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Universidade Federal de Sergipe
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Química
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÂO DE RESÍDUOS
DE PESTICIDAS EM PLANTA MEDICINAL Cordia salicifolia UTILIZANDO AS
TÉCNICAS DE MSPD, GC/MS e HPLC-UV
PEDRO HENRIQUE VIANA DE CARVALHO
SÃO CRISTÓVÃO/SE
2009
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2
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÂO DE RESÍDUOS
DE PESTICIDAS EM PLANTA MEDICINAL Cordia salicifolia UTILIZANDO AS
TÉCNICAS DE MSPD, GC/MS e HPLC-UV.
PEDRO HENRIQUE VIANA DE CARVALHO
ORIENTADOR: Prof. Dr. Sandro Navickiene
SÃO CRISTÓVÃO/SE
2009
Dissertação apresentada ao
Núcleo de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal
de Sergipe como requisito para a
obtenção do título de Mestre em
Química.
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
C331d
Carvalho, Pedro Henrique Viana de
Desenvolvimento de método para determinação de resíduos
de pesticidas em planta medicinal Cordia salicifolia utilizando as
técnicas de MSPD, GC/MS e HPLC-UV / Pedro Henrique Viana
de Carvalho. – São Cristóvão, 2009.
118 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de
Sergipe, 2009.
Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene
1. Química analítica – métodos físico-quimicos. 2. Pesticidas. 3.
Plantas medicinais. I. Título.
CDU 543.5:632.95:633.88
4
Este trabalho é dedicado especialmente à minha mãe Lea Maria Viana de
Carvalho e meu pai Hélio Wilson Lemos de Carvalho por todo carinho, atenção,
inspiração profissional e de vida, à minha inesquecível infância, à grande educação
e incentivo que me foi concedido; e a vocês declamo meu enorme carinho aqueles
que considero os melhores pais do mundo sem dúvida alguma.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pelo dom da vida e pela oportunidade de seguir em frente.
Ao apoio de meus pais por todo incentivo, educação e aprendizado, inspiração
profissional e de vida, atenção, dedicação dado durante todos esses anos pois sem
eles eu não teria chegado aonde eu cheguei.
Ao meu avô e minha avó Henrique e Helena (in memorian) e avô e avó Pedro e
Avelina.
Aos meus tios e tias em especial a minha madrinha Iliege Maria Viana.
Aos meus tios Álvaro, Chiquinho e tia Santinha (in memorian).
A minha família, meus irmãos Thiago e Thiana pelo companheirismo e amizade ao
longo destes anos.
A meus primos em especial Paulinho, Marcelinho e Marquinhos, a todos amigos de
Barreiras e Aracaju.
Um agradecimento especial a um grande primo, irmão que tive durante todos esses
anos, a grande e eterna amizade, parceria, momentos compartilhados de dificuldades
e alegrias daquele que considero meu melhor amigo Mateus Viana de Souza (in
memorian).
Um agradecimento especial a meu orientador Prof. Sandro Navickiene pela oportunidade
concebida de ser seu aluno de mestrado, pela atenção, pela competência na busca dos
caminhos para a solução de dúvidas e resolução de problemas.
Ao prof. Haroldo Silveira Dórea por sua grata ajuda ao longo da graduação e do
mestrado.
6
Ao professor Carlos Alexandre por sua amizade e orientação no Programa de
Iniciação Científica no LQA.
Aos meus antigos colegas de graduação e mestrado em Química: Moacir, Kennedy,
Marcelo Zohio, Elias, Luís Oliveira, Taís, Danielle Barros, Ana Clécia, Charlene e
Adilson.
Aos amigos Ismael, dona Eliza e dona Ednalva.
Aos colegas do LCP Ricardo, Adriano Aquino, Elissandro, Débora, Márcia, Tamires
Cruz, Tamires Gleice, Marcell, Michel, Alain Gaujac, Daniela, Maria Geovânia,
Adalberto, Anselmo, Clóvis, Thaíse, Mirella, Vanessa e Iara pelo clima de harmonia e
alegria no laboratório.
Aos professores do Departamento de Química: Nivan, Paulo César, José do
Patrocínio, Péricles, Valéria, Luciane, Maria Eliane, Maria de Lara e Ana Paula.
Agradecimento a CAPES pela bolsa de mestrado concedida.
Ao CNPq pelo financiamento do projeto intitulado por: “Cooperação acadêmica UFS-
UFSCar para o fortalecimento do Programa de Pós-Graduação em Química aplicada
ao estudo de recursos naturais renováveis do Estado de Sergipe”, Processo nº
620212/2006-3, coordenado por Péricles Barreto Alves, o qual foi selecionado no
Edital MCT/CT-INFRA/CT-ENERG/CNPq nº 07/2006.
7
CURRICULLUM VITAE
1. Formação Acadêmica:
• Mestrado em Química pela Universidade Federal de Sergipe.
Desenvolvimento de Método para Determinação de Resíduos de
Pesticidas em Planta Medicinal Cordia salicifolia utilizando as
Técnicas de MSPD, GC/MS e HPLC-UV, 2009, sob orientação do
professor Dr. Sandro Navickiene.
• Graduação em Química Licenciatura pela Universidade Federal de
Sergipe, São Cristóvão/SE, 2005.
2. Artigos Aceitos para Publicação:
CARVALHO, P. H. V.; PRATA, V. M.; ALVES, P. B.; NAVICKIENE, S.
Determination of Six Pesticides in Medicinal Herb ("Cordia
salicifolia") by Matrix Solid-Phase Dispersion and Gas Chromatography-
Mass Spectrometry. Aceito para publicação em The Journal of AOAC
International. 2009.
RODRIGUES, M. O.; BRITO, A. M.; JÚNIOR, S. A. ;SIMONE, C. A. ;ARAÚJO,
A. A. S. ; CARVALHO, P. H. V. ; SANTOS, S. C. G. ; ARAGÃO, K. A. S. ;
MESQUITA, M. E. ; FREIRE, R. O
.
Estudos Espectroscópicos e Estruturais
dos Polímeros de Coordenação 2D, ∞[TB(DPA)(HDPA)] E
∞[GD(DPA)(HDPA)]. Aceito para publicação em Química Nova, 2008.
8
3. Artigo Submetido:
CARVALHO, P. H. V.; BARRETO, A. B.; RODRIGUES, M. O.; PRATA, V.
M.; ALVES, P. B.; MESQUITA, M. A.; JÚNIOR, S. A.; NAVICKIENE, S.
Coordination Polymer [(GD)(DPA)(HDPA)], as a New Selective Material
for The Matrix Solid-Phase Extraction of Pesticides Residues from
Medicinal Plant. Submetido em Journal of Chromatography A, 2008.
4. Resumos Apresentados em Congressos Internacionais: 3
5. Resumos Apresentados em Congressos Nacionais: 12
6. Experiência Profissional:
a. Escola Monteiro Lobato, Barreiras – Bahia.
Função: Professor da Sétima e Oitava Série do Ensino
Fundamental da Disciplina Ciências e dos 1º, 2º e 3º graus do
Ensino Médio das disciplinas Química e Física. (02/2006 a
08/2006).
• Estágio Docência da CAPES realizado pelo Núcleo de Pós-
Graduação em Química da Universidade Federal de Sergipe
(NPGQ/UFS).
Disciplina: Métodos Cromatográficos e Espectrometria de
Massas. (04/2008 a 08/2008).
9
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO.....................................................................................................20
2. OBJETIVOS........................................................................................................24
2.1. Objetivo Geral...............................................................................................24
2.2. Objetivos Específicos....................................................................................24
3. JUSTIFICATIVA..................................................................................................25
4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..........................................................................27
4.1. Pesticidas......................................................................................................27
4.1.1. Classes químicas dos Pesticidas Estudados............................................32
4.2. Plantas Medicinais........................................................................................36
4.3. Dispersão da Matriz em Fase Sólida............................................................39
4.4. Cromatografia Gasososa e Espectrometria de Massas..............................44
4.5. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência....................................................46
5. REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................49
6. EXPERIMENTAL................................................................................................53
6.1. Materiais e métodos......................................................................................53
6.2. Solventes e adsorventes...............................................................................53
6.3. Padrões de pesticidas...................................................................................53
6.4. Equipamentos...............................................................................................54
6.5.Preparação de amostra de planta medicinal................................................54
6.6. Condições Cromatográficas para o GC/MS.................................................54
6.6.1.Condições Cromatográficas para o HPLC-UV...........................................55
6.7.. Preparação das Soluções Padrão de Pesticidas.......................................56
6.8. Otimização das Condições Cromatográficas por GC/MS...........................56
6.8.1. Otimização das Condições Cromatográficas por HPLC-UV....................57
6.9. Procedimento de Limpeza das Vidrarias.....................................................58
6.9.1 Curva analítica...........................................................................................58
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................59
7.1. Método de extração por MSPD.......................................................................59
8. Resultados de Valores de Recuperação em Análises por GC/MS....................61
10
8.1. Ensaios para Seleção do Suporte Sólido.....................................................61
8.2. Ensaios para Seleção de Co-coluna............................................................64
8.3. Ensaios para Seleção de Solventes de Eluição dos Pesticidas.................69
8.4. Ensaios para Seleção do Volume de Solventes...........................................71
8.5. Ensaios para Seleção da Proporção de Solventes .....................................72
8.6. Ensaios para Seleção da Proporção Matriz/Suporte Sólido........................73
8.7. Efeito Matriz .................................................................................................76
8.8. Resultados de Valores de Recuperação em Análises por HPLC-UV..........78
8.9. Validação do Método....................................................................................80
8.9.1. Estudos de Recuperação do Método........................................................86
8.9.2. Linearidade................................................................................................88
8.9.3. Limites de Detecção e Limites de Quantificação para Análises por GC/MS
e HPLC-UV.........................................................................................................90
8.9.4. Limites de Detecção..................................................................................90
8.9.5. Limites de Quantificação ..........................................................................91
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................92
10. REFERÊNCIAS..........................................................................................93
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquematização da dispersão da matriz em fase sólida.
Figura 2. Esquema de coluna MSPD para extração de pesticidas na planta
medicinal Cordia salicifolia.
Figura 3. Ensaios de recuperação para seleção do suporte sólido e concentração
da solução padrão de fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 4. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente, utilizando
ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de
fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 5. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente utilizando
ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de
fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 6. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente, utilizando
ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de
fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 7. Ensaios de recuperação para seleção de co-sorvente, utilizando
ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução padrão de
fortificação dos pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 8. Cromatograma obtido por GC/MS, (no modo SCAN), de extrato de
Cordia salicifolia com solvente ciclohexano.
Figura 9. Cromatograma obtido por GC/MS, (no modo SCAN), de extrato de
Cordia salicifolia com solvente acetato de etila.
12
Figura 10. Ensaios de recuperação para seleção da mistura dos solventes de
eluição, utilizando C
18
como co-sorvente e alumina como suporte sólido, com
concentração de solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 11. Ensaios de recuperação para seleção do volume de mistura de
solventes ciclohexano/diclorometano, utilizando C
18
como co-sorvente e alumina
como suporte sólido, com concentração de solução padrão de fortificação de
pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 12. Ensaios de recuperação para seleção da proporção da mistura de
solventes ciclohexano/diclorometano no volume de 30 mL, utilizando C
18
como
co-sorvente e alumina como suporte sólido, com concentração de solução
padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 13. Ensaios de recuperação para seleção da proporção planta
medicinal/suporte sólido utilizando mistura de solventes
ciclohexano/diclorometano (1:3, v,v) no volume de 30 mL, com concentração de
solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
Figura 14. Ensaios de recuperação por MSPD com sistema alumina/planta
medicinal (1:1 m/m) e co-sorvente C
18
, com volume de 30 mL de mistura de
solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) e análise por HPLC-UV com
concentrações da solução padrão de fortificação dos pesticidas de 0,3; 0,5 e 1,0
µg/g.
Figura 16. Cromatograma obtido por GC/MS, da solução padrão dos pesticidas
acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona na
concentração de 0,5 µg/g em solvente diclorometano.
13
Figura 17. Cromatograma obtido por GC/MS no modo SIM do extrato de Cordia
salicifolia fortificado com solução padrão dos pesticidas acefato, clorprofam,
pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona na concentração de 0,5 µg/g,
utilizando C
18
como co-sorvente e alumina como suporte sólido e mistura e
solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) no volume de 30 mL.
Figura 18. Cromatograma obtido por HPLC-UV, da solução padrão dos
pesticidas pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina na concentração de 0,5
µg/g em solvente acetonitrila.
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação dos pesticidas de acordo com os efeitos à saúde humana
segundo dados da ANVISA.
Tabela 2. Características gerais dos pesticidas selecionados para estudo.
Tabela 3. Propriedades físico-quimicas dos pesticidas selecionados para estudo
Tabela 4. Solubilidade dos Pesticidas em Solventes Orgânicos
Tabela 5. Estruturas químicas dos pesticidas selecionados para estudo.
Tabela 6. Série eluotrópica utilizada na seleção da fase móvel em MSPD.
Tabela 7. Comprimentos de onda mínimo dos solventes mais utilizados em
HPLC.
Tabela 8. Tempos de retenção e fragmentos monitorados na quantificação dos
pesticidas.
Tabela 9. Programação de eluição no modo gradiente para análises em HPLC-
UV.
Tabela 10. Tempos de retenção dos pesticidas analisados por HPLC-UV.
Tabela 11. Valores de recuperação média e coeficientes de variação em extrato
de Cordia salicifolia por MSPD e GC/MS.
Tabela 12. Valores de recuperação média e coeficientes de variação em extrato
de Cordia salicifolia por MSPD e HPLC-UV.
15
Tabela 13. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os
pesticidas preparados em extrato de Cordia salicifolia e analisados por GC/MS.
Tabela 14. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os
pesticidas preparados em extrato de Cordia salicifolia e analisados por HPLC-
UV.
Tabela 15. Valores dos limites de detecção (LOD) em análises por GC/MS e
HPLC-UV.
Tabela 16. Valores dos limites de quantificação (LOQ) dos pesticidas em
análises por GC/MS e HPLC-UV.
16
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASE – Extração Acelerada com Solventes (do inglês Accelerated Solvent
Extraction)
BHC - Hexaclorociclohexano
CV – Coeficiente de Variação
DAD – Detector de Arranjo de Fotodiodos (do inglês Diode Array Detector)
DCM - Diclorometano
DDD - Diclorodifenildicloroetano
DDE - Diclorodifenildicloroetileno
DDT – Diclorodifeniltricloroetano
DL – Dose Letal
DL
50
– Dose Letal para 50% da População
EBDC - Etileno-Bis-Ditiocarbamato
ECD – Detector de Captura de Elétrons (do inglês Electron Capture Detection)
EI – Modo de ionização por impacto de elétrons (do inglês Electron Impact)
EU – União Européia (do inglês European Union)
EUA – Estados Unidos da América
FAO – Organização das Nações Unidas de Agricultura e Alimentos (do inglês
Food and Agriculture Organization of the United Nations)
FID – Detector por Ionização em Chama (do inglês Flame Ionization Detection)
GC – Cromatografia Gasosa (do inglês Gas Chromatography)
HCB – Hexaclorobenzeno
HCH – Hexaclorociclohexano
HDL – Lipoproteína de Alta Densidade (do inglês High Density Lipoprotein)
HPA – Hidrocarboneto Policíclico Aromático
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (do inglês High Performance
Liquid Chromatography)
HS – do inglês Headspace
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
IC – Intervalo de Confiança
ICH – Protocolo Harmonizado Internacional
17
IDA – Índice Diário Aceitável.
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Industrial
IT – Aprisionamento de Íons (do inglês Ion-Trap)
LC – Cromatografia Líquida (do inglês Liquid Chromatography)
LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade (do inglês Low Density Lipoprotein)
LLE – Extração Líquido-Líquido (do inglês Liquid – Liquid Extraction)
LMR – Limite Máximo de Resíduos
LOD – Limite de Detecção
LOQ – Limite de Quantificação
MAE – Extração Assistida por Microondas (do inglês Microwave Extraction)
MS – Espectrometria de Massas (do inglês Mass Spectrometry)
MS-MS – Espectrometria de massas (do inglês Tandem Mass Spectrometry)
MSPD – Dispersão da Matriz em Fase Sólida (do inglês Matrix Solid-Phase
Dispersion)
NCI – Ionização química no modo negativo (do inglês Negative Chemical
Ionization)
NPD – Detector de Nitrogênio e Fósforo (do inglês Nitrogen Phosphorus
Detector)
PA – Poliacrilato
PCI – Ionização química no modo positivo (do inglês Positive Chemical
ionization)
PDMS - Polidimetilsiloxano
PID - Detector de Fotoionização – (do inglês Phothometric Ionization Detector)
PLE – Extração com Líquido Pressurizado (do inglês Pressurized Liquid
Extraction)
r – Coeficiente de Correlação
RP – Fase Reversa (do inglês Reversed Phase)
RSD – Desvio Padrão Relativo
s – Estimativa do Desvio Padrão Absoluto
SBSE – Extração com Barras de Agitação (do inglês Stir Bar Sorptive
Extraction)
SFC – Cromatografia por Fluido Supercrítico (do inglês Supercritical Fluid
Chromatography)
18
SFE – Extração por Fluido Supercrítico (do inglês Supercritical Fluid Extraction)
SIM – Monitoramento de Íons Selecionados (do inglês Selected Íon Monitoring)
SPE – Extração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Extraction)
SPME – Microextração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Microextraction)
THF – Tetrahidrofurano
TOF – Tempo de Vôo (do inglês Time-Of-Fly)
USA – do inglês United States of America
USEPA – Agência Americana de Proteção Ambiental (do inglês United States
Environmental Agency)
UV – Ultravioleta
19
RESUMO
A fitoterapia constitui em um tipo de método terapêutico. As plantas medicinais são as principais
fontes de suporte para este tipo de atividade e estão sujeitas à ação de pragas como insetos e
doenças que podem comprometer ou inviabilizar seu desenvolvimento ocasionando perdas
econômicas. Pesticidas de diferentes grupos químicos são aplicados para controlar ação destas
pragas. Todavia, este tratamento pode ocasionar a contaminação por resíduos de pesticidas. Em
vista disto, este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de método baseado na extração por
dispersão da matriz em fase sólida e pelas técnicas de cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massas e cromatografia liquida de alta eficiência com detector UV-Vis com arranjo
de fotodiodos para determinar resíduos dos pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina,
tetradifona e fosalona em planta medicinal Cordia salicifolia. O método por dispersão da matriz em
fase sólida foi desenvolvido, testando-se diferentes tipos e quantidades de sorventes, alumina,
Florisil, sílica e C
18,
e solventes orgânicos (20 a 40 mL) como ciclohexano, diclorometano, acetato de
etila, clorofórmio e n-hexano em diferentes proporções (1:1, 1:2 e 1:3, v/v). As melhores
recuperações para os pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona em
análises por GC/MS, foram obtidas com o sistema alumina/C
18
, utilizando um volume de 30mL de
mistura de solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) com valores médios de recuperação
variando de 62 a 129% e coeficientes de variação na faixa de 5,24 a 16,4% para os níveis de
concentração de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g. Foram realizadas também análises pela técnica de HPLC-UV,
utilizando-se a mesma fase sólida para extração por MSPD, alumina/C
18
, e sistema de solventes
ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), com valores de recuperação na faixa de 55 a 112% e
coeficientes de variação entre 0,6 a 15,1% para os pesticidas pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e
bifentrina para os níveis de concentração de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g. Os limites de detecção e
quantificação para análises no GC/MS ficaram na faixa de 0,02 a 0,07 mg/kg e 0,03 a 0,1 mg/kg
respectivamente e os limites de detecção e quantificação em análises por HPLC-UV ficaram na faixa
de 0,03 a 0,08 mg/kg e 0,03 a 0,4 mg/kg, respectivamente.
