comparação com dados da literatura.
Os espectros de RMN
1
H e
13
C foram obtidos em um espectrômetro
BRUKER, modelo DRX400 de 9,4 Tesla (400 MHz para freqüência do
hidrogênio), pertencente ao Departamento de Química da UFSCar. Os
experimentos foram realizados a temperatura ambiente, sendo as amostras
LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9, LGRA 10 e LGRA 13 solubilizadas em
metanol deuterado e LGRA 12 em DMSO deuterado, utilizando como
referência interna o tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos ( )
são indicados em ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).
4.10 - ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA
As análises quimiométricas foram realizadas pelo Prof. Dr. Edenir
Rodrigues Pereira Filho, da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar).
empregando o software PIROUETTE
®
, versão 4.0 (Informetrix).
4.11 - ESTUDO FARMACOLÓGICO DO EXTRATO METANÓLICO
DAS FOLHAS DE LIPPIA GRACILIS
Dois testes farmacológicos foram realizados com o extrato metanólico
das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis para verificar um possível efeito
antiinflamatório do extrato, uma vez que existem indicações desta atividade
em outras espécies de Lippia como, por exemplo, na L. dulcis [151].
Gomes, S. V. F.
2009
60
4.11.1 - Animais
Foram 80 camundongos (Mus musculus) Swiss, machos, albinos
pesando de 25 - 33 gramas, oriundos do Biotério Central da Universidade
Federal de Sergipe (UFS). Todos os animais foram mantidos até o dia dos
experimentos em gaiolas de polipropileno, com temperatura ambiente de 23
± 2 ºC e ciclo claro-escuro de 12:00 horas, sendo que a fase de luz tinha
início às 6:00 e término às 18:00 horas. Os animais tiveram livre acesso a
alimentação do tipo "pellets" (Labina) e água, disponível em frascos de vidro
com bicos apropriados, até 60 minutos antes dos experimentos.
O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em pesquisa com Animal
para avaliação sob o protocolo de número 07/09. Vale ressaltar que todos os
protocolos experimentais propostos respeitam os critérios éticos de
experimentação animal preconizados pelo Colégio Brasileiro em
Experimentação Animal (COBEA).
4.11.2 – Drogas
- Extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis
(EMLG);
- Tween (Sigma, USA);
- Formaldeído 37% (Reagen, Brasil);
- Ácido acetilsalicílico (Sigma, USA);
- Solução de cloreto de sódio, 0.9% (Merck, Brasil);
- Ácido acético glacial PA (Synth, Brasil).
4.11.3 – Avaliação da Atividade Antinociceptiva
4.11.3.1 - Teste de contorção abdominal induzida pelo ácido
acético a 0,85%
Esta metodologia foi realizada com camundongos (n=8/grupo) que
receberam o pré-tratamento com veículo (solução salina/Tween), EMLG
(100, 200 e 400 mg/Kg, v.o.) e ácido acetilsalicílico (200 mg/Kg). Após 60
Gomes, S. V. F.
2009
61
minutos todos os animais foram tratados com solução de ácido acético a
0,85%, pela via intraperitoneal (i.p.). Posteriormente, os animais foram
observados individualmente quanto à apresentação de contorções
abdominais seguidas de extensões dos membros posteriores, durante um
período de 15 minutos [152].
4.11.3.2 - Formalina
O comportamento espontâneo indicativo de nocicepção foi
quantificado após a administração subcutânea de 20 l/animal de uma
solução de formalina a 1,5% no dorso da pata traseira direita do animal
[152]. Para tanto, camundongos foram divididos em 5 grupos de 8 animais
(n=8) e pré-tratados com o veículo (solução salina/Tween), EMLG (100, 200
e 400 mg/Kg, v.o.) e ácido acetilsalicílico (200 mg/Kg, i.p.). A resposta
nociceptiva foi avaliada através da quantificação do tempo que o animal
executou o ato de lamber a pata que recebeu o estímulo, em dois períodos.
O primeiro deles, entre 0-10 minutos e o segundo período de observação, de
20-40 minutos [153, 154].
Os percentuais de inibição foram determinados através da fórmula
seguinte [155]:
% Inibição = 100. (controle - experimental)
controle
62
Capítulo
Gomes, S. V. F.
2009
63
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 - DESENVOLVIMENTO DOS CROMATOGRAMAS FINGERPRINT
5.1.1 - Otimização do procedimento de pré-tratamento
Devido à alta concentração de clorofila nos extratos brutos de Lippia
gracilis, inviabilizando as análises por cromatografia líquida, foi necessário
realizar um pré-tratamento por SPE nos extratos para posterior análise
cromatográfica.
Desta forma, foram testados dois métodos de extração em fase sólida
com o extrato metanólico das folhas do genótipo 108, descrito no item 4.5.1.
Os cartuchos de fase C
18
de diferentes marcas (Varian
®
, Supelco
®
e JT
Baker
®
) foram avaliados quanto ao seu poder de retenção da clorofila
(visualmente) na fase sólida e, principalmente, com relação à recuperação
dos metabólitos de interesse presentes na amostra.
O primeiro método utilizado para o pré-tratamento foi testado nas três
marcas de cartuchos. Durante o procedimento do método percebeu-se que
as clorofilas ficavam retidas no cartucho enquanto as substâncias de
interesse eram eluídas e coletadas em tubos de ensaio.
A análise visual permitiu constatar a melhor retenção da clorofila pelo
cartucho da marca JT Baker . Também foi realizada a análise por
cromatografia líquida para verificar a composição química das frações
extraídas por SPE nas três marcas de cartuchos. Para estas análises foi
utilizada uma coluna C
18
LUNA
®
de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i).
Gomes, S. V. F.
2009
64
As frações 5% de MeOH:H
2
O e 100% de MeOH extraídas dos três
cartuchos foram analisadas separadamente no cromatógrafo líquido de alta
eficiência (CLAE) da marca SHIMADZU acoplado a um detector UV com
arranjo de diodos pertencente ao Laboratório de Síntese Orgânica e CLAE
do Departamento de Química da UFSCar (Sistema 1 - item 4.2.1), utilizando
um gradiente exploratório linear de ACN (B) e H
2
O (A), nas condições de 5%
a 100% (B) por 60 min e mantida constante em 100% (B) até 65 min, vazão
de 1 mL/min, volume de injeção de 50 µL, detecção em = 280nm em
coluna C
18
LUNA
®
de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i) (Figuras 11, 12 e 13).
Figura 11: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100% MeOH após
tratamento por extração em fase sólida (Varian ). Condições cromatográficas: gradiente
linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão = 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL.
Figura 12: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100% MeOH após
tratamento por extração em fase sólida (Supelco ). Condições cromatográficas: gradiente
linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão = 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL.
Gomes, S. V. F.
2009
65
Figura 13: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100% MeOH após
tratamento por extração em fase sólida (JT Baker ). Condições cromatográficas: gradiente
linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão = 1mL/min, =280nm, V
inj.
= 50µL.
Analisando os cromatogramas é possível perceber claramente a
diferença entre o perfil químico das frações do cartucho da Supelco
®
e os
perfis químicos das frações dos cartuchos da Varian
®
e JT Baker
®
. Isso
demonstra que a maioria dos constituintes químicos não eluíram com a
passagem da solução 5% de MeOH:H
2
O e 100% de MeOH no cartucho da
Supelco
®
.
Diante do exposto, optou-se por realizar o restante das análises com
o cartucho da marca JT Baker
®
, uma vez que nele houve uma melhor
retenção das clorofilas na fase estacionária e uma boa resposta nas análises
cromatográficas das frações.
