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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU - CPGSS
MESTRADO EM GENÉTICA
SARA GISELLE DE CÁSSIA ALEXANDRE GONDIM
DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES
PARA Hoplias malabaricus (BLOCH, 1794)
GOIÂNIA – GOIÁS – BRASIL
- ABRIL DE 2010 –
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SARA GISELLE DE CÁSSIA ALEXANDRE GONDIM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU - CPGSS
MESTRADO EM GENÉTICA
SARA GISELLE DE CÁSSIA ALEXANDRE GONDIM
DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES
PARA Hoplias malabaricus (BLOCH, 1794)
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO PROGRAMA
DE MESTRADO EM GENÉTICA DA PONTIFÍCIA
UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS, COMO
REQUISITO PARCIAL PARA OBTENÇÃO DO
TÍTULO DE MESTRE EM GENÉTICA.
Profª. Dra. Mariana Pires de Campos Telles
- ORIENTADORA -
M.Sc. Lucileide Vilela Resende
- CO-ORIENTADORA -
GOIÂNIA – GOIÁS – BRASIL
- ABRIL DE 2010 -
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3
Aos meus pais, Antônio Carlos Gondim e Euripa Alexandre Gondim, pelo
amor, incentivo, compreensão, paciência e por estarem presentes em todos
os momentos de minha vida, mostrando que é possível realizar vários
sonhos.
Ao meu irmão, Halley Wesley Alexandre Gondim, pelos grandiosos
conselhos, ajuda, incentivo, apoio e paciência a mim dedicado.
Ao meu namorado Rodrigo Roncato Pereira, pelo amor, incentivo, carinho,
compreensão e paciência que a mim é dado incondicionalmente e pelo apoio
de todas as horas, compartilhando momentos difíceis e alegres,
contribuindo nesta trajetória.
D E D I C O.
Á DEUS, fonte de coragem, inspiração e vida, por ter me concedido
sabedoria, saúde e força para buscar meus objetivos.
O F E R E Ç O.
4
A G R A D E C I M E N T O S
Acredito que a parte mais difícil seja agradecer a todos aqueles que tiveram papel importante
durante a realização deste estudo. Agradeço:
Ao Departamento de Pós-Graduação Stricto Sensu em Genética da Pontifícia Universidade
Católica de Goiás e a todos os docentes do curso de mestrado, pela dedicação e
conhecimentos transmitidos;
Em especial à minha querida orientadora Professora Dra. Mariana Pires de Campos Telles,
pelas orientações, confiança, conselhos, que com sabedoria, competência e paciência tornou
mais rica essa minha caminhada;
À empresa Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda. pelo apoio financeiro concedido
através do programa comunitário de bolsa de estudo do PROEX; em especial ao Dr. Nelson
Jorge da Silva Junior, Ph.D., por acreditar em meu trabalho, estando sempre pronto e disposto
a ajudar;
À Capes - coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior projeto n°
1418/2007- Ações novas fronteiras programa de cooperação acadêmica – Procad/NF;
À minha amiga e co-orientadora Lucileide pelas sugestões, orientações e principalmente pela
paciência, sempre compartilhando o seu saber;
Aos responsáveis pelo Laboratório de Genética e Biodiversidade da Universidade Federal de
Goiás/ICB1, por cederem suas instalações e equipamentos para a realização deste trabalho;
Ao Laboratório de Biotecnologia da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa
Arroz e Feijão do estado de Goiás, por proporcionar parte do desenvolvimento deste trabalho;
Aos meus amigos e colegas de laboratório que sempre se colocaram à disposição para
realização deste estudo e pelas horas de descontração e trabalho; em destaque à Monik,
Jacqueline, Felipe, Advaldo, Natácia, Dayane, Eliane, Thaís, Camila, Franciele, Kesler, e em
especial à minha amiga Fernanda que sempre me deu força, ajuda, suporte e por sempre
confiar em mim. Valeu de mais Fê;
Com muito carinho, aos professores Thannya, Talge, Rosane e Renato, por toda paciência
durante nosso longo e constante convívio e por compartilharem seus conhecimentos para a
melhor realização deste trabalho;
Ao meu pai Antônio e ao meu namorado Rodrigo pelo desempenho e diversão nas pescarias
inesquecíveis;
À minha querida mãe Euripa por cuidar sempre carinhosamente de mim;
Ao meu irmão, Halley, por me ajudar a fazer os géis de acrilamida;
5
À minha querida sogra, Ângela, por sempre me apoiar e me dar muita força para seguir em
frente;
À minha prima Lucimeire e minha linda afilhadinha Lívia por incansavelmente me ajudarem
na pesca das traíras;
Aos proprietários do Sítio Mucunã, por estarem sempre prontos a ajudar;
E a todos aqueles que de uma forma direta ou indireta colaboraram na realização desse
trabalho, fazendo parte da minha vida, tornando minha caminhada mais tranquila;
Minha eterna gratidão.
6
E P Í G R A F E
“Confia no Senhor de todo o teu coração e não te estribes no teu próprio entendimento.
Reconhece-o em todos os teus caminhos, e ele endireitará as tuas veredas.”
Provérbios 3:5-6
“Não tenho medo das tempestades, pois estou aprendendo a manobrar meu barco.”
Louisa May Alcott
7
L I S T A D E F I G U R A S
F i g u r a s
P á g i n a
Figura 1.
19
Figura 2.
20
Figura 3.
21
Figura 4.
24
Figura 5.
28
Figura 6.
31
Figura 7.
32
Figura 8.
33
Figura 9.
34
Figura 10.
36
Figura 11.
37
Figura 12.
37
Figura 13.
38
Figura 14.
44
Figura 15.
45
Figura 16.
47
8
Figura 17.
48
Figura 18.
49
Figura 19.
51
9
L I S T A D E T A B E L A S
T a b e l a s
P á g i n a
Tabela 1.
Diversidade no tipo de unidade repetitiva de marcadores
moleculares microssatélites (Tautz, 1989; Weber et al., 1990).
27
Tabela 2.
Área de coleta, local, código (Cód.), coordenadas geográficas
(longitude e latitude) e altitude (m).
38
Tabela 3.
Protocolo das Reações em Cadeia da Polimerase
demonstrando os reagentes utilizados e suas concentrações
de uso e volumes, para um sistema de 15µl.
41
Tabela 4.
Programa de termociclagem para regiões microssatélites.
41
Tabela 5.
Sequencias aceitas e rejeitadas por placa analisadas pelo
software BIOFOCO.
45
Tabela 6.
Relação dos 14 locos microssatélites que apresentaram padrão
eletroforético satisfatório para 48 indivíduos da espécie
Hoplias malabaricus, contendo a temperatura de anelamento
dos locos (Ta); o número de alelos observados (Na) e a
amplitude de variação do tamanho dos alelos em pares de base
(AVA).
50
Tabela 7.
Frequências alélicas dos 14 locos microssatélites.
51
Tabela 8.
Relação dos 14 locos microssatélites que apresentaram padrão
eletroforético satisfatório para 48 indivíduos da espécie
Hoplias malabaricus, onde, (He) e (Ho) representam a
heterozigosidade esperada e observada, respectivamente, (f) é
o índice de fixação e (p value) é o índice de significância para
o teste de aderência às proporções de equilíbrio de Hardy-
Weinberg.
53
Tabela 9.
Iniciadores desenvolvidos para a ordem Characiforme.
54
Tabela 10.
Número de indivíduos (n), Número de alelos observados (Na),
Probabilidade de exclusão de paternidade (PE), Probabilidade
de identidade (PI).
55
10
L I S T A D E A P Ê N D I C E
A p ê n d i c e
P á g i n a
Apêndice I.
78 regiões microssatélites com diferentes motivos de
repetição.
70
Apêndice II.
78 sequências obtidas através da estratégia de
sequenciamento aleatório a partir de bibliotecas shotgun.
73
11
L I S T A D E A N E X O S
A n e x o s
P á g i n a
Anexo I.
Protocolo de Extração SDS (Sodium dodecyi sulphete)
fenol/clorofórmio.
85
Anexo II.
Construção da biblioteca Genômica.
86
Anexo III.
Procedimento de miniprep em placa por Lise Alcalina.
89
Anexo IV.
Reações de seqüenciamento.
91
Anexo V.
Protocolo de Coloração com Nitrato de Prata (Creste, et al.,
2001).
92
Anexo VI.
Padronização das condições de amplificação, com ajuste nas
condições para amplificação para loco Hmal 15.
93
12
R E S U M O
A espécie Hoplias malabaricus, pertencente à família Erythrinidae, representa uma das
espécies de peixes characiformes com maior distribuição na região Neotropical. O grupo vem
sendo considerado por diversos autores como um conjunto de espécies que necessita de uma
revisão quanto à classificação. Para tanto, dentre outros, são necessários estudos genéticos,
aumentando a quantidade de informações disponível para a espécie. Os marcadores
microssatélites, por serem codominantes, multialélicos, abundantes e bem distribuídos ao
longo do genoma, são eficientes para avaliar a variabilidade genética em populações naturais
e para a realização de estudos de genética com aplicação em manejo e conservação. Este
estudo utiliza uma estratégia de desenvolvimento de iniciadores para regiões microssatélites
que se baseia no sequenciamento aleatório de fragmentos provenientes de uma biblioteca
genômica “shotgun” para a detecção de regiões microssatélites, em H. malabaricus (traíra).
Das 864 sequências obtidas, foram encontradas 78 regiões microssatélites que possibilitaram
a construção de pares de iniciadores. Estas regiões são compostas por vários tipos de motivos
de repetição, incluindo dinucleotídios, trinucleotídios, tetranucleotídios, pentanucleotídios. Os
alelos apresentaram amplitude de variação de tamanho entre 136 a 236 pares de bases. Isto
mostra que a estratégia de sequenciamento aleatório a partir de bibliotecas “shotgun” é
interessante para a obtenção de regiões repetitivas com diferentes motivos. Dos 78 pares de
iniciadores encontrados, 25 foram sintetizados para padronização e caraterização. Destes 25,
apenas 14 apresentaram padrão de amplificação satisfatório, e dentre estes, seis (Hmal 9,
Hmal 23, Hmal 33, Hmal 34, Hmal 46 e Hmal 60) apresentaram polimorfismos.
Considerando os 14 locos avaliados, a heterozigosidade observada (Ho) apresentou uma
média igual a 0,054 e a heterozigosidade esperada (He) apresentou um valor médio igual a
0,246. Dentre os locos que apresentaram polimorfismos, apenas Hmal-9 apresentou desvios
significativos para o teste de aderência às proporções esperadas para o equilíbrio de Hardy-
Weinberg. A estratégia de desenvolvimento de iniciadores a partir de biblioteca shotgun foi
eficiente para a detecção de diferentes tipos de regiões microssatélites no genoma da espécie
Hoplias malabaricus. Existe um baixo polimorfismos nos 14 locos microssatélites avaliados
em 48 indivíduos da espécie Hoplias malabaricus.
Palavras-chave: Hoplias malabaricus, marcadores microssatélites, iniciadores, biblioteca
shotgun, polimorfismos
13
A B S T R A C T
Hoplias malabaricus is a characiforme fish (family Erythrinidae) with a wide distribution in
the Neotropical region. The species has been considered by several authors as a group of
species in urgent need of a taxonomic revision. Under this context, genetic studies are needed
in order to increase the amount of information available for this species. Microsatellite
markers are codominant, multiallelic, abundant and well distributed throughout the genome,
and therefore are efficient to evaluate the genetic variability in natural populations. Also for
conservation and managment studies. This study uses a strategy of development of primers
for microsatellite regions based on the sequencing of random fragments from a genomic
library "shotgun" for the detection of microsatellite regions in H. malabaricus. From 864
sequences obtained, I found 78 microsatellite regions that allowed the construction of pairs of
primers. These regions are composed of different types of repeat motifs, including
dinucleotide, trinucleotídes, tetranucleotídes and pentanucleotídes. Alleles varied in size from
136 to 236 base pairs. This shows that the strategy of random sequence from libraries
"shotgun" is interesting to obtain repetitive regions with different motives. From 78 pairs of
primers found, 25 were synthesized for standardization and characterzation. Of these 25, 14
had satisfactory standard of amplification, and among these, six (Hmal-9, Hmal-23, Hmal-33,
Hmal-34, Hmal-46 and Hmal-60) showed polymorphisms. Considering the 14 loci evaluated,
the observed heterozygosity (Ho) had a mean of 0.054 and expected heterozygosity (He) had
a mean value equal to 0.246. Among the loci that showed polymorphisms, only the reported
Hmal-9 showed significant deviations for the test of adherence to the proportions expected for
the Hardy-Weinberg. The strategy of development of starters from library shotgun was
efficient for the detention of different types of regions microssatélites in the genome of the
species Hoplias malabaricus exists low polimorfismos in the 14 locos microssatélites
evaluated in 48 individuals.
Keywords: Hoplias malabaricus, microsatellite markers, initiators, library shotgun,
polymorphism
14
S U M Á R I O
P á g i n a
Lista de Figuras
vii
Lista de Tabelas
ix
Lista de Apêndice
x
Lista de Anexos
xi
Resumo
xii
Abstract
xiii
Sumário
xiv
1.
Introdução
15
2.
Objetivos
17
3.
Revisão Bibliográfica
18
3.1.
Características ecológicas, evolutivas e biologia da espécie Hoplias
malabaricus
18
3.2.
3.2. Desenvolvimento de marcadores microssatélites
24
4.
Material e Métodos
36
4.1.
Áreas de coleta das amostras
36
4.2.
Coleta do material biológico e extração do DNA
38
4.3.
Construção da biblioteca Genômica e sequenciamento
39
4.4.
Caracterização da variabilidade genética presente nos locos
padronizados
42
5.
Resultado e Discussão
44
5.1.
Busca de regiões microssatélites em sequências genômicas de
Hoplias malabaricus
44
5.2.
Caracterização dos locos microssatélites desenvolvidos para
Hoplias malabaricus
46
6.
Conclusão
56
7.
Referências Bibliográficas
57
8.
Apêndice
70
9.
Anexos
85
15
1. I N T R O D U Ç Ã O
A Região Neotropical é considerada como a mais rica em número de espécies de
peixes de água doce do mundo (Schaffer, 1998), no entanto o conhecimento de sua ictiofauna
é bastante limitado (Menezes, 1972; Böhlke et al., 1979; Bussing, 1985; Kaufman, 1992;
Reis, 1997; Albert, 1998; Laurence, 1998; Malabarba, 1998).
Devido ao fato de as informações existentes em relação à diversidade da ictiofauna da
região Neotropical ser muito fragmentada, há relativamente poucos estudos sobre a
sistemática de grandes grupos taxonômicos (Buckup et al., 1983; Oyakawa, 2003), portanto a
falta de conhecimento afeta diretamente a compreensão da história filogenética das espécies e
de suas adaptações ecológicas e fisiológicas ao ambiente, o que impede a interpretação correta
dos dados experimentais quando aplicados a espécies de ampla distribuição (Laurence, 1998).
A família Erythrinidae compreende um pequeno grupo de Characiformes, e é
composta pelos gêneros Erythrinus , Hoplerythrinus e Hoplias (Oyakawa, 2003), que estão
distribuídos pela região neotropical e apresentam um grande número de espécies endêmicas às
Américas do Sul e Central, principalmente em ambientes lênticos (Oyakawa, 2003).
No gênero Hoplias, encontramos a espécie Hoplias malabaricus (Bloch, 1794),
popularmente conhecida como traíra, um peixe neotropical (Nelson, 1994). A traíra é um
predador que apresenta o corpo cilíndrico com uma leve depressão lateral, nadadeira dorsal
angular, cabeça bastante longa, boca ampla e mandíbulas proeminentes, com dentes fortes e
cônicos, com presença de caninos. Os olhos são circulares e estão dispostos na metade
proximal da cabeça. A porção dorsal da cabeça mostra-se mais escura do que a ventral, assim
como o restante do corpo, que varia desde marrom escuro a bege claro (Morellí,1998). É um
animal de hábitos bentônicos, sendo encontrado em rios e lagoas, principalmente em
ambientes de águas rasas e próximo à vegetação submersa ou marginal (Sabino & Zuanon,
1998).
Diferenças genéticas têm sido documentadas para o gênero Hoplias desde os
primeiros trabalhos de Bertollo et al. (1978; 2000). A espécie Hoplias malabaricus apresenta
uma grande homogeneidade morfológica e grande diversidade cariotípica com o número de
cromossomos variando de 2n=39 a 2n=42 (Oyakawa, 2003). Desta forma pode-se dizer que
há grandes divergências dentro da espécie. Para uma melhor identificação da diversidade
genética e um melhor conhecimento da espécie Hoplias malabaricus, desde o final da década
de 70 estão sendo feitos estudos utilizando ferramentas moleculares.
16
Nos últimos anos todas as teorias propostas e desenvolvidas nas áreas de biologia
molecular e genética, permitiram o desenvolvimento de técnicas laboratoriais e
biotecnológicas bastante eficientes, que se integraram a toda teoria ecológica e evolutiva
permitindo o emprego das técnicas moleculares na reconstrução filogenética, inferências
evolutivas e obtenção de informações que subsidiam a elaboração de programas de manejo e
conservação de áreas e das espécies (Mullis & Faloona, 1987; Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Os marcadores moleculares têm se mostrado uma poderosa ferramenta para o estudo
de populações naturais, auxiliando no descobrimento de muitos parâmetros genéticos
importantes para a conservação ou para a utilização dos recursos genéticos das diversas
espécies (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Telles et al., 2003). Neste contexto, os marcadores
moleculares são utilizados como ferramentas capazes de fornecer subsídios para estudos que
visem avaliar a extensão e a distribuição da variação entre as espécies como também para
investigar questões taxonômicas e evolutivas (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Dentre os diversos marcadores moleculares existentes, os microssatélites, também
chamados de SSR (Simple Sequence Repeats), destacam-se nos estudos de identificação
individual, investigação de vinculo familiar, mapeamento genético em seres vivos e estudos
genético-populacionais (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Os marcadores microssatélites são
codominantes, multialélicos e amplamente distribuídos no genoma de eucariotos. Apesar de
serem marcadores específicos, o que eleva seu custo inicial e limita seu uso, os microssatélites
têm sido transferidos e utilizados para detectar polimorfismo em locos homólogos de outras
espécies afins. Devido sua abundância, codominância e alto nível de diversidade, esta técnica
permite caracterizar corretamente um indivíduo em uma população, bem como monitorar a
transmissão de genes através de gerações, possibilitando acelerar a estimação de parâmetros
genéticos que são de considerável interesse em estudos de diversidade, padrões de estrutura
genética e conservação de populações (Chase et al., 1996; Souza, 2001; Zucchi, 2002).
As diversas aplicações destes marcadores dependem, portanto, do desenvolvimento de
iniciadores espécie-específicos para estas regiões genômicas a serem amplificadas via PCR
(Ferreira & Grattapaglia, 1998).
17
2. O B J E T I V O S
2.1. Objetivo Geral
Isolar e caracterizar regiões microssatélites do genoma da espécie Hoplias
malabaricus a fim de disponibilizar marcadores eficientes para estudos em genética de
populações, conservação e manejo dessa espécie.
2.2. Objetivo Específicos
Isolar DNA de um indivíduo da espécie Hoplias malabaricus e construir bibliotecas
shotgun para o seqüenciamento de fragmentos aleatórios do DNA genômico;
Realizar a busca de regiões microssatélites nos fragmentos aleatórios seqüenciados;
Desenhar pares de iniciadores que flanqueiam as regiões microssatélites nucleares do
genoma de Hoplias malabaricus;
Padronizar as condições de amplificação dos pares de iniciadores desenvolvidos para cada
uma das regiões microssatélites;
Caracterizar o polimorfismo dos marcadores que apresentarem os melhores padrões de
amplificação.
18
3. R E V I S Ã O B I B L I O G R Á F I C A
3.1. Características ecológicas, evolutivas e biologia da espécie Hoplias malabaricus
A Região Neotropical contém a mais rica diversidade de peixe de água doce do
mundo. Em 1978, foi estimado que o número total de espécies de água doce neotropicais
chegaria a 5000 (Böhlke et al., 1978). Em 1998, Schaefer disponibilizou a estimativa de 8000
espécies, o que representa um oitavo de toda a biodiversidade estimada de vertebrados
viventes (Vari & Malabarba, 1998). Além disso, Buckup et al. (2007) relataram que 2587
espécies de água doce ocorrem apenas no Brasil, tendo em vista apenas duas das diversas
ordens já descritas ou conhecidas, Characiformes e Siluriformes.
Segundo Vari & Malabarba (1998), um percentual de 30% a 40% de toda a
diversidade existente na ictiofauna Neotropical não foi, até o momento, reconhecida. Portanto,
é principalmente nesse contexto de identificação da diversidade que estão sendo aplicados os
estudos de marcadores genéticos e moleculares nas espécies de peixes neotropicais, buscando,
inclusive, a exploração de características de interesse econômico, bem como a preservação de
unidades evolutivamente significativas para a manutenção dessa biodiversidade (Ryder,
1986).