Palavras-chave: pesticidas; MSPD; GC/MS; HPLC-UV; Cordia salicifolia, planta medicinal.
20
ABSTRACT
The phytotherapy is usually regarded as a type of alternative medicine. The medicinal herbs
comprises the herbal material used as main source of this approach, which can be susceptible to the
action of pests and diseases.. Pesticides are widely used in agricultural crops because of their
susceptibility to disease attacks. Therefore, it has been a growing interest in the detection and
quantification of pesticide residues in agricultural produce intended of human consumption. A simple
and effective extraction method based on matrix solid-phase dispersion (MSPD) was developed to
determine acephate, chlorpropham, pyrimicarb, bifenthrin, tetradifon, and phosalone in leaves of the
medicinal plant Cordia salicifolia using gas chromatography-mass spectrometry with selected ion
monitoring (GC/MS, SIM) and high performance liquid chromatography with diode array detector
(HPLC-UV). Different parameters of the method were evaluated, such as type of solid phase (C
18
,
alumina, silica-gel and Florisil), the amount of solid phase and eluent (dichloromethane, ethyl acetate,
chloroform, and cyclohexane). The best results were obtained using 0.5 g of herb sample, 0.5 g of
neutral alumina as dispersant sorbent, 1,0 g of C
18
as clean-up sorbent and
cyclohexane:dichloromethane (1:3, v/v) as eluting solvent. The method was validated using herb
samples fortified with pesticides at different concentration levels (0.3, 0.5 and 1.0 mg/kg). Average
recoveries (7 replicates) ranged from 62 to 129%, with relative standard deviations between 5,24 and
16,4%, respectively in analysis of GC/MS and recoveries (5 replicates) ranged 55 to 112%, with
relative standard deviations between 0.6 and 15.1% in analysis of HPLC-UV. Detection and
quantification limits for herb ranged from 0.02 to 0.07 mg/kg and from 0.03 to 0.1 mg/kg, respectively
in analysis with GC/MS and analysis with HPLC-UV detection and quantification limits for herb ranged
from 0.03 to 0.08 mg/kg and from 0.03 to 0.4 mg/kg, respectively.
Keywords: medicinal plant; porangaba; Cordia salicifolia; pesticides; MSPD; GC/MS; HPLC-UV.
21
1.
INTRODUÇÃO
Fitoterapia é a utilização de vegetais em preparações farmacêuticas (extratos,
pomadas, tinturas e cápsulas) para auxílio no tratamento de doenças, manutenção e
recuperação da saúde. O termo fitoterapia vem do idioma grego e quer dizer
"tratamento" (therapeia) "vegetal" (phyto). O uso de plantas medicinais na fitoterapia
vai desde as formas mais empíricas e tradicionais até as científicas. Dados literários
sobre a utilização de vegetais para a cura de doenças ou outros males são
encontrados desde 50.000 anos atrás. Intuitivamente o homem procurou descobrir
soluções para as suas necessidades básicas como nutrição, reprodução e proteção
(DEVIENNE, 2004).
Os egípcios (1.500 a.C) relataram a utilização de azeite, figo, cebola, alho,
funcho, açafrão, hortelã e pimenta como culturas utilizadas medicinalmente. O
“Papyrus Erbers”, coleção egípcia contendo 811 prescrições, menciona 700 drogas
vegetais, minerais e animais, incluindo salgueiro, acácia e sedativos extraídos de
Ephedra (TAVARES, 1996; TEIXEIRA, 1994). Em toda história, registra-se que os
medicamentos surgiram da simples observação. O conhecimento alquímico foi
utilizado por diversos povos e nações, especialmente pelos chineses, indianos e
árabes, sendo assimilados a partir do século XX pelo continente europeu (DI STASI,
1996). Num estágio mais avançado do uso das plantas medicinais, foram criadas
teorias e observações que contribuíram para a fitoterapia atual (TAVARES, 1996).
Na primeira metade do século XX, os produtos de origem vegetal foram
esquecidos, temporariamente, em decorrência do grande sucesso de compostos
químicos obtidos de microorganismos, os quais eram capazes de curar infecções
graves (VILLEGAS, 1998).
22
Alguns fatos proporcionaram o renascimento do interesse das plantas medicinais
como menor tempo e menor custo no desenvolvimento de novos medicamentos à
base destes produtos naturais (FERREIRA, 2001). As pesquisas científicas têm
como base a comprovação da identidade botânica, composição química de drogas
vegetais, obtenção, identificação e análise dos princípios ativos, bem como a
determinação da ação farmacológica e propriedade tóxicas. Vários são os princípios
ativos químicos obtidos exclusivamente de matéria-prima vegetal que representam
não apenas um novo grupo de substâncias, mas a descoberta de uma intervenção
terapêutica no mercado (FERREIRA, 2001).
Nas três últimas décadas, as pesquisas com plantas geraram diversos princípios
químicos, com atividades farmacológicas importantes como a vimblastina e
vincristina, ambas isoladas da vinca (Cantharanthus roseus), o lapachol e a beta-
lapachona, obtidos da Tabebuia heptaphylla, os derivados da camptotecina obtidos
de Camptotheca acuminata, entre outros (SANTOS 1999).
Atualmente as descobertas de várias substâncias de origem vegetal, indicadas
pelo uso popular, tiveram suas atividades farmacológicas cientificamente
consolidadas (MIGUEL, 1999), contudo é comprovado que apenas 30% dos
medicamentos comercializados são originados direta ou indiretamente de plantas
medicinais (DEVIENNE, 2004). A Organização Mundial da Saúde estima que
aproximadamente 80% da população mundial utiliza de algum modo plantas
medicinais como medicamentos. Das 365.000 espécies já catalogadas, 25.000 são
utilizadas em preparações da medicina tradicional. Estes valores indicam a
importância quanto ao estudo das plantas medicinais, de modo a revelar sua
eficácia, segurança e qualidade, e assegurar melhor aceitação destas pela classe
médica e, conseqüentemente, pela população em geral.
Os parâmetros de qualidade para fins farmacêuticos são, em princípio,
estabelecidos pelas Farmacopéias e Códigos Oficiais. Muito contrastante é a
biodiversidade da flora brasileira ao lado do atraso de nossa Farmacopéia no que se
refere às monografias de plantas medicinais. A primeira edição da Farmacopéia
Brasileira publicada em 1929 continha 257 monografias de plantas medicinais.
23
No período de 1980 a 1990 houve um grande aumento no consumo de plantas
medicinais, em virtude do modismo naturalista existente na época, e nos anos
seguintes até os dias atuais, formaram-se várias comissões técnicas pelo Ministério
da Saúde, com o objetivo de regulamentar o registro, a produção e a
comercialização de plantas medicinais, em um mercado de características amplas e
de baixa qualidade.
A identificação de novas fontes naturais de compostos químicos visando o
desenvolvimento de fitofármacos pode beneficiar a economia de países em
desenvolvimento, além de possibilitar a autonomia no gerenciamento de suas
políticas de saúde. Neste contexto, produtos naturais obtidos de plantas
demonstram ter um valor incalculável para a sociedade contribuindo
significativamente para a economia e para a melhoria na qualidade de vida da
população (YUNES, 2001).
As plantas medicinais assim como outras plantas nativas estão sujeitas ao
ataques de pragas como insetos, ácaros e fungos, o que inviabiliza a
comercialização destes produtos, ocasionando em perdas econômicas, sendo
necessário efetuar processos mitigadores como a utilização de pesticidas para
controlar a ação das pragas (GRISOLIA, 2005).
Pesticidas de diferentes grupos químicos e classes toxicológicas são utilizados
para controlar o ataque das pragas às culturas, todavia o tratamento com pesticidas,
deixa resíduos no ambiente ou no próprio produto quando utilizado de maneira
excessiva, desrespeitando os limites máximos de resíduos estabelecidos pelas
legislações, comprometendo a saúde dos consumidores. Vários países têm
restringindo a utilização destas substâncias tóxicas e estabelecido diretrizes legais
para calcular suas concentrações através da implementação do limite máximo de
resíduos para cada tipo de cultura. No Brasil estes níveis são estabelecidos pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2008).
Além da eventual presença de pesticidas, a literatura relata que produtos
fitoterápicos utilizados como base da medicina airvédica, baseada em um sistema
tradicional da Índia, comercializados pela internet, contém níveis elevados de metais
como chumbo, mercúrio e arsênio, e que segundo dados de pesquisas já feitas nos
Estados Unidos, os níveis destes metais excedem os padrões legais aceitáveis e
podem provocar intoxicações (RAI, 2008).
24
Isto posto faz-se necessário dispor de métodos analíticos para garantir a
qualidade das plantas medicinais e de fitoterápicos comercializados, bem como
estabelecer limites máximos permitidos e intervalos de ingestão diária, visto a
crescente demanda da população não só do Brasil como também mundial por
medicamentos de baixo custo (CRUZ, 1995).
Um método apropriado para análise de resíduos de pesticidas, precisa
apresentar sensibilidade, seletividade, exatidão e precisão e ser de baixo custo,
aplicável para uma variedade de pesticidas em matrizes diversas e capazes de
fornecer informações estruturais necessárias e corretas sobre o princípio ativo
(MICHEL, 2004).
O método de dispersão da matriz em fase sólida (MSPD, do inglês Matrix Solid-
Phase Dispersion) é uma técnica de extração conveniente uma vez que proporciona
efetuar etapas de rompimento da estrutura sólida original da matriz,
homogeneização, extração e purificação da amostra de maneira simultânea,
possibilitando a posterior análise do extrato pré-concentrado utilizando mínima
quantidade de solventes orgânicos e pouca quantidade de amostra (KRISTENSON,
2006). O extrato final pode ser analisado por cromatografia gasosa com detector
espectrofotométrico de massas, cromatografia líquida de alta eficiência e
eletroforese capilar (LIANG, 2004).
O presente trabalho propõe desenvolver um método analítico simples e eficaz
para determinação de resíduos de pesticidas acefato, chlorpropham, pirimicarbe,
bifentrina, tetradifona e fosalona em planta medicinal Cordia salicifolia, utilizando a
dispersão da matriz em fase sólida e as técnicas de cromatografia gasosa acoplada
à espectrometria de massas e cromatografia líquida de alta eficiência com detector
no UV-Vis com arranjo de fotodiodos.
25
2. OBJETIVOS
2.1 – Objetivo Geral
Desenvolver um método analítico pela utilização de dispersão da matriz em fase
sólida e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas e
cromatografia liquida de alta eficiência com detector UV com arranjo de fotodiodos
para determinação de resíduos de pesticidas de diferentes classes químicas em
amostras de planta medicinal Cordia salicifolia.
2.2 – Objetivos Específicos
Selecionar pesticidas que podem estar presentes direta ou diretamente em
Cordia salicifolia.
Desenvolver um método analítico rápido, seletivo e sensível para
determinação de resíduos dos pesticidas acefato, bifentrina, chlorpropham, fosalona,
pirimicarbe e tetradifona na planta medicinal Cordia salicifolia utilizando a técnica por
dispersão da matriz em fase sólida.
Otimizar as condições cromatográficas de análise dos pesticidas selecionados
por GC/MS/SIM e HPLC-UV.
Validar o método desenvolvido por MSPD, GC/MS e HPLC-UV.
Analisar amostras de Cordia salicifolia comercializadas no Mercado Municipal
da cidade de Aracaju-Sergipe.
26
3. JUSTIFICATIVA
A crescente demanda da população mundial por plantas medicinais tem
aumentado continuamente e com isso o maior interesse da população por produtos
fitoterápicos obtidos diretamente da natureza (CALIXTO, 2000). As plantas medicinais
que sustentam este tipo de prática popular são produtos agrícolas que assim como os
alimentos estão sujeitos ao ataque de diversos tipos de pragas como fungos, ervas
daninhas, insetos ou ácaros, sendo, portanto necessário o uso de pesticidas como
necessidade de preservação destas culturas. Com esta finalidade, o uso de
praguicidas na agricultura é permitido por órgãos governamentais, após o registro
adequado de suas formulações para as diversas culturas as quais pode ser utilizado
(TANG, 2008).
O monitoramento da quantidade de pesticidas presentes em culturas agrícolas
é de grande importância, pois permite avaliar a qualidade destes produtos,
proporcionando a verificação de tendências no aumento do uso. É necessário,
portanto o desenvolvimento de métodos analíticos que sejam confiáveis, de baixo
custo, com curto tempo de análise e que seja de fácil difusão e aplicação em outros
laboratórios.
A técnica de dispersão da matriz em fase sólida é dentre outros aspectos
bastante simples de ser aplicada, apesentando algumas vantagens frente aos outros
métodos de extração como a LLE e SPE, como a menor utilização de solventes
orgânicos, sendo aplicada para matrizes sólidas ou semi-sólidas (LANÇAS, 2004).
A cromatografia pode ser utilizada como técnica por sua aplicação em diversos
tipos de análises químicas na separação de uma boa parte dos constituintes
presentes na natureza. As técnicas de cromatografia gasosa e cromatografia líquida
quando acopladas com detectores adequados têm sido bastante utilizadas na
separação e na análise de poluentes orgânicos, como pesticidas, em matrizes
ambientais e alimentares, pelo alto poder de identificação e quantificação destas
substâncias químicas (NETO, 2003).
27
A planta medicinal Cordia salicifolia é bastante popular pela sua propriedade
cardiotônica e conhecida também por ser antidiurético e aplicada como medicamento
alternativo para redução de peso corporal, sendo comercializada em farmácias
populares como fitoterápico de baixo custo. Por ser uma cultura agrícola é susceptível
principalmente ao ataque de insetos, ervas daninhas, ácaros ou fungos que podem vir
a inviabilizar sua comercialização ou uso caseiro por parte da população (FAO, 2008).
A porangaba é cultivada próximo a culturas de laranja no município de Boquim/
SE, e pode estar sendo indiretamente contaminada por pesticidas aplicados na
laranja. Por isso se faz necessário dispor de um método analítico simples e eficiente
para determinar resíduos de pesticidas na planta medicinal porangaba a fim de
garantir que o uso desta planta medicinal não resulte em problemas de intoxicação
para os consumidores deste produto.
28
4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
4.1 – Pesticidas
As substâncias químicas estão presentes em nossa sociedade, nos mais
diferentes contextos do dia-a-dia, como nos medicamentos, alimentos, plásticos,
detergentes, tintas, cosméticos, roupas, pesticidas, produtos de limpeza e
desinfecção, em ambientes industriais e rurais, além da poluição típica de grandes
centros urbanos.
No que se refere às áreas agricultáveis, um grande desafio para a humanidade é
a produção de alimentos para uma população em plena expansão. Os setores rurais
estão disputando espaço com a expansão das áreas de urbanização e
industrialização. Nesse contexto, a busca de uma maior produtividade agrícola por
hectare, o emprego de pesticidas tem apresentado papel preponderante. Atualmente
a exploração comercial e econômica de qualquer cultura agrícola faz uso de
pesticidas, exceto a agricultura orgânica (GRISOLIA, 2002).
Literalmente o termo praguicida tem o significado de produto com a capacidade
de destruir pragas. A denominação pesticida, muito difundida entre os povos de
língua portuguesa e usual naqueles de língua inglesa, tem o significado de algo,
com poder de destruir pestes. O termo defensivo tem o significado de algo que serve
para defender ou resistir ao ataque de um inimigo qualquer. Um outro termo também
em uso é agrotóxico que tem o sentido geral de incluir todos os compostos químicos
utilizados na agricultura (FAO, 2008).
Com o desenvolvimento das monoculturas e o considerável aumento da
produção agrícola mundial, intensificou-se a preocupação em relação ao controle de
qualidade dos produtos agrícolas. O uso destes produtos aumentou
consideravelmente mesmo na pecuária, tornando-se necessário o monitoramento de
resíduos destas substâncias que eventualmente estariam no meio ambiente e
conseqüentemente nos produtos cultivados (SANCHEZ, 2006).
29
Os sistemas de produção intensivos elevam a necessidade de uso de pesticidas,
os quais aumentam as concentrações residuais destes princípios ativos ou de seus
metabólitos, que por sua vez podem comprometer a qualidade do ecossistema. A
deriva de pesticidas ocorrida durante o processo de aplicação dos produtos diminui
a eficiência da aplicação, além de comprometer a qualidade da flora e fauna nativas
de uma determinada região, assim como a água local, ou de outras regiões, bem
como na saúde do trabalhador rural e de comunidades vizinhas.
O pesticida aplicado no campo para combater as pragas tem um tempo de meia-
vida para se degradar ou pode ser metabolizado por enzimas do próprio produto e
ser transformado em um metabólito com possibilidade de ser ainda mais tóxico que
o composto original (VIANA, 1996).
Quando o produtor não respeita o prazo de carência de cada princípio ativo ou
metabólito e colhe o produto antes desse prazo, este chega ao consumidor
contaminado. Por isso é necessário se conhecer o comportamento físico-químico de
um pesticida e de seus metabólitos ou produtos de degradação formados para se
prever sua atuação no meio ambiente e estabelecer limites máximos aceitáveis
destes resíduos assim como seu intervalo de segurança e o índice diário aceitável
(GRISOLIA, 2005).
Os pesticidas podem ser classificados de acordo com a praga que eles
combatem:
Acaricidas – para controle de ácaros.
Bactericidas – para controle de bactérias.
Fungicidas – para controle de fungos.
Herbicidas – para controle de ervas daninhas.
Inseticidas – para controle de insetos.
Nematicidas – para controle de nematelmintos.
Rodenticidas – para controle de roedores.
Vermífugos – para controle de vermes.
30
E também podem ser classificados quimicamente como:
Organo-sintéticos: Carbamatos (nitrogenados), clorados, fosforados e
clorofosforados
Inorgânicos: À base de arsênio, tálio, bário, selênio, nitrogênio, fósforo, cádmio,
ferro, chumbo, cobre, mercúrio e zinco.
Botânicos: À base de nicotina. piretrina, sabadina e rotenona.
De acordo com parâmetros como mobilidade e persistência, toxicidade aguda e
crônica realizados com organismos não-alvo (peixe, abelhas, algas, etc.), os
pesticidas são classificados quanto à periculosidade ambiental em classes que
variam de I a IV, de produtos impeditivos de obtenção de registro, produtos
altamente perigosos ao meio ambiente (Classe I), e produtos pouco perigosos ao
meio ambiente (Classe IV). Observando-se a exposição humana a estes agentes, a
avaliação dos pesticidas em função dos efeitos à saúde, resulta em diferentes
categorias toxicológicas de acordo com a Tabela 1. Esta classificação obedece aos
resultados de testes realizados em laboratório que tentam estabelecer a dose letal
(DL), do pesticida em 50% dos animais utilizados naquela concentração.
Tabela 1. Classificação dos pesticidas de acordo com os efeitos à saúde
humana segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2008.