Além da análise anterior, foi avaliada a composição química dos
extratos reunindo-se as frações de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% e 60%
de MeOH:H
2
O e 100% de MeOH coletadas no SPE, com o objetivo de
comparar os compostos presentes nas frações isoladas de 5% MeOH:H
2
O e
100% MeOH realizadas anteriormente (Figuras 10 a 12). Para isso, repetiu-
se o mesmo processo de eluição de gradiente exploratório linear de ACN (B)
e H
2
O (A), nas condições de 5% a 100% (B) por 60 min, vazão de 1 mL/min,
volume de injeção de 50 µL, detecção em =280nm em coluna C
18
LUNA
®
de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i). O cromatograma pode ser visualizado na
figura 14.
Gomes, S. V. F.
2009
66
0 10 20 30 40 min
0
25
50
75
100
125
mAU
Figura 14: Cromatograma das frações reunidas de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%
e 60% MeOH:H
2
O e 100% MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker
®
).
Analisando o cromatograma da figura 14 foi possível observar que
ele apresenta um perfil cromatográfico similar ao cromatograma (a) da
figura 13. Isto comprova que os compostos eluíram apenas com a
passagem da solução de 5% MeOH:H
2
O e 100% MeOH no cartucho. O
cromatograma da figura 15 evidencia esta observação, pois trata-se de um
cromatograma obtido pela análise das frações reunidas de 5% MeOH:H
2
O e
100% MeOH.
Gomes, S. V. F.
2009
67
Figura 15: Cromatograma das frações reunidas 5% MeOH:água e 100% MeOH
após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker
®
). Condições cromatográficas:
gradiente linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, V
inj.
=
50µL.
Desta forma, o segundo método para o pré-tratamento dos extratos
brutos das folhas e caules dos genótipos de L. gracilis foi selecionado, na
qual o cartucho C
18
da marca JT Baker
®
é condicionado com 3 mL de
metanol, seguido por 1 mL de água. Posteriormente, é aplicado 100µL da
amostra a qual é eluída seqüencialmente com 1 mL de solução a 5%
MeOH:H
2
O e 3 mL de 100% MeOH.
5.1.2 – Cromatograma fingerprint das folhas de Lippia gracilis
As condições cromatográficas foram otimizadas utilizando-se a
amostra obtida após a extração em fase sólida. Para a otimização das
condições de análise foram avaliados os efeitos dos seguintes fatores:
natureza do modificador orgânico (ACN ou MeOH), fase estacionária, vazão,
volume de injeção e condições de eluição gradiente.
Todas as análises para a obtenção do cromatograma fingerprint das
folhas de Lippia gracilis foram realizadas no Cromatógrafo líquido da marca
Gomes, S. V. F.
2009
68
SHIMADZU (Kyoto, Japão) pertencente ao Laboratório de Síntese Orgânica
e CLAE do Departamento de Química da UFSCar (Sistema 1 – item 4.2.1).
O uso da eluição gradiente em condições de ampla faixa de força da
fase móvel é tido como exploratório e pode ser usado de modo a fornecer
um cromatograma fingerprint (impressão digital) da amostra em análise.
SYNDER e DOLAN relatam que a mistura ACN:H
2
O como fase móvel é
menos viscosa e permite a utilização de valores baixos de comprimento de
onda no UV para detecção de compostos [29].
O primeiro passo do trabalho foi a realização de um gradiente
exploratório para visualizar a complexidade da amostra e identificar a fase
móvel mais eficiente para separação dos componentes da amostra.
Inicialmente, foi empregado um gradiente exploratório binário usando
a mistura ACN (B) e H
2
O (A) como solventes, em uma coluna analítica C
18
LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex). Foi variada a concentração
do modificador orgânico (ACN) de 5% a 100% durante 60 minutos, com
vazão de 1mL/min, acompanhado pelo detector UV-Vis com arranjo de
diodos.
A figura 16 mostra o cromatograma na qual a maioria dos compostos
eluíram entre 6 a 34 min.
Gomes, S. V. F.
2009
69
0 10 20 30 40 min
0
25
50
75
100
125
mAU
Figura 16: Cromatograma do extrato metanólico da Lippia gracillis. Condições
cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min,
=280nm, V
inj.
= 50µL.
A análise cromatográfica permitiu verificar que os compostos
presentes na amostra apresentavam baixa interação com a fase
estacionária, além disso não foi possível obter uma adequada separação
das bandas cromatográficas.
Através deste cromatograma fingerprint foi possível determinar a
inclinação do gradiente (%B/min) e correlacionar a afinidade dos
constituintes presentes na amostra com as fases móvel e estacionária
empregadas através da seguinte fórmula:
% B/min = Δ%B = 95 = 1,58%B/min
t
g
60
%B/min = variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente)
Δ%B = diferença entre a % de B final e inicial
t
g
= tempo de gradiente
Gomes, S. V. F.
2009
70
Desta forma, diferentes otimizações de condições de separação foram
testadas variando os fatores inicialmente mencionados com o intuito de
melhorar a separação dos compostos. Estas diferentes condições são
demonstradas com seus respectivos perfis cromatográficos na tabela 7 e
nas figuras 17.
Tabela 7: Condições cromatográficas avaliadas para separação dos
compostos químicos, com detecção em = 280 nm.
Condição
Eluição
gradiente
(B)
Solventes
Coluna
cromatográfica
(15,0 x 0,46 cm)
Vazão
(mL/min)
Vol. de
injeção
(µL)
%B/min
1
5-60% por
60min
ACN:H
2
O
C
18
LUNA
®
(Phenomenex)
1,0
50,0
0,92
2
5-60% por
60min
ACN:HCOOH
0,5% (v/v)
C
18
LUNA
®
(Phenomenex)
1,0
50,0
0,92
3
5-90% por
60min
MeOH:HCOOH
0,5% (v/v)
C
18
LUNA
®
(Phenomenex)
1,0
50,0
1,42
4
15-90%
por 60min
MeOH:HCOOH
0,5% (v/v)
C
18
LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
50,0
1,25
5
5-100%
por 60min
MeOH: H
2
O
C
18
LUNA
®
(Phenomenex)
1,0
50,0
1,58
6
5-100%
por 60min
MeOH: H
2
O
Hexil-fenil LUNA
®
(QC-UFSCar-
158)
1,0
50,0
1,58
7
20-100%
por 60min
MeOH:HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(QC-UFSCar-
158)
0,5
25,0
1,33
8
35-85%
por 60min
MeOH:HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(QC-UFSCar-
158)
0,5
25,0
0,83
9
5-90% por
60 min
ACN: HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(QC-UFSCar-
158)
0,5
25,0
1,42
Gomes, S. V. F.
2009
71
Tabela 7: continuação
Condição
Eluição
gradiente
(B)
Solventes
Coluna
cromatográfica
(15,0 x 0,46 cm)
Vazão
(mL/min)
Vol. de
injeção
(µL)
%B/min
10
1) 20-40%
por 40min;
2) 40-70%
por 20min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil
LUNA® (QC-
UFSCar-158)
0,5
25,0
1) 0,5
2) 1,5
11
1) 10-30%
por 40min;
2) 30-70%
por 25min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil
LUNA® (QC-
UFSCar-158)
0,5
25,0
1) 0,5
2) 1,6
12
1) 15-40%
por 50min;
2) 40-70%
por 20min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil
LUNA® (QC-
UFSCar-158)
0,5
25,0
1) 0,5
2) 1,5
Gomes, S. V. F.
2009
72
Figura 17: Cromatogramas para seleção de condições para o método em CLAE. Os
números correspondem às condições apresentadas na tabela 3.
Observando os cromatogramas das figuras 17, nota-se que não
houve uma boa separação das bandas cromatográficas utilizando as
misturas MeOH:H
2
O ou MeOH:solução de ácido fórmico (HCOOH) 0,5%
(v/v) com a coluna de fase estacionária C
18
, apresentando muitas bandas
em co-eluição (condições cromatográficas de 1 a 5).
Gomes, S. V. F.