O gênero Hoplias se distingue dos outros dois gêneros da família Erythrinidae por
algumas particularidades apresentadas pelas espécies que compreendem este gênero, como a
presença de dentes caninos no maxilar (Figura 1 A) e na porção anterior do dentário, e por
possuírem a nadadeira ventral com oito raios e a anal com 10 a 12 raios (Figura 1 B) (Britski
et al., 1988).
Segundo Oyakawa (2003) e Froese et al. (2007), o gênero Hoplias é constituido por
nove espécies, sendo elas: Hoplias lacerdae (Ribeiro, 1908), Hoplias malabaricus (Bloch,
1794), Hoplias parana (Valenciennes, 1847); Hoplias Aimara (Valenciennes, 1847); Hoplias
brasiliensis (Agassiz et. al., 1829); Hoplias macrophthalmus (Pellegrin, 1907); Hoplias
microcephalus (Agassiz et. al., 1829); Hoplias microlepis (Günther, 1864); e Hoplias teres
(Valenciennes, 1847). Destas, cinco espécies são encontradas no Brasil: Hoplias lacerdae,
Hoplias malabaricus, Hoplias brasiliensis, Hoplias macrophthalmus, e Hoplias
microcephalus (Oyakawa, 2003; Froese et al., 2007).
19
Figura 1. (A) Caninos no maxilar superior e inferior, (Fonte: www.pesca.tur.br/page/3, 2008); (B)
Nadadeira ventral e anal com 10 a 12 raios, (Fonte: Timm, 2008).
De acordo com Morellí (1998), a espécie Hoplias malabaricus (popularmente
conhecida como traíra) é caracterizada por apresentar o corpo cilíndrico com uma leve
depressão lateral, nadadeira dorsal angular, cabeça bastante longa, boca ampla e mandíbulas
proeminentes, com dentes fortes e cônicos, e com a presença de caninos.
Com base na região gular, a espécie Hoplias malabaricus (Bloch, 1794), apresenta a
linha dentária convergindo, na forma de “V” invertido, na região anterior (Britski, 1972;
Bertollo et al., 1978). Outro caráter diferencial entre as espécies é a presença ou ausência de
dentículos na língua, e Hoplias malabaricus apresenta uma língua provida de placas ósseas
com dentes diminutos (Britski et al., 1988).
Na metade proximal da cabeça, estão dispostos os olhos circulares e na porção dorsal
da cabeça, observa-se uma coloração mais escura do que a ventral, assim como o restante do
corpo, que varia desde marrom escuro até um bege claro. Além disso, a espécie apresenta
manchas marrons, dispostas perpendicularmente com uma leve inclinação em direção à cauda,
conforme a Figura 2. Devido a esta coloração, a traíra se camufla na vegetação para capturar
suas presas (Oyakawa, 1998).
Durante a fase adulta, a espécie apresenta hábitos sedentários, típicos de espécies não
migratórias. Hoplias malabaricus ocupa o topo da cadeia alimentar nos pequenos cursos
d’água, e são predadores de outras espécies de peixes de menor porte, inclusive de indivíduos
jovens de sua própria espécie, crustáceos e moluscos, mas também é facilmente utilizado
como fonte alimentar por aves piscívoras e por mamíferos, incluindo o homem (Oyakawa,
1998).
A
B
20
Figura 2. Hoplias malabaricus (Fonte: http://peska.com.br/novopeska/, 2010).
No Brasil, Hoplias malabaricus é conhecida por algumas nomenclaturas populares,
como por exemplo, traíra, trairões, taraíras, trairuçus e morobás (Pacheco, 2004). Além disso,
a espécie é normalmente confundida com Hoplias lacerdae, principalmente quando nas
formas jovens (Oyakawa, 1998). Entretanto a espécie Hoplias malabaricus apresenta hábitos
noturnos e, durante o dia, aninha-se em locais com vegetação abundante (Sabino & Zuanon,
1998). Podem atingir cerca de 60 cm de comprimento e pesar em torno de 3 kg (Morelli,
1998).
Quanto à reprodução, a espécie Hoplias malabaricus apresenta-se desova parcelada,
realizando muitas pequenas desovas durante a temporada reprodutiva. Para tal, o macho e a
fêmea, juntos, procuram ou constroem pequenas depressões de aproximadamente 20 cm de
profundidade, onde a fêmea deposita seus ovos adesivos (Lamas, 1993), enquanto o macho os
fertiliza e fica cuidando por alguns dias, até que eclodam e se evadam espalhadamente para a
vegetação (Oyakawa, 1998), conforme observada na Figura 3.
A espécie Hoplias malabaricus, representa uma das espécies com maior distribuição
dentre os peixes characiformes da região Neotropical. É amplamente distribuída pelas
Américas, sendo comum em rios, arroios, lagoas e represas (Ringuelet et. al., 1967; Kock et.
al., 2000), diferentemente das demais espécies de Hoplias, que estão restritas a algumas
pequenas áreas específicas (Oyakawa, 2003).
A traíra pode ser encontrada por todo o Continente Americano, desde o sul da
província de Buenos Aires, no rio Salado, até o Panamá (Berra, 1982). Além disso, a espécie
foi introduzida nos Estados Unidos, no Estado da Flórida (Hensley & Moody, 1975; Hensley,
1976; Courtenay et al., 1979, 1984, 1986,).
21
Figura 3. Deposição de ovos da espécie Hoplias malabaricus (Fonte: Prado et al., 2006).
A presença de Hoplias malabaricus tem sido registrada em quase todos os sistemas de
águas lênticas e lóticas em muitos países, como: Argentina (Cordiviola de Yuan &
Pignalberide Hassan, 1985); (Domanico, et al., 1993); Bolívia, Equador, Peru, Uruguai
(Godoy, 1975); Brasil (Bloch, 1794); (Agassiz et al., 1829); (Cuvier & Vallenciennes, 1847);
(Castro & Casatti, 1997); Costa Rica (Oyakawa, 1998, 2003); Colômbia (Miles, 1947; (Dahl,
1971); (Galvis et al., 1997); Guiana, Paraguai (Godoy, 1975; Géry, 1977); Panamá (Miller,
1966); Suriname (Bloch, 1794; Gill, 1858, 1903; Kenny, 1995, Oyakawa, 1998, 2003); e
Venezuela (Géry, 1977; Galvis et al., 1997).
Esta espécie é considerada como um importante hospedeiro definitivo, intermediário e
paratênico de helmintos, principalmente para as larvas de nematóides. Além disso, as larvas
de Anisakídeos quando parasitam humanos, adquirem um potencial zoonótico (Wharton et al.,
1999; Martins et al., 2006). Elas podem ser encontradas no mesentério dos peixes e podem,
ainda, migrar para os músculos após a morte de seu hospedeiro. Devido ao seu alto grau de
patogenicidade, essas larvas podem causar implicações importantes nos humanos que se
alimentarem dos peixes infectados, tais como vômitos, diarréias e náuseas (Bouree et al.,
1995; Barros et al., 2007).
Especialmente no Brasil, as principais receitas e práticas medicinais são atribuídas aos
indivíduos do reino vegetal, enquanto que os animais consistem numa fonte secundária de
tratamentos médicos. Como uma evidência de que diversos peixes são utilizados na medicina
22
caseira entre os povos ribeirinhos da Amazônia, destaca-se a espécie Hoplias malabaricus
dentre os mais citados. A gordura destes peixes é utilizada para o tratamento de doenças
otológicas e oftalmológicas (Begossi & Braga, 1992).
Algumas espécies de peixes vêm sendo utilizadas como bioindicadores através de
análises das respostas biológicas e bioquímicas, desses animais, em decorrência da exposição
aos contaminantes presentes nos ambientes aquáticos (Powers, 1989), visto que eles
apresentam um papel importante no transporte de energia entre os níveis tróficos da cadeia
alimentar (Van Der oost et al., 2003).
Além de avaliar os níveis de poluição do ecossistema aquático, os peixes, podem
servir como espécies sentinelas para estimar os riscos toxicológicos para a espécie humana.
Os poluentes e principalmente as substâncias tóxicas presentes na água, interagem com a
biota em nível celular, e por este motivo, as respostas celulares dos peixes podem constituir
ferramentas sensíveis e satisfatórias para a detecção precoce da exposição a agentes químicos.
Estas respostas são geralmente utilizadas nas áreas biomédicas e toxicológicas (Hightower &
Renfro, 1988).
A espécie Hoplias malabaricus que está localizada no topo da cadeia alimentar por ser
considerada um animal predador, torna-se interessante como uma espécie bioacumuladora de
poluentes, mostrando a importância de estudos com a espécie. Além disso, a traíra apresenta
uma ampla distribuição geográfica, por todo o território brasileiro, podendo ser pescada
durante o ano inteiro. Apresenta, ainda, tolerância a hipóxia que está atribuída a uma
combinação de características tais como o baixo metabolismo e controle muito eficiente da
função cardiorespiratória. Durante situações extremas, a espécie pode ser encontrada
enterrada na lama (Paiva, 1974) e são caracterizadas por apresentarem alta resistência durante
longos períodos de privação de alimentos (Rios et al., 2002). Todas estas características
importantes demonstram a boa resistência da espécie a situações adversas.
Diversos autores já realizaram trabalhos sobre a espécie Hoplias malabaricus no
Brasil, destacando a presença da espécie em todas as regiões do país, em Estados como,
Amazonas, Mato Grosso, Minas Gerais, Goiás, Pará, Paraná, Paraíba, Rio Grande do Sul, Rio
Grande do Norte, Rondônia, Santa Catarina e São Paulo (Bertollo et al., 2000; Born &
Bertollo, 2000, 2006); Dergam et al., 1996, 1998, 2002; Gimenes, 2006; Lucio et al., 2002;
Marques et al., 2001; Centofante, 2003; Pacheco, 2004; Pereira, 2005; Rosa, 2006 ; Martins et
al., 2006; Vicari et al., 2003, 2005, 2006). Hoplias malabaricus vem sendo considerada por
diversos autores como um conjunto de espécies que necessita de uma melhor revisão quanto à
23
classificação, ou seja, para um melhor entendimento da espécie, serão necessários estudos
utilizando-se marcadores moleculares, com o objetivo de melhor caracterizá-la (Oyakama,
1990; Bertollo et al., 2000; Born & Bertollo, 2001).
Para a espécie Hoplias malabaricus, atualmente são identificados sete cariótipos
diferentes (Bertollo et al., 2000; Born & Bertollo, 2001), como pode ser observado na figura
4, conforme descrito a seguire:
1) Cariótipo A: 2n=42, com cromossomos metacêntricos (M) e submetacêntricos (SM) para
ambos os sexos, sem cromossomos sexuais heteromórficos, com distribuição do nordeste
ao sudeste do Brasil, Uruguai e Argentina (Bertollo et al., 2000);
2) Cariótipo B: 2n=42, com cromossomos M e SM para os dois sexos, apresentando um
sistema sexual simples do tipo XX/XY (Born & Bertollo, 2000), com distribuição no Vale
do Rio Doce, no estado de Minas Gerais, Brasil;
3) Cariótipo C: 2n=40, com cromossomos M e SM, sem dimorfismo sexual, com ocorrência
do norte do Brasil ao nordeste da Argentina;
4) Cariótipo D: 2n=40, com cromossomos M e SM para fêmeas e 2n=39 para machos, com a
presença de um sistema cromossômico de determinação do sexo do tipo X1 X1X2
X2/X1X2Y (Bertollo et al., 1983, 1997), e com uma distribuição limitada à bacia
hidrográfica do Paraná superior;
5) Cariótipo E: 2n=42, com cromossomos M, SM e com a presença de um cromossomo
acrocêntrico (par cromossômico 6);
6) Cariótipo F: 2n=40, com cromossomos M e SM sem diferenciação sexual entre os
cromossomos. Há, ainda, uma grande diferença de tamanho entre os dois primeiros pares
cromossômicos e o restante (Bertollo et al., 1997). Esses cariótipos foram observados
desde o Suriname até o sudeste do Brasil, com uma distribuição maior na parte oriental do
continente;
7) Cariótipo G: 2n=40, para as fêmeas e 2n=41, para os machos. Essa diferença ocorre devido
a um sistema sexual múltiplo do tipo XX/XY1Y2 (Bertollo et al., 1983). A presença
destes cariótipos é restrita a alguns locais da Amazônia. Além desses sete cariótipos,
também já foram observadas outras variações numéricas nos cromossomos de indivíduos
de Hoplias malabaricus; como a presença de 2n=39 a 2n=42 para machos e fêmeas
encontrados nas regiões do Alto Paraná (São Paulo), Rio São Francisco (Minas Gerais) e
Aguapey (Argentina) (Bertollo et al., 1983; Dergam & Bertollo, 1990; Lopez et al., 1998 e
24
Rosa, 2006). O padrão de distribuição geográfica destes cariótipos é complexo, com
situações de simpatria e de alopatria (Scavone et al., 1994).
Figura 4. Idiograma parcial dos cariótipos de Hoplias malabaricus. Destaque para o sistema de
cromossomos sexuais, para o maior tamanho do cromossomo 1 dos cariótipos F e G e para
a presença de um cromossomo acrocêntrico nos cariótipos E e G (seta) (Fonte: Bertollo et
al., 2000; Pereira, 2005).
3.3. Desenvolvimento de marcadores microssatélites
Atualmente existem diversos tipos de marcadores moleculares disponíveis para serem
utilizados em estudos de diferentes áreas de pesquisa. Eles podem ser definidos como
características de DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdadas
25
geneticamente e a principal diferença existente entre os variados tipos de marcadores
moleculares está na metodologia utilizada para revelar a variabilidade ao nível de DNA.
Sendo assim, podem variar quanto à habilidade em detectar diferenças entre indivíduos,
quanto ao custo, à facilidade de uso, consistência e repetibilidade (Milach, 1998).
Segundo Hamrick & Godt (1990), a introdução da técnica de eletroforese de
isoenzimas no início dos anos 1960, além de iniciar a era dos marcadores moleculares,
ampliou o número de marcadores genéticos que viriam a ser utilizados. O polimorfismo
detectado pela técnica de eletroforese baseia-se na ocorrência prévia de mutações no DNA, as
quais alteram a constituição e a carga eletronegativa líquida de algumas proteínas com função
enzimática. Após a eletroforese de amostras dessas proteínas, os polimorfismos são
detectados pela visualização do produto enzimático por métodos histoquímicos.
Já na década de 1980, Mullis & Faloona (1987) desenvolveram a técnica de PCR
(Polymerase Chain Reaction), permitindo a síntese enzimática de milhões de cópias de um
segmento específico de DNA, o que provocou uma verdadeira revolução nas técnicas de
biologia molecular, facilitando enormemente os trabalhos de laboratório. O desenvolvimento
desta técnica e as aplicações dela derivadas habilitaram o americano Kary Mullis ao
recebimento do Prêmio Nobel. As aplicações da técnica são inúmeras, sendo utilizada, por
exemplo, desde experimentos relacionados ao sequenciamento de DNA até aplicações
comerciais na área de diagnose (Ferreira & Gratapaglia, 1996).
Os principais tipos de marcadores moleculares podem ser classificados conforme a
metodologia utilizada para identificá-los. Entre os marcadores dominantes destacam-se
aqueles do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism) e os VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), estes últimos
baseados em polimorfismo de minissatélites. Entre os mais utilizados estão os marcadores
codominantes, que podem ser baseados em polimorfismo de isoenzimas, ou polimorfismo no
DNA, tais como o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e o SSR (Simple
Sequence Repeats) ou microssatélites. (Ferreira & Gratapaglia, 1996). Qualquer que seja a
técnica utilizada, as principais etapas necessárias para obtenção de resultados variam com o
tipo de marcador molecular.
Atributos como consistência e tempo para obtenção de resultados, nível de
polimorfismo obtido, custo e facilidade de uso são fatores importantes que devem ser
considerados quando da escolha da técnica a ser utilizada em estudos genéticos. Enquanto que
marcadores RFLP têm sido utilizados em estudos de mapeamento comparativo devido à
26
consistência dos resultados obtidos, estes tendem a ser mais caros. Por outro lado, os
marcadores identificados por amplificação via PCR (Polymerase Chain Reaction),
especialmente os marcadores RAPD, são mais fáceis de serem manipulados e apresentam
menor custo, embora gerem resultados menos consistentes. Outros marcadores como os SSR
(microssatélites) e os AFLP revelam mais polimorfismo e têm sido a melhor opção para
estudos genéticos de populações (Ferreira & Grattapaglia, 1996; Milach, 1998).
Os marcadores SSR (Simple Sequence Repeats), (Tautz, 1989) também chamados
STRs (Short Tandem Repeats) (Edwards & Elgar, 1998) foram descritos por três grupos de
pesquisadores, consistindo de fragmentos de DNA contendo pequenas repetições em tandem
(lado a lado), com sequências contendo de 1 a 6 nucleotídeos flanqueados por sequências
altamente conservadas (Litt & Luty, 1989; Tautz, 1989). Podem ser encontrados amplamente
distribuídos pelo genoma dos eucariotos, embora também estejam presentes em procariotos.
Os microssatélites localizam-se em maior proporção em regiões não codificantes do genoma,
mas também ocorrem em regiões codificantes (Litt & Luty, 1989; Tautz et al., 1994; Tautz,
1989).
São marcadores que apresentam uma série de características desejáveis em estudos
genéticos: são codominantes, ou seja, permitem a distinção entre homozigotos e
heterozigotos, sendo, portanto, altamente informativos (Powell, 1996). São multialélicos,
devido ao processo recorrente de expansão e contração no número de unidades repetitivas ao
longo das gerações, possibilitando a discriminação de indivíduos geneticamente distintos; são
amplificados via PCR, utilizando um par de iniciadores específico, complementar às regiões
flanqueadoras, o que facilita sua obtenção, mesmo com poucas quantidades de DNA; uma vez
desenvolvidos os iniciadores que amplificam tais regiões do genoma, estes podem ser
compartilhados entre laboratórios para a realização de diversos estudos. Além disso, o
resultado da amplificação via PCR revela o polimorfismo resultante da presença de diferentes
números de elementos simples repetidos na região microssatélite (Morgante & Olivieri, 1993;
Ellegren, 2004; Grattaplaglia & Kirst, 2007).
O alto polimorfismo observado nesse tipo de marcador é decorrente das altas taxas de
mutações presentes nas regiões microssatélites (Oliveira et al., 2006). As taxas de mutação
variam de loco para loco, sendo essa variação cerca de 10
-2
a 10
-6
nucleotídeos por loco por
geração (Schlötterer et al., 2000), resultando em uma ampla variação no número de unidades
repetidas (Ellegren, 2004). Por este motivo, os marcadores baseados em microssatélites são
considerados altamente informativos em estudos genéticos de populações (Goldstein &
27
Schlötterer, 2001; Oliveira et al., 2008). São também amplamente utilizados em construções
de mapas genéticos, análise de paternidade e estudos forense (Zhao & Kochert, 1993; Ferdig
& Su, 2000; Leoi, 2008; Melo et al., 2008).
Os marcadores microssatélites são potencialmente polimórficos (Tautz, 1989; Weber
et al., 1990) uma vez que apresentam grande diversidade no tipo de unidade de repetição
(Tabela 1). Estes marcadores podem ser classificados como perfeitos, quando a sequência
repetida não é interrompida por outra base que não pertença ao motivo; imperfeitos, quando
existe entre os motivos pares de bases que não correspondam aos mesmos; ou podem ser
compostos, quando contém duas sequências distintas repetidas adjacentes (Weber, 1990;
Oliveira et al., 2006) (Figura 5).
Tabela 1. Diversidade no tipo de unidade repetitiva de marcadores moleculares microssatélites
(Tautz, 1989; Weber et al., 1990).
Unidade repetitiva (SSR)
Mononucleotídica
(G)n
Dinucleotídica
(GA)n
Trinucletídica
(GAT)n
Tetranucleitídica
(GATA)n
Pentanucleitídica
(GATAC)n
Hexanucleitídica
(GATACA)n
A origem da alta variabilidade dos microssatélites está associada a três tipos de
mecanismos. O primeiro está relacionado a elementos de transposição que são sequências
repetitivas dispersas no genoma cuja função é fazer cópias de si e reinserí-las no genoma em
posições aleatórias, como por exemplo, em uma região adjacente (Nadir et al., 1996). O
segundo fator está relacionado com a ocorrência de crossing-over desigual no qual ocorre erro
no emparelhamento entre cromossomos homólogos causados pela grande quantidade de
repetições e as cromátides erradamente emparelhadas causarão alterações no número de
repetições de microssatelites em cada cromossomo. Essa hipótese justifica as variações muito
grandes no tamanho dos microssatélites (Smith, 1973). O último fator seria slipped strand
mispairing, que significa um erro de pareamento causando um “escorregão” do DNA
polimerase da fita molde durante a replicação, que acaba por deixar de incorporar grampos
“repeats” ou adicionar novos “repeats”, formando uma nova fita de DNA com quantidade de
repetições diferentes de fita molde. Esta é a hipótese mais aceita no meio científico, pelo fato
28
de explicar o surgimento de pequenas variações no número de repetições entre os diferentes
alelos dentro do loco, característica comumente encontrada em regiões microssatélites
(Streisinger et al., 1966; Oliveira et al., 2006).