Classificação
Toxicológica
Toxicidade DL
50
(mg/kg) Faixa colorida
I Extremamente
tóxico
≤ 5 Vermelha
II Altamente tóxico 5 a 50 Amarela
III Medianamente
tóxico
50 a 500 Azul
IV Pouco tóxico 5.000 Verde
- Muito pouco tóxico ≥ 5.000 -
31
Os pesticidas são classificados também quanto à ação, a forma de atuação e
a origem. Quanto à forma de atuação os agrotóxicos podem ser sistêmicos ou não
sistêmicos. Os não sistêmicos têm ação de contato (via dérmica), penetração,
ingestão (via oral) e fumigante (via respiratória). Os agrotóxicos sistêmicos surgiram
como um aperfeiçoamento na seletividade do combate à praga, com a intenção de
não matar os insetos não nocivos. É transportado pela seiva do vegetal em
quantidade letal para o inseto, sem prejudicar a planta (PINHEIRO, 2004).
A Tabela 2 mostra a classificação dos pesticidas selecionados para o estudo
quanto ao seu modo de ação, forma de atuação e classe toxicológica.
O comportamento de um pesticida pode ser estimado pelas suas
características físico-químicas e pelos seus metábolitos ou produtos de degradação
formados. A Tabela 3 mostra algumas propriedades físico-químicas dos pesticidas
selecionados para o estudo. A Tabela relaciona a solubilidade dos pesticidas
estudados em alguns solventes orgânicos.
Tabela 2. Características gerais dos pesticidas selecionados para estudo.
FONTE: ANVISA, 2008.
Pesticidas Modo de ação Forma de
atuação
Classe
toxicológica
Fórmula
bruta
acefato
inseticida e
acaricida
sistêmico moderadamente
tóxico
C
4
H
10
NO
3
P
S
bifentrina
inseticida sistêmico altamente tóxico C
23
H
22
ClF
3
O
2
clorprofam
fungicida sistêmico altamente tóxico C
10
H
12
ClNO
2
fosalona
inseticida e
acaricida
sistêmico altamente tóxico C12H
15
ClNO
4
PS
2
pirimicarbe
acaricida sistêmico pouco tóxico C
11
H
18
N
4
O
2
tetradifona
Inseticida
acaricida
sistêmico altamente tóxico C
12
H
6
Cl
4
O
2
S
32
Tabela 3. Propriedades físico-químicas dos pesticidas selecionados para estudo.
Pesticidas
Ponto de
Ebulição (ºC)
Pressão de
Vapor (Pa),
20-25ºC
*Log K
ow
Tempo de
meia vida (t
1/2
), em dias
**Solubilidade
de 20-25ºC
(g
/L)
acefato 153-154 2,3x10
-
4
-0,89 3 790
bifentrina 150 2,4x10
-
5
>6 30 <1,0 x 10
-
7
clorprofam 78,6 1,3x10
-
3
- 26 0,089
fosalona 117 <6,7x10
-
5
3,3 108 0,0017
pirimicarbe 164,7-167,7 0,97x10
-
3
1,7 21 3,0
tetradifona 156-157 0,91x10
-
3
- 31 3,0 x 10
-
5
FONTE: BARCELÓ, 1997.
•
*Coeficiente de partição octanol:água.
•
**Solubilidade em água.
Tabela 4. Solubilidade dos Pesticidas em Solventes Orgânicos
Solubilidade (g/L)
Pesticidas Acetato
de etila
Acetona
Acetonitrila
Clorofórmio
Diclorometano
Hexano
acefato 35 151 - - solúvel 0,1
bifentrina - solúvel solúvel solúvel solúvel solúvel
clorprofam - - solúvel solúvel solúvel solúvel
fosalona solúvel solúvel solúvel solúvel solúvel -
pirimicarbe - 4,0 - 3,3 solúvel -
tetradifona - 82 solúvel 225 solúvel -
Fonte: BARCELÓ, 1997.
33
4.1.1. Classes Químicas dos Pesticidas Selecionados.
Os pesticidas em estudo têm seu limite máximo de resíduos relacionado à
aplicação em culturas agrícolas diversas susceptíveis ao ataque de pragas como
insetos, fungos, ácaros e ervas daninhas. Os pesticidas selecionados têm forte
atuação na preservação da produção agrícola como plantas medicinais, com classes
químicas distintas classificadas como piretróides, organofosforados, organoclorados
e carbamatos (BARCELÓ, 1997).
Piretróides: Substâncias que foram sintetizadas a partir do ácido crisantêmico,
com a finalidade de obtenção de inseticidas potentes com menor grau de toxicidade
para mamíferos, que ainda apresente dentre outras vantagens, baixo custo e
fabricação e de venda e maior facilidade e uso. Um piretróide selecionado para
estudo é a bifentrina que atua como acaricida e inseticida muito aplicado em cultura
de rosas e plantas ornamentais, susceptíveis ao ataque destas pragas. A bifentrina
tem sido muito empregada, devido a sua eficácia no controle dos insetos Sitophilus
zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae), e Tribolium castaneum
(Coleoptera: Tenebrionidae) em cultura de grãos. (SILVEIRA, 2006).
Organofosforados: Os pesticidas organofosforados são classificados nas
seguintes classes fundamentais: fosfato, fosforotionato, fosforoditionato,
fosforotiolato, fosforoamidato e pirofosfato
.
Os pesticidas organofosforados
constituem uma classe importante de inseticidas, acaricidas, nematicidas e
fungicidas, sendo atualmente os mais utilizados na agricultura. Embora estes
compostos sejam degradados em água, existe a possibilidade de restarem resíduos
e subprodutos em níveis relativamente nocivos ao consumo humano, além da
possibilidade de contaminação aguda, pontual, com altas concentrações (NETO,
2003).
Os pesticidas organofosforados por serem hidrossolúveis, não se acumulam no
tecido adiposo e consequentemente, são degradados mais rapidamente em tecidos
vivos. Possuem a vantagem de serem eliminados mais rapidamente em mamíferos,
quando comparados com os pesticidas organoclorados (DÓREA, 1999). Os
organofosforados são conhecidos por promover a inibição da enzima
acetilcolinesterase, responsável pela degradação do neurotransmissor acetilcolina
(FILHO, 2005).
34
Dentre os pesticidas organofosforados, os selecionados para estudo no presente
trabalho foram a fosalona e o acefato. A fosalona vem sendo freqüentemente
utilizada em culturas de jardinagem amadora e em culturas caseiras, devido a sua
moderada toxicidade e forte atuação como substância inseticida e acaricida (LIAPIS,
2003). O acefato é comumente utilizado como acaricida principalmente em culturas
de couve-flor, cravo, brócolis, fumo, crisântemo, melão, pimentão (ANVISA, 2008) e
atualmente tem sido descoberta a sua forte atuação contra a bactéria Paramecium
caudatum, um ácaro que causa transtornos na plantação de diversas culturas
agrícolas (VENKATESWARA, 2006).
Carbamatos: são compostos orgânicos derivados do ácido carbâmico. São
menos tóxicos que os fosforados e mais tóxicos que os clorados (contaminação
aguda). Degrada-se relativamente rápido e não se acumulam em tecidos
gordurosos. Possuem ação mais curta que os organofosforados, com relação à
função reguladora da acetilcolinesterase (enzima que torna possível a transmissão
de impulsos nervosos no organismo); todavia, vários produtos deste grupo químico
foram banidos em outros países devido aos seus efeitos cancerígenos.
Dentre os pesticidas da classe química dos carbamatos selecionados para
estudo tem-se o pirimicarbe e o clorprofam. O pirimicarbe é bastante utilizado nas
plantações de alface, tomate, berinjela, batatas ou diretamente em culturas de
plantas medicinais como camomila, hortelã e boldo de acordo com dados recentes
da ANVISA, 2008. Os limites máximos de resíduos para o pirimicarbe se referem à
soma de outros metabólitos, o pirimicarbe dietilico e N-formil (metilamina). O
pirimicarbe é freqüentemente empregado como acaricida no combate ao Coccinella
undecimpunctata que ocorre em culturas de batatas. O clorprofan é geralmente
utilizado em culturas que são frequentemente atacadas por ervas daninhas (NETO,
2005), e sendo um carbamato possui considerável degradação em meio aquoso.
35
Clorodifenilsulfonas: Substâncias que fazem parte desse grupo, basicamente
possuem a mesma característica dos compostos organoclorados, pela presença do
cloro ligado a um ou mais anéis aromáticos na estrutura química da substância.
Organoclorados são classificados como pesticidas com alto grau de persistência
ambiental, pela facilidade de acumulação em meio gorduroso como o tecido
adiposo, ou em sedimentos de mares e rios. Pesticidas organoclorados são vistos
sob o aspecto da toxicidade crônica pelo fato de causarem efeitos patológicos em
longo prazo. Os pesticidas organoclorados atuam no sistema nervoso central e
periférico, interferindo nas transmissões dos impulsos nervosos. O famoso DDT
(diclorodifeniltricloroetano) foi o primeiro inseticida sintetizado logo após a segunda
guerra mundial com o objetivo de combater insetos que transmitiam a malária e o
tifo. A tetradifona, que faz parte do grupo químico das clorodifenilsulfonas, é
comumente utilizada no controle de ácaros em cultura de frutas cítricas, feijão,
berinjela, mamão e pimentão (ANVISA, 2008).
A Tabela 5 relaciona as estruturas químicas dos pesticidas selecionados para
estudo.
36
Tabela 5. Estrutura química dos pesticidas selecionados para estudo.
Pesticidas Estrutura química
acefato (O,S-dimethyl
acetylphosphoramidothioate)
clorprofam
(
1-methylethyl
(3-
chlorocarphenyl)carbamate
p
irimicarbe
(2-
dimethylamino-5,6-
dimethylpyrimidin-4-yl
dimethylcarbamate)
b
ifentrina
(2-
methylbiphenyl-3-ylmethyl
(Z)-(1RS,3RS)-3-(2-chloro-
3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-
2,2-dimethylcyclopropane
carboxylate)
t
etradifona
(4-chlorophenyl
2,4,5-trichlorophenyl
sulfone)
fosalona (S-6-chloro-2,3-
dihydro-2-oxobenzoxazol-3-
ylmethyl O,O-
diethylphosphorodithioate
FONTE: ANVISA, 2008.
37
4.2 – Plantas Medicinais
As plantas são recursos naturais de fundamental importância tanto para o
homem quanto para outros seres vivos. A vida seria inexistente sem os vegetais,
pois além de sua grande importância nos processos vitais de transformação de gás
carbônico em oxigênio, em conjunto representam a maior fonte da biomassa de
carbono e energia para os seres vivos, desde os organismos unicelulares até o mais
complexo mamífero (GRISOLIA, 2007).
Além dessa importância outra grande potencialidade refere-se à capacidade que
as plantas possuem em produzir imensa variedade de moléculas orgânicas de
grande complexidade estrutural, muitas destas substâncias utilizadas como
mecanismo de defesa das próprias plantas contra agentes patogênicos, herbívoros
ou agressores abióticos como os raios ultravioletas entre outros (CHAN, 2002).
Dentre as várias moléculas que servem como mecanismo de defesa das plantas,
várias espécies foram utilizadas pelo homem em situações adversas (patogenias,
mutações, etc.) de grande interesse não apenas agrícola como também terapêutico,
que levou cientistas realizarem um estudo mais detalhado dessas plantas medicinais
e de suas respectivas substâncias.
Nos tempos atuais são numerosos os trabalhos realizados com diversas plantas
medicinais nativas, destacando-se os trabalhos da química de produtos naturais,
estudos biotecnológicos de culturas de tecidos vegetais, biologia molecular e mais
recentemente os de microorganismos endofíticos (LU, 2003).
A utilização das plantas medicinais e a fitoterapia encontram-se em expansão em
todo o mundo, consistindo em um mercado bastante promissor (CALIXTO, 2000).
No Brasil a utilização das plantas medicinais vem sendo estimulada por diversos
fatores tais como a enorme variedade de espécies vegetais disponíveis, a grande
desinformação relacionada ao tema e o fraco desenvolvimento tecnológico desta
área no país (CARVALHO, 2008).
38
Produtos à base de plantas medicinais são comercializados no Brasil em
farmácias/drogarias, supermercados, ervanárias. Na maior parte das vezes o modo
de preparo de um medicamento à base de planta medicinal é de forma caseira
sendo a folha a parte mais utilizada (53%), seguida de toda a planta (13%), raízes
(11%), flores (7%), sementes (5%), cascas (5%), resinas (3%), frutos (2%) e bulbos
(1%) (SANTOS, 2007).
Na maior parte dos trabalhos com plantas medicinais o principal modo de
preparo dos remédios caseiros é na forma chá, sendo que a facilidade de preparo
de medicamentos caseiros está diretamente relacionada à facilidade de coleta e o
manuseio das plantas. Os quintais de residências são um exemplo típico desta
facilidade de obtenção das plantas medicinais, que se constitui em espaços ao redor
da unidade familiar, onde além de plantas medicinais, são cultivadas plantas
ornamentais ou frutíferas (SANTOS, 2008).
Para uma utilização segura de qualquer planta medicinal como medicamento é
necessário que ela seja padronizada, isto é, deve-se estabelecer a autenticidade da
droga vegetal e seu teor de princípios ativos dentro dos parâmetros que são
utilizados como critérios de qualidade (CARVALHO, 2008).
A planta medicinal em estudo é conhecida popularmente por porangaba de nome
científico Cordia salicifolia, também conhecida por cafezinho, café-de-bugre, café-
do-mato, chá-de-bugre, claraiba, louro-mole ou chá-de-frade. A Cordia salicifolia é
da família das boragináceas de nome botânico aceitável Cordia ecalyculata; é uma
árvore de copa alongada, de 8-12 cm de altura com tronco de 30-40 cm de diâmetro
nativa desde o nordeste ao sul do Brasil. Possui folhas simples de 8-14 cm de
comprimento, e flores pequenas, perfumadas de cor branca. Seus frutos têm a
forma de bagas de cor vermelha semelhantes ao café, por isso as denominações
populares (LORENZI, 2005).
39
A Cordia salicifolia foi primeiramente descoberta pela população indígena do
Brasil, e ainda é consumida em regiões tropicais deste país, da Argentina e Paraguai.
Seu uso no Brasil é considerável nas regiões de Minas Gerais, Goiás, Bahia e Acre,
onde a planta é bastante conhecida por sua propriedade diurética e cardiotônica
(MENGHINI, 2008).
A Cordia salicifolia é indicada terapeuticamente como tônico cardíaco, diurético e
redutor de apetite. Estudos recentes no Japão encontraram novos usos medicinais
para esta planta, no tratamento do vírus tipo I do Herpes, reduzindo em 99% dos
casos a penetração do vírus (HAYASHI, 1990).
Estudos ainda em andamento comprovam que doses maiores de extrato de óleo
de porangaba podem atuar contra células cancerosas e na minimização de gastrites e
úlceras gástricas, um problema que atinge mais de 50% da população mundial,
principalmente em nações em processos de desenvolvimento (MENGHINI, 2008). A
bactéria Helicobacter pylori, responsável por este tipo de gastrite ou úlcera,
específica, é contraída muitas vezes por falta de higiene adequada na manipulação de
alimentos para consumo.
Outro constituinte químico típico de plantas do gênero Cordia é o β-sitosterol. Este
composto sozinho ou em combinação com outros esteróis de plantas tem
demonstrado em estudos clínicos um efeito de reduzir os níveis de colesterol no
sangue. Ele age neste sentido de três formas. Primeiramente quando usado junto com
a comida, onde ele se associa às gorduras e age bloqueando a absorção do
colesterol pelo corpo (somente 5-10% de β-sitosterol agregado é absorvido). Este
efeito pode ajudar também em regimes de redução de peso e especialmente na
prevenção de doenças cardiovasculares (MENGHINI, 2008).
40
4.3 – Dispersão da Matriz em Fase Sólida
O preparo da amostra tem como principal objetivo isolar o(s) componente(s) de
interesse de outros compostos presentes na matriz os quais poderão interferir
posteriormente na determinação analítica. Muitas vezes esta etapa é também
denominada de extração, mas em muitos casos, não é necessária uma etapa de
extração para que o analito possa ser avaliado por uma técnica instrumental. Após o
isolamento dos compostos de interesse da matriz, pode ser necessária uma etapa
de limpeza do extrato, particularmente em se tratando de amostras complexas
(LANÇAS, 2008).
A limpeza da amostra é quase sempre empregada na análise de amostras
ambientais, fluidos biológicos, alimentos e similares, pois, devido a grande
quantidade de compostos presentes nestas matrizes, invariavelmente a técnica de
extração não será suficiente para gerar um extrato insento de contaminantes. Alguns
autores incluem a etapa de clean-up como uma forma de preparo de amostra, outros
não. Após a etapa de preparo da amostra propriamente dita, o extrato está pronto
para a análise instrumental (POOLE, 1995).
A extração é sem dúvida a etapa mais crítica e complexa no preparo da amostra.
Em muitos casos a extração pode ser combinada com a concentração dos analitos,
derivatização e outros procedimentos, em uma única etapa de preparo da amostra.
Existem várias técnicas de extração, dependendo do estado físico, químico e a
complexidade da matriz e dos compostos a serem extraídos sendo os principais a
extração líquido-líquido (LLE), extração em fase sólida (SPE), microextração em
fase sólida (SPME), extração em fluido supercrítico (SFE), extração contínua,
extração Soxhlet, extração com fluidos pressurizados (PLE), extração acelerada
com solventes (ASE), extração por microcroondas (MAE), extração sortiva em
barras de agitação (SBSE) e a dispersão da matriz em fase sólida (MSPD), entre
outras (LANÇAS, 2008).
41
A dispersão da matriz em fase sólida foi primeiramente introduzida pelo norte
americano Steven Barker em 1989 e surgiu a partir de modificações feitas na
extração em fase sólida com o objetivo de se fazer pré-concentração de analitos
diretamente sobre amostras sólidas ou semi-sólidas. A MSPD é usualmente
empregada com o propósito de isolar um ou mais analitos de uma matriz sólida ou
semi-sólida (BARKER, 2007). Um esquema da MSPD pode ser visto na Figura 2.
Figura 1. Esquema da dispersão da matriz em fase sólida.
42
A MSPD faz uso de fases estacionárias ou suportes sólidos como sílica, alumina,
Florisil, ou sílica modificada com modificadores orgânicos como C
18
, C
8
amino,
ciano, entre outras a depender da natureza do analito. A matriz é dispersa e
homogeneizada sobre o suporte até a obtenção de uma massa uniforme, permitindo
uma interação forte entre o suporte sólido e os componentes da matriz (LOPEZ,
2008). O adsorvente serve como um abrasivo rompendo a estrutura original da
amostra, proporcionando um novo grau de interação dos analitos com o suporte
sólido facilitando no isolamento e no processo de extração. O adsorvente exerce um
papel fundamental no processo de extração. No entanto é difícil se obter um
adsorvente que seja eficiente na extração de um conjunto de substâncias
pertencentes a funções químicas diferentes e que apresentem os mesmos tipos de
interação com este sorvente (LANÇAS, 2004).