2009
73
A mudança da coluna de fase estacionária C
18
para uma de fase hexil-
fenil utilizando as misturas MeOH:H
2
O ou MeOH:solução de ácido fórmico
(HCOOH) 0,5% (v/v) permitiu obter uma melhor separação das bandas
cromatográficas (condições cromatográficas 6 a 8); no entanto, ainda foi
observado sobreposição de bandas.
Contudo, ao variar o modificador orgânico de MeOH para ACN e
também as condições de eluição gradiente, pôde-se obter cromatogramas
com melhor separação das bandas cromatográficas (condições
cromatográficas 9 a 12).
Dentre as condições testadas, a condição 12 foi a que apresentou o
melhor cromatograma. Tanto a composição da fase móvel ACN: solução de
HCOOH 0,5% (v/v), quanto à fase estacionária hexil-fenil LUNA
®
(10 µm,
15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158) foram eficazes na separação dos
compostos presentes no extrato metanólico (Figura 18).
10 20 30 40 50 60 70 min
0
50
100
150
200
250
mAU
Figura 18: Cromatograma obtido com a condição de eluição gradiente: 15-40%
ACN (B):solução de 0,5% HCOOH (A) em 50 min; 40-70% (B) em 20 min, vazão 0,5 ml/min,
=280nm, V
inj.
= 25µL, coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158).
As análises posteriores deste trabalho foram realizadas no
Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto, Japão) pertencente ao
Gomes, S. V. F.
2009
74
Departamento de Química da UFS (Sistema 2 – item 4.2.1). A coluna
cromatográfica que passou a ser utilizada nas análises foi uma hexil-fenil
LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), uma coluna comercial e não
mais manufaturada como a anterior.
Após a otimização do gradiente, na qual se obteve a melhor condição
cromatográfica para separação dos compostos químicos, foi realizado a
análise cromatográfica nas mesmas condições com os extratos metanólicos
das folhas dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis,
utilizando coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex),
volume de injeção 25 µL, vazão 0,5 mL/ min e detecção em 280 nm. Os
cromatogramas podem ser visualizados na figura 19.
Figura 19: Cromatogramas fingerprint das folhas dos sete genótipos (106-110, 201
e 202) de Lippia gracilis.
Observando os perfis cromatográficos dos sete genótipos (106-110,
201 e 202) expostos na figura 19, é possível perceber que os tempos de
retenção das bandas cromatográficas não são os mesmos quando
comparados com os tempos de retenção do cromatograma da figura 18.
Além disso, as bandas cromatográficas correspondentes aos tempos de
Gomes, S. V. F.
2009
75
retenção 58,91 e 60,00 minutos, presentes no cromatograma da figura 18,
não são visualizados nos cromatogramas da figura 19.
Isto se deve ao fato de que, provavelmente, a mudança de uma
coluna manufaturada hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-
158) para uma coluna comercial hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm,
Phenomenex) e a utilização de outro aparelho de Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência devem ter influenciado a separação dos compostos químicos.
Após as análises, fez-se a seleção do comprimento de onda através
da projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra do genótipo
108 de Lippia gracilis, conforme apresentado na figura 20. O comprimento
de onda de 280 nm foi selecionado por apresentar uma absorção máxima
dos compostos presentes na amostra.
Figura 20: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra das folhas do
genótipo 108 de Lippia gracilis.
Na Figura 22 são apresentados os espectros de UV das principais
bandas cromatográficas, numeradas no cromatograma fingerprint da figura
21, do genótipo 108 de Lippia gracilis.
Gomes, S. V. F.
2009
76
Figura 21: Cromatograma da amostra do genótipo 108 das folhas de Lippia gracilis.
Numeração referente aos picos registrados no espectro de UV-Vis (CLAE-DAD) da figura
22.
Gomes, S. V. F.
2009
77
Figura 22: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD)
correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 20, da amostra do
genótipo 108 de Lippia gracilis.
Na Figura 23 estão apresentados os cromatogramas das folhas dos
sete genótipos de Lippia gracilis realizados em quintuplicata para serem
utilizados na análise quimiométrica.
Gomes, S. V. F.
2009
78
Figura 23: Cromatogramas dos sete genótipos das folhas de Lippia gracilis em
quintuplicata.
Gomes, S. V. F.
2009
79
5.1.3 – Cromatograma fingerprint dos caules de Lippia gracilis
Similarmente ao que foi feito com as análises por CLAE dos genótipos
das folhas de Lippia gracilis, também foram realizados estudos com os
caules com o objetivo da aquisição de um cromatograma fingerprint ou
‘’impressão digital’’ que o caracterizasse quimicamente.
A primeira etapa foi realizar o pré-tratamento dos extratos metanólicos
dos caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202), utilizando a extração
em fase sólida com cartucho C
18
da marca JT Baker
®
, descrito no item 4.5.1.
Em seguida, foi efetuada a análise utilizando as mesmas condições
de eluição gradiente do cromatograma fingerprint das folhas de Lippia
gracilis (figura 21) com o objetivo de conhecer o perfil químico do extrato
metanólico dos caules.
Para essas análises foi empregado o gradiente de eluição linear
constituído pela mistura ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (A) como
solventes em uma coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm,
Phenomenex). Foi variada a concentração do modificador orgânico (ACN) de
15-40% durante 50 min; 40-70% (B) durante 20 min; 70% (B) por 5 min, 70-
15% (B) para o retorno do gradiente, isocrático em 15% (B) para o
recondicioamento da coluna, vazão de 0,5 mL/min, volume de injeção de
25µL e detecção em =280nm. O cromatograma pode ser visualizado na
figura 24 (a).
A análise foi realizada no Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU
(Kyoto, Japão) pertencente ao Departamento de Química da UFS (Sistema
2 – item 4.2.1).
Gomes, S. V. F.
2009
80
Figura 24: Cromatograma (a) extrato metanólico dos caules do genótipo 108 da
Lippia gracilis e (b) extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis.
Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de
HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, V
inj.
=
25µL.
Comparando-se o cromatograma do extrato metanólico das folhas do
genótipo 108, figura 24 (a), com o cromatograma do caule genótipo 108,
figura 24 (b), verifica-se que os perfis cromatográficos apresentam-se de
forma distinta, o que leva a inferir que a os constituintes químicos dos caules
apresentam características mais polares do que os constituintes das folhas,
pois eluíram nos vinte minutos iniciais da corrida cromatográfica.
Essa condição inicial não foi adequada para se obter o cromatograma
fingerprint do caule, pois apresentou co-eluição de algumas bandas
cromatográficas.
Para obtermos uma melhor separação das bandas, diferentes
otimizações de gradiente foram testadas variando somente o percentual do
modificador orgânico (alteração na inclinação do gradiente), como mostrado
na tabela 8 e nas figuras 25.
Gomes, S. V. F.
2009
81
Tabela 8: Condições cromatográficas para otimização do gradiente
com detecção em = 280 nm.
Condição
Eluição
gradiente
(B)
Solventes
Coluna
cromatográfica
(15,0 x 0,46 cm)
Vazão
(mL/min)
Vol. de
injeção
(µL)
%B/min
1
15-36% em
60 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
0,35
2
1) 15-25%
em 30 min;
2) 25-40%
em 30 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
1) 0,33
2) 0,50
3
1) 15-25%
em 40 min;
2) 25-40%
em 30 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
1) 0,25
2) 0,50
4
1) 15-23%
em 40 min;
2) 23-38%
em 50 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
1) 0,20
2) 0,30
5
1) 15-23%
em 30 min;
2) 23-40%
em 25 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
1) 0,26
2) 0,68
6
1) 15-25%
em 50 min;
2) 25-40%
em 25 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
1) 0,20
2) 0,60
7
1) 15-20%
em 25 min;
2) 20-23%
em 30 min
3) 23-40%
em 25 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
1) 0,20
2) 0,10
3) 0,68
8
1) 15-20%
em 25 min;
2) 20-40%
em 45 min
ACN:
HCOOH
0,5% (v/v)
Hexil-fenil LUNA
®
(Phenomenex)
0,5
25,0
1) 0,20
2) 0,40
Gomes, S. V. F.