Figura 5. Classificação dos microssatélites (A) perfeitos, (B) imperfeitos, (C) compostos (Fonte:
Weber, 1990).
De acordo com Beckmann & Weber (1992), a distribuição e a frequência de regiões
microssatélites variam entre diferentes classes de organismos. No genoma humano são
comuns as sequências poliA e os dinucleotídeos AC/TG. Em Drosophila melanogaster os
dinucleotídeos mais comuns são CA/GT e em plantas são AT/TA seguidos por AG/TC
(Lagercrantz et al., 1993; Schug et al., 1998).
Contudo, classes contendo repetições de dinucleotídeos AT/TA não são ideais para
análises populacionais, por serem altamente instáveis em condições de PCR devido à sua
complementariedade. De acordo com alguns autores (Edwards et al., 1998; Elgar et al., 1999;
Aguero et al., 2000) é mais comum encontrarmos microssatélites do tipo dinucleotídicos do
que trinucleotídicos, e assim por diante.
Os locos microssatélites de cópia única, cuja informação alélica seja facilmente
visualizada, são os mais utilizados em estudos genéticos de populações, permitindo uma
análise mais segura (Bancroft, 2001). De acordo com a literatura, há uma correlação positiva
entre o número de repetições presentes num loco microssatélite (tamanho final da sequência)
com o número de alelos e heterozigosidade (Byrne et al., 1996; Cho et al., 2000). Sendo
29
assim, alelos maiores, ou seja, com maior número de motivos, são mais interessantes em
análises genéticas, possibilitando a geração de maior informação por loco, principalmente em
estudos de paternidade e genética de populações.
Os marcadores microssatélites são considerados ideais para estudos de genética e
evolução devido a algumas características importantes, como seu alto poder discriminatório,
sua robustez, praticidade operacional, confiabilidade e por serem geneticamente mais
informativos (Slatkin, 1995). Esses marcadores têm se mostrado extremamente eficientes na
caracterização e entendimento da estrutura genética de populações, na determinação do fluxo
gênico, da variabilidade genética e quantificação dos efeitos de fragmentação de habitats. Tais
informações são fundamentais na definição de estratégias de conservação, pré-melhoramento
e melhoramento genético (Parker et al., 1998; Goldstein & Schlotterer, 2001).
As regiões microssatélites são bastante abundantes dentro do genoma de diversos
organismos, entretanto estas regiões, em nível de sequências, não são bem caracterizadas, pois
a grande maioria dos locos microssatélites já estudados foram isolados de bibliotecas
genômicas, através da utilização de sondas oligonucleotídicas. Isto dificulta a avaliação da
variação de tamanho das regiões microssatélites em populações e impossibilita avaliar qual é
a variabilidade e qual é a quantidade de tipos de sequências no genoma (Goldstein &
Schlotterer, 1999).
Outro fator importante que deve ser citado é que microssatélites que contenham
motivos formados por nucleotídeos que possam formar estruturas secundárias, como por
exemplo, (AT)n/(TA)n, não são identificados através de bibliotecas enriquecidas. Além disso,
dificilmente são construídas bibliotecas para tri-, tetra- e pentanucleotídeos sem que se saibam
suas frequências, visto que as possibilidades de composição de motivos aumentam
progressivamente de acordo com o aumento do tamanho do motivo (Goldstein & Schlotterer,
1999).
A obtenção das regiões microssatélites envolve uma série de passos, sendo que o
primeiro deles consiste na identificação das sequências, que podem ser obtidas diretamente de
bibliotecas genômicas, bibliotecas de cDNA, bibliotecas enriquecidas para sequências
microssatélites, ou ainda a partir de sequências depositadas em bancos como o GenBank
(Zane et al., 2002; Gao et al., 2003).
Com a conclusão do projeto genoma, a capacidade de sequenciamento aumentou
muito em escala, em função da diminuição do seu custo total e do desenvolvimento de várias
técnicas mais robustas (Hutchison, 2007; Shendure & Ji, 2008). O método de Sample
30
Sequencing (sequenciamento de DNA por amostragem), também chamada de Random
Sequencing (sequenciamento aleatório de DNA), aliado a uma estratégia de clonagem
Shotgun DNA Sequencing tem sido muito utilizado para estudos sobre a estrutura e
composição do genoma de diversos organismos (Venter et al., 2002; Aparicio et al., 2002).
Todas as estratégias de sequenciamento de genomas são baseadas em clonagem.
Primeiro, prepara-se uma biblioteca de clones, que em seguida, é seqüenciado para a obtenção
da sequência da inserção imediatamente adjacente ao vetor. Entretanto, existem duas
estratégias de se montar uma sequência de consenso de um genoma: a primeira é chamada de
sequenciamento hierárquico (sequenciamento de clone ordenado); nesse caso, uma das
primeiras etapas é a construção de um mapa físico do genoma para que os fragmentos
sequenciados possam ser facilmente montados (Waterston et al., 2001). Segundo Takahashi et
al. (1996), amplas regiões do DNA genômico, como por exemplo um cromossomo, são
cortados em grandes fragmentos e clonados em vetores específicos como BACs, PACs, e
YACs .
A segunda estratégia, chamada de sequenciamento Whole-genome shotgun (WGS)
consiste em sequenciar primeiro e mapear depois. As leituras de sequencias são obtidas de
clones selecionados aleatoriamente de uma biblioteca genômica total sem nenhuma
informação sobre onde estes clones estão mapeados no genoma. Esta técnica é chamada de
biblioteca shotgun e estas leituras de sequências são montadas em uma sequência de consenso
cobrindo o genoma total, ajustando às sequências homólogas compartilhadas por leitura de
clones superpostos (Waterston et al., 2001).
Para isso, o genoma total de um organismo é fragmentado em pequenos pedaços,
através de quebra mecânica (por sonicação ou nebulização) e inúmeras bibliotecas são
geradas desses fragmentos aleatórios (Figura 6). O tamanho dos fragmentos clonados
geralmente varia entre 1000 a 4000 pares de bases, podendo chegar a até 10.000 pares de
bases. Esta estratégia pode ser aplicada em genomas bacterianos de um modo direto, portanto
qualquer determinada leitura de sequência de DNA de um genoma bacteriano virá de um
único local por possuir apenas algumas megabases de DNA em tamanho (Waterston et al.,
2001).
31
Figura 6. Estratégia de sequenciamento Whole-genome shotgun (WGS), (Fonte: Waterston et al.,
2001).
Segundo Griffiths et al. (2006) o sequenciamento começa a partir de iniciador,
baseados nas sequências de DNA do vetor adjacente, que são usados para guiar a reação de
sequenciamento na inserção. Com isso, as curtas regiões em uma ou ambas as pontas das
inserções genômicas podem ser sequenciadas, e após o sequenciamento, o resultado é uma
grande coleção de sequências curtas e aleatórias onde algumas delas estão superpostas (Figura
7). As sequencias de leituras superpostas são montadas em unidades chamadas sequências de
contings (sequências que são contiguas, ou seja, que se tocam, sendo que cada contig cobre
uma grande região do genoma).
Os espaços ocasionais ocorrem sempre que uma região do genoma não é, por acaso,
encontrada em uma biblioteca shotgun, e alguns fragmentos de DNA não são determinados
em vetores de clonagem. Esses espaços são preenchidos por técnicas tais como primer
32
walking, ou seja, a utilização de uma sequência final clonada como um primer para sequenciar
os fragmentos não clonados adjacentes (Griffiths et al., 2006).
Figura 7. Produção de leitura de sequenciamento de inserções terminais (Fonte: Griffiths et al.,
2006).
A utilização da estratégia shotgun em estudos genéticos vem aumentando a cada ano.
Em 2003, 112 espécies procarióticas foram totalmente sequenciadas utilizando esta estratégia
e também tem sido muito utilizada para genomas de eucariotos, incluindo para estudos do
genoma humano (Griffiths et al., 2006).
O problema de sequenciar genomas complexos é a grande presença de DNA
repetitivo. A estratégia shotgun é considerada como muito boa em produzir sequências com
qualidade rascunho de genomas complexos, como exemplo o genoma da mosca Drosophila
melanogaster que foi inicialmente sequenciado por esse método (Griffiths et al., 2006).
Ainda de acordo com Griffiths et al. (2006), as leituras de sequência de ambas as
pontas de inserções de clones genômicos são obtidas e alinhadas às superposições de
sequências homologas que são identificadas e os clones colocados em ordem, produzindo
sequências contigs de consenso para trechos de copia única do genoma, ao contrário da
situação das bactérias, onde há apenas DNA de copia única, e os contigs eventualmente estão
em um segmento repetitivo de DNA, tal como um elemento genético móvel, fato que impede
33
a montagem não ambígua dos contigs em um genoma total. A solução para este problema é
conhecer quais pares de leituras de sequências vieram de pontas opostas das inserções
genômicas no mesmo clone, que são chamadas de leituras de pontas pareadas. A idéia é
encontrar leituras de pontas pareadas que cubram os espaços entre duas sequências contigs, ou
seja, se a ponta de uma inserção fosse parte de um contig e a outra ponta fosse parte de um
segundo contig, então esta inserção deveria cobrir o espaço entre dois contigs, e os dois
contigs estariam claramente próximos um do outro (Figura 8).
Figura 8. Leituras de sequencias pareadas para unir duas sequencias de contigs em um arcabouço
ordenado e orientado (Fonte: Griffiths et al., 2006).
O alinhamento das sequências de dois contigs usando leituras de pontas pareadas,
automaticamente determina a orientação relativa dos dois contigs e deste modo, os contigs de
cópia única podem ser unidos, embora com espaços onde residem os elementos repetitivos.
Essas coleções espaçadas de contigs de sequências unidas são chamadas de arcabouços ou
supercontigs (Griffiths et al., 2006) (Figura 9).
34
Figura 9. Montagem de sequenciamento shotgun de genoma inteiro (Fonte: Griffiths et al., 2006).
Tanto pela estratégia shotgun do genoma inteiro, quanto pelo sequenciamento
ordenado de clones, ainda restarão alguns espaços e esses espaços se devem às sequências do
genoma que são incapazes de crescer dentro do hospedeiro de clonagem bacteriana. Devem
ser usadas técnicas especiais para preencher estes espaços nas montagens das sequências. Se
os espaços são curtos, os fragmentos de PCR podem ser gerados a partir de primers baseados
nas pontas das montagens, e estes fragmentos de PCR podem ser diretamente sequenciados
sem uma etapa de clonagem (Griffiths et al., 2006).
O método primer walking sucessivo, às vezes cobre o espaço, mas se os espaços são
maiores, podem ser feitas tentativas para clonar utilizando hospedeiros diferentes, como por
exemplo, leveduras. Se a clonagem falha em um hospedeiro diferente, então os espaços na
sequências deverão continuar (Griffiths et al., 2006).
A estratégia de seqüenciamento shotgun já foi utilizada no Brasil para o
sequenciamento do genoma de cana-de-açúcar, onde foram sequenciados um total de 340.000
ESTs (Expressed Sequencing Tags ou Sequências Expressas Marcadas). O Brasil tem se
destacado no sequenciamento de genomas de diversos organismos através de muitos projetos
em redes, envolvidos nos laboratórios de biologia molecular em mais de 48 instituições de
ensino e pesquisa, com a mobilização de cerca de 240 cientistas de quase todas as regiões do
país (Waterston et al., 2001).
35
O desenvolvimento de marcadores de regiões microssatélites, através das
metodologias tradicionais de construção de bibliotecas enriquecidas, é mais trabalhoso e
demanda mais tempo e recursos financeiros do que utilizando a abrodagem de biliotecas
randômicas. Entretanto, uma vez desenvolvidos os iniciadores para uma determinada espécie,
a técnica se torna simples e de baixo custo, além da vantagem de demandar pequena
quantidade de DNA e poder ser analisada de forma semi-automatizada, gerando grandes
quantidades de dados genéticos em espaço de tempo relativamente curto (Grattapaglia, 2007).
Além disso, os iniciadores de microssatélites são transferíveis entre indivíduos da mesma
espécie, entre gêneros e muitas vezes entre gêneros distintos, diminuindo custos e mão de
obra (Zane et al., 2002; Grattapaglia, 2007). As sequências de DNA contendo microssatélites
podem ser obtidas diretamente de bibliotecas genômicas, bibliotecas para sequências
microssatélites ou sequências depositadas em bancos de dados. A transferibilidade ou
amplificação heteróloga dos iniciadores de regiões microssatélites entre espécies relacionadas
é possível devido à homologia de sequências genômicas e está relacionada ao grau de
conservação das sequências flanqueadoras da região microssatélite e à distância taxonômica
entre as espécies de interesse
A presença de regiões microssatélites em ESTs tem possibilitado o desenvolvimento
de marcadores SSR de um modo simples, relativamente rápido e direto, através da busca
eletrônica em bancos de dados de ESTs. O aproveitamento desta importante fonte de
marcadores, entretanto, é limitado para espécies que possuem bancos de dados disponíveis
para análise GenBank (Zane et al., 2002; Grattapaglia, 2007). Por este motivo, torna-se
importante o desenvolvimento de iniciadores para regiões microssatélites em um número
maior de espécies. Assim, muitos estudos genético-populacionais, de melhoramento, manejo e
conservação das espécies poderão ser desenvolvidos.
36
4. M A T E R I A L E M É T O D O S
O presente estudo foi desenvolvido nos Laboratórios de Biotecnologia da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa Arroz e Feijão e de Genética &
Biodiversidade da Universidade Federal de Goiás.
4.1. Áreas de coleta das amostras
As amostras da espécie Hoplias malabaricus foram coletadas em quatro áreas: A
primeira área foi na bacia do rio Caiapó, que possui cerca de 12.000 km
2
, incluindo 11
municípios goianos: Amorinópolis, Aragarças, Arenópolis, Bom Jardim de Goiás, Caiapônia,
Diorama, Iporá, Ivolândia, Montes Claros, Palestina de Goiás e Piranhas. O rio Caiapó é
afluente do rio Araguaia pela margem direita e a sua bacia hidrográfica situa-se no oeste
goiano do estado de Goiás (Arruda, 2006) (Figura 10).
Além de garantir ambientes de desova, forrageamento e proteção à grande parte das
espécies de peixes da bacia do alto rio Araguaia, a região apresenta-se como um conjunto de
possibilidades de manutenção de diversidade (Arruda, 2006).
Figura 10. Localização da bacia hidrográfica do rio Caiapó, Goiás (Fonte: Google Earth, 2010;
AGMA, 2004).
A segunda área de coleta se localiza no Sítio Mucunã, município de Hidrolândia,
Estado de Goiás (Figura 11). A sua hidrografia é formada pelo rio Meia Ponte que banha o
município em pequena extensão, os ribeirões das Lages, Santo Antônio e o córrego da Serra
(Barbosa, 2002).
37
Figura 11. Sitio Mucunã no Município de Hidrolândia, Goiás (Fonte: Google Earth, 2010).
A terceira área de coleta foi o Lago Municipal (Lago do Sol) do município de
Anicuns, Goiás (Figura 12). O município teve origem na exploração de ouro em meados do
século XVIII. Sua estrutura hidrográfica é composta por dois rios, o Cachoeirinha de São José
e o Rio dos Bois (Dooles, 1978).
Figura 12. Lago Municipal (Lago do Sol) do município de Anicuns, Goiás (Fonte: Google Earth,
2010).
A quarta área de coleta foi o Lago Serra da Mesa, que é considerado como o quinto
maior lago do Brasil e está localizado no Noroeste do Estado de Goiás, onde foi construída a
usina hidrelétrica de Serra da Mesa. O lago está em uma área inundada, com 1784 km², na
elevação de 460m (em relação ao nível do mar) e é o primeiro lago em volume de água 54,4
bilhões de metros cúbicos. Além disso, o Lago Serra da Mesa apresenta uma das mais ricas
diversidades de peixes do estado de Goiás (Figura 13) (Ferreira & Pellegrini, 2005).
38
Figura 13. Lago Serra da Mesa. Localizado no estado Goiás (Fonte: Google Earth, 2010).
Todos os locais de coleta dos indivíduos da espécie Hoplias malabaricus foram
georeferenciados com o uso de um GPS (Global Position System), conforme descrito na
Tabela 2.
Tabela 2. Área de coleta, local, código (Cód.), coordenadas geográficas (longitude e latitude) e
altitude (m).
Área de Coleta
Cód.
Longitude
Latitude
Altitude (m)
Rio Caiapó - GO
RCG
-43,96300
-11,83400
534
Sítio Mucunã - GO
SMG
-48,34838
-13,67493
387
Lago Municipal de Anicuns - GO
LMAG
-42, 53726
-11,37542
467
Lago Serra da Mesa - GO
LSMG
-41,48723
-10,34987
489
4.2. Coleta do material biológico e extração do DNA
A coleta dos indivíduos, no Rio Caiapó, da espécie Hoplias malabaricus foi realizada
pela empresa Naturae Consultoria Ambiental, devidamente autorizado pelo IBAMA (Instituto
Brasileiro do meio Ambiente e dos Recursos renováveis). Foram coletados 18 indivíduos de
Hoplias malabaricus oriundos do Rio Caiapó, 21 indivíduos do Sítio Mucunã, 8 do Lago
Municipal de Anicuns e 5 indivíduos do Lago Serra da Mesa.
Para o isolamento e posterior desenvolvimento dos iniciadores, o DNA total de um
único indivíduo foi extraído de amostras do tecido muscular utilizando o protocolo de
extração SDS (Sodium dodecyi sulphete) - fenol/clorofórmio (modificado de Bruford et al.
39
1992), de acordo com as etapas descritas no Anexo I. O mesmo protocolo foi utilizado para a
extração do DNA de todos os indivíduos utilizados para a caracterização dos locos
padronizados.
Após a extração, o DNA total foi quantificado com o auxílio de um marcador de peso
molecular conhecido, em gel de agarose 1% e tampão para eletroforese TBE (Tris Borato -
EDTA) na concentração de 1x. Para a visualização das bandas o gel foi corado com brometo
de etídeo (10mg/mL) e fotografado por fotodocumentador.
4.3. Construção da biblioteca Genômica e sequenciamento
A bilbioteca genômica foi construída utilizando a metodologia shotgun utilizando o
protocolo descrito no Anexo II. As principais etapas desta metodologia consistem na
fragmentação do DNA por sonicação, com o objetivo de produzir fragmentos de diversos
tamanhos, sem qualquer tipo de viés gerado por aumento de temperatura (Bankier et al.,
1987). Para a checagem do tamanho desses fragmentos de DNA, realizou-se uma eletroforese
em gel de agarose 1%, com o auxílio do marcador de peso molecular 1Kb. Em seguida, as
extremidades desses fragmentos de DNA foram tratadas por uma reação pk, para posterior
ligação ao vetor de clonagem pMOSBlue, segundo protocolo do pMOSBlue Blunt Ended
Cloning Kit, fornecido pela Amersham Biosciences (Sambrook et al., 1989). Para catalisar a
ligação dos fragmentos de DNA ao vetor de clonagem foi utilizado a enzima T4 DNA ligase.
Para a realização da clonagem, a reação de ligação foi inserida em células competentes,
disponibilizadas no próprio Kit. Finalmente as células transformadas foram aliquotadas em
placas de Petri contendo meio LB sólido e os antibióticos Ampicilina e Tetraciclina.
Para a seleção das células transformantes, realizou-se o repique das colônias positivas
(de cor branca), com auxílio de uma haste de madeira autoclavada. As colônias positivas
foram, então, transferidas para placas deepwell contendo 110µl de meio Circle Grow,
permitindo o crescimento das colônias de bactérias. Em seguida, realizou-se a preparação de
reações de miniprep em placas por lise alcalina, seguindo o protocolo sugerido por Sambrook
et al. (1989) (Anexo III).
As reações de seqüenciamento foram preparadas a partir da precipitação com
isopropanol, seguido de purificação com etanol e secagem em termociclador. Estas reações
foram armazenadas a -20°C, protegidas da luz. Imediatamente antes do procedimento de
sequenciamento foi adicionado formamida Hi-Di às amostras que, em seguida, foram
desnaturadas em termociclador por 5 minutos à 95°C e colocadas por 2 minutos no gelo. As
40
reações de sequenciamento foram montadas utilizando o Kit DYEnamic ET Termintor (GE
Healthcare) (Anexo IV) e os fragmentos de DNA foram submetidos ao sequenciador
automático ABI 3100.