Na prática, o processo de MSPD pode ser dividido em duas etapas, sendo que a
primeira consiste no preparo do cartucho contendo a amostra e a segunda na
eluição dos analitos de interesse. A fase sólida é pesada numa balança adequada e
transferida para um recipiente adequado para posterior trituração. A amostra então é
adicionada à fase sólida e então ambos são triturados e homogeneizados até a
formação de uma pasta uniforme e homogênea por um tempo de aproximadamente
30 a 60 segundos tipicamente. Este sistema irá conter a amostra distribuída
uniformemente sobre a superfície da fase sólida. A amostra é então colocada em um
cartucho. Em seguida é adicionado o solvente e procede-se a eluição com auxílio de
pequena pressão para diminuição do tempo de extração. O extrato obtido poderá
ser analisado diretamente caso já esteja na forma, pureza e concentração
adequados, ou sofrer outras operações como centrifugação, filtração, derivatização,
concentração, dependendo da técnica analítica empregada (BARKER, 2007).
Várias aplicações da dispersão da matriz em fase sólida podem ser encontradas
na literatura ilustrando o crescimento do interesse pela técnica. Uma das grandes
aplicações no momento é como uma das etapas importantes em um enfoque para
análise de multirresíduos de pesticidas em alimentos denominado QUECHERS
(“Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe”, ou seja, Rápido, Fácil, Barato,
Efetivo. Robusto e Seguro) (GONZÁLEZ, 2008).
43
Dentre os suportes sólidos comumente utilizados em processos de extração
por dispersão da matriz fase sólida pode-se citar:
Sílica (SiO
2
)
n
-OH: É um polímero inorgânico usado diretamente como
sorvente e para preparação de uma importante família de sorventes conhecidos
como sílicas ligadas fisicamente. É o sorvente mais utilizado para propósitos gerais.
Possui superfície ligeiramente ácida que facilita a retenção dos compostos básicos.
Facilmente absorve água pela formação de ligação de hidrogênio com grupos
silanóis (LANÇAS, 2004).
Alumina (Al
2
O
3
)
n
: Depois da sílica, é o adsorvente mais utilizado. Possui
caráter anfótero Tem característica alcalina, embora possa também ser preparada
para apresentar características neutra ou ácida. É geralmente empregada na
separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder ser preparada com
características ácida, neutra ou alcalina, é bastante útil na separação de substâncias
que apresentam variações dessas características (COLLINS, 2006).
Florisil [Mg.Al(SiO
4
)
n
] : É o sorvente mais polar e deve ser utilizado com
reservas quando se analisa compostos polares, uma vez que poderá provocar
adsorção irreversível em sua superfície e o analito de interesse não ser removido
com os eluentes comumente empregados nesta técnica. É muito utilizado na
extração de pesticidas (LANÇAS, 2004).
Octadecilsilano (C
18
): Possui caráter apolar. A característica lipofílica do C
18
facilita o rompimento, dispersão e retenção de espécies lipofílicas (KRISTENSON,
2006).
Os fatores que afetam na MSPD são: a natureza do suporte sólido como
tamanho do poro com ou sem end-caping, natureza da fase ligada ao suporte (fase
normal, fase reversa, e com ou sem pré-condicionamento da fase), a natureza da
amostra (conteúdo de água, açúcar), modificações na matriz (ajustes no pH), e a
natureza ou a ordem dos solventes de eluição (SILVA, 2007).
Muitas vezes a depender da natureza da amostra, o extrato obtido após o
processo de MSPD encontra-se suficientemente limpo para a análise num
equipamento adequado, entretanto muitas vezes torna-se necessário adicionar uma
etapa adicional no processo de extração atuando na remoção substâncias
interferentes da matriz, pelo uso de co-sorvente ou conectando-se uma segunda
coluna, no próprio processo de MSPD (BARKER, 2007).
44
A seletividade de um procedimento por MSPD depende da combinação
sorvente/solvente usada. A natureza desta combinação é determinada
principalmente pela polaridade dos analitos de interesse e a natureza da matriz
(KRISTENSON, 2006). Na seleção do solvente de eluição, o principal auxílio é a
série eluotrópica (εº). Quanto maior o valor de εº do solvente, maior será sua força
de eluição e, portanto, mais facilmente removerá o analito da fase sólida. O solvente
selecionado deve maximizar a recuperação dos analitos de interesse e minimizar a
eluição dos componentes interferentes da matriz (MITRA, 2003).
A Tabela 6 relaciona alguns solventes comumente utilizados como fase móvel em
processos de MSPD e SPE.
Tabela 6. Série eluotrópica utilizada na seleção da fase móvel em MSPD.
Solvente
Valor eluotr
ópico (
ε°) em s
ílica
acetato de etila 0,45
acetona 0,43
acetronitrila 0,50
ácido acético glacial > 0,73
água > 0,73
álcool isobutílico 0,54
benzeno 0,27
ciclohexano 0,03
clorofórmio 0,31
diclorometano 0,32
éter anidro 0,29
éter tert-butil metílico 0,29
Hexano 0,00
n-hexano 0,00
n-heptano 0,00
metanol 0,73
metil etil cetona 0,39
Pentano 0,00
piridina 0,55
2-propanol 0,63
tetracloreto de carbono 0,14
45
tetrahidrofurano 0,35
tolueno 0,22
1,1,2-tricloro-trifluoroetano 0,02
2,2,4-trimetilpentano 0,01
FONTE: SILVA, 2007.
4.4 – Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas
A cromatografia é um eficiente método de separação empregada em diversos
setores da ciência de grande aplicação em vasta área de conhecimentos na qual a
análise qualitativa e quantitativa das espécies químicas deve ser realizada
permitindo a separação de misturas complexas (LANÇAS, 1993). As várias
modalidades de emprego da cromatografia respondem por mais de 70% da química
analítica (COLLINS, 2005). De uma forma geral a cromatografia é definida como um
processo de separação dos componentes de uma mistura, através da distribuição
destes componentes entre duas fases: uma estacionária e uma fase móvel. Durante
a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os componentes são distribuídos
entre as duas fases de tal forma que cada um destes componentes é seletivamente
retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais dos mesmos.
Esta diferença de interações entre os diversos compostos permite a separação
dos constituintes químicos de uma determinada mistura. Como conseqüência, os
tempos gastos para cada constituinte químico de uma mistura chegar ao detector
são diferentes permitindo a identificação e quantificação adequada dos mesmos
(COLLINS, 2004).
Os analitos a serem separados por cromatografia gasosa devem apresentar uma
razoável pressão de vapor à temperatura de separação. Substâncias orgânicas,
complexos organometálicos e substâncias inorgânicas voláteis ser analisadas e
quantificadas.
46
A cromatografia gasosa está limitada à análise de compostos voláteis (cerca de
15% dos compostos orgânicos); porém a existência de cromatógrafos que operam a
temperaturas de até 450 ºC, às técnicas de pirólise e a possibilidade de converter
muitos compostos em derivados voláteis ampliam consideravelmente o campo de
aplicação desta técnica (BARCELÓ, 1997). A cromatografia gasosa acoplada ao
espectrômetro de massas é utilizada na identificação de centenas de componentes
presentes em sistemas naturais e biológicos, permitindo a caracterização de
substâncias em diversas amostras e na quantificação dos compostos
(SKOOG, 2002).
No espectrômetro de massas as moléculas são bombardeadas com um feixe de
elétrons. As moléculas se ionizam e se quebram em muitos fragmentos. Cada
espécie de íons possui determinado valor da razão da massa para a carga, ou valor
m/z. Um espectro de massas é um gráfico contendo as massas dos fragmentos
positivamente carregados (incluindo o íon principal) nas suas concentrações
relativas. O pico mais intenso do espectro, chamado pico base, tem arbitrariamente
a intensidade 100% (SILVERSTEIN, 2002).
Os espectrômetros de massas empregados na elucidação das estruturas de
substâncias são classificados conforme o método de separação, deflexão ou desvio
da trajetória dos íons. Alguns são de deflexão em campo magnético simples ou de
dupla focalização, outros, de tempo de vôo (Time-of-Flyght) e, ainda, de filtro de
massas com quadrupolo ou triplo quadrupolo e aprisionamento de íons (íon-trap)
(SKOOG, 2002).
As informações qualitativas são obtidas através da interpretação dos espectros
de massas. Esse espectro de massas é característico da substância principal e pode
ser comparado a espectros de massas de padrões analisados simultaneamente, ou
provenientes de bibliotecas armazenadas no computador (COLLINS, 2006). A
elevada sensibilidade possibilita a hifenação com técnicas cromatográficas como a
cromatografia gasosa (GC/MS), cromatografia líquida (LC/MS) e eletroforese capilar
(CE/MS), tornando a espectrometria de massas um dos mais apropriados métodos
físico-químicos para elucidação e determinação estrutural de compostos orgânicos
como produtos naturais, drogas, fármacos, polímeros e identificação de poluentes
orgânicos como pesticidas, HPA’s, bifenilas policloradas, dioxinas em matrizes
diversas.
47
A técnica de GC/MS, com o espectrômetro de massas operando no modo de
impacto de elétrons (EI) é bastante empregada em laboratórios de análises de
resíduos de poluentes orgânicos. Esse tipo de instrumentação permite elucidar
diversas estruturas de poluentes como pesticidas. As bibliotecas atuais compõem
cerca de aproximadamente 120.000 espectros de massa (m/z) de poluentes
ambientais como, por exemplo, os pesticidas (BARCELÓ, 1997).
Em análises ambientais o espectrômetro de massas é usualmente operado no
modo de impacto de elétrons, ionização química no modo positivo (PCI), ionização
química no modo negativo (NCI) ou no modo Tandem (MS-MS), (BARCELÓ, 1997).
4.5. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
A técnica de cromatografia líquida é complementar à cromatografia gasosa,
pelo fato de permitir a separação e análise de compostos termicamente instáveis,
não-voláteis ou de elevada polaridade. A análise de substâncias polares pode ser
realizada através do uso de mistura binária de solventes metanol:água ou
acetonitrila:água, e colunas com fases estacionárias do tipo C
18
, C
8
ou ciano
(BARCELÓ, 1997).
Um sistema de HPLC é basicamente constituído de bombas de alta pressão,
injetor, colunas, detector e um sistema de aquisição de dados. A separação de uma
mistura por HPLC se dá por uma ou mais interações entre o soluto, a fase
estacionária e a fase móvel, as quais podem ser pontes de hidrogênio, interações
eletrostáticas e hidrofóbicas ou forças de Van der Walls entre outras. Os modos de
separação podem ser classificados de acordo com a natureza das interações. São
eles: cromatografia em fase normal, cromatografia em fase reversa, por pareamento
de íons, por troca iônica ou por exclusão de tamanho. A escolha do modo adequado
para cada tipo de análise é baseado na natureza, massa molecular, polaridade e
caráter iônico do soluto (SNYDER, et. al1997).
Em cromatografia no modo normal a fase estacionária é mais polar do que a
fase móvel, o oposto ocorre em cromatografia no modo reverso. Os solventes
utilizados são geralmente uma mistura de solventes orgânicos sem a adição de água.
As fases estacionárias são adsorventes orgânicos como sílica e alumina ou fases
48
polares quimicamente ligadas. A força de diferentes misturas de solventes para
eluição no modo normal pode ser medida experimentalmente (CASS, 2001).
A cromatografia em fase reversa é a mais utilizada em HPLC, uma vez que
permite a separação de uma grande variedade de solutos e de fases móveis aquosas.
A fase móvel comumente utilizada é a mistura acetonitrila/água, sendo a acetonitrila
quando necessário substituída por metanol ou tetrahidrofurano. O uso de apenas
estes três solventes deve-se à pequena quantidade de solventes orgânicos miscíveis
em água (SNYDER, 1993).
O princípio da retenção em fase reversa é a hidrofobia, sendo a separação
baseada em interações entre a parte não polar do soluto e a fase estacionária, ou a
repulsão desta parte não polar do soluto com a fase móvel. A retenção em fase
reversa aumenta com o aumento de água na fase móvel (CASS, 2001).
A cromatografia líquida é particularmente adaptável às análises de resíduos de
pesticidas, com faixas amplas de polaridades, incluindo produtos de degradação ou
metabólitos secundários destes pesticidas, sem necessariamente derivatizar a
molécula do princípio ativo a ser quantificado. A cromatografia líquida apresenta
alguns requintes em relação à cromatografia gasosa, como a instalação no próprio
sistema de pré ou pós-colunas, sendo esta uma aplicação bastante usual na
determinação de pesticidas carbamatos e piretróides (BARCELÓ, 1997).
O detector aplicado neste trabalho foi o detector espectrofotômétrico UV-Vis
com arranjo de fotodiodos. Seu princípio é baseado na absorção de luz ultravioleta ou
visível, por parte da amostra. É um detector seletivo para moléculas com grupos
cromóforos (que absorvem num comprimento de onda específico) (CASS, 2001).
Recomenda-se a utilização de comprimentos de onda no máximo do analito, para
evitar interferência do solvente que compõe a fase móvel.
A Tabela 7 mostra os comprimentos de onda mínimos para que não seja
observada interferência da fase móvel.
49
Tabela 7. Comprimentos de onda mínimo dos solventes mais utilizados em HPLC.
Solvente UV (nm) mínimo
Acetona 330
Acetonitrila 200
Benzeno 280
Tetracloreto de carbono 265
Clorofórmio 245
Ciclohexano 210
Éter etílico 220
Dimetilsulfóxido 270
Etanol 210
Acetato de etila 255
Hexano 200
Metanol 210
Pentano 200
1-Propanol 210
Tetrahidrofurano 215
Tolueno 285
Água 190
FONTE: CASS, 2001
50
5. REVISÃO DE LITERATURA
Esta revisão da literatura apresenta trabalhos que abordam métodos de
determinação de resíduos de pesticidas em plantas medicinais por técnicas
cromatográficas de análise.
ABHILASH, 2008, desenvolveram um método por MSPD para determinação de
resíduos de pesticidas lindano e isômeros do hexaclorociclohexano em vegetais,
frutas e planta medicinais por GC-ECD. Foi adicionado a etapa de limpeza na
extração dos pesticidas nas matrizes estudadas. Foi utilizado 500 mg de Florisil como
adsorvente para homogeneização com 5,0 g de amostra. Na tentativa de eliminar a
umidade da matriz foi utilizado ainda 1,0 g de sulfato de magnésio anidro e 500mg de
cloreto de sódio que foram transferidos para uma coluna contendo 2,0 g de alumina
neutra e 500 mg de sulfato de sódio anidro. Para a etapa de eluição foi feito
otimização do sistema de solventes, sendo utilizado 1 mL do gradiente de solvente n-
hexano/acetato de etila (70:30, v/v). As recuperações ficaram na faixa de 93 a 103%.
Os limites de detecção para os α, β, γ e δ-HCH foram de 3 a 5 ng/g respectivamente.
O método foi aplicado para determinação de lindano e outros isômeros do
hexaclorociclohexano em matrizes alimentícias e de plantas medicinais.
DONG, 2007, desenvolveram uma metodologia para determinação de resíduos
de Metalaxyl nas plantas medicinais Panax notoginseng, Panax quinguefolium L,
Paeonia lactiflora Pall e Angelica sinensis. A extração foi realizada por SPE utilizando
cartuchos de 250 mm x 15 mm empacotados com 10 g de Al
2
O
3
(contendo 3% de
água). As análises foram feitas por cromatografia liquida de alta eficiência no modo
reverso (RP-HPLC) com detector UV. A eluição foi realizada no modo isocrático, com
fase móvel composta pela mistura acetonitrila/água (40:60 v/v) e comprimento de
onda de 220nm. Os resultados de recuperação ficaram na faixa de 91,6 a 97,9%
considerados satisfatórios e RSD’s entre 1,2 e 5,0%. O limite de detecção foi de 3,6 x
10
-10
g. O método foi considerado eficiente, seletivo, e sensível e, portanto adequado
para determinação de Metalaxil nas plantas medicinais analisadas.
51
HAJJO, 2007, desenvolveram uma metodologia multirresíduo para análise de
pesticidas na planta medicinal Origanum syriacum bastante popular na região do Rio
Jordão, Oriente Médio. A extração foi feita utilizando ma mistura de solventes
acetonitrila/éter de petróleo. Foi feito uso de coluna preparada com Florisil, como
etapa na eliminação de impurezas da matriz. Os valores de recuperação dos
pesticidas foram de 74 a 119% com valores de coeficientes de variação entre 1,0 e
23,6%. Os valores de limites de detecção foram de 0,0008-0,5 mg/Kg. O método foi
empregado para análise de pesticidas em amostras da planta medicinal
comercializada em um supermercado da região. Sete das oito amostras
apresentavam quantidades detectáveis dos pesticidas DDT, folpet, dicofol, HCB,
HCH, vinclozolina e quintozeno.
LING, 1999, desenvolveram um método para determinação de 13 pesticidas
organoclorados em plantas medicinais típicas da China por extração SFE análises por
GC-ECD e GC-MS para confirmação dos pesticidas na matriz. Os pesticidas em
estudo foram os isômeros α, β, γ, σ-HCH, heptacloro, aldrin, endrin, dieldrin, α, β-
endosulfan, 4,4’DDT, 4,4’-DDE e 4,4’DDD. O gás utilizado como fluido supercrítico foi
o CO
2
sob pressão de 250 atm e temperatura de 50ºC, com 5 minutos de extração
estática e 20 minutos de extração dinâmica. Para a etapa de purificação do extrato foi
utilizado 2,0 g de Florisil como sorvente para cada 0,1g de planta medicinal, e eluição
com 12,0 mL de n-hexano sob vazão de 1 mL/min. Os valores de recuperação ficaram
na faixa de 78 a 121% com reprodutibilidade na faixa de 5-31%, exceto para os
pesticidas endrin e β-endosulfan. Em termos gerais o método foi considerado rápido e
simples para a determinação dos pesticidas organoclorados estudados.
MA, 2007, desenvolveram um método por GC-ECD para determinar pesticidas
organoclorados (DDT, BHC e PCNB) em amostras de plantas medicinais. A extração
por SPE foi feita utilizando-se éter de petróleo como solvente. Os valores de
recuperação ficaram na faixa de numa faixa 89% a 102%, considerados satisfatórios,
e os valores de RSD’s ficaram na faixa de 0,5% a 8,9% para três valores de
concentração das soluções padrão dos pesticidas. O método foi validado
demonstrando ser rápido, simples, pouco gasto de solvente orgânico e com bons
valores de recuperação para os pesticidas estudados.
52
SCHUREK, 2008, desenvolveram um método para determinação de 36
pesticidas em amostras de chás. A determinação foi realizada pelo acoplamento on-
line da técnica de microextração em fase sólida no modo headspace com um
sistema bidimensional de cromatografia acoplado a espectrometria de massa com
analisador de massa por tempo de vôo (HS-SPME-GCxGC-TOF/MS) como uma
nova alternativa em relação à prática convencional de análise por GC-MS utilizando
outro tipo de técnica de extração que possa consumir maior quantidade de solventes
orgânicos. Alguns parâmetros no processo de extração por SPME foram ajustados
como o tipo da fibra utilizada para adsorção adequada dos pesticidas estudados e
temperatura de dessorção dos analitos. A repetibilidade foi medida pelo CV, cujo
valor máximo foi de 24%. Os limites de quantificação variaram no intervalo de 1 a 28
µg/kg.