2009
82
Figura 25: Cromatogramas para seleção de condições cromatográficos para análise
dos extratos dos caules de Lippia gracilis. Os números correspondem às condições
apresentadas na tabela 8.
Dentre as condições cromatográficas testadas, a condição 8 foi a que
apresentou a separação mais adequada dos constituintes do caule de Lippia
gracilis.
Após a otimização do gradiente na qual se obteve a melhor condição
cromatográfica para separação dos compostos químicos, foi realizado a
análise cromatográfica nas mesmas condições com os extratos metanólicos
dos caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis,
utilizando coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex),
volume de injeção 25 µL, vazão 0,5 mL/ min e detecção em 280 nm. Os
cromatogramas podem ser visualizado na figura 26.
Gomes, S. V. F.
2009
83
Figura 26: Cromatogramas fingerprint dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de
Lippia gracilis.
Após as análises fez-se a seleção do comprimento de onda através
da projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra do genótipo
108 de Lippia gracilis, conforme apresentado na figura 27. O comprimento
de onda de 280 nm foi selecionado por apresentar uma absorção máxima
dos compostos presentes na amostra.
Figura 27: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra dos caules do
genótipo 108 de Lippia gracilis.
Gomes, S. V. F.
2009
84
Na figura 29 são apresentados os espectros de UV das principais
bandas cromatográficas, numeradas no cromatograma fingerprint da figura
28, do genótipo 108 de Lippia gracilis.
Figura 28: Cromatograma da amostra do genótipo 108 dos caules de Lippia gracilis.
Numeração referente aos picos registrados no espectro de UV-Vis da figura 29.
Gomes, S. V. F.
2009
85
Figura 29: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD)
correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 28, da amostra do
genótipo 108 de Lippia gracilis.
Na figura 30 estão apresentados os cromatogramas dos caules dos
sete genótipos de Lippia gracilis realizados em quintuplicata para serem
utilizados na análise quimiométrica.
Gomes, S. V. F.
2009
86
Figura 30: Cromatogramas dos sete genótipos dos caules de Lippia gracilis em
quintuplicata.
Gomes, S. V. F.
2009
87
5.2 - ISOLAMENTO DOS MARCADORES QUÍMICOS
5.2.1 – Fracionamento do extrato das folhas do genótipo 107 de
Lippia gracilis com Amberlite XAD-2
Após a obtenção dos cromatogramas fingerprint dos sete genótipos
de Lippia gracilis iniciou-se a etapa de isolamento dos marcadores químicos.
Havendo a possibilidade de existir flavonóides no extrato, devido à presença
comum destes compostos em espécies do gênero Lippia, optou-se por usar
a resina amberlite XAD-2 por ser um polímero orgânico não-iônico, apolar,
hidrofóbico e muito utilizado no isolamento de compostos fenólicos, como
flavonóides.
Lianda et al. [156], por exemplo, relataram o isolamento de um
flavonol, a morina (47), a partir do fracionamento do mel de Apis melifera em
coluna amberlite XAD-2 com metanol.
47
O
OH
O
HO
OH
HO
OH
Desta forma, o extrato metanólico das folhas do genótipo 107 de
Lippia gracilis foi submetido à cromatografia em coluna com a resina
amberlite XAD-2. Esse extrato foi escolhido por ser um dos genótipos com
maior rendimento para realizar o fracionamento.
Para a cromatografia em coluna com a resina amberlite XAD-2 foram
utilizados 6,0g do extrato metanólico do genótipo 107 das folhas, o qual foi
eluído com 500 mL de MeOH:H
2
O nas proporções: 5%, 15%, 25%, 35%,
50%, 70%, 85% de MeOH:H
2
O e 100% MeOH, obtendo-se oito frações que
foram analisados por CLAE-DAD, utilizando uma coluna hexil-fenil LUNA
®
Gomes, S. V. F.
2009
88
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), volume de injeção 25µL, vazão 0,5
mL/min e detecção em 280 nm.
Nas análises das frações foram empregadas as mesmas condições
dos cromatogramas fingerprint das folhas, na qual foi utilizado um sistema
de eluição gradiente de solvente onde a porcentagem de ACN (B) e solução
de HCOOH 0,5%(v/v) (A) variaram de 15% a 40% (B) em 50 min, 40% a
70% (B) em 20 min, obtendo-se os cromatogramas mostrados na figura 31.
Gomes, S. V. F.
2009
89
Figura 31: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5%
MeOH:H
2
O; b) 15% MeOH:H
2
O; c) 25% MeOH:H
2
O; d) 35% MeOH:H
2
O; e) 50%
MeOH:H
2
O; f) 70% MeOH:H
2
O; g) 85% MeOH:H
2
O. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B)
por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, V
inj.
= 25µL.
Observando os cromatogramas da figura 31, verifica-se que os
compostos químicos com características polares eluíram nas frações 5%,
Gomes, S. V. F.
2009
90
15%, 25%, 35%, 50% MeOH:H
2
O e foram detectados na primeira rampa de
eluição gradiente de 15% a 40% de ACN:solução de HCOOH 0,5% (v/v) por
50 min.
A fração 70% MeOH:H
2
O apresentou compostos químicos que
eluíram em toda a corrida cromatográfica, enquanto que a fração 85%
MeOH:H
2
O mostrou os compostos de mais baixa polaridade, pois eluíram na
segunda rampa de eluição gradiente de 40% a 70% de ACN: solução de
HCOOH 0,5% (v/v) por 20 min.
É importante mencionar que as clorofilas ficaram retidas na resina
durante quase todo o fracionamento, com exceção do momento em que
MeOH foi adicionado no final, provocando o arraste das clorofilas e, por isso,
impossibilitando a análise desta fração no cromatógafo líquido.
As frações 50% e 85% MeOH:H
2
O obtidas da coluna com a resina
amberlite XAD-2 foram escolhidas para a análise por CLAE semipreparativa
por apresentarem constituintes polares e de baixa polaridade divididos em
ambas as frações.
5.2.2 – Fracionamento do extrato dos caules do genótipo 107 de
Lippia gracilis com Amberlite XAD-2
Seguindo o mesmo objetivo exposto para o fracionamento do extrato
das folhas de Lippia gracilis, o extrato metanólico dos caules do genótipo
107 também foi submetido à cromatografia em coluna com a resina
amberlite XAD-2 para a obtenção de frações a serem utilizadas no
isolamento dos marcadores químicos.
As oito frações (5%, 15%, 25%, 35%, 50%, 70%, 85% MeOH:H
2
O e
100% MeOH) obtidas do fracionamento do extrato com a resina foram
analisadas por CLAE-DAD, utilizando uma coluna hexil-fenil LUNA
®
(10 µm,
15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), volume de injeção 25µL, vazão 0,5 mL/min e
detecção em 280 nm.
Gomes, S. V. F.
2009
91
As condições utilizadas para a análise foram as mesmas dos
cromatogramas fingerprint dos caules, na qual utilizou um sistema de eluição
gradiente de solvente onde a porcentagem de ACN (B) e solução de
HCOOH 0,5% (v/v) (A) variaram de 15% a 20% (B) em 25 min, 20% a 40%
(B) em 45 min, obtendo-se os cromatogramas da figura 32.
Gomes, S. V. F.
2009
92
Figura 32: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5%
MeOH:H
2
O; b) 15% MeOH:H
2
O; c) 25% MeOH:H
2
O; d) 35% MeOH:H
2
O; e) 50%
MeOH:H
2
O; f) 70% MeOH:H
2
O; g) 85% MeOH:H
2
O. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B)
por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, V
inj.
= 25µL.
Gomes, S. V. F.