A última etapa envolveu o processo de busca de regiões microssatélites na parte do
genoma que foi sequenciada. Para tanto, essas sequências foram depositadas na plataforma
BIOFOCO, (Rede de Pesquisa e Desenvolvimento em Bioinformática do Centro-Oeste), onde
foram avaliadas quanto à qualidade, sendo consideradas como válidas aquelas com um
número mínimo de 250 pares de base com phred > 20 (Castelo, 2002). O desenho dos
iniciadores foi efetuado utilizando o software PRIMER 3, onde se inicia a procura dos
iniciadores microssatélites de acordo alguns parâmetros pré-estabelecidos, tais como:
tamanho dos oligonucleotídeos variando entre 18 a 26 nucleotídeos, temperatura de
anelamento entre 55ºC e 72ºC, diferença de temperatura de anelamento entre os dois
iniciadores do par (<=1ºC), o conteúdo % GC (entre 40 e 60%). Foram evitados iniciadores
com diferença de temperatura de anelamento de 4°C, iniciadores com diferença de conteúdo
de G e C superior a 5%, a complementaridade de sequências ou que formem dímeros na
extremidade 3’OH e procurou-se, ainda, evitar os iniciadores que formem estruturas
secundárias ou que se complementem (Rozen & Skaletsky, 2000).
Do total de regiões microssatélites encontradas, foram escolhidos para a realização da
padronização 25 iniciadores utilizando alguns critérios, tais como o tamanho do motivo e o
número de repetições. Depois de sintetizados, os iniciadores foram submetidos a diversos
testes de amplificação utilizando três indivíduos da espécie Hoplias malabaricus para
verificar a eficiência da amplificação locos microssatélites isolados. Assim, os iniciadores
obtidos foram testados por meio de reações em cadeia da polimerase (PCR) em termociclador,
conforme protocolo descrito na Tabela 3. Para cada um dos iniciadores foi necessária a etapa
de ajuste da temperatura de anelamento e, quando necessário, foram feitos ajustes na
concentração dos reagentes, a fim de melhorar a amplificação dessas regiões de interesse e
possibilitar a obtenção de genótipos oriundos de locos que apresentassem uma segregação
com padrão esperado (Tabela 4).
41
Tabela 3. Protocolo das Reações em Cadeia da Polimerase demonstrando os reagentes utilizados e
suas concentrações de uso e volumes, para um sistema de 15µl.
Reagentes
Concentração
Volume (µl)
DNA
25ng/µl
5,0
Iniciador (F+R)
1,8mM
4,4
Tampão da enzima
10X
1,5
dNTP´s
2,5mM
1,3
BSA
10mg/ml
1,3
MgCl2
50mM
0,5
H2O MilliQ - autoclavada
-
0,8
Taq-Polimerase
5U
0,2
Total
-
15
Em seguida, a mistura desses reagentes da PCR (mix) foi acondicionada aos tubos
contendo o DNA de cada indivíduo e levada ao termociclador, programado conforme descrito
na Tabela 4.
Tabela 4. Programa de termociclagem para regiões microssatélites.
Passo
Tempo
Temperatura
1
5’
94°C
2
1’
94°C
3
1’
TA
1
4
1’
72°C
5
30 ciclos (2 - 4)
-
6
7’
72°C
1
- TA (Temperatura de anelamento do iniciador)
Os produtos de PCR gerados foram submetidos a uma eletroforese vertical utilizando
gel desnaturante de poliacrilamida na concentração de 6% e TBE 1X, com duração de cerca
de 2 horas a 90 W. Em seguida, a coloração do gel foi realizada com nitrato de prata
conforme o protocolo de Creste et al. (2001) (Anexo V). Após a revelação e secagem das
placas contendo os géis, elas foram colocadas sobre luz branca para a obtenção dos genótipos.
42
A genotipagem foi feita sobre a luz branca pela comparação do tamanho dos alelos de cada
indivíduo com os fragmentos de tamanho conhecido do marcador de massa molecular 10
pares de bases da Invitrogen
®
. Após a etapa de padronização, os locos considerados bons
foram caracterizados utilizando os 48 indivíduos.
A confirmação da existência e do tamanho de todos os alelos foi feita por meio da
elaboração de uma escada alélica, obtida com base na realização de uma nova eletroforese,
em gel de poliacrilamida, dos produtos amplificados arranjados na sequência crescente de
tamanho dos alelos.
4.4. Caracterização da variabilidade genética presente nos locos padronizados
A partir da codificação dos iniciadores desenvolvidos e padronizados nos 48
indivíduos da espécie Hoplias malabaricus, foi construída uma matriz de dados com os
genótipos, que foi utilizada para realizar uma análise descritiva a partir da estimativa das
medidas de variabilidade apresentadas a seguir: proporção de locos polimórficos, número de
alelos observados (Na), número médio de alelos, amplitude de variação do tamanho dos alelos
em pares de base (AVA) índice de fixação (f), conforme sugerido por (Alfenas et al. 1991). O
número efetivo de alelos foi calculado por:
n
i
i
p
1
2
1
onde I é o número de locos ; pi é a freqüência do i-ésimo alelo na população.
Para estimar a diversidade genética foi calculada a heterozigosidade média observada
(Ho), obtida pela média aritmética das proporções do número total de heterozigotos em
relação ao número total de indivíduos entre os locos analisados. A heterozigosidade esperada
(He) ou diversidade de (Nei, 1973) foi calculada por:
r
i
k
j
ij
e
n
p
n
r
H
1
1
2
12
1
2
1
onde n é o número de indivíduos, r é o número de locos, k é o número de alelos no loco i e pij
é a freqüência do j-ésimo alelo do i-ésimo loco. Com base nas estimativas das
heterozigosidades esperadas e observadas (He e Ho), calculou-se o índice de fixação ou
43
coeficiente de endogamia (f) para cada população, como medida da deficiência ou excesso de
heterozigotos, (Weir, 1996).
A freqüência estimada de alelos nulos foi calculada segundo (Brookfield, 1996),
assumindo panmixia e que toda deficiência de heterozigotos relativa às proporções de Hardy-
Weinberg foi devida aos alelos nulos e não à subdivisão de população.
A Probabilidade de Exclusão de Paternidade (PE), que se refere a probabilidade de se
excluir uma falsa paternidade foi calculada conforme sugerido por (Evett & Weir 1998).
Sendo (p
u
) as freqüências alélicas do loco (u) na população, Q a probabilidade de que pelo
menos um loco do sistema permita a exclusão de um dos prováveis pais. Esta probabilidade,
por loco(Q
L
), pode ser estimada por:
A Probabilidade de Identidade, que é a probabilidade de dois indivíduos escolhidos
aleatoriamente em uma população terem genótipo idêntico, foi calculada segundo (Paetkau et
al. 1998).
As análises foram realizadas utilizando os softwares GDA (Genetic Data Analysis)
(Lewis & Zaykin, 2001), IDENTITY 1.0 (Wagner & Agner & Sefc, 1999) e Tools for
Population Genetic Analyses (TFPGA) version 1.3 Mark P. (Miller, 1997).
44
5. R E S U L T A D O S E D I S C U S S Ã O
5.1. Busca de regiões microssatélites em sequências genômicas de Hoplias malabaricus
A qualidade das sequencias, utilizando o software BIOFOCO, apresentou uma média
igual a 73,5 sequencias aceitas por placa e, consequentemente, o número médio de sequencias
rejeitadas foi igual a 22,4 por placa (Figura 14).
Figura 14. Número de sequencias aceitas (boa qualidade) e rejeitadas utilizando o software
BIOFOCO.
Do total de amostras contendo sequências válidas, foram geradas 662 sequências com
padrão de qualidade adequado para a procura de regiões microssatélites, conforme descrito na
Tabela 5.
Nas 662 sequências válidas foi possível encontrar 78 que continham regiões
microssatélites com diferentes motivos de repetição (Apêndices I). Do total de sequencias que
apresentaram regiões microssatélites foram encontradas 39 regiões contendo dinucleotídios,
10 contendo trinucleotídios, 22 contendo tetranucleotídios e 5 contendo pentanucleotídios.
(Figura 15).
45
Tabela 5. Sequencias aceitas e rejeitadas por placa analisadas pelo software BIOFOCO.
Placas
S.A
1
S.R
2
1
77
19
2
87
9
3
30
66
4
86
10
5
83
13
6
65
31
7
67
29
8
87
9
9
79
16
Total
662
202
S.A
1-
Sequencias aceitas
S.R
2 -
Sequencias rejeitadas.
Figura 15. Porcentagem de tipos de motivos repetitivos nas 78 regiões microssatélites identificadas
no genoma da espécie Hoplias malabaricus.
Os tipos de motivos que apareceram no genoma de Hoplias malabaricus foram: 1)
dinucleotídeos: GA, CA, TG, TC, AG, CT, TA, GT, AC, AT; 2) trinucleotídios: CAC, AAC,
TAA, AAT, GGA, TTG, ATT; 3) tetranucleotídios: CATT, CACT, TCAC, GTGA, TTCA,
TTTG, TCAT, AAAG, TGTT, TGTT, TAAT, CTGG, AATG, TCAT, TTTA, CTAT, AAAC,
46
GCAG, ACTC; 4) pentanucleotídio: TTTAT, AAAAT, TTTTG, ATTTG, TTTTA; 5). O
resultado encontrado confirma que a estratégia de sequenciamento aleatório a partir de
bibliotecas shotgun é de fato uma estratégia adequada para a busca de diferentes tipos de
regiões microssatélites, além de possibilitar uma economia de tempo e mão-de-obra
(Waterston et al., 2001).
5.2. Caracterização dos locos microssatélites desenvolvidos para Hoplias malabaricus
Dos 78 iniciadores desenhados (Apêndice II), 25 foram escolhidos para a síntese e
padronização da amplificação. Estes 25 iniciadores contêm 10 regiões microssatélites
compostas de dinucleotídios, 3 de trinucleotídios, 11 de tetranucleotídios e um de
pentanucleotídios (Figura 16).
Dos 25 locos testados, 14 apresentaram produtos de amplificação satisfatórios e foram,
portanto, considerados padronizados. Durante a padronização das condições de amplificação,
houve a necessidade de ajuste nas condições de amplificação para o loco Hmal-15 (Anexo
VI).
A faixa de variação do tamanho dos alelos dos 14 locos padronizados ficou entre 136 e
236 pares de bases (pb), conforme descrito na Tabela 6. Os locos Hmal-11, Hmal-15, Hmal-
26, Hmal-39, Hmal-59, Hmal- 6, Hmal-71, e Hmal-72 apresentaram-se monomórficos para os
48 indivíduos, portanto, não são informativos para análises genético-populacionais. Para os
locos Hmal-9, Hmal-23, Hmal-33, Hmal-34, Hmal-46 e Hmal 60 foi possível observar a
presença de polimorfismos (Tabela 6).
47
Figura 16. Proporções das 25 regiões microssatélites escolhidas para a espécie Hoplias malabaricus,
de acordo com o tamanho do motivo.
A figura 18 exemplifica o padrão de amplificação dos locos Hmal-60, Hmal-34, Hmal-
23, Hmal-46, Hmal-33 e Hmal-9. O número médio de alelos nos locos polimórficos foi igual
a 2,166, variando entre 2 a 3 alelos por loco (Tabela 6). Para cada loco, foi confirmada a
existência de cada um dos alelos a partir de uma nova eletroforese dos fragmentos de
amplificação obtidos do menor número de indivíduos que contemplava todos os alelos de
cada loco, formado uma escada alélica (Figura 19).
48
Figura 17. Perfil eletroforético, em gel desnaturante de poliacrilamida 6%, de seis locos
microssatélites polimórficos (Hmal-60, Hmal-34, Hmal-23, Hmal-46, Hmal-33 e
Hmal-9) desenvolvidos para espécie Hoplias malabaricus.
49
Figura 18. Escadas alélicas para a confirmação da altura dos alelos dos 14 locos microssatélites
desenvolvidos para a espécie Hoplias malabaricus, onde 1.Hmal-71, 2.Hmal-69, 3.Hmal-
9, 4.Hmal-23, 5.Hmal-15, 6.Hmal-39, 7.Hmal-26, 8.Hmal-46, 9.Hmal-33, 10.Hmal-60,
11.Hmal-59, 12.Hmal-72, 13.Hmal-11, 14.Hmal-34, analisados em gel de poliacrilameida
6%, corado com nitrato de prata. As colunas das extremidades de cada foto são os
marcadores de massa molecular (10 pares de bases, da Invitrogen®).
As frequências relativas dos alelos, para cada loco, estão apresentadas na Tabela 7 e
Figura 20. Nesse aspecto, pode-se verificar que esse conjunto de locos não permite a detecção
de variabilidade genética para produzir um bom poder de discriminação individual.
50
Tabela 6. Relação dos 14 locos microssatélites que apresentaram padrão eletroforético satisfatório para 48 indivíduos da espécie Hoplias malabaricus,
contendo a temperatura de anelamento dos locos (Ta); o número de alelos observados (Na) e a amplitude de variação do tamanho dos alelos em
pares de base (AVA).
Loco
Iniciador- Forward (F)
Iniciador-Reverse (R)
Motivo
Ta
Na
AVA (pb)
Hmal 9
CAACACCTGTCCTGAGAGCA
TGGCAGTCATACACCACAGA
(GA)6
58°C
2
226 - 232
Hmal 11
TCACTCTAACCCAGGGCAAC
ACATTCCGAGTAGGCTCCG
(TTCA)3
68°C
1
137
Hmal 15
CTTGTCAGCAGAAAGTGCCC
GCTACCATTCATCACCAGCA
(AG)10
62°C
1
226
Hmal 23
CACAAGAGCAGAGGCAGTTG
TGGCAAGAATTTTCCACCTT
(TAA)4
66°C
2
224- 252
Hmal 26
GGGCTAAGCGCTATTCCTCT
GCACTGCAAGCAAGCAAATA
(TGTT)6
68°C
1
204
Hmal 33
AGGGGATTTCTTCAAGTCCG
GGTGGAGCGAAAAATTCAAA
(AG)6
66°C
2
184 - 190
Hmal 34
ACGCGCTCCTACAACAGTTT
TGGTGAAAGGGTGGATTTTC
(AAAC)4
66°C
2
136 - 156
Hmal 39
CCGATGTTTGTGGTATTTGC
GATGTTGTGGTTGGAGTGGA
(GGA)4
66°C
1
209
Hmal 46
GGGGCAGTGAGGATCTTTCT
TCACCAACCATTCCCATTTT
(AT)7
54°C
2
189-196
Hmal 59
AGAAAACTGAATTGGCCGTG
TGAGGATTAGCATCAAGGGC
(TTTA)4
68°C
1
154
Hmal 60
TTTAATTGAACCCGTGAGCC
AGCATAACATTCCAGGGAGC
(AAAC)3
66°C
3
174 - 186
Hmal 69
AGCCTTTCAGCCAAGGACAG
GGTGCCATTACTTGTTAGCCA
(GA)5
66°C
1
229
Hmal 71
ATCAATGGGTGGTTCCTCAG
CACCTGTGACCATGGAATTG
(ACTC)3
66°C
1
236
Hmal 72
TGCAGTTTGCTTTGAGGTTG
CCCCTTAAACTCAGCTCCAA
(ATT)4
58°C
1
155
51
Tabela 7. Frequências alélicas dos 14 locos microssatélites.
1
- F1,F2,F3 – Frequências alélicas.
Figura 19. Frequências alélicas dos 14 locos microssatélites, estimadas a partir dos 48
indivíduos da espécie Hoplias malabaricus.
Verifica-se que a quantidade de locos polimórficos e o número de alelos por loco
foi relativamente baixo, considerando que locos microssatélites são potencialmente
Loco
F1
1
F2
1
F3
1
Hmal 9
0,914
0,085
0
Hmal 11
1
0
0
Hmal 15
1
0
0
Hmal 23
0,567
0,432
0
Hmal 26
1
0
0
Hmal 33
0,315
0,657
0
Hmal 34
0,927
0,072
0
Hmal 39
1
0
0
Hmal 46
0,472
0,527
0
Hmal 59
1
0
0
Hmal 60
0,750
0,113
0,136
Hmal 69
1
0
0
Hmal 71
1
0
0
Hmal 72
1
0
0
52
multialélicos (Brondani et al., 1998; Goldstein & Schlötterer, 1999; Ellegren, 2004).
Entretanto, esta quantidade pequena de alelos pode estar relacionada com o tamanho
reduzido das regiões microssatélites encontradas no genoma de H. malabaricus,
independente do tamanho do motivo de repetição, mesmo sabendo que se esperam taxas
de mutação menores em motivos de repetição maiores (Ellegren, 2004). Existem
diversos modelos de mutação para regiões microssatélites e a variação diferente do
esperado, em função do tamanho, tem sido observada em locos microssatélites de
alguns outros organismos (Van Oppen et al., 2000).
Considerando os 14 locos analisados, a heterozigosidade observada (Ho)
apresentou uma média igual a 0,054 variando entre 0,020 e 0,170. A heterozigosidade
esperada (He) apresentou um valor médio igual a 0,246 variando entre 0,136 e 0,505
(Tabela 8).
Os locos Hmal-34 e Hmal-46 apresentaram menor e maior valor das estimativas
de heterozigosidade, respectivamente, mostrando que, apesar do baixo polimorfismo,
existe uma considerável diversidade genética nesses locos.
Os valores obtidos para o índice de fixação (f) por loco, variaram entre -0,081
(Hmal-9) e 1,0 (Hmal-23, Hmal-33, Hmal-34, Hmal-46, Hmal-60), com média igual a
0,346 (Tabela 8). Dentre os locos que apresentaram polimorfismo, apenas o Hmal-9
apresentou desvios significativos para o teste de aderência às proporções esperados para
o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Esse resultado pode ter aparecido tanto em função do
tamanho amostral reduzido, quanto pelo fato de se tratar de indivíduos oriundos de
localidades distintas.
A espécie Hoplias malabaricus já foi estudada geneticamente com marcadores
RAPD e SPAR para estudos da diversidade cariotípica, caracterização molecular e
variabilidade genética (Dergan & Bertollo, 1990; Dergam et al., 1998; Lucio et al.,
2004; Pereira, 2005). Para os estudos com os marcadores RAPD foi utilizado mtDNA
para verificar divergência genômica e para estudos filogeográficos. Mas até o momento
nenhum estudo foi feito com o isolamento e a caracterização de iniciadores utilizando
marcadores microssatelites para a espécie Hoplias malabaricus.
53
Tabela 8. Relação dos 14 locos microssatélites que apresentaram padrão eletroforético
satisfatório para 48 indivíduos da espécie Hoplias malabaricus, onde, (He) e (Ho)
representam a heterozigosidade esperada e observada, respectivamente, (f) é o
índice de fixação e (p value) é o índice de significância para o teste de aderência às
proporções de equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Loco
He
Ho
f
p value
1
Hmal 9
0,158
0,170
-0,081
1,0
2
Hmal 11
0,0
0,0
0,0
-
3
Hmal 15
0,0
0,0
0,0
-
4
Hmal 23
0,497
0,0
1,0
0,0
5
Hmal 26
0,0
0,0
0,0
-
6
Hmal 33
0,456
0,0
1,0
0,0
7
Hmal 34
0,136
0,020
0,848
0,001
8
Hmal 39
0,0
0,0
0,0
-
9
Hmal 46
0,505
0,0
1,0
0,0
10
Hmal 59
0,0
0,0
0,0
-
11
Hmal 60
0,410
0,0
1,0
0,0
12
Hmal 69
0,0
0,0
0,0
-
13
Hmal 71
0,0
0,0
0,0
-
14
Hmal 72
0,0
0,0
0,0
-
Média
0,246
0,054
0,346
-
Renesto & Peres (2000) realizaram estudos genéticos e moleculares utilizando
marcadores enzimáticos para H. malabaricus da bacia do Alto Rio Paraná, para estimar
a variabilidade genética da espécie. Os resultados encontrados por estes autores foram
relativamente próximos aos resultados encontrados neste estudo, com marcadores
microssatélites, no que se refere à quantidade de locos polimórficos encontrados e à
heterozigosidade observada e esperada. Renesto & Peres (2000) encontraram, para
traíras coletadas em rios, uma heterozigosidade média observada de 0,048, enquanto
que neste estudo a média Ho foi de 0,054, e uma heterozigosidade média esperada de
0,14, enquanto que aqui encontramos a média He de 0,24. Em relação à proporção de
locos polimórficos, aqueles autores encontraram 33,3% e neste estudo o valor
encontrado foi de 42,8%.
54
De acordo com a literatura (Yazbeck & Kalapothakis, 2007; Morelli et al., 2007;
Assunção, 2009; Santos et al., 2009) já foram desenvolvidos alguns iniciadores para
ordem Characiformes, conforme a (Tabela 9). Dessa forma, é possível observar que há
uma grande diferença entre a quantidade de polimorfismos detectados neste estudo, com
a espécie H. malabaricus, em comparação com a quantidade de polimorfismos
encontrados por outros autores para a ordem Characiformes.
Tabela 9. Iniciadores desenvolvidos para a ordem Characiforme.
1
- B.E – Biblioteca Enriquecida.
Para fins de análise de vínculo genético foi estimada a probabilidade de exclusão
de paternidade (PE), que se refere à probabilidade de excluir uma falsa paternidade.