TANG, 2007, determinaram resíduos de seis pesticidas nas plantas medicinais
Isatis indigotica e Paeonia lactiflora Pall por MSPD. O método consistiu na
homogeneização de 0,5g de planta medicinal com o sorvente sílica-gel e acetona
como solvente de eluição. Os resultados de recuperação para os ensaios fortificados
com soluções padrão nas concentrações de 0,1 a 5 mg/kg foram de 80 a 110% com
valores de RSDs na faixa de 0,43 a 17,6%. Os limites de quantificação para os
pesticidas metalaxyl, triadimefon e paclobutrazole foi de 0,01mg/kg e de 0,05 mg/kg
para os pesticidas vinclozolina, tebuconazole e fenatimol. O método empregado foi
rápido, eficiente e sensível para determinação dos pesticidas.
TANG, 2006, utilizaram dois métodos de extração para determinação de 15
fungicidas (organoclorados, organofosforados e piretróides) na planta medicinal Isatis
indigotica e formulações. Utilizou-se extração por ultra-som e posterior centrifugação
para separação do material particulado da planta medicinal na preparação da infusão.
Em seguida foi feito uso de extração líquido-líquido para extração dos pesticidas com
uso de éter de petróleo. A determinação dos pesticidas foi feita por GC-ECD-FID. As
soluções padrão dos pesticidas foram preparadas nas concentrações de 0,4 e
10µg/Kg. Os valores de recuperação foram considerados satisfatórios situados na
faixa de 72 a 113% para a infusão. Para o extrato obtido somente após a sonicação e
centrifugação sem fazer uso da LLE os resultados de recuperação foram de 73 a
105,1%, e os valores de recuperação obtidos apenas por extração no ultra-som foram
de 70 a 119%.
53
Os valores de coeficientes de variação para todos os pesticidas analisados
foram menores que 20%. Em termos gerais os métodos empregados para
determinação dos pesticidas estudados foram considerados simples, rápidos para
determinação simultânea dos resíduos dos pesticidas analisados com bons valores de
recuperação e repetibilidade com limites de determinação adequados e satisfatórios.
ZUIN, 2002, realizaram um estudo de comparação entre uma metodologia
convencional da Farmacopéia Européia (EP) e uma metodologia por MSPD para
analisar resíduos de pesticidas em plantas medicinais brasileiras. Os pesticidas
estudados foram os organoclorados (clorotalonil, tetradifona, lindano, α-endosulfan, β-
endosulfan, hexaclorobenzeno e dieldrin) e os pesticidas organofosforados
(fenitrotiona, parationa-etílica, parationa-metílica e malationa) que foram analisados
por GC-ECD. Uma massa de 0,5 g de Florisil desativada com 3% de água foi
adicionada a 1,0 g de folhas secas e pulverizadas Passiflora. L foi homogeneizado por
5 minutos. A mistura foi transferida para um cartucho (5 X 15 cm) contendo 2,0g de
alumina neutra desativada com 3% de água e 0,5 g de sulfato de sódio anidro para
retirada da umidade no processo de extração. A eluição foi feita com 5,0mL de uma
mistura dos solventes n-hexano/acetato de etila (70:30, v/v). Foram realizados testes
para a seleção do suporte sólido (C
8
, C
18
e Florisil), do solvente de eluição (acetato de
etila e n-hexano) e adsorvente adequado para a etapa de limpeza do extrato, evitando
eventual interferência de algum constituinte químico característico da planta, evitando
desta forma a influência da matriz nos resultados. O estudo de recuperação do
método foi feito considerando-se três níveis de concentração, com valores médios de
recuperação de 96% (Farmacopéia Européia) e 94% por MSPD. O método
desenvolvido apresentou valores equivalentes ao da Farmacopéia Européia com a
vantagem de ser de baixo custo, simples e rápido.
54
6. EXPERIMENTAL
6.1 – Material
Béquer (50 e 250 mL), bastão de vidro, proveta (10 a 50 mL), balão
volumétrico (1, 5, 10 e 25 mL), balão de fundo redondo, vidro de relógio, frasco de
vidro com tampa rosqueável, vial para auto injetor (Shimadzu, Japão); colher de aço
inoxidável, espátula, garra, pinça, seringa de polietileno (20 mL), lã de vidro, garra,
micropipeta (Boeco Pipette 10-100 e 100-1000 µL), pipeta Pasteur.
6.2 – Solventes e Sorventes
Acetona, acetonitrila, acetato de etila, clorofórmio, ciclohexano,
diclorometano, n-hexano, (p.a., Merck, Darmstadt, Alemanha); Florisil 60-100 mesh
(Sigma, U.S.A); alumina neutra 70-290 mesh (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha);
C18 50 µM-65 A° (Waters - U.S.A); Sílica Gel 60 -20 0 mesh (J. T. Baker, Estados
Unidos); sulfato de sódio anidro (Merck, Darmstadt, Alemanha).
6.3 – Padrões de Pesticidas
- acefato (Dr. Ehrenstorfer GmbH, USA, pureza de 97,0%)
- bifentrina (Riedel-de-Haën, México, pureza de 99,8 %)
- clorprofam (Crescent Chemical CO. Inc, USA, pureza de 99,9%)
- fosalona (Crescent Chemical CO., Inc., USA, pureza 99,0%)
- pirimicarbe (Chem Service,USA, pureza de 98,0%)
- tetradifona (Radian International, Holanda , pureza 99,0 %)
55
6.4. Equipamentos
Evaporador-rotatório (Fisatom 802D), balança analítica (Sartorius BL 2105),
cromatógrafo gasoso modelo 17A acoplado ao espectrômetro de massas QP5050A
da marca Shimadzu com injetor split/splitless, cromatógrafo líquido de alta eficiência
da Shimadzu modelo Prominence, Sistema para SPE vacuum manifold (Varian,
Walnut Creck, CA, EUA).
6.5. Preparação de Amostra de Planta Medicinal
A planta medicinal conhecida popularmente por porangaba de nome científico
Cordia salicifolia é plantada no município de Boquim/SE e adquirida no mercado
municipal Tales Ferraz, BOX 168, da cidade de Aracaju/Sergipe. A porangaba foi
previamente seca para retirar umidade e triturada. Em seguida suas folhas foram
triturados com auxílio de um liquidificador caseiro, peneirados e armazenados num
frasco de vidro previamente limpo, sob refrigeração.
6.6. Condições Cromatográficas para o GC/MS
Cromatógrafo Gasoso da Shimadzu modelo 17A acoplado ao espectrômetro de
massas modelo QP5050A da marca Shimadzu (Kyoto, Japão); Coluna DB5MS - 5%
fenil e 95 % polidimetilsiloxano (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) J & W Scientific (USA).
O gás de arraste foi o He (99,999%) à pressão de 100,1 KPa
.
; Injetor split/splitless
(250ºC); modo splitless; temperatura de interface de 280ºC, Volume injetado 1 µL;
Programação de temperatura: temperatura inicial: 60 ºC (1 min); taxa de
aquecimento de 10 ºC/min até 300 ºC (3 min); O espectrômetro de massas foi
operado com monitoramento de íons selecionados (SIM), no modo de impacto de
elétrons a 70 eV (250ºC); Vazão de 1,6 mL/min; Tempo de corrida de 30 minutos.
56
6.6.1. Condições Cromatográficas para o HPLC-UV
Cromatógrafo líquido de alta eficiência modelo Prominence da marca Shimadzu
com desgaseificador modelo DGU-20A, detector no UV-Visível com arranjo de
fotodiodos modelo SPD-20MA, sistema de bombas reciprocicantes modelo LC-
6AD/7A e CBM-20A, injetor automático modelo SIL-20A.
Coluna C
18
(250 x 4,6 mm) da Microsorb-MV 100-5, da marca Varian. Software
LCSolution. Fase móvel composta por gradiente binário acetonitrila/água e eluição no
modo gradiente como mostra a Tabela 8. Volume de injeção de 20 µL. Varredura de
comprimento de onda na faixa de 200 a 800 nm. Tempo de corrida de 25 minutos.
Vazão da fase móvel de 1ml/min.
Tabela 8. Programação de eluição no modo gradiente em HPLC-UV otimizada
para análise dos pesticidas selecionados no presente trabalho.
Tempo (min) Porcentagem de
acetonitrila
0,01 60
2,00 65
6,00 70
15,00 75
18,00 70
20,00 65
25,00 60
30,00 60
57
6.7 – Preparação das Soluções Padrão dos Pesticidas
As soluções padrão estoque de cada pesticida foram usadas para preparar as
soluções padrão intermediárias e de trabalho e obtenção das curvas analíticas por
diluições apropriadas em diclorometano, por serem solúveis neste solvente orgânico, e
armazenadas a - 4º C. Foram preparadas soluções dos pesticidas acefato, clorprofam,
pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona em níveis diferentes de concentração
para a etapa de fortificação das amostras de porangaba. Também foram preparadas
soluções padrões dos pesticidas no extrato da matriz. As soluções de trabalho foram
utilizadas no prazo máximo de quatro semanas e armazenadas no freezer para
minimizar a degradação.
6.8. Otimização das Condições Cromatográficas por GC/MS.
Primeiramente foram realizadas análises das soluções padrão individuais dos
pesticidas selecionados no presente estudo por GC/MS (modo SCAN) para
obtenção dos tempos de retenção dos pesticidas. Posteriormente foram feitas
injeção das soluções padrão dos pesticidas selecionando seus íons característicos
(modo SIM, Selected Ion Monitoring).
Foram feitas programações de temperatura, a fim de obter uma melhor
separação entre os analitos durante a análise por GC/MS. A seleção dos fragmentos
monitorados e os tempos de retenção dos pesticidas estão relacionados na Tabela
9.
58
Tabela 9 – Tempos de retenção e fragmentos monitorados na quantificação dos
pesticidas.
Pesticidas Tempo de
retenção (min)
Fragmentos
monitorados (m/z)
acefato 5,9 136, 142, 168
clorprofam 14,5 154, 171, 213
pirimicarbe 16,7 166, 238, 152
bifentrina 22,7 165, 181, 322
tetradifona 23,3 227, 356, 362
fosalona 23,6 257, 367, 121
6.8.1. Otimização das Condições Cromatográficas por HPLC-UV.
Foram estabelecidas condições cromatográficas adequadas para identificação e
quantificação dos pesticidas no extrato da planta medicinal. Os padrões dos
pesticidas acefato, chlorpropham, pirimicarbe, bifentrina e tetradifona na
concentração de 5 µg/mL foram injetados individualmente para reconhecimento dos
tempos de retenção e dos espectros no UV-Vis.
A eluição gradiente foi empregada com fase móvel constituída por uma mistura
binária dos solventes acetonitrila/água e coluna do tipo C
18
. A utilização da eluição
gradiente é aplicada com o intuito de aumentar a força de eluição no modo reverso a
fim de diminuir o tempo de análise. A vazão da fase móvel foi de 1 ml/min e o tempo
total de corrida foi de 20 minutos para todos os pesticidas. A Tabela 10 apresenta os
pesticidas analisados por HPLC-UV e seus respectivos tempos de retenção.
59
Tabela 10. Tempos de retenção dos pesticidas analisados por HPLC-UV.
Pesticidas Tempo de
retenção (min)
pirimicarbe 4,4
clorprofam 5,0
tetradifona 5,4
bifentrina 10,4
6.9. Procedimento de Limpeza da Vidraria
Os materiais utilizados no preparo das soluções e durante as extrações foram
enxaguados em água corrente, por três vezes; lavar com solução de Extran a 2%;
enxaguar em água corrente, por três vezes; lavar com água destilada; enxaguar com
acetona; secar com auxílio de uma estufa à 90ºC; cobrir com papel alumínio as
extremidades abertas dos materiais e guardá-los em armários fechados.
6.9.1 Curva Analítica
Preparou-se uma solução estoque para cada pesticida (acefato, clorprofan,
pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona) com concentração de 400 µg/mL em
diclorometano. A partir disto foram preparadas soluções intermediárias com
concentração de 10 µg/mL para reconhecimento dos tempos de retenção dos
pesticidas por GC/MS e HPLC-UV. Para preparação da curva analítica e fortificação
das amostras de porangaba foram preparadas soluções padrão da mistura dos
pesticidas com concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 3,0 e 5,0 µg/mL para GC/MS e
HPLC-UV. Recomendação INMETRO/ANVISA, 2008, cinco pontos para cada
padrão de pesticida.
60
7.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.1. Método de Extração por MSPD
Os métodos analíticos para determinação de resíduos de pesticidas em
diferentes matrizes de uma forma geral estão divididos em dois grupos: os métodos
individuais e os métodos multirresíduos. Os primeiros são aplicados para análise de
um único pesticida ou de seu metabólito mais importante em uma ou várias matrizes e
os métodos multirresíduos são aplicados para análise de vários pesticidas de um
mesmo grupo químico ou de diferentes classes químicas em uma ou várias matrizes
(KRISTENSON, 2004).
O uso de métodos multirresíduos em programas de monitoramento de
alimentos, amostras ambientais e fluidos biológicos é muito freqüente, pelo fato de
possibilitar a otimização do monitoramento de vários pesticidas de diferentes grupos
químicos em uma única extração em diversos tipos de matrizes. Os métodos
multirresíduos além de serem eficientes, apresentam um menor custo com redução do
tempo de trabalho se comparados a métodos individuais (SOLER, 2007).
Neste trabalho foi desenvolvido um método multirresíduo utilizando a
dispersão da matriz em fase sólida como método de extração dos pesticidas acefato,
chlorpropham, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona em extrato de planta
medicinal Cordia salicifolia.
O procedimento de extração desenvolvido consistiu nas seguintes etapas:
• Pesar em vidro de relógio 0,5 g de planta medicinal.
• Pesar em vidro de relógio 0,5 g do adsorvente alumina neutra
,
1,0 g do
adsorvente C
18
e 1,0g do sulfato de sódio anidro.
• Fortificar 0,5 g de Cordia salicifolia com 500 µL de solução dos
pesticidas selecionados e aguardar 30 min.
• Adicionar 0,5 g de alumina neutra à planta medicinal fortificada e
homogeneizar por 3 minutos, tempo suficiente para obtenção de um
material homogêneo adequado para extração.
• Adicionar o Na
2
SO
4
à coluna de MSPD após colocar a lã de vidro na
mesma.
• Transferir o conteúdo do almofariz para a seringa de polietileno
contendo o Na
2
SO
4,
C
18
e a lã de vidro.
61
• Eluir os pesticidas com 30mL do sistema de solvente
(ciclohexano/diclorometano, 3:1, v/v) usando o sistema de vácuo,
ajustando o fluxo para 1 mL/min.
• Recolher o eluato no balão do evaporador-rotatório.
• Evaporar o solvente em evaporador-rotatório (41°C, 100 rpm) até cerca
de 3 mL.
• Concentrar com suave corrente de N
2
até 1,0 mL.
• Analisar por GC/MS ou HPLC-UV.
A Figura 2 apresenta o esquema da coluna MSPD utilizada para extrair os
pesticidas selecionados da matriz de planta medicinal Cordia salicifolia.
FIGURA 2 - Esquema da coluna MSPD para extração dos pesticidas na planta
medicinal Cordia salicifolia.
30 mL de mistura de ciclohexano:DCM (1:3,
v/v)
0,5 g de Cordia salicifolia + 0,5 g de
alumina neutra homogeneizados
1,0 g de sulfato de sódio anidro
Lã de vidro
1,0g de C
18
62
A extração dos pesticidas selecionados para estudo em matriz de planta
medicinal através do uso da dispersão da matriz em fase sólida consistiu em
homogeneizar 0,5 g de Cordia salicifolia com 0,5 g de adsorvente alumina neutra por
3 minutos até se obter uma massa uniforme. É necessário efetuar a transferência do
homogeneizado para a coluna de MSPD preparada previamente com sulfato de
sódio anidro para reter a umidade da amostra e co-coluna C
18
. A preparação da
coluna, com capacidade de 20 mL, foi feita colocando a lã de vidro que serviu como
suporte para o material homogeneizado, adicionando-se em seguida o
homogeneizado amostra/adsorvente.
A eluição dos pesticidas foi otimizada, utilizando-se uma mistura de 30 mL de
ciclohexano:diclorometano (1:3, v/v), passando através do cartucho. O eluato obtido
é concentrado em um evaporador-rotatório, com rotação de 100 rpm e temperatura
de 41ºC. O ajuste do volume do extrato final foi realizado com suave corrente de gás
nitrogênio.
8.0. Resultados dos Valores de Recuperação em Análises por GC/MS/SIM.
8.1. Ensaios para Seleção do Suporte Sólido
Testes preliminares foram realizados para escolha do melhor sistema de
sorvente em duplicata, utilizando ciclohexano como solvente de eluição dos
pesticidas, já que a princípio a utilização deste solvente juntamente com os sistemas
de sorventes utilizados era obtido um cromatograma mais livre de impurezas
características da planta medicinal Cordia salicifolia. Os resultados de recuperação
dos testes com os sorventes alumina, C
18
, sílica e Florisil na extração dos pesticidas
acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona, na planta
medicinal estão apresentados na Figura 5.
63
153,3
132,7
48,5
58,6
206,5
171,3
141,6
101,5
280,4
104,9
80,3
138
440,5
241,1
120,3
155
5,31
173,1
13,3
136,1
21,6
130,9
183,1
86,6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
C18 Florisil sílica alumina
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 3. Ensaios de recuperação para seleção do suporte sólido extração dos
pesticidas com concentração da solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5
µg/g.
Em princípio foi possível notar os elevados valores de recuperação em todos os
ensaios somente quando se faz uso de suporte sólido sem adição de etapa de
limpeza na eliminação de impurezas características da matriz. A alumina neutra por
ser um adsorvente tipicamente anfótero consegue interagir quimicamente de forma
favorável com os pesticidas de classes químicas variadas no processo de dispersão
facilitando no processo de extração.
64
O sorvente Florisil segundo dados da literatura deve ser utilizado com reservas
quando se faz extração de analitos mais polares pelo seu elevado caráter polar,
podendo ocasionar em adsorção irreversível dos pesticidas (LANÇAS, 2004).
Resultados maiores de recuperação foram obtidos quando se fez uso deste
sorvente. Os pesticidas interagiram mais quimicamente com o Florisil, entretanto a
utilização do mesmo facilitou também a extração de outros constituintes oriundos da
porangaba por sua maior capacidade de interação química com grupos polares da
planta como a clorofila (ABHILASH, 2007), resultando em efeito matriz, evidenciado
pelos elevados valores de recuperação nos ensaios como mostra os valores de
recuperação para os pesticidas clorprofam, bifentrina e tetradifona.
O sorvente C
18
, pelo fato de ser sílica modificada com grupos orgânicos, tem
característica apolar facilitando sua interação química com constituintes apolares
provenientes da matriz facilitando desta forma na co-eluição das impurezas da
planta medicinal resultando em elevados valores de recuperação para os pesticidas
acefato, clorprofam, pirimicarbe e bifentrina como mostra a Figura 3, o que dificulta
nos cálculos de quantificação e na identificação dos pesticidas.
Com a utilização da sílica como sorvente, foram obtidos menores valores de
recuperação em relação à utilização de C
18
e Florisil. A sílica possui propriedades
mais polares em relação aos outros sorventes utilizados interagindo com mais
facilidade com pesticidas mais polares. Dado a característica mais polar dos
pesticidas em estudo, o solvente ciclohexano utilizado nesta ocasião, não foi
eficiente na eluição dos pesticidas em ensaios com sílica como suporte sólido. É
preciso se considerar a baixa força eluotrópica do ciclohexano em sílica, o que
justifica os baixos valores de recuperação para o acefato e tetradifona, obtidos
nestes ensaios em relação à utilização dos outros sorventes.