2009
93
Nos cromatogramas das frações é possível verificar que a eluição dos
compostos químicos ocorreram basicamente nas frações 50%, 70% e 85%
MeOH:H
2
O.
A etapa de isolamento dos marcadores químicos utilizando as frações
obtidas da coluna amberlite XAD-2 não foi realizado, uma vez que o
rendimento das frações foram insuficientes para serem utilizadas no
isolamento dos compostos químicos.
5.2.3 – CLAE semipreparativa das frações 50% e 85% MeOH:H
2
O
das folhas de Lippia gracilis
Uma vez conhecidos os perfis cromatográficos das frações 50% e
85% MeOH:H
2
O, iniciou-se a etapa de isolamento dos marcadores químicos
empregando-se um procedimento cromatográfico (CLAE) em escala
semipreparativa. Para a realização deste estudo, as condições
cromatográficas estabelecidas para a separação analítica foram
escalonados.
O escalonamento tem por finalidade os ajustes dos parâmetros
cromatográficos (diâmetro e comprimento da coluna, fase estacionária
empregada, dimensões das partículas de sílica, vazão) de forma a conseguir
reproduzir em escala preparativa ou semipreparativa os resultados obtidos
em escala analítica.
Desta forma, a transferência do método analítico para o semi-
preparativo foi feito basicamente ajustando as condições em que a coluna
semipreparativa (maior dimensão) seria submetida. Na prática isto significa
ajustar a vazão da fase móvel e a carga que seria injetada por análise
(concentração da amostra) utilizando a fórmula:
S = R
2
p
. L
p
: (1,00 cm)
2
. 25 cm = 7,87
R
2
a
. L
a
(0,46 cm)
2
. 15 cm
R
p
: diâmetro das coluna preparativa ou semipreparativa
Gomes, S. V. F.
2009
94
R
a
: diâmetro da coluna analítica
L
p
: comprimento da coluna preparativa ou semipreparativa
L
a
: comprimento da coluna analítica
S: fator de escalonamento
A vazão a ser utilizada na CLAE semipreparativa foi definida
multiplicando o fator de escalonamento pela vazão utilizado na CLAE
analítica.
Definida a vazão a ser empregada na separação semipreparativa,
iniciou-se o isolamento dos compostos químicos das frações 50% e 85%
MeOH:H
2
O obtidas da coluna cromatográfica com resina amberlite XAD-2.
A fração 50% MeOH:H
2
O foi submetida a isolamento dos compostos
químicos utilizando coluna de fase estacionária hexil-fenil LUNA
®
de 10 µm
(25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), nas seguintes condições: vazão 4 mL/ min,
volume de injeção 100 µL, eluição gradiente no modo reverso utilizando
ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (v/v) (A) de 8% a 40% (B) por 50 min.
A detecção foi acompanhada pelo detector UV-Vis com arranjo de diodos em
280 nm. Em cada análise foram injetados 10 mg/ 100 µL e um total de doze
injeções. Os compostos que eluíram em 20 a 36 minutos foram coletados e
denominados LGRA 1 a LGRA 10, conforme a figura 33.
Gomes, S. V. F.
2009
95
Figura 33: Cromatograma da fração 50% MeOH:H
2
O para isolamento dos
compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 8% a 40% de ACN (B) em 50 min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, V
inj.
= 100 µL,
m
inj
= 10 mg.
As amostras LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9 e LGRA 10 foram
enviadas para análise por Ressonância Magnética Nuclear.
Depois do isolamento dos compostos químicos presentes na fração
50% MeOH:H
2
O iniciou-se o estudo com a fração 85% MeOH:H
2
O.
A fração 85% MeOH:H
2
O foi submetida ao isolamento dos
compostos químicos utilizando coluna de fase estacionária hexil-fenil LUNA
®
de 10 µm (25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), nas seguintes condições: vazão 4
mL/ min, volume de injeção 200 µL, eluição gradiente no modo reverso
utilizando ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (v/v) (A) de 35% a 53% (B)
por 15 min. A detecção foi acompanhada pelo detector UV-Vis com arranjo
de diodos em 280 nm. Em cada análise foram injetados 10 mg/ 200 µL e um
total de doze injeções. Os compostos que eluíram em 9 a 14 minutos foram
coletados e denominados LGRA 11 a LGRA 15, figura 34.
Gomes, S. V. F.
2009
96
Figura 34: Cromatograma da fração 85% MeOH:H
2
O para isolamento dos
compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 35% a 53% de ACN (B) em 50 min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, V
inj.
= 200 µL,
m
inj
= 10 mg.
As amostras LGRA 12 e LGRA 13 foram enviadas para análise por
Ressonância Magnética Nuclear.
5.3 – IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL
Sete amostras (LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9, LGRA 10, LGRA
12 e LGRA 13) foram isoladas por CLAE semipreparativa e enviadas para
análise por Ressonância Magnética Nuclear. Destas amostras, somente a
LGRA 12 teve a sua estrutura elucidada e as outras ainda estão em
processo de identificação estrutural.
5.3.1 – Identificação da substância LGRA 12
A substância LGRA 12 foi isolado através de CLAE semipreparativa
da fração 85% MeOH:H
2
O obtida do fracionamento com resina amberlite
XAD-2 do extrato metanólico das folhas do genótipo 107 de Lippia gracilis. A
substância possui aspecto de cristal e apresenta coloração amarela. A
Gomes, S. V. F.
2009
97
identificação foi baseada na análise dos dados espectrais de RMN
1
H e
13
C
e por comparação com os dados da literatura [157].
O espectro de RMN
1
H e
13
C para LGRA 12, realizado em DMSO-d
6
,
apresentou sinais compatíveis para um flavonóide. Com base nesses
espectros foi possível sugerir a presença da flavanona naringenina (48)
(5,7,4’-triidroxiflavanona).
48
O
O
OH
OH
HO
2
3
4
5
6
7
8
2
'
3
'
4
'
5
'
6
'
9
10
1
'
No espectro de RMN
1
H (Espectros 1 e 2) foi observado,
primeiramente, a presença de dois singletos em 12,16 (1H) e 8,36 (1H),
que são característicos dos hidrogênios das hidroxilas em C-5 e C-4’,
respectivamente.
Gomes, S. V. F.
2009
98
Espectro 1: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz)
Gomes, S. V. F.
2009
99
Espectro 2: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da
região entre 12,45 ppm e 11,7 ppm.
Ao ampliarmos a região entre 7,60 e 6,37 ppm, espectro 3,
observamos a presença de dois dubletos, um em 7,31 (2H; d; J = 8,53 Hz;
H-2’ e H-6’) e outro em 6,78 (2H; d; J = 8,53 Hz; H-3’ e H-5’) que
comprovam a presença de um anel B para-substituído por uma hidroxila.
Gomes, S. V. F.
2009
100
Espectro 3: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da
região entre 7,60 ppm e 6,37 ppm.
Em 5,84 foi observado a presença de dois dubletos com um
acoplamento meta (J = 2,04 Hz), atribuídos aos dois hidrogênios aromáticos
pertencentes ao anel A, H-6 e H-8 (Espectro 4).
Gomes, S. V. F.
2009
101
Espectro 4: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da
região entre 5,95 ppm e 5,34 ppm.
A presença de três duplos dubletos em 5,42 (1H; dd; J = 2,98 e
12,84 Hz), 3,24 (1H; dd; J = 12,84 e 17,10 Hz) e 2,66 (1H; dd; J = 2,98 e
17,10 Hz) indicam a estrutura de uma flavanona, sendo o primeiro duplo
dubleto atribuído ao H-2 e os outros dois duplos dubletos aos hidrogênios H-
3
ax
e H-3
eq
do anel C (Espectro 4 e 5).
O O
H
3ax
H
3eq
H
2
Conformação preferida do anel C de flavanonas
Gomes, S. V. F.