Considerando os 14 locos, variou entre 0,0 (Hmal 11, Hmal 15, Hmal 26, Hmal 39,
Hmal 59, Hmal 69, Hmal 71, Hmal 72) e 0,212 (Hmal 60). A probabilidade de exclusão
combinada (PEC) foi igual a 0,638 que pode ser considerada “ruim”, pois foi calculada
com base em 14 locos, isso ocorreu pois os locos apresentaram poucos alelos (Tabela
10). Outra medida importante em análises de vínculo genético é a probabilidade de
identidade (PI), que é a probabilidade de dois indivíduos escolhidos aleatoriamente em
uma população terem genótipo idêntico. Ela variou entre 0,460 (Hmal 60) e 1,0 (Hmal
11, Hmal 15, Hmal 26, Hmal 39, Hmal 59, Hmal 69, Hmal 71, Hmal 72) (Tabela 10).
Segundo Rodrigues et al. (2002) um bom microssatélite para análise de vínculo
genético é aquele que apresenta altos valores de probabilidade de exclusão (PE), sendo
satisfatórios os valores de PE maiores que 50%. Níveis reduzidos de polimorfismo ou
fixação de alelos para alguns marcadores causam baixos valores de PE. É preciso
ressaltar que o valor de PE é dependente do número de alelos e a distribuição de
Espécies
Estratégia de
Desenvolvimento
Números
de
iniciadores
Números de
locos
polimórficos
Números
de alelos
por loco
Literatura
citada
Prochilodus
lineatus
B.E
1
5
5
3 - 21
(Yazbeck &
Kalapothakis,
2007)
Paracheirodon
axelrodi
B.E
1
12
5
17
(Assunção,
2009)
Leporinus
macrocephalus
B.E
1
8
8
5 - 17
(Morelli et al.,
2007)
Colossoma
macropomum
B.E
1
14
14
4 - 21
(Santos et al.,
2009)
55
freqüências desses alelos na população. O único loco que apresentou valor de PE
superior a 50%, neste estudo, foi o Hmal 60.
Tabela 10. Número de indivíduos (n), Número de alelos observados (Na), Probabilidade de
exclusão de paternidade (PE), Probabilidade de identidade (PI).
Locos
n
Na
PE
PI
Hmal 9
41
2
0,071
0,748
Hmal 11
37
1
0,0
1,0
Hmal 15
48
1
0,0
1,0
Hmal 23
37
2
0,185
0,620
Hmal 26
48
1
0,0
1,0
Hmal 33
38
2
0,0
0,545
Hmal 34
48
2
0,063
0,775
Hmal 39
40
1
0,0
1,0
Hmal 46
36
2
0,187
0,624
Hmal 59
42
1
0,0
1,0
Hmal 60
44
3
0,212
0,460
Hmal 69
47
1
0,0
1,0
Hmal 71
45
1
0,0
1,0
Hmal 72
47
1
0,0
1,0
Total
-
21
0,638
-
56
6. C O N C L U S Õ E S
A estratégia de desenvolvimento de iniciadores a partir de biblioteca shotgun foi
eficiente para a detecção de diferentes tipos de regiões microssatélites no
genoma da espécie Hoplias malabaricus;
Foi possível padronizar a amplificação de 14 locos para análise genético
populacional da espécie Hoplias malabaricus;
Existe um baixo polimorfismos nos 14 locos microssatélites avaliados em 48
indivíduos da espécie Hoplias malabaricus.
57
7. R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A
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70
A P Ê N D I C E I
78 regiões microssatélites com diferentes motivos de repetição.
Locos
Tamanho
Produto
amplificado
Motivo repetição
Tamanho
motivo
Número de repetições
Região microssatélite
Hmal1
204
GA
(20)
2
20
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA
Hmal2
290
CATT
(4)
4
4
CATTCATTCATTCATT
Hmal3
484
CA
(6)
2
6
CACACACACAC
Hmal4
389
TG
(11)
2
11
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
Hmal5
262
AGAGAAAGAG
(4)
10
4
AGAGAAAGAGAGAGAAAGAGAGAGAAAGAGAGAGA
Hmal6
80
TC
(9)
2
9
TCTCTCTCTCTCTCTCT
Hmal7
266
CACT
(4)
4
4
CACTCACTCACTCA
Hmal8
113
TCAC
(8)
4
8
TCACTCACTCACTCACTCACTCACTCACTCA
Hmal9
226
GA
(7)
2
7
GAGAGAGAGAGAG
Hmal10
306
GTGA
(4)
4
4
GTGAGTGAGTGAGT
Hmal11
137
TTCA
(3)
4
3
TTCATTCATTCAT
Hmal12
114
CAC
(4)
3
4
CACCACCACCAC
Hmal13
252
AG
(9)
2
9
AGAGAGAGAGAGAGAGA
Hmal14
118
TTTG
(4)
4
4
TTTGTTTGTTTGTTT
Hmal15
216
AG
(11)
2
11
AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA
Hmal16
284
AG
(17)
2
17
AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA
Hmal17
195
TG
(9)
2
9
TGTGTGTGTGTGTGTGT
Hmal18
150
TCAT
(3)
4
3
TCATTCATTCATT
Hmal19
114
AG
(8)
2
8
AGAGAGAGAGAGAGA
Hmal20
376
AAC
(7)
3
7
AACAACAACAACAACAACAA
Hmal21
402
AAAG
(5)
4
5
AAAGAAAGAAAGAAAGAA
Hmal22
176
CT
(20)
2
20
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
Hmal23
224
TAA
(4)
3
4
TAATAATAATAA
71
Hmal24
475
AAT
(5)
3
5
AATAATAATAATAA
Hmal25
290
TA
(16)
2
16
TATATATATATATATATATATATATATATAT
Hmal26
204
TGTT
(6)
4
6
TGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTT
Hmal27
127
GT
(12)
2
12
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
Hmal28
109
TG
(7)
2
7
TGTGTGTGTGTGT
Hmal29
107
CA
(15)
2
15
CACACACACACACACACACACACACACAC
Hmal30
441
GA
(9)
2
9
GAGAGAGAGAGAGAGAG
Hmal31
354
AC
(13)
2
13
ACACACACACACACACACACACACAC
Hmal32
278
TG
(10)
2
10
TGTGTGTGTGTGTGTGTGT
Hmal33
177
AG
(6)
2
6
AGAGAGAGAGAG
Hmal34
135
AAAC
(5)
4
5
AAACAAACAAACAAACAAA
Hmal35
208
AC
(12)
2
12
ACACACACACACACACACACACA
Hmal36
138
AG
(7)
2
7
AGAGAGAGAGAGAG
Hmal37
391
TAAT
(4)
4
4
TAATTAATTAATTA
Hmal38
345
TG
(8)
2
8
TGTGTGTGTGTGTGTG
Hmal39
206
GGA
(4)
3
4
GGAGGAGGAGGAG
Hmal40
176
CTGG
(3)
4
3
CTGGCTGGCTGGC
Hmal41
122
AATG
(4)
4
4
AATGAATGAATGAAT
Hmal42
293
AATG
(5)
4
5
AATGAATGAATGAATGAAT
Hmal43
108
GTGA
(8)
4
8
GTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGT
Hmal44
108
GT
(6)
2
6
GTGTGTGTGTGT
Hmal45
228
AT
(27)
2
27
ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA
Hmal46
194
AT
(8)
2
8
ATATATATATATATA
Hmal47
165
TCAT
(3)
4
3
TCATTCATTCATT
Hmal48
90
TTG
(5)
3
5
TTGTTGTTGTTGTT
Hmal49
241
TTTAT
(4)
5
4
TTTATTTTATTTTATTTTATTT
Hmal50
255
AC
(18)
2
18
ACACACACACACACACACACACACACACACACACAC
Hmal51
166
GT
(7)
2
7
GTGTGTGTGTGTGT
Hmal52
121
TTTA
(6)
4
6
TTTATTTATTTATTTATTTATT
Hmal53
355
GT
(11)
2
11
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
Hmal54
248
CTAT
(3)
4
3
CTATCTATCTATC
Hmal55
195
CA
(7)
2
7
CACACACACACAC
Hmal56
364
AAAAT
(4)
5
4
AAAATAAAATAAAATAAA
72
Hmal57
170
GT
(6)
2
6
GTGTGTGTGTG
Hmal58
291
TG
(8)
2
8
TGTGTGTGTGTGTGT
Hmal59
154
TTTA
(4)
4
4
TTTATTTATTTATTTAT
Hmal60
170
AAAC
(4)
4
4
AAACAAACAAACAAA
Hmal61
312
ATT
(4)
3
4
ATTATTATTATT
Hmal62
151
AC
(2)
2
7
ACACACACACACA
Hmal63
329
GGGTCCAGCAGCA
GCATCAACAGCGC
A
(3)
27
3
GGGTCCAGCAGCAGCATCAACAGCGCAGGGTCCAGCAGCAGCATCAACAGCGC
AGGGTCCAGCAGCAGCATCAACAGCGCAGGGTCCAGCA
Hmal64
126
TG
(18)
2
18
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
Hmal65
317
CAC
(4)
3
4
CACCACCACCAC
Hmal66
107
CT
(15)
2
15
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
Hmal67
197
GCAG
(3)
4
3
GCAGGCAGGCAGG
Hmal68
154
GT
(6)
2
6
GTGTGTGTGTG
Hmal69
229
GA
(6)
2
6
GAGAGAGAGAG
Hmal70
139
TG
(13)
2
13
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
Hmal71
236
ACTC
(4)
4
4
ACTCACTCACTCAC
Hmal72
145
ATT
(4)
3
4
ATTATTATTATT
Hmal73
345
TTTTG
(5)
5
5
TTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTT
Hmal74
378
TAA
(5)
3
5
TAATAATAATAATA
Hmal75
160
TC
(6)
2
6
TCTCTCTCTCT
Hmal76
351
ATTTG
(4)
5
4
ATTTGATTTGATTTGATTT
Hmal77
118
TTTTA
(4)
5
4
TTTTATTTTATTTTATTTT
Hmal78
157
TC
(8)
2
8
TCTCTCTCTCTCTCTC
73
A P Ê N D I C E II
78 sequências obtidas através da estratégia de sequenciamento aleatório a partir de
bibliotecas shotgun.
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_001_1_A04
CCCCCGTTTTGTGAANTCGAGCTCGGCCCCCGTTGATCCGATGGTGAGTTTGGCCAAGGTGACCTGCCTTTAATGATT
CCGAGTGGTATATATACAGTTCATATTCATTATTTCATTCTGTGTTTAGATGTGTGCCAGAGAGAAAGAGAGGTTTAA
ATACACTATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGTTTAATGAGACCTAGGAAGGGG
AGAGATGTAAAGTGACTTAAGAGAGAGTGAGAGAGAGAGGTTTAAAGAGAATTAAAGAGGGAGCGATCCATATGAC
TXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXTCGNT
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_001_1_C01
TAACACCCCTTCTANTGAATTCGAGCTCGCCCACCGTTGNATCCGATCTCACTCATTCACACCTTGTCTGATATTTTCA
CTCACCCCCGTAACTTACACACTCACACATTCACAACTGTGCACATTTTCACACTCTCACCCAGTCACTCACTCATTCA
CAACTAGTGGACATGTTGACACATTCACAACTGAGCGATATTTTCACACATTCACATGGTCACTCACACTTTCACACC
TAAAAATATACTCACACACTTGCACATTCACTCACTCATTCACACTTTGCCGATATTTTCTTTCACACCATCACTCACT
CACTCACTCACTCACTCACTCATTCACACCTGTGGACATTCTCACACACTCGCACAGTCACTCGATCATTCATCCAT
ATGACTAGTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_001_1_E10
CCCCGCCTCTNNTGAATNCGAGCTCGCCACCCGATCNATCCGATTCTGATTGCATTAAGCTTCATGAACATTAGTGAT
GTCAGGTACTTATGTTATTCAGAGGGGGGTTAAAAACTCCAGCAGCACTGCTGTGTCTGATCCACTCTACACCAGCAC
AACACACACTAACACACCACCACCACGTCAGTGTCACTGCAGCGCTGAGAATGATCCACCACCACATCACACCTGCT
CTGTGGGGGTCCTGAGGGGCACGCAAAGTATGCAGAGCAACAGGGGGACGGTCTGTGTGTGAGAGAGAGCGGGTGA
AAGGCTCAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACAGAAAAATATATATAGAGAG
AAAAATAGAGAGGGGGGGAGAGAGAGACAGACAGAAAAATAGAGGGAGAGAGAGAGANAGAAAAATAGAGGGAG
GGAGGGAGAGAGAANTGGGTCAGAGAGAGAGAAAAATAGAGAGAGAGAAAGAAAGAAAAATAGAGAGAGAGAAA
GANAGAAAAAGAGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGANAGAAAAATAGAGGGAGAGAGAGAGAGANAGAAAA
ATAGAGGGAGAGAGAGAGAGAAGGA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_001_1_E11
TAATCCCCTTTTTANTGAATTCGAGCTCGGCCACCGATCGATCCGATGCCATGACTTTTTANTGTGGTTAAAAAAACA
CATTTACCTATAATTTGTTTGTTTGTTTTACATTAAGCACTTAATTGCACTTTAATTGCTTGATAAATTTGATGTCAGC
TATGATTAATTAAAAGCAATAAGAGCATTAATTCGGTCAGTTATACACTTCTGTGGTGCTATCCATATGACTXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_001_1_F03
CACACCTTCTAGTGAANTCGAGCTCGCCACCCGTATNATCCGATAGAGAGAGGATAAAAGTAGCTTGTCAGCAGAAA
GTGCCCAGCACTTTGCAGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTGTGGGGCAGATGCTAAGAAAAGAACAGCAGCTA
GAGAGAAATAGAGAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTAATGAATGGGTCTTGAGTTCTC
TTGGTGCATGTAGAGCTGAAATGCTTACTTGCTGGTGATGAATGGTAGCCAGGCCGTATTGGGCACCAAAGGGACCA
TAGCTATGCACCACCTTTTTATAGAATAACCCCGATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATGGAA
GAAAGTGTTTCAGGATAGAAATATTACAANCAAAGTTCAAATAAGNAAAGAAANTTAAANANAANANCTTAAGATA
AAGNCTTAAAGNAGAATCCATGAAANAANANAAAAANANAGTTTAAAANAGTACCCATGATCANATCTNATAGATG
TTAAAGAGTAAATGTGTNAAGTNTGTTTTTTATTGGGGGAAGGGGGTGGGGAGNANTTGTTNTTTANATGTGTGTGG
GTAATTTGGTATTANNTNTNANAA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_A04
CCCACGTGTAGTGAATTCGAGCTCGGCCACCGGTTGATCCGATCAGGGGAGGGAGAGAGTGTGATTCAGTGTGTGTG
TCTGTTGGTATGTGTGTGTGTGTGTGTATGCACGTACACCATAGGAAAAACAAACTAATTGCTTTCTAAAAGATGAT
TAAATAAAGGTATAAATCAGACAGCAGAAGCATCTGCGGCAGAAGAACTTGTGGGAGTCTTTTTCGATTGTGAAGGA
AGGGGCTAAGATGAATGGCACTTTCTCCGTCATAAAGCAGTGTCTTCTCATTCAGGAGATTTATTCCAGATCCGGAGA
GAGATCAGTGTCTGATAGGTGTTATCCATATGACTXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_A05
TAACCACGTTCTANTGAATTCGAGCTCGCCCACCGTGTGATCCGATATCAGCAGACAATTAGTTCACTCTTCATTCAT
TATCTTTCTGTAACCACTTCATTCACAAATTCTCTCAATTTCACACATTCACCCAGTCACTCACACCTGTGGACAGTTT
CACACACTCACCCAGTCACTCACACCTCCGGACAATGTCACACACTCATCCAGTCACTCACACATTCAACCAGTCATT
CACACACTCACCCAGTCACTCACATTTGTGGACAGTTTCACACACTCACCCATTCTTTCACACATCCATATGACTXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_B01
TGTAAACCACGTGTCGNTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTTGNATCCGATCTTTATTACTTTTAATAAGTATGAGATTA
CAGTATTCAATTGTTTTAAAATAAATTGTAATTATGCAAGAAAGTGCAGGTTCAAGTCACCAAAAAAATTGTTTTCCT
TTAATGCCTACGAACTCACGCAATTGTCTAACAGAGCTTCAAGGGCCACTGTAGCTCACAAAAAACATCCAGTTAAG
AGCCACAGTGGCCCTCAAGGCTCTGCAAAATGTCCAGACCACTGTGGACATTCACGTTGATGCAGATGAGGCTTTCA
74
AAGAGAGAGAGAGAGAAGCATAGAGACTGGCATAGAGAGAGTAAAAGGACACAATGTCTTGAGGCCTTGTTGCTA
AAAGGCAGATCTATCTGCTCATGTTTCACTCACAGTGGCCTGCACTCACATCCATATGACTAGTXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_B04
CCCAGGTTTTGNTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTTGNATCCGATCACTAAGGAAAAGTGAAAGTAGGAGCGGACAAT
ATGCAATCCTTAATGTGACAGTATGGTTTTCTGAGTGTATTGTGGATACTGCCAGTGCATCTTGAATACTAAACAAGT
GTATGTATCATAAAAAAGACCCATTACACACTGCTTCTAAACAACAACAACAACAACAATAATAATTTTAAAGTAAC
CTATGCTATGCTATGATTTGATTCTTACACTATATTTCATCAATTAATTCATTAATTTATTCATTGCCTGTAACTGCTTA
TCCAGTTCAGGGTCGCGGTGGGTCCGGAGCCTACTGGAATCATTGGGTGCAAGGCAGGAACACACCCTGGAGGGGGC
GCCAGTCTTTCACAGGGCGACACACACTCACACCTTGGACACTTCTGAGTCACCGATACCACCTACCAACGTGTGATT
TTGGACCGTGGGAGGAAACCCACACAGACACAGGGAGAACACACCACACTCCTCACAGACAGTCACCCGCAGCGAG
ACTTGAACCCACAACCTCCAGGTCCCTGNAGCTGTGCGACTATCCATATGACTAGTAGATCCTCTAGAGTCGAC
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_C01
GTAACACACGTTGTANTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTATTATCCGATATATAGGAAATGGCAAGAGAGCCATGGTT
AGAGTGCCCATTAATTAGAATTTGAAGCATTCCCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCA
CACACACACACTCCTCTCTAACGATGGTGATCAGTGAAACAGTTTCTCGCCCTGATCCCGTATGGCTGCGTCTGAAGT
CTTTCGCATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_B09
TTTTCGTAACACACCTTGTANTNGAATCGAGCTCGGCACCCGTATTATCCGATGCCTTATCAACAATGACAACAACCT
GGCCTACAGAGACGAAAATTTGCTGCTGGTGGGTTGGTGCAAAGGACAGAAATGGAAATTTACATTGAAATGATAAG
AAACAAAAGAAGAAAACAAAAGAAAGAAAGAAAGAAGGTAAAAAAAGAAAGAAATAAAGAAAGAAAGATAAAA
GAAACAGAATAAAGAAAGAAAATAACAGAATATACAGAAAGAAACAAAAGAAAGTAAAAAGAAAATAACAGATTG
TACACAAAGATAAACACAGAAAGAACGAAGAAATAAATAAACAAAAAGAAAGAAAAAGGCAAAAACAAAAAAGA
AAAAGAAAGAAAATAACAAAGACAAAGTACAGAAGGAACAATAAATGGAGAAAGATAGAAAGGAAGAAAGAAAA
NTAAATGAATTGTGCTGGAACACCTGGAGATCAAAGAAAACCTTCCCCAANANTGAAAAANNGGAGCGTNAATCTTT
AAACAANTGTAAAAATAANTAAATTGTAATTANTCCTGGTTTCANAATTTTAATTTCACTTAAAANNGANATTGGATC
TGGNATGANCCANNAATNCCAAATCTCANATGGTGTGATGTATGTGNAGGATAATGATGGTATGATTGTNAATATAA
NAANTGATGTAAGGGTATNAA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_C08
CCCCCCCTGTAGNNGAANNNCGAGCCGGCCACCGTATTATCCGATCTCTGAAAATTTTTAGCAACTGTGGGATGAGTT
ATACCGTTTTTATTGATCTAGAACTAATAATTCAATATCACTACCTGACCTCACTTAGTCCTTAAACTTGTGAATGCCA
TCAAAAGCTTACAAAAAGCTTTCATCATATAGAGTGAGACATTTTACACAAGAGCAGAGGCAGTTGTTGGAACAAAC
TTCAGGAGTAATGTTCAGGAGTAATAATAATAAGCAGGTCTTCACAAATTTTGGCCATAAAGGCCATTGATAATTCA
ATCATGTAACATGAATAGATATTGTCCGGCACTTTTCTGACCAAAACCTTGTTACATTGTGTAAACGTTTTGACAAAT
ATGATTGTTAAGCAAACAAAGGTGGAAAATTCTTGCCAAGCAATTATGCAANAATTGTGGNATGCCTAATTAGNAGA
ANTCANATGGAAATTACCCATCTGGAANTGTGATTAGTCAGGATGNTCANAGNANANANATNTGAAANNATTGGGT
ATGAAAAAAATNNACATNANATATTTGANAAATGTTNTGTTGCCTTTCAAANANTAANTNNATCTTAANATTAAGGA
TTGAATATTTGTNNTGATATTAANAAAATAATTNATATGAT
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_C12
TGTAAACCCCCGTGCTTGAATTCGAGCTCCGGTCCCGGGTATCCGATGATTCTGGGGACAGGCTGGAATGAAATAAT
AATAATAAAGTAATGGAATATTGGTATTACTTGTGTGTATCTATGTGTGTTCTCTGGAATGTCTATCATGGGCAGGAA