De acordo com os dados mostrados na Figura 3, é possível verificar que os
ensaios realizados apresentaram resultados com valores de recuperação acima de
120%. De acordo com a literatura, valores aceitáveis para matrizes complexas estão
na faixa de 50-120% (LOPEZ, 2008). É conveniente, portanto, a adição no
procedimento de uma etapa de limpeza na tentativa de minimizar a quantidade de
impurezas típicas de matrizes complexas como alimentos, plantas, águas, fluidos
biológicos. (KRINTENSON, 2008) que interferem na identificação e quantificação
dos pesticidas (POOLE, 2007).
65
8.2. Ensaios para Seleção de Co-sorvente
É possível verificar que o uso de sílica como sorvente na etapa de limpeza
permitiu a obtenção de valores de recuperação menores quando comparado com
outros sorventes, como é possível perceber os baixos valores de recuperação para
os pesticidas pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona quando foi utilizado
Florisil como suporte sólido. Como os pesticidas selecionados apresentam
características polares a moderadamente polares estes provavelmente estariam
sendo retidos nos grupos silanóis da sílica, pela afinidade química destes grupos de
substâncias com os grupos silanóis, como mostra os resultados da Figura 4, para os
pesticidas bifentrina, tetradifona e fosalona quando do uso dos suportes sólidos C
18
e Florisil. Evidencia-se também que a sílica na função de co-sorvente retém também
impurezas de características polares provenientes da planta medicinal pelos baixos
valores de recuperação obtidos de uma forma geral.
61
27,6
25,1
52,7
18,6
9,85
13,9
7,5
62,9
12,3
9,33
7,33
1,34
1,61
30,7
1,06
1,31
13,1
0
10
20
30
40
50
60
70
C18/sílica Florisil/sílica alumina/sílica
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 4. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-sorvente,
utilizando o ciclohexano como solvente de eluição com concentração da solução
padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
66
Com a utilização do sorvente C
18
como co-sorvente foi possível se observar
menores valores de recuperação como 25,4; 30,9 e 31,1%, para os pesticidas
pirimicarbe, bifentrina e fosalona respectivamente, quando foi feito uso de sílica
como suporte sólido e os valores de 1,86, 21,1 e 31,3% para os pesticidas fosalona,
tetradifona e bifentrina respectivamente pela utilização de Florisil como suporte
sólido, resultados estes que podem ser justificados pela retenção de impurezas com
propriedade polares provenientes da porangaba, já que o adsorvente C
18
possui
grupos silanóis residuais que realizam a adsorção de compostos polares e apolares
pela característica tipicamente polar do C
18
,
como mostra os resultados na Figura 5.
A presença dos grupos silanóis residuais do C
18
poderá ter adsorvido alguma
quantidade dos pesticidas como a bifentrina, tetradifona e fosalona quando se
utilizou Florisil como suporte sólido e dos pesticidas pirimicarbe, bifentrina e fosalona
quando foi feito uso de sílica como suporte sólido, pelos menores valores de
recuperação mostrados na Figura 5.
Nos ensaios pelo qual se utilizou alumina como suporte sólido com C
18
como co-
sorvente foi possível perceber resultados de recuperação numa faixa mediana entre
42,9 e 71,8%, pela baixa força eluotrópica do solvente ciclohexano. Os resultados
mais satisfatórios quando foi utilizado alumina neutra como suporte sólido pode ser
atribuído a maior versatilidade deste sorvente em interagir de maneira mais
universal com os pesticidas de características químicas variadas e possivelmente à
adição da etapa de limpeza do sorvente C
18
, na retenção de impurezas provenientes
da porangaba. Os baixos valores de recuperação foram obtidos quando foi utilizado
sílica e Florisil como suportes sólidos. Pode-se observar efeito matriz na extração do
pesticida clorprofan em ensaios que fizeram uso de Florisil como suporte sólido e
C
18
como co-sorvente, o que ocorre quando alguma impureza de característica
química semelhante ao analito ser extraído juntamente no processo de extração
(POOLE, 2007). Resultados com valores de recuperação pela utilização de C
18
como co-sorvente podem ser verificados na Figura 5.
67
63,1
116,4
47,1
209,9
56,6
42,9
80,2
25,4
57,4
31,3
30,9
58,7
21,1
76,1
71,8
1,86
31,1
51,6
0
50
100
150
200
250
Florisil/C18 sílica/C18 alumina/C18
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 5. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-sorvente,
utilizando o ciclohexano como solvente de eluição e concentração da solução
padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
O Florisil não foi discutido ainda na literatura como sorvente para extração de
pesticidas em planta medicinal, no entanto resultados de recuperação satisfatórios
foram obtidos quando este foi utilizado no processo de extração como co-sorvente
para os pesticidas clorprofam, pirimicarbe, bifentrina e tetradifona. O sorvente C
18
foi
eficiente no processo de dispersão dos pesticidas e o co-sorvente Florisil teve a
função de reter impurezas polares da porangaba como clorofilas, (ABHILASH,
2007), permitindo a eluição dos pesticidas. Resultados satisfatórios também podem
ser observados em ensaios que foi utilizado Florisil como suporte sólido e ao mesmo
tempo como co-sorvente na retenção de impurezas da planta, pelos bons valores de
recuperação para os pesticidas clorprofam, bifentrina e tetradifona, como mostra os
resultados na Figura 6.
68
Ensaios que fazem uso de sílica como suporte sólido não apresentaram valores
satisfatórios de recuperação, pela natureza polar da sílica na retenção dos
pesticidas, como mostra os menores valores de recuperação na Figura 6.
62,8
45,6
34,1
68,5
116,8
241,7
36,4
97,2
82,3
90,4
52,6
65,1
94,3
74,9
102,6
61,1
64,6
104,3
6,6
7,31
56,1
31,6
71,6
3,31
0
50
100
150
200
250
300
C18/Florisil Florisil/Florisil sílica/Florisil alumina/Florisil
Recupewração Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 6. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-coluna,
utilizando o ciclohexano como solvente de eluição com concentração da solução
padrão de fortificação de 0,5 µg/g.
Foi possível verificar valores de recuperação bastante elevados para os
pesticidas quando se utilizou alumina neutra como co-sorvente como, por exemplo,
os pesticidas acefato, clorprofam, tetradifona e fosalona em quase todos os ensaios
realizados. A partir disto é possível concluir que apesar de apresentar caráter
anfótero, o uso da alumina neutra não foi adequado para a retenção de impurezas
da porangaba como mostram os resultados de recuperação da Figura 7.
69
183,4
339,1
121,1
55,8
51,2
103,6
69,5
189,8
33,1
57,3
105,1
74,4
50,9
74,4
105,1
162,5
125,1
63,8
186,1
183,1
331,6
51,6
183,1
101,6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
C18/alumina Florisil/ alumina sílica/ alumina alumina/ alumina
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 7. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a co-sorvente,
utilizando o ciclohexano como solvente de eluição com concentração da solução
padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
70
8.3. Ensaios para Seleção de Solventes de Eluição dos Pesticidas.
O ensaio de MSPD selecionado para testes de seleção de solvente de eluição foi
o sistema alumina como suporte sólido e C
18
como co-sorvente.
Com o objetivo de se obter um extrato de Cordia salicifolia mais limpo com
menor presença de impurezas, foram realizados ensaios com os solventes acetato
de etila, diclorometano, ciclohexano, n-hexano e acetato de etila. Devido à baixa
força eluotrópica do solvente ciclohexano nos sorventes testados nos ensaios de
MSPD, foram obtidos cromatogramas relativamente livres de impurezas
características da Cordia salicifolia em relação aos outros solventes utilizados como
o n-hexano e acetato de etila.
O extrato de Cordia salicifolia com ciclohexano, alumina como suporte sólido e
C
18
como co-sorvente está mostrado no cromatograma da Figura 8.
Figura 8. Cromatograma obtido do GC/MS (no modo SCAN) do extrato de Cordia
salicifolia com solvente ciclohexano. Para condições cromatográficas de análise ver
item 6.8.
Os testes com acetato de etila juntamente com os sorventes citados
anteriormente na tentativa de reter impurezas provenientes da porangaba não foram
tão satisfatórios em relação à utilização do ciclohexano como mostra o
cromatograma da Figura 9, com alguns picos relativos aos constituintes químicos
presentes na porangaba.
71
Figura 9. Cromatograma obtido no GC/MS (Modo SCAN) do extrato de Cordia
salicifolia com solvente acetato de etila. Para condições cromatográficas de análise
ver item 6.8.
A utilização do ciclohexano não foi conveniente para eluição dos pesticidas,
pelos baixos valores de recuperação obtidos naqueles ensaios. Isto posto, no
propósito de se obter maiores valores de recuperação dos pesticidas no extrato de
porangaba, foram realizados ensaios com mistura de solventes para aumentar a
força eluotrópica e desta maneira maximizar a extração dos pesticidas no processo
de MSPD. Os ensaios realizados com misturas de solventes estão mostrados na
Figura 10.
75,9
69,4
105,3
56,1
113,1
57,3
49,1
53
190,4
221,7
103,6
134,8
262,3
125,8
142,4
56,1
102,3
161,6
0
50
100
150
200
250
300
ciclohexano/clorofórmio ciclohexano/diclorometano ciclohexano/acetato de etila
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 10. Ensaios de recuperação para seleção do sistema de solventes (1:1,
v/v) de eluição, utilizando alumina como suporte sólido e C
18
como co-sorvente, com
concentração da solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
72
Em termos gerais foi possível perceber a mudança dos valores de recuperação
quando da utilização de misturas do ciclohexano com solventes de maior força de
eluição como diclorometano e clorofórmio. Bons valores de recuperação podem ser
observados para todos os pesticidas com o uso da mistura de solventes
ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v). Foi verificado efeito matriz para os pesticidas
acefato, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona e fosalona com a mistura
ciclohexano/acetato de etila (1:1, v/v).
8.4. Ensaios para Seleção do Volume de Solventes
O sistema ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v), foi selecionado para testes de
volume e proporção da mistura dos mesmos na otimização da extração dos
pesticidas. Foi possível verificar a partir dos resultados de recuperação mostrados na
Figura 16 que quando se utilizou 40 mL de mistura de solventes
ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v), foram obtidos resultados de recuperação
bastantes elevados, exceto para o pesticida acefato. O volume de 30 mL foi suficiente
para obtenção de bons valores de recuperação, principalmente para os pesticidas
chlorpropham, tetradifona e fosalona como mostrado na Figura 11.
73
56,3
60,5
59,2
100,9
110,9
142,6
77,9
47,8
121,1
94,8
116,3
145,3
63,3
100,7
102,1
81,1
89,5
160,4
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Ciclohexano/DCM 20mL Ciclohexano/DCM 30mL Ciclohexano/DCM 40mL
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 11. Ensaios de recuperação para seleção do volume da mistura e
solventes ciclohexano/diclorometano (1:1, v/v) utilizando alumina como suporte
sólido e C
18
como co-sorvente, com concentração da solução padrão de fortificação
de pesticidas de 0,5 µg/g.
8.5. Ensaios para Seleção da Proporção de Solventes
Testes de proporção do sistema de solventes ciclohexano/diclorometano foram
realizados nas proporções (1:1, 1:2, 1:3, v/v) no volume de 30 mL, com resultados
de recuperação favoráveis com a proporção (1:3, v/v). A mistura com o solvente
diclorometano de fato favoreceu na extração dos pesticidas de características
relativamente polares do que quando se compara estes dados com os valores de
recuperação quando se fazia uso apenas do ciclohexano como solvente de eluição.
Bons valores de recuperação podem ser verificados na Figura 12 para os pesticidas
acefato, clorprofam, bifentrina e fosalona.
74
56,3
44,8
91,9
100,9
142,3
116,4
77,9
70,1
121,4
94,8
153,5
103,3
63,3
63,6
133,1
81,1
89,1
79,5
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Ciclohexano/DCM (1:1, v/v) Ciclohexano/DCM (1:2, v/v) Ciclohexano/DCM (1:3, v/v)
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 12. Ensaios de recuperação para seleção da proporção da mistura de
solventes ciclohexano/diclorometano no volume de 30 mL, utilizando alumina como
suporte sólido e C
18
como co-sorvente, com concentração da solução padrão de
fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
8.6. Ensaios para Seleção da Proporção Matriz/Suporte Sólido
Foram feitos testes de recuperação variando-se a proporção matriz/adsorvente
(1:1, 2:1 e 1:2, m/m), na tentativa de se obter melhores valores de recuperação para
os pesticidas em extrato de porangaba. A melhor proporção matriz/adsorvente foi
(1:1, m/m), com 0,5 g de porangaba e 0,5 g de alumina como mostra os dados da
Figura 13.
75
56,3
60,5
141,3
100,9
110,9
93,1
77,9
47,8
156,9
94,8
116,3
123,1
63,3
100,7
98,1
81,1
89,5
113,1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
planta/alumina 1:1 (m/m) planta/alumina 2:1 (m/m) planta/alumina 1:2 (m/m)
Recuperação Média (%)
acefato clorprofam pirimicarbe bifentrina tetradifona fosalona
Figura 13. Ensaios de recuperação dos pesticidas para selecionar a proporção
(planta medicinal:alumina, m/m), utilizando o 30 mL da mistura dos solventes
ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), com C
18
como co-sorvente, com concentração
da solução padrão de fortificação de pesticidas de 0,5 µg/g.
Foi verificado efeito matriz em ensaios com proporção matriz/adsorvente (2:1,
m/m) quando se fez uso de maior massa de planta, 1,0 g, e pouca massa de
alumina, 0,5 g, no processo de homogeneização resultando em maiores valores de
recuperação como mostra os resultados da Figura 15, que pode ser resultado da
pouca quantidade de sorvente para romper a estruturas moleculares de uma maior
massa da matriz adicionada no processo de homogeneização, aumentando a
quantidade de impurezas provenientes da porangaba.
Valores de recuperação mais satisfatórios foram obtidos com proporção
matriz/adsorvente (1:1, m/m) com 0,5g de planta medicinal e 0,5 de alumina neutra.
Além do mais é importante se destacar nestes ensaios a menor manipulação de
amostra e reagentes na preparação da amostra para estudos de recuperação.
76
De acordo com os resultados apresentados anteriormente, pode-se concluir que
o sistema alumina/C
18,
foi selecionado de maneira favorável para obtenção de
resultados de recuperação mais satisfatórios em extrato de Cordia salicifolia,
destacando-se a eficiência da fase C
18
como co-coluna na retenção de impurezas
provenientes da planta medicinal.
A utilização de etapa de limpeza na coluna de MSPD tem se mostrado muito útil
em alguns trabalhos na retenção de substâncias endógenas (KRISTENSON, 2006).
A mistura de solventes selecionada ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), foi
satisfatória na eluição dos pesticidas pelo ajuste da força eluotrópica da mistura de
solventes obtendo-se valores de recuperação satisfatórios dos pesticidas.
A adição da etapa de limpeza com co-coluna C
18
foi fundamental para retenção
de impurezas provenientes da porangaba, resultando em valores de recuperação
razoáveis levando-se em consideração a complexidade da amostra, minimizando o
efeito matriz. A alumina neutra já havia sido utilizada por ZUIN, 2003, em amostras
de folhas de maracujá, Passiflora. L, com 1 g de amostra e utilização de sulfato de
sódio anidro e Florisil na extração dos pesticidas clorotalonil, hexaclorobenzeno, α-
endosulfan, β-endosulfan, tetradifona e lindano nos níveis de concentração de 0,05;
0,1 e 0,3 µg/g, utilizando GC-ECD para comparar a eficiência do método de extração
por MSPD frente ao da Farmacopoeia Européia.
Os testes de fortificação na porangaba foram realizados em três níveis
diferentes de concentração, sendo que, como não existe limite máximo aceitável
para a planta medicinal Cordia salicifolia propriamente dita, os valores de fortificação
foram selecionados com base no limite de detecção dos equipamentos utilizados
(GC/MS/SIM e HPLC-UV) para determinação dos pesticidas na matriz em estudo.
77
8.7. EFEITO MATRIZ
A validação de método é um processo para demonstrar se o método de ensaio é
capaz de produzir resultados confiáveis para a finalidade a que se destina. Para
alcançar este objetivo é necessária a verificação de alguns parâmetros de
desempenho como, por exemplo, a seletividade. O efeito da resposta cromatográfica
acentuada e induzida pela matriz ou efeito matriz é um fator avaliado de grande
magnitude neste parâmetro já que pode afetar acentuadamente as concentrações da
amostra (HAJSLOVÁ, 1998).
Constituintes da matriz que co-eluem com princípios ativos de interesse para
quantificação, resultam em alargamento da banda cromatográfica e acentuam o
valor da concentração do analito, pela mesma afinidade e competição pelos sítios
ativos da coluna do equipamento interferindo na análise do composto de interesse.
Embora os métodos de análise multirresíduos representem formas efetivas de
quantificar uma variedade de pesticidas em alimentos, águas, solos, vegetais como
plantas medicinais ou mesmo fluidos biológicos os valores percentuais de
recuperação para os analitos nem sempre são satisfatórias, por apresentarem,
muitas vezes, porcentagens de extração acima de 100% e, ainda, elevados desvios
nas análises. Estes resultados estão relacionados com os efeitos matriz que
ocorrem durante a análise cromatográfica (HAJSLOVÁ, 1998. Este efeito matriz foi
descrito primeiramente por ERNEY e colaboradores, 1993, que observaram durante
a análise de amostras naturais, a co-extração de vários componentes oriundos da
própria matriz, além dos compostos de interesse, os quais provocavam modificações
na resposta dos pesticidas estudados.
A interferência dos componentes da matriz ocorre porque a curva analítica
utilizada para quantificar os pesticidas, geralmente, é preparada em solvente puro.
Já nas análises dos extratos obtidos por um método de extração adequado, além de
apresentar os pesticidas, contém uma variedade de constituintes provenientes da
matriz que são co-extraídos. Estes compostos interferem durante uma análise
cromatográfica, pois influenciam na quantidade de pesticidas que é transferido para
a coluna. Esta interferência dos componentes da matriz, na quantificação dos
pesticidas depois da análise cromatográfica, é denominada de efeito matriz
(GONZALEZ, 2002).
78
O efeito matriz pode ocorrer em diversas partes do sistema cromatográfico como:
injetor, coluna ou detector. O liner do injetor, um tubo de vidro, é o principal
responsável pelo efeito de matriz, pois os sítios ativos deste material podem
adsorver ou induzir a degradação térmica de alguns analitos. Quando as soluções
padrão são preparadas no solvente puro e analisadas por cromatografia mais sítios
ativos do liner estarão disponíveis para interagir com os pesticidas. Entretanto
quando a análise é feita no próprio extrato da matriz, os pesticidas estarão na
presença de componente da própria matriz, ocorrendo assim uma competição pelos
sítios ativos. Dependendo das características dos analitos e da amostra, os
componentes da matriz podem ser absorvidos pelo liner e uma maior quantidade de
pesticidas serão introduzidos na coluna cromatográfica, resultando numa maior
resposta para os pesticidas quando comparado com a resposta deste em solvente
puro (HAJSLOVÁ, 2003).