2009
102
Espectro 5: Espectro de RMN
1
H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da
região entre 3,30 ppm e 2,63 ppm.
O esqueleto de uma flavanona foi também confirmado pelo espectro
de
13
C (Espectro 6) pelos sinais em
C
78,4 (CH),
C
41,9 (CH
2
) e 195,9 (C
o
)
relativos, respectivamente aos carbonos C-2, C-3 e C-4 do anel C. Os sinais
em
C
95,8 (CH) e
C
95,0 (CH) são atribuídos aos carbonos C-6 e C-8 do
anel A;
C
128,2 (2CH) e
C
115,0 (2CH) relativos, respectivamente aos
carbonos C-2’/C-6’ e C-3’/C-5’ do anel B.
O espectro de RMN de
13
C também auxiliou na confirmação dos
sinais dos carbonos quarternários em
C
195,9 (C=O), 163,4 (C-5), 167,4 (C-
7), 162,8 (C-9), 101,4 (C-10), 128,8 (C-1’) e 157,6 (C-4’).
Gomes, S. V. F.
2009
103
Espectro 6: Espectro de RMN
13
C da amostra LGRA 12 (400 MHz)
Pelos dados acima apresentados, confirma-se para LGRA 12 a
estrutura de uma 5,7,4’-triidroxiflavanona, também conhecida como
naringenina. Os dados de RMN de
1
H e
13
C são coincidentes com os dados
da literatura [157], apresentados na tabela 9.
Gomes, S. V. F.
2009
104
Tabela 9: Correlações observadas no espectro de RMN
1
H e
13
C da
substância LGRA 12 e dados da naringenina da literatura [157].
H/C
c LGRA 12
(ppm)
H
LGRA 12 (ppm)
(mult., int, J=Hz)
c Lit.
(ppm)
H
Lit.
(ppm)
(mult., int, J=Hz)
2
78,2
5,42 (dd, 1H, 2,98 e
12,84 Hz)
79,0
5,43 (dd, 1H, 4,00 e
13,00 Hz)
3
eq
41,9
2,66 (dd, 1H, 2,98 e
17,10 Hz)
42,6
2,70 (dd, 1H, 2,80 e
17,00 Hz)
3
axial
-
3,24 (dd, 1H, 12,84 e
17,10 Hz)
-
3,20 (m, 1H)
4
195,9
-
196,4
-
5
163,4
-
163,7
-
6
95,8
5,84 (d, 2,04 Hz)
96,4
5,88 (s,1H)
7
167,4
166,9
8
95,0
5,84 (d, 2,04 Hz)
95,5
5,88 (s,1H)
9
162,8
-
163,3
-
10
101,4
-
102,3
-
1'
128,8
-
129,4
-
2'
128,2
7,31 (d, 1H, 8,53 Hz)
128,7
7,32 (d, 1H, 9,00 Hz)
3'
115,0
6,78 (d, 1H, 8,53 Hz)
115,7
6,79 (d, 1H, 9,00 Hz)
4'
157,6
-
158,1
-
5'
115,0
6,78 (d, 1H, 8,53 Hz)
115,7
6,79 (d, 1H, 9,00 Hz)
6'
128,2
7,31 (d, 1H,8,53 Hz)
128,7
7,32 (d, 1H, 9,00 Hz)
5-OH
-
12,16 (s, 1H)
-
12,14 (s, 1H)
7-OH
-
-
-
10,82 (s, 1H)
OH-4’
-
8,36 (s, 1H)
-
9,60 (s, 1H)
No gênero Lippia a naringenina foi isolada pela primeira vez na L.
graveolens por Dominguez et al. [111].
Em 2007, Lin et al. [108] relataram a identificação e quantificação da
naringenina e de outros flavonóides do extrato hidroalcoólico da L.
graveolens (70:30 v/v) através da técnica de LC-DAD-ESI/EM.
Gomes, S. V. F.
2009
105
O nosso trabalho traz o primeiro estudo sobre os constituintes fixos da
espécie Lippia gracilis, sendo a naringenina o primeiro composto a ser
identificado nesta espécie.
5.4 - ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA
Como os cromatogramas fingerprint são muito semelhantes, é difícil
identificar diferenças entre as amostras baseando-se em uma simples
análise visual. Desta forma, o emprego de técnicas quimiométricas de
análise multivariada tem auxiliado na interpretação dos resultados obtidos.
A base fundamental da maioria dos métodos modernos para
interpretação de dados multivariados é a Análise de Componentes Principais
– PCA, que consiste numa transformação da matriz de dados originais com
o objetivo de avaliar semelhanças e diferenças entre as amostras pela
projeção das mesmas em gráficos bidimensionais elaborados a partir de
cálculos de novos eixos denominados Componentes Principais (PC’s) [55].
Esta técnica tem sido utilizada com êxito, por exemplo, na
discriminação de espécies vegetais de Phyllanthus, conhecida popularmente
como ‘’quebra-pedra’’. MARTINS et al. [158] empregaram a Análise de
Componentes Principais para interpretar os cromatogramas fingerprint,
obtidos por CLAE-DAD de seis diferentes espécies de Phyllanthus, com o
objetivo de construir um modelo de classificação que pode ser utilizado para
verificar a autenticidade de amostras comerciais de ‘’quebra-pedra’’.
No nosso caso, a utilização desta técnica irá nos auxiliar na
diferenciação dos cromatogramas fingerprint dos extratos das folhas e
caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis obtidos por
CLAE-DAD. Para a análise quimiométrica foram utilizados os dados dos
cromatogramas fngerprint realizados em quintuplicata de cada um dos sete
genótipos com o objetivo de obtermos um maior número de amostras para a
análise. Os cromatogramas podem ser visualizados nas figuras 23 e 30.
Gomes, S. V. F.
2009
106
É importante lembrar que os genótipos 106-110 são provenientes do
estado de Sergipe, município de Tomar do Geru, e os genótipos 201 e 202
são provenientes do estado da Bahia, município de Rio Real. Essas
amostras foram coletadas nestes municípios e cultivadas no Campus Rural
da UFS.
5.4.1 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint das
folhas
Os cromatogramas foram transformados em uma matriz numérica de
dados, contendo 35 linhas (amostras) e 2188 variáveis (tempos de
retenção), que foram alinhados utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised
Warping’’ (COW) [159]. A figura 35 mostra uma parte do cromatograma
antes e após o alinhamento, podendo-se perceber a grande necessidade de
se realizar o alinhamento antes da aplicação da análise quimiométrica.
Figura 35: Parte do cromatograma das folhas: a) antes do alinhamento, b) após o
alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW)
O método de análise exploratória utilizado foi a PCA. Antes de
empregar a PCA foi necessário um pré-processamento dos dados originais.
Gomes, S. V. F.
2009
107
Os métodos de pré-processamento mais utilizados consistem basicamente
em centrar na média ou auto-escalar os dados. Neste caso, os dados foram
centrados na média, isto é, calculou-se a média dos valores experimentais
para cada variável e subtraiu-se cada valor experimental do respectivo valor
médio, o que está representado no gráfico de pré-processamento na figura
36.
Figura 36: Gráfico de pré-processamento centrado na média
Pela Análise dos Componentes Principais observou-se que 93,9% da
variância total dos dados foram explicados nas duas primeiras componentes
principais, tabela 10. A PC1 contém 89,2% e a PC2 contém 4,63% da
variância dos dados originais. As demais PC’s (de 3 a 10) não foram
consideradas para a interpretação de tendências dos dados. A figura 37,
mostra um gráfico da variância explicada em cada PC. Nesta figura pode-se
observar que, a partir da PC2, não há uma variação muito grande da
variância explicada, ou seja, ao se aplicar a PCA, foi possível reduzir a
dimensão dos dados de 2188 para 2 (2PC’s).
Gomes, S. V. F.