AAAGATGGTTGGGCAAAAATAAGCTGTTACTGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATATATTTTATCAGGTGACA
AAAAAAGGTTAAATTCAGTGACGGCTCACTGTTCAGCTTCCACTCGGGGTGGGTGTAGTGAATAATGTTCTGTTGGAA
AATCTGCTGAGTTGCTGATGGTGCTGATATGTGCTTCACTGCTGATATTGCGTGGTGTGTGTCTGTGTATGTTTGTATT
GGTGTGTGTCTGCACATACTGTGTATATAAATGTATGTTATGGCGAAAGTGGCTCTGCAAATTTGCAAATCCCTTCAA
ATTCCCCAAGTAATGGAAATTCTTAGCTTCACTACCGCAGGCTTTTCTTCCTCATCTCTTCCCTCACTTGTCTCACTTGC
AGTAAGGTGTTCAACATTTAAAACTTTATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_D08
TGTAACACACGTTGTTGNTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTATTATCCGATAGTGTGTGTGTTGCCCTGTGAAGGACTG
GCGCCCCCCCCAGGGTTTTATTACCGCTTTGCGCCCAATGATTCCAGGTAGGCTGTGGACCCACCGTGACCCTGAAAT
GGATAAGCGGTTACAGATAATGAATGGATGGAATAATTTCACTCTAAGCCTAAAGTAACTCAAGAAACATTCTCCAC
GGATTTGTAGGTAATAAACATACAGTTGCGTTCTATGCTAATATTTTTGTATAGAGCAATTCATCTCATACAGGTTTTA
TATATATATATATATATATATATATATATTTACTTCAGTGTAGTTCTTTTTAATTTAAAACTCATTTGTAAATTTCGG
ACATGTTTCAAGGAACCAGGTCTTTCTCTAATCAACAAGTTTACTTTTTCAGACTCTGTAAGAGTGTTGCTGTGCTATA
ACCAATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_E10
TGTAAACACCTGCTANTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTTTGGATCCGATATTCATATGGGAGGTGGTCCTCCTCAGTA
TGGCAACCTTGAAGATATGGTGAGTTGCATTGTGCAAATGCCTTATCCACTTATTTATGGATGTCTAGCTGCTTCAAG
TAATTATTTTAAGAATGTTTTGTTTTTCCATGTACATGGAAATATGGGGTGCTGGTAGAAGAAATGAAAGATTTAAAT
TATTTTATACATTGCTCTTTGTCTTAAAGGGTGTTGGTGGTGGCCGGCTAAGCGCTATTCCTCTCAGAGGCAGAGACC
AGTGCCTGAGCCAGCACCCATGCATATAGGGGTGATGGAGAGCCACTACTATGAACACAGTGAGTGCATGTGCTTAT
AAGGCTTTATGTTGTTTTAGATATTGAATGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTACTTTTTCATCTTATTTGTTTATTTG
CTTGCTTGCAGTGCCATTCCAGGNACCAATCTACACACATGGTGAAAGCCCTGCTGCGATGCCACCGCAGGGCCTTCT
AGTCCAGCCAGAGATGCATCTTCCCCCGNCTCCACACCCANGTGAAAACAGGCACTGATTTGACCTTTTCTGAGTTGA
GCGATTTCCAACGCTGGCCCTGNATTAACATGATCTATTGTTAAATTTTTG
75
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_F11
GTAAAGCACGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTCAGTACCTAACAAGAAGTGTGTGTGTGT
GTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGTGAGAAAAAGGGAAGAGGTGGTATTTTCAGACACTG
GCCCACCACTATAAATATGGAGATGTAAACTGATAATACACTCAAACAACTGAAAAGAGATTTATATTAAATTAGCT
GACTGCTGCCCAGTATTGGAAATATATTTGGATTATGATTTTTTCCCTATATAACATCACAATAGATCCATATGACTX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAAAA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_G07
GTAACACACTTGTCTAGTGAATTCGAGCTCGCCCACCGTTTGATCCGATCAGTCACACAGCTCCAGGGGCCTAGAGGT
TGTGGGTCCCCGATTTGGGTGACTGTCTGTGAGGAGTTGGTGTGTTCTCCCTNTGTCCACGTGGGTTTACTCCTGGTGC
TCCGGTTTCCTCCCACAGTCCAAAAACACACGTTGGTAGGTGGATCGGCGACTCAAAATTGTCCGTAGGGGTGAGTG
TGGGAGTGAATGTGTGTGTGTGTCTGTGTTGCCCTGTGAAGGACCGGCGCCCCCTCCACGGTGTATTCATCCATATG
ACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_G10
TGTAACACCACTTCTANTGAATTCGAGCTCGCCCCCCGACTTNATCGATTATAGGATGTCTATGGGAGTGTCTTTTTCT
CCTTCCCCTCAACTTTATCCCTCATCTTATTCTCTTCTGTTTTTCTATTCTTTCGTGCATGCACACACACACACACACA
CACACACACACCCACACACACCCACACACAAACATTTTAACAGCCAGTCTGTCTGGCCGGTGTAGTGGGCAGGATGT
GGGCAGTGACAGTAGTTTCCTGTGCTGTTACAAATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_H06
GTAACACACTGTCANTGAATTCGAGCTCGCCCACCTTCGNNATCCGATGAGGGGGAAAAAAGAGAGGAGAGAGAGA
GAGAGAGCGAGGCCATTTAGACTTTGAGGTTGTTTCTCCTACCACGTCTAAGTGCACTCTCCAAATAGACGTGTTAAA
AACAACACATAGGGGCAGATTTACTAAAATAGGTGCTAATTACATACAGGATGCTGACACATTGCAGTGGTTAACCT
AGTGACTTACATTGTCAGAAAAATTTATGCCACCATTAAAATTTTGGAACTCCTTTACATAAATTTGTATTTATTTTAG
GACTGAAAATAGATATTTCAGAAAATCTGTGATGACAAATGAGAGCTATCCTGAAGGAACAGCATTTATTTTTTTTCC
TCACTCTAAAACAAATAAAAACTATAAAATCAATTGTTCTTGCTTCAGATCTGAACAAGCCCATTGTGGTTTGTGTCC
ATTCTTCCANTGTGAGAAGANATCCATATGANNTAGTAGAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNATCN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_E04
GTAAACGACTTGTANTGAATTCGAGCTCGGCTACCGTTGGATCCGATCACAGTAAAAACAAAATAATAAAATAAATA
TAGCCGCCAGCGTCTATGGCGGGTCCTAGCACGGATAAGCCACATCAGAGCACTTTGACAGTCTCAGCCAACAATGA
GGCCTTTGGGAGCATGGGCCTGTTTGGCCAAACAAGGGAAATTTGGGTGTAAGATATTGTTGTAGATGTCGTTATAAT
GTTTAGCAAAAGACATGTGAGATGTGACATGTGTGTGTTATGACCGGCGAGTGCTGTTTTCAATTATGATAAATATTT
ATGTTCATATGTTATGACCTTTCACTTGTGCAGATGAATAGGATTTCATGAATGAAGTTGAACAAAGCAATATTTGGT
CTTAAAGTGCCATCTGCTGGTGAAAGCGTGTACTTTTGACTCATGGAGCTGNAAAGGAGTTCATGTTAAAAATGCAC
ACACACACTTTTTAATCGTCTAATGGTCTGTGAATATGTAANTAANATGGANATATGTGGTATCAATCCATATGAATA
ATANNATCTCTANANTNNNACTGNANGNATGNAANNTTTCCCTATAATGANTTNTATTANAN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_F08
TGTAACACACTGTTCCTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTTGATCCGATGTAGGTGGATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
TGAGACCGAGTTTGTAGTGCCCTGTAATTTATAGAGAATAAAGCGCCTGTGTCTGTGTTGTGGATATTGTGACCCGTG
CTTCATAACGTCAGAAAGAGTCAGTAAAGACTCTATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_002_1_B08
CCCCAGGTGTTNNTGAATTCGAGCTCGGCCACCGGTGTATCCGATCTCTTTTTCGTGTCAGATAAAGCATCTTCTACG
GAGAGAGAGAGTGAGAGAGAGGGAGAGAGAGAGAGAGATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
76
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_C04
TGTAAACCCCGGTTCTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTATCTGTGAATGTTAGAAGCTCCATGAT
CTTTTTTTTCAGGCAGAAATTCCGGCATGACAACACTACTGATGTTGGATCACAAACACATCAGAGGTACTGGGTGGG
GGATGAAGCTCCATGGTTCCACCAACCAATGCTGGGGAGCCTTATACCCCTCTAGCCAAAACTAATAGACGAATATC
ATGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTGTTTGTATGCACACTCCCTCGCTAACCTAAACAATTATCTCTCCTATCATAGC
AGCTGCTGAGCGCAGTACCTGAGGGCCACAGAGCATCTACAGCGTGAAAAACCTCCACACTGCAGCAGAACATGGT
GGAGCACCAGCATTCCCCAGTGGAGAAGTGTGTTTCTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
TGTGNGCGTGNGTGGGAGGAGTNATGAAGANANANNTCANAGGGNNCAANGGNNNGTTNTAATGGAATNANANTG
NANNGGNAGAANCTAAAANNAAANNNTGNAANTNAATATAATNAAANANNNANANTGANGNTNNNNNANNNNNN
NAAAAAAAAAATNANNAAAANTNNNNGAANGAAAAAANNNNNNNAAANAANNAAAAAAAAAAAAAAAAAAANN
NNN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_C08
TGTAAAACACGTTCCATGAATTCGAGCTCGGCCCCCGGTCTCTCCGATTCANTTCGAGGGATTTCTTCAAGTCCGCGC
CTGAATTACCACAAAGTTCAGTTAGCGTTAGTCCGCTTCAGAGAGAGAGAGGTAGGTAACGTCAGTTCAAGTCCTTC
ACAAGAGAAAAAGGCAATGGCTTTTACTGTTTCTCTCTTTCGAAACTGAGATTCTTATTTGAATTTTTCGCTCCACCTT
AAAATTTAAATAGTGCAGCTCCATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAAAAAAANAAAAAAGGNNN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_C11
TGTAACACACGGTCGANNTGAATCGAGCTCGGCTCCCGGATGTATCCGATCTGTGAAATCACAGCTCCGCCTTCAGCT
TGATCTGATCCGTCCATCTTTGGAAAAAAAACTAGTGACGTAGGCTAGTGAACGCTTGGAGGGAACTGTTTTCAACTC
TGCGCCCTTAGTCCAGGGTCTCGCCCCAAACCCAATAGCGCGCAAAACGCGCTCCTACAACAGTTTAAACAAACAAA
CAAACAAAAACCCGACTAATGTGAAACCTATTTAACTACTTTCTGTGATATAATTTCGGAGACCATTTTAGAAAGCAT
CGTAAGGAAAATCCACCCTTTCACCATCGGNACTAAACTGTCAGNGCTGGCTGGGACGAANTTTTCGTTCCTGGTTGA
AGANTAANANCCTGATCGGANGNTGGANAANTTNATNAATATGAATAATAAATNNTNTANANTNNANTGNANGNAT
GNAANNNNNNNTATAANGAATNAATAANANNNGNNNNAANNANNNNANANNNNNNNNNNNNNNAAANNNNNANN
NNNNAAANNNANAAANNAAAANNNNAANANAANNNNAANNNNNNNNNNNNANNANNNNNANNNNNNNANNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_D04
TTTAAACACCGGTGTTATGAATTCGAGCTCGGCCACCCGGTTATCCGATACGTAAACACACACACACACACACACA
CATAATGCATAAACAGACTGGTGACACTTTACATTTCTTTAAGAAGCCCCGCCCCAATAATCCATTTCCACAGAGGAC
CAGGTTTAACACTTGTCCCAACACCTGAACCATTGCCTCTGAAGGTGTAATGATGGTAGAATCAAGGAGCAGCATCA
AGTTTGGCTTCTTTCCCATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXGNGNAAAGGGAATAANTNANTNNAAAGNGGNAAAAAGNNAANAAAAAAAAANGAAAAANNNANAAAAA
AANNNAANAAAAAN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_D05
TGTAAACCACGTTCTATGAATTCGAGCTCCGGCCCCGGTTAATCCGATCTAATCTGAGAAGCGAGGACGCTAAATATT
CACCAAGCCCTGAATATGTGTAAAAATCTGAACATGGAGCTAACTGACAAAACTGGTGGATTGTATACATCCCAGAC
ATTGGTATCTATTAAATATACACAAACGCATTAATATTCAAACGGAGACACTGGAAACATGCAGAAGACAGACACAT
ACACAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTTATAATGGGATGTCTGGAGTGGACCATTTCTTGGCAATTCTAATGGAATCTT
ATTGGAGAAAGATCGAACGCTTTAACGTTTACCAGACGTTTACACCCGCTCCAGTTCATCCGNGACACAGTTAGAGTC
AATAATTCATTTCAGTTGGATTTGTCGTGACAGAAAGCTTTGTTTAATGGATTATTTTCAAAATTGAAAAGGNTGNGT
TTAANGAAAGAATNTGGGGTTGTGTAAGGGGTGATTAATATGTNGNTAATAAANNNAATNNAANTAAATANANGTG
TNNGNNAANNNNGNNNAAAAAAAANAANAAANGNAATAAGNNNNNAANNNANNNNNNANAAANNNNANNNNNN
ANNNNNNNNNNAANNAANNNNAANNNNNNNNNNNNAANAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_E07
TTGTAAACGACGTTCTGNTGAATTCGAGCTCGGACACCGGTCTCANTCGATGCAGACAGCCAGTCAAATCAAATCTTT
ATTAAGGAAGCCCTTATATATGTTCTCTAACCTTTGTGGAAAGTAAGTGCTATTATGCTCATATCCAGTTTGTTAGTCA
CCCCTTTTAATCAGTGAATTCTGCACAGACATTCAATTGTGCACACATCTTATATAAAAAATCATGTAATGAAATGGG
ACGCTCTGATTCAAGCTCATCATACACAAAGCTAAGCGTAGGCTAAAGGGATATAATGCACCCATTTATTTGTGAAG
CTGGTGGAACTGCCCCTTCCAGAGTGTCAGAGCATGGTCCAGAACCTTTTGGATGAACTGGTGTGGNGTTTGTTATCT
AATTAATTAATTATTCAACATCATTACCTGAATACACTCATGTGGTTGTGGNTGTATGNAATCAAATCCTCANANAA
NTGTNTNATTATTTGTGTAAANNTGTTAATGNANNANATGNGGANAAANTATAAATNATNNNNTTAANTNNTGATNA
AATGTNGNATATNNNNAAANNNNANNNNNANGNNNATANANNNANANNANNANANANNNNNNANANNNANNNNN
NNNANNNANNNNNNNNANANNNANNNNANANANNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
77
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_F03
TGTAAACGACTTCTANTGAATTCGAGCTCGGCCCCCGTATTATCCGATAGAGAACAGAGCTCCACAGCCACCCACTA
GGGGCTTCACCCCCTACTTTTCACACAGTGAATGTTGGTATTAGCCTTCCATTGCATTGCAGTGTTTTTCAGTGCTGAT
TCAAGCAGCTGCACAACCCGATCAGAATCCACGGNGTGTGATTCATTAAACTCCAGTGTTACAAATGAAAGTGTTTA
ATAACGAGGCAAAATAGAGTGAATAAATAAAGAAAGAGAAAAAAGGGGAAAACAGATTTGAGAATGTATTTATTCA
AGTGGTGAATGATGTGTGAGTCAGATTTGTGTTTTGGACCTTGTGCCTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGCGAGAGT
GAAAGAGAGAGTGTGTATGTGTGTGTGTGGGGATCCATATGAATAATAAATNNTNTANATNNNANNGNANGNATGN
AANNNNNNNNTATAANGANTNNAATAANANNNNGNNNNAANNANGNNNANANNNGNNNNNNGNNNNAAANNGNN
ANNNNNNAAANNNNAANAANAAANANNNNNAANNAAANNNNAANNNNNNNNNNNNANNNANNNNNNANNNNNN
NNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_F05
TGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCCCCCGTATTATCCGATGTTTGTGGTATTTGCATCTGATACAACT
TTGTACAAATCCACATGATCTAATAAACAATAAGGGAATCTCTGCTTATTTTACCTGTTTTCTCCATGTCTCAGTATTA
CTGCTGTAAGAAGGAGGAGTCCGAGTCGGAGGAGGAGGAGCCCGACTTTGTCGTCACATCTCGTCTGCCCACCGTC
CACTCCAACCACAACATCCTGGCGGCTAGCGTCCCCGCGGCGGCCACACCCAATGGCCCCGATCCATTTGACTXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNANNNNANAAANNNNAAA
ANNNNANNAAAAAANNNNAAAANNNNNAAAAANNNNNNNAANNNNNNAAAN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_003_1_F08
TGTAACCCACGTTCCATGAATTCGAGCTCGGCCCCCGGTGTTNTCGATACAGCTAAGTTTAATGTAACTACAAAGAAA
AACAGACAACCTCCATACTGCTGATGGAGCTAAAAGACCAGACTATTCACAGTCTTGCAGTGAGAGAGCTGTGGTTC
ATATCAAAATCAGCAGGAGACTACAATTCCTAGAACAGTGATGAAAAATCGGTGTGTCAAAAAACCAAGGTCTCCAC
TGAGTTTATGGTGCAGGGCATTTTTAAATGTCTGACCACCATCAACCCTGACAAAAAACAGCTCCATTATATAGGCAA
AAATAAAACTACATCACATGAGAGAACTGTAAAACACAGTTGTACTGCAGTGCAATCAACACAACAATGAAAGGTC
ATCCTGCATCACACATTAAATACATTCATTCATTCATTATCTGTAAGCGCTTATCCAGTTCAGGGTCGCGGTGGGTCC
AGAGCCTACCTGGAATCATTGGGCACAAGGGGGGAATAACCCTGNAGGGGGNNGCCAGTCTTCANAGGGAANNATA
ANANNAAANANAATTANTCANTTTTGAATTAACATTCACTATCATATGANTANTANATCTNTANANTNNANTGNNAG
NTGNANNNTTNNNTATANGANTNNAATAANNNNGNNNAAAANGNNNAAANNGNNNNNNNNNAANNGNAANNNNN
AAANNNA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_B09
GCCCCCTTCCCNTGAATNNGAGCTCGGCCCCCCTACTATCCGATGTNCAGTCTGGTAGAGGTCGATGAGGTCATANA
ACTCCTCCCACTTCGAGTCGGAGGACACAGAGTCTGTGTCTTGGATGTCAGCTTTGGACTGATGTTTGCTGACGAACC
AAAAAAAATAACCATGCTTTAACATTACTGTGCCCAGTGCTATGTGTCCACTAGATCCAAACCTTGGACCCTGGATAC
AAGTTCCAGGCCTGGCTGGCTGGCATGACACTTATACAGCTGCAATTATAAAGTCTCTGCCTGGAACGTGTATCAGA
GATCCCCCTTTGAAGACCTCATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_D11
CACCGCTTGCANTGAATTCGAGCTCGGCCCCCCTTCCATCCGATCGCCCAATGATTCCAGGTAGGCTCTGGACCCACC
GCCCCACTAATTCGGATAAGCGGTTACAGATAATGAATGAATGAATGAATATATATCTATATTTTACATATTCACTG
ACCTCACTTTTCAATTCAATATATAATGCTTTGTCGTTATGCCATAGCTTTTTTCTCACATTGCCAAAGCATAAATATA
TTACTAAAATATACACCTCAGATACTGTTATTTACAAAAATATACTTCCTACCTATCTCCAAAAGTTACTTAGCTTGGA
GTCGCAATGACAGGGGCTCTGTCCTCAATTTTANATTTCANTGTCCTCCATTTTCTTTGTCTTTTTTTTAATGTTGTCAA
CTTGGTTTATTTATTATTTATTCTATTGTCTACTTTGTATTTTTCTGTAAGGTGTCCTTCAGTGACAAAAAGACGCCTGT
GAAATAAAATGTATTATTATTATTTTACAAATTCATTGTTTGTCTGACCTCANTTTAATTCAGAGGTTCTAATTGGTTT
AATTTTTCCTATTCANTATTANTANATAATGANATNNGTATTANNNATGTATAGGAAAGTNNATANATAATGNTTCTG
TGTGAAATNATTGTTTGTNTGNATTNAGAGTGAAATGANCAATGGA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_C04
CACTNCGTGCTNNNGAANNNNANCNCGCACCCCCTATTATCNGATGCCCCCTCCAGGGNTGTATTCCCGCCTTGCGCC
CAATGCTTCCAAGTTCGGCTCTGGACCCCCCGCGACCCTGAACTGGATAAGCGGTTACAGATAATGAATGAATGAAT
AATTAGTGGCTTATTCTAATTTAAAGGAACAGGCGTTGAACCAGTTGTTCTGAACAGGGCTTTTTAGACATGGGGGAT
CCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_E01
CACGCGCTATTNNTGAANNTCGAGCTCCGCACCCGTTCNATCCGATTACACTTGAAACCTTGAAATTTGGTTCTTTCA
CGAACCGTAATGTTAATGCAGAGGAATGAACAGAAGTCGAATGAATGAAGAAGCACAGCGACACTGATGTGATGCA
GCGAAAGCCCTTCTTATAAAGCAGTTTGTTAAATGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTTAAACTAAGTTA
GCACTGCAGGTGGTGTCGCTGCCAAACAACTCCAGGGTCTCGGGTCCTGGATTGGATCCTGTCCACAAGTCTCTGACT
GTGAGGGGATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
78
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXT
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_E07
CCCANNGTTTGNTGAATTCGAGCTCGGCCACCGGTTGATCCGACGCACGCTAAGCTATGCTAACAACTGCTGCTGTTG
CCACATTCTTCTNTTCATGTTGGCCAAGCTCACAATCTCAGATACCCTTNTTTTAAACTTACCCTGATATTCATAAACA
AATTTACATGTATACTCATTTATACTACCGTTCTGTAATACAATATATTTTGCTAGGTTAACTAGCTAGCTAGTCTGAC
TTTAAGAAAATATGCTAGATAATATTCTAATTTAAACAGTCAGCAAAATATGAAAATGCACTTGTTTACACAGTCTTT
ATCCATTTTATCAGCTTTGCTTGGTTCTACAGTAAAAGACGATACTCCATCTGTTGGTCTACCTATATTATTAGTCTAC
TTTCACCCTGTTTTTCCATGGTCAGTACCATTAATGAGCAAATAATATATGCCCCGAGTTTGGTTTTATATATTTGAGT
GTGTGTGTGTNATTTGACACACACAGGCAGTGGTGTGTTAGTGTGTGTNGTGCAGTGTGCTGGTACAATTGCATGAG
GCACAGCTGTGCTTCTGTAGACCTTAACCCCTCAGTGTCACTGCTGGGCTGAGAATAGTCCACAACCAAAANCATTCA
GCCAACAGCATCCTTTGTCCAC
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_F06
CCCCCCGTTATCNTGAATTCGAGCTCGGCCCCCGGTCTATCCGATGTCCAGAAAAATAATGGATGTCAATGGTGAGTG
TGGCCAGAAGGTAGTGTTTTTACCGTGTGTGTATTTGTCTGTGTCTACACTGTTCATTTATCCATCTACATGAAGCATA
TGTTAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAAAATACATTAGAGAGACT
CCAATTAATACATCAAAGCAGAGTCTGGATCAGCTGATCTCCCCAGGCTTTACCCTAAATTTGTTCAGTTAGTTGTAC
ACATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
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XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXG
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_F09
CACGACTTCTANTGAATTCGAGCTCGGCTCCCGTTCNATCCGATCAACCTGTCACCGCCTGAGGGGCAGTGAGGATCT
TTCTTTTATTTTTTAGTGTTGCGTAATATATATATATATACACACAGTACAGTGCAGAAGTCTTAATGATATGTATTTA
AACGAATGCCTTCTCAGTGAGCGTGGCGCTCGTATAAAGTCATGTACAGGGTGGGCCATTTATATTGATACACTTTAA
TAAAATGGGAATGGTTGGTGATATTAACTTCCTGTTTGTGGCACATATGAGAGCCGAAATCCATATGACTXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTGGGGN
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TGTAACACATCTTGCTANTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTATNATCCGATCAAAGGCACTGGGCCATTGAAAACCCA
TTACAGAATCCCAGAACTTGATGCCTGAAATTAATATCACTAGTGTCCTGTCTGCCCATTCAGTTTTGAAAGCCTTGT
GCAGAATTTATCATTCATTCATTAAGTCATTTGTAACCGCGCATCCATTTCAGGGTCGCTTGCGGGTCCAGTGCCTAC
CAGGAACCACTGGGTGCAAGGCAGAAACTCAACACTTTTGATGGGGAACTAGTTCATATATTTTGTAAATGAATGTG
TGTATGATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_G03
CACCGCTACTANTGAANTCGAGCTCGCCACCCCTATCATCCGATAGTGATCAGGAGAGTGTTCCTCCTCACTGCAGAA
AACTCTCAATTACATTGCTGTCAGGATCTGGTGGCATTCAGCCACATAATCTTCAGTGAGGTCAGGGGCTAATGGAGG
GTCAGAAGCACCACTTGAACTCATCCCAGAGGAACTGGATGGAGCTCCATCTCTCCAGAGAACACCTCTCTGTTTTG
TTGTTGTTGTTATCTCAGGTCCACTGCTCATGATTTTCCTGAATCTGTTCATTATAGTGTGTGAATACCAAGTGTTTAC
ACACAGTCCATCTATAAACAGGACTCCACCGTTCTTCCATTGTGATCATCAAACCGGATAGTTACAGTAATTCACTCA
TTCATCCACCTTCTGTAACCACTGTGTGACCAAAGACCCCCTGGAACCATTAGGCACACCAAAGGAACCCAAAGAGC
GAGCATGTATCAGTCCANTGGNATAAAAATGCTGGNACACCANTGANTGTAGACCANTGGTGGTCCANCATCAGAAC
ANTCAGATTANTGGTCTGTANAGGANTCATTTATAANTCATTTTAATTTNATATAANNTCATTTATAATNNCTCAANA
GATT
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_004_1_G10
GTAACCCACGTTTAGTGAATTCGAGCTCGCCTACCGATGGATCCGATTTTTGTCCTGACTAGGAAGGAAACCTGTGGG
CAGTAGGCTGTGAAAAAATCATGCTTACTGAAAATGACATGGCTTAGACCATCCAAAGGAAGTACAGACACTAATGT
TTGCTTTGGCTTTTTTTCCTCAGATTTCTCTTTTACTCCTGAATCTAGATATGAGGCTTCCCTGATCACAAACACAGTGC
CCATGTACCGTGCTTTTAAGAGTGAGTATGCTCATGCTTATCTTTTATATTTATTTTATTTTATTTTATTTATATATTT
TTGCACATGACTGATGGAGTGTAGTGACACAAATGAGCAGAGGCCAGTCCACGCAGCTGACACTGACAGAAGTAAG
GCTATGCAGGACAGCATGGACTAAGAAGTACAAAATAAAAGCACAGAAAGTAAACCACAAAACAAATGTAAATCAC
TAAAATTGTAGCTTTTCCAAAATGAACGTATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_A07
TGTAAACGCCTGCTANTGNAATCGAGCTCGGCACCCGTTCTATCCGATCTCCGGTCTGTCTCTCTGTCACCAGTCTCCA
CCTCTGCCTTTATTTCTCTGTCTCTGGTCTCTCTCTGCTCTCAGGTGCCTCTCCTGTAAATCCTCGGTTCACTCCATCCC
TCATCCTGCTCACACTGACACACACACACACACACACACACACACACACACACCAGCCAAAATATTACAGCCATCC
CGTCTCTCCACCCACTGTCCCCTTCAGGTTGACCCAGACACAGGGCGCATGATCTAGAATATCACATAACAACAAACT
CAGCAGCGTGCAATTCCCGGTCCCACCAGAAGGGTGCTTTAGCTTTAAGTGCAGGTCTCTGTCTCAGACTGTGTTTGT
GTCTCCTGAGCGTTCTCCTGAGATTATAATGAGATGATTGGGTCTCATCGGGATGGGGCCTTGTTGCTGAGAGACCAG
TCGANACAAACCTCTGGGTCCGGAACACACAGGAGCTTTGTTCCGTGTGTGTGTGTGTNTTCCTACCTCTGGGGTCCT
79
GTGTCATTTCTGGTGTNTATATTNCAGANTCAATCTGANGGTGATTNAAGAGAAGAAAANANTGNAGAGGGATGGGA
GGATGNATAAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAANGNGNATGAAGTGTTT
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_A07
TGTAAACGCCTGCTANTGNAATCGAGCTCGGCACCCGTTCTATCCGATCTCCGGTCTGTCTCTCTGTCACCAGTCTCCA
CCTCTGCCTTTATTTCTCTGTCTCTGGTCTCTCTCTGCTCTCAGGTGCCTCTCCTGTAAATCCTCGGTTCACTCCATCCC
TCATCCTGCTCACACTGACACACACACACACACACACACACACACACACACACCAGCCAAAATATTACAGCCATCCC
GTCTCTCCACCCACTGTCCCCTTCAGGTTGACCCAGACACAGGGCGCATGATCTAGAATATCACATAACAACAAACTC
AGCAGCGTGCAATTCCCGGTCCCACCAGAAGGGTGCTTTAGCTTTAAGTGCAGGTCTCTGTCTCAGACTGTGTTTGTG
TCTCCTGAGCGTTCTCCTGAGATTATAATGAGATGATTGGGTCTCATCGGGATGGGGCCTTGTTGCTGAGAGACCAGT
CGANACAAACCTCTGGGTCCGGAACACACAGGAGCTTTGTTCCGTGTGTGTGTGTGTNTTCCTACCTCTGGGGTCCT
GTGTCATTTCTGGTGTNTATATTNCAGANTCAATCTGANGGTGATTNAAGAGAAGAAAANANTGNAGAGGGATGGGA
GGATGNATAAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAANGNGNATGAAGTGTTT
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_E01
TGTTAACCGATGTGCTCNTGAATTCGAGCTCGGCCCCCGTATTATCCGATGGAATATAAAAAAAGGCCAAAAAAGAA
AAAAACGGCTCCTTTTCCTTAATTGAAGTCCGATTGCTTGTAAGAAACTAATTTTAAAAGTTTTTATTTATTTATTTAT
TTATTGGGGCGAGACAGGTATAATGGACAAAGGGAAACACCAGTGTGACAGTTCTTCACGTGAATTTATAATACGCA
AACTACGTATGTCTAATTAAAGTTGTATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTC
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_F12
TGTAACACACTTTCANTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTATTATCGATGGCTGAATTTAGGGGTGTGGCTTGGTGACTT
ACTCACCGTGTTTTTTGCAAAATCACCTACTGTAGCTTTAAACCTGACATGAACATGTGACCCTGTTTAACCAGTCAG
GTTTAATGTTGCCTTCCCGCCCTCAGCATACACACACTTGTGTTGTTACCATGACAACCAAAATACATCAATCAAGTC
TGATCTCACACATTGTACATGCACACAACACACTCGCAGAGTTAAGAAAACCATTCAGTTCCCTACACACAGTGTGT
GTGTGTGTGTGTGTGCCATGGACCCCGGTTATGAAAATTTAAAGCCCGAGGAGTGATGACCTCTGGGCTAAGGGTG
GTGGTATTCCCGGCATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_G01
TTTTGTAACCCACTGGTCNTGAATTCGAGCTCGGCCACCGTGCCATCCGATCAGATTGTGCTTTTTACATTGGCCAAC
ATTTTTATGCCTGACAGTTGTCATTTGATATAGTAATGCAAATTTCCTTTGCTATCTATCTATCCTTTACAACACATTC
AGCATCATTCATTGTACATCACATACTATTAGAATTTTAAAATACTTTATCCACAGCTCAACATTTATCAGCAAGAGA
CATAGGACCACAAAAATATTCTCATATTTCATAATTTCTAAATTTCTGCAAGAGGCTTGAAGGAGCTTCATGTGTCCA
GGGAATTTTTTGGGGGCAATAGTCACCTGCAAGAGAGATAAATCAGAATTAGGACTTTTGCTAAAGCAATTTGACAT
TGAGGAAGAAATTCATAATCCTTTCTTGCTCAGTGAAAACTAAAAAAAGTTTTTGACTTAATTCACCTTTTAACTATC
CATTTAATTACTATAATGTAGCCTGTTATAACTACGTATGTCATACTTCTGTGGCAGGTAATGGACTTTATGGAATAA
AAAGATATGTTTAA
AAAACAAATTACTTGAGCGAAG
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_G03
TTTTCGTAAACCCTCTAGCTCNTGAATTNANGCTCGACCCCCTACTAATCNGATCANANTTGNTGGACAGTGTNANAN
ANTCANCCAGTCACCCACAAATTCTCAGANCTGTGGAGAGTTNNANANATTCANCCAGTCACTCACACACTCACACC
TGTGGACAGTGTCACACACTCACCCAGTCACTCACAACTCACAACTGTGGACAGTGTCACACTCTCACCCAGTCACA
CACACACACTCACAACTGTGTACAGTGTCACACACTCACCCAGTCACTCACACACTCACACCTGTGTTTTTGTGTCAC
ACACTCACCCAGTCACTCACCCACTCACACCTGTGGACAGTGTCACACACTCACCCAGTCACTCACAACTCACAACTG
TGGACAGTGACACACACTCACCCAGTCACTCACACACTCACACCTGTGGACAGTGTCACACACTCACCCAGTCACTC
ACACCTGTGGACAGTGTNANACANACTCANCCAGTCACTCANACACTCAAAATTGTGGANAGTGTNANANANTCACC
CAGTCATTCANANATTCA
ANACTGTGGANAGTGTNANANATTCACCCAGTTATTCAAANATTTANNACTGTGGANAGTGTTAAANATTAACCCAA
TTA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_G04
TTTTCGTTAGCTCTCGTGCTCNTGAATTCGAGCTCGGCTCCGTTCTGATCCGATNCAAGCAGAAACAGAACCCCCAAG
GAGAGGTAATTTACCGGTTATTTAGCACTTTCTAGCTCTATTTCAGACAGATCTACTGTATGATCTTCTCAGAGTTGAT
GAGAGAACATTCACTCATTAGTTGTTTGTAACCACTTATCTGATTCAGGGTCACATTGGGACAGTAGCCTACTCGGAA
TCACTAGGCACAAGGGGAGTTAACATAAACCCACAATTTCAGTACCCTAGAACTGTGTGACAGTTACACTACATGTT
GCACTGCCGTGCCACCACCCGATGAGAGAACAGGAACCTGTAAATATTAAAAATAAAATAAAATAAACAAAAACAC
AGCACTCAAAGATGACATTTTCCTCAGATGGTTAGCTGACCGTTCATATTTATAAATGTAAGTGACAGATATCATCCA
TATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXAN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_005_1_G05
TCTTTGTAACCCACTGGCTCNNTGAATCGAGCTCGGCACCCTACANATCCGATTCAGAGGCAGAGACAGAGGAAGAG
GACGCACCTGGTCCTGTGTTATAGAGACACCGNGTCTGGATGTGTGTGGTCTGTGATGTGTGTCCAGTGCTGTATGTG
GTCAGTCCGAGTGCTTTTCCTCGGCCATGTTTAATCCGAGTCTGAACGGCTGCAGTGTGGGATTATTTCCTGTAAAGC
CACTGAAAGAAAGTGTGTGGAGAGAGAAGTGTGTGTGTGCAGCGTTGTACCTTGTCTGTGTGCACACTTATATCACC
80
ATCTGTAGCCTGAGGCAGAGAGAGATAGGGATGAGAGAGAGAGAGAGAGATAGGGATGAGAGANANANANANANA
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_006_1_D08
TTTAACACCCACTTCTAGCTGAANTCGAGCTCGCCCCCCCTATCTATNCGATTGAAATNANAAGATATATTATAANAA
GTGAAAGNAAACCATTAAGTTCTAGAGAAATAGNAAGGAAGTTAAAAAATATGTTATGATGAANGAAAAATTNAAA
NGGTGGNAGAAAATAAATTTTTAGAAAAANTAANATAGTTAAAAAAATAATAATTAAANGGGAAAAATAAGATTNT
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GTGTGTGTGTGTGTGCCCCTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_006_1_D11
AAACCCCCGTTTTTGAATTCGAGCTCGGTCCCCCGGGTATTCCGATAATTCTATACATGCAAATGGAATGAGATATTG
TTGGTTACTCCAAATTGACTTTACATTACAACATTACAACTTTATTCTCAAAATCATTACGATAAGTAATAATTATTTA
TGTATTTTTCCCCCCTATGTTCCTTTATCAGCCCCATCAAGTTGATAAAGAAATAATGCTCGTATGTATTAAAAACAAG
TTGCAAAGCTAAATGTTTTCAAAATGAATGAACTATGTAGATGCTAGTCTGAATGGAATGATATTCTCATGTTTGTTC
TCTGAACATTTCGGGATAAAANAGTTTCAGTTGACCATCAGTCAGTTTCCTCAGGCAGGGTCATTGGGGGTGTTAAAT
AGTGTGGTTTCAAGCATCCAGTGGAAGTGGATGTTTGTGTGTGTGTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
TGTGNAGGNATGGAGAGTGANAGANTCTGGTGGATTTGGGANAGATTTGGNTTGAAGGTGANAGNGAAGAGGAANA
GAGNTGANAGAAAATTTNTTNANANATTTNNTCCTGTNTNATNNATATGANTANTANATNNTNTANANTNNANTGNA
GGNATG
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_006_1_E11
TAAACCCCCGTTATTTGAATTCGAGCTCCGGTCCCCGGGTATTCGATAGAATCAGAGTGACTGGGATATTCTCTGAGA
GAATGGGTTATGAATCCTGCTCTGAGAGGATTAGAACTCACTGCATGAGTGTGAAAAATAGCAAAAAGTTGAAGGTT
TAATGTGTCTATGAGAAGTCTAATCAGAACTGTGAGCATTAGCTCAGAGCCAGTGTGGCAGCAAAGATCATCTCCTA
TAGAAAACTGAATTGGCCGTGAGCTCTGATTTACTTATTTTATTTATTTATTTATGCTCATATGCACAATCAAGACCC
TATTATCTCTCACTATCCTCTTATGATAATTGCTACTGATTTGAATCAGNCCTCTTGCCCTTGATGCTAATCCTCATTAT
AATAAGCTAAAGATANATTCCTGTCCAGGATCAANTCTTAATGGAGGAAAGTGGTGGTCTTTGGATTGGATTGGATT
GGATTGGTGGNCTANNGTTNAATAATANNAATGTANNAAATTATTTTAATTTATAGTGGANTATAAATNTATAATAT
AATAGGTATTTGTANTTTGGTANNCATAATANATANAAAAATNTAATATGTAANATNTGGTTAATTTGTTTNCGAAAT
N
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_006_1_G08
TGTAACCCCCTCTTAGTGAATTCGAGCTCGCCACCCGTTCNATCCGATCTGTCTGAGCCCCTTAAGGCCTCTTCATTTC
CAAAACCTACACACATACACACACACACACACACAAACAGACCTTTGCTTGGTCCGACTGGCCTTCATTAAAACTTGT
GATTGGTAACACATGGCAGCAGAGCGTGTGTGTGTTGTGTTGTCTTCACACGGAAGGTGTGCAGGGGGAAATTGTG
GACGTGCCGTGCTGTAAGCCGACTCCTGCAGCTGATTTCCTGCGCTTTACTCTGCACACGTGTCCGGCTCGTGTCTTTT
GGGTCACTGAGGGGCCCAAATATAACCTGCCAGACCATGGAGACTCTAATGGATGTGTATACACCTGAATAAAGTAT
AAGGTTTGTCTGTCAGTAAGTCAGTCAAATGATGGGGATATCGGGGCGAANGAGCGGAGGTTTAATATGGATGTGTA
TCAGAGGATGATGTGGGGGTGTATATTGGAGNANGGTGGGAAAGTGAGGAANTCGGAGATGATGGGNGTTTAAGAG
AATTTATNANNGNCAGTGAAGAAGAGGAGAGGNGGAGATATAGGGAACTGTTGAAGAATTTGTTAAAAATGTGGTT
GTGGTGA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_007_1_A04
GTAAACACACGTGTTATGAATTCGAGCTCCGGTCCCGGGTTATCCGATCAACAATATTTACATTAGTGTTTATATAAA
ACCAATTTAACGCCAGAATAAACAAGCATAAATTAGAACAAAGAATGTTTGAAGACGATAGGTGTCAATAATAATAC
AAAACAATCAGTTTTAATTGAACCCGTGAGCCTCAAATGAGTTTTTATAAACAGCTTACAGTAAAAAAACAAGTTTA
GTATTTGTCTAAGCATATTAAATGTTAACAGACTTTAGGACTCTAAACAAAACAAACAAACAAAATAAAACTAAACT
AAATCTTAGCTCCCTGGAATGTTATGCTGTAATGGGTCATAAAATAATAAATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCGNNTCTCNTCATGATCNT
GNNTCGNNGTNGNTGGGGAAGGATANNTATAAGNGAATNAGTACNAAAATAGGAAANAGAAAAAGTANAAGNANA
AGNAAANNAAAGNGTGNGNTNNAAANNCCCGAAAAAAA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_007_1_A11
TAAACCACGGTTTGNTGAATTCGAGCTCCGGCCCCGGATGATCCGATAAAAAACACAGCAACAAACGGATTAAATTA
CTCCCATCACCTTTTACTTCCATCCATTATTATTATTTTTTAATTTTACAACTTTTAAAAAGCTGTTTTCATGTTTTATA
ACATCTACAAAATGTAAATATTACATAAGCCATGTATTCCTATATAAAACTAATGTTTTTTGGACAGAAGTGCTCACA
AAGCAATAAACAGCTGTCATACAGTTATATATCAAACTCTAAACTATTAGTGGACACCTTGCTATATGGAAATGAAC
ACACATCCTCTGGCCAGTGTGGCCATGCGGTTGGGCTGTAAGAGGCTTGGGGAGCTGATCCATATGACTXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXA
81
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_007_1_C10
CCACCGGTACTTCCGATCATAGTGCTTATGAAGTTTACGTGGTTAAAGATGATTGCCAAGTGGTTGACTGCCTTAGTG
ATGTCATCTCAGTGATCGGAAAAGTTCTGTAGACCATATTTCCAGTGTCAGGGTGATGAATGTGAAAGCTCAGTGTTT
ATATTTATGAACATATGGGGGGTGNGTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGNGCGGGTGGGTGG
GTGTGTGAGTATGTGTGTGGAGGGTAATNTTGGTTTTTGTGTNNNGGTNNNNGGTGTNATNTTGTGGTGGNGATNNN
NNNNTNTGTNTNTNTNTNTNTNTNTNTNTNTNTNTNNNTNNNTNTNNNTNTNTNTTAAAAAATGGNGTNNNTNTNNN
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NANNNAN
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_008_1_B04
TAAACCACGTATANTGAATTCGAGCTCGGCCCCCGGATGATCCGATACTTATTTCTTTCTGACTTTTAACCAGTTTAAG
GAGGCCCACCGTTCCCAGAAGTACTGCAATACCGGGTCGATGCGTGGAGCGGACGGAGCAAGCCCCTCTTCCGTCTC
CCTGCTCAAAAAATCAATTTAATATGTAGTCCTCGTATAGAGGACGTATCAGATATTAAACTGATAAGAACAGATAC
TACACTTGATCTTAGCCAAAAGGCCGAGAAGCGATAACCGGAAAGGCCCGGCCGGCCCGGAGCACCCTGCCGCAAA
CCAGCAACTACTGGAGGGTATTTAAACCTGGTCGTCAGACCTTGACCCCTCCCACTCAGACACCACCACCACACCGG
AGGCTCCTCCCACCAAGAACTGCAAACAGAAGCTAAGAGCTGCTATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXT
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_008_1_C10
CCCCCCTTATGNTGAATNCGAGCTCGGCCCCCGGTATCATCGATGTGATGAAGTTCGGCAGGTGGTTTTAATAATTTG
GCTCCTCTATGTTTATTCAAACAGGGCTCGGNCAATCAGATTTCAGTAANAGAATCTCCTATATTGTCACTTCCTCTTA
ATGTCCATTTTACTAAAGCTCTCTCTCTGTCTTCTCTCGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTAATGGAGA
GTAATGGAGTGTCAGTGTCCCTCGCCCACACGTCCACCTTCAACCCAGNATCCAAATTACCTCAGNANAGGGACATT
AGCCCTGATCCATATGANTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGNTAAATGATGNTGGGNNG
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_008_1_E09
CCCATGTTTANTGAATTCGAGCTCGGCCACCGGTGTATCCGATGCATTCTCACCTATGAGTTTTGACAGTCCAGGTGG
GTCAGTGCAGTGCTGTTGAGATAGCGTCCTCGGTGGATCTGTTGCTACGATAAGCAAACTGGTGTGGGTCCAGCGTA
GCAGGCAGGCAGGATTTCAAGTGAGAAAGAACTAGTCTTTTAAAGCACTTGGAAATTATTGGGGTGAGTGCTACAG
GTCAAAAGTCATTAAAGTCTGAAGCAGTAGAATGCTCAGGCACAGGCACAATAACGGCTGACTTAAAGATAGATGGT
ACAGCTGCCTGGGATCCATATGACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXAGGGG
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_008_1_F03
CCCCANCTTCTANNGAATNCGAGCTCGCCCACCCGATCCATCCGATCTCTCGCATTTAAAGAGCACAGAAAGATGAT
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_008_1_H11
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82
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_C08
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_C11
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_D02
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_D04
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_F01
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_F08
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_H04
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83
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_H05