HAJSLOVÁ, 2003, fez análise do pesticida captan em extratos de laranja. Este
pesticida quando preparado em tolueno puro, não havia sido detectado pelo detector
por captura de elétrons, muito provavelmente devido a decomposição ou interação
deste com os sítios ativos do liner. Depois de várias injeções de amostra de extratos
de laranja em que foi se acumulando componentes da matriz no sistema
cromatográfico o pico de captan foi devidamente quantificado, embora a
repetibilidade das análises tenham sido baixas.
Normalmente, para corrigir estes erros nos valores de recuperação, a curva
analítica preparada substituindo o solvente puro por extratos da matriz insenta do
analito, durante a diluição das soluções padrões nas diversas concentrações
(RIBANI, 2004). Muitos pesticidas têm apresentado estabilidade quando preparados
no extrato da matriz.
KOCOUREK, 1998, observaram a degradação de pesticidas organofosforados
apenas quando se elevava a temperatura de armazenamento dos padrões, caso
contrário, quando os padrões eram preparados no extrato da matriz e armazenados
em baixas temperaturas, estes se tornavam mais estáveis que os padrões
preparados em solventes puros.
79
Outra forma de minimizar o efeito matriz é quando se faz uso de injeção on-
columm, para evitar a presença de sítios ativos do sistema de injeção, ou freqüentes
mudanças do liner do injetor. Pode-se também utilizar o método de adição de
padrão na própria matriz, ou ainda etapas de clean-up dos extratos para minimizar a
co-extração de constituintes indesejáveis na análise (POOLE, 2007; MASTOVSKÁ,
2004). Entretanto a adição de etapas de limpeza resulta em aumento no tempo de
análise e baixos valores de recuperação caso o constituinte a ser analise tenha
afinidade pelo adsorvente de limpeza ou co-coluna da etapa clean-up no processo
de extração (POOLE, 2007).
Outra alternativa é a adição de substâncias químicas similares aos componentes
da matriz nos padrões preparados em solventes puros, para ocupar os sítios ativos
do liner, impedindo a adsorção ou degradação dos pesticidas. Tais substâncias ditas
como protetoras como o óleo de oliva (ou produtos de degradação destes) tem
maior facilidade de realizar ligações de hidrogênio do que os pesticidas com os
grupos silanóis do liner. Desta maneira estes compostos mascaram os sítios ativos e
proporcionam maior transferência dos pesticidas para a coluna cromatográfica
(POOLE, 2007). A intensidade do efeito da matriz pode variar de uma amostra para
outra, ou de acordo com a concentração do analito na matriz. HAJLSLOVÁ e
colaboradores, 2003, verificaram que quanto menor a concentração do analito na
amostra, maior será o efeito da matriz.
8.8. Resultados dos Valores de Recuperação em Análises por HPLC-UV
Para testes de comparação entre as análises por GC/MS/SIM e HPLC-UV foi
selecionado o sistema de MSPD constituído pelos sorventes alumina como suporte
sólido e C
18
como co-sorvente com proporção porangaba/alumina (1:1, m/m) e
mistura de 30 mL dos solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v). Os resultados
de recuperação foram considerados satisfatórios pela utilização deste sistema de
MSPD.
80
Não foi obtida resposta cromatográfica por HPLC-UV do pesticida acefato em
coluna C
18
com gradiente binário acetonitrila/água com uso de detector no UV-Vis,
pela menor sensibilidade deste nos comprimentos de ondas selecionados na faixa
de 220 a 800 nm. Os cálculos de recuperação foram feitos para os pesticidas
pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina com valores de recuperação variando
de 59,4 a 108,6% como mostra a Figura 14.
78,9
74,3
75
97
98,9
59,4
95,9
105,6
77,2
108,6
92,9
65,3
0
20
40
60
80
100
120
1µg/g 0,5µg/g 0,3µg/g
Recuperação Média (%)
pirimicarbe clorprofam tetradifona bifentrina
Figura 14. Ensaios de recuperação por MSPD com sistema alumina/planta
medicinal (1:1, m/m) e co-sorvente C
18
, com volume de 30 mL de mistura de
solventes ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v) e análise por HPLC-UV com
concentrações da solução padrão de fortificação dos pesticidas de 0,3; 0,5 e
1,0µg/g.
81
A técnica de GC/MS/SIM se mostrou mais adequada para quantificação de todos
os pesticidas em extrato de porangaba pela característica universal do
espectrofotômetro de massas acoplado ao cromatógrafo a gás, destacando-se a
eficiência do método de extração por MSPD; No entanto com a utilização da técnica
de HPLC-UV foi obtido menor tempo de análise pela aplicação de eluição gradiente.
Em termos gerais as duas técnicas cromatográficas foram adequadas para cálculos
de quantificação dos pesticidas destacando de forma satisfatória os valores de
recuperação obtidos.
8.9. Validação do método
O desenvolvimento de um método analítico envolve um processo de avaliação
que estime sua eficiência na rotina do laboratório, demonstrando que o mesmo é
adequado para o propósito para o qual foi desenvolvido (LANÇAS, 2004). Este
processo de avaliação é chamado de validação. Um método será considerado validado se
suas características estiverem em conformidade com os pré-requisitos exigidos por
literaturas de referência na área.
Algumas definições de validação são citadas a seguir.
Segundo a ANVISA, a validação deve garantir, através de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados. Validação é o ato ou efeito de validar,
dar validade, tornar válido, tornar legítimo ou legal. Visa a diminuir ou controlar os
fatores que levam à imprecisão ou inexatidão de um dado gerado (LANÇAS, 2004).
A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso
rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma
evidência documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para
fazer” (RIBANI, 2004).
Validar, em análise química, é estar com o objetivo voltado para a
confiabilidade analítica do laboratório e do método escolhido ou desenvolvido para se
obter o resultado (LEITE, 1998). Em análise de resíduos de pesticidas, a validação do
método de ensaio ocorre, usualmente, por meio de ensaios de recuperações
intralaboratorial, ou seja, no próprio laboratório onde se deseja validar o método.
82
Os principais parâmetros a serem estudados durante o processo analítico de
validação do método (LANÇAS, 2004
)
são:
a) Especificidade: capacidade de medir o analito “livre de interferências”;
b) Seletividade: capacidade de medir com exatidão e sem interferentes,
vários analitos em uma mistura;
c) Linearidade: capacidade de fornecer resultado proporcional à
concentração do padrão, em uma faixa de trabalho apropriada;
d) Sensibilidade: capacidade de registrar pequenas variações ou inclinações
da curva analítica provocadas pelo efeito da matriz;
e) Faixa de trabalho: intervalo de concentração entre o limite inferior e
superior dos padrões analisados;
f) Limite de detecção (LOD): capacidade do método em fornecer resultados
no nível mais baixo detectável qualitativamente, mas não
quantitativamente;
g) Limite de quantificação (LOQ): capacidade do método em fornecer
resultados no nível mais baixo detectável de forma precisa e exata,
qualitativa e quantitativamente;
h) Exatidão: capacidade de dar resultados próximos ao valor real verdadeiro;
i) Precisão: capacidade de dar resultados com a menor variabilidade em
relação à repetitividade (intralaboratorial) e reprodutibilidade
(interlaboratorial), de resultados analisados de uma mesma amostra;
j) Incerteza de medição: capacidade de dar resultados com a dispersão dos
valores que podem ser atribuídos razoavelmente ao mensurando.
83
Os parâmetros contemplados neste trabalho para a validação do método
analítico desenvolvido foram: exatidão (em termos de recuperação), precisão (em
termos do coeficiente de variação), linearidade (em termos de coeficiente de
correlação da curva analítica para uma dada faixa de concentração), sensibilidade
(em termos de limite de detecção e limite de quantificação).
EXATIDÃO
Os parâmetros exatidão e precisão são considerados os mais relevantes
porque permitem estimar os erros e as variações embutidos no resultado analítico.
Através dos termos exatidão e precisão a química desenvolve todo o potencial
analítico para emitir um resultado analítico (LEITE, 1998).
Exatidão expressa a concordância entre o valor encontrado e o valor aceito
como verdadeiro ou aceito como referência (LANÇAS, 2004). O ensaio de
recuperação constitui o método mais utilizado para validação de processos analíticos.
A recuperação está relacionada com a exatidão, pois reflete a quantidade de
determinado analito, recuperado no processo, em relação à quantidade real presente
na amostra. A exatidão é expressa como erro sistemático percentual, inerente ao
processo (perda da substância devido à baixa recuperação da extração, medidas
volumétricas imprecisas ou substâncias interferentes na amostra, entre outros)
(LEITE, 1998).
A recuperação é determinada pela relação:
Recuperação (%) = [valor obtido / valor adicionado] x 100
Estes estudos são efetuados adicionando-se soluções do padrão analítico de
interesse de concentração conhecida à matriz isenta do analito (usualmente
denominada testemunha). Efetuam-se as operações necessárias à recuperação do
analito (por exemplo, extração, purificação, concentração, etc.), e o valor do analito é,
então, determinado. Empregando-se esses valores na equação anterior, encontra-se
a recuperação, ou seja, quando do analito adicionado foi determinado no método
(LANÇAS, 2004).
84
As fortificações (adição de soluções com diferentes concentrações do analito
de interesse) na amostra de planta medicinal Cordia salicifolia, foram efetuadas em
três níveis nas concentrações de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g em uma série de sete replicatas
para cada nível. As recuperações dos pesticidas em amostras fortificadas de Cordia
salicifolia, nas concentrações de 0,3; 0,5 e 1,0 µg/g variaram de 58 a 130%, com
precisão variando de 5,24 a 29,7% para análises no GC/MS/SIM e valores de
recuperação na faixa de 59 a 108% com coeficientes de variação na faixa de 0,65 a
15,1% nos níveis de concentração de 0,3; 0,5 e 1,0µg/g para análises no HPLC-UV.
O método desenvolvido por MSPD e GC/MS/SIM apresentou valores
satisfatórios de recuperação na concentração de 0,5 µg/g. Os valores de
coeficientes de variação mais baixos são estabelecidos na concentração de 0,5
µg/g, dado a boa precisão em ensaios realizados nesta concentração. Resultados
de recuperação na faixa de 50 a 120% são aceitáveis para metodologias de
matrizes complexas (RIBANI, 2004), dentro da faixa de recuperação obtida nos
resultados mostrados nas Tabelas 11 e12.
Tabela 11. Valores de recuperarão média dos pesticidas e coeficientes de
variação no extrato de planta medicinal Cordia salicifolia por MSPD e GC/MS/SIM.
Pesticidas
Fortificação
(µg/g)
Recuperação
média (%)
CV* (%)
acefato 0,5
0,3
1,0
68 ±11,7
86 ±15,9
63 ±11,8
12,1
29,7
15,8
clorprofam 0,5
0,3
1,0
113 ±11,7
116 ±17,3
130 ±17,5
8,67
10,6
11,3
pirimicarbe 0,5
0,3
1,0
98 ±14,3
118 ±20,6
81 ±7,54
12,2
12,4
7,8
bifentrina 0,5
0,3
1,0
99 ±19,4
95 ±24,7
84 ±6,36
16,4
26,0
6,6
tetradifona 0,5
0,3
1,0
104 ±6,47
109 ±26,9
82 ±10,8
5,2
24,1
11,0
fosalona 0,5
0,3
1,0
68 ±11,7
105 ±20,8
59 ±11,0
14,5
19,7
15,9
85
Tabela 12. Valores de recuperação média dos pesticidas e coeficientes de
variação no extrato de planta medicinal Cordia salicifolia por MSPD e HPLC-UV.
Pesticidas
Fortificação
(µg/g)
Recuperação
média (%)
CV* (%)
pirimicarbe 0,5
0,3
1,0
74 ±1,61
75 ±12,5
79 ±15,6
1,2
9,1
8,9
clorprofam 0,5
0,3
1,0
99 ±12,9
59 ±9,24
97 ±19,0
7,2
8,6
10,8
tetradifona 0,5
0,3
1,0
105 ±11,9
77±0,90
96±10,6
6,2
0,6
13,0
bifentrina 0,5
0,3
1,0
93 ±10,5
65 ±5,52
108 ±2,08
15,1
4,6
1,0
CV*: Coeficiente de variação.
PRECISÃO
A precisão é a expressão da concordância entre vários resultados analítica
obtidos para uma mesma amostra (LANÇAS, 2004). Pode ser determinada em
condições de repetibilidade ou reprodutibilidade. A repetitividade representa a
concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo método,
efetuadas sob as mesmas condições de medição, chamadas de repetitividade:
mesmo procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento usado sob as mesmas
condições; mesmo local; repetições em um curto intervalo de tempo (RIBANI, 2004).
Reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados das medições
de uma mesma amostra, efetuadas sob condições variadas (mudança de operador,
local, equipamentos, etc) (RIBANI, 2004). Precisão é um termo geral para avaliar a
dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma
amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas (INMETRO,
2003).
86
Segundo LANÇAS, 2004, o parâmetro que avalia a proximidade entre várias
medidas efetuadas na mesma amostra é a precisão do processo analítico.
Usualmente, é expressa como desvio-padrão, variância ou coeficiente de variação de
diversas medidas.
Precisão representa a dispersão dos resultados entre ensaios independentes,
repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições
definidas (RIBANI, 2004). Em validação de métodos, o número de determinações é
geralmente pequeno e o que se calcula é a estimativa do desvio padrão absoluto (s).
onde x é a média aritmética de um número de medições (média das determinações),
sendo uma estimativa de µ, a média verdadeira (média da população); x
i
é o valor
individual de uma medição e n é o número de medições.
A precisão também pode ser expressa através do intervalo de confiança da
média, que é uma faixa de valores no qual existe uma determinada probabilidade de
se encontrar um certo valor de uma variável (RIBANI, 2004), calculada pela equação:
Intervalo de confiança da média = x ± t
n-1
s/
onde x é a média aritmética das medidas, s é o desvio padrão das medidas em
replicata (n = 4), t
n-1
é o valor crítico da distribuição de Student com n-1
graus de liberdade ( 95% de confiança).
Outra expressão de precisão é através da estimativa do desvio padrão relativo
(RSD), também conhecido como coeficiente de variação (CV).
87
A repetividade do método foi determinada pelos coeficientes de variação
(CV%) das recuperações dos pesticidas conduzidos em cada nível fortificado (n =5),
usando a seguinte fórmula:
CV% = s.x/100
Onde:
s = desvio padrão das quatro recuperações conduzidas em cada nível.
x = média das recuperações em cada nível.
Os coeficientes de variação para cálculos de recuperação no presente estudo
variaram de 6,2 a 29,7% para análises realizadas em GC/MS e de 0,6 a 10,8% para
análises em HPLC-UV.
8.9.1. Estudo de Recuperação do Método
O método desenvolvido por MSPD e HPLC-UV apresentou valores satisfatórios
de recuperação nas concentrações de 0,5 e 1,0 µg/g. Os valores de coeficientes de
variação foram consideravelmente menores em relação às analises realizadas por
GC/MS/SIM, porém valores mais elevados de CV podem ser verificados para o
pesticida tetradifona no nível de concentração de 1,0 µg/g e bifentrina no nível de
concentração de 0,5 µg/g. Coeficientes de variação maiores do que 20% podem ser
observados para ensaios de recuperação no menor nível de concentração pela
maior interferência de constituintes da matriz na eluição juntamente com os
pesticidas em MSPD, afetando na precisão do método (POOLE, 2007).
Os cromatogramas da solução padrão dos pesticidas na concentração de 1,0
µg/g, em solvente diclorometano e do extrato de Cordia salicifolia fortificado com
solução padrão de pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina, tetradifona
e fosalona no nível de concentração de 0,5 µg/g estão mostrados nas Figuras 17 e
18 respectivamente para análises realizadas no GC/MS/SIM.
88
Figura 17. Cromatograma obtido por GC/MS, da solução padrão de pesticidas em
diclorometano. 1 – acefato, 2 – clorprofam, 3 – pirimicarbe, 4 – cloropirifós, 5 –
bifentrina, 6 – tetradifona, 7 – fosalona na concentração de 1 µg/g. Para condições
cromatográficas de análise ver item 6.8.
Figura 18. Cromatograma obtido por GC/MS, no modo SIM, com extrato obtido de
Cordia salicifolia, utilizando C
18
como co-coluna e alumina como suporte sólido na
proporção (1:1, m/m), com eluição em MSPD feita com 30 mL de mistura
ciclohexano/diclorometano (1:3, v/v), com concentração de solução padrão dos
pesticidas de 0,5 µg/g. 1 – acefato, 2 – clorprofam, 3 – pirimicarbe, 4 – bifentrina, 5 –
tetradifona, 6 – fosalona. Para condições cromatográficas de análise ver item 6.8.
89
Os cromatogramas da solução padrão dos pesticidas na concentração de 1,0
µg/g em solvente acetonitrila e do extrato de Cordia salicifolia fortificado com
solução padrão de pesticidas pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina na
concentração de 0,3 µg/g estão mostrados na Figura 19 para análises realizadas no
HPLC-UV.
Figura 19. Cromatograma obtido por HPLC-UV no comprimento de onda de 254 nm
de solução padrão de pesticidas com concentração de 1,0 µg/g em acetonitrila.
pirimicarbe, 4,4 min; clorprofam, 5,1 min; tetradifona, 5,5 min; bifentrina, 10,4 min,
Para condições cromatográficas de análise ver item 6.8.1.
8.9.2. Linearidade
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração da substância em questão, dentro de uma
dada faixa de aplicação (RIBANI, 2004). A faixa linear de cada analito foi
determinada a partir de um conjunto de medições experimentais, usando o método
matemático da regressão linear, obtendo-se o coeficiente de correlação r. A
Agência Nacional de Vigilância Sanitária recomenda um coeficiente de correlação
igual a 0,99 como uma evidência de um ajuste ideal dos resultados para a linha de
regressão (ANVISA, 2008). Os valores das faixas de trabalho para todos os
pesticidas foram de 0,1 a 5 µg/g por GC/MS/SIM e HPLC-UV preparados no extrato
da planta medicinal Cordia salicifolia.
90
As Tabelas 13 e 14 apresentam os respectivos valores dos coeficientes de
correlação e equações de regressão linear de cada pesticida estudado por
GC/MS/SIM e HPLC-UV.
Tabela 13. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os
pesticidas preparados no extrato da matriz e analisados por MSPD e GC/MS/SIM da
Shimadzu modelo 5050A. Para condições cromatográficas de análise ver item 6.8.
Pesticidas
Linearidade
(µg/g)
Coeficiente de
correlação r
Equação da reta
acefato 0,1-5,0 0,9989 y=519026x - 13471
clorprofam 0,1-5,0 0,9993 y=290141x - 34813
pirimicarbe 0,1-5,0 0,9985 y=361613x - 10300
bifentrina 0,1-5,0 0,9984 y=304031x - 20813
tetradifona 0,1-5,0 0,9989 y=394073x - 30410
fosalona 0,1-5,0 0,9993 y=234170x - 45103
Tabela 14. Valores dos coeficientes de correlação e equações da reta para os
pesticidas preparados no extrato da matriz e analisados por MSPD e HPLC-UV da
Shimadzu modelo Prominence. Para condições cromatográficas de análise ver item
6.8.1.
Pesticidas
Linearidade
(µg/g)
Coeficiente de
correlação r
Equação da reta
pirimicarbe 0,1-5,0 0,9981 y=461613x - 10471
clorprofam 0,1-5,0 0,9971 y=391510x - 1481
tetradifona 0,1-5,0 0,9983 y=393246x - 33513
bifentrina 0,1-5,0 0,9986 y=415213x - 41919
91
8.9.3. Limites de Detecção e Limites de Quantificação para análises por
GC/MS/SIM e HPLC/UV.