2009
108
De acordo com Ferreira et al. [8], a primeira Componente Principal
PC1, tem uma direção tal que descreve o máximo de variabilidade das
amostras, mais que qualquer uma das variáveis originais, como apresentado
na tabela 10 e na figura 37.
Tabela 10: Variância percentual das Componentes Principais
calculadas para os dados da matriz original centrados na média
Componente Principal
% de Variância
% de Variância Acumulada
PC1
89,2
89,2
PC2
4,63
93,9
PC3
2,04
95,9
PC4
1,15
97,1
PC5
0,91
97,9
PC6
0,53
98,5
PC7
0,45
98,9
PC8
0,34
99,3
PC9
0,24
99,5
PC10
0,16
99,7
Figura 37: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s)
Gomes, S. V. F.
2009
109
Na figura 38 é apresentado o gráfico de escores de PC1 versus PC2.
O gráfico de escores traz informações sobre as amostras. Nesta figura é
possível notar que a PC1 separa as amostras 107 e 201 em valores de
escores positivos, da amostra 108 em valores de escores negativos e as
demais amostras apresentam valores próximos de zero. A PC2 por sua vez
consegue separar as amostras 201 e 202 em valores de escores negativos
das amostras 106, 110 e 107 em valores de escores positivos e as amostras
108 e 109 em valores próximos de zero. Percebe-se que a amostra 109
apresenta valor próximo de zero tanto no eixo da PC1 como PC2.
Figura 38: Gráfico de escores (PC1 versus PC2)
É possível observar a nítida separação das amostras e formação de
grupos coesos para os subtipos 107, 108, 109 e 202; as amostras 106 e 110
não apresentaram distinção entre si, porém se diferenciam das demais
amostras. Essa diferenciação entre as amostras pode ser explicada
observando o gráfico de loading (Figura 39) que demonstra a importância
(peso) que cada variável teve na construção de cada componente principal
e, conseqüentemente, na projeção das amostras pelos escores.
Gomes, S. V. F.
2009
110
Figura 39: Gráfico de loading das folhas de Lippia gracilis
No gráfico de loading (Figura 39) a PC1 está representada pela cor
vermelha e a PC2 pela cor verde. É possível perceber, no gráfico acima, na
PC1 e PC2 algumas bandas cromatográficas que se destacam com valores
de loading positivo e outras com valores de loading negativos. Somente a
PC2 apresenta valores de loadings positivos e negativos, a outra PC só tem
valores positivos.
Os loadings da PC1 apresentam as bandas cromatográficas que
contém maior peso/influência na projeção das amostras, e só contém
variáveis com valores positivos. Sendo assim, as amostras que apresentam
as bandas cromatográficas mais intensas nas regiões com valores positivos
de loadings apresentarão valores positivos nos escores da PC1, como
ocorre com as amostras 107 e 201. Essas bandas cromatográficas
correspondem aos tempos de retenção 15,3; 19,8; 32,3; 33,0; 34,7 e 36,4
minutos (Figura 40).
Gomes, S. V. F.
2009
111
Figura 40: Cromatogramas fingerprint sobrepostos das folhas dos sete genótipos
(106-110, 201 e 202) de Lippia gracillis.
A amostra 108 é muito distinta das demais, pois apresenta valores de
escores negativos e nenhuma banda cromatográfica intensa apresentada no
gráfico de loadings.
Os loadings da PC2 contêm variáveis com valores positivos e
negativos. Sendo assim, as amostras que apresentam as bandas
cromatográficas mais intensas nas regiões com valores negativos de
loadings apresentarão valores negativos nos escores da PC2, como ocorre
com as amostras 201 e 202, que correspondem aos tempos de retenção
30,4; 32,3; 33,0; 36,4; 47,7; 50,5; 55,4; 57,1 e 59,9 minutos. Já as amostras
que apresentam bandas cromatográficas mais intensas nas regiões de
loadings positivos, apresentarão valores positivos nos escores da PC2,
como ocorre com as amostras 106, 107 e 110. Essas bandas
cromatográficas correspondem aos tempos de retenção 15,3; 19,8 e 33,0
minutos, conforme apresentado na figura 40.
As amostras 108 e 109 apresentam variáveis com pesos próximos a
zero, isto significa que estas amostras não apresentam bandas
cromatográficos intensas no gráfico de loadings.
Gomes, S. V. F.
2009
112
Como os valores da PC2 no gráfico de escores são negativos para as
amostras 201 e 202, procedentes do Rio Real (Bahia), e positivos ou
próximos de zero para as amostras 106-110, procedentes de Tomar do Geru
(Sergipe), foi possível através da análise quimiométrica diferenciar os
genótipos pelas suas procedências.
Desta forma, através da análise quimiométrica foi possível diferenciar
os cromatogramas fingerprint dos extratos das folhas dos sete genótipos de
Lippia gracilis e, principalmente, observar a dissimilaridade das amostras
procedentes de Tomar do Geru (106-110) das amostras procedentes do Rio
Real (201 e 202).
5.4.2 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint dos
caules
Os cromatogramas foram convertidos em uma matriz de 35 linhas
(amostras) e 2188 colunas (variáveis: tempos de retenção). Os
cromatogramas foram alinhados utilizando o algoritmo ‘’Correlation
Optimised Warping’’ antes da análise quimiométrica [156]. A figura 41
mostra uma parte do cromatograma antes e após o alinhamento.
Figura 41: Parte do cromatograma dos caules: a) antes do alinhamento, b) após o
alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW)
Gomes, S. V. F.
2009
113
Em seguida, os valores foram submetidos a um pré-processamento.
Como apresentado na figura 42, os dados originais foram centrados na
média.
Figura 42: Gráfico de pré-processamento centrado na média
Pela Análise dos Componentes Principais (PCA), tabela 11,
observou-se que 96,2% da variância dos dados foram explicados nas três
primeiras componentes principais. A PC1 contém cerca de 77,2% da
variância dos dados originais e as PC’s 2 e 3 explicam 12,2% e 6,89%,
respectivamente. A figura 43 mostra um gráfico da variância explicada em
cada PC. Nesta figura pode-se observar que, a partir da PC3, não há uma
quantidade significativa de variância explicada.
Gomes, S. V. F.
2009
114
Tabela 11: Variância percentual das Componentes Principais
calculadas para os dados da matriz original centrados na média.
Componente Principal
% de Variância
% de Variância Acumulada
PC1
77,2
77,2
PC2
12,2
89,4
PC3
6,89
96,2
PC4
1,96
98,2
PC5
0,68
98,9
PC6
0,35
99,2
PC7
0,29
99,5
PC8
0,15
99,7
PC9
0,12
99,8
Figura 43: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s)
Na figura 44 é apresentado o gráfico de escores de PC1 versus PC3.
Nesta figura é possível visualizar a separação das sete amostras, sendo que
PC1 separa as amostras 201 e 202 em valores de escores negativos das
amostras 106-108 em valores de escores positivos e as amostras 109 e 110
com valores próximos de zero. A PC3, por sua vez, consegue separar as
Gomes, S. V. F.
2009
115
amostras 108, 109 e 110 em valores de escores negativos das amostras
106, 107, 201 e 202 em valores de escores positivos. A projeção das
amostras pode ser explicada analisando o gráfico de loading.
Figura 44: Gráfico de escores (PC1 versus PC3)
O gráfico de loading mostra a importância de cada banda
cromatográfica na projeção e diferenciação das amostras. No gráfico da
figura 45, a PC1 está representada pela cor azul e a PC3 pela cor vermelha.
A análise do gráfico demonstra que na PC1 algumas bandas
cromatográficas se destacam com valores de loading positivos e outras com
valores de loading negativos. A PC3 só apresenta valores de loading
positivos.
Gomes, S. V. F.