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_A06
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_A07
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_B04
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_009_1_D04
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_007_1_B05
TGTAACCCCCGTGATANTGAATCGAGCTCGGCCCCCGGTTTTTCCGATAACACTCAGAGCATTAGGCTACAGTTCACT
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84
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_007_1_B05
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>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_007_1_B06
CCCCGGGTATCCGATGTAACTTTGCAGTTACAAGCAAAGTTACCTTGGTTTCTTGGTAAGTTGTGGAATAGAATCTGT
ATTGGTGATGTTTAGTTACTTTATGATGTTATGGCTGGTAAGTTGTATAAGTGCAAATTCTGGACTGGAACATGGATC
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CAGCGCAGGGTCCAGCAGCAGCATCAACAGCGCAGGGTCCAGCATCAACAGCAAAGGGTCCAGCAGCATCAACAGC
ACAGGGTCCAGCGGCAGTGCAGGGTCCAGCAGCAGCAGTAGCTTAGCGGTCAAAGGCAGCAGCAGTAGCTCAGCG
GTCAAAGGCAGCAGCAGCTCATCATTCAACTGCAGCAGTGCCAGGTCCACCATCAGCAGCTCAGGGTCCAGTAGTAG
TTTATGTAAATCATTACAATGTCTTTACAGTAAGTCATAAGGATATGCGATGTGGGAGTCTAAGCCATGCCATATTGA
TATATAGTGTTATATCTGAATCTATGCTATATCCTGATCAGCAANATTAAACACATGCCTAGTGTGTATAGATGATAT
TTAGTAGGTAGTTGAGTACTCATATGTAGACAGTTCCAGAATGCAAATACGCCTCAATGTAGCCTTAGTCATCA
>DYENAMIC_HOPLIAS_HM_SG_005_007_1_B09
GTAACCGACGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTGTGGGAATTCATTAATTACAACATTTATTG
TGTAACTGCATCTGTATATGTGTAATTCAGCACTACTTGTTTTACTCAAATGACATGTGAATGACAGTATGCTATGAG
TAACATTGTTTCGTGTTTATTTATTTATTTTTTTTTTAGTTGAAATTGAAGTTGAAATGCTGAGTTTGCCCAGTATCTG
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85
A N E X O I
Protocolo de Extração SDS (Sodium dodecyi sulphete) fenol/clorofórmio
Passos: Maceração do tecido com o equipamento TissueRuptor diretamente em
microtubos de 2,0mL, a partir de algumas gramas de tecido muscular, e em seguida
adição dos tampões: 300µl de TNE 20X, 30µl de TrisHCl pH 7,5, 10µl de SDS - 20%.
Seguiu-se com a adição de 10µl de proteinase K a 20mg/ml e aquecimento a 55ºC por 4
horas ou 37ºC durante 12 horas (overnight) em banho Maria.
Na sequência, deixou-se esfriar o material preparado e adicionou-se o volume de
250µl de Fenol, mais 250µl de Clorofórmico:Álcool isoamílico na concentração de
(24:1), misturou-se bem (por inversão, por no mínimo 20 vezes) e centrifugou-se a
12.000 rpm por 10 minutos (repetindo mais uma vez esta etapa). Em seguida foi retirado
o sobrenadante e colocado em um tubo eppendorf de 1,5 ml; ao sobrenadante foi
acrescentado 1000µl de etanol absoluto para causar a precipitação do DNA.
Novamente misturou-se bem (por inversão, no mínimo 10 vezes) e centrifugou-
se durante 5 minutos a 12.000 rpm; seguiu-se com uma lavagem com álcool 70% por 2
vezes (500µl cada vez) - Inversão, no mínimo 2 vezes; lavagem mais uma vez com
álcool absoluto (500µl) - Inversão, no mínimo 2 vezes e centrifugação por 2 minutos a
12.000 rpm. O pellet foi seco e em seguida ocorreu a ressuspenção com 50µl de TE com
RNAse (2µl de RNase para 998µl de TE) e o material obtido até este passo foi colocado
em banho Maria por 1h a 37°C.
Após a extração, o DNA total foi quantificado com o auxílio de um marcador de peso
molecular conhecido, em gel de agarose 1% e tampão para eletroforese TBE (Tris
Borato - EDTA) na concentração de 1x. Para a visualização das bandas o gel foi corado
com brometo de etídeo (10mg/mL) e fotografado por fotodocumentador.
86
A N E X O II
Construção da biblioteca Genômica
1. Sonicação
Cerca de 8 alíquotas de 40 µl de DNA a 50 ng/µl foram colocadas em tubos de
0,2 ml. Estes tubos foram colocados sobre gelo em um adaptador onde uma fonte de
ultra-som, gerando vibração, causou a ruptura do DNA em tamanhos variáveis. Metade
dos tubos foram sonicados por 7 segundos de ondas intensas, enquanto a outra metade
foi sonicada por 5 segundos de ondas intensas, sendo que a temperatura durante a
sonicação era mantida entre 0ºC e 4ºC para que a quebra do DNA fornecesse
fragmentos de todos os tamanhos sem qualquer tipo de viés gerado por aumento de
temperatura (Bankier et al., 1987).
Para a seleção dos fragmentos de DNA, realizou-se uma eletroforese com o
produto fragmentado (DNA genômico) em gel de agarose 1%, com o auxílio do
marcador de peso molecular 1Kb, onde se verificou a presença de fragmentos do
tamanho desejado (entre 1Kb a 500pb). Após a confirmação em gel de agarose 1%,
obtivemos uma boa qualidade de DNA sonicado nesses tubos.
2. Tratamento das extremidades dos fragmentos
As extremidades dos fragmentos de DNA, obtidos pelo sonicador, foram
tratadas por uma reação pk, contendo tampão pk 10x e 100mM de DTT (Dithiothreitol).
Misturou-se a enzima pk com os fragmentos do DNA, para posterior ligação ao vetor de
clonagem pMOSBlue, segundo protocolo do pMOSBlue Blunt Ended Cloning Kit,
fornecido pela Amersham Biosciences (Sambrook et al., 1989) (Tabela 1). Nessa fase, a
reação foi incubada no termociclador a 22°C por 40 minutos, 75°C por 10 minutos e 2
minutos no gelo.
Tabela 1. Reagentes da reação de tratamento - protocolo do Kit pMOSBlue Blunt
Ended Cloning
Reagentes - Volume (para 1 reação)
10µl do produto da reação Pk
1µl do vetor de clonagem pMOSBlue, fornecido pelo Kit pMOSBlue Blunt Ended
Cloning
1µl Tampão/T4 DNA ligase
12µl (total)
87
3. Ligação dos fragmentos
Para a ligação dos fragmentos de DNA foram utilizados: a reação pk, o vetor
pMOSBlue e a enzima T4 DNA ligase, que catalisa a reação. Essa reação foi incubada a
22°C overnight e depois armazenada a -20°C.
4. Transformação
Posteriormente, a reação de ligação foi inserida em células competentes,
disponibilizadas no próprio Kit. As células permaneceram no gelo por 30 minutos e em
seguida foram transferidas para o banho Maria a 42°C por 20 segundos, voltando
novamente ao gelo.
O procedimento foi feito em câmara de fluxo devidamente esterilizada com
álcool 70% para evitar contaminação do material. Homogeneizou-se a solução X-gal,
IPTG, H
2
O MilliQ. Anteriormente, o meio LB solido foi acrescentado em placas de
Petri altoclavadas, tampadas e armazenadas em estufa a (37°C) por 30 minutos para
secar. Em seguida adicionou-se a solução X-gal, IPTG, H
2
O MilliQ em todas as placas,
espalhando a solução pelas placas com o auxílio de uma alça de vidro (flambada entre
uma placa e outra).
Finalmente as células transformadas foram aliquotadas em placas de Petri
contendo meio LB sólido, os antibióticos Ampicilina e Tetraciclina, e incubadas em
estufa a 37 º C por período overnight.
5. Seleção de transformantes
Para a seleção de transformantes, realizou-se o repique das colônias positivas (de
cor branca), uma a uma, com auxílio de uma haste de madeira autoclavada. As colônias
positivas foram, então, transferidas para placas deepwell contendo 110µl de meio Circle
Grow, permitindo o crescimento das colônias de bactérias por cerca de 22h a 37°C sob
agitação a 225 rpm. Em seguida, realizou-se a preparação de reações de miniprep em
placas por lise alcalina, seguindo o protocolo sugerido por Sambrook et al. (1989).
6. Sequenciamento automático dos fragmentos de DNA
As reações foram preparadas a partir da precipitação com isopropanol, seguido
de purificação com etanol e secagem em termociclador a 90°C por 1 minuto. Estas
88
reações foram armazenadas a -20°C, protegidas da luz. Imediatamente antes do
procedimento de sequenciamento foi adicionado formamida Hi-Di às amostras que, em
seguida, foram desnaturadas em termociclador por 5 minutos à 95°C e colocadas por 2
minutos no gelo (Sambrook et al., 1989).
89
A N E X O III
Procedimento de miniprep em placa por Lise Alcalina
Importante: Ligar a estufa a 90°C antes de iniciar a miniprep.
1) Centrifugar a 20°C (15 minutos 4.000 rpm) a microplaca-cultura e descartar o
sobrenadante, invertendo a microplaca sobre papel absorvente por 5 min.
2) Adicionar ao segmento bacteriano 240µl da Solução I (GET = Tris/EDTA/Glicose),
selar a placa, ressuspender com vórtex (rotação 10) por 2 min: 8 ponteiras amarelas +
micropipeta multicanal + recipiente.
3) Centrifugar (15 minutos 4.000 rpm), descartar o sobrenadante secando a placa
sobre o papel absorvente e ressuspender o sedimento bacteriano em 70µl de GET
acrescido de RNase com vórtex: 8 ponteiras amarelas + micropipeta multicanal +
recipiente + adesivo + GET + RNase + vórtex. - (2 placas – 14ml GET + 300µl de
RNase 10mg/ml). - 150µl de RNase 20mg/ml - (4 placas – 28ml GET + 600µl de
RNase 10mg/ml). - 300µl de RNase 20mg/ml
4) Transferir 70ul das suspensões de células para microplaca – fundo U: caixa com 96
ponteiras amarelas + 8 ponteiras incolores + micropipeta multicanal + recipiente +
microplaca fundo U.
5) Adicionar 70ul de solução de lise preparada na hora do uso (SDS1%/NaOH 0,2M,
preparar aproximadamente 14ml para 2 placas), selar com adesivo e homogeneizar por
inversão 40 vezes e incubar a temperatura ambiente por 10 min: 8 ponteiras amarelas +
micropipeta multicanal + recipiente + solução de lise + adesivo.
6) Centrifugar (1min a 4000rpm) rapidamente para solução soltar do adesivo antes de
removê-lo: centrífuga.
7) Adicionar a 70ul de Solução de Neutralização gelada (KOAc 3M), selar com
adesivo e homogeneizar por inversão 40 vezes e incubar a temperatura ambiente por 10
min: 8 ponteiras amarelas + micropipeta multicanal + recipiente + solução de
Neutralização + adesivo.
8) Centrifugar rapidamente (1min a 4000rpm), remover o adesivo e incubar a 90°C
por 30 min. A seguir, selar novamente a placa com adesivo e incubar por 10 min em
gelo: centrífuga + estufa + adesivo.
9) Centrifugar (15min a 4000rpm) e transferir 120ul do sobrenadante para microplaca
filtro ( Millipore) com a base fixada com elástico a microplaca – fundo V (cuidado para
90
não transferir o precipitado): centrífuga + caixa com 96 ponteiras amarelas +
micropipeta multicanal + microplaca-filtro + microplaca-fundo V + fita adesivo.
10) Centrifugar/Filtrar (6min a 4000rpm placa de filtro nova ou 10 min a 4000 rpm
placa de filtro reutilizada) e identificar a microplaca – fundo V: identificação +
centrífuga.
11) Remover a microplaca-filtro. Precipitar os plasmídeos com a adição de 110ul de
isopropanol (temp. ambiente) a microplaca-fundo V, selar com adesivo e homogeneizar
por inversão 20 vezes (Incubar 30 minutos em geladeira). Centrifugar (45 minutos 4.000
rpm), descartar o sobrenadante e manter a placa invertida em papel absorvente por 5
mim: 8 ponteiras amarelas + micropipeta multicanal + recipiente + isopropanol +
adesivo + centrífuga + geladeira.
12) Lavar com adição de 200ul de etanol 70% (temp. ambiente), centrifugar (15 mim a
4.000 rpm) e descartar os sobrenadantes: 8 ponteiras amarelas + micropipeta multicanal
+ recipiente + etanol 70% + adesivo + centrífuga.
13) Centrifugar (20 s a 600 rpm) a microplaca invertida para remoção de traços de
etanol e incubar á temperatura ambiente por 1 hora ou 30 minutos na estufa a 37ºC:
centrífuga + papel absorvente + estufa.
14) Ressuspender os plasmídeos em 50ul de água com incubação o/n á temperatura
ambiente: 8 ponteiras amarelas + micropipeta multicanal + recipiente + água milli Q +
adesivo.
15) Estocagem de plasmídeos. Após a retirada de alíquota (1ul) para sequenciamento, a
microplaca com o restante da solução de plasmídeos (49ul) será estocada em
ultrafreezer ou freezer convencional.
91
A N E X O IV
Reações de sequenciamento
As reações de sequenciamento foram montadas utilizando o Kit DYEnamic ET
Termintor (GE Healthcare) (Tabela 1 e 2) e os fragmentos de DNA foram submetidos
ao sequenciador automático ABI 3100.
O sequenciamento baseia-se em uma eletroforese em capilar, onde 16 capilares
ficam submersos em tampões nas suas extremidades. Esses capilares são preenchidos
com polímeros de acrilamida por onde passam os fragmentos de DNA que estão sendo
sequenciados, que são separados por uma diferença de potencial, sob um campo
elétrico. Nessa etapa, os nucleotídeos se separam e o feixe de laser que intercepta os
capilares, realiza a leitura das bases nitrogenadas que compõem o fragmento de DNA
dos clones.
Tabela 1. Reação de Sequenciamento
Reação de Sequenciamento (para um sistema)
DNA
1µl
Primer U-19
1µl
Premix
1µl
H
2
O Milliq
7 µl
Total
10 µl
Tabela 2. Programa para Reação de Sequenciamento
Programa para reação de Sequenciamento
Temperatura (C°)
Tempo
1° - 96°C
10 segundos
2° - 53°C
5 segundos
3° - 60°C
4 minutos
4° - 10°C
∞
30 ciclos 1°, 2°, 3°
92
A N E X O V
Protocolo de Coloração com Nitrato de Prata (Creste, et al., 2001)
Tabela 1. Protocolo de (Creste, et al., 2001)
Procedimentos
Solução
Tempo
N° de vezes
para
reutilização
Fixação Etanol
Etanol 10%, ácido acético 1%
10’
3
Lavagem
Água destilada deionizada
1’
-
Pré-tratamento
Ácido Nítrico 1,5%
3’
4
Lavagem
Água destilada deionizada
1’
-
Impregnação
0,2% AgNO3
20’
3
Lavagem
Água destilada deionizada
30’’
-
Lavagem
Água destilada deionizada
30’’
-
Revelação
30g Na2CO3, 500mL H
2
O
Milliq,Formaldeído 0,54Ml
1
7-10’
-
Bloqueio
Ácido acético
5’
5
Lavagem
Água destilada deionizada
1’
-
1
-Acrescentar na solução de revelação na hora de utilizar, (resfriada a 12°C) e
manter sob lenta agitação.
93
A N E X O VI
Padronização das condições de amplificação, com ajuste nas condições para
amplificação para loco Hmal 15.
Tabela 1. Protocolo das Reações em Cadeia da Polimerase demonstrando os reagentes
utilizados e suas concentrações de uso e volumes, para um sistema de 15µl.
Reagentes
Concentração
Volume (µl)
DNA
25ng/µl
5
Iniciador (F+R)
1,8mM
4,4
Tampão da enzima
10X
1,5
dNTP´s
2,5mM
1,3
BSA
10mg/ml
1,3
MgCl2
50mM
1,0
H2O MilliQ - autoclavada
-
0,3
Taq-Polimerase
5U
0,2
Total
-
15
94
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