8.9.4 Limite de Detecção (LOD)
Limite de detecção é a menor quantidade do analito que pode ser detectada no
cromatograma, mas não quantificada, com certo nível de confiança, utilizando-se um
determinado método analítico (LANÇAS, 2004).
O limite de detecção de cada um dos pesticidas estudados foi calculado através
do desvio padrão (n=7 replicatas para análises no GC/MS/SIM e n=5 replicatas para
análises realizadas no HPLC-UV) no menor nível de concentração da solução de
fortificação de cada analito (INMETRO, 2008). O cálculo do limite de detecção foi feito
através da relação mostrada abaixo.
LOD = t
99%
.s
A seguir na Tabela 15 os valores dos limites de detecção para os pesticidas
analisados por GC/MS/SIM e HPLC-UV.
Tabela. 15. Valores dos limites de detecção do método para os pesticidas em
análises realizadas por GC/MS/SIM e HPLC-UV
Pesticidas LOD (mg/kg)
GC/MS/SIM
LOD (mg/kg)
HPLC- UV
acefato 0,07 -
clorprofam 0,03 0,03
pirimicarbe 0,02 0,04
bifentrina 0,02 0,08
tetradifona 0,03 0,07
fosalona 0,02 -
92
8.9.5. Limite de Quantificação (LOQ)
O limite de quantificação de um método representa a menor quantidade do
analito presente numa amostra que pode ser determinado com aceitáveis precisão e
exatidão sob as condições experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é
uma característica de ensaios quantitativos, onde se espera baixos níveis de
concentração do analito. Os limites de quantificação foram calculados levando em
consideração sete replicatas de fortificação na planta medicinal em análises por
GC/MS/SIM e cinco replicatas de fortificação em análises por HPLC-UV, sendo que o
mesmo é estabelecido como dez vezes a estimativa do desvio padrão (INMETRO,
2008). Os limites de quantificação de cada pesticida foram calculados com base na
equação mostrada abaixo:
LOQ = 10. s. t
99%
.
A seguir na Tabela 16 os valores dos limites de quantificação para os pesticidas
analisados por GC/MS/SIM e HPLC-UV.
Tabela 16. Valores dos limites de quantificação dos pesticidas em análises
realizadas por GC/MS/SIM e HPLC-UV
Pesticidas LOQ (mg/kg)
GC/MS/SIM
LOQ (mg/kg)
HPLC- UV
acefato 0,3 -
clorprofam 0,1 0,4
pirimicarbe 0,4 0,25
bifentrina 0,4 0,1
tetradifona 0,3 0,3
fosalona 0,2 -
93
9. CONSIDERAÇÔES FINAIS
O método de dispersão da matriz em fase sólida com utilização de alumina
neutra como suporte sólido e C
18
como co-sorvente na proporção 1:1, m/m, fazendo-
se uso de 30 mL de mistura de solventes ciclohexano/diclorometano, 1:3, v/v, foi
eficiente para extração dos pesticidas acefato, clorprofam, pirimicarbe, bifentrina,
tetradifona e fosalona em planta medicinal Cordia salicifolia e na retenção de
impurezas provenientes da planta medicinal, dado os valores satisfatórios de
recuperação obtidos pela utilização das técnicas de GC/MS/SIM e HPLC-UV
A técnica de GC/MS/SIM com os parâmetros de análise ajustados foi adequada
na identificação e quantificação dos pesticidas. Os resultados de recuperação foram
melhores na concentração de 0,5 µg/g variando de 68 ±11,7% a 130 ±17,5% dado a
melhor exatidão neste nível de concentração.
Valores de recuperação satisfatórios na faixa de 59 a 108% para os pesticidas
pirimicarbe, clorprofam, tetradifona e bifentrina, foram obtidos pela utilização da
técnica de HPLC-UV no comprimento de onda de 254 nm. As condições para
extração por MSPD foram otimizadas para obtenção de uma extração eficiente,
precisa e seletiva para os pesticidas analisados no presente estudo, com pouco
tempo de análise e pouca manipulação de solventes orgânicos. Em análises de
amostras reais de porangaba adquiridas no Mercado Municipal Talles Ferraz
localizado na cidade de Aracaju/SE foi possível concluir que as mesmas não
apresentavam contaminação pelos pesticidas selecionados no presente trabalho.
94
10. REFERÊNCIAS
ABHILASH, P. C.; JAMIL, S.; SINGH, N. Matrix solid-phase dispersion extraction
versus solid phase dispersion extraction in the analysis of combined residues of
hexachlorocyclohexane isomers in plant matrices. Journal of Chromatography A.
1176. p. 43-47. 2007.
ABHILASH, P. C.; SINGH, N. Multiple residue extraction for organochlorine
pesticides in medicinal plant. Bulletin of Environmental Contamination and
Toxicology. p. 6-10. 2008.
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Sistema de Informações
sobre Agrotóxicos. Disponível em: www.anvisa.gov.br. Consultado em 03/07/2008.
A World Compendium the Pesticide Manual. Incorporating the Agrochemicals
Handbook. Tenth Edition. Editor: Clive Tomlin. 1994.
BADRAOUI, R. Erratum to the article effect of subchronic exposure to tetradifon
on bone remodelling and metabolism in female rat C. R. Comptes Rendus
Biologies, v. 330, p.897-904. 2007.
BARCELÓ, D.; HENNION, C. M. Trace Determination of Pesticides and their
Degradation Products in Water. Techniques and Instrumentation in Analytical
Chemistry. Elsevier. P. 116-121. 1997.
BARRIADA, P. M. et al. Microwave – Assisted Extraction versus Soxhlet
Extraction in the Analysis of 21 Organochlorine Pesticides in Plants. Journal of
Chromatography A. v. 1008. p. 115-122. 2003.
BARKER, S. A. Matrix solid-phase dispersion. Journal of Biochemical and
Biophysical Methods. 70. p. 151-162. 2007.
95
BERNAL, J. L. Matriz effects in the determination of acaricides and fungicides in
must by gas chromatograph with electron-capture and nitrogen-phosphorous capture
detection. Journal of Chromatography A. v. 778. p. 111-117. 1997.
BICCHI, C. et al. SBSE-GC-ECD/FPD in the analysis of pesticide residues in
Passiflora alata dryander herbal teas. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
51. p. 27-33. 2003.
CALIXTO, J. B. Efficacy, safety, quality, control, marketing and regulatory
guidelines of herbal medicines (phytotherapeutic agents). Brazilian Journal of
Medical and Biological Research. v. 33. p. 179-89. 2000.
CAPARROZ, A. S. M. et al. Toxicity studies of Cordia salicifolia,. Acta Health
Science. 27. p. 41-44. 2005.
CARVALHO, A. C. B. et al. Situação de registro de medicamentos fitoterápicos no
Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia. 18(2). p. 314-319. 2008.
CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G. Desenvolvimento de Métodos por HPLC:
Fundamentos, Estratégias e Validação. Série Apontamentos. Editora UFSCar.
Universidade Federal de São Carlos. São Carlos – São Paulo. Brasil. 2001.
CHAN, K. Some aspects of toxic contaminants in herbal medicines.
Chemosphere. 52. p. 1361-1371. 2003.
COLLINS, C. H.; BONATO, P.; BRAGA, G. L. Fundamentos de Cromatografia.
Editora Unicamp. Campinas – São Paulo. 2006.
DEVIENNE, K. F.; RADDI, M. S. G.; POZETTI, G. L. Das Plantas Medicinais aos
Fitofármacos. Revista Brasileira de plantas Medicinais. v. 6. No. 3. p. 11 – 14, 2004.
DI STASI, L. C. Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo
interdisciplinar. São Paulo: UNESP. p. 230. 1996.
96
DONG, S. L. et al. Determination of residues metalaxyl in Chinese crude drugs by
RH-HPLC. Journal of China Pharmaceutical University. p. 13-19. 2007.
DÓREA, H. S. Análise multirresíduo de pesticidas organofosforados e piretróides
em frutas por CGC, após extração com fluido supercrítico comprando com LLE, SPE
e MSPD. São Paulo. Tese de doutorado (Doutorado em Química) – Instituto de
Química de São Carlos, Universidade de São Paulo. 1999.
FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), 2005. Disponível
em: http://faostat.fao.org/faostat. Acesso em 16 de Outubro de 2008.
FERREIRA, S. H. Medicamentos a Partir de Plantas Medicinais no Brasil.
Disponível: HTTP://<www.abc.org.br/arquivos/medicamentos.pdf. 2001. Acesso em
25 de Novembro de 2002.
FILHO, A. M.; Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de
pesticidas em tomate por dispersão da matriz em fase sólida e cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas. Defesa de Dissertação de Mestrado em
Química.do Programa de Pós-graduação em Química da Universidade Federal de
Sergipe. São Cristóvão – Sergipe. 2005.
GONZALEZ, F. J. E. et al. Matrix effects of vegetable commodities in electron-
capture detection apllied to pesticide multiresidue analysis. Journal of
Chromatography A. 996. p. 155-165. 2002.
GONZÁLEZ, R. R.; FRENICH, A. G.; VIDAL, J. L. M. Multiresidue method for fast
determination of pesticides in fruits juices by ultra performance liquid
chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. v. 76. p. 211-225.
2008.
GRISOLIA, C. K. A. Agrotóxicos, mutações, câncer e reprodução, riscos ao
homem e ao meio ambiente pela avaliação de genotoxicidade, carcinogenicidade e
efeitos sobre a reprodução. Editora UnB. Brasília. p. 392. 2005
97
GRISOLIA, C. K. A. Comparison between mouse and fish micronucleous test
using cyclophosphamide mitomyxin C and various pesticides. Mutation Research.
518. p. 145-150, 2002.
HAJJO, R. M. et al. Multiresidue pesticide analysis of the medicinal plant
Origanum syriacum. Food Additives and Contaminants: Part A. v. 24. Issue. 3. p.
274-279. 2007.
HAJSLOVÁ, J. et al. Matriz-induced effects: a critical point in the a gas
chromatograph analysis of pesticides residues. Journal of Chromatography A. 800.
p. 283-295. 1998.
HANNAZATO, T. Pesticides effects on freshwater zooplankton: an ecological
perspectives. Environmental Pollution. 112. p. 1-10. 2000.
HAYASHI, K. et al. Antiviral activity of an extract of Cordia salicifolia on Herpes
simplex virus Type I. Plant Medicinal. 56. p. 439-443. 2002.
HO, W. H.; HSIEH, S. J. Solid phase microextraction associated with microwave
assisted extraction of organochlorine pesticides in medicinal plants. Analytica
Chimica Acta. 428. p. 111-120. 2001.
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial:
Orientação sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos. DOG-CGCRE-008.
2003.
LANÇAS, F. M. Extração em Fase Sólida (Solid Phase Extraction). São Carlos –
São Paulo: Ed. Rima, 2004.
LANÇAS, F. M. Validação de Métodos Cromatográficos de Análise. São Carlos –
São Paulo. Ed. Rima. 2004.
LEITE, F. Validação em Análise Química. Campinas. Editora Átomo. 1998.
98
LIANG, Y. Z.; XIE. P.; CHAN. K. Quality control of herbal medicines. Journal of
Chromatography B. 812. p. 53-70.2004.
LIAPIS, K. S. SARLIS, P. A.; KYRIAKIDIS, N. V. Rapid multi-residue method for
the determination of azinphos methyl, bromopropylate, chlorpyriphos, dimethoate,
parathion-methyl and phosalone in apricots and peaches by using negative chemical
ionization ion trap technology. Journal of Chromatography A. 996. p 181-187. 2003.
LING, Y. C.; TENG, H. C.; CARTWRIGHT, C. Supercritical fluid extraction and
clean-up of organochlorine pesticides in Chinese herbal medicine. Journal of
Chromatography A. 835. p. 145-157. 1999.
LÓPEZ, G. M.; CANOSA. P.; RODRÍGUEZ. J. Trends and recent applications of
matrix-solid phase dispersion. Bioanalalytical Chemical. 391. p. 963-974. 2008.
LORENZI, H. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas. Instituto
Plantarum de Estudos, Nova Odessa – São Paulo. p 99. 2005.
LU, Y. et al. Herb use critical care. What to what for. Critical Care Nursing Clinic
North America. 15. p. 313-319. 2003.
MA, H. Y. et al. Studies on determination of organochlorine pesticide residues in
parts of medicinal plants in Hunan market. Chromatographia. v .31. p. 319-326.
2007.
MASTOVSKÁ, K.; LEHOTAY, S. J. Evaluation of common organic solvents for
gas chromatographic analysis and stability of multiclass pesticides residues. Journal
of Chromatography A. 1040. p. 259-272. 2004.
MENGHINI, L. et al. Phytochemical investigation on leaf of Cordia salicifolia
Cham. Journal of Medical Food. v. 11. p. 193-194. 2008.
99
MENKISSOGLU-SPIROUDI, U.; FOTOPOULOU, A. matrix effect in gas
chromatographic determination of insecticides and fungicides in vegetables.
International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 84. p. 15-27. 2004.
MICHEL. M.; BUSZEWSKI, B. Optimization of a matrix-solid phase dispersion
method for determination analysis of carbendazin residues in plant material. Journal
of Chromatography B. v. 800. p. 309-314. 2004.
MIGUEL, M. D.; MIGUEL. O. G. Desenvolvimento de Fitoterápicos. São Paulo.
Probe Editorial. p.116. 1999.
MITRA, S. Sample preparation techniques in analytical chemistry. New Jersey.
Wiley Interscience. 2003.
NAVICKIENE, S.; RIBEIRO, M. L. A simple and rapid extraction for gas
chromatographic determination of thiabendazole and imazalil residues in lemons.
Journal Brazilian Chemistry Society, Brasil, v. 13, n. 5, p. 592-596, 2002.
NETO, P. A. de S. P. CAETANO, L. C. Plantas medicinais do popular ao
cientifico. Editora UFAL. Maceió – Alagoas. 2005.
OZBEY. A.; UYGUN, U. Behaviour of some organophosphorous pesticides
residues in thyme and stinging nettle tea during infusion process. International
Journal of Food Science and Technology. v. 42. p. 380-383. 2007.
PEREIRA, A. S. et al. Desafios da química analítica frente às necessidades da
indústria farmacêutica. Química Nova. V. 28. p. 107-111. 2005.
POOLE, C. F.; POOLE, S. K. Chromatography Today. Elsevier: Amsterdam.
1995.
POOLE, C. F. Matrix induce response enhancement in pesticide residue analysis
by gas chromatography. Journal of Chromatography A. 1158. v.241-250. 2007.
100
RAI, V. et al. Toxic Metals and organochlorine pesticides residue in single herbal
drugs used in important ayurvedic formulation – Dashmoola. Environmental
Monitoring Asses. 143. p. 273-277. 2008.
RIBANI, M. et al. Validação de métodos cromatográficos e eletroforéticos.
Química Nova. v. 27. p. 771-780. 2004.
RODRIGUES, M. V. N. et. al. O emprego das técnicas hifenadas no estudo de
plantas medicinais. Revista de Multiciência. v. 7. 2006.
RODRIGUES, M. V. N. GC-MS determination of organochlorine pesticides in
medicinal plants harvested in Brazil. Journal Brazilian Chemical Society. v. 18. No.1.
p. 135-142. 2007.
SÁNCHEZ, G.; MARTOS, N. R. Simultaneous multidetermination of residues of
pesticides and polycyclic aromatic hydrocarbons in olive and olive-pomace oils by
gas chromatography/tandem Mass Spectrometry. Journal of Chromatography A.
1891. p. 71-78. 2006.
SANTOS, J. F.; AMOROZO, M. C. M.; MING, L. C. Uso popular das plantas
medicinais na comunidade rural da Vargem Grande, Município de Natividade da
Serra, São Paulo. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v. 10. p.67-81. 2007.
SANTOS, T. F. S. et al.. MSPD procedure for determining buprofenzin, tetradifon,
vinclozolin, and bifenthrin residue in propolis by gas chromatograph – Mass
Spectrometry. Analytical Bioanalytical Chemistry. p.390-1425. 2008.
SCHUREK, J. et al. Application of head-space solid-phase microextraction
coupled to comprehensive two dimensional gas chromatograph-time-of-fly Mass
spectrometry for the determination of multiple pesticide residues in tea samples.
Analytica Chimica Acta. 611. p. 163-172. 2008.
SILVA, M. G. D. et al Simultaneous determination of eight pesticide residues in
coconut using MSPD and GC/MS. Talanta (Oxford), v. 76, p. 680-684, 2008.
101
SILVERSTEIN, R. M. Identificação Espectrométrica de Compostos Orgânicos. 3º
Edição. Rio de Janeiro. Editora Guanabara Dois. S.A. 2002.
SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. Pratical HPLC Method
Development. 2.ed. New York, John Wiley and Sons. p. 233-349. 1997.
SOLER, C.; MAÑES, J.; PICÓ, Y. Routine application using single quadrupole
liquid chromatograph – mass spectrometry to pesticides analysis in citrus fruits.
Journal of Chromatography A.1088. p. 224-233. 2005.
SOLER, C.; PICÓ, Y. Recent trends in liquid chromatography-tandem mass
spectrometry to determine pesticides and their metabolites in food. Trends in
Analytical Chemistry. v. 26. No. 2. 2007.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAM, T. A. Princípios de Análise
Instrumental. 5º ed. Porto Alegre: BOOKMAN Companhia editora, 2002
TANG, F. et al. Development of methods for determination of the residues of 15
pesticides in medicinal herbs Isatis Indigotica Fort. by. capillary gas chromatography
with electron capture or flame photometric detection. Journal of China
Pharmaceutical University. 361. p. 319-343. 2006.
KOCOURECK, V. et al. Stability of pesticides in plant extracts used as calibrants
in the gas chromatographic analysis of residues. Journal of Chromatography A. 800.
p. 297-304. 1998.
KRISTENSON, M.E; RAMOS, L; BRINKMAN, U.T. Recent advances in matrix
solid-phase dispersion. Trends in Analytical Chemistry. v. 25, no 2. 2006.
VIANA, E.; MOLT, J. C.; FONT, G. Optimization of a matrix-solid-phase
dispersion method for the analysis of pesticide residues in vegetables. Journal of
Chromatography A. 754. p. 437-444. 1996.
102
VENKATESWARA, J. et al. Assessment of cytoskeletal damage in Paramecium
caudatum: An early warning system for apoptotic studies. Pesticide Biochemistry and
Physiology, v. 91, p. 75-80. 2008.
VILLEGAS, W. Fitoquímica de Plantas Brasileiras. Tese (Livre-Docência em
Química Orgânica) Instituto de Química. Universidade Estadual Paulista.
Araraquara. São Paulo. 1998.
YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas Medicinais: sob a ótica da Química
Medicinal Moderna. Argos: Editora Universitária. Universidade do Oeste de Santa
Catarina. Chapecó – Santa Catarina. 2001.
ZUIN, V. G.; YARIWAKE. J. H.; LANÇAS. F. M. Analysis of pesticides residues in
brazilian medicinal plants: matrix solid-phase dispersion versus conventional
(European Pharmacopoeia) methods. Journal Brazilian Chemical Society. v. 14. No.
2, p. 304-309. 2002.
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