2009
116
Figura 45: Gráfico de loading dos caules de Lippia gracilis
Os loadings da PC1 representam as bandas cromatográficas que
contém maior peso/influência na projeção das amostras, e contém variáveis
com valores positivos e negativos. Sendo assim, as amostras que
apresentam as bandas cromatográficas mais intensas nas regiões com
valores negativos de loadings apresentarão valores negativos nos escores
da PC1, como ocorre com as amostras 201 e 202, que corresponde ao
tempo de retenção 34,74 minutos. Já as amostras que apresentam bandas
cromatográficas mais intensas nas regiões de loadings positivos,
apresentarão valores positivos nos escores da PC1, como ocorre com as
amostras 106, 107, 108. Essas bandas cromatográficas correspondem aos
tempos de retenção 21,2; 25,4; 27,7; 36,6 e 62,8 minutos, conforme
apresentado na figura 46.
Os loadings da PC3 contêm variáveis com valores positivos. Sendo
assim, as amostras que apresentam as bandas cromatográficas mais
intensas nas regiões com valores positivos de loadings apresentarão valores
positivos nos escores da PC3, como ocorre com as amostras 106, 107 e
Gomes, S. V. F.
2009
117
201. Essas bandas cromatográficas correspondem aos tempos de retenção
31,6; 36,6; 50,9; 53,9 minutos (Figura 46).
As amostras 108 e 109 apresentam valores de escores negativos e
nenhuma banda cromatográfica intensa apresentada no gráfico de loadings.
Figura 46: Cromatogramas fingerprint sobrepostos dos caules dos sete genótipos
(106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis.
Como os valores da PC1 no gráfico de escores são negativos para as
amostras 201 e 202, procedentes do Rio Real (Bahia), e positivos ou
próximos de zero para as amostras 106-110, procedentes de Tomar do Geru
(Sergipe), foi possível através da análise quimiométrica diferenciar os
genótipos pelas suas procedências.
Desta forma, através da análise quimiométrica foi possível diferenciar
os cromatogramas fingerprint dos extratos dos caules dos sete genótipos de
Lippia gracilis e, assim como nos resultados da análise quimiométrica das
folhas, observar a dissimilaridades entre as amostras procedentes de Tomar
do Geru (106-110) das amostras procedentes do Rio Real (201 e 202).
Gomes, S. V. F.
2009
118
Além disso, estas análises quimiométricas mostraram que os
cromatogramas fingerprint dos caules, quando comparado com as folhas,
apresentaram uma melhor diferenciação entre os genótipos das
procedências, visto que no gráfico de escores (Figura 44) esta diferenciação
se dá pela PC1, a qual apresenta 77,2% da variância dos dados originais.
5.5 – ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
Para a análise da possível atividade antinociceptiva do extrato
metanólico das folhas de Lippia gracilis (EMLG) realizou-se o teste das
contorções abdominais induzidas por ácido acético a 85%. Este protocolo é
o teste mais utilizado na triagem de substâncias com atividade
antinociceptiva [160].
Neste método, o ácido acético atua indiretamente no fluido do
peritônio, provocando a liberação de mediadores como, por exemplo, PGE
2
e PGF
2
, que sensibilizam e estimulam as terminações neuronais da região.
Drogas analgésicas, geralmente, reduzem ou até mesmo inibem este
comportamento, assim como antiinflamatórios não esteróides e anti-
histamínicos, o que demonstra a baixa especificidade deste teste [152]. O
tratamento dos animais com EMLG reduziu, de maneira dose dependente, a
resposta nociceptiva quando comparado com o controle, como mostrado na
figura 47.
Gomes, S. V. F.
2009
119
Figura 47: Efeito do EMLG sobre as contorções abdominais induzidas por ácido
acético. Cada valor representa a média ± D.P.M. Os asteriscos denotam a significância
estatística, * p < 0,05 e ** p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.
A fim de verificar qual a via de inibição da nocicepção do EMLG, foi
realizado o teste da formalina, que consiste na estimulação de nociceptores
pela formalina.
Esse protocolo é um modelo de dor persistente que se caracteriza por
apresentar um comportamento bifásico indicativo de dor, sendo que nos
primeiros 5 minutos após a administração, é observada a primeira fase
(Fase 1) pela estimulação direta dos nociceptores; a inibição desta fase é
um indicativo de drogas analgésicas que atuam em nível central.
Após um intervalo de 10 minutos, ocorre a segunda fase (Fase 2) que
dura 20 minutos, caracterizada tanto pelo estímulo dos nociceptores como
pela liberação de mediadores inflamatórios, que encontram a medula
espinhal num estado de hiperexitabilidade, induzida pela fase 1 [153].
O tratamento com o EMLG inibiu a nocicepção mediada por
mecanismos centrais (Fase1), de forma significativa, apenas na dose de
400mg/Kg (p < 0,05), sugerindo uma possível atividade antinociceptiva pela
via central (Figura 48). Na Fase 2, houve uma inibição, de maneira dose
dependente, da resposta nociceptiva (p < 0,001), em todas as doses,
Gomes, S. V. F.
2009
120
demonstrando que este extrato é capaz de inibir a produção de mediadores
inflamatórios, principalmente aqueles derivados da metabolização do ácido
araquidônico (Figura 49) [153, 161].
Figura 48: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 1ª
fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a
significância estatística, * p < 0,05 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.
Figura 49: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 2ª
fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a
significância estatística, * p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.
Gomes, S. V. F.
2009
121
A análise dos constituintes químicos do extrato metanólico das folhas
de Lippia gracilis revelou a presença de um flavonóide, a naringenina. Um
estudo realizado por Fang et al. [162], demonstrou que a naringenina
apresenta atividade antiinflamatória, antioxidante e possui a capacidade de
inibir a proliferação de células cancerosas. Com isso, é possível afirmar que
a presença desse composto no extrato pode estar auxiliando na resposta
antiinflamatória conseguida neste trabalho. Além disso, existe a
possibilidade de outros flavonóides estarem presentes no extrato
contribuindo com essa atividade.
Desta forma, pode-se sugerir que o tratamento com EMLG, nas doses
testadas, apresenta atividade antinociceptiva provavelmente mediada pela
inibição de fatores pró-inflamatórios (via das ciclooxigenase). A presença de
flavonóides presentes no extrato, como a naringenina, pode estar
contribuindo com esse efeito. Outros estudos são requeridos para melhor
compreensão dos mecanismos celulares envolvidos nessa resposta.
122
Capítulo
Gomes, S. V. F.
2009
123
6. CONCLUSÕES
Através das análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
acoplada ao detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) foi possível obter,
pela primeira vez, os cromatogramas fingerprint dos extratos metanólicos
das folhas e caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia
gracilis Schauer.
As análises quimiométricas de PCA foram essenciais para a
diferenciação dos cromatogramas fingerprint das folhas e caules dos sete
genótipos estudados, pois permitiram a separação das amostras conforme
as características apresentadas nos cromatogramas (dados químicos), o que
não seria possível apenas pela análise visual dos cromatogramas, bem
como permitiu a diferenciação dos genótipos das procedências de Tomar de
Geru (106-110) dos genótipos do Rio Real (201 e 202).
Além disso, as análises quimiométricas mostraram que os
cromatogramas fingerprint dos caules apresentaram uma melhor
diferenciação entre os genótipos das procedências.
Como o método analítico desenvolvido por CLAE-DAD mostrou
dissimilaridades entre os cromatogramas fingerprint das folhas e caules dos
sete genótipos, ele pode ser utilizado para o controle de qualidade desta
espécie.
A cromatografia líquida semipreparativa foi útil para o isolamento do
primeiro constituinte fixo das folhas de Lippia gracilis, a 5,7,4’-
triidroxiflavanona conhecida como naringenina, isolada da fração 85%
MeOH:H
2
O.
Gomes, S. V. F.
2009
124
O extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis
apresentou atividade antinociceptiva através dos testes de contorções
abdominais induzidas por ácido acético e formalina, inédito para esta
espécie.
125
Capítulo
Gomes, S. V. F.
2009
126